修飾されたステフィンＡスカフォールドタンパク質
本発明は、ペプチドアプタマーのようなペプチドのディスプレイのための新しいスカフォールドタンパク質を提供する。新しいスカフォールドタンパク質はステフィンＡまたはＳＴＭ（ステフィンＡの変異体）の修飾物であり、そしてスカフォールドタンパク質およびディスプレイシステムとして有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチド、例えばペプチドアプタマーのようなペプチドのディスプレイのための新しいスカフォールドタンパク質に関し、特に、本発明は、修飾されたステフィンＡポリペプチドおよびステフィンＡに基づく修飾された人工的なタンパク質の使用に関し、全てをスカフォールドタンパク質およびディスプレイ法に使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質相互作用の研究は多くの生物学的プロセス、例えば遺伝子産物の健康および疾患の双方における生体内の役割のようなものにおいて重要である。ペプチドアプタマーは、特に分子医学の基礎および応用の双方の面のために有用である重要な分子ツールとして現れた。所定の標的タンパク質と細胞内レベルにおいて、特異的に結合して不活性化するそれらの能力により、それらは生体外および生体内の双方の機能タンパク質分析（解析）のための実験的方策を提供する。それらはまた細胞外タンパク質に対して使用することもできる。タンパク質機能の研究での適用と同様に、これらのツールは従って、分子検出、診断のため、および／または治療剤として有用である。ペプチドおよびペプチドアプタマーは溶液において遊離で使用することができる。しかしながら、小（低分子）ペプチドが非拘束のとき、制限された相互作用面を提示する構造を形成する傾向にある。さらに、それらは標的分子との関連により、立体構造のエントロピーを失うことが多く、結合の自由エネルギーが減少し、その結果、フリーのペプチドは緊密な非共有結合複合体を形成しないことが多く、それは問題である。その上、細胞内でペプチドは急速に分解し、それは生体内におけるタンパク質の相互作用の研究についてそれらの有効性制限し、それがまた問題である。
【０００３】
自由溶液（free solutions）において使用されるよりもむしろ、興味のあるペプチドを物理的な支持体に結合してもよく、またはより一層大きなポリペプチドとの関連において表示してもよい。前者は生体内の研究において難なく適用することができない。後者において、ペプチドは単純且つ安定なスカフォールドタンパク質の一次配列中に遺伝学的に挿入する。スカフォールドの折り畳みはペプチドを立体構造的に拘束し、ペプチドアプタマーは高い特異性および親和性によってパートナーと結合する。これは本発明において重要なポリペプチドとの関連のディスプレイである。このようなディスプレイは、頻繁にスカフォールドタンパク質を用いて成し遂げられる。
【０００４】
先行技術のスカフォールドは、不活性のブドウ球菌ヌクレアーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびチオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）、ならびに分離したタンパク質の折り畳み、例えばブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、“アフィボディ（affibodies）”、アンチカリン（anticalins）、およびアンキリン（anyrin）反復からなる。
【０００５】
さらに先行技術のスカフォールドタンパク質には、ファイブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（‘Ｆｎ３’）、アンチカリンが導き出されるリポカリンファミリータンパク質、ビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）等が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／１３１７４９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
つい最近（国際公開第２００６／１３１７４９号）は、ステフィンＡ内において形成されるいくつかの合理的な変異を、それをスカフォールドとして改善するために記載する。修飾されたステフィンＡスカフォールドは、以下三つの部位、Ｌｙｓ７１−Ｌｅｕ７３，Ｖ４８ＤおよびＧ４Ｗにおける変異を含み、ＳＴＭ（ステフィンＡ三重変異）と称す。これら三つの変異の組み合わせは、ヒト細胞において、タンパク質との最小の相互作用をもつタンパク質を生じさせ、そして特にすべての検出可能な既知の自然なパートナーとの相互作用を喪失したことを示した。しかしながら、本発明者らは、タンパク質中に位置７１〜７３でペプチドを挿入することは、挿入されたペプチドの端部でのタンパク質のトランケーション（切り詰め）のための強い選択圧（淘汰圧）につながることを見出した。このように切り詰められたタンパク質は生物学的な有効性を表示することができたが、この観察は単純に位置７１−７３で切り詰められずに挿入されたペプチドのサブセットが、標的タンパク質との相互作用のために自由に利用可能でありえないという懸念を導き、これは問題である。さらに、単一部位でペプチドを挿入することは、必然的にタンパク質の相互作用のために用いられる合計表面積を制限し、それは次に結合親和性および潜在的な特異性を制限する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ステフィンＡに対して、およびステフィンＡに基づく修飾された人工タンパク質、例えば本発明において開示したようなＳＴＭ（ステフィンＡ三重変異）のようなものに対して作られた新しい変異は、代わりの改善された、およびより一層安定なスカフォールドタンパク質を提供し、そして、また、先行技術のものより用途の広いディスプレイシステムを提供する。さらに、これらの新たなタンパク質のスカフォールド／ディスプレイシステムはまた、効率的且つローバスト（robust）なディスプレイエンティティー（実体）としてまったく予測不可能である。これ以降に記載の新たな変異はステフィンＡ／ＳＴＭタンパク質の特定された多様なエリアで作られ、そして驚くべきことにステフィンＡ／ＳＴＭタンパク質の構造（立体構造）またはそれらのスカフォールドタンパク質としての潜在的な機能が見出された。さらにまた、本発明の改善されたスカフォールドを伴い、さらなる工学技術（engineering）の理由により、スカフォールドが多重の挿入物をもち、時には今まで先行技術のスカフォールドにおいて可能でない修飾を提供することが可能である。
【０００９】
本開示の概略。本発明の第一形態において、修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質を提供し、修飾は、単一の変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンをステフィンＡのためにトリプトファンまたはＳＴＭのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、または
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本願書の明細書および請求の範囲において、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”、“なる（ｃｏｎｔａｉｎ）”、そしてこの用語のバリエーション、例えば“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”および“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”の意味は“からなるが制限されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）”であって、他の一部、添加物、成分、整数またはステップを排除するという意図はない。本願の明細書および請求の範囲において、その背景において必要とされなければ、単数形は複数形を含む。
【００１１】
特に、本願は不定冠詞が使われているところで、背景に必要としなければ、複数形並びに単数形を意図している。
【００１２】
特徴、整数、指標、化合物、化学成分、または群と共に記載された本発明の特定の態様、実施形態、または実施例は両立しない限り、いずれの本願の他の態様、実施形態、または実施例である。
【００１３】
本明細書のスカフォールドタンパク質は、一つのタンパク質と結合した配列で、用語はまた融合タンパク質と同義語である。“融合タンパク質”は本発明のスカフォールドタンパク質を一つ以上の異なった（例えば“異種”）ペプチドまたはタンパク質と結合したタンパク質からなるものを意味する。異種ペプチドまたはタンパク質の挿入において、融合タンパク質は所望の標的と結合できる。
【００１４】
本発明は、新しい変異体に基づく野生型ステフィンＡタンパク質そのもの、好ましくはステフィンＡがヒトのステフィンＡ、または三重変異ＳＴＭ、安定したスカフォールドタンパク質として使用するのに適した形状の状態にする一方、付随してそれらを有利な生物学的において中性な状態に生物学的に重要な相互作用および活性な状態にカテプシンまたは他の不明のタンパク質との自然の相互作用に必要な残基の変異によって取り除いて行った。 さらに、選択された変異または挿入部位は、挿入するペプチドを容認および拘束し、例えばペプチドアプタマーの産出を制限することができる。その一方、ヒトの研究はヒトのスカフォールドを必要とし、例えばマウスのステフィンＡの使用は、マウスモデルの生態および／または疾患の研究に有利で、同様に他の種または植物のステフィンＡ由来の使用はまたその種に特異的であることができる。したがって、本発明のスカフォールドおよびプレゼンテーション法はいかなる選択された種において実用性を目的とし、ステフィンＡの誘導は使用者の必要性に依存している。
【００１５】
ＤＮＡ配列の変異において、ステフィンＡまたはそのＳＴＭ形状いずれのコドン４のアミノ酸をコード化するか、またはコドン４６から５４を含有したステフィンＡまたはそのＳＴＭ形状のループ１を含むまたは拘束するアミノ酸をコード化し、コドン６７から８４までを含有するステフィンＡまたはそのＳＴＭ形状のループ２を含むまたは制限するアミノ酸をコード化し、それぞれ独立することができ、好まれている。すなわち、ステフィンＡタンパク質の変異体が、３つの異なる個々の領域または部位の１つであり、すなわち位置４またはループ１もしくはループ２に拘束されていることができる。同様に、三重変異形状ＳＴＭにおける変異体はまた３つの特異的且つ独立した個々のサイトのの１つであり、すなわち位置４のループ１またはループ２に拘束された１箇所のいずれかであることができる。ステフィンＡまたはＳＴＭの配列の残余は、不変および以下における配列を含むであろう。
【００１６】
野生型のヒトステフィンＡの配列を以下の配列番号：１に示す
【化１】
【００１７】
三重変異ＳＴＭの配列を以下の変異部位を配列番号：２の様に示し、従ってＳＴＭが野生型ステフィンＡと異なる部分は、太字および下線で示す
【化２】
【００１８】
本明細書の参照における“変異性の変化”は、遺伝子物質における変異性の変化がアミノ酸の付加、欠失、挿入または置換による永久の変異を伝えることができる。
【００１９】
好ましくは、実施形態において単一の変異性の変化は、ステフィンＡにおけるコドン４のグリシンの置換であって、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｉ、Ｇ４Ｌ、Ｇ４Ｍ、Ｇ４Ｆ、Ｇ４Ｐ、Ｇ４Ｎ、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｑ、Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｇ４Ｒ、Ｇ４Ｈ、Ｇ４Ｋ、Ｇ４ＤおよびＧ４Ｅを含む群から選択される。より好ましくは、置換がＧ４Ｒ、すなわちコドン４のグリシンをアルギニンに置換することである。
【００２０】
好ましくは、実施形態において単一の変異性の変化は、ＳＴＭにおけるコドン４のトリプトファンの置換であって、Ｗ４Ｖ、Ｗ４Ｉ、Ｗ４Ｌ、Ｗ４Ｍ、Ｗ４Ｆ、Ｗ４Ｐ、Ｗ４Ｎ、Ｗ４Ｖ、Ｗ４Ｑ、Ｗ４Ｓ、Ｗ４Ｔ、Ｗ４Ｇ、Ｗ４Ｙ、Ｗ４Ｒ、Ｗ４Ｈ、Ｗ４Ｋ、Ｗ４ＤおよびＷ４Ｅを含む群から選択される。より好ましくは、置換がＷ４Ｒ、すなわちコドン４のグトリプトファンをアルギニンに置換することである。
【００２１】
ステフィンＡのオープンリーディングフレームの５’末端部位のステフィンＡまたはＳＴＭの８アミノ酸をコード化するアミノ末端における変異は、制限エンドヌクレアーゼまたは標的とする組み換え部位の切断部位の導入を認めた。例えば、本明細書においてＤＮＡ配列の変異後、例えば位置４のアルギニン（ＳＴＭの野生型グリシンまたはトリプトファンを置換する）をコード化することによって、ＳＴＭと同様の生物物理学の特徴を有し、驚くほど安定性のあるタンパク質を産出することを示したが、オープンリーディングフレームが、現在、酵素特有の制限サイトを有し、ここで例えば酵素Ａｖｒｌｌに制限はないので、選択肢を提供し、効率的なスカフォールドタンパク質としての役割を果たす。
【００２２】
好ましくは、実施形態において、ステフィンＡ（配列番号３：ＱＶＶＡＧＴＮＹＹ）またはＳＴＭ（配列番号４：ＱＶＤＡＧＴＮＹＹ）のコード化アミノ酸がループ１を含むまたは拘束するもの、ここで、例えばＱＶＬＡＳＴＮＹＹ（配列番号：５）を含む変異であり、変異性の変化はコドン４６から５４を含有するいかなる変異である。驚くべきことに、アミノ酸の配列は、例えば制限なしに、位置４８、４９、および５０におけるロイシン、アラニン、セリンを取り入れ、ＳＴＭと同様の生物物理学の特徴のタンパク質を導きだし、従って効率的なスカフォールドとなるであろう。
【００２３】
好ましくは、ステフィンＡの変異性の変化は４８−ＶＡＧ−５０、そしてＳＴＭにおいては４８−ＬＡＳ−５０であり、結果は４８−ＬＸＳ−５０においてＸはいずれのアミノ酸である。
【００２４】
好ましくは、実施形態において、ステフィンＡ（配列番号６：ＬＫＶＦＫＳＬＰＧＱＮＥＤＬＶＬＴＧ）またはＳＴＭ（配列番号７：ＬＫＶＦＮＧＰＰＧＱＮＥＤＬＶＬＴＧ）のコード化アミノ酸のループ２を含むか、または拘束し、ここで、例えば配列番号８：ＬＫＶＦＮＧＰＰＧＱＮＥＤＬＶＲＳＧを含む変異である、変異性の変化は、コドン６７から８４番目までを含有するいかなる変異である。驚くべきことに、アミノ酸の配列、例えばアルギニンに続くセリン（ステフィンＡまたはＳＴＭのロイシン８２およびトレオニン８３の置換）は安定したタンパク質、例えばＳＴＭの産出を導き、ペプチドアプタマーのプレゼンテーションにおいて優れたスカフォールドとして役割を果たすことを示した。
【００２５】
好ましくは、ステフィンＡの変異性の変化は７１−ＫＳＬ−７３および８２−ＬＴ−８３、ＳＴＭの変異性の変化は７１−ＮＰＧ−７３および８２−ＬＴ−８３であって、その結果は７１−ＮｘＰ−７３および８２−ＲＳ−８３において、Ｘはいかなるアミノ酸でもある。
【００２６】
好ましくは、さらなる本発明の実施形態において、ステフィンＡおよびＳＴＭにおいて８２−ＬＴ−８３であって、その結果は８２−ＸＸ−８３において、Ｘはいかなるアミノ酸、特に好ましい実施形態において、それは８２−ＲＳ−８３のさらなる変異性の変化がある。
【００２７】
好ましくは、変異性の変化は本明細書に述べる前記のいかなる組み合わせと、例えば制限なしに８２−ＸＸ−８３、そして特に好ましい変異は、少なくとも位置７１−７３および／または位置８２−８３における変異性の変化を有することである。
【００２８】
他の形態では、修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質であって、修飾は、単一の変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンをステフィンＡのためにトリプトファンまたはＳＴＭのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、または
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
【００２９】
本発明の態様において、修飾されたステフィンＡは２つの変異を含み、それは例えば、位置４およびループ１の機能を有するコドン４６から５４のいかなる変異を含有するか、位置４の変異およびループ２の機能を有するコドン６７から８４までのいかなるコドンの変化を含有するか、またはループ１の機能を有するコドン４６から５４までのいかなるコドンの変化およびループ２の機能を有するコドン６７から８４までのいかなるコドンの変化を含有することができる。
【００３０】
同様に、ＳＴＭは、位置４の変異およびループ１の機能を有するコドン４６から５４までのいかなる変化を含有するか、位置４の変異およびループ２の機能を有するコドン６７から８４までのいかなる変化を含有するか、ループ１の機能を有するコドン４６から５４の変化およびループ２の機能を有するコドン６７から８４までのいかなる変化を含有するか、またはループ２の機能を有するコドン６７から８４までのいかなる変化を含有することができる。
【００３１】
さらなる本発明の態様において、修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質であって、修飾は、単一の変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンをステフィンＡのためにトリプトファンまたはＳＴＭのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、または
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
【００３２】
従って、本発明の特定の実施形態において、修飾されたステフィンＡおよびＳＴＭは前述した全て三つの変異性の変化を含む。それ故に、修飾されたステフィンＡまたはＳＴＭのスカフォールドタンパク質は、三つの特異的な変異を位置４のループ１およびループ２の双方における変化を含む。
【００３３】
本発明の他の実施形態は修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質に関して、いかなる上記リストの配列の単一または組み合わせであるが、ステフィンＡまたはＳＴＭの７３残基またはステフィンＡまたはＳＴＭの８４残基のいずれにおける終結、そしてこれらの位置における新しいアミノ酸配列の挿入の有無のいずれにおける終結に関する。ＳＴＭのＮＧＰ後にアミノ酸配列を挿入する終止コドンに厳しい選択圧を見出したが、驚くべきことに、この様な機能を失ったタンパク質は共に安定、且つ標的タンパク質の生物学的機能を妨ぐことができる。
【００３４】
本発明は従って、さらに切り詰めたかまたは短縮された修飾されたステフィンＡおよびＳＴＭスカフォールドタンパク質を含み、理想的にはＣ末端から１５または２５残基を短縮し、従ってステフィンＡまたはＳＴＭのいずれの７３または８４残基のいずれにおいて終結することを含有する。さらに本発明は切り詰めたかまたは短縮による修飾されたステフィンＡおよびＳＴＭスカフォールドタンパク質を含み、１５から２５の間の整数まで短縮し、従ってステフィンＡまたはＳＴＭの７３から８４までの間の残基において終結する。
【００３５】
本発明は望ましくは全ての記載の変異からなり、それぞれが、ステフィンＡまたはＳＴＭの変異の一つ以上の位置において、作成したオープンリーディングフレーム内の改変制限酵素認識部位内にオリゴヌクレオチドを挿入することによって、異種ペプチドの導入を許可した。従って、本発明は、
位置４のタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンＡ、ＳＴＭ、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置４６〜５４、特に位置４８／４９／５０におけるタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンＡ、ＳＴＭ、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置６７〜８４、特に位置７１／７２／７３におけるタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンＡ、ＳＴＭ、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置６７〜８４、特に位置８２／８３におけるタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンＡ、ＳＴＭ、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置４および／または位置４８／４９／５０および／または位置７１／７２／７３および／または位置８２／８３における単数または複数のペプチドのいかなる組み合わせ。
ステフィンＡまたはＳＴＭいずれかの最後の２５個のアミノ酸残基または最後の１５個のアミノ酸残基の除去または置換する終止コドンに続いて位置４および／または位置４８／４９／５０および／または位置７１／７２／７３および／または位置８２／８３における単数または複数のペプチドのいかなる組み合わせに基づく、いくつかの新しいスカフォールドを提供する。
【００３６】
本発明のスカフォールドタンパク質の特別な利点および新しい変異は、それらが全てのループ１またはループ２、またはループ１およびループ２の双方、並びにアミノ末端の使用ができる。同時に、これらの変異は少なくとも使用する抗体と同じ大きさの表面積の提示を許す。さらにそれぞれを単一で使用することができるか、またはそれらはペアに基づくか、または他の変異と複数の組み合わせで使用することができる。相互作用の表面性が異なる位置と、異なった位置に挿入されたペプチドの間の異なった相互作用との組み合わせは、スカフォールドの新しい使用を提供することがありえ、例えば実用的な相互作用のため、一つの部位において存在することができないため、現在は他の異なる部位におけるペプチドの組み合わせが既知のペプチドから相互作用しないものに交代し、相互作用する構造を提供する。さらに、これらのいかなる新しい変異はステフィンＡの全長、ＳＴＭの全長、本明細書に開示のタンパク質の全長、またはこれらいずれのタンパク質の変異型より使用することができ、ステフィンＡもしくはＳＴＭのいずれから生成することができる最終残基は、ＳｔｅＡのＬｅｕ７３もしくは本願明細書に記載の新しい変異、ＳＴＭのＰｒｏ７３もしくはその新しい変異、または挿入された異種性ペプチドの最終残基において、ステフィンＡもしくはＳＴＭの最後から１５もしくは２５アミノ酸残基は機能を失っている。
【００３７】
本発明の他の形態は、核酸の分離に関して、本願明細書の上記スカフォールドタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む。
本発明の他の形態は、所望の構造に結合することができる標的ペプチドの同定方法に関して、本明細書の前記修飾されたステフィンＡまたはＳＴＭタンパク質のスカフォールドタンパク質を提供することを含み、標的ペプチドを含む；前記スカフォールドタンパク質と前記所望の構造と接触する方法に関して；スカフォールドおよび所望の構造の間の関係を観測する方法に関してであって、スカフォールドタンパク質と所望の構造の関連は、標的ペプチドを前記構造に結合する標的ペプチドの候補として同定する。
【００３８】
本発明のさらなる態様において、スカフォールドタンパク質は、
【化３】
を含む群から選択される。
【００３９】
本発明のさらなる態様において、本発明のスカフォールドタンパク質を診断、治療、バイオマーカー、バイオマーカーに結合し、およびそれを特異的に検出するための薬剤、合理化された薬物設計の鋳型、創薬のための標的または試薬、抗体の代替物およびリサーチツールを含む群より選ばれる薬剤としての用途を提供する。
【００４０】
本発明のさらなる態様において、本発明のスカフォールドタンパク質の融合タンパク質としての使用を提供する。
【００４１】
本明細書の前記の好ましい特徴は、必要な変更を加え（ｍｕｔａｔｉｓ ｍｕｔａｎｄｉｓ）、本発明の全てのそしてそれぞれの態様において適用した。
【００４２】
本願明細書の以下に記載のおよび上記に示した結果を総合すると、本発明のスカフォールドは複数の箇所における操作の影響を受けやすく、それぞれの変異は単独、または驚くほど良い耐性およびいかなる変異の不安定な効果との組み合わせによって、アミノ末端およびループ２の挿入を拡大した。これらの部位は、従って定期的に使用できず、驚くべきことに複数の挿入物に対しては、ＳＱＭ−ループ１などに対する部位の結合親和性およびペプチドアプタマーの特異性の改善に使用されるようになる耐性がある。さらに、ループ１は外見上、ペプチドの範囲において、ととても小さな問題が存在することができる。これは比較的小さなループであるため、とても驚くべきことである。
【００４３】
本発明の詳細な記載
“欠失”とは、それぞれ一つ以上のアミノ酸残基または核酸の欠乏による、アミノ酸または核酸の配列の変異を参照する。“挿入”または“付加”という用語は、アミノ酸または核酸の配列の変異であって、参照の配列と比較して、分子またはその代表に、それぞれ一つ以上のアミノ酸残基または核酸の付加の結果であり、自然起源の分子において見られるもの等を参照する。“置換”とは一つ以上のアミノ酸または核酸をそれぞれ異なったアミノ酸または核酸と置き換えることを参照する。
【００４４】
ステフィンＡまたはＳＴＭをスカフォールドとして改善するため、選択的な部位および／または複数の部位に異種ペプチドを挿入することができることが好ましい。これにはステフィンＡまたはＳＴＭのいずれかをコード化するオープンリーディングフレームを変えることを必要とするため、オリゴヌクレオチド内に異種ペプチドを挿入することができ、コード化される制限エンドヌークレアーゼ認識部位を導入する。オープンリーディングフレームを変えることは、ほぼ必然的に発現するタンパク質を含むアミノ酸配列を変えることにつながる。タンパク質が最適な機能および安定の組み合わせを形成してることが既知であれば、最もあり得る（最も頻繁的に観測される）タンパク質のアミノ酸配列の変異の結果は、二次構造の欠損であって、従って安定性の欠損である。本発明において、新しいスカフォールドタンパク質は安定性を保持している（実施例および図を参照）。
【００４５】
ＤＮＡ（オープンリーディングフレーム）レベルにおける変異、そしてさらに新しいステフィンＡ／ＳＴＭの変異体のアミノ酸配列の変異によるタンパク質の安定性の減少へと導き出すことを明確にするため、本明細書に記載の全ての変異がＥ． ｃｏｌｉにおいて発現していて、円偏光二色性を用いてそれらのステフィンＡの構成の二次構造を比較した。全てのタンパク質がＥ． ｃｏｌｉにおいて同等に良く発現していて、通常約２８ｍｇ変異タンパク質／細菌用培養液ｍＬ（図１）であることが見出した。タンパク質を均一に近くなるまでＮｉアガロースを用いた親和性クロマトグラフィーで精製し、精製品を用いて０．３ｍｇタンパク質／ｍＬまで希釈した。それぞれ得られたサンプルは円偏光二色性による解析を受けた。これはタンパク質をＵＶ波長に近い範囲に渡ってスキャン（ｓｃａｎｎｎｉｎｇ）し、光の楕円率がタンパク質の二次構造要素（αヘリックスまたはβストランド）等によって影響するからである。タンパク質の二次構造の比率が上昇するにつれ、楕円率の結果も上昇する。効果はタンパク質濃度によって影響するため、タンパク質を解析直前に０．３ｍｇ／ｍＬまで希釈した。効果は解析するタンパク質のペプチド結合数に比例するので、この効果を考慮に入れて、モル楕円率を参照する。データを図３に示す。このデータは二次構造の比率がＳＴＭおよび新しい変異体において保持されていること、ＳＴＭ内の挿入物の存在がその構造に不利に影響しないことを示す。二つの変異体（ＳＵＮおよびＳＱＭ）は他と比較して外見上、構造増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を示すことを意味する。これは二次構造の取得にこれら全てのタンパク質に存在するアミノ末端尾内において属すことができ、これがＳＵＮおよびＳＱＭに共通する少しの変異であるから、位置４のグリシン（ステフィンＡ）またはトリプトファン（ＳＴＭ）をアージニンに置換することで活性化するであろう、そしてこれらはこの変異を有する少ない変異である。
【００４６】
スカフォールド
従来技術で良く知られているように、‘スカフォールド’の用語はそのものの構造を標的ペプチドによって変形することなく、標的ペプチドを溶媒に発現させるタンパク質を参照する。ペプチドを溶媒に発現するにあたって、これは免疫沈降実験を用いて試験することができる。例えば、ペプチドが溶媒に発現する表示はそれを認識できる抗体に対するその有効性から得ることができる。従って、スカフォールドタンパク質の溶媒に対するペプチドの発現性能を試験するため、ペプチドを含むスカフォールドを発現し、ペプチドを認識する抗体をスカフォールドペプチド融合の免疫沈降に使用されるであろう。このタンパク質が免疫沈降または抗体をキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）することができるのであれば、これはペプチドがスカフォールドタンパク質に必要とされるため、溶媒に発現していることを示す。他のまたは別のペプチドが溶媒に発現していることはリン酸化反応の研究から得られる表示である。リン酸化受容体部位を標的ペプチド内に組み込み、その後類似のキナーゼとスカフォールドペプチド融合体がリン酸化反応の許容条件下において接触し、その後溶媒に対するペプチドの発現を検証した。ペプチドのリン酸化反応は溶媒に対して、あるべき発現を示した。形成された標的ペプチドによるスカフォールドタンパク質の抵抗に関して、これを円偏光二色または熱安定性の技術を用いて試験することができる。具体的には、スカフォールドタンパク質その物に標的ペプチドを挿入することのない円偏光二色解析は、標的ペプチドを形成するときの同じスカフォールドタンパク質と実質上同様な円偏光二色特徴である。これはスカフォールドタンパク質内の標的ペプチドの発現がスカフォールドタンパク質を産出するスカフォールドタンパク質の構造を危険にさらさないか、変形させないことの証明を提供する。標的ペプチドによる変形であるこの抵抗を試験する他の方法は、スカフォールドタンパク質と挿入物である標的ペプチドの有無の熱安定性を研究することである。
【００４７】
スカフォールドタンパク質はペプチド挿入物を受容することができるべきである。ペプチド挿入物は、好ましくは３６アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下である。好ましくは、標的ペプチド挿入物が１２アミノ酸残基以下である。
【００４８】
スカフォールドタンパク質は知られた構造でなければならない。‘知られた構造’とは、結晶性構造または溶液構造（ＮＭＲ構造）が既知でなければならないことを意味する。
【００４９】
本発明にかかるスカフォールドタンパク質の好ましい特徴
好ましくは、スカフォールドタンパク質が標的ペプチドを抑制していることである。スカフォールドタンパク質における抑制効果の存在は、標的ペプチドがスカフォールドタンパク質内のときの標的ペプチドの実態結合の親和力とペプチドがスカフォールドタンパク質内でないときの親和力を比較することによって証明することができる。これら二つの親和力の違いは、スカフォールドタンパク質がペプチドを抑制し、特定の三次元構造を仮定していることを示す。好ましくは、スカフォールドタンパク質はペプチドを抑制し、スカフォールドタンパク質の状況において発現しているとき、それが結合親和力の上昇を示していることである。言い換えれば、結合していないペプチドの結合と比較したとき、好ましくはスカフォールドタンパク質が結合のエントロピー消費を減少し、測定した親和性を上昇する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、抑制は標的ペプチドに対する単一のＮ末端またはＣ末端の融合によって提供される。
【００５１】
好ましくは、スカフォールドタンパク質が生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）において標的ペプチドの向上した安定性を提供することである。この効果は、標的ペプチドの発現をスカフォールドタンパク質と標的ペプチドその物の発現の関係を比較することによって実証することができる。好ましくは、標的ペプチドがスカフォールドタンパク質の関係において上昇した安定性を示すことである。
【００５２】
スカフォールドタンパク質が、好ましくは生物学的に中性であることである。‘生物学的に中性’とは他の既知のタンパク質との相互作用が取り除かれたことを意味する。さらに、タンパク質が保持しているいかなるシグナル伝達能力も好ましくは除去することである。従って、本発明にかかる好ましいスカフォールドタンパク質はＳＴＭスカフォールドタンパク質である。
【００５３】
生物学的に中性とは、それがスカフォールドタンパク質の大半の従来技術に存在しないことから、本発明の利点である。例えば、チオレドキシンＡは、細胞内の自然な酸化還元経路の優性阻害として働くことである。さらに、それはＰ５３を阻害することが知られていて、ＢＣＬ６シグナル経路を阻害することが知られている。有利に、本発明のスカフォールドタンパク質は自然発生のシグナル経路と妨げない。
【００５４】
スカフォールドタンパク質は小さい場合である。“小さい”とは２５ｋＤａ以下を意味し、好ましくは１３ｋＤａ以下である。最も好ましくは、スカフォールドタンパク質が１１０アミノ酸以下である（標的ペプチド挿入物を除いて）。
【００５５】
好ましくは、本発明にかかるスカフォールドタンパク質が構造的に安定していることである。‘構造的に安定’とは、構造変化が起きないことを意味する。好ましくは、スカフォールドタンパク質がヒンジ部位を有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質がＰＨドメインを有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質がＳＨ３ドメインを有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質がＳＨ２ドメインを有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質が’ＷＷドメインを有さないことである。好ましくはスカフォールドタンパク質が’ＷＤドメインを有さないことである。好ましくはスカフォールドタンパク質がＨＥＡＴドメインを有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質がプロリンに富むドメインを有さないことである。好ましくは、スカフォールドたんぱく質が細胞内において翻訳後修飾を有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質が構造変化を促進する他の既知のドメインを有さないことである。
【００５６】
本発明にかかるスカフォールドタンパク質は、好ましくはタンパク質間相互作用ドメインを有さないことである。タンパク質は、これらが変異し、機能しない状態にある場合、タンパク質間相互作用ドメインを有さないと考えることができる。
【００５７】
好ましくは、本発明にかかるスカフォールドタンパク質が翻訳後修飾を有さないことである。従って、好ましくは本発明にかかるスカフォールドタンパク質が糖鎖付加部位を有さないことである。これは従来技術のスカフォールドタンパク質、例えばジストロフィンに対して、翻訳後修飾が相互作用を妨げるか、それら自身の疑似相互作用を作り出すことができるため、有利である。
【００５８】
上記のように、スカフォールドタンパク質はペプチド挿入物によって変形されるべきでない。この基準によって、緑色蛍光タンパク質が、少なくとも三分の一の挿入した標的ペプチドが緑色の蛍光を滅ぼすため、スカフォールドタンパク質としては考えられない。これは標的ペプチドインサートがタンパク質の構造を変形することを明らかにした。従って、スカフォールドタンパク質が好ましくは標的ペプチドの挿入によって変形されてるべきでないので、それは本発明にかかるスカフォールドタンパク質ではない。
【００５９】
チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）は従来技術のタンパク質である。ＴｒｘＡは小さく、安定性がある。しかしながら、ＴｒｘＡ内における標的ペプチドの挿入はシステインの二残基の間に起こる。発明にかかるスカフォールドタンパク質は、ＴｒｘＡ内のシステイン残基が、スカフォールドタンパク質の構造を変えることができ、示した標的ペプチドの構造に影響することができる、可逆のジスルフィド結合を経ることができるため、有利にこの配列を避ける。従って、好ましくは標的ペプチドの挿入部位は、スカフォールドタンパク質のシステインの二残基の間ではない。
設計の検討
【００６０】
スカフォールドタンパク質は、好ましくは以下の一つ以上の特徴を有する：
１）既知の構造によって、ペプチド挿入部位または置換部位のインフォームドチョイスを考慮していることと、
２）広範囲のペプチドの折り畳みを制限するために十分に安定であることと、
３）生物物理学的に中性であって、例えば表現型に寄与する細胞内タンパク質の相互作用を欠失していることと、
４）原核性および真核性の環境の双方において、同様に、好ましくは完全に同じように、折り畳むことができ、１つの方法から得たデータが他の実験の実施を満たすことができる。
【００６１】
本発明は、ペプチドアプタマー技術の要件に適したスカフォールドを提供する。発明のスカフォールドタンパク質は、好ましくは全ての上記基準を有している：親（ｐａｒｅｎｔ）ステフィンＡの構造が既知である；操作されたスカフォールドは安定性があり、少なくとも一つのペプチド挿入に、その生物物理学的な安定性を欠失することなく耐性がある；広範囲のペプチドにおける機能上の相互作用を示すことができる；そして全ての既知の生物学的相互作用が操作されているわけではない。
さらなる応用
【００６２】
当業者はマイクロアレイでのペプチドアプタマーの使用は、これらのペプチドアプタマーが本発明にかかるスカフォールドタンパク質に存在しているとき、特に好都合であると理解するであろう。従来技術におけるマイクロアレイ技術は抗体に大きく依存している。しかしながら、抗体はアレイに結合しているとき、特異性を欠失することができる。さらにマイクロアレイに使用される組み換えタンパク質は、タンパク質の存在の情報を提供することができるが、何が結合しているかについての情報は提供することができない。一方、本発明にかかるスカフォールドタンパク質において、ペプチドアプタマーを使用したディスプレイは、アレイを詮索したとき、有利に比較的たくさんの情報を提供することができる。例えば、結合パートナーの観測により、アプタマーのディスプレイにスカフォールドタンパク質を使用したとき、背景情報（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｉｎｆｏｒｍａｉｔｏｎ）が有利的に導き出される。この利点は繊細さの欠損および情報に基づくライブラリーとの間の違いにおいて特徴付けられる。従って、本発明の他の態様において、これら新しいスカフォールドタンパク質の使用はマイクロアレイ上にペプチドをディスプレイすることに関する。
【００６３】
好ましくは、本発明にかかるスカフォールドタンパク質はステフィンＡの配列に基づくことである。‘ステフィンＡの配列に基づく’とは、スカフォールドタンパク質が、ステフィンＡの９８アミノ酸残基の少なくとも３０を有するべきであり、好ましくはステフィンＡのアミノ酸残基に対して２５％、好ましくはステフィンＡのアミノ酸配列に対して３０％、４０％、５０％、６０％または７０％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくはステフィンＡの配列に対して９５％またはそれ以上である。最も好ましいスカフォールドタンパク質はステフィンＡ、ＳＴＭ、または本明細書に開示の新しい変異体の一つを有し、本明細書前記の一つ以上の変異性の変化を含む。
【００６４】
ペプチドアプタマーの特性である生体内のタンパク質間相互作用の分離において、新しい薬物の迅速な識別の主用として許容することができる。さらに、小さな薬物分子対象の使用は、タンパク質間相互作用の分離に本発明で有利に促進される。
【００６５】
翻訳後修飾部位、リン酸化部位などを含むペプチド挿入物の使用は、有利に使用することができる。これは、標的ペプチドのリン酸化状態によって変異する相互作用解離に有益である。さらに、それは候補のペプチドアプタマーに結合したリン酸化反応に依存する方法の識別を考慮した。
【００６６】
いくつかの実施形態において、それはジスルフィド結合を標的ペプチド挿入物のいずれかの側面に導入しることができ、例えばシステイン残基をそれぞれの標的ペプチド挿入物の側面に操作することが好ましい。これはスカフォールドが排他的に一条件において使用されているとき、実用的であることができる。この関連において、ファミリーＩＩシスタチンはジスルフィド結合を使用し、一つの好ましい挿入部位に一致する二次構造の要因を形成することを意味する。本発明の背景において、これは例えば、スカフォールドポリペプチドのＣ末端、または標的ペプチド内、例えば標的ペプチドのＣ末端エンドに単一のシステインを付加し、二番目の場所、例えばスカフォールドのＮ末端または標的ペプチドのＮ末端エンドに二つ目のシステイン残基挿入の付加し、従って二つの間に架橋を可能にすることで、達成することができる。 しかしながら、それはペプチドの共有結合性の制限をこの様に回避することが好ましい。従って、好ましい本発明のスカフォールドにおいて、好ましくは標的ペプチドはシステイン残基に対して側面に位置しないことである。
【００６７】
全体的に、異なったスカフォールドがそれを発現するペプチドに対して偏見を押し付けることができ、標的ペプチドの研究は有利に一つ以上のスカフォールドにおけるペプチドおよび／またはライブラリーと関与し、成功率を最大にすると理解されている。
【００６８】
本発明のスカフォールドは研究者に、細胞内の環境に対する生体外およびその逆の観測に伸ばし、そして生体外における識別または細胞内における折り畳みパターンまたはジスルフィド結合の酸化状態に関する問題もなく使用することができるツールの創作として考慮させることを可能とした。
【００６９】
本発明のスカフォールドを基にしたペプチドアプタマーは、診断の要素、予後の試験、またはヒトの疾患の治療のための主な組成物の形成の基としても使用することができ、薬剤標的を有効にすることができる。本発明のスカフォールドは、有利に全長のヒトタンパク質に基づき、生物学的な治療および／または遺伝子治療において実用的であることができる。
標的ペプチド
【００７０】
本明細書に使用される‘標的ペプチド’の用語は所望のペプチドを参照する。標的ペプチドは好ましくは、異種性ペプチドである。異種性とは通常の状況から除去したペプチドを意味し、好ましくはスカフォールドタンパク質の産出、保持、またはディスプレイの配列において通常発見されない配列を有するペプチドである。ペプチドがスカフォールドタンパク質の配列の他の場所に発生する配列を有する場合、その結果‘異種性’であるためには、配列が背景から外れていることである。すなわちその自然発生のスカフォールドタンパク質ポリペプチド内の位置（アドレス）を占領していないことである。この背景において“位置”とは直鎖アミノ酸内の位置であって、他のアミノ酸残基に対して三次元空間の位置を意味する。標的ペプチドは人工的で、例えばスカフォールドタンパク質内に組み込んだペプチドのライブラリー構築を生み出すことであることができる。これらの実施形態において、人工的なペプチドは本発明の目的のために‘異種性’であることが考えられる。
【００７１】
ペプチドアプタマーは細胞内において拘束されたペプチドで、タンパク質機能の研究に用いられるスカフォールドタンパク質を示す。いくつかにおいては、タンパク質間相互作用を分離することができ、いくつかにおいては細胞内のタンパク質解析のための分子ツールキットの創作を可能とする認識モジュールを構成することができる。
【００７２】
特異的に結合することができ、特定のタンパク質が高い親和性を備える小分子をデザインまたは識別できることは、タンパク質マイクロアレイの発展、生細胞の背景におけるタンパク質の解析、および薬剤標的候補の有効性を含む多数の実験において律速段階である。自然界において、タンパク質間相互作用は折り畳まれたタンパク質の狭い表面によって仲介することができる。これはスカフォールドと呼ばれるタンパク質認識モジュールとして安定性のあるタンパク質の背景において示される小ペプチド表面の使用へと導いた。このような試薬は、本明細書においてペプチドアプタマーと呼び、システムの範囲で、生体タンパク質活性の分離に使用される。
【００７３】
ペプチドアプタマーは、細胞内において、結合していないペプチドと比較して、より簡単に輸送され、より安定性があり、そしてその制限された折り畳みは結合の低エントロピー消費、それ故に標的タンパク質に対して高い親和性という結果になる。ペプチドアプタマーのタンパク質操作はそれらが分子ツールキットのデザインにおける認識機能を提供することを可能とするが、しかしこの潜在力は完全には気付かれていない。ペプチドアプタマーのその標的との親和性は１０”８から５×１０”９ＭまでとＩＱ１０７から１０”１１Ｍまでの範囲における抗体／標的との相互作用とを比較した。複数の挿入物を使用することによって、相互作用の表面積を増加し、ペプチドアプタマーを一致することができると予期するか、可能性として抗体の結合親和性が有利に超えるかである。それにも関わらず、ペプチドアプタマーは明らかに生体内のタンパク質間相互作用を分離する。ペプチドアプタマースクリーンをペプチドまたは抗体ライブラリーのファージディスプレイ法スクリーン（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｃｒｅｅｎ）から区別し、実質的にミスフォールドの（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）原核生物において発現しているタンパク質に対して行う、酵母もしくは哺乳類細胞におけるペプチドアプタマースクリーンを実施した。
【００７４】
比較的広範囲な多数の他のタンパク質が使用されているが、使用するスカフォールドは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）タンパク質チオレドキシン（ＴｒｘＡ）である。この技術の成功はスカフォールドのロバストネスに定まるが、ペプチドの三分の一が不安定なＧＦＰであることができる一方、多数のＴｒｘＡを基にしたペプチドアプタマーは培養されたヒト細胞において不安定な発現をしていて、これはスカフォールドがより十分に厳密でない発現をしていて、それ自体が部分的にアンフォールドしていないペプチドを示唆する。あるスカフォールドの背景から取り出してきた、他の頻繁にそれらの標的タンパク質と相互作用能力を欠失する部位のペプチドが、適したスカフォールドが使用されないと失敗する既知の標的との相互作用に制限されたスクリーンである可能性として挙げる。最後に、本ペプチドとして使用されるスカフォールドの生物学的活性は従来技術において厳密に特徴付けられていないため、ペプチドアプタマーが発現しているとき、いかなる表現型が観測されるかの問題において、少なくとも一部はスカフォールドの効果のためであって、挿入されたペプチドではない。従って、制限されたペプチドのプレゼンテーションにおいて、ロバスト、多用途、生物学的に中性なスカフォールドを産出した。実験系の範囲において安定した発現である一方、機能的に広範囲の標的と相互作用することができるペプチドを示すタンパク質を得た。このようなスカフォールドは、実質的にペプチドアプタマー技術をそのロバストネスを上昇することによって改善する。さらに、複数のスカフォールドのライブラリーを使用して、それぞれの標的に対して、同時にスクリーンし、有効なスカフォールドのレパートリーを広げることによって、本発明は有利に多数の標的タンパク質に対するスクリーンにおいて、正しいものが得られる可能性を高めた。
ステフィンＡ
【００７５】
ステフィンＡは、リソソームペプチダーゼのパパインファミリーであるシステインカテプシンのタンパク質阻害剤のシスタチンファミリーの発起メンバーである。シスタチンファミリーのステフィン下位群は比較的小さな（約１００アミノ酸）単一ドメインタンパク質である。これらは既知の翻訳後修飾を受けず、ジスルフィド結合を欠失していることから、これらが細胞外および細胞内環境の幅広い範囲において、完全に同じ様に折り畳むことができることを示唆する。ＳｔｅＡそのものは単量体、短鎖、単一ドメインの９８アミノ酸のタンパク質である。ＳｔｅＡの構造を解明し、ＳｔｅＡからＳＴＭスカフォールドへの合理的な変異を促進した。唯一既知のシスタチンの生物学的活性は、カテプシン活性の阻害であって、操作したタンパク質の残部生物学的活性を徹底的に試験することを可能とする。従って、本来のＳｔｅＡの操作したタンパク質の開示は、ペプチドアプタマースカフォールドとして実用的な変異を産出することができる。従来技術のペプチドアプタマーは、生物活性を識別する難しさから細胞を基にした、少なくとも部分的には最適以下の様々なスカフォールドの存在による性能が原因の分析において妨害された。本発明は、生体外および生体内におけるタンパク質間相互作用の研究を求める者に有用であり、役立つであろう実用的なスカフォールドを提供する。
ステフィンＡ配列
【００７６】
ステフィンＡを“基にした”スカフォールドは、ステフィンＡ由来の配列を有する。好ましくは、ステフィンＡ由来の配列はステフィンＡ野生型配列を含み、好ましくは本願明細書に記載の一つ以上の修飾（変異）を含む。当業者には明白な、比較的重要でない修飾が、本発明から外れることなくスカフォールド配列に作られた。特に、本発明はアミノ酸配列および／または核酸配列において、本明細書の対応配列と少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％または６０％同一性を有し、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％同一、またはそれ以上に関する、しかしながらそれぞれの場合、配列変異は‘重要でない’と考えられ、それらがスカフォールドの特性に悪影響を与えず、標的ペプチドを溶媒に示し、生物学的機能を、野生型ステフィンＡを有する等、復元または作り出さないが、本発明の変異性の変化を取り除いた。
【００７７】
さらに、比較的重要でない修飾は、また本明細書に開示のステフィンＡまたはステフィンＡ由来の配列への小さな付加または欠失を含み、例えばステフィンＡ由来のポリペプチドに１０アミノ酸以下の付加または欠失である。従って、本発明は本明細書に開示のステフィンＡまたはＳＴＭの配列に対して、４０アミノ酸以下、好ましくは３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、好ましくは１５アミノ酸以下、さらに好ましくは１０アミノ酸以下、好ましくは９アミノ酸以下、好ましくは８アミノ酸以下、好ましくは７アミノ酸以下、好ましくは６アミノ酸以下、好ましくは５アミノ酸以下、好ましくは４アミノ酸以下、好ましくは３アミノ酸以下、好ましくは２アミノ酸以下、好ましくは１アミノ酸以下の総付加または総欠失を有するアミノ酸配列に関する。総付加または総欠失は重要な要素であるから、９以下の違いは９つのアミノ酸の欠失を意味し、３つの欠失はそれぞれ３つのアミノ酸、３つのアミノ酸の２つの付加、３つのアミノ酸の１つの欠失などである。本発明はまた対応する核酸変異に関する。それぞれの場合、それがスカフォールドの標的ペプチドから溶媒に示す特徴に悪影響を与えず、生物学的機能、例えば野生ステフィンＡの有し、復元または作り出さないと仮定すると、配列変異は“重要でない”修飾と考えられる。
ステフィンＡおよびＳＴＭの変異
【００７８】
変異部位の討論の背景において、“近隣”とは７アミノ酸以内、好ましくは５アミノ酸内、好ましくは３アミノ酸内、好ましくは２アミノ酸内、好ましくは所定のアミノ酸、または２つの隣接したアミノ酸の１つである。
【００７９】
挿入物の背景において、核酸レベルの制限酵素部位、好ましくは特有の制限酵素部位を今後の挿入物の促進に導入することが好ましい。核酸の組み換え技術におけるこれらの内容および一般的な知識は、当業者に関連する制限酵素部位を導入する一方、スカフォールドの重要な特徴を維持している。“特有”とはスカフォールドタンパク質のコード化される配列が特有であることを意味する。非特有部位は使用されるかもしれないが、特有部位は挿入物の容易さ、構造の操作によって好ましい。２つ以上の部位が使用される場合、例えばステフィンＡ１のループ１のいかなるコドン６７−８４の除去および置換、好ましくはそれぞれ２つ以上の部位が特有である。しかしながら、二つ以上の部位が同一である場合、それは有利に除去および置換の工程を単純にすることができ、例えば一回の制限酵素処理のみ伴う。これらの選択肢は本発明の当業者の能力内の範囲において十分である。好ましい実施形態において、二つの同一部位はループの除去および置換を導入した。好ましく変異性の変化をコード化する配列に使用される制限酵素部位は異なり、コード化される配列内のこれらそれぞれ４箇所の挿入または修飾が容易な操作のため、異なった制限酵素を使用して作られた。
位置４の変異
【００８０】
‘位置４の変異’という用語は本明細書において、好ましくはステフィンＡのＧ４部位、ＳＴＭのＷ４部位またはその付近で、好ましくはこの部位として使用され、変異はＳｔｅＡまたはＳＴＭのアミノ末端のアミノ酸残基の付加、挿入または置換を参照する。好ましくは、この様な変異はＰｒｏ３付近、好ましくはＧ４（ステフィンＡ）またはＷ４（ＳＴＭ）付近である。好ましくは、このような変異がヒトステフィンＡもしくはＳＴＭのＰｒｏ３の付近もしくは好ましくはこの部位である。最も好ましいのは残基４とＲの置換である。
【００８１】
好ましい実施形態において、位置４とは本明細書の上記のループ１および／または２の他の変異性の変化に加えて、第一、第二または第三の挿入部位として使用する。Ｒは正電荷のアミノ酸であって、従ってαヘリックスループの認識部位を覆うことを防ぐため、ＲよりはむしろＧの存在が認識（標的結合）表面への近接性を増加する。さらに変異は単一のときアプタマーを不安定にしたが、アプタマーが一度標的に結合すると安定する。
コドン４６−５４のいずれにおける変異
【００８２】
‘コドン４６−５４のいずれにおける変異’という用語は本明細書において周囲の変異、ＳｔｅＡのＶＡＧ部位またはＳＴＭのＤＡＧ部位の周り、好ましくはこの付近または好ましくはこの部位である。ＶＡＧ部位はＱＶＶＡＧ部位の４８−５０残基、ヒトＳｔｅＡの４６−５０残基である。ＤＡＧ部位はＱＶＤＡＧ部位の４８−５０残基、ＳＴＭの４６−５０残基である。
【００８３】
好ましくはこの付加、挿入または置換、好ましくはＶＡＧ／ＤＡＧ部位付近または好ましくはこの部位を参照する。好ましくはこのＶＡＧ／ＤＡＧ部位の付加または挿入を参照する。
【００８４】
好ましい実施形態において、４６−５４番目の部位は本明細書の上記の変異性の変化と組み合わせた第一、第二または第三の挿入部位として使用した。
【００８５】
ある好ましい実施形態において、ＶＡＧ／ＤＡＧ部位の変異はＬＡＳである。
【００８６】
実験はＤ４８ＬおよびＧ５０Ｓの修飾が細菌系の発現増加を導くことを示した。
コドン６７−５４のいずれにおける変化
【００８７】
‘コドン６７−５４のいずれにおける変化’という用語は本明細書において周囲の変化、ＳｔｅＡのＶＡＧ部位またはＳＴＭのＤＡＧ部位の周り、好ましくはこの付近または好ましくはこの部位である。
【００８８】
用語はこの部位の付加、挿入または置換を参照することができる。
【００８９】
一実施形態において、変異はＬ７３とＬ８０、Ｐ７３とＬ８０の間の全ループといずれのペプチド配列、好ましくは異なる標的ペプチド配列の範囲（好ましくは１ペプチド配列毎ステフィンスカフォールド分子）、すなわちライブラリーを含むことができる。
【００９０】
核酸レベルにおいて、好ましい変異はこれらのループ内の挿入で、制限酵素部位をもたらし、より好ましくはこのループをコード化される配列の置換の二箇所の制限酵素部位である。特に好ましいのは、制限酵素部位がＲｓｒＩＩ制限酵素部位である。
【００９１】
好ましい実施形態において、ループ２部位は第一、第二または第三の挿入部位と本明細書の上記の変異性の変化との組み合わせとして使用される。
【００９２】
本発明にかかる二つの新しいスカフォールドにおいて、変異性の変化はＮＧＰ（ＳＱＭはＬ８２ＲとＴ８３Ｓを有し、そしてＳＱＴはＥ７８ＡとＬ８０Ｒを有する）で操作し、親タンパク質とかなり異なるため、最も予期していなかったが、それぞれＥ．ｃｏｌｉにおいて高発現を示す。ＳＱＭおよびＳＱＴは双方とも円偏光二色性に示すように、親タンパク質とかなり異なるため、最も予期していなかったが、安定した構造を有する。
【００９３】
これらのアプタマー内に挿入したペプチドは抗体結合実験で示すように溶媒から得られ、有利にこれらのタンパク質は固体表面に付着したとき、これらの結合および機能を保つ。さらにこれらは三つの挿入物の位置による表面積の増加を有し、それ故に高い結合親和性を生み出し、実験はＳＱＭがペプチド挿入物の特有のセットと共に正しく折り畳み、結合部位を遮蔽することができるダイマーを形成しないことを示し、これはＳＴＭと対象であり、従って従来技術と比較して重要な利点を提供する。さらに本発明のペプチドアプタマーライブラリーのスカフォールドは、例えばＳＱＭを用いて作成することができ、従ってアプタマーはヒト組織内の標的と複数の結合表面によって相互作用する潜在力を有することを確認できる。
挿入物
【００９４】
好ましくは、挿入物がヒトステフィンＡのＬ７３−Ｌ８０ループまたはＳＴＭのＰ７３−Ｌ８０ループ付近または好ましくはその部位、より好ましくはアニーリング配列にコード化されている二残基ＬｅｕＡｌａと共にで、従ってスカフォールドタンパク質は基のステフィンＡより二残基長い。
変異の組み合わせ
【００９５】
好ましくは、本発明にかかるスカフォールドタンパク質はステフィンＡまたはＳＴＭを基にしていて、少なくとも一つの上記変異を含む。好ましくは、スカフォールドタンパク質は、少なくとも二つまたは三つ全ての上記変異を含む。好ましくは、本発明にかかるスカフォールドタンパク質は三つ全ての上記変異と残部のタンパク質ステフィンＡ、ＳＴＭまたは他の変異の一つのいずれかと共通点を有する。さらにもしくは代わりに、末端の変異は位置７２／７３または８２／８３で、ステフィンＡまたはＳＴＭのいずれかの最後の２５または最後の１５アミノ酸の除去または置換は終止コドンが続く。標的ペプチドを有利に三つのいずれかの好ましい変異部位に挿入することができる。より高い実施形態において、ステフィンＡ／ＳＴＭを基にしたスカフォールドタンパク質は総合で三面の表面を使用することを考慮に入れた。これらの表面は位置４のループ１およびループ２（図２）と定義する。
固体相およびマイクロアレイ
【００９６】
上記のように、本発明はマイクロアレイの応用を見出した。固体相の実施形態において、マイクロアレイ実施形態などは、本発明のスカフォールドタンパク質が、好ましくは解析のため会合または固体相の基質に付着させ、促進するために操作した。好ましくは、これは金のコーティングに留めるか、ビオチンとの関連である。スカフォールドの操作のために、金のコーティングに留めるか、好ましくは一つ以上のＣｙｓ残基をスカフォールドタンパク質のＣまたはＮ末端に導入した。スカフォールド固定の操作のため、ビオチンで留めて、好ましくは８アミノ酸のビオチン結合ドメイン（“ｓｔｒｅｐタグ”）の 一つ以上のコピーを前記スカフォールド内に導入した。固定はこれらの一つ以上またはいずれか他の適したものであることができる。好ましくは、本発明のスカフォールドタンパク質が固定化されたものである。好ましくは本発明のスカフォールドタンパク質を固定して操作することである。好ましくは、本発明にかかる相互作用試験を固定されたスカフォールドタンパク質を使用して実施することである。
本発明のさらなる利点
【００９７】
ステフィンＡを基にしたスカフォールドタンパク質は、これらを生体内において使用するものであるから、ペプチドの使用に優れていることである。さらに組み換え系の使用において、これらは合成ペプチドの研究より安いものである。さらに、ライブラリー構築は、同じ理由から合成ライブラリーの使用より安いものであり、さらにこれらは核酸の操作に用いて合理的なデザインをすることができるからである。これは複雑なペプチド合成の化学に頼ることを減少する。
【００９８】
ステフィンＡを基にしたスカフォールドタンパク質は、これらが細胞内部である一方、ファージディスプレイ法は細胞外相互作用に頼っているので、従来技術、例えばファージディスプレイ法スクリーンより優れている。さらに本発明のスカフォールドタンパク質は、組み換え標的よりはむしろ自然の標的に使用することができる。これは生体内における正確なリン酸化、グリコシレート、または他の翻訳語修飾されるが、おそらく生体外における産出は正確に形成されないであろう翻訳後修飾タンパク質の観測を許容し、さらなる利点を有する。
【００９９】
本発明にかかるスカフォールドタンパク質のさらなる利点は、これらが自然に起こるスプライス変異および生体内における解析のためにそれぞれ一つずつの産出、それらの配列、または他の区画化を有さずに産出される翻訳後修飾変異のスペクトルの疑問を許容する。
【０１００】
本発明のさらなる応用は、スカフォールドタンパク質を基としたステフィンＡとの相互作用の出力としてのマイクロカンチレバーの使用である。さらに本発明のスカフォールドタンパク質は、特に電気化学および／または薄いフィルムのトランジスタ出力の使用に適している。
【０１０１】
本発明のスカフォールドのさらなる利点は、本発明のペプチドアプタマーが抗体の代用品であることができ、結果はそれらがより良く実施できることを示し、例えばＣＤＫ２はペプチドアプタマーの使用において抗体より迅速に検出された。従って、抗体の使用よりはむしろペプチドアプタマーの使用は、より少数の動物が分子プローブの生産に必要とされ、科学の研究で重大な利点を提供する。
【０１０２】
本発明を、現在参照の以下の図に示した例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】Ｅ． ｃｏｌｉにおけるＳＴＭの発現および溶解性を示す；図１ＡはＳＵＮ、ＳＵＭおよびＳＴＭ変異体を示し、図１ＢはＳＵＣおよびＳＤＭ変異体を示し、そして図１ＣはＳＱＭ変異体を示す。
【図２】ＮＭＲ溶液構造におけるＳＴＭ変異において、ループ１のコドン４、コドン４８−５０、ループ２のコドン６７−８４、そしてコドン９１−９２をＣｎ３ＤソフトウェアおよびＰＤＢ座標ＩＤＶＤ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９５ ‘Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｆｉｎ Ａ．’Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ２４６ ｐｐ３３１−４３）を用いて作成した。変異部位は修飾されたステフィンＡタンパク質の産出を示す。
【図３】ＳＤＭ、ＳＵＣ、ＡＵＭ、ＳＵＮ、ＳＱＭ、ＳＴＭ Ｗ４ＲおよびＳＴＭ参照プロットの円偏光二色性（ＣＤ）分光法解析において、左回り円偏光に対する右回り円偏光の吸収の違いを測定し、構造非対称から生じた、ＳＴＭおよび新しい変異に保持された二次構造の比率を説明する。
【図４】長期保管に続くＳＴＭ、ＳＤＭ、ＳＱＭ、ＳＵＭ、ＳＵＮ、ＳＵＣ、ｐｅｐ６Ｍ、ｐｅｐ９Ｍおよびｐｅｐ１０Ｍの円偏光二色性（ＣＤ）分光法解析を示す。
【図５】独立したＳＴＭ、ＳＤＭ、ＳＱＭ、ＳＵＭ、ＳＵＮ、ＳＵＣ、ｐｅｐ６Ｍ、ｐｅｐ９Ｍおよびｐｅｐ１０Ｍの調製の円偏光二色性（ＣＤ）分光法解析を示す。
【図６】ＳＱＴおよびエピトープ標識したその変異体：ＳＱＴ−ＡＵＩ（１）、ＳＱＴ−ＡＵＩ（２）、ＳＱＴ−ＨＡ（２）、ＳＱＴ−ｍｙｃ（１）、ＳＱＴ−ｍｙｃ（２）、ＳＱＴ−ＡＵＩ（１）、ＡＵＩ（２）、ＳＱＴ ＡＵＩ（１）、ＨＡ（２）およびＳＱＴ ＡＵＩ（１）、ｍｙｃ（２）の円偏光二色性（ＣＤ）分光法解析を示す。
【図７】エピトープ標識したＳＱＭ変異体：ＳＱＭ−ｍｙｃ（１）、ＳＱＭ−ＡＵＩ（２）、ＳＱＭ−ｍｙｃ（ｎ）ＡＵＩ（１）、ＳＱＭ−ＡＵＩ（１）、ＨＡ（２）、ＳＱＭ−ｍｙｃ（ｎ）、ＡＵＩ（１）、ＨＡ（２）、ＳＱＭ−ＨＡ（ｎ末端）、ＳＱＭ−ｍｙｃ（２）、ＳＱＭ（２１ランダムループ１）、ＳＱＭ−ＡＵＩ（１）、ＳＱＭ（ＡＵＩｘ２、ループ１）、ＳＱＭ−ＨＡ（ｎ）、ＡＵＩ（１）、ＳＱＭ−ＨＡ（ｎ）、ｍｙｃ（２）、ＳＱＭ−ＡＵＩ（１）、ｍｙｃ（２）、ＳＱＭ−ＨＡｘ２（ｎ）、ＡＵＩ（１）、ｍｙｃ（２）、ＳＱＭ−ＨＡ（ｎ）、ＡＵＩ（１）、ｍｙｃ（２）およびｐｅｐ２２（Ｔｒｘ）を指定するペプチドアプタマーの円偏光二色性（ＣＤ）分光法解析を示す。
【図８Ａ】図８ＡはＡＵＩペプチドの抗ＡＵＩ抗体による免疫沈降を示す。
【図８Ｂ】図８ＢはＳＱＭ−ｍｙｃ（ループ１）の免疫沈降を示す。
【図８Ｃ】図８ＣはＳＱＴ−ＨＡ（ループ２）の免疫沈降を示す。
【図９】マイクロアレイ実験において、異なった部位でのペプチドアプタマーと異なるエピトープの結果を示す。
【図１０Ａ】抗体／エピトープ相互作用をＳＱＭスカフォールドの背景における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を示す。図１０ＡはｐＨ７．３における３３ｎｍのＡｎｔｉ−Ｍｙｃ（赤）、Ａｎｔｉ−ＨＡ（青）、およびＡｎｔｉ−Ａｕ１（緑）の溶液および化学吸着ＳＱＭ（Ｎｔ Ｈａ、Ｌ１ Ａｕ１、Ｌ２ Ｍｙｃ）単分子層（黒）に固定した１０ｍＭリン酸緩衝液の比較を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは異なった濃度のＡｎｔｉ−Ｍｙｃが飽和速度関数Ｍ＝（Ｃ×Ｂｍａｘ）／（Ｃ＋Ｋ）に一致し、平衡定数５０×１０−９Ｍを生じるＳＰＲ反応を示す。
【図１１】ループ１（上）、ループ２（中）またはアミノ酸末端（下）に挿入した８６４ランダムペプチドアプタマーを含むマイクロアレイの結果である。
【図１２】ＳＱＭ（ＳＱＭ−ｐｅｐ６）およびＳＱＴ（ＳＱＴ−ｐｅｐ１０ｍ）におけるぺプチドアプタマーの使用で、ヒト（ＨｅＬａ）細胞の二通りのライセートにおける内因性ｃｄｋ２発現を検出した。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
図２を参照とし、ステフィンＡの三次元構造および本発明の新しいスカフォールドタンパク質の産出のため、ステフィンＡ内の三箇所に変異を作ったことを示す。これらの部位は：ステフィンＡについてはＧ４またはＳＴＭについてはＷ４の部位；ループ１を拘束するコドン４６から５４までを含むいずれのコドン；特にコドン４８−５０；いずれのコドン；ループ２に拘束するコドン６７から８４を含有するいずれのコドン、特に７０−７３の変異。修飾されたステフィンＡまたはＳＴＭポリペプチドのスカフォールドタンパク質としての使用は記載のようにステフィンＡの配列を変異によって作成した。ステフィンＡを基にして得られたタンパク質であるが、特異的な変異性の変化は上の本明細書に開示の既知の配列を有する。
実施例２
【０１０５】
図１はＥ． ｃｏｌｉでのＳＴＭ発現および変異体の例を示す。本明細書に開示のＳＴＭおよび変異体のオープンリーディングフレームは、アミノ末端尾に付加の機能を含む、システイン残基（全ての示した変異体に存在する）またはＳｔｒｅｐＩＩタグ（ＳＴＭのみ）等の工作をしたＥ． ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ３０ａ＋型でクローンした。ＳｔｒｅｐＩＩタグに挿入した８アミノ酸の付加は、ＳＴＭタンパク質と他の変異体の遊走を比較するとわずかな違いを占めた。これらの発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を有するＥ． ｃｏｌｉ細胞は、ＳＴＭおよび変異体タンパク質（＊で強調する）の発現を誘導するイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の欠乏（−）または存在（＋）で培養した。３７℃で誘導から３時間後、細胞を超音波処理で溶解し、１０分間１６，０００×ｇの遠心後、総細胞ライセート（Ｔ）または溶解物（Ｓ）の部位に回収して、１５％のポリアクリルアミドゲルに負荷した。タンパク質をクーマシィー染色によって視覚化した。この方法で限界に達するまで、それぞれ１００％の示したタンパク質（ＳＵＮ、ＳＵＭ、ＳＴＭ、ＳＵＣ、ＳＤＭおよびＳＱＭ）が可溶性成分に回収することができ、これは変異体タンパク質の残物がＥ． ｃｏｌｉ内において折り畳むことができることを示す。
実施例３
【０１０６】
新しいペプチドのデザインの合理的な方法において、ステフィンＡおよび／またはＳＴＭを基にした新しいスカフォールドタンパク質の産出を実施した。本発明の新しいスカフォールドタンパク質が、生体外および生体内における研究の広範囲において実用的な質を有する理想的なスカフォールドを有することを必要とし、これらの要素が新しいスカフォールドのデザインに応用されるであろう。
【０１０７】
ステフィンＡまたはＳＴＭの小さな、安定性のある細胞内プロテアーゼ阻害剤から始め、親タンパク質が安定した構造を保持する、生物学的に中性な多数のスカフォールドを操作した。異種性型新しいスカフォールドタンパク質は、既知の相互作用物の背景およびライブラリースクリーンの双方において、所望の標的に結合するペプチドを示すことを期待する。スカフォールドを基にした分子ツールとして生物学的な経路の研究の幅広い範囲および薬剤標的の検証を見出した。ＳｔｅＡは既知の翻訳後修飾を受けない、ジスルフィド結合を欠失した、９８アミノ酸の単量体、単一ドメインタンパク質である。ＳｔｅＡは遷移と共に、ＳｔｅＡを基にしたスカフォールドの全ての重要な特徴である、９８℃の観測および４９０ｋＪ／ｍｏｌの折り畳みエンタルピーにおいて、驚くべき熱安定性を示した。
実施例４
【０１０８】
ＳＴＭ変異体発現プラスミド（全てはｐＥＴ３０ａ＋を用いる）をＥ． ｃｏｌｉ内において変形した。単一のコロニーを接種し、一晩３７℃で振とう（軌道振とう機で２５０ｒｐｍ）による増殖で培養した。翌朝、それぞれ０．５ｍＬの一晩培養した液体を、ｐＥＴ３０プラスミドに対する選択を維持するためにカナマイシンを追加した５００ｍＬの新しい培地に接種した。培養が対数期の中央（ＯＤ６００〜０．６−０．８）に達したとき、様々なタンパク質の発現を誘導した。培養液にさらに３時間、３７℃のまま、振とうしながら培養した。Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を遠心によって採取し、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓを用いて溶解した。ライセートを遠心によって澄まし、ＳＴＭ変異体タンパク質はＮｉキレート親和性クロマトグラフィーを用いて得られた上清から精製した。これに０．５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡｇｅｎ）を２０ｍＬのライセートに使用した。樹脂を５０ｍＬのファルコンチューブにて７００ｇで２分間遠心し、上清を取り除いた。樹脂を２．５ｍＬの１×Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｗａｓｈバッファーで、樹脂をバッファーに再度けん濁し、その後７００ｇで２分間、４℃で遠心し、上清を取り除く洗浄を３回行った。ライセートを洗浄した金属の親和性樹脂と組み合わせ、ローラー上において２時間、４℃で培養した。ライセートのアリコートを次の解析に保持した。樹脂をライセートから７００ｇ、５分、４℃で遠心し、分離し、上清を取り除いた。さらにライセートのアリコートをその後の結合親和性解析に保持した。樹脂を１０ｍＬのＷａｓｈバッファーで（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）、ビーズをバッファーに再度けん濁し、その後７００ｇで２分間、４℃で遠心し、上清を取り除く洗浄を６回行った。樹脂を１ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎバッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）と共に１０分間室温で培養した。けん濁液を７００ｇ、５分間遠心し、上清を保持した。このステップをさらに二回繰り返し、さらに二つの溶出画分を得た。画分と最も高濃度のタンパク質を保持し、４℃に保管した。円偏光二色性のため、サンプルを５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４にバッファー交換した。サンプルを解析する日に約０．３ｍｇ／ｍＬまで希釈し、正確なタンパク質はＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して測定した。図１に示す部位において、１ｍＭ ＤＴＴを解析直前に直ちに加えた。ＣＤスペクトラムをＪａｓｃｏ Ｊ７１５分光偏光計を使用して２００から２６０ｎｍにおいて収集した。スペクトラムをモルタンパク質濃度および残留モル楕円率に標準化し、プロットすることで、サンプル間の不自然な結果を最小にした。
実施例５
【０１０９】
ステフィンＡおよびＳＴＭを基にした本発明のスカフォールドタンパク質を構造的に安定しているか、ＤＮＡ（オープンリーディングフレーム）レベルで作った変異が新しいステフィンＡ／ＳＴＭの変異体のアミノ酸配列を変異に導き、タンパク質の安定性を減少するかを明確にし、全ての本明細書に記載の変異体を発現させ、円偏光二色性の対象として、それらの二次構造組成物をステフィンＡと比較した。図１に参照し、全てのタンパク質がＥ． ｃｏｌｉ内において同等、通常約２８ｍｇ変異体のタンパク質／ｍＬの細菌培養液に発現していることを見出すことができる。その後、タンパク質はＮｉアガロースを使用して、ほぼ均一に親和性クロマトグラフィーによって精製し、精製した調製物を円偏光二色性解析の直前に０．３ｍｇ／ｍＬまで希釈した。前述のように、円偏光二色性解析はタンパク質をほぼＵＶ波長の範囲に渡ってスキャンすることからなり、例えばライトの楕円率はタンパク質の二次構造要素（αヘリックスまたはβストランド）に影響する。
【０１１０】
図３を参照に、二次構造の割合はＳＴＭおよび本発明において好都合にＳＤＭ、ＳＱＭ、ＳＵＭ、ＳＵＮおよびＳＵＣ（上記の本明細書で定めた配列番号：９−１３）として参照される新しい変異体の間において保持され、ＳＴＭ内の挿入物の存在はその構造に悪影響を与えない。特に注目すべきは、二つの変異体（ＳＵＮおよびＳＱＭ）の外見が、他のスカフォールドタンパク質試験と比較して構造上昇していることである。これはこれら全てのタンパク質に存在するアミノ末端尾の二次構造の取得のためであることができ、位置４のグリシン（ステフィンＡ）またはトリプトファン（ＳＴＭ）をアルギニンに置換することによって誘導され、これがＳＵＮおよびＳＱＭに共通する唯一の変異で、これらはこの変異を有する唯一の変異体である。最小の変異をＳＵＮ、ＳＵＭ、ＳＵＣおよびＳＤＭにおいて考慮するとき、結果は主な変曲点の場所である２１８ｎｍはそれぞれの変異によって大きくは影響されないことを示し（図３）、これはアミノ酸変異が一般的にタンパク質を不安定にして、ステフィンＡ由来の二次構造の割合はアミノ酸変異によって変異しないことを予期することを示す。その一方、変曲の深さを変異体の間において著しく変えた（図３）。
実施例６
【０１１１】
保存効果を検索した。図４は４℃で２週間、ｐＨ７．４のリン酸化バッファーで保存した後、濃縮したストックの全スカフォールドタンパク質変異体の試験をして、二次構造の比率を同じサンプルの作りたての希釈液を解析したとき（図５と比較）保持していることを示す。これは大半のタンパク質が完全に変性したか、保存ビンに吸着したため欠失しているため、この時点ではキャリアタンパク質の大量を添加しない限りとても驚くべきことである。このステップにおいて、ペプチドアプタマーの高い精製の調整、即ち診断および分析解析において関連性のないタンパク質、例えばキャリアタンパク質の存在の結果からなる非特異的なシグナルを最小にする使用が目標であるため、即ちキャリアタンパク質の添加は好ましくない。結論として、新しいスカフォールドタンパク質ステフィンＡタンパク質の変異体は、明白な利点となる結果はないが、単純なリン酸化バッファーに保存することができる。この観測は新しいスカフォールドタンパク質ステフィンＡの変異体の工業的な応用を補助する方法である。
実施例７
【０１１２】
円偏光二色性はまたＳＴＭ、ＳＤＭ、ＳＱＭ、ＳＵＭ、ＳＵＮ、ＳＵＣおよび３つのペプチドアプタマーのｐｅｐ６Ｍ、ｐｅｐ９Ｍ、ｐｅｐ１０Ｍ（図６）の変異体に実施した。ＤＴＴを添加し、アミノ末端尾に存在するシステイン残基の発現変異体タンパク質が、実験に影響を与えることができる分子間のジスルフィド結合の形成を妨ぐことができる。ＤＴＴの有無は観測された二次構造に影響ないが、ＤＴＴそのものがほぼＵＶ範囲のシグナルの一因のため、その欠失のとき得られたスペクトラムの解析は比較的簡単であった。これらの結果はＤＴＴが本発明のスカフォールドタンパク質の二次構造に影響しないことを示した。
実施例８
【０１１３】
ループ１および２の双方に加える変異において、位置４の部位に変異性の変化を含有するＳＱＭ変異体（配列番号：１０）を、すなわち単一のスカフォールドに複数の挿入部位、そのスカフォールドタンパク質ディスプレイ法の特徴として評価した。ペプチド（ＨＡ、ＡＵ１またはＭＹＣ）をそれぞれ４、４８、および７２／８２番目の部位に挿入し、円偏光二色性データを作り出した（図７）。円偏光二色性解析データは新しい挿入部位がペプチドの相互作用を示す特徴のみではないが、それらは重要な構造欠失がないことを示す。
実施例９
【０１１４】
二つの方法によってスカフォールド構造のアミノ酸変異の結果を得るために使用した。第一の方法は、おおざっぱにＥ． ｃｏｌｉ内のタンパク質操作の相対発現レベルを大半のアミノ酸変異がタンパク質を不安定にするという論理を定めた。以下の表１は細菌培養からの様々なスカフォールド変異体の発現収率が生じ、収率はｍｇの精製タンパク質毎培養液のリットルとして起こる。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
二番目に使用された方法は、直接それぞれのタンパク質を円偏光二色性（ＣＤ）によって二次構造の要素を評価する。Ｅ． ｃｏｌｉのタンパク質収率を比較したとき、それは、それぞれステフィンＡ内のＳＵＮ、ＳＵＭ、およびＳＵＣに少しの効果、もしくはＳＴＭ（表１）と比較して上昇した収率を導き出すことを見出した（表１）。これはまた二つの変異の組み合わせ（ＳＤＭ）またはＳＱＭ一つのタンパク質内に三つ全ての変異があるとき当てはまる。実に、ＳＱＭの４調製のタンパク質の平均収率が、５８＋／−２９ｍｇ精製したスカフォールド／細菌培養のリットルである一方、三調製のＳＴＭの培養の収率が５８＋／−４１ｍｇ精製したスカフォールド／細菌培養のリットルであった。
【０１１７】
異なったＳＴＭ変異体のＣＤスペクトラムを２００ｎｍから２６０ｎｍの間で得た。ＣＤスペクトラムのプロットの形の変異は折り畳まれたαヘリックスおよびβシートの容量の変異を示していると考えられる。全てのＳＴＭ変異体における同様の約２１８ｎｍの変曲点のＣＤスペクトラムは、導入した修飾（図３）によるかく乱作用のない同様の構造を示した。しかしながら、観測されたＣＤスペクトラムの振幅差は、またＳＴＭ（図３）と比較してＳＤＭ、ＳＵＣおよびＳＵＭにおいても見られ、ゆるやかな曲線を示し、ＳＱＭおよびＳＵＮにおいてはなだらかな曲線を示した。説明の可能性として、折り畳みの安定性の強化が考えられ、即ち正しく折り畳まれたタンパク質の平均の一定時間の容量が、ＳＴＭと比較して、ＳＱＭおよびＳＵＮの溶液において高上していて、高い楕円率の出力の結果に至った。ＣＤスペクトラムに基づいて、得られたタンパク質の収率との組み合わせ（表１）によって、それはＳＱＭ変異体がスカフォールドタンパク質であることがあり得ることが断定された。
実施例１０
【０１１８】
調査をＳＱＭがペプチドの相互作用を示すことができるか否かであって、試験は、ＳＱＭ内に作成された新しい部位が存在するとき、単純なエピトープタグがそれらの類似抗体に認識されることができるかによって実施された。長さおよび物理化学的な特徴双方において異なる、三つのエピトープが選択された（ＡＵ１、ＨＡおよびＭＹＣタグ）。これらのペプチドをスカフォールド内の可能な位置（Ｎ末端、ループ１またはループ２）に単一または様々な組み合わせによって挿入した。始めに、ＨＡタグをアミノ末端部位、ＡＵ１タグ（最短ペプチド）をループ１の中、Ｍｙｃタグをループ２の中に挿入した。驚くべきことに、アミノ末端内のＨＡタグの挿入物の許容はとても低く、タンパク質の収率は空スカフォールドと比較して約２．５倍であった。同様に、Ｅ． ｃｏｌｉにおいてＭｙｃタグをループ２の中に挿入した結果は＞５倍低下であった。その一方、ループ１内におけるＡＵ１タグの挿入はＳＱＭを不安定にせく、実際収率（表１）を上昇することができる。
【０１１９】
総合すると、タンパク質発現データはＳＱＭがペプチドをアミノ末端、ループ１およびループ２の３カ所において示すことができることを現した。そのうち新しいループ１部位は最も広範囲において実用的であるように見られる。
実施例１１
【０１２０】
実験は、上記のペプチドアプタマー２内のＳＴＭスカフォールドに存在する短いペプチド由来の形状の挿入による効果の評価によって実施した。これらのペプチドは様々な長さ、１０残基（Ａ４８、Ａ５２、およびＡ５８）、１７残基（Ａ７）、および２２残基（Ａ５２直列）の長さである。これらのＡ７のみがＳＴＭタンパク質の二次構造に影響した（データ未記載）。驚くべきことに、同じペプチドをＳＱＭのループ２の中に挿入したとき、二次構造の割合がそれぞれの得られたペプチドアプタマーの変異に至らなかった（データ未記載）。これはＳＱＭがＳＴＭよりペプチド挿入に耐えられることに優れていることを示した。さらに、実験を上記三つの部位内（表１）におけるエピトープタグの結果として得られたペプチドアプタマーの二次構造の割合に対して挿入効果を評価するため実施した。結果は予期せず、タンパク質収率を減少するそれらの挿入物でさえ、感知できるほど得られたペプチドアプタマー（図７）の二次構造の分離をしないことを示した。しかしながら、それはＮ末端部位変異のペプチドの存在が曲線の形状を変え、変曲点を２１８ｎｍから２０９ｎｍに向かって押す（図７、ＳＱＭ−Ｈａ）。これがスカフォールド構造のこの部位への挿入の一般的な効果に反映するか明確にするため、ＳＱＭ由来ペプチドアプタマーとループ１および／またはループ２内への挿入、並びにアミノ末端全ての挿入の範囲におけるスペクトルを解析した。これは常にこれらのタンパク質がＮ末端部位に挿入物を欠失している相応のタンパク質より少ない二次構造を有することを見出した（図７）。
実施例１２
【０１２１】
制限内であると、モデルペプチドをそれぞれ本発明の三つの部位に挿入することが可能だと断定され、挿入ペプチドアプタマーが免疫沈降することができることを見出した。図８Ａを参照に、ＡＵ１ペプチドをループ１内に挿入する免疫沈降を示し、ループ１内へのＡＵ１ペプチド挿入が抗ＡＵ１抗体結合の十分に密接で、ペプチドアプタマーが免疫沈降できることを示す。図８Ｂおよび８ＣはまたＳＱＭのループ１（ＡＵ１およびＭＹＣ）そしてＳＱＴ（ＨＡ）のループ２のエピトープタグ付のスカフォールド変異体のエピトープ類似抗体によって認識することができることを示した。これはマイクロアレイ構成を使用した他のエピトープタグが同等に良く認識されることを確認した（図９）。ペプチドアプタマー（Ｐｅｐ２、ｐｅｐ６、ｐｅｐ９またはｐｅｐ１０ｍ）はループ２内のＳＱＭまたはＳＱＴをガラス顕微鏡スライド上にアミン化学を使用して固定し、溶解、標識されていない工業用のソースのＣＤＫ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）活性によって探索（ｐｒｏｂｅ）した。長い間洗浄した後、固定されたペプチドアプタマーに結合したＣＤＫ２は抗ＣＤＫ２抗体および標識された二次抗体を使用して検出して、標準のＤＮＡマイクロアレイスキャナーを使用して画像化した。データはＳＱＭが他のスカフォールドよりｐｅｐ６に比較的良く存在するのに対して、ＳＱＴは他のスカフォールド変異体よりｐｅｐ１０ｍにおいて比較的良く存在することを臨床的に関連のある範囲において示した。空のＳＱＴスカフォールドは低いシグナルを発し、これをバックグラウンドとして設定した。Ｅ． ｃｏｌｉから精製された異なる部位におけるペプチドアプタマーと異なるエピトープをガラススライドにニッケルキレート（それぞれのペプチドアプタマーのヘキサヒスチジンタグを捕らえ、方向付けを制御する）または単純にポリＬリジンのいずれかによって印刷した。全てのプリントは、始まりから終わりがプリントバッファースポット（ｐｒｉｎｔ ｂｕｆｆｅｒ ｓｐｏｔ）および遊離ＳＱＭスポットであって、常にシグナルが得られなく、ネガティブコントロールとして働く。全ての場合、抗体吸収率は特異的である。これらの結果をＳＰＲ（図１０）で確認した。抗体は次の順にＳＱＭ標的に対して、最も高い親和性を有する：３３ｎＭ溶液の噴射によって抗Ｍｙｃ、抗Ｈａおよび抗Ａｕ１と表面濃度の変化０．４、０．１３、および０．０２ｐＭ ｃｍ−２を観測した（以下の表２）。これらの値は比較的定性的な平衡定数の降幅Ｋを示す。抗Ｍｙｃ抗体に対するＫ値は〜５０ｎＭの位数として算出され、抗シスタチンにおける同様の研究と一致する。抗Ｈａおよび抗Ａｕ１に対するＫ値ヲＳＰＲ分析の非理想的な作用によって正確に測定した。抗Ｈａは急速で、激しい関連性の急上昇後、同様の性質の分離として二番目に遅い関連性の要素を示した。このような性質は、複数の工程が起きていること、複数の代わりのスカフォールド末端構造の結合の結果によるものであることができるか、または商業用のサンプルの不純物を示す。あるいはそれはとても早い速度の結合および分離定数の結果であることができる。ＡＵ１はＭｙｃに対してはっきりと変化した分離関連曲線として同様な反応を示したが、完全に固定した等級抗体が大幅にｃａ２位数の大きさで減少したことが見られた。ＨａおよびＡｕ１の場合、Ｋ値は明白に５０×１０−９Ｍ以下である。
【０１２２】
表２は、抗体が三つ全てのエピトープタグからなるＳＱＭアプタマーに共有結合した相対的な反応を示す。
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
サンプルの結果は、二つの表面の間において同等の質で、基本となる違いは見られなかったが、ノイズシグナルおよび再現性はアミン表面より優れている。表面間の類似は双方のランダムな方向性および制御された方向性の場合を示し、三ループ全ては周囲に開放されていて、処置することができる。Ｎ末端のループ１または２に設置した類似エピトープが有する変数の結合親和性の証拠はない。実験はまた上記濃度の抗体を混合物に同時に加えて繰り返した。同程度の結果が全ての場合において、ループがそれぞれ他から十分に分離されていること、独立して反応を示すことが見られた。ループが隣接したループの抗体結合の阻害であることの証拠がないことが見られた。操作されたスカフォールドは予期しないほどの広い表面積において、タンパク質または４５０ｋＤａまでの複数のタンパク質複合体を認識すると推定し、相性の良い三つの抗体分子の結合と同時に相互作用を示すことができる。
実施例１３
【０１２５】
それぞれ三つの部位に挿入された８６４のランダムペプチドの発現プロフィールを解析した。この実験において、小スケールの培養物を９６穴プレートのランダムペプチドアプタマーで成長させ、高い処理量のペプチドアプタマーを精製し（すなわちそれぞれの穴に最適な発現または精製プロトコールなしに）、それぞれのペプチドアプタマーを等体積でガラスの顕微鏡スライドにスポットし、小さいマイクロアレイを作り出した。マイクロアレイをその後、スカフォールドタンパク質を認識する二つの抗体によって検出した。得られたシグナルの強度と抗体は、その後それぞれの特徴のアレイにおいてペプチドアプタマーの量と比例する。結果はループ１およびループ２への挿入が、一般的に良く発現していることを示した一方、ほぼアミノ末端挿入物の５０％があまり優位に発現していない（図１１）。結果は試験した３８４のうち６８％のペプチドアプタマーとＳＱＭのループ１内への６アミノ酸の長さのランダム挿入物が良く発現していて、１６％の発現が低レベルであることができる一方、１５％の発現が検出することができない。結果は試験した３８４のうち７６％のペプチドアプタマーとＳＱＭのループ２内への１２アミノ酸の長さのランダム挿入物が良く発現している一方、１４％の発現が低レベルで、１０％が全く検出されなかった。最後に、アミノ末端内の１９２ペプチドアプタマーとランダム挿入物の内、３５％のみが良く発現している一方、３２％の発現が低レベルで、３２％が全く検出されなかった。
【０１２６】
結論として、多数の異なったペプチドがアミノ末端部位において挿入できることを示すが、これらはまたしばしばスカフォールドの安定性に不利である。それに応じて、スカフォールドおよび本発明の新しい部位が、標的タンパク質と広い表面積の使用、従って高い親和性および特異性で相互作用するペプチドアプタマーの産出に使用することができることを提案した。
実施例１４
【０１２７】
ループ２のさらなる操作の試みによって、ＳＴＭと比較して、８２−８３部位における新しい変異の不安定効果を始めた。従って、新しいスカフォールドはアミノ末端のループ１においてＳＱＭと同様の変異を有し、また７１−ＮＧＰ−７３を有するが、現在は野生型（ステフィンＡ）配列７８−ＥＤＬ−８０と７８−ＡＤＲ−８０、７７−ＳＤＲＬ−８０、または７８−ＮＴＤ−８０のいずれかと置換し、操作した。これらそれぞれの変異は、ループ２内のペプチドをコード化するオリゴヌクレオチドの導入による二つのＲｓｒＩＩ部位の使用に許容なようにデザインした。これらの７８−ＡＤＲ−８０バージョンは比較的柔軟性があることを立証した。新しいスカフォールドはＳＱＴとしてデザインした（配列番号：２４）。Ｅ． ｃｏｌｉ内のＳＱＴのタンパク質発現の収率はそれらのＳＱＭ（表３）と比較して減少していることを見出した。しかしながら、ＳＱＴのバージョンとループ２への挿入の収率は、ＳＱＭ（表３）のループ２内へ同じ配列を挿入したものと比較して、常に改善している。これらの違いは、ループ２内のＡＵ１として最も公表されていて、発現レベルが、ＳＱＭを使用したとき１Ｌの細菌培養液から１ｍｇペプチドアプタマー以下であったが、４５ｍｇ／Ｌの培養液とＳＱＴであった。表３はペプチドアプタマー発現のペプチドの収率を１リットルの細菌培養液から通常の条件において得られる精製したタンパク質のｍｇとして示す。
【０１２８】
【表３】
【０１２９】
ある驚くべき観測は、ループ１単独の挿入物の発現収率がＳＱＭにおいてＳＱＴより高いことができる。例えば、２５ｍｇのペプチドアプタマー毎リットルの培養液がＳＱＴ−ＡＵ１−ループ１から得られるが、１０３ｍｇ毎ＳＱＭ−ＡＵ１−ループ１であるかこれは一般概念ではなく、ペプチドアプタマーとループ１内のＭｙｃエピトープ（表３）より効果は反対であった。ペプチドアプタマーとＳＱＴのループ１およびループ２内への二重挿入物は一般的に良く発現していて、ＳＱＭの同じ組み合わせの収率において改善を示したが、ＳＱＭ（表３）のループ１内へのＡＵ１タグおよびループ２内へのＨＡタグを挿入したとき、今までは高い収率がペプチドアプタマーにおいて得られた。
【０１３０】
別の手段のペプチド挿入の効果を考慮したとき、ＳＱＴはモデルＣＤＫ結合ペプチド（ｐｅｐ２、６、９および１０ｍ）またはＭｙｃエピトープの存在を見出した。一般的に、ＳＱＴはＳＱＭよりこれらのペプチドを受容することができることに優れている。しかしながら、驚くべきことに、ＳＱＴはＳＴＭより少しの（ｐｅｐ２、ｐｅｐ９）または一切認められない（ｐｅｐ６、ｐｅｐ１０ｍ）利点を有しているように見られる。これらのデータはスカフォールドおよびループ内へのペプチド挿入物の最小の操作が比較的複雑な変異より、これらが二次構造の分離を最小にするようデザインしたとしても、容易にできるとされている。
実施例１５
【０１３１】
ＳＱＴのループ１を用いたライブラリー構築の効率を改善するために、
【化４】
（配列番号：２６）をＮｈｅＩ部位内のオリゴヌクレオチド配列に、５’末端のＮｈｅＩ部位と３’末端のＳｐｅＩ部位を使用して挿入し、後者は切断したＮｈｅＩ部位の切断をアニールしたとき欠失し、これはまたＳＴＭオープンリーディングフレーム内の３’ＮｈｅＩ部位欠失の結果に至った。挿入したオリゴヌクレオチドは、ペプチドをコード化するオリゴヌクレオチドの挿入に使用することができる３つの新しい制限酵素サイト（ＳｔｕＩ、ＢＣＩＩおよびＮｃｏＩ）を有する。変性スカフォールドの最後の配列のこの部位において、新しいリンカー鎖はＤＮＡ：
【化５】
からなる。タンパク質：
【化６】
と挿入したオリゴヌクレオチドをコード化するアミノ酸を小文字で示す。リンカー鎖のＮｈｅ１およびＮｃｏＩ部位を用いたオリゴヌクレオチド挿入は、ＳｐｅＩＩ／ＮｈｅＩアニーリング配列にコード化される二残基（ＬｅｕＡｌａ）の挿入の終結という結果となるであろう、そしてＳＱＴスカフォールドタンパク質は従って、従来のステフィンＡより二残基長い。これを延長したスカフォールドＳＱＬと呼ぶ。この方法がライブラリー構築を改善に必要とする、５’−ＮｈｅＩおよび３’−ＮｃｏＩ部位による隣接塩基配列（ｆｌａｎｋｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にＳＱＬ内の一致する部位のランダムオリゴヌクレオチドを挿入した。形質転換細胞の配列を決定した全２０に対して、単一な正しい挿入物をそれぞれのクローンにおいて示す一方、ＮｈｅＩ部位を単独で使用したとき、クローンしたとき、形質転換細胞の２４配列中、８つのみが必要とされるものであった（単一の挿入物、正確な方向）。他の９つのクローンは空プラスミド（不十分な処理（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）および脱リン酸化ステップを示す）、３つのコンカテマー（オリゴヌクレオチドをライゲーション前にそれぞれ他のスカフォールドＯＲＦ内においてライゲーションした）、４つは間違った方向であった。これらの数は、両端をＮｈｅＩ部位によって隣接塩基配列にされたランダムオリゴヌクレオチドをＳＱＴのＮｈｅＩ内に挿入したとき、これら得られたものに対して方向付けられた挿入物を使用によって広大な改善を示した。従って、オープンリーディングフレームの核酸配列を変えて、ＳＱＴＲｓｒＩＩ部位の代わりに、Ｘｍａｌ部位を作成した。これはＳＱＴのアミノ酸配列に変異を及ぼさないような、ループ２と同様の手段を実施した。これはＳＱＴのアミノ酸配列に変異を及ぼさない。
実施例１６
【０１３２】
二つのペプチドアプタマーがＣＤＫ２に対して明白に最も高い親和性をマイクロアレイ実験における表示は、“免疫ブロット法”プロトコールを使用し（またウェスタンブロット法と呼ぶ、図１２参照）、抗体の代わりにペプチドアプタマーを除いたもの（ＳＱＭ−ｐｅｐ６およびＳＱＴｐｅｐ１０Ｍ）を使用した。抗体は同様に、Ｓタンパク質のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）融合を検出することができるＳタグを有するペプチドアプタマーとして、“免疫ブロット法”の開発ステップから除いた。ネガティブコントロールとして、パラレルブロットは空スカフォールドと検出し（ＳＱＴ参照）、Ｓタンパク質プロトコールを使用して開発した。ポジティブコントロールとしてパラレルブロットを同じ相対的な分子量のタンパク質検出に使用することができるが、抗体がペプチドアプタマーと同じ濃度で使用されるとき、長い露光時間を必要とする抗ｃｄｋ２抗体で検出した。図１２はニトロセルロースまたはＰＶＤＦメンブランへの転写前にポリアクリルアミドゲルの電気泳動における異種性の対象として、上記のようにスカフォールド、ペプチドアプタマーまたはスカフォールドによって検出した二つのヒト組織培養細胞のライセートを示す。データはペプチドアプタマーがこのプロトコールにおいて、抗体のみとの置換はできないが、ペプチドアプタマーを使用した検出は抗体より比較的迅速であるため、実際にはＣＤＫ２としての機能が優れていることを示した。従って、有利に抗体よりペプチドアプタマーの使用とは、分子プローブの産出に少ない動物の使用が必要されることを意味する。
【図１Ａ−１Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチド、例えばペプチドアプタマーのようなペプチドのディスプレイのための新しいスカフォールドタンパク質に関し、特に、本発明は、修飾されたステフィンＡポリペプチドおよびステフィンＡに基づく修飾された人工的なタンパク質の使用に関し、全てをスカフォールドタンパク質およびディスプレイ法に使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質相互作用の研究は多くの生物学的プロセス、例えば遺伝子産物の健康および疾患の双方における生体内の役割のようなものにおいて重要である。ペプチドアプタマーは、特に分子医学の基礎および応用の双方の面のために有用である重要な分子ツールとして現れた。所定の標的タンパク質と細胞内レベルにおいて、特異的に結合して不活性化するそれらの能力により、それらは生体外および生体内の双方の機能タンパク質分析（解析）のための実験的方策を提供する。それらはまた細胞外タンパク質に対して使用することもできる。タンパク質機能の研究での適用と同様に、これらのツールは従って、分子検出、診断のため、および／または治療剤として有用である。ペプチドおよびペプチドアプタマーは溶液において遊離で使用することができる。しかしながら、小（低分子）ペプチドが非拘束のとき、制限された相互作用面を提示する構造を形成する傾向にある。さらに、それらは標的分子との関連により、立体構造のエントロピーを失うことが多く、結合の自由エネルギーが減少し、その結果、フリーのペプチドは緊密な非共有結合複合体を形成しないことが多く、それは問題である。その上、細胞内でペプチドは急速に分解し、それは生体内におけるタンパク質の相互作用の研究についてそれらの有効性制限し、それがまた問題である。
【０００３】
自由溶液（free solutions）において使用されるよりもむしろ、興味のあるペプチドを物理的な支持体に結合してもよく、またはより一層大きなポリペプチドとの関連において表示してもよい。前者は生体内の研究において難なく適用することができない。後者において、ペプチドは単純且つ安定なスカフォールドタンパク質の一次配列中に遺伝学的に挿入する。スカフォールドの折り畳みはペプチドを立体構造的に拘束し、ペプチドアプタマーは高い特異性および親和性によってパートナーと結合する。これは本発明において重要なポリペプチドとの関連のディスプレイである。このようなディスプレイは、頻繁にスカフォールドタンパク質を用いて成し遂げられる。
【０００４】
先行技術のスカフォールドは、不活性のブドウ球菌ヌクレアーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびチオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）、ならびに分離したタンパク質の折り畳み、例えばブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、“アフィボディ（affibodies）”、アンチカリン（anticalins）、およびアンキリン（anyrin）反復からなる。
【０００５】
さらに先行技術のスカフォールドタンパク質には、ファイブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（‘Ｆｎ３’）、アンチカリンが導き出されるリポカリンファミリータンパク質、ビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）等が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／１３１７４９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
つい最近（国際公開第２００６／１３１７４９号）は、ステフィンＡ内において形成されるいくつかの合理的な変異を、それをスカフォールドとして改善するために記載する。修飾されたステフィンＡスカフォールドは、以下三つの部位、Ｌｙｓ７１−Ｌｅｕ７３，Ｖ４８ＤおよびＧ４Ｗにおける変異を含み、ＳＴＭ（ステフィンＡ三重変異）と称す。これら三つの変異の組み合わせは、ヒト細胞において、タンパク質との最小の相互作用をもつタンパク質を生じさせ、そして特にすべての検出可能な既知の自然なパートナーとの相互作用を喪失したことを示した。しかしながら、本発明者らは、タンパク質中に位置７１〜７３でペプチドを挿入することは、挿入されたペプチドの端部でのタンパク質のトランケーション（切り詰め）のための強い選択圧（淘汰圧）につながることを見出した。このように切り詰められたタンパク質は生物学的な有効性を表示することができたが、この観察は単純に位置７１−７３で切り詰められずに挿入されたペプチドのサブセットが、標的タンパク質との相互作用のために自由に利用可能でありえないという懸念を導き、これは問題である。さらに、単一部位でペプチドを挿入することは、必然的にタンパク質の相互作用のために用いられる合計表面積を制限し、それは次に結合親和性および潜在的な特異性を制限する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ステフィンＡに対して、およびステフィンＡに基づく修飾された人工タンパク質、例えば本発明において開示したようなＳＴＭ（ステフィンＡ三重変異）のようなものに対して作られた新しい変異は、代わりの改善された、およびより一層安定なスカフォールドタンパク質を提供し、そして、また、先行技術のものより用途の広いディスプレイシステムを提供する。さらに、これらの新たなタンパク質のスカフォールド／ディスプレイシステムはまた、効率的且つローバスト（robust）なディスプレイエンティティー（実体）としてまったく予測不可能である。これ以降に記載の新たな変異はステフィンＡ／ＳＴＭタンパク質の特定された多様なエリアで作られ、そして驚くべきことにステフィンＡ／ＳＴＭタンパク質の構造（立体構造）またはそれらのスカフォールドタンパク質としての潜在的な機能が見出された。さらにまた、本発明の改善されたスカフォールドを伴い、さらなる工学技術（engineering）の理由により、スカフォールドが多重の挿入物をもち、時には今まで先行技術のスカフォールドにおいて可能でない修飾を提供することが可能である。
【０００９】
本開示の概略。本発明の第一形態において、修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質を提供し、修飾は、単一の変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンをステフィンＡのためにトリプトファンまたはＳＴＭのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、または
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本願書の明細書および請求の範囲において、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”、“なる（ｃｏｎｔａｉｎ）”、そしてこの用語のバリエーション、例えば“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”および“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”の意味は“からなるが制限されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）”であって、他の一部、添加物、成分、整数またはステップを排除するという意図はない。本願の明細書および請求の範囲において、その背景において必要とされなければ、単数形は複数形を含む。
【００１１】
特に、本願は不定冠詞が使われているところで、背景に必要としなければ、複数形並びに単数形を意図している。
【００１２】
特徴、整数、指標、化合物、化学成分、または群と共に記載された本発明の特定の態様、実施形態、または実施例は両立しない限り、いずれの本願の他の態様、実施形態、または実施例である。
【００１３】
本明細書のスカフォールドタンパク質は、一つのタンパク質と結合した配列で、用語はまた融合タンパク質と同義語である。“融合タンパク質”は本発明のスカフォールドタンパク質を一つ以上の異なった（例えば“異種”）ペプチドまたはタンパク質と結合したタンパク質からなるものを意味する。異種ペプチドまたはタンパク質の挿入において、融合タンパク質は所望の標的と結合できる。
【００１４】
本発明は、新しい変異体に基づく野生型ステフィンＡタンパク質そのもの、好ましくはステフィンＡがヒトのステフィンＡ、または三重変異ＳＴＭ、安定したスカフォールドタンパク質として使用するのに適した形状の状態にする一方、付随してそれらを有利な生物学的において中性な状態に生物学的に重要な相互作用および活性な状態にカテプシンまたは他の不明のタンパク質との自然の相互作用に必要な残基の変異によって取り除いて行った。 さらに、選択された変異または挿入部位は、挿入するペプチドを容認および拘束し、例えばペプチドアプタマーの産出を制限することができる。その一方、ヒトの研究はヒトのスカフォールドを必要とし、例えばマウスのステフィンＡの使用は、マウスモデルの生態および／または疾患の研究に有利で、同様に他の種または植物のステフィンＡ由来の使用はまたその種に特異的であることができる。したがって、本発明のスカフォールドおよびプレゼンテーション法はいかなる選択された種において実用性を目的とし、ステフィンＡの誘導は使用者の必要性に依存している。
【００１５】
ＤＮＡ配列の変異において、ステフィンＡまたはそのＳＴＭ形状いずれのコドン４のアミノ酸をコード化するか、またはコドン４６から５４を含有したステフィンＡまたはそのＳＴＭ形状のループ１を含むまたは拘束するアミノ酸をコード化し、コドン６７から８４までを含有するステフィンＡまたはそのＳＴＭ形状のループ２を含むまたは制限するアミノ酸をコード化し、それぞれ独立することができ、好まれている。すなわち、ステフィンＡタンパク質の変異体が、３つの異なる個々の領域または部位の１つであり、すなわち位置４またはループ１もしくはループ２に拘束されていることができる。同様に、三重変異形状ＳＴＭにおける変異体はまた３つの特異的且つ独立した個々のサイトのの１つであり、すなわち位置４のループ１またはループ２に拘束された１箇所のいずれかであることができる。ステフィンＡまたはＳＴＭの配列の残余は、不変および以下における配列を含むであろう。
【００１６】
野生型のヒトステフィンＡの配列を以下の配列番号：１に示す
【化１】
【００１７】
三重変異ＳＴＭの配列を以下の変異部位を配列番号：２の様に示し、従ってＳＴＭが野生型ステフィンＡと異なる部分は、太字および下線で示す
【化２】
【００１８】
本明細書の参照における“変異性の変化”は、遺伝子物質における変異性の変化がアミノ酸の付加、欠失、挿入または置換による永久の変異を伝えることができる。
【００１９】
好ましくは、実施形態において単一の変異性の変化は、ステフィンＡにおけるコドン４のグリシンの置換であって、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｉ、Ｇ４Ｌ、Ｇ４Ｍ、Ｇ４Ｆ、Ｇ４Ｐ、Ｇ４Ｎ、Ｇ４Ｖ、Ｇ４Ｑ、Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｗ、Ｇ４Ｙ、Ｇ４Ｒ、Ｇ４Ｈ、Ｇ４Ｋ、Ｇ４ＤおよびＧ４Ｅを含む群から選択される。より好ましくは、置換がＧ４Ｒ、すなわちコドン４のグリシンをアルギニンに置換することである。
【００２０】
好ましくは、実施形態において単一の変異性の変化は、ＳＴＭにおけるコドン４のトリプトファンの置換であって、Ｗ４Ｖ、Ｗ４Ｉ、Ｗ４Ｌ、Ｗ４Ｍ、Ｗ４Ｆ、Ｗ４Ｐ、Ｗ４Ｎ、Ｗ４Ｖ、Ｗ４Ｑ、Ｗ４Ｓ、Ｗ４Ｔ、Ｗ４Ｇ、Ｗ４Ｙ、Ｗ４Ｒ、Ｗ４Ｈ、Ｗ４Ｋ、Ｗ４ＤおよびＷ４Ｅを含む群から選択される。より好ましくは、置換がＷ４Ｒ、すなわちコドン４のグトリプトファンをアルギニンに置換することである。
【００２１】
ステフィンＡのオープンリーディングフレームの５’末端部位のステフィンＡまたはＳＴＭの８アミノ酸をコード化するアミノ末端における変異は、制限エンドヌクレアーゼまたは標的とする組み換え部位の切断部位の導入を認めた。例えば、本明細書においてＤＮＡ配列の変異後、例えば位置４のアルギニン（ＳＴＭの野生型グリシンまたはトリプトファンを置換する）をコード化することによって、ＳＴＭと同様の生物物理学の特徴を有し、驚くほど安定性のあるタンパク質を産出することを示したが、オープンリーディングフレームが、現在、酵素特有の制限サイトを有し、ここで例えば酵素Ａｖｒｌｌに制限はないので、選択肢を提供し、効率的なスカフォールドタンパク質としての役割を果たす。
【００２２】
好ましくは、実施形態において、ステフィンＡ（配列番号３：ＱＶＶＡＧＴＮＹＹ）またはＳＴＭ（配列番号４：ＱＶＤＡＧＴＮＹＹ）のコード化アミノ酸がループ１を含むまたは拘束するもの、ここで、例えばＱＶＬＡＳＴＮＹＹ（配列番号：５）を含む変異であり、変異性の変化はコドン４６から５４を含有するいかなる変異である。驚くべきことに、アミノ酸の配列は、例えば制限なしに、位置４８、４９、および５０におけるロイシン、アラニン、セリンを取り入れ、ＳＴＭと同様の生物物理学の特徴のタンパク質を導きだし、従って効率的なスカフォールドとなるであろう。
【００２３】
好ましくは、ステフィンＡの変異性の変化は４８−ＶＡＧ−５０、そしてＳＴＭにおいては４８−ＬＡＳ−５０であり、結果は４８−ＬＸＳ−５０においてＸはいずれのアミノ酸である。
【００２４】
好ましくは、実施形態において、ステフィンＡ（配列番号６：ＬＫＶＦＫＳＬＰＧＱＮＥＤＬＶＬＴＧ）またはＳＴＭ（配列番号７：ＬＫＶＦＮＧＰＰＧＱＮＥＤＬＶＬＴＧ）のコード化アミノ酸のループ２を含むか、または拘束し、ここで、例えば配列番号８：ＬＫＶＦＮＧＰＰＧＱＮＥＤＬＶＲＳＧを含む変異である、変異性の変化は、コドン６７から８４番目までを含有するいかなる変異である。驚くべきことに、アミノ酸の配列、例えばアルギニンに続くセリン（ステフィンＡまたはＳＴＭのロイシン８２およびトレオニン８３の置換）は安定したタンパク質、例えばＳＴＭの産出を導き、ペプチドアプタマーのプレゼンテーションにおいて優れたスカフォールドとして役割を果たすことを示した。
【００２５】
好ましくは、ステフィンＡの変異性の変化は７１−ＫＳＬ−７３および８２−ＬＴ−８３、ＳＴＭの変異性の変化は７１−ＮＰＧ−７３および８２−ＬＴ−８３であって、その結果は７１−ＮｘＰ−７３および８２−ＲＳ−８３において、Ｘはいかなるアミノ酸でもある。
【００２６】
好ましくは、さらなる本発明の実施形態において、ステフィンＡおよびＳＴＭにおいて８２−ＬＴ−８３であって、その結果は８２−ＸＸ−８３において、Ｘはいかなるアミノ酸、特に好ましい実施形態において、それは８２−ＲＳ−８３のさらなる変異性の変化がある。
【００２７】
好ましくは、変異性の変化は本明細書に述べる前記のいかなる組み合わせと、例えば制限なしに８２−ＸＸ−８３、そして特に好ましい変異は、少なくとも位置７１−７３および／または位置８２−８３における変異性の変化を有することである。
【００２８】
他の形態では、修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質であって、修飾は、単一の変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンをステフィンＡのためにトリプトファンまたはＳＴＭのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、または
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
【００２９】
本発明の態様において、修飾されたステフィンＡは２つの変異を含み、それは例えば、位置４およびループ１の機能を有するコドン４６から５４のいかなる変異を含有するか、位置４の変異およびループ２の機能を有するコドン６７から８４までのいかなるコドンの変化を含有するか、またはループ１の機能を有するコドン４６から５４までのいかなるコドンの変化およびループ２の機能を有するコドン６７から８４までのいかなるコドンの変化を含有することができる。
【００３０】
同様に、ＳＴＭは、位置４の変異およびループ１の機能を有するコドン４６から５４までのいかなる変化を含有するか、位置４の変異およびループ２の機能を有するコドン６７から８４までのいかなる変化を含有するか、ループ１の機能を有するコドン４６から５４の変化およびループ２の機能を有するコドン６７から８４までのいかなる変化を含有するか、またはループ２の機能を有するコドン６７から８４までのいかなる変化を含有することができる。
【００３１】
さらなる本発明の態様において、修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質であって、修飾は、単一の変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンをステフィンＡのためにトリプトファンまたはＳＴＭのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、または
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
【００３２】
従って、本発明の特定の実施形態において、修飾されたステフィンＡおよびＳＴＭは前述した全て三つの変異性の変化を含む。それ故に、修飾されたステフィンＡまたはＳＴＭのスカフォールドタンパク質は、三つの特異的な変異を位置４のループ１およびループ２の双方における変化を含む。
【００３３】
本発明の他の実施形態は修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質に関して、いかなる上記リストの配列の単一または組み合わせであるが、ステフィンＡまたはＳＴＭの７３残基またはステフィンＡまたはＳＴＭの８４残基のいずれにおける終結、そしてこれらの位置における新しいアミノ酸配列の挿入の有無のいずれにおける終結に関する。ＳＴＭのＮＧＰ後にアミノ酸配列を挿入する終止コドンに厳しい選択圧を見出したが、驚くべきことに、この様な機能を失ったタンパク質は共に安定、且つ標的タンパク質の生物学的機能を妨ぐことができる。
【００３４】
本発明は従って、さらに切り詰めたかまたは短縮された修飾されたステフィンＡおよびＳＴＭスカフォールドタンパク質を含み、理想的にはＣ末端から１５または２５残基を短縮し、従ってステフィンＡまたはＳＴＭのいずれの７３または８４残基のいずれにおいて終結することを含有する。さらに本発明は切り詰めたかまたは短縮による修飾されたステフィンＡおよびＳＴＭスカフォールドタンパク質を含み、１５から２５の間の整数まで短縮し、従ってステフィンＡまたはＳＴＭの７３から８４までの間の残基において終結する。
【００３５】
本発明は望ましくは全ての記載の変異からなり、それぞれが、ステフィンＡまたはＳＴＭの変異の一つ以上の位置において、作成したオープンリーディングフレーム内の改変制限酵素認識部位内にオリゴヌクレオチドを挿入することによって、異種ペプチドの導入を許可した。従って、本発明は、
位置４のタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンＡ、ＳＴＭ、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置４６〜５４、特に位置４８／４９／５０におけるタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンＡ、ＳＴＭ、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置６７〜８４、特に位置７１／７２／７３におけるタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンＡ、ＳＴＭ、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置６７〜８４、特に位置８２／８３におけるタンパク質に特異的な異種ペプチドと、他のタンパク質はステフィンＡ、ＳＴＭ、または本明細書に記載の他の変異のいずれか一つに似ている。
位置４および／または位置４８／４９／５０および／または位置７１／７２／７３および／または位置８２／８３における単数または複数のペプチドのいかなる組み合わせ。
ステフィンＡまたはＳＴＭいずれかの最後の２５個のアミノ酸残基または最後の１５個のアミノ酸残基の除去または置換する終止コドンに続いて位置４および／または位置４８／４９／５０および／または位置７１／７２／７３および／または位置８２／８３における単数または複数のペプチドのいかなる組み合わせに基づく、いくつかの新しいスカフォールドを提供する。
【００３６】
本発明のスカフォールドタンパク質の特別な利点および新しい変異は、それらが全てのループ１またはループ２、またはループ１およびループ２の双方、並びにアミノ末端の使用ができる。同時に、これらの変異は少なくとも使用する抗体と同じ大きさの表面積の提示を許す。さらにそれぞれを単一で使用することができるか、またはそれらはペアに基づくか、または他の変異と複数の組み合わせで使用することができる。相互作用の表面性が異なる位置と、異なった位置に挿入されたペプチドの間の異なった相互作用との組み合わせは、スカフォールドの新しい使用を提供することがありえ、例えば実用的な相互作用のため、一つの部位において存在することができないため、現在は他の異なる部位におけるペプチドの組み合わせが既知のペプチドから相互作用しないものに交代し、相互作用する構造を提供する。さらに、これらのいかなる新しい変異はステフィンＡの全長、ＳＴＭの全長、本明細書に開示のタンパク質の全長、またはこれらいずれのタンパク質の変異型より使用することができ、ステフィンＡもしくはＳＴＭのいずれから生成することができる最終残基は、ＳｔｅＡのＬｅｕ７３もしくは本願明細書に記載の新しい変異、ＳＴＭのＰｒｏ７３もしくはその新しい変異、または挿入された異種性ペプチドの最終残基において、ステフィンＡもしくはＳＴＭの最後から１５もしくは２５アミノ酸残基は機能を失っている。
【００３７】
本発明の他の形態は、核酸の分離に関して、本願明細書の上記スカフォールドタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列を含む。
本発明の他の形態は、所望の構造に結合することができる標的ペプチドの同定方法に関して、本明細書の前記修飾されたステフィンＡまたはＳＴＭタンパク質のスカフォールドタンパク質を提供することを含み、標的ペプチドを含む；前記スカフォールドタンパク質と前記所望の構造と接触する方法に関して；スカフォールドおよび所望の構造の間の関係を観測する方法に関してであって、スカフォールドタンパク質と所望の構造の関連は、標的ペプチドを前記構造に結合する標的ペプチドの候補として同定する。
【００３８】
本発明のさらなる態様において、スカフォールドタンパク質は、
【化３】
を含む群から選択される。
【００３９】
本発明のさらなる態様において、本発明のスカフォールドタンパク質を診断、治療、バイオマーカー、バイオマーカーに結合し、およびそれを特異的に検出するための薬剤、合理化された薬物設計の鋳型、創薬のための標的または試薬、抗体の代替物およびリサーチツールを含む群より選ばれる薬剤としての用途を提供する。
【００４０】
本発明のさらなる態様において、本発明のスカフォールドタンパク質の融合タンパク質としての使用を提供する。
【００４１】
本明細書の前記の好ましい特徴は、必要な変更を加え（ｍｕｔａｔｉｓ ｍｕｔａｎｄｉｓ）、本発明の全てのそしてそれぞれの態様において適用した。
【００４２】
本願明細書の以下に記載のおよび上記に示した結果を総合すると、本発明のスカフォールドは複数の箇所における操作の影響を受けやすく、それぞれの変異は単独、または驚くほど良い耐性およびいかなる変異の不安定な効果との組み合わせによって、アミノ末端およびループ２の挿入を拡大した。これらの部位は、従って定期的に使用できず、驚くべきことに複数の挿入物に対しては、ＳＱＭ−ループ１などに対する部位の結合親和性およびペプチドアプタマーの特異性の改善に使用されるようになる耐性がある。さらに、ループ１は外見上、ペプチドの範囲において、ととても小さな問題が存在することができる。これは比較的小さなループであるため、とても驚くべきことである。
【００４３】
本発明の詳細な記載
“欠失”とは、それぞれ一つ以上のアミノ酸残基または核酸の欠乏による、アミノ酸または核酸の配列の変異を参照する。“挿入”または“付加”という用語は、アミノ酸または核酸の配列の変異であって、参照の配列と比較して、分子またはその代表に、それぞれ一つ以上のアミノ酸残基または核酸の付加の結果であり、自然起源の分子において見られるもの等を参照する。“置換”とは一つ以上のアミノ酸または核酸をそれぞれ異なったアミノ酸または核酸と置き換えることを参照する。
【００４４】
ステフィンＡまたはＳＴＭをスカフォールドとして改善するため、選択的な部位および／または複数の部位に異種ペプチドを挿入することができることが好ましい。これにはステフィンＡまたはＳＴＭのいずれかをコード化するオープンリーディングフレームを変えることを必要とするため、オリゴヌクレオチド内に異種ペプチドを挿入することができ、コード化される制限エンドヌークレアーゼ認識部位を導入する。オープンリーディングフレームを変えることは、ほぼ必然的に発現するタンパク質を含むアミノ酸配列を変えることにつながる。タンパク質が最適な機能および安定の組み合わせを形成してることが既知であれば、最もあり得る（最も頻繁的に観測される）タンパク質のアミノ酸配列の変異の結果は、二次構造の欠損であって、従って安定性の欠損である。本発明において、新しいスカフォールドタンパク質は安定性を保持している（実施例および図を参照）。
【００４５】
ＤＮＡ（オープンリーディングフレーム）レベルにおける変異、そしてさらに新しいステフィンＡ／ＳＴＭの変異体のアミノ酸配列の変異によるタンパク質の安定性の減少へと導き出すことを明確にするため、本明細書に記載の全ての変異がＥ． ｃｏｌｉにおいて発現していて、円偏光二色性を用いてそれらのステフィンＡの構成の二次構造を比較した。全てのタンパク質がＥ． ｃｏｌｉにおいて同等に良く発現していて、通常約２８ｍｇ変異タンパク質／細菌用培養液ｍＬ（図１）であることが見出した。タンパク質を均一に近くなるまでＮｉアガロースを用いた親和性クロマトグラフィーで精製し、精製品を用いて０．３ｍｇタンパク質／ｍＬまで希釈した。それぞれ得られたサンプルは円偏光二色性による解析を受けた。これはタンパク質をＵＶ波長に近い範囲に渡ってスキャン（ｓｃａｎｎｎｉｎｇ）し、光の楕円率がタンパク質の二次構造要素（αヘリックスまたはβストランド）等によって影響するからである。タンパク質の二次構造の比率が上昇するにつれ、楕円率の結果も上昇する。効果はタンパク質濃度によって影響するため、タンパク質を解析直前に０．３ｍｇ／ｍＬまで希釈した。効果は解析するタンパク質のペプチド結合数に比例するので、この効果を考慮に入れて、モル楕円率を参照する。データを図３に示す。このデータは二次構造の比率がＳＴＭおよび新しい変異体において保持されていること、ＳＴＭ内の挿入物の存在がその構造に不利に影響しないことを示す。二つの変異体（ＳＵＮおよびＳＱＭ）は他と比較して外見上、構造増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を示すことを意味する。これは二次構造の取得にこれら全てのタンパク質に存在するアミノ末端尾内において属すことができ、これがＳＵＮおよびＳＱＭに共通する少しの変異であるから、位置４のグリシン（ステフィンＡ）またはトリプトファン（ＳＴＭ）をアージニンに置換することで活性化するであろう、そしてこれらはこの変異を有する少ない変異である。
【００４６】
スカフォールド
従来技術で良く知られているように、‘スカフォールド’の用語はそのものの構造を標的ペプチドによって変形することなく、標的ペプチドを溶媒に発現させるタンパク質を参照する。ペプチドを溶媒に発現するにあたって、これは免疫沈降実験を用いて試験することができる。例えば、ペプチドが溶媒に発現する表示はそれを認識できる抗体に対するその有効性から得ることができる。従って、スカフォールドタンパク質の溶媒に対するペプチドの発現性能を試験するため、ペプチドを含むスカフォールドを発現し、ペプチドを認識する抗体をスカフォールドペプチド融合の免疫沈降に使用されるであろう。このタンパク質が免疫沈降または抗体をキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）することができるのであれば、これはペプチドがスカフォールドタンパク質に必要とされるため、溶媒に発現していることを示す。他のまたは別のペプチドが溶媒に発現していることはリン酸化反応の研究から得られる表示である。リン酸化受容体部位を標的ペプチド内に組み込み、その後類似のキナーゼとスカフォールドペプチド融合体がリン酸化反応の許容条件下において接触し、その後溶媒に対するペプチドの発現を検証した。ペプチドのリン酸化反応は溶媒に対して、あるべき発現を示した。形成された標的ペプチドによるスカフォールドタンパク質の抵抗に関して、これを円偏光二色または熱安定性の技術を用いて試験することができる。具体的には、スカフォールドタンパク質その物に標的ペプチドを挿入することのない円偏光二色解析は、標的ペプチドを形成するときの同じスカフォールドタンパク質と実質上同様な円偏光二色特徴である。これはスカフォールドタンパク質内の標的ペプチドの発現がスカフォールドタンパク質を産出するスカフォールドタンパク質の構造を危険にさらさないか、変形させないことの証明を提供する。標的ペプチドによる変形であるこの抵抗を試験する他の方法は、スカフォールドタンパク質と挿入物である標的ペプチドの有無の熱安定性を研究することである。
【００４７】
スカフォールドタンパク質はペプチド挿入物を受容することができるべきである。ペプチド挿入物は、好ましくは３６アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下である。好ましくは、標的ペプチド挿入物が１２アミノ酸残基以下である。
【００４８】
スカフォールドタンパク質は知られた構造でなければならない。‘知られた構造’とは、結晶性構造または溶液構造（ＮＭＲ構造）が既知でなければならないことを意味する。
【００４９】
本発明にかかるスカフォールドタンパク質の好ましい特徴
好ましくは、スカフォールドタンパク質が標的ペプチドを抑制していることである。スカフォールドタンパク質における抑制効果の存在は、標的ペプチドがスカフォールドタンパク質内のときの標的ペプチドの実態結合の親和力とペプチドがスカフォールドタンパク質内でないときの親和力を比較することによって証明することができる。これら二つの親和力の違いは、スカフォールドタンパク質がペプチドを抑制し、特定の三次元構造を仮定していることを示す。好ましくは、スカフォールドタンパク質はペプチドを抑制し、スカフォールドタンパク質の状況において発現しているとき、それが結合親和力の上昇を示していることである。言い換えれば、結合していないペプチドの結合と比較したとき、好ましくはスカフォールドタンパク質が結合のエントロピー消費を減少し、測定した親和性を上昇する。
【００５０】
いくつかの実施形態において、抑制は標的ペプチドに対する単一のＮ末端またはＣ末端の融合によって提供される。
【００５１】
好ましくは、スカフォールドタンパク質が生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）において標的ペプチドの向上した安定性を提供することである。この効果は、標的ペプチドの発現をスカフォールドタンパク質と標的ペプチドその物の発現の関係を比較することによって実証することができる。好ましくは、標的ペプチドがスカフォールドタンパク質の関係において上昇した安定性を示すことである。
【００５２】
スカフォールドタンパク質が、好ましくは生物学的に中性であることである。‘生物学的に中性’とは他の既知のタンパク質との相互作用が取り除かれたことを意味する。さらに、タンパク質が保持しているいかなるシグナル伝達能力も好ましくは除去することである。従って、本発明にかかる好ましいスカフォールドタンパク質はＳＴＭスカフォールドタンパク質である。
【００５３】
生物学的に中性とは、それがスカフォールドタンパク質の大半の従来技術に存在しないことから、本発明の利点である。例えば、チオレドキシンＡは、細胞内の自然な酸化還元経路の優性阻害として働くことである。さらに、それはＰ５３を阻害することが知られていて、ＢＣＬ６シグナル経路を阻害することが知られている。有利に、本発明のスカフォールドタンパク質は自然発生のシグナル経路と妨げない。
【００５４】
スカフォールドタンパク質は小さい場合である。“小さい”とは２５ｋＤａ以下を意味し、好ましくは１３ｋＤａ以下である。最も好ましくは、スカフォールドタンパク質が１１０アミノ酸以下である（標的ペプチド挿入物を除いて）。
【００５５】
好ましくは、本発明にかかるスカフォールドタンパク質が構造的に安定していることである。‘構造的に安定’とは、構造変化が起きないことを意味する。好ましくは、スカフォールドタンパク質がヒンジ部位を有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質がＰＨドメインを有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質がＳＨ３ドメインを有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質がＳＨ２ドメインを有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質が’ＷＷドメインを有さないことである。好ましくはスカフォールドタンパク質が’ＷＤドメインを有さないことである。好ましくはスカフォールドタンパク質がＨＥＡＴドメインを有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質がプロリンに富むドメインを有さないことである。好ましくは、スカフォールドたんぱく質が細胞内において翻訳後修飾を有さないことである。好ましくは、スカフォールドタンパク質が構造変化を促進する他の既知のドメインを有さないことである。
【００５６】
本発明にかかるスカフォールドタンパク質は、好ましくはタンパク質間相互作用ドメインを有さないことである。タンパク質は、これらが変異し、機能しない状態にある場合、タンパク質間相互作用ドメインを有さないと考えることができる。
【００５７】
好ましくは、本発明にかかるスカフォールドタンパク質が翻訳後修飾を有さないことである。従って、好ましくは本発明にかかるスカフォールドタンパク質が糖鎖付加部位を有さないことである。これは従来技術のスカフォールドタンパク質、例えばジストロフィンに対して、翻訳後修飾が相互作用を妨げるか、それら自身の疑似相互作用を作り出すことができるため、有利である。
【００５８】
上記のように、スカフォールドタンパク質はペプチド挿入物によって変形されるべきでない。この基準によって、緑色蛍光タンパク質が、少なくとも三分の一の挿入した標的ペプチドが緑色の蛍光を滅ぼすため、スカフォールドタンパク質としては考えられない。これは標的ペプチドインサートがタンパク質の構造を変形することを明らかにした。従って、スカフォールドタンパク質が好ましくは標的ペプチドの挿入によって変形されてるべきでないので、それは本発明にかかるスカフォールドタンパク質ではない。
【００５９】
チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）は従来技術のタンパク質である。ＴｒｘＡは小さく、安定性がある。しかしながら、ＴｒｘＡ内における標的ペプチドの挿入はシステインの二残基の間に起こる。発明にかかるスカフォールドタンパク質は、ＴｒｘＡ内のシステイン残基が、スカフォールドタンパク質の構造を変えることができ、示した標的ペプチドの構造に影響することができる、可逆のジスルフィド結合を経ることができるため、有利にこの配列を避ける。従って、好ましくは標的ペプチドの挿入部位は、スカフォールドタンパク質のシステインの二残基の間ではない。
設計の検討
【００６０】
スカフォールドタンパク質は、好ましくは以下の一つ以上の特徴を有する：
１）既知の構造によって、ペプチド挿入部位または置換部位のインフォームドチョイスを考慮していることと、
２）広範囲のペプチドの折り畳みを制限するために十分に安定であることと、
３）生物物理学的に中性であって、例えば表現型に寄与する細胞内タンパク質の相互作用を欠失していることと、
４）原核性および真核性の環境の双方において、同様に、好ましくは完全に同じように、折り畳むことができ、１つの方法から得たデータが他の実験の実施を満たすことができる。
【００６１】
本発明は、ペプチドアプタマー技術の要件に適したスカフォールドを提供する。発明のスカフォールドタンパク質は、好ましくは全ての上記基準を有している：親（ｐａｒｅｎｔ）ステフィンＡの構造が既知である；操作されたスカフォールドは安定性があり、少なくとも一つのペプチド挿入に、その生物物理学的な安定性を欠失することなく耐性がある；広範囲のペプチドにおける機能上の相互作用を示すことができる；そして全ての既知の生物学的相互作用が操作されているわけではない。
さらなる応用
【００６２】
当業者はマイクロアレイでのペプチドアプタマーの使用は、これらのペプチドアプタマーが本発明にかかるスカフォールドタンパク質に存在しているとき、特に好都合であると理解するであろう。従来技術におけるマイクロアレイ技術は抗体に大きく依存している。しかしながら、抗体はアレイに結合しているとき、特異性を欠失することができる。さらにマイクロアレイに使用される組み換えタンパク質は、タンパク質の存在の情報を提供することができるが、何が結合しているかについての情報は提供することができない。一方、本発明にかかるスカフォールドタンパク質において、ペプチドアプタマーを使用したディスプレイは、アレイを詮索したとき、有利に比較的たくさんの情報を提供することができる。例えば、結合パートナーの観測により、アプタマーのディスプレイにスカフォールドタンパク質を使用したとき、背景情報（ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ ｉｎｆｏｒｍａｉｔｏｎ）が有利的に導き出される。この利点は繊細さの欠損および情報に基づくライブラリーとの間の違いにおいて特徴付けられる。従って、本発明の他の態様において、これら新しいスカフォールドタンパク質の使用はマイクロアレイ上にペプチドをディスプレイすることに関する。
【００６３】
好ましくは、本発明にかかるスカフォールドタンパク質はステフィンＡの配列に基づくことである。‘ステフィンＡの配列に基づく’とは、スカフォールドタンパク質が、ステフィンＡの９８アミノ酸残基の少なくとも３０を有するべきであり、好ましくはステフィンＡのアミノ酸残基に対して２５％、好ましくはステフィンＡのアミノ酸配列に対して３０％、４０％、５０％、６０％または７０％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくはステフィンＡの配列に対して９５％またはそれ以上である。最も好ましいスカフォールドタンパク質はステフィンＡ、ＳＴＭ、または本明細書に開示の新しい変異体の一つを有し、本明細書前記の一つ以上の変異性の変化を含む。
【００６４】
ペプチドアプタマーの特性である生体内のタンパク質間相互作用の分離において、新しい薬物の迅速な識別の主用として許容することができる。さらに、小さな薬物分子対象の使用は、タンパク質間相互作用の分離に本発明で有利に促進される。
【００６５】
翻訳後修飾部位、リン酸化部位などを含むペプチド挿入物の使用は、有利に使用することができる。これは、標的ペプチドのリン酸化状態によって変異する相互作用解離に有益である。さらに、それは候補のペプチドアプタマーに結合したリン酸化反応に依存する方法の識別を考慮した。
【００６６】
いくつかの実施形態において、それはジスルフィド結合を標的ペプチド挿入物のいずれかの側面に導入しることができ、例えばシステイン残基をそれぞれの標的ペプチド挿入物の側面に操作することが好ましい。これはスカフォールドが排他的に一条件において使用されているとき、実用的であることができる。この関連において、ファミリーＩＩシスタチンはジスルフィド結合を使用し、一つの好ましい挿入部位に一致する二次構造の要因を形成することを意味する。本発明の背景において、これは例えば、スカフォールドポリペプチドのＣ末端、または標的ペプチド内、例えば標的ペプチドのＣ末端エンドに単一のシステインを付加し、二番目の場所、例えばスカフォールドのＮ末端または標的ペプチドのＮ末端エンドに二つ目のシステイン残基挿入の付加し、従って二つの間に架橋を可能にすることで、達成することができる。 しかしながら、それはペプチドの共有結合性の制限をこの様に回避することが好ましい。従って、好ましい本発明のスカフォールドにおいて、好ましくは標的ペプチドはシステイン残基に対して側面に位置しないことである。
【００６７】
全体的に、異なったスカフォールドがそれを発現するペプチドに対して偏見を押し付けることができ、標的ペプチドの研究は有利に一つ以上のスカフォールドにおけるペプチドおよび／またはライブラリーと関与し、成功率を最大にすると理解されている。
【００６８】
本発明のスカフォールドは研究者に、細胞内の環境に対する生体外およびその逆の観測に伸ばし、そして生体外における識別または細胞内における折り畳みパターンまたはジスルフィド結合の酸化状態に関する問題もなく使用することができるツールの創作として考慮させることを可能とした。
【００６９】
本発明のスカフォールドを基にしたペプチドアプタマーは、診断の要素、予後の試験、またはヒトの疾患の治療のための主な組成物の形成の基としても使用することができ、薬剤標的を有効にすることができる。本発明のスカフォールドは、有利に全長のヒトタンパク質に基づき、生物学的な治療および／または遺伝子治療において実用的であることができる。
標的ペプチド
【００７０】
本明細書に使用される‘標的ペプチド’の用語は所望のペプチドを参照する。標的ペプチドは好ましくは、異種性ペプチドである。異種性とは通常の状況から除去したペプチドを意味し、好ましくはスカフォールドタンパク質の産出、保持、またはディスプレイの配列において通常発見されない配列を有するペプチドである。ペプチドがスカフォールドタンパク質の配列の他の場所に発生する配列を有する場合、その結果‘異種性’であるためには、配列が背景から外れていることである。すなわちその自然発生のスカフォールドタンパク質ポリペプチド内の位置（アドレス）を占領していないことである。この背景において“位置”とは直鎖アミノ酸内の位置であって、他のアミノ酸残基に対して三次元空間の位置を意味する。標的ペプチドは人工的で、例えばスカフォールドタンパク質内に組み込んだペプチドのライブラリー構築を生み出すことであることができる。これらの実施形態において、人工的なペプチドは本発明の目的のために‘異種性’であることが考えられる。
【００７１】
ペプチドアプタマーは細胞内において拘束されたペプチドで、タンパク質機能の研究に用いられるスカフォールドタンパク質を示す。いくつかにおいては、タンパク質間相互作用を分離することができ、いくつかにおいては細胞内のタンパク質解析のための分子ツールキットの創作を可能とする認識モジュールを構成することができる。
【００７２】
特異的に結合することができ、特定のタンパク質が高い親和性を備える小分子をデザインまたは識別できることは、タンパク質マイクロアレイの発展、生細胞の背景におけるタンパク質の解析、および薬剤標的候補の有効性を含む多数の実験において律速段階である。自然界において、タンパク質間相互作用は折り畳まれたタンパク質の狭い表面によって仲介することができる。これはスカフォールドと呼ばれるタンパク質認識モジュールとして安定性のあるタンパク質の背景において示される小ペプチド表面の使用へと導いた。このような試薬は、本明細書においてペプチドアプタマーと呼び、システムの範囲で、生体タンパク質活性の分離に使用される。
【００７３】
ペプチドアプタマーは、細胞内において、結合していないペプチドと比較して、より簡単に輸送され、より安定性があり、そしてその制限された折り畳みは結合の低エントロピー消費、それ故に標的タンパク質に対して高い親和性という結果になる。ペプチドアプタマーのタンパク質操作はそれらが分子ツールキットのデザインにおける認識機能を提供することを可能とするが、しかしこの潜在力は完全には気付かれていない。ペプチドアプタマーのその標的との親和性は１０”８から５×１０”９ＭまでとＩＱ１０７から１０”１１Ｍまでの範囲における抗体／標的との相互作用とを比較した。複数の挿入物を使用することによって、相互作用の表面積を増加し、ペプチドアプタマーを一致することができると予期するか、可能性として抗体の結合親和性が有利に超えるかである。それにも関わらず、ペプチドアプタマーは明らかに生体内のタンパク質間相互作用を分離する。ペプチドアプタマースクリーンをペプチドまたは抗体ライブラリーのファージディスプレイ法スクリーン（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｃｒｅｅｎ）から区別し、実質的にミスフォールドの（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）原核生物において発現しているタンパク質に対して行う、酵母もしくは哺乳類細胞におけるペプチドアプタマースクリーンを実施した。
【００７４】
比較的広範囲な多数の他のタンパク質が使用されているが、使用するスカフォールドは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）タンパク質チオレドキシン（ＴｒｘＡ）である。この技術の成功はスカフォールドのロバストネスに定まるが、ペプチドの三分の一が不安定なＧＦＰであることができる一方、多数のＴｒｘＡを基にしたペプチドアプタマーは培養されたヒト細胞において不安定な発現をしていて、これはスカフォールドがより十分に厳密でない発現をしていて、それ自体が部分的にアンフォールドしていないペプチドを示唆する。あるスカフォールドの背景から取り出してきた、他の頻繁にそれらの標的タンパク質と相互作用能力を欠失する部位のペプチドが、適したスカフォールドが使用されないと失敗する既知の標的との相互作用に制限されたスクリーンである可能性として挙げる。最後に、本ペプチドとして使用されるスカフォールドの生物学的活性は従来技術において厳密に特徴付けられていないため、ペプチドアプタマーが発現しているとき、いかなる表現型が観測されるかの問題において、少なくとも一部はスカフォールドの効果のためであって、挿入されたペプチドではない。従って、制限されたペプチドのプレゼンテーションにおいて、ロバスト、多用途、生物学的に中性なスカフォールドを産出した。実験系の範囲において安定した発現である一方、機能的に広範囲の標的と相互作用することができるペプチドを示すタンパク質を得た。このようなスカフォールドは、実質的にペプチドアプタマー技術をそのロバストネスを上昇することによって改善する。さらに、複数のスカフォールドのライブラリーを使用して、それぞれの標的に対して、同時にスクリーンし、有効なスカフォールドのレパートリーを広げることによって、本発明は有利に多数の標的タンパク質に対するスクリーンにおいて、正しいものが得られる可能性を高めた。
ステフィンＡ
【００７５】
ステフィンＡは、リソソームペプチダーゼのパパインファミリーであるシステインカテプシンのタンパク質阻害剤のシスタチンファミリーの発起メンバーである。シスタチンファミリーのステフィン下位群は比較的小さな（約１００アミノ酸）単一ドメインタンパク質である。これらは既知の翻訳後修飾を受けず、ジスルフィド結合を欠失していることから、これらが細胞外および細胞内環境の幅広い範囲において、完全に同じ様に折り畳むことができることを示唆する。ＳｔｅＡそのものは単量体、短鎖、単一ドメインの９８アミノ酸のタンパク質である。ＳｔｅＡの構造を解明し、ＳｔｅＡからＳＴＭスカフォールドへの合理的な変異を促進した。唯一既知のシスタチンの生物学的活性は、カテプシン活性の阻害であって、操作したタンパク質の残部生物学的活性を徹底的に試験することを可能とする。従って、本来のＳｔｅＡの操作したタンパク質の開示は、ペプチドアプタマースカフォールドとして実用的な変異を産出することができる。従来技術のペプチドアプタマーは、生物活性を識別する難しさから細胞を基にした、少なくとも部分的には最適以下の様々なスカフォールドの存在による性能が原因の分析において妨害された。本発明は、生体外および生体内におけるタンパク質間相互作用の研究を求める者に有用であり、役立つであろう実用的なスカフォールドを提供する。
ステフィンＡ配列
【００７６】
ステフィンＡを“基にした”スカフォールドは、ステフィンＡ由来の配列を有する。好ましくは、ステフィンＡ由来の配列はステフィンＡ野生型配列を含み、好ましくは本願明細書に記載の一つ以上の修飾（変異）を含む。当業者には明白な、比較的重要でない修飾が、本発明から外れることなくスカフォールド配列に作られた。特に、本発明はアミノ酸配列および／または核酸配列において、本明細書の対応配列と少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％または６０％同一性を有し、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％同一、またはそれ以上に関する、しかしながらそれぞれの場合、配列変異は‘重要でない’と考えられ、それらがスカフォールドの特性に悪影響を与えず、標的ペプチドを溶媒に示し、生物学的機能を、野生型ステフィンＡを有する等、復元または作り出さないが、本発明の変異性の変化を取り除いた。
【００７７】
さらに、比較的重要でない修飾は、また本明細書に開示のステフィンＡまたはステフィンＡ由来の配列への小さな付加または欠失を含み、例えばステフィンＡ由来のポリペプチドに１０アミノ酸以下の付加または欠失である。従って、本発明は本明細書に開示のステフィンＡまたはＳＴＭの配列に対して、４０アミノ酸以下、好ましくは３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、好ましくは１５アミノ酸以下、さらに好ましくは１０アミノ酸以下、好ましくは９アミノ酸以下、好ましくは８アミノ酸以下、好ましくは７アミノ酸以下、好ましくは６アミノ酸以下、好ましくは５アミノ酸以下、好ましくは４アミノ酸以下、好ましくは３アミノ酸以下、好ましくは２アミノ酸以下、好ましくは１アミノ酸以下の総付加または総欠失を有するアミノ酸配列に関する。総付加または総欠失は重要な要素であるから、９以下の違いは９つのアミノ酸の欠失を意味し、３つの欠失はそれぞれ３つのアミノ酸、３つのアミノ酸の２つの付加、３つのアミノ酸の１つの欠失などである。本発明はまた対応する核酸変異に関する。それぞれの場合、それがスカフォールドの標的ペプチドから溶媒に示す特徴に悪影響を与えず、生物学的機能、例えば野生ステフィンＡの有し、復元または作り出さないと仮定すると、配列変異は“重要でない”修飾と考えられる。
ステフィンＡおよびＳＴＭの変異
【００７８】
変異部位の討論の背景において、“近隣”とは７アミノ酸以内、好ましくは５アミノ酸内、好ましくは３アミノ酸内、好ましくは２アミノ酸内、好ましくは所定のアミノ酸、または２つの隣接したアミノ酸の１つである。
【００７９】
挿入物の背景において、核酸レベルの制限酵素部位、好ましくは特有の制限酵素部位を今後の挿入物の促進に導入することが好ましい。核酸の組み換え技術におけるこれらの内容および一般的な知識は、当業者に関連する制限酵素部位を導入する一方、スカフォールドの重要な特徴を維持している。“特有”とはスカフォールドタンパク質のコード化される配列が特有であることを意味する。非特有部位は使用されるかもしれないが、特有部位は挿入物の容易さ、構造の操作によって好ましい。２つ以上の部位が使用される場合、例えばステフィンＡ１のループ１のいかなるコドン６７−８４の除去および置換、好ましくはそれぞれ２つ以上の部位が特有である。しかしながら、二つ以上の部位が同一である場合、それは有利に除去および置換の工程を単純にすることができ、例えば一回の制限酵素処理のみ伴う。これらの選択肢は本発明の当業者の能力内の範囲において十分である。好ましい実施形態において、二つの同一部位はループの除去および置換を導入した。好ましく変異性の変化をコード化する配列に使用される制限酵素部位は異なり、コード化される配列内のこれらそれぞれ４箇所の挿入または修飾が容易な操作のため、異なった制限酵素を使用して作られた。
位置４の変異
【００８０】
‘位置４の変異’という用語は本明細書において、好ましくはステフィンＡのＧ４部位、ＳＴＭのＷ４部位またはその付近で、好ましくはこの部位として使用され、変異はＳｔｅＡまたはＳＴＭのアミノ末端のアミノ酸残基の付加、挿入または置換を参照する。好ましくは、この様な変異はＰｒｏ３付近、好ましくはＧ４（ステフィンＡ）またはＷ４（ＳＴＭ）付近である。好ましくは、このような変異がヒトステフィンＡもしくはＳＴＭのＰｒｏ３の付近もしくは好ましくはこの部位である。最も好ましいのは残基４とＲの置換である。
【００８１】
好ましい実施形態において、位置４とは本明細書の上記のループ１および／または２の他の変異性の変化に加えて、第一、第二または第三の挿入部位として使用する。Ｒは正電荷のアミノ酸であって、従ってαヘリックスループの認識部位を覆うことを防ぐため、ＲよりはむしろＧの存在が認識（標的結合）表面への近接性を増加する。さらに変異は単一のときアプタマーを不安定にしたが、アプタマーが一度標的に結合すると安定する。
コドン４６−５４のいずれにおける変異
【００８２】
‘コドン４６−５４のいずれにおける変異’という用語は本明細書において周囲の変異、ＳｔｅＡのＶＡＧ部位またはＳＴＭのＤＡＧ部位の周り、好ましくはこの付近または好ましくはこの部位である。ＶＡＧ部位はＱＶＶＡＧ部位の４８−５０残基、ヒトＳｔｅＡの４６−５０残基である。ＤＡＧ部位はＱＶＤＡＧ部位の４８−５０残基、ＳＴＭの４６−５０残基である。
【００８３】
好ましくはこの付加、挿入または置換、好ましくはＶＡＧ／ＤＡＧ部位付近または好ましくはこの部位を参照する。好ましくはこのＶＡＧ／ＤＡＧ部位の付加または挿入を参照する。
【００８４】
好ましい実施形態において、４６−５４番目の部位は本明細書の上記の変異性の変化と組み合わせた第一、第二または第三の挿入部位として使用した。
【００８５】
ある好ましい実施形態において、ＶＡＧ／ＤＡＧ部位の変異はＬＡＳである。
【００８６】
実験はＤ４８ＬおよびＧ５０Ｓの修飾が細菌系の発現増加を導くことを示した。
コドン６７−５４のいずれにおける変化
【００８７】
‘コドン６７−５４のいずれにおける変化’という用語は本明細書において周囲の変化、ＳｔｅＡのＶＡＧ部位またはＳＴＭのＤＡＧ部位の周り、好ましくはこの付近または好ましくはこの部位である。
【００８８】
用語はこの部位の付加、挿入または置換を参照することができる。
【００８９】
一実施形態において、変異はＬ７３とＬ８０、Ｐ７３とＬ８０の間の全ループといずれのペプチド配列、好ましくは異なる標的ペプチド配列の範囲（好ましくは１ペプチド配列毎ステフィンスカフォールド分子）、すなわちライブラリーを含むことができる。
【００９０】
核酸レベルにおいて、好ましい変異はこれらのループ内の挿入で、制限酵素部位をもたらし、より好ましくはこのループをコード化される配列の置換の二箇所の制限酵素部位である。特に好ましいのは、制限酵素部位がＲｓｒＩＩ制限酵素部位である。
【００９１】
好ましい実施形態において、ループ２部位は第一、第二または第三の挿入部位と本明細書の上記の変異性の変化との組み合わせとして使用される。
【００９２】
本発明にかかる二つの新しいスカフォールドにおいて、変異性の変化はＮＧＰ（ＳＱＭはＬ８２ＲとＴ８３Ｓを有し、そしてＳＱＴはＥ７８ＡとＬ８０Ｒを有する）で操作し、親タンパク質とかなり異なるため、最も予期していなかったが、それぞれＥ．ｃｏｌｉにおいて高発現を示す。ＳＱＭおよびＳＱＴは双方とも円偏光二色性に示すように、親タンパク質とかなり異なるため、最も予期していなかったが、安定した構造を有する。
【００９３】
これらのアプタマー内に挿入したペプチドは抗体結合実験で示すように溶媒から得られ、有利にこれらのタンパク質は固体表面に付着したとき、これらの結合および機能を保つ。さらにこれらは三つの挿入物の位置による表面積の増加を有し、それ故に高い結合親和性を生み出し、実験はＳＱＭがペプチド挿入物の特有のセットと共に正しく折り畳み、結合部位を遮蔽することができるダイマーを形成しないことを示し、これはＳＴＭと対象であり、従って従来技術と比較して重要な利点を提供する。さらに本発明のペプチドアプタマーライブラリーのスカフォールドは、例えばＳＱＭを用いて作成することができ、従ってアプタマーはヒト組織内の標的と複数の結合表面によって相互作用する潜在力を有することを確認できる。
挿入物
【００９４】
好ましくは、挿入物がヒトステフィンＡのＬ７３−Ｌ８０ループまたはＳＴＭのＰ７３−Ｌ８０ループ付近または好ましくはその部位、より好ましくはアニーリング配列にコード化されている二残基ＬｅｕＡｌａと共にで、従ってスカフォールドタンパク質は基のステフィンＡより二残基長い。
変異の組み合わせ
【００９５】
好ましくは、本発明にかかるスカフォールドタンパク質はステフィンＡまたはＳＴＭを基にしていて、少なくとも一つの上記変異を含む。好ましくは、スカフォールドタンパク質は、少なくとも二つまたは三つ全ての上記変異を含む。好ましくは、本発明にかかるスカフォールドタンパク質は三つ全ての上記変異と残部のタンパク質ステフィンＡ、ＳＴＭまたは他の変異の一つのいずれかと共通点を有する。さらにもしくは代わりに、末端の変異は位置７２／７３または８２／８３で、ステフィンＡまたはＳＴＭのいずれかの最後の２５または最後の１５アミノ酸の除去または置換は終止コドンが続く。標的ペプチドを有利に三つのいずれかの好ましい変異部位に挿入することができる。より高い実施形態において、ステフィンＡ／ＳＴＭを基にしたスカフォールドタンパク質は総合で三面の表面を使用することを考慮に入れた。これらの表面は位置４のループ１およびループ２（図２）と定義する。
固体相およびマイクロアレイ
【００９６】
上記のように、本発明はマイクロアレイの応用を見出した。固体相の実施形態において、マイクロアレイ実施形態などは、本発明のスカフォールドタンパク質が、好ましくは解析のため会合または固体相の基質に付着させ、促進するために操作した。好ましくは、これは金のコーティングに留めるか、ビオチンとの関連である。スカフォールドの操作のために、金のコーティングに留めるか、好ましくは一つ以上のＣｙｓ残基をスカフォールドタンパク質のＣまたはＮ末端に導入した。スカフォールド固定の操作のため、ビオチンで留めて、好ましくは８アミノ酸のビオチン結合ドメイン（“ｓｔｒｅｐタグ”）の 一つ以上のコピーを前記スカフォールド内に導入した。固定はこれらの一つ以上またはいずれか他の適したものであることができる。好ましくは、本発明のスカフォールドタンパク質が固定化されたものである。好ましくは本発明のスカフォールドタンパク質を固定して操作することである。好ましくは、本発明にかかる相互作用試験を固定されたスカフォールドタンパク質を使用して実施することである。
本発明のさらなる利点
【００９７】
ステフィンＡを基にしたスカフォールドタンパク質は、これらを生体内において使用するものであるから、ペプチドの使用に優れていることである。さらに組み換え系の使用において、これらは合成ペプチドの研究より安いものである。さらに、ライブラリー構築は、同じ理由から合成ライブラリーの使用より安いものであり、さらにこれらは核酸の操作に用いて合理的なデザインをすることができるからである。これは複雑なペプチド合成の化学に頼ることを減少する。
【００９８】
ステフィンＡを基にしたスカフォールドタンパク質は、これらが細胞内部である一方、ファージディスプレイ法は細胞外相互作用に頼っているので、従来技術、例えばファージディスプレイ法スクリーンより優れている。さらに本発明のスカフォールドタンパク質は、組み換え標的よりはむしろ自然の標的に使用することができる。これは生体内における正確なリン酸化、グリコシレート、または他の翻訳語修飾されるが、おそらく生体外における産出は正確に形成されないであろう翻訳後修飾タンパク質の観測を許容し、さらなる利点を有する。
【００９９】
本発明にかかるスカフォールドタンパク質のさらなる利点は、これらが自然に起こるスプライス変異および生体内における解析のためにそれぞれ一つずつの産出、それらの配列、または他の区画化を有さずに産出される翻訳後修飾変異のスペクトルの疑問を許容する。
【０１００】
本発明のさらなる応用は、スカフォールドタンパク質を基としたステフィンＡとの相互作用の出力としてのマイクロカンチレバーの使用である。さらに本発明のスカフォールドタンパク質は、特に電気化学および／または薄いフィルムのトランジスタ出力の使用に適している。
【０１０１】
本発明のスカフォールドのさらなる利点は、本発明のペプチドアプタマーが抗体の代用品であることができ、結果はそれらがより良く実施できることを示し、例えばＣＤＫ２はペプチドアプタマーの使用において抗体より迅速に検出された。従って、抗体の使用よりはむしろペプチドアプタマーの使用は、より少数の動物が分子プローブの生産に必要とされ、科学の研究で重大な利点を提供する。
【０１０２】
本発明を、現在参照の以下の図に示した例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】Ｅ． ｃｏｌｉにおけるＳＴＭの発現および溶解性を示す；図１ＡはＳＵＮ、ＳＵＭおよびＳＴＭ変異体を示し、図１ＢはＳＵＣおよびＳＤＭ変異体を示し、そして図１ＣはＳＱＭ変異体を示す。
【図２】ＮＭＲ溶液構造におけるＳＴＭ変異において、ループ１のコドン４、コドン４８−５０、ループ２のコドン６７−８４、そしてコドン９１−９２をＣｎ３ＤソフトウェアおよびＰＤＢ座標ＩＤＶＤ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． １９９５ ‘Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｆｉｎ Ａ．’Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ２４６ ｐｐ３３１−４３）を用いて作成した。変異部位は修飾されたステフィンＡタンパク質の産出を示す。
【図３】ＳＤＭ、ＳＵＣ、ＡＵＭ、ＳＵＮ、ＳＱＭ、ＳＴＭ Ｗ４ＲおよびＳＴＭ参照プロットの円偏光二色性（ＣＤ）分光法解析において、左回り円偏光に対する右回り円偏光の吸収の違いを測定し、構造非対称から生じた、ＳＴＭおよび新しい変異に保持された二次構造の比率を説明する。
【図４】長期保管に続くＳＴＭ、ＳＤＭ、ＳＱＭ、ＳＵＭ、ＳＵＮ、ＳＵＣ、ｐｅｐ６Ｍ、ｐｅｐ９Ｍおよびｐｅｐ１０Ｍの円偏光二色性（ＣＤ）分光法解析を示す。
【図５】独立したＳＴＭ、ＳＤＭ、ＳＱＭ、ＳＵＭ、ＳＵＮ、ＳＵＣ、ｐｅｐ６Ｍ、ｐｅｐ９Ｍおよびｐｅｐ１０Ｍの調製の円偏光二色性（ＣＤ）分光法解析を示す。
【図６】ＳＱＴおよびエピトープ標識したその変異体：ＳＱＴ−ＡＵＩ（１）、ＳＱＴ−ＡＵＩ（２）、ＳＱＴ−ＨＡ（２）、ＳＱＴ−ｍｙｃ（１）、ＳＱＴ−ｍｙｃ（２）、ＳＱＴ−ＡＵＩ（１）、ＡＵＩ（２）、ＳＱＴ ＡＵＩ（１）、ＨＡ（２）およびＳＱＴ ＡＵＩ（１）、ｍｙｃ（２）の円偏光二色性（ＣＤ）分光法解析を示す。
【図７】エピトープ標識したＳＱＭ変異体：ＳＱＭ−ｍｙｃ（１）、ＳＱＭ−ＡＵＩ（２）、ＳＱＭ−ｍｙｃ（ｎ）ＡＵＩ（１）、ＳＱＭ−ＡＵＩ（１）、ＨＡ（２）、ＳＱＭ−ｍｙｃ（ｎ）、ＡＵＩ（１）、ＨＡ（２）、ＳＱＭ−ＨＡ（ｎ末端）、ＳＱＭ−ｍｙｃ（２）、ＳＱＭ（２１ランダムループ１）、ＳＱＭ−ＡＵＩ（１）、ＳＱＭ（ＡＵＩｘ２、ループ１）、ＳＱＭ−ＨＡ（ｎ）、ＡＵＩ（１）、ＳＱＭ−ＨＡ（ｎ）、ｍｙｃ（２）、ＳＱＭ−ＡＵＩ（１）、ｍｙｃ（２）、ＳＱＭ−ＨＡｘ２（ｎ）、ＡＵＩ（１）、ｍｙｃ（２）、ＳＱＭ−ＨＡ（ｎ）、ＡＵＩ（１）、ｍｙｃ（２）およびｐｅｐ２２（Ｔｒｘ）を指定するペプチドアプタマーの円偏光二色性（ＣＤ）分光法解析を示す。
【図８Ａ】図８ＡはＡＵＩペプチドの抗ＡＵＩ抗体による免疫沈降を示す。
【図８Ｂ】図８ＢはＳＱＭ−ｍｙｃ（ループ１）の免疫沈降を示す。
【図８Ｃ】図８ＣはＳＱＴ−ＨＡ（ループ２）の免疫沈降を示す。
【図９】マイクロアレイ実験において、異なった部位でのペプチドアプタマーと異なるエピトープの結果を示す。
【図１０Ａ】抗体／エピトープ相互作用をＳＱＭスカフォールドの背景における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を示す。図１０ＡはｐＨ７．３における３３ｎｍのＡｎｔｉ−Ｍｙｃ（赤）、Ａｎｔｉ−ＨＡ（青）、およびＡｎｔｉ−Ａｕ１（緑）の溶液および化学吸着ＳＱＭ（Ｎｔ Ｈａ、Ｌ１ Ａｕ１、Ｌ２ Ｍｙｃ）単分子層（黒）に固定した１０ｍＭリン酸緩衝液の比較を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは異なった濃度のＡｎｔｉ−Ｍｙｃが飽和速度関数Ｍ＝（Ｃ×Ｂｍａｘ）／（Ｃ＋Ｋ）に一致し、平衡定数５０×１０−９Ｍを生じるＳＰＲ反応を示す。
【図１１】ループ１（上）、ループ２（中）またはアミノ酸末端（下）に挿入した８６４ランダムペプチドアプタマーを含むマイクロアレイの結果である。
【図１２】ＳＱＭ（ＳＱＭ−ｐｅｐ６）およびＳＱＴ（ＳＱＴ−ｐｅｐ１０ｍ）におけるぺプチドアプタマーの使用で、ヒト（ＨｅＬａ）細胞の二通りのライセートにおける内因性ｃｄｋ２発現を検出した。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
図２を参照とし、ステフィンＡの三次元構造および本発明の新しいスカフォールドタンパク質の産出のため、ステフィンＡ内の三箇所に変異を作ったことを示す。これらの部位は：ステフィンＡについてはＧ４またはＳＴＭについてはＷ４の部位；ループ１を拘束するコドン４６から５４までを含むいずれのコドン；特にコドン４８−５０；いずれのコドン；ループ２に拘束するコドン６７から８４を含有するいずれのコドン、特に７０−７３の変異。修飾されたステフィンＡまたはＳＴＭポリペプチドのスカフォールドタンパク質としての使用は記載のようにステフィンＡの配列を変異によって作成した。ステフィンＡを基にして得られたタンパク質であるが、特異的な変異性の変化は上の本明細書に開示の既知の配列を有する。
実施例２
【０１０５】
図１はＥ． ｃｏｌｉでのＳＴＭ発現および変異体の例を示す。本明細書に開示のＳＴＭおよび変異体のオープンリーディングフレームは、アミノ末端尾に付加の機能を含む、システイン残基（全ての示した変異体に存在する）またはＳｔｒｅｐＩＩタグ（ＳＴＭのみ）等の工作をしたＥ． ｃｏｌｉ発現ベクターｐＥＴ３０ａ＋型でクローンした。ＳｔｒｅｐＩＩタグに挿入した８アミノ酸の付加は、ＳＴＭタンパク質と他の変異体の遊走を比較するとわずかな違いを占めた。これらの発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を有するＥ． ｃｏｌｉ細胞は、ＳＴＭおよび変異体タンパク質（＊で強調する）の発現を誘導するイソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の欠乏（−）または存在（＋）で培養した。３７℃で誘導から３時間後、細胞を超音波処理で溶解し、１０分間１６，０００×ｇの遠心後、総細胞ライセート（Ｔ）または溶解物（Ｓ）の部位に回収して、１５％のポリアクリルアミドゲルに負荷した。タンパク質をクーマシィー染色によって視覚化した。この方法で限界に達するまで、それぞれ１００％の示したタンパク質（ＳＵＮ、ＳＵＭ、ＳＴＭ、ＳＵＣ、ＳＤＭおよびＳＱＭ）が可溶性成分に回収することができ、これは変異体タンパク質の残物がＥ． ｃｏｌｉ内において折り畳むことができることを示す。
実施例３
【０１０６】
新しいペプチドのデザインの合理的な方法において、ステフィンＡおよび／またはＳＴＭを基にした新しいスカフォールドタンパク質の産出を実施した。本発明の新しいスカフォールドタンパク質が、生体外および生体内における研究の広範囲において実用的な質を有する理想的なスカフォールドを有することを必要とし、これらの要素が新しいスカフォールドのデザインに応用されるであろう。
【０１０７】
ステフィンＡまたはＳＴＭの小さな、安定性のある細胞内プロテアーゼ阻害剤から始め、親タンパク質が安定した構造を保持する、生物学的に中性な多数のスカフォールドを操作した。異種性型新しいスカフォールドタンパク質は、既知の相互作用物の背景およびライブラリースクリーンの双方において、所望の標的に結合するペプチドを示すことを期待する。スカフォールドを基にした分子ツールとして生物学的な経路の研究の幅広い範囲および薬剤標的の検証を見出した。ＳｔｅＡは既知の翻訳後修飾を受けない、ジスルフィド結合を欠失した、９８アミノ酸の単量体、単一ドメインタンパク質である。ＳｔｅＡは遷移と共に、ＳｔｅＡを基にしたスカフォールドの全ての重要な特徴である、９８℃の観測および４９０ｋＪ／ｍｏｌの折り畳みエンタルピーにおいて、驚くべき熱安定性を示した。
実施例４
【０１０８】
ＳＴＭ変異体発現プラスミド（全てはｐＥＴ３０ａ＋を用いる）をＥ． ｃｏｌｉ内において変形した。単一のコロニーを接種し、一晩３７℃で振とう（軌道振とう機で２５０ｒｐｍ）による増殖で培養した。翌朝、それぞれ０．５ｍＬの一晩培養した液体を、ｐＥＴ３０プラスミドに対する選択を維持するためにカナマイシンを追加した５００ｍＬの新しい培地に接種した。培養が対数期の中央（ＯＤ６００〜０．６−０．８）に達したとき、様々なタンパク質の発現を誘導した。培養液にさらに３時間、３７℃のまま、振とうしながら培養した。Ｅ． ｃｏｌｉ細胞を遠心によって採取し、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓを用いて溶解した。ライセートを遠心によって澄まし、ＳＴＭ変異体タンパク質はＮｉキレート親和性クロマトグラフィーを用いて得られた上清から精製した。これに０．５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡｇｅｎ）を２０ｍＬのライセートに使用した。樹脂を５０ｍＬのファルコンチューブにて７００ｇで２分間遠心し、上清を取り除いた。樹脂を２．５ｍＬの１×Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ／Ｗａｓｈバッファーで、樹脂をバッファーに再度けん濁し、その後７００ｇで２分間、４℃で遠心し、上清を取り除く洗浄を３回行った。ライセートを洗浄した金属の親和性樹脂と組み合わせ、ローラー上において２時間、４℃で培養した。ライセートのアリコートを次の解析に保持した。樹脂をライセートから７００ｇ、５分、４℃で遠心し、分離し、上清を取り除いた。さらにライセートのアリコートをその後の結合親和性解析に保持した。樹脂を１０ｍＬのＷａｓｈバッファーで（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）、ビーズをバッファーに再度けん濁し、その後７００ｇで２分間、４℃で遠心し、上清を取り除く洗浄を６回行った。樹脂を１ｍＬのＥｌｕｔｉｏｎバッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）と共に１０分間室温で培養した。けん濁液を７００ｇ、５分間遠心し、上清を保持した。このステップをさらに二回繰り返し、さらに二つの溶出画分を得た。画分と最も高濃度のタンパク質を保持し、４℃に保管した。円偏光二色性のため、サンプルを５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４にバッファー交換した。サンプルを解析する日に約０．３ｍｇ／ｍＬまで希釈し、正確なタンパク質はＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して測定した。図１に示す部位において、１ｍＭ ＤＴＴを解析直前に直ちに加えた。ＣＤスペクトラムをＪａｓｃｏ Ｊ７１５分光偏光計を使用して２００から２６０ｎｍにおいて収集した。スペクトラムをモルタンパク質濃度および残留モル楕円率に標準化し、プロットすることで、サンプル間の不自然な結果を最小にした。
実施例５
【０１０９】
ステフィンＡおよびＳＴＭを基にした本発明のスカフォールドタンパク質を構造的に安定しているか、ＤＮＡ（オープンリーディングフレーム）レベルで作った変異が新しいステフィンＡ／ＳＴＭの変異体のアミノ酸配列を変異に導き、タンパク質の安定性を減少するかを明確にし、全ての本明細書に記載の変異体を発現させ、円偏光二色性の対象として、それらの二次構造組成物をステフィンＡと比較した。図１に参照し、全てのタンパク質がＥ． ｃｏｌｉ内において同等、通常約２８ｍｇ変異体のタンパク質／ｍＬの細菌培養液に発現していることを見出すことができる。その後、タンパク質はＮｉアガロースを使用して、ほぼ均一に親和性クロマトグラフィーによって精製し、精製した調製物を円偏光二色性解析の直前に０．３ｍｇ／ｍＬまで希釈した。前述のように、円偏光二色性解析はタンパク質をほぼＵＶ波長の範囲に渡ってスキャンすることからなり、例えばライトの楕円率はタンパク質の二次構造要素（αヘリックスまたはβストランド）に影響する。
【０１１０】
図３を参照に、二次構造の割合はＳＴＭおよび本発明において好都合にＳＤＭ、ＳＱＭ、ＳＵＭ、ＳＵＮおよびＳＵＣ（上記の本明細書で定めた配列番号：９−１３）として参照される新しい変異体の間において保持され、ＳＴＭ内の挿入物の存在はその構造に悪影響を与えない。特に注目すべきは、二つの変異体（ＳＵＮおよびＳＱＭ）の外見が、他のスカフォールドタンパク質試験と比較して構造上昇していることである。これはこれら全てのタンパク質に存在するアミノ末端尾の二次構造の取得のためであることができ、位置４のグリシン（ステフィンＡ）またはトリプトファン（ＳＴＭ）をアルギニンに置換することによって誘導され、これがＳＵＮおよびＳＱＭに共通する唯一の変異で、これらはこの変異を有する唯一の変異体である。最小の変異をＳＵＮ、ＳＵＭ、ＳＵＣおよびＳＤＭにおいて考慮するとき、結果は主な変曲点の場所である２１８ｎｍはそれぞれの変異によって大きくは影響されないことを示し（図３）、これはアミノ酸変異が一般的にタンパク質を不安定にして、ステフィンＡ由来の二次構造の割合はアミノ酸変異によって変異しないことを予期することを示す。その一方、変曲の深さを変異体の間において著しく変えた（図３）。
実施例６
【０１１１】
保存効果を検索した。図４は４℃で２週間、ｐＨ７．４のリン酸化バッファーで保存した後、濃縮したストックの全スカフォールドタンパク質変異体の試験をして、二次構造の比率を同じサンプルの作りたての希釈液を解析したとき（図５と比較）保持していることを示す。これは大半のタンパク質が完全に変性したか、保存ビンに吸着したため欠失しているため、この時点ではキャリアタンパク質の大量を添加しない限りとても驚くべきことである。このステップにおいて、ペプチドアプタマーの高い精製の調整、即ち診断および分析解析において関連性のないタンパク質、例えばキャリアタンパク質の存在の結果からなる非特異的なシグナルを最小にする使用が目標であるため、即ちキャリアタンパク質の添加は好ましくない。結論として、新しいスカフォールドタンパク質ステフィンＡタンパク質の変異体は、明白な利点となる結果はないが、単純なリン酸化バッファーに保存することができる。この観測は新しいスカフォールドタンパク質ステフィンＡの変異体の工業的な応用を補助する方法である。
実施例７
【０１１２】
円偏光二色性はまたＳＴＭ、ＳＤＭ、ＳＱＭ、ＳＵＭ、ＳＵＮ、ＳＵＣおよび３つのペプチドアプタマーのｐｅｐ６Ｍ、ｐｅｐ９Ｍ、ｐｅｐ１０Ｍ（図６）の変異体に実施した。ＤＴＴを添加し、アミノ末端尾に存在するシステイン残基の発現変異体タンパク質が、実験に影響を与えることができる分子間のジスルフィド結合の形成を妨ぐことができる。ＤＴＴの有無は観測された二次構造に影響ないが、ＤＴＴそのものがほぼＵＶ範囲のシグナルの一因のため、その欠失のとき得られたスペクトラムの解析は比較的簡単であった。これらの結果はＤＴＴが本発明のスカフォールドタンパク質の二次構造に影響しないことを示した。
実施例８
【０１１３】
ループ１および２の双方に加える変異において、位置４の部位に変異性の変化を含有するＳＱＭ変異体（配列番号：１０）を、すなわち単一のスカフォールドに複数の挿入部位、そのスカフォールドタンパク質ディスプレイ法の特徴として評価した。ペプチド（ＨＡ、ＡＵ１またはＭＹＣ）をそれぞれ４、４８、および７２／８２番目の部位に挿入し、円偏光二色性データを作り出した（図７）。円偏光二色性解析データは新しい挿入部位がペプチドの相互作用を示す特徴のみではないが、それらは重要な構造欠失がないことを示す。
実施例９
【０１１４】
二つの方法によってスカフォールド構造のアミノ酸変異の結果を得るために使用した。第一の方法は、おおざっぱにＥ． ｃｏｌｉ内のタンパク質操作の相対発現レベルを大半のアミノ酸変異がタンパク質を不安定にするという論理を定めた。以下の表１は細菌培養からの様々なスカフォールド変異体の発現収率が生じ、収率はｍｇの精製タンパク質毎培養液のリットルとして起こる。
【０１１５】
【表１】
【０１１６】
二番目に使用された方法は、直接それぞれのタンパク質を円偏光二色性（ＣＤ）によって二次構造の要素を評価する。Ｅ． ｃｏｌｉのタンパク質収率を比較したとき、それは、それぞれステフィンＡ内のＳＵＮ、ＳＵＭ、およびＳＵＣに少しの効果、もしくはＳＴＭ（表１）と比較して上昇した収率を導き出すことを見出した（表１）。これはまた二つの変異の組み合わせ（ＳＤＭ）またはＳＱＭ一つのタンパク質内に三つ全ての変異があるとき当てはまる。実に、ＳＱＭの４調製のタンパク質の平均収率が、５８＋／−２９ｍｇ精製したスカフォールド／細菌培養のリットルである一方、三調製のＳＴＭの培養の収率が５８＋／−４１ｍｇ精製したスカフォールド／細菌培養のリットルであった。
【０１１７】
異なったＳＴＭ変異体のＣＤスペクトラムを２００ｎｍから２６０ｎｍの間で得た。ＣＤスペクトラムのプロットの形の変異は折り畳まれたαヘリックスおよびβシートの容量の変異を示していると考えられる。全てのＳＴＭ変異体における同様の約２１８ｎｍの変曲点のＣＤスペクトラムは、導入した修飾（図３）によるかく乱作用のない同様の構造を示した。しかしながら、観測されたＣＤスペクトラムの振幅差は、またＳＴＭ（図３）と比較してＳＤＭ、ＳＵＣおよびＳＵＭにおいても見られ、ゆるやかな曲線を示し、ＳＱＭおよびＳＵＮにおいてはなだらかな曲線を示した。説明の可能性として、折り畳みの安定性の強化が考えられ、即ち正しく折り畳まれたタンパク質の平均の一定時間の容量が、ＳＴＭと比較して、ＳＱＭおよびＳＵＮの溶液において高上していて、高い楕円率の出力の結果に至った。ＣＤスペクトラムに基づいて、得られたタンパク質の収率との組み合わせ（表１）によって、それはＳＱＭ変異体がスカフォールドタンパク質であることがあり得ることが断定された。
実施例１０
【０１１８】
調査をＳＱＭがペプチドの相互作用を示すことができるか否かであって、試験は、ＳＱＭ内に作成された新しい部位が存在するとき、単純なエピトープタグがそれらの類似抗体に認識されることができるかによって実施された。長さおよび物理化学的な特徴双方において異なる、三つのエピトープが選択された（ＡＵ１、ＨＡおよびＭＹＣタグ）。これらのペプチドをスカフォールド内の可能な位置（Ｎ末端、ループ１またはループ２）に単一または様々な組み合わせによって挿入した。始めに、ＨＡタグをアミノ末端部位、ＡＵ１タグ（最短ペプチド）をループ１の中、Ｍｙｃタグをループ２の中に挿入した。驚くべきことに、アミノ末端内のＨＡタグの挿入物の許容はとても低く、タンパク質の収率は空スカフォールドと比較して約２．５倍であった。同様に、Ｅ． ｃｏｌｉにおいてＭｙｃタグをループ２の中に挿入した結果は＞５倍低下であった。その一方、ループ１内におけるＡＵ１タグの挿入はＳＱＭを不安定にせく、実際収率（表１）を上昇することができる。
【０１１９】
総合すると、タンパク質発現データはＳＱＭがペプチドをアミノ末端、ループ１およびループ２の３カ所において示すことができることを現した。そのうち新しいループ１部位は最も広範囲において実用的であるように見られる。
実施例１１
【０１２０】
実験は、上記のペプチドアプタマー２内のＳＴＭスカフォールドに存在する短いペプチド由来の形状の挿入による効果の評価によって実施した。これらのペプチドは様々な長さ、１０残基（Ａ４８、Ａ５２、およびＡ５８）、１７残基（Ａ７）、および２２残基（Ａ５２直列）の長さである。これらのＡ７のみがＳＴＭタンパク質の二次構造に影響した（データ未記載）。驚くべきことに、同じペプチドをＳＱＭのループ２の中に挿入したとき、二次構造の割合がそれぞれの得られたペプチドアプタマーの変異に至らなかった（データ未記載）。これはＳＱＭがＳＴＭよりペプチド挿入に耐えられることに優れていることを示した。さらに、実験を上記三つの部位内（表１）におけるエピトープタグの結果として得られたペプチドアプタマーの二次構造の割合に対して挿入効果を評価するため実施した。結果は予期せず、タンパク質収率を減少するそれらの挿入物でさえ、感知できるほど得られたペプチドアプタマー（図７）の二次構造の分離をしないことを示した。しかしながら、それはＮ末端部位変異のペプチドの存在が曲線の形状を変え、変曲点を２１８ｎｍから２０９ｎｍに向かって押す（図７、ＳＱＭ−Ｈａ）。これがスカフォールド構造のこの部位への挿入の一般的な効果に反映するか明確にするため、ＳＱＭ由来ペプチドアプタマーとループ１および／またはループ２内への挿入、並びにアミノ末端全ての挿入の範囲におけるスペクトルを解析した。これは常にこれらのタンパク質がＮ末端部位に挿入物を欠失している相応のタンパク質より少ない二次構造を有することを見出した（図７）。
実施例１２
【０１２１】
制限内であると、モデルペプチドをそれぞれ本発明の三つの部位に挿入することが可能だと断定され、挿入ペプチドアプタマーが免疫沈降することができることを見出した。図８Ａを参照に、ＡＵ１ペプチドをループ１内に挿入する免疫沈降を示し、ループ１内へのＡＵ１ペプチド挿入が抗ＡＵ１抗体結合の十分に密接で、ペプチドアプタマーが免疫沈降できることを示す。図８Ｂおよび８ＣはまたＳＱＭのループ１（ＡＵ１およびＭＹＣ）そしてＳＱＴ（ＨＡ）のループ２のエピトープタグ付のスカフォールド変異体のエピトープ類似抗体によって認識することができることを示した。これはマイクロアレイ構成を使用した他のエピトープタグが同等に良く認識されることを確認した（図９）。ペプチドアプタマー（Ｐｅｐ２、ｐｅｐ６、ｐｅｐ９またはｐｅｐ１０ｍ）はループ２内のＳＱＭまたはＳＱＴをガラス顕微鏡スライド上にアミン化学を使用して固定し、溶解、標識されていない工業用のソースのＣＤＫ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）活性によって探索（ｐｒｏｂｅ）した。長い間洗浄した後、固定されたペプチドアプタマーに結合したＣＤＫ２は抗ＣＤＫ２抗体および標識された二次抗体を使用して検出して、標準のＤＮＡマイクロアレイスキャナーを使用して画像化した。データはＳＱＭが他のスカフォールドよりｐｅｐ６に比較的良く存在するのに対して、ＳＱＴは他のスカフォールド変異体よりｐｅｐ１０ｍにおいて比較的良く存在することを臨床的に関連のある範囲において示した。空のＳＱＴスカフォールドは低いシグナルを発し、これをバックグラウンドとして設定した。Ｅ． ｃｏｌｉから精製された異なる部位におけるペプチドアプタマーと異なるエピトープをガラススライドにニッケルキレート（それぞれのペプチドアプタマーのヘキサヒスチジンタグを捕らえ、方向付けを制御する）または単純にポリＬリジンのいずれかによって印刷した。全てのプリントは、始まりから終わりがプリントバッファースポット（ｐｒｉｎｔ ｂｕｆｆｅｒ ｓｐｏｔ）および遊離ＳＱＭスポットであって、常にシグナルが得られなく、ネガティブコントロールとして働く。全ての場合、抗体吸収率は特異的である。これらの結果をＳＰＲ（図１０）で確認した。抗体は次の順にＳＱＭ標的に対して、最も高い親和性を有する：３３ｎＭ溶液の噴射によって抗Ｍｙｃ、抗Ｈａおよび抗Ａｕ１と表面濃度の変化０．４、０．１３、および０．０２ｐＭ ｃｍ−２を観測した（以下の表２）。これらの値は比較的定性的な平衡定数の降幅Ｋを示す。抗Ｍｙｃ抗体に対するＫ値は〜５０ｎＭの位数として算出され、抗シスタチンにおける同様の研究と一致する。抗Ｈａおよび抗Ａｕ１に対するＫ値ヲＳＰＲ分析の非理想的な作用によって正確に測定した。抗Ｈａは急速で、激しい関連性の急上昇後、同様の性質の分離として二番目に遅い関連性の要素を示した。このような性質は、複数の工程が起きていること、複数の代わりのスカフォールド末端構造の結合の結果によるものであることができるか、または商業用のサンプルの不純物を示す。あるいはそれはとても早い速度の結合および分離定数の結果であることができる。ＡＵ１はＭｙｃに対してはっきりと変化した分離関連曲線として同様な反応を示したが、完全に固定した等級抗体が大幅にｃａ２位数の大きさで減少したことが見られた。ＨａおよびＡｕ１の場合、Ｋ値は明白に５０×１０−９Ｍ以下である。
【０１２２】
表２は、抗体が三つ全てのエピトープタグからなるＳＱＭアプタマーに共有結合した相対的な反応を示す。
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
サンプルの結果は、二つの表面の間において同等の質で、基本となる違いは見られなかったが、ノイズシグナルおよび再現性はアミン表面より優れている。表面間の類似は双方のランダムな方向性および制御された方向性の場合を示し、三ループ全ては周囲に開放されていて、処置することができる。Ｎ末端のループ１または２に設置した類似エピトープが有する変数の結合親和性の証拠はない。実験はまた上記濃度の抗体を混合物に同時に加えて繰り返した。同程度の結果が全ての場合において、ループがそれぞれ他から十分に分離されていること、独立して反応を示すことが見られた。ループが隣接したループの抗体結合の阻害であることの証拠がないことが見られた。操作されたスカフォールドは予期しないほどの広い表面積において、タンパク質または４５０ｋＤａまでの複数のタンパク質複合体を認識すると推定し、相性の良い三つの抗体分子の結合と同時に相互作用を示すことができる。
実施例１３
【０１２５】
それぞれ三つの部位に挿入された８６４のランダムペプチドの発現プロフィールを解析した。この実験において、小スケールの培養物を９６穴プレートのランダムペプチドアプタマーで成長させ、高い処理量のペプチドアプタマーを精製し（すなわちそれぞれの穴に最適な発現または精製プロトコールなしに）、それぞれのペプチドアプタマーを等体積でガラスの顕微鏡スライドにスポットし、小さいマイクロアレイを作り出した。マイクロアレイをその後、スカフォールドタンパク質を認識する二つの抗体によって検出した。得られたシグナルの強度と抗体は、その後それぞれの特徴のアレイにおいてペプチドアプタマーの量と比例する。結果はループ１およびループ２への挿入が、一般的に良く発現していることを示した一方、ほぼアミノ末端挿入物の５０％があまり優位に発現していない（図１１）。結果は試験した３８４のうち６８％のペプチドアプタマーとＳＱＭのループ１内への６アミノ酸の長さのランダム挿入物が良く発現していて、１６％の発現が低レベルであることができる一方、１５％の発現が検出することができない。結果は試験した３８４のうち７６％のペプチドアプタマーとＳＱＭのループ２内への１２アミノ酸の長さのランダム挿入物が良く発現している一方、１４％の発現が低レベルで、１０％が全く検出されなかった。最後に、アミノ末端内の１９２ペプチドアプタマーとランダム挿入物の内、３５％のみが良く発現している一方、３２％の発現が低レベルで、３２％が全く検出されなかった。
【０１２６】
結論として、多数の異なったペプチドがアミノ末端部位において挿入できることを示すが、これらはまたしばしばスカフォールドの安定性に不利である。それに応じて、スカフォールドおよび本発明の新しい部位が、標的タンパク質と広い表面積の使用、従って高い親和性および特異性で相互作用するペプチドアプタマーの産出に使用することができることを提案した。
実施例１４
【０１２７】
ループ２のさらなる操作の試みによって、ＳＴＭと比較して、８２−８３部位における新しい変異の不安定効果を始めた。従って、新しいスカフォールドはアミノ末端のループ１においてＳＱＭと同様の変異を有し、また７１−ＮＧＰ−７３を有するが、現在は野生型（ステフィンＡ）配列７８−ＥＤＬ−８０と７８−ＡＤＲ−８０、７７−ＳＤＲＬ−８０、または７８−ＮＴＤ−８０のいずれかと置換し、操作した。これらそれぞれの変異は、ループ２内のペプチドをコード化するオリゴヌクレオチドの導入による二つのＲｓｒＩＩ部位の使用に許容なようにデザインした。これらの７８−ＡＤＲ−８０バージョンは比較的柔軟性があることを立証した。新しいスカフォールドはＳＱＴとしてデザインした（配列番号：２４）。Ｅ． ｃｏｌｉ内のＳＱＴのタンパク質発現の収率はそれらのＳＱＭ（表３）と比較して減少していることを見出した。しかしながら、ＳＱＴのバージョンとループ２への挿入の収率は、ＳＱＭ（表３）のループ２内へ同じ配列を挿入したものと比較して、常に改善している。これらの違いは、ループ２内のＡＵ１として最も公表されていて、発現レベルが、ＳＱＭを使用したとき１Ｌの細菌培養液から１ｍｇペプチドアプタマー以下であったが、４５ｍｇ／Ｌの培養液とＳＱＴであった。表３はペプチドアプタマー発現のペプチドの収率を１リットルの細菌培養液から通常の条件において得られる精製したタンパク質のｍｇとして示す。
【０１２８】
【表３】
【０１２９】
ある驚くべき観測は、ループ１単独の挿入物の発現収率がＳＱＭにおいてＳＱＴより高いことができる。例えば、２５ｍｇのペプチドアプタマー毎リットルの培養液がＳＱＴ−ＡＵ１−ループ１から得られるが、１０３ｍｇ毎ＳＱＭ−ＡＵ１−ループ１であるかこれは一般概念ではなく、ペプチドアプタマーとループ１内のＭｙｃエピトープ（表３）より効果は反対であった。ペプチドアプタマーとＳＱＴのループ１およびループ２内への二重挿入物は一般的に良く発現していて、ＳＱＭの同じ組み合わせの収率において改善を示したが、ＳＱＭ（表３）のループ１内へのＡＵ１タグおよびループ２内へのＨＡタグを挿入したとき、今までは高い収率がペプチドアプタマーにおいて得られた。
【０１３０】
別の手段のペプチド挿入の効果を考慮したとき、ＳＱＴはモデルＣＤＫ結合ペプチド（ｐｅｐ２、６、９および１０ｍ）またはＭｙｃエピトープの存在を見出した。一般的に、ＳＱＴはＳＱＭよりこれらのペプチドを受容することができることに優れている。しかしながら、驚くべきことに、ＳＱＴはＳＴＭより少しの（ｐｅｐ２、ｐｅｐ９）または一切認められない（ｐｅｐ６、ｐｅｐ１０ｍ）利点を有しているように見られる。これらのデータはスカフォールドおよびループ内へのペプチド挿入物の最小の操作が比較的複雑な変異より、これらが二次構造の分離を最小にするようデザインしたとしても、容易にできるとされている。
実施例１５
【０１３１】
ＳＱＴのループ１を用いたライブラリー構築の効率を改善するために、
【化４】
（配列番号：２６）をＮｈｅＩ部位内のオリゴヌクレオチド配列に、５’末端のＮｈｅＩ部位と３’末端のＳｐｅＩ部位を使用して挿入し、後者は切断したＮｈｅＩ部位の切断をアニールしたとき欠失し、これはまたＳＴＭオープンリーディングフレーム内の３’ＮｈｅＩ部位欠失の結果に至った。挿入したオリゴヌクレオチドは、ペプチドをコード化するオリゴヌクレオチドの挿入に使用することができる３つの新しい制限酵素サイト（ＳｔｕＩ、ＢＣＩＩおよびＮｃｏＩ）を有する。変性スカフォールドの最後の配列のこの部位において、新しいリンカー鎖はＤＮＡ：
【化５】
からなる。タンパク質：
【化６】
と挿入したオリゴヌクレオチドをコード化するアミノ酸を小文字で示す。リンカー鎖のＮｈｅ１およびＮｃｏＩ部位を用いたオリゴヌクレオチド挿入は、ＳｐｅＩＩ／ＮｈｅＩアニーリング配列にコード化される二残基（ＬｅｕＡｌａ）の挿入の終結という結果となるであろう、そしてＳＱＴスカフォールドタンパク質は従って、従来のステフィンＡより二残基長い。これを延長したスカフォールドＳＱＬと呼ぶ。この方法がライブラリー構築を改善に必要とする、５’−ＮｈｅＩおよび３’−ＮｃｏＩ部位による隣接塩基配列（ｆｌａｎｋｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にＳＱＬ内の一致する部位のランダムオリゴヌクレオチドを挿入した。形質転換細胞の配列を決定した全２０に対して、単一な正しい挿入物をそれぞれのクローンにおいて示す一方、ＮｈｅＩ部位を単独で使用したとき、クローンしたとき、形質転換細胞の２４配列中、８つのみが必要とされるものであった（単一の挿入物、正確な方向）。他の９つのクローンは空プラスミド（不十分な処理（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）および脱リン酸化ステップを示す）、３つのコンカテマー（オリゴヌクレオチドをライゲーション前にそれぞれ他のスカフォールドＯＲＦ内においてライゲーションした）、４つは間違った方向であった。これらの数は、両端をＮｈｅＩ部位によって隣接塩基配列にされたランダムオリゴヌクレオチドをＳＱＴのＮｈｅＩ内に挿入したとき、これら得られたものに対して方向付けられた挿入物を使用によって広大な改善を示した。従って、オープンリーディングフレームの核酸配列を変えて、ＳＱＴＲｓｒＩＩ部位の代わりに、Ｘｍａｌ部位を作成した。これはＳＱＴのアミノ酸配列に変異を及ぼさないような、ループ２と同様の手段を実施した。これはＳＱＴのアミノ酸配列に変異を及ぼさない。
実施例１６
【０１３２】
二つのペプチドアプタマーがＣＤＫ２に対して明白に最も高い親和性をマイクロアレイ実験における表示は、“免疫ブロット法”プロトコールを使用し（またウェスタンブロット法と呼ぶ、図１２参照）、抗体の代わりにペプチドアプタマーを除いたもの（ＳＱＭ−ｐｅｐ６およびＳＱＴｐｅｐ１０Ｍ）を使用した。抗体は同様に、Ｓタンパク質のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）融合を検出することができるＳタグを有するペプチドアプタマーとして、“免疫ブロット法”の開発ステップから除いた。ネガティブコントロールとして、パラレルブロットは空スカフォールドと検出し（ＳＱＴ参照）、Ｓタンパク質プロトコールを使用して開発した。ポジティブコントロールとしてパラレルブロットを同じ相対的な分子量のタンパク質検出に使用することができるが、抗体がペプチドアプタマーと同じ濃度で使用されるとき、長い露光時間を必要とする抗ｃｄｋ２抗体で検出した。図１２はニトロセルロースまたはＰＶＤＦメンブランへの転写前にポリアクリルアミドゲルの電気泳動における異種性の対象として、上記のようにスカフォールド、ペプチドアプタマーまたはスカフォールドによって検出した二つのヒト組織培養細胞のライセートを示す。データはペプチドアプタマーがこのプロトコールにおいて、抗体のみとの置換はできないが、ペプチドアプタマーを使用した検出は抗体より比較的迅速であるため、実際にはＣＤＫ２としての機能が優れていることを示した。従って、有利に抗体よりペプチドアプタマーの使用とは、分子プローブの産出に少ない動物の使用が必要されることを意味する。
【図１Ａ−１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質であって、修飾は、単一の変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンをステフィンＡのためにトリプトファンまたはＳＴＭのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、または
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項２】
位置４での変異性の変化は、ステフィンＡについてはＧ４Ｒであり、およびＳＴＭについてはＷ４Ｒである、請求項１に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項３】
変異性の変化はコドン４６から５４まで（包括的）の任意の変化であり、ステフィンＡについては４８−ＶＡＧ−５０であり、およびＳＴＭについては４８−ＬＡＳ−５０である、請求項１に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項４】
変異は４８−ＬＸＳ−５０であり、式中、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項３に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項５】
変異性の変化はコドン６７から８４まで（包括的）の任意の変化であり、ステフィンＡについては７１−ＫＳＬ−７３であり、およびＳＴＭについては７１−ＮＰＧ−７３である、請求項１に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項６】
変異は７１−ＮｘＰ−７３であり、式中、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項５に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項７】
ステフィンＡまたはＳＴＭの残基７３または８４のいずれかで終結する、先行する請求項のいずれか一項に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項８】
終結性残基７３または８４には、ステフィンＡまたはＳＴＭのいずれかの最後の２５個のアミノ酸残基または最後の１５個のアミノ酸残基を除去または置換する終止コドンが続く、請求項７に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項９】
ペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドはステフィンＡまたはＳＴＭのいずれかの残基７３または８４と終結性終止コドンとの間に挿入される、請求項７または８に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項１０】
ペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドは２０個のアミノ酸またはそれよりも少数を含む、請求項９に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項１１】
変異性の変化とは別に、タンパク質の残部は、ステフィンＡまたはＳＴＭのいずれかと似ている、先行する請求項のいずれか一項に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項１２】
修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質であって、二つの変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンを別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、および／または
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、および／または
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化の異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する２つの異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１３】
さらに、請求項２から１１までに記載の特色の任意の一つまたはそれよりも多くを含む、請求項１４に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項１４】
修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質であって、三つの変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンを別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、および
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、および
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
で挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１５】
さらに、請求項２から１１までに記載の特色の任意の一つまたはそれよりも多くを含む、請求項１４に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項１６】
配列番号９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４および２５のいずれか一つに記載するようなアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１７】
いずれか一つのアミノ酸配列はさらに、それに挿入されるペプチドをコード化する一つまたはそれよりも多くの異種のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
任意の一つまたはそれよりも多くの変異性の変化の部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドの、スカフォールドタンパク質としての使用。
【請求項１９】
診断、治療、バイオマーカー、バイオマーカーに結合し、およびそれを特異的に検出するための薬剤、合理化された薬物設計の鋳型、創薬のための標的または試薬、抗体の代替物およびリサーチツールを含む群より選ばれる薬剤としての用途のための先行する請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
興味ある構造を結合することが可能な標的ペプチドを識別するための方法であって、次の
（ｉ）標的ペプチドを含む請求項１から１７までのいずれか一項に規定されたような修飾されたステフィンＡまたはＳＴＭタンパク質を提供すること、
（ｉｉ）前記スカフォールドタンパク質を興味のある前記構造と接触させること、および
（ｉｉｉ）スカフォールドと興味ある構造との間の関連を監視することであり、スカフォールドタンパク質の興味ある構造との関連は、標的ペプチドを、前記構造と結合することが可能な候補標的ペプチドとして識別するものを含む、方法。
【請求項１】
修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質であって、修飾は、単一の変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンをステフィンＡのためにトリプトファンまたはＳＴＭのためにグリシンでない別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、または
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、または
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項２】
位置４での変異性の変化は、ステフィンＡについてはＧ４Ｒであり、およびＳＴＭについてはＷ４Ｒである、請求項１に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項３】
変異性の変化はコドン４６から５４まで（包括的）の任意の変化であり、ステフィンＡについては４８−ＶＡＧ−５０であり、およびＳＴＭについては４８−ＬＡＳ−５０である、請求項１に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項４】
変異は４８−ＬＸＳ−５０であり、式中、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項３に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項５】
変異性の変化はコドン６７から８４まで（包括的）の任意の変化であり、ステフィンＡについては７１−ＫＳＬ−７３であり、およびＳＴＭについては７１−ＮＰＧ−７３である、請求項１に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項６】
変異は７１−ＮｘＰ−７３であり、式中、Ｘは任意のアミノ酸である、請求項５に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項７】
ステフィンＡまたはＳＴＭの残基７３または８４のいずれかで終結する、先行する請求項のいずれか一項に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項８】
終結性残基７３または８４には、ステフィンＡまたはＳＴＭのいずれかの最後の２５個のアミノ酸残基または最後の１５個のアミノ酸残基を除去または置換する終止コドンが続く、請求項７に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項９】
ペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドはステフィンＡまたはＳＴＭのいずれかの残基７３または８４と終結性終止コドンとの間に挿入される、請求項７または８に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項１０】
ペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドは２０個のアミノ酸またはそれよりも少数を含む、請求項９に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項１１】
変異性の変化とは別に、タンパク質の残部は、ステフィンＡまたはＳＴＭのいずれかと似ている、先行する請求項のいずれか一項に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項１２】
修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質であって、二つの変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンを別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、および／または
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、および／または
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化の異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
が包含される群より選ばれる部位に挿入されたペプチドをコード化する２つの異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１３】
さらに、請求項２から１１までに記載の特色の任意の一つまたはそれよりも多くを含む、請求項１４に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項１４】
修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質であって、三つの変異性の変化または次の
（ｉ）コドン４での変異であり、ステフィンＡのグリシンまたはＳＴＭのトリプトファンを別のアミノ酸によって、または異種のオリゴヌクレオチドによりコード化されたペプチドによって置換されたもの、および
（ｉｉ）コドン４６から５４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ１を含み、または拘束するもの、および
（ｉｉｉ）コドン６７から８４までを含んでペプチド挿入をコード化する任意の変化または異種のオリゴヌクレオチドであり、そのコード化アミノ酸がループ２を含み、または拘束するもの
で挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、ポリペプチドまたはタンパク質。
【請求項１５】
さらに、請求項２から１１までに記載の特色の任意の一つまたはそれよりも多くを含む、請求項１４に記載の修飾されたステフィンＡポリペプチドまたは修飾されたＳＴＭタンパク質。
【請求項１６】
配列番号９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４および２５のいずれか一つに記載するようなアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１７】
いずれか一つのアミノ酸配列はさらに、それに挿入されるペプチドをコード化する一つまたはそれよりも多くの異種のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
任意の一つまたはそれよりも多くの変異性の変化の部位に挿入されたペプチドをコード化する異種のオリゴヌクレオチドを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のポリペプチドの、スカフォールドタンパク質としての使用。
【請求項１９】
診断、治療、バイオマーカー、バイオマーカーに結合し、およびそれを特異的に検出するための薬剤、合理化された薬物設計の鋳型、創薬のための標的または試薬、抗体の代替物およびリサーチツールを含む群より選ばれる薬剤としての用途のための先行する請求項のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
興味ある構造を結合することが可能な標的ペプチドを識別するための方法であって、次の
（ｉ）標的ペプチドを含む請求項１から１７までのいずれか一項に規定されたような修飾されたステフィンＡまたはＳＴＭタンパク質を提供すること、
（ｉｉ）前記スカフォールドタンパク質を興味のある前記構造と接触させること、および
（ｉｉｉ）スカフォールドと興味ある構造との間の関連を監視することであり、スカフォールドタンパク質の興味ある構造との関連は、標的ペプチドを、前記構造と結合することが可能な候補標的ペプチドとして識別するものを含む、方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１１−５２０７８６（Ｐ２０１１−５２０７８６Ａ）
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０４５４１（Ｐ２０１１−５０４５４１）
【出願日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５０３８０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３６１８２
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５０３１８４７４０）ユニヴァーシティ オブ リーズ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＬＥＥＤＳ
【住所又は居所原語表記】ＬＥＥＤＳ，ＬＳ２ ９ＪＴ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【出願人】（３１１００７４９７）メディカル リサーチ カウンシル (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２１日（２０１１．７．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５０３８０
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３６１８２
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５０３１８４７４０）ユニヴァーシティ オブ リーズ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＬＥＥＤＳ
【住所又は居所原語表記】ＬＥＥＤＳ，ＬＳ２ ９ＪＴ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
【出願人】（３１１００７４９７）メディカル リサーチ カウンシル (1)
【Ｆターム（参考）】
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