修飾ベータ−サブユニット結合モチーフを含む２成分ＤＮＡＰＯＬＩＩＩレプリカーゼおよびその使用
本発明は、修飾ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼ、およびそれをさまざまな核酸複製用途を用いる方法を提供する。修飾レプリカーゼは、２成分、特にαサブユニットを含むポリメラーゼ成分、およびβサブユニットを含むスライディングクランプ成分を含む。２成分ポリメラーゼはクランプローダーを欠く。修飾レプリカーゼのαサブユニットは、β−サブユニット結合部位の一つ以上に、一つ以上の偏移を有する。結果として、変異αサブユニットはβ−サブユニットに対して上昇した親和性を有し、および２成分レプリカーゼは合成持続性の上昇を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ、そのβ−サブユニット結合モチーフ、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとのβサブユニット結合を変化させる修飾、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ活性および熱安定性を変化させる修飾，および核酸分子の持続性酵素的複製および増幅に関する。
関連特許
【０００２】
本明細書は、全体が明示的に参照により本開示に含まれる２００５年４月７日出願の米国特許出願公開第１１／１０１，９７７号明細書の一部継続出願である。本明細書はまた、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下に、２００５年１１月２９日出願の米国仮出願第６０／７４１，００９号明細書の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼは、核酸配列決定、核酸定量（リアルタイムＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ）、核酸増幅（ＰＣＲ、ＲＤＡ、ＳＤＡ）、およびｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写を含むがそれらに限定されない、分子生物学におけるいくつかの用途を有する。
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素（「Ｐｏｌ ＩＩＩ」）は、コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）によって最初に精製され、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体の主なレプリカーゼと決定された（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，『ＤＮＡ複製補遺１９８２』（１９８２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ），フリーマン・パフリケーションズ社（Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ），サンフランシスコ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐｐ １２２−１２５，参照により本開示に含まれる）。該ホロ酵素は、３つの別々の機能成分を形成する１０種類の異なるサブユニットから成る（マクヘンリー（ＭｃＨｅｎｒｙ）他，Ｊ．Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．，２５２：６４７８−６４８４（１９７７）；マキ（Ｍａｋｉ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：６５５１−６５５９（１９８８）、それぞれ参照により本開示に含まれる）。３つの機能成分は、（ｉ）「コア」（すなわちポリメラーゼ）、（ｉｉ）β複合体（すなわちスライディングクランプ）、および（ＩＩＩ）γ複合体（すなわちクランプローダー）である。「コア」内には３つのサブユニットが存在する：αサブユニット（ｄｎａＥにコードされる）はＤＮＡポリメラーゼ活性を有する触媒サブユニットに相当する；εサブユニット（ｄｎａＱ、ｍｕｔＤにコードされる）はプルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼである（ショイエルマン（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ），他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１ ：７７４７−７７５１（１９８４）；およびディフランシスコ（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：５５６７−５５７３（１９８４）、それぞれ参照により本開示に含まれる）、およびθサブユニット（ｈｏｌＥにコードされる）はεを刺激する（スタッドウェル−ヴァーガン（Ｓｔｕｄｗｅｌｌ−Ｖａｕｇｈａｎ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１１７８５−１１７９１（１９９３）、参照により本開示に含まれる）。αサブユニットはεと密な１：１複合体を形成し（マキ（Ｍａｋｉ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１２９８７−１２９９２（１９８５）参照により本開示に含まれる）、およびθはεと１：１複合体を形成する（Ｓｔｕｄｗｅｌｌ−Ｖａｕｇｈａｎ 他，前掲）。
【０００５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ｓｓＤＮＡ結合タンパク質（「ＳＳＢ」）で被覆された独特にプライミングされたバクテリオファージ一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）ゲノムを、３０℃にて少なくとも毎秒５００ヌクレオチドの速度で、５ｋｂ環状ＤＮＡから一度も解離せずに、非常に効率的におよび完全に複製する（フェイ（Ｆａｙ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：９７６−９８３（１９８１）；オドネル（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１２８８４−１２８８９（１９８５）；およびモク（Ｍｏｋ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１６６４４−１６６５４（１９８７）、それぞれ参照により本開示に含まれる）。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼはＤＮＡ複製において高い信頼性を示す。
【０００６】
好熱性細菌を含むいくつかのグラム陰性およびグラム陽性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼが記載されており（たとえば、ブラード（Ｂｕｌｌａｒｄ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１３４０１−１３４０８，２００２； およびブルック（Ｂｒｕｃｋ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１７３３４−１７３４８，２００２を参照； それぞれ参照により本開示に含まれる）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩに見られる３成分構成を示す。たとえばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）では、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは（ｉ）ｐｏｌＣ遺伝子にコードされるαサブユニット（イプシロンおよびシータサブユニットを含まない）、（ｉｉ）β−スライディングクランプ、および（ＩＩＩ）τ／δ／δ’複合体（すなわち、クランプローダー）から成る（ブルック（Ｂｒｕｃｋ）Ｉ，オドネル（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ）Ｍ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ｓｅｐ １５；２７５（３７）：２８９７１−８３，参照により本開示に含まれる）。
【０００７】
文献は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の３つの主要な機能成分、すなわち、ポリメラーゼコア（αサブユニットを含む）、合成持続性クランプ、およびクランプローダーが、ゲノムレプリカーゼに特徴的な速い伸長速度および低いエラー率を有する機能する持続性ＤＮＡレプリカーゼに必要であると一致して教示している。（たとえば、米国特許第６，５５５，３４９； ６，２２１，６４２； ５，６６８，００４； ５，５８３，０２６； ６，６７７，１４６； および ６，２３８，９０５号明細書を参照；またオドネル（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ），Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１４：１０５−１１１，１９９２； オドネル（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ） 他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１２８７５−１２８８３，１９８５； マクヘンリー（ＭｃＨｅｎｒｙ），Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：１１５７−１１６５，２００３； マクヘンリー（ＭｃＨｅｎｒｙ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１９１２７−１９１３０，１９９１； スタッドウェル（Ｓｔｕｄｗｅｌｌ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１７１−１１７８，１９９０； ブラード（Ｂｕｌｌａｒｄ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１３４０１−１３４０８，２００２； およびブルック（Ｂｒｕｃｋ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１７３３４−１７３４８，２００２を参照；それぞれ参照により本開示に含まれる）。コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）他による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩに関する原報は、単離αサブユニットおよび単離コアポリメラーゼのポリメラーゼ活性は「ギャップ埋め」検定法を用いて非常に高い酵素濃度でしか測定できず、および最大伸長速度２０ｂ／ｓｅｃしか生じなかったことを最初に示した。この非持続性の低速合成、およびそれを達成するために必要な高いタンパク質濃度は、分子生物学用途における単離αサブユニットまたはＤＮＡポリメラーゼコア部分構築物の使用を不可能にする。さまざまな細菌に由来するＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩに関するより多数の近年の報告は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のαサブユニットもコア複合体も単独では、速い伸長速度を有する持続性モードで機能できず、ホロ酵素の３成分部分構築物が必要であるという定説をさらに強固にしている。たとえば、ブルック（Ｂｒｕｃｋ）他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５： ２８９７１− ２８９８３，２０００，参照により本開示に含まれる）は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｐｏｌ ＩＩＩのアルファサブユニット（ｐｏｌＣ）は単独ではＤＮＡポリメラーゼとして機能しないことを報告しており、一方、ブラード（Ｂｕｌｌａｒｄ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１３４０１−１３４０８，２００２，およびブルック（Ｂｒｕｃｋ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１７３３４−１７３４８，２００２（それぞれ参照により本開示に含まれる）はそれぞれ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）においてレプリカーゼ活性にＰｏｌ ＩＩＩの３成分が必要であることを報告している。
【０００８】
ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼの合成持続性は、ホロ酵素中のＤＮＡポリメラーゼコア（アルファ、イプシロン、シータ）とのβ−スライディングクランプ結合に由来し、およびＤＮＡ上のＤＮＡポリメラーゼコアとのβ−スライディングクランプ結合はクランプローダーを必要とすると考えられており、したがって３成分説である。βサブユニットはＤＮＡを取り囲む２量体を形成し、およびそれによって、結合したコアポリメラーゼをそのＤＮＡ基質へ繋ぐ。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ アルファ （Ｅｃｏ ＤｎａＥ）中の２ヶ所が、β−スライディングクランプと結合すると報告されている。第一は、上流がへリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合領域とおよび下流がＯＢ折りたたみ領域と隣接している残基９２０−９２４（ＱＡＤＭＦ）の間に位置する内部結合部位である。他のβ−サブユニット結合タンパク質の調査は、共通β−サブユニット結合モチーフＱＬ（Ｓ／Ｄ）ＬＦを示唆している。第二のモチーフは、配列ＱＶＥＬＥＦを有し、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤｎａＥのカルボキシ末端に残基１１５４と１１５９の間に位置する。このカルボキシ末端モチーフはまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）τサブユニットとの高い親和性を示す。ロペズ（Ｌｏｐｅｚ）他，ＰＮＡＳ １００： １４６８９− １４６９４，２００３； ドーマン（Ｄｏｈｒｍａｎ）他，ＪＭＢ ３０８，２２８−２３９，２００５； ダルリンプル（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ）他，ＰＮＡＳ ９８：１１６２７−１１６３２，２００１； キム（Ｋｉｍ）他，ＪＢＣ ２７１：２０６９９−２０７０４，１９９６を参照（それぞれ参照により本開示に含まれる）。
【０００９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＥ中のβ−サブユニット結合部位（「β−結合部位」）の欠失および変異分析は、どちらの配列も離散性ポリメラーゼ（ギャップ埋め）活性に必要でない一方、内部部位は効率的なβ−サブユニット結合活性（「β−結合活性」）におよびホロ酵素の持続性ポリメラーゼ活性に必要であることを示している。ドーマン（Ｄｏｈｒｍａｎ）他，ＪＭＢ ３０８，２２８−２３９，２００５を参照 （参照として本開示に含まれる）。カルボキシ末端モチーフは、対照的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでβサブユニットへの結合に、またはホロ酵素の持続性ポリメラーゼ活性に必要でないことが示された。にもかかわらず、該モチーフにおける変異は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体においてＤｎａＥα変異体を補完するサブユニットの能力を、おそらくτとの結合における妨害のために、部分的に損なうことが見出された。加えて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）共通配列ＱＬＤＬＦでの内部配列ＱＡＤＭＦの置換は、βに対する親和性が大幅に上昇したαポリメラーゼサブユニットを生じた。対照的に、同じ共通配列でのカルボキシ末端モチーフの置換は、βサブユニットに対する親和性がわずかに上昇したが、τサブユニットに対する結合親和性が４００倍低いαサブユニットを生じた。内部共通配列を有する変異体αサブユニットはβに対して大幅に上昇した親和性をｉｎ ｖｉｔｒｏで示したが、その特異的ポリメラーゼ活性、伸長速度および合成持続性は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素に組み込まれた際、野生型αサブユニットのものより大きくなかった。カルボキシ末端にβ結合共通配列を有する第二の変異体αサブユニットは、ベータに対してわずかに高い親和性を示したものであるが、同じくｉｎ ｖｉｔｒｏ複製検定法において特異的活性、合成持続性および伸長速度に改善を何ら示さなかった。したがって、当業者は、β−結合部位の親和性を高める変異はｉｎ ｖｉｔｒｏで野生型酵素に対する変異ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩの性能を改善しないことを教示される。
【００１０】
これらの結果は、持続性ＤＮＡ複製に対するカルボキシ末端モチーフの、非常に限られた、必須でない寄与を示唆する。しかし、αのカルボキシ末端への結合についてのτとβの間の競合は、ＤＮＡ合成のモードを調節するのに関与すると仮説が立てられている。特に、αのカルボキシ末端でのτによるβの置換は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素がニックに遭遇する際の持続性合成の中断を媒介すると示唆されている。加えて、βサブユニット相互作用とＤＮＡ結合の間の関連が示唆されている。特に、内部部位は２個の潜在的ＤＮＡ結合配列と隣接しており、ＤＮＡへのαサブユニット結合がβサブユニット結合に、およびその逆に影響しうると示唆する。したがって、カルボキシ末端ベータ結合モチーフの親和性における変化は、持続性ＤＮＡ複製の最中および完了後にそれぞれ、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素分解の正確な組立に影響しうる。
【００１１】
Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの組立および機能は、成分サブユニットの互いへの親和性に依存するように見え、および同一サブユニット部位への結合についてのある程度の競合が関与する。たとえば、クランプローダー複合体（デルタサブユニット）およびαサブユニットはβスライディングクランプの同一のポケットに結合する一方、τおよびβサブユニットはαのカルボキシ末端部位について競合するように見える。加えて、ＤＮＡ修復および複製に関与する他の酵素、たとえばＤＮＡリガーゼ、ＭｕｔＳ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＶもまた、ベータ上の同一の疎水性ポケットとの結合についてアルファサブユニットと競合する。結合部位変異およびサブユニット親和性における変化は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ組立および機能に対して有害と立証される可能性があり、および現在までに試験された変異体は、ホロ酵素活性を損なったのみであることがわかっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以前に報告された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤｎａＥにおけるβ−結合部位の欠失および変異分析が、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素作用の機構に光を投じている一方、組み換えＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼの合理的設計においてβ−結合部位修飾に関して容易に明らかな有用性は無く、なぜなら修飾はホロ酵素の完全性および持続性活性を損なうだけであるように見えていたためである。加えて、修復型ポリメラーゼはＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで支持するよりもはるかに高い塩濃度を必要とすることを考慮すると、修復型ポリメラーゼとのβ−スライディングクランプの併用は不可能であった。全体的に、Ｐｏｌ ＩＩＩ αサブユニット中のβ−結合部位の同定および分析は、ＰＣＲ用途においてより高い合成持続性、特異的活性および熱安定性を有する組み換えＤＮＡポリメラーゼの設計に用途を見出していない。
【００１３】
以前の報告とは対照的に、同時係属の米国特許出願公開第１１／１０１，９７７号明細書は、細菌ｄｎａＥにコードされるおよびｐｏｌＣにコードされるαサブユニット、およびそれを含むコアポリメラーゼは、単独でおよびβ−スライディングクランプとの組み合わせで、最小の機能性ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとして適当な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏにて機能しうることを確証する。そのような単一成分（αまたはコア単独）および２成分（αまたはコア、加えてβ−スライディングクランプ）Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、Ｐｏｌ ＩＩＩクランプローダーを欠く。したがって、さまざまなＰｏｌ ＩＩＩホロ酵素サブユニットのベータ結合についての競合する相互作用は、機能性２成分ポリメラーゼホロ酵素を組み立てるには無関係である。
【００１４】
本発明は、そのような２成分ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ組成物では、βサブユニットに対する親和性を高めるためおよびレプリカーゼの合成持続性を高めるために、変異がαサブユニット成分の一つ以上のβ−結合モチーフへ導入されうるという別の発見から始まる。これは、βサブユニットに対する単離αサブユニットの親和性をｉｎ ｖｉｔｒｏで高める変異はホロ酵素活性に対応する上昇を生じていない、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ ホロ酵素に関する報告と対照的である。加えて、ここで実証される通り、本２成分ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにおけるアルファサブユニットへのベータのより密な結合は、ＰＣＲといった高温ストレスを伴う用途における、複合体の熱安定性を改善する。したがって、β−結合部位の操作は、２成分ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼに新しく関連して有用性を見出している。
【００１５】
本発明のアルファサブユニットは、ここで記載される通り現存のβ−結合部位の修飾によって得られ、ここでは「修飾αサブユニット」と呼ばれる。本発明の２成分ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、そのような修飾αサブユニットを含み、「修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ」と呼ばれる。
【００１６】
ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、修飾αサブユニットを含む第一の成分を含む。一部の好ましい実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一の成分は、本質的に修飾αサブユニットから成る。一部の好ましい実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一の成分は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのコアポリメラーゼ複合体の一つ以上の別のサブユニットを含む。しかし、ここで開示されるすべての修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼはクランプローダーを欠く。
【００１７】
ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼはまた、第二の成分を含む。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第二の成分は、本質的に合成持続性クランプから成る。好ましい一実施形態では、合成持続性クランプは、本質的にＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩβサブユニットから成る。
【００１８】
ここで用いられる修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ここで定義される通りの機能性レプリカーゼである。
【００１９】
修飾αサブユニットは、好ましくは、グラム陰性細菌のｄｎａＥにコードされるαサブユニット、またはグラム陽性細菌のｐｏｌＣにコードされるαサブユニットに由来する。好ましい修飾αサブユニットは、非中温性細菌、好ましくは好極限性菌に由来するものを含む。本発明における使用に特に好ましいのは、好熱菌に由来する修飾αサブユニットである。驚くべきことに、好熱菌に由来する修飾αサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、適当な条件下では、反復ＤＮＡ複製反応を温度サイクルモードで維持するための、熱安定性の向上を示し、二本鎖ＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増幅に繋がる。好熱菌に由来する修飾αサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ここでは「熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ」と呼ばれる。
【００２０】
一態様では、本発明は、対応する野生型αサブユニットとは異なるβ−結合部位を含む、修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットおよびｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを対象とする。２つのβ−結合部位が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＥで以前に同定されており、および１つのβ−結合部位がグラム陽性細菌のＰｏｌＣαサブユニットについて提案されている。グラム陽性細菌のＰｏｌＣαサブユニットに存在する新規の第二のβ−結合部位の同定がここで開示される。この新規のベータ結合部位は、ＰｏｌＣアルファサブユニット中のへリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合領域から上流に位置する。以前に同定された部位、およびここで開示される新規のβ−結合部位は、修飾αサブユニットを、およびそのようにして本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一の成分を生じるために操作されうる。
【００２１】
修飾αサブユニットのβ−結合部位は、その野生型対応物と、配列に基づいて識別可能である。異なるβ−結合部位は、２成分Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ組成物で示される通り、修飾αサブユニットに、対応する野生型αサブユニットのものとは異なるβ−結合活性を与える。本発明の修飾αサブユニットをコードする核酸もまた提供される。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、一つ以上の変異一つ以上のβ−結合部位を含む修飾αサブユニットを提供する。好ましい一実施形態では、変異β−結合部位は、本質的に、ＧＭＭＧＬＦＳ，ＱＥＡＶＰＦ，ＧＬＶＧＬＦＡ，ＥＥＶＶＰＦ，ＧＡＬＤＡＦＧ，ＴＱＮＳＬＦＧ，ＧＶＫＶＩＩ，ＧＡＦＤＦＴ，（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＬＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ），（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＱＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ），（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＮＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ），ＱＬ（Ｇ／Ａ／Ｌ）Ｌ（Ｐ／Ａ／Ｇ）Ｆ，Ｇ（Ｌ／Ａ）（Ｌ／Ａ）（Ｇ／Ａ）ＬＦＧの群から選択される配列を含むかまたはそれから成る。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、グラム陽性細菌のｐｏｌＣにコードされるαサブユニットのβ−結合部位に一つ以上の変異を含む修飾αサブユニットを提供する。好ましい一実施形態では、一つ以上の変異は、グラム陰性細菌由来のｄｎａＥにコードされるαサブユニットの内部β−結合部位に存在する。別の一実施形態では、一つ以上の変異は、グラム陰性細菌由来のｄｎａＥにコードされるαサブユニットのカルボキシ末端β−結合部位に存在する。好ましい一実施形態では、修飾αサブユニットは、グラム陰性細菌由来のＤｎａＥの、カルボキシ末端β−結合部位に一つ以上の変異、および内部β−結合部位に一つ以上の変異を有する。変異は同一または別々でありうる。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、グラム陽性細菌のｐｏｌＣにコードされるαサブユニットのβ−結合部位に一つ以上の変異を含む修飾αサブユニットを提供する。一実施形態では、一つ以上の変異は、ＰｏｌＣのカルボキシ末端β−結合部位に存在する。別の一実施形態では、一つ以上の変異は、ここに記載のＰｏｌＣの内部β−結合部位に存在する。別の一実施形態では、一つ以上の変異は、ＰｏｌＣの内部β−結合部位およびカルボキシ末端β−結合部位の両方に存在する。変異は同一または別々でありうる。
【００２５】
一態様では、本発明は、ここで開示される修飾αサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを対象とする。
【００２６】
一態様では、本発明は、組成物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの使用、および、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定といったＤＮＡ増幅の方法を含む核酸複製のための方法を対象とする。
【００２７】
したがって、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む複製反応混合物中で核酸分子を複製反応に供することを含む、核酸分子を複製するための方法がここで提供される。
【００２８】
好ましい一実施形態では、複製される核酸分子はＤＮＡ分子である。さらに好ましい一実施形態では、ＤＮＡ分子は二本鎖である。他の実施形態では、ＤＮＡ分子は一本鎖である。さらに好ましい一実施形態では、二本鎖ＤＮＡ分子は直鎖ＤＮＡ分子である。他の実施形態では、ＤＮＡ分子は非直鎖、たとえば環状またはスーパーコイルＤＮＡである。
【００２９】
好ましい一実施形態では、核酸分子を複製するための方法は、核酸分子、好ましくはＤＮＡを配列決定するのに有用な配列決定法である。好ましい一実施形態では、方法は、配列決定反応混合物中で核酸分子を配列決定反応に供することを含む。配列決定反応混合物は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、配列決定反応混合物中で３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、 サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する、修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。
【００３０】
別の好ましい一実施形態では、核酸分子を複製するための方法は、核酸分子、好ましくはＤＮＡを増幅するのに有用な増幅法である。好ましい一実施形態では、方法は、増幅反応混合物中で核酸分子を増幅反応に供することを含む。増幅反応混合物は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、増幅反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００３１】
好ましい一実施形態では、増幅法は、温度サイクルモードで好ましくは二本鎖である核酸分子、好ましくはＤＮＡを増幅するのに有用な、熱サイクル増幅法である。好ましい一実施形態では、方法は、熱サイクル増幅反応混合物中で核酸分子を熱サイクル増幅反応に供することを含む。熱サイクル増幅反応混合物は、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、熱サイクル増幅反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属に、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する、修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応混合物はさらに、ここで開示される通り、熱安定剤を含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属に、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応混合物はさらに、ここで開示される通り、ＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００３２】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅法は、好ましくは二本鎖である、核酸分子、好ましくはＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅するのに有用なＰＣＲ法である。好ましい一実施形態では、方法は、ＰＣＲ反応混合物中で核酸分子をＰＣＲに供することを含む。好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ＰＣＲ反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、熱安定剤を含む。さらに好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、ＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００３３】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲ法は迅速ＰＣＲ法である。好ましい一実施形態では、方法は、迅速ＰＣＲ反応混合物中で核酸分子を迅速ＰＣＲに供することを含む。迅速ＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは，熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、迅速ＰＣＲ反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。好ましい一実施形態では、迅速ＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、熱安定剤を含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、迅速ＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、ＤＮＡ不安定化剤を含む。迅速ＰＣＲ法は、好ましくは、変性のための第一の温度、およびプライマーアニーリングおよびプライマー伸長の両方のための第二の温度を用いる、反復２温度サイクルから成る２段階ＰＣＲ法である。
【００３４】
別の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ法はロングレンジＰＣＲ法である。好ましい一実施形態では、方法は、ロングレンジＰＣＲ反応混合物中で核酸分子をロングレンジＰＣＲに供することを含む。ロングレンジＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ロングレンジＰＣＲ反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましい一実施形態では、ロングレンジＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、熱安定剤を含む。さらに好ましい一実施形態では、ロングレンジＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、ＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００３５】
一実施形態では、ここで複製反応に用いられるプライマーはＤＮＡである。別の一実施形態では、複製反応に用いられるプライマーはＲＮＡである。
【００３６】
一態様では、本発明は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む、核酸複製のための複製反応混合物を提供する。本発明の好ましい複製反応混合物は、ＤＮＡ複製に有用である。複製反応混合物は、テンプレート核酸およびプライマーを含む荷電反応混合物を含むがそれらに限定されない。複製反応混合物はまた、テンプレートの複製を与えるために、テンプレート核酸および／またはプライマーの添加、および随意的に希釈を必要とする、前反応混合物を含む。
【００３７】
好ましい一実施形態では、複製反応混合物は、核酸配列決定、好ましくはＤＮＡ配列決定に有用な配列決定反応混合物である。配列決定反応混合物は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、配列決定反応混合物中で３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去できる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。
【００３８】
別の好ましい一実施形態では、複製反応混合物は、核酸増幅、好ましくはＤＮＡ増幅に有用な増幅反応混合物である。増幅反応混合物は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、増幅反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００３９】
好ましい一実施形態では、増幅反応混合物は、温度サイクルモードで好ましくは二本鎖である核酸、好ましくはＤＮＡを増幅するのに有用な、熱サイクル増幅反応混合物である。好ましくは、熱サイクル増幅反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、熱サイクル増幅反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属に、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、 サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは、熱サイクル増幅反応混合物はさらに、ここで開示される熱安定剤を含む。好ましくは、熱サイクル増幅反応混合物はまた、ここで開示されるＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００４０】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応混合物は、好ましくは二本鎖である、核酸、好ましくはＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅するのに有用なＰＣＲ反応混合物である。ＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ＰＣＲ反応混合物中で３−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは、ＰＣＲ混合物はさらに、ここで開示される熱安定剤を含む。好ましくは、ＰＣＲ反応混合物はまた、ここで開示されるＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００４１】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応混合物は、迅速ＰＣＲ法に有用な迅速ＰＣＲ反応混合物である。迅速ＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、迅速ＰＣＲ反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは、迅速ＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される熱安定剤を含む。好ましくは、迅速ＰＣＲ反応混合物はまた、ここで開示されるＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００４２】
別の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応混合物は、ロングレンジＰＣＲ法に有用なロングレンジＰＣＲ反応混合物である。ロングレンジＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ロングレンジＰＣＲ反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、 サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは、ロングレンジＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される熱安定剤を含む。好ましくは、ロングレンジＰＣＲ反応混合物はまた、ここで開示されるＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００４３】
好ましい一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物は、反応混合物またはそれに由来する荷電反応混合物が、ハイブリダイズしたプライマーを毎秒１００塩基より大、より好ましくは１５０より大、より好ましくは２００より大、より好ましくは２５０より大、より好ましくは３００より大、より好ましくは３５０より大、より好ましくは４００より大、より好ましくは４５０より大、より好ましくは５００より大、より好ましくは５５０より大、より好ましくは６００より大、より好ましくは６５０より大、より好ましくは７００より大の速度で伸長することによってＤＮＡテンプレートを複製できる修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ活性を有するように、ある量の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。
【００４４】
好ましくは、βサブユニットは、反応混合物中にモル比（α：β）１：１ないし１：１０、好ましくは１：３ないし１：５で存在する。
【００４５】
好ましい一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物は、双性イオン緩衝液を含む。好ましい一実施形態では、双性イオン緩衝液は、約ｐＨ７．５〜８．９のｐＨを有する。好ましい一実施形態では、双性イオン緩衝液は、弱有機酸および弱有機塩基の組み合わせを含む。
【００４６】
好ましい一実施形態では、ここで提供される熱サイクル増幅反応混合物は、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの熱安定性を高める熱安定剤（ここでは代替的に「安定剤」と呼ばれる）を含む。
【００４７】
好ましい一実施形態では、ここで提供される熱サイクル増幅反応混合物はテンプレート変性に必要な温度を低下させるＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００４８】
好ましい一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物は、ＣａＣｌ2を欠く。
【００４９】
好ましい一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物は、γサブユニットおよび／またはτサブユニットを欠く。
【００５０】
一態様では、本発明は、ここで開示される核酸複製反応混合物を含む核酸複製反応チューブを提供する。複製反応混合物を含むチューブとは、反応混合物が入ったチューブである。
【００５１】
好ましい一実施形態では、核酸複製反応チューブは、ここで開示される配列決定反応混合物を含む配列決定反応チューブである。
【００５２】
別の好ましい一実施形態では、核酸複製反応チューブは、ここで開示される増幅反応混合物を含む増幅反応チューブである。
【００５３】
好ましい一実施形態では、増幅反応チューブは、ここで開示される熱サイクル増幅反応混合物を含む熱サイクル増幅反応チューブである。
【００５４】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応チューブは、本明細書で開示されるＰＣＲ反応混合物を含むＰＣＲ反応チューブである。
【００５５】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応チューブは、ここで開示される迅速ＰＣＲ反応混合物を含む迅速ＰＣＲ反応チューブである。
【００５６】
別の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応チューブは、ここで開示されるロングレンジＰＣＲ反応混合物を含むロングレンジＰＣＲ反応チューブである。
【００５７】
一態様では、本発明は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む、核酸複製に有用な核酸複製キットを提供する。好ましい一実施形態では、複製キットはここで開示される複製反応混合物を含む。キットは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ、および、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含まずおよびここで開示される反応混合物を生じるために使用前に修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの添加を必要とする混合物を提供しうる。好ましい一実施形態では、複製キットはＤＮＡ複製に有用である。本発明のキットはさらに、情報パンフレットおよび包装材を含みうる。
【００５８】
好ましい一実施形態では、核酸複製キットは、核酸配列決定、好ましくはＤＮＡ配列決定に有用な配列決定キットである。配列決定キットは、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。
【００５９】
別の好ましい一実施形態では、核酸複製キットは、核酸増幅、好ましくはＤＮＡ増幅に有用な増幅キットである。増幅キットはここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、増幅キットは、ここで開示される核酸増幅反応混合物を含む。
【００６０】
好ましい一実施形態では、増幅キットは、温度サイクルモードで好ましくは二本鎖である核酸、好ましくはＤＮＡを増幅するのに有用な、熱サイクル増幅キットである。熱サイクル増幅キットは、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、 サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、 サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは，熱サイクル増幅キットは、ここで開示される熱サイクル増幅反応混合物を含む。
【００６１】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅キットは、好ましくは二本鎖である、核酸、好ましくはＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅するためのＰＣＲキットである。ＰＣＲキットは、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ neapolitana）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくはＰＣＲキットは、本明細書で開示されるＰＣＲ反応混合物を含む。
【００６２】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲキットは迅速ＰＣＲキットである。迅速ＰＣＲキットは、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ neapolitana）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは迅速ＰＣＲキットは、ここで開示される迅速ＰＣＲ反応混合物を含む。
【００６３】
別の好ましい一実施形態では、ＰＣＲキットはロングレンジＰＣＲキットである。ロングレンジＰＣＲキットは、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属に由来する、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ neapolitana）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくはロングレンジＰＣＲキットは、ここで開示されるロングレンジＰＣＲ反応混合物を含む。
【００６４】
好ましい一実施形態では、ここで提供される核酸複製キットは核酸複製反応混合物を含み、その複製反応混合物は、反応混合物をテンプレートＤＮＡ、およびそれにハイブリダイズ可能なプライマーと混合でき、および随意的に適当に希釈して荷電反応混合物を生じ、ここでハイブリダイズしたプライマーを毎秒１００塩基より大、より好ましくは１５０より大、より好ましくは２００より大、より好ましくは２５０より大、より好ましくは３００より大、より好ましくは３５０より大、より好ましくは４００より大、より好ましくは４５０より大、より好ましくは５００より大、より好ましくは５５０より大、より好ましくは６００より大、より好ましくは６５０より大、より好ましくは７００より大の速度で伸長することによって修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼがＤＮＡテンプレートを複製できるように、ある量の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。さらに、荷電反応混合物は、好ましくは修飾αサブユニット濃度１ｎｇ／μＬないし１００ｎｇ／μＬ、より好ましくは２ｎｇ／μＬないし５０ｎｇ／μＬ、および非常に好ましくは４ｎｇ／μＬないし１０ｎｇ／μＬを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
ここでは、特定の細菌属または種「の」または「に由来する」遺伝子とは、直接に特定の細菌属または種のまたはそれに由来することを意味しない。むしろ、その語句は、特定の細菌属または種の内因性遺伝子との、特定の遺伝子の対応をいう。
【００６６】
ここでは、「熱安定性」修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとは、加熱による不活性化に耐性である修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼをいう。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとは、ＤＮＡポリメラーゼであり、プライマーを５’から３’方向へ伸長することによって一本鎖ＤＮＡテンプレートと相補的なＤＮＡ分子の構成を合成する。ここでは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、熱不安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼよりも熱不活性化に耐性である。しかし、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、熱不活性化に対して完全に耐性である必要は無く、および、したがって、熱処理はそのＤＮＡポリメラーゼ活性をある程度低下させうる。熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは典型的にはまた、熱不安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼよりも、合成機能について高い最適温度を有する。熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの成分は、典型的には好熱性細菌から単離される。
【００６７】
ここでは、「熱不安定性」修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとは、熱による不活性化に耐性でない修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼをいう。熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼの一例はＴ５ＤＮＡポリメラーゼであり、その活性は、酵素を温度９０℃に３０秒間曝露することによって完全に不活性化される。ここでは、熱不安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼよりも熱不活性化に対して耐性が低い。熱不安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは典型的にはまた、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼよりも低い最適温度を有する可能性が高い。熱不安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、典型的には中温性細菌から単離される。
【００６８】
ここでは、「プライマー」の語はまた、複数のプライマーをいう可能性がある。「プライマー」はオリゴヌクレオチドプライマーを含み、オリゴヌクレオチドプライマーはＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ
【００６９】
本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、「機能性」レプリカーゼ、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットの機能性の部分組立物である。機能性とは、レプリカーゼ活性をいい、プライマー伸長速度によって特徴づけることができる。本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、プライマー伸長検定法において、毎秒７５塩基より大の伸長速度で機能する能力によって特徴づけられる。本発明の特に好ましい修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、毎秒１００塩基より大、より好ましくは１５０より大、より好ましくは２００より大、より好ましくは２５０より大、より好ましくは３００より大、より好ましくは３５０より大、より好ましくは４００より大、より好ましくは４５０より大、より好ましくは５００より大、より好ましくは５５０より大、より好ましくは６００より大、より好ましくは６５０より大、より好ましくは７００より大の伸長速度で機能する。さらに、そのような好ましい修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましい伸長速度で濃度２ｐｍｏｌ／μＬ以下にて機能できる。
【００７０】
好ましくは、βサブユニットは、モル比（α：β）１：１ないし１：１０、好ましくは１：３ないし１：５の範囲の反応混合物中にある。
【００７１】
したがって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニットに由来する修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは，文献で実証されおよび２００５年４月７日出願の同時係属出願第１１／１０１，９７７号明細書で確認された通り非機能性であり、本発明の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼに含まれない。
【００７２】
「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニット」はここでは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の未変化ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニットを意味する。たとえば、マキ（Ｍａｋｉ）他，１９８５，前掲を参照。「修飾」大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニットはここでは、少なくとも一つのβサブユニット結合部位に少なくとも一つの変異を有する、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニットを意味する。
【００７３】
本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩαサブユニットを含む第一の成分を含む。一部の好ましい実施形態では、第一の成分は本質的に、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩαサブユニットから成る。一部の好ましい実施形態では、第一の成分は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩのコアポリメラーゼ複合体の一つ以上の別のサブユニットを含む。第二の成分は本質的に、合成持続性クランプから成る。合成持続性クランプは、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩβサブユニットを含む。一部の好ましい実施形態では、合成持続性クランプは本質的に、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩβサブユニットから成る。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一のおよび第二の成分は、好ましくは同一種に由来する。本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、クランプローダー成分を欠く。一部の実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、同一であるかまたは異なりうる、二つ以上の第一の成分を含む。
【００７４】
好ましい一実施形態では、ここで用いられる修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの修飾αサブユニットは、グラム陰性細菌のｄｎａＥにコードされるαサブユニットに由来する。
【００７５】
別の好ましい一実施形態では、ここで用いられる修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの修飾αサブユニットは、グラム陽性細菌のｐｏｌＣにコードされるαサブユニットに由来する。
【００７６】
好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの修飾αサブユニットは、アクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、カルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、サーモクリニス（Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）およびサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属といった、しかしそれらに限定されない、分類学的に系統樹真正細菌の基部に位置する好極限性細菌のｄｎａＥにコードされるまたはｐｏｌＣにコードされるαサブユニットに由来する。
【００７７】
特に好ましいのは、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｕｒａｎｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）、サーマス・ブロキアナス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ neapolitana） およびサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属の他の種、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、およびサーモクリニス（Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｄｉｓ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｃｈｅｃｏｃｃｕｓ）属の種、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）およびこれらの種の変異体から成る群から選択される細菌または藍藻に由来する修飾αサブユニットである。特に好ましいのは、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、アクイフェックス・ピオゲネス（Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ） およびサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）である。
【００７８】
好極限性細菌とは、高放射線、極端な低湿度、高温（６０℃超）または低温（１０℃未満）、および高浸透圧（塩濃度０．５Ｍ超）といった、通常の生理条件の範囲外の極端な環境条件下で成長および増殖する細菌である。
【００７９】
好極限性細菌のｄｎａＥにコードされるおよびｐｏｌＣにコードされるαサブユニットの中でも、好熱性細菌由来のものが特に好ましい。
【００８０】
特に好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの修飾αサブユニットは、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｄｎａＥにコードされるαサブユニットに由来する。
【００８１】
本発明で用いられる修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットは、好ましくは内因性の亜鉛依存性３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００８２】
一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一の成分は、さらに、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するεサブユニットを含む。
【００８３】
αサブユニットの例は、たとえば、それぞれ明示的に参照により本開示に含まれる、２００１年５月２９日発行の米国特許第６，２３８，９０５号明細書；２０００年８月１８日出願の米国特許出願公開第０９／６４２，２１８号明細書；２０００年１１月２１日出願の米国特許出願公開第０９／７１６，９６４号明細書；１９９８年９月１１日出願の米国特許出願公開第０９／１５１，８８８号明細書；および２００１年３月２８日出願の米国特許出願公開第０９／８１８，７８０号明細書に見出される。
【００８４】
ここで修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにおける使用のために修飾されうるαサブユニットには、同時係属出願の米国特許出願公開第１１／１０１，９７７号明細書に開示される通りのタンパク質モチーフの存在および配列によって特徴づけられるものが含まれる。
【００８５】
ここで修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにおける使用のために修飾されうるαサブユニットにはまた、同時係属出願の米国特許出願公開第１１／１０１，９７７号明細書に開示される方法によって精製されるもの、および同時係属出願の第１１／１０１，９７７号明細書に開示される検定法によって望まれる性質を有すると同定されるものが含まれる。
【００８６】
一実施形態では、反応混合物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、εサブユニットによって与えられる。別の一実施形態では、反応混合物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、修飾αサブユニットによって与えられる。修飾αサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、ここで開示される通り、亜鉛濃度を操作することによって調節でき、および異なる反応混合物では異なりうる。
【００８７】
一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、反応混合物中で３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができる有意な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示さない。好ましい一実施形態では、有意な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、グラム陰性細菌のｄｎａＥにコードされるαサブユニットに由来する修飾αサブユニットを含む。
【００８８】
一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一の成分は、Ｐｏｌ ＩＩＩＤＮＡポリメラーゼコアの別のサブユニット、たとえばθを含む。
【００８９】
一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩの第一の成分は、細菌ｄｎａＱ遺伝子にコードされるεサブユニットを含む。εサブユニットの例は、たとえば、２０００年８月１８日出願の米国特許出願公開第０９／６４２，２１８号明細書；２０００年１１月２１日出願の米国特許出願公開第０９／７１６，９６４号明細書；１９９８年９月１１日出願の米国特許出願公開第０９／１５１，８８８号明細書；および２００１年３月２８日出願の米国特許出願公開第０９／８１８，７８０号明細書に見出される。
【００９０】
βサブユニットの例は、たとえば、それぞれ明示的に全体が参照により本開示に含まれる、２０００年８月１８日出願の米国特許出願公開第０９／６４２，２１８号明細書；２０００年１１月２１日出願の米国特許出願公開第０９／７１６，９６４号明細書；１９９８年９月１１日出願の米国特許出願公開第０９／１５１，８８８号明細書；および２００１年３月２８日出願の米国特許出願公開第０９／８１８，７８０号明細書に見出される。
【００９１】
本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一のおよび第二の成分は、同時インキュベートでき、および溶液中で２成分ポリメラーゼを形成させることができる。同時インキュベート溶液は、反応混合物となることができ、または、好ましくは、成分が反応混合物への添加前に結合されうる。一実施形態では、二種類以上の第一の成分が、第二の成分と同時インキュベートされる。
修飾アルファサブユニット
【００９２】
ここでは修飾αサブユニットは、本分野で以前に記載されたものおよびここで同定されるグラム陽性ＰｏｌＣアルファサブユニットについての新規のβ−結合部位を含む、現存するβ−結合部位の修飾によって得られる。表１は、グラム陰性ＤｎａＥおよびグラム陽性ＰｏｌＣアルファサブユニットの両方での、内部ベータ−結合モチーフの代表的一覧を提供する。
【表１】
【００９３】
背景技術で言及された通り、先行技術文献は、内部ＤｎａＥタンパク質β結合部位について共通配列ＱＬ（Ｓ／Ｄ）ＬＦを定義する。たとえば、ダルリンプル（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ）他，ＰＮＡＳ ９８：１１６２７− １１６３２，２００１を参照。図１を参照して、隣接領域のアミノ酸配列を整列すると、いくつかのグラム陰性およびグラム陽性細菌に由来するＤｎａＥタンパク質中のこの内部部位を特定できた。驚くべきことに、配列整列の結果は、ＤｎａＥ内部β結合部位について共通アミノ酸配列の逸脱を容認するような、βサブユニット結合モチーフ内の一次配列保存は無いことを明らかにした。細菌ＤｎａＥタンパク質中の内部β結合モチーフの唯一の一致した性質は、β結合モチーフの両側に隣接する、Ｃ−末端フェニルアラニン残基および２個の低分子量アミノ酸（プロリン、グリシン、セリンまたはスレオニン）の存在である。この驚くべき知見は、本分野の教示と相反する。図１に含まれていない、αサブユニットについてのβ−結合部位のアミノ酸配列は、図にあるものとの配列比較によって、およびＯＢ折りたたみおよびへリックス−ヘアピン−へリックス領域を同定する構造分析によって同定されうる（ドーマン（Ｄｏｈｒｍａｎｎ）他，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｊｕｌ ８；３５０（２）：２２８−３９を参照）。図２および３も参照。ＤｎａＥのカルボキシ末端のβ−結合部位配列はよく記録されている。たとえば、キム（Ｋｉｍ） 他，ＪＢＣ ２７１：２０６９０−２０６９８，１９９６を参照。
グラム陰性細菌の好熱性ＤＮＡ ＰＯＬ ＩＩＩの好ましい修飾αサブユニットβ−結合部位配列
【００９４】
【００９５】
【００９６】
β−クランプ結合改善のための別の変異体モチーフ：
【００９７】
（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＬＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ）
【００９８】
ＱＬ（Ｇ／Ａ／Ｌ）Ｌ（Ｐ／Ａ／Ｇ）Ｆ
【００９９】
Ｇ（Ｌ／Ａ）（Ｌ／Ａ）（Ｇ／Ａ）ＬＦＧ
【０１００】
（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＱＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ）
【０１０１】
（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＮＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ）
【０１０２】
いくつかの研究は、さまざまなα−サブユニットβ−結合部位配列に相当するペプチドを含むさまざまなペプチドの、β−サブユニットに対する親和性を比較している。内部ベータ結合部位、およびカルボキシ末端（τ−結合部位）に変異を有するα−サブユニットのβ−サブユニットに対する親和性を調べる別の研究が行われている。これらの研究は、本発明におけるβ−結合部位修飾の選択の情報を与えうる。特に、β−サブユニットに対してαサブユニットの現存するβ−結合配列よりも高い親和性を示す配列は、βサブユニット結合を改善するためにそのような現存するβ−結合部位を置換するのに使用でき、点変異、複数変異、および完全モチーフ置換を含むがそれらに限定されない。
核酸複製
【０１０３】
一態様では、本発明は、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む複製反応混合物中で核酸分子を複製反応に供することを含む、核酸分子を複製するための方法を提供する。
【０１０４】
「核酸複製」は、テンプレート核酸分子が、全体、または一部複製される過程である。したがって、核酸複製反応の産物は、複製されているテンプレート核酸分子に完全にまたは一部が相補的でありうる。核酸複製は、テンプレート核酸とハイブリダイズしているプライマーを５’−３’方向へ、テンプレート核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを伸長産物の各位で組み込んで伸長することによって行われる。プライマーは、たとえば、一本鎖ＤＮＡテンプレートの一部とハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドでありうる。プライマーはまた、たとえば、一本鎖ＤＮＡテンプレートの別の領域と相補的でありおよび自己プライミングできる、一本鎖ＤＮＡテンプレートの一部でありうる。核酸複製反応の範囲に含まれるのは、等温複製反応、配列決定反応、増幅反応、熱サイクル増幅反応、ＰＣＲ、迅速ＰＣＲ、およびロングレンジＰＣＲである。
【０１０５】
核酸複製反応で複製された核酸は、好ましくはＤＮＡであり、および複製は好ましくは、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が関与する。
【０１０６】
好ましい一実施形態では、複製反応混合物は、ｐＫ約７．０〜８．５である弱有機酸（たとえば、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＰＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＡＢＳおよびＴＥＳ）およびｐＫ約６．８〜８．５である弱有機塩基（たとえば、トリス、Ｂｉｓ−トリス−プロパン、イミダゾール、ＴＭＮＯ、４−メチルイミダゾール、トリエタノールアミンおよび時エタノールアミン）の組み合わせを含む、緩衝液のｐＨが有機塩基を用いた滴定によって約ｐＨ７．５〜８．９に設定され、および有機酸の濃度が約１０〜４０ｍＭ、より好ましくは約２０〜３０ｍＭ．である、双性イオン緩衝液を含む。
【０１０７】
特に好ましい一実施形態では、複製反応混合物および修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの組み合わせが下記の組み合わせから選択される：（ｉ）ＨＥＰＥＳ−Ｂｉｓ−トリス−プロパン（２０ｍＭ，ｐＨ ７．５）と、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種由来の修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ；および（ｉｉ）ＴＡＰＳ−トリス（２０ｍＭ，ｐＨ ８．７）と、アクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【０１０８】
好ましい一実施形態では、核酸複製反応混合物は、反応混合物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの最適活性のために含まれている、Ｚｎ2+、Ｍｇ2+、Ｋ+、およびＮＨ42+から成る群から選択される一つ以上のイオンを含む。イオンは好ましくは、反応混合物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの最適活性のための最適濃度を決定するために予備検定で滴定される。特に好ましい一実施形態では、核酸複製反応混合物はＣａ2+イオンを欠く。
【０１０９】
一部の好ましい実施形態では、核酸複製反応混合物はカリウムイオンを含む。カリウムイオンは好ましくは、使用される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについて最適濃度を決定するために最初に滴定される。一般的に、複製反応混合物のＫ+濃度は、好ましくは０ないし約１００ｍＭ、より好ましくは約５〜２５ｍＭである。カリウムイオンは好ましくは、ＫＣｌ、Ｋ2ＳＯ4、または酢酸カリウムの形で提供される。Ｋ+と共に提供される特定のカウンター陰イオンは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの活性に影響する可能性があり、および好ましくは、特定の複製反応のための特定の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにどのカウンター陰イオンが最適であるかを決定するために予備検定が行われる。一般的に、硫酸または塩化物カウンター陰イオンが、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾 Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼと共に好ましくは用いられ、硫酸が塩化物よりも好ましい。加えて、カリウムイオンは、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物での使用には好ましくない。
【０１１０】
一部の好ましい実施形態では、核酸複製反応混合物はアンモニウムイオンを含む。アンモニウムイオンは好ましくは、使用される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについて最適濃度を決定するために最初に滴定される。一般的に、複製反応混合物のＮＨ42+濃度は、好ましくは０ないし約１５ｍＭである。アンモニウムイオンは好ましくは、硫酸アンモニウムの形で提供される。アンモニウムイオンは好ましくは、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと共に複製反応混合物に含まれる。加えて、アンモニウムイオンは、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物での使用には好ましくない。
【０１１１】
一部の好ましい実施形態では、複製反応混合物は亜鉛イオンを含む。亜鉛イオンは好ましくは、使用される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについて最適濃度を決定するために最初に滴定される。一般的に、複製反応混合物のＺｎ2+濃度は、好ましくは０ないし約５０μＭ、より好ましくは約５〜１５μＭである。亜鉛イオンは好ましくは、ＺｎＳＯ4、ＺｎＣｌ2および酢酸亜鉛から成る群から選択される塩の形で提供される。Ｚｎ2+と共に提供される特定のカウンター陰イオンは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの活性に影響する可能性があり、および好ましくは、特定の複製反応のための特定の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにどのカウンターイオンが最適であるかを決定するために予備検定が行われる。一般的に、塩化物または酢酸カウンター陰イオンがサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物中で好ましくは用いられ、および硫酸カウンター陰イオンがアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物中で好ましくは用いられる。
【０１１２】
一般的に、Ｚｎ2+は、いくつかのαサブユニット（たとえば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｄｎａＥ）の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を上昇させうるため、配列決定反応混合物における使用には好ましくない。任意の特定の最小機能性Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対するＺｎ2+の影響、およびそれを用いる配列決定反応に対するＺｎ2+の影響は、本分野で公知である標準的なエキソヌクレアーゼ活性検定法を用いて評価されうる。
【０１１３】
一部の好ましい実施形態では、複製反応混合物はマグネシウムイオンを含む。マグネシウムイオンは好ましくは、使用される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについて最適濃度を決定するために最初に滴定される。一般的に、複製反応混合物のＭｇ2+濃度は、好ましくは０ないし約１５ｍＭ、より好ましくは約４〜１０ｍＭである。一般的に、核酸配列決定反応を含む、等温核酸複製反応は、好ましい濃度範囲の上限のＭｇ2+濃度によりよく適応する。マグネシウムイオンは好ましくは、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、および酢酸マグネシウムから成る群から選択される塩の形で提供される。Ｍｇ2+と共に提供される特定のカウンター陰イオンは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの活性に影響する可能性があり、および好ましくは、特定の複製反応のための特定の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにどのカウンターイオンが最適であるかを決定するために予備検定が行われる。一般的に、酢酸または塩化物カウンター陰イオンが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと好ましくは用いられ、酢酸が塩化物よりも好ましい。加えて、硫酸カウンター陰イオンが、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと好ましくは用いられる。
【０１１４】
特に好ましい一実施形態では、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための複製反応混合物は、ＴＡＰＳ−トリス （２０ｍＭ，ｐＨ８．７）、 ２５ｍＭ Ｋ2ＳＯ4、１０ｍＭ ＮＨ4（ＯＡｃ）2、および １０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む。
【０１１５】
別の特に好ましい一実施形態では、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための複製反応混合物は、ＨＥＰＥＳ−Ｂｉｓ−トリス−プロパン（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）、および１０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含む。
【０１１６】
一実施形態では、複製のための一本鎖核酸テンプレートを提供するのに必要な変性温度を低下させるために、複製反応にヘリカーゼが含まれる。
【０１１７】
一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物はＡＴＰを欠く。
【０１１８】
一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物はＳＳＢを欠き、ＳＳＢは複製反応混合物中に存在するならば、複製反応混合物中に用いられる特定の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を低下させる。好ましい一実施形態では、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む複製反応混合物はＳＳＢを欠く。
【０１１９】
ここでは、使用される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼが好熱性細菌に由来する核酸複製反応で、反応混合物は好ましくは約７．２〜８．９のｐＨを有する。一部の好ましい実施形態では、反応混合物はＺｎ2+濃度０ないし約５０μＭ、より好ましくは約５〜１５μＭである。一部の好ましい実施形態では、反応混合物は、Ｍｇ2+濃度０ないし約１５ｍＭ、より好ましくは約４〜１０ｍＭである。一部の好ましい実施形態では、反応混合物は、Ｋ+濃度０ないし約１００ｍＭ、より好ましくは約５〜２５ｍＭである。一部の好ましい実施形態では、反応混合物は、ＮＨ４2+濃度０ないし約１２ｍＭ、より好ましくは約５〜１２ｍＭである。一部の好ましい実施形態では、反応混合物は、これらの陽イオンをそれらの好ましい濃度範囲で組み合わせて有する。
【０１２０】
ここでは核酸複製反応では、プライマー伸長が行われる温度は、好ましくは約５５℃〜７２℃、より好ましくは約６０℃〜６８℃である。
【０１２１】
好ましい一実施形態では、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長が熱サイクル増幅反応において行われる温度は、約５５℃〜７２℃、より好ましくは約６０℃〜６８℃、より好ましくは約６０℃〜６５℃であるが、最適温度は、本分野で公知である通り、プライマー長、塩基含量、テンプレートに対するプライマー相補性の程度、および他の因子によって決定される。
【０１２２】
好ましい一実施形態では、変性が熱サイクル増幅反応において行われる温度は、約８６℃〜９５℃、より好ましくは８７℃〜９３℃であり、ここで開示される通りＤＮＡ不安定化剤を含む熱サイクル増幅反応混合物と組み合わせた使用にはその範囲の下限の温度が好ましい。好ましい熱サイクル増幅方法は、約１０ないし約１００サイクル、より好ましくは約２５ないし約５０サイクル、およびピーク温度約８６℃〜９５℃、より好ましくは８７℃〜９３℃を含むポリメラーゼ連鎖反応を含み、ここで開示される通りＤＮＡ不安定化剤を含むＰＣＲ反応混合物と組み合わせた使用にはその範囲の下限の温度が好ましい。
核酸増幅
【０１２３】
一態様では、本発明は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む増幅反応混合物中で核酸分子を増幅反応に供することを含む、核酸分子を増幅するための方法を提供する。好ましくは、増幅反応は、ここに記載される増幅反応チューブ中で行われる。
【０１２４】
核酸分子は、文献に記載された手動または自動化増幅方法の任意のものに従って増幅されうる。ここで用いられる「増幅」は、目的のヌクレオチド配列のコピー数を増加させるための任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ法をいう。増幅される核酸は好ましくはＤＮＡであり、および増幅は好ましくは、ここで記載される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が関与する。
【０１２５】
一実施形態では、核酸増幅は、ＤＮＡ分子またはプライマーへのヌクレオチドの組み込みを結果として生じ、それによって核酸テンプレートと相補的な新しいＤＮＡ分子を形成する。生じたＤＮＡ分子およびそのテンプレートは、別のＤＮＡ分子を合成するためのテンプレートとして使用されうる。ここでは、一つの増幅反応は、多数回のＤＮＡ複製から成りうる。ＤＮＡ増幅反応は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を含む。一つのＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の変性および合成の１０から１００「サイクル」から成りうる。そのような方法は、ＰＣＲ（参照により本開示に含まれる、米国特許第４，６８３，１９５および４，６８３，２０２号明細書に記載の通り）、鎖置換増幅（「ＳＤＡ」）（参照により本開示に含まれる、米国特許第５，４５５，１６６号明細書に記載の通り）、および核酸配列準拠増幅（「ＮＡＳＢＡ」）（参照により本開示に含まれる、米国特許第５，４０９，８１８号明細書に記載の通り）を含むがそれらに限定されない。たとえば、増幅は、低い熱で溶解するＤＮＡにおける効率増大のためにヘリカーゼを使用することさえできる、ローリングサークル複製系によって達成されうる（参照により本開示に含まれる、ユザコウ（Ｙｕｚｈａｋｏｕ）他，Ｃｅｌｌ ８６：８７７−８８６ （１９９６） およびモク（Ｍｏｋ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６５５８−１６５６５ （１９８７）を参照）。
【０１２６】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応において変性が行われる温度は、約８６℃〜９５℃、より好ましくは８７℃〜９３℃であり、ここで開示される通りＤＮＡ不安定化剤を含む熱サイクル増幅反応混合物と組み合わせた使用にはその範囲の下限の温度が好ましい。好ましい熱サイクル増幅方法は、約１０ないし約１００サイクル、より好ましくは約２５ないし約５０サイクル、およびピーク温度約８６℃〜９３℃、より好ましくは８７℃〜９３℃を含むポリメラーゼ連鎖反応を含み、ここで開示される通りＤＮＡ不安定化剤を含むＰＣＲ反応混合物と組み合わせた使用にはその範囲の下限の温度が好ましい。特に好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属の、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種のｄｎａＥαサブユニットを含む。
【０１２７】
好ましい一実施形態では、一つ以上の高温変性段階を含む増幅反応で用いられる増幅反応混合物は、ここで記載されおよびより詳細に例示される通り、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの熱安定性に寄与する安定剤をさらに含む。
【０１２８】
好ましい一実施形態では、ここで提供される増幅混合物はＳＳＢを欠き、ＳＳＢは複製反応混合物中に存在するならば、複製反応混合物中に用いられる特定の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する。
【０１２９】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応は修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを適当な安定剤と共に用いて行われ、（ａ）標的配列の末端が十分詳細に判っていてそれらとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが合成されうるならば、および（ｂ）連鎖反応を開始するために少量の標的配列が利用可能であるならば、含まれる反応段階の数に対して指数的な量で、少なくとも一つの標的核酸配列を生じる。連鎖反応の産物は、使用した特異的プライマーの末端と対応する末端を有する、不連続の核酸二重鎖となる。
【０１３０】
目的の標的核酸配列を含むかまたは含むと考えられるならば、精製形または非精製形の、核酸の任意の起源が、開始核酸として使用されうる。したがって、処理は、たとえば、ＤＮＡまたは、メッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを使用でき、そのＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖でありうる。加えて、それぞれの鎖を１本含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドもまた使用されうる。これらの核酸のうちの任意のものの混合物もまた使用でき、または、同一または異なるプライマーを用いた前の増幅反応から生じた核酸もそのように使用されうる。増幅される核酸は好ましくはＤＮＡである。増幅すべき標的核酸配列は、より大きい分子の一部だけでもよく、または標的配列が核酸全体を構成するように最初は不連続な分子として存在できる。増幅すべき標的配列が最初に純粋な形で存在する必要は無い；標的配列は、たとえばヒトＤＮＡ全体に含まれるβ−グロビン遺伝子の一部のように、または特定の生物試料の非常に小さい画分を構成しうるにすぎない特定の微生物に由来する核酸配列の一部のように、複雑な混合物のより小さい画分でありうる。開始核酸は、同一または別々でありうる、二つ以上の目的の標的核酸配列を含みうる。したがって、本方法は、大量の一つの標的核酸配列を作製するためだけでなく、同一のまたは異なる核酸分子上に位置する複数の標的核酸配列を同時に増幅するためにも有用である。
【０１３１】
核酸は任意の起源から得ることができ、および、プラスミドおよびクローンＤＮＡまたはＲＮＡ、および細菌、酵母、ウイルス、および植物または動物といったより高等な生物を含む任意の起源のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。ＤＮＡまたはＲＮＡは、たとえば、血液または他の体液、または絨毛膜絨毛または羊膜細胞といった組織材料から、たとえばマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他，『分子クローニング：実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），（ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）） ｐｐ ２８０−２８１（１９８２）に記載されたようなさまざまな方法によって抽出されうる。
【０１３２】
任意の特異的（すなわち、標的）核酸配列が、本方法によって作製されうる。目的配列の別々の鎖にハイブリダイズするような、および一つのプライマーから合成された伸長産物がテンプレート（相補鎖）から分離された際に他のプライマーが規定の長さの核酸へ伸長するためのテンプレートとして役立ちうるような配列の相対的な位置にハイブリダイズするような、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーが作製されうるように、標的配列の両端の十分な数の塩基が十分詳細に知られてさえいればよい。標的配列の両端の塩基がよく知られているほど、標的核酸配列に対するプライマーの特異性は高く、および、したがって、その処理の効率は高い。以後用いられるプライマーの語は、特に、増幅すべき断片の末端配列に関する情報に何らかの曖昧さがある場合は、二つ以上のプライマーをいうことができると理解される。たとえば、核酸配列がタンパク質配列情報から推測される場合は、遺伝コードの縮重に基づくすべての可能なコドン変異に相当する配列を含むプライマーの集合が、各鎖について使用されうる。この集合からの一つのプライマーが、増幅すべき目的配列の末端と相同となる。
【０１３３】
一部の代替的実施形態では、ランダムプライマー、好ましくは六量体が、テンプレート核酸分子を増幅するために用いられる。そのような実施形態では、増幅される正確な配列は規定されていない。
【０１３４】
加えて、単一プライマーを用いる片側増幅を実施しうることが当業者に理解される。
【０１３５】
オリゴヌクレオチドプライマーは、たとえば、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法またはその自動化実施形態といった任意の適当な方法を用いて調製されうる。そのような自動化された一実施形態では、ジエチロホスホロアミダイトが開始材料として用いられ、および参照により本開示に含まれるビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９−１８６２ （１９８１）に記載された通り合成されうる。修飾固相担体上でオリゴヌクレオチドを合成するための一つの方法が、参照により本開示に含まれる米国特許第４，４５８，００６号明細書に記載されている。生物起源（たとえば制限エンドヌクレアーゼ消化物）から単離されているプライマーを用いることもまた可能である。
【０１３６】
好ましいプライマーは、約１５〜１００、より好ましくは約２０〜５０、非常に好ましくは約２０〜４０塩基の長さを有する。特に、ここでの使用に好ましいプライマーは、Ｐｏｌ Ｉポリメラーゼに好ましいものよりも長い。
【０１３７】
標的核酸配列は、テンプレートとしてその配列を含む核酸を用いて増幅される。核酸が２つの鎖を含む場合、プライマー伸長産物の合成と別個の段階としてまたは同時に、テンプレートとして使用できる前に核酸の鎖を分離する必要がある。この鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的方法を含む、任意の適当な変性方法によって達成されうる。核酸の鎖を分離する一つの物理的方法は、完全に（＞９９％）変性するまで核酸を加熱することを含む。典型的な熱変性は、温度範囲約８０℃ないし１０５℃、好ましくは約９０℃ないし約９８℃、さらにより好ましくは９３℃ないし９４℃を、時間範囲約１ないし１０分間を含みうる。鎖分離はまた、ヘリカーゼとして知られる類の酵素、または、ヘリカーゼ活性を有しおよびＤＮＡを変性させることが知られている酵素ＲｅｃＡによっても誘導されうる。ヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するのに適当な反応条件は、参照により本開示に含まれるＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．ＸＬＩＩＩ 『ＤＮＡ：複製および組み換え』"ＤＮＡ： Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ" （ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９７８）によって記載され、 および ＲｅｃＡを用いるための方法は、Ｃ．ラディング（Ｒａｄｄｉｎｇ），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：４０５−３７ （１９８２）で総説されている。本発明での使用に好ましいヘリカーゼは、ｄｎａＢにコードされる。
【０１３８】
増幅すべき配列を含む元の核酸が一本鎖である場合、その相補鎖が、オリゴヌクレオチドプライマーを加えることによって合成される。適当な単一プライマーが添加される場合、プライマー伸長産物は、プライマー、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ、および下記の４種類のヌクレオチドの存在下で合成される。産物は、一本鎖核酸と部分的に相補となり、および核酸鎖とハイブリダイズして、不等な鎖長の二重鎖を形成し、二重鎖はついで上記の通り一本鎖へ分離して、２種類の分離した相補一本鎖を生じうる。
【０１３９】
元の核酸が増幅すべき配列を構成する場合、生じるプライマー伸長産物は、元の核酸の鎖と完全に相補となり、およびそれとハイブリダイズして、等しい鎖長の二重鎖を形成し、一本鎖分子へ分離される。
【０１４０】
核酸の相補鎖が分離される際、核酸が元は二本鎖であっても一本鎖であっても、鎖は別の核酸鎖の合成のためのテンプレートとして使用可能である。この合成は、任意の適当な方法を用いて実施されうる。一般的に、反応は緩衝水溶液中で起こる。一部の好ましい実施形態では、緩衝液ｐＨは約８．５から８．９であり、Ｐｏｌ Ｉ酵素の好ましいｐＨ範囲とは著しく異なる。好ましくは、モル過剰（クローン核酸については通常プライマー：テンプレート約１０００：１、およびゲノム核酸については通常プライマー：テンプレート約１０6：１）の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーが、分離されたテンプレート鎖を含む緩衝液に添加される。しかし、ここでの処理が消化用途に用いられる場合、相補鎖の量は不明でありうるため、相補鎖の量に相対的なプライマーの量が確実に決定できないことが理解される。実際問題としては、しかし、増幅すべき配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物に含まれる場合、添加されるプライマーの量は一般的に相補鎖（テンプレート）の量に対してモル過剰となる。その過程の効率を改善するためには、モル大過剰が好ましい。
【０１４１】
ヌクレオシド三リン酸、好ましくはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および／またはｄＵＴＰもまた、適当な量で合成混合物に添加される。
【０１４２】
新たに合成された鎖およびその相補核酸鎖は、二本鎖分子を形成し、それが処理の次の段階で用いられる。次の段階では、二本鎖分子の鎖が、上記の手順のうち任意のものを用いて分離され、一本鎖分子を提供する。
【０１４３】
新しい核酸が、その一本鎖分子上で合成される。上記の条件下で反応が進むための必要に応じて、別のポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびプライマーが添加されうる。再び、合成はオリゴヌクレオチドプライマーの一方の端で開始され、およびテンプレートの一本鎖に沿って進行し、別の核酸を生じる。
【０１４４】
鎖分離および伸長産物合成の段階は、目的の量の特異的核酸配列を生じるのに必要なだけ反復されうる。生じる特異的核酸配列の量は、指数的に増大する。
【０１４５】
最初の核酸または核酸混合物から二つ以上の特異的核酸配列を生じることが望まれる場合、適当な数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。たとえば、２種類の異なる特異的核酸配列を生ずべき場合、４種類のプライマーが用いられる。プライマーのうち２種類は特異的核酸配列の一つに特異的であり、および残り２種類のプライマーは、第二の特異的核酸配列に特異的である。この方法で、２種類の異なる特異的配列のそれぞれが、本処理によって指数的に産生されうる。もちろん、異なるテンプレート核酸配列の末端配列が同一である場合、プライマー配列は互いに同一およびテンプレート末端配列に対し相補となる。
【０１４６】
加えて、上述の通り、代替的一実施形態では、ランダムプライマー、好ましくは六量体、が、テンプレート核酸分子を増幅するのに用いられる。
【０１４７】
加えて、単一プライマーを用いる片側増幅が実施されうる。
【０１４８】
本発明は、各段階後に新しい試薬が添加される段階法で、またはすべての試薬が最初の段階で加えられて同時に、または所定数の段階後に新しい試薬が添加されて一部段階的におよび一部同時に、実施されうる。別の材料、たとえば、安定剤が、必要に応じて添加されうる。目的量の特異的核酸配列を生じるために適当な長さの時間の経過後、反応は、任意の公知の方法で酵素を不活性化することによって、または反応の成分を分離することによって停止されうる。
【０１４９】
このように、本発明に記載の核酸分子の増幅において、核酸分子は、好ましくは熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを、好ましくは安定剤を含む適当な増幅反応混合物中に含む組成物と接触させられる。
【０１５０】
一実施形態では、本発明は、「ロングレンジＰＣＲ」と一般に呼ばれる用法によって核酸高分子を増幅する方法を提供する（バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ），Ｗ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２２１６−２２２０ （１９９４） （「バーンズ」）；チェン（Ｃｈｅｎｇ），Ｓ．他．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５６９５−５６９９ （１９９４）、参照により本開示に含まれる）。約５〜６キロベースより大の核酸分子を増幅するために有用な一つの方法では、標的核酸分子が接触させられる組成物は、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼだけでなく、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す（「エキソ＋」ポリメラーゼ）低濃度の第二のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは熱安定性修復型ポリメラーゼ、またはｐｏｌＣαサブユニット）もまた、濃度約０．０００２〜２００単位／ミリリットル、好ましくは約０．００２〜１００単位／ｍＬ、より好ましくは約０．００２〜２０単位／ｍＬ、さらにより好ましくは約０．００２〜２．０単位／ｍＬ、および非常に好ましくは濃度約０．４０単位／ｍＬにて含む。本方法での使用のために好ましいエキソ＋ポリメラーゼは、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ） ＰｏｌＣ、Ｐｆｕ／ＤＥＥＰＶＥＮＴまたはＴｌｉ／ＮＥＮＴ？ （バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）； 米国特許第５，４３６，１４９号明細書、参照により本開示に含まれる）；サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種由来熱安定性ポリメラーゼ、たとえばＴｍａ Ｐｏｌ Ｉ （米国特許第 ５，５１２，４６２号明細書、参照により本開示に含まれる）； およびＴｎｅ（３’ｅｘｏ＋）といったサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ neapolitana）から単離されたある種の熱安定性ポリメラーゼおよびその変異体である。サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＰｏｌＣ産物もまた好ましい。本方法で修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを第二のポリメラーゼと併用することによって、長さ少なくとも３５〜１００キロベースのＤＮＡ配列が、顕著に改善した信頼性で、高濃度まで増幅されうる。
【０１５１】
ロングレンジＰＣＲの考察については、たとえば、明示的に参照により本開示に含まれる、デイビーズ（Ｄａｖｉｅｓ）他，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２； １８７：５１−５を参照。
【０１５２】
好ましくは、本発明の増幅方法は、２修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの安定剤の使用を含む。安定剤は好ましくは増幅反応混合物中に含まれ、および、これらの反応混合物中での修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの熱安定性を高める。
【０１５３】
本発明の増幅反応混合物は、最大２５％の共溶媒（反応混合物に添加されるすべての共溶媒の合計）、最大５％のクラウディング剤（反応混合物に添加されるすべてのクラウディング剤の合計）および最大２Ｍのオキサイド（反応混合物に添加されるすべてのオキサイドの合計）を含みうる。
【０１５４】
特に好ましい一実施形態では、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための増幅反応混合物は、ＴＡＰＳ−トリス（２０ｍＭ，ｐＨ８．７）、 ２５ｍＭ Ｋ2ＳＯ4，１０ｍＭ ＮＨ4（ＯＡｃ）2，１５μｍｏｌ ＺｎＳＯ4，および ４ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む。
【０１５５】
別の特に好ましい一実施形態では、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための増幅反応混合物は、ＨＥＰＥＳ−Ｂｉｓ−トリス−プロパン（２０ｍＭ，ｐＨ７．５）、０．５μｍｏｌ ＺｎＣｌ2またはＺｎ（ＯＡｃ）2，および ６ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含む。
【０１５６】
一つ以上の高温変性段階が８９℃未満で実施される一実施形態では、熱サイクル増幅法は、熱サイクル増幅反応混合物中でのヘリカーゼの使用、および好ましくは細菌ｄｎａＢ遺伝子にコードされるヘリカーゼを含む。ヘリカーゼは、好ましくは、８９℃以上の一つ以上の変性段階を含む熱サイクル増幅方法では使用されない。
【０１５７】
一実施形態では、ここでの核酸複製方法は、ＡＴＰを欠く核酸複製混合物の使用を含む。
【０１５８】
一実施形態では、ここでの核酸複製方法は、ＳＳＢを欠く核酸複製混合物の使用を含み、ＳＳＢは複製反応混合物中に存在するならば、複製反応混合物中に用いられる特定の最小機能性Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する。
安定剤
【０１５９】
好ましくは、少なくとも２種類、およびより好ましくは少なくとも３種類の安定剤の組み合わせが、熱サイクル増幅反応混合物中に含まれる。好ましい実施形態では、安定剤は、たとえばポリオール（たとえばグリセロール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール）といった少なくとも一つの共溶媒、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、ポリビニルアルコールまたはポリプロピレングリコールといった少なくとも一つのクラウディング剤、および、糖、有機第四アミンたとえばベタイン、およびそのＮ−オキサイド、および界面活性剤から成る群から選択される第３の成分を含む。特に好ましい実施形態では、安定剤は、共溶媒、クラウディング剤、および第四アミンＮ−オキサイド、たとえばトリメチルアミン−Ｎ−オキサイド（ＴＭＮＯ）またはモルホリノ−Ｎ−オキサイドを含む。さらに好ましい実施形態では、反応混合物はさらに、第４の安定剤、非常に好ましくは第２のポリオールを含む。他の好ましい４種類の安定剤の組み合わせは、３種類の異なる共溶媒、および一つの第四アミンＮ−オキサイドを含む。
【０１６０】
高温変性段階を用いる核酸複製反応は、反応混合物に一つ以上の安定剤を含めることで利益を受けうる。本発明に従って好ましい安定剤は、ポリオールといった共溶媒およびポリエチレングリコールといったクラウディング剤を、典型的には一つ以上のオキサイド、糖、界面活性剤、ベタインおよび／または塩と共に含む。前記の成分の組み合わせが非常に好ましい。
【０１６１】
ここでは、「クラウディング高分子剤」または「クラウディング剤」とは、タンパク質凝集を少なくとも部分的に模倣する高分子をいう。本発明における使用のためのクラウディング剤の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＶＰ、フィコール、およびプロピレングリコールを含む。
【０１６２】
ここでは、「界面活性剤」とは、水の表面張力を低下させる任意の物質をいい、および陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、および双性イオン性界面活性剤を含むがそれらに限定されない。本発明における使用のための界面活性剤の例は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、ＮＰ−４０およびツヴィッタージェント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３−１０を含む。
【０１６３】
ここでは、「ポリオール」とは多価アルコール、すなわち、３個以上の水酸基を含むアルコールをいう。３個の水酸基を有するもの（三価）はグリセロール類である；３個より多数を有するものは糖アルコールと呼ばれ、一般式ＣＨ2ＯＨ（ＣＨＯＨ）nＣＨ2ＯＨであり、ここでｎは２ないし５でありうる。
【表２】
【表３】
【０１６４】
本発明の実施形態は一般的に、温度を基礎とする核酸増幅を促進するためにＧｒｏｕｐｓＩ〜ＶＩＩ群（表２参照）から選択される少なくとも２種類、およびより好ましくは少なくとも３種類の異なる安定剤を組み合わせることを含む。本発明の好ましい実施形態は、ＩＩ群の少なくとも一つと、ＩＩＩ群の一つとの、増幅反応混合物内での組み合わせを含み、特にＩＩ群のものはグリセロールおよび／またはソルビトールである。特に好ましい組み合わせは、ＩＩ群の異なる２つの、ＩＩＩ群の１つおよびＶＩＩ群の１つとの組み合わせを含む。
核酸配列決定
【０１６５】
一態様では、本発明は、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む配列決定反応混合物中で核酸を配列決定反応に供することを含む、核酸、好ましくはＤＮＡを配列決定するための方法を提供する。
【０１６６】
好ましくは、使用する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、配列決定反応混合物中で３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
【０１６７】
したがって、ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、その高レベルの亜鉛非依存性３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のために、配列決定反応における使用には一般的に好ましくない。
【０１６８】
好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属の、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種の、ｄｎａＥαサブユニットを含む。
【０１６９】
特に、本発明に用いられるｄｎａＥαサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、一般的に３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができ、一方、εサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は一般的にそのような末端ジデオキシヌクレオチド除去の能力は無い。したがって、配列決定反応混合物中のεサブユニットによって与えられる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、一般的にここでの配列決定反応に有用である。さらに、望ましくないｄｎａＥαサブユニット３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、化学的方法（すなわち、緩衝液条件、より具体的には、Ｚｎ2+濃度およびｐＨ）によって、好ましくは低減または完全に阻害される。
【０１７０】
核酸分子は、文献に記載された手動または自動化配列決定法のうち任意のものに従って配列決定されうる。そのような方法は、ジデオキシ配列決定法（「サンガー配列決定」； 参照により本開示に含まれる、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ），Ｆ．，他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４：４４４−４４８ （１９７５）； サンガー（Ｓａｎｇｅｒ），Ｆ．，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７ （１９７７）； 米国特許第 ４，９６２，０２２ および ５，４９８，５２３号明細書）、 およびＰＣＲを基礎とする方法、およびより複雑なＰＣＲを基礎とする核酸フィンガープリント法、たとえばランダム増幅多形ＤＮＡ（「ＲＡＰＤ」）分析（ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ），Ｊ．Ｇ．Ｋ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（２２）：６５３１−６５３５，（１９９０）、参照により本開示に含まれる）、任意プライミングＰＣＲ （「ＡＰ−ＰＣＲ」）（ウェルシュ（Ｗｅｌｓｈ），Ｊ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（２４）：７２１３−７２１８，（１９９０）、参照により本開示に含まれる）、ＤＮＡ増幅フィンガープリント法（「ＤＡＦ」）（カエタノ−アノレス（Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ）他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：５５３−５５７，（１９９１）、参照により本開示に含まれる）、マイクロサテライトＰＣＲまたはマイクロサテライト領域ＤＮＡ指定増幅（「ＤＡＭＤ」） （ヒース（Ｈｅａｔｈ），Ｄ．Ｄ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（２４）： ５７８２−５７８５，（１９９３）、参照により本開示に含まれる）、および増幅断片長多形（「ＡＦＬＰ」）分析（ヴォス（Ｖｏｓ），Ｐ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３（２１）：４４０７−４４１４ （１９９５）；リン（Ｌｉｎ），Ｊ．Ｊ．，他，ＦＯＣＵＳ，１７（２）：６６−７０，（１９９５）、参照により本開示に含まれる）を含むがそれらに限定されない。
【０１７１】
配列決定すべき核酸分子が、配列決定反応混合物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと一旦接触させられると、配列決定反応は上記で開示されるプロトコルまたは本分野で公知であるその他に従って進行しうる。
【０１７２】
特に好ましい一実施形態では、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための配列決定反応混合物は、ＴＡＰＳ−トリス （２０ｍＭ，ｐＨ８．７）、 ２５ｍＭ Ｋ2ＳＯ4，１０ｍＭ ＮＨ4（ＯＡｃ）2，および １０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む。好ましくは、反応混合物は、αサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を制限するように亜鉛を欠く。
【０１７３】
別の特に好ましい一実施形態では、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための配列決定反応混合物は、ＨＥＰＥＳ−Ｂｉｓ−トリス−プロパン（２０ｍＭ，ｐＨ７．５）、および１０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含む。好ましくは、反応混合物は、αサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を制限するように亜鉛を欠く。
キット
【０１７４】
一態様では、本発明は、ここで開示される最小Ｐｏｌ ＩＩＩを利用する、核酸複製のためのキットを提供する。キットは、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。
【０１７５】
好ましい一実施形態では、核酸増幅キットは、緩衝液および安定剤、またはここに記載の通り安定剤を含む緩衝液を含む。安定剤は、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを用いる熱サイクル反応用のキットにおいて特に好ましい。
【０１７６】
本発明に記載の核酸配列決定キットは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼおよび好ましくはジデオキシヌクレオチド三リン酸を含む。配列決定キットは、ピロホスファターゼ、配列決定ゲルを処方するためのアガロースまたはポリアクリルアミド媒体といった、標準的な核酸配列決定プロトコルを実施するのに必要な別の試薬および化合物、および配列決定された核酸の検出に必要な他の成分をさらに含みうる（ＤＮＡ配列決定の方法を対象とする米国特許第４，９６２，０２０および５，４９８，５２３号明細書を参照）。
【０１７７】
核酸増幅キットは、好ましくは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼおよびｄＮＴＰを含む。増幅キットはさらに、標準的な核酸増幅プロトコルを実施するために必要な別の試薬および化合物を含みうる（ＰＣＲによるＤＮＡ増幅の方法を対象とする米国特許第４，６８３，１９５および４，６８３，２０２号明細書を参照；参照により本開示に含まれる）。
【０１７８】
一実施形態では、キットはＡＴＰを欠き、およびＡＴＰはキットによって提供される核酸複製反応で使用されない。
【０１７９】
別の好ましい実施形態では、本発明の核酸複製キットは、３−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第二のＤＮＡポリメラーゼをさらに含みうる。好ましいのは、Ｐｆｕ／ＤＥＥＰＶＥＮＴ、ＴｌｉＮＥＮＴ？、Ｔｍａ、Ｔｎｅ（３’エキソ＋）、およびその変異体および誘導体である。ＰｏｌＣもまた好ましい。
【０１８０】
本発明のキットは、情報パンフレットを含みうる。
ベクターおよび宿主細胞
【０１８１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子を含むベクター、およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチド分子のうち任意のものを、一般的に選択可能マーカーおよび複製開始点を含むベクターに含めることができる。ベクターはさらに、細菌分子またはウイルス分子に由来するもののような、適当な転写および／または翻訳調節配列を含む。そのような調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および適当な配列を含む。プロモーターヌクレオチド配列がコード配列の転写を導く場合、プロモーターヌクレオチド配列は、コードＤＮＡ配列に調節可能に結合している。
【０１８２】
本発明の標的ポリペプチドをコードするサブユニット分子のクローニングに適したベクターの選択は、ベクターで形質転換される宿主細胞、および、該当する場合には、標的ポリペプチドを発現すべき宿主細胞に依存する。適当な宿主細胞は上記で考察されているが、しかし原核生物、酵母、およびその他の類似の生物を含む。具体例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の細菌、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の仲間；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、およびクリベロマイセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母を含む。
【０１８３】
本発明の修飾αサブユニットは、融合タンパク質構造を生じるように、異種タンパク質またはペプチドをコードする配列と組み換えによって結合されうる。そのような異種タンパク質またはペプチドは、たとえば、精製の促進、分泌の増大、または安定性の上昇を可能にするように含められうる。たとえば、修飾αサブユニットがシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるように、シグナルペプチド（分泌リーダー）をコードする核酸配列が、修飾αサブユニット配列のフレーム内に融合されうる。
【０１８４】
特定のベクターへの挿入、特定の発現系または宿主での使いやすさ（たとえば、制限部位を修飾することによる）、などを促進するための、本発明の修飾α−サブユニットをコードするポリヌクレオチド分子の修飾が公知であり、および本発明における使用が考えられている。修飾α−サブユニットポリペプチドの産生のための遺伝工学法は、無細胞発現系で、細胞系で、宿主細胞で、組織で、および動物モデルでのポリヌクレオチド分子の発現を含む。
抗体
【０１８５】
本発明の新規のポリペプチド、およびその断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生じるのに使用されうる。好ましくは、修飾β−結合部位を含むペプチドが、抗体の調製に使用される。抗体の設計および産生のための方法は本分野で公知であり、たとえば、『抗体：実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびランド（Ｌａｎｄ）（編）、１９８８コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク；『モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物分析の新次元』（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ），ケネット（Ｋｅｎｎｅｔ）他（編）、１９８０ プレナム・プレス社（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨークを参照。
【０１８６】
本明細書で引用された文献は全体が明示的に参照により本開示に含まれる。
【実施例】
【０１８７】
実施例１：ＰＣＲ比較−変異対非変異２成分Ｐｏｌ ＩＩＩ系
【０１８８】
下記の実施例は、βサブユニットを、図４に開示される通り一つ以上の内部β−結合領域に少なくとも一つのアミノ酸変異を有するαサブユニットと組み合わせて含む、２成分Ｔｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系を用いて標的核酸を増幅する有用性を説明するために提供される。実験は、変異αサブユニットを含む２成分Ｔｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系を、非変異αサブユニットを含む２成分Ｔｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系に対して比較する。反応混合物は、２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｂｉｓ−トリスプロパンｐＨ７．５、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２００ｎＭヒトベータグロビン遺伝子プライマー混合物、５０ｎｇヒトゲノムＤＮＡテンプレート、表１に示される少なくとも一つの安定剤の組み合わせ、および修飾２成分組立物についてβサブユニット１、１．２５、１．５および１．７５ｕｇ、およびそれぞれ非修飾２成分ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ組立物についてβサブユニット１．６、２．０、２．４、２．８ｕｇを含む。図８に示す通り、反応当たりの修飾Ｔｔｈ Ｐｏｌ ＩＩＩポリメラーゼの量は非修飾Ｔｔｈ Ｐｏｌ ＩＩＩポリメラーゼの量より１．６倍低いにもかかわらず、修飾２成分ポリメラーゼを用いるすべての反応は、より多くの特異的ＰＣＲ産物を生じる。これは、修飾２成分Ｔｔｈ Ｐｏｌ ＩＩＩポリメラーゼのより良好な合成持続性および特異的活性を示す。
実施例２：ＰＣＲ比較−変異対非変異Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素系
【０１８９】
下記の実施例は、ここに開示される通り内部β−結合部位に変異を有するαサブユニットがＴｔＨ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素系に添加される場合の、非変異αサブユニットを含むＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素系と比較して、不利な増幅収量を説明するために提供される。反応混合物は、２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｂｉｓ−トリスプロパンｐＨ７．５、２００μＭ ｄＮＴＰｓ，２００ ｎＭ Ｕｎｉ−ｏｒｉ プライマー混合物、ＰＢＳプラスミドＤＮＡテンプレート１ｎｇ、表２および３に示される少なくとも一つの安定剤の組み合わせ、βサブユニット２〜５ｍｇ／ｍＬ、δサブユニット０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ、δ’サブユニット０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ、およびＤＮＡＸ複合体（γサブユニット＋Ｔサブユニット）０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬを含む。変異および非変異ＴｔＨ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素系の両方で、対応するαサブユニットは、反応混合物濃度２〜５ ｍｇ／ｍＬを有する。最終反応容量５０μＬが得られる。反応は９５℃ないし４℃の範囲の複数の温度サイクルに曝露される。
【０１９０】
より高い増幅産物収量が、非変異αサブユニットを含むＰｏｌ ＩＩＩホロ酵素系について得られる。
実施例３：伸長速度比較−変異対非変異２成分Ｐｏｌ ＩＩＩ系
【０１９１】
２種類の２成分ＴｔＨ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系の伸長速度が、プライミングされた一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（７．２ｋｂ）をテンプレートとして用いる複製検定法で比較された。第一の２成分系は、ここで開示される通り内部β−結合部位に変異を有するαサブユニットを含む；第二の系は、非変異αサブユニットを含む。この検定法では、各系が７．２ｋｂ長一本鎖テンプレートＤＮＡの複製を完了する時点が測定される。塩基数でのテンプレートサイズを、複製を完了するのに要した秒での反応時間で割って、２成分ＴｔＨ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系の伸長速度を与える。反応混合物は、反応緩衝液、ｄＮＴＰｓ、プライミングされたＭ１３ＤＮＡテンプレート、およびＴｔｈβサブユニット２〜５ｍｇ／ｍＬを含む。各反応混合物は、対応するαサブユニット２〜５ ｍｇ／ｍＬを含む。
【０１９２】
より速い伸長速度が、変異αサブユニットを含む２成分ＴｔＨ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系によって示される。
実施例４：２成分Ｐｏｌ ＩＩＩ増幅比較（合成α対変異合成α）
【０１９３】
精製Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩベータサブユニットとの組み合わせで、精製非変異未変化Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩアルファサブユニット（Ｔｔｈ ｎＤｎａＥ）が、精製変異Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼＩＩＩアルファサブユニット（ＴｔｈｍｕＤｎａＥ）と比較された。この一連の実験では、ベータサブユニット（β）の濃度は８１５ｎｇ／反応にて一定に保たれた一方、２つのアルファサブユニット（α）の２濃度（２５０ｎｇ／反応および１２５ｎｇ／反応）が試験された。２つの標的、３ｋｂ ｐＢＳ２および ５ｋｂラムダは、温度サイクル増幅プロトコルを用いて増幅された。反応混合物およびサイクル条件は下記の通り設定された：
【０１９４】
ｐＢＳ２反応
【０１９５】
５ｋｂラムダ反応
【０１９６】
図５および６で見られる通り、変異合成アルファ／ベータの組み合わせは、３ｋｂ ｐＢＳ２および５ｋｂラムダ標的の両方について、合成アルファ／ベータの組み合わせよりも多くの増幅産物を生じた。
実施例５：２成分Ｐｏｌ ＩＩＩ伸長速度比較（合成α対変異合成α）
【０１９７】
この実験では、２成分Ｐｏｌ ＩＩＩ系内での合成アルファおよび変異合成アルファの比較が行われた。２種類のアルファは、ベータと組み合わせた際の、５ｋｂラムダ単位複製配列を生じる能力について試験された。すべての場合で、ベータ対アルファタンパク質濃度比は４：１であった。反応およびサイクル条件は下記の通り設定された：
【０１９８】
反応混合物は、４０秒または７０秒のどちらかの伸長時間でサイクルされた。図７に見られる通り、合成アルファ／ベータおよび変異合成アルファ／ベータの組み合わせの両方が、完全な５ｋｂ単位複製配列を伸長時間７０秒で生じた。しかし、変異合成アルファ／ベータの組み合わせだけが、５ｋｂ単位複製配列を伸長時間４０秒で生じた。
【０１９９】
本明細書でのすべての引用は全体が参照により本開示に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図１は、グラム陰性細菌由来のさまざまなＤＮＡポリメラーゼＩＩＩアルファサブユニット（ＤｎａＥ）について内部βサブユニット−結合部位配列の整列を示す。ＤｎａＥのカルボキシ末端に位置する第二のβ−結合部位配列（β／τ−結合部位）は示されていない。
【図２】図２は、ここで記載の通り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＴｔｈにおけるへリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合領域およびＯＢ折りたたみ領域、およびベータ−結合部位との関係を示す。
【図３】図３は、Ｔｍａにおけるへリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合領域およびＯＢ折りたたみ領域、およびベータ−結合領域との関係を示す。
【図４】図４は、本発明に記載の修飾Ｔｔｈアルファサブユニットのアミノ酸配列に対して、Ｔｔｈアルファサブユニットの野生型Ｃ−末端アミノ酸配列を比較する。
【図５】図５は、ＤＮＡ増幅における修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼおよびＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについての結果比較を示す。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは合成トリプル変異体αと呼ばれる。
【図６】図６は、ＤＮＡ増幅における修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼおよびＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについての結果比較を示す。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは合成トリプル変異体αと呼ばれる。
【図７】図７は、ＤＮＡ増幅における修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼおよびＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについての結果比較を示す。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは変異体αと呼ばれる。
【図８】図８は、ＤＮＡ増幅においてＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと比較した、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを用いて得られる合成持続性および産物収量の改善を示す。
【図９】図９は、ＤＮＡ増幅においてＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと比較した、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを用いて得られる熱安定性の改善を示す。
【図１０】図１０は、ＤＮＡ増幅においてＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと比較した、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを用いて得られる熱安定性の改善を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ、そのβ−サブユニット結合モチーフ、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとのβサブユニット結合を変化させる修飾、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ活性および熱安定性を変化させる修飾，および核酸分子の持続性酵素的複製および増幅に関する。
関連特許
【０００２】
本明細書は、全体が明示的に参照により本開示に含まれる２００５年４月７日出願の米国特許出願公開第１１／１０１，９７７号明細書の一部継続出願である。本明細書はまた、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下に、２００５年１１月２９日出願の米国仮出願第６０／７４１，００９号明細書の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼは、核酸配列決定、核酸定量（リアルタイムＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ）、核酸増幅（ＰＣＲ、ＲＤＡ、ＳＤＡ）、およびｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写を含むがそれらに限定されない、分子生物学におけるいくつかの用途を有する。
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素（「Ｐｏｌ ＩＩＩ」）は、コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）によって最初に精製され、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体の主なレプリカーゼと決定された（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，『ＤＮＡ複製補遺１９８２』（１９８２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ），フリーマン・パフリケーションズ社（Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ），サンフランシスコ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐｐ １２２−１２５，参照により本開示に含まれる）。該ホロ酵素は、３つの別々の機能成分を形成する１０種類の異なるサブユニットから成る（マクヘンリー（ＭｃＨｅｎｒｙ）他，Ｊ．Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．，２５２：６４７８−６４８４（１９７７）；マキ（Ｍａｋｉ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：６５５１−６５５９（１９８８）、それぞれ参照により本開示に含まれる）。３つの機能成分は、（ｉ）「コア」（すなわちポリメラーゼ）、（ｉｉ）β複合体（すなわちスライディングクランプ）、および（ＩＩＩ）γ複合体（すなわちクランプローダー）である。「コア」内には３つのサブユニットが存在する：αサブユニット（ｄｎａＥにコードされる）はＤＮＡポリメラーゼ活性を有する触媒サブユニットに相当する；εサブユニット（ｄｎａＱ、ｍｕｔＤにコードされる）はプルーフリーディング３’−５’エキソヌクレアーゼである（ショイエルマン（Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ），他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１ ：７７４７−７７５１（１９８４）；およびディフランシスコ（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：５５６７−５５７３（１９８４）、それぞれ参照により本開示に含まれる）、およびθサブユニット（ｈｏｌＥにコードされる）はεを刺激する（スタッドウェル−ヴァーガン（Ｓｔｕｄｗｅｌｌ−Ｖａｕｇｈａｎ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１１７８５−１１７９１（１９９３）、参照により本開示に含まれる）。αサブユニットはεと密な１：１複合体を形成し（マキ（Ｍａｋｉ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１２９８７−１２９９２（１９８５）参照により本開示に含まれる）、およびθはεと１：１複合体を形成する（Ｓｔｕｄｗｅｌｌ−Ｖａｕｇｈａｎ 他，前掲）。
【０００５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ｓｓＤＮＡ結合タンパク質（「ＳＳＢ」）で被覆された独特にプライミングされたバクテリオファージ一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）ゲノムを、３０℃にて少なくとも毎秒５００ヌクレオチドの速度で、５ｋｂ環状ＤＮＡから一度も解離せずに、非常に効率的におよび完全に複製する（フェイ（Ｆａｙ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：９７６−９８３（１９８１）；オドネル（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１２８８４−１２８８９（１９８５）；およびモク（Ｍｏｋ），他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１６６４４−１６６５４（１９８７）、それぞれ参照により本開示に含まれる）。さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼはＤＮＡ複製において高い信頼性を示す。
【０００６】
好熱性細菌を含むいくつかのグラム陰性およびグラム陽性細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼが記載されており（たとえば、ブラード（Ｂｕｌｌａｒｄ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１３４０１−１３４０８，２００２； およびブルック（Ｂｒｕｃｋ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１７３３４−１７３４８，２００２を参照； それぞれ参照により本開示に含まれる）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩに見られる３成分構成を示す。たとえばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）では、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは（ｉ）ｐｏｌＣ遺伝子にコードされるαサブユニット（イプシロンおよびシータサブユニットを含まない）、（ｉｉ）β−スライディングクランプ、および（ＩＩＩ）τ／δ／δ’複合体（すなわち、クランプローダー）から成る（ブルック（Ｂｒｕｃｋ）Ｉ，オドネル（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ）Ｍ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ｓｅｐ １５；２７５（３７）：２８９７１−８３，参照により本開示に含まれる）。
【０００７】
文献は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の３つの主要な機能成分、すなわち、ポリメラーゼコア（αサブユニットを含む）、合成持続性クランプ、およびクランプローダーが、ゲノムレプリカーゼに特徴的な速い伸長速度および低いエラー率を有する機能する持続性ＤＮＡレプリカーゼに必要であると一致して教示している。（たとえば、米国特許第６，５５５，３４９； ６，２２１，６４２； ５，６６８，００４； ５，５８３，０２６； ６，６７７，１４６； および ６，２３８，９０５号明細書を参照；またオドネル（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ），Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１４：１０５−１１１，１９９２； オドネル（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ） 他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：１２８７５−１２８８３，１９８５； マクヘンリー（ＭｃＨｅｎｒｙ），Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：１１５７−１１６５，２００３； マクヘンリー（ＭｃＨｅｎｒｙ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１９１２７−１９１３０，１９９１； スタッドウェル（Ｓｔｕｄｗｅｌｌ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１１７１−１１７８，１９９０； ブラード（Ｂｕｌｌａｒｄ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１３４０１−１３４０８，２００２； およびブルック（Ｂｒｕｃｋ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１７３３４−１７３４８，２００２を参照；それぞれ参照により本開示に含まれる）。コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）他による大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩに関する原報は、単離αサブユニットおよび単離コアポリメラーゼのポリメラーゼ活性は「ギャップ埋め」検定法を用いて非常に高い酵素濃度でしか測定できず、および最大伸長速度２０ｂ／ｓｅｃしか生じなかったことを最初に示した。この非持続性の低速合成、およびそれを達成するために必要な高いタンパク質濃度は、分子生物学用途における単離αサブユニットまたはＤＮＡポリメラーゼコア部分構築物の使用を不可能にする。さまざまな細菌に由来するＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩに関するより多数の近年の報告は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のαサブユニットもコア複合体も単独では、速い伸長速度を有する持続性モードで機能できず、ホロ酵素の３成分部分構築物が必要であるという定説をさらに強固にしている。たとえば、ブルック（Ｂｒｕｃｋ）他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５： ２８９７１− ２８９８３，２０００，参照により本開示に含まれる）は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｐｏｌ ＩＩＩのアルファサブユニット（ｐｏｌＣ）は単独ではＤＮＡポリメラーゼとして機能しないことを報告しており、一方、ブラード（Ｂｕｌｌａｒｄ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１３４０１−１３４０８，２００２，およびブルック（Ｂｒｕｃｋ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：１７３３４−１７３４８，２００２（それぞれ参照により本開示に含まれる）はそれぞれ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）においてレプリカーゼ活性にＰｏｌ ＩＩＩの３成分が必要であることを報告している。
【０００８】
ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼの合成持続性は、ホロ酵素中のＤＮＡポリメラーゼコア（アルファ、イプシロン、シータ）とのβ−スライディングクランプ結合に由来し、およびＤＮＡ上のＤＮＡポリメラーゼコアとのβ−スライディングクランプ結合はクランプローダーを必要とすると考えられており、したがって３成分説である。βサブユニットはＤＮＡを取り囲む２量体を形成し、およびそれによって、結合したコアポリメラーゼをそのＤＮＡ基質へ繋ぐ。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ アルファ （Ｅｃｏ ＤｎａＥ）中の２ヶ所が、β−スライディングクランプと結合すると報告されている。第一は、上流がへリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合領域とおよび下流がＯＢ折りたたみ領域と隣接している残基９２０−９２４（ＱＡＤＭＦ）の間に位置する内部結合部位である。他のβ−サブユニット結合タンパク質の調査は、共通β−サブユニット結合モチーフＱＬ（Ｓ／Ｄ）ＬＦを示唆している。第二のモチーフは、配列ＱＶＥＬＥＦを有し、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤｎａＥのカルボキシ末端に残基１１５４と１１５９の間に位置する。このカルボキシ末端モチーフはまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）τサブユニットとの高い親和性を示す。ロペズ（Ｌｏｐｅｚ）他，ＰＮＡＳ １００： １４６８９− １４６９４，２００３； ドーマン（Ｄｏｈｒｍａｎ）他，ＪＭＢ ３０８，２２８−２３９，２００５； ダルリンプル（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ）他，ＰＮＡＳ ９８：１１６２７−１１６３２，２００１； キム（Ｋｉｍ）他，ＪＢＣ ２７１：２０６９９−２０７０４，１９９６を参照（それぞれ参照により本開示に含まれる）。
【０００９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＥ中のβ−サブユニット結合部位（「β−結合部位」）の欠失および変異分析は、どちらの配列も離散性ポリメラーゼ（ギャップ埋め）活性に必要でない一方、内部部位は効率的なβ−サブユニット結合活性（「β−結合活性」）におよびホロ酵素の持続性ポリメラーゼ活性に必要であることを示している。ドーマン（Ｄｏｈｒｍａｎ）他，ＪＭＢ ３０８，２２８−２３９，２００５を参照 （参照として本開示に含まれる）。カルボキシ末端モチーフは、対照的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでβサブユニットへの結合に、またはホロ酵素の持続性ポリメラーゼ活性に必要でないことが示された。にもかかわらず、該モチーフにおける変異は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体においてＤｎａＥα変異体を補完するサブユニットの能力を、おそらくτとの結合における妨害のために、部分的に損なうことが見出された。加えて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）共通配列ＱＬＤＬＦでの内部配列ＱＡＤＭＦの置換は、βに対する親和性が大幅に上昇したαポリメラーゼサブユニットを生じた。対照的に、同じ共通配列でのカルボキシ末端モチーフの置換は、βサブユニットに対する親和性がわずかに上昇したが、τサブユニットに対する結合親和性が４００倍低いαサブユニットを生じた。内部共通配列を有する変異体αサブユニットはβに対して大幅に上昇した親和性をｉｎ ｖｉｔｒｏで示したが、その特異的ポリメラーゼ活性、伸長速度および合成持続性は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素に組み込まれた際、野生型αサブユニットのものより大きくなかった。カルボキシ末端にβ結合共通配列を有する第二の変異体αサブユニットは、ベータに対してわずかに高い親和性を示したものであるが、同じくｉｎ ｖｉｔｒｏ複製検定法において特異的活性、合成持続性および伸長速度に改善を何ら示さなかった。したがって、当業者は、β−結合部位の親和性を高める変異はｉｎ ｖｉｔｒｏで野生型酵素に対する変異ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素ＩＩＩの性能を改善しないことを教示される。
【００１０】
これらの結果は、持続性ＤＮＡ複製に対するカルボキシ末端モチーフの、非常に限られた、必須でない寄与を示唆する。しかし、αのカルボキシ末端への結合についてのτとβの間の競合は、ＤＮＡ合成のモードを調節するのに関与すると仮説が立てられている。特に、αのカルボキシ末端でのτによるβの置換は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素がニックに遭遇する際の持続性合成の中断を媒介すると示唆されている。加えて、βサブユニット相互作用とＤＮＡ結合の間の関連が示唆されている。特に、内部部位は２個の潜在的ＤＮＡ結合配列と隣接しており、ＤＮＡへのαサブユニット結合がβサブユニット結合に、およびその逆に影響しうると示唆する。したがって、カルボキシ末端ベータ結合モチーフの親和性における変化は、持続性ＤＮＡ複製の最中および完了後にそれぞれ、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素分解の正確な組立に影響しうる。
【００１１】
Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの組立および機能は、成分サブユニットの互いへの親和性に依存するように見え、および同一サブユニット部位への結合についてのある程度の競合が関与する。たとえば、クランプローダー複合体（デルタサブユニット）およびαサブユニットはβスライディングクランプの同一のポケットに結合する一方、τおよびβサブユニットはαのカルボキシ末端部位について競合するように見える。加えて、ＤＮＡ修復および複製に関与する他の酵素、たとえばＤＮＡリガーゼ、ＭｕｔＳ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩおよびＩＶもまた、ベータ上の同一の疎水性ポケットとの結合についてアルファサブユニットと競合する。結合部位変異およびサブユニット親和性における変化は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ組立および機能に対して有害と立証される可能性があり、および現在までに試験された変異体は、ホロ酵素活性を損なったのみであることがわかっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
以前に報告された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤｎａＥにおけるβ−結合部位の欠失および変異分析が、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素作用の機構に光を投じている一方、組み換えＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼの合理的設計においてβ−結合部位修飾に関して容易に明らかな有用性は無く、なぜなら修飾はホロ酵素の完全性および持続性活性を損なうだけであるように見えていたためである。加えて、修復型ポリメラーゼはＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで支持するよりもはるかに高い塩濃度を必要とすることを考慮すると、修復型ポリメラーゼとのβ−スライディングクランプの併用は不可能であった。全体的に、Ｐｏｌ ＩＩＩ αサブユニット中のβ−結合部位の同定および分析は、ＰＣＲ用途においてより高い合成持続性、特異的活性および熱安定性を有する組み換えＤＮＡポリメラーゼの設計に用途を見出していない。
【００１３】
以前の報告とは対照的に、同時係属の米国特許出願公開第１１／１０１，９７７号明細書は、細菌ｄｎａＥにコードされるおよびｐｏｌＣにコードされるαサブユニット、およびそれを含むコアポリメラーゼは、単独でおよびβ−スライディングクランプとの組み合わせで、最小の機能性ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとして適当な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏにて機能しうることを確証する。そのような単一成分（αまたはコア単独）および２成分（αまたはコア、加えてβ−スライディングクランプ）Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、Ｐｏｌ ＩＩＩクランプローダーを欠く。したがって、さまざまなＰｏｌ ＩＩＩホロ酵素サブユニットのベータ結合についての競合する相互作用は、機能性２成分ポリメラーゼホロ酵素を組み立てるには無関係である。
【００１４】
本発明は、そのような２成分ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ組成物では、βサブユニットに対する親和性を高めるためおよびレプリカーゼの合成持続性を高めるために、変異がαサブユニット成分の一つ以上のβ−結合モチーフへ導入されうるという別の発見から始まる。これは、βサブユニットに対する単離αサブユニットの親和性をｉｎ ｖｉｔｒｏで高める変異はホロ酵素活性に対応する上昇を生じていない、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ ホロ酵素に関する報告と対照的である。加えて、ここで実証される通り、本２成分ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにおけるアルファサブユニットへのベータのより密な結合は、ＰＣＲといった高温ストレスを伴う用途における、複合体の熱安定性を改善する。したがって、β−結合部位の操作は、２成分ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼに新しく関連して有用性を見出している。
【００１５】
本発明のアルファサブユニットは、ここで記載される通り現存のβ−結合部位の修飾によって得られ、ここでは「修飾αサブユニット」と呼ばれる。本発明の２成分ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、そのような修飾αサブユニットを含み、「修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ」と呼ばれる。
【００１６】
ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、修飾αサブユニットを含む第一の成分を含む。一部の好ましい実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一の成分は、本質的に修飾αサブユニットから成る。一部の好ましい実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一の成分は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのコアポリメラーゼ複合体の一つ以上の別のサブユニットを含む。しかし、ここで開示されるすべての修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼはクランプローダーを欠く。
【００１７】
ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼはまた、第二の成分を含む。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第二の成分は、本質的に合成持続性クランプから成る。好ましい一実施形態では、合成持続性クランプは、本質的にＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩβサブユニットから成る。
【００１８】
ここで用いられる修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ここで定義される通りの機能性レプリカーゼである。
【００１９】
修飾αサブユニットは、好ましくは、グラム陰性細菌のｄｎａＥにコードされるαサブユニット、またはグラム陽性細菌のｐｏｌＣにコードされるαサブユニットに由来する。好ましい修飾αサブユニットは、非中温性細菌、好ましくは好極限性菌に由来するものを含む。本発明における使用に特に好ましいのは、好熱菌に由来する修飾αサブユニットである。驚くべきことに、好熱菌に由来する修飾αサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、適当な条件下では、反復ＤＮＡ複製反応を温度サイクルモードで維持するための、熱安定性の向上を示し、二本鎖ＤＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増幅に繋がる。好熱菌に由来する修飾αサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ここでは「熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ」と呼ばれる。
【００２０】
一態様では、本発明は、対応する野生型αサブユニットとは異なるβ−結合部位を含む、修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットおよびｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを対象とする。２つのβ−結合部位が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤｎａＥで以前に同定されており、および１つのβ−結合部位がグラム陽性細菌のＰｏｌＣαサブユニットについて提案されている。グラム陽性細菌のＰｏｌＣαサブユニットに存在する新規の第二のβ−結合部位の同定がここで開示される。この新規のベータ結合部位は、ＰｏｌＣアルファサブユニット中のへリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合領域から上流に位置する。以前に同定された部位、およびここで開示される新規のβ−結合部位は、修飾αサブユニットを、およびそのようにして本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一の成分を生じるために操作されうる。
【００２１】
修飾αサブユニットのβ−結合部位は、その野生型対応物と、配列に基づいて識別可能である。異なるβ−結合部位は、２成分Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ組成物で示される通り、修飾αサブユニットに、対応する野生型αサブユニットのものとは異なるβ−結合活性を与える。本発明の修飾αサブユニットをコードする核酸もまた提供される。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、一つ以上の変異一つ以上のβ−結合部位を含む修飾αサブユニットを提供する。好ましい一実施形態では、変異β−結合部位は、本質的に、ＧＭＭＧＬＦＳ，ＱＥＡＶＰＦ，ＧＬＶＧＬＦＡ，ＥＥＶＶＰＦ，ＧＡＬＤＡＦＧ，ＴＱＮＳＬＦＧ，ＧＶＫＶＩＩ，ＧＡＦＤＦＴ，（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＬＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ），（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＱＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ），（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＮＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ），ＱＬ（Ｇ／Ａ／Ｌ）Ｌ（Ｐ／Ａ／Ｇ）Ｆ，Ｇ（Ｌ／Ａ）（Ｌ／Ａ）（Ｇ／Ａ）ＬＦＧの群から選択される配列を含むかまたはそれから成る。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、グラム陽性細菌のｐｏｌＣにコードされるαサブユニットのβ−結合部位に一つ以上の変異を含む修飾αサブユニットを提供する。好ましい一実施形態では、一つ以上の変異は、グラム陰性細菌由来のｄｎａＥにコードされるαサブユニットの内部β−結合部位に存在する。別の一実施形態では、一つ以上の変異は、グラム陰性細菌由来のｄｎａＥにコードされるαサブユニットのカルボキシ末端β−結合部位に存在する。好ましい一実施形態では、修飾αサブユニットは、グラム陰性細菌由来のＤｎａＥの、カルボキシ末端β−結合部位に一つ以上の変異、および内部β−結合部位に一つ以上の変異を有する。変異は同一または別々でありうる。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、グラム陽性細菌のｐｏｌＣにコードされるαサブユニットのβ−結合部位に一つ以上の変異を含む修飾αサブユニットを提供する。一実施形態では、一つ以上の変異は、ＰｏｌＣのカルボキシ末端β−結合部位に存在する。別の一実施形態では、一つ以上の変異は、ここに記載のＰｏｌＣの内部β−結合部位に存在する。別の一実施形態では、一つ以上の変異は、ＰｏｌＣの内部β−結合部位およびカルボキシ末端β−結合部位の両方に存在する。変異は同一または別々でありうる。
【００２５】
一態様では、本発明は、ここで開示される修飾αサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを対象とする。
【００２６】
一態様では、本発明は、組成物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの使用、および、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定といったＤＮＡ増幅の方法を含む核酸複製のための方法を対象とする。
【００２７】
したがって、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む複製反応混合物中で核酸分子を複製反応に供することを含む、核酸分子を複製するための方法がここで提供される。
【００２８】
好ましい一実施形態では、複製される核酸分子はＤＮＡ分子である。さらに好ましい一実施形態では、ＤＮＡ分子は二本鎖である。他の実施形態では、ＤＮＡ分子は一本鎖である。さらに好ましい一実施形態では、二本鎖ＤＮＡ分子は直鎖ＤＮＡ分子である。他の実施形態では、ＤＮＡ分子は非直鎖、たとえば環状またはスーパーコイルＤＮＡである。
【００２９】
好ましい一実施形態では、核酸分子を複製するための方法は、核酸分子、好ましくはＤＮＡを配列決定するのに有用な配列決定法である。好ましい一実施形態では、方法は、配列決定反応混合物中で核酸分子を配列決定反応に供することを含む。配列決定反応混合物は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、配列決定反応混合物中で３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、 サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する、修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。
【００３０】
別の好ましい一実施形態では、核酸分子を複製するための方法は、核酸分子、好ましくはＤＮＡを増幅するのに有用な増幅法である。好ましい一実施形態では、方法は、増幅反応混合物中で核酸分子を増幅反応に供することを含む。増幅反応混合物は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、増幅反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００３１】
好ましい一実施形態では、増幅法は、温度サイクルモードで好ましくは二本鎖である核酸分子、好ましくはＤＮＡを増幅するのに有用な、熱サイクル増幅法である。好ましい一実施形態では、方法は、熱サイクル増幅反応混合物中で核酸分子を熱サイクル増幅反応に供することを含む。熱サイクル増幅反応混合物は、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、熱サイクル増幅反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属に、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する、修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応混合物はさらに、ここで開示される通り、熱安定剤を含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属に、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応混合物はさらに、ここで開示される通り、ＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００３２】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅法は、好ましくは二本鎖である、核酸分子、好ましくはＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅するのに有用なＰＣＲ法である。好ましい一実施形態では、方法は、ＰＣＲ反応混合物中で核酸分子をＰＣＲに供することを含む。好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ＰＣＲ反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、熱安定剤を含む。さらに好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、ＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００３３】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲ法は迅速ＰＣＲ法である。好ましい一実施形態では、方法は、迅速ＰＣＲ反応混合物中で核酸分子を迅速ＰＣＲに供することを含む。迅速ＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは，熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、迅速ＰＣＲ反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。好ましい一実施形態では、迅速ＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、熱安定剤を含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、迅速ＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、ＤＮＡ不安定化剤を含む。迅速ＰＣＲ法は、好ましくは、変性のための第一の温度、およびプライマーアニーリングおよびプライマー伸長の両方のための第二の温度を用いる、反復２温度サイクルから成る２段階ＰＣＲ法である。
【００３４】
別の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ法はロングレンジＰＣＲ法である。好ましい一実施形態では、方法は、ロングレンジＰＣＲ反応混合物中で核酸分子をロングレンジＰＣＲに供することを含む。ロングレンジＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ロングレンジＰＣＲ反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましい一実施形態では、ロングレンジＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、熱安定剤を含む。さらに好ましい一実施形態では、ロングレンジＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される通り、ＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００３５】
一実施形態では、ここで複製反応に用いられるプライマーはＤＮＡである。別の一実施形態では、複製反応に用いられるプライマーはＲＮＡである。
【００３６】
一態様では、本発明は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む、核酸複製のための複製反応混合物を提供する。本発明の好ましい複製反応混合物は、ＤＮＡ複製に有用である。複製反応混合物は、テンプレート核酸およびプライマーを含む荷電反応混合物を含むがそれらに限定されない。複製反応混合物はまた、テンプレートの複製を与えるために、テンプレート核酸および／またはプライマーの添加、および随意的に希釈を必要とする、前反応混合物を含む。
【００３７】
好ましい一実施形態では、複製反応混合物は、核酸配列決定、好ましくはＤＮＡ配列決定に有用な配列決定反応混合物である。配列決定反応混合物は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、配列決定反応混合物中で３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去できる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。
【００３８】
別の好ましい一実施形態では、複製反応混合物は、核酸増幅、好ましくはＤＮＡ増幅に有用な増幅反応混合物である。増幅反応混合物は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、増幅反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００３９】
好ましい一実施形態では、増幅反応混合物は、温度サイクルモードで好ましくは二本鎖である核酸、好ましくはＤＮＡを増幅するのに有用な、熱サイクル増幅反応混合物である。好ましくは、熱サイクル増幅反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、熱サイクル増幅反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属に、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、 サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは、熱サイクル増幅反応混合物はさらに、ここで開示される熱安定剤を含む。好ましくは、熱サイクル増幅反応混合物はまた、ここで開示されるＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００４０】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応混合物は、好ましくは二本鎖である、核酸、好ましくはＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅するのに有用なＰＣＲ反応混合物である。ＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ＰＣＲ反応混合物中で３−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは、ＰＣＲ混合物はさらに、ここで開示される熱安定剤を含む。好ましくは、ＰＣＲ反応混合物はまた、ここで開示されるＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００４１】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応混合物は、迅速ＰＣＲ法に有用な迅速ＰＣＲ反応混合物である。迅速ＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、迅速ＰＣＲ反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは、迅速ＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される熱安定剤を含む。好ましくは、迅速ＰＣＲ反応混合物はまた、ここで開示されるＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００４２】
別の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応混合物は、ロングレンジＰＣＲ法に有用なロングレンジＰＣＲ反応混合物である。ロングレンジＰＣＲ反応混合物は、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、ロングレンジＰＣＲ反応混合物中で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、 サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは、ロングレンジＰＣＲ反応混合物はさらに、ここで開示される熱安定剤を含む。好ましくは、ロングレンジＰＣＲ反応混合物はまた、ここで開示されるＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００４３】
好ましい一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物は、反応混合物またはそれに由来する荷電反応混合物が、ハイブリダイズしたプライマーを毎秒１００塩基より大、より好ましくは１５０より大、より好ましくは２００より大、より好ましくは２５０より大、より好ましくは３００より大、より好ましくは３５０より大、より好ましくは４００より大、より好ましくは４５０より大、より好ましくは５００より大、より好ましくは５５０より大、より好ましくは６００より大、より好ましくは６５０より大、より好ましくは７００より大の速度で伸長することによってＤＮＡテンプレートを複製できる修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ活性を有するように、ある量の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。
【００４４】
好ましくは、βサブユニットは、反応混合物中にモル比（α：β）１：１ないし１：１０、好ましくは１：３ないし１：５で存在する。
【００４５】
好ましい一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物は、双性イオン緩衝液を含む。好ましい一実施形態では、双性イオン緩衝液は、約ｐＨ７．５〜８．９のｐＨを有する。好ましい一実施形態では、双性イオン緩衝液は、弱有機酸および弱有機塩基の組み合わせを含む。
【００４６】
好ましい一実施形態では、ここで提供される熱サイクル増幅反応混合物は、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの熱安定性を高める熱安定剤（ここでは代替的に「安定剤」と呼ばれる）を含む。
【００４７】
好ましい一実施形態では、ここで提供される熱サイクル増幅反応混合物はテンプレート変性に必要な温度を低下させるＤＮＡ不安定化剤を含む。
【００４８】
好ましい一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物は、ＣａＣｌ2を欠く。
【００４９】
好ましい一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物は、γサブユニットおよび／またはτサブユニットを欠く。
【００５０】
一態様では、本発明は、ここで開示される核酸複製反応混合物を含む核酸複製反応チューブを提供する。複製反応混合物を含むチューブとは、反応混合物が入ったチューブである。
【００５１】
好ましい一実施形態では、核酸複製反応チューブは、ここで開示される配列決定反応混合物を含む配列決定反応チューブである。
【００５２】
別の好ましい一実施形態では、核酸複製反応チューブは、ここで開示される増幅反応混合物を含む増幅反応チューブである。
【００５３】
好ましい一実施形態では、増幅反応チューブは、ここで開示される熱サイクル増幅反応混合物を含む熱サイクル増幅反応チューブである。
【００５４】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応チューブは、本明細書で開示されるＰＣＲ反応混合物を含むＰＣＲ反応チューブである。
【００５５】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応チューブは、ここで開示される迅速ＰＣＲ反応混合物を含む迅速ＰＣＲ反応チューブである。
【００５６】
別の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応チューブは、ここで開示されるロングレンジＰＣＲ反応混合物を含むロングレンジＰＣＲ反応チューブである。
【００５７】
一態様では、本発明は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む、核酸複製に有用な核酸複製キットを提供する。好ましい一実施形態では、複製キットはここで開示される複製反応混合物を含む。キットは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ、および、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含まずおよびここで開示される反応混合物を生じるために使用前に修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの添加を必要とする混合物を提供しうる。好ましい一実施形態では、複製キットはＤＮＡ複製に有用である。本発明のキットはさらに、情報パンフレットおよび包装材を含みうる。
【００５８】
好ましい一実施形態では、核酸複製キットは、核酸配列決定、好ましくはＤＮＡ配列決定に有用な配列決定キットである。配列決定キットは、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。
【００５９】
別の好ましい一実施形態では、核酸複製キットは、核酸増幅、好ましくはＤＮＡ増幅に有用な増幅キットである。増幅キットはここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましくは、増幅キットは、ここで開示される核酸増幅反応混合物を含む。
【００６０】
好ましい一実施形態では、増幅キットは、温度サイクルモードで好ましくは二本鎖である核酸、好ましくはＤＮＡを増幅するのに有用な、熱サイクル増幅キットである。熱サイクル増幅キットは、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、 サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、 サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは，熱サイクル増幅キットは、ここで開示される熱サイクル増幅反応混合物を含む。
【００６１】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅キットは、好ましくは二本鎖である、核酸、好ましくはＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅するためのＰＣＲキットである。ＰＣＲキットは、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ neapolitana）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくはＰＣＲキットは、本明細書で開示されるＰＣＲ反応混合物を含む。
【００６２】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲキットは迅速ＰＣＲキットである。迅速ＰＣＲキットは、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ neapolitana）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくは迅速ＰＣＲキットは、ここで開示される迅速ＰＣＲ反応混合物を含む。
【００６３】
別の好ましい一実施形態では、ＰＣＲキットはロングレンジＰＣＲキットである。ロングレンジＰＣＲキットは、ここで開示される熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属に由来する、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む。さらに好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ neapolitana）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む。好ましくはロングレンジＰＣＲキットは、ここで開示されるロングレンジＰＣＲ反応混合物を含む。
【００６４】
好ましい一実施形態では、ここで提供される核酸複製キットは核酸複製反応混合物を含み、その複製反応混合物は、反応混合物をテンプレートＤＮＡ、およびそれにハイブリダイズ可能なプライマーと混合でき、および随意的に適当に希釈して荷電反応混合物を生じ、ここでハイブリダイズしたプライマーを毎秒１００塩基より大、より好ましくは１５０より大、より好ましくは２００より大、より好ましくは２５０より大、より好ましくは３００より大、より好ましくは３５０より大、より好ましくは４００より大、より好ましくは４５０より大、より好ましくは５００より大、より好ましくは５５０より大、より好ましくは６００より大、より好ましくは６５０より大、より好ましくは７００より大の速度で伸長することによって修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼがＤＮＡテンプレートを複製できるように、ある量の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。さらに、荷電反応混合物は、好ましくは修飾αサブユニット濃度１ｎｇ／μＬないし１００ｎｇ／μＬ、より好ましくは２ｎｇ／μＬないし５０ｎｇ／μＬ、および非常に好ましくは４ｎｇ／μＬないし１０ｎｇ／μＬを有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
ここでは、特定の細菌属または種「の」または「に由来する」遺伝子とは、直接に特定の細菌属または種のまたはそれに由来することを意味しない。むしろ、その語句は、特定の細菌属または種の内因性遺伝子との、特定の遺伝子の対応をいう。
【００６６】
ここでは、「熱安定性」修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとは、加熱による不活性化に耐性である修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼをいう。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとは、ＤＮＡポリメラーゼであり、プライマーを５’から３’方向へ伸長することによって一本鎖ＤＮＡテンプレートと相補的なＤＮＡ分子の構成を合成する。ここでは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、熱不安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼよりも熱不活性化に耐性である。しかし、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、熱不活性化に対して完全に耐性である必要は無く、および、したがって、熱処理はそのＤＮＡポリメラーゼ活性をある程度低下させうる。熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは典型的にはまた、熱不安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼよりも、合成機能について高い最適温度を有する。熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの成分は、典型的には好熱性細菌から単離される。
【００６７】
ここでは、「熱不安定性」修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとは、熱による不活性化に耐性でない修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼをいう。熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼの一例はＴ５ＤＮＡポリメラーゼであり、その活性は、酵素を温度９０℃に３０秒間曝露することによって完全に不活性化される。ここでは、熱不安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼよりも熱不活性化に対して耐性が低い。熱不安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは典型的にはまた、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼよりも低い最適温度を有する可能性が高い。熱不安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、典型的には中温性細菌から単離される。
【００６８】
ここでは、「プライマー」の語はまた、複数のプライマーをいう可能性がある。「プライマー」はオリゴヌクレオチドプライマーを含み、オリゴヌクレオチドプライマーはＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。
修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ
【００６９】
本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、「機能性」レプリカーゼ、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニットの機能性の部分組立物である。機能性とは、レプリカーゼ活性をいい、プライマー伸長速度によって特徴づけることができる。本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、プライマー伸長検定法において、毎秒７５塩基より大の伸長速度で機能する能力によって特徴づけられる。本発明の特に好ましい修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、毎秒１００塩基より大、より好ましくは１５０より大、より好ましくは２００より大、より好ましくは２５０より大、より好ましくは３００より大、より好ましくは３５０より大、より好ましくは４００より大、より好ましくは４５０より大、より好ましくは５００より大、より好ましくは５５０より大、より好ましくは６００より大、より好ましくは６５０より大、より好ましくは７００より大の伸長速度で機能する。さらに、そのような好ましい修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましい伸長速度で濃度２ｐｍｏｌ／μＬ以下にて機能できる。
【００７０】
好ましくは、βサブユニットは、モル比（α：β）１：１ないし１：１０、好ましくは１：３ないし１：５の範囲の反応混合物中にある。
【００７１】
したがって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニットに由来する修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは，文献で実証されおよび２００５年４月７日出願の同時係属出願第１１／１０１，９７７号明細書で確認された通り非機能性であり、本発明の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼに含まれない。
【００７２】
「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニット」はここでは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の未変化ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニットを意味する。たとえば、マキ（Ｍａｋｉ）他，１９８５，前掲を参照。「修飾」大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニットはここでは、少なくとも一つのβサブユニット結合部位に少なくとも一つの変異を有する、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩαサブユニットを意味する。
【００７３】
本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩαサブユニットを含む第一の成分を含む。一部の好ましい実施形態では、第一の成分は本質的に、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩαサブユニットから成る。一部の好ましい実施形態では、第一の成分は、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩのコアポリメラーゼ複合体の一つ以上の別のサブユニットを含む。第二の成分は本質的に、合成持続性クランプから成る。合成持続性クランプは、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩβサブユニットを含む。一部の好ましい実施形態では、合成持続性クランプは本質的に、ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩβサブユニットから成る。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一のおよび第二の成分は、好ましくは同一種に由来する。本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、クランプローダー成分を欠く。一部の実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、同一であるかまたは異なりうる、二つ以上の第一の成分を含む。
【００７４】
好ましい一実施形態では、ここで用いられる修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの修飾αサブユニットは、グラム陰性細菌のｄｎａＥにコードされるαサブユニットに由来する。
【００７５】
別の好ましい一実施形態では、ここで用いられる修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの修飾αサブユニットは、グラム陽性細菌のｐｏｌＣにコードされるαサブユニットに由来する。
【００７６】
好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの修飾αサブユニットは、アクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、カルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、サーモクリニス（Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ）、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）およびサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属といった、しかしそれらに限定されない、分類学的に系統樹真正細菌の基部に位置する好極限性細菌のｄｎａＥにコードされるまたはｐｏｌＣにコードされるαサブユニットに由来する。
【００７７】
特に好ましいのは、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｕｒａｎｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ゲオバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）、サーマス・ブロキアナス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ neapolitana） およびサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属の他の種、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、およびサーモクリニス（Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｄｉｓ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｃｈｅｃｏｃｃｕｓ）属の種、カルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）およびこれらの種の変異体から成る群から選択される細菌または藍藻に由来する修飾αサブユニットである。特に好ましいのは、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、アクイフェックス・ピオゲネス（Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ） およびサーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）である。
【００７８】
好極限性細菌とは、高放射線、極端な低湿度、高温（６０℃超）または低温（１０℃未満）、および高浸透圧（塩濃度０．５Ｍ超）といった、通常の生理条件の範囲外の極端な環境条件下で成長および増殖する細菌である。
【００７９】
好極限性細菌のｄｎａＥにコードされるおよびｐｏｌＣにコードされるαサブユニットの中でも、好熱性細菌由来のものが特に好ましい。
【００８０】
特に好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの修飾αサブユニットは、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｄｎａＥにコードされるαサブユニットに由来する。
【００８１】
本発明で用いられる修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットは、好ましくは内因性の亜鉛依存性３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
【００８２】
一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一の成分は、さらに、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するεサブユニットを含む。
【００８３】
αサブユニットの例は、たとえば、それぞれ明示的に参照により本開示に含まれる、２００１年５月２９日発行の米国特許第６，２３８，９０５号明細書；２０００年８月１８日出願の米国特許出願公開第０９／６４２，２１８号明細書；２０００年１１月２１日出願の米国特許出願公開第０９／７１６，９６４号明細書；１９９８年９月１１日出願の米国特許出願公開第０９／１５１，８８８号明細書；および２００１年３月２８日出願の米国特許出願公開第０９／８１８，７８０号明細書に見出される。
【００８４】
ここで修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにおける使用のために修飾されうるαサブユニットには、同時係属出願の米国特許出願公開第１１／１０１，９７７号明細書に開示される通りのタンパク質モチーフの存在および配列によって特徴づけられるものが含まれる。
【００８５】
ここで修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにおける使用のために修飾されうるαサブユニットにはまた、同時係属出願の米国特許出願公開第１１／１０１，９７７号明細書に開示される方法によって精製されるもの、および同時係属出願の第１１／１０１，９７７号明細書に開示される検定法によって望まれる性質を有すると同定されるものが含まれる。
【００８６】
一実施形態では、反応混合物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、εサブユニットによって与えられる。別の一実施形態では、反応混合物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、修飾αサブユニットによって与えられる。修飾αサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、ここで開示される通り、亜鉛濃度を操作することによって調節でき、および異なる反応混合物では異なりうる。
【００８７】
一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、反応混合物中で３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができる有意な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示さない。好ましい一実施形態では、有意な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、グラム陰性細菌のｄｎａＥにコードされるαサブユニットに由来する修飾αサブユニットを含む。
【００８８】
一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一の成分は、Ｐｏｌ ＩＩＩＤＮＡポリメラーゼコアの別のサブユニット、たとえばθを含む。
【００８９】
一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩの第一の成分は、細菌ｄｎａＱ遺伝子にコードされるεサブユニットを含む。εサブユニットの例は、たとえば、２０００年８月１８日出願の米国特許出願公開第０９／６４２，２１８号明細書；２０００年１１月２１日出願の米国特許出願公開第０９／７１６，９６４号明細書；１９９８年９月１１日出願の米国特許出願公開第０９／１５１，８８８号明細書；および２００１年３月２８日出願の米国特許出願公開第０９／８１８，７８０号明細書に見出される。
【００９０】
βサブユニットの例は、たとえば、それぞれ明示的に全体が参照により本開示に含まれる、２０００年８月１８日出願の米国特許出願公開第０９／６４２，２１８号明細書；２０００年１１月２１日出願の米国特許出願公開第０９／７１６，９６４号明細書；１９９８年９月１１日出願の米国特許出願公開第０９／１５１，８８８号明細書；および２００１年３月２８日出願の米国特許出願公開第０９／８１８，７８０号明細書に見出される。
【００９１】
本発明の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの第一のおよび第二の成分は、同時インキュベートでき、および溶液中で２成分ポリメラーゼを形成させることができる。同時インキュベート溶液は、反応混合物となることができ、または、好ましくは、成分が反応混合物への添加前に結合されうる。一実施形態では、二種類以上の第一の成分が、第二の成分と同時インキュベートされる。
修飾アルファサブユニット
【００９２】
ここでは修飾αサブユニットは、本分野で以前に記載されたものおよびここで同定されるグラム陽性ＰｏｌＣアルファサブユニットについての新規のβ−結合部位を含む、現存するβ−結合部位の修飾によって得られる。表１は、グラム陰性ＤｎａＥおよびグラム陽性ＰｏｌＣアルファサブユニットの両方での、内部ベータ−結合モチーフの代表的一覧を提供する。
【表１】
【００９３】
背景技術で言及された通り、先行技術文献は、内部ＤｎａＥタンパク質β結合部位について共通配列ＱＬ（Ｓ／Ｄ）ＬＦを定義する。たとえば、ダルリンプル（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ）他，ＰＮＡＳ ９８：１１６２７− １１６３２，２００１を参照。図１を参照して、隣接領域のアミノ酸配列を整列すると、いくつかのグラム陰性およびグラム陽性細菌に由来するＤｎａＥタンパク質中のこの内部部位を特定できた。驚くべきことに、配列整列の結果は、ＤｎａＥ内部β結合部位について共通アミノ酸配列の逸脱を容認するような、βサブユニット結合モチーフ内の一次配列保存は無いことを明らかにした。細菌ＤｎａＥタンパク質中の内部β結合モチーフの唯一の一致した性質は、β結合モチーフの両側に隣接する、Ｃ−末端フェニルアラニン残基および２個の低分子量アミノ酸（プロリン、グリシン、セリンまたはスレオニン）の存在である。この驚くべき知見は、本分野の教示と相反する。図１に含まれていない、αサブユニットについてのβ−結合部位のアミノ酸配列は、図にあるものとの配列比較によって、およびＯＢ折りたたみおよびへリックス−ヘアピン−へリックス領域を同定する構造分析によって同定されうる（ドーマン（Ｄｏｈｒｍａｎｎ）他，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｊｕｌ ８；３５０（２）：２２８−３９を参照）。図２および３も参照。ＤｎａＥのカルボキシ末端のβ−結合部位配列はよく記録されている。たとえば、キム（Ｋｉｍ） 他，ＪＢＣ ２７１：２０６９０−２０６９８，１９９６を参照。
グラム陰性細菌の好熱性ＤＮＡ ＰＯＬ ＩＩＩの好ましい修飾αサブユニットβ−結合部位配列
【００９４】
【００９５】
【００９６】
β−クランプ結合改善のための別の変異体モチーフ：
【００９７】
（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＬＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ）
【００９８】
ＱＬ（Ｇ／Ａ／Ｌ）Ｌ（Ｐ／Ａ／Ｇ）Ｆ
【００９９】
Ｇ（Ｌ／Ａ）（Ｌ／Ａ）（Ｇ／Ａ）ＬＦＧ
【０１００】
（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＱＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ）
【０１０１】
（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＮＬ（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｑ／Ｎ／Ｓ／Ｔ）ＬＦ（Ｓ／Ａ／Ｇ）
【０１０２】
いくつかの研究は、さまざまなα−サブユニットβ−結合部位配列に相当するペプチドを含むさまざまなペプチドの、β−サブユニットに対する親和性を比較している。内部ベータ結合部位、およびカルボキシ末端（τ−結合部位）に変異を有するα−サブユニットのβ−サブユニットに対する親和性を調べる別の研究が行われている。これらの研究は、本発明におけるβ−結合部位修飾の選択の情報を与えうる。特に、β−サブユニットに対してαサブユニットの現存するβ−結合配列よりも高い親和性を示す配列は、βサブユニット結合を改善するためにそのような現存するβ−結合部位を置換するのに使用でき、点変異、複数変異、および完全モチーフ置換を含むがそれらに限定されない。
核酸複製
【０１０３】
一態様では、本発明は、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む複製反応混合物中で核酸分子を複製反応に供することを含む、核酸分子を複製するための方法を提供する。
【０１０４】
「核酸複製」は、テンプレート核酸分子が、全体、または一部複製される過程である。したがって、核酸複製反応の産物は、複製されているテンプレート核酸分子に完全にまたは一部が相補的でありうる。核酸複製は、テンプレート核酸とハイブリダイズしているプライマーを５’−３’方向へ、テンプレート核酸の塩基と相補的なヌクレオチドを伸長産物の各位で組み込んで伸長することによって行われる。プライマーは、たとえば、一本鎖ＤＮＡテンプレートの一部とハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドでありうる。プライマーはまた、たとえば、一本鎖ＤＮＡテンプレートの別の領域と相補的でありおよび自己プライミングできる、一本鎖ＤＮＡテンプレートの一部でありうる。核酸複製反応の範囲に含まれるのは、等温複製反応、配列決定反応、増幅反応、熱サイクル増幅反応、ＰＣＲ、迅速ＰＣＲ、およびロングレンジＰＣＲである。
【０１０５】
核酸複製反応で複製された核酸は、好ましくはＤＮＡであり、および複製は好ましくは、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が関与する。
【０１０６】
好ましい一実施形態では、複製反応混合物は、ｐＫ約７．０〜８．５である弱有機酸（たとえば、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＰＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＡＢＳおよびＴＥＳ）およびｐＫ約６．８〜８．５である弱有機塩基（たとえば、トリス、Ｂｉｓ−トリス−プロパン、イミダゾール、ＴＭＮＯ、４−メチルイミダゾール、トリエタノールアミンおよび時エタノールアミン）の組み合わせを含む、緩衝液のｐＨが有機塩基を用いた滴定によって約ｐＨ７．５〜８．９に設定され、および有機酸の濃度が約１０〜４０ｍＭ、より好ましくは約２０〜３０ｍＭ．である、双性イオン緩衝液を含む。
【０１０７】
特に好ましい一実施形態では、複製反応混合物および修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの組み合わせが下記の組み合わせから選択される：（ｉ）ＨＥＰＥＳ−Ｂｉｓ−トリス−プロパン（２０ｍＭ，ｐＨ ７．５）と、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種由来の修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ；および（ｉｉ）ＴＡＰＳ−トリス（２０ｍＭ，ｐＨ ８．７）と、アクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属、好ましくはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【０１０８】
好ましい一実施形態では、核酸複製反応混合物は、反応混合物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの最適活性のために含まれている、Ｚｎ2+、Ｍｇ2+、Ｋ+、およびＮＨ42+から成る群から選択される一つ以上のイオンを含む。イオンは好ましくは、反応混合物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの最適活性のための最適濃度を決定するために予備検定で滴定される。特に好ましい一実施形態では、核酸複製反応混合物はＣａ2+イオンを欠く。
【０１０９】
一部の好ましい実施形態では、核酸複製反応混合物はカリウムイオンを含む。カリウムイオンは好ましくは、使用される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについて最適濃度を決定するために最初に滴定される。一般的に、複製反応混合物のＫ+濃度は、好ましくは０ないし約１００ｍＭ、より好ましくは約５〜２５ｍＭである。カリウムイオンは好ましくは、ＫＣｌ、Ｋ2ＳＯ4、または酢酸カリウムの形で提供される。Ｋ+と共に提供される特定のカウンター陰イオンは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの活性に影響する可能性があり、および好ましくは、特定の複製反応のための特定の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにどのカウンター陰イオンが最適であるかを決定するために予備検定が行われる。一般的に、硫酸または塩化物カウンター陰イオンが、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾 Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼと共に好ましくは用いられ、硫酸が塩化物よりも好ましい。加えて、カリウムイオンは、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物での使用には好ましくない。
【０１１０】
一部の好ましい実施形態では、核酸複製反応混合物はアンモニウムイオンを含む。アンモニウムイオンは好ましくは、使用される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについて最適濃度を決定するために最初に滴定される。一般的に、複製反応混合物のＮＨ42+濃度は、好ましくは０ないし約１５ｍＭである。アンモニウムイオンは好ましくは、硫酸アンモニウムの形で提供される。アンモニウムイオンは好ましくは、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと共に複製反応混合物に含まれる。加えて、アンモニウムイオンは、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物での使用には好ましくない。
【０１１１】
一部の好ましい実施形態では、複製反応混合物は亜鉛イオンを含む。亜鉛イオンは好ましくは、使用される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについて最適濃度を決定するために最初に滴定される。一般的に、複製反応混合物のＺｎ2+濃度は、好ましくは０ないし約５０μＭ、より好ましくは約５〜１５μＭである。亜鉛イオンは好ましくは、ＺｎＳＯ4、ＺｎＣｌ2および酢酸亜鉛から成る群から選択される塩の形で提供される。Ｚｎ2+と共に提供される特定のカウンター陰イオンは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの活性に影響する可能性があり、および好ましくは、特定の複製反応のための特定の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにどのカウンターイオンが最適であるかを決定するために予備検定が行われる。一般的に、塩化物または酢酸カウンター陰イオンがサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物中で好ましくは用いられ、および硫酸カウンター陰イオンがアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの複製反応混合物中で好ましくは用いられる。
【０１１２】
一般的に、Ｚｎ2+は、いくつかのαサブユニット（たとえば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｄｎａＥ）の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を上昇させうるため、配列決定反応混合物における使用には好ましくない。任意の特定の最小機能性Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に対するＺｎ2+の影響、およびそれを用いる配列決定反応に対するＺｎ2+の影響は、本分野で公知である標準的なエキソヌクレアーゼ活性検定法を用いて評価されうる。
【０１１３】
一部の好ましい実施形態では、複製反応混合物はマグネシウムイオンを含む。マグネシウムイオンは好ましくは、使用される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについて最適濃度を決定するために最初に滴定される。一般的に、複製反応混合物のＭｇ2+濃度は、好ましくは０ないし約１５ｍＭ、より好ましくは約４〜１０ｍＭである。一般的に、核酸配列決定反応を含む、等温核酸複製反応は、好ましい濃度範囲の上限のＭｇ2+濃度によりよく適応する。マグネシウムイオンは好ましくは、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、および酢酸マグネシウムから成る群から選択される塩の形で提供される。Ｍｇ2+と共に提供される特定のカウンター陰イオンは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの活性に影響する可能性があり、および好ましくは、特定の複製反応のための特定の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼにどのカウンターイオンが最適であるかを決定するために予備検定が行われる。一般的に、酢酸または塩化物カウンター陰イオンが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと好ましくは用いられ、酢酸が塩化物よりも好ましい。加えて、硫酸カウンター陰イオンが、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと好ましくは用いられる。
【０１１４】
特に好ましい一実施形態では、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための複製反応混合物は、ＴＡＰＳ−トリス （２０ｍＭ，ｐＨ８．７）、 ２５ｍＭ Ｋ2ＳＯ4、１０ｍＭ ＮＨ4（ＯＡｃ）2、および １０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む。
【０１１５】
別の特に好ましい一実施形態では、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための複製反応混合物は、ＨＥＰＥＳ−Ｂｉｓ−トリス−プロパン（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）、および１０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含む。
【０１１６】
一実施形態では、複製のための一本鎖核酸テンプレートを提供するのに必要な変性温度を低下させるために、複製反応にヘリカーゼが含まれる。
【０１１７】
一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物はＡＴＰを欠く。
【０１１８】
一実施形態では、ここで提供される複製反応混合物はＳＳＢを欠き、ＳＳＢは複製反応混合物中に存在するならば、複製反応混合物中に用いられる特定の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を低下させる。好ましい一実施形態では、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む複製反応混合物はＳＳＢを欠く。
【０１１９】
ここでは、使用される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼが好熱性細菌に由来する核酸複製反応で、反応混合物は好ましくは約７．２〜８．９のｐＨを有する。一部の好ましい実施形態では、反応混合物はＺｎ2+濃度０ないし約５０μＭ、より好ましくは約５〜１５μＭである。一部の好ましい実施形態では、反応混合物は、Ｍｇ2+濃度０ないし約１５ｍＭ、より好ましくは約４〜１０ｍＭである。一部の好ましい実施形態では、反応混合物は、Ｋ+濃度０ないし約１００ｍＭ、より好ましくは約５〜２５ｍＭである。一部の好ましい実施形態では、反応混合物は、ＮＨ４2+濃度０ないし約１２ｍＭ、より好ましくは約５〜１２ｍＭである。一部の好ましい実施形態では、反応混合物は、これらの陽イオンをそれらの好ましい濃度範囲で組み合わせて有する。
【０１２０】
ここでは核酸複製反応では、プライマー伸長が行われる温度は、好ましくは約５５℃〜７２℃、より好ましくは約６０℃〜６８℃である。
【０１２１】
好ましい一実施形態では、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長が熱サイクル増幅反応において行われる温度は、約５５℃〜７２℃、より好ましくは約６０℃〜６８℃、より好ましくは約６０℃〜６５℃であるが、最適温度は、本分野で公知である通り、プライマー長、塩基含量、テンプレートに対するプライマー相補性の程度、および他の因子によって決定される。
【０１２２】
好ましい一実施形態では、変性が熱サイクル増幅反応において行われる温度は、約８６℃〜９５℃、より好ましくは８７℃〜９３℃であり、ここで開示される通りＤＮＡ不安定化剤を含む熱サイクル増幅反応混合物と組み合わせた使用にはその範囲の下限の温度が好ましい。好ましい熱サイクル増幅方法は、約１０ないし約１００サイクル、より好ましくは約２５ないし約５０サイクル、およびピーク温度約８６℃〜９５℃、より好ましくは８７℃〜９３℃を含むポリメラーゼ連鎖反応を含み、ここで開示される通りＤＮＡ不安定化剤を含むＰＣＲ反応混合物と組み合わせた使用にはその範囲の下限の温度が好ましい。
核酸増幅
【０１２３】
一態様では、本発明は、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む増幅反応混合物中で核酸分子を増幅反応に供することを含む、核酸分子を増幅するための方法を提供する。好ましくは、増幅反応は、ここに記載される増幅反応チューブ中で行われる。
【０１２４】
核酸分子は、文献に記載された手動または自動化増幅方法の任意のものに従って増幅されうる。ここで用いられる「増幅」は、目的のヌクレオチド配列のコピー数を増加させるための任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ法をいう。増幅される核酸は好ましくはＤＮＡであり、および増幅は好ましくは、ここで記載される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が関与する。
【０１２５】
一実施形態では、核酸増幅は、ＤＮＡ分子またはプライマーへのヌクレオチドの組み込みを結果として生じ、それによって核酸テンプレートと相補的な新しいＤＮＡ分子を形成する。生じたＤＮＡ分子およびそのテンプレートは、別のＤＮＡ分子を合成するためのテンプレートとして使用されうる。ここでは、一つの増幅反応は、多数回のＤＮＡ複製から成りうる。ＤＮＡ増幅反応は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を含む。一つのＰＣＲ反応は、ＤＮＡ分子の変性および合成の１０から１００「サイクル」から成りうる。そのような方法は、ＰＣＲ（参照により本開示に含まれる、米国特許第４，６８３，１９５および４，６８３，２０２号明細書に記載の通り）、鎖置換増幅（「ＳＤＡ」）（参照により本開示に含まれる、米国特許第５，４５５，１６６号明細書に記載の通り）、および核酸配列準拠増幅（「ＮＡＳＢＡ」）（参照により本開示に含まれる、米国特許第５，４０９，８１８号明細書に記載の通り）を含むがそれらに限定されない。たとえば、増幅は、低い熱で溶解するＤＮＡにおける効率増大のためにヘリカーゼを使用することさえできる、ローリングサークル複製系によって達成されうる（参照により本開示に含まれる、ユザコウ（Ｙｕｚｈａｋｏｕ）他，Ｃｅｌｌ ８６：８７７−８８６ （１９９６） およびモク（Ｍｏｋ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６５５８−１６５６５ （１９８７）を参照）。
【０１２６】
好ましい一実施形態では、熱サイクル増幅反応において変性が行われる温度は、約８６℃〜９５℃、より好ましくは８７℃〜９３℃であり、ここで開示される通りＤＮＡ不安定化剤を含む熱サイクル増幅反応混合物と組み合わせた使用にはその範囲の下限の温度が好ましい。好ましい熱サイクル増幅方法は、約１０ないし約１００サイクル、より好ましくは約２５ないし約５０サイクル、およびピーク温度約８６℃〜９３℃、より好ましくは８７℃〜９３℃を含むポリメラーゼ連鎖反応を含み、ここで開示される通りＤＮＡ不安定化剤を含むＰＣＲ反応混合物と組み合わせた使用にはその範囲の下限の温度が好ましい。特に好ましい一実施形態では、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属の、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種のｄｎａＥαサブユニットを含む。
【０１２７】
好ましい一実施形態では、一つ以上の高温変性段階を含む増幅反応で用いられる増幅反応混合物は、ここで記載されおよびより詳細に例示される通り、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの熱安定性に寄与する安定剤をさらに含む。
【０１２８】
好ましい一実施形態では、ここで提供される増幅混合物はＳＳＢを欠き、ＳＳＢは複製反応混合物中に存在するならば、複製反応混合物中に用いられる特定の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する。
【０１２９】
好ましい一実施形態では、ＰＣＲ反応は修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを適当な安定剤と共に用いて行われ、（ａ）標的配列の末端が十分詳細に判っていてそれらとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーが合成されうるならば、および（ｂ）連鎖反応を開始するために少量の標的配列が利用可能であるならば、含まれる反応段階の数に対して指数的な量で、少なくとも一つの標的核酸配列を生じる。連鎖反応の産物は、使用した特異的プライマーの末端と対応する末端を有する、不連続の核酸二重鎖となる。
【０１３０】
目的の標的核酸配列を含むかまたは含むと考えられるならば、精製形または非精製形の、核酸の任意の起源が、開始核酸として使用されうる。したがって、処理は、たとえば、ＤＮＡまたは、メッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを使用でき、そのＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖でありうる。加えて、それぞれの鎖を１本含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドもまた使用されうる。これらの核酸のうちの任意のものの混合物もまた使用でき、または、同一または異なるプライマーを用いた前の増幅反応から生じた核酸もそのように使用されうる。増幅される核酸は好ましくはＤＮＡである。増幅すべき標的核酸配列は、より大きい分子の一部だけでもよく、または標的配列が核酸全体を構成するように最初は不連続な分子として存在できる。増幅すべき標的配列が最初に純粋な形で存在する必要は無い；標的配列は、たとえばヒトＤＮＡ全体に含まれるβ−グロビン遺伝子の一部のように、または特定の生物試料の非常に小さい画分を構成しうるにすぎない特定の微生物に由来する核酸配列の一部のように、複雑な混合物のより小さい画分でありうる。開始核酸は、同一または別々でありうる、二つ以上の目的の標的核酸配列を含みうる。したがって、本方法は、大量の一つの標的核酸配列を作製するためだけでなく、同一のまたは異なる核酸分子上に位置する複数の標的核酸配列を同時に増幅するためにも有用である。
【０１３１】
核酸は任意の起源から得ることができ、および、プラスミドおよびクローンＤＮＡまたはＲＮＡ、および細菌、酵母、ウイルス、および植物または動物といったより高等な生物を含む任意の起源のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。ＤＮＡまたはＲＮＡは、たとえば、血液または他の体液、または絨毛膜絨毛または羊膜細胞といった組織材料から、たとえばマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他，『分子クローニング：実験の手引き』（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），（ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）） ｐｐ ２８０−２８１（１９８２）に記載されたようなさまざまな方法によって抽出されうる。
【０１３２】
任意の特異的（すなわち、標的）核酸配列が、本方法によって作製されうる。目的配列の別々の鎖にハイブリダイズするような、および一つのプライマーから合成された伸長産物がテンプレート（相補鎖）から分離された際に他のプライマーが規定の長さの核酸へ伸長するためのテンプレートとして役立ちうるような配列の相対的な位置にハイブリダイズするような、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーが作製されうるように、標的配列の両端の十分な数の塩基が十分詳細に知られてさえいればよい。標的配列の両端の塩基がよく知られているほど、標的核酸配列に対するプライマーの特異性は高く、および、したがって、その処理の効率は高い。以後用いられるプライマーの語は、特に、増幅すべき断片の末端配列に関する情報に何らかの曖昧さがある場合は、二つ以上のプライマーをいうことができると理解される。たとえば、核酸配列がタンパク質配列情報から推測される場合は、遺伝コードの縮重に基づくすべての可能なコドン変異に相当する配列を含むプライマーの集合が、各鎖について使用されうる。この集合からの一つのプライマーが、増幅すべき目的配列の末端と相同となる。
【０１３３】
一部の代替的実施形態では、ランダムプライマー、好ましくは六量体が、テンプレート核酸分子を増幅するために用いられる。そのような実施形態では、増幅される正確な配列は規定されていない。
【０１３４】
加えて、単一プライマーを用いる片側増幅を実施しうることが当業者に理解される。
【０１３５】
オリゴヌクレオチドプライマーは、たとえば、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法またはその自動化実施形態といった任意の適当な方法を用いて調製されうる。そのような自動化された一実施形態では、ジエチロホスホロアミダイトが開始材料として用いられ、および参照により本開示に含まれるビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９−１８６２ （１９８１）に記載された通り合成されうる。修飾固相担体上でオリゴヌクレオチドを合成するための一つの方法が、参照により本開示に含まれる米国特許第４，４５８，００６号明細書に記載されている。生物起源（たとえば制限エンドヌクレアーゼ消化物）から単離されているプライマーを用いることもまた可能である。
【０１３６】
好ましいプライマーは、約１５〜１００、より好ましくは約２０〜５０、非常に好ましくは約２０〜４０塩基の長さを有する。特に、ここでの使用に好ましいプライマーは、Ｐｏｌ Ｉポリメラーゼに好ましいものよりも長い。
【０１３７】
標的核酸配列は、テンプレートとしてその配列を含む核酸を用いて増幅される。核酸が２つの鎖を含む場合、プライマー伸長産物の合成と別個の段階としてまたは同時に、テンプレートとして使用できる前に核酸の鎖を分離する必要がある。この鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的方法を含む、任意の適当な変性方法によって達成されうる。核酸の鎖を分離する一つの物理的方法は、完全に（＞９９％）変性するまで核酸を加熱することを含む。典型的な熱変性は、温度範囲約８０℃ないし１０５℃、好ましくは約９０℃ないし約９８℃、さらにより好ましくは９３℃ないし９４℃を、時間範囲約１ないし１０分間を含みうる。鎖分離はまた、ヘリカーゼとして知られる類の酵素、または、ヘリカーゼ活性を有しおよびＤＮＡを変性させることが知られている酵素ＲｅｃＡによっても誘導されうる。ヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するのに適当な反応条件は、参照により本開示に含まれるＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．ＸＬＩＩＩ 『ＤＮＡ：複製および組み換え』"ＤＮＡ： Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ" （ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９７８）によって記載され、 および ＲｅｃＡを用いるための方法は、Ｃ．ラディング（Ｒａｄｄｉｎｇ），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：４０５−３７ （１９８２）で総説されている。本発明での使用に好ましいヘリカーゼは、ｄｎａＢにコードされる。
【０１３８】
増幅すべき配列を含む元の核酸が一本鎖である場合、その相補鎖が、オリゴヌクレオチドプライマーを加えることによって合成される。適当な単一プライマーが添加される場合、プライマー伸長産物は、プライマー、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ、および下記の４種類のヌクレオチドの存在下で合成される。産物は、一本鎖核酸と部分的に相補となり、および核酸鎖とハイブリダイズして、不等な鎖長の二重鎖を形成し、二重鎖はついで上記の通り一本鎖へ分離して、２種類の分離した相補一本鎖を生じうる。
【０１３９】
元の核酸が増幅すべき配列を構成する場合、生じるプライマー伸長産物は、元の核酸の鎖と完全に相補となり、およびそれとハイブリダイズして、等しい鎖長の二重鎖を形成し、一本鎖分子へ分離される。
【０１４０】
核酸の相補鎖が分離される際、核酸が元は二本鎖であっても一本鎖であっても、鎖は別の核酸鎖の合成のためのテンプレートとして使用可能である。この合成は、任意の適当な方法を用いて実施されうる。一般的に、反応は緩衝水溶液中で起こる。一部の好ましい実施形態では、緩衝液ｐＨは約８．５から８．９であり、Ｐｏｌ Ｉ酵素の好ましいｐＨ範囲とは著しく異なる。好ましくは、モル過剰（クローン核酸については通常プライマー：テンプレート約１０００：１、およびゲノム核酸については通常プライマー：テンプレート約１０6：１）の２種類のオリゴヌクレオチドプライマーが、分離されたテンプレート鎖を含む緩衝液に添加される。しかし、ここでの処理が消化用途に用いられる場合、相補鎖の量は不明でありうるため、相補鎖の量に相対的なプライマーの量が確実に決定できないことが理解される。実際問題としては、しかし、増幅すべき配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物に含まれる場合、添加されるプライマーの量は一般的に相補鎖（テンプレート）の量に対してモル過剰となる。その過程の効率を改善するためには、モル大過剰が好ましい。
【０１４１】
ヌクレオシド三リン酸、好ましくはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および／またはｄＵＴＰもまた、適当な量で合成混合物に添加される。
【０１４２】
新たに合成された鎖およびその相補核酸鎖は、二本鎖分子を形成し、それが処理の次の段階で用いられる。次の段階では、二本鎖分子の鎖が、上記の手順のうち任意のものを用いて分離され、一本鎖分子を提供する。
【０１４３】
新しい核酸が、その一本鎖分子上で合成される。上記の条件下で反応が進むための必要に応じて、別のポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびプライマーが添加されうる。再び、合成はオリゴヌクレオチドプライマーの一方の端で開始され、およびテンプレートの一本鎖に沿って進行し、別の核酸を生じる。
【０１４４】
鎖分離および伸長産物合成の段階は、目的の量の特異的核酸配列を生じるのに必要なだけ反復されうる。生じる特異的核酸配列の量は、指数的に増大する。
【０１４５】
最初の核酸または核酸混合物から二つ以上の特異的核酸配列を生じることが望まれる場合、適当な数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。たとえば、２種類の異なる特異的核酸配列を生ずべき場合、４種類のプライマーが用いられる。プライマーのうち２種類は特異的核酸配列の一つに特異的であり、および残り２種類のプライマーは、第二の特異的核酸配列に特異的である。この方法で、２種類の異なる特異的配列のそれぞれが、本処理によって指数的に産生されうる。もちろん、異なるテンプレート核酸配列の末端配列が同一である場合、プライマー配列は互いに同一およびテンプレート末端配列に対し相補となる。
【０１４６】
加えて、上述の通り、代替的一実施形態では、ランダムプライマー、好ましくは六量体、が、テンプレート核酸分子を増幅するのに用いられる。
【０１４７】
加えて、単一プライマーを用いる片側増幅が実施されうる。
【０１４８】
本発明は、各段階後に新しい試薬が添加される段階法で、またはすべての試薬が最初の段階で加えられて同時に、または所定数の段階後に新しい試薬が添加されて一部段階的におよび一部同時に、実施されうる。別の材料、たとえば、安定剤が、必要に応じて添加されうる。目的量の特異的核酸配列を生じるために適当な長さの時間の経過後、反応は、任意の公知の方法で酵素を不活性化することによって、または反応の成分を分離することによって停止されうる。
【０１４９】
このように、本発明に記載の核酸分子の増幅において、核酸分子は、好ましくは熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを、好ましくは安定剤を含む適当な増幅反応混合物中に含む組成物と接触させられる。
【０１５０】
一実施形態では、本発明は、「ロングレンジＰＣＲ」と一般に呼ばれる用法によって核酸高分子を増幅する方法を提供する（バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ），Ｗ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２２１６−２２２０ （１９９４） （「バーンズ」）；チェン（Ｃｈｅｎｇ），Ｓ．他．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５６９５−５６９９ （１９９４）、参照により本開示に含まれる）。約５〜６キロベースより大の核酸分子を増幅するために有用な一つの方法では、標的核酸分子が接触させられる組成物は、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼだけでなく、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示す（「エキソ＋」ポリメラーゼ）低濃度の第二のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは熱安定性修復型ポリメラーゼ、またはｐｏｌＣαサブユニット）もまた、濃度約０．０００２〜２００単位／ミリリットル、好ましくは約０．００２〜１００単位／ｍＬ、より好ましくは約０．００２〜２０単位／ｍＬ、さらにより好ましくは約０．００２〜２．０単位／ｍＬ、および非常に好ましくは濃度約０．４０単位／ｍＬにて含む。本方法での使用のために好ましいエキソ＋ポリメラーゼは、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ） ＰｏｌＣ、Ｐｆｕ／ＤＥＥＰＶＥＮＴまたはＴｌｉ／ＮＥＮＴ？ （バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）； 米国特許第５，４３６，１４９号明細書、参照により本開示に含まれる）；サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種由来熱安定性ポリメラーゼ、たとえばＴｍａ Ｐｏｌ Ｉ （米国特許第 ５，５１２，４６２号明細書、参照により本開示に含まれる）； およびＴｎｅ（３’ｅｘｏ＋）といったサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ neapolitana）から単離されたある種の熱安定性ポリメラーゼおよびその変異体である。サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＰｏｌＣ産物もまた好ましい。本方法で修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを第二のポリメラーゼと併用することによって、長さ少なくとも３５〜１００キロベースのＤＮＡ配列が、顕著に改善した信頼性で、高濃度まで増幅されうる。
【０１５１】
ロングレンジＰＣＲの考察については、たとえば、明示的に参照により本開示に含まれる、デイビーズ（Ｄａｖｉｅｓ）他，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２； １８７：５１−５を参照。
【０１５２】
好ましくは、本発明の増幅方法は、２修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの安定剤の使用を含む。安定剤は好ましくは増幅反応混合物中に含まれ、および、これらの反応混合物中での修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼの熱安定性を高める。
【０１５３】
本発明の増幅反応混合物は、最大２５％の共溶媒（反応混合物に添加されるすべての共溶媒の合計）、最大５％のクラウディング剤（反応混合物に添加されるすべてのクラウディング剤の合計）および最大２Ｍのオキサイド（反応混合物に添加されるすべてのオキサイドの合計）を含みうる。
【０１５４】
特に好ましい一実施形態では、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための増幅反応混合物は、ＴＡＰＳ−トリス（２０ｍＭ，ｐＨ８．７）、 ２５ｍＭ Ｋ2ＳＯ4，１０ｍＭ ＮＨ4（ＯＡｃ）2，１５μｍｏｌ ＺｎＳＯ4，および ４ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む。
【０１５５】
別の特に好ましい一実施形態では、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための増幅反応混合物は、ＨＥＰＥＳ−Ｂｉｓ−トリス−プロパン（２０ｍＭ，ｐＨ７．５）、０．５μｍｏｌ ＺｎＣｌ2またはＺｎ（ＯＡｃ）2，および ６ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含む。
【０１５６】
一つ以上の高温変性段階が８９℃未満で実施される一実施形態では、熱サイクル増幅法は、熱サイクル増幅反応混合物中でのヘリカーゼの使用、および好ましくは細菌ｄｎａＢ遺伝子にコードされるヘリカーゼを含む。ヘリカーゼは、好ましくは、８９℃以上の一つ以上の変性段階を含む熱サイクル増幅方法では使用されない。
【０１５７】
一実施形態では、ここでの核酸複製方法は、ＡＴＰを欠く核酸複製混合物の使用を含む。
【０１５８】
一実施形態では、ここでの核酸複製方法は、ＳＳＢを欠く核酸複製混合物の使用を含み、ＳＳＢは複製反応混合物中に存在するならば、複製反応混合物中に用いられる特定の最小機能性Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性を阻害する。
安定剤
【０１５９】
好ましくは、少なくとも２種類、およびより好ましくは少なくとも３種類の安定剤の組み合わせが、熱サイクル増幅反応混合物中に含まれる。好ましい実施形態では、安定剤は、たとえばポリオール（たとえばグリセロール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール）といった少なくとも一つの共溶媒、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、ポリビニルアルコールまたはポリプロピレングリコールといった少なくとも一つのクラウディング剤、および、糖、有機第四アミンたとえばベタイン、およびそのＮ−オキサイド、および界面活性剤から成る群から選択される第３の成分を含む。特に好ましい実施形態では、安定剤は、共溶媒、クラウディング剤、および第四アミンＮ−オキサイド、たとえばトリメチルアミン−Ｎ−オキサイド（ＴＭＮＯ）またはモルホリノ−Ｎ−オキサイドを含む。さらに好ましい実施形態では、反応混合物はさらに、第４の安定剤、非常に好ましくは第２のポリオールを含む。他の好ましい４種類の安定剤の組み合わせは、３種類の異なる共溶媒、および一つの第四アミンＮ−オキサイドを含む。
【０１６０】
高温変性段階を用いる核酸複製反応は、反応混合物に一つ以上の安定剤を含めることで利益を受けうる。本発明に従って好ましい安定剤は、ポリオールといった共溶媒およびポリエチレングリコールといったクラウディング剤を、典型的には一つ以上のオキサイド、糖、界面活性剤、ベタインおよび／または塩と共に含む。前記の成分の組み合わせが非常に好ましい。
【０１６１】
ここでは、「クラウディング高分子剤」または「クラウディング剤」とは、タンパク質凝集を少なくとも部分的に模倣する高分子をいう。本発明における使用のためのクラウディング剤の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＶＰ、フィコール、およびプロピレングリコールを含む。
【０１６２】
ここでは、「界面活性剤」とは、水の表面張力を低下させる任意の物質をいい、および陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、および双性イオン性界面活性剤を含むがそれらに限定されない。本発明における使用のための界面活性剤の例は、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、ＮＰ−４０およびツヴィッタージェント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３−１０を含む。
【０１６３】
ここでは、「ポリオール」とは多価アルコール、すなわち、３個以上の水酸基を含むアルコールをいう。３個の水酸基を有するもの（三価）はグリセロール類である；３個より多数を有するものは糖アルコールと呼ばれ、一般式ＣＨ2ＯＨ（ＣＨＯＨ）nＣＨ2ＯＨであり、ここでｎは２ないし５でありうる。
【表２】
【表３】
【０１６４】
本発明の実施形態は一般的に、温度を基礎とする核酸増幅を促進するためにＧｒｏｕｐｓＩ〜ＶＩＩ群（表２参照）から選択される少なくとも２種類、およびより好ましくは少なくとも３種類の異なる安定剤を組み合わせることを含む。本発明の好ましい実施形態は、ＩＩ群の少なくとも一つと、ＩＩＩ群の一つとの、増幅反応混合物内での組み合わせを含み、特にＩＩ群のものはグリセロールおよび／またはソルビトールである。特に好ましい組み合わせは、ＩＩ群の異なる２つの、ＩＩＩ群の１つおよびＶＩＩ群の１つとの組み合わせを含む。
核酸配列決定
【０１６５】
一態様では、本発明は、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む配列決定反応混合物中で核酸を配列決定反応に供することを含む、核酸、好ましくはＤＮＡを配列決定するための方法を提供する。
【０１６６】
好ましくは、使用する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、配列決定反応混合物中で３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
【０１６７】
したがって、ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットを含む修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、その高レベルの亜鉛非依存性３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のために、配列決定反応における使用には一般的に好ましくない。
【０１６８】
好ましい一実施形態では、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、好ましくはサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属の、好ましくはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種の、ｄｎａＥαサブユニットを含む。
【０１６９】
特に、本発明に用いられるｄｎａＥαサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、一般的に３’末端ジデオキシヌクレオチドを除去することができ、一方、εサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は一般的にそのような末端ジデオキシヌクレオチド除去の能力は無い。したがって、配列決定反応混合物中のεサブユニットによって与えられる３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは、一般的にここでの配列決定反応に有用である。さらに、望ましくないｄｎａＥαサブユニット３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、化学的方法（すなわち、緩衝液条件、より具体的には、Ｚｎ2+濃度およびｐＨ）によって、好ましくは低減または完全に阻害される。
【０１７０】
核酸分子は、文献に記載された手動または自動化配列決定法のうち任意のものに従って配列決定されうる。そのような方法は、ジデオキシ配列決定法（「サンガー配列決定」； 参照により本開示に含まれる、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ），Ｆ．，他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９４：４４４−４４８ （１９７５）； サンガー（Ｓａｎｇｅｒ），Ｆ．，他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７ （１９７７）； 米国特許第 ４，９６２，０２２ および ５，４９８，５２３号明細書）、 およびＰＣＲを基礎とする方法、およびより複雑なＰＣＲを基礎とする核酸フィンガープリント法、たとえばランダム増幅多形ＤＮＡ（「ＲＡＰＤ」）分析（ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ），Ｊ．Ｇ．Ｋ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（２２）：６５３１−６５３５，（１９９０）、参照により本開示に含まれる）、任意プライミングＰＣＲ （「ＡＰ−ＰＣＲ」）（ウェルシュ（Ｗｅｌｓｈ），Ｊ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（２４）：７２１３−７２１８，（１９９０）、参照により本開示に含まれる）、ＤＮＡ増幅フィンガープリント法（「ＤＡＦ」）（カエタノ−アノレス（Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ）他，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：５５３−５５７，（１９９１）、参照により本開示に含まれる）、マイクロサテライトＰＣＲまたはマイクロサテライト領域ＤＮＡ指定増幅（「ＤＡＭＤ」） （ヒース（Ｈｅａｔｈ），Ｄ．Ｄ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（２４）： ５７８２−５７８５，（１９９３）、参照により本開示に含まれる）、および増幅断片長多形（「ＡＦＬＰ」）分析（ヴォス（Ｖｏｓ），Ｐ．，他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３（２１）：４４０７−４４１４ （１９９５）；リン（Ｌｉｎ），Ｊ．Ｊ．，他，ＦＯＣＵＳ，１７（２）：６６−７０，（１９９５）、参照により本開示に含まれる）を含むがそれらに限定されない。
【０１７１】
配列決定すべき核酸分子が、配列決定反応混合物中の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと一旦接触させられると、配列決定反応は上記で開示されるプロトコルまたは本分野で公知であるその他に従って進行しうる。
【０１７２】
特に好ましい一実施形態では、アクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための配列決定反応混合物は、ＴＡＰＳ−トリス （２０ｍＭ，ｐＨ８．７）、 ２５ｍＭ Ｋ2ＳＯ4，１０ｍＭ ＮＨ4（ＯＡｃ）2，および １０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む。好ましくは、反応混合物は、αサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を制限するように亜鉛を欠く。
【０１７３】
別の特に好ましい一実施形態では、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼとの使用のための配列決定反応混合物は、ＨＥＰＥＳ−Ｂｉｓ−トリス−プロパン（２０ｍＭ，ｐＨ７．５）、および１０ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含む。好ましくは、反応混合物は、αサブユニットの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を制限するように亜鉛を欠く。
キット
【０１７４】
一態様では、本発明は、ここで開示される最小Ｐｏｌ ＩＩＩを利用する、核酸複製のためのキットを提供する。キットは、ここで開示される修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む。
【０１７５】
好ましい一実施形態では、核酸増幅キットは、緩衝液および安定剤、またはここに記載の通り安定剤を含む緩衝液を含む。安定剤は、熱安定性修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを用いる熱サイクル反応用のキットにおいて特に好ましい。
【０１７６】
本発明に記載の核酸配列決定キットは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼおよび好ましくはジデオキシヌクレオチド三リン酸を含む。配列決定キットは、ピロホスファターゼ、配列決定ゲルを処方するためのアガロースまたはポリアクリルアミド媒体といった、標準的な核酸配列決定プロトコルを実施するのに必要な別の試薬および化合物、および配列決定された核酸の検出に必要な他の成分をさらに含みうる（ＤＮＡ配列決定の方法を対象とする米国特許第４，９６２，０２０および５，４９８，５２３号明細書を参照）。
【０１７７】
核酸増幅キットは、好ましくは、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼおよびｄＮＴＰを含む。増幅キットはさらに、標準的な核酸増幅プロトコルを実施するために必要な別の試薬および化合物を含みうる（ＰＣＲによるＤＮＡ増幅の方法を対象とする米国特許第４，６８３，１９５および４，６８３，２０２号明細書を参照；参照により本開示に含まれる）。
【０１７８】
一実施形態では、キットはＡＴＰを欠き、およびＡＴＰはキットによって提供される核酸複製反応で使用されない。
【０１７９】
別の好ましい実施形態では、本発明の核酸複製キットは、３−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する第二のＤＮＡポリメラーゼをさらに含みうる。好ましいのは、Ｐｆｕ／ＤＥＥＰＶＥＮＴ、ＴｌｉＮＥＮＴ？、Ｔｍａ、Ｔｎｅ（３’エキソ＋）、およびその変異体および誘導体である。ＰｏｌＣもまた好ましい。
【０１８０】
本発明のキットは、情報パンフレットを含みうる。
ベクターおよび宿主細胞
【０１８１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子を含むベクター、およびそのようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチド分子のうち任意のものを、一般的に選択可能マーカーおよび複製開始点を含むベクターに含めることができる。ベクターはさらに、細菌分子またはウイルス分子に由来するもののような、適当な転写および／または翻訳調節配列を含む。そのような調節配列の例は、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および適当な配列を含む。プロモーターヌクレオチド配列がコード配列の転写を導く場合、プロモーターヌクレオチド配列は、コードＤＮＡ配列に調節可能に結合している。
【０１８２】
本発明の標的ポリペプチドをコードするサブユニット分子のクローニングに適したベクターの選択は、ベクターで形質転換される宿主細胞、および、該当する場合には、標的ポリペプチドを発現すべき宿主細胞に依存する。適当な宿主細胞は上記で考察されているが、しかし原核生物、酵母、およびその他の類似の生物を含む。具体例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の細菌、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の仲間；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈｏｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、およびクリベロマイセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母を含む。
【０１８３】
本発明の修飾αサブユニットは、融合タンパク質構造を生じるように、異種タンパク質またはペプチドをコードする配列と組み換えによって結合されうる。そのような異種タンパク質またはペプチドは、たとえば、精製の促進、分泌の増大、または安定性の上昇を可能にするように含められうる。たとえば、修飾αサブユニットがシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるように、シグナルペプチド（分泌リーダー）をコードする核酸配列が、修飾αサブユニット配列のフレーム内に融合されうる。
【０１８４】
特定のベクターへの挿入、特定の発現系または宿主での使いやすさ（たとえば、制限部位を修飾することによる）、などを促進するための、本発明の修飾α−サブユニットをコードするポリヌクレオチド分子の修飾が公知であり、および本発明における使用が考えられている。修飾α−サブユニットポリペプチドの産生のための遺伝工学法は、無細胞発現系で、細胞系で、宿主細胞で、組織で、および動物モデルでのポリヌクレオチド分子の発現を含む。
抗体
【０１８５】
本発明の新規のポリペプチド、およびその断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生じるのに使用されうる。好ましくは、修飾β−結合部位を含むペプチドが、抗体の調製に使用される。抗体の設計および産生のための方法は本分野で公知であり、たとえば、『抗体：実験の手引き』（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびランド（Ｌａｎｄ）（編）、１９８８コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ），コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク；『モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物分析の新次元』（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ），ケネット（Ｋｅｎｎｅｔ）他（編）、１９８０ プレナム・プレス社（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ），ニューヨークを参照。
【０１８６】
本明細書で引用された文献は全体が明示的に参照により本開示に含まれる。
【実施例】
【０１８７】
実施例１：ＰＣＲ比較−変異対非変異２成分Ｐｏｌ ＩＩＩ系
【０１８８】
下記の実施例は、βサブユニットを、図４に開示される通り一つ以上の内部β−結合領域に少なくとも一つのアミノ酸変異を有するαサブユニットと組み合わせて含む、２成分Ｔｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系を用いて標的核酸を増幅する有用性を説明するために提供される。実験は、変異αサブユニットを含む２成分Ｔｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系を、非変異αサブユニットを含む２成分Ｔｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系に対して比較する。反応混合物は、２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｂｉｓ−トリスプロパンｐＨ７．５、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２００ｎＭヒトベータグロビン遺伝子プライマー混合物、５０ｎｇヒトゲノムＤＮＡテンプレート、表１に示される少なくとも一つの安定剤の組み合わせ、および修飾２成分組立物についてβサブユニット１、１．２５、１．５および１．７５ｕｇ、およびそれぞれ非修飾２成分ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ組立物についてβサブユニット１．６、２．０、２．４、２．８ｕｇを含む。図８に示す通り、反応当たりの修飾Ｔｔｈ Ｐｏｌ ＩＩＩポリメラーゼの量は非修飾Ｔｔｈ Ｐｏｌ ＩＩＩポリメラーゼの量より１．６倍低いにもかかわらず、修飾２成分ポリメラーゼを用いるすべての反応は、より多くの特異的ＰＣＲ産物を生じる。これは、修飾２成分Ｔｔｈ Ｐｏｌ ＩＩＩポリメラーゼのより良好な合成持続性および特異的活性を示す。
実施例２：ＰＣＲ比較−変異対非変異Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素系
【０１８９】
下記の実施例は、ここに開示される通り内部β−結合部位に変異を有するαサブユニットがＴｔＨ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素系に添加される場合の、非変異αサブユニットを含むＴｔｈ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素系と比較して、不利な増幅収量を説明するために提供される。反応混合物は、２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−Ｂｉｓ−トリスプロパンｐＨ７．５、２００μＭ ｄＮＴＰｓ，２００ ｎＭ Ｕｎｉ−ｏｒｉ プライマー混合物、ＰＢＳプラスミドＤＮＡテンプレート１ｎｇ、表２および３に示される少なくとも一つの安定剤の組み合わせ、βサブユニット２〜５ｍｇ／ｍＬ、δサブユニット０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ、δ’サブユニット０．１〜０．３ｍｇ／ｍＬ、およびＤＮＡＸ複合体（γサブユニット＋Ｔサブユニット）０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬを含む。変異および非変異ＴｔＨ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素系の両方で、対応するαサブユニットは、反応混合物濃度２〜５ ｍｇ／ｍＬを有する。最終反応容量５０μＬが得られる。反応は９５℃ないし４℃の範囲の複数の温度サイクルに曝露される。
【０１９０】
より高い増幅産物収量が、非変異αサブユニットを含むＰｏｌ ＩＩＩホロ酵素系について得られる。
実施例３：伸長速度比較−変異対非変異２成分Ｐｏｌ ＩＩＩ系
【０１９１】
２種類の２成分ＴｔＨ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系の伸長速度が、プライミングされた一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（７．２ｋｂ）をテンプレートとして用いる複製検定法で比較された。第一の２成分系は、ここで開示される通り内部β−結合部位に変異を有するαサブユニットを含む；第二の系は、非変異αサブユニットを含む。この検定法では、各系が７．２ｋｂ長一本鎖テンプレートＤＮＡの複製を完了する時点が測定される。塩基数でのテンプレートサイズを、複製を完了するのに要した秒での反応時間で割って、２成分ＴｔＨ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系の伸長速度を与える。反応混合物は、反応緩衝液、ｄＮＴＰｓ、プライミングされたＭ１３ＤＮＡテンプレート、およびＴｔｈβサブユニット２〜５ｍｇ／ｍＬを含む。各反応混合物は、対応するαサブユニット２〜５ ｍｇ／ｍＬを含む。
【０１９２】
より速い伸長速度が、変異αサブユニットを含む２成分ＴｔＨ ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ系によって示される。
実施例４：２成分Ｐｏｌ ＩＩＩ増幅比較（合成α対変異合成α）
【０１９３】
精製Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩベータサブユニットとの組み合わせで、精製非変異未変化Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩアルファサブユニット（Ｔｔｈ ｎＤｎａＥ）が、精製変異Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼＩＩＩアルファサブユニット（ＴｔｈｍｕＤｎａＥ）と比較された。この一連の実験では、ベータサブユニット（β）の濃度は８１５ｎｇ／反応にて一定に保たれた一方、２つのアルファサブユニット（α）の２濃度（２５０ｎｇ／反応および１２５ｎｇ／反応）が試験された。２つの標的、３ｋｂ ｐＢＳ２および ５ｋｂラムダは、温度サイクル増幅プロトコルを用いて増幅された。反応混合物およびサイクル条件は下記の通り設定された：
【０１９４】
ｐＢＳ２反応
【０１９５】
５ｋｂラムダ反応
【０１９６】
図５および６で見られる通り、変異合成アルファ／ベータの組み合わせは、３ｋｂ ｐＢＳ２および５ｋｂラムダ標的の両方について、合成アルファ／ベータの組み合わせよりも多くの増幅産物を生じた。
実施例５：２成分Ｐｏｌ ＩＩＩ伸長速度比較（合成α対変異合成α）
【０１９７】
この実験では、２成分Ｐｏｌ ＩＩＩ系内での合成アルファおよび変異合成アルファの比較が行われた。２種類のアルファは、ベータと組み合わせた際の、５ｋｂラムダ単位複製配列を生じる能力について試験された。すべての場合で、ベータ対アルファタンパク質濃度比は４：１であった。反応およびサイクル条件は下記の通り設定された：
【０１９８】
反応混合物は、４０秒または７０秒のどちらかの伸長時間でサイクルされた。図７に見られる通り、合成アルファ／ベータおよび変異合成アルファ／ベータの組み合わせの両方が、完全な５ｋｂ単位複製配列を伸長時間７０秒で生じた。しかし、変異合成アルファ／ベータの組み合わせだけが、５ｋｂ単位複製配列を伸長時間４０秒で生じた。
【０１９９】
本明細書でのすべての引用は全体が参照により本開示に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図１は、グラム陰性細菌由来のさまざまなＤＮＡポリメラーゼＩＩＩアルファサブユニット（ＤｎａＥ）について内部βサブユニット−結合部位配列の整列を示す。ＤｎａＥのカルボキシ末端に位置する第二のβ−結合部位配列（β／τ−結合部位）は示されていない。
【図２】図２は、ここで記載の通り、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＴｔｈにおけるへリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合領域およびＯＢ折りたたみ領域、およびベータ−結合部位との関係を示す。
【図３】図３は、Ｔｍａにおけるへリックス−ヘアピン−へリックスＤＮＡ結合領域およびＯＢ折りたたみ領域、およびベータ−結合領域との関係を示す。
【図４】図４は、本発明に記載の修飾Ｔｔｈアルファサブユニットのアミノ酸配列に対して、Ｔｔｈアルファサブユニットの野生型Ｃ−末端アミノ酸配列を比較する。
【図５】図５は、ＤＮＡ増幅における修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼおよびＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについての結果比較を示す。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは合成トリプル変異体αと呼ばれる。
【図６】図６は、ＤＮＡ増幅における修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼおよびＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについての結果比較を示す。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは合成トリプル変異体αと呼ばれる。
【図７】図７は、ＤＮＡ増幅における修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼおよびＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼについての結果比較を示す。修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼは変異体αと呼ばれる。
【図８】図８は、ＤＮＡ増幅においてＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと比較した、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを用いて得られる合成持続性および産物収量の改善を示す。
【図９】図９は、ＤＮＡ増幅においてＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと比較した、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを用いて得られる熱安定性の改善を示す。
【図１０】図１０は、ＤＮＡ増幅においてＰｏｌ ＩＩＩレプリカーゼと比較した、修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを用いて得られる熱安定性の改善を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性細菌由来のｐｏｌＣにコードされるαサブユニットの内部β−結合部位配列中に一つ以上の変異を含む修飾αサブユニット。
【請求項２】
ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットのカルボキシ末端β−結合部位中に一つ以上の変異をさらに含む、請求項１に記載の修飾αサブユニット。
【請求項３】
第一の成分を含み、前記第一の成分が修飾αサブユニットを含む、修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項４】
修飾αサブユニットが修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットである、請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項５】
修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットがサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属に由来する、請求項４に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項６】
修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する、請求項５に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項７】
修飾αサブユニットが修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットである、請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項８】
修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットが、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属に由来する、請求項７に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項９】
修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットが、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する、請求項８に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項１０】
核酸分子を複複製反応混合物中での複製反応に供することを含み、その複製反応混合物は請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含み、前記核酸分子が前記複製反応において前記複製反応混合物中で前記修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼによって複製される、核酸分子を複製するための方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む核酸複製反応混合物。
【請求項１２】
請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む、核酸複製に有用な核酸複製キット。
【請求項１３】
請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む核酸複製反応チューブ。
【請求項１４】
（ｉ）テンプレートＤＮＡ分子、（ｉｉ）随意的に、前記テンプレートＤＮＡ分子とハイブリダイズ可能なプライマー、（ＩＩＩ）請求項３に記載の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼ、および（ｉｖ）前記修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを用いる複製反応の産物である、前記テンプレートＤＮＡ分子の少なくとも一つの完全コピー、を含む核酸複製反応混合物。
【請求項１】
グラム陽性細菌由来のｐｏｌＣにコードされるαサブユニットの内部β−結合部位配列中に一つ以上の変異を含む修飾αサブユニット。
【請求項２】
ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットのカルボキシ末端β−結合部位中に一つ以上の変異をさらに含む、請求項１に記載の修飾αサブユニット。
【請求項３】
第一の成分を含み、前記第一の成分が修飾αサブユニットを含む、修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項４】
修飾αサブユニットが修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットである、請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項５】
修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットがサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）またはアクイフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）属に由来する、請求項４に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項６】
修飾ｄｎａＥにコードされるαサブユニットが、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、またはアクイフェックス・エオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）種に由来する、請求項５に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項７】
修飾αサブユニットが修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットである、請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項８】
修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットが、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）、ハイドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）またはカルボキシドサーマス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属に由来する、請求項７に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項９】
修飾ｐｏｌＣにコードされるαサブユニットが、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａpｏｌiｔａｎａ）、またはカルボキシドサーマス・ハイドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）種に由来する、請求項８に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼ。
【請求項１０】
核酸分子を複複製反応混合物中での複製反応に供することを含み、その複製反応混合物は請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含み、前記核酸分子が前記複製反応において前記複製反応混合物中で前記修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼによって複製される、核酸分子を複製するための方法。
【請求項１１】
請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む核酸複製反応混合物。
【請求項１２】
請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む、核酸複製に有用な核酸複製キット。
【請求項１３】
請求項３に記載の修飾ＤＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを含む核酸複製反応チューブ。
【請求項１４】
（ｉ）テンプレートＤＮＡ分子、（ｉｉ）随意的に、前記テンプレートＤＮＡ分子とハイブリダイズ可能なプライマー、（ＩＩＩ）請求項３に記載の修飾Ｐｏｌ ＩＩＩ レプリカーゼ、および（ｉｖ）前記修飾Ｐｏｌ ＩＩＩレプリカーゼを用いる複製反応の産物である、前記テンプレートＤＮＡ分子の少なくとも一つの完全コピー、を含む核酸複製反応混合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５３５４９７（Ｐ２００８−５３５４９７Ａ）
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０５６５３（Ｐ２００８−５０５６５３）
【出願日】平成１８年４月７日（２００６．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３４９３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０８１７９
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（３０７０３６０９６）キアゲン ノース アメリカン ホールディングス， インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月７日（２００６．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３４９３
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０８１７９
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（３０７０３６０９６）キアゲン ノース アメリカン ホールディングス， インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]