低密度リポ蛋白中コレステロール測定方法およびその試薬
【課題】 本発明は、血清、血漿等の生体試料中の低密度リポ蛋白中コレステロール（ＬＤＬ）の測定方法およびその試薬に関する。
【解決手段】 酵素反応による低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法において、第一反応で、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を含む反応液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で、第一反応における上記両酵素の低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を、反応液中に加えることを特徴とする方法。
【解決手段】 酵素反応による低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法において、第一反応で、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を含む反応液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で、第一反応における上記両酵素の低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を、反応液中に加えることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清、血漿等の生体試料中の低密度リポ蛋白中コレステロール（ＬＤＬ）の測定方法およびその試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清中の脂質の主な成分は、コレステロール、中性脂肪、リン脂質等である。これら血清脂質はアポ蛋白と結合してリポ蛋白を形成し、血液中を循環している。このリポ蛋白は密度の差により高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、ＬＤＬ、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）等に分類される。これらリポ蛋白のうち、ＨＤＬは組織に沈着した過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、抗動脈硬化作用がある。一方、ＬＤＬは肝臓から各組織へのコレステロールの主たる運搬体であり、ＬＤＬの増加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられている。このことから、ＬＤＬ中のコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）は、動脈硬化症、虚血性心疾患（冠動脈疾患）の危険因子と考えられ、ＬＤＬ−Ｃの含有量を知ることは、これら疾患の診断、治療、および予防において重要である。
【０００３】
従来、ＬＤＬ−Ｃの測定法としては、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法、算出式による算出法等が知られている。これら従来法のうち、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法は、沈殿・遠心分離処理、超遠心分離処理、電気泳動処理により、ＬＤＬとＬＤＬ以外のリポ蛋白とを分離する前処理工程が必要であるため、操作が煩雑であり、現在、臨床検査分野で広く普及している自動分析機だけで直接測定を実施することができないという問題点がある。また、フリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）の式で知られている総コレステロール値、ＨＤＬ中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）値及び中性脂肪値から算出する算出法も、中性脂肪高値試料を用いた場合には食事の影響等を受け、正確なＬＤＬ−Ｃ量を測定、算出することができないという問題点がある。
【０００４】
これに対し、これらの問題点を解消する方法としてＬＤＬ−Ｃを遠心分離等の前処理なく自動分析機で直接測定する方法が開発されてきている。ポリアニオンを含むリポ蛋白凝集剤を用いた方法として、ＬＤＬのみを凝集させる水溶性ポリマーの存在下でＬＤＬ−Ｃの凝集によって上昇する反応液濁度を測定する方法が開示されている（たとえば、特許文献１参照）。また、ＬＤＬを一旦凝集させた後ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、さらに凝集したＬＤＬを解凝集させ、ＬＤＬ−Ｃを酵素反応させてＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている（たとえば、特許文献２参照）。また、ＬＤＬのみを反応阻害する試薬の存在下でＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを消去した後に残存したＬＤＬ−Ｃを反応させ検出する、あるいはＨＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを凝集させてＨＤＬ−Ｃを反応消去した後にＬＤＬのみに作用する酵素を用いてＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている（たとえば、特許文献３参照）。また、ＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールの酵素反応を抑制するシクロデキストリン誘導体を用いる方法が開示されている（たとえば、特許文献４、５参照）。しかし、これらポリアニオンおよび２価金属イオンを含むリポ蛋白凝集剤を用いた方法は、凝集体の濁りの散乱光を吸光度として測定することから特異性、精密性が劣る。またポリアニオンおよび２価金属イオンを含むリポ蛋白凝集剤と自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じることから、排液ラインがつまり自動分析機の故障もしくは他測定項目の正確性、精密性に悪影響をもたらす。
【０００５】
界面活性剤を用いた方法として、第一工程でＨＬＢ値が１３〜１５のポリアルキレンオキサイド誘導体等の界面活性剤を用いてＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを全て反応させた後に残存したＬＤＬ−Ｃを第二工程で別種の界面活性剤を用いて反応させ検出する方法が開示されている（たとえば、特許文献６参照）。しかし、ここで用いられる界面活性剤はＨＤＬ−Ｃにはよく作用するが、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する作用は充分ではなく、２価金属イオンを大過剰存在させる必要があり、前述のごとく自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じ、自動分析機への適用性に問題が生じる。また、血清に対しポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、コレステロール測定用酵素試薬を添加し、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中コレステロールを優先的に反応させた後、その後の反応量を測定することでＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている（たとえば、特許文献７参照）。本法においても、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する作用は充分ではなく、ＶＬＤＬ、ＣＭに対する反応性を増強するためにポリアニオンおよび２価金属を必要とすることから、前述のごとく自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じ、自動分析機への適用性に問題が生じる。また、両性界面活性剤とカルボキシル基またはスルホン酸基を有する脂肪族アミン類の存在下でＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法が開示されている（たとえば、特許文献８参照）。また、両性界面活性剤とポリアニオンの存在下でＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法が開示されている（たとえば、特許文献９参照）。これらの方法は、第一反応におけるＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等のＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を抑制を目的としたものである。
【０００６】
また、ＬＤＬのみに作用する化学修飾酵素を用いてＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法も開示されている（たとえば、特許文献１０参照）。また、生体試料と膵臓由来コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを、アルブミンが測定系全体の０．０１重量％以上及び胆汁酸又はその塩が存在する条件下で反応させ、その後微生物由来コレステロールエステラーゼを作用させ測定する方法が開示されている（たとえば、特許文献１１参照）。この方法は、第一試薬と第二試薬に由来の異なるコレステロールエステラーゼを作用させることから、酵素使用量が多くなることになり経済性に問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許２７４９００９号公報
【特許文献２】特許３１０７４９２号公報
【特許文献３】特許３２５６２４１号公報
【特許文献４】特開平１０−３１１８３３号公報
【特許文献５】特開平１１−３０６１７号公報
【特許文献６】特許３０５８６０２号公報
【特許文献７】特許３１９３６３４号公報
【特許文献８】特開平１０−８４９９７号公報
【特許文献９】特開平２０００−６０６００号公報
【特許文献１０】特開平１０−８０３００号公報
【特許文献１１】特開平１１−９３００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このことから、本発明が解決しようとする課題は、遠心分離、電気泳動等の前処理の必要性がなく、種々の自動分析機に適用可能な、簡便性、特異性、精密性に優れたＬＤＬ−Ｃの分別測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、第一反応でＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに作用する、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼ、およびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を添加し、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを消去した後、第二反応で第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を加えることでＬＤＬ−Ｃを簡便に、特異性、精密性良く分別測定できることを見出した。また、本測定法ではポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく、自動分析機への適用性が優れていることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、第一反応で化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を添加し、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を加えることを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（２）化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（３）コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩より選択される１種または複数である（２）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（４）コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．０１〜０．２％である（２）、（３）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（５）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（６）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン（２モル）ポリオキシエチレンデシルエーテルである（５）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（７）少なくとも第一反応中に２価金属イオンを含有する（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（８）２価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである（７）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（９）ポリアニオンを含有しない（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１０）ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である（９）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１１）試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、第一反応で化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または
未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を添加し、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を加えることを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１２）化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である（１１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬（１３）コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩より選択される１種または複数である（１２）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１４）コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．０１〜０．２％である（１２）、（１３）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１５）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である（１１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１６）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン（２モル）ポリオキシエチレンデシルエーテルである（１１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１７）少なくとも第一反応中に２価金属イオンを含有する（１１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１８）２価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである（１７）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１９）ポリアニオンを含有しない（１１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２０）ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である（１９）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、遠心分離、電気泳動等の試料の前処理を行なう必要性がなく、種々の自動分析機に適用可能な、簡便性、特異性、精密性に優れたＬＤＬ−Ｃの分別測定法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において「阻害」とは、ＬＤＬを凝集させることなく、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼのＬＤＬに対する反応性を低下させることを意味する。
【００１２】
本発明の一実施態様として、第一試薬に、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼ、化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ、色源体、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、ペルオキシダーゼ、カプラー、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＬＤＬ−Ｃ測定試薬がある。
【００１３】
また、第一試薬に、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼ、化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色源体、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、カプラー、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＬＤＬ−Ｃ測定試薬がある。
【００１４】
本発明で用いるコレステロールオキシダーゼ（コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素）は、その起源は特に限定されないが、例えば、ノカルディア属、シュードモナス属等の微生物、牛膵臓等動物臓器に由来する物等を用いることができる。これらは市販のものを入手することが出来る。
本発明においては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＬＤＬ−Ｃに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
酵素の使用量下限は、第一試薬中で通常０．５Ｕ／ｍＬ、好ましくは１Ｕ／ｍＬである。使用量上限は、１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。
【００１５】
本発明に用いるコレステロールエステラーゼ（コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素）は、その起源は特に限定されないが、例えば、キャンディダ属、シュードモナス属等の微生物、牛膵臓等動物臓器に由来する物等を用いることができる。これらは市販のものを入手することが出来る。
本発明においては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＬＤＬ−Ｃに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
酵素の使用量下限は、第一試薬中で通常０．０１Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．０５Ｕ／ｍＬである。使用量上限は、１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。
【００１６】
本発明で用いる、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質としては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性への影響が実質的になく、ＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させるものであれば特に限定はない。
このような物質として例えばコール酸誘導体がある。コール酸誘導体としては、特に限定されないが、好ましくは３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩が適切であるが、少ない添加量でＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させ得ることから、更に好ましくはＮ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドおよびその塩が良い。また、これらのコール酸誘導体より選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。これらの使用量としてはコール酸誘導体の総量として第一試薬中で通常０．００１〜５％の範囲で用いられ得るが、好ましくは限界ミセル濃度（ｃ．ｍ．ｃ）付近かそれ以下で使用するのがよい。これは、これらコール酸誘導体の本来ある界面活性剤としての作用が反って本発明の期待するコレステロールエステラーゼおよび／またはコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応阻害効果を弱めることに起因する。
限界ミセル濃度の測定は電気伝導度、浸透圧、氷点降下、蒸気圧、粘度、密度、可溶化能、洗浄力、光散乱、色素の変化などの物理性質の急変点を測定することで測定が可能である。例えば、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸の限界ミセル濃度は、０．５０％（ｗ／ｖ）であり、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸は０．５１％（ｗ／ｖ）であり、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドは０．２６％（ｗ／ｖ）であり、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドは０．１２％（ｗ／ｖ）であることが知られている。したがって、これらの好ましい使用量としては０．０１〜０．６％である。また、その他のコール酸誘導体についても同じく限界ミセル濃度を知ることで使用量の最適化が可能である。
【００１７】
一方、ポリアニオン等の凝集剤等もＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させるものであるが、自動分析機への適用性に悪影響を及ぼすことから、添加しないかまたは前述の自動分析機で用いられるアルカリ性洗剤との共存により濁りまたは沈殿が生じない程度に添加することができる。しかし、好ましくは添加しない方がよい。このようなポリアニオンとしては、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩が挙げられる。
これらの使用量としては、反応終濃度として０〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００１８】
本発明で用いる２価金属イオンとしては、ＨＤＬ−Ｃに対する反応性を向上させることを目的として、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンが用いられるが、好ましくは、マグネシウムイオン、カルシウムイオンが好適である。また、これらの２価金属イオンは選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。また、少なくとも第一試薬に添加されていればよい。これらの使用量は、自動分析機への適用性を考慮し、第一試薬中で通常０．０００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．００５〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
本発明の化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質とは、第一試薬中におけるＬＤＬ−Ｃに対する阻害を、当該物質を含む第二試薬の添加により軽減または消失が可能なものであれば特に限定されないが、好ましくはポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数を組合わせて用いられる。更に好ましくはポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類より選択される１種または複数を組合わせて用いられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としては、エマルゲンＡ６０（ＨＬＢ：１２．８）、エマルゲンＡ９０（ＨＬＢ：１４．５）、エマルゲンＢ６６（ＨＬＢ：１３．２）等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７（ＨＬＢ：１０）、エマレックスＤＡＰＥ０２１０（ＨＬＢ：１１）、エマレックスＤＡＰＥ０２１２（ＨＬＢ：１２）、エマレックスＤＡＰＥ０２１５（ＨＬＢ：１３）、エマレックスＤＡＰＥ０２２０（ＨＬＢ：１４）、エマレックスＤＡＰＥ０２２０（ＨＬＢ：１５）等が挙げられる。これら界面活性剤のＨＬＢは「新界面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版編で公知であるが、ＨＬＢの範囲として通常、１０〜１５であり、好ましくは１０〜１３、更に好ましくは１０〜１２である。これらの使用量は、自動分析機への適用性を考慮し、第ニ試薬中で通常０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０５〜０．３％（ｗ／ｖ）である。
【００２０】
本発明で用いる色源体としては特に限定されないが、水素供与体、ロイコ体、テトラゾリウム塩などが挙げられる。
【００２１】
水素供与体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。また、これら水素供与体はカップラーと組合わせて用いることができる。カプラーとしては４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。
【００２２】
また、ロイコ体としては、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩等が挙げられる。
【００２３】
また、テトラゾリウム塩としては、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。
【００２４】
色源体の使用量としては、溶解度を考慮して反応終濃度として０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００２５】
本発明では、さらにＬＤＬ−Ｃに対する特異性、精密性を損なわない範囲で、界面活性剤を共存させることができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤または／および両性イオン界面活性剤が好適に用いられる。
【００２６】
本発明で用いる非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ
ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ
ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ
ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００２７】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０等が挙
げられる。ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２８】
本発明で用いる両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、等が挙げられる。
【００２９】
また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。該緩衝液のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには６〜８が好ましい。中でも第一試薬においてはＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させる目的で７．０〜７．５が好ましい。また、第二試薬は、第二試薬との混合したときのｐＨを考慮し、ＬＤＬ−Ｃに対する反応性を向上させる目的で６．５〜７．５が好ましい。これらの使用量は、通常０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０２〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。
【００３０】
本発明において、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色源体安定化剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。色源体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。
【００３１】
本発明において、第一反応におけるＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを優先的に消去する方法としては、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼの作用により生成した過酸化水素を、例えばカタラーゼ、またはペルオキシダーゼと前述の色源体、またはペルオキシダーゼと前述のカプラーを用いて消去することができるが、特に限定されない。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
下記組成１〜３のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し下記測定条件で、試料としてヒト血清より精製したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭを測定し、各測定値より各々のリポ蛋白中のコレステロール濃度を１００％として相対％を求めた。また、比較例として下記組成４〜６のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し実施例と同様の検討を行なった。尚、精製リポ蛋白画分の調製はＨａｔｃｈ ａｎｄ Ｌｅｅｓの方法の、３種の密度液を用い超遠心分離にて分離・分取した。
【００３３】
（試薬の調製）
下記組成１〜３のＬＤＬ−Ｃ測定試薬をそれぞれ調製した。
組成１
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．０５％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３４】
組成２
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製） ０．２％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３５】
組成３
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．０５％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類（エマルゲンＢ６６；花王社製）
０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３６】
組成４
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．０５％
未修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３７】
組成５
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３８】
組成６
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．０５％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３９】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．４μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍ主波長、８００ｎｍ副波長で吸光度を測定した。ＬＤＬ−Ｃ濃度未知試料のＬＤＬ−Ｃ濃度の算出は、精製水および１１０ｍｇ／ｄＬ ＬＤＬ−Ｃ標準血清の測定吸光度より算出して求めた。
【００４０】
【表１】
【００４１】
結果
表１に示す。実施例の組成１〜３はいずれもＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する非特異反応は５．０％以下であり、良好な特異性が確認された。一方、比較例の組成４はＬＤＬ−Ｃを全く回収しない。この原因としては、ＬＤＬ−Ｃが第一反応においてほとんど消去されたものと考えられる。比較例の組成５は、ＬＤＬ−Ｃを一部回収するものの、高密度リポ蛋白中コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）に対し非特異反応がある。この原因としては、第一反応においてＨＤＬ−Ｃを消去しきれていないものと考えられる。比較例の組成６は、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する非特異反応は５．０％以下であるが、ＬＤＬ−Ｃの回収が低い。この原因としては、第ニ反応においてＬＤＬ−Ｃに対する反応性が十分に得られていないものと考えられる。
【００４２】
（実施例２）
実施例１に示す組成１〜３のＬＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例１に示す測定条件で、試料として健常人血清２０検体を測定した。また、比較例として下記組成４〜６のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し実施例と同様の測定を行なった。各試薬における測定値は、当該検体の総コレステロール値（東洋紡社製 コレスカラー・リキッド使用）、ＨＤＬ−Ｃ値（第一化学社製 分画剤試液により分画した試料を東洋紡社製 コレスカラー・リキッドで測定）及び中性脂肪値（東洋紡社製 リピドス・リキッド）を測定し、フリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）の計算式を用いて算出したＬＤＬ−Ｃ値を対照として相対％を求めた。
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
結果
表２に測定値を示し、表３に対照の測定値に対する相対％を示す。各組成の相対％は、実施例の組成１で９５．７〜１０６．５％、組成２で９３．１〜１０８．９％、組成３で９２．５〜１０５．６％と良好であった。一方、比較例では、組成４で−５８．８〜１０５．３％、組成５で７９．８〜１０４．９％、組成６では８７．３〜１１４．９％と特異性または精密性に問題があった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法は、血中の低密度リポ蛋白中コレステロールを簡便に、特異性、精密性良く分別測定でき、ポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく自動分析機への適用性が優れていることから、特に動脈硬化症等の臨床検査の分野においてより的確で迅速な診断を行なうことができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清、血漿等の生体試料中の低密度リポ蛋白中コレステロール（ＬＤＬ）の測定方法およびその試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清中の脂質の主な成分は、コレステロール、中性脂肪、リン脂質等である。これら血清脂質はアポ蛋白と結合してリポ蛋白を形成し、血液中を循環している。このリポ蛋白は密度の差により高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、ＬＤＬ、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）等に分類される。これらリポ蛋白のうち、ＨＤＬは組織に沈着した過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、抗動脈硬化作用がある。一方、ＬＤＬは肝臓から各組織へのコレステロールの主たる運搬体であり、ＬＤＬの増加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられている。このことから、ＬＤＬ中のコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）は、動脈硬化症、虚血性心疾患（冠動脈疾患）の危険因子と考えられ、ＬＤＬ−Ｃの含有量を知ることは、これら疾患の診断、治療、および予防において重要である。
【０００３】
従来、ＬＤＬ−Ｃの測定法としては、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法、算出式による算出法等が知られている。これら従来法のうち、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法は、沈殿・遠心分離処理、超遠心分離処理、電気泳動処理により、ＬＤＬとＬＤＬ以外のリポ蛋白とを分離する前処理工程が必要であるため、操作が煩雑であり、現在、臨床検査分野で広く普及している自動分析機だけで直接測定を実施することができないという問題点がある。また、フリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）の式で知られている総コレステロール値、ＨＤＬ中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）値及び中性脂肪値から算出する算出法も、中性脂肪高値試料を用いた場合には食事の影響等を受け、正確なＬＤＬ−Ｃ量を測定、算出することができないという問題点がある。
【０００４】
これに対し、これらの問題点を解消する方法としてＬＤＬ−Ｃを遠心分離等の前処理なく自動分析機で直接測定する方法が開発されてきている。ポリアニオンを含むリポ蛋白凝集剤を用いた方法として、ＬＤＬのみを凝集させる水溶性ポリマーの存在下でＬＤＬ−Ｃの凝集によって上昇する反応液濁度を測定する方法が開示されている（たとえば、特許文献１参照）。また、ＬＤＬを一旦凝集させた後ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、さらに凝集したＬＤＬを解凝集させ、ＬＤＬ−Ｃを酵素反応させてＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている（たとえば、特許文献２参照）。また、ＬＤＬのみを反応阻害する試薬の存在下でＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを消去した後に残存したＬＤＬ−Ｃを反応させ検出する、あるいはＨＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを凝集させてＨＤＬ−Ｃを反応消去した後にＬＤＬのみに作用する酵素を用いてＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている（たとえば、特許文献３参照）。また、ＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールの酵素反応を抑制するシクロデキストリン誘導体を用いる方法が開示されている（たとえば、特許文献４、５参照）。しかし、これらポリアニオンおよび２価金属イオンを含むリポ蛋白凝集剤を用いた方法は、凝集体の濁りの散乱光を吸光度として測定することから特異性、精密性が劣る。またポリアニオンおよび２価金属イオンを含むリポ蛋白凝集剤と自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じることから、排液ラインがつまり自動分析機の故障もしくは他測定項目の正確性、精密性に悪影響をもたらす。
【０００５】
界面活性剤を用いた方法として、第一工程でＨＬＢ値が１３〜１５のポリアルキレンオキサイド誘導体等の界面活性剤を用いてＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを全て反応させた後に残存したＬＤＬ−Ｃを第二工程で別種の界面活性剤を用いて反応させ検出する方法が開示されている（たとえば、特許文献６参照）。しかし、ここで用いられる界面活性剤はＨＤＬ−Ｃにはよく作用するが、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する作用は充分ではなく、２価金属イオンを大過剰存在させる必要があり、前述のごとく自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じ、自動分析機への適用性に問題が生じる。また、血清に対しポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、コレステロール測定用酵素試薬を添加し、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中コレステロールを優先的に反応させた後、その後の反応量を測定することでＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている（たとえば、特許文献７参照）。本法においても、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する作用は充分ではなく、ＶＬＤＬ、ＣＭに対する反応性を増強するためにポリアニオンおよび２価金属を必要とすることから、前述のごとく自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じ、自動分析機への適用性に問題が生じる。また、両性界面活性剤とカルボキシル基またはスルホン酸基を有する脂肪族アミン類の存在下でＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法が開示されている（たとえば、特許文献８参照）。また、両性界面活性剤とポリアニオンの存在下でＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法が開示されている（たとえば、特許文献９参照）。これらの方法は、第一反応におけるＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等のＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を抑制を目的としたものである。
【０００６】
また、ＬＤＬのみに作用する化学修飾酵素を用いてＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法も開示されている（たとえば、特許文献１０参照）。また、生体試料と膵臓由来コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを、アルブミンが測定系全体の０．０１重量％以上及び胆汁酸又はその塩が存在する条件下で反応させ、その後微生物由来コレステロールエステラーゼを作用させ測定する方法が開示されている（たとえば、特許文献１１参照）。この方法は、第一試薬と第二試薬に由来の異なるコレステロールエステラーゼを作用させることから、酵素使用量が多くなることになり経済性に問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許２７４９００９号公報
【特許文献２】特許３１０７４９２号公報
【特許文献３】特許３２５６２４１号公報
【特許文献４】特開平１０−３１１８３３号公報
【特許文献５】特開平１１−３０６１７号公報
【特許文献６】特許３０５８６０２号公報
【特許文献７】特許３１９３６３４号公報
【特許文献８】特開平１０−８４９９７号公報
【特許文献９】特開平２０００−６０６００号公報
【特許文献１０】特開平１０−８０３００号公報
【特許文献１１】特開平１１−９３００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このことから、本発明が解決しようとする課題は、遠心分離、電気泳動等の前処理の必要性がなく、種々の自動分析機に適用可能な、簡便性、特異性、精密性に優れたＬＤＬ−Ｃの分別測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、第一反応でＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに作用する、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼ、およびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を添加し、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを消去した後、第二反応で第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を加えることでＬＤＬ−Ｃを簡便に、特異性、精密性良く分別測定できることを見出した。また、本測定法ではポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく、自動分析機への適用性が優れていることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、第一反応で化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を添加し、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を加えることを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（２）化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（３）コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩より選択される１種または複数である（２）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（４）コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．０１〜０．２％である（２）、（３）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（５）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（６）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン（２モル）ポリオキシエチレンデシルエーテルである（５）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（７）少なくとも第一反応中に２価金属イオンを含有する（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（８）２価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである（７）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（９）ポリアニオンを含有しない（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１０）ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である（９）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１１）試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、第一反応で化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または
未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を添加し、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を加えることを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１２）化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である（１１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬（１３）コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩より選択される１種または複数である（１２）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１４）コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．０１〜０．２％である（１２）、（１３）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１５）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である（１１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１６）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン（２モル）ポリオキシエチレンデシルエーテルである（１１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１７）少なくとも第一反応中に２価金属イオンを含有する（１１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１８）２価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである（１７）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１９）ポリアニオンを含有しない（１１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２０）ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である（１９）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、遠心分離、電気泳動等の試料の前処理を行なう必要性がなく、種々の自動分析機に適用可能な、簡便性、特異性、精密性に優れたＬＤＬ−Ｃの分別測定法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において「阻害」とは、ＬＤＬを凝集させることなく、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼのＬＤＬに対する反応性を低下させることを意味する。
【００１２】
本発明の一実施態様として、第一試薬に、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼ、化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ、色源体、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、ペルオキシダーゼ、カプラー、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＬＤＬ−Ｃ測定試薬がある。
【００１３】
また、第一試薬に、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼ、化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色源体、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、カプラー、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＬＤＬ−Ｃ測定試薬がある。
【００１４】
本発明で用いるコレステロールオキシダーゼ（コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素）は、その起源は特に限定されないが、例えば、ノカルディア属、シュードモナス属等の微生物、牛膵臓等動物臓器に由来する物等を用いることができる。これらは市販のものを入手することが出来る。
本発明においては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＬＤＬ−Ｃに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
酵素の使用量下限は、第一試薬中で通常０．５Ｕ／ｍＬ、好ましくは１Ｕ／ｍＬである。使用量上限は、１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。
【００１５】
本発明に用いるコレステロールエステラーゼ（コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素）は、その起源は特に限定されないが、例えば、キャンディダ属、シュードモナス属等の微生物、牛膵臓等動物臓器に由来する物等を用いることができる。これらは市販のものを入手することが出来る。
本発明においては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＬＤＬ−Ｃに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
酵素の使用量下限は、第一試薬中で通常０．０１Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．０５Ｕ／ｍＬである。使用量上限は、１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。
【００１６】
本発明で用いる、化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質としては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性への影響が実質的になく、ＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させるものであれば特に限定はない。
このような物質として例えばコール酸誘導体がある。コール酸誘導体としては、特に限定されないが、好ましくは３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩が適切であるが、少ない添加量でＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させ得ることから、更に好ましくはＮ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドおよびその塩が良い。また、これらのコール酸誘導体より選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。これらの使用量としてはコール酸誘導体の総量として第一試薬中で通常０．００１〜５％の範囲で用いられ得るが、好ましくは限界ミセル濃度（ｃ．ｍ．ｃ）付近かそれ以下で使用するのがよい。これは、これらコール酸誘導体の本来ある界面活性剤としての作用が反って本発明の期待するコレステロールエステラーゼおよび／またはコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応阻害効果を弱めることに起因する。
限界ミセル濃度の測定は電気伝導度、浸透圧、氷点降下、蒸気圧、粘度、密度、可溶化能、洗浄力、光散乱、色素の変化などの物理性質の急変点を測定することで測定が可能である。例えば、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸の限界ミセル濃度は、０．５０％（ｗ／ｖ）であり、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸は０．５１％（ｗ／ｖ）であり、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドは０．２６％（ｗ／ｖ）であり、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドは０．１２％（ｗ／ｖ）であることが知られている。したがって、これらの好ましい使用量としては０．０１〜０．６％である。また、その他のコール酸誘導体についても同じく限界ミセル濃度を知ることで使用量の最適化が可能である。
【００１７】
一方、ポリアニオン等の凝集剤等もＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させるものであるが、自動分析機への適用性に悪影響を及ぼすことから、添加しないかまたは前述の自動分析機で用いられるアルカリ性洗剤との共存により濁りまたは沈殿が生じない程度に添加することができる。しかし、好ましくは添加しない方がよい。このようなポリアニオンとしては、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩が挙げられる。
これらの使用量としては、反応終濃度として０〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０〜０．５％（ｗ／ｖ）である。
【００１８】
本発明で用いる２価金属イオンとしては、ＨＤＬ−Ｃに対する反応性を向上させることを目的として、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンが用いられるが、好ましくは、マグネシウムイオン、カルシウムイオンが好適である。また、これらの２価金属イオンは選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。また、少なくとも第一試薬に添加されていればよい。これらの使用量は、自動分析機への適用性を考慮し、第一試薬中で通常０．０００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．００５〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。
【００１９】
本発明の化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質とは、第一試薬中におけるＬＤＬ−Ｃに対する阻害を、当該物質を含む第二試薬の添加により軽減または消失が可能なものであれば特に限定されないが、好ましくはポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数を組合わせて用いられる。更に好ましくはポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類より選択される１種または複数を組合わせて用いられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としては、エマルゲンＡ６０（ＨＬＢ：１２．８）、エマルゲンＡ９０（ＨＬＢ：１４．５）、エマルゲンＢ６６（ＨＬＢ：１３．２）等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７（ＨＬＢ：１０）、エマレックスＤＡＰＥ０２１０（ＨＬＢ：１１）、エマレックスＤＡＰＥ０２１２（ＨＬＢ：１２）、エマレックスＤＡＰＥ０２１５（ＨＬＢ：１３）、エマレックスＤＡＰＥ０２２０（ＨＬＢ：１４）、エマレックスＤＡＰＥ０２２０（ＨＬＢ：１５）等が挙げられる。これら界面活性剤のＨＬＢは「新界面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版編で公知であるが、ＨＬＢの範囲として通常、１０〜１５であり、好ましくは１０〜１３、更に好ましくは１０〜１２である。これらの使用量は、自動分析機への適用性を考慮し、第ニ試薬中で通常０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０５〜０．３％（ｗ／ｖ）である。
【００２０】
本発明で用いる色源体としては特に限定されないが、水素供与体、ロイコ体、テトラゾリウム塩などが挙げられる。
【００２１】
水素供与体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。また、これら水素供与体はカップラーと組合わせて用いることができる。カプラーとしては４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。
【００２２】
また、ロイコ体としては、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩等が挙げられる。
【００２３】
また、テトラゾリウム塩としては、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。
【００２４】
色源体の使用量としては、溶解度を考慮して反応終濃度として０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【００２５】
本発明では、さらにＬＤＬ−Ｃに対する特異性、精密性を損なわない範囲で、界面活性剤を共存させることができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤または／および両性イオン界面活性剤が好適に用いられる。
【００２６】
本発明で用いる非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ
ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ
ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ
ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００２７】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０等が挙
げられる。ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２８】
本発明で用いる両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、等が挙げられる。
【００２９】
また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、フタル酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。該緩衝液のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには６〜８が好ましい。中でも第一試薬においてはＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させる目的で７．０〜７．５が好ましい。また、第二試薬は、第二試薬との混合したときのｐＨを考慮し、ＬＤＬ−Ｃに対する反応性を向上させる目的で６．５〜７．５が好ましい。これらの使用量は、通常０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０２〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。
【００３０】
本発明において、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色源体安定化剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。色源体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。
【００３１】
本発明において、第一反応におけるＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを優先的に消去する方法としては、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼの作用により生成した過酸化水素を、例えばカタラーゼ、またはペルオキシダーゼと前述の色源体、またはペルオキシダーゼと前述のカプラーを用いて消去することができるが、特に限定されない。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
下記組成１〜３のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し下記測定条件で、試料としてヒト血清より精製したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭを測定し、各測定値より各々のリポ蛋白中のコレステロール濃度を１００％として相対％を求めた。また、比較例として下記組成４〜６のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し実施例と同様の検討を行なった。尚、精製リポ蛋白画分の調製はＨａｔｃｈ ａｎｄ Ｌｅｅｓの方法の、３種の密度液を用い超遠心分離にて分離・分取した。
【００３３】
（試薬の調製）
下記組成１〜３のＬＤＬ−Ｃ測定試薬をそれぞれ調製した。
組成１
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．０５％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３４】
組成２
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製） ０．２％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３５】
組成３
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．０５％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類（エマルゲンＢ６６；花王社製）
０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３６】
組成４
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．０５％
未修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３７】
組成５
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３８】
組成６
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製） ０．０５％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３） ０．５Ｕ／ｍＬ
未修飾コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１） ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製 微生物由来） １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩 ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（和光純薬社製） ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
【００３９】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．４μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍ主波長、８００ｎｍ副波長で吸光度を測定した。ＬＤＬ−Ｃ濃度未知試料のＬＤＬ−Ｃ濃度の算出は、精製水および１１０ｍｇ／ｄＬ ＬＤＬ−Ｃ標準血清の測定吸光度より算出して求めた。
【００４０】
【表１】
【００４１】
結果
表１に示す。実施例の組成１〜３はいずれもＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する非特異反応は５．０％以下であり、良好な特異性が確認された。一方、比較例の組成４はＬＤＬ−Ｃを全く回収しない。この原因としては、ＬＤＬ−Ｃが第一反応においてほとんど消去されたものと考えられる。比較例の組成５は、ＬＤＬ−Ｃを一部回収するものの、高密度リポ蛋白中コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）に対し非特異反応がある。この原因としては、第一反応においてＨＤＬ−Ｃを消去しきれていないものと考えられる。比較例の組成６は、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する非特異反応は５．０％以下であるが、ＬＤＬ−Ｃの回収が低い。この原因としては、第ニ反応においてＬＤＬ−Ｃに対する反応性が十分に得られていないものと考えられる。
【００４２】
（実施例２）
実施例１に示す組成１〜３のＬＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例１に示す測定条件で、試料として健常人血清２０検体を測定した。また、比較例として下記組成４〜６のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し実施例と同様の測定を行なった。各試薬における測定値は、当該検体の総コレステロール値（東洋紡社製 コレスカラー・リキッド使用）、ＨＤＬ−Ｃ値（第一化学社製 分画剤試液により分画した試料を東洋紡社製 コレスカラー・リキッドで測定）及び中性脂肪値（東洋紡社製 リピドス・リキッド）を測定し、フリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）の計算式を用いて算出したＬＤＬ−Ｃ値を対照として相対％を求めた。
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
結果
表２に測定値を示し、表３に対照の測定値に対する相対％を示す。各組成の相対％は、実施例の組成１で９５．７〜１０６．５％、組成２で９３．１〜１０８．９％、組成３で９２．５〜１０５．６％と良好であった。一方、比較例では、組成４で−５８．８〜１０５．３％、組成５で７９．８〜１０４．９％、組成６では８７．３〜１１４．９％と特異性または精密性に問題があった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法は、血中の低密度リポ蛋白中コレステロールを簡便に、特異性、精密性良く分別測定でき、ポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく自動分析機への適用性が優れていることから、特に動脈硬化症等の臨床検査の分野においてより的確で迅速な診断を行なうことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する手段において、第一反応で、
（１）化学修飾コレステロールエステラーゼ、および、
（２）化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼ、および、
（３）これらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質としてコール酸誘導体、および、
（４）高密度リポ蛋白のコレステロールに対する反応性を向上させる物質として２価金属イオン
を含む反応液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、
（５）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を、
反応液中に加えることを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項２】
コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩より選択される１種または複数である、請求項１に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項３】
コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．０１〜０．２％である、請求項１または２に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項４】
第二反応で、第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である、請求項１〜３のいずれかに記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項５】
第二反応で、第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテルおよびポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である、請求項４に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項６】
ポリアニオンを含有しない請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
【請求項７】
試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するための試薬であって、
第一反応用の試薬に、
（１）化学修飾コレステロールエステラーゼ、および、
（２）化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼ、および、
（３）これらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質としてコール酸誘導体、および、
（４）高密度リポ蛋白のコレステロールに対する反応性を向上させる物質として２価金属イオンを含み、
第二反応用の試薬に、
（５）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を、
含むことを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
【請求項１】
試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する手段において、第一反応で、
（１）化学修飾コレステロールエステラーゼ、および、
（２）化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼ、および、
（３）これらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質としてコール酸誘導体、および、
（４）高密度リポ蛋白のコレステロールに対する反応性を向上させる物質として２価金属イオン
を含む反応液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、
（５）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を、
反応液中に加えることを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項２】
コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸およびその塩より選択される１種または複数である、請求項１に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項３】
コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．０１〜０．２％である、請求項１または２に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項４】
第二反応で、第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である、請求項１〜３のいずれかに記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項５】
第二反応で、第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテルおよびポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である、請求項４に記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項６】
ポリアニオンを含有しない請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
【請求項７】
試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するための試薬であって、
第一反応用の試薬に、
（１）化学修飾コレステロールエステラーゼ、および、
（２）化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼ、および、
（３）これらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質としてコール酸誘導体、および、
（４）高密度リポ蛋白のコレステロールに対する反応性を向上させる物質として２価金属イオンを含み、
第二反応用の試薬に、
（５）第一反応における化学修飾または未修飾のコレステロールエステラーゼおよび化学修飾または未修飾のコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を、
含むことを特徴とする低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
【公開番号】特開２０１０−６３４６８（Ｐ２０１０−６３４６８Ａ）
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９０５２２（Ｐ２００９−２９０５２２）
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【分割の表示】特願２００３−３７５４５６（Ｐ２００３−３７５４５６）の分割
【原出願日】平成１５年１１月５日（２００３．１１．５）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【分割の表示】特願２００３−３７５４５６（Ｐ２００３−３７５４５６）の分割
【原出願日】平成１５年１１月５日（２００３．１１．５）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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