免疫調節剤粒子および処置方法
対象において免疫応答を刺激する方法であって、抗原とカップリングしたマイクロメートルサイズの粒子を対象に投与することを含み、その際、マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比の増大が免疫応答を増大させる方法。対象において免疫応答を刺激する方法であって、対象に複数の粒子を投与することを含み、その際、各粒子が免疫刺激作用物およびタンパク質とカップリングしている方法。第１タンパク質を第１速度で放出しかつ第２タンパク質を第２速度で放出するように構築され、かつ１回量で初回抗原刺激能および追加抗原刺激能を備えるように構築された複数の粒子を含む、ワクチン粒子組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
[001] 本出願は、米国仮特許出願Ｎｏ．６１／０６８，２２７、２００８年３月４日出願、に基づく優先権を主張し、それの全体を本明細書に援用する。
【０００２】
発明の技術分野
[002] 本発明は、ある態様において、迅速無細胞製造方法により作製した合成ワクチンナノ粒子に関する。より詳細には、ある態様において、ナノ粒子は抗原および／または免疫増強作用物を含む。
【背景技術】
【０００３】
[003] マラリア、結核、炭疽病、野兎病、ブルセラ症、Ｃ型肝炎感染症、ヒストプラスマ症、クシジオイデス症、ウイルス性出血熱、腺ペスト、ウイルス性脳炎、黄熱病、ならびにウイルス性および細菌性胃腸炎を含めた多くの感染性疾患について、依然としてワクチンが無いか、または有効なワクチンが無い。これらの疾患に対処するために新たなワクチンが求められている。さらに、抗原変動性および免疫タイプにおける挑戦は新たな研究方法を必要とする。
【０００４】
[004] ワクチンとして使用するのに適切ないかなる組成物においても、コンホメーション統合性ならびに免疫原エピトープおよび抗原部位を無傷のまま保存することが必須である。これらの分子および化合物の立体構造、化学的電荷、または空間配向の変化は、抗原としての活性および有用性を部分的または完全に失う結果となる可能性がある。付随するキャリヤー粒子がワクチンの不都合な反応を最小限にしなおかつ抗原性化合物と免疫系の相互作用を促進する能力は、主要な関心事である。ワクチンとして使用するコンジュゲートとして、または特定の受容体を認識するための生体材料として、組成物を調製する際には、これらの要因をすべて考慮に入れなければならない。
【０００５】
[005] ある抗原に対して強い免疫応答を誘導するためには、タンパク質、アジュバントまたは他の免疫増強作用物が必要である。最適な免疫応答を獲得するためには、抗原および作用物（１以上）をしばしば共送達しなければならない。共送達のための技術には２つのタンパク質を融合させることが含まれているが、これらの技術は欠点を含む；これには、他の欠点のうち特に、それら２成分間の物理的干渉、免疫系への各成分の提示が制御されないこと、この技術に利用できる融合タンパク質および組成物が制限されることが含まれる。
【０００６】
[006] 他の技術には、ミョウバン、伝統的な二層または多層リポソーム、ポリマー粒子およびウイルス様粒子を含有する組成物の使用が含まれる。そのような技術は著しい欠点をもち、これには、物理的および化学的安定性、広範な抗原との適合性、抗原と免疫調節剤を共送達できないこと、ならびに細胞または卵をベースとする製造に起因する安全性の問題、ならびに組換えウイルスについてのリスクが含まれる。したがって、抗体と細胞性応答の両方をもたらし、広範な抗原と適合性であり、共送達および多価性が可能であり、かつ一貫した製品を確保するための安全で再現性のある製造方法をもつ、新たなワクチンが求められている。
【発明の概要】
【０００７】
[007] 本発明の態様によれば、対象において免疫応答を刺激する方法は、対象に複数の粒子を投与することを含み、その際、各粒子は免疫刺激作用物およびタンパク質とカップリングしている。１態様において、前記の複数の粒子の投与により、粒子とカップリングしていない免疫刺激作用物およびタンパク質の投与により起きるものより抗体価が少なくとも約１０倍大きくなる。１態様において、実質的に、前記の複数の粒子の各粒子は、約２００ｎｍ×約２００ｎｍ×約２００ｎｍの寸法を有する粒子を含む。他の態様において、実質的に、前記の複数の粒子の各粒子は、約２μｍ×約２μｍ×約２μｍの寸法を有する粒子を含み、その際、複数の粒子の投与により、粒子とカップリングしていない免疫刺激作用物およびタンパク質の投与により起きるものより抗体価が少なくとも約１００倍大きくなる。
【０００８】
[008] 本発明の他の態様によれば、対象において免疫応答を刺激する方法は、抗原とカップリングしたマイクロメートルサイズの粒子を対象に投与することを含み、その際、マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比の増大は免疫応答を増大させる。１態様において、マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比は約３：１であり、約１：１のアスペクト比を有する粒子の投与により起きるものより免疫応答が約２〜約３倍大きい。１態様において、マイクロメートルサイズの粒子は、約１マイクロメートル×約１マイクロメートル×約３マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む。他の態様において、マイクロメートルサイズの粒子は、約２マイクロメートル×約２マイクロメートル×約６マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む。他の態様において、マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比は約１０：１であり、約１：１のアスペクト比を有する粒子の投与により起きるものより免疫応答が約３〜約４倍大きい。そのような１態様において、マイクロメートルサイズの粒子は、約１マイクロメートル×約１マイクロメートル×約１０マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む。
【０００９】
[009] 本発明の他の態様によれば、ナノメートルサイズの粒子にカップリングした抗原により起きる免疫応答を低下させる方法は、ナノメートルサイズの粒子のアスペクト比を増大させることを含む。
【００１０】
[0010] 本発明の他のある態様において、対象に投与した免疫刺激作用物により起きる免疫応答を実質的に阻害する方法は、免疫刺激作用物を対象に投与する前に、免疫刺激作用物を非分解性リンカーにより粒子にカップリングさせることを含む。１態様において、該方法により、免疫刺激作用物を対象に初回投与した後の免疫応答が実質的に阻害される。他の態様において、該方法により、免疫刺激作用物を対象に追加抗原刺激（ブースター）投与した後の免疫応答が実質的に阻害される。
【００１１】
[0011] 本発明のある態様によるワクチン粒子組成物は、第１タンパク質を第１速度で放出しかつ第２タンパク質を第２速度で放出するように構築され、かつ１回量で初回抗原刺激能および追加抗原刺激能を備えるように構築された、複数の粒子を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
[0012]
【図１】図１は、本発明の１態様によるワクチン粒子の初回注射後３週目の応答を示す；その際、抗体レベルは２００ｎｍのワクチン粒子について１，２８０；２マイクロメートルのワクチン粒子について１０，２４０；ｒＰｒｏｔｅｉｎについて１０１である。
【００１３】
[0013]
【図２】図２は、本発明の１態様によるワクチン粒子の初回注射後の他の応答を示す。 [0014]
【図３】図３は、本発明の１態様によるワクチン粒子の初回注射後のさらに他の応答を示す。
【００１４】
[0015]
【図４】図４は、非分解性リンカーと分解性リンカーを比較した、初回注射後の本発明の１態様によるワクチン粒子に対する応答を示す。 [0016]
【図５】図５は、非分解性リンカーと分解性リンカーを比較した、追加抗原刺激注射後の本発明の１態様によるワクチン粒子に対する応答を示す。
【００１５】
[0017]
【図６】図６は、本発明の１態様による８０ｎｍ×８０ｎｍ×３６０ｎｍポリ（ジメチルアミノメタクリレート）（ＰＬＧＡ）ワクチン粒子を示す。 [0018]
【図７】図７は、本発明の１態様によるワクチン粒子についてビオチン−アビジン連結システムの模式図を示す。
【００１６】
[0019]
【図８】図８は、本発明の１態様による血球凝集反応アッセイを示す：（１）マウス血清アルブミンでコートした２００ｎｍ×２００ｎｍ×２００ｎｍのワクチン粒子（対照）；（２）ＨＡタンパク質でコートした２００ｎｍ×２００ｎｍ×２００ｎｍのワクチン粒子（活性）；（３）ＨＡタンパク質陽性対照；および（４）陰性対照を比較した複合イメージを示し、その際、粒子の表面にＨＡタンパク質が存在することの指標となる血球凝集は囲まれたウェル内に示される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[0020] 本発明のある態様は、ナノ粒子成形法によりワクチンを作製する。意外な結果のひとつは、抗原、たとえばインフルエンザＨＡ（”ＨＡ”）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡタンパク質）と免疫刺激作用物または免疫増強作用物、たとえばフラジェリンまたはＩＬ−１２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）とをナノ粒子上またはナノ粒子内で組み合わせると、強力な適応免疫応答を誘発しうることである。さらに、抗原および／または免疫増強作用物（以下、”作用物”と呼ぶ）は、ある態様において、個々の適用および／または抗原／作用物の組合わせに対して最適化しうるように、ナノ粒子内にパッケージするか、あるいはナノ粒子の外側に提示することができる。さらに、ある態様において、ナノ粒子の免疫増強作用物と抗原成分の比率を、個々の適用に合わせて構築することができる。ある態様においては、１種類以上の免疫増強作用物をナノ粒子および１種類以上の抗原と共に含有させることができる。他の態様において、ナノ粒子は、細胞特異的または組織特異的な結合剤またはターゲティング剤をも含有することができる。
【００１８】
[0021] ＰＲＩＮＴ（登録商標）技術（Ｌｉｑｕｉｄｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ノースカロライナ州）は、ナノ粒子のサイズ、形状、組成、表面機能性、および他の物理的特性、たとえばモジュラスなどを特異に制御することができる、ナノ粒子製造方法である。この技術を本発明のある態様に使用すると、特異な共送達方式、形状特異的およびサイズ特異的な免疫原性、抗原および免疫増強作用物など生物学的な装填物（ｃａｒｇｏ）の無ウイルス送達、合成による送達ベクター、ならびに非経口、鼻、経口、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、吸入などを含めた多数の送達経路を得ることが可能になる。
【００１９】
[0022] 本発明のある態様によるナノ粒子の組成は、種々の用量の抗原を、および／または抗原と作用物成分を、持続放出するように構築して、免疫系との相互作用および抗体形成を最適化することができる。ある態様において、ナノ粒子の組成は、予め定めた速度で、および／または予め定めた環境条件、たとえばｐＨ、水性環境、特定の酵素などに応答して分解するように構築できる。ある態様において、ナノ粒子は、架橋剤および／または架橋剤密度を予め選択することにより、予め選択した環境または予め選択した分解速度での粒子の分解を促進するように、分解を調節することができる。ある態様において、ナノ粒子は、目的とする細胞をスクリーニングし、結合し、またはそれから遮蔽するために、多様なタイプおよび量の表面作用物を含有することができる。本発明のある態様によるナノ粒子は、ナノ粒子のポリマーマトリックスを制御することにより、ナノ粒子が分解する前に抗原を細胞内空間へ送達するように設計することもでき、これにより抗原および／または抗原／免疫増強作用物の細胞内送達が得られる。本発明のある態様による組成物は、生分解性材料、親水性材料、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）材料などを含有することができる。ある態様において、本発明の粒子はポリ（エチレングリコール）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトンなどを含有するか、またはそれらから形成することができる。
【００２０】
[0023] ある態様において、粒子組成物は抗原と作用物の両方を含む。ある態様において、粒子組成物は抗原または作用物のうち一方のみを含む。ある態様においては、１種類以上の抗原または作用物をナノ粒子の表面にコンジュゲートさせる。ある態様において、作用物と抗体の比率は、ナノ粒子に成形する組成物またはナノ粒子の表面にコンジュゲートさせる組成物を制御することにより制御できる。
【００２１】
[0024] ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０〜約５０重量％を構成する。ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０〜約４０重量％を構成する。ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０〜約３０重量％を構成する。ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０〜約２０重量％を構成する。ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０．１〜約２０重量％を構成する。ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０．１〜約１０重量％を構成する。
【００２２】
[0025] ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約７０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約６０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約５０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約４０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約３０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約２０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約１０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０．１〜約３０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０．１〜約２０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０．１〜約１０重量％を構成する。
【００２３】
[0026] ある態様において、本発明のナノ粒子は粒子仲介による制御放出をもたらし、これにより現在の免疫調節ワクチン技術に対する応答を改善し、反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を低下させることができる。ある態様によるナノ粒子は、たとえばマトリックス組成を操作することにより、用量節減およびブースト節減方式を提供するように、かつ製品の安定性および貯蔵寿命を高めるように構築することもできる。ある態様における免疫調節ワクチンのナノ粒子パッケージングはさらに、予め選択した環境条件に対してインビボ分解を最小限にし、またはインビボ分解を制御することができる。本発明のある態様におけるナノ粒子は、さらに追加の免疫調節剤および／または抗原を、１回量または多数回量を構成する単一のナノ粒子内または複数のナノ粒子内に共パッケージングする可能性を提供する。
【００２４】
[0027] 他の態様において、本発明のナノ粒子は、多価ワクチンおよびＴｈ１／Ｔｈ２調節をもたらす。ある態様において、ナノ粒子は、エンドソームを回避して粒子仲介による細胞質ゾルへの送達をもたらすこともでき、これによりＴ細胞誘導のために効果的な抗原提示が可能になる。本発明のある態様におけるナノ粒子は、単一粒子の内部または上におけるフラジェリンおよび免疫原の共パッケージングをもたらこともでき、これにより融合タンパク質の必要性を避けることができる。ある態様において、本発明のナノ粒子は、フラジェリンおよび／または免疫原の適正なコンホメーションの維持、ＡＰＣターゲティングの向上、投与要求量の減少、反応原性の低下、その組合わせなどを増強する。ある態様においては、粒子を作製した後、すべての水性条件および化学を使用した後に、免疫原および／またはフラジェリンを粒子に付着させるので、フラジェリンおよび／または免疫原の適正なコンホメーションが本発明のナノ粒子において増強される。
【００２５】
[0028] ある態様において、本明細書に援用したナノ粒子成形技術（ＰＲＩＮＴ（登録商標）（Ｌｉｑｕｉｄｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州））に記載されたナノ粒子作製により、抗原、免疫調節剤、アジュバントおよび他の免疫増強作用物を含めた多数の生物学的作用物を容易にナノ粒子マトリックス内に取り込むことができる。このナノ粒子成形技術により、ある態様において、ターゲティングリガンドを粒子の表面に付着させることもできる。ある態様によるワクチン適用について、療法剤をターゲティングさせることは全身的な反応原性をもつ機会を減らし、および／または投与要求量を減少させる。本発明のある態様において、粒子は表面、全表面または粒子内に、１種類以上の免疫増強作用物および１種類以上の抗原を含有する。ある態様において、粒子は１種類以上の目的抗原、免疫増強作用物、およびターゲティング剤を含む。前記のナノ粒子成形技術により、ある態様において、多価ワクチンも可能となる。ある態様において、ナノ粒子は多価ワクチン抗原を含有または収容する。
【００２６】
[0029] ある態様において、ナノ粒子は、抗原（１以上）と免疫増強作用物が物理的に分離されるように構成される。抗原と作用物を物理的に分離するための技術のひとつは、ある態様において、抗原を封入し、そして粒子の表面を作用物で機能化するか、あるいはその逆を含む。抗原と作用物を物理的に分離するための他の技術は、ある態様において、抗原と作用物の両方を同一粒子の表面の異なる領域に付着させ、粒子に抗原と作用物の間を連結させることを含む。ある態様において、これによりタンパク質の形状、すなわちコンホメーションを維持することができる；これは、適切な免疫応答を発生させるために、たとえば抗体誘導のために重要であり、免疫増強作用物の活性にとって決定的となることができる。
【００２７】
[0030] 本発明のある態様において、粒子は、含有される免疫増強作用物に応じて免疫応答をＴｈ１またはＴｈ２のいずれかに偏る方向へ偏らせるように設計される。ある態様において、粒子マトリックスの分解は特定の応答を誘導するように設計される。ある態様において、粒子は、エンドソーム内で分解し、それを破裂させ、ＣＤ８応答を発生させるように設計される。ある態様において、粒子はエンドソーム／リゾソーム経路で分解され、ＣＤ４ Ｔ細胞に提示されて、最終的にさらに多くの抗体応答を誘導するように設計される。
【００２８】
[0031] ある態様において、粒子は２種類以上のタンパク質を異なる速度で放出するように設計される。ある態様において、２種類以上のタンパク質はそれぞれ異なる速度で放出される。ある態様においては、単一のナノ粒子デザインが同じ投与で初回抗原刺激能および追加抗原刺激能を備えることができるように、放出速度を調整する。ある態様において、ある粒子は、あるタンパク質を速やかに放出し、かつそのナノ粒子と結合または組み合わせた他のタンパク質を徐々に放出するように設計される。ある態様においては、装填物を遮蔽して、遅れて追加抗原刺激する能力を高める。ある態様においては、装填物をインビボ分解から保護し、これにより有効性が改善され、おそらく投与要求量の減少につながるであろう。
【００２９】
[0032] ある態様において、本発明のワクチン粒子を特定の形状に加工して、目的とする増強または低下した抗体応答を誘発することができる。ある態様において、高いアスペクト比の粒子は、より低いアスペクト比をもつ粒子より大きな免疫原応答を誘発する。他の場合、より低いアスペクト比がより大きな免疫原応答を誘発する。アスペクト比は、粒子の最短軸に対する最長軸の比を表わす。ある態様において、好ましい粒子形状は、取込み機序、抗原、免疫刺激作用物、応答のタイプなどの関数である可能性がある。ある態様においては、より大きな表面−対−体積比をもつ粒子形状が好ましい。
【００３０】
[0033] ある態様においては、少なくとも約１：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約２：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約３：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約４：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約５：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約６：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約７：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約８：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約９：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約１０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様によれば、約１：１〜約６０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。別態様においては、約１：１〜約５０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。他の態様においては、約１：１〜約４０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様によれば、約１：１〜約３０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約２０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約１５：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約１０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約９：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約８：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約７：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様において、約１：１〜約６：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約５：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約４：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約３：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約２：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約１：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約２：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約３：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約４：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約５：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約６：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約７：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約８：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約９：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。別態様においては、約１０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。他の態様においては、約１５：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。他の態様においては、約２０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様によれば、約３０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約４０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約５０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約６０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約６０：１より大きなアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。
【００３１】
[0034] したがって、本発明のワクチン粒子はナノスケールで制御されるいかなる寸法でも作製できる。たとえば、前記アスペクト比をもつ本発明のワクチンナノ粒子を、約８０ｎｍ×約９０ｎｍの寸法の円筒形をもつ粒子；約８０ｎｍ×約８０ｎｍ×約３６０ｎｍの寸法をもつ粒子；約８０ｎｍ×約８０ｎｍ×約２０００ｎｍの寸法をもつ粒子；約８０ｎｍ×約８０ｎｍ×約５０００ｎｍの寸法をもつ粒子；約１マイクロメートル×約１マイクロメートルの寸法をもつ粒子；約１マイクロメートル×約３マイクロメートルの寸法の円筒形をもつ粒子；約１マイクロメートル×約１０マイクロメートルの寸法をもつ粒子として作製することができる。
【００３２】
[0035] 本発明のある態様による、ＨＡおよびＩＬ−１２を共送達するワクチン粒子（たとえば実施例２の粒子）は、図１に示すように、２種類の可溶性タンパク質の混合物を投与したマウスにおいて発生する応答と比較してより強い抗体応答をＨＡタンパク質に対して誘導する。ある態様における抗体応答の増大は、約１０倍から約１００倍までの増大に及ぶことができる。ある態様においては、粒子サイズも抗体応答に影響を及ぼす。図１に示すように、初回注射の３週後に、可溶性タンパク質は約１００抗体価の応答を発生し、本発明の２００ｎｍ×２００ｎｍ×２００ｎｍのワクチン粒子は約１２８０抗体価の応答を発生し、本発明の２マイクロメートル×２マイクロメートル×２マイクロメートルのワクチン粒子は約１０，２４０抗体価の応答を発生する。ある態様において、本発明のワクチン粒子は、抗原とタンパク質アジュバントを効果的に送達するように、かつ目的とする免疫原性が得られるように、形状、サイズおよびアスペクト比を調整することができる。
【００３３】
[0036] 他の態様によれば、本発明のワクチンナノ粒子のアスペクト比は、ワクチンナノ粒子に対して発生する応答に影響を及ぼすことができる。ある態様において、図２に示すように、初回注射の後、それらの表面とカップリングしたインフルエンザＨＡをもつマイクロメートルサイズのワクチンナノ粒子のアスペクト比は、ワクチンナノ粒子のアスペクト比が増大するのに伴って増大する免疫応答を発生する。ある態様において、約３：１のアスペクト比をもつ粒子の免疫応答は、１：１のアスペクト比をもつ粒子の免疫応答の約２〜３倍である。ある態様において、約１０：１のアスペクト比をもつマイクロメートル粒子の免疫応答は、１：１のアスペクト比をもつマイクロメートルサイズの粒子の免疫応答の約３〜４倍である。１回注射後に誘導された抗体応答を図２に示す。
【００３４】
[0037] ある態様において、図３に示すように、ナノメートルサイズのワクチン粒子のアスペクト比は、初回注射の後、表面にインフルエンザＨＡがカップリングしたワクチン粒子のアスペクト比が増大するのに伴って低下する免疫応答を生じる。図３に示すワクチン粒子の組成物は、架橋したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースのもの（７９％のポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、２０％のアミノメチルメタクリレートＨＣｌ、１％のＨＣＰＫから構成され、次いでビオチンリンカー表面修飾により処理されたもの）を含有する。
【００３５】
[0038] 本発明のワクチン粒子は、ある態様において、低い表面エネルギーの型内で、下記の特許出願に記載された方法および材料を用いて成形される：米国特許出願Ｎｏｓ．：１０／５８３，５７０、２００６年６月１９日出願、および１１／５９４，０２３、２００６年１１月７日出願；ならびにＰＣＴ国際特許出願Ｎｏｓ．：ＰＣＴ／ＵＳ０４／４２７０６、２００４年１２月２０日出願；ＰＣＴ／ＵＳ／０６／２３７２２、２００６年６月１９日出願；ＰＣＴ／ＵＳ０６／３４９９７、２００６年９月７日出願；ＰＣＴ／ＵＳ０６／４３３０５、２００６年１１月７日出願；およびＰＣＴ／ＵＳ０７／０２４７６、２００７年１月２９日出願；そのそれぞれの全体を本明細書に援用する。下記も参照されたい：米国仮特許出願Ｎｏｓ．：６０／５３１，５３１、２００３年１２月１９日出願；６０／５８３，１７０、２００４年６月２５日出願；６０／６０４，９７０、２００４年８月２７日出願；６０／６９１，６０７、２００５年６月１７日出願；６０／７１４，９６１、２００５年９月７日出願；６０／７６２，８０２、２００６年１月２７日出願；６０／７９８，８５８、２００６年５月９日出願；６０／７３４，２２８、２００５年１１月７日出願；６０／７５７，４１１、２００６年１月９日出願；６０／７９９，８７６、２００６年５月１２日出願；６０／８３３，７３６、２００６年７月２７日出願；６０／９７９，７１０、２００７年１０月１２日出願、および６０／８２８，７１９、２００６年１０月９日出願；そのそれぞれの全体を本明細書に援用する。
【００３６】
[0039] ある態様において、本発明のワクチン粒子は免疫応答を生じないように配合される。ある態様による粒子の免疫原性は、リンカー基化学を用いて抗原および／または作用物を粒子の表面にコンジュゲートさせることにより制御できる。詳細には、ある態様において、リンカー基の分解速度により免疫原性を制御できる。非分解性結合により表面に連結したＨＡを含有する粒子と対比して、分解性ジスルフィド架橋剤により表面に連結したＨＡを含有する粒子を注射したマウスにおいて、より高い抗体応答がみられる。この効果は、初回抗原刺激および追加抗原刺激の両方の注射後にみることができる。
【００３７】
[0040] ある態様によれば、図４および５にみられるように、非分解性架橋剤によりナノ粒子に連結したタンパク質は活性を生じないか、または限られた活性を生じ、これに対し、分解性架橋剤により連結したタンパク質は応答を生じる。ある態様において、ナノ粒子はそれに非分解性架橋剤により付着したアジュバントをもち、したがってそのアジュバントに関して免疫応答は発生しないかまたは発生は最小限である。これは、単に非分解性リンカーによりアジュバントをナノ粒子に付着させるだけで、たとえば多数回の注射にわたってアジュバントの効果を維持するのを補助することができ、さほど存在量を考慮せずに有効性の高いアジュバントを使用するのを可能にし、しばしば有害反応を誘発するアジュバントの使用を可能にする。図４に示すように、分解性リンカーで付着させた場合にはＨＡタンパク質でコートしたワクチンナノ粒子を投与したマウスにおいて抗ＨＡ抗体応答が発生したが、非分解性リンカーでＨＡタンパク質を付着させた場合には初回注射後に検出可能な応答は発生しなかった。これらの結果は、２００ｎｍ×２００ｎｍ×２００ｎｍのワクチン粒子および２マイクロメートル×２マイクロメートル×２マイクロメートルのワクチン粒子の両方についてみられた。２回目の注射後、図５にみられるように、非分解性リンカーで連結したＨＡタンパク質を含有する粒子について抗ＨＡ抗体応答は検出可能ではあったが、２００ｎｍのワクチン粒子についての応答は、分解性リンカーにより付着したＨＡをもつ２００ｎｍのワクチン粒子で発生した応答より約３〜４倍少なく、２マイクロメートルのワクチン粒子についての応答は、分解性リンカーにより付着したＨＡをもつ２マイクロメートルのワクチン粒子から発生したものより約５〜６倍少なかった。
【００３８】
[0041] 本発明のある態様によれば、それに対する免疫応答を望まないかまたは限られた免疫応答を望む作用物、抗原、分子などを付着させる非分解性リンカーを用いて、ワクチン粒子を形成することができる。たとえば、ターゲティング剤または他のタンパク質もしくは分子を非分解性リンカーにより本発明のワクチン粒子に付着させることができ、その作用物がワクチン粒子上に存在することによる免疫応答は誘発されないか、または限られた免疫応答が誘発されるであろう。
【００３９】
[0042] ある態様においては、抗原に対する免疫応答を改善するために抗原を粒状で送達する。ある態様においては、適切な応答を得るためにアジュバントおよび／または免疫増強作用物の用量を変更する。ある態様においては、送達される抗原の量を減らす必要なしに反応原免疫調節剤を少なく投与するように、用量を調整する。ある態様においては、反応原タンパク質を粒子内に封入する。ある態様においては、粒子を目的細胞へターゲティングさせる。ある態様において、細胞は抗原提示細胞である。他の態様において、粒子は、細胞内に取り込まれ、次いで粒子がインターナリゼーションされた時点で分解するように設計される。ある態様においては、粒子の表面を１種類以上の抗原、免疫増強作用物およびターゲティングリガンドで機能化することができる。ある態様においては、１種類以上の抗原、免疫増強作用物およびターゲティングリガンドを分解性リンカー基で表面に付着させる。ある態様においては、１種類以上の抗原、免疫増強作用物およびターゲティングリガンドを非分解性リンカー基で表面に付着させる。ある態様においては、１種類以上の抗原、免疫増強作用物およびターゲティングリガンドを分解性リンカー基で表面に付着させ、他を非分解性リンカー基で表面に付着させる。たとえば、１態様において、ＰＬＧＡナノ粒子は、表面に多様な量で付着したＨＡ、ＩＬ−１２および細胞ターゲティングリガンドをもつことができる；ＨＡおよびＩＬ−１２を分解性リンカー基で付着させ、細胞ターゲティングリガンドを非分解性リンカー基で付着させることができる。
【００４０】
[0043] 本発明のナノ粒子ワクチンに用いる抗原はいかなるタイプの抗原であってもよく、たとえば下記のものを含むが、これらに限定されない：病原体関連抗原、腫瘍関連抗原、アレルギー関連抗原、神経欠損関連抗原、心血管疾患抗原、リウマチ様関節炎関連抗原、他の疾病関連抗原、ホルモン、妊娠関連抗原、胚性抗原、および／または胎児性抗原など。１態様において、ナノ粒子ワクチンは組換えタンパク質、または組換えリポタンパク質、または組換え糖タンパク質、および１以上の抗原である。
【００４１】
[0044] 本発明のナノ粒子ワクチンをその必要がある対象に投与して、目的抗原に対する免疫応答および抗体形成を誘発することができる。ナノ粒子ワクチンは、注射、吸入、経皮、経粘膜、肛門、膣、眼、経口摂取、静脈内、その組合わせなどにより投与できる。ある態様において、ウイルス抗原／作用物ナノ粒子製剤、たとえば抗原−フラジェリンナノ粒子は、著しく免疫原性ではないターゲットに対してすら応答を発生することができ、これにはウイルスタンパク質の高度に保存された領域が含まれる。
【００４２】
[0045] ヒトまたは動物対象に投与すると、本発明のある態様によるナノ粒子ワクチンはたとえば樹状細胞およびマクロファージと相互作用することができる。この相互作用は２つの結果を伴うであろう：第１に、ナノ粒子ワクチンの免疫刺激作用物部分がシグナル伝達経路、たとえばＮＦ−カッパＢ、ＪＮＫおよび／またはｐ３８経路と相互作用してそれを刺激するであろう。第２に、受容体とのこの相互作用のため、ナノ粒子ワクチンは細胞タイプ、ナノ粒子ワクチンのサイズ、および刺激作用物の素性に応じて、食作用、エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスにより樹状細胞およびマクロファージに取り込まれるであろう。次いで、シグナル伝達経路の活性化によって、樹状細胞およびマクロファージ、場合によってはＢ細胞による、サイトカイン、ケモカイン、接着分子、および共刺激分子の発現が誘導されるであろう。ナノ粒子の取込みにより、粒子内または粒子上に含まれる抗原（１以上）のプロセシング、ならびにＭＨＣクラス−ＩおよびＭＨＣクラス−ＩＩ分子による提示が生じるであろう。これは、ナイーブＴ細胞の活性化に必要な２つのシグナル、すなわち特異的抗原シグナルおよび共刺激シグナルを発生するであろう。さらに、ナノ粒子ワクチンにより誘導されたケモカインはナイーブＴ細胞をＡＰＣへ動員し、サイトカイン、たとえばＩＬ−１２はＴ細胞からＴｈ−１エフェクター細胞への分化を誘導するであろう。その結果、強力なＴ細胞性免疫応答が誘導され、これが次いで適応免疫応答の他の面、たとえば抗原特異的Ｂ細胞およびマクロファージの活性化を活性化するであろう。
【００４３】
[0046] ある態様において、本発明に有用な物質は下記にみられる：米国特許番号ＵＳ７，２８５，５３５、表題：Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）；およびＵＳ６，９６０，３４３、表題：Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）；ならびに米国特許出願公開ＵＳ２００７０１６０６２３、表題：先天性免疫系指向性ワクチン；ＵＳ２００７０１２２４２１、表題：先天性免疫系指向性ワクチン；ＵＳ２００６０１８８９３３、表題：ＩＲＡＫ−Ｍはｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の負の調節物質である；ＵＳ２００６０１３０１６４、表題：Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）；ＵＳ２００６０１２１４６０、表題：Ｔｏｌｌ様受容体１１；ＵＳ２００５０１６３７６４、表題：ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストによる治療；ＵＳ２００３０２３２０５５、表題：先天性免疫系指向性ワクチン；ＵＳ２００３０２２４３８８、表題：ＲＩＰ２：先天性および適応免疫系におけるシグナル伝達の仲介物質；ＵＳ２００３０１７５２８７、表題：先天性免疫系指向性ワクチン；ＵＳ２００３０１５７５３９、表題：ＩＲＡＫ−Ｍはｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の負の調節物質である；ＵＳ２００３００２３９９３、表題：Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）；およびＵＳ２００２００６１３１２、表題：先天性免疫系指向性ワクチン；これらのそれぞれをそこに開示されるすべてについて全体として本明細書に援用する。ある態様において、前記に援用した参考文献中の情報の一部には、免疫刺激タンパク質または作用物、抗原、融合タンパク質、送達技術、投与計画などが含まれる。
【００４４】
[0047] 本発明に有用な他の物質には、下記のものを含めることができる：米国特許番号７，０６０，２８４、これは特に免疫系を刺激するための、およびＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現に関連する悪性疾患を処置するための、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む組成物について考察している; Brennan, et al.,”Cowpea Mosaic Virus as a Vaccine Carrier of Heterologous Antigens,”Mol. Biotechnol. 17(1): 15-26 (2001)、これは特にヘテロロガス抗原のキャリヤーとしてのキメラウイルス粒子について考察している；米国特許番号６，０６０，０６４、Ａｄａｍｓらに付与、これは特にワクチンとして使用するための免疫原アミノ酸配列をディスプレーするために用いるタンパク質キャリヤーの使用について記載している；米国特許番号６，０８６，８８１、Ｆｒｅｙらに付与、これは特に金属酸化物粒子を含む他の多価ワクチン構築体について記載している；米国特許番号５，６８６，１１３、Ｓｐｅａｋｅｒらに付与、これは特に合成によらない多糖類ベースのスペルミン、アルギネートカプセルについて記載している；米国特許番号６，３２６，０２１、Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎらに付与、これは特に合成によるポリラクチド−ｃｏ−グリコリドの生体適合性ベースのポリマーについて記載している；米国特許番号５，７０９，８７９、Ｂａｒｃｈｆｅｌｄらに付与；６，３４２，２２６、Ｂｅｔｂｅｄｅｒらに付与；６，０９０，４０６、Ｐｏｐｅｓｃｕらに付与；ならびにLian, et al., Trends and Developments in Liposome Drug Delivery Systems, J. of Pharma. Sci. 90(6): 667-680 (2001)、およびvan Slooten, et al., Liposomes Containing Interferon-gamma as Adjuvant in Tumor Cell Vaccines, Pharm Res. 17(1): 42-48 (2000)、これらは特に脂質または他の脂肪酸から製造したワクチンとして使用するためのナノ粒子キャリヤーについて記載している；ならびにKreuter,”Nanoparticles and Microparticles for Drug and Vaccine Delivery,” J. Anat. 189: 503-505 (1996)、これは特に非脂質組成物について記載している；これらのそれぞれをそこに開示されるすべてについて全体として本明細書に援用する。
【００４５】
[0048] ”ワクチン”は、抗原、および場合により他の補助分子（ａｎｃｉｌｌａｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む組成物を表わすことができる；それの目的は、そのような組成物を対象に投与して、特異的にその抗原に対する免疫応答を刺激し、好ましくは対象が将来いつかその抗原に遭遇した際に免疫応答の装着（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）をもたらす免疫記憶を生じさせることである。他の補助分子の例は、非特異的免疫刺激分子であるアジュバント、および抗原の薬物動態特性および／または薬力学的特性を改善する他の分子である。一般に、ワクチンは通常、疾患を引き起こす生物（適切に弱毒化または死滅させたもの）または病原性生物のある部分を抗原として含む。弱毒化した生物、たとえば弱毒化したウイルスまたは弱毒化した細菌は、それらの自然宿主におけるそれらの増殖能の一部または全部を失うように操作されている。現在では、ワクチンの製造のために用いられる広範なバイオテクノロジー方法がある（たとえばW. Bains (1998) Biotechnology From A to Z, Second Edition, Oxford University Press参照）；これの全体を本明細書に援用する。
【００４６】
[0049] ”抗原”は、適応免疫系の抗原受容体によって特異的に認識される物質を表わす。たとえば、本明細書中で用いる用語”抗原”には、抗原、抗原の免疫原性である誘導体または部分、および抗原に由来する免疫原性分子が含まれる。好ましくは、本発明に使用する抗原は単離された抗原である。本発明に特に有用な抗原には、病原体関連、アレルゲン関連または疾病関連であるものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
[0050] 抗原は、インビボまたはインビトロで、幾らかの潜伏期（ヒトにおいては、普通は数日ないし数週間）の後、感受性および／または免疫応答性の状態を誘導し、感作された対象の抗体および／または免疫細胞と証明可能な形で反応するいずれかの物質でもある。抗原の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：微生物関連抗原、特に病原体、たとえばウイルス、真菌もしくは細菌の抗原、またはそれらに由来する免疫原分子；細胞性抗原：正常な移植抗原および／または腫瘍関連抗原を含む細胞が含まれる；ＲＲ Ｒｈ抗原；特定の細胞または組織または体液に特徴的または特異的な抗原；ならびにアレルゲン関連抗原、たとえば環境アレルゲン（たとえば、牧草（ｇｒａｓｓｅｓ）、花粉、カビ、塵埃、昆虫および鱗屑）、職業性抗原（たとえば、ラテックス、鱗屑、ウレタン、エポキシ樹脂）、食物（たとえば、貝、ピーナッツ、卵、乳製品）、薬物（たとえば抗生物質、麻酔薬）、およびワクチン（たとえばインフルエンザワクチン）に関連するもの。
【００４８】
[0051] 抗原プロセシング、およびディスプレーされたペプチドのＴリンパ球による認識は、抗原の三次元構造よりむしろ、大部分は抗原のアミノ酸配列に依存する。したがって、本発明のナノ粒子ワクチンに用いる抗原部分は、配列全体よりむしろ、目的とするエピトープまたは特異的ドメインを含むことができる。事実、本発明のナノ粒子ワクチンの抗原性部分は、抗原全体よりむしろ、抗原の１以上の免疫原部分または誘導体を含むことができる。さらに、本発明のナノ粒子ワクチンは、抗原の空間エピトープに対する抗体応答を発生させるために、無傷の三次元構造をもつ抗原全体、または抗原の抗原決定基の三次元構造を保持する部分を含むことができる。
【００４９】
[0052] 病原体関連抗原。病原体関連抗原の具体例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：下記のものからなる群から選択される抗原：ワクシニア、アビポックスウイルス、七面鳥インフルエンザウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、ニワトリ肺ウイルス症（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｏｓｉｓ）ウイルス、イヌパルボウイルス、ウマインフルエンザ、ＦＨＶ、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ニワトリ／ペンシルベニア／１／８３インフルエンザウイルス；感染性気管支炎ウイルス；デング熱ウイルス、麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）ウイルス、風疹ウイルス、仮性狂犬病、エプスタイン−バーウイルス、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＨＶ、ＢＨＶ、ＨＣＭＶ，ハンターン（Ｈａｎｔａａｎ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、流行性耳下腺炎、麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）、単純疱疹ウイルス１型、単純疱疹ウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、呼吸系発疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、およびプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）およびトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）、破傷風（Ｔｅｔａｎｕｓ）菌、百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、体内寄生性アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、ならびにトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎａｓｏｍａ）。
【００５０】
[0053] 癌関連抗原。本発明の方法および組成物は、腫瘍関連タンパク質抗原、たとえば黒色腫関連抗原、乳癌関連抗原、結腸直腸癌関連抗原、前立腺癌関連抗原などに対抗するワクチンの製造にも使用できる。
【００５１】
[0054] そのようなワクチンに有用な腫瘍関連または組織特異的タンパク質抗原の具体例には、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｈｅｒ−２、上皮増殖因子受容体、ｇｐｌ２０、およびｐ２４からなる群から選択される抗原が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍が増殖性および悪性の細胞を生じるためには、それらは血管新生性にならなければならない。腫瘍の血管新生を阻止する方策は治療法になる可能性をもつ。本発明の方法および組成物は、腫瘍の血管新生に対抗するナノ粒子ワクチンの製造にも使用できる。そのようなナノ粒子ワクチンのターゲット抗原の例は、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子および線維芽細胞増殖因子受容体などである。
【００５２】
[0055] アレルゲン関連抗原。本発明の方法および組成物は、アレルギーおよび喘息の予防および治療にも使用できる。本発明によれば、１以上のタンパク質アレルゲンを１以上のナノ粒子または免疫刺激作用物に連結させて、作用物／抗原キメラ構築体を調製し、そしてその抗原に対してアレルギー性である対象に投与することができる。したがって、本発明の方法および組成物は、アレルギー反応を抑制しうるナノ粒子ワクチンの構築にも使用できる。
【００５３】
[0056] 本発明の方法および組成物に有用なアレルゲン関連タンパク質抗原の具体例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：花粉に由来するアレルゲン、たとえば樹木、たとえば杉（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｅｄａｒ）（スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ））、牧草（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）、たとえば鴨萱（オーチャードグラス）（ｏｒｃｈａｒｄ−ｇｒａｓｓ）（カモガヤ属（Ｄａｃｔｙｌｉｓ），カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ））、雑草（ｗｅｅｄ）、たとえば豚草（ｒａｇｗｅｅｄ）（ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ））；花粉アレルゲンの具体例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：スギ花粉アレルゲンＣｒｙ ｊ １（J. Allergy Clin. Immunol. (1983) 71: 77-86)およびＣｒｙ ｊ ２（FEBS Letters (1988) 239: 329-332)；これらの全体を本明細書に援用する；ならびにブタクサアレルゲンＡｍｂ ａ Ｉ．１、Ａｍｂａ Ｉ．２、Ａｍｂ ａ Ｉ．３、Ａｍｎｂ ａ Ｉ．４、Ａｍｂ ａ ＩＩなど；真菌（アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）など）に由来するアレルゲン；ダニに由来するアレルゲン（ヤケチリダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、コナチリダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）などに由来するアレルゲン；ダニアレルゲンの具体例には、Ｄｅｒ ｐ Ｉ、Ｄｅｒ ｐ ＩＩ、Ｄｅｒ ｐ ＩＩＩ、Ｄｅｒ ｐ ＶＩＩ、Ｄｅｒ ｆ Ｉ、Ｄｅｒ ｆ ＩＩ、Ｄｅｒ ｆ ＩＩＩ、Ｄｅｒ ｆ ＶＩＩなどが含まれる）；ハウスダスト；動物の皮膚片、糞および毛に由来するアレルゲン（たとえば、ネコアレルゲンＦｅｌ ｄ Ｉ）；昆虫に由来するアレルゲン（たとえば、ガ、チョウ、ユスリカ科（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｉｄａｅ）などの鱗毛または鱗粉、スズメバチ科（Ｖｅｓｐｉｄａｅ）、たとえばオオスズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｍａｎｄａｒｉｎｉａ）の毒）；食物アレルゲン（卵、牛乳、食肉、海産食物、マメ類、穀類、果実、ナッツ類および野菜など）；寄生生物（たとえば回虫および線虫、たとえばアニサキス属（Ａｎｉｓａｋｉｓ））に由来するアレルゲン；ならびにタンパク質またはペプチドをベースとする薬物（たとえばインスリン）。
【００５４】
[0057] 他の疾病抗原。本発明においては、癌、アレルギーおよび喘息以外の疾病に関連する抗原に対抗するナノ粒子ワクチンも考慮される。多数のうちの限定ではない一例として、ベータ−アミロイド前駆タンパク質のタンパク質開裂産物、”アミロイドベータペプチド”と呼ばれるものの細胞外蓄積は、アルツハイマー病の病因と関連する(Janus et al., Nature (2000) 408: 979-982; Morgan et al., Nature (2000) 408: 982-985)；それらの全体を本明細書に援用する。したがって、本発明のナノ粒子ワクチン中に用いるキメラ構築体は、アミロイドベータペプチド、またはアミロイドベータペプチドの抗原性ドメインを構築体の抗原部分として含むことができる。
【００５５】
[0058] ”免疫増強作用物（ｉｍｍｕｎｏ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）”または”免疫刺激作用物（ｉｍｍｕｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）”または”作用物（ａｇｅｎｔ）”は、微生物中にみられるがヒトにはみられない分子パターンであって、先天性免疫応答を誘発することができるものを意味することができる。したがって、本明細書中で用いる前記の用語は、そのような微生物分子パターンをいずれも含み、病原性の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍまたはｍｉｃｒｏｂｅ）に関連するものに限定されない。本明細書中で用いる前記の用語には、先天性免疫応答の潜在的イニシエーターである構造体またはその誘導体が含まれる。免疫刺激構造体は、下記を含めた分子（それらに限定されない）にみられるか、またはそれからなる：リポ多糖類；ホスファチジルコリン；サイトカインアジュバント；グリカン：ペプチドグリカンを含む；テイコ酸（ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）類：リポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）類を含む；タンパク質：リポタンパク質およびリポペプチドを含む；細菌細胞壁の外膜タンパク質（ＯＭＰ）、外面タンパク質（ＯＳＰ）および他のタンパク質成分；細菌ＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ウイルスＲＮＡ；非メチル化ＣｐＧ−ＤＮＡ；マンナン；マイコバクテリア膜；ポーリン（ｐｏｒｉｎ）類；ならびに多様な他の細菌および真菌の細胞壁成分：酵母にみられるものを含む。
【００５６】
[0059] 本明細書中で用いる免疫刺激作用物は、大きな微生物グループが共有する明確に区別される分子構造体である。それらはしばしば保存された微生物代謝産物であり、抗原変動性を受けず、自己抗原とは区別される；参照：Medzhitov et al. (1997) Current Opinion in Immunology 9: 4；それの全体を本明細書に援用する。
【００５７】
[0060] 免疫刺激作用物は、下記のタイプの分子（それらに限定されない）からなるか、またはそれらにみられる：リポ多糖類（ＬＰＳ）、ポーリン類、脂質Ａ−関連タンパク質（ＬＡＰ）、リポ多糖類、線毛タンパク質（ｆｉｍｂｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、非メチル化ＣｐＧモチーフ、細菌ＤＮＡ、二本鎖ウイルスＲＮＡ、マンナン、細胞壁関連タンパク質、熱ショックタンパク質、糖タンパク質、脂質、細胞表面多糖類、グリカン（たとえばペプチドグリカン）、ホスファチジルコリン、テイコ酸類（たとえばリポテイコ酸類）、マイコバクテリア細胞壁成分／膜、細菌リポタンパク質（ＢＬＰ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、および外面タンパク質Ａ（Ｏｓｐ Ａ）。他の有用なアジュバントは下記に示されている：Henderson et al. (1996) Microbiol. Review 60: 316; Medzhitov et al (1997) Current Opinion in Immunology 9: 4-9); The European Medicines Agency Evaluation of Medicines for Human Use, January 20, 2005, http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/vwp/13471604en.pdf；これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
【００５８】
[0061] 本発明の１態様において、本発明の好ましい免疫刺激作用物には、ＤＮＡコードタンパク質成分を含むもの、たとえばＢＬＰ、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ポーリン、ＯＭＰおよびＯｓｐＡが含まれる。本発明に使用する免疫刺激作用物のひとつはＢＬＰである；ＢＬＰは先天性免疫応答の活性化を誘導することが知られており(Henderson et al. (1996) Microbiol. Review 60: 316)、免疫系により認識されることが示されている(Aliprantis et al. (1999) Science 285: 763)からである；これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
【００５９】
[0062] 本発明には、同一または異なる組成の多数のナノ粒子を大規模バッチ法または連続法で作製することによって複数の免疫増強作用物、抗原、および／またはターゲティング剤をスクリーニングする方法も含まれる。ナノ粒子は、ナノ粒子の組成物全体として作用物／抗原のみを含有することができ、あるいは作用物／抗原の組合わせを、目的とするインビボ活性を提供しうる第３組成物と混合し、またはそれに包み込む（ｅｎｃａｓｅ）ことができる。そのような目的とするインビボ活性には循環時間の延長、分解からの遮蔽、望ましくない免疫応答からの遮蔽、細胞膜の通過、細胞内分解、その組合わせなどを含めることができるが、それらに限定されない。さらに、抗原からナノ粒子を作製し、次いで作用物をナノ粒子と結合させ、あるいはターゲティング剤をナノ粒子とカップリングさせることができる。スクリーニング方法のひとつにおいて、リンカー基、たとえば第一級アミン、ヒドロキシル基、スルフィド、カルボン酸などを含むマトリックスから、目的抗原を含有する大量のナノ粒子を作製することができる。次いで、抗原含有粒子のサブセットに、これらのリンカー基により、当技術分野で既知の有機化学を用いて免疫増強作用物を化学的または物理的にカップリングさせることができる。これらの粒子は、粒子を型から採集した後に溶液状または乾燥粉末状で機能化するか、あるいはコンビナトリアル様式で粒子のアレイ上において直接機能化することができる。この方法により、１以上の異なる免疫調節剤を制御された密度、比率および位置で表面に含むように粒子を機能化することができる。この表面機能化された粒子のライブラリーを、次いで適切なインビトロまたはインビボモデルにおいてスクリーニングして、目的とする抗原に最適な免疫増強作用物、作用物の組合わせ、および相対濃度を決定することができる。他のスクリーニング方法には、表面の免疫増強作用物のほか粒子内の抗原濃度の変更が含まれる。
【００６０】
[0063] 他の態様において、本発明のナノ粒子ワクチンは、対象を抗体の存在についてスクリーニングするために、あるいは一連の多様な刺激作用物／抗原の組合わせナノ粒子を試料に対してスクリーニングして抗体の存在もしくは不存在または刺激作用物／抗原の組合わせの機能を判定するために使用できる。ナノ粒子は、目的とする抗体と接触した際に検出可能であるかまたは信号を発する物理的または化学的変化を生じる成分を用いて構築できる；たとえば、ナノ粒子はバイオセンサーを含むか、またはバイオセンサーであってもよく、それはナノ粒子が特異的ターゲットに結合した際に誘発可能である。したがって、刺激作用物−対−抗原の異なる組合わせおよび／または比率をもつ多様な組合わせのナノ粒子を対象に投与し、または試料に適用して、抗体の存在、または抗原／刺激作用物の組合わせの機能もしくは実用性を検出することができる。
【００６１】
[0064] ある態様においては、本発明のナノ粒子を用いて、生物または試料に由来する特定の細胞またはタンパク質を引き付け、結合し、フラギング（ｆｌａｇｇｉｎｇ）または濾過を容易にすることができる。そのような態様によれば、細胞、タンパク質またはウイルスに特異的な結合剤、たとえば捕獲リガンドを用いて、ナノ粒子を構築することができる；これは、いったん結合するとそのような細胞、タンパク質またはウイルスを非自己としてフラギングすることができ、したがってその細胞、タンパク質またはウイルスを生物から分離するのが容易になる。他の態様において、ナノ粒子は、目的とする免疫系成分を刺激してナノ粒子の方向または周囲に集合、凝集または移行させる免疫刺激作用物を含むことができ、これにより、ナノ粒子の捕獲リガンドが免疫系細胞と結合し、非自己としてフラギングし、その結果その細胞を対象から分離するのが容易になる。ある態様において、認識されないタンパク質コートで遮蔽された自己の細胞またはタンパク質またはウイルスをフラギングする方法は、自己作用物と結合したナノ粒子を現時点では非自己作用物として免疫系が認識するのを容易にし、これにより抗原を対象から分離するのを容易にすることによって、対象を処置することができる。
【００６２】
[0065]
【実施例】
【００６３】
[0066] 以下の実施例は、本明細書に開示する主題の代表的な態様を当業者が実施するための指針を提供するために含まれる。以下の実施例が例示にすぎないこと、ならびに本明細書の開示内容および一般的な技術水準を考慮して本明細書に開示する対象事項の範囲から逸脱することなく多数の変更、改変および入れ替えを採用できることを、当業者は認識することができる。
【００６４】
[0067] 実施例１．粒子の作製および分析法
[0068] タンパク質の修飾：タンパク質を、[スクシンイミジル ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート］（分解性ジスルフィドビオチンリンカー）またはスルホスクシンイミジル−６−［ビオチンアミド］ヘキサノエート（非分解性ビオチンリンカー）で、下記の標準法により修飾した。
【００６５】
[0069] Ｗｙｏｍｉｎｇ Ｈ３ ＨＡ：（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）：Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡ溶液（１２０μｇ／ｍＬ，１．７５ｍＬ，全タンパク質２１０μｇ）を、１４．２μＬの１０ｍＭ［スクシンイミジル ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート］（６ｍｇを１ｍＬのＨ２Ｏに溶解したもの）で処理した。混合物を３０分間振とうし、次いで１０ ＭＷＣＯ γ線照射ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いる透析により精製した。試料を１５０ｍＬのＨ２Ｏに対して透析し、これを３０分間隔で７回交換した。次いでタンパク質を透析カセットから回収し、粒子修飾に用いた。
【００６６】
[0070] 組換えマウスＩＬ−１２：（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）：マウスＩＬ−１２溶液（４００μｇ／ｍＬ，５μＬ，全タンパク質２μｇ）を、０．３μＬの１０ｍＭ［スクシンイミジル ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート］（６ｍｇを１ｍＬのＨ２Ｏに溶解したもの）で処理した。混合物を３０分間振とうし、次いで０．０２５μｍのニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いる滴下透析により精製した。試料を膜に乗せ、これを５０ｍＬのＨ２Ｏ上に浮遊させ、３０分間透析した。次いでタンパク質を透析膜から回収し、粒子修飾用にＨ２Ｏで４倍希釈した。
【００６７】
[0071] ＰＥＧ粒子の作製および修飾：ＰＲＩＮＴ法により、目的とするサイズおよび形状のキャビティーを備えたＦｌｕｏｒｏｃｕｒ型を用いて粒子を作製した。型に、２０重量％の２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩、７９重量％のポリエチレングリコールジメタクリレート（ＭＷ 約１０００）、および１％の１−ヒドロキシルシクロヘキシルフェニルケトンを含有するモノマー混合物を充填した。充填した型をＰＥＴシートに向けて積層し、次いでＵＶ線露光により硬化させた。硬化した後、型をＰＥＴシートから取り除くと、粒子は離脱してＰＥＴシート上に残った。粒子をポリエチレンブレードで掻き取ることによりＰＥＴシートから溶液（無菌Ｈ２Ｏ）中へ採集した。この粒子懸濁液を遠心（１６Ｋ ｘ ｇ，１０分）によりペレット化し、上清を除去し、次いで７０：３０ エタノール：水に音波処理により再分散させた。この操作を３回繰り返し、粒子を７０％エタノールに１０ｍｇ／ｍＬで再分散させ、４℃に保存した。
【００６８】
[0072] ＰＬＧＡ粒子の作製：ＨＡ（ＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標））（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，２００８−２００９季節型）の表面吸着のためのカチオン性ＰＬＧＡ粒子を、ＰＲＩＮＴ法により、９５：５ ＰＬＧＡ（５０：５０，０．３ｉ．ｖ．）およびポリ（ジメチルアミノメタクリレート）（ＭＷ 約２０，０００）混合物のＤＭＦ中における５重量％溶液を用いて製造した。このポリマー混合物を、８０ｎｍ ｘ ８０ｎｍ ｘ ３６０ｎｍのキャビティーを含むＦＬＵＯＲＯＣＵＲ（登録商標）（Ｌｉｑｕｉｄｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ノースカロライナ州）型で成形した。粒子を遠心により精製し、０．１重量％ポリビニルアルコール溶液中へ再懸濁した。
【００６９】
[0073] ＨＡタンパク質（ＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標））を下記により表面に吸着させた：１０Ｋ ＭＷＣＯ透析膜を用いたＨ２Ｏに対する透析により、まずすべての塩類をタンパク質から除去した。粒子の表面にタンパク質１０重量％を付与する目標のために、１０μｇのタンパク質（１００μＬ）を、２００μＬの０．１重量％ポリビニルアルコール溶液に懸濁した０．１ｍｇの粒子に添加した。懸濁液を４℃で１５分間振とうし、次いで粒子を遠心（１６，０００ ｘ ｇ，１０分）によりペレット化した。上清を除去し、残留タンパク質含量をＢＣＡアッセイにより分析した。次いで、タンパク質濃度が２５μｇ／ｍＬになるように、粒子を０．４ｍＬの０．１重量％ポリビニルアルコール溶液に再分散させた。得られた８０ｎｍ ｘ ８０ｎｍ ｘ ３６０ｎｍのＰＬＧＡワクチン粒子を図６に示す。
【００７０】
[0074] ビオチン−アビジン化学：粒子を[スクシンイミジル ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート］（分解性ジスルフィドビオチンリンカー）またはスルホスクシンイミジル−６−［ビオチンアミド］ヘキサノエート（非分解性ビオチンリンカー）で、下記の標準法により表面修飾した。２００ｎｍ ｘ ２００ｎｍ ｘ ２００ｎｍの粒子の７０％エタノール中における懸濁液（１ｍＬ，１０ｍｇ／ｍＬ）をペレット化し、次いで１ｍＬの無水ＤＭＦに３回再懸濁した。１０ｍｇの［スクシンイミジル ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート］および７０ｍｇのトリエチルアミンを０．５ｍＬのＤＭＦ中に含有する溶液を粒子懸濁液に添加し、次いで混合物を振とう台に１時間乗せた。次いで混合物を遠心と７０％エタノール中への再懸濁（３ ｘ １ｍＬ）の繰返しにより精製し、７０％エタノールに懸濁して１０ｍｇ／ｍＬにした。
【００７１】
[0075] 表面機能化：粒子を下記の２工程法でタンパク質によりコートした。ビオチニル化粒子の懸濁液（０．２ｍＬ，１０ｍｇ／ｍＬ，７０％エタノール中）をペレット化し、１重量％マウスアルブミン溶液または０．１重量％ポリビニルアルコール溶液中で遠心と再懸濁により２回洗浄した。粒子を水性ビヒクル中にそれらの元の体積で再懸濁し、次いで等体積の３ｍｇ／ｍＬアビジン溶液を添加した。次いで混合物を室温で１５分間振とうした。次いで粒子懸濁液を遠心と水性ビヒクル中への再懸濁により３回精製した。このアビジンコートした粒子を次いでビヒクルに１０ｍｇ／ｍＬで再懸濁した。
【００７２】
[0076] 次いで第２工程において、粒子をＨＡおよび／またはＩＬ−１２でコートした。目的量のタンパク質をエッペンドルフ試験管内のＨ２Ｏに添加し、続いてアビジンコートした粒子を添加した。懸濁液を４℃で１５分間振とうし、次いで遠心によりペレット化した。上清を除去し、次いで粒子をビヒクルに再懸濁して、目的量のタンパク質／注射が４０μＬで行なわれる体積にした。粒子を０．１重量％ポリビニルアルコールに懸濁した場合、上清を残留タンパク質についてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより分析した（一般に＞９５％のタンパク質が上清から除去される）。粒子を１％マウスアルブミンに懸濁した場合、粒子上のアビジンへのビオチニル化タンパク質の結合の化学量論を用いて、粒子の結合容量を間接的に測定した。アビジンコートした粒子を蛍光標識タンパク質（ビオチンとＨｙｌｉｔｅ ６４７の両方で標識したウシＩｇＧ）で処理した。粒子をペレット化し、粒子処理の前と後の蛍光強度を比較し、作成した標準曲線に対して検量した。各粒子について結合容量を計算し、次いで、測定した結合容量と同等またはそれ未満の値のＨＡおよびＩＬ−１２を、粒子に付与した。本発明のビオチン−アビジンナノ粒子の模式図を図７に示す。
【００７３】
[0077] カチオン性表面吸着：修飾されていない粒子（２０％のアミノエチルメタクリレートＨＣＬ、７９％のＰＥＧ１Ｋ−ジメタクリレート、１％のＨＣＰＫ）をエタノール懸濁液からペレット化し、０．１重量％ポリビニルアルコール溶液中で遠心と再懸濁により２回洗浄した。粒子（１ｍｇ，１０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｈ２Ｏに対し透析してタンパク質調製物からＮａＣｌを除去したＨＡ溶液（１０μｇ，２２２μＬ，４５μｇ／ｍＬのもの）に添加した。懸濁液を４℃で１５分間振とうし、次いで粒子をペレット化し、０．２５ｍＬの０．１重量％ポリビニルアルコールに再懸濁した。上清をタンパク質の存在についてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより分析し、＞９５％のタンパク質が粒子に吸着されていた。組換えマウスＩＬ−１２を同様にして単独でまたはＨＡタンパク質との組合わせで吸着させることができる。
【００７４】
[0078] 分析：ＨＡ ＥＬＩＳＡ。標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて抗ＨＡ抗体応答を検出した。このアッセイにおいては、９６ウェルプレートを５０ｎｇ／ウェルのヘマグルチニンタンパク質（Ｈ３ Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／０３／２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号３００６）でコートした。血清試料を系列２倍希釈法で試験した。ヤギにおいて発色するアルカリホスファターゼと共に抗マウスＩｇＧ全分子（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号＝Ａ３６８８）を用いて抗体を検出した。このアッセイをＳｉｇｍａ Ｆａｓｔ（商標）ｐ−ニトロフェニルホスフェート錠（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｎ２７７０−５０ＳＥＴ）で発色させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで読み取った。
【００７５】
[0079] ＨＡ／ＩＬ１２コートした粒子についての抗体染色：ＩＬ１２が表面に付着した粒子を、ＩＬ１２に対する標識抗体（抗マウスＩＬ１２ ＰＥ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，カタログ番号５０５２０３）に曝露し、洗浄した。粒子は、ＩＬ１２に対して特異的なこの赤色標識抗体のため、蛍光顕微鏡検査で赤色に見える。
【００７６】
[0080] ＨＡが表面に付着した粒子を、ＨＡに対する抗体（抗Ｈ３インフルエンザヘマグルチニン−ウサギポリクローナル抗体，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号６１００）に曝露した。粒子を洗浄すると、粒子表面に存在するＨＡに結合した抗体が残った。抗体結合は、緑色標識した抗ウサギ二次抗体（抗ウサギＩｇＧ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ａ２１２０６）により認識された。過剰の二次抗体を洗浄し、粒子を蛍光顕微鏡検査によりイメージングして、粒子表面のＨＡの存在の指標となる緑色蛍光を検出した。
【００７７】
[0081] ＩＬ１２およびＨＡが表面に付着した粒子を、ＩＬ１２に対する標識抗体（抗マウスＩＬ１２ ＰＥ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，カタログ番号５０５２０３）およびＨＡに対する抗体（抗Ｈ３インフルエンザヘマグルチニン−ウサギポリクローナル抗体，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号６１００）に曝露した。粒子を洗浄すると、粒子表面に存在するＨＡに結合した一方の抗体、および表面のＩＬ１２に結合した他方の抗体が残った。ＨＡ抗体結合は、緑色標識した抗ウサギ二次抗体（抗ウサギＩｇＧ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ａ２１２０６）により認識された。過剰の二次抗体を洗浄し、粒子を蛍光顕微鏡検査によりイメージングして、粒子表面のＨＡの存在の指標となる緑色蛍光、および粒子表面のＩＬ１２の存在の指標となる赤色蛍光を検出した；図８に示す。
【００７８】
[0082] 実施例２：送達されたＰＲＩＮＴタンパク質ワクチン粒子の免疫原性
[0083] ＨＡおよびＩＬ１２を表面に含むワクチン粒子（７９％のポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、２０％のアミノエチルメタクリレートＨＣｌ、１％のＨＣＰＫからなり、次いで分解性ビオチンリンカーで表面処理したもの）を、それらがインターフェロンガンマを刺激する能力について試験した。第１に、脾細胞をマウス全脾臓（ＢＡＬＢ／ｃマウス，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから）から分離し、９６ウェルプレートに接種した。被験粒子を脾細胞に付与し、一夜インキュベートしておいた。これらの細胞からの上清を、インターフェロンガンマの産生について標準ＥＬＩＳＡキット（マウスＩＮＦｇ ＥＬＩＳＡキット，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号８８−７３１４−７７）により分析した。表１に述べるデータは、ＩＬ１２が粒子上にあり、機能性を保持していることを示す。
【００７９】
[0084]
【００８０】
【表１】
【００８１】
[0085] 表１
[0086] 可溶性タンパク質として、またはワクチン粒子に付着して送達された場合に、インフルエンザＨＡタンパク質（免疫刺激作用物ＩＬ−１２を含むもの、および含まないもの）に対して発生する免疫応答を測定するためのインビボ試験法を設計した。架橋ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースのＰＲＩＮＴ（商標）粒子（７９％のポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、２０％のアミノエチルメタクリレートＨＣｌ、１％のＨＣＰＫからなり、次いで分解性ビオチンリンカーで表面処理したもの）を用いて、ＨＡ抗原およびＩＬ−１２タンパク質を提示した。ＨＡ：ＩＬ１２は１００：１である。
【００８２】
[0087] インビボ試験には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。マウスは試験開始時に７週令であった。動物の体重はマウス当たり１５〜２５ｇであった。あるグループでは、マウスに筋肉内（ＩＭ）用量４０ｕＬ（脇腹（ｆｌａｎｋ）当たり２０ｕＬ）の粒子溶液を投与し、したがって各動物は粒子０．１５０ｍｇ上のＨＡタンパク質２ｕｇを投与された。他のグループでは、動物に４０ｕＬ（足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）当たり２０ｕＬ）の粒子溶液を後足蹠注射し、したがって各動物はＨＡタンパク質２ｕｇを投与された。試験にはグループ当たり３匹の動物を用い、同一用量を投与した。動物に１日目に初回抗原刺激注射し、続いて２１日目に追加抗原刺激注射した。０、８、２１日目にすべてのグループについて眼窩後放血により血液を採取した。動物を２９日目にＣＯ２窒息により安楽死させ、全採血により確認した。それぞれの放血血液から血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。
【００８３】
[0088] 実施例３．サイズおよび形状による免疫原性の相異
[0089] この試験は、可溶性タンパク質として、または多様なサイズおよび形状のワクチン粒子に付着させて送達した場合に、インフルエンザＨＡタンパク質に対して発生する免疫応答を評価するために設計された。架橋ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの（７９％のポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、２０％のアミノエチルメタクリレートＨＣｌ、１％のＨＣＰＫからなり、次いでビオチンリンカー表面修飾により処理したもの）ＰＲＩＮＴ粒子システムを、ＨＡ抗原提示のために使用する。
【００８４】
[0090] インビボ試験には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。マウスは試験開始時に７週令であった。動物の体重はマウス当たり１５〜２５ｇであった。動物に筋肉内（ＩＭ）用量４０ｕＬ（脇腹当たり２０ｕＬ）の粒子溶液を投与し、したがって各動物はＨＡタンパク質２ｕｇを投与され、粒子量は結合容量に応じて注射当たり粒子０．０８〜０．３ｍｇの範囲にわたっていた。この試験には特定の被験試料のグループ当たり６匹の動物を用いた。動物に１日目に初回抗原刺激注射し、続いて２１日目に追加抗原刺激注射した。０および２０日目にすべてのグループについて眼窩後放血により血液を採取した。動物を２９日目にＣＯ２窒息により安楽死させ、全採血により確認した。剖検には血液および脾臓の採取が含まれる。それぞれの放血血液から血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。結果を図２および３に示す。
【００８５】
[0091] 実施例４．分解性リンカーと非分解性リンカーの対比：
[0092] この試験は、可溶性タンパク質として、または異なるリンカー基化学を用いてワクチン粒子に付着させて送達した場合に、インフルエンザＨＡタンパク質に対して発生する免疫応答を評価するために設計された。架橋ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（７９％のポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、２０％のアミノエチルメタクリレートＨＣｌ、１％のＨＣＰＫからなり、次いで分解性ビオチンリンカーで処理したもの）ベースのＰＲＩＮＴ粒子システムを、ＨＡ抗原提示のために使用する。
【００８６】
[0093] インビボ試験には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。マウスは試験開始時に７週令であった。動物の体重はマウス当たり１５〜２５ｇであった。動物に筋肉内（ＩＭ）用量４０ｕＬ（脇腹当たり２０ｕＬ）の粒子溶液を投与し、したがって各動物はＨＡタンパク質２ｕｇを、粒子の結合容量に応じて０．１〜０．３ｍｇの粒子上において投与された。この試験には特定の被験試料のグループ当たり６匹の動物を用いた。動物に１日目に初回抗原刺激注射し、続いて２１日目に追加抗原刺激注射した。０および２０日目にすべてのグループについて眼窩後放血により血液を採取した。動物を２９日目にＣＯ２窒息により安楽死させ、全採血により確認した。剖検には血液および脾臓の採取が含まれる。それぞれの放血血液から血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。結果を図４および５に示す。
【００８７】
[0094] 本発明を特定の態様に関して以上に述べたが、本発明の精神および範囲内での改変および置換が当業者に明らかであろう。本発明において特定の態様に属すると同定した個々の要素が本発明の他の態様に含まれる可能性があることも明らかなはずである。本発明はその中心的な属性から逸脱することなく他の具体的形態で実施することができる。したがって、あらゆる観点で、例示および記載した態様および例は例示とみなすべきであって限定とみなすべではなく、本発明の範囲を示すためには特許請求の範囲を参照されたい。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
[001] 本出願は、米国仮特許出願Ｎｏ．６１／０６８，２２７、２００８年３月４日出願、に基づく優先権を主張し、それの全体を本明細書に援用する。
【０００２】
発明の技術分野
[002] 本発明は、ある態様において、迅速無細胞製造方法により作製した合成ワクチンナノ粒子に関する。より詳細には、ある態様において、ナノ粒子は抗原および／または免疫増強作用物を含む。
【背景技術】
【０００３】
[003] マラリア、結核、炭疽病、野兎病、ブルセラ症、Ｃ型肝炎感染症、ヒストプラスマ症、クシジオイデス症、ウイルス性出血熱、腺ペスト、ウイルス性脳炎、黄熱病、ならびにウイルス性および細菌性胃腸炎を含めた多くの感染性疾患について、依然としてワクチンが無いか、または有効なワクチンが無い。これらの疾患に対処するために新たなワクチンが求められている。さらに、抗原変動性および免疫タイプにおける挑戦は新たな研究方法を必要とする。
【０００４】
[004] ワクチンとして使用するのに適切ないかなる組成物においても、コンホメーション統合性ならびに免疫原エピトープおよび抗原部位を無傷のまま保存することが必須である。これらの分子および化合物の立体構造、化学的電荷、または空間配向の変化は、抗原としての活性および有用性を部分的または完全に失う結果となる可能性がある。付随するキャリヤー粒子がワクチンの不都合な反応を最小限にしなおかつ抗原性化合物と免疫系の相互作用を促進する能力は、主要な関心事である。ワクチンとして使用するコンジュゲートとして、または特定の受容体を認識するための生体材料として、組成物を調製する際には、これらの要因をすべて考慮に入れなければならない。
【０００５】
[005] ある抗原に対して強い免疫応答を誘導するためには、タンパク質、アジュバントまたは他の免疫増強作用物が必要である。最適な免疫応答を獲得するためには、抗原および作用物（１以上）をしばしば共送達しなければならない。共送達のための技術には２つのタンパク質を融合させることが含まれているが、これらの技術は欠点を含む；これには、他の欠点のうち特に、それら２成分間の物理的干渉、免疫系への各成分の提示が制御されないこと、この技術に利用できる融合タンパク質および組成物が制限されることが含まれる。
【０００６】
[006] 他の技術には、ミョウバン、伝統的な二層または多層リポソーム、ポリマー粒子およびウイルス様粒子を含有する組成物の使用が含まれる。そのような技術は著しい欠点をもち、これには、物理的および化学的安定性、広範な抗原との適合性、抗原と免疫調節剤を共送達できないこと、ならびに細胞または卵をベースとする製造に起因する安全性の問題、ならびに組換えウイルスについてのリスクが含まれる。したがって、抗体と細胞性応答の両方をもたらし、広範な抗原と適合性であり、共送達および多価性が可能であり、かつ一貫した製品を確保するための安全で再現性のある製造方法をもつ、新たなワクチンが求められている。
【発明の概要】
【０００７】
[007] 本発明の態様によれば、対象において免疫応答を刺激する方法は、対象に複数の粒子を投与することを含み、その際、各粒子は免疫刺激作用物およびタンパク質とカップリングしている。１態様において、前記の複数の粒子の投与により、粒子とカップリングしていない免疫刺激作用物およびタンパク質の投与により起きるものより抗体価が少なくとも約１０倍大きくなる。１態様において、実質的に、前記の複数の粒子の各粒子は、約２００ｎｍ×約２００ｎｍ×約２００ｎｍの寸法を有する粒子を含む。他の態様において、実質的に、前記の複数の粒子の各粒子は、約２μｍ×約２μｍ×約２μｍの寸法を有する粒子を含み、その際、複数の粒子の投与により、粒子とカップリングしていない免疫刺激作用物およびタンパク質の投与により起きるものより抗体価が少なくとも約１００倍大きくなる。
【０００８】
[008] 本発明の他の態様によれば、対象において免疫応答を刺激する方法は、抗原とカップリングしたマイクロメートルサイズの粒子を対象に投与することを含み、その際、マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比の増大は免疫応答を増大させる。１態様において、マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比は約３：１であり、約１：１のアスペクト比を有する粒子の投与により起きるものより免疫応答が約２〜約３倍大きい。１態様において、マイクロメートルサイズの粒子は、約１マイクロメートル×約１マイクロメートル×約３マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む。他の態様において、マイクロメートルサイズの粒子は、約２マイクロメートル×約２マイクロメートル×約６マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む。他の態様において、マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比は約１０：１であり、約１：１のアスペクト比を有する粒子の投与により起きるものより免疫応答が約３〜約４倍大きい。そのような１態様において、マイクロメートルサイズの粒子は、約１マイクロメートル×約１マイクロメートル×約１０マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む。
【０００９】
[009] 本発明の他の態様によれば、ナノメートルサイズの粒子にカップリングした抗原により起きる免疫応答を低下させる方法は、ナノメートルサイズの粒子のアスペクト比を増大させることを含む。
【００１０】
[0010] 本発明の他のある態様において、対象に投与した免疫刺激作用物により起きる免疫応答を実質的に阻害する方法は、免疫刺激作用物を対象に投与する前に、免疫刺激作用物を非分解性リンカーにより粒子にカップリングさせることを含む。１態様において、該方法により、免疫刺激作用物を対象に初回投与した後の免疫応答が実質的に阻害される。他の態様において、該方法により、免疫刺激作用物を対象に追加抗原刺激（ブースター）投与した後の免疫応答が実質的に阻害される。
【００１１】
[0011] 本発明のある態様によるワクチン粒子組成物は、第１タンパク質を第１速度で放出しかつ第２タンパク質を第２速度で放出するように構築され、かつ１回量で初回抗原刺激能および追加抗原刺激能を備えるように構築された、複数の粒子を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
[0012]
【図１】図１は、本発明の１態様によるワクチン粒子の初回注射後３週目の応答を示す；その際、抗体レベルは２００ｎｍのワクチン粒子について１，２８０；２マイクロメートルのワクチン粒子について１０，２４０；ｒＰｒｏｔｅｉｎについて１０１である。
【００１３】
[0013]
【図２】図２は、本発明の１態様によるワクチン粒子の初回注射後の他の応答を示す。 [0014]
【図３】図３は、本発明の１態様によるワクチン粒子の初回注射後のさらに他の応答を示す。
【００１４】
[0015]
【図４】図４は、非分解性リンカーと分解性リンカーを比較した、初回注射後の本発明の１態様によるワクチン粒子に対する応答を示す。 [0016]
【図５】図５は、非分解性リンカーと分解性リンカーを比較した、追加抗原刺激注射後の本発明の１態様によるワクチン粒子に対する応答を示す。
【００１５】
[0017]
【図６】図６は、本発明の１態様による８０ｎｍ×８０ｎｍ×３６０ｎｍポリ（ジメチルアミノメタクリレート）（ＰＬＧＡ）ワクチン粒子を示す。 [0018]
【図７】図７は、本発明の１態様によるワクチン粒子についてビオチン−アビジン連結システムの模式図を示す。
【００１６】
[0019]
【図８】図８は、本発明の１態様による血球凝集反応アッセイを示す：（１）マウス血清アルブミンでコートした２００ｎｍ×２００ｎｍ×２００ｎｍのワクチン粒子（対照）；（２）ＨＡタンパク質でコートした２００ｎｍ×２００ｎｍ×２００ｎｍのワクチン粒子（活性）；（３）ＨＡタンパク質陽性対照；および（４）陰性対照を比較した複合イメージを示し、その際、粒子の表面にＨＡタンパク質が存在することの指標となる血球凝集は囲まれたウェル内に示される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[0020] 本発明のある態様は、ナノ粒子成形法によりワクチンを作製する。意外な結果のひとつは、抗原、たとえばインフルエンザＨＡ（”ＨＡ”）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡタンパク質）と免疫刺激作用物または免疫増強作用物、たとえばフラジェリンまたはＩＬ−１２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）とをナノ粒子上またはナノ粒子内で組み合わせると、強力な適応免疫応答を誘発しうることである。さらに、抗原および／または免疫増強作用物（以下、”作用物”と呼ぶ）は、ある態様において、個々の適用および／または抗原／作用物の組合わせに対して最適化しうるように、ナノ粒子内にパッケージするか、あるいはナノ粒子の外側に提示することができる。さらに、ある態様において、ナノ粒子の免疫増強作用物と抗原成分の比率を、個々の適用に合わせて構築することができる。ある態様においては、１種類以上の免疫増強作用物をナノ粒子および１種類以上の抗原と共に含有させることができる。他の態様において、ナノ粒子は、細胞特異的または組織特異的な結合剤またはターゲティング剤をも含有することができる。
【００１８】
[0021] ＰＲＩＮＴ（登録商標）技術（Ｌｉｑｕｉｄｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ノースカロライナ州）は、ナノ粒子のサイズ、形状、組成、表面機能性、および他の物理的特性、たとえばモジュラスなどを特異に制御することができる、ナノ粒子製造方法である。この技術を本発明のある態様に使用すると、特異な共送達方式、形状特異的およびサイズ特異的な免疫原性、抗原および免疫増強作用物など生物学的な装填物（ｃａｒｇｏ）の無ウイルス送達、合成による送達ベクター、ならびに非経口、鼻、経口、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、吸入などを含めた多数の送達経路を得ることが可能になる。
【００１９】
[0022] 本発明のある態様によるナノ粒子の組成は、種々の用量の抗原を、および／または抗原と作用物成分を、持続放出するように構築して、免疫系との相互作用および抗体形成を最適化することができる。ある態様において、ナノ粒子の組成は、予め定めた速度で、および／または予め定めた環境条件、たとえばｐＨ、水性環境、特定の酵素などに応答して分解するように構築できる。ある態様において、ナノ粒子は、架橋剤および／または架橋剤密度を予め選択することにより、予め選択した環境または予め選択した分解速度での粒子の分解を促進するように、分解を調節することができる。ある態様において、ナノ粒子は、目的とする細胞をスクリーニングし、結合し、またはそれから遮蔽するために、多様なタイプおよび量の表面作用物を含有することができる。本発明のある態様によるナノ粒子は、ナノ粒子のポリマーマトリックスを制御することにより、ナノ粒子が分解する前に抗原を細胞内空間へ送達するように設計することもでき、これにより抗原および／または抗原／免疫増強作用物の細胞内送達が得られる。本発明のある態様による組成物は、生分解性材料、親水性材料、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ ｓａｆｅ）材料などを含有することができる。ある態様において、本発明の粒子はポリ（エチレングリコール）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ポリカプロラクトンなどを含有するか、またはそれらから形成することができる。
【００２０】
[0023] ある態様において、粒子組成物は抗原と作用物の両方を含む。ある態様において、粒子組成物は抗原または作用物のうち一方のみを含む。ある態様においては、１種類以上の抗原または作用物をナノ粒子の表面にコンジュゲートさせる。ある態様において、作用物と抗体の比率は、ナノ粒子に成形する組成物またはナノ粒子の表面にコンジュゲートさせる組成物を制御することにより制御できる。
【００２１】
[0024] ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０〜約５０重量％を構成する。ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０〜約４０重量％を構成する。ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０〜約３０重量％を構成する。ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０〜約２０重量％を構成する。ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０．１〜約２０重量％を構成する。ある態様において、表面における抗原の量は粒子の約０．１〜約１０重量％を構成する。
【００２２】
[0025] ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約７０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約６０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約５０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約４０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約３０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約２０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０〜約１０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０．１〜約３０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０．１〜約２０重量％を構成する。ある態様において、免疫増強作用物は抗原量の約０．１〜約１０重量％を構成する。
【００２３】
[0026] ある態様において、本発明のナノ粒子は粒子仲介による制御放出をもたらし、これにより現在の免疫調節ワクチン技術に対する応答を改善し、反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を低下させることができる。ある態様によるナノ粒子は、たとえばマトリックス組成を操作することにより、用量節減およびブースト節減方式を提供するように、かつ製品の安定性および貯蔵寿命を高めるように構築することもできる。ある態様における免疫調節ワクチンのナノ粒子パッケージングはさらに、予め選択した環境条件に対してインビボ分解を最小限にし、またはインビボ分解を制御することができる。本発明のある態様におけるナノ粒子は、さらに追加の免疫調節剤および／または抗原を、１回量または多数回量を構成する単一のナノ粒子内または複数のナノ粒子内に共パッケージングする可能性を提供する。
【００２４】
[0027] 他の態様において、本発明のナノ粒子は、多価ワクチンおよびＴｈ１／Ｔｈ２調節をもたらす。ある態様において、ナノ粒子は、エンドソームを回避して粒子仲介による細胞質ゾルへの送達をもたらすこともでき、これによりＴ細胞誘導のために効果的な抗原提示が可能になる。本発明のある態様におけるナノ粒子は、単一粒子の内部または上におけるフラジェリンおよび免疫原の共パッケージングをもたらこともでき、これにより融合タンパク質の必要性を避けることができる。ある態様において、本発明のナノ粒子は、フラジェリンおよび／または免疫原の適正なコンホメーションの維持、ＡＰＣターゲティングの向上、投与要求量の減少、反応原性の低下、その組合わせなどを増強する。ある態様においては、粒子を作製した後、すべての水性条件および化学を使用した後に、免疫原および／またはフラジェリンを粒子に付着させるので、フラジェリンおよび／または免疫原の適正なコンホメーションが本発明のナノ粒子において増強される。
【００２５】
[0028] ある態様において、本明細書に援用したナノ粒子成形技術（ＰＲＩＮＴ（登録商標）（Ｌｉｑｕｉｄｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州））に記載されたナノ粒子作製により、抗原、免疫調節剤、アジュバントおよび他の免疫増強作用物を含めた多数の生物学的作用物を容易にナノ粒子マトリックス内に取り込むことができる。このナノ粒子成形技術により、ある態様において、ターゲティングリガンドを粒子の表面に付着させることもできる。ある態様によるワクチン適用について、療法剤をターゲティングさせることは全身的な反応原性をもつ機会を減らし、および／または投与要求量を減少させる。本発明のある態様において、粒子は表面、全表面または粒子内に、１種類以上の免疫増強作用物および１種類以上の抗原を含有する。ある態様において、粒子は１種類以上の目的抗原、免疫増強作用物、およびターゲティング剤を含む。前記のナノ粒子成形技術により、ある態様において、多価ワクチンも可能となる。ある態様において、ナノ粒子は多価ワクチン抗原を含有または収容する。
【００２６】
[0029] ある態様において、ナノ粒子は、抗原（１以上）と免疫増強作用物が物理的に分離されるように構成される。抗原と作用物を物理的に分離するための技術のひとつは、ある態様において、抗原を封入し、そして粒子の表面を作用物で機能化するか、あるいはその逆を含む。抗原と作用物を物理的に分離するための他の技術は、ある態様において、抗原と作用物の両方を同一粒子の表面の異なる領域に付着させ、粒子に抗原と作用物の間を連結させることを含む。ある態様において、これによりタンパク質の形状、すなわちコンホメーションを維持することができる；これは、適切な免疫応答を発生させるために、たとえば抗体誘導のために重要であり、免疫増強作用物の活性にとって決定的となることができる。
【００２７】
[0030] 本発明のある態様において、粒子は、含有される免疫増強作用物に応じて免疫応答をＴｈ１またはＴｈ２のいずれかに偏る方向へ偏らせるように設計される。ある態様において、粒子マトリックスの分解は特定の応答を誘導するように設計される。ある態様において、粒子は、エンドソーム内で分解し、それを破裂させ、ＣＤ８応答を発生させるように設計される。ある態様において、粒子はエンドソーム／リゾソーム経路で分解され、ＣＤ４ Ｔ細胞に提示されて、最終的にさらに多くの抗体応答を誘導するように設計される。
【００２８】
[0031] ある態様において、粒子は２種類以上のタンパク質を異なる速度で放出するように設計される。ある態様において、２種類以上のタンパク質はそれぞれ異なる速度で放出される。ある態様においては、単一のナノ粒子デザインが同じ投与で初回抗原刺激能および追加抗原刺激能を備えることができるように、放出速度を調整する。ある態様において、ある粒子は、あるタンパク質を速やかに放出し、かつそのナノ粒子と結合または組み合わせた他のタンパク質を徐々に放出するように設計される。ある態様においては、装填物を遮蔽して、遅れて追加抗原刺激する能力を高める。ある態様においては、装填物をインビボ分解から保護し、これにより有効性が改善され、おそらく投与要求量の減少につながるであろう。
【００２９】
[0032] ある態様において、本発明のワクチン粒子を特定の形状に加工して、目的とする増強または低下した抗体応答を誘発することができる。ある態様において、高いアスペクト比の粒子は、より低いアスペクト比をもつ粒子より大きな免疫原応答を誘発する。他の場合、より低いアスペクト比がより大きな免疫原応答を誘発する。アスペクト比は、粒子の最短軸に対する最長軸の比を表わす。ある態様において、好ましい粒子形状は、取込み機序、抗原、免疫刺激作用物、応答のタイプなどの関数である可能性がある。ある態様においては、より大きな表面−対−体積比をもつ粒子形状が好ましい。
【００３０】
[0033] ある態様においては、少なくとも約１：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約２：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約３：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約４：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約５：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約６：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約７：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約８：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約９：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、少なくとも約１０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様によれば、約１：１〜約６０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。別態様においては、約１：１〜約５０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。他の態様においては、約１：１〜約４０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様によれば、約１：１〜約３０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約２０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約１５：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約１０：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約９：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約８：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約７：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様において、約１：１〜約６：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約５：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約４：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約３：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約１：１〜約２：１の範囲のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約１：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約２：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約３：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約４：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約５：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約６：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約７：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約８：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様においては、約９：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。別態様においては、約１０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。他の態様においては、約１５：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。他の態様においては、約２０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。ある態様によれば、約３０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約４０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約５０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約６０：１のアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。さらに他の態様においては、約６０：１より大きなアスペクト比をもつワクチン粒子を作製することができる。
【００３１】
[0034] したがって、本発明のワクチン粒子はナノスケールで制御されるいかなる寸法でも作製できる。たとえば、前記アスペクト比をもつ本発明のワクチンナノ粒子を、約８０ｎｍ×約９０ｎｍの寸法の円筒形をもつ粒子；約８０ｎｍ×約８０ｎｍ×約３６０ｎｍの寸法をもつ粒子；約８０ｎｍ×約８０ｎｍ×約２０００ｎｍの寸法をもつ粒子；約８０ｎｍ×約８０ｎｍ×約５０００ｎｍの寸法をもつ粒子；約１マイクロメートル×約１マイクロメートルの寸法をもつ粒子；約１マイクロメートル×約３マイクロメートルの寸法の円筒形をもつ粒子；約１マイクロメートル×約１０マイクロメートルの寸法をもつ粒子として作製することができる。
【００３２】
[0035] 本発明のある態様による、ＨＡおよびＩＬ−１２を共送達するワクチン粒子（たとえば実施例２の粒子）は、図１に示すように、２種類の可溶性タンパク質の混合物を投与したマウスにおいて発生する応答と比較してより強い抗体応答をＨＡタンパク質に対して誘導する。ある態様における抗体応答の増大は、約１０倍から約１００倍までの増大に及ぶことができる。ある態様においては、粒子サイズも抗体応答に影響を及ぼす。図１に示すように、初回注射の３週後に、可溶性タンパク質は約１００抗体価の応答を発生し、本発明の２００ｎｍ×２００ｎｍ×２００ｎｍのワクチン粒子は約１２８０抗体価の応答を発生し、本発明の２マイクロメートル×２マイクロメートル×２マイクロメートルのワクチン粒子は約１０，２４０抗体価の応答を発生する。ある態様において、本発明のワクチン粒子は、抗原とタンパク質アジュバントを効果的に送達するように、かつ目的とする免疫原性が得られるように、形状、サイズおよびアスペクト比を調整することができる。
【００３３】
[0036] 他の態様によれば、本発明のワクチンナノ粒子のアスペクト比は、ワクチンナノ粒子に対して発生する応答に影響を及ぼすことができる。ある態様において、図２に示すように、初回注射の後、それらの表面とカップリングしたインフルエンザＨＡをもつマイクロメートルサイズのワクチンナノ粒子のアスペクト比は、ワクチンナノ粒子のアスペクト比が増大するのに伴って増大する免疫応答を発生する。ある態様において、約３：１のアスペクト比をもつ粒子の免疫応答は、１：１のアスペクト比をもつ粒子の免疫応答の約２〜３倍である。ある態様において、約１０：１のアスペクト比をもつマイクロメートル粒子の免疫応答は、１：１のアスペクト比をもつマイクロメートルサイズの粒子の免疫応答の約３〜４倍である。１回注射後に誘導された抗体応答を図２に示す。
【００３４】
[0037] ある態様において、図３に示すように、ナノメートルサイズのワクチン粒子のアスペクト比は、初回注射の後、表面にインフルエンザＨＡがカップリングしたワクチン粒子のアスペクト比が増大するのに伴って低下する免疫応答を生じる。図３に示すワクチン粒子の組成物は、架橋したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースのもの（７９％のポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、２０％のアミノメチルメタクリレートＨＣｌ、１％のＨＣＰＫから構成され、次いでビオチンリンカー表面修飾により処理されたもの）を含有する。
【００３５】
[0038] 本発明のワクチン粒子は、ある態様において、低い表面エネルギーの型内で、下記の特許出願に記載された方法および材料を用いて成形される：米国特許出願Ｎｏｓ．：１０／５８３，５７０、２００６年６月１９日出願、および１１／５９４，０２３、２００６年１１月７日出願；ならびにＰＣＴ国際特許出願Ｎｏｓ．：ＰＣＴ／ＵＳ０４／４２７０６、２００４年１２月２０日出願；ＰＣＴ／ＵＳ／０６／２３７２２、２００６年６月１９日出願；ＰＣＴ／ＵＳ０６／３４９９７、２００６年９月７日出願；ＰＣＴ／ＵＳ０６／４３３０５、２００６年１１月７日出願；およびＰＣＴ／ＵＳ０７／０２４７６、２００７年１月２９日出願；そのそれぞれの全体を本明細書に援用する。下記も参照されたい：米国仮特許出願Ｎｏｓ．：６０／５３１，５３１、２００３年１２月１９日出願；６０／５８３，１７０、２００４年６月２５日出願；６０／６０４，９７０、２００４年８月２７日出願；６０／６９１，６０７、２００５年６月１７日出願；６０／７１４，９６１、２００５年９月７日出願；６０／７６２，８０２、２００６年１月２７日出願；６０／７９８，８５８、２００６年５月９日出願；６０／７３４，２２８、２００５年１１月７日出願；６０／７５７，４１１、２００６年１月９日出願；６０／７９９，８７６、２００６年５月１２日出願；６０／８３３，７３６、２００６年７月２７日出願；６０／９７９，７１０、２００７年１０月１２日出願、および６０／８２８，７１９、２００６年１０月９日出願；そのそれぞれの全体を本明細書に援用する。
【００３６】
[0039] ある態様において、本発明のワクチン粒子は免疫応答を生じないように配合される。ある態様による粒子の免疫原性は、リンカー基化学を用いて抗原および／または作用物を粒子の表面にコンジュゲートさせることにより制御できる。詳細には、ある態様において、リンカー基の分解速度により免疫原性を制御できる。非分解性結合により表面に連結したＨＡを含有する粒子と対比して、分解性ジスルフィド架橋剤により表面に連結したＨＡを含有する粒子を注射したマウスにおいて、より高い抗体応答がみられる。この効果は、初回抗原刺激および追加抗原刺激の両方の注射後にみることができる。
【００３７】
[0040] ある態様によれば、図４および５にみられるように、非分解性架橋剤によりナノ粒子に連結したタンパク質は活性を生じないか、または限られた活性を生じ、これに対し、分解性架橋剤により連結したタンパク質は応答を生じる。ある態様において、ナノ粒子はそれに非分解性架橋剤により付着したアジュバントをもち、したがってそのアジュバントに関して免疫応答は発生しないかまたは発生は最小限である。これは、単に非分解性リンカーによりアジュバントをナノ粒子に付着させるだけで、たとえば多数回の注射にわたってアジュバントの効果を維持するのを補助することができ、さほど存在量を考慮せずに有効性の高いアジュバントを使用するのを可能にし、しばしば有害反応を誘発するアジュバントの使用を可能にする。図４に示すように、分解性リンカーで付着させた場合にはＨＡタンパク質でコートしたワクチンナノ粒子を投与したマウスにおいて抗ＨＡ抗体応答が発生したが、非分解性リンカーでＨＡタンパク質を付着させた場合には初回注射後に検出可能な応答は発生しなかった。これらの結果は、２００ｎｍ×２００ｎｍ×２００ｎｍのワクチン粒子および２マイクロメートル×２マイクロメートル×２マイクロメートルのワクチン粒子の両方についてみられた。２回目の注射後、図５にみられるように、非分解性リンカーで連結したＨＡタンパク質を含有する粒子について抗ＨＡ抗体応答は検出可能ではあったが、２００ｎｍのワクチン粒子についての応答は、分解性リンカーにより付着したＨＡをもつ２００ｎｍのワクチン粒子で発生した応答より約３〜４倍少なく、２マイクロメートルのワクチン粒子についての応答は、分解性リンカーにより付着したＨＡをもつ２マイクロメートルのワクチン粒子から発生したものより約５〜６倍少なかった。
【００３８】
[0041] 本発明のある態様によれば、それに対する免疫応答を望まないかまたは限られた免疫応答を望む作用物、抗原、分子などを付着させる非分解性リンカーを用いて、ワクチン粒子を形成することができる。たとえば、ターゲティング剤または他のタンパク質もしくは分子を非分解性リンカーにより本発明のワクチン粒子に付着させることができ、その作用物がワクチン粒子上に存在することによる免疫応答は誘発されないか、または限られた免疫応答が誘発されるであろう。
【００３９】
[0042] ある態様においては、抗原に対する免疫応答を改善するために抗原を粒状で送達する。ある態様においては、適切な応答を得るためにアジュバントおよび／または免疫増強作用物の用量を変更する。ある態様においては、送達される抗原の量を減らす必要なしに反応原免疫調節剤を少なく投与するように、用量を調整する。ある態様においては、反応原タンパク質を粒子内に封入する。ある態様においては、粒子を目的細胞へターゲティングさせる。ある態様において、細胞は抗原提示細胞である。他の態様において、粒子は、細胞内に取り込まれ、次いで粒子がインターナリゼーションされた時点で分解するように設計される。ある態様においては、粒子の表面を１種類以上の抗原、免疫増強作用物およびターゲティングリガンドで機能化することができる。ある態様においては、１種類以上の抗原、免疫増強作用物およびターゲティングリガンドを分解性リンカー基で表面に付着させる。ある態様においては、１種類以上の抗原、免疫増強作用物およびターゲティングリガンドを非分解性リンカー基で表面に付着させる。ある態様においては、１種類以上の抗原、免疫増強作用物およびターゲティングリガンドを分解性リンカー基で表面に付着させ、他を非分解性リンカー基で表面に付着させる。たとえば、１態様において、ＰＬＧＡナノ粒子は、表面に多様な量で付着したＨＡ、ＩＬ−１２および細胞ターゲティングリガンドをもつことができる；ＨＡおよびＩＬ−１２を分解性リンカー基で付着させ、細胞ターゲティングリガンドを非分解性リンカー基で付着させることができる。
【００４０】
[0043] 本発明のナノ粒子ワクチンに用いる抗原はいかなるタイプの抗原であってもよく、たとえば下記のものを含むが、これらに限定されない：病原体関連抗原、腫瘍関連抗原、アレルギー関連抗原、神経欠損関連抗原、心血管疾患抗原、リウマチ様関節炎関連抗原、他の疾病関連抗原、ホルモン、妊娠関連抗原、胚性抗原、および／または胎児性抗原など。１態様において、ナノ粒子ワクチンは組換えタンパク質、または組換えリポタンパク質、または組換え糖タンパク質、および１以上の抗原である。
【００４１】
[0044] 本発明のナノ粒子ワクチンをその必要がある対象に投与して、目的抗原に対する免疫応答および抗体形成を誘発することができる。ナノ粒子ワクチンは、注射、吸入、経皮、経粘膜、肛門、膣、眼、経口摂取、静脈内、その組合わせなどにより投与できる。ある態様において、ウイルス抗原／作用物ナノ粒子製剤、たとえば抗原−フラジェリンナノ粒子は、著しく免疫原性ではないターゲットに対してすら応答を発生することができ、これにはウイルスタンパク質の高度に保存された領域が含まれる。
【００４２】
[0045] ヒトまたは動物対象に投与すると、本発明のある態様によるナノ粒子ワクチンはたとえば樹状細胞およびマクロファージと相互作用することができる。この相互作用は２つの結果を伴うであろう：第１に、ナノ粒子ワクチンの免疫刺激作用物部分がシグナル伝達経路、たとえばＮＦ−カッパＢ、ＪＮＫおよび／またはｐ３８経路と相互作用してそれを刺激するであろう。第２に、受容体とのこの相互作用のため、ナノ粒子ワクチンは細胞タイプ、ナノ粒子ワクチンのサイズ、および刺激作用物の素性に応じて、食作用、エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスにより樹状細胞およびマクロファージに取り込まれるであろう。次いで、シグナル伝達経路の活性化によって、樹状細胞およびマクロファージ、場合によってはＢ細胞による、サイトカイン、ケモカイン、接着分子、および共刺激分子の発現が誘導されるであろう。ナノ粒子の取込みにより、粒子内または粒子上に含まれる抗原（１以上）のプロセシング、ならびにＭＨＣクラス−ＩおよびＭＨＣクラス−ＩＩ分子による提示が生じるであろう。これは、ナイーブＴ細胞の活性化に必要な２つのシグナル、すなわち特異的抗原シグナルおよび共刺激シグナルを発生するであろう。さらに、ナノ粒子ワクチンにより誘導されたケモカインはナイーブＴ細胞をＡＰＣへ動員し、サイトカイン、たとえばＩＬ−１２はＴ細胞からＴｈ−１エフェクター細胞への分化を誘導するであろう。その結果、強力なＴ細胞性免疫応答が誘導され、これが次いで適応免疫応答の他の面、たとえば抗原特異的Ｂ細胞およびマクロファージの活性化を活性化するであろう。
【００４３】
[0046] ある態様において、本発明に有用な物質は下記にみられる：米国特許番号ＵＳ７，２８５，５３５、表題：Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）；およびＵＳ６，９６０，３４３、表題：Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）；ならびに米国特許出願公開ＵＳ２００７０１６０６２３、表題：先天性免疫系指向性ワクチン；ＵＳ２００７０１２２４２１、表題：先天性免疫系指向性ワクチン；ＵＳ２００６０１８８９３３、表題：ＩＲＡＫ−Ｍはｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の負の調節物質である；ＵＳ２００６０１３０１６４、表題：Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）；ＵＳ２００６０１２１４６０、表題：Ｔｏｌｌ様受容体１１；ＵＳ２００５０１６３７６４、表題：ｔｏｌｌ様受容体のアゴニストによる治療；ＵＳ２００３０２３２０５５、表題：先天性免疫系指向性ワクチン；ＵＳ２００３０２２４３８８、表題：ＲＩＰ２：先天性および適応免疫系におけるシグナル伝達の仲介物質；ＵＳ２００３０１７５２８７、表題：先天性免疫系指向性ワクチン；ＵＳ２００３０１５７５３９、表題：ＩＲＡＫ−Ｍはｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の負の調節物質である；ＵＳ２００３００２３９９３、表題：Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）；およびＵＳ２００２００６１３１２、表題：先天性免疫系指向性ワクチン；これらのそれぞれをそこに開示されるすべてについて全体として本明細書に援用する。ある態様において、前記に援用した参考文献中の情報の一部には、免疫刺激タンパク質または作用物、抗原、融合タンパク質、送達技術、投与計画などが含まれる。
【００４４】
[0047] 本発明に有用な他の物質には、下記のものを含めることができる：米国特許番号７，０６０，２８４、これは特に免疫系を刺激するための、およびＨＥＲ−２タンパク質の過剰発現に関連する悪性疾患を処置するための、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む組成物について考察している; Brennan, et al.,”Cowpea Mosaic Virus as a Vaccine Carrier of Heterologous Antigens,”Mol. Biotechnol. 17(1): 15-26 (2001)、これは特にヘテロロガス抗原のキャリヤーとしてのキメラウイルス粒子について考察している；米国特許番号６，０６０，０６４、Ａｄａｍｓらに付与、これは特にワクチンとして使用するための免疫原アミノ酸配列をディスプレーするために用いるタンパク質キャリヤーの使用について記載している；米国特許番号６，０８６，８８１、Ｆｒｅｙらに付与、これは特に金属酸化物粒子を含む他の多価ワクチン構築体について記載している；米国特許番号５，６８６，１１３、Ｓｐｅａｋｅｒらに付与、これは特に合成によらない多糖類ベースのスペルミン、アルギネートカプセルについて記載している；米国特許番号６，３２６，０２１、Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎらに付与、これは特に合成によるポリラクチド−ｃｏ−グリコリドの生体適合性ベースのポリマーについて記載している；米国特許番号５，７０９，８７９、Ｂａｒｃｈｆｅｌｄらに付与；６，３４２，２２６、Ｂｅｔｂｅｄｅｒらに付与；６，０９０，４０６、Ｐｏｐｅｓｃｕらに付与；ならびにLian, et al., Trends and Developments in Liposome Drug Delivery Systems, J. of Pharma. Sci. 90(6): 667-680 (2001)、およびvan Slooten, et al., Liposomes Containing Interferon-gamma as Adjuvant in Tumor Cell Vaccines, Pharm Res. 17(1): 42-48 (2000)、これらは特に脂質または他の脂肪酸から製造したワクチンとして使用するためのナノ粒子キャリヤーについて記載している；ならびにKreuter,”Nanoparticles and Microparticles for Drug and Vaccine Delivery,” J. Anat. 189: 503-505 (1996)、これは特に非脂質組成物について記載している；これらのそれぞれをそこに開示されるすべてについて全体として本明細書に援用する。
【００４５】
[0048] ”ワクチン”は、抗原、および場合により他の補助分子（ａｎｃｉｌｌａｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む組成物を表わすことができる；それの目的は、そのような組成物を対象に投与して、特異的にその抗原に対する免疫応答を刺激し、好ましくは対象が将来いつかその抗原に遭遇した際に免疫応答の装着（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）をもたらす免疫記憶を生じさせることである。他の補助分子の例は、非特異的免疫刺激分子であるアジュバント、および抗原の薬物動態特性および／または薬力学的特性を改善する他の分子である。一般に、ワクチンは通常、疾患を引き起こす生物（適切に弱毒化または死滅させたもの）または病原性生物のある部分を抗原として含む。弱毒化した生物、たとえば弱毒化したウイルスまたは弱毒化した細菌は、それらの自然宿主におけるそれらの増殖能の一部または全部を失うように操作されている。現在では、ワクチンの製造のために用いられる広範なバイオテクノロジー方法がある（たとえばW. Bains (1998) Biotechnology From A to Z, Second Edition, Oxford University Press参照）；これの全体を本明細書に援用する。
【００４６】
[0049] ”抗原”は、適応免疫系の抗原受容体によって特異的に認識される物質を表わす。たとえば、本明細書中で用いる用語”抗原”には、抗原、抗原の免疫原性である誘導体または部分、および抗原に由来する免疫原性分子が含まれる。好ましくは、本発明に使用する抗原は単離された抗原である。本発明に特に有用な抗原には、病原体関連、アレルゲン関連または疾病関連であるものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
[0050] 抗原は、インビボまたはインビトロで、幾らかの潜伏期（ヒトにおいては、普通は数日ないし数週間）の後、感受性および／または免疫応答性の状態を誘導し、感作された対象の抗体および／または免疫細胞と証明可能な形で反応するいずれかの物質でもある。抗原の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：微生物関連抗原、特に病原体、たとえばウイルス、真菌もしくは細菌の抗原、またはそれらに由来する免疫原分子；細胞性抗原：正常な移植抗原および／または腫瘍関連抗原を含む細胞が含まれる；ＲＲ Ｒｈ抗原；特定の細胞または組織または体液に特徴的または特異的な抗原；ならびにアレルゲン関連抗原、たとえば環境アレルゲン（たとえば、牧草（ｇｒａｓｓｅｓ）、花粉、カビ、塵埃、昆虫および鱗屑）、職業性抗原（たとえば、ラテックス、鱗屑、ウレタン、エポキシ樹脂）、食物（たとえば、貝、ピーナッツ、卵、乳製品）、薬物（たとえば抗生物質、麻酔薬）、およびワクチン（たとえばインフルエンザワクチン）に関連するもの。
【００４８】
[0051] 抗原プロセシング、およびディスプレーされたペプチドのＴリンパ球による認識は、抗原の三次元構造よりむしろ、大部分は抗原のアミノ酸配列に依存する。したがって、本発明のナノ粒子ワクチンに用いる抗原部分は、配列全体よりむしろ、目的とするエピトープまたは特異的ドメインを含むことができる。事実、本発明のナノ粒子ワクチンの抗原性部分は、抗原全体よりむしろ、抗原の１以上の免疫原部分または誘導体を含むことができる。さらに、本発明のナノ粒子ワクチンは、抗原の空間エピトープに対する抗体応答を発生させるために、無傷の三次元構造をもつ抗原全体、または抗原の抗原決定基の三次元構造を保持する部分を含むことができる。
【００４９】
[0052] 病原体関連抗原。病原体関連抗原の具体例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：下記のものからなる群から選択される抗原：ワクシニア、アビポックスウイルス、七面鳥インフルエンザウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、ニワトリ肺ウイルス症（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｏｓｉｓ）ウイルス、イヌパルボウイルス、ウマインフルエンザ、ＦＨＶ、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ニワトリ／ペンシルベニア／１／８３インフルエンザウイルス；感染性気管支炎ウイルス；デング熱ウイルス、麻疹（ｍｅａｓｌｅｓ）ウイルス、風疹ウイルス、仮性狂犬病、エプスタイン−バーウイルス、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＨＶ、ＢＨＶ、ＨＣＭＶ，ハンターン（Ｈａｎｔａａｎ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、流行性耳下腺炎、麻疹ウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）、単純疱疹ウイルス１型、単純疱疹ウイルス２型、ヒトサイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、呼吸系発疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザウイルス、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、およびプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）およびトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）、破傷風（Ｔｅｔａｎｕｓ）菌、百日咳（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）菌、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、体内寄生性アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）、ならびにトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎａｓｏｍａ）。
【００５０】
[0053] 癌関連抗原。本発明の方法および組成物は、腫瘍関連タンパク質抗原、たとえば黒色腫関連抗原、乳癌関連抗原、結腸直腸癌関連抗原、前立腺癌関連抗原などに対抗するワクチンの製造にも使用できる。
【００５１】
[0054] そのようなワクチンに有用な腫瘍関連または組織特異的タンパク質抗原の具体例には、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｈｅｒ−２、上皮増殖因子受容体、ｇｐｌ２０、およびｐ２４からなる群から選択される抗原が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍が増殖性および悪性の細胞を生じるためには、それらは血管新生性にならなければならない。腫瘍の血管新生を阻止する方策は治療法になる可能性をもつ。本発明の方法および組成物は、腫瘍の血管新生に対抗するナノ粒子ワクチンの製造にも使用できる。そのようなナノ粒子ワクチンのターゲット抗原の例は、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体、線維芽細胞増殖因子および線維芽細胞増殖因子受容体などである。
【００５２】
[0055] アレルゲン関連抗原。本発明の方法および組成物は、アレルギーおよび喘息の予防および治療にも使用できる。本発明によれば、１以上のタンパク質アレルゲンを１以上のナノ粒子または免疫刺激作用物に連結させて、作用物／抗原キメラ構築体を調製し、そしてその抗原に対してアレルギー性である対象に投与することができる。したがって、本発明の方法および組成物は、アレルギー反応を抑制しうるナノ粒子ワクチンの構築にも使用できる。
【００５３】
[0056] 本発明の方法および組成物に有用なアレルゲン関連タンパク質抗原の具体例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：花粉に由来するアレルゲン、たとえば樹木、たとえば杉（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｃｅｄａｒ）（スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ））、牧草（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）、たとえば鴨萱（オーチャードグラス）（ｏｒｃｈａｒｄ−ｇｒａｓｓ）（カモガヤ属（Ｄａｃｔｙｌｉｓ），カモガヤ（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ））、雑草（ｗｅｅｄ）、たとえば豚草（ｒａｇｗｅｅｄ）（ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ））；花粉アレルゲンの具体例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：スギ花粉アレルゲンＣｒｙ ｊ １（J. Allergy Clin. Immunol. (1983) 71: 77-86)およびＣｒｙ ｊ ２（FEBS Letters (1988) 239: 329-332)；これらの全体を本明細書に援用する；ならびにブタクサアレルゲンＡｍｂ ａ Ｉ．１、Ａｍｂａ Ｉ．２、Ａｍｂ ａ Ｉ．３、Ａｍｎｂ ａ Ｉ．４、Ａｍｂ ａ ＩＩなど；真菌（アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）など）に由来するアレルゲン；ダニに由来するアレルゲン（ヤケチリダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）、コナチリダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）などに由来するアレルゲン；ダニアレルゲンの具体例には、Ｄｅｒ ｐ Ｉ、Ｄｅｒ ｐ ＩＩ、Ｄｅｒ ｐ ＩＩＩ、Ｄｅｒ ｐ ＶＩＩ、Ｄｅｒ ｆ Ｉ、Ｄｅｒ ｆ ＩＩ、Ｄｅｒ ｆ ＩＩＩ、Ｄｅｒ ｆ ＶＩＩなどが含まれる）；ハウスダスト；動物の皮膚片、糞および毛に由来するアレルゲン（たとえば、ネコアレルゲンＦｅｌ ｄ Ｉ）；昆虫に由来するアレルゲン（たとえば、ガ、チョウ、ユスリカ科（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｉｄａｅ）などの鱗毛または鱗粉、スズメバチ科（Ｖｅｓｐｉｄａｅ）、たとえばオオスズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｍａｎｄａｒｉｎｉａ）の毒）；食物アレルゲン（卵、牛乳、食肉、海産食物、マメ類、穀類、果実、ナッツ類および野菜など）；寄生生物（たとえば回虫および線虫、たとえばアニサキス属（Ａｎｉｓａｋｉｓ））に由来するアレルゲン；ならびにタンパク質またはペプチドをベースとする薬物（たとえばインスリン）。
【００５４】
[0057] 他の疾病抗原。本発明においては、癌、アレルギーおよび喘息以外の疾病に関連する抗原に対抗するナノ粒子ワクチンも考慮される。多数のうちの限定ではない一例として、ベータ−アミロイド前駆タンパク質のタンパク質開裂産物、”アミロイドベータペプチド”と呼ばれるものの細胞外蓄積は、アルツハイマー病の病因と関連する(Janus et al., Nature (2000) 408: 979-982; Morgan et al., Nature (2000) 408: 982-985)；それらの全体を本明細書に援用する。したがって、本発明のナノ粒子ワクチン中に用いるキメラ構築体は、アミロイドベータペプチド、またはアミロイドベータペプチドの抗原性ドメインを構築体の抗原部分として含むことができる。
【００５５】
[0058] ”免疫増強作用物（ｉｍｍｕｎｏ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ａｇｅｎｔ）”または”免疫刺激作用物（ｉｍｍｕｎｏ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）”または”作用物（ａｇｅｎｔ）”は、微生物中にみられるがヒトにはみられない分子パターンであって、先天性免疫応答を誘発することができるものを意味することができる。したがって、本明細書中で用いる前記の用語は、そのような微生物分子パターンをいずれも含み、病原性の微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍまたはｍｉｃｒｏｂｅ）に関連するものに限定されない。本明細書中で用いる前記の用語には、先天性免疫応答の潜在的イニシエーターである構造体またはその誘導体が含まれる。免疫刺激構造体は、下記を含めた分子（それらに限定されない）にみられるか、またはそれからなる：リポ多糖類；ホスファチジルコリン；サイトカインアジュバント；グリカン：ペプチドグリカンを含む；テイコ酸（ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）類：リポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）類を含む；タンパク質：リポタンパク質およびリポペプチドを含む；細菌細胞壁の外膜タンパク質（ＯＭＰ）、外面タンパク質（ＯＳＰ）および他のタンパク質成分；細菌ＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ウイルスＲＮＡ；非メチル化ＣｐＧ−ＤＮＡ；マンナン；マイコバクテリア膜；ポーリン（ｐｏｒｉｎ）類；ならびに多様な他の細菌および真菌の細胞壁成分：酵母にみられるものを含む。
【００５６】
[0059] 本明細書中で用いる免疫刺激作用物は、大きな微生物グループが共有する明確に区別される分子構造体である。それらはしばしば保存された微生物代謝産物であり、抗原変動性を受けず、自己抗原とは区別される；参照：Medzhitov et al. (1997) Current Opinion in Immunology 9: 4；それの全体を本明細書に援用する。
【００５７】
[0060] 免疫刺激作用物は、下記のタイプの分子（それらに限定されない）からなるか、またはそれらにみられる：リポ多糖類（ＬＰＳ）、ポーリン類、脂質Ａ−関連タンパク質（ＬＡＰ）、リポ多糖類、線毛タンパク質（ｆｉｍｂｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）、非メチル化ＣｐＧモチーフ、細菌ＤＮＡ、二本鎖ウイルスＲＮＡ、マンナン、細胞壁関連タンパク質、熱ショックタンパク質、糖タンパク質、脂質、細胞表面多糖類、グリカン（たとえばペプチドグリカン）、ホスファチジルコリン、テイコ酸類（たとえばリポテイコ酸類）、マイコバクテリア細胞壁成分／膜、細菌リポタンパク質（ＢＬＰ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、および外面タンパク質Ａ（Ｏｓｐ Ａ）。他の有用なアジュバントは下記に示されている：Henderson et al. (1996) Microbiol. Review 60: 316; Medzhitov et al (1997) Current Opinion in Immunology 9: 4-9); The European Medicines Agency Evaluation of Medicines for Human Use, January 20, 2005, http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/vwp/13471604en.pdf；これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
【００５８】
[0061] 本発明の１態様において、本発明の好ましい免疫刺激作用物には、ＤＮＡコードタンパク質成分を含むもの、たとえばＢＬＰ、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ポーリン、ＯＭＰおよびＯｓｐＡが含まれる。本発明に使用する免疫刺激作用物のひとつはＢＬＰである；ＢＬＰは先天性免疫応答の活性化を誘導することが知られており(Henderson et al. (1996) Microbiol. Review 60: 316)、免疫系により認識されることが示されている(Aliprantis et al. (1999) Science 285: 763)からである；これらそれぞれの全体を本明細書に援用する。
【００５９】
[0062] 本発明には、同一または異なる組成の多数のナノ粒子を大規模バッチ法または連続法で作製することによって複数の免疫増強作用物、抗原、および／またはターゲティング剤をスクリーニングする方法も含まれる。ナノ粒子は、ナノ粒子の組成物全体として作用物／抗原のみを含有することができ、あるいは作用物／抗原の組合わせを、目的とするインビボ活性を提供しうる第３組成物と混合し、またはそれに包み込む（ｅｎｃａｓｅ）ことができる。そのような目的とするインビボ活性には循環時間の延長、分解からの遮蔽、望ましくない免疫応答からの遮蔽、細胞膜の通過、細胞内分解、その組合わせなどを含めることができるが、それらに限定されない。さらに、抗原からナノ粒子を作製し、次いで作用物をナノ粒子と結合させ、あるいはターゲティング剤をナノ粒子とカップリングさせることができる。スクリーニング方法のひとつにおいて、リンカー基、たとえば第一級アミン、ヒドロキシル基、スルフィド、カルボン酸などを含むマトリックスから、目的抗原を含有する大量のナノ粒子を作製することができる。次いで、抗原含有粒子のサブセットに、これらのリンカー基により、当技術分野で既知の有機化学を用いて免疫増強作用物を化学的または物理的にカップリングさせることができる。これらの粒子は、粒子を型から採集した後に溶液状または乾燥粉末状で機能化するか、あるいはコンビナトリアル様式で粒子のアレイ上において直接機能化することができる。この方法により、１以上の異なる免疫調節剤を制御された密度、比率および位置で表面に含むように粒子を機能化することができる。この表面機能化された粒子のライブラリーを、次いで適切なインビトロまたはインビボモデルにおいてスクリーニングして、目的とする抗原に最適な免疫増強作用物、作用物の組合わせ、および相対濃度を決定することができる。他のスクリーニング方法には、表面の免疫増強作用物のほか粒子内の抗原濃度の変更が含まれる。
【００６０】
[0063] 他の態様において、本発明のナノ粒子ワクチンは、対象を抗体の存在についてスクリーニングするために、あるいは一連の多様な刺激作用物／抗原の組合わせナノ粒子を試料に対してスクリーニングして抗体の存在もしくは不存在または刺激作用物／抗原の組合わせの機能を判定するために使用できる。ナノ粒子は、目的とする抗体と接触した際に検出可能であるかまたは信号を発する物理的または化学的変化を生じる成分を用いて構築できる；たとえば、ナノ粒子はバイオセンサーを含むか、またはバイオセンサーであってもよく、それはナノ粒子が特異的ターゲットに結合した際に誘発可能である。したがって、刺激作用物−対−抗原の異なる組合わせおよび／または比率をもつ多様な組合わせのナノ粒子を対象に投与し、または試料に適用して、抗体の存在、または抗原／刺激作用物の組合わせの機能もしくは実用性を検出することができる。
【００６１】
[0064] ある態様においては、本発明のナノ粒子を用いて、生物または試料に由来する特定の細胞またはタンパク質を引き付け、結合し、フラギング（ｆｌａｇｇｉｎｇ）または濾過を容易にすることができる。そのような態様によれば、細胞、タンパク質またはウイルスに特異的な結合剤、たとえば捕獲リガンドを用いて、ナノ粒子を構築することができる；これは、いったん結合するとそのような細胞、タンパク質またはウイルスを非自己としてフラギングすることができ、したがってその細胞、タンパク質またはウイルスを生物から分離するのが容易になる。他の態様において、ナノ粒子は、目的とする免疫系成分を刺激してナノ粒子の方向または周囲に集合、凝集または移行させる免疫刺激作用物を含むことができ、これにより、ナノ粒子の捕獲リガンドが免疫系細胞と結合し、非自己としてフラギングし、その結果その細胞を対象から分離するのが容易になる。ある態様において、認識されないタンパク質コートで遮蔽された自己の細胞またはタンパク質またはウイルスをフラギングする方法は、自己作用物と結合したナノ粒子を現時点では非自己作用物として免疫系が認識するのを容易にし、これにより抗原を対象から分離するのを容易にすることによって、対象を処置することができる。
【００６２】
[0065]
【実施例】
【００６３】
[0066] 以下の実施例は、本明細書に開示する主題の代表的な態様を当業者が実施するための指針を提供するために含まれる。以下の実施例が例示にすぎないこと、ならびに本明細書の開示内容および一般的な技術水準を考慮して本明細書に開示する対象事項の範囲から逸脱することなく多数の変更、改変および入れ替えを採用できることを、当業者は認識することができる。
【００６４】
[0067] 実施例１．粒子の作製および分析法
[0068] タンパク質の修飾：タンパク質を、[スクシンイミジル ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート］（分解性ジスルフィドビオチンリンカー）またはスルホスクシンイミジル−６−［ビオチンアミド］ヘキサノエート（非分解性ビオチンリンカー）で、下記の標準法により修飾した。
【００６５】
[0069] Ｗｙｏｍｉｎｇ Ｈ３ ＨＡ：（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅｓ）：Ｗｙｏｍｉｎｇ ＨＡ溶液（１２０μｇ／ｍＬ，１．７５ｍＬ，全タンパク質２１０μｇ）を、１４．２μＬの１０ｍＭ［スクシンイミジル ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート］（６ｍｇを１ｍＬのＨ２Ｏに溶解したもの）で処理した。混合物を３０分間振とうし、次いで１０ ＭＷＣＯ γ線照射ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いる透析により精製した。試料を１５０ｍＬのＨ２Ｏに対して透析し、これを３０分間隔で７回交換した。次いでタンパク質を透析カセットから回収し、粒子修飾に用いた。
【００６６】
[0070] 組換えマウスＩＬ−１２：（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）：マウスＩＬ−１２溶液（４００μｇ／ｍＬ，５μＬ，全タンパク質２μｇ）を、０．３μＬの１０ｍＭ［スクシンイミジル ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート］（６ｍｇを１ｍＬのＨ２Ｏに溶解したもの）で処理した。混合物を３０分間振とうし、次いで０．０２５μｍのニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いる滴下透析により精製した。試料を膜に乗せ、これを５０ｍＬのＨ２Ｏ上に浮遊させ、３０分間透析した。次いでタンパク質を透析膜から回収し、粒子修飾用にＨ２Ｏで４倍希釈した。
【００６７】
[0071] ＰＥＧ粒子の作製および修飾：ＰＲＩＮＴ法により、目的とするサイズおよび形状のキャビティーを備えたＦｌｕｏｒｏｃｕｒ型を用いて粒子を作製した。型に、２０重量％の２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩、７９重量％のポリエチレングリコールジメタクリレート（ＭＷ 約１０００）、および１％の１−ヒドロキシルシクロヘキシルフェニルケトンを含有するモノマー混合物を充填した。充填した型をＰＥＴシートに向けて積層し、次いでＵＶ線露光により硬化させた。硬化した後、型をＰＥＴシートから取り除くと、粒子は離脱してＰＥＴシート上に残った。粒子をポリエチレンブレードで掻き取ることによりＰＥＴシートから溶液（無菌Ｈ２Ｏ）中へ採集した。この粒子懸濁液を遠心（１６Ｋ ｘ ｇ，１０分）によりペレット化し、上清を除去し、次いで７０：３０ エタノール：水に音波処理により再分散させた。この操作を３回繰り返し、粒子を７０％エタノールに１０ｍｇ／ｍＬで再分散させ、４℃に保存した。
【００６８】
[0072] ＰＬＧＡ粒子の作製：ＨＡ（ＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標））（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，２００８−２００９季節型）の表面吸着のためのカチオン性ＰＬＧＡ粒子を、ＰＲＩＮＴ法により、９５：５ ＰＬＧＡ（５０：５０，０．３ｉ．ｖ．）およびポリ（ジメチルアミノメタクリレート）（ＭＷ 約２０，０００）混合物のＤＭＦ中における５重量％溶液を用いて製造した。このポリマー混合物を、８０ｎｍ ｘ ８０ｎｍ ｘ ３６０ｎｍのキャビティーを含むＦＬＵＯＲＯＣＵＲ（登録商標）（Ｌｉｑｕｉｄｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ノースカロライナ州）型で成形した。粒子を遠心により精製し、０．１重量％ポリビニルアルコール溶液中へ再懸濁した。
【００６９】
[0073] ＨＡタンパク質（ＦＬＵＶＩＲＩＮ（登録商標））を下記により表面に吸着させた：１０Ｋ ＭＷＣＯ透析膜を用いたＨ２Ｏに対する透析により、まずすべての塩類をタンパク質から除去した。粒子の表面にタンパク質１０重量％を付与する目標のために、１０μｇのタンパク質（１００μＬ）を、２００μＬの０．１重量％ポリビニルアルコール溶液に懸濁した０．１ｍｇの粒子に添加した。懸濁液を４℃で１５分間振とうし、次いで粒子を遠心（１６，０００ ｘ ｇ，１０分）によりペレット化した。上清を除去し、残留タンパク質含量をＢＣＡアッセイにより分析した。次いで、タンパク質濃度が２５μｇ／ｍＬになるように、粒子を０．４ｍＬの０．１重量％ポリビニルアルコール溶液に再分散させた。得られた８０ｎｍ ｘ ８０ｎｍ ｘ ３６０ｎｍのＰＬＧＡワクチン粒子を図６に示す。
【００７０】
[0074] ビオチン−アビジン化学：粒子を[スクシンイミジル ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート］（分解性ジスルフィドビオチンリンカー）またはスルホスクシンイミジル−６−［ビオチンアミド］ヘキサノエート（非分解性ビオチンリンカー）で、下記の標準法により表面修飾した。２００ｎｍ ｘ ２００ｎｍ ｘ ２００ｎｍの粒子の７０％エタノール中における懸濁液（１ｍＬ，１０ｍｇ／ｍＬ）をペレット化し、次いで１ｍＬの無水ＤＭＦに３回再懸濁した。１０ｍｇの［スクシンイミジル ２−（ビオチンアミド）−エチル−１，３’−ジチオプロピオネート］および７０ｍｇのトリエチルアミンを０．５ｍＬのＤＭＦ中に含有する溶液を粒子懸濁液に添加し、次いで混合物を振とう台に１時間乗せた。次いで混合物を遠心と７０％エタノール中への再懸濁（３ ｘ １ｍＬ）の繰返しにより精製し、７０％エタノールに懸濁して１０ｍｇ／ｍＬにした。
【００７１】
[0075] 表面機能化：粒子を下記の２工程法でタンパク質によりコートした。ビオチニル化粒子の懸濁液（０．２ｍＬ，１０ｍｇ／ｍＬ，７０％エタノール中）をペレット化し、１重量％マウスアルブミン溶液または０．１重量％ポリビニルアルコール溶液中で遠心と再懸濁により２回洗浄した。粒子を水性ビヒクル中にそれらの元の体積で再懸濁し、次いで等体積の３ｍｇ／ｍＬアビジン溶液を添加した。次いで混合物を室温で１５分間振とうした。次いで粒子懸濁液を遠心と水性ビヒクル中への再懸濁により３回精製した。このアビジンコートした粒子を次いでビヒクルに１０ｍｇ／ｍＬで再懸濁した。
【００７２】
[0076] 次いで第２工程において、粒子をＨＡおよび／またはＩＬ−１２でコートした。目的量のタンパク質をエッペンドルフ試験管内のＨ２Ｏに添加し、続いてアビジンコートした粒子を添加した。懸濁液を４℃で１５分間振とうし、次いで遠心によりペレット化した。上清を除去し、次いで粒子をビヒクルに再懸濁して、目的量のタンパク質／注射が４０μＬで行なわれる体積にした。粒子を０．１重量％ポリビニルアルコールに懸濁した場合、上清を残留タンパク質についてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより分析した（一般に＞９５％のタンパク質が上清から除去される）。粒子を１％マウスアルブミンに懸濁した場合、粒子上のアビジンへのビオチニル化タンパク質の結合の化学量論を用いて、粒子の結合容量を間接的に測定した。アビジンコートした粒子を蛍光標識タンパク質（ビオチンとＨｙｌｉｔｅ ６４７の両方で標識したウシＩｇＧ）で処理した。粒子をペレット化し、粒子処理の前と後の蛍光強度を比較し、作成した標準曲線に対して検量した。各粒子について結合容量を計算し、次いで、測定した結合容量と同等またはそれ未満の値のＨＡおよびＩＬ−１２を、粒子に付与した。本発明のビオチン−アビジンナノ粒子の模式図を図７に示す。
【００７３】
[0077] カチオン性表面吸着：修飾されていない粒子（２０％のアミノエチルメタクリレートＨＣＬ、７９％のＰＥＧ１Ｋ−ジメタクリレート、１％のＨＣＰＫ）をエタノール懸濁液からペレット化し、０．１重量％ポリビニルアルコール溶液中で遠心と再懸濁により２回洗浄した。粒子（１ｍｇ，１０ｍｇ／ｍＬ）を、Ｈ２Ｏに対し透析してタンパク質調製物からＮａＣｌを除去したＨＡ溶液（１０μｇ，２２２μＬ，４５μｇ／ｍＬのもの）に添加した。懸濁液を４℃で１５分間振とうし、次いで粒子をペレット化し、０．２５ｍＬの０．１重量％ポリビニルアルコールに再懸濁した。上清をタンパク質の存在についてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより分析し、＞９５％のタンパク質が粒子に吸着されていた。組換えマウスＩＬ−１２を同様にして単独でまたはＨＡタンパク質との組合わせで吸着させることができる。
【００７４】
[0078] 分析：ＨＡ ＥＬＩＳＡ。標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて抗ＨＡ抗体応答を検出した。このアッセイにおいては、９６ウェルプレートを５０ｎｇ／ウェルのヘマグルチニンタンパク質（Ｈ３ Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／０３／２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号３００６）でコートした。血清試料を系列２倍希釈法で試験した。ヤギにおいて発色するアルカリホスファターゼと共に抗マウスＩｇＧ全分子（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号＝Ａ３６８８）を用いて抗体を検出した。このアッセイをＳｉｇｍａ Ｆａｓｔ（商標）ｐ−ニトロフェニルホスフェート錠（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号Ｎ２７７０−５０ＳＥＴ）で発色させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーで読み取った。
【００７５】
[0079] ＨＡ／ＩＬ１２コートした粒子についての抗体染色：ＩＬ１２が表面に付着した粒子を、ＩＬ１２に対する標識抗体（抗マウスＩＬ１２ ＰＥ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，カタログ番号５０５２０３）に曝露し、洗浄した。粒子は、ＩＬ１２に対して特異的なこの赤色標識抗体のため、蛍光顕微鏡検査で赤色に見える。
【００７６】
[0080] ＨＡが表面に付着した粒子を、ＨＡに対する抗体（抗Ｈ３インフルエンザヘマグルチニン−ウサギポリクローナル抗体，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号６１００）に曝露した。粒子を洗浄すると、粒子表面に存在するＨＡに結合した抗体が残った。抗体結合は、緑色標識した抗ウサギ二次抗体（抗ウサギＩｇＧ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ａ２１２０６）により認識された。過剰の二次抗体を洗浄し、粒子を蛍光顕微鏡検査によりイメージングして、粒子表面のＨＡの存在の指標となる緑色蛍光を検出した。
【００７７】
[0081] ＩＬ１２およびＨＡが表面に付着した粒子を、ＩＬ１２に対する標識抗体（抗マウスＩＬ１２ ＰＥ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，カタログ番号５０５２０３）およびＨＡに対する抗体（抗Ｈ３インフルエンザヘマグルチニン−ウサギポリクローナル抗体，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号６１００）に曝露した。粒子を洗浄すると、粒子表面に存在するＨＡに結合した一方の抗体、および表面のＩＬ１２に結合した他方の抗体が残った。ＨＡ抗体結合は、緑色標識した抗ウサギ二次抗体（抗ウサギＩｇＧ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ａ２１２０６）により認識された。過剰の二次抗体を洗浄し、粒子を蛍光顕微鏡検査によりイメージングして、粒子表面のＨＡの存在の指標となる緑色蛍光、および粒子表面のＩＬ１２の存在の指標となる赤色蛍光を検出した；図８に示す。
【００７８】
[0082] 実施例２：送達されたＰＲＩＮＴタンパク質ワクチン粒子の免疫原性
[0083] ＨＡおよびＩＬ１２を表面に含むワクチン粒子（７９％のポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、２０％のアミノエチルメタクリレートＨＣｌ、１％のＨＣＰＫからなり、次いで分解性ビオチンリンカーで表面処理したもの）を、それらがインターフェロンガンマを刺激する能力について試験した。第１に、脾細胞をマウス全脾臓（ＢＡＬＢ／ｃマウス，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから）から分離し、９６ウェルプレートに接種した。被験粒子を脾細胞に付与し、一夜インキュベートしておいた。これらの細胞からの上清を、インターフェロンガンマの産生について標準ＥＬＩＳＡキット（マウスＩＮＦｇ ＥＬＩＳＡキット，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号８８−７３１４−７７）により分析した。表１に述べるデータは、ＩＬ１２が粒子上にあり、機能性を保持していることを示す。
【００７９】
[0084]
【００８０】
【表１】
【００８１】
[0085] 表１
[0086] 可溶性タンパク質として、またはワクチン粒子に付着して送達された場合に、インフルエンザＨＡタンパク質（免疫刺激作用物ＩＬ−１２を含むもの、および含まないもの）に対して発生する免疫応答を測定するためのインビボ試験法を設計した。架橋ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースのＰＲＩＮＴ（商標）粒子（７９％のポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、２０％のアミノエチルメタクリレートＨＣｌ、１％のＨＣＰＫからなり、次いで分解性ビオチンリンカーで表面処理したもの）を用いて、ＨＡ抗原およびＩＬ−１２タンパク質を提示した。ＨＡ：ＩＬ１２は１００：１である。
【００８２】
[0087] インビボ試験には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。マウスは試験開始時に７週令であった。動物の体重はマウス当たり１５〜２５ｇであった。あるグループでは、マウスに筋肉内（ＩＭ）用量４０ｕＬ（脇腹（ｆｌａｎｋ）当たり２０ｕＬ）の粒子溶液を投与し、したがって各動物は粒子０．１５０ｍｇ上のＨＡタンパク質２ｕｇを投与された。他のグループでは、動物に４０ｕＬ（足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）当たり２０ｕＬ）の粒子溶液を後足蹠注射し、したがって各動物はＨＡタンパク質２ｕｇを投与された。試験にはグループ当たり３匹の動物を用い、同一用量を投与した。動物に１日目に初回抗原刺激注射し、続いて２１日目に追加抗原刺激注射した。０、８、２１日目にすべてのグループについて眼窩後放血により血液を採取した。動物を２９日目にＣＯ２窒息により安楽死させ、全採血により確認した。それぞれの放血血液から血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。
【００８３】
[0088] 実施例３．サイズおよび形状による免疫原性の相異
[0089] この試験は、可溶性タンパク質として、または多様なサイズおよび形状のワクチン粒子に付着させて送達した場合に、インフルエンザＨＡタンパク質に対して発生する免疫応答を評価するために設計された。架橋ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの（７９％のポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、２０％のアミノエチルメタクリレートＨＣｌ、１％のＨＣＰＫからなり、次いでビオチンリンカー表面修飾により処理したもの）ＰＲＩＮＴ粒子システムを、ＨＡ抗原提示のために使用する。
【００８４】
[0090] インビボ試験には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。マウスは試験開始時に７週令であった。動物の体重はマウス当たり１５〜２５ｇであった。動物に筋肉内（ＩＭ）用量４０ｕＬ（脇腹当たり２０ｕＬ）の粒子溶液を投与し、したがって各動物はＨＡタンパク質２ｕｇを投与され、粒子量は結合容量に応じて注射当たり粒子０．０８〜０．３ｍｇの範囲にわたっていた。この試験には特定の被験試料のグループ当たり６匹の動物を用いた。動物に１日目に初回抗原刺激注射し、続いて２１日目に追加抗原刺激注射した。０および２０日目にすべてのグループについて眼窩後放血により血液を採取した。動物を２９日目にＣＯ２窒息により安楽死させ、全採血により確認した。剖検には血液および脾臓の採取が含まれる。それぞれの放血血液から血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。結果を図２および３に示す。
【００８５】
[0091] 実施例４．分解性リンカーと非分解性リンカーの対比：
[0092] この試験は、可溶性タンパク質として、または異なるリンカー基化学を用いてワクチン粒子に付着させて送達した場合に、インフルエンザＨＡタンパク質に対して発生する免疫応答を評価するために設計された。架橋ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（７９％のポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート、２０％のアミノエチルメタクリレートＨＣｌ、１％のＨＣＰＫからなり、次いで分解性ビオチンリンカーで処理したもの）ベースのＰＲＩＮＴ粒子システムを、ＨＡ抗原提示のために使用する。
【００８６】
[0093] インビボ試験には、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。マウスは試験開始時に７週令であった。動物の体重はマウス当たり１５〜２５ｇであった。動物に筋肉内（ＩＭ）用量４０ｕＬ（脇腹当たり２０ｕＬ）の粒子溶液を投与し、したがって各動物はＨＡタンパク質２ｕｇを、粒子の結合容量に応じて０．１〜０．３ｍｇの粒子上において投与された。この試験には特定の被験試料のグループ当たり６匹の動物を用いた。動物に１日目に初回抗原刺激注射し、続いて２１日目に追加抗原刺激注射した。０および２０日目にすべてのグループについて眼窩後放血により血液を採取した。動物を２９日目にＣＯ２窒息により安楽死させ、全採血により確認した。剖検には血液および脾臓の採取が含まれる。それぞれの放血血液から血清試料を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。結果を図４および５に示す。
【００８７】
[0094] 本発明を特定の態様に関して以上に述べたが、本発明の精神および範囲内での改変および置換が当業者に明らかであろう。本発明において特定の態様に属すると同定した個々の要素が本発明の他の態様に含まれる可能性があることも明らかなはずである。本発明はその中心的な属性から逸脱することなく他の具体的形態で実施することができる。したがって、あらゆる観点で、例示および記載した態様および例は例示とみなすべきであって限定とみなすべではなく、本発明の範囲を示すためには特許請求の範囲を参照されたい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において免疫応答を刺激する方法であって、
抗原とカップリングしたマイクロメートルサイズの粒子を対象に投与することを含み、その際、マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比の増大が免疫応答を増大させる方法。
【請求項２】
マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比が約３：１であり、約１：１のアスペクト比を有する粒子の投与により起きるものより免疫応答が約２〜約３倍大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マイクロメートルサイズの粒子が、約１マイクロメートル×約１マイクロメートル×約３マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
マイクロメートルサイズの粒子が、約２マイクロメートル×約２マイクロメートル×約６マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比が約１０：１であり、約１：１のアスペクト比を有する粒子の投与により起きるものより免疫応答が約３〜約４倍大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
マイクロメートルサイズの粒子が、約１マイクロメートル×約１マイクロメートル×約１０マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ナノメートルサイズの粒子にカップリングした抗原により起きる免疫応答を低下させる方法であって、
ナノメートルサイズの粒子のアスペクト比を増大させることを含む方法。
【請求項８】
対象に投与した免疫刺激作用物により起きる免疫応答を実質的に阻害する方法であって、
免疫刺激作用物を対象に投与する前に、免疫刺激作用物を非分解性リンカーにより粒子にカップリングさせることを含む方法。
【請求項９】
該方法により、免疫刺激作用物を対象に初回投与した後の免疫応答が実質的に阻害される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該方法により、免疫刺激作用物を対象に追加抗原刺激投与した後の免疫応答が実質的に阻害される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
第１タンパク質を第１速度で放出しかつ第２タンパク質を第２速度で放出するように構築され、かつ１回量で初回抗原刺激能および追加抗原刺激能を備えるように構築された複数の粒子を含む、ワクチン粒子組成物。
【請求項１２】
対象において免疫応答を刺激する方法であって、
対象に複数の粒子を投与することを含み、その際、各粒子が免疫刺激作用物およびタンパク質とカップリングしている方法。
【請求項１３】
複数の粒子の投与により、粒子とカップリングしていない免疫刺激作用物およびタンパク質の投与により起きるものより抗体価が少なくとも約１０倍大きくなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
複数の粒子の各粒子が、実質的に、約２００ｎｍ×約２００ｎｍ×約２００ｎｍの寸法を有する粒子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
実質的に、複数の粒子の各粒子が、約２μｍ×約２μｍ×約２μｍの寸法を有する粒子を含み、その際、これらの複数の粒子の投与により、粒子とカップリングしていない免疫刺激作用物およびタンパク質の投与により起きるものより抗体価が少なくとも約１００倍大きくなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１】
対象において免疫応答を刺激する方法であって、
抗原とカップリングしたマイクロメートルサイズの粒子を対象に投与することを含み、その際、マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比の増大が免疫応答を増大させる方法。
【請求項２】
マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比が約３：１であり、約１：１のアスペクト比を有する粒子の投与により起きるものより免疫応答が約２〜約３倍大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マイクロメートルサイズの粒子が、約１マイクロメートル×約１マイクロメートル×約３マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
マイクロメートルサイズの粒子が、約２マイクロメートル×約２マイクロメートル×約６マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
マイクロメートルサイズの粒子のアスペクト比が約１０：１であり、約１：１のアスペクト比を有する粒子の投与により起きるものより免疫応答が約３〜約４倍大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
マイクロメートルサイズの粒子が、約１マイクロメートル×約１マイクロメートル×約１０マイクロメートルの寸法を有する粒子を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ナノメートルサイズの粒子にカップリングした抗原により起きる免疫応答を低下させる方法であって、
ナノメートルサイズの粒子のアスペクト比を増大させることを含む方法。
【請求項８】
対象に投与した免疫刺激作用物により起きる免疫応答を実質的に阻害する方法であって、
免疫刺激作用物を対象に投与する前に、免疫刺激作用物を非分解性リンカーにより粒子にカップリングさせることを含む方法。
【請求項９】
該方法により、免疫刺激作用物を対象に初回投与した後の免疫応答が実質的に阻害される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該方法により、免疫刺激作用物を対象に追加抗原刺激投与した後の免疫応答が実質的に阻害される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
第１タンパク質を第１速度で放出しかつ第２タンパク質を第２速度で放出するように構築され、かつ１回量で初回抗原刺激能および追加抗原刺激能を備えるように構築された複数の粒子を含む、ワクチン粒子組成物。
【請求項１２】
対象において免疫応答を刺激する方法であって、
対象に複数の粒子を投与することを含み、その際、各粒子が免疫刺激作用物およびタンパク質とカップリングしている方法。
【請求項１３】
複数の粒子の投与により、粒子とカップリングしていない免疫刺激作用物およびタンパク質の投与により起きるものより抗体価が少なくとも約１０倍大きくなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
複数の粒子の各粒子が、実質的に、約２００ｎｍ×約２００ｎｍ×約２００ｎｍの寸法を有する粒子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
実質的に、複数の粒子の各粒子が、約２μｍ×約２μｍ×約２μｍの寸法を有する粒子を含み、その際、これらの複数の粒子の投与により、粒子とカップリングしていない免疫刺激作用物およびタンパク質の投与により起きるものより抗体価が少なくとも約１００倍大きくなる、請求項１に記載の方法。
【図６】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５２５４７７（Ｐ２０１１−５２５４７７Ａ）
【公表日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４９８６１（Ｐ２０１０−５４９８６１）
【出願日】平成２１年３月４日（２００９．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３６０６８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１１５８８
【国際公開日】平成２１年９月１１日（２００９．９．１１）
【出願人】（５０９１５７４１０）リクイディア・テクノロジーズ・インコーポレーテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月４日（２００９．３．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３６０６８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１１１５８８
【国際公開日】平成２１年９月１１日（２００９．９．１１）
【出願人】（５０９１５７４１０）リクイディア・テクノロジーズ・インコーポレーテッド (4)
【Ｆターム（参考）】
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