免疫グロブリン画分
本発明は、ヒト免疫グロブリン製剤の画分を含む新規医薬組成物、これらの組成物の新規応用、及び前記組成物を製造する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫グロブリン製剤の画分を含む新規医薬組成物、これら組成物の新規な応用、及び前記組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）製剤は、数千の健康なドナーのプールされた血漿（現在のプールサイズは１,０００から６０,０００の範囲である）から由来するものであり、ドナー集団の累積の抗原経験を反映している免疫抗体及び自然抗体（ＮＡｂｓ）の両者を含有している。ＩＶＩＧは、それ故、病原体及び外部抗原、更に自己抗原と反応するＮＡｂｓを対象とする、いわゆる「免疫抗体」の広範囲の特異性を含んでいる。ＮＡｂｓは、人為的な免疫化が存在しない場合、及び外部抗原への曝露とは無関係に発生するものと定義されている（１）。実際、自己抗原に対する抗体の長い一覧表が検出されており、そしてＩＶＩＧ製剤からアフィニティクロマトグラフィーによって精製されてさえいる。これらのＮＡｂｓは、しばしば、多反応性であり、病原体に結合することができ、老化した又は改変した分子や細胞を標識付けし循環から除去することによって、免疫恒常性を保持するのに重要である（２）。更に、これらＮＡｂｓは、自己に対する寛容を保持するために必須の、免疫学的小人と称されている、保存されている免疫優勢抗原のサブセットを認識することが提案されている（３）。しかしながら、これらの抗体のより精密な特徴付け、それらの性状及びＩＶＩＧの小画分におけるそれらの潜在的な存在は、関連する標的抗原及び抗体についての知識の不足により、部分的にしか解明されていない。
【０００３】
ＩＶＩＧの現在の治療応用は、２つの主要なカテゴリーを対象としている：ｉ）一次及び二次抗体欠乏における抗体の交換（４）、ii）全身性炎症及び自己免疫疾患の患者における免疫調節（２、５）である。ＩＶＩＧは、抗体欠乏症及びある種の自己免疫疾患及び炎症性疾患［例えば、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）］において臨床効果を示しているけれども、統計的に有意な対照臨床試験がしばしば欠如しているため、その他の自己免疫状態や全身性炎症性疾患において、未確認の／疑わしい多くの例がある。
【０００４】
ＩＶＩＧの作用様式は、Ｆｃ受容体の発現及び機能の調節、補体活性化とサイトカインネットワークの障害、多くの異なった細胞型における活性化、分化及びエフェクター機能の調節を含む複雑なものである。イディオタイプ・ネットワークは、顕在的な自己免疫疾患を最終的に導くアンバランスを有している免疫恒常性に含まれる、必須のネットワークとして提案されている。ＩＶＩＧの現在の治療指標の多くは、病的自己免疫抗体を平衡させる、中和する又は遮断することであり、それ故健康なイディオタイプ・ネットワークを回復することを基本としている（６、７）。最近の報告は、又、単球、樹枝状細胞、内皮並びにＴ及びＢリンパ球の両者に対する直接的効果を示している。この複雑さは、健常者における恒常性の維持における循環抗体の必須の機能に反映している（２、８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
年齢に伴う免疫反応性の低下、いわゆる免疫老化を明らかにした文献に多くの報告がある（９）。しかしながら、加齢に伴う外部抗原に対するＩｇＧ抗体レパトアの年齢依存的な多様性に比較して、自己抗原と反応する自然のＩｇＧ抗体の生涯にわたる安定性があるようである（１０）。
【０００６】
ＩＶＩＧは、正常なヒト血清のＩｇＧ分子及び微量のＩｇＡに相当するＩｇＧイソ型分
布を有する未処理のＩｇＧ分子から成りたっている。処方によって、ＩＶＩＧ製剤は、不定量の単量体ＩｇＧ及び二量体ＩｇＧを含有している。単量体は、単量体ＩｇＧ（およその分子量１５０,０００）を表し、一方、二量体は、以前のデータでは、古典的なイディオタイプ・抗イディオタイプ対として定置させることができる、２ＩｇＧ分子を表している。
【０００７】
欧州公開特許公報第１３９４１８３号は、リガンド、例えば、固体支持体に結合した免疫グロブリン以外のヒト血清中に存在するタンパク質の混合物、に対するアフィニティクロマトグラフィーを使用して、ＩＶＩＧ製剤から自己抗体を精製する方法を開示している。
【０００８】
米国特許第６,２３１,８５６は、抗体に基づく自己免疫疾患の治療のための、実質的に精製され、濃縮された抗イディオタイプ抗体、又はそれらの抗原結合断片を含むヒト抗体組成物を開示している。抗体組成物は、アフィニティクロマトグラフィーによって得られる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、ヒト免疫グロブリン製剤のサイズ分別は、異なった性質を有する、二量体抗体の画分及び単量体抗体の画分を与えることが見出された。二量体画分は、抗原、例えば自己抗原及び／又は外部抗原に対する反応性の増加を示している。更に、二量体画分は、標的抗原に対して高い親和性を有する抗体を含有しており、それ故、高い生物活性、例えば抗細菌活性、抗トキシン活性又は抗ウイルス活性の場合における中和活性、を有しているであろう。これとは対照的に、単量体画分は、低い親和性抗体、例えば自然抗体、即ち、高親和性抗体を発生する基礎的なレパトアを含有しているであろう。
【００１０】
第一の態様において、本発明は、異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含む医薬組成物であって、前記画分が二量体ヒト抗体に由来するものである医薬組成物に関する。
【００１１】
更なる態様において、本発明は、異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含む医薬組成物であって、前記画分が単量体ヒト抗体に由来するものである医薬組成物に関する。
【００１２】
画分は、複数のドナーからのポリクローナルヒト抗体製剤を含むいかなる製剤から得られてもよい。好ましくは、画分は、ＩＶＩＧ製剤から得られる。
【００１３】
これに関連して、ＩＶＩＧ製剤は、複数の、例えば１,０００〜１００,０００人の血液ドナーのプールされた血漿に由来するであろうヒト免疫グロブリン製剤である。抗体の抗原結合断片は、公知の方法によって、例えばタンパク分解消化によって得ることができる。好ましい抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ(ａｂ’)2断片である。
【００１４】
単量体又は二量体画分は、ヒト抗体製剤のサイズ分別によって得ることができる。サイズ分別は、サイズ排除分離、ゲルろ過、限外ろ過、透析ろ過及び／又はその他のゲル又は膜分離法を含んでよい。単量体画分は、約１５０ｋＤａの見かけの分子量を有する抗体単量体を回収することによって得ることができ、そして二量体画分は、約３００ｋＤａの見かけの分子量を有する抗体二量体を回収することによって得ることができる。
【００１５】
好ましくは、サイズ分別は、サイズ排除クロマトグラフィー、例えば、スーパーロース６又はセファクリルＳ−３００カラムを含む。
【００１６】
サイズ分別によって得られる単量体画分及び二量体画分の純度は、分析用ＨＰＬＣ、例えばＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００１７】
二量体抗体画分の純度は、分析用ＨＰＬＣによって測定されるように、通常少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも８５％であり、分析は、好ましくは、サイズ分別後直ちに行われる。
【００１８】
単量体抗体画分の純度は、分析用ＨＰＬＣによって測定されるように、通常少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％であり、分析は、好ましくは、サイズ分別後直ちに行われる。
【００１９】
二量体抗体画分は、破傷風トキソイド及び／又は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）及び／又は緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のトキシンＡ及び／又は赤血球細胞ゴーストのような自己抗原及び／又はＨｅｐ−２上皮細胞のような外部抗原に対する反応性の増加によって、好ましくは特徴付けられる。より詳しくは、二量体画分は、未分別ＩＶＩＧ製剤と比較して、実施例の項で測定されるように、破傷風トキソイド及び／又は呼吸器合胞体ウイルスに対して少なくとも２倍増加した比活性を有することができる。更に、S.pyogenesのＭ毒性タンパク質及び／又はＨｅｐ−２上皮細胞、特に、実施例の項で測定されるように、未分別のＩＶＩＧ製剤と比較して、細胞内抗原に対して少なくとも２倍増大した反応性を有することができる。
【００２０】
二量体抗体画分の医薬組成物は、二量体の形態、又は解離した若しくは（再）単量体化した形態での抗体を含んでいてもよい。好ましくは、抗体は、解離した又は（再）単量体化した形態であり、そこでは二量体の含量は１０％又はそれ以下、より好ましくは５％又はそれ以下である。単量体化は、酸性ｐＨ、例えば約３から約５、好ましくは約３.５から約４.５、より好ましくは約４.０の範囲のｐＨに調節することによって実施することができる。ｐＨは、いずれの薬学的に許容される酸性緩衝剤、例えば酢酸によって調節することができる。二量体抗体の単量体化製剤は、好ましくは、動的に安定であり、実質的に、実施例の項で測定されるような上記で指摘した貯蔵及び使用条件下において、二量体に再変換しない。
【００２１】
二量体画分は、単量体画分よりも、より高い比活性を有する抗体を含有している。それ故、この画分は、好ましくは、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫及び／又は寄生虫感染の病原体による感染に対する薬剤の製造のために使用される。特に好ましいのは、急性感染の治療のための二量体画分の使用である。
【００２２】
二量体画分の更に好ましい応用は、自己免疫疾患に対する、例えば、及び／又は自己免疫恒常性の維持のための、薬剤の製造である。二量体画分は、内部均衡を維持するために重要である、イディオタイプ及び抗イディオタイプ抗体を含有する。二量体は、自己免疫疾患に導く自己反応性クローンのクローン性増殖を回避するために、対応する抗イディオタイプ抗体による制御下に維持されている、生理的自己反応性を示す。例えば、未分別ＩＶＩＧ又は単量体画分のいずれかと比較して、単量体化二量体画分は、実施例の項において測定されるように、シェーグレン症候群の標的抗体の１つである、ムスカリン３受容体（Ｍ３Ｒ）のループ２に対して増加した活性を示す。この活性は、二量体画分中のイディオタイプ及び抗イディオタイプ抗体が単量体化される場合のみに現れる。
【００２３】
高い比活性の故に、二量体画分は低投与量で投与してもよく、その結果高い適合性と低い副作用をもたらす。好ましくは、本発明のこの実施態様において、製剤は、望ましくない副作用の原因となることなく治療効果を得るのに充分な投与量で投与される。
【００２４】
他方、単量体画分は、抗イディオタイプ抗体がない免疫抗体及び自然抗体の両者を含んでおり、病んでいる免疫系を維持し、元気付けるのに特に有益である。好ましい応用は、小児、高齢者又は免疫不全の人々、例えば、免疫系が衰える障害に罹患している、又は免疫系を弱める治療を受けている人々への投与である。特に好ましいのは、老化防止及び／又は若返り療法に対する投与である。又、驚くべきことに、単量体画分は、微生物の多糖類に対して、特にPseudomonas aeruginosaの異なった血清型の多糖類に対して、増大した反応性を有していることが見出された。
【００２５】
それ故、本発明の別の態様は、Pseudomonas aeruginosaによる感染の治療に優先的である、感染微生物に対する薬剤の製造のための、単量体画分の使用である。
【００２６】
単量体製剤の二量体含量は、治療群に対して副作用を避けるために、７％、好ましくは２.５％、そしてより好ましくは１％の最大量に、好ましくは限定される。
【００２７】
なお更なる本発明の態様は、異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を製造する方法であって：
（ａ）異種ドナー集団からのヒト抗体製剤をサイズ分別にかけ；
（ｂ）二量体抗体の画分を回収し、そして場合により二量体抗体を単量体化し；
（ｃ）単量体抗体の画分を回収する；
ことを含む方法である。
【００２８】
単量体画分は、サイズ分別手順において約１５０ｋＤａの分子量を有することで特徴付けられる。二量体画分は、サイズ分別手順において約３００ｋＤａの分子量を有することで特徴付けられる。
【００２９】
更に、本発明は、以下の実施例によって、より詳細に説明されるであろう。
【００３０】
〔図１〕ＩＶＩＧ製剤のクロマトグラフィー及び分別の最適化
１２％ Sandoglobulin（ＳＡＧＬ）製剤について、異なった流速（ＦＲ）、異なったバッファー系を使用し、負荷容積を変化させて、種々のカラムを上記のようにして試験した。単量体、二量体及び会合体の内容について、分析用ＨＰＬＣによって画分を採取し、分析した。
【００３１】
〔図２〕ＩＶＩＧ製剤の分取分別
セファクリルＳ−３００カラム（サイズ２６／６０）をＰＢＳ／０.９２％アジドで平衡化し、続いて１２％ Sandoglobulin（ＳＡＧＬ）製剤（５００ｍｌ）を適用した。カラムを流速１.２ｍｌ／分で運転し、上記したように画分１〜４を採取し、単量体、二量体及び会合体の内容を分析用ＨＰＬＣによって分析した。このカラムは、単量体画分及び二量体画分の調製に対し、実験室規模への拡大を可能にした。
【００３２】
〔図３〕分析用ＨＰＬＣにおけるＩＶＩＧ及び分離した単量体画分及び二量体画分の概要
分析用ＨＰＬＣを、異なった画分中の二量体、単量体及び会合体の比率の分析に使用した：即ち、ＳＡＧＬ１２％製剤から新しく溶解したＩＶＩＧ；セファクリルＳ−３００カラムで単離した単量体画分及び二量体画分である。破線は、分離していないＳＡＧＬに見出された二量体及び単量体を示す。
【００３３】
〔図４〕分離した二量体画分の動力学
分離した二量体画分を室温に保持し、単量体への解離に関して二量体画分の安定性を観察するため、４８時間の最大の時間帯にわたる間隔（範囲は０〜２４時間で示す）で分析
した。実線は二量体画分中の二量体の比率を表し、破線は二量体画分中の単量体の比率を表す。
【００３４】
〔図５〕ＩＶＩＧ中の単量体及び二量体のサイズ排除分離のフローチャート
【００３５】
〔図６〕単量体化二量体画分調製のための最適ｐＨ条件
二量体画分及び単量体画分を採取し、ｐＨ２.６〜７のクエン酸リン酸バッファー又は１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４のいずれかを使用して、ｐＨ４〜７の範囲で、２４時間、４℃にて透析した。透析は、分子量１２,０００〜１４,０００のカットオフ値（ＭＷＣＯ）を有するSpectra/Por 4 Dialysis Membranes（Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, California）又はＭＷＣＯ８,０００を有するMini Dialysis Kit (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)を使用して実施した。分析用ＨＰＬＣを透析後直ぐに実施した。パネルＡ、Ｂ、Ｃ：透析した二量体画分のＨＰＬＣの概要図を示す：二量体ｐＨ４（Ａ）、二量体ｐＨ５（Ｂ）及び二量体ｐＨ７（Ｃ）：パネルＤ、Ｅ、Ｆ：透析した単量体画分のＨＰＬＣの概要図を示す：単量体ｐＨ４（Ｄ）、単量体ｐＨ５（Ｅ）及び単量体ｐＨ７（Ｆ）。
【００３６】
〔図７〕分離した単量体画分及び二量体画分の２Ｄ−ＰＡＧＥ分析
２次元ポリアクリルアミド電気泳動を、2D-Electrophoresis, Principles and Methods
(Amersham Biosciences)に既に記載されたようにして実施した。要約すると、総ＩＶＩＧ、単量体及び二量体免疫グロブリン（Ｉｇ）画分（４μｇ）を、８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、０.００２％ブロムフェノールブルー、ＤＴＴ（０.６５ｍＭ）及びＩＰＧバッファー０.５％をそれぞれ含有する再水和バッファー（１２５μｌ）に希釈した。ＩＰＧ細片、ｐＨ３〜１０（Amersham Biosciences）７cmを一夜再水和し、細片の指示書（ステップ１：一定電圧３００Ｖ／６０分、ステップ２：１０００Ｖ／３０分まで勾配、ステップ３：５０００Ｖ／９０分まで勾配、ステップ４：一定電圧５０００Ｖ／１５分）に従って、ＩＰＧｐｈｏｒユニット（Amersham Biosciences）に焦点を合わせた。焦点をあてたストリップは、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８.８、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセリン、２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、０.００２％（ｖ／ｖ）ブロムフェノールブルー及びＤＴＴ１０ｍｇ／ｍｌ（１次平衡化）又はヨードアセトアミド２５ｍｇ／ｍｌ（２次平衡化）のいずれかを含有する平衡バッファー中で、１５分間の２つのステップで平衡化した。分子量分離のために、細片を、２.５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Merck）、２５ｍＭグリシン（Merck）、０.０１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）（Flucka）を含有するドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）流動バッファー中ですすぎ、１２％ポリアクリルアミドゲル上に置いた。続いて、細片を４％ポリアクリルアミド積層ゲルで重層し、２次元目を、１００Ｖの定電圧でおよそ９０分間MiniProtean電気泳動函（BioRad）で泳動した。銀染色を、PlusOne銀染色キット（Amersham Biosciences）を使用して実施した。
【００３７】
〔図８〕ＩＶＩＧ画分におけるS.pyogenesのＭ５タンパク質に対する反応性
ＥＬＩＳＡ：
抗原（組換えヒトＭタンパク質：Ｍ１、Ｍ３、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ１９）１０μｇ／ｍｌで被覆。ブロッキング：ＰＢＳ／カゼイン２時間３７℃。第１抗体（ＩＶＩＧ：ＴＯ／ＩＶＩＧ、ｐＨ４.０／二量体／単量体）１０、１００及び１０００μｇ／ｍｌ：３７℃で４時間。第２抗体：ＡＰ００４（結合部位）ヒツジ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ、１／１０００（２時間、３７℃）。結果は、全ての他のＭタンパク質を代表する、Ｍ５について示す。
【００３８】
〔図９〕外部抗原に対する二量体画分の微差活性。二量体画分の増大した活性は、結合の親和性の増大と相関している
破傷風トキソイド及びＭ１タンパク質に対する親和性測定。異なったＩＶＩＧ製剤の親
和性を、ＩＡｓｙｓキュベットシステムを使用してオンラインモニタリングによって評価した。キュベットを、Streptococcus pyogenes (S. pyogenes)由来の組換えＭ１タンパク質又は破傷風トキソイドのいずれか（５μｇ）で固定化した。会合を測定するため、ＩＶＩＧ製剤をＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０中異なった濃度に希釈し、試料５０μｌでキュベットに加えた。抗体の解離をモニターするために、キュベットを５０μｌのＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗滌した。再生のために、キュベットを２０ｍＭ・ＨＣｌ（４０μｌ）で２分間、及びＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０（４５μｌ）で３回連続的に洗滌した。ＫDは、ＩＶＩＧ、単量体又は二量体の各濃度に対して得られたＫon値を、ＦＡＳＴｐｌｏｔ及びＧｒａｆｔプログラムを使用して、プロットすることによって計算した。
ＥＬＩＳＡ：
ＩＶＩＧ、単量体画分及び二量体画分は、破傷風トキソイド、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）及びH.influenzae B用の市販キットを使用して分析し、結果は、標準曲線から計算した免疫グロブリン（Ｉｇ）単位／ｇに従って表現した。Ｍ１タンパク質に対する活性を、図７に記載したようにして測定した。
【００３９】
〔図１０〕二量体は、ＨＥｐ−２細胞を使用した機能的中和アッセイにおいてＲＳＶに対する増大した中和活性を示す
異なったＩＶＩＧ製剤（ＩＶＩＧtotalはｐＨ７及びｐＨ４、単量体はｐＨ４、そして二量体はｐＨ４における）の中和作用は、１.５ｍｇ／ｍｌに予備希釈し、９６ウエルプレート（Becton Dickinson, Meylan Cedex, FR）に２倍連続希釈した。ＲＳＶ Ｌｏｎｇ画分（1/2 105TCID50/ml）（５０μｌ）を各ウエルに加えた後、抗体−ウイルス混合物を室温で１時間インキュベートした（パラフィンにてシールして振盪機で）。全ての希釈を、全成分を補充したＤＭＥＭで行った。アッセイに必要なウイルス量は、３日後に１００％細胞死となるＲＳＶ粒子の量（500TCID50/ml）として、前もって定義された。ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２３）を９６ウエルプレート（Becton Dickinson, Meylan Cedex, FR）において培養し、２０,０００細胞／ウエルまで増殖した。その後、培地を取り除き、前もってインキュベートした抗体−ウイルス混合物をＨＥｐ−２細胞に転移し、加湿環境下で３７℃にて、およそ７２時間インキュベートした。
【００４０】
細胞培地をＨＥｐ−２細胞から除き、細胞をＰＢＳ、ｐＨ７.４で２回洗滌した。細胞を、メタノール−アセトン（１：１の割合、４℃に予備冷却）で、４℃にて１０分間固定した。細胞をＰＢＳ、ｐＨ７.４で再び洗滌した。それらをモノクローナルマウス抗ＲＳＶ・ＦＩＴＣ標識抗体（Chemicon Europe LTD., Southampton, UK）（５０μｌ／ウエル）で覆った。標識抗体を、暗所で、３７℃にて１時間インキュベートした。過剰の抗体をＰＢＳ、ｐＨ７.４で２回、蒸留水で１回洗滌除去した。染色した後、蛍光封入液（fluorescence mounting fluid: Chemicon Europe LTD., Southampton, UK）１滴を加え、感染を蛍光顕微鏡（Nikon, Eclipse TE300, Egg/ZH, CH）下、倍率２０倍で可視化した。画像は画像解析ソフトウエア（ACT-1, Nikon, Egg/ZH, CH）を使用して、デジタルカメラ（Nikon, Digital Camera DXM1200, Egg/ZH, CH）で取り込んだ。
【００４１】
〔図１１〕二量体は、シェーグレン症候群の標的抗原であるムスカリン３受容体のループ２ペプチドに対して増大した活性を示す
ＩＶＩＧ製剤（ＩＶＩＧtotalはｐＨ７及びｐＨ４、単量体はｐＨ４、そして二量体はｐＨ４において）は、Ｍ３Ｒのループ２を表す合成ペプチドを使用してＥＬＩＳＡで（図８で既に記載したように）比較した。
【００４２】
〔図１２〕二量体は、細胞外自己抗原と比較すると細胞内自己抗原に対し選択的に増大した活性を示す
濃度１００μｇ／ｍｌで使用したｐＨ４における単量体及び二量体を、１０μｇ／ｍｌ
で被覆した細胞内及び細胞外タンパク質を表す抗原を使用して（図８に既に記載したようにして）ＥＬＩＳＡで比較した。
【００４３】
〔図１３〕単量体は、Pseudomonas aeruginosaの種々のリポ多糖類血清型（ＩＡＴＳ）に対して選択的な反応性を示すが、トキシンＡについてはその逆であることが見出された
Pseudomonas aeruginosaのＬＰＳ血清型（International Antigen Typing System）及びトキシンＡを標準ＥＬＩＳＡによって評価した。各プレートは、標準抗体製剤（８価Pseudomonas aeruginosaのＯ−多糖類トキシンＡ共役ワクチンで免役した９個人のプールした血漿）、対照血漿及び試験試料（単量体及び二量体）の連続希釈物を含有した。標準抗体は、対照血漿及び試験試料における抗ＬＰＳ又は抗トキシンＡＩｇＧ抗体濃度を定量するための基準として使用した。
【００４４】
〔図１４〕二量体は、ＨＥｐ−２細胞における細胞骨格タンパク質免疫蛍光に対して増大した活性を示す
免疫組織学のために、ＩＶＩＧ、単量体及び二量体Ｉｇ画分（５０μｌ）を診断用ＡＮＡ（ＨＥｐ−２アクチン）スライド（INOVA Diagnostics, Inc., San Diego, US）上で、２００μｇ／ｍｌで３０分間インキュベートし、続いて、ＰＢＳで５分間洗滌工程を行った。その後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ複合体（INOVA Diagnostics, Inc., San Diego, US）を２０分間インキュベートし、次いで、別に５分間ＰＢＳで洗滌した。画像は、ＡＣＴ−１ソフトウエア（Nikon）を採用し、蛍光顕微鏡（Nikon E600, Eclipse）を用いて倍率４００倍で得た。
【００４５】
〔図１５〕二量体は、ＨｅｐＧ２細胞において増大した自己反応性を示す
ＨｅｐＧ２（肝癌）細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地でコンフルエントになるまで増殖させた。細胞をトリプシン処理し、溶解前にＰＢＳで２回洗滌した。細胞タンパク質をトリクロロ酢酸沈殿に処して、図７で前に記載したのと同じ手順を使用して引続き２Ｄ−ＰＡＧＥを行うようにした。得られた２次元ゲル（銀染色、図１.ａを参照）は、ニトロセルロースに転写し、０.１５％カゼイン含有ＰＢＳでブロックし、単量体ＩｇＧ画分（図１.ｂ）又は二量体ＩｇＧ画分（図１.ｃ）を１０μｇ／ｍｌで４℃にて、一夜インキュベートした。展開は、アルカリ性ホスファターゼ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をＰＢＳ−カゼイン（０.１５％）中で１：１,０００で、アルカリ性ホスファターゼ展開キット（BioRad Inc.）を使用して行った。
【００４６】
〔図１６〕二量体は、異なった動物種からの上皮細胞の細胞内タンパク質に対して増大した活性を示す
サル（ＣＯＳ−７）、ヒト（ＨＥＰ−Ｇ２、ＨＥｐ−２）及びハムスター（ＣＨＯ）からの上皮細胞のＦＡＣＳ分析。ラット好塩基球性白血病細胞野生型（ＲＢＬｗｔ）を、対照の非上皮細胞として使用した（ＦＡＣＳ分析結果は示していない）。
フローサイトメトリーのために、全ての接着細胞を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ０.０３％（ｗ／ｖ）で剥離し、ＰＢＳ−カゼイン０.１５％（ｗ／ｖ）（Sigma, Buchs, Switzerland）中１％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ−カゼイン０.１５％（ｗ／ｖ）中０.３％サポニン（Sigma, Buchs, Switzerland）で透過性化した。間接染色を２回多段階手法で実施した：（１）非透過性化細胞又は透過性化細胞を、それぞれ、ＰＢＳ−カゼイン０.１５％（ｗ／ｖ）又はＰＢＳ−カゼイン０.１５％／サポニン０.３％（両者、ｗ／ｖ）のいずれかで、ＩＶＩｇ、単量体又は二量体Ｉｇ画分（５０μｇ）と２０分間インキュベーション。（２）イソ型特異性ＦＩＴＣ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ−ＦＣ（ＰＦＯ０４、The Binding Site、Birmingham）と２０分間インキュベーション。両インキュベーション共ＰＢＳで２回の５分間洗滌工程が続けられた。フローサイトメトリーデータ獲得は、Cell Quest Proソフトウエアを使用したFACS Calibur装置（両者共Becton-Dickinson）で行われ、その後のデータ解析には、Win ＭＤＩソフトウエア（(C)Joseph Trotter）
を採用した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
イムノドット：
抗原１０ｎｇ、１００ｎｇ及び５００ｎｇの風乾ドット。ブロッキング：トップブロック、１.５時間、室温（ＲＴ）。第１抗体（二量体／単量体）１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌ：一夜４℃。第２抗体：ＡＰ００４（結合部位）ヒツジ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ（２時間、ＲＴ）。
反応性：
＋：抗原ドット１０ｎｇに対して免疫グロブリン製剤１００μｇ／ｍｌで強い反応。
＋／−：抗原ドット５００ｎｇに対して免疫グロブリン製剤５００μｇ／ｍｌで弱い反応。
−：抗原ドット５００ｎｇに対して免疫グロブリン製剤５００μｇ／ｍｌで反応性なし。
【００４９】
ＥＬＩＳＡ：
抗原１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌで被覆。ＰＢＳ／カゼインで２時間、３７℃でブロッキング。第１抗体（二量体／単量体）１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ及び１０００μｇ／ｍｌ：４時間、３７℃。第２抗体：ＡＰ００４（結合部位）ヒツジ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ、１／１０００（２時間、３７℃）。
反応性：
抗原１０μｇ／ｍｌで免疫グロブリン画分１００μｇ／ｍｌと反応性を比較。＋＋：二量体シグナルが単量体よりも少なくとも対数倍検出される。＋：バックグランドを越えた明らかなシグナル。＋／−：弱いシグナルであるが、なおバックグランドより上。−：シグナルなし。
【実施例】
【００５０】
本発明者らは、ＩＶＩＧ製剤中に見出された単量体画分及び二量体画分の微差反応性を調べた。本発明者らは凍結乾燥製剤を使用し、これを臨床においてインビボで使用するための指示書に従って溶解した。このＩＶＩＧ、ＳＡＧＬ（サンドグロブリンの短縮形）とも呼ばれている、を一定量とり、更なる実験用として２０℃で貯蔵した。このＩＶＩＧを、全ての更なるアッセイにおける標準品として使用し、単量体画分及び二量体画分の分離のための条件確立に使用した。本発明者らの結果は、種々の技術を用いて確認されている、自己抗原及び外部抗原の両者に対するこれらの画分の微差反応性パターンを示唆している。
【００５１】
１）ＩＶＩＧの単量体画分及び二量体画分の単離：
分別を最適化するため、本発明者らは、いくつかの異なったカラムの型（セファクリル、スーパーロース、レプロシル）及び異なった条件（バッファー、流速、カラムのサイズ）を試験した。セファクリルＳ−３００という半分取ＨＰＬＣシステムは、分別において、良好なピーク分離、高純度の画分、短いランタイム及び高タンパク質濃度の組合せをもたらした（図１及び２を参照）。分離された画分は、図３に示すように、ＨＰＬＣによって直ちに分析された。以前の報告と一致して、本発明者らは、二量体が、バッファー、ｐＨ、温度、タンパク質濃度及び貯留時間によって影響される動的不安定性（即ち、単量体形に戻る傾向）を示すことを観察した。図４は、室温で貯蔵された場合の、分離された二量体画分の崩壊の動力学を示す。数時間のうちに、より安定な二量体集団に減少する二量体ＩｇＧは、もとの二量体の２０から３０％の範囲になる。一般的に、二量体の形成はゆっくりであるが、それらの崩壊はより速い。対照的に、単量体画分は、何週間にもわたって安定であり、二量体を再形成しない。
【００５２】
２）解離した二量体製剤の製造：
動的に安定であり、注射した際に二量体のインビボ解離を模倣するような二量体画分を製造するために、解離した二量体画分で、その単量体成分に効率的に変換されるものを使用した。至適ｐＨ条件を、４から７の範囲のｐＨのバッファーに対して二量体と単量体（対照のため）の両者を透析することによって試験した。透析に続いて、直ちに透析画分をＨＰＬＣ分析した。図６に示すように、二量体の解離に至適なｐＨは、ｐＨ４（残りの二量体含量は１０％未満に減少した）であるが、ｐＨ５及び７で透析すると、残留する二量体含量は、それぞれ、３９.４１％及び５５.１９％であった。単量体画分は、試験した全てのｐＨ条件で著しく安定である。このことは、二量体画分がサイズ排除によって分離され、その後の処理（本発明者らによる、例えば、ｐＨ４.０の酢酸中への透析を使った）により二量体ＩｇＧは単量体に変換されたことを意味している。これには、ｐＨ４.０で１０ｍＭの酢酸中への透析が、最低２４時間必要であった。その後、この解離した二量体製剤は、５％未満の二量体を含有しており、動的に安定性を維持しており、貯蔵及び使用のために定められた条件下では二量体に再変換しない。更に、解離した二量体をＰＢＳバッファー中でｐＨ７.４に中和しても、室温において２４時間まで貯蔵した後でも、二量体の含有率に影響しなかった。このように、反応性を評価するために使用されるアッセイ条件の間、解離した二量体は解離したまま残っていることになる。単量体と二量体を等しく比較するために、単量体には同じ処理を施し、同じバッファー系で比較した。使用した種々の画分の分離及び製剤についての、最適なフローチャートの例を図５に示す。
【００５３】
３）単量体及び解離した二量体製剤の特徴付け
両画分は、２次元ゲル電気泳動において重鎖及び軽鎖についての予期された総合的な型を明らかに示した。二量体画分は、より酸性領域へ拡張したより広い等電点分布の傾向を示した（図７）。比較イソタイプ分析では、二量体画分において、ＩｇＧ１、２、４及び幾分増加したＩｇＧ３の等しい分布を示した。
【００５４】
４）単量体及び解離した二量体製剤の微差反応性
ある範囲の異なったアッセイにおける外部抗原及び自己／自己抗原の両者に対する反応性を調べた。要約すると、二量体画分は、自己抗原及び外部抗原の両者のある種の抗原に対して、増大した反応性を示す。ある場合には、反応の親和性を測定したが、二量体において明らかに増大していた。単量体又は二量体のいずれかにのみ反応性が存在する抗原特異性は見出せなかった。検出可能な抗体反応性が、単量体又は二量体のいずれにも検出さ
れない抗原がある。
【００５５】
図８は、Streptococcus pyogenesのヒト組換えＭ５タンパク質（毒性因子）を用いたＥＬＩＳＡからの結果を示す。二量体は、単量体若しくはＴＯ（調製され、時間ゼロで凍結されたＩＶＩＧ）と定義されたＩＶＩＧ製剤、又はｐＨ４.０と定義されたＩＶＩＧ（二量体と同じバッファー中に透析したＩＶＩＧ）のいずれと比較しても、明らかに増強された反応を示す。
【００５６】
図９は、破傷風トキソイド、S.pyogenesのＭ１、ＲＳＶ及びH.influenzae Bの外部抗原に対する結果を示す。二量体は、明らかに増強された反応を示しており、それは、両画分において同じ反応性を示すH.influenzae Bを除いて、親和性測定によって確認された。
【００５７】
図１０は、単量体に比較して二量体における増大した抗ＲＳＶ活性を示す。ｐＨ７及びｐＨ４での分離していないＩＶＩＧの、ｐＨ４での単量体の、及びｐＨ４での二量体の中和作用を評価した。これら４つのＩＶＩＧ画分を滴定し、ＨＥｐ−２細胞の＞９０％が感染から防御されるＩｇＧ濃度を決定した。ＨＥｐ−２細胞のＲＳＶ感染の検出は、免疫蛍光染色によってはっきりと示された（図１０）。試験されたＩＶＩＧ画分によって変化する用量依存性が明瞭に見られた。中和活性における最も著しい相異は、ｐＨ４での単量体と二量体の比較で見られた。二量体（４６.８μｇ／ｍｌ）よりもより多くの単量体（１８７μｇ／ｍｌ）が、同じ量のＲＳＶ粒子を１００％中和するのに必要とされた。
【００５８】
図１１は、シェーグレン症候群の標的抗原の１つであるＭ３Ｒペプチドに対して、単量体に比較して二量体において、活性が増大していることを示す。Ｍ３Ｒに対する自己抗体が、ＩＶＩＧ製剤に、より詳しくは解離した二量体に存在しており、正常な生理条件下で、そのような自己抗体の抗イディオタイプ制御の存在を示唆している。
【００５９】
図１２は、細胞外自己抗原と比較した細胞内コンパートメントに存在する自己抗原に対する、二量体の優勢な反応性を示している。
【００６０】
図１３は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の種々のリポ多糖体血清型（ＩＡＴＳ分類によって表される）に対する単量体の明らかに増大した活性を示す。相対的に、二量体は、タンパク質、トキシンＡに対して増大した活性を示した。
【００６１】
図１４は、免疫組織学的解析にＨＥｐ−２細胞を使用した結果を示す。これらの細胞は、一連の核抗原、リボソーム抗原及びミトコンドリア関連抗原と反応する種々の自己免疫疾患において見出される自己抗体を検出するために、臨床検査室によって通常使用されている。反応性の病原的型は見られなかった。代わりに、高い倍率において細胞の細胞骨格成分のようにみえる、二量体画分の著しい活性があった。
【００６２】
図１５は、ＨＥｐ−２（上皮）細胞において免疫蛍光によって前に観察された結果を確認したものである。この図は、単量体画分又は二量体画分のいずれかを使用し、ＨｅｐＧ２細胞のプロテオームの２次元解析に続くウエスタンブロッティングを示す。単量体画分に比較して二量体画分において自己反応性の増大が見られる。反応性におけるこの増大は、スポット採取と質量分析法によって定量された、自己抗原の限られた明確な免疫優性サブセットによるものである。
【００６３】
図１６は、異なった型の上皮細胞についてのＦＡＣＳ分析の結果を示す。細胞は、処理されたか、即ち、膜染色と細胞内染色のそれぞれの間の識別を可能にするように透過性にされたか、又は処理されなかったかのいずれかであった。二量体は、処理された全ての上皮細胞に対して増大した細胞内反応性を示す。バックグランドを越える顕著な染色は、非
透過性細胞については見られなかった。このことは、試験した全ての画分について、膜タンパク質との反応性が欠けていることを示している。対照的に、対照の非上皮細胞系（形状は示していない）として使用した非処理ＲＢＬ細胞は、全ての画分によって均等に染色されたことを示した。このことは、多分、Ｆｃ−γ受容体との相互作用を表している。
【００６４】
表１は、それぞれの抗原が固定化され、ある濃度範囲の単量体、二量体及び対照としてのＩＶＩＧ出発製剤と反応することを可能にした、ＥＬＩＳＡとイムノドットアッセイの両者による累積データを表す。比較に便利なように、単量体と二量体は、単純な反応性の等級（＋＋から−）で比較した。微差反応性が、単量体と二量体の間で明らかに見られた。ある種の自己抗原、例えばミオシン及びホスホリラーゼＢは、単量体と反応するが、二量体とも増大した反応性を示すように見える。
【００６５】
要約
上記の結果に基づいて、二量体画分は、より成熟した抗体レパトアを含有し、細胞内自己抗原に対して顕著な活性を示す。対照的に、免疫固体及び自然抗体の両者からなる単量体画分は、ある種の多糖類抗原と優先的に反応するようである。
【００６６】
二量体画分は高親和性抗体を含有し、それ故、この画分は、又、例えば抗細菌抗体、抗トキシン抗体又は抗ウイルス抗体の場合における中和活性について、生物学的により活性であろう。それ故、二量体画分は、ある種の抗原に対して高い比活性を有するＩＶＩＧの亜画分を意味する。このことは、又、免疫系は恒常性を維持するためにネガティブフィードバック又はダウンレギュレーションによって産生される高親和性抗体に応答しなければならないから、この画分に抗イディオタイプ抗体が存在することを明らかにしていることになる。
【００６７】
単量体画分は、自然抗体、即ち、高親和性抗体が発生しなければならない基本的なレパトアを提供する、低親和性抗体を含有している。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＩＶＩＧ製剤のクロマトグラフィー及び分別の最適化を示す。
【図２】ＩＶＩＧ製剤の分取分別を示す。
【図３】分析用ＨＰＬＣにおけるＩＶＩＧ及び分離した単量体画分及び二量体画分の概要を示す。
【図４】分離した二量体画分の動力学を示す。
【図５】ＩＶＩＧ中の単量体及び二量体のサイズ排除分離のフローチャートを示す。
【図６】単量体化二量体画分調製のための最適ｐＨ条件を示す。
【図７】分離した単量体画分及び二量体画分の２Ｄ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図８】ＩＶＩＧ画分におけるS.pyogenesのＭ５タンパク質に対する反応性を示す。
【図９】外部抗原に対する二量体画分の微差活性。二量体画分の増大した活性は、結合の親和性の増大と相関しているを示す。
【図１０】二量体は、Ｈｐ−２細胞を使用した機能的中和アッセイにおいてＲＳＶに対する増大した中和活性を示す。
【図１１】二量体は、シェーグレン症候群の標的抗原であるムスカリン３受容体のループ２ペプチドに対して増大した活性を示す。
【図１２】二量体は、細胞外自己抗原と比較すると細胞内自己抗原に対し選択的に増大した活性を示す。
【図１３】単量体は、Pseudomonas aeruginosaの種々のリポ多糖類血清型（ＩＡＴＳ）に対して選択的な反応性を示すが、トキシンＡについてはその逆であることが見出された。
【図１４】二量体は、ＨＥｐ−２細胞における細胞骨格タンパク質免疫蛍光に対して増大した活性を示す。
【図１５】二量体は、ＨｅｐＧ２細胞において増大した自己反応性を示す。
【図１６】二量体は、異なった動物種からの上皮細胞の細胞内タンパク質に対して増大した活性を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫グロブリン製剤の画分を含む新規医薬組成物、これら組成物の新規な応用、及び前記組成物を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）製剤は、数千の健康なドナーのプールされた血漿（現在のプールサイズは１,０００から６０,０００の範囲である）から由来するものであり、ドナー集団の累積の抗原経験を反映している免疫抗体及び自然抗体（ＮＡｂｓ）の両者を含有している。ＩＶＩＧは、それ故、病原体及び外部抗原、更に自己抗原と反応するＮＡｂｓを対象とする、いわゆる「免疫抗体」の広範囲の特異性を含んでいる。ＮＡｂｓは、人為的な免疫化が存在しない場合、及び外部抗原への曝露とは無関係に発生するものと定義されている（１）。実際、自己抗原に対する抗体の長い一覧表が検出されており、そしてＩＶＩＧ製剤からアフィニティクロマトグラフィーによって精製されてさえいる。これらのＮＡｂｓは、しばしば、多反応性であり、病原体に結合することができ、老化した又は改変した分子や細胞を標識付けし循環から除去することによって、免疫恒常性を保持するのに重要である（２）。更に、これらＮＡｂｓは、自己に対する寛容を保持するために必須の、免疫学的小人と称されている、保存されている免疫優勢抗原のサブセットを認識することが提案されている（３）。しかしながら、これらの抗体のより精密な特徴付け、それらの性状及びＩＶＩＧの小画分におけるそれらの潜在的な存在は、関連する標的抗原及び抗体についての知識の不足により、部分的にしか解明されていない。
【０００３】
ＩＶＩＧの現在の治療応用は、２つの主要なカテゴリーを対象としている：ｉ）一次及び二次抗体欠乏における抗体の交換（４）、ii）全身性炎症及び自己免疫疾患の患者における免疫調節（２、５）である。ＩＶＩＧは、抗体欠乏症及びある種の自己免疫疾患及び炎症性疾患［例えば、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）］において臨床効果を示しているけれども、統計的に有意な対照臨床試験がしばしば欠如しているため、その他の自己免疫状態や全身性炎症性疾患において、未確認の／疑わしい多くの例がある。
【０００４】
ＩＶＩＧの作用様式は、Ｆｃ受容体の発現及び機能の調節、補体活性化とサイトカインネットワークの障害、多くの異なった細胞型における活性化、分化及びエフェクター機能の調節を含む複雑なものである。イディオタイプ・ネットワークは、顕在的な自己免疫疾患を最終的に導くアンバランスを有している免疫恒常性に含まれる、必須のネットワークとして提案されている。ＩＶＩＧの現在の治療指標の多くは、病的自己免疫抗体を平衡させる、中和する又は遮断することであり、それ故健康なイディオタイプ・ネットワークを回復することを基本としている（６、７）。最近の報告は、又、単球、樹枝状細胞、内皮並びにＴ及びＢリンパ球の両者に対する直接的効果を示している。この複雑さは、健常者における恒常性の維持における循環抗体の必須の機能に反映している（２、８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
年齢に伴う免疫反応性の低下、いわゆる免疫老化を明らかにした文献に多くの報告がある（９）。しかしながら、加齢に伴う外部抗原に対するＩｇＧ抗体レパトアの年齢依存的な多様性に比較して、自己抗原と反応する自然のＩｇＧ抗体の生涯にわたる安定性があるようである（１０）。
【０００６】
ＩＶＩＧは、正常なヒト血清のＩｇＧ分子及び微量のＩｇＡに相当するＩｇＧイソ型分
布を有する未処理のＩｇＧ分子から成りたっている。処方によって、ＩＶＩＧ製剤は、不定量の単量体ＩｇＧ及び二量体ＩｇＧを含有している。単量体は、単量体ＩｇＧ（およその分子量１５０,０００）を表し、一方、二量体は、以前のデータでは、古典的なイディオタイプ・抗イディオタイプ対として定置させることができる、２ＩｇＧ分子を表している。
【０００７】
欧州公開特許公報第１３９４１８３号は、リガンド、例えば、固体支持体に結合した免疫グロブリン以外のヒト血清中に存在するタンパク質の混合物、に対するアフィニティクロマトグラフィーを使用して、ＩＶＩＧ製剤から自己抗体を精製する方法を開示している。
【０００８】
米国特許第６,２３１,８５６は、抗体に基づく自己免疫疾患の治療のための、実質的に精製され、濃縮された抗イディオタイプ抗体、又はそれらの抗原結合断片を含むヒト抗体組成物を開示している。抗体組成物は、アフィニティクロマトグラフィーによって得られる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、ヒト免疫グロブリン製剤のサイズ分別は、異なった性質を有する、二量体抗体の画分及び単量体抗体の画分を与えることが見出された。二量体画分は、抗原、例えば自己抗原及び／又は外部抗原に対する反応性の増加を示している。更に、二量体画分は、標的抗原に対して高い親和性を有する抗体を含有しており、それ故、高い生物活性、例えば抗細菌活性、抗トキシン活性又は抗ウイルス活性の場合における中和活性、を有しているであろう。これとは対照的に、単量体画分は、低い親和性抗体、例えば自然抗体、即ち、高親和性抗体を発生する基礎的なレパトアを含有しているであろう。
【００１０】
第一の態様において、本発明は、異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含む医薬組成物であって、前記画分が二量体ヒト抗体に由来するものである医薬組成物に関する。
【００１１】
更なる態様において、本発明は、異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含む医薬組成物であって、前記画分が単量体ヒト抗体に由来するものである医薬組成物に関する。
【００１２】
画分は、複数のドナーからのポリクローナルヒト抗体製剤を含むいかなる製剤から得られてもよい。好ましくは、画分は、ＩＶＩＧ製剤から得られる。
【００１３】
これに関連して、ＩＶＩＧ製剤は、複数の、例えば１,０００〜１００,０００人の血液ドナーのプールされた血漿に由来するであろうヒト免疫グロブリン製剤である。抗体の抗原結合断片は、公知の方法によって、例えばタンパク分解消化によって得ることができる。好ましい抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ(ａｂ’)2断片である。
【００１４】
単量体又は二量体画分は、ヒト抗体製剤のサイズ分別によって得ることができる。サイズ分別は、サイズ排除分離、ゲルろ過、限外ろ過、透析ろ過及び／又はその他のゲル又は膜分離法を含んでよい。単量体画分は、約１５０ｋＤａの見かけの分子量を有する抗体単量体を回収することによって得ることができ、そして二量体画分は、約３００ｋＤａの見かけの分子量を有する抗体二量体を回収することによって得ることができる。
【００１５】
好ましくは、サイズ分別は、サイズ排除クロマトグラフィー、例えば、スーパーロース６又はセファクリルＳ−３００カラムを含む。
【００１６】
サイズ分別によって得られる単量体画分及び二量体画分の純度は、分析用ＨＰＬＣ、例えばＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００１７】
二量体抗体画分の純度は、分析用ＨＰＬＣによって測定されるように、通常少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも８５％であり、分析は、好ましくは、サイズ分別後直ちに行われる。
【００１８】
単量体抗体画分の純度は、分析用ＨＰＬＣによって測定されるように、通常少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％であり、分析は、好ましくは、サイズ分別後直ちに行われる。
【００１９】
二量体抗体画分は、破傷風トキソイド及び／又は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）及び／又は緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のトキシンＡ及び／又は赤血球細胞ゴーストのような自己抗原及び／又はＨｅｐ−２上皮細胞のような外部抗原に対する反応性の増加によって、好ましくは特徴付けられる。より詳しくは、二量体画分は、未分別ＩＶＩＧ製剤と比較して、実施例の項で測定されるように、破傷風トキソイド及び／又は呼吸器合胞体ウイルスに対して少なくとも２倍増加した比活性を有することができる。更に、S.pyogenesのＭ毒性タンパク質及び／又はＨｅｐ−２上皮細胞、特に、実施例の項で測定されるように、未分別のＩＶＩＧ製剤と比較して、細胞内抗原に対して少なくとも２倍増大した反応性を有することができる。
【００２０】
二量体抗体画分の医薬組成物は、二量体の形態、又は解離した若しくは（再）単量体化した形態での抗体を含んでいてもよい。好ましくは、抗体は、解離した又は（再）単量体化した形態であり、そこでは二量体の含量は１０％又はそれ以下、より好ましくは５％又はそれ以下である。単量体化は、酸性ｐＨ、例えば約３から約５、好ましくは約３.５から約４.５、より好ましくは約４.０の範囲のｐＨに調節することによって実施することができる。ｐＨは、いずれの薬学的に許容される酸性緩衝剤、例えば酢酸によって調節することができる。二量体抗体の単量体化製剤は、好ましくは、動的に安定であり、実質的に、実施例の項で測定されるような上記で指摘した貯蔵及び使用条件下において、二量体に再変換しない。
【００２１】
二量体画分は、単量体画分よりも、より高い比活性を有する抗体を含有している。それ故、この画分は、好ましくは、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫及び／又は寄生虫感染の病原体による感染に対する薬剤の製造のために使用される。特に好ましいのは、急性感染の治療のための二量体画分の使用である。
【００２２】
二量体画分の更に好ましい応用は、自己免疫疾患に対する、例えば、及び／又は自己免疫恒常性の維持のための、薬剤の製造である。二量体画分は、内部均衡を維持するために重要である、イディオタイプ及び抗イディオタイプ抗体を含有する。二量体は、自己免疫疾患に導く自己反応性クローンのクローン性増殖を回避するために、対応する抗イディオタイプ抗体による制御下に維持されている、生理的自己反応性を示す。例えば、未分別ＩＶＩＧ又は単量体画分のいずれかと比較して、単量体化二量体画分は、実施例の項において測定されるように、シェーグレン症候群の標的抗体の１つである、ムスカリン３受容体（Ｍ３Ｒ）のループ２に対して増加した活性を示す。この活性は、二量体画分中のイディオタイプ及び抗イディオタイプ抗体が単量体化される場合のみに現れる。
【００２３】
高い比活性の故に、二量体画分は低投与量で投与してもよく、その結果高い適合性と低い副作用をもたらす。好ましくは、本発明のこの実施態様において、製剤は、望ましくない副作用の原因となることなく治療効果を得るのに充分な投与量で投与される。
【００２４】
他方、単量体画分は、抗イディオタイプ抗体がない免疫抗体及び自然抗体の両者を含んでおり、病んでいる免疫系を維持し、元気付けるのに特に有益である。好ましい応用は、小児、高齢者又は免疫不全の人々、例えば、免疫系が衰える障害に罹患している、又は免疫系を弱める治療を受けている人々への投与である。特に好ましいのは、老化防止及び／又は若返り療法に対する投与である。又、驚くべきことに、単量体画分は、微生物の多糖類に対して、特にPseudomonas aeruginosaの異なった血清型の多糖類に対して、増大した反応性を有していることが見出された。
【００２５】
それ故、本発明の別の態様は、Pseudomonas aeruginosaによる感染の治療に優先的である、感染微生物に対する薬剤の製造のための、単量体画分の使用である。
【００２６】
単量体製剤の二量体含量は、治療群に対して副作用を避けるために、７％、好ましくは２.５％、そしてより好ましくは１％の最大量に、好ましくは限定される。
【００２７】
なお更なる本発明の態様は、異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を製造する方法であって：
（ａ）異種ドナー集団からのヒト抗体製剤をサイズ分別にかけ；
（ｂ）二量体抗体の画分を回収し、そして場合により二量体抗体を単量体化し；
（ｃ）単量体抗体の画分を回収する；
ことを含む方法である。
【００２８】
単量体画分は、サイズ分別手順において約１５０ｋＤａの分子量を有することで特徴付けられる。二量体画分は、サイズ分別手順において約３００ｋＤａの分子量を有することで特徴付けられる。
【００２９】
更に、本発明は、以下の実施例によって、より詳細に説明されるであろう。
【００３０】
〔図１〕ＩＶＩＧ製剤のクロマトグラフィー及び分別の最適化
１２％ Sandoglobulin（ＳＡＧＬ）製剤について、異なった流速（ＦＲ）、異なったバッファー系を使用し、負荷容積を変化させて、種々のカラムを上記のようにして試験した。単量体、二量体及び会合体の内容について、分析用ＨＰＬＣによって画分を採取し、分析した。
【００３１】
〔図２〕ＩＶＩＧ製剤の分取分別
セファクリルＳ−３００カラム（サイズ２６／６０）をＰＢＳ／０.９２％アジドで平衡化し、続いて１２％ Sandoglobulin（ＳＡＧＬ）製剤（５００ｍｌ）を適用した。カラムを流速１.２ｍｌ／分で運転し、上記したように画分１〜４を採取し、単量体、二量体及び会合体の内容を分析用ＨＰＬＣによって分析した。このカラムは、単量体画分及び二量体画分の調製に対し、実験室規模への拡大を可能にした。
【００３２】
〔図３〕分析用ＨＰＬＣにおけるＩＶＩＧ及び分離した単量体画分及び二量体画分の概要
分析用ＨＰＬＣを、異なった画分中の二量体、単量体及び会合体の比率の分析に使用した：即ち、ＳＡＧＬ１２％製剤から新しく溶解したＩＶＩＧ；セファクリルＳ−３００カラムで単離した単量体画分及び二量体画分である。破線は、分離していないＳＡＧＬに見出された二量体及び単量体を示す。
【００３３】
〔図４〕分離した二量体画分の動力学
分離した二量体画分を室温に保持し、単量体への解離に関して二量体画分の安定性を観察するため、４８時間の最大の時間帯にわたる間隔（範囲は０〜２４時間で示す）で分析
した。実線は二量体画分中の二量体の比率を表し、破線は二量体画分中の単量体の比率を表す。
【００３４】
〔図５〕ＩＶＩＧ中の単量体及び二量体のサイズ排除分離のフローチャート
【００３５】
〔図６〕単量体化二量体画分調製のための最適ｐＨ条件
二量体画分及び単量体画分を採取し、ｐＨ２.６〜７のクエン酸リン酸バッファー又は１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４のいずれかを使用して、ｐＨ４〜７の範囲で、２４時間、４℃にて透析した。透析は、分子量１２,０００〜１４,０００のカットオフ値（ＭＷＣＯ）を有するSpectra/Por 4 Dialysis Membranes（Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, California）又はＭＷＣＯ８,０００を有するMini Dialysis Kit (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)を使用して実施した。分析用ＨＰＬＣを透析後直ぐに実施した。パネルＡ、Ｂ、Ｃ：透析した二量体画分のＨＰＬＣの概要図を示す：二量体ｐＨ４（Ａ）、二量体ｐＨ５（Ｂ）及び二量体ｐＨ７（Ｃ）：パネルＤ、Ｅ、Ｆ：透析した単量体画分のＨＰＬＣの概要図を示す：単量体ｐＨ４（Ｄ）、単量体ｐＨ５（Ｅ）及び単量体ｐＨ７（Ｆ）。
【００３６】
〔図７〕分離した単量体画分及び二量体画分の２Ｄ−ＰＡＧＥ分析
２次元ポリアクリルアミド電気泳動を、2D-Electrophoresis, Principles and Methods
(Amersham Biosciences)に既に記載されたようにして実施した。要約すると、総ＩＶＩＧ、単量体及び二量体免疫グロブリン（Ｉｇ）画分（４μｇ）を、８Ｍ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、０.００２％ブロムフェノールブルー、ＤＴＴ（０.６５ｍＭ）及びＩＰＧバッファー０.５％をそれぞれ含有する再水和バッファー（１２５μｌ）に希釈した。ＩＰＧ細片、ｐＨ３〜１０（Amersham Biosciences）７cmを一夜再水和し、細片の指示書（ステップ１：一定電圧３００Ｖ／６０分、ステップ２：１０００Ｖ／３０分まで勾配、ステップ３：５０００Ｖ／９０分まで勾配、ステップ４：一定電圧５０００Ｖ／１５分）に従って、ＩＰＧｐｈｏｒユニット（Amersham Biosciences）に焦点を合わせた。焦点をあてたストリップは、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８.８、６Ｍ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセリン、２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、０.００２％（ｖ／ｖ）ブロムフェノールブルー及びＤＴＴ１０ｍｇ／ｍｌ（１次平衡化）又はヨードアセトアミド２５ｍｇ／ｍｌ（２次平衡化）のいずれかを含有する平衡バッファー中で、１５分間の２つのステップで平衡化した。分子量分離のために、細片を、２.５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Merck）、２５ｍＭグリシン（Merck）、０.０１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）（Flucka）を含有するドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）流動バッファー中ですすぎ、１２％ポリアクリルアミドゲル上に置いた。続いて、細片を４％ポリアクリルアミド積層ゲルで重層し、２次元目を、１００Ｖの定電圧でおよそ９０分間MiniProtean電気泳動函（BioRad）で泳動した。銀染色を、PlusOne銀染色キット（Amersham Biosciences）を使用して実施した。
【００３７】
〔図８〕ＩＶＩＧ画分におけるS.pyogenesのＭ５タンパク質に対する反応性
ＥＬＩＳＡ：
抗原（組換えヒトＭタンパク質：Ｍ１、Ｍ３、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ１９）１０μｇ／ｍｌで被覆。ブロッキング：ＰＢＳ／カゼイン２時間３７℃。第１抗体（ＩＶＩＧ：ＴＯ／ＩＶＩＧ、ｐＨ４.０／二量体／単量体）１０、１００及び１０００μｇ／ｍｌ：３７℃で４時間。第２抗体：ＡＰ００４（結合部位）ヒツジ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ、１／１０００（２時間、３７℃）。結果は、全ての他のＭタンパク質を代表する、Ｍ５について示す。
【００３８】
〔図９〕外部抗原に対する二量体画分の微差活性。二量体画分の増大した活性は、結合の親和性の増大と相関している
破傷風トキソイド及びＭ１タンパク質に対する親和性測定。異なったＩＶＩＧ製剤の親
和性を、ＩＡｓｙｓキュベットシステムを使用してオンラインモニタリングによって評価した。キュベットを、Streptococcus pyogenes (S. pyogenes)由来の組換えＭ１タンパク質又は破傷風トキソイドのいずれか（５μｇ）で固定化した。会合を測定するため、ＩＶＩＧ製剤をＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０中異なった濃度に希釈し、試料５０μｌでキュベットに加えた。抗体の解離をモニターするために、キュベットを５０μｌのＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗滌した。再生のために、キュベットを２０ｍＭ・ＨＣｌ（４０μｌ）で２分間、及びＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０（４５μｌ）で３回連続的に洗滌した。ＫDは、ＩＶＩＧ、単量体又は二量体の各濃度に対して得られたＫon値を、ＦＡＳＴｐｌｏｔ及びＧｒａｆｔプログラムを使用して、プロットすることによって計算した。
ＥＬＩＳＡ：
ＩＶＩＧ、単量体画分及び二量体画分は、破傷風トキソイド、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）及びH.influenzae B用の市販キットを使用して分析し、結果は、標準曲線から計算した免疫グロブリン（Ｉｇ）単位／ｇに従って表現した。Ｍ１タンパク質に対する活性を、図７に記載したようにして測定した。
【００３９】
〔図１０〕二量体は、ＨＥｐ−２細胞を使用した機能的中和アッセイにおいてＲＳＶに対する増大した中和活性を示す
異なったＩＶＩＧ製剤（ＩＶＩＧtotalはｐＨ７及びｐＨ４、単量体はｐＨ４、そして二量体はｐＨ４における）の中和作用は、１.５ｍｇ／ｍｌに予備希釈し、９６ウエルプレート（Becton Dickinson, Meylan Cedex, FR）に２倍連続希釈した。ＲＳＶ Ｌｏｎｇ画分（1/2 105TCID50/ml）（５０μｌ）を各ウエルに加えた後、抗体−ウイルス混合物を室温で１時間インキュベートした（パラフィンにてシールして振盪機で）。全ての希釈を、全成分を補充したＤＭＥＭで行った。アッセイに必要なウイルス量は、３日後に１００％細胞死となるＲＳＶ粒子の量（500TCID50/ml）として、前もって定義された。ＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２３）を９６ウエルプレート（Becton Dickinson, Meylan Cedex, FR）において培養し、２０,０００細胞／ウエルまで増殖した。その後、培地を取り除き、前もってインキュベートした抗体−ウイルス混合物をＨＥｐ−２細胞に転移し、加湿環境下で３７℃にて、およそ７２時間インキュベートした。
【００４０】
細胞培地をＨＥｐ−２細胞から除き、細胞をＰＢＳ、ｐＨ７.４で２回洗滌した。細胞を、メタノール−アセトン（１：１の割合、４℃に予備冷却）で、４℃にて１０分間固定した。細胞をＰＢＳ、ｐＨ７.４で再び洗滌した。それらをモノクローナルマウス抗ＲＳＶ・ＦＩＴＣ標識抗体（Chemicon Europe LTD., Southampton, UK）（５０μｌ／ウエル）で覆った。標識抗体を、暗所で、３７℃にて１時間インキュベートした。過剰の抗体をＰＢＳ、ｐＨ７.４で２回、蒸留水で１回洗滌除去した。染色した後、蛍光封入液（fluorescence mounting fluid: Chemicon Europe LTD., Southampton, UK）１滴を加え、感染を蛍光顕微鏡（Nikon, Eclipse TE300, Egg/ZH, CH）下、倍率２０倍で可視化した。画像は画像解析ソフトウエア（ACT-1, Nikon, Egg/ZH, CH）を使用して、デジタルカメラ（Nikon, Digital Camera DXM1200, Egg/ZH, CH）で取り込んだ。
【００４１】
〔図１１〕二量体は、シェーグレン症候群の標的抗原であるムスカリン３受容体のループ２ペプチドに対して増大した活性を示す
ＩＶＩＧ製剤（ＩＶＩＧtotalはｐＨ７及びｐＨ４、単量体はｐＨ４、そして二量体はｐＨ４において）は、Ｍ３Ｒのループ２を表す合成ペプチドを使用してＥＬＩＳＡで（図８で既に記載したように）比較した。
【００４２】
〔図１２〕二量体は、細胞外自己抗原と比較すると細胞内自己抗原に対し選択的に増大した活性を示す
濃度１００μｇ／ｍｌで使用したｐＨ４における単量体及び二量体を、１０μｇ／ｍｌ
で被覆した細胞内及び細胞外タンパク質を表す抗原を使用して（図８に既に記載したようにして）ＥＬＩＳＡで比較した。
【００４３】
〔図１３〕単量体は、Pseudomonas aeruginosaの種々のリポ多糖類血清型（ＩＡＴＳ）に対して選択的な反応性を示すが、トキシンＡについてはその逆であることが見出された
Pseudomonas aeruginosaのＬＰＳ血清型（International Antigen Typing System）及びトキシンＡを標準ＥＬＩＳＡによって評価した。各プレートは、標準抗体製剤（８価Pseudomonas aeruginosaのＯ−多糖類トキシンＡ共役ワクチンで免役した９個人のプールした血漿）、対照血漿及び試験試料（単量体及び二量体）の連続希釈物を含有した。標準抗体は、対照血漿及び試験試料における抗ＬＰＳ又は抗トキシンＡＩｇＧ抗体濃度を定量するための基準として使用した。
【００４４】
〔図１４〕二量体は、ＨＥｐ−２細胞における細胞骨格タンパク質免疫蛍光に対して増大した活性を示す
免疫組織学のために、ＩＶＩＧ、単量体及び二量体Ｉｇ画分（５０μｌ）を診断用ＡＮＡ（ＨＥｐ−２アクチン）スライド（INOVA Diagnostics, Inc., San Diego, US）上で、２００μｇ／ｍｌで３０分間インキュベートし、続いて、ＰＢＳで５分間洗滌工程を行った。その後、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ複合体（INOVA Diagnostics, Inc., San Diego, US）を２０分間インキュベートし、次いで、別に５分間ＰＢＳで洗滌した。画像は、ＡＣＴ−１ソフトウエア（Nikon）を採用し、蛍光顕微鏡（Nikon E600, Eclipse）を用いて倍率４００倍で得た。
【００４５】
〔図１５〕二量体は、ＨｅｐＧ２細胞において増大した自己反応性を示す
ＨｅｐＧ２（肝癌）細胞を、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地でコンフルエントになるまで増殖させた。細胞をトリプシン処理し、溶解前にＰＢＳで２回洗滌した。細胞タンパク質をトリクロロ酢酸沈殿に処して、図７で前に記載したのと同じ手順を使用して引続き２Ｄ−ＰＡＧＥを行うようにした。得られた２次元ゲル（銀染色、図１.ａを参照）は、ニトロセルロースに転写し、０.１５％カゼイン含有ＰＢＳでブロックし、単量体ＩｇＧ画分（図１.ｂ）又は二量体ＩｇＧ画分（図１.ｃ）を１０μｇ／ｍｌで４℃にて、一夜インキュベートした。展開は、アルカリ性ホスファターゼ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をＰＢＳ−カゼイン（０.１５％）中で１：１,０００で、アルカリ性ホスファターゼ展開キット（BioRad Inc.）を使用して行った。
【００４６】
〔図１６〕二量体は、異なった動物種からの上皮細胞の細胞内タンパク質に対して増大した活性を示す
サル（ＣＯＳ−７）、ヒト（ＨＥＰ−Ｇ２、ＨＥｐ−２）及びハムスター（ＣＨＯ）からの上皮細胞のＦＡＣＳ分析。ラット好塩基球性白血病細胞野生型（ＲＢＬｗｔ）を、対照の非上皮細胞として使用した（ＦＡＣＳ分析結果は示していない）。
フローサイトメトリーのために、全ての接着細胞を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ０.０３％（ｗ／ｖ）で剥離し、ＰＢＳ−カゼイン０.１５％（ｗ／ｖ）（Sigma, Buchs, Switzerland）中１％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ−カゼイン０.１５％（ｗ／ｖ）中０.３％サポニン（Sigma, Buchs, Switzerland）で透過性化した。間接染色を２回多段階手法で実施した：（１）非透過性化細胞又は透過性化細胞を、それぞれ、ＰＢＳ−カゼイン０.１５％（ｗ／ｖ）又はＰＢＳ−カゼイン０.１５％／サポニン０.３％（両者、ｗ／ｖ）のいずれかで、ＩＶＩｇ、単量体又は二量体Ｉｇ画分（５０μｇ）と２０分間インキュベーション。（２）イソ型特異性ＦＩＴＣ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ−ＦＣ（ＰＦＯ０４、The Binding Site、Birmingham）と２０分間インキュベーション。両インキュベーション共ＰＢＳで２回の５分間洗滌工程が続けられた。フローサイトメトリーデータ獲得は、Cell Quest Proソフトウエアを使用したFACS Calibur装置（両者共Becton-Dickinson）で行われ、その後のデータ解析には、Win ＭＤＩソフトウエア（(C)Joseph Trotter）
を採用した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
イムノドット：
抗原１０ｎｇ、１００ｎｇ及び５００ｎｇの風乾ドット。ブロッキング：トップブロック、１.５時間、室温（ＲＴ）。第１抗体（二量体／単量体）１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌ：一夜４℃。第２抗体：ＡＰ００４（結合部位）ヒツジ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ（２時間、ＲＴ）。
反応性：
＋：抗原ドット１０ｎｇに対して免疫グロブリン製剤１００μｇ／ｍｌで強い反応。
＋／−：抗原ドット５００ｎｇに対して免疫グロブリン製剤５００μｇ／ｍｌで弱い反応。
−：抗原ドット５００ｎｇに対して免疫グロブリン製剤５００μｇ／ｍｌで反応性なし。
【００４９】
ＥＬＩＳＡ：
抗原１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌで被覆。ＰＢＳ／カゼインで２時間、３７℃でブロッキング。第１抗体（二量体／単量体）１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ及び１０００μｇ／ｍｌ：４時間、３７℃。第２抗体：ＡＰ００４（結合部位）ヒツジ抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ、１／１０００（２時間、３７℃）。
反応性：
抗原１０μｇ／ｍｌで免疫グロブリン画分１００μｇ／ｍｌと反応性を比較。＋＋：二量体シグナルが単量体よりも少なくとも対数倍検出される。＋：バックグランドを越えた明らかなシグナル。＋／−：弱いシグナルであるが、なおバックグランドより上。−：シグナルなし。
【実施例】
【００５０】
本発明者らは、ＩＶＩＧ製剤中に見出された単量体画分及び二量体画分の微差反応性を調べた。本発明者らは凍結乾燥製剤を使用し、これを臨床においてインビボで使用するための指示書に従って溶解した。このＩＶＩＧ、ＳＡＧＬ（サンドグロブリンの短縮形）とも呼ばれている、を一定量とり、更なる実験用として２０℃で貯蔵した。このＩＶＩＧを、全ての更なるアッセイにおける標準品として使用し、単量体画分及び二量体画分の分離のための条件確立に使用した。本発明者らの結果は、種々の技術を用いて確認されている、自己抗原及び外部抗原の両者に対するこれらの画分の微差反応性パターンを示唆している。
【００５１】
１）ＩＶＩＧの単量体画分及び二量体画分の単離：
分別を最適化するため、本発明者らは、いくつかの異なったカラムの型（セファクリル、スーパーロース、レプロシル）及び異なった条件（バッファー、流速、カラムのサイズ）を試験した。セファクリルＳ−３００という半分取ＨＰＬＣシステムは、分別において、良好なピーク分離、高純度の画分、短いランタイム及び高タンパク質濃度の組合せをもたらした（図１及び２を参照）。分離された画分は、図３に示すように、ＨＰＬＣによって直ちに分析された。以前の報告と一致して、本発明者らは、二量体が、バッファー、ｐＨ、温度、タンパク質濃度及び貯留時間によって影響される動的不安定性（即ち、単量体形に戻る傾向）を示すことを観察した。図４は、室温で貯蔵された場合の、分離された二量体画分の崩壊の動力学を示す。数時間のうちに、より安定な二量体集団に減少する二量体ＩｇＧは、もとの二量体の２０から３０％の範囲になる。一般的に、二量体の形成はゆっくりであるが、それらの崩壊はより速い。対照的に、単量体画分は、何週間にもわたって安定であり、二量体を再形成しない。
【００５２】
２）解離した二量体製剤の製造：
動的に安定であり、注射した際に二量体のインビボ解離を模倣するような二量体画分を製造するために、解離した二量体画分で、その単量体成分に効率的に変換されるものを使用した。至適ｐＨ条件を、４から７の範囲のｐＨのバッファーに対して二量体と単量体（対照のため）の両者を透析することによって試験した。透析に続いて、直ちに透析画分をＨＰＬＣ分析した。図６に示すように、二量体の解離に至適なｐＨは、ｐＨ４（残りの二量体含量は１０％未満に減少した）であるが、ｐＨ５及び７で透析すると、残留する二量体含量は、それぞれ、３９.４１％及び５５.１９％であった。単量体画分は、試験した全てのｐＨ条件で著しく安定である。このことは、二量体画分がサイズ排除によって分離され、その後の処理（本発明者らによる、例えば、ｐＨ４.０の酢酸中への透析を使った）により二量体ＩｇＧは単量体に変換されたことを意味している。これには、ｐＨ４.０で１０ｍＭの酢酸中への透析が、最低２４時間必要であった。その後、この解離した二量体製剤は、５％未満の二量体を含有しており、動的に安定性を維持しており、貯蔵及び使用のために定められた条件下では二量体に再変換しない。更に、解離した二量体をＰＢＳバッファー中でｐＨ７.４に中和しても、室温において２４時間まで貯蔵した後でも、二量体の含有率に影響しなかった。このように、反応性を評価するために使用されるアッセイ条件の間、解離した二量体は解離したまま残っていることになる。単量体と二量体を等しく比較するために、単量体には同じ処理を施し、同じバッファー系で比較した。使用した種々の画分の分離及び製剤についての、最適なフローチャートの例を図５に示す。
【００５３】
３）単量体及び解離した二量体製剤の特徴付け
両画分は、２次元ゲル電気泳動において重鎖及び軽鎖についての予期された総合的な型を明らかに示した。二量体画分は、より酸性領域へ拡張したより広い等電点分布の傾向を示した（図７）。比較イソタイプ分析では、二量体画分において、ＩｇＧ１、２、４及び幾分増加したＩｇＧ３の等しい分布を示した。
【００５４】
４）単量体及び解離した二量体製剤の微差反応性
ある範囲の異なったアッセイにおける外部抗原及び自己／自己抗原の両者に対する反応性を調べた。要約すると、二量体画分は、自己抗原及び外部抗原の両者のある種の抗原に対して、増大した反応性を示す。ある場合には、反応の親和性を測定したが、二量体において明らかに増大していた。単量体又は二量体のいずれかにのみ反応性が存在する抗原特異性は見出せなかった。検出可能な抗体反応性が、単量体又は二量体のいずれにも検出さ
れない抗原がある。
【００５５】
図８は、Streptococcus pyogenesのヒト組換えＭ５タンパク質（毒性因子）を用いたＥＬＩＳＡからの結果を示す。二量体は、単量体若しくはＴＯ（調製され、時間ゼロで凍結されたＩＶＩＧ）と定義されたＩＶＩＧ製剤、又はｐＨ４.０と定義されたＩＶＩＧ（二量体と同じバッファー中に透析したＩＶＩＧ）のいずれと比較しても、明らかに増強された反応を示す。
【００５６】
図９は、破傷風トキソイド、S.pyogenesのＭ１、ＲＳＶ及びH.influenzae Bの外部抗原に対する結果を示す。二量体は、明らかに増強された反応を示しており、それは、両画分において同じ反応性を示すH.influenzae Bを除いて、親和性測定によって確認された。
【００５７】
図１０は、単量体に比較して二量体における増大した抗ＲＳＶ活性を示す。ｐＨ７及びｐＨ４での分離していないＩＶＩＧの、ｐＨ４での単量体の、及びｐＨ４での二量体の中和作用を評価した。これら４つのＩＶＩＧ画分を滴定し、ＨＥｐ−２細胞の＞９０％が感染から防御されるＩｇＧ濃度を決定した。ＨＥｐ−２細胞のＲＳＶ感染の検出は、免疫蛍光染色によってはっきりと示された（図１０）。試験されたＩＶＩＧ画分によって変化する用量依存性が明瞭に見られた。中和活性における最も著しい相異は、ｐＨ４での単量体と二量体の比較で見られた。二量体（４６.８μｇ／ｍｌ）よりもより多くの単量体（１８７μｇ／ｍｌ）が、同じ量のＲＳＶ粒子を１００％中和するのに必要とされた。
【００５８】
図１１は、シェーグレン症候群の標的抗原の１つであるＭ３Ｒペプチドに対して、単量体に比較して二量体において、活性が増大していることを示す。Ｍ３Ｒに対する自己抗体が、ＩＶＩＧ製剤に、より詳しくは解離した二量体に存在しており、正常な生理条件下で、そのような自己抗体の抗イディオタイプ制御の存在を示唆している。
【００５９】
図１２は、細胞外自己抗原と比較した細胞内コンパートメントに存在する自己抗原に対する、二量体の優勢な反応性を示している。
【００６０】
図１３は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の種々のリポ多糖体血清型（ＩＡＴＳ分類によって表される）に対する単量体の明らかに増大した活性を示す。相対的に、二量体は、タンパク質、トキシンＡに対して増大した活性を示した。
【００６１】
図１４は、免疫組織学的解析にＨＥｐ−２細胞を使用した結果を示す。これらの細胞は、一連の核抗原、リボソーム抗原及びミトコンドリア関連抗原と反応する種々の自己免疫疾患において見出される自己抗体を検出するために、臨床検査室によって通常使用されている。反応性の病原的型は見られなかった。代わりに、高い倍率において細胞の細胞骨格成分のようにみえる、二量体画分の著しい活性があった。
【００６２】
図１５は、ＨＥｐ−２（上皮）細胞において免疫蛍光によって前に観察された結果を確認したものである。この図は、単量体画分又は二量体画分のいずれかを使用し、ＨｅｐＧ２細胞のプロテオームの２次元解析に続くウエスタンブロッティングを示す。単量体画分に比較して二量体画分において自己反応性の増大が見られる。反応性におけるこの増大は、スポット採取と質量分析法によって定量された、自己抗原の限られた明確な免疫優性サブセットによるものである。
【００６３】
図１６は、異なった型の上皮細胞についてのＦＡＣＳ分析の結果を示す。細胞は、処理されたか、即ち、膜染色と細胞内染色のそれぞれの間の識別を可能にするように透過性にされたか、又は処理されなかったかのいずれかであった。二量体は、処理された全ての上皮細胞に対して増大した細胞内反応性を示す。バックグランドを越える顕著な染色は、非
透過性細胞については見られなかった。このことは、試験した全ての画分について、膜タンパク質との反応性が欠けていることを示している。対照的に、対照の非上皮細胞系（形状は示していない）として使用した非処理ＲＢＬ細胞は、全ての画分によって均等に染色されたことを示した。このことは、多分、Ｆｃ−γ受容体との相互作用を表している。
【００６４】
表１は、それぞれの抗原が固定化され、ある濃度範囲の単量体、二量体及び対照としてのＩＶＩＧ出発製剤と反応することを可能にした、ＥＬＩＳＡとイムノドットアッセイの両者による累積データを表す。比較に便利なように、単量体と二量体は、単純な反応性の等級（＋＋から−）で比較した。微差反応性が、単量体と二量体の間で明らかに見られた。ある種の自己抗原、例えばミオシン及びホスホリラーゼＢは、単量体と反応するが、二量体とも増大した反応性を示すように見える。
【００６５】
要約
上記の結果に基づいて、二量体画分は、より成熟した抗体レパトアを含有し、細胞内自己抗原に対して顕著な活性を示す。対照的に、免疫固体及び自然抗体の両者からなる単量体画分は、ある種の多糖類抗原と優先的に反応するようである。
【００６６】
二量体画分は高親和性抗体を含有し、それ故、この画分は、又、例えば抗細菌抗体、抗トキシン抗体又は抗ウイルス抗体の場合における中和活性について、生物学的により活性であろう。それ故、二量体画分は、ある種の抗原に対して高い比活性を有するＩＶＩＧの亜画分を意味する。このことは、又、免疫系は恒常性を維持するためにネガティブフィードバック又はダウンレギュレーションによって産生される高親和性抗体に応答しなければならないから、この画分に抗イディオタイプ抗体が存在することを明らかにしていることになる。
【００６７】
単量体画分は、自然抗体、即ち、高親和性抗体が発生しなければならない基本的なレパトアを提供する、低親和性抗体を含有している。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＩＶＩＧ製剤のクロマトグラフィー及び分別の最適化を示す。
【図２】ＩＶＩＧ製剤の分取分別を示す。
【図３】分析用ＨＰＬＣにおけるＩＶＩＧ及び分離した単量体画分及び二量体画分の概要を示す。
【図４】分離した二量体画分の動力学を示す。
【図５】ＩＶＩＧ中の単量体及び二量体のサイズ排除分離のフローチャートを示す。
【図６】単量体化二量体画分調製のための最適ｐＨ条件を示す。
【図７】分離した単量体画分及び二量体画分の２Ｄ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図８】ＩＶＩＧ画分におけるS.pyogenesのＭ５タンパク質に対する反応性を示す。
【図９】外部抗原に対する二量体画分の微差活性。二量体画分の増大した活性は、結合の親和性の増大と相関しているを示す。
【図１０】二量体は、Ｈｐ−２細胞を使用した機能的中和アッセイにおいてＲＳＶに対する増大した中和活性を示す。
【図１１】二量体は、シェーグレン症候群の標的抗原であるムスカリン３受容体のループ２ペプチドに対して増大した活性を示す。
【図１２】二量体は、細胞外自己抗原と比較すると細胞内自己抗原に対し選択的に増大した活性を示す。
【図１３】単量体は、Pseudomonas aeruginosaの種々のリポ多糖類血清型（ＩＡＴＳ）に対して選択的な反応性を示すが、トキシンＡについてはその逆であることが見出された。
【図１４】二量体は、ＨＥｐ−２細胞における細胞骨格タンパク質免疫蛍光に対して増大した活性を示す。
【図１５】二量体は、ＨｅｐＧ２細胞において増大した自己反応性を示す。
【図１６】二量体は、異なった動物種からの上皮細胞の細胞内タンパク質に対して増大した活性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含み、該画分が二量体ヒト抗体から由来するものである医薬組成物。
【請求項２】
ヒト抗体の画分が、ポリクローナルヒト免疫グロブリン製剤からの二量体抗体の画分である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒト抗体の画分が、静脈内投与ポリクローナルヒト免疫グロブリン製剤（ＩＶＩＧ）からの二量体抗体の画分である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
二量体抗体の純度が、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも８５％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ヒト抗体が、非分別免疫グロブリン製剤を越えて少なくとも２倍の反応性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ヒト抗体の二量体画分が、異種ドナー集団からのヒト抗体製剤をサイズ分別し、そして約３００ｋＤａの見かけの分子量を有する抗体二量体を回収することによって得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
サイズ分別が、サイズ排除、分離、ゲルろ過、限外濾過及び／又はその他のゲル又は膜分離法を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
二量体抗体又は抗体断片が、解離した形態又は単量体化した形態で存在している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
感染症、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫又は寄生虫感染、に対する薬剤の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０】
感染が急性感染である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
自己免疫疾患に対する薬剤の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
シェーグレン症候群に対する薬剤の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
自己免疫疾患に対する薬剤が、自己免疫恒常性の維持及び／又は回復のための薬剤である、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含み、該画分が単量体ヒト抗体に由来するものである医薬組成物。
【請求項１５】
ヒト抗体の画分が、ポリクローナルヒト免疫グロブリン製剤からの単量体抗体の画分である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ヒト抗体の画分が、静脈内投与ポリクローナルヒト免疫グロブリン製剤（ＩＶＩＧ）からの単量体抗体の画分である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
単量体抗体の純度が、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９３％である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
単量体ヒト抗体の画分が、異種ドナー集団からのヒト抗体製剤をサイズ分別し、そして約１５０ｋＤａの見かけの分子量を有する抗体単量体を回収することによって得られる、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
サイズ分別が、サイズ排除分離、ゲルろ過、限外濾過及び／又はその他のゲル又は膜分離法を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
免疫恒常性の維持のための薬剤を製造するための、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
免疫恒常性の維持のための薬剤が、小児、高齢者、又は免疫不全者、例えば、免疫系に影響を及ぼす障害に罹患している又は免疫系に影響を及ぼす治療を受けている人に投与するための薬剤である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
免疫恒常性の維持のための薬剤が老化防止又は若返り治療用の薬剤である、請求項２０又は２１に記載の使用。
【請求項２３】
感染症、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫又は寄生虫感染、に対する薬剤の製造のための、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２４】
緑膿菌の血清型に起因する感染症の治療用の薬剤を製造するための、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２５】
異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を製造する方法であって、
（ａ）異種ドナー集団からのヒト抗体製剤をサイズ分別にかけ、
（ｂ）二量体抗体の画分を回収し、そして場合により二量体抗体を単量体化し、そして
（ｃ）単量体抗体の画分を回収する
ことを含む上記方法。
【請求項２６】
単量体ヒト抗体の画分が約１５０ｋＤａの見かけの分子量を有し、そして二量体抗体の画分が約３００ｋＤａの見かけの分子量を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
画分（ｂ）及び（ｃ）が異なった薬物応用のための薬剤の製造用に使用される、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項１】
異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含み、該画分が二量体ヒト抗体から由来するものである医薬組成物。
【請求項２】
ヒト抗体の画分が、ポリクローナルヒト免疫グロブリン製剤からの二量体抗体の画分である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ヒト抗体の画分が、静脈内投与ポリクローナルヒト免疫グロブリン製剤（ＩＶＩＧ）からの二量体抗体の画分である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
二量体抗体の純度が、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも８５％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ヒト抗体が、非分別免疫グロブリン製剤を越えて少なくとも２倍の反応性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
ヒト抗体の二量体画分が、異種ドナー集団からのヒト抗体製剤をサイズ分別し、そして約３００ｋＤａの見かけの分子量を有する抗体二量体を回収することによって得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
サイズ分別が、サイズ排除、分離、ゲルろ過、限外濾過及び／又はその他のゲル又は膜分離法を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
二量体抗体又は抗体断片が、解離した形態又は単量体化した形態で存在している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
感染症、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫又は寄生虫感染、に対する薬剤の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０】
感染が急性感染である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
自己免疫疾患に対する薬剤の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
シェーグレン症候群に対する薬剤の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
自己免疫疾患に対する薬剤が、自己免疫恒常性の維持及び／又は回復のための薬剤である、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含み、該画分が単量体ヒト抗体に由来するものである医薬組成物。
【請求項１５】
ヒト抗体の画分が、ポリクローナルヒト免疫グロブリン製剤からの単量体抗体の画分である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ヒト抗体の画分が、静脈内投与ポリクローナルヒト免疫グロブリン製剤（ＩＶＩＧ）からの単量体抗体の画分である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
単量体抗体の純度が、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９３％である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
単量体ヒト抗体の画分が、異種ドナー集団からのヒト抗体製剤をサイズ分別し、そして約１５０ｋＤａの見かけの分子量を有する抗体単量体を回収することによって得られる、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
サイズ分別が、サイズ排除分離、ゲルろ過、限外濾過及び／又はその他のゲル又は膜分離法を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
免疫恒常性の維持のための薬剤を製造するための、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
免疫恒常性の維持のための薬剤が、小児、高齢者、又は免疫不全者、例えば、免疫系に影響を及ぼす障害に罹患している又は免疫系に影響を及ぼす治療を受けている人に投与するための薬剤である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
免疫恒常性の維持のための薬剤が老化防止又は若返り治療用の薬剤である、請求項２０又は２１に記載の使用。
【請求項２３】
感染症、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原虫又は寄生虫感染、に対する薬剤の製造のための、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２４】
緑膿菌の血清型に起因する感染症の治療用の薬剤を製造するための、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２５】
異種ヒトドナー集団からのヒト抗体の画分又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を製造する方法であって、
（ａ）異種ドナー集団からのヒト抗体製剤をサイズ分別にかけ、
（ｂ）二量体抗体の画分を回収し、そして場合により二量体抗体を単量体化し、そして
（ｃ）単量体抗体の画分を回収する
ことを含む上記方法。
【請求項２６】
単量体ヒト抗体の画分が約１５０ｋＤａの見かけの分子量を有し、そして二量体抗体の画分が約３００ｋＤａの見かけの分子量を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
画分（ｂ）及び（ｃ）が異なった薬物応用のための薬剤の製造用に使用される、請求項２５又は２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公表番号】特表２００８−５１８８８７（Ｐ２００８−５１８８８７Ａ）
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３８３３２（Ｐ２００７−５３８３３２）
【出願日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１１４９４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４８１７４
【国際公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（５０１０９１６０４）ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１１４９４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０４８１７４
【国際公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【出願人】（５０１０９１６０４）ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]