低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法
【課題】食品添加物として使用する際に苦みが少ない重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産する新規な菌株、及び該菌株を用いた発酵法による低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法を提供する。
【解決手段】ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）またはその変異株である菌株、及びこれらの菌株を用いた重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【解決手段】ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）またはその変異株である菌株、及びこれらの菌株を用いた重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産しうる製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ε−ポリ−Ｌ−リジンは、Ｌ−リジンのε位のアミノ基が、隣り合うＬ−リジンのカルボン酸基とアミド結合で結合したイソペプチドである。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、必須アミノ酸であるＬ−リジンのポリマーであるため、安全性が高く、また、カチオン含量が高いので特異な物性を有する。したがってトイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等の用途が期待できる。特に、食品添加物の分野では、天然物系の添加物として注目されている。
【０００３】
ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法としては、ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株を培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法が知られている。このような方法に使用される菌株としては、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. Lysinopolymerus）Ｎｏ．３４６−Ｄ株（微工研菌寄第３８３４号）（以下、Ｎｏ．３４６−Ｄ株という。）（例えば特許文献１参照）、Ｎｏ．３４６−Ｄ株のＳ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株である１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）（例えば、特許文献２参照）、Ｎｏ．３４６−Ｄ株のプラスミド増幅変異株である５０８３３株（微工研条寄第１１１０号）（例えば、特許文献３及び４参照）、高濃度のＳ−アミノエチル−Ｌ−システインに対して耐性を有する、１１０１１Ａ−１株の変異株であるＢ２１０２１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９２６）（例えば、特許文献５参照）、ストレプトマイセス・ノールセイ（Streptomyces noursei）に属する菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−９７９７）（例えば、特許文献６参照）、ストレプトマイセス・スピーシズ（Streptomyces sp.）ＳＰ−７２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８１０）（以下ＳＰ−７２株という。）（例えば、特許文献７参照）、ストレプトマイセス・スピーシズ（Streptomyces sp.）ＳＰ−６６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７２２３）（例えば、特許文献７参照）、ストレプトマイセス・ヘルバリカラー（Streptomyces herbaricolor）ＳＰ−１３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７８４５）（例えば、特許文献９参照）、ストレプトマイセス・アルブルス・サブスピーシズ（Streptomyces albulus subsp.）ＳＰ−２５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７９８８）（例えば、特許文献１０参照）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae）ＵＳＥ−５３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０５）（例えば、特許文献１１参照）、ストレプトマイセス・スピーシズ（Streptomyces sp.）ＵＳＥ−５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６１）（例えば、特許文献１２参照）、ストレプトマイセス・スピーシズ（Streptomyces sp.）ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６２）（例えば、特許文献１３参照）が知られている。
【０００４】
しかしながら前述の菌株を用いて生産したε−ポリ−Ｌ−リジンを食品添加物として使用する際、使用量に応じて苦みが増す傾向があった。そこで苦みを低減できる重合度８、９から２０余程度のε−ポリ−Ｌ−リジンが好まれ、そうしたε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた製造法が知られている。（例えば、特許文献８、９及び特許文献１２参照）また、重合度１０〜１０余のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法も報告されている（例えば、特許文献１０参照）。しかし、これらの菌株のε−ポリ−Ｌ−リジン生産量は、同一の培養条件で比較した場合、重合度１３〜３５程度（数平均分子量約３５００）のε−ポリ−Ｌ−リジンを生産するＳＰ−７２株（例えば、特許文献７参照）やＵＳＥ−１３株（例えば、特許文献１３参照）の生産量よりも相当低い。そこで、重合度１３〜３５程度のε−ポリ−Ｌ−リジンの生産菌と同程度の著量の低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法が望まれている。
【０００５】
【特許文献１】特公昭５９−２０３５９号公報
【特許文献２】特公平３−４２０７０号公報
【特許文献３】特公平３−４２０７５号公報
【特許文献４】特公平６−７５５０１号公報
【特許文献５】特開平９−１７３０５７号公報
【特許文献６】特開平１−１８７０９０号公報
【特許文献７】特開２０００−０６９９８８号公報
【特許文献８】特開２００１−０１７１５９号公報
【特許文献９】特開２００２−９５４６６号公報
【特許文献１０】特開２００２−９５４６７号公報
【特許文献１１】特開２００３−５２３５８号公報
【特許文献１２】特開２００５−６５６１号公報
【特許文献１３】特開２００５−６５６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、例えば、食品添加物として使用する際に苦みが少ない重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産する新規な菌株、及び該菌株を用いた発酵法による低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は前述の従来技術の問題点に鑑み、鋭意研究を重ねた。その結果、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）及びその変異株であれば、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は下記の（１）〜（４）の構成を有する。
（１）低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）。
【０００９】
（２）低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）の変異株。
【００１０】
（３）低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを９０％以上の高い分率で含有することを特徴とする前記（１）または（２）項記載の菌株。
【００１１】
（４）前記（１）〜（３）項のいずれか１項記載の菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とする低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【００１２】
（５）低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを９０％以上の高い分率で含有することを特徴とする前記（４）項記載の低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の菌株を用いれば、重合度１０〜３３、特に重合度１５〜３０のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産することができる。該菌株を用いた本発明の製造方法であれば、著量の低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
＜１＞本発明の菌株
本発明の菌株は、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）またはその変異株であり、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジン、特に重合度１５〜３０のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産する性質を有する。低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産するとは、採取可能な量の低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産することを意味し、著量に生産するとは、ここでは少なくとも１ｇ／ｌ以上のε−ポリ−Ｌ−リジンを培養液中に生成することを意味する。
【００１５】
本発明でいう低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジン（以下、「低中重合度ポリリジン」ともいう）とは、Ｎｏ．３４６−Ｄ株やＳＰ−７２株を生産培地（２．０％（ｗ／ｖ）グリセロール、２．０％（ｗ／ｖ）クエン酸・Ｈ２Ｏ（ｐＨ４．５）、１．０％（ｗ／ｖ）（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン・ＨＣｌ）を用い、３０℃で培養してえられたε−ポリ−Ｌ−リジンの重合度（１３〜３５程度）よりやや低く、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する。
本発明の低中重合度ポリリジンは、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを９０％以上の分率で含有することが好ましく、更に重合度１５〜３０のε−ポリ−Ｌ−リジンを７０％以上の高い分率で含有することが好ましい。ここで、該分率は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のチャートから求めた面積％である。
また、本発明の低中重合度ポリリジンは、数平均分子量が３０００から３５００（高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のチャートから算出）であることが好ましい。上記の分率や数平均分子量が上記の範囲であれば、該ポリリジンを食品添加物として使用する際に苦みが少ない。
【００１６】
ε−ポリ−Ｌ−リジンを食品添加物として食品に添加した際の苦みの低減については、通常ε−ポリ−Ｌ−リジンの生産菌として用いられるＮｏ．３４６−Ｄ株が生産するε−ポリ−Ｌ−リジン（重合度１３〜３５）よりも低い重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に含めば、苦み低減の効果が認められる。
【００１７】
本発明の菌株は培養条件の操作により、重合度１０〜３３、更に重合度１５〜３０のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ポリリジンを著量に生産することができる。その結果、本菌株が生産する低中重合度ポリリジンはＮｏ．３４６−Ｄ株やＳＰ−７２株が生産するε−ポリ−Ｌ−リジンよりも平均重合度がやや低い。
培養液中の低中重合度ポリリジンは、後記実施例１(1)(c)に記載した方法により測定することができる。
【００１８】
本発明菌株のうち、低中重合度ポリリジンを生産するストレプトマイセス・セルロフラヴスＵＳＥ−３１株（Streptomyces celluloflavus）（以下、ＵＳＥ−３１株という）は、後記実施例１に示すスクリーニングによって低中重合度ポリリジンの生産性を指標として土壌から単離されたものである。
【００１９】
国際ストレプトマイセス プロジェクト（ＩＳＰ）基準に基づいて調査したＵＳＥ−３１株の菌学的性質は以下の通りである。尚、％は特に断りのない限り％（ｗ／ｖ）である。
（１）形態学的性質
酵母エキス・麦芽エキス寒天培地（ISP Medium 2）上で２８℃、１〜２週間生育したＵＳＥ−３１株の気菌糸及び基生菌糸を顕微鏡で観察した結果を次に示す。
胞子形成菌糸の分枝法及び形態：らせん(渦巻き)状。
【００２０】
（２）各種培地における気菌糸、基生菌糸の色と溶解生色素の生産
下記表１に示す３種の培地における２８℃で２週間培養後の観察結果である。また、これらの培地において淡黄色の溶解性色素の産出が見られた。
【００２１】
【表１】
【００２２】
イースト・麦芽寒天(ISP 2)
１．０％ バクト・麦芽エキス（Bacto Malt Extract）
０．４％ バクト・酵母エキス（Bacto Yeast Extract)
０．４％ グルコース（Glucose）
２．０％ バクト・アガー（Bacto Agar)
ｐＨ ７．０
【００２３】
オートミール寒天(ISP 3)
２．４％ バクト・オートミールアガー、脱水品
（Bacto Oatmeal Agar,Dehydrated）
０．０００１％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．０００１％ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
１．４％ バクト・アガー（Bacto Agar Difco社製)
ｐＨ ６．０±０．２
【００２４】
スターチ・無機塩寒天(ISP 4)
１．０％ バクト・可溶性澱粉（Bacto Soluble Starch)
０．２％ ＣａＣＯ３
０．２％ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％ Ｋ２ＨＰＯ４
０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．１％ ＮａＣｌ
０．０００１％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．０００１％ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
０．０００１％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
２．０％ バクト・アガー（Bacto Agar)
ｐＨ ７．０
【００２５】
（３）生理的性質
i)細胞壁組成：細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸の型についてスタネック（Staneck）らの方法(アプライド・マイクロバイオロジー（Applied Microbiology）第２８巻第２２６頁（１９７４年）参照）により分析した結果、Ｌ，Ｌ型であった。
【００２６】
ii)９種炭素源の同化性をキュスター（Kuester）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Int.J.Syst.Bacteriol.）第２２巻 第１３９頁（１９７２）参照）により調べた結果を表２に示した。
【００２７】
【表２】
注）＋：同化する、−：同化しない。
【００２８】
iii)メラニン様色素の生成（ペプトン・イースト鉄寒天(ISP Medium 6)：なし、チロシン寒天培地(ISP Medium ７)：なし。）
【００２９】
ペプトン・イースト鉄寒天(ISP Medium 6)
１．５％ バクト・ペプトン（Bacto Peptone)
０．５％ バクト・プロテオーゼ・ペプトン
（Bacto Proteose Peptone）
０．１％ Ｋ２ＨＰＯ４
０．１％ バクト・酵母エキス（Bacto Yeast Extract)
０．０５％ クエン酸アンモニウム鉄(III)−褐色
（Ammonium Iron(III)Citrate,Brown）
０．０１２６％ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３・５Ｈ２Ｏ
１．５％ バクト・アガー（Bacto Agar）
ｐＨ ７．２
【００３０】
チロシン寒天 (ISP Medium ７)
１．５％ グリセロール（Glycerol）
０．０５％ Ｌ−チロシン（L-Tyrosine）
０．１１４％ Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ（L-asparagine・Ｈ２Ｏ）
０．０５％ Ｋ２ＨＰＯ４
０．０５％ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ
０．０５％ ＮａＣｌ
０．００１１３６％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．０００２８５％ Ｈ３ＢＯ３
０．０００１８％ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
０．０００２１％ (+)−酒石酸ナトリウム２水和物
（Sodium(+)-tartrate・２Ｈ２Ｏ）
０．０００００４％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
０．０００００２７％ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
０．０００００２５％ Ｎａ２Ｍｏ４Ｏ４・２Ｈ２Ｏ
０．０００００２％ ＺｎＣｌ２
２．０％ バクト・アガー（Bacto Agar Difco社製）
ｐＨ ７．２
【００３１】
上記の菌学的性質、特に形態学的性質及び細胞壁のジアミノピメリン酸の型等から、ＵＳＥ−３１株はストレプトマイセス属に属すると判定される。Ｅ.キュスター（E.Kuester）のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Intern. J. Syst. Bacteriol.）第２２巻第１３９頁−１４８頁（１９７２年）及びＰ.ケムファー（P.K舂pher）らのジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（J.Gen.Microbiol.）第１３７巻第１８３１頁−第１８９１頁（１９９１年）を参照して類縁菌種を検索し、更にバージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）第２４５２頁−第２４９２頁並びにＥ．Ｂ．シーリング（E. B. Shirling）及びＤ．ゴットリーブ（D. Gottlieb）のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Intern. J. Syst. Bacteriol.）第２２巻第２７１頁−第２７３頁（１９７２年）を参照して類縁菌種を検索したところ、本発明菌株は、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）あるいはストレプトマイセス・カスガエンシス（Streptomyces kasugaensis）に属すると同定されたが、そのどちらであるのかは菌学的性質からだけでは決定が困難であった。
【００３２】
そこで本発明菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分遺伝子配列を分析した。すなわち、本発明菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡをＰＣＲで増幅し、初めから５００番目までの塩基配列を決定した。次いでドイツの菌株保存・分譲機関ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）のストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）のタイプカルチャーであるＤＳＭ ４０８３９Ｔ 及び同ストレプトマイセス・カスガエンシス（Streptomyces kasugaensis）のタイプカルチャーであるＤＳＭ ４０８１９Ｔの１６Ｓ ｒＲＮＡの５００塩基までの部分遺伝子配列と比較した。
【００３３】
その結果、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）のタイプカルチャーとは１００％の相同性を示し、同ストレプトマイセス・カスガエンシス（Streptomyces kasugaensis）のタイプカルチャーとも１００％の相同性を示した。ストレプトマイセス属の場合は他の多くの細菌の場合と異なり、この方法で種のレベルまで同定することは不可能であることが知られている。本発明菌株の場合もそうであると思われる。
【００３４】
そこで次に、本発明菌株のリボソームのＲＮＡをコードしている遺伝子の制限酵素による切断パターン（リボプリント）を比較検討した。その結果、本発明菌株はストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）と０．７１という高い相関性を有していた。同ストレプトマイセス・ヘルバリカラー（Streptomyces herbaricolor）との相関性は０．４９という低い値であった。以上全ての結果を総合して、本発明菌株はストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）と同定し、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株と命名した。ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株は、独立行政法人 産業技術総合研究所に２００４年２月２日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９９６０が付与されている。
【００３５】
また、本発明菌株にはＵＳＥ−３１株と同等以上に低中重合度ポリリジンを生産する性質（好ましくは本発明菌株の上記の好ましい性質）を有する限り、ＵＳＥ−３１株の変異株も包含される。ＵＳＥ−３１株の変異株とは、ＵＳＥ−３１株に変異処理をして誘導することのできる低中重合度ポリリジン生産性変異株またはＵＳＥ−３１株の自然突然変異株を意味する。
【００３６】
ＵＳＥ−３１株の変異株は、ＵＳＥ−３１株の細胞を変異誘発処理することによって得られる変異株やＵＳＥ−３１株の自然突然変異株を、ε−ポリ−Ｌ−リジン（以下「ポリリジン」ということがある。）を生産する性質等を指標としてスクリーニングすることによって得られる。変異誘発処理としては、紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異誘発物質による処理が挙げられる。ポリリジンを生産する性質等を指標とするスクリーニングは、例えば、後記実施例１に記載された方法によって行うことができる。
【００３７】
＜２＞本発明の製造方法
本発明製造方法は、本発明菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低中重合度ポリリジンを採取することを特徴とする。本発明菌株は、好ましくは、ＵＳＥ−３１株である。
【００３８】
液体培地は、炭素源、窒素源、無機塩及びその他の栄養物が含まれていれば、いかなるものでもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、スターチ等が挙げられ、その含有量は０．１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸等の有機化合物や、硫酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩等が挙げられ、その含有量は０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。液体培地は、好ましくは炭素源としてブドウ糖またはグリセロールを含み、窒素源として硫酸アンモニウムまたは酵母エキスもしくはペプトンを含むものである。無機塩としては、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオン等を与えるものが挙げられる。
【００３９】
培養は、好気的条件下で振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。培養温度は２０〜４０℃が好ましい。培地のｐＨは３〜８が好ましい。培養期間は、通常には、１〜１０日であるが、本発明菌株では、それ以上の期間、培養を続けることができる。培養途中で、炭素源、窒素源を逐次添加してもよい。また、Ｌ−リジンを液体培地に添加することが好ましく、その量は通常０．１〜２％（ｗ／ｖ）である。また、クエン酸、リンゴ酸を添加することは好ましく、その量は通常０．１〜５％(ｗ／ｖ)である。このような培養により、培養液中に低中重合度ポリリジンが生成蓄積する。
【００４０】
培養液中に著量生成蓄積した低中重合度ポリリジンの採取は、培養液から遠心分離やフィルター濾過で菌体を除き、得られる菌体除去液から公知の方法により低中重合度ポリリジンを単離することによって行うことができる。具体的には、例えば、菌体除去液をアニオン交換樹脂のカラムを通して不純物の大部分を除き、更にカチオン交換樹脂のカラムを通して精製し、濃縮する。得られる濃縮液からアセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することにより低中重合度ポリリジンが得られる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。
実施例１
（低中重合度のポリリジン生産菌の取得）
(1) 低中重合度ポリリジン生産菌のスクリーニング
(a) 土壌からの分離方法
土壌１ｇ（湿重量）を滅菌した生理食塩水（１０ｍｌ）に懸濁し、３０℃で振とう（２００ｒｐｍで１０分間）、静置（３０分間）後、上澄液を生理食塩水で希釈し、この希釈液を放線菌分離用培地（培地１）に塗布した。これを２８℃で２週間程度培養し、生育した放線菌のコロニーを酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（培地２）に植継ぎ、単離、保存した。
【００４２】
(b)低中重合度ポリリジンの生産
分離・取得した放線菌について、まず生育培地（培地３）で菌体を十分に生育させた（３０℃、４２時間）後、遠心分離で無菌的に培地を除き菌体を回収した。次に、回収した菌体を生産培地（培地４）に懸濁し、３０℃で振とう培養した。
【００４３】
(c)低中重合度ポリリジンの検出・測定
分離・取得株を生産培地（培地４）を用い、３０℃で６日間培養後、培養液を遠心分離して菌体を除いた上澄液について、ポリリジンの検出・測定を行った。ポリリジンの検出はイツアキ（Itzhaki）（アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）第５０巻第５６９頁）の方法によった。すなわち、培養上澄液０．５ｍｌと１ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）メチルオレンジ及び５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）の水溶液２ｍｌとを混合し、室温で３０分間放置後、生じたポリリジン−メチルオレンジコンプレックスを遠心分離により除き、その上澄水の吸光度（４７０ｎｍ）を測定して、既知濃度のポリリジン溶液を用いて作成した標準曲線より培養液中のポリリジン量を求めた。
【００４４】
上記培地１〜４の組成を下記に示す。表中、「％」は、％（ｗ／ｖ）である。
培地１ 放線菌分離用培地（Glycerol-Czapek培地）
グリセロール ０．３％
ＮａＮＯ３ ０．２％
Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０） ０．１％
ＫＣｌ ０．０５％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％
寒天 １．５％
シクロヘキシミド ５０μｇ／ｍｌ
ナイスタチン ５０μｇ／ｍｌ
【００４５】
培地２ 酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（ISP Mediumu 2）
酵母エキス ０．４％
麦芽エキス １．０％
グルコース ０．４％
寒天 １．５％
ｐＨ ７．２
【００４６】
培地３ 生育培地
グリセロール ２．０％
酵母エキス ０．５％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％
ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．８） １／５０Ｍ
【００４７】
培地４ 生産培地
グリセロール ３．０％
クエン酸・Ｈ２Ｏ（ｐＨ４．５） １．０％
（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０％
Ｌ−リジン・ＨＣｌ ０．２％
【００４８】
上記の検出方法によりポリリジン生産菌を土壌よりスクリーニングした結果、滋賀県神崎郡山地の土壌より、低中重合度ポリリジンを生産するポリリジン生産菌を分離・取得した。
【００４９】
(2)取得株の菌学的性質
分離・取得株の形態学的性質、各種培地上における生育状態及び生理的性質を調べたところ、上述のような性質が認められた。
本菌株は、形態学的特徴や細胞壁のジアミノピメリン酸タイプ等からストレプトマイセス属と判定された。次いで、ストレプトマイセス属の種に関する既知の同定法に従い、上記の如く、種々の試験を行い、本発明菌株はストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）と同定した。本菌株は、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株と命名され、独立行政法人 産業技術総合研究所に２００４年２月２日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０が付与されている。
【００５０】
(3)ＵＳＥ−３１株の生産物の確認
ＵＳＥ−３１株を生産培地（培地４）を用い、３０℃で６日間培養後、培養ろ液をメタノール：アセトン（３：１）の混合液で沈殿させ回収した（４０〜６７％画分）。次に回収したメタノール：アセトン（３：１）の混合液沈殿画分を陽イオン交換カラム（ＴＳＫgel ＣＭ−５ＰＷ）を用いて精製し、精製物が電気泳動的に均一になることを確認した。次に、この精製物を6M塩酸で加水分解し、加水分解物についてアミノ酸分析を行った。アミノ酸分析の方法は、加水分解物のアミノ基を前もってＤＡＢＳ（dimethylaminoazobenzenesulfonyl-）化し、液体クロマトグラフィー（アミノクロームアミノ酸分析システム）を用いて分析を行った。
【００５１】
アミノ酸分析の結果、ＵＳＥ−３１株の生産物はリジンを唯一の構成アミノ酸とするポリペプチドすなわちポリリジンであることが確認された。
また、該ポリリジンの重合度を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のイオン会合クロマトグラフィー法によって逆相カラム（ＴＳＫgel ＯＤＳ−８０Ｔｓ）を用いて、非水溶媒としてアセトニトリルを用いてグラジエントをかけながら測定した。その結果、該ポリリジンは、重合度が従来の１３〜３５程度よりやや低く、重合度１０〜３３のポリリジンを９７．８％、重合度１５〜３０のポリリジンを７６．８％の高い分率で含有する低中重合度ポリリジンであった。重合度検定の基準とするために化学合成して得た重合度５及び１０のε−ポリ−Ｌ−リジンのピーク位置を基準にしてＸ軸（横軸）を定めた結果を図１に示す。図１より数平均分子量は３０００と算出された。
【００５２】
更に、該ポリリジンは、ε−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解するタンパク質分解酵素（Aspergillus oryzae由来のプロテアーゼＡ；天野製薬）により分解された。一方、α−ポリアミド結合したα−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解する酵素トリプシンでは加水分解されなかった。
【００５３】
該ポリリジンの抗菌活性をペーパーディスク法で調べたところ、グラム陽性細菌であるBacillus brevis(ＩＦＯ ３３３１)及びグラム陰性細菌であるEscherichia coli Ｋ−１２（ＩＦＯ ３３０１）に対してStreptomyces albulus Ｎｏ．３４６−Ｄ株やＳＰ−７２株由来のポリリジンと同程度の抗菌活性を有していた。
【００５４】
実施例２
ＵＳＥ−３１株の低中重合度ポリリジン生産性
ＵＳＥ−３１株を生育培地（培地３）で坂口フラスコ（１００ｍｌ培地／５００ｍｌ容）を用いて３０℃で４０時間培養した後、遠心分離で菌体を回収した。回収した菌体を生理的食塩水で１回洗浄後、生産培地（培地４）に移し、坂口フラスコ（１００ｍｌ培地／５００ｍｌ容）を用いて３０℃で培養した。この培養中に採取した培養上澄液の低中重合度ポリリジン濃度を前記の方法により測定した。
７日間の培養では、ＵＳＥ−３１株は１．５０ｇ／ｌの生産性を示した。
【００５５】
実施例３
ジャーファーメンターでのＵＳＥ−３１株による低中重合度ポリリジンの生産
ＵＳＥ−３１株を５Ｌ容のジャーファーメンターで培養し、ポリリジンを生産させた。すなわち、ＵＳＥ−３１株を実施例１記載の培地２（ISP Medium 2）で３週間培養後、プレート３枚分を２Ｌの培地２（ISP Medium 2）を有する5L容ジャーファーメンターで、回転数２００ｒｐｍ、通気量２ｌ／ｍｉｎ、３０℃において培養した。培地のｐＨが４に下がった時点でクエン酸を加え、ｐＨを４に保ち、通気量を４．５ｌ／ｍｉｎに上げ、６日間、回転数と温度をそれぞれ、２００ｒｐｍと３０℃に保ちながら培養を続けた。６日後、遠心分離（７０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）により、菌体を除去しメチルオレンジ法でポリマーの生成量を求めた。結果は４．２ｇ／ｌであった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の低中重合度ポリリジンは、苦みが少ないため食品添加物として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＵＳＥ−３１株が生産する低中重合度ポリリジンのイオン会合クロマトグラムの結果。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産しうる製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ε−ポリ−Ｌ−リジンは、Ｌ−リジンのε位のアミノ基が、隣り合うＬ−リジンのカルボン酸基とアミド結合で結合したイソペプチドである。ε−ポリ−Ｌ−リジンは、必須アミノ酸であるＬ−リジンのポリマーであるため、安全性が高く、また、カチオン含量が高いので特異な物性を有する。したがってトイレタリー用品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電子材料等の用途が期待できる。特に、食品添加物の分野では、天然物系の添加物として注目されている。
【０００３】
ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法としては、ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株を培地にて培養し、得られた培養物からε−ポリ−Ｌ−リジンを採取する方法が知られている。このような方法に使用される菌株としては、ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピーシズ・リジノポリメラス（Streptomyces albulus subsp. Lysinopolymerus）Ｎｏ．３４６−Ｄ株（微工研菌寄第３８３４号）（以下、Ｎｏ．３４６−Ｄ株という。）（例えば特許文献１参照）、Ｎｏ．３４６−Ｄ株のＳ−アミノエチル−Ｌ−システイン耐性変異株である１１０１１Ａ−１株（微工研条寄第１１０９号）（例えば、特許文献２参照）、Ｎｏ．３４６−Ｄ株のプラスミド増幅変異株である５０８３３株（微工研条寄第１１１０号）（例えば、特許文献３及び４参照）、高濃度のＳ−アミノエチル−Ｌ−システインに対して耐性を有する、１１０１１Ａ−１株の変異株であるＢ２１０２１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５９２６）（例えば、特許文献５参照）、ストレプトマイセス・ノールセイ（Streptomyces noursei）に属する菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−９７９７）（例えば、特許文献６参照）、ストレプトマイセス・スピーシズ（Streptomyces sp.）ＳＰ−７２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８１０）（以下ＳＰ−７２株という。）（例えば、特許文献７参照）、ストレプトマイセス・スピーシズ（Streptomyces sp.）ＳＰ−６６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７２２３）（例えば、特許文献７参照）、ストレプトマイセス・ヘルバリカラー（Streptomyces herbaricolor）ＳＰ−１３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７８４５）（例えば、特許文献９参照）、ストレプトマイセス・アルブルス・サブスピーシズ（Streptomyces albulus subsp.）ＳＰ−２５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７９８８）（例えば、特許文献１０参照）、ストレプトマイセス・ラベンデュラエ（Streptomyces lavendulae）ＵＳＥ−５３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３０５）（例えば、特許文献１１参照）、ストレプトマイセス・スピーシズ（Streptomyces sp.）ＵＳＥ−５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６１）（例えば、特許文献１２参照）、ストレプトマイセス・スピーシズ（Streptomyces sp.）ＵＳＥ−１３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６２）（例えば、特許文献１３参照）が知られている。
【０００４】
しかしながら前述の菌株を用いて生産したε−ポリ−Ｌ−リジンを食品添加物として使用する際、使用量に応じて苦みが増す傾向があった。そこで苦みを低減できる重合度８、９から２０余程度のε−ポリ−Ｌ−リジンが好まれ、そうしたε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた製造法が知られている。（例えば、特許文献８、９及び特許文献１２参照）また、重合度１０〜１０余のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びそれを用いた低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法も報告されている（例えば、特許文献１０参照）。しかし、これらの菌株のε−ポリ−Ｌ−リジン生産量は、同一の培養条件で比較した場合、重合度１３〜３５程度（数平均分子量約３５００）のε−ポリ−Ｌ−リジンを生産するＳＰ−７２株（例えば、特許文献７参照）やＵＳＥ−１３株（例えば、特許文献１３参照）の生産量よりも相当低い。そこで、重合度１３〜３５程度のε−ポリ−Ｌ−リジンの生産菌と同程度の著量の低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する菌株及びε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法が望まれている。
【０００５】
【特許文献１】特公昭５９−２０３５９号公報
【特許文献２】特公平３−４２０７０号公報
【特許文献３】特公平３−４２０７５号公報
【特許文献４】特公平６−７５５０１号公報
【特許文献５】特開平９−１７３０５７号公報
【特許文献６】特開平１−１８７０９０号公報
【特許文献７】特開２０００−０６９９８８号公報
【特許文献８】特開２００１−０１７１５９号公報
【特許文献９】特開２００２−９５４６６号公報
【特許文献１０】特開２００２−９５４６７号公報
【特許文献１１】特開２００３−５２３５８号公報
【特許文献１２】特開２００５−６５６１号公報
【特許文献１３】特開２００５−６５６２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、例えば、食品添加物として使用する際に苦みが少ない重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産する新規な菌株、及び該菌株を用いた発酵法による低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は前述の従来技術の問題点に鑑み、鋭意研究を重ねた。その結果、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）及びその変異株であれば、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は下記の（１）〜（４）の構成を有する。
（１）低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）。
【０００９】
（２）低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）の変異株。
【００１０】
（３）低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを９０％以上の高い分率で含有することを特徴とする前記（１）または（２）項記載の菌株。
【００１１】
（４）前記（１）〜（３）項のいずれか１項記載の菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とする低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【００１２】
（５）低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを９０％以上の高い分率で含有することを特徴とする前記（４）項記載の低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の菌株を用いれば、重合度１０〜３３、特に重合度１５〜３０のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産することができる。該菌株を用いた本発明の製造方法であれば、著量の低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
＜１＞本発明の菌株
本発明の菌株は、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）またはその変異株であり、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジン、特に重合度１５〜３０のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産する性質を有する。低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産するとは、採取可能な量の低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産することを意味し、著量に生産するとは、ここでは少なくとも１ｇ／ｌ以上のε−ポリ−Ｌ−リジンを培養液中に生成することを意味する。
【００１５】
本発明でいう低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジン（以下、「低中重合度ポリリジン」ともいう）とは、Ｎｏ．３４６−Ｄ株やＳＰ−７２株を生産培地（２．０％（ｗ／ｖ）グリセロール、２．０％（ｗ／ｖ）クエン酸・Ｈ２Ｏ（ｐＨ４．５）、１．０％（ｗ／ｖ）（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン・ＨＣｌ）を用い、３０℃で培養してえられたε−ポリ−Ｌ−リジンの重合度（１３〜３５程度）よりやや低く、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する。
本発明の低中重合度ポリリジンは、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを９０％以上の分率で含有することが好ましく、更に重合度１５〜３０のε−ポリ−Ｌ−リジンを７０％以上の高い分率で含有することが好ましい。ここで、該分率は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のチャートから求めた面積％である。
また、本発明の低中重合度ポリリジンは、数平均分子量が３０００から３５００（高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のチャートから算出）であることが好ましい。上記の分率や数平均分子量が上記の範囲であれば、該ポリリジンを食品添加物として使用する際に苦みが少ない。
【００１６】
ε−ポリ−Ｌ−リジンを食品添加物として食品に添加した際の苦みの低減については、通常ε−ポリ−Ｌ−リジンの生産菌として用いられるＮｏ．３４６−Ｄ株が生産するε−ポリ−Ｌ−リジン（重合度１３〜３５）よりも低い重合度のε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に含めば、苦み低減の効果が認められる。
【００１７】
本発明の菌株は培養条件の操作により、重合度１０〜３３、更に重合度１５〜３０のε−ポリ−Ｌ−リジンを高い分率で含有する低中重合度ポリリジンを著量に生産することができる。その結果、本菌株が生産する低中重合度ポリリジンはＮｏ．３４６−Ｄ株やＳＰ−７２株が生産するε−ポリ−Ｌ−リジンよりも平均重合度がやや低い。
培養液中の低中重合度ポリリジンは、後記実施例１(1)(c)に記載した方法により測定することができる。
【００１８】
本発明菌株のうち、低中重合度ポリリジンを生産するストレプトマイセス・セルロフラヴスＵＳＥ−３１株（Streptomyces celluloflavus）（以下、ＵＳＥ−３１株という）は、後記実施例１に示すスクリーニングによって低中重合度ポリリジンの生産性を指標として土壌から単離されたものである。
【００１９】
国際ストレプトマイセス プロジェクト（ＩＳＰ）基準に基づいて調査したＵＳＥ−３１株の菌学的性質は以下の通りである。尚、％は特に断りのない限り％（ｗ／ｖ）である。
（１）形態学的性質
酵母エキス・麦芽エキス寒天培地（ISP Medium 2）上で２８℃、１〜２週間生育したＵＳＥ−３１株の気菌糸及び基生菌糸を顕微鏡で観察した結果を次に示す。
胞子形成菌糸の分枝法及び形態：らせん(渦巻き)状。
【００２０】
（２）各種培地における気菌糸、基生菌糸の色と溶解生色素の生産
下記表１に示す３種の培地における２８℃で２週間培養後の観察結果である。また、これらの培地において淡黄色の溶解性色素の産出が見られた。
【００２１】
【表１】
【００２２】
イースト・麦芽寒天(ISP 2)
１．０％ バクト・麦芽エキス（Bacto Malt Extract）
０．４％ バクト・酵母エキス（Bacto Yeast Extract)
０．４％ グルコース（Glucose）
２．０％ バクト・アガー（Bacto Agar)
ｐＨ ７．０
【００２３】
オートミール寒天(ISP 3)
２．４％ バクト・オートミールアガー、脱水品
（Bacto Oatmeal Agar,Dehydrated）
０．０００１％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．０００１％ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
１．４％ バクト・アガー（Bacto Agar Difco社製)
ｐＨ ６．０±０．２
【００２４】
スターチ・無機塩寒天(ISP 4)
１．０％ バクト・可溶性澱粉（Bacto Soluble Starch)
０．２％ ＣａＣＯ３
０．２％ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％ Ｋ２ＨＰＯ４
０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．１％ ＮａＣｌ
０．０００１％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．０００１％ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
０．０００１％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
２．０％ バクト・アガー（Bacto Agar)
ｐＨ ７．０
【００２５】
（３）生理的性質
i)細胞壁組成：細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸の型についてスタネック（Staneck）らの方法(アプライド・マイクロバイオロジー（Applied Microbiology）第２８巻第２２６頁（１９７４年）参照）により分析した結果、Ｌ，Ｌ型であった。
【００２６】
ii)９種炭素源の同化性をキュスター（Kuester）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Int.J.Syst.Bacteriol.）第２２巻 第１３９頁（１９７２）参照）により調べた結果を表２に示した。
【００２７】
【表２】
注）＋：同化する、−：同化しない。
【００２８】
iii)メラニン様色素の生成（ペプトン・イースト鉄寒天(ISP Medium 6)：なし、チロシン寒天培地(ISP Medium ７)：なし。）
【００２９】
ペプトン・イースト鉄寒天(ISP Medium 6)
１．５％ バクト・ペプトン（Bacto Peptone)
０．５％ バクト・プロテオーゼ・ペプトン
（Bacto Proteose Peptone）
０．１％ Ｋ２ＨＰＯ４
０．１％ バクト・酵母エキス（Bacto Yeast Extract)
０．０５％ クエン酸アンモニウム鉄(III)−褐色
（Ammonium Iron(III)Citrate,Brown）
０．０１２６％ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３・５Ｈ２Ｏ
１．５％ バクト・アガー（Bacto Agar）
ｐＨ ７．２
【００３０】
チロシン寒天 (ISP Medium ７)
１．５％ グリセロール（Glycerol）
０．０５％ Ｌ−チロシン（L-Tyrosine）
０．１１４％ Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ（L-asparagine・Ｈ２Ｏ）
０．０５％ Ｋ２ＨＰＯ４
０．０５％ ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ
０．０５％ ＮａＣｌ
０．００１１３６％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．０００２８５％ Ｈ３ＢＯ３
０．０００１８％ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ
０．０００２１％ (+)−酒石酸ナトリウム２水和物
（Sodium(+)-tartrate・２Ｈ２Ｏ）
０．０００００４％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ
０．０００００２７％ ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ
０．０００００２５％ Ｎａ２Ｍｏ４Ｏ４・２Ｈ２Ｏ
０．０００００２％ ＺｎＣｌ２
２．０％ バクト・アガー（Bacto Agar Difco社製）
ｐＨ ７．２
【００３１】
上記の菌学的性質、特に形態学的性質及び細胞壁のジアミノピメリン酸の型等から、ＵＳＥ−３１株はストレプトマイセス属に属すると判定される。Ｅ.キュスター（E.Kuester）のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Intern. J. Syst. Bacteriol.）第２２巻第１３９頁−１４８頁（１９７２年）及びＰ.ケムファー（P.K舂pher）らのジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（J.Gen.Microbiol.）第１３７巻第１８３１頁−第１８９１頁（１９９１年）を参照して類縁菌種を検索し、更にバージェイズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）第２４５２頁−第２４９２頁並びにＥ．Ｂ．シーリング（E. B. Shirling）及びＤ．ゴットリーブ（D. Gottlieb）のインターナショナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Intern. J. Syst. Bacteriol.）第２２巻第２７１頁−第２７３頁（１９７２年）を参照して類縁菌種を検索したところ、本発明菌株は、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）あるいはストレプトマイセス・カスガエンシス（Streptomyces kasugaensis）に属すると同定されたが、そのどちらであるのかは菌学的性質からだけでは決定が困難であった。
【００３２】
そこで本発明菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡの部分遺伝子配列を分析した。すなわち、本発明菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡをＰＣＲで増幅し、初めから５００番目までの塩基配列を決定した。次いでドイツの菌株保存・分譲機関ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）のストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）のタイプカルチャーであるＤＳＭ ４０８３９Ｔ 及び同ストレプトマイセス・カスガエンシス（Streptomyces kasugaensis）のタイプカルチャーであるＤＳＭ ４０８１９Ｔの１６Ｓ ｒＲＮＡの５００塩基までの部分遺伝子配列と比較した。
【００３３】
その結果、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）のタイプカルチャーとは１００％の相同性を示し、同ストレプトマイセス・カスガエンシス（Streptomyces kasugaensis）のタイプカルチャーとも１００％の相同性を示した。ストレプトマイセス属の場合は他の多くの細菌の場合と異なり、この方法で種のレベルまで同定することは不可能であることが知られている。本発明菌株の場合もそうであると思われる。
【００３４】
そこで次に、本発明菌株のリボソームのＲＮＡをコードしている遺伝子の制限酵素による切断パターン（リボプリント）を比較検討した。その結果、本発明菌株はストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）と０．７１という高い相関性を有していた。同ストレプトマイセス・ヘルバリカラー（Streptomyces herbaricolor）との相関性は０．４９という低い値であった。以上全ての結果を総合して、本発明菌株はストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）と同定し、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株と命名した。ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株は、独立行政法人 産業技術総合研究所に２００４年２月２日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭＰ−１９９６０が付与されている。
【００３５】
また、本発明菌株にはＵＳＥ−３１株と同等以上に低中重合度ポリリジンを生産する性質（好ましくは本発明菌株の上記の好ましい性質）を有する限り、ＵＳＥ−３１株の変異株も包含される。ＵＳＥ−３１株の変異株とは、ＵＳＥ−３１株に変異処理をして誘導することのできる低中重合度ポリリジン生産性変異株またはＵＳＥ−３１株の自然突然変異株を意味する。
【００３６】
ＵＳＥ−３１株の変異株は、ＵＳＥ−３１株の細胞を変異誘発処理することによって得られる変異株やＵＳＥ−３１株の自然突然変異株を、ε−ポリ−Ｌ−リジン（以下「ポリリジン」ということがある。）を生産する性質等を指標としてスクリーニングすることによって得られる。変異誘発処理としては、紫外線照射やＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異誘発物質による処理が挙げられる。ポリリジンを生産する性質等を指標とするスクリーニングは、例えば、後記実施例１に記載された方法によって行うことができる。
【００３７】
＜２＞本発明の製造方法
本発明製造方法は、本発明菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低中重合度ポリリジンを採取することを特徴とする。本発明菌株は、好ましくは、ＵＳＥ−３１株である。
【００３８】
液体培地は、炭素源、窒素源、無機塩及びその他の栄養物が含まれていれば、いかなるものでもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、スターチ等が挙げられ、その含有量は０．１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましい。窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸等の有機化合物や、硫酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩等が挙げられ、その含有量は０．１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。液体培地は、好ましくは炭素源としてブドウ糖またはグリセロールを含み、窒素源として硫酸アンモニウムまたは酵母エキスもしくはペプトンを含むものである。無機塩としては、リン酸イオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、硫酸イオン等を与えるものが挙げられる。
【００３９】
培養は、好気的条件下で振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。培養温度は２０〜４０℃が好ましい。培地のｐＨは３〜８が好ましい。培養期間は、通常には、１〜１０日であるが、本発明菌株では、それ以上の期間、培養を続けることができる。培養途中で、炭素源、窒素源を逐次添加してもよい。また、Ｌ−リジンを液体培地に添加することが好ましく、その量は通常０．１〜２％（ｗ／ｖ）である。また、クエン酸、リンゴ酸を添加することは好ましく、その量は通常０．１〜５％(ｗ／ｖ)である。このような培養により、培養液中に低中重合度ポリリジンが生成蓄積する。
【００４０】
培養液中に著量生成蓄積した低中重合度ポリリジンの採取は、培養液から遠心分離やフィルター濾過で菌体を除き、得られる菌体除去液から公知の方法により低中重合度ポリリジンを単離することによって行うことができる。具体的には、例えば、菌体除去液をアニオン交換樹脂のカラムを通して不純物の大部分を除き、更にカチオン交換樹脂のカラムを通して精製し、濃縮する。得られる濃縮液からアセトン、エタノール等の有機溶媒で晶析することにより低中重合度ポリリジンが得られる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。
実施例１
（低中重合度のポリリジン生産菌の取得）
(1) 低中重合度ポリリジン生産菌のスクリーニング
(a) 土壌からの分離方法
土壌１ｇ（湿重量）を滅菌した生理食塩水（１０ｍｌ）に懸濁し、３０℃で振とう（２００ｒｐｍで１０分間）、静置（３０分間）後、上澄液を生理食塩水で希釈し、この希釈液を放線菌分離用培地（培地１）に塗布した。これを２８℃で２週間程度培養し、生育した放線菌のコロニーを酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（培地２）に植継ぎ、単離、保存した。
【００４２】
(b)低中重合度ポリリジンの生産
分離・取得した放線菌について、まず生育培地（培地３）で菌体を十分に生育させた（３０℃、４２時間）後、遠心分離で無菌的に培地を除き菌体を回収した。次に、回収した菌体を生産培地（培地４）に懸濁し、３０℃で振とう培養した。
【００４３】
(c)低中重合度ポリリジンの検出・測定
分離・取得株を生産培地（培地４）を用い、３０℃で６日間培養後、培養液を遠心分離して菌体を除いた上澄液について、ポリリジンの検出・測定を行った。ポリリジンの検出はイツアキ（Itzhaki）（アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）第５０巻第５６９頁）の方法によった。すなわち、培養上澄液０．５ｍｌと１ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）メチルオレンジ及び５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）の水溶液２ｍｌとを混合し、室温で３０分間放置後、生じたポリリジン−メチルオレンジコンプレックスを遠心分離により除き、その上澄水の吸光度（４７０ｎｍ）を測定して、既知濃度のポリリジン溶液を用いて作成した標準曲線より培養液中のポリリジン量を求めた。
【００４４】
上記培地１〜４の組成を下記に示す。表中、「％」は、％（ｗ／ｖ）である。
培地１ 放線菌分離用培地（Glycerol-Czapek培地）
グリセロール ０．３％
ＮａＮＯ３ ０．２％
Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０） ０．１％
ＫＣｌ ０．０５％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００１％
寒天 １．５％
シクロヘキシミド ５０μｇ／ｍｌ
ナイスタチン ５０μｇ／ｍｌ
【００４５】
培地２ 酵母エキス−麦芽エキス寒天培地（ISP Mediumu 2）
酵母エキス ０．４％
麦芽エキス １．０％
グルコース ０．４％
寒天 １．５％
ｐＨ ７．２
【００４６】
培地３ 生育培地
グリセロール ２．０％
酵母エキス ０．５％
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％
ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ６．８） １／５０Ｍ
【００４７】
培地４ 生産培地
グリセロール ３．０％
クエン酸・Ｈ２Ｏ（ｐＨ４．５） １．０％
（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．０％
Ｌ−リジン・ＨＣｌ ０．２％
【００４８】
上記の検出方法によりポリリジン生産菌を土壌よりスクリーニングした結果、滋賀県神崎郡山地の土壌より、低中重合度ポリリジンを生産するポリリジン生産菌を分離・取得した。
【００４９】
(2)取得株の菌学的性質
分離・取得株の形態学的性質、各種培地上における生育状態及び生理的性質を調べたところ、上述のような性質が認められた。
本菌株は、形態学的特徴や細胞壁のジアミノピメリン酸タイプ等からストレプトマイセス属と判定された。次いで、ストレプトマイセス属の種に関する既知の同定法に従い、上記の如く、種々の試験を行い、本発明菌株はストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）と同定した。本菌株は、ストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株と命名され、独立行政法人 産業技術総合研究所に２００４年２月２日に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０が付与されている。
【００５０】
(3)ＵＳＥ−３１株の生産物の確認
ＵＳＥ−３１株を生産培地（培地４）を用い、３０℃で６日間培養後、培養ろ液をメタノール：アセトン（３：１）の混合液で沈殿させ回収した（４０〜６７％画分）。次に回収したメタノール：アセトン（３：１）の混合液沈殿画分を陽イオン交換カラム（ＴＳＫgel ＣＭ−５ＰＷ）を用いて精製し、精製物が電気泳動的に均一になることを確認した。次に、この精製物を6M塩酸で加水分解し、加水分解物についてアミノ酸分析を行った。アミノ酸分析の方法は、加水分解物のアミノ基を前もってＤＡＢＳ（dimethylaminoazobenzenesulfonyl-）化し、液体クロマトグラフィー（アミノクロームアミノ酸分析システム）を用いて分析を行った。
【００５１】
アミノ酸分析の結果、ＵＳＥ−３１株の生産物はリジンを唯一の構成アミノ酸とするポリペプチドすなわちポリリジンであることが確認された。
また、該ポリリジンの重合度を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のイオン会合クロマトグラフィー法によって逆相カラム（ＴＳＫgel ＯＤＳ−８０Ｔｓ）を用いて、非水溶媒としてアセトニトリルを用いてグラジエントをかけながら測定した。その結果、該ポリリジンは、重合度が従来の１３〜３５程度よりやや低く、重合度１０〜３３のポリリジンを９７．８％、重合度１５〜３０のポリリジンを７６．８％の高い分率で含有する低中重合度ポリリジンであった。重合度検定の基準とするために化学合成して得た重合度５及び１０のε−ポリ−Ｌ−リジンのピーク位置を基準にしてＸ軸（横軸）を定めた結果を図１に示す。図１より数平均分子量は３０００と算出された。
【００５２】
更に、該ポリリジンは、ε−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解するタンパク質分解酵素（Aspergillus oryzae由来のプロテアーゼＡ；天野製薬）により分解された。一方、α−ポリアミド結合したα−ポリ−Ｌ−リジンを加水分解する酵素トリプシンでは加水分解されなかった。
【００５３】
該ポリリジンの抗菌活性をペーパーディスク法で調べたところ、グラム陽性細菌であるBacillus brevis(ＩＦＯ ３３３１)及びグラム陰性細菌であるEscherichia coli Ｋ−１２（ＩＦＯ ３３０１）に対してStreptomyces albulus Ｎｏ．３４６−Ｄ株やＳＰ−７２株由来のポリリジンと同程度の抗菌活性を有していた。
【００５４】
実施例２
ＵＳＥ−３１株の低中重合度ポリリジン生産性
ＵＳＥ−３１株を生育培地（培地３）で坂口フラスコ（１００ｍｌ培地／５００ｍｌ容）を用いて３０℃で４０時間培養した後、遠心分離で菌体を回収した。回収した菌体を生理的食塩水で１回洗浄後、生産培地（培地４）に移し、坂口フラスコ（１００ｍｌ培地／５００ｍｌ容）を用いて３０℃で培養した。この培養中に採取した培養上澄液の低中重合度ポリリジン濃度を前記の方法により測定した。
７日間の培養では、ＵＳＥ−３１株は１．５０ｇ／ｌの生産性を示した。
【００５５】
実施例３
ジャーファーメンターでのＵＳＥ−３１株による低中重合度ポリリジンの生産
ＵＳＥ−３１株を５Ｌ容のジャーファーメンターで培養し、ポリリジンを生産させた。すなわち、ＵＳＥ−３１株を実施例１記載の培地２（ISP Medium 2）で３週間培養後、プレート３枚分を２Ｌの培地２（ISP Medium 2）を有する5L容ジャーファーメンターで、回転数２００ｒｐｍ、通気量２ｌ／ｍｉｎ、３０℃において培養した。培地のｐＨが４に下がった時点でクエン酸を加え、ｐＨを４に保ち、通気量を４．５ｌ／ｍｉｎに上げ、６日間、回転数と温度をそれぞれ、２００ｒｐｍと３０℃に保ちながら培養を続けた。６日後、遠心分離（７０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ、４℃）により、菌体を除去しメチルオレンジ法でポリマーの生成量を求めた。結果は４．２ｇ／ｌであった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の低中重合度ポリリジンは、苦みが少ないため食品添加物として好適である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＵＳＥ−３１株が生産する低中重合度ポリリジンのイオン会合クロマトグラムの結果。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）。
【請求項２】
低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）の変異株。
【請求項３】
低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを９０％以上の高い分率で含有することを特徴とする請求項１または請求項２の菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とする低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【請求項５】
低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを９０％以上の高い分率で含有することを特徴とする請求項４記載の低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【請求項１】
低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）。
【請求項２】
低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを生産する性質を有するストレプトマイセス・セルロフラヴス（Streptomyces celluloflavus）ＵＳＥ−３１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９９６０）の変異株。
【請求項３】
低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを９０％以上の高い分率で含有することを特徴とする請求項１または請求項２の菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の菌株を液体培地中で培養し、培養液中に生成蓄積した低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴とする低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【請求項５】
低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンが、重合度１０〜３３のε−ポリ−Ｌ−リジンを９０％以上の高い分率で含有することを特徴とする請求項４記載の低中重合度ε−ポリ−Ｌ−リジンの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−２９６３０５（Ｐ２００６−２９６３０５Ａ）
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１２３２６８（Ｐ２００５−１２３２６８）
【出願日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【出願人】（５９８１１７９８６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２１日（２００５．４．２１）
【出願人】（０００００２０７１）チッソ株式会社 (658)
【出願人】（５９８１１７９８６）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]