低分子量コンドロイチン硫酸を含む医薬
【課題】 新規なＣＤ４４切断誘導剤、並びに関節炎治療剤を提供することを解決すべき課題とした。
【解決手段】 低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を含む、ＣＤ４４切断誘導剤。
【解決手段】 低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を含む、ＣＤ４４切断誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＣＤ４４切断誘導剤に関する。また本発明は、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする関節炎治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４４は１回膜貫通型糖蛋白質で、４つの機能的ドメインからなる。外側の細胞外ドメインは主にヒアルロン酸結合に関与する部位である。内側の細胞外ドメインは主に選択的スプライシングを受ける部位で、その結果、ＣＤ４４の多くのアイソフォームが合成される。ＣＤ４４の膜貫通ドメインはまさしく典型的な１回膜貫通型糖蛋白質の性質を示すが、界面活性剤可溶化ヒアルロン酸レセプターを用いた研究や、部位特異的変異導入法による研究から、この部位に相互作用する脂質や修飾膜蛋白質が細胞骨格とＣＤ４４の相互作用やヒアルロン酸結合をも調節することが示されている。ＣＤ４４は、ほとんどの細胞と組織に発現しているが、血小板、肝細胞、心筋、腎尿細管上皮、精巣、皮膚には発現していない。ＣＤ４４は、細胞凝集、細胞周囲のマトリックスの保持、マトリックス−細胞間のシグナリング、レセプターを介するヒアルロン酸の取り込み／分解や細胞遊走などを含む様々な細胞機能に関与することが知られている。これらの機能の制御には、特定のＣＤ４４アイソフォームの利用、ＣＤ４４の翻訳後修飾、細胞骨格に結合する中間系フィラメントのような他の蛋白とＣＤ４４の特異的結合などが関与している可能性がある。また、ＣＤ４４には切断機構（シェディング機構）が存在し、ＣＤ４４の切断により、リガンド結合によるＣＤ４４シグナル伝達は強く遮断されることが分かっている。
【０００３】
ＣＤ４４と関節炎との関連についてはこれまでに幾つかの報告がある。例えば、マウス関節炎モデルにおいて、ＣＤ４４シェディング誘発物質の投与により可溶性ＣＤ４４（ｓＣＤ４４）量が増加すること（非特許文献１）、並びにＣＤ４４シェディング誘発物質により関節炎治療効果があること（非特許文献２）が報告されている。また、ＣＤ４４シェディングを誘発する抗ＣＤ４４抗体の投与により関節炎の治療効果が見られることが報告されている（非特許文献３）。また、ＣＤ４４ノックアウトマウスでは関節炎の発症が抑制されていることが報告されている（非特許文献４）。さらに、慢性関節リウマチ患者において、滑液及び滑膜組織でＣＤ４４が高発現していること（非特許文献５）、及びｓＣＤ４４と重症度が相関していること（非特許文献６）が報告されている。
【０００４】
ＣＤ４４切断誘導剤としては、特許文献１には、低分子量ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＣＤ４４切断誘導剤及び細胞の移動促進剤が記載されている。また、特許文献１で言う「低分子量ヒアルロン酸」は、ヒアルロン酸２糖以上で、かつ重量平均分子量３０ｋＤ以下のものが好ましいことが記載されている。
【０００５】
一方、特許文献２には、４糖から８糖からなる糖化合物（コンドロイチン硫酸）がＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインとリガンドとの結合を調節し、炎症性疾患などを改善できることが記載されている。しかしながら、特許文献２には、コンドロイチン硫酸がＣＤ４４に及ぼす作用については何等記載がない。
【０００６】
【非特許文献１】Katoh S, J.Immunol 1994; 153(8): 3440
【非特許文献２】Mikecz K, Nat Med 1995; 186): 558
【非特許文献３】Mikecz K, Kim JH. Arthritis Rheum. 1999 Apr; 42(4): 659-68
【非特許文献４】Mikecz K, Arthritis Rheum. 2001; 44(12): 2922
【非特許文献５】Fujii K, Eto S, J Immunol 1999; 162(4); 2391
【非特許文献６】Haynes BF Arthritis Rheum. 1991; 34(11): 1434
【特許文献１】特開２００４−２３８２９４号公報
【特許文献２】特開２００４−５９５０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規なＣＤ４４切断誘導剤、並びに関節炎治療剤を提供することを解決すべき課題とした。本発明は、特に、吸収性が良好であり、かつ生体に対する安全性の高い物質を用いて、新規なＣＤ４４切断誘導剤、並びに関節炎治療剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、低分子量コンドロイチン硫酸が、ＣＤ４４の切断を誘導することを実証し、関節炎の治療に有効であることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を含む、ＣＤ４４切断誘導剤が提供される。
本発明のＣＤ４４切断誘導剤において、好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は重量平均分子量１０ｋＤ以下のコンドロイチン硫酸であり、さらに好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は重量平均分子量２〜３ｋＤのコンドロイチン硫酸である。好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は、ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されているＥ型コンドロイチン硫酸である。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を含む、関節炎治療剤が提供される。
好ましくは、関節炎は、慢性関節リウマチ又は変形性関節症による関節炎である。
好ましくは、関節炎は慢性の関節炎である。
好ましくは、本発明の関節炎治療剤は、ＣＤ４４が高発現している関節炎の治療のために使用される。
【００１１】
本発明の関節炎治療剤において、好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は重量平均分子量１０ｋＤ以下のコンドロイチン硫酸であり、さらに好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は重量平均分子量２〜３ｋＤのコンドロイチン硫酸である。好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は、ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されているＥ型コンドロイチン硫酸である。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、ＣＤ４４切断を誘導する方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、関節炎を治療する方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、ＣＤ４４切断誘導剤の製造のための低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、関節炎治療剤の製造のための低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明において有効成分として用いる低分子量コンドロイチン硫酸は、分子量は小さいため吸収性が良好であることが期待できる。また、コンドロイチン硫酸は生体成分に由来する物質であるので、生体に対する安全性が高いことが期待できる。即ち、本発明によれば、吸収性が良好であり、かつ生体に対する安全性の高い物質を用いて、新規なＣＤ４４切断誘導剤、並びに関節炎治療剤を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のＣＤ４４切断誘導剤及び関節炎治療剤は、低分子量コンドロイチン硫酸を有効成分として含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明で用いるコンドロイチン硫酸は低分子量のものである。ここで「低分子量」とは、当技術分野における当業者において低分子量であると認識される程度の分子量を意味する。一般的には、当業者であれば、重量平均分子量が３０ｋＤ以下であれば「低分子量」であると認識し、重量平均分子量が７５ｋＤａを超える場合には「低分子量」であるとは認識しない。
【００１９】
低分子量コンドロイチン硫酸は、重量平均分子量１０ｋＤ以下のコンドロイチン硫酸であることが好ましく、重量平均分子量２〜３ｋＤのコンドロイチン硫酸であることが特に好ましい。なお、分子量約１０ｋＤのコンドロイチン硫酸は３６糖に相当し、分子量約５ｋＤのコンドロイチン硫酸は１８糖に相当し、分子量約４ｋＤのコンドロイチン硫酸は１４糖に相当し、分子量約３ｋＤのコンドロイチン硫酸は１１糖に相当し、分子量約２ｋＤのコンドロイチン硫酸は７糖に相当し、分子量約１ｋＤのコンドロイチン硫酸は４糖に相当する。本発明では、これらの３６糖〜４糖のコンドロイチン硫酸を使用することが好ましく、１８糖〜４糖のコンドロイチン硫酸を使用することがさらに好ましい。
【００２０】
コンドロイチン硫酸は、グルクロン酸とガラクトサミンの繰り返し構造を有し、硫酸化される位置によって以下の異なる型が存在する。
Ａ型：ガラクトサミンの４位が硫酸化されている。
Ｃ型：ガラクトサミンの６位が硫酸化されている。
Ｄ型：ガラクトサミンの６位とグルクロン酸の２位が硫酸化されている。
Ｅ型：ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されている。
【００２１】
本発明では、上記した何れの型のコンドロイチン硫酸を使用することができるが、ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されているＥ型コンドロイチン硫酸を使用することが特に好ましい。
【００２２】
コンドロイチン硫酸を構造式で示すと以下の通りである。
【００２３】
【化１】
【００２４】
Ｒ11及びＲ12は各々独立に、水素原子又はスルホン酸基を示す。Ｒ13及びＲ14は各々独立に、水素原子又はスルホン酸基を示す。ここで、Ｒ11〜Ｒ14のうちの少なくとも１つ以上はスルホン酸基を示す。
【００２５】
本明細中前記した通り、特開２００４−２３８２９４号公報には、低分子量ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＣＤ４４切断誘導剤が記載されている。本発明で用いるコンロイチン硫酸（特に、コンドロイチン硫酸Ｅ）とヒアルロン酸とは、以下に述べる通り、構成糖、物性、生理活性、分子量の違いによる活性の差、及び遊走時の仮足の形状などが互いに相違しており、両者は、特に、生理活性については全く異なる別個の物質である。
【００２６】
構成糖：コンドロイチン硫酸Ｅはグルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミン４，６−硫酸により構成される。ヒアルロン酸はグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンにより構成される。
【００２７】
物性：コンドロイチン硫酸Ｅは多数の硫酸基を有し、酸性度が極めて高い。ヒアルロン酸は硫酸基を有さないので、酸性度は低い。
【００２８】
生理活性：コンドロイチン硫酸Ｅは、セレクチン及びケモカインに結合し、ケモカインレセプターについてはＣａ流入を阻害し、細胞の活性化を抑制し、リンパ球では活性化されると発現する。また、コンドロイチン硫酸Ｅは、ＣＤ４４との結合が報告されているが、ＣＤ４４の活性化及びＣＤ４４との結合によるアポトーシスについては報告がない。ヒアルロン酸は、セレクチン及びケモカインとの結合、ケモカインレセプターへの影響、及びリンパ球での発現は報告がない。また、ヒアルロン酸は、ＣＤ４４と結合し、それによりＣＤ４４が活性化され、ヒアルロン酸とＣＤ４４との結合により細胞のアポトーシスに影響を及ぼすことが報告されている。
【００２９】
分子量と活性：コンドロイチン硫酸Ｅは、分子量の違いによる活性の差は報告されていない。ヒアルロン酸は分子量により生理活性が異なる。
【００３０】
ＣＤ４４活性の最適な大きさ：コンドロイチン硫酸Ｅは２〜３ｋＤａ（約７〜１１糖）である。ヒアルロン酸は６．９ｋＤａ（約３６糖）である。
【００３１】
遊走時の仮足の形状：コンドロイチン硫酸Ｅとヒアルロン酸では異なっている。
【００３２】
本発明で用いるコンドロイチン硫酸は、例えば、
（ａ） イカ軟骨 ［スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３， １５４３−１５５０ （１９６８）］、肥満細胞 ［カッツ（Ｋａｔｚ， Ｈ． Ｒ．） ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６１， １３３９３−１３３９６ （１９８６）；及びスティーブンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ， Ｒ． Ｌ．）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８５， ２２８４−２２８７ （１９８８）］、好中球 ［オオハシ（Ｏｈｈａｓｈｉ， Ｙ．） ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， ２１７， １９９−２０７ （１９８４）； 及びピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ． Ｆ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， １２３７６−１２３８２ （１９９９）］、単球 ［ウーリン−ハンセン（Ｕｈｌｉｎ−Ｈａｎｓｅｎ， Ｌ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４， １４９１６−１４９２２ （１９８９）；マックジー（ＭｃＧｅｅ， Ｍ． Ｐ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２６１０９−２６１１５ （１９９５）］、糸球体 ［コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｓ．） ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ａｃｔａ， ８４１， ７１−８０ （１９８５）］ 、糸球体間質細胞 ［（Ｙａｏｉｔａ， Ｅ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５， ５２２−５３１ （１９９０）］等に見出されるコンドロイチン硫酸を、例えば、ヒアルロニダーゼなどの酵素で消化する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた消化産物を高速液体クロマトグラフィーに供して、オリゴ糖画分を得る工程、
を行なうことにより得ることができる。
【００３３】
前記工程（ａ）において、コンドロイチン硫酸は、慣用の手法により得ることができる。前記コンドロイチン硫酸の供給源は、前述の例示に特に限定されるものではなく、コンドロイチン硫酸を保持する他の生物、組織、細胞等を使用してもよい。コンドロイチン硫酸を消化する酵素としては、ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼＳＤ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣなどを適宜使用することができる。
【００３４】
また、酵素処理と組み合わせて、また酵素処理の代わりに、化学分解によってコンドロイチン硫酸を低分子量化することもできる。化学分解法としては、アルカリ分解法やＤＭＳＯ法等が挙げられる。アルカリ分解法は、例えばコンドロイチン硫酸の溶液に０．５〜１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和することにより行うことができる。ＤＭＳＯ法としてはＮａｇａｓａｗａらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄ． Ｒｅｓ．， １４１， ｐ９９−１１０， １９８５）が挙げられる。超音波処理法としては Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３３， ｐ６５０３−６５０７ （１９９４）等に記載された方法が挙げられる。
【００３５】
工程（ｂ）においては、前記（ａ）で得られた消化産物を、クロマトグラフィー、例えば、高速液体クロマトグラフィーに供することができる。工程（ｂ）においては、単一種類のオリゴ糖を、単一ピークとして得られるように、慣用の各種クロマトグラフィーを行なうことができる。例えば、イカ軟骨由来コンドロイチンＥの場合、前記クロマトグラフィーとして、１Ｍ〜３．５ＭのＮａＣｌのグラジエントによる陰イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーを行うことができる。ここで、クロマトグラフィーに用いられる溶液は、低分子量コンドロイチン硫酸を分離するのに適した水溶液又は水溶性有機溶媒と水との混合溶液であればよい。
【００３６】
上記したような方法によって低分子量コンドロイチン硫酸を含む画分が得られるが、この画分は通常の糖鎖の分離、精製の手法によってさらに精製することができる。例えば、吸着クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフィー、有機溶媒による分画、あるいはこれらの組み合わせ等の操作によって行うことができるが、これらに限定されるものではない。このような方法によって画分中の低分子量コンドロイチン硫酸の含有率を高めることができ、また医薬として混入が許されない物質を排除することもできる。このようにして、低分子量コンドロイチン硫酸は、高純度に精製することができる。
【００３７】
低分子量コンドロイチン硫酸の薬学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容される塩を用いることができる。上記の中でも、ナトリウム塩を使用することが好ましい。
【００３８】
本発明のＣＤ４４切断誘導剤及び関節炎治療剤（以下、これらを総称して本発明の薬剤と称する）の投与方法は、特に限定されないが、例えば注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入等の投与経路が挙げられる。その投与方法は、注射による特定部位への直接投与や、点滴による投与など、適用される疾患や部位等によって適宜選択することができる。
【００３９】
本発明においては、上記した投与方法に応じて、低分子量低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を適宜製剤化して、本発明の薬剤とすることができる。剤形としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等が挙げられるが、注射剤等の液剤の形態とすることが好ましい。
【００４０】
液剤は、例えば適当な水性溶媒あるいは医薬品に慣用される溶媒に、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を溶解させることにより製造することができる。このような溶媒としては、蒸留水、緩衝液、生理食塩水、水性有機溶媒を含む水等が挙げられる。
【００４１】
本発明の薬剤を注射剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、または凍結乾燥物のいずれでもよい。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤として投与することができる。
【００４２】
本発明の薬剤の製剤化は公知の方法で行うことができる。製剤化においては、本発明の効果に影響を与えない限り、他の薬学的有効成分（例えば抗炎症剤、鎮痛剤、ビタミン剤、抗菌剤、成長因子、接着因子など）、助剤、安定化剤、乳化剤、溶解補助剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等を適宜配合することができる。
【００４３】
また、本発明の薬剤は、細胞生物学分野における試験試薬として使用することもできる。例えば、本発明の薬剤は、細胞生物学分野における実験において、ＣＤ４４の切断を誘導するための試薬として利用することができる。
【００４４】
本発明のＣＤ４４切断誘導剤は、ＣＤ４４の切断の誘導を目的とするするものであるから、ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる細胞やこれを含む組織や臓器に対して適用することができる。ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる細胞としては、例えばＣＤ４４が切断されるべきであるにもかかわらず切断されないような状態にある細胞や、細胞生物学分野における実験において、ＣＤ４４の切断を誘導する必要がある細胞等が例示される。
【００４５】
本発明の薬剤を動物に投与する場合、これが投与される動物は、脊椎動物、特に哺乳動物が好ましく、とりわけヒトが好ましい。
【００４６】
本発明の薬剤は、ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる疾患、ＣＤ４４の切断の抑制もしくは阻害に起因する疾患の予防、進行抑制（悪化防止）、症状の改善または治療等を目的として投与することができる。
【００４７】
ここで、ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる疾患、ＣＤ４４の切断の抑制もしくは阻害に起因する疾患の具体例としては、関節炎が挙げられる。本明細書中上記した通り、ＣＤ４４シェディング誘発物質により関節炎治療効果があること（非特許文献２）、並びにＣＤ４４シェディングを誘発する抗ＣＤ４４抗体の投与により関節炎の治療効果が見られること（非特許文献３）が報告されている。従って、ＣＤ４４の切断を誘導する活性を有する本発明の薬剤は、関節炎の治療剤として使用することができる。
【００４８】
関節炎としては、慢性関節リウマチ又は変形性関節症による関節炎等が挙げられる。従って、本発明の薬剤は、特に、関節炎治療剤として使用することができる。本発明の薬剤は、特に慢性の関節炎の治療に有効であり、具体的には、ＣＤ４４が高発現している関節炎の治療のために使用することができる。
【００４９】
本発明の薬剤における低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩の配合量、１回あたりの投与量、投与間隔等は、本発明の薬剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されない。本発明の薬剤の投与量は、投与される患者の年齢、体重、病態等に応じて、適宜設定することができ、例えば、有効成分の量として、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１００μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ／日〜８ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。本発明の薬剤の投与間隔は、１日１回程度でもよく、１日２〜３回に分けて投与することもできる。
【００５０】
以下の実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１：コンドロイチン硫酸Ｅ（CSE）フラグメントの調製方法
（１）粗精製ＣＳＥの調製
スルメイカより得られた軟骨800gをチョッパーにて細断し、水を加えた後、炭酸ナトリウム17.5g、エスペラーゼ（ノボノバルティス社）5gを加えて液量を１Lとした。水酸化ナトリウムにてpH11に調整し、45℃で一晩酵素消化を行った。
酵素消化液にろ過助剤を加えてろ過を行った後、ろ液を減圧濃縮機で500mlまで濃縮した。
【００５２】
得られた濃縮液に0.5Nとなるように水酸化ナトリウムを添加し、30℃で1時間反応させた。反応液に適当量のエタノールを滴下して沈殿させた。沈殿物が十分沈んだのを確認して上清をカットした。
沈殿物を水で溶解した後、塩酸にてｐＨを6.0に調整し、液量を300mlとした。この溶液に沈殿の生成を確認しながら適当量のエタノールを加えた。沈殿物が十分沈んだのを確認した後、上清をカットした。沈殿物はエタノールで洗浄後、ろ過により沈殿物を集め乾燥することにより粗ＣＳＥ画分を20gを得た。
【００５３】
（２）精製ＣＳＥの調製
得られた粗精製画分10gを0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）200mlに溶解し、アクチナーゼＥ（科研製薬製）100mgを加えて55℃で一晩酵素反応を行った。
分解後水酸化ナトリウムを加えて0.5N溶液とし、30℃で１時間反応した。反応後適当量のエタノールを滴下して沈殿させた。沈殿物が十分沈んだのを確認し上清をカットした。
【００５４】
沈殿物は水200mlに溶解後、酢酸ナトリウムを3％になるように添加しさらにpHを4.8に調整した。この溶液に沈殿物の生成を確認しながらエタノールを加えた。沈殿物が十分沈んだのを確認した後上清をカットした。
沈殿物を水200mlに溶解後、pHを4.8に調整し、活性炭2gを加えて50℃、1時間反応した。反応液にろ過助剤を加えてろ過を行った後、酢酸ナトリウムを3％となるように添加してｐHを5.0とした。この液に適当量のエタノールを加えて沈殿した。沈殿物はエタノールで洗浄後、ろ過により回収した後、真空乾燥機で乾燥した。これにより精製ＣＳＥ（90kDa）7gを得た。
【００５５】
（３）ＣＳＥフラグメントの調製
精製CSE１gをPBS（pH5.3）50mlに溶解した。この液に羊睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社）10万Uを加え37℃で一晩反応した。反応液を陰イオン交換樹脂Dowex1X2（ダウケミカル社）を充填したカラムにアプライした。カラムは1M NaCl溶液で洗浄した後1M〜3.5M NaCl溶液のグラジエントにより溶出し、溶出液をフラクションコレクターで分取した。得られた画分をカルバゾール法にて分析した。カルバゾール法で発色の見られた画分をＧＰＣ用カラムG4500PWXL、G3000PWXL及びG2500PWXL（東ソー社）の３本を連結したHPLC装置により各画分のCSE分子量を測定した。分子量算出には分子量既知の標準コンドロイチン硫酸として1kDa、7kDa、10kDaのものを用いた。これらの画分の中から平均分子量2kDa、及び3kDaのものを集めた。この画分をセファテ゛ックスG25（アマシャムバイオサイエンス社）を充填したカラムにアプライし、脱塩処理を行った後、濃縮した。さらに30,000カットの限外ろ過フィルター（日本ミリポア社）にかけてエンドトキシンを除去し、凍結乾燥したものを以下の実験に使用した。
【００５６】
実施例２：ＣＤ４４切断アッセイ
ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞を２４ウエルのプレートに５ｘ１０4 細胞／ウエルとなるように播種し、３７℃で一晩培養した。その後、細胞を１０ ｍＭ ＭＧ１３２中、３７℃で３０分間インキュベートすることによってＣＤ４４の細胞内ドメインの二次分解を防ぐことができる（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １５５（５）， ｐ７５５−７６２， （２００１））。細胞を、３７℃、 １０ ｍＭ ＭＧ１３２の存在下で、実施例１で調製した各種のＣＳＥと共に１時間、又は１００ ｎｇ／ｍｌのＰＭＡとともに３０分間インキュベートし、細胞上清を採取して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に付した。細胞をＳＤＳサンプルバッファー（２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、０．１ Ｍ ジチオトレイトール、１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）、０．０２％ ブロモフェノールブルー）で溶解し、５分間ボイルした。同数の細胞から抽出した細胞溶解液を含有する等量のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。この膜を、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中でブロッキングし、抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ ｐＡｂ又は抗ｂ−チューブリンｍＡｂと共にインキュベートした。抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ ｐＡｂでインキュベートした膜についてはＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧと共に、抗チューブリン ｍＡｂでインキュベートした膜についてはＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧと共にそれぞれインキュベートした。二次抗体は、ＥＣＬ ウエスタンブロッティング検出試薬（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。ＥＬＩＳＡで分析する前に、刺激を与えた細胞の上清を０．２２−ｍｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｆｉｌｔｅｒ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）で濾過した。培養上清中に存在する可溶性のヒトＣＤ４４Ｈ を、可溶性ＣＤ４４Ｈ ＥＬＩＳＡ キット（Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ， Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて、その説明書に従って定量した。上記したウエスタンブロッティングの結果を図１〜３に示す。
【００５７】
図１は、細胞を処理しない場合、並びに細胞をＰＭＡ、６．９ｋＤａヒアルロン酸、又は７５ｋＤａ、１０ｋＤａ若しくは５ｋＤａのコンドロイチン硫酸で処理した場合の結果を示す。
【００５８】
図２は、細胞を処理しない場合、並びに細胞をＰＭＡ、又は１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ若しくは６ｋＤａのコンドロイチン硫酸で処理した場合の結果を示す。
【００５９】
図３は、コンドロイチン硫酸の濃度を変えて細胞を処理した場合の結果を示す。
【００６０】
図１〜図３の結果から分かるように、低分子量コンドロイチン硫酸を用いた場合にＣＤ４４に切断が誘導されることが示された。即ち、分子量１０ｋＤａ、６ｋＤａ、５ｋＤａ、４ｋＤａ、３ｋＤａ、２ｋＤａ、及び１ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いた場合にＣＤ４４の切断が誘導されている。中でも、分子量２ｋＤａ及び３ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いた場合には、ＣＤ４４の切断が高度に誘導されている。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、低分子量コンドロイチン硫酸のＣＤ４４切断能を示すウエスタンブロッティングの結果である。
【図２】図２は、低分子量コンドロイチン硫酸のＣＤ４４切断能を示すウエスタンブロッティングの結果である。
【図３】図３は、低分子量コンドロイチン硫酸のＣＤ４４切断能を示すウエスタンブロッティングの結果である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＣＤ４４切断誘導剤に関する。また本発明は、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする関節炎治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４４は１回膜貫通型糖蛋白質で、４つの機能的ドメインからなる。外側の細胞外ドメインは主にヒアルロン酸結合に関与する部位である。内側の細胞外ドメインは主に選択的スプライシングを受ける部位で、その結果、ＣＤ４４の多くのアイソフォームが合成される。ＣＤ４４の膜貫通ドメインはまさしく典型的な１回膜貫通型糖蛋白質の性質を示すが、界面活性剤可溶化ヒアルロン酸レセプターを用いた研究や、部位特異的変異導入法による研究から、この部位に相互作用する脂質や修飾膜蛋白質が細胞骨格とＣＤ４４の相互作用やヒアルロン酸結合をも調節することが示されている。ＣＤ４４は、ほとんどの細胞と組織に発現しているが、血小板、肝細胞、心筋、腎尿細管上皮、精巣、皮膚には発現していない。ＣＤ４４は、細胞凝集、細胞周囲のマトリックスの保持、マトリックス−細胞間のシグナリング、レセプターを介するヒアルロン酸の取り込み／分解や細胞遊走などを含む様々な細胞機能に関与することが知られている。これらの機能の制御には、特定のＣＤ４４アイソフォームの利用、ＣＤ４４の翻訳後修飾、細胞骨格に結合する中間系フィラメントのような他の蛋白とＣＤ４４の特異的結合などが関与している可能性がある。また、ＣＤ４４には切断機構（シェディング機構）が存在し、ＣＤ４４の切断により、リガンド結合によるＣＤ４４シグナル伝達は強く遮断されることが分かっている。
【０００３】
ＣＤ４４と関節炎との関連についてはこれまでに幾つかの報告がある。例えば、マウス関節炎モデルにおいて、ＣＤ４４シェディング誘発物質の投与により可溶性ＣＤ４４（ｓＣＤ４４）量が増加すること（非特許文献１）、並びにＣＤ４４シェディング誘発物質により関節炎治療効果があること（非特許文献２）が報告されている。また、ＣＤ４４シェディングを誘発する抗ＣＤ４４抗体の投与により関節炎の治療効果が見られることが報告されている（非特許文献３）。また、ＣＤ４４ノックアウトマウスでは関節炎の発症が抑制されていることが報告されている（非特許文献４）。さらに、慢性関節リウマチ患者において、滑液及び滑膜組織でＣＤ４４が高発現していること（非特許文献５）、及びｓＣＤ４４と重症度が相関していること（非特許文献６）が報告されている。
【０００４】
ＣＤ４４切断誘導剤としては、特許文献１には、低分子量ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＣＤ４４切断誘導剤及び細胞の移動促進剤が記載されている。また、特許文献１で言う「低分子量ヒアルロン酸」は、ヒアルロン酸２糖以上で、かつ重量平均分子量３０ｋＤ以下のものが好ましいことが記載されている。
【０００５】
一方、特許文献２には、４糖から８糖からなる糖化合物（コンドロイチン硫酸）がＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びケモカインとリガンドとの結合を調節し、炎症性疾患などを改善できることが記載されている。しかしながら、特許文献２には、コンドロイチン硫酸がＣＤ４４に及ぼす作用については何等記載がない。
【０００６】
【非特許文献１】Katoh S, J.Immunol 1994; 153(8): 3440
【非特許文献２】Mikecz K, Nat Med 1995; 186): 558
【非特許文献３】Mikecz K, Kim JH. Arthritis Rheum. 1999 Apr; 42(4): 659-68
【非特許文献４】Mikecz K, Arthritis Rheum. 2001; 44(12): 2922
【非特許文献５】Fujii K, Eto S, J Immunol 1999; 162(4); 2391
【非特許文献６】Haynes BF Arthritis Rheum. 1991; 34(11): 1434
【特許文献１】特開２００４−２３８２９４号公報
【特許文献２】特開２００４−５９５０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規なＣＤ４４切断誘導剤、並びに関節炎治療剤を提供することを解決すべき課題とした。本発明は、特に、吸収性が良好であり、かつ生体に対する安全性の高い物質を用いて、新規なＣＤ４４切断誘導剤、並びに関節炎治療剤を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、低分子量コンドロイチン硫酸が、ＣＤ４４の切断を誘導することを実証し、関節炎の治療に有効であることを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００９】
即ち、本発明によれば、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を含む、ＣＤ４４切断誘導剤が提供される。
本発明のＣＤ４４切断誘導剤において、好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は重量平均分子量１０ｋＤ以下のコンドロイチン硫酸であり、さらに好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は重量平均分子量２〜３ｋＤのコンドロイチン硫酸である。好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は、ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されているＥ型コンドロイチン硫酸である。
【００１０】
本発明の別の側面によれば、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を含む、関節炎治療剤が提供される。
好ましくは、関節炎は、慢性関節リウマチ又は変形性関節症による関節炎である。
好ましくは、関節炎は慢性の関節炎である。
好ましくは、本発明の関節炎治療剤は、ＣＤ４４が高発現している関節炎の治療のために使用される。
【００１１】
本発明の関節炎治療剤において、好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は重量平均分子量１０ｋＤ以下のコンドロイチン硫酸であり、さらに好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は重量平均分子量２〜３ｋＤのコンドロイチン硫酸である。好ましくは、低分子量コンドロイチン硫酸は、ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されているＥ型コンドロイチン硫酸である。
【００１２】
本発明のさらに別の側面によれば、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、ＣＤ４４切断を誘導する方法が提供される。
【００１３】
本発明のさらに別の側面によれば、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩の有効量をヒトを含む哺乳動物に投与する工程を含む、関節炎を治療する方法が提供される。
【００１４】
本発明のさらに別の側面によれば、ＣＤ４４切断誘導剤の製造のための低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の側面によれば、関節炎治療剤の製造のための低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【発明の効果】
【００１６】
本発明において有効成分として用いる低分子量コンドロイチン硫酸は、分子量は小さいため吸収性が良好であることが期待できる。また、コンドロイチン硫酸は生体成分に由来する物質であるので、生体に対する安全性が高いことが期待できる。即ち、本発明によれば、吸収性が良好であり、かつ生体に対する安全性の高い物質を用いて、新規なＣＤ４４切断誘導剤、並びに関節炎治療剤を提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明のＣＤ４４切断誘導剤及び関節炎治療剤は、低分子量コンドロイチン硫酸を有効成分として含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明で用いるコンドロイチン硫酸は低分子量のものである。ここで「低分子量」とは、当技術分野における当業者において低分子量であると認識される程度の分子量を意味する。一般的には、当業者であれば、重量平均分子量が３０ｋＤ以下であれば「低分子量」であると認識し、重量平均分子量が７５ｋＤａを超える場合には「低分子量」であるとは認識しない。
【００１９】
低分子量コンドロイチン硫酸は、重量平均分子量１０ｋＤ以下のコンドロイチン硫酸であることが好ましく、重量平均分子量２〜３ｋＤのコンドロイチン硫酸であることが特に好ましい。なお、分子量約１０ｋＤのコンドロイチン硫酸は３６糖に相当し、分子量約５ｋＤのコンドロイチン硫酸は１８糖に相当し、分子量約４ｋＤのコンドロイチン硫酸は１４糖に相当し、分子量約３ｋＤのコンドロイチン硫酸は１１糖に相当し、分子量約２ｋＤのコンドロイチン硫酸は７糖に相当し、分子量約１ｋＤのコンドロイチン硫酸は４糖に相当する。本発明では、これらの３６糖〜４糖のコンドロイチン硫酸を使用することが好ましく、１８糖〜４糖のコンドロイチン硫酸を使用することがさらに好ましい。
【００２０】
コンドロイチン硫酸は、グルクロン酸とガラクトサミンの繰り返し構造を有し、硫酸化される位置によって以下の異なる型が存在する。
Ａ型：ガラクトサミンの４位が硫酸化されている。
Ｃ型：ガラクトサミンの６位が硫酸化されている。
Ｄ型：ガラクトサミンの６位とグルクロン酸の２位が硫酸化されている。
Ｅ型：ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されている。
【００２１】
本発明では、上記した何れの型のコンドロイチン硫酸を使用することができるが、ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されているＥ型コンドロイチン硫酸を使用することが特に好ましい。
【００２２】
コンドロイチン硫酸を構造式で示すと以下の通りである。
【００２３】
【化１】
【００２４】
Ｒ11及びＲ12は各々独立に、水素原子又はスルホン酸基を示す。Ｒ13及びＲ14は各々独立に、水素原子又はスルホン酸基を示す。ここで、Ｒ11〜Ｒ14のうちの少なくとも１つ以上はスルホン酸基を示す。
【００２５】
本明細中前記した通り、特開２００４−２３８２９４号公報には、低分子量ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＣＤ４４切断誘導剤が記載されている。本発明で用いるコンロイチン硫酸（特に、コンドロイチン硫酸Ｅ）とヒアルロン酸とは、以下に述べる通り、構成糖、物性、生理活性、分子量の違いによる活性の差、及び遊走時の仮足の形状などが互いに相違しており、両者は、特に、生理活性については全く異なる別個の物質である。
【００２６】
構成糖：コンドロイチン硫酸Ｅはグルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミン４，６−硫酸により構成される。ヒアルロン酸はグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンにより構成される。
【００２７】
物性：コンドロイチン硫酸Ｅは多数の硫酸基を有し、酸性度が極めて高い。ヒアルロン酸は硫酸基を有さないので、酸性度は低い。
【００２８】
生理活性：コンドロイチン硫酸Ｅは、セレクチン及びケモカインに結合し、ケモカインレセプターについてはＣａ流入を阻害し、細胞の活性化を抑制し、リンパ球では活性化されると発現する。また、コンドロイチン硫酸Ｅは、ＣＤ４４との結合が報告されているが、ＣＤ４４の活性化及びＣＤ４４との結合によるアポトーシスについては報告がない。ヒアルロン酸は、セレクチン及びケモカインとの結合、ケモカインレセプターへの影響、及びリンパ球での発現は報告がない。また、ヒアルロン酸は、ＣＤ４４と結合し、それによりＣＤ４４が活性化され、ヒアルロン酸とＣＤ４４との結合により細胞のアポトーシスに影響を及ぼすことが報告されている。
【００２９】
分子量と活性：コンドロイチン硫酸Ｅは、分子量の違いによる活性の差は報告されていない。ヒアルロン酸は分子量により生理活性が異なる。
【００３０】
ＣＤ４４活性の最適な大きさ：コンドロイチン硫酸Ｅは２〜３ｋＤａ（約７〜１１糖）である。ヒアルロン酸は６．９ｋＤａ（約３６糖）である。
【００３１】
遊走時の仮足の形状：コンドロイチン硫酸Ｅとヒアルロン酸では異なっている。
【００３２】
本発明で用いるコンドロイチン硫酸は、例えば、
（ａ） イカ軟骨 ［スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４３， １５４３−１５５０ （１９６８）］、肥満細胞 ［カッツ（Ｋａｔｚ， Ｈ． Ｒ．） ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６１， １３３９３−１３３９６ （１９８６）；及びスティーブンス（Ｓｔｅｖｅｎｓ， Ｒ． Ｌ．）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８５， ２２８４−２２８７ （１９８８）］、好中球 ［オオハシ（Ｏｈｈａｓｈｉ， Ｙ．） ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， ２１７， １９９−２０７ （１９８４）； 及びピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ． Ｆ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４， １２３７６−１２３８２ （１９９９）］、単球 ［ウーリン−ハンセン（Ｕｈｌｉｎ−Ｈａｎｓｅｎ， Ｌ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４， １４９１６−１４９２２ （１９８９）；マックジー（ＭｃＧｅｅ， Ｍ． Ｐ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０， ２６１０９−２６１１５ （１９９５）］、糸球体 ［コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｓ．） ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ａｃｔａ， ８４１， ７１−８０ （１９８５）］ 、糸球体間質細胞 ［（Ｙａｏｉｔａ， Ｅ．）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６５， ５２２−５３１ （１９９０）］等に見出されるコンドロイチン硫酸を、例えば、ヒアルロニダーゼなどの酵素で消化する工程、及び
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた消化産物を高速液体クロマトグラフィーに供して、オリゴ糖画分を得る工程、
を行なうことにより得ることができる。
【００３３】
前記工程（ａ）において、コンドロイチン硫酸は、慣用の手法により得ることができる。前記コンドロイチン硫酸の供給源は、前述の例示に特に限定されるものではなく、コンドロイチン硫酸を保持する他の生物、組織、細胞等を使用してもよい。コンドロイチン硫酸を消化する酵素としては、ヒアルロニダーゼ（睾丸由来）、ヒアルロニダーゼＳＤ、コンドロイチナーゼＡＣＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＡＢＣなどを適宜使用することができる。
【００３４】
また、酵素処理と組み合わせて、また酵素処理の代わりに、化学分解によってコンドロイチン硫酸を低分子量化することもできる。化学分解法としては、アルカリ分解法やＤＭＳＯ法等が挙げられる。アルカリ分解法は、例えばコンドロイチン硫酸の溶液に０．５〜１Ｎ程度の水酸化ナトリウム等の塩基を加え、数時間加温して低分子化させた後、塩酸等の酸を加えて中和することにより行うことができる。ＤＭＳＯ法としてはＮａｇａｓａｗａらの方法（Ｃａｒｂｏｈｙｄ． Ｒｅｓ．， １４１， ｐ９９−１１０， １９８５）が挙げられる。超音波処理法としては Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３３， ｐ６５０３−６５０７ （１９９４）等に記載された方法が挙げられる。
【００３５】
工程（ｂ）においては、前記（ａ）で得られた消化産物を、クロマトグラフィー、例えば、高速液体クロマトグラフィーに供することができる。工程（ｂ）においては、単一種類のオリゴ糖を、単一ピークとして得られるように、慣用の各種クロマトグラフィーを行なうことができる。例えば、イカ軟骨由来コンドロイチンＥの場合、前記クロマトグラフィーとして、１Ｍ〜３．５ＭのＮａＣｌのグラジエントによる陰イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーを行うことができる。ここで、クロマトグラフィーに用いられる溶液は、低分子量コンドロイチン硫酸を分離するのに適した水溶液又は水溶性有機溶媒と水との混合溶液であればよい。
【００３６】
上記したような方法によって低分子量コンドロイチン硫酸を含む画分が得られるが、この画分は通常の糖鎖の分離、精製の手法によってさらに精製することができる。例えば、吸着クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフィー、有機溶媒による分画、あるいはこれらの組み合わせ等の操作によって行うことができるが、これらに限定されるものではない。このような方法によって画分中の低分子量コンドロイチン硫酸の含有率を高めることができ、また医薬として混入が許されない物質を排除することもできる。このようにして、低分子量コンドロイチン硫酸は、高純度に精製することができる。
【００３７】
低分子量コンドロイチン硫酸の薬学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち、薬学的に許容される塩を用いることができる。上記の中でも、ナトリウム塩を使用することが好ましい。
【００３８】
本発明のＣＤ４４切断誘導剤及び関節炎治療剤（以下、これらを総称して本発明の薬剤と称する）の投与方法は、特に限定されないが、例えば注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経鼻、経口、経皮、吸入等の投与経路が挙げられる。その投与方法は、注射による特定部位への直接投与や、点滴による投与など、適用される疾患や部位等によって適宜選択することができる。
【００３９】
本発明においては、上記した投与方法に応じて、低分子量低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を適宜製剤化して、本発明の薬剤とすることができる。剤形としては、注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、貼付剤、ゲル剤、坐剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等が挙げられるが、注射剤等の液剤の形態とすることが好ましい。
【００４０】
液剤は、例えば適当な水性溶媒あるいは医薬品に慣用される溶媒に、低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を溶解させることにより製造することができる。このような溶媒としては、蒸留水、緩衝液、生理食塩水、水性有機溶媒を含む水等が挙げられる。
【００４１】
本発明の薬剤を注射剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、または凍結乾燥物のいずれでもよい。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤として投与することができる。
【００４２】
本発明の薬剤の製剤化は公知の方法で行うことができる。製剤化においては、本発明の効果に影響を与えない限り、他の薬学的有効成分（例えば抗炎症剤、鎮痛剤、ビタミン剤、抗菌剤、成長因子、接着因子など）、助剤、安定化剤、乳化剤、溶解補助剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等を適宜配合することができる。
【００４３】
また、本発明の薬剤は、細胞生物学分野における試験試薬として使用することもできる。例えば、本発明の薬剤は、細胞生物学分野における実験において、ＣＤ４４の切断を誘導するための試薬として利用することができる。
【００４４】
本発明のＣＤ４４切断誘導剤は、ＣＤ４４の切断の誘導を目的とするするものであるから、ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる細胞やこれを含む組織や臓器に対して適用することができる。ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる細胞としては、例えばＣＤ４４が切断されるべきであるにもかかわらず切断されないような状態にある細胞や、細胞生物学分野における実験において、ＣＤ４４の切断を誘導する必要がある細胞等が例示される。
【００４５】
本発明の薬剤を動物に投与する場合、これが投与される動物は、脊椎動物、特に哺乳動物が好ましく、とりわけヒトが好ましい。
【００４６】
本発明の薬剤は、ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる疾患、ＣＤ４４の切断の抑制もしくは阻害に起因する疾患の予防、進行抑制（悪化防止）、症状の改善または治療等を目的として投与することができる。
【００４７】
ここで、ＣＤ４４の切断の誘導が望まれる疾患、ＣＤ４４の切断の抑制もしくは阻害に起因する疾患の具体例としては、関節炎が挙げられる。本明細書中上記した通り、ＣＤ４４シェディング誘発物質により関節炎治療効果があること（非特許文献２）、並びにＣＤ４４シェディングを誘発する抗ＣＤ４４抗体の投与により関節炎の治療効果が見られること（非特許文献３）が報告されている。従って、ＣＤ４４の切断を誘導する活性を有する本発明の薬剤は、関節炎の治療剤として使用することができる。
【００４８】
関節炎としては、慢性関節リウマチ又は変形性関節症による関節炎等が挙げられる。従って、本発明の薬剤は、特に、関節炎治療剤として使用することができる。本発明の薬剤は、特に慢性の関節炎の治療に有効であり、具体的には、ＣＤ４４が高発現している関節炎の治療のために使用することができる。
【００４９】
本発明の薬剤における低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩の配合量、１回あたりの投与量、投与間隔等は、本発明の薬剤の投与方法、投与形態、使用目的、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されない。本発明の薬剤の投与量は、投与される患者の年齢、体重、病態等に応じて、適宜設定することができ、例えば、有効成分の量として、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１００μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ／日〜８ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。本発明の薬剤の投与間隔は、１日１回程度でもよく、１日２〜３回に分けて投与することもできる。
【００５０】
以下の実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１：コンドロイチン硫酸Ｅ（CSE）フラグメントの調製方法
（１）粗精製ＣＳＥの調製
スルメイカより得られた軟骨800gをチョッパーにて細断し、水を加えた後、炭酸ナトリウム17.5g、エスペラーゼ（ノボノバルティス社）5gを加えて液量を１Lとした。水酸化ナトリウムにてpH11に調整し、45℃で一晩酵素消化を行った。
酵素消化液にろ過助剤を加えてろ過を行った後、ろ液を減圧濃縮機で500mlまで濃縮した。
【００５２】
得られた濃縮液に0.5Nとなるように水酸化ナトリウムを添加し、30℃で1時間反応させた。反応液に適当量のエタノールを滴下して沈殿させた。沈殿物が十分沈んだのを確認して上清をカットした。
沈殿物を水で溶解した後、塩酸にてｐＨを6.0に調整し、液量を300mlとした。この溶液に沈殿の生成を確認しながら適当量のエタノールを加えた。沈殿物が十分沈んだのを確認した後、上清をカットした。沈殿物はエタノールで洗浄後、ろ過により沈殿物を集め乾燥することにより粗ＣＳＥ画分を20gを得た。
【００５３】
（２）精製ＣＳＥの調製
得られた粗精製画分10gを0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）200mlに溶解し、アクチナーゼＥ（科研製薬製）100mgを加えて55℃で一晩酵素反応を行った。
分解後水酸化ナトリウムを加えて0.5N溶液とし、30℃で１時間反応した。反応後適当量のエタノールを滴下して沈殿させた。沈殿物が十分沈んだのを確認し上清をカットした。
【００５４】
沈殿物は水200mlに溶解後、酢酸ナトリウムを3％になるように添加しさらにpHを4.8に調整した。この溶液に沈殿物の生成を確認しながらエタノールを加えた。沈殿物が十分沈んだのを確認した後上清をカットした。
沈殿物を水200mlに溶解後、pHを4.8に調整し、活性炭2gを加えて50℃、1時間反応した。反応液にろ過助剤を加えてろ過を行った後、酢酸ナトリウムを3％となるように添加してｐHを5.0とした。この液に適当量のエタノールを加えて沈殿した。沈殿物はエタノールで洗浄後、ろ過により回収した後、真空乾燥機で乾燥した。これにより精製ＣＳＥ（90kDa）7gを得た。
【００５５】
（３）ＣＳＥフラグメントの調製
精製CSE１gをPBS（pH5.3）50mlに溶解した。この液に羊睾丸ヒアルロニダーゼ（シグマ社）10万Uを加え37℃で一晩反応した。反応液を陰イオン交換樹脂Dowex1X2（ダウケミカル社）を充填したカラムにアプライした。カラムは1M NaCl溶液で洗浄した後1M〜3.5M NaCl溶液のグラジエントにより溶出し、溶出液をフラクションコレクターで分取した。得られた画分をカルバゾール法にて分析した。カルバゾール法で発色の見られた画分をＧＰＣ用カラムG4500PWXL、G3000PWXL及びG2500PWXL（東ソー社）の３本を連結したHPLC装置により各画分のCSE分子量を測定した。分子量算出には分子量既知の標準コンドロイチン硫酸として1kDa、7kDa、10kDaのものを用いた。これらの画分の中から平均分子量2kDa、及び3kDaのものを集めた。この画分をセファテ゛ックスG25（アマシャムバイオサイエンス社）を充填したカラムにアプライし、脱塩処理を行った後、濃縮した。さらに30,000カットの限外ろ過フィルター（日本ミリポア社）にかけてエンドトキシンを除去し、凍結乾燥したものを以下の実験に使用した。
【００５６】
実施例２：ＣＤ４４切断アッセイ
ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞を２４ウエルのプレートに５ｘ１０4 細胞／ウエルとなるように播種し、３７℃で一晩培養した。その後、細胞を１０ ｍＭ ＭＧ１３２中、３７℃で３０分間インキュベートすることによってＣＤ４４の細胞内ドメインの二次分解を防ぐことができる（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １５５（５）， ｐ７５５−７６２， （２００１））。細胞を、３７℃、 １０ ｍＭ ＭＧ１３２の存在下で、実施例１で調製した各種のＣＳＥと共に１時間、又は１００ ｎｇ／ｍｌのＰＭＡとともに３０分間インキュベートし、細胞上清を採取して酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に付した。細胞をＳＤＳサンプルバッファー（２％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール、０．１ Ｍ ジチオトレイトール、１２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）、０．０２％ ブロモフェノールブルー）で溶解し、５分間ボイルした。同数の細胞から抽出した細胞溶解液を含有する等量のサンプルを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。この膜を、３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中でブロッキングし、抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ ｐＡｂ又は抗ｂ−チューブリンｍＡｂと共にインキュベートした。抗ＣＤ４４ｃｙｔｏ ｐＡｂでインキュベートした膜についてはＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧと共に、抗チューブリン ｍＡｂでインキュベートした膜についてはＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧと共にそれぞれインキュベートした。二次抗体は、ＥＣＬ ウエスタンブロッティング検出試薬（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。ＥＬＩＳＡで分析する前に、刺激を与えた細胞の上清を０．２２−ｍｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｆｉｌｔｅｒ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）で濾過した。培養上清中に存在する可溶性のヒトＣＤ４４Ｈ を、可溶性ＣＤ４４Ｈ ＥＬＩＳＡ キット（Ｂｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ， Ｖｉｅｎｎａ， Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて、その説明書に従って定量した。上記したウエスタンブロッティングの結果を図１〜３に示す。
【００５７】
図１は、細胞を処理しない場合、並びに細胞をＰＭＡ、６．９ｋＤａヒアルロン酸、又は７５ｋＤａ、１０ｋＤａ若しくは５ｋＤａのコンドロイチン硫酸で処理した場合の結果を示す。
【００５８】
図２は、細胞を処理しない場合、並びに細胞をＰＭＡ、又は１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ若しくは６ｋＤａのコンドロイチン硫酸で処理した場合の結果を示す。
【００５９】
図３は、コンドロイチン硫酸の濃度を変えて細胞を処理した場合の結果を示す。
【００６０】
図１〜図３の結果から分かるように、低分子量コンドロイチン硫酸を用いた場合にＣＤ４４に切断が誘導されることが示された。即ち、分子量１０ｋＤａ、６ｋＤａ、５ｋＤａ、４ｋＤａ、３ｋＤａ、２ｋＤａ、及び１ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いた場合にＣＤ４４の切断が誘導されている。中でも、分子量２ｋＤａ及び３ｋＤａのコンドロイチン硫酸を用いた場合には、ＣＤ４４の切断が高度に誘導されている。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、低分子量コンドロイチン硫酸のＣＤ４４切断能を示すウエスタンブロッティングの結果である。
【図２】図２は、低分子量コンドロイチン硫酸のＣＤ４４切断能を示すウエスタンブロッティングの結果である。
【図３】図３は、低分子量コンドロイチン硫酸のＣＤ４４切断能を示すウエスタンブロッティングの結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を含む、ＣＤ４４切断誘導剤。
【請求項２】
低分子量コンドロイチン硫酸が重量平均分子量１０ｋＤ以下のコンドロイチン硫酸である、請求項１に記載のＣＤ４４切断誘導剤。
【請求項３】
低分子量コンドロイチン硫酸が重量平均分子量２〜３ｋＤのコンドロイチン硫酸である、請求項１又は２に記載のＣＤ４４切断誘導剤。
【請求項４】
低分子量コンドロイチン硫酸が、ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されているＥ型コンドロイチン硫酸である、請求項１から３の何れかに記載のＣＤ４４切断誘導剤。
【請求項５】
低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を含む、関節炎治療剤。
【請求項６】
関節炎が、慢性関節リウマチ又は変形性関節症による関節炎である、請求項５に記載の関節炎治療剤。
【請求項７】
関節炎が慢性の関節炎である、請求項５又は６に記載の関節炎治療剤。
【請求項８】
ＣＤ４４が高発現している関節炎の治療のために使用される、請求項５から７の何れかに記載の関節炎治療剤。
【請求項９】
低分子量コンドロイチン硫酸が重量平均分子量１０ｋＤ以下のコンドロイチン硫酸である、請求項５から８の何れかに記載の関節炎治療剤。
【請求項１０】
低分子量コンドロイチン硫酸が重量平均分子量２〜３ｋＤのコンドロイチン硫酸である、請求項５から８の何れかに記載の関節炎治療剤。
【請求項１１】
低分子量コンドロイチン硫酸が、ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されているＥ型コンドロイチン硫酸である、請求項５から１０の何れかに記載の関節炎治療剤。
【請求項１】
低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を含む、ＣＤ４４切断誘導剤。
【請求項２】
低分子量コンドロイチン硫酸が重量平均分子量１０ｋＤ以下のコンドロイチン硫酸である、請求項１に記載のＣＤ４４切断誘導剤。
【請求項３】
低分子量コンドロイチン硫酸が重量平均分子量２〜３ｋＤのコンドロイチン硫酸である、請求項１又は２に記載のＣＤ４４切断誘導剤。
【請求項４】
低分子量コンドロイチン硫酸が、ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されているＥ型コンドロイチン硫酸である、請求項１から３の何れかに記載のＣＤ４４切断誘導剤。
【請求項５】
低分子量コンドロイチン硫酸又はその薬学的に許容される塩を含む、関節炎治療剤。
【請求項６】
関節炎が、慢性関節リウマチ又は変形性関節症による関節炎である、請求項５に記載の関節炎治療剤。
【請求項７】
関節炎が慢性の関節炎である、請求項５又は６に記載の関節炎治療剤。
【請求項８】
ＣＤ４４が高発現している関節炎の治療のために使用される、請求項５から７の何れかに記載の関節炎治療剤。
【請求項９】
低分子量コンドロイチン硫酸が重量平均分子量１０ｋＤ以下のコンドロイチン硫酸である、請求項５から８の何れかに記載の関節炎治療剤。
【請求項１０】
低分子量コンドロイチン硫酸が重量平均分子量２〜３ｋＤのコンドロイチン硫酸である、請求項５から８の何れかに記載の関節炎治療剤。
【請求項１１】
低分子量コンドロイチン硫酸が、ガラクトサミンの４位と６位が硫酸化されているＥ型コンドロイチン硫酸である、請求項５から１０の何れかに記載の関節炎治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００６−３２７９５５（Ｐ２００６−３２７９５５Ａ）
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１５０８２０（Ｐ２００５−１５０８２０）
【出願日】平成１７年５月２４日（２００５．５．２４）
【出願人】（０００００２８１９）大正製薬株式会社 (437)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２４日（２００５．５．２４）
【出願人】（０００００２８１９）大正製薬株式会社 (437)
【Ｆターム（参考）】
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