写真応用に適した組換えコラーゲンを有するハロゲン化銀乳剤及びその調製
【課題】 高い生産性の組換えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法、並びに該ポリペプチド、及びそれを用いたより均一な写真用ＡｇＸ乳剤材料の提供。
【解決手段】 平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤であって、該乳剤が核形成ペプタイザーの存在下で核化され、その後成長ペプタイザーの存在下で成長するハロゲン化銀粒子を有し、少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有するハロゲン銀乳剤。該ＡｇＸ乳剤の調製方法。組換えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法であって、0.95グラム／リットルを超える程度まで微生物によるコラーゲン様ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を有し、組換えコラーゲンがらせん構造を有さず、好ましくは該発現が大腸菌またはサッカロミセス・セレビシアエ以外の微生物で起こる上記製造方法。
【解決手段】 平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤であって、該乳剤が核形成ペプタイザーの存在下で核化され、その後成長ペプタイザーの存在下で成長するハロゲン化銀粒子を有し、少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有するハロゲン銀乳剤。該ＡｇＸ乳剤の調製方法。組換えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法であって、0.95グラム／リットルを超える程度まで微生物によるコラーゲン様ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を有し、組換えコラーゲンがらせん構造を有さず、好ましくは該発現が大腸菌またはサッカロミセス・セレビシアエ以外の微生物で起こる上記製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された写真製品と、該製品の改良された生産方法に関する。特に、この改良は写真製品の成分の製造において組換えＤＮＡ技術を利用することによりなされた。この興味ある成分とはコラーゲンである。
【背景技術】
【０００２】
写真製品の製造過程は、多くのことが開示され、特許された複雑な操作である。一般的に言えば、印画紙やトリアセテート・セルロースフィルム等の写真製品を製造する方法は、ラミネート紙又は透明なポリマー支持体上部に幾つかの層でコーティングすることからなる。これらの層は、最も重要な成分として放射線感受性ハロゲン化銀の結晶を含み得る乳剤層又はこれらの感光性成分を持たない中間層として知られている。本発明は感光層それ自体を向上させ、かつ写真層の製造方法を向上させることに関する。
【０００３】
フィルムの製造方法においてゼラチンが使われる段階がいくつかある。ゼラチンの機能は各段階で異なるために各段階で必要とされる特性も異なり、コラーゲン様物質がそれぞれの特定の応用に合うように明確に適応させることが期待されることになる。
【０００４】
写真応用のためのハロゲン化銀乳剤の製造方法に多くの注目が集められている。ＡｇＸ核形成の過程およびその後の成熟過程に影響を与える、ハロゲン化銀の粒子構造の役割及び特徴に多くの注意が払われている。写真製品の乳剤層で最も重要な成分は、ハロゲン化銀粒子と普通呼ばれ、ヨウ化物を任意に含む放射線感受性臭化銀、放射線感受性塩化銀、または放射線感受性塩化臭化銀微結晶からなる。粒子の析出中にペプタイザーを導入して、制御できない凝集を避ける。さもなければ、その凝集は多くの欠点を示す。即ち、薄い中間物および高いアスペクト比の平板粒子乳剤の形成を制限して、その後の写真撮影に不利をもたらす。多様な形態のゼラチンはペプタイザーとして写真の製造方法で用いられてきた。高いアスペクト比を有する平板状粒子は、鮮明度の高さ、感度粒状性関係の向上、青色とマイナス青色（minus blue）との感度分離の増大、より速い現像能力およびより高い銀被覆力等の幾つかの写真上の利点を持つことがよく知られている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照）。アスペクト比が高いだけではなく、粒子サイズ分布が狭い（これらは単分散あるいは均質拡散の要望として表される）平板状粒子を生産することも望まれている。
【０００５】
現在まで、工業的な方法に用いられるゼラチンは一般に、単に動物の骨及び皮からの導出により動物源から得られている。この物質の欠点は、不純物の存在と、その組成の性質が明確に定められていないため再現性がないことである。どのような成分が存在し、どのような量であるのかも明らかでない。さらに、最適活性に、どの成分が実際に必要とされるのかも不明である。写真製造方法の種々の段階で使用されるゼラチン組成のばらつきがあるため写真製造方法の再現性は疑わしい。
【０００６】
写真応用でのゼラチンの欠点は、長年にわたり詳細に取り組まれ、種々の特許出願の課題となってきた。これらの文献のほとんどは、修飾ゼラチンの特性に特別な改良を取り入れるために、動物源からの導出後の該修飾ゼラチンを改良する方法に取り組むことに向けられている。文献は、結晶の50％以上がアスペクト比８を越えることが望ましいと記載しているが、これによって青色の感度が高められるからである（特許文献２参照）。メチオニン含量が１グラムあたり30マイクロモル以下、好ましくは１グラムあたり５マイクロモル以下のゼラチンを使用して、台形、六角形および三角形の薄い平板状粒子を得ることが記載されている（特許文献３参照）。ゼラチン１グラムあたり30マイクロモル以下のメチオニンレベルを得るために酸化しておいた正常な骨由来のゼラチンが使用された。それよりも低いメチオニン含量は、析出条件中に広い範囲のｐＢｒを提供するものとして記載されている（特許文献４）。多くの刊行物がゼラチンのメチオニン含量を減少させる方法を包含している。アルカリ次亜塩素酸塩またはＨ2 Ｏ2 の酸化性試薬反応が記載されている（例えば、特許文献５、非特許文献２〜４参照）。1959年の初期でさえ、酸化が不純物を除去するための方法として示唆されていた。
【０００７】
組換え核酸技術を用いてコラーゲンおよびコラーゲン様タンパク質自体になされた多くの研究も存在する。しかし、コラーゲンと組合わせて組換えＤＮＡ技術を用いることおよび写真応用においてそれを適用することは意外なことに欠如している。組換えコラーゲンの領域で発表された文献のほとんどはコラーゲンをコードする配列の発現を必要とさえしない染色体核酸のＰＣＲ技術を用いる診断応用に向けられていた。染色体中の該配列の単なる存在がこれらの実例での診断にとっては十分である。コラーゲンをコードする配列の発現を実際に示すそうした文献のいずれもが、確かに高レベルの発現を必要としなかった。もしくは、発現が示されていても、完全な配列ではなく、むしろコード配列の単なる部分が発現された。しばしば、これらの部分的な配列は、必要とされるタンパク質材料の量が最小となるように抗体を得るために用いられている。さらに、抗体がいったん得られたら、該配列は医薬応用のためにはそれ以上は必要とされない。したがって、これらの例では、低い発現は実際的な問題ではない。また、コード配列の小さい部分の発現は、コード配列の高い程度の繰返しが原因となる発現問題を排除することが期待できる。
【０００８】
長い繰返し配列に関連する発現問題を克服する努力において、および新しいタイプのタンパク質、即ち合成タンパク質を設計する努力において合成核酸が設計されてきた。しかし、そのような合成ポリペプチドは生産に非常に費用がかかる。よって、写真フィルム生産の分野に必要とされるラージスケール生産を必要とする利用にそれを応用することはできない。
【０００９】
よって、先行技術の多くの応用は工業的規模での生産に必要とされる高い程度の発現を必要としないし、実際に所望の結果も提供してはいない。その結果、これらの種類の応用を考察する文献は天然コラーゲン配列または対応する長さと構造の配列の高い発現を得る問題を扱ってもいないし解決もしていない。
【００１０】
先行技術が天然の配列またはその部分を発現することを示唆する場合は一般に、一般用語が用いられ、さらに詳細を示すことなく一般的な形質転換法のハンドブックが照会される。生産用生物と発現程度は重要性が低く、注目されてこなかったために、提供されるどの具体例も大腸菌およびサッカロミセス・セレビシアエである。
【００１１】
コラーゲン様タンパク質の発現問題を扱う場合、これは修飾大腸菌または高等動物細胞および昆虫細胞のいずれかを用いることにより生じている。後者の生物は、翻訳後プロセッシングについても修飾される。しかし、後者の種類の細胞利用は、細胞、培地および産物の単離の費用が高いために、大規模生産ではひどく費用がかさむ。大腸菌の欠点は、それが所望の産物を分泌できないことである。さらに、発現される核酸配列の繰返しは形質転換バクテリアの不安定性をもたらし、その結果、コラーゲン様コード配列の発現量が低下する。よって、写真フィルム生産の分野で要求される大規模生産を必要とする応用においてそのような生産（微）生物を適用することができない。
【００１２】
多くの研究努力は、動物源に存在するコラーゲンの状態、すなわち工業的規模の写真応用で現在使用されているコラーゲンの状態である繊維原状または三重らせんを得るために必要とされる翻訳後修飾を行うことに向けられている。三重らせんを有するコラーゲンを達成するため、より具体的には繊維原コラーゲンを達成するためにコラーゲン様材料を発現させる場合、翻訳後プロセッシング装置それ自体を有するか、または翻訳後プロセシング酵素のコード配列を付加することにより該プロセッシング装置を有する宿主細胞を用いるべきであることは一般的に認められている。この形態のコラーゲンが応用に有用な形態であることが通常認められている。
【００１３】
組換えコラーゲンが写真応用に利用できることを確定的でないにせよ、先行技術が実際に示唆している場合、コラーゲン材料の特別な形態の関連性は、応用のために特異な要件に対して通常は取り上げられなかった。ある特許出願は、組換えコラーゲンを写真フィルム用に用いることを見過ごしてきた一方で、他の特許出願は写真応用を具体的にさえ示している。しかし、そうした文献の教示は明らかに他の問題に関するもので、写真応用およびその特定の要件には具体的には向けられていない。さらに分析するならば、さまざまな理由から、それら出願で提供される具体例のいずれも写真フィルムへの応用に実際に適することを示してはいない。これら特許出願は組換えコラーゲンを写真製造方法に応用しようとするときには実施不能であり、単なる自然の推論とみなされる。そのような文献の具体例を以下に示す。
【００１４】
特許文献６は、小さい繰返し配列を有する新規なポリマーの生産を記載し、具体的には絹等の繰返し基が開示されている。コラーゲンは繰返し単位を提供することのできる構造の一つとして示唆されている。「ＣＬＰの性質は高温で熱可逆的なゲル化を受け、ならびに免疫原性を有さないように設計される。らせんの高い安定性により、ＣＬＰから形成された繊維または膜が高い引張り強度をもたらすに違いない。これらの鎖性質により、硬質基体に塗布される場合に柔軟な被膜として働くに違いない水溶液中のハイドロゲルコロイドが生成されるべきである」ことが述べられている。次に、細胞レセプターのリガンドを有する柔軟な被膜材料が示唆されている。ＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰの配列がＣＬＰモノマーに加えられるべきであって、大腸菌から発現される構築物の一例が提供されている。この組成物に関して、「本組成物は傷の包帯としての利用を見出し、血管新生、目への適用、人工器官のマトリックス等を可能とする」と開示されている。ＣＬＰと他の繰返しの機能単位との組合せにより機能を組み合せることも示唆されている。しかし、使用される配列の具体例は提供されていない。
【００１５】
提供された唯一の具体例は、Ｎ末端およびＣ末端スペーサーを有する組換えで作られた合成ＣＬＰポリペプチド［［ＧＡＰ（ＧＰＰ）３］２［ＧＰＶＧＳＰ］ｎを示している。該スペーサーは長さがそれぞれ３３アミノ酸および２５アミノ酸である。例えば、長さが２４アミノ酸のポリマーの繰返しＧＰＰ部分は３３＋２５＋６アミノ酸により分けられる。このようにして、大腸菌は７６０アミノ酸、すなわちＭｗ63,800のＣＬＰタンパク質を見かけ上うまく発現する。細胞結合性ＣＬＰは同一の基本的な構造を有するが、ヘキサマーが上記の細胞配列により置き換えられるために、８１４アミノ酸のアミノ酸長およびＭｗ70,560をもたらす。発現される繰返しＧＸＹ部分は短く、長い非繰返し配列により分けられている。スペーサーＤＮＡは２個のシステイン残基および３個のメチオニン残基もコードする。
【００１６】
この挙げられた文献は、コラーゲンに関する導入部で「化学的に加水分解された天然コラーゲンを加熱と冷却により変成、再生させて、他の応用の中でも写真および医薬応用に用いられるゼラチンを作ることができる。この現象の原因となるコラーゲンの鎖性質は、三重らせんと呼ばれる高次構造を有する相互鎖凝集体を自発的に形成する能力である。」と述べている。よって、この先行技術の文献では、らせん構造が必要とされることが特に注目されている。その後の文章は写真応用については実際のところ何も示していなく、明らかに完全に他の事項に向けられている。その後の文章も大腸菌により得られた発現の実際の程度について何も示していない。繰返し構造は低い程度で存在しているので、写真応用に有用なように十分なコラーゲン様活性を保持することは起こりにくい。さらに、発現生成物中において、システインとメチオニン残基が実際に提供されるレベルで存在することにより、実際に写真応用にＡｇＸ乳剤中で使用するのを不適当なものとしている。さらに、ここで記載の繰返しの少ない配列の利用が大腸菌の向上レベルの発現を実際に提供したのかどうかが明らかでない。よって、写真応用の当業者らは写真応用におけるこの文献の教示を適用することを思いとどまるであろう。第一に、工業的な規模の生産が可能かどうか明らかでないからである。繰返し配列の不安定性を考慮すると、このことはありそうにもない。第二に、それは、写真応用のためのＡｇＸ乳剤における不所望なシステインおよびメチオニンの存在のためにありそうにもない。第三に、このことは、発現生成物のらせん構造がないためにありそうにもない。その影響は発現産物の安定性に対して、および現在のゼラチンの主要な構造的違いを鑑みて写真での利用可能性に対して完全には予測することはできない。
【００１７】
前述の特許出願と同一の発明者らは、プロリン含量が減少した繰返し三つ組残基（repetitive triads)を有する高分子量コラーゲン様タンパク質ポリマーを開示する（特許文献７参照）。該ポリマーは、高分子量および高頻度で単細胞微生物において産生が可能なものとして述べられている。これらは、「コラーゲン繰返しトリペプチドの独自性は、配列中の高い繰返し性と組成中のアミノ酸であるグリシン及びプロリンの配列を頻繁に利用する観点から組換え技術に対する挑戦である。グリシンおよびプロリンを高レベルで有するタンパク質をコードする遺伝子は、必要により自己相補的配列中の高レベルのヌクレオチドであるグアニジン及びシチジンからなる。例えば、遺伝子を合成するにしたがって、ストランドがループから外れ、一本鎖ＤＮＡが切除され、組換えが起こって遺伝子セグメントの損失と非能率的な転写および／または翻訳をもたらしうる実質的な機会が存在する。よって、コラーゲンの有利な性質を提供しながら、同時に高分子量コラーゲン様タンパク質の安定な発現を可能とする技術および組成物の開発に実質的な興味がある。」ことを示している。さらに、「該ポリマーは、らせんを提供し、コラーゲンのように変成と再生が可能であり、ゲルを形成するなどの点でさらに特性付けられよう」と述べられている。分子量30〜150 ｋＤが示唆され、グリシン間のアミノ酸の数の少なくとも45％がプロリンであり、三つ組残基の少なくとも80重量％が第一のアミノ酸としてグリシンを有し、三つ組残基の数の少なくとも40％は少なくとも一つのプロリンを有する。その具体例は、繰返しＧＸＯをコードする配列およびＮ末端とＣ末端スペーサー配列の３タイプの使用を示している。前記特許出願と同じスペーサー配列が用いられた。繰返し配列の構造は［［ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ］２（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰ）２４（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）２］２＝［［Ｃ］２［Ａ］２４［Ｃ］２］２であった。作られたポリペプチドの長さは、Ｍｗ46.409ダルトンの 561アミノ酸であった。別の実施例において、繰り返し配列は、［［ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ］２（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰ）１２（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）２］５＝［［Ｃ］２［Ａ］１２［Ｃ］２］５であった。作られたポリペプチドの長さは、Ｍｗ64.094ダルトンの777 アミノ酸であり、100ｋＤの観察されたタンパク質バンドを有した。第三の具体例において、その構造は［［ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ］２（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰＧＳＲＤＰＧＰＰ）１２（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）２］４＝［［Ｃ］２［ＡＢ］１２［Ｃ］２］４であった。その具体例は1065アミノ酸およびＭｗ91,966を有し、 135ｋＤに見えるタンパク質バンドを有した。明らかに小さいバージョンも28ｋＤ、64ｋＤおよび98ｋＤのタンパク質バンド重量を有して作られた。発現に関して、提供される唯一の詳細は、抗血清を用いるウエスタンブロットによる検出が実施され、全長ポリマーの発現が遺伝子サイズとともに減少する一方で、全長ｍＲＮＡの合成は等しいレベルにあったことである。二つの異なる繰返し単位を有するポリマーのもう一つのグループは、作られた［［Ｃ］２［ＤＢ］１２［Ｃ］２］４、［［Ｃ］２［ＤＢ］６［Ｃ］２］４および［［Ｃ］２［Ｄ］２４［Ｃ］２］４であり、ここでＢとＣは上記の通りであり、Ｄ＝ＧＡＱＧＰＡＧＰＧである。これらの３つのタンパク質はそれぞれ、1065アミノ酸およびＭｗ91,533Ｄ、 633アミノ酸およびＭｗ55,228Ｄ、1065アミノ酸およびＭｗ85,386Ｄを有し、140 ｋＤに見えるタンパク質バンドを有した。これらの例のうち、産物の特性に関する唯一の情報はナンバー６について提供されている。この産物は非常に水溶性である。室温以上では、８％を超えるその水溶液は粘性があるが、流動性があり０℃に冷却すると固体のゲルを形成する。28℃以上の加熱で、ゲルは濃厚な溶液を形成する。液体とゲルとの熱的可逆性変移がこうして示される。最終的な具体例は、同一のスペーサーと1077アミノ酸およびＭｗ91.266Ｄを有する構造（ＧＡＰＳＱＧＡＰＧＬＱ）６８に関した。そのようなポリペプチドの利用に関して、これらの発明者らの前に挙げた出願以上のことは何も述べられていない。明らかに、繰返しＧＸＯ部分のブロックコポリマー構造を変えることにより、さらに長い繰返し配列の発現が起こることは可能となった。しかし、そのようなタンパク質が如何に効率的に発現されるかは明らかでない。さらにまた、繰返しによる発現の問題は解決されているものとしては示されていない。工業的規模の発現が達成できたことには疑問がある。具体的に写真応用に関する教示は提供されていない。特に、すべての具体例は写真応用で望まれないシステインとメチオニンを有するスペーサーを利用する。よって、写真応用の当業者はこの文献の教示を写真応用に適用することを思いとどまったであろう。
【００１８】
また、ゼラチンに性質の類似する組換え材料を作ることが望ましいことが論じられている（特許文献８参照）。その利点は、再現性の問題を解決するさらに均質な製品およびその化学的機能を改良する機会であろう。その考えはオリゴペプチドをゼラチン代用物として作ることである。選択された微生物は大腸菌であり、大腸菌に共通するグリコシル化等の翻訳後修飾がないことは問題ではないことが述べられている。他の宿主が可能であることが述べられている。しかし、そうした可能な宿主の具体例は示されていない。適用される核酸配列は、選択を起こすためのＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔコドンに結合させた（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎのゼラチンペプチドをコードする配列を有さなければならない。具体的に挙げられた配列はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔをコードする。当該発明者による後の論文で、発現度は実際にどのような種類の工業的な応用にも不十分であることが実際にわかったことが明らかとなった。さらに、作られたアミノ酸の回収方法は複雑であった。大腸菌は上記の宿主細胞であり、実際のところ、工業的な規模での生産に興味のある当業者のために上記で既に紹介された欠点、すなわち分泌の欠如、繰返し配列の不安定性、よって低い発現度を、事実として明らかに示していた。最終的に、この先行技術において提案されたコラーゲンの写真フィルムへの応用に関して実際には何も示されなかった。よって、そのような構造的に異なる材料の予想できない結果のために当業者はこの文献の教示を写真応用に適用することを思いとどまったであろう。
【００１９】
最後に、具体的に改良されたコラーゲン様ポリペプチドおよび写真応用目的のためのその利用に関する1996年にイーストマンコダックに交付された米国特許は、銀結合力が50ｍＶ以下のコラーゲン様ペプタイザーが高度の薄い平板状粒子を導きうることを記載している（特許文献９参照）。この文献はこれを２５アミノ酸の長さを有する多くの合成ポリペプチドを示している。この文献はコラーゲン様構造が組換え技術により作られたことも示している。この組換えポリペプチドは単に４つの異なるアミノ酸からなるブロックコポリマー構造の合成ポリペプチドである。実際の発現の詳細はこの組換えポリペプチドには提供されていなく、標準的な分子生物学生産方法およびサッカロミセス・セレビシアエの発現宿主としての利用が単に言及されているだけである。その分子量は約26ｋＤａである。よって、それと同じ日およびそれ以降の他の文献に詳細に示された発現の問題に親しい分子生物学者がそうした生産に真摯に取り組んだかどうかは疑問がある。さらに、組換えで生産された産物の結合力に関して詳細が提供されていないので、写真応用の当業者が写真製品のためにハロゲン化銀乳剤にこの製品を用いることを真摯に考えるか、もしくはそれが、開示された短い合成ポリペプチドの特性を示すことを真摯に期待するかどうも疑問がある。また、当文献は、ヒスチジンおよびメチオニンを特定の部位、つまり下記式のＸａａに有する開示された特定のポリペプチドが高い結合力を示し、非平板状粒子形成を示すことを示唆している。該化合物の式は、ＧｌｙＰｒｏＸａａ１ＧｌｙＬｅｕＸａａ２ＧｌｙＰｒｏＡｒｇＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＡｌａＳｅｒＧｌｙＡｌａＰｒｏＧｌｙＰｈｅＧｌｎＧｌｙである。イーストマンコダックにより研究された化合物の詳細を提供する表を分析すると、高い結合力を有する化合物は全て、２５アミノ酸毎に少なくとも一つの還元アミノ酸（＝ヒスチジンまたはメチオニン）を有することでポリペプチド１グラムあたりのメチオニン含量が 400マイクロモルを超えることとなる。そのような化合物は、写真応用の核形成／成長ＡｇＸ−乳剤プロセスに有用ではないであろう。低い結合力と平板状粒子形成に利するものとして示されている合成化合物は、還元アミノ酸のＭｅｔもＨｉｓも有さない。多くの他の米国特許が関連する主題でイーストマンコダックに交付されている。これらの特許（特許文献１０、１１参照）は、平板状粒子形成のために有用であると主張された他の合成断片を明らかにしたが、同じ単一の組換え産物の実例が記載されているので、これらの特許は組換えコラーゲン発現およびＡｇＥ乳剤を用いた写真応用への組換えコラーゲンの利用に対して何の新しいことも提供していない。
【００２０】
イーストマンコダックのこれらの記載から、サッカロミセス・セレビシアエに存在し、示された特定の配列の発現は実際のところ非常に低かったと推論することもできる。20リットルの培養物を用いて、単に約600 ｍｇの生成物を単離することができただけであった。しかし、この記載におけるこの点には何の注意も払われていない。実際、これらの記載から推論できる情報は当業者がこのシステムをコラーゲンを作るために用いることを思いとどまったことであろう。既に扱ったように、この低い発現度は転写および／または翻訳される配列の繰返し、および／またはプロテアーゼの存在によるものであろう。特に、非らせんコラーゲンの開口構造のために、非らせんコラーゲン発現産物はプロテアーゼの攻撃を著しく受け易い。
【００２１】
【非特許文献１】Research Disclosure Vol. 225 Jan. 1983, Item 22534
【非特許文献２】J. Phot. Sci., 40, 230-230(Nippi)
【非特許文献３】J. Photo. Sci., 37, 14-18(AGFA)
【非特許文献４】J. Imag. Sci., 33, 13-17
【特許文献１】欧州特許第０，６１０，７９６Ａ号
【特許文献２】米国特許第４，４３９，５２０ 号
【特許文献３】米国特許第４，７１３，３２０ 号
【特許文献４】米国特許第４，９１４，０１４ 号
【特許文献５】欧州特許第５５８，４１０号
【特許文献６】国際特許第９０/０５１７７ 号
【特許文献７】国際特許第９３/１０１５４ 号
【特許文献８】フランス特許第２６８５３４７ 号
【特許文献９】米国特許第５，５８０，７１２ 号
【特許文献１０】米国特許第５，５８０，７１２ 号
【特許文献１１】米国特許第５，６７０，６１６ 号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、組換えＤＮＡ技術の利用に向けられることで、今回最終的に大量の実質的に純粋なコラーゲン材料の生産を可能として上記の困難性を克服した。組換えコラーゲン産生方法を実行して、高価な培地、発現宿主または非分泌発現宿主を必要とせずに高レベルの発現を初めて提供する。さらに、現在までゼラチンを適用すべき写真製品の製造方法の特定の各段階での最適使用のために選択されるか、および／または適合させたコラーゲンを作ることが今回可能となった。それによりさらに向上を可能とする。また、改良ＡｇＸ乳剤生産方法が現在可能であり生産費用の減少を導く。
本発明者らは、より均一な写真用ＡｇＸ乳剤材料を得ることに興味を持ち、工業的写真紙およびフィルム生産方法で現在用いられている動物源由来のコラーゲンに匹敵するコラーゲンを作る可能性を研究する決心をした。本発明者らは、組換えで作られたコラーゲンを利用することにより、多数の不純物及び定義されていない性質とコラーゲンのタイプＩを主要な成分として有する可変的な性質のコラーゲンタイプの混合物とを有する天然源に対してより均一な性質のためにハロゲン化銀乳剤生産に向上がもたらすことができることを予期した。この考えは、各ブロックコポリマー構造を多く有する新しく設計されたコラーゲン様ポリペプチドを使用するよりも、天然コラーゲンに近くなっている物質を用いることであった。この希望は、天然配列に対応する配列の発現問題が、先行技術に詳細に記載されているように、合成的に設計されたコラーゲン様ポリペプチド配列において遭遇する問題よりも小さいことであった。これは、発現される配列の低い繰返し性に基づいて予想することができた。一方、よりランダムな配列を利用することは、多様なプロテアーゼによる攻撃をさらに受け易くするだろう。
【００２３】
コラーゲンの天然の条件とはどんなに異なっても、我々は組換え技術を用いるらせん様構造を作る試みを放棄することを決定した。「適当な数のｙ位プロリル残基がプロリル４ヒドロキラーゼにより4-ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化されていない場合、新しく合成された鎖は、37℃で三重らせん立体配置に折りたたむことができない。ヒドロキシル化が起こらない場合、ポリペプチドは非らせんのままであり、細胞から十分には分泌されず、コラーゲン繊維原に自己集合することはできない」と述べられているWO93／07889 の１ページを参考にして、分泌を確実とするために分泌細胞を用いる際に問題が起こることが予想することができた。また、プロテアーゼ攻撃の潜在性は、得られたオープンな非折りたたみ構造のためにかなり高いものであろう。よって、我々の組換え配列が、発現宿主により高い量でかなり容易に分泌される発現産物をもたらすことは驚くべきことである。また、組換えコラーゲン化合物が、写真応用に現在用いられている天然コラーゲンに特徴的な繊維原構造または三重らせん構造を形成できないような条件下で組換えコラーゲンを産生することは、写真応用自体に対して疑問のある効果も有しえた。現在の市販されている製品とのこの違いを鑑みて、得られた組換え化合物が、現在使用されている化合物を有するらせんと同じように写真応用に適するかどうかも勿論疑問があった。
【００２４】
しかし、コラーゲンタイプのＩおよびＩＩＩのゲノム配列をクローニングする際の、十分な量を作ってそれを写真応用に利用するための発現の問題を克服する多くの難しい研究後の結果は、すべての有り得る失敗にもかかわらず、思いかけなかったことに良好であった。第一に、発現速度は意外に高く、0.95グラム／リットルより高く、実際には全体として３グラム／リットルより高かった。これは、コラーゲンまたはコラーゲン様材料を発現しようとする試みがあったとしても１リットルあたり数ミリグラムより多くは産生できなかった先行技術とは顕著な対照である。よって、この驚くべき高い発現速度は、先行技術に記載された全ての問題を鑑みて当初はまったく予想されないと思われた。しかし、発現速度は、他のタンパク質に関しての発現宿主ピヒア・パストリスにより得られた生産速度をかなり上回りさえした。かなり具体的には、コラーゲンのような高い量で作ることは難しいとは予想されなかったタンパク質の生産速度さえも上回った。遂には、組換えコラーゲンの形態が経済的に興味のある量で経済的に興味のある発現宿主により作ることができると今や考えられている。発現が多い他の宿主は、真菌タイプの微生物中に見出すことができる。特に高い発現酵母および最も具体的には低いタンパク質分解活性を有するプロテアーゼ陰性株が望ましい。適切に使用することができる酵母は、かなり特異的にメチルトローフである酵母（methylotropic yeasts）である。特に適切な例は酵母のピヒア・パストリスである。コラーゲンの発現のために関連があるものとして達成された基準に基づいて、十分に高い程度までおよび経済的に実施可能な条件下で発現が可能な適当な宿主細胞が発見され使用できる。
【００２５】
大規模生産が本発明者らにより可能とされたことは、写真応用分野での実際の試験を最終的に実施可能とさえもした。写真応用のための試験は、十分な組換えコラーゲンが比較的大量に作られた後にのみ可能であり、これは先行技術で詳細に記載された医薬応用のために必要とされる少量とは対照的である。写真応用に関するこれらの試験を行った後、平板状粒子形成が高いことがわかった（表ＩＩを参照されたい）。実質的に純粋なコラーゲンタイプＩＩＩの利用がペプタイザーとして写真乳剤に初めて利用された。その結果は傑出したものであった。しかし、我々は、平板状粒子形成が80％を超えるものであることを思いもかけずに発見した。これは低い結合力を有するポリペプチドのイーストマンコダックポリペプチド性能よりもまさり、これは、69.5ｍＶの結合力がこの生成物に関して見出されたので、イーストマンコダック教示にしたがえば非平板状粒子形成を予想しなければならなかったことを鑑みれば最も驚くべきものと思われた。よって、80％の平板状粒子形成を得るためには結合力が50ｍＶ以下でなければならないとする要件に関するイーストマンコダックによって仮定された理論が覆された。よって、80％を超えるレベルでの平板状粒子を必要とするハロゲン化銀乳剤における応用のために適当であると先行技術に述べられているものよりもさらに高い銀結合力を有する多くのペプタイザーを開発するための経路が開かれた。この経路は、写真乳剤におけるペプタイザーの主要コラーゲン成分としてタイプＩＩＩ以外のコラーゲンのタイプを適用するためにも開かれた。種々の天然コラーゲン間の相同性の程度が40〜50％であることを考慮すれば、わずかに操作された天然配列からも良好な結果を期待することができる。天然コラーゲンアミノ酸配列に対して50％を超える相同性を示すアミノ酸配列が良好な結果を提供すると期待することができる。天然配列の変異は、天然配列に対する挿入、欠損および置換を有してもよい。それ以外に、天然ＤＮＡ配列に対してある程度の相同性を有する合成ＤＮＡ配列を使用することができる。しかし、本発明に有用な配列は、それらのコードする核酸配列の発現の問題を防止するために、最小程度の可変性を保持しなければならない。例えば、変異は４個を超えて異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を常にもたらさななければならない。ＧＸＹ部分はブロックコポリマーの形態であってはならず、多くのＧＸＹ部分間のスペーサー配列を有してはならない。好ましくは、８個を超え、さらには９個を超えて異なるアミノ酸が存在しなければならない。実施例において、19個もの多くの異なるアミノ酸を有するタンパク質が用いられる。天然に存在するのは僅かに20アミノ酸である。適切には、10〜20アミノ酸または10〜19アミノ酸を用いることができる（しかし好ましくはシステインは避けられる）。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、コラーゲン様ポリペプチドをコードする核酸配列の高い発現を含む組換えコラーゲン様ポリペプチドの高い生産性の製造方法、並びに該ポリペプチド、及びそれを用いたより均一な写真用ＡｇＸ乳剤材料を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
よって、本発明は、平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤を有し、該乳剤が核形成ペプタイザーの存在下で核化され、その後成長ペプタイザーの存在下で成長するハロゲン化銀粒子を有し、少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。このような乳剤は、適切には天然コラーゲンに対して50％を超え、好ましくは60％を超える相同性を示すアミノ酸配列を有するペプタイザーを有することができる。適切には、ペプタイザーは少なくとも10ｋＤａのサイズを有する。実施例から明らかであるように、20〜80ｋＤａのサイズが写真応用に有用である。約 600アミノ酸のペプタイザーを示す。
乳剤は、コラーゲンに関して自然に存在するものと同等のアミノ酸を有することができる。ここで同等であるとは天然に存在するものとアミノ酸同一性が少なくとも80％、好ましくは90％であることを意味する。
【００２８】
乳剤は、天然に存在するものと実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプタイザーを有することができる。ここで実質的とは、アミノ酸の変異が５個未満、好ましくは３個未満であることを意味する。適切な種類のコラーゲンはＩ、ＩＩおよびＩＩＩである。活性を確保し、且つ発現問題を避けるために、配列は天然配列に近いことが好ましい。ペプタイザーのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、天然であっても合成であってもよい。本発明によるコラーゲンタイプＩＩＩアミノ酸配列は、適切には図３の配列を有するか、またはそれである。本発明によるコラーゲンタイプＩアミノ酸配列は、図８、１0 または12の配列を有するか、またはそれである。コラーゲンタイプＩＩＩは実施例１の参考文献５に定められたアミノ酸を有する。この文献は、参照により本明細書に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
ペプタイザーが実質的に純粋な形で存在する本発明の乳剤とは、ペプタイザーが、核酸、多糖類および他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。本実施例は、これが実際に可能であることを具体的に示している。糖および核酸の存在が微量でさえ、結晶形成に対して幾分かの影響を持つことができ、具体的な写真応用のための十分に純粋な組換え材料が作ることができるかどうかを実際に疑ってみなければならなかった。
【００３０】
ピヒア・パストリスを発現宿主として用いるとき、ＭＧＰＲの配列がコラーゲンＩの天然配列には存在していたとしても、それを持たないアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いるのが有利である。なぜならばこの配列は、一部のコラーゲンタイプが受けるピヒア・パストリスに存在するプロテアーゼの新しい認識部位であることを我々が思いもかけずに発見したからである。プロテアーゼはＫｅｘ−２様プロテアーゼであり、Ｋｅｘ−２様プロテアーゼのネガティブ宿主株が適当な宿主細胞であろうと予想されている。宿主としてピヒア・パストリスを用いるときの一般条件において、対応するアミノ酸配列が［Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ］−Ｘａａ−Ｙａａ−Ａｒｇ（式中、ＸａａおよびＹａａはＧｌｙおよびＰｒｏまたは他のアミノ酸に対応しており、括弧内のアミノ酸の少なくとも一つが変えられる）のないコラーゲンをコードする核酸配列を用いるのが有利であろう。非らせんコラーゲンのオープン構造はタンパク質分解を受け易いので、宿主が選択され、および／または発現しようとする配列が宿主および発現配列の特定の組合せについてタンパク質分解が最小化されるように好ましくは変異されるか、選択されなければならない。共通する一般的知識、および挙げられた文献の内容を含めた本開示に基づいて、これを実現するために当業者に開かれた多数のオプションが存在する。
【００３１】
発現を増加させるための別の方法は、配列が発現のために導入されている宿主細胞のために最適化されたコドン利用に存在するであろう。マルチコピー形質転換体の利用は、発現の増大が達成できる方法でもある。最大レベルのタンパク質分泌が小胞体のタンパク質折り畳み能力により最終的に決定されることが、ウシ膵臓トリプシンインヒビターのサッカロミセス・セレビシアエ発現の技術で示唆されている。マルチコピー形質転換体を利用することによりこの能力を超えることは、小胞体での折り畳まれていないタンパク質の蓄積および生理学的不安定性による発現レベルでの付随的な莫大な減少をもたらすと考えられている。これは1995年Parekh（Protein Expr. Purif. 6, 537-545 ）および1997年Parekh及びWittrup （Biotechnol. Prog. 13, 117-122 ）に記載されている。折りたたまれていない分子として発現されている我々の組換えコラーゲンの場合、このネガティブな特徴が打ち消されるか、および／またはこの現象が他の発現宿主で、特に他の酵母宿主であまり関連がないようである。酵母宿主および細菌宿主において、プロリルヒドロキシル化機構が存在せず、それ自体ではコラーゲンのそれら宿主内での発現は折りたたまれていないコラーゲンをもたらすであろう。コラーゲンが折りたたまれていない場合、それは小胞体の折りたたみ能力を消耗させないだろう。また、顕著な可溶性のために、折りたたまれておらず、かつヒドロキシル化されていないコラーゲンは、小胞体中で凝集も蓄積もしないだろう。発現の程度に関連するようになる、そうした折り畳みの危険を除くために、コラーゲンはヒドロキシル化されず、またはできるだけ低い程度まで少なくともヒドロキシル化されているのが望ましい。
【００３２】
サッカロミセス・セレビシアエおよびピヒア・パストリス等の酵母細胞中で、不均一プロリル−4-ヒドロキシラーゼの共発現によりヒドロキシル化を行うことができることが最近わかった。これは1997年にVuorela ら（EMBO J. 16, 6702-6712 ）および1998年にVaughan ら（DNA cell Biol. 17, 511-518）により記載されている。ゼラチンのゲル化温度がヒドロキシル化度に依存するので、現在、種々のゲル化温度を有する発現産物をもたらす方法でヒドロキシル化度を変えることができるであろう。これは、コラーゲンの経済的利用を以前に禁止した特異的温度要件を有する方法、すなわち所望とされないゲル化を妨げるために室温以上の温度を必要とする方法に特別な興味を有するだろう。
【００３３】
ペプタイザーは、それが、天然コラーゲンをコードする配列由来の一定の長さおよび組成の断片であり、該断片がコラーゲンに特徴的なＧＸＹ部分を有し、アミノ酸ベースで該断片の重さが少なくとも 2.5ｋＤａであるような長さである点で、天然配列と同一である必要はない。適切には、重量は 2.5〜 100ｋＤａであってよい。多様な大きさの断片が適切である。５〜50ｋＤａ、さらには20〜50ｋＤａが適用される適切な態様である。該ペプタイザーは、合成核酸配列から新たに（de novo)で作ることができる。
【００３４】
らせん構造の非存在を確保する多様な方法が利用可能である。例えば、ペプタイザーにヒドロキシプロリンが存在しないこと、および／またはプロコラーゲンおよびテロペプチドが存在しないことを確保することである。好ましくは、写真応用のために、ペプタイザーはシステインが存在すべきではない。ペプタイザーが脱アミン化されていない本発明によるＡｇＸ乳剤は、等電点が７〜10のペプタイザーである本発明の興味あるさらなる態様である。
【００３５】
さらに、他のどのパラメーターを用いてその結果を向上させることができるかを定義するために他に何を発見することができるかを確認するために、さらに研究が行われた。これを行うために、我々は多数の修飾コラーゲン、すなわち非組換え産生コラーゲンを我々の組換えコラーゲンで試験に用いて分析し、関連するパラメーターを決定した。次に我々は、平板状粒子形成に必要とされる程度のハロゲン化銀を作成するのに適切なものとして種々のカテゴリーの化合物を定めた。
【００３６】
さらに、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力 0.1〜 200マイクロモルに等しいレベルで存在する程度に酸化された還元性アミノ酸を有するペプタイザーを有する、既に示された他の態様のいずれかにおける本発明の乳剤が適切な態様である。好ましくは、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンが 160マイクロモル未満、好ましくは120 マイクロモル未満で存在するのがよい。還元力は低いレベルが好ましいので、本発明による好ましい乳剤は、還元性アミノ酸が該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力 0.1〜80マイクロモルに等しいレベルで存在する程度に酸化された還元性アミノ酸を有するペプタイザーを含有するのがよい。該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力30〜80マイクロモルに等しいレベルで還元性アミノ酸が存在する程度のかなり高いレベルの還元性アミノ酸も十分な結果を提供することができる。これは、多くの先行技術刊行物における平板状粒子形成のための要件、低い還元力値という要件に関する以前の教示を考慮すれば、かなり驚くべきことである。本発明は、80μｍｏｌｅ以下のレベルのメチオニンを有するそれら修飾コラーゲン、例えば修飾タイプＩも包含する。例えばタイプＩコラーゲンへの修飾は、必ずしも酸化によるものではなく、還元性アミノ酸が非還元アミノ酸により必要とされる程度まで置換されたコード配列の変異の結果であってもよい。このことは、ハロゲン化銀乳剤中における使用前のコラーゲンの化学処置工程を省略することができ、付随的に生産工程に対する時間と費用の利点をもたらす。明らかに、80μｍｏｌｅを超える還元アミノ酸を有さない天然コラーゲン、例えば修飾タイプＩＩＩも適用できる。
【００３７】
さらに、最初に示され、1996年に発表されたイーストマンコダックの教示とは対照的に、示された他の実施態様のいずれかにおいても本発明の乳剤は50ｍＶを超える銀の結合力を有するペプタイザーを有し、平板状粒子の高い形成レベルを有す乳剤としてかなりよく機能できる。適切なペプタイザーは、銀への結合力100 ｍＶ以下を有する。先行技術の教示とは対照的に、ペプタイザーは銀への結合力50〜100 ｍＶを有することができ、優れた平板状粒子パーセントを有する乳剤を提供する。
【００３８】
そのようなコラーゲン様材料の適用から得られるハロゲン化銀乳剤は、適切には80％を超える平板状粒子、好ましくは90％を超える平板状粒子を示すだろう。95％を超える平板状粒子パーセントが最も好ましい。粒子は、実施例記載の反応条件下の単一噴流法を用いて測定した場合、平均アスペクト比が５を超える値を示すだろう。これらの反応条件は最大のアスペクト比を得るための実際の写真乳剤方法に用いられる最適化反応条件ではなく、そのような最適化条件が使用されるときに高いアスペクト比を達成するのに適切かどうかを示すことを単に提供していることに注意されたい。例えば二重噴流法および付加的な成熟法を用いる通常のコラーゲンに現在用いられている最適化条件を適用すると、本発明の化合物はさらに高いアスペクト比を示すと予想される。使用される試験は高いアスペクト比形成能の迅速な単なる指標であり、当業者はその結果をさらに高めるためにどのような対策を取ることができるかを理解しよう。
【００３９】
我々の試験において、成熟プロセスを、ペプタイザーまたは余分な銀をさらに添加することなしに行う。明らかに、本発明の方法において、成熟工程は、そのような、さらに添加することを有することができる。ペプタイザーは核形成および成熟段階の双方で同一の材料とすることができる。成熟段階でさらに添加することは、この段階での立体安定性の増大のために有利でありえよう。
【００４０】
本発明による好ましいＡｇＸ乳剤は、ｐＨ４〜８でハロゲン化銀平板状粒子形成に対して安定なペプタイザーを有する。石灰骨およびヒドロキシル化ゼラチン由来の従来のゼラチンは、ｐＨ 5.5を超えた値で、そのような平板状粒子形成の結果を示さない。本発明によるペプタイザー、例えば天然組換えコラーゲンＩＩＩはそのような特徴を示さず、乳剤生産保存と適用中の厳密なｐＨ調節を不要にする。天然組換えコラーゲンはメチオニンの酸化を受け、向上した挙動を示すこともできる。適切には、メチオニンレベルは１グラムあたり80マイクロモル未満である。よって、本発明による乳剤は、平板状粒子形成に否定的な影響を与えずにｐＨ４〜８で核形成および成長することができる。乳剤生産の工程において、ｐＨの変化は、写真生産に関して得られる乳剤をさらに処理する際に、否定的な影響をその結果に与えることはないであろう。
【００４１】
本発明による乳剤は、ハロゲン化銀乳剤を有する従来のコラーゲンよりも、ペプタイザーが均質分散性を有するとの利点を提供する。このために結晶化法はすべての上記利点によりさらに均質でもある。ハロゲン化銀の核形成および成長の多様な段階で、明確に定義され、実質的に純粋なさらに均質なペプタイザーを添加することで、コスト効果性と組合わせて、かつコラーゲン様ペプタイザーによっては以前には可能ではなかった調節された方法で結晶化性質を調節することができる。多くのタイプのコラーゲンが自然に存在するので、これらは本発明による写真ハロゲン化乳剤に適用することもできる。
【００４２】
現在まで発見された２３コラーゲン遺伝子が存在する。これらの多くが部分的または全体として配列決定されている。データバンクはそのための多様な配列を有している。例えばGenbank は寄託番号Genbank U08020でｃｏｌＩ配列を有しており、ｃｏｌＩＩＩ配列が実施例１の参考文献５で示されている。これらの天然コラーゲン遺伝子は、それら自体と比較して40〜50％の相同性を示す。配列データに関して挙げられた参考文献の関連情報は、本明細書で参考として含まれる。例えばWO95／31473 の５ページを参照のこと。上述のように、本発明のコラーゲン様化合物（この化合物はその後写真応用のためにハロゲン化銀乳剤で使用される）を作るために、天然源からの単離または化学合成により得られた、これらの天然配列それ自体または修飾しての利用が本発明に包含される。適切には、これら配列が利用され、すなわち天然アミノ酸配列または天然アミノ酸配列に類似したポリペプチドをコードする配列は、コードされたポリペプチドが上記のパラメーターに入る限り利用される。ハロゲン化銀乳剤ゼラチンの源は動物の骨であり、そのうちタイプＩコラーゲンが最も主要に存在するコラーゲンタイプであるために、タイプＩがハロゲン化銀乳剤で最も多く適用されるタイプであった。現在、ハロゲン化銀乳剤での適性のために他のコラーゲンタイプも試験し、適用することもできる。他のコラーゲンタイプは、写真応用での先行技術ではそれ自体として適用されず、ハロゲン化乳剤中ではそれ自体では確かに適用されていない。当然、多くのコラーゲンタイプは現在まで使用されてきた動物組織中に存在している。現在、これらのコラーゲンタイプは、以前に認識されなかった写真製品に対するさらに有利な性質に実際にもたらしているのかどうか、または寄与しているのかどうかを理解することもできるようになっている。コラーゲン様成分としてタイプＩ以外の組換えコラーゲン様ポリペプチドを有する写真感光性乳剤も、上記の特定要件が満足される限り、本発明の適切な態様を形成するとみなされる。具体的には、ハロゲン化銀中の利用が包含される。ハロゲン化乳剤の場合、コラーゲンの100 ％の均一な源は、結晶形成の最大均質分散性を提供することが予想される。均質分散性の要件およびその値が本発明の説明のいずれかで扱われている。ペプタイザーは全長コラーゲンを有することは必要でなく、その断片を有してもよい。しかし、適切には、そのような断片は少なくとも2.5 ｋＤａ、好ましくは10ｋＤａ以上の長さで、ペプタイザーに必要とされるコラーゲン特徴を保持しながら、発現の十分なランダム性を確保する。
【００４３】
上記の乳剤以外に、本発明は、平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤の調製方法も関する。該方法は、核形成ペプタイザーの存在下でハロゲン化銀粒子を核化し、その後成長ペプタイザーの存在下でハロゲン化銀粒子を成長させることを有し、双方のペプタイザーが所定の量で存在し、少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製されたコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。本発明のそのような方法は、核形成工程において、および／または粒子成長工程中で、ペプタイザーを添加することを有することができ、該ペプタイザーが上記態様のいずれかまたは請求の範囲から選択できる。ある特別の態様において、本方法は、核角形成工程において、及び粒子成長工程中の双方において、ペプタイザーを添加することを有することができる。両工程が取られる場合に用いられるペプタイザーは、その場合の環境によるが、同一であっても異なってもよい。
【００４４】
本発明にしたがってＡｇＸ乳剤を調製した後、ＡｇＸ乳剤は、写真要素を調製する標準的操作を受けることができる。該乳剤は、写真材料上にハロゲン化銀乳剤層を得るためにそれ自体公知の方法で塗布することができ、該層のハロゲン化銀結晶は５以上のアスペクト比を有する。
【００４５】
該写真要素は、適切には、光、レーザーまたはＸ線照射に感光性のある材料であり、該要素は白黒リバーサルフィルム、白黒ネガフィルム、カラーネガフィルム、カラーリバーサルフィルム、感光性写真成分がデジタルスキャンされたフィルム、白黒反転紙、白黒紙、カラー紙、反転カラー紙、感光性写真成分がデジタルデータベースからのレーザー照射により感光された紙から選択される。そのような方法にしたがって得られる写真要素、ならびに内部感光化ハロゲン化銀乳剤を用いる直接ポジプロセスおよび熱現像を用いる要素も本発明に包含される。
【００４６】
本発明のもう一つの特徴は、0.95グラム／リットルを超える程度までの微生物によるコラーゲン様ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を有する組換えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法にある。該組換えコラーゲンはらせん構造が存在しない。発現は、高い発現および好ましくは分泌を確実とするように大腸菌またはサッカロミセス・セレビシアエ以外の微生物中で起こるのが好ましい。本方法は、真菌細胞、好ましくは酵母細胞を用いて適切に実施することができる。適切には、宿主細胞は、ハンセヌラ属、トリコデルマ属、アスペルギルス属およびピヒア属のような高い発現宿主細胞からなる群から選択される。真菌および特に酵母細胞は、繰り返し配列の悪い発現をあまり受けないので、バクテリアよりも好ましい。最も好ましくは、宿主は、発現されるコラーゲン構造を攻撃する高いレベルのプロテアーゼを有さないのがよい。この点で、ピヒア属は非常に適切な発現システムの具体例を提供する。好ましくは、該微生物は、コラーゲン様配列を繊維原へと処理する活性のある翻訳後プロセッシング機構がないことにより、発現産物中にらせん構造の欠如を確実とする。また、そうしたプロセスは、微生物が、コラーゲン様配列を三重らせんに処理する活性のある翻訳後プロセッシング機構を持たないとき、および／または発現される核酸配列がプロコラーゲンおよびテロペプチドをコードする配列を持たないときに起こりうる。使用される宿主は、コラーゲン生産に関して当分野での以前の示唆とは対照的に、コラーゲン三重らせん構築物に必要とされる酵素であるプロリル−4-ヒドロキシラーゼの発現のために遺伝子の存在を必要としない。本発明の組換えコラーゲンの発現に適する宿主細胞を、発現される配列と宿主細胞に関する知識との組合せにおける写真技術に適するようにするために、本明細書に記載される必要なパラメーターに基づいて、公知の工業的な酵素産生真菌宿主細胞、具体的には酵母細胞からの適切な宿主細胞の選択は当業者には可能であろう。
【００４７】
非切断配列の生産を確実とするために、組換えコラーゲン様材料を作るための本発明の方法は、発現宿主細胞でプロテアーゼ活性のあるプロテアーゼ切断部位が実質的に存在しない組換えコラーゲンアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いることを有する。例えばピヒア・パストリスの場合、およびおそらく他の宿主細胞にも関しても、対応するアミノ酸が［Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ］−Ｘａａ−Ｙａａ−Ａｒｇ（ここで、ＸａａおよびＹａａはＧｌｙおよびＰｒｏまたは他のアミノ酸に対応しており、括弧内のアミノ酸の少なくとも一つが変えられる）を有さないコラーゲンをコードする核酸配列が望ましいであろう。本発明の好ましい方法は、発現宿主として微生物ピヒア・パストリスを用いることを有する。
【００４８】
本方法は、３グラム／リットルを超えるペプチド収穫をもたらす発現を適切に提供する。本方法は、本発明の乳剤に対して上記で定義した組換えコラーゲン様ペプタイザーのいずれかを用いて適切に実施することができる。そこに記載の環境下の実施例から明らかであるように、マルチコピー形質転換体は、バイオマス湿潤重量 435ｇ／リットルで、清澄化ブロス１リットルあたり14ｇを超えるゼラチンを提供する。最も適切には、他のタンパク質、多糖類および核酸が実質的に存在しなくなるまで、微生物発現から得られる生成物を単離し、精製する。実施例から明らかなように、多くの方法がこれを達成するために当業者に利用できる。本発明による方法は、核酸含量 100ｐｐｍ未満、多糖類含量５％未満、他のタンパク質が市販製品中の含量未満の程度まで少なくとも単離され精製された発現生成物を提供することができる。より好ましくは、ＤＮＡ含量１ｐｐｍ未満、ＲＮＡ含量10ｐｐｍ未満、さらには５ｐｐｍ未満、および多糖類含量１％未満を得ることができる。
【００４９】
本発明のもう一つの特徴は、新規な組換えコラーゲン様ペプチドを包含する。特に、本発明は、コラーゲンをコードする核酸の遺伝子工学により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料を包含し、該ペプタイザーが天然コラーゲンに対して40％を超える相同性を示すアミノ酸配列を有し、４個を超える異なるアミノ酸タイプを有する。核酸配列は天然配列に由来するか、または新たに（de novo)合成された合成核酸であってよい。他の適切な態様は、本発明による乳剤の態様に記載したペプタイザーである。相同性が50％を超える、好ましくは80％のオーダー、さらに80〜100 ％が好ましいので、できるだけ近い相同性が望ましい。具体的には、産物はＧＸＹ部分配列内にブロックコポリマー構造がないのが好ましい。
【００５０】
本発明の好ましい態様として、コラーゲン様材料はシステイン残基を有さない。写真製品にシステインが存在することにより、製品製造方法が妨げられるであろう。よって、システインはできるだけ少量で存在するのが好ましい。これは、組換え産物の化学的修飾によるか、またはシステインがもはやコードされない程度にシステインをコードする配列の変異または削除による産物をコードする核酸配列の変異により達成することができる。適切には、写真応用は、システインを 0.1％未満で有する材料を用いる。
【００５１】
特に、最適なハロゲン化銀乳剤のために、コラーゲン材料の相同性が最も重要性を持つ。それは、改良を提供する不純物がないという単なる問題ではなく、結晶化の非常に感受性のある方法の良好なコントロールを可能とし、均一な結晶成長をも可能とする正確に同一の組成と長さの分子を提供する可能性である。このため、組換えコラーゲン様材料は、写真製造法のこの部分に価値を持ちうるだろう。さらに、現在まで完全に見過ごされてきた特徴である、繊維原形成と三重らせんの形成がないことが写真製造方法におけるこの特別な利用に必要とされる。写真材料における還元基の数の関連性における洞察も大きな重要性を有する。これは平板状粒子形成に必要とされる先行技術に示唆された厳密な低い量ではない。よって、適用されるコラーゲン様材料において、システイン、ヒスチジンおよびメチオニンレベルを低減することにより、本発明の好ましい態様が形成される。
【００５２】
本発明による化合物はさらに別の利点も明らかにした。公知のコラーゲン材料、例えば、骨および皮等の動物源からの規則的で加水分解されたコラーゲンは、ｐＨ5.5 を超えるｐＨで写真フィルム乳剤の低い平板状粒子形成をもたらす。組換えコラーゲンの新しいグループは、ｐＨ5.5 だけでなく、より高いｐＨ、例えばｐＨ７以上でも、同一で目覚しく高い平板状粒子形成程度をもたらすことがわかった。これにより、新しい化合物が非組換えコラーゲンよりも明らかに低いｐＨ依存性を有するので、厳密性を低くして調整したｐＨを有するハロゲン化銀乳剤を調製する可能性がもたらされる。よって、本発明は、高い平板状粒子パーセント、すなわち50％を超え、好ましくは80％を超えるパーセントに到達しながらｐＨ４〜８でハロゲン化銀乳剤の生産に用いることのできる組換えコラーゲン様化合物にも関する。有用であると考えることのできる組換えコラーゲンの付加的な特徴は、等電点が、酸性ＩＥＰを有する1996年に記載されたイーストマンコダック組換えポリペプチドとは反対に塩基性である。本発明による組換えコラーゲンが、４個を超えるアミノ酸が存在するアミノ酸組成物を有することは、コード配列において可変性の増大がもたらされ、よって高い発現度を可能とすることが予期される。全ＧＸＹ配列中で33％プロリン未満のＧＸＹ部分を有する配列を用いることにより、付加的な変化が導入される。この良好な発現は、ＧＸＹ配列におけるブロックコポリマーアミノ酸配列構造を用いることなく達成される。
【実施例】
【００５３】
本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。
【００５４】
［実施例１］
組換えＤＮＡ技術による写真応用のための酵母、真菌等の発現宿主生物中で組換え異種タンパク質として発現されたゼラチン、コラーゲンまたはコラーゲン断片は幾つかの利点を有している。（ｉ）例えば慣用のゼラチンとは対照的に、組換え分子が厳密に非架橋物として作ることができる。（ii）分子組成が正確に定められる。（iii)作られる分子は単一種類（またはわずかに数個の分子の明確な混合物）を有し、他のタンパク質性分子または非タンパク質性分子による汚染が少量であるかまたは無視できる。分子量分布は非常に狭く、単分散（単一成分ゼラチン）または多分散（oligo-disperse）である。（iv）生成物は高い再現性のある方法で、すなわち一定の品質をもって産生することができる。特に、酵母は、繰り返し性の高いグリシンに富んだ配列及びプロリンに富んだ配列を有するポリペプチドのためによく適した産生生物である。
【００５５】
これらの分子的特徴が細菌システム中で遺伝的不安定性（例えば遺伝子の一部の組換えおよびシャフリング（shuffling)）をしばしば引き起こす一方で、これは酵母中では大きな問題ではないように思えた［1, 2］。それらは真核細胞であり、該細胞中ではヒドロキシル化等の翻訳後修飾が引き起こされうるが、効率的な分泌または細胞内発現のいずれかのための選択を可能とさせる。幾つかの種は、動物細胞培養とは対照的にメタノール等の安い基質で効率的に生育する。分泌産生は（植物とは対照的に）培養中または培養後の産物の十分な回収を可能とする。幾つかの強くしっかりと調節された誘導性プロモーターが酵母システムに利用可能であり、効率の良い発現が可能となり、宿主細胞の生存と成長に対する起こりうる否定的な効果を最小限にする。利用可能な幾つかのよく適合させたシステムの一つとして、我々はメチロトローフである（methylotropic)酵母ピヒア・パストリスによる分泌産生のために選択した。我々の発現レベルは組換えタンパク質についてこれまで報告された最大のものの中にあり、遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびタンパク質レベルでのゼラチン／コラーゲン構造の上述のものを処理することのできるこの発現宿主の能力を示している。宿主の形質転換後、統合物は酵母の染色体中に取り込まれ、形質転換体の遺伝的安定性をもたらす（プラスミドの損失は、その後は重要性ではない）。組換え遺伝子がＨＩＳ４座またはＡＯＸ１座のいずれかに導入されている形質転換体（例えばアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーターの調節下に外来標的遺伝子を有するもの）を作ることができる。後者の場合、統合のタイプにしたがって、ＡＯＸ１遺伝子が壊され、メタノールの遅い利用およびメタノールによる遅い成長をもたらす（ＭｕｔS 表現型）。機能的ＡＯＸ１遺伝子がなおも存在する場合、表現型はＭｕｔ+ である。両表現型を用いることができるが、我々は一般的には迅速な成長を好むので、我々のプロトコールは主にＭｕｔ+ 形質転換体の生成と選択に向けられた。Ｐ．パストリス発現系以外の酵母または真菌発現系が、原則として、産生される分子の正確な種類および品質、意図される産生規模、並びに生産コスト及び適用可能な市場価格に依存するが、組換えゼラチンの効率的な産生に同じくよく用いることができることは自明である。ピヒア属系がパイロット生産および比較的容易な産物回収のための迅速で効率的なシステムとして用いられた。
【００５６】
材料、方法および分析
一般的な分子生物学的技術
クローニング操作は基本的にはManiatisら［３］にしたがって行った。ウィザードプラスＳＶミニプレプ（Wizard Plus SV miniprep)、またはキアゲン（Qiagen）ミジプレプシステム（midiprep systems）を用いてＤＮＡを単離した。ＤＮＡをＱＩＡクイックゲル抽出キット（QIAquick Gel Extraction Kit)（キアゲン）を用いてアガロースゲルから単離した。用いられる酵素はすべて、特記しない限り、ファルマシア（Pharmacia)からのものであり、製造業者の推薦にしたがって用いた。大腸菌の形質転換を、バイオラッド（BioRad）のジーンパルサー（GenePulser）を用いる標準的な泳動により行った。ピヒア・パストリスの扱いと形質転換を伴なうすべての操作およびこの宿主微生物におけるタンパク質の発現は、ピヒア発現キット（インビトロゲン（Invitrogen))のマニュアルにしたがって行った［４］。
【００５７】
ラットＣＯＬ３Ａ１ ｃＤＮＡ断片の酵母（ピヒア・パストリス）発現ベクターへの挿入
部分的ラットプロα１（ＩＩＩ）コラーゲンｃＤＮＡを含むプラスミドｐＲＧＲ５は、Vuorio博士より贈呈されたものである［５］。それをＰｓｔＩで消化し、らせん領域の約０．７ｋｂ断片を得た。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を用いて、該断片を平滑末端化し、次にＳｎａＢＩ消化されたＣＩＰ脱リン酸化ｐＰＩＣ９ピヒア・パストリス発現ベクター（インビトロゲン）にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。次に、この連結反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
【００５８】
可能で適当なベクターの選択はｐＰＩＣ９に限定されないことは理解されよう。当業者であれば誰でもｐＨＩＬ−Ｓ１等の多くの他の可能なベクターを使用し、適合させることができ、ここで、サッカロマイセスセレビシアエ由来のα接合因子（alpha-mating factor)（αＭＦ）プレプロ（prepro）シグナルのかわりにピヒア・パストリス酸性ホスファターゼ１（Ｐｈｏ１）−シグナルが用いられるか、または細胞内発現のためにｐＨＩＬ−Ｄ１および多くの他のものが用いられる。
【００５９】
プラスミドＤＮＡを単離し、こうして作られたｐＣＯＬ３Ａ１構築物の配列（図１）を、自動化シーケンサー（ＡＬＦ ＤＮＡシーケンサー、ファルマシア）およびピヒア・パストリス発現キットで示唆された5'ＡＯＸ１、3'ＡＯＸ１およびα−因子（αＭＦ）配列決定プライマーを用いてサンガー（Sanger）の方法［６］による配列決定で確認した（図２を参照のこと）。発現したタンパク質について予想されたタンパク質配列を図３に示す。
【００６０】
ｐＣＯＬ３Ａ１によるピヒア・パストリスの形質転換
ピヒア・パストリスの形質転換でＭｕｔ+ 形質転換体を得るために、該構築物をＳａｌＩで一本鎖とした。ＭｕｔS 形質転換体を得るために、構築物をＢｇｌＩＩで消化した。フェノール抽出およびエタノール析出後、次にこの構築物を用いて、バイオラッドジーンパルサー（1500Ｖ、25μＦおよび 200Ωに設定し、 0.2ｃｍキュベットを用いたもの）を用いて、BeckerおよびGuarente［７］によるエレクトロポレーションを用いて、ピヒア・パストリス株ＧＳ１１５（インビトロゲン）を形質転換した。Ｈｉｓ- 株ＧＳ１１５をＨｉｓ+ に変換するベクターの存在について選択するために最小デキストロースプレート（ＭＤプレート；1.34％ＹＮＢ、４×10-5％ビオチン、１％デキストロースおよび1.5 ％寒天）に形質転換混合物を塗布した。30℃で３日間の生育後、幾つかのコロニーがＭｕｔ遺伝子型のＰＣＲ確認のために選択した。ゲノムＤＮＡを Lee［８］の酵母ミニプレプ法にしたがって単離し、ＲＮａｓｅＡで処理した。ＰＣＲを、全体積50μｌに、ゲノムＤＮＡ 100ｎｇ、5'ＡＯＸ１プライマー50ｐｍｏｌ、3'ＡＯＸ１プライマー50ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ1.25Ｕ（ファルマシア）、0.2 ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ファルマシア）および１×Ｔａｑ緩衝液（ファルマシア）を用いて行った。94℃で５分間の最初の変成後、94℃で１分間、57℃で１分間および72℃で２分間からなるサイクルを30回行った。最終的な伸長は72℃で10分間であった。使用されたＰＣＲ装置はパーキンエルマー（Perkin-Elmer）GeneAmp 480 であった。アガロースゲル電気泳動により、Ｍｕｔ+ 形質転換体に関して 2.2ｋｂ内因性ＡＯＸ１バンドを示すはずである。 2.2ｋｂバンドのない形質転換体はＭｕｔS である。Ｍｕｔ+ およびＭｕｔS 遺伝子型の双方の確認済形質転換体を、50ｍｌコニカルチューブ（角度をつけて置かれ、キャップをゆるく付けた）中、または100 ｍｌもしくは１Ｌ（バッフル付き）フラスコ中での小規模発現について選択した。
【００６１】
ＣＯＬ３Ａ１断片の発現
基本的にはピヒア・パストリス発現キットマニュアルに記載のように発現を行った。簡単には、形質転換体を一晩ＢＭＧ（100 ｍＭリン酸カリウムｐＨ6.0 、1.34％ＹＮＢ、４×10-5％ビオチンおよび１％グリセロール）をＯＤ600 ＝２〜６まで生育させた。次に培養物を遠心してＢＭＭ（グリセロールを 0.5％メタノール変えた以外はＢＭＧと同じ）でＯＤ600 が 1.0になるまで再懸濁した。細胞を４日間30℃および 250ｒｐｍで、毎日メタノールを 0.5％まで加えて生育させた。
【００６２】
培養上清10μｌをLaemmli ［９］によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、バイオラッドのミニPROTEAN IIシステムを用いて分析した。クーマシーブリリアントブルー染色から、幾つかのバンドが明らかになり、そのうちの最大のバンドは、見掛けの長さが約29ｋＤという予想された値を有していた。ゼラチン、コラーゲンおよびコラーゲン断片は、見掛けのＭｗにより移動し、少なくとも部分的には比較的低い平均残基Ｍｗ［12］のため、真のＭｗよりも約 1.4倍高い見掛けのＭｗにより移動することに注意すべきである。
【００６３】
それらを同定するために、アセトン分画されたＣＯＬ３Ａ１発酵上清（分画操作については下記を参照のこと）をかけたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、バイオラッドミニトランスブロットセルを用いてImmobilon ＰSQメンブレン（ミリポア）にブロットした。定量的な移動が、ＣＡＰＳ緩衝液（10％ＭｅＯＨ１リットルあたりＣＡＰＳ2.2 ｇ、ｐＨ11）を用いて、100 Ｖを１時間かけることにより得られた。クーマシーブリリアントブルーによる染色後、４本の最も主なバンドを切り出して、そのＮ末端配列をエドマン分解により決定した。29ｋＤバンドは何のシグナルも示さなかったが、おそらくＮ末端がブロックされているためであろう。二つの小さい断片のうち一つは、配列決定するほどには純粋ではなかった。他の二つの小さいバンドは読み取り可能なシグナルを示し、図３で下線を付けている。バンドはタンパク質分解の一部の形により引き起こされていることは明らかである。これは、ゼラチンがランダムコイル立体配座中の非常にオープンなタンパク質であるためにタンパク質分解を非常に受け易いとのことにより説明することができる。
【００６４】
プロテアーゼ活性
コラーゲンの分解は、ｐＨ5.0 での発酵中にコラーゲンタイプＩおよびＩＩＩで観察された。この分解をさらに特性付けるために試験を行った。この分解は、低いｐＨで発酵プロセスを実施するとき、顕著に減少した。具体的には、ｐＨ3.0 で良好な結果を得た。我々はカザミノ酸の添加の効果も調べた。この添加により、ｐＨ5.0 で両タイプのコラーゲンが保護された。さらに、この添加により、ｐＨ3.0 でコラーゲンタイプＩに対して良好な保護をもたらした。この添加保護は、ｐＨ3.0 でコラーゲンタイプＩＩＩの場合には観察できなかった。細胞外中性プロテアーゼは、ランダムな立体配座から起こるタンパク質分解にかなり冒されやすいコラーゲンを攻撃すると思われる。（発酵操作の記載について下記参照のこと。）ｐＨ3.0 でのｐＣＯＬ３ＡＩ発酵のコラーゲン含有上清を用いて試験を行い、発酵中の分解を最小限とした。遠心分離により細胞を除去した後、上清のｐＨを5.0 に調整した。次に、平行インキュベーションを下記の添加と共に行った。
（１）新しいピヒア・パストリス細胞（ミリＱ（MilliQ）で洗浄したもの）
（２）新しいピヒア・パストリス細胞（ミリＱで洗浄したもの）およびガラスビーズ：この混合物を攪拌した（陽性コントロールＩ）。
（３）何も加えないもの（陰性コントロール）
（４）トリプシン（５ｍｇ／ｍｌ）（陽性コントロールＩＩ）。
【００６５】
すべての試料を96時間、30℃、ｐＨ5.0 でインキュベートした（これらは発酵中ゼラチンの分解を引き起こす条件であった）。最後に、インキュベートされた試料をバイオラッドミニPROTEAN IIシステムでLaemmli ［９］によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行った後、クーマシーブリリアントブルー染色により分析した。
【００６６】
結果は以下通りであった。
（１）ｐＨ5.0 で、洗浄された無傷の細胞とのインキュベーションは、おそらく細胞表面会合タンパク質分解酵素活性の結果としてｐＣＯＬ３Ａ１（元々はｐＨ3.0 で作られたもの）を４〜５の別々のバンドへの分解を引き起こした。
（２）壊れた細胞を添加することにより、両方のコラーゲンタイプが多くのタンパク質分解産物へとその分解が引き起こされた（陽性コントロールＩ）。
（３）ｐＨ5.0 で細胞の不存在下で、分解は起こらなかった。
（４）トリプシンの添加はゼラチンの大量分解を引き起こした（陽性コントロールＩＩ）。
【００６７】
異なる実験において、我々は、発酵の最後に細胞の除去後、無細胞発酵ブロス中の組換えゼラチンが温度範囲０〜30℃で、ｐＨ範囲3.0 〜7.0 で７日間安定であったことを確かめた。よって、ゼラチンのタンパク質分解の一部が発酵中に起こったが、細胞の除去後、関連性のあるタンパク質分解活性は保持されず、生成物を安定化するためのさらなる注意は必要ではない。類似の安定性が下記のＣＯＬ−１Ａ１生成物について観察された。組換えゼラチンは（下記のようにアミノ酸組成の分析により示されているように）ヒドロキシル化されないので、非らせん、すなわち二次構造を持たないために、それら組換えゼラチンの安定性は驚きであった。二次構造（すなわちコラーゲンタイプのらせん）およびヒドロキシプロリンがまったくないことを、参考文献［13］による円偏光二色性スペクトロスコピー（ＣＤ）により、およびペプチド結合の全加水分解後のアミノ酸組成のＨＰＬＣ分析によりそれぞれ確認した。５℃で、発現産物は主にランダムコイル立体配置にとどまり、よって基本的にはゲル化しないことが確認された。これは、実験により確認されたように、らせん安定化させるヒドロキシプロリンがないことによる。よって、組換えゼラチンは、タンパク質分解を著しく受けやすいのに違いない、著しくオープンな分子（およびそれ自体として非平行ポリペプチド）である。この発現宿主での生成物の予想されない安定性は（分泌後でも）、この発現系からの生成物の下流プロセシングおよび単離を非常に容易にし、タンパク質分解活性の高価で不安定な阻害剤（例えばパラ−メチル−スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））を繰返し添加する必要がない。さらに、単純なマイクロ濾過または栄養ブロスに対する透析により、および細胞を発酵糟（fermenter)へ再循環させることによって、発酵中細胞からの生成物を連続的に分離することに対して、高い細胞密度発酵中のゼラチン分解を最小限にする可能性を開発している。前もって三重らせんコラーゲンまたは折りたたみポリペプチドのみが作られている。これらはプロテアーゼに対してより耐性がある。三重らせんコラーゲンはトリプシン、ペプシン、および他の周知のプロテアーゼに対してさえも十分に耐性がある。対照的に、そのままの非ヒドロキシル化で折りたたまれていないゼラチンの保護はしたがって著しく難しいと予想された。
【００６８】
プロテアーゼ欠損株における産生
ｐｅｐ４プロテアーゼＡ欠損株ＳＤＭ１１６８（インビトロゲン）がプロテアーゼ感受性ゼラチン配列の発現によく適合しているかどうかを調べるために、この株もｐＣＯＬ３Ａ１構築物で形質転換した。方法論は上記のとおりであった。不幸にも、振とうフラスコおよび発酵糟発現実験の両方で明らかな陽性の（positive）効果は存在しなかった。
【００６９】
グリコシル化の分析
該タンパク質がグリコシル化されているかどうかを証明するために、過ヨウ素酸による酸化後にシッフ試薬の適用を伴なうＰＡＳ染色をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で行った。ゲルを、12.5％ＴＣＡ中で１時間、１％過ヨウ素酸／３％酢酸中で１時間、15％酢酸中で１時間（10分毎に交換）およびシッフ試薬中で１時間（暗室中４℃で）インキュベートした。次にゲルを 0.5％亜硫酸水素ナトリウムで５分間、２度洗浄し、７％酢酸で脱色した。発現されたタンパク質バンドはシグナルを示さなかったが、陽性コントロール（カルボキシぺプチダーゼＹ）からのシグナルが存在した。予想されたように、陰性コントロール（大腸菌抽出物）を用いてシグナルは得られなかった。発現されたタンパク質はグリコシル化しないと結論することができる。
【００７０】
ノーザンブロット
メタノール成長細胞のノーザンブロットを行った。Schmitt らの方法［10］にしたがってＲＮＡを単離した。ｐＣＯＬ３ＡｌベクターをＥｃｏ−ＲＩ／ＳｐｈＩで消化して 0.5ｋｂのＣＯＬ３Ａ１断片を得た。該断片を32Ｐランダムプライマーで標識し、ブロットにハイブリダイズし、その後ブロットを0.2 ×ＳＳＣの最終濃度になるまで65℃で洗浄した。オートラジオグラフィーは予期された長さ(1.3ｋｂ）のメッセンジャーを明らかにした。
【００７１】
異種ＣＯＬ３Ａ１遺伝子のマルチコピーを含むピヒア形質転換体
ゼラチン発現量をさらに高めることができるかどうかを調べるために、ScorerらのＧ４１８マルチコピー選択法［11］が利用された。ｐＰＩＣ９ＫベクターをＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、9.0 ｋｂバンドを単離した。ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターもＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、得られた1.0 ｋｂ断片を9.0 ｋｂのｐＰＩＣ９Ｋバンドに連結し、その後それを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。こうして得られた構築物ｐＣＯＬ３Ａ１Ｋ（図４）を制限消化により確認した。
【００７２】
ピヒア・パストリスＧＳ１１５を上記のように（Ｍｕｔ+ 形質転換体を得るためにＳａｌＩで消化された）ｐＣＯＬ３Ａ１Ｋベクターで形質転換した。マルチコピー形質転換体を選択するために、ＭＤプレート上のｈｉｓ+ コロニーを集め（約6000個）、0.25〜4.0 ｍｇ／ｍｌの範囲の一連の10種類の異なるＧ４１８（ギブコＢＲＬ）濃度を含有するプレート上で二次スクリーニングに供した。細胞をプレート１枚あたり約105 個の細胞の密度で塗布した。４日間、30℃でのインキュベーション後、各Ｇ４１８濃度の幾つかの耐性コロニーをＧ４１８の対応する量の新しいプレートに移してそれらの耐性を確認した。
【００７３】
Ｇ４１８耐性形質転換体におけるｐＣＯＬ３Ａ１Ｋのコピー数を決定するために、半定量的ドットブロットを行った。確認されたＧ４１８耐性形質転換体のゲノムＤＮＡをLee の方法［８］にしたがって単離し、ＲＮａｓｅ Ａ処理した。40個（Ｇ４１８の濃度あたり４）の形質転換体のそれぞれの染色体ＤＮＡ約 200ｎｇを、真空ブロット装置（ギブコＢＲＬ変換システム）を用いて、正電荷ナイロンメンブレン（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim)）に移した。１コピーコントロールとして、サザンブロットにより僅かに１コピーを含むと証明されたｐＣＯＬ３Ａ１形質転換体をブロットに（デュプロで（in duplo))移し、また非形質転換コントロールもブロットに（デュプロで）移した。
【００７４】
ｐＣＯＬ３ＡｌベクターをＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩで消化し0.5 ｋｂのＣＯＬ３Ａ１断片を得た。この断片は32Ｐプライマー標識し、ドットブロットフィルターにハイブリダイズさせた。65℃で0.5 ×ＳＳＣの最終濃度まで洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。（効率をチェックした）ストリップ後、メンブレンを確認済ピヒア・パストリスＵＲＡ−３断片由来のプローブにハイブリダイズさせ、異種ＵＲＡ３プライマーによるＰＣＲにより選択した。このコントロールは、かけられたＤＮＡの量に関してＣＯＬ３Ａ１シグナルの標準化に役立つ。メンブレンを洗浄し、ＣＯＬ−３Ａｌプローブについて記載したようにオートラジオグラフィーに供した。両オートラジオグラフにおけるシグナルをゲルスキャナー（ＰＤＩ、ファルマシア）を用いて濃度による定量を行った。予想されたように、０コピーコントロールについてはＣＯＬ３Ａ１シグナルが存在しなかった一方、ＵＲＡ３シグナルは存在した。そのコピー数は、各ＵＲＡ３シグナルの比により標準化するように、各形質転換体についてのＣＯＬ３Ａ１シグナルと１コピーコントロールに対して得られた平均ＣＯＬ３Ａ１シグナルとの比を計算することで見積もることができる（即ち、メンブレンにブロットされたＤＮＡ量の違いを計算に入れる）。約１〜15コピーを含む形質転換体がこうして得られた。
【００７５】
マルチコピー形質転換体におけるＣＯＬ３Ａ１断片の発現
１〜15コピーを含有する一連の形質転換体を上記のように小規模発現に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、高いコピー数で高い収量を示したので、さらに試験を100 ｍｌの規模で２、５、10および15コピーの形質転換体を用いて行った。これらを、ＢＭＧ25ｍｌ（100 ｍＭリン酸カリウムｐＨ6.0 、1.34％ＹＮＢ、４×10-5％ビオチンおよび１％グリセロール）を含む100 ｍｌフラスコ中で一晩生育させた。1500〜3000ｇで５分間の遠心後、細胞をＢＭＭ100 ｍｌ（グリセロールの代りに0.5 ％メタノールとした以外はＢＭＧと同じ）に再懸濁した。１リットルのバッフル付きフラスコ中、30℃、 250ｒｐｍ、４日間、メタノールを毎日 0.5％まで加えながら細胞を生育させた。試料１ｍｌを毎日採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。高いコピー数は、高い量のゼラチン産物をもたらした。選択された５〜15コピーの形質転換体を発酵糟で１Ｌの規模で発現試験のために用いた。最大のＣＯＬ３Ａ１生産が15コピー形質転換体を用いて得られた（乾燥バイオマス177 ｇ／Ｌで約184 時間発酵後に細胞外培地中約14.8ｇゼラチン／Ｌ、即ち全体で約7.7 ｇ／Ｌ、即ち42ｍｇ／（Ｌ．時間）；乾燥バイオマス110 ｇ／Ｌで約120 時間発酵後、細胞外培地中約７ｇゼラチン／Ｌ、すなわち全体で約3.7 ｇ／Ｌ、または31ｍｇ／（Ｌ．時間））。
【００７６】
マウスＣＯＬ１Ａ１断片（ＣＯＬ１Ａ１−１）マウスのクローニング
プライマーを公知の配列に基づいて設計した（図５）。全体積20μｌ中、マウス17日目の胎児QUICK クローン（QUICK-Clone)（登録商標）（繊維芽細胞）ｃＤＮＡ（クローンテック（Clontech))に対して、ｃＤＮＡ 0.4ｎｇ、0.4 μＭ Ｃ１Ａ１−ＦＷプライマー（図５）、0.4 μＭ Ｃ１Ａ１−ＲＶ１プライマー（図５）、１×Advantage Klen Taqポリメラーゼミックス（クローンテック）、0.2
ｍＭのｄＮＴＰ'ｓ（ファルマシア）および１×Klen TaqＰＣＲ反応緩衝液（クローンテック）を用いて、ＰＣＲを行った。94℃で４分間の最初の変成後に、94℃で１分間、68℃で１分間および72℃で２分間からなるサイクルを35回行った。最終的な伸長（extension)は72℃で10分間であった。アガロースゲル電気泳動は、配列から予想された大きさである１ｋｂバンドを示している。ＤＮＡをアガロースゲルから単離し、次にＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化した。消化された断片をアガロースゲルから単離して、下記の方法にしたがってピヒア・パストリス発現ベクターｐＰＩＣ９にクローニングした（図６）。最初に、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位を有するアダプターをｐＰＩＣ９のマルチクローニング部位に挿入して、ｐＰＩＣ９* を得た。該アダプターを、図５と図６に示されたように合成オリゴヌクレオチドＮ−Ｘ−ＦＷおよびＮ−Ｘ−ＲＶにアニーリングすることにより調製した。オリゴヌクレオチドＮ−Ｘ−ＲＶの5'末端から生じた一本鎖の突出部は、ＥｃｏＲＩ消化ベクターでのアニーリング後にＥｃｏＲＩ部位を形成するように設計した。Ｎ−Ｘ−ＦＷ（ＸｈｏＩ* ）からの5'突出部はベクター上のＸｈｏＩの作用により作られた突出部に相補的であったが、連結後、ＸｈｏＩ部位を作らなかった。標的ベクターであるｐＰＩＣ９がマルチクローニング部位の外側にＮｃｏＩ部位を有しているため、ｐＵＣ１８をこの断片のクローニング用中間ベクターとして用いた。ｐＰＩＣ９* の変更マルチクローニング部位のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとの間の部分を、ｐＵＣ１８ベクターのマルチクローニング部位に移して、ｐＵＣ１８* が得られた。ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ消化断片ＣＯＬ−１Ａ１−１をＮｃｏＩとＸｈｏＩ部位との間のｐＵＣ１８* ベクターに連結した。このｐＵＣ１８−ＣＯＬ１Ａ１−１構築物から、ＣＯＬ１Ａ１−１断片を、ｐＰＩＣ９からのマルチクローニング部位の部分とともに、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｐＰＩＣ９に連結して、構築物ｐＣＯＬ１Ａ−１が得られた（図７）。よって、ｐＰＩＣ９の部分的ＮｃｏＩ消化は必要ではなかった。ｐＰＩＣ９の正しい挿入を制限分析により最初にチェックし、次にＤＮＡ配列決定によりチェックした。
【００７７】
ｐＣＯＬ１Ａ１−１によるピヒアの形質転換およびＣＯＬ１Ａ１−１断片の発現
ピヒア・パストリスＧＳ１１５を、ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターについて記載されたようにｐＣＯＬ１Ａ１−１で形質転換した。ＳａｌＩ消化ＤＮＡを、具体的にはＭｕｔ+ 形質転換体を作るために用いた。いくつかの形質転換体を振とうフラスコ中の小規模発現のために用い、そのうちの一形質転換体を発酵糟中で１〜100 Ｌの規模での発現のために選択した。典型的な収率は（細胞外）培地１リットルあたり、乾燥バイオマス100 〜120 ｇ／Ｌ（全体でゼラチン約３ｇ／Ｌ）であり、ゼラチン４〜５ｇ（下記のようにアセトン分画後に測定されたもの）の範囲にある。目的のゼラチン（図８）は、理論Ｍｗ27.4ｋＤを有している。コラーゲン性タンパク質およびゼラチンは、見掛けのＭｗであり、真のＭｗよりも1.4 倍速く移動することが知られている［10］。一致するように、約38ｋＤの見掛けのＭｗで移動するＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドが観察された（球状タンパク質Ｍｗマーカーを用いて得られた内挿値）。さらに、見掛けのＭｗ24、18および15ｋＤ（内挿値）を有する３種類の短い産物が観察された。これらは、細胞間の細胞表面会合もしくは細胞外区画中、または翻訳レベルでの問題からの初期タンパク質分解活性の結果であろう。分解産物は、誘導のごく初期段階に存在し、それ以上の分解は起こらなかった。ｐＨ5.0 および30℃での96時間の洗浄されたそのままの細胞の存在下でのインキュベーションでさえ、ｐＨ3.0 での発酵後の場合についてｐＣＯＬ１Ａ１−１のそれ以上の分解を引き起こさなかった。（大量の分解は、陽性コントロールとしてのトリプシンの存在下で起こった）。ｍＲＮＡレベルでの問題が24、18および15ｋＤ産物の存在の原因ではないことを確認するために、プローブとして、ｐＣＯＬ１Ａ１−１からの32Ｐランダムプライマー標識化 1.0ｋｂＮｃｏＩ／ＸｈｏＩＣＯＬ−１Ａ１−１断片を用いて、ＣＯＬ３Ａ１について記載されたように、ノーザンブロットを行った。予想された 1.6ｋｂメッセンジャーが見出された。
【００７８】
観察されたフラグメントの同定を確立するために、アセトン分画化ＣＯＬ１Ａ１−１発酵上清を充填したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをバイオラッドミニトランスブロットセルを用いるImmobilon ＰSQメンブラン（ミリポア）にブロットした。（アセトン分画操作の記載については下記を参照のこと）。定量的移動は、ＣＡＰＳ緩衝液（10％ＭｅＯＨ１リットルあたりＣＡＰＳ2.2 ｇ、ｐＨ11）を用いて、100 Ｖを１時間印加することにより行った。クーマシーブリリアントブルーによる染色後、４本の主なバンドを切り出し、そのＮ末端配列をエドマン分解により決定した。得られた配列決定シグナルは、充填された材料の量と比較して著しく低かった（平均５％程度）。したがって、該断片はほとんどがＮ末端でブロックされていると思われる。これは、ＣＯＬ１Ａ１−１のタンパク質分解が細胞内で起こるとの考えを支持する。それにもかかわらず、供給された大量のＣＯＬ１Ａ１はＮ末端配列の容易な決定を可能とした。得られたＮ末端配列は、トランスフェクトされたＣＯＬ１Ａ１−１遺伝子によりコードされたタンパク質配列（図８）に下線を付す。38ｋＤと18ｋＤの両方の見掛けのＭｗを有する断片は、該タンパク質のＮ末端について予想された配列を与えたが、'ＥＡ'により伸長した。この伸長（即ちＥＡＥＡ）は、サッカロミセス・セレビシアエ由来のα接合因子（αＭＦ）プレプロシグナルを利用する発現ベクターから発現される幾つかのタンパク質上に存在することが知られている。この効果はＳＴＥ１３切断活性の立体的妨げによるものと思われる。しかし、タンパク質のほとんどがおそらくＮ末端でブロックされているために、この伸長したバージョンは配列決定可能な小さいフラクションのみを表すのであろう。Ｎ末端および内部配列に基づいて、見掛けのＭｗ38、24、18および15ｋＤを有する断片が、図８に示されているように、標的産物の残基１〜310 、126 〜310 、１〜125 および42〜125 からそれぞれなる断片であると割り当てられた。残基１〜41（理論Ｍｗ４ｋＤ）および42〜310
（理論Ｍｗ24ｋＤ、見掛けのＭｗ34ｋＤ）に対応する断片は観察されなかった。これは、残基41と42との間よりも残基125 と126 との間の（さらに）多くの頻繁な切断によるものであろう。
【００７９】
マウスＣＯＬ１Ａ１−２のクローニングと発現
マウス１７日目の胎児QUICK-Clone(登録商標）ｃＤＮＡ（クローンテック）に対してマウスＣＯＬ１Ａ１−Ｉと同じように、Ｃ１Ａ１−ＦＷおよびＣ１Ａ１−ＲＶ２プライマーを用いてＰＣＲを行った。94℃で４分間での変成後に、94℃で１分間、65℃で１分間および72℃で３分間からなるサイクルを35回行った。最終的な伸長は72℃で10分間であった。アガロースゲル電気泳動は、配列から予想された大きさである1.8 ｋｂバンドを示している。ＣＯＬ１Ａ１−２のｐＰＩＣ９発現ベクターへのクローニングが、ＣＯＬＩＡ−１と同じように、さらに行われてｐＣＯＬ１Ａ１−２が得られた（図９）。
【００８０】
ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターについて記載したように、ピヒア・パストリスＧＳ１１５をｐＣＯＬ１Ａ１−２ベクターで形質転換した。Ｍｕｔ+ 形質転換体を特異的に作るためにＳａｌＩ消化ＤＮＡを用いた。振とうフラスコ中での小規模での発現のために幾つかの形質転換体を用いて、それらの一つを、１〜100 Ｌ規模での発酵糟中発現のために選択した。図10は予想されたＣＯＬ１Ａ１−２アミノ酸配列を示す。典型的な収量は、バイオマス100 〜120 ｇ／Ｌ（全体でゼラチン３ｇ／Ｌ）において、（細胞外）培地中、４〜５ｇ／Ｌゼラチンの範囲である。標的ゼラチン（図10）は、理論Ｍｗ53ｋＤを有する。この値と一致して（およびＳＤＳ−ＰＡＧＥでのゼラチンの公知の異常な移動［10］により）、見掛けのＭｗ約74ｋＤ（球状タンパク質Ｍｗマーカーを用いて得られた内挿値）で移動するＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドが観察された。さらに、見掛けのＭｗ56、18および15ｋＤ（内挿値）を有する３つの短い産物が観察された。タンパク質分解切断がＣＯＬ１Ａ１−１およびＣＯＬ１Ａ１−２の発現産物に対応する部位で生じる場合（図８、10）、ＣＯＬ１Ａ１−２産物の残基１〜595 、126 〜595 、１〜125 、および42〜125 からなる断片が生じることが予想されよう。これらは、見掛けのＭｗが74、58、17および11ｋＤに対応する、理論Ｍｗそれぞれ53、42、12および８ｋＤを有するだろう。驚くことに、これは、観察された見掛けのＭｗによく対応し、ＣＯＬ１Ａ１−２の切断が主に残基125 と126 の間の結合、および（さらに）41と42の結合に制限されていたことを示している。また、残基１〜41（理論Ｍｗ４ｋＤ）および42〜595 （理論Ｍｗ50ｋＤ、見掛けのＭｗ70ｋＤ）に対応する断片は観察されなかった。ＣＯＬ１Ａ１−１で示されたように、これは残基41と42との間よりも残基125 と126 との（さらに）多くの頻繁な切断によるものであろう。
【００８１】
マウスＣＯＬ１Ａ１−３のクローニングと発現
マウス１７日目の胎児QUICK-Clone(登録商標）ｃＤＮＡ（クローンテック）に対して、マウスＣＯＬ１Ａ１−１と同じように、Ｃ１Ａ１−ＦＷおよびＣ１Ａ１−ＲＶ３プライマーを用いてＰＣＲを実施した。94℃で４分間の変成後に、94℃で１分間、65℃で１分間および72℃で３分間からなるサイクルを35回行った。最終的な伸長は72℃で10分間であった。アガロースゲル電気泳動は、配列から予想された大きさである 2.8ｋｂバンドを示している。
【００８２】
ＰＵＣ１８* プラスミドをＮｃｏＩで消化し、脱リン酸化した。Ｃ１Ａ１−ＦＷ／Ｃ１Ａ１−ＲＶ３ ＰＣＲ生成物をＮｃｏＩで消化し、得られた 2.5ｋｂ断片をゲル精製し、これを、該ＮｃｏＩ消化され且つ脱リン酸化したベクターに連結した。大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅの形質転換後、得られたクローンの挿入物の正確な向きをＰｖｕＩＩ消化により確認した。さらに、ＣＯＬ１Ａ１−３のｐＰＩＣ９発現ベクターへのクローニングが、ＣＯＬＩＡ−１について記載した方法と同じようにさらに行われて、ｐＣＯＬ１Ａ１−３が得られた（図11）。
【００８３】
ピヒア・パストリスＧＳ１１５をｐＣＯＬ１Ａ１−３ベクターで、ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターについ記載したように形質転換した。Ｍｕｔ+ 形質転換体を特異的に作るためにＳａｌＩ消化ＤＮＡを用いた。幾つかの形質転換体を振とうフラスコ中での小規模発現のために用いて、それらの一つを発酵糟中、１〜100 Ｌ規模での発現のために選択した。図12は予想されたＣＯＬ１Ａ１−３アミノ酸配列を示す。典型的な収量は、（細胞外）培地中、乾燥バイオマス100 〜120 ｇ／Ｌにおいて、４〜５ｇゼラチン／Ｌの範囲（アセトン分画後に測定）である（全体で３ｇゼラチン／Ｌ）。標的ゼラチン（図12）は、理論Ｍｗ72ｋＤである。この値に一致して、見掛けのＭｗ約100 ｋＤ（球状タンパク質Ｍｗマーカーを用いて得られた内挿値）で移動するＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドが観察された。さらに、見掛けのＭｗが85、18および15ｋＤ（内挿値）の３つの短い産物が観察された。タンパク質分解がＣＯＬ１Ａ１−１およびＣＯＬ１Ａ１−３の発現産物の均一部位で起こる場合（図８，12）、ＣＯＬ１Ａ１−３産物の残基１〜812 、126 〜812 、１〜125 、および42〜125 からなる断片が存在することが予想されよう。これらは、見掛けのＭｗが100 、84、17および11ｋＤのそれぞれに対応する理論上のＭｗ72、60、12および８ｋＤを有するだろう。驚くことに、これは観察された見掛けのＭｗによく対応し、ＣＯＬ１Ａ１−３の切断が主に残基125 と126 の間の結合および（さらに少ない程度で）41と42の結合に限定されていることを示している。再び、残基１〜41（理論Ｍｗ４ｋＤ）および42〜812 （理論Ｍｗ68ｋＤ、見掛けのＭｗ96ｋＤ）に対応する断片は観察されなかった。これは、ＣＯＬ１Ａ１−１に示されたように、残基41と42との間よりも残基125 と126 との間の（さらに）多くの頻繁な切断によるものであろう。
【００８４】
表１は、分子量マーカータンパク質（ＬＭＷキャリブレーションキット；ファルマシア）との比較により得られた見掛けＣＯＬ１Ａ１断片サイズを、配列から計算したサイズとともにまとめた。
【００８５】
ＣＯＬ１Ａ１断片の見掛けの分子量および理論分子量
【表１】
【００８６】
表１から、「ＭＧＰＲ」モデルは、実際に見出された断片によく適合していることがわかる。
【００８７】
残基１〜41（４ｋＤ；１Ａ１−１，２，３）および残基42〜310 （理論Ｍｗ：24ｋＤ、見掛けのＭｗ：34ｋＤ；１Ａ１−１）、残基42〜595 （理論Ｍｗ：50ｋＤ、見掛けのＭｗ：70ｋＤ；１Ａ１−２）、または残基42〜595 （理論Ｍｗ：68ｋＤ、見掛けのＭｗ：96ｋＤ；１Ａ１−３）の断片も予想できるであろう。これらの断片がゲル上に見られないということは、第２の「ＭＧＰＲ」部位での切断速度が、第１の部位よりもさらに高いとみなすことにより説明がつくだろう。このことは、タンパク質分子が切断される場合、それが常に第２の部位で最初に起こることを意味する。切断速度におけるこの違いは、第１の部位がプロテアーゼを立体的に妨げる可能性のあるプロリン残基の前に存在するとのことで説明がつくだろう。
【００８８】
マウスＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２およびＣＯＬ１Ａ１−３'ＲＧＰＭ'変異体
我々は、タンパク質分解酵素の認識部位として働く同じアミノ酸配列がすべてのＣＯＬ１Ａ１産物（ＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２、ＣＯＬＩＡ１−３）の分解の原因である可能性を考慮した。驚くことに、ＣＯＬ１Ａ１−１断片15ｋＤおよび24ｋＤから得られた両内部Ｎ末端配列は、同一の配列「ＭＧＰＲ」よりも前に存在する。さらに、この配列は、残基83〜41および残基 122〜 125に対して、マウスＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２、またはＣＯＬ１Ａ１−３遺伝子中に２回のみ存在する。（ＣＯＬ１Ａ１−１と比較して、ＣＯＬ１Ａ１−２及びＣＯＬ１Ａ１−３は、付加的なＭＧＰＲ部位を含まない。）また、ラットからのＣＯＬ３Ａ１断片はそのような部位を含まなかった。これは観察された切断パターンにうまく対応する。したがって、我々は、「ＭＧＰＲ」が特定のプロテアーゼにより認識される部分であり、ＣＯＬ１Ａ１タンパク質の切断をもたらすと考えている。このＭＧＰＲプロテアーゼ認識部位は以前には記載されていない。この部分のさらに一般化された表示は、おそらくＭＸＸＲ、ＭＸＸ［ＲＫ］、または［ＭＬＩＶ］ＸＸ［ＲＫＨ］であろう。前者２つの部分は実際に全マウスＣＯＬ１Ａ１遺伝子中にわずかに２回存在するだけであり、ＣＯＬ３Ａ１断片には存在いない。一方、三番目の部分は広いために非切断部位（ＣＯＬ１Ａ１中の残基85〜88のＭＫＧＨおよび残基169 〜172 のＶＧＡＫ、並びにＣＯＬ３Ａ１中の残基198 〜201 のＩＫＧＨ）を含む。よって、ＭＸＸＲまたはＭＸＸ［ＲＫ］は［ＭＬＩＶ］ＸＸ［ＲＫＨよりもさらに一般化された部分である。図13はＣＯＬ−１Ａ１−２配列中の「ＭＧＰＲ」部分を示している。このタンパク質切断部位が、それが比較的オープンで、折りたたまれていない構造（我々のゼラチンのように）で存在するが、さらにコンパクトに折りたたまれた構造（球状タンパク質のように）では容易に存在しない場合、関与する酵素により単に認識されることが予想できる。よって、それは、ゼラチンおよび折りたたまれていないコラーゲン等のある種のタンパク質及びポリペプチドにのみ重要であろう。
【００８９】
３つの他の主要バンドが存在することなく、完全長のＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２およびＣＯＬ１Ａ１−３を作ることができるために、「ＭＧＰＲ」部分が部位特異的変異誘発により除去しなければならない。天然のＣＯＬ１Ａ１ゼラチンの元のアミノ酸組成を保持するために、「ＭＧＰＲ」部分を「ＲＧＰＭ」に変換することにより除去した。下記の相補的プライマーの二対が合成された。
【００９０】
ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＦＷ：
Ｒ Ｇ Ｐ Ｍ
5'-GAG-CCT-GGC-GGT-TCA-GGT-CCA-CGA-GGT-CCA-ATG-GGT-CCC-CCT-GG-3'
ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＲＶ：
5'-CC-AGG-GGG-ACC-CAT-TGG-ACC-TCG-TGG-ACC-TGA-ACC-GCC-AGG-CTC-3'
ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＦＷ：
Ｒ Ｇ Ｐ Ｍ
5'-GGA-GCT-CCT-GGC-CAG-CGA-GGT-CCA-ATG-GGT-CTG-CCC-GGT-GAG-AG-3'
ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＲＶ：
5'-CT-CTC-ACC-GGG-CAG-ACC-CAT-TGG-ACC-TCG-CTG-GCC-AGG-AGC-TCC-3'
注意：変異部位に下線が引かれている；Ｐｒｏ残基の元のＣがＡに変換されてＮｃｏＩ部位の生成を避ける。
【００９１】
３プライマーの組合せが用いられた：
１．5'ＡＯＸ１プライマーとＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＲＶ
２．ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＦＷとＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＲＶ
３．ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＦＷと3'ＡＯＸ１
【００９２】
反応物は、1.25Ｕ Ｐｗｏポリメラーゼ（ユーロゲンテック（Eurogentec))、各プライマー50ｐｍｏｌ、0.2 ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ファルマシア）、１×Ｐｗｏ緩衝液（ユーロゲンテック）およびｐＣＯＬ−１Ａ１−１テンプレートＤＮＡ15ｎｇを全反応体積50μｌ中に含んだ。使用したＰＣＲ装置は、GeneAmp 9700（パーキンエルマー）であった。94℃で５分間の最初のインキュベーション後、94℃で30秒間、60℃で30秒間および72℃で45秒間からなるサイクルを18回行った。最終伸長は72℃で10分間行った。ＰＣＲ反応のアガロース電気泳動は予想された大きさ（それぞれ0.5 、0.3 および0.7 ｋｂ）の産物であることがわかった。バンドをゲルから切り出して精製した。次に、単離した断片をオーバーラップ伸長ＰＣＲに供した。各断片約0.1 ｐｍｏｌを共に混合した。5'ＡＯＸ１ 50ｐｍｏｌおよび3'ＡＯＸ１プライマー、ならびにＰｗｏポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよび上記の緩衝液を加えた。72℃での伸長を45秒間の代りに90秒間実施した以外、サイクル条件は上記と同じである。アガロースゲル電気泳動により、予期された1.5 ｋｂ産物であることがわかった。ＰＣＲ反応の残りはＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精製した。精製されたＤＮＡを次にＢａｍＨＩ／ＡｐａＩで消化し、その後、得られた1.0 ｋｂ断片をゲルから精製した。ＡｐａＩ部位のｄｃｍメチル化を除去するために、大腸菌株ＪＭ１１０をｐＣＯＬ１Ａ１−１、ｐＣＯＬ１Ａ１−２およびｐＣＯＬ１Ａ１−３で形質転換した。ＤＮＡ単離後、プラスミドをＢａｍＨＩ／ＡｐａＩで消化した。それぞれ7.9 、8.8 および9.5 ｋｂの得られたベクター断片をアガロースゲルから精製し、ＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ消化ＰＣＲ生成物に連結した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅをこれらの連結反応物で形質転換し、ＰＣＲで証明された挿入物を含有するクローンのプラスミドＤＮＡを単離し、自動化配列決定法により証明した。こうして作られた変異体プラスミドｐＣＯＬ１Ａ１−１* 、ｐＣＯＬＩＡ１−２* およびｐＣＯＬＩＡ１−３* をＳａｌＩで消化してピヒア・パストリス株ＧＳ１１５を形質転換するために用いた。小規模および発酵糟規模の発現を、ＣＯＬＩＡ１−１で記載したように行った。
【００９３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、予期された完全長サイズの僅かに一つの主要バンドがｐＣＯＬ１Ａ１−１* ならびにｐＣＯＬＩＡ１−２* およびｐＣＯＬＩＡ１−３* について形成された。
【００９４】
合成遺伝子の構築と発現
極性ゼラチン（Ｐ単量体）をコードする合成遺伝子は、オーラーラップ伸長ＰＣＲにより構築した。理論上の分子量及び等電点は、それぞれ9.1 ｋＤ及び4.9
であった。該遺伝子は、ピヒア・パストリスの高度に発現された遺伝子のコドン利用を有するように設計された（Sreekrishna, K. and Kropp, K. E. (1996) Pichia pastoris, Wolf, K. (Ed), Nonconventional yeasts in biotechnology. A handbook, Springer-Verlag, pp. 6/203-6/253 ）。二つの別々のＰＣＲ反応を下記のオリゴヌクレオチドを用いて実施した。
【００９５】
ＯＶＬ−ＰＡ−ＦＷ １ｐｍｏｌ、ＯＶＬ−ＰＡ−ＲＶ １ｐｍｏｌ、ＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ 50ｐｍｏｌおよびＨＬＰ−ＰＡ−ＲＶ 50ｐｍｏｌ。
ＯＶＬ−ＰＢ−ＦＷ １ｐｍｏｌ、ＯＶＬ−ＰＢ−ＲＶ １ｐｍｏｌ、ＨＬＰ−ＰＢ−ＦＷ 50ｐｍｏｌおよびＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶ 50ｐｍｏｌ。
【００９６】
オリゴヌクレオチド配列は次の通りである。
ＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ：5'-GCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGC-3'
ＯＶＡＬ−ＰＡ−ＦＷ：
5'-GCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCCAGGATCTCCTGGTAACCAAGGACAGCCCGGTAACAAGGGTTCTCCAGGTAATCCA-3'
ＯＶＬ−ＰＡ−ＲＶ：
5'-TGAGAACCTTGTGGACCGTTGGAACCTGGCTCACCAGGTTGTCCGTTCTGACCAGGTTGACCAGGTTGACCTTCGTTTCCTGGTTGACCTGGATTACCTGGAGAACCCTT-3'
ＨＬＰ−ＰＡ−ＲＶ：5'-TGAGAACCTTGTGGACCGTTGGAA-3'
ＨＬＰ−ＰＢ−ＦＷ：5'-TTCCAACGGTCCACAAGGTTCTCA-3'
ＯＶＬ−ＰＢ−ＦＷ：
5'-TTCCAACGGTCCACAAGGTTCTCAGGGTAACCCTGGAAAGAATGGTCAACCTGGATCCCCAGGTTCACAAGGCTCTCCAGGTAACCAAGGTTCCCCTGGTCAGCCAGGTAACCCT-3'
ＯＶＬ−ＰＢ−ＲＶ：
5'-GCGTCTGCAGTACGAATTCTATTAGCCACCGGCTGGACCCTGGTTTCCTGGTTTACCTTGTTCACCTGGTTGACCAGGGTTACCTGGCTGACCAGGGGAACCTTGGTT-3'
ＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶ：5'-GCGTCTGCAGTACGAATTCTATTAGC-3'
【００９７】
ＰＣＲ反応物50μｌは、0.2 ｍＭ ｄＮＴＰ'ｓ（ファルマシア）、１×Ｐｗｏ緩衝液（ユーロゲンテック）および1.25Ｕ Ｐｗｏポリメラーゼ（ユーロゲンテック）を含んでいた。反応１は、94℃で15秒間および72℃で15秒間からなる18サイクルを伴なった。反応２はタッチダウンＰＣＲを伴なうことで、各サイクルは94℃で15秒間、アニーリング温度で15秒間および72℃で15秒間からなった。アニーリング温度は最初の５サイクルで72℃から68℃まで低下させ、その後、67℃でのアニーリング温度でさらに20サイクルを行った。
【００９８】
ＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離した。各断片0.3 ｐｍｏｌと外側プライマーＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ50ｐｍｏｌおよびＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶをオーバーラップ伸長ＰＣＲに供した。94℃で15秒間、67℃で15秒間および72℃で15秒間からなる25サイクルを行った。得られた0.3 ｋｂ ＰＣＲ断片をＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、クローニングベクターｐＭＴＬ２３にクローニングした。遺伝子の配列を自動化ＤＮＡ配列決定により確認した。
【００９９】
Ｐテトラマー（Ｐ４；理論分子量36.8ｋＤ）を作るために、ベクターをＤｒａＩＩＩ／Ｖａｎ９１Ｉで消化することにより該断片を放出させた。別の反応において、ベクターをＶａｎ９１Ｉで消化し、脱リン酸化した。次に、ＤｒａＩＩＩ／Ｖａｎ９１Ｉ断片をこのＶａｎ９１Ｉ消化ベクターに挿入した。これによりＰダイマーを有するベクターを得た。このダイマーはＤｒａＩＩＩ／Ｖａｎ９１Ｉによる消化により放出させ、ダイマーを有するベクターのＶａｎ９１Ｉ部位中に再挿入して、Ｐテトラマー（Ｐ４）を得た。次に、Ｐ断片とＰ４断片をベクターｐＩＣ９のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。成熟（プロセシング後の）Ｐモノマーおよびテトラマーのコードされたアミノ酸配列は下記の通りである。
【０１００】
モノマー（Ｐ）：
１ GPPGEPGNPG SPGNQGQPGN KGSPGNPGQP GNEGQPGQPG QNGQPGEPGS NGPQGSQGNP
61 GKNGQPGSPG SQGSPGNQGS PGQPGNPGQP GEQGKPGNQG PAGG
テトラマー（Ｐ４）：
１ GPPGEPGNPG SPGNQGQPGN KGSPGNPGQP GNEGQPGQPG QNGQPGEPGS NGPQGSQGNP
61 GKNGQPGSPG SQGSPGNQGS PGQPGNPGQP GEQGKPGNQG PAGEPGNPGS PGNQGQPGNK
121 GSPGNPGQPG NEGQPGQPGQ NGQPGEPGSN GPQGSQGNPG KNGQPGSPGS QGSPGNQGSP
181 GQPGNPGQPG EQGKPGNQGP AGEPGNPGSP GNQGQPGNKG SPGNPGQPGN EGQPGQPGQN
241 GQPGEPGSNG PQGSQGNPGK NGQPGSPGSQ GSPGNQGSPG QPGNPGQPGE QGKPGNQGPA
301 GEPGNPGSPG NQGQPGNKGS PGNPGQPGNE GQPGQPGQNG QPGEPGSNGP QGSQGNPGKN
361 GQPGSPGSQG SPGNQGSPGQ PGNPGQPGEQ GKPGNQGPAG G
【０１０１】
ＰおよびＰ４ゼラチンの起こりうるＣ末端分解を防止するために、ＰとＰ４と同一の配列を有するが、Ｇｌｙ残基の代りにＣ末端Ｐｒｏを有する構築物を作った（それぞれをＰＣとＰ４Ｃとした）。
【０１０２】
ベクターをＳａｌＩによる消化により直鎖とし、これを用いてピヒア・パストリス株ＧＳ１１５を形質転換した。発酵を、ＣＯＬ１Ａ１について記載したように（すなわちｐＨ３およびカザミノ酸の存在下での成長）行った。培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、予想されたＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質バンドを明らかにした。収率は１グラム／Ｌ発酵培地と算出された。生産物を上天然のゼラチンについて上記したようにアセトン分画（すなわち40％アセトンでの内因性タンパク質の除去と80％アセトンでのゼラチンの析出）により精製することができた。
【０１０３】
発酵糟中のゼラチンの発現／産生
供給バッチ発酵をインビトロゲン社のピヒア発酵法指針にしたがって行った。細胞を、最初の実験段階で１リットルの発酵糟（アップリコン）中で生育させて、タンパク質産生を最適化した。その後、コラーゲンのパイロット規模生産のために、細胞を20リットルまたは140 リットルの発酵糟（バイオベンチ２０、バイオパイロット１４０、アップリコン（Aplikon)）で生育させた。作動体積はそれぞれ１リットル、15リットルおよび100 リットルであった。AD1020コントローラ（アップリコン）を用いて発酵パラメータをモニターし、調節した。プログラムBioXpert（アップリコン）をデータ保存のために用いた。溶解酸素レベルを、酸素電極（１リットル発酵についてはインゴールド（Ingold）、大規模発酵についてメトラー・トレド（Mettler Toledo))を用いて発酵糟中でモニターした。攪拌（500 〜1000ｒｐｍ）と通気（１〜２ｖｖｍ、すなわち１〜２ＬＬ-1／分）を手動で調整して溶解酸素濃度を20％以上に保った。ｐＨをｐＨ電極（ブロードリージェームス（Broadly James)社）で測定し、水酸化アンモニウム（25％）の添加によりｐＨ3.0 またはｐＨ5.0 に自動的に維持し、該水酸化アンモニウムは微生物成長のための窒素源としても機能した。消泡電極を用いて過剰の発泡を防止した。必要であれば、消泡Strutol J673（チル＆ザイラッハー（Schill & Seilacher）、ハンブルグ、ドイツ）を用いた。微生物の成長を細胞乾燥重量の測定によりモニターした。検量線を作成することで細胞湿重量を細胞乾燥重量に換算することができた。細胞湿重量は、試料２ｍｌを５分間15,000ｒｐｍで遠心分離後、上清を除去することにより測定した。細胞乾燥重量は、細胞 200μｌを予備乾燥フィルター（0.45μｍメンブレン、シュライヒナー＆シェル、ダッセル、ドイツ）に加え、脱イオン水25ｍｌで洗浄し、乾燥（例えば電子レンジで1000Ｗ、15分間）した後に測定した。細胞乾燥重量は、細胞湿重量の約１／３であった。前培養はＭＧＹの初期発酵体積の合計10％を含有するフラスコ中でＭＧＹプレート上のコロニーから開始した。培地の体積は全フラスコ体積の20％以下であった。細胞を30℃、200 ｒｐｍでロータリーシェーカー（ギャレンカンプ）で24〜60時間生育させた。
【０１０４】
発酵培地
発酵糟中の発酵基礎塩培地は、１リットルあたり、リン酸26.7ｍｌ（85％）、硫酸カルシウム0.93ｇ、硫酸カリウム18.2ｇ、硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ 14.9ｇ、水酸化カリウム4.13ｇおよびグリセロール40.0ｇを含んでいた。ＰＴＭ1 微量塩4.3 ｍｌの量を発酵基礎塩培地１リットルあたり加えた。ＰＴＭ1 微量塩は、１リットルあたり、塩化第二銅・２Ｈ2 Ｏ 4.5ｇ、ヨウ化カリウム0.09ｇ、塩化マンガン・４Ｈ2 Ｏ 3.5ｇ、モリブデン酸ナトリウム・２Ｈ2 Ｏ 0.2ｇ、ホウ酸0.02ｇ、硫酸コバルト・７Ｈ2 Ｏ1.08ｇ、硫酸亜鉛・７Ｈ2 Ｏ42.3ｇ、硫酸鉄・７Ｈ2 Ｏ65.0ｇ、ビオチン 0.2ｇおよび硫酸5.0 ｍｌを含んでいた。微量塩はフィルター濾過（ポアサイズ0.22μｍ、コスター、米国）で除菌した。カザミノ酸（カゼイン加水分解物、メルク）を別に滅菌し、マウスのコラーゲンタイプＩが発現されたときに（ＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−１* 、ＣＯＬ１Ａ１−２、ＣＯＬ１Ａ１−２* 、ＣＯＬ１Ａ１−３、ＣＯＬ１Ａ１−３* ）、５ｇ／ｌの量で発酵培地に加えた。発酵中、50時間後に、５ｇ／ｌ滅菌カザミノ酸をさらに発酵培地に加えた。
【０１０５】
ｍｕｔ+ 培養物の発酵
発酵糟を発酵基本塩培地とともに滅菌した。20リットルと120 リットルの発酵糟をそれぞれ５〜7.5 リットルと50リットルの容量の初期培地とともにその場で滅菌した。１リットル発酵糟を培地500 ｍｌとともにオートクレーブ中で滅菌した。滅菌後、温度を30℃に設定し、攪拌と通気をそれぞれ500 ｒｐｍと１ｖｖｍ（すなわ、１ＬＬ-1／分）に設定した。ｐＨを25％水酸化アンモニウムで設定点（通常ｐＨ5.0 ）に調整した。微量塩を培地に無菌的に加えた。発酵糟にＭＧＹの前培養培地の初期発酵体積の10％を接種した。バッチ培養物を、グリセロールが完全に消費されるまで（18〜24時間）生育させた。これは、溶解酸素濃度の100 ％までの増加により示された。細胞乾燥重量はこの段階で25〜35ｇ／ｌであった。その後、グリセロール供給バッチ相を、グリセロール１リットルあたりＰＴＭ1 微量塩を12ｍｌ含む50％（ｖ／ｖ）グリセロールの供給を始めることにより開始した。グリセロール供給は、18ｍｌ／時間／１リットル初期発酵体積に設定した。グリセロール供給は４時間、または長期ラグ相の場合は一晩実施した。グリセロールバッチ相中、発酵培地のｐＨを3.0 まで低下させた。タンパク質誘導相は、メタノール１リットルあたりＰＴＭ1 微量塩を12ｍｌ含む100 ％メタノール供給を始めることにより開始した。供給速度は３ｍｌ／時間／リットルの初期発酵糟体積に設定した。最初の数時間、メタノールは発酵糟中に蓄積した。２〜４時間後、溶解酸素量はメタノールへの順応のために減少した。迅速溶解酸素の上昇の場合、メタノール供給を、６ｍｌ／時間／リットルの初期発酵糟体積まで増加させた。炭素源が制限されている場合、炭素源を封じることにより培養の代謝速度が減少して、溶解酸素濃度が高まる。さらに２時間後、メタノール速度は９ｍｌ／時間／リットルの初期発酵糟体積まで増加させた。この供給速度は残りの培養中にわたって維持した。培養は、70〜130 時間のメタノール供給バッチ相後に止めた。培養中、試料２ｍｌを取り、遠心し（５分間、15,000ｒｐｍ）、上清を−20℃で保存した。
【０１０６】
ゼラチンおよび全タンパク質の濃度を、試料（0.22μｍ）の濾過およびその後のアセトン分画（40体積％アセトン後に60〜80体積％アセトン）後に測定した。メルクのゼラチンをリファレンスとして用いて、ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアス（Pierce))を慣用的に用いた。アミノ酸組成のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析にしたがって、非コラーゲンタンパク質は40％アセトンで析出した一方、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ１Ａ１断片は60〜80％で析出した。60％アセトンで、好ましくは高分子量のゼラチン成分が析出した。増加アセトン濃度で、上記の主要な分解生成物の増加する析出が得られた。80％で、すべての主要な分解生成物が（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりチェックされたように）析出物中に回収された。小ペプチドと他の低分子量不純物が80％アセトンでは溶液中にとどまった。
【０１０７】
１リットルの培養の場合、培養の最後に、細胞を遠心分離すること（10,000ｒｐｍ、30分、４℃）により除去した。20リットルの培養の場合は、マイクロフィルター濾過により細胞を除去した。細胞ブロスを、最初に孔径が0.50μｍのポリエーテルスルホンメンブレンを含むマイクロ濾過モジュール（X-Flow社のRX 300濾過モジュールに合わせたX-Flow社のタイプMF 05 M2）に適用した。その後、上清を孔径が0.2 μｍのポリエーテルスルホンメンブレンを含む類似のタイプのマイクロ濾過モジュール（同様にX-Flow社のタイプMF 02 M1）に適用した。120 リットルの発酵の場合、細胞を、孔径が0.2 μｍのポリエーテルスルホンメンブレンを有するパイロットプラント規模のマイクロ濾過ユニット（R-10メンブレンモジュールに合わせたX-Flow社のタイプMF 02 M1）により除去した。これらの濾過ユニットは、単に例として示しただけである。細胞を除去するためにどのような適当なマイクロ濾過システムも利用できることを理解されたい。任意に、細胞およびデブリ（debris）の塊を遠心分離により除去し、上清および細胞を洗浄するために用いられた培地のみをマイクロ濾過ユニットに適用した。または、発酵ブロスから産物を回収し、産生したゼラチンを特異的に結合させる樹脂を用いる、適切な膨張層クロマトグラフィーシステムに該発酵ブロスを適用することにより産物を細胞から分離することができる。我々は、ファルマシアのＳＰセファロースＸＬストリームラインを膨張層モード中のカチオン交換体（ｐＨ３〜４）としてうまく利用することができた。
【０１０８】
Ｍｕｔs 培養物の発酵
グリセロールバッチおよび供給バッチ相を、ｍｕｔ+ 培養物について記載されたように行った。Ｍｕｔs 培養物はメタノールを十分には代謝しないので、それらの酸素消費は低い。したがって、溶解酸素濃度の上昇は、培養物を評価するのに用いることはできない。メタノール供給は、0.3 ％を超えない培地中の過剰のメタノールを保持するために調整した。メタノール供給は、１ｍｌ／ｈ／リットルの初期発酵糟体積で始められ、ゆっくりと３ｍｌ／ｈ／リットルまで高めた。Ｍｕｔs 培養物を用いるときに必要とされる全発酵時間は、Ｍｕｔs 培養物が用いられたときよりも比較的長い。
【０１０９】
コラーゲン／ゼラチンの調製規模での調製的精製
マイクロ濾過工程後、二つの代用精製方法にしたがった（下記のＩ、ＩＩを参照のこと）。
【０１１０】
Ｉ．析出差（differential precipitation）による精製
アセトン分画
コラーゲンタイプＩおよびタイプＩＩＩを、40〜80％アセトン分画により上清のバッチ500 ｍｌ〜２リットルから部分精製した。40％アセトンで、（ピヒア由来の）非コラーゲンタンパク質が析出した一方、60〜80％アセトンで、コラーゲンならびにコラーゲン分解生成物が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアミノ酸組成物の分析により示されたように、析出した。60％アセトンで、好ましくは高分子量のゼラチン成分が析出した。増加アセトン濃度で、上記の主要な分解生成物の増加する析出が得られた。80％で、すべての主要な分解生成物が（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりチェックしたように）析出物中に回収された。小ペプチドと他の低分子量の不純物が80％アセトンでは溶液中にとどまった。アセトンを２〜４時間、−20℃で冷却した。40％の氷冷アセトン（ｖ／ｖ）をマグネテックスターラーによる４℃での攪拌下で発酵からの予備冷却した上清にゆっくりと加えた。上清を４℃で一晩攪拌した。析出したタンパク質と粒子を遠心分離により除去した（４℃、10,000ｒｐｍ、30分間）。ペレットを40％の氷冷アセトンに再懸濁し、再び遠心分離した。両方の40％アセトン上清フラクションを収集した。その後、上清を60〜80％アセトン（ｖ／ｖ）とし、一晩攪拌した。析出したタンパク質は遠心分離により収集した。ペレットを60〜80％アセトンに懸濁し、再び遠心分離した。ペレットを５ｍＭ酢酸／水酸化アンモニウム緩衝液、ｐＨ3.0 （緩衝液Ａ）の適切な量で20〜50ｇ／ｌタンパク質濃度まで溶解した。
【０１１１】
硫酸アンモニウム沈殿
次に、多糖類を60％飽和硫酸アンモニウムでのゼラチン／コラーゲンの析出により除去する。ここで多糖類は溶液中に残った。硫酸アンモニウムをゆっくりと４℃で60％飽和まで加えた。60分間の攪拌後、試料を遠心分離した（30分間、４℃、１0,000 ｒｐｍ）。そのペレットを60％硫酸アンモニウムに再懸濁し、再び遠心分離した。１％（ｗ／ｗ）を超える多糖類または糖が残っている場合、硫酸アンモニウムの不存在下でゼラチン／コラーゲンを完全に再溶解した後、上記の完全な硫酸アンモニウム析出法を繰り返した。最後に、ペレットを脱イオン水または緩衝液Ａに溶解し、タンパク質濃度を20〜50ｇ／ｌとした。試料のｐＨを3.0
に調整した。試料を緩衝液Ａに対する透析により脱塩した。該緩衝液は４時間毎に取替えた。排除分子量８ｋＤの再生セルロースの透析膜（Spectra Por （登録商標）、スペクトラム（Spektrum）社）を用いた。透析は、試料の電導度が十分に低い（典型的にはバックグランド上の20〜150 μＳ．ｃｍ-1）と判定されたときの２〜７日後に止めた。電導度は、１ｍＭおよび10ｍＭのＫＣｌ溶液（それぞれ140 および1400μＳ．ｃｍ-1）で検量したデジタル電導測定計（ラジオメーター）を用いて測定した。透析に変わるものとして、限外濾過および透析濾過を用いて試料を脱塩し、（任意に）濃縮した。適用可能であれば、生成物を次に高濃度のアセトンによる析出およびアセトンの蒸発により前乾燥し（任意）、最終的に凍結乾燥した。
【０１１２】
ＩＩ．陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
陽イオン交換樹脂は、ＳＰセファロースＸＬ（ファルマシア バイオテク）であったが、他の適当な樹脂も用いることができた。精製を、幾つかの規模で行った。よって、ＸＫ１６カラム（ファルマシア）の25ｍｌベッドを用いた。運転はＦＰＬＣ（ファルマシア）を用いて行った。ベッドの高さは12.5ｃｍであった。流速は典型的には１ｍｌ／分であった。中間規模では、100 ｍｌのベットを用いて、運転はエクタ・エクスプローラー統合ポンプ／プロセッサー／複数バルブ／複数検出器装置（ファルマシア）により調節した。パイロット規模では、インデックス１４０／２００カラム中の２リットルのベッドを用いた。ベッドの高さは少なくとも13ｃｍであった。運転はエクタ・エクスプローラーポンプ／プロセッサー装置（ファルマシア）または他のポンプシステムを用いて行った。流速は50〜100 ｍｌ／分以上であった。具体例として、下記の緩衝液系と溶出条件を用いた。緩衝液Ｘは５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ3.2)であり、緩衝液Ｙは１ＭのＮａＣｌを有する５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ3.0)であった。カラムを２〜５ベッド体積の緩衝液Ｘで平衡化した。目的タンパク質を、５〜10カラム体積分の０〜0.5 Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエントで溶出した。コラーゲンタイプＩＩＩのメインバンドを50〜100 ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。コラーゲンタイプＩのメインバンドを70ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、他のバンドは30〜150 ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、それらの理論的等電点と合致した。該カラムを１ベッド容積分の緩衝液Ｙで洗った。パイロット規模では、プールしたフラクションを脱塩し、例えば80％アセトンを加えることにより濃縮した後に凍結乾燥した。
【０１１３】
ゼラチン／コラーゲン生成物の特性決定
アミノ酸組成を、非常に低いｐＨおよび高温で、ペプチド結合をＨＣｌ媒介で完全に加水分解した後、アミノ酸を蛍光体で誘導体化し、かつＨＰＬＣにより決定した。
【０１１４】
純粋なコラーゲンから予測されたＧｌｙのパーセントは33％である。これは、産生組換えゼラチンの純度を評価する手段を提供する。ピヒア・パストリスの内因性分泌タンパク質中のＧｌｙのパーセントを補正するために、ｐＰＩＣ９のＭｕｔ+ 変異体の発酵上清のアミノ酸組成分析を行った。観測されたＧｌｙのパーセントは９％であった。試料の純度はここで下記式により推定することができる。
（Ｇｌｙ（％）−９）／（３３−９）＝（Ｇｌｙ（％）−９）／２４。
【０１１５】
試料のミリＱ水（MilliQ water）への溶解後、下記のアッセイを行った。
【０１１６】
タンパク質含量は、メルク社のゼラチンを参照として用いて、ピアス社のＢＣＡアッセイにより決定した。
【０１１７】
タンパク質Ｍｗ分布を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。
【０１１８】
糖含量はフェノールに基づくアッセイで決定した。試料200 μＬを５％（ｗ／ｗ）フェノール200 μＬと混合した。Vortexミキサーを用いて完全に混合した後、濃硫酸１ｍｌを加えた。混合後、試料を室温で10分間、続いて30℃で20分間インキュベートした。冷却後、試料の 485ｎｍの光吸収を測定した。デンプン、グルコースおよびスクロースを用いて検量線を作成した。
【０１１９】
ＤＮＡ含量は、モレキュラープローブ社の希釈ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ核酸「ゲル」染色（ＤＭＳＯ中10,000×濃度）のアリコートを試料と混合することによって決定した。完全なスペクトル分析後に、励起波長を 490ｎｍに選択し、発光波長を 523ｎｍに選択した。その検量は、内部標準としてわかっている量のＤＮＡをこの同じ混合物に加えることによった。こうして、検量線を作った。さらに、ＤＮＡ−分解酵素をその後に添加することにより、蛍光シグナルの完全な分解がもたらされることがチェックされた。
【０１２０】
ＲＮＡプラスＤＮＡ−含量を定量的に示すものを、次にＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩの代りにＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩ「ＲＮＡゲルステイン」を用いることにより得られた。完全なスペクトル分析後に、励起波長を490 ｎｍに選択し、発光波長を514 ｎｍに選択した。検量は、既知量のＲＮＡを加えることによった。得られた値が該試料の「ＲＮＡ」含量を示した。ＤＮＡの不存在下では、それは真のＲＮＡ含量に対応する。存在する場合、ＤＮＡに関連した蛍光はＲＮＡ値に影響を与えたかもしれないが、ＲＮＡｓｅの最終添加を用いて蛍光に対するＤＮＡおよびＲＮＡ由来の寄与を見分けた。
【０１２１】
試料の電導度を、デジタルラジオメーター電導計を用いて測定して、ミリＱ水中の１ｍＭ及び10ｍＭ ＫＣｌ溶液がそれぞれ 140μＳ．ｃｍ-1及び1400μＳ．ｃｍ-1の読みを与えることをチェックした。
【０１２２】
本発明により作られた幾つかのゼラチンバッチの純度に関するデータ（実施例）
ＧＡＴＯ４ａ（ｃｏｌ３ａｌ）
・約 2.4グラム
・精製
マイクロ濾過、析出（１×アセトン分画（40％／80％）、１×（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ）、試料をｐＨ４以下に保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐＨ3.0 に調整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製された緩衝液）に対する透析、凍結乾燥
・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：12.7ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：4.5 ％（ｗ／ｗ）
・ゼラチンは精製中分解しなかった（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：図１４）
【０１２３】
ＧＡＴＯ４ｂ（ｃｏｌ３ａｌ、ＧＡＴＯ４ａよりもさらに精製されたもの）
・約１グラム
・精製
繰返し（２×追加）硫酸アンモニウム析出後に、試料をｐＨ４以下に保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐＨ3.0 に調整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製された緩衝液）に対する透析、凍結乾燥
・ＤＮＡ：0.56ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：3.2 ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：0.94％（ｗ／ｗ）
・ゼラチンは精製中分解しなかった。
・10ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約180 μＳｃｍ-1
（緩衝液の比電導度約100 μＳｃｍ-1）
・凍結乾燥および試料の溶解後の比電導度：10ｇゼラチン／Ｌで180 μＳｃｍ-1、５ｇゼラチン／Ｌで100 μＳｃｍ-1
【０１２４】
ＧＡＴＯ５（ｃｏｌ１ａ１−１）
・約0.9 グラム
・精製
マイクロ濾過、析出（１×アセトン分画（40％／80％）、１×（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ）、試料をｐＨ４以下に保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐＨ3.0 に調整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製された緩衝液）に対する透析、凍結乾燥
・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：87ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：4.5 ％（ｗ／ｗ）
・ゼラチンは精製中分解しなかった（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：図15）
【０１２５】
ＧＡＴＯ６（膨張層陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたｃｏｌ３ａ１）
・約50ｍｇ
・精製
ｐＨ３〜3.5 での膨張層陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−セファロースＸＬ"ストリームライン"樹脂（ファルマシアバイオテック；カラムの副最適洗浄および0.3 ＭＮａＣｌの溶出後の糖含量：1.8 ％（ｗ／ｗ））、さらに一回の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 析出による糖の除去後、５ｍＭのＮＨ4 + ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液（ｐＨ約3.5 ）に対する透析、凍結乾燥
・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ、すでに（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 析出および透析）・ＲＮＡ：＜９ｐｐｍ（ｗ／ｗ、すでに（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 析出および透析）・全糖類：1.1 ％（ｗ／ｗ）
・0.55ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約94μＳｃｍ-1
（緩衝液の比電導度：約100 μＳｃｍ-1）
・ゼラチンは精製中分解しなかった
【０１２６】
ＧＡＴＯ７（ｃｏｌ１ａ１−２）
・400 ｍｇ
・精製
マイクロ濾過、析出（１×アセトン分画（40％／71.5％）、３×（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ）、アセトン沈殿による予備脱塩：１×71.5％、１×80％、ミリＱ水に対する透析、凍結乾燥
・ＤＮＡ：0.79ｐｐｍ
・ＲＮＡ：9.5 ｐｐｍ
・全糖類：0.7 ％（ｗ／ｗ）
・４ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約15.5μＳｃｍ-1
・ゼラチンは精製中分解しなかった
【０１２７】
ＧＡＴＯ８（ｃｏｌ３ａ１）
・約６ｍｇ
・精製
マイクロ濾過、希釈、20ｍＭクエン酸、ｐＨ3.5 で平衡化させた2.1 リットル層ＳＰセファロース−ＸＬ中の陽イオン交換クロマトグラフィー（ファルマシアバイオテック）および同緩衝液中の0.1 〜１ＭＮａＣｌのグラジエントによる0.15ＭＮａＣｌでの溶出、濃縮、80％アセトンによる部分的な脱塩、遠心、ミリＱ水への再溶解、ミリＱ水に対する透析および凍結乾燥
・ＤＮＡ：1.55ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：10.9ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：1.2 ％（ｗ／ｗ）
・透析後の7.5 ｇゼラチン／Ｌの比電導度約90μＳｃｍ-1
・ゼラチンは精製中分解しなかった
図16は精製の結果を示す。
【０１２８】
ＧＡＴＯ９（ｃｏｌ１ａ１−１）
・ 1.7ｇ
・精製：ＧＡＴＯ８を参照。陽イオン交換体から0.74Ｍ ＮａＣｌの１つの塩段階での溶出だけが異なる。
・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：1.3 ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：2.2 ％（ｗ／ｗ）
・透析後の12ｇゼラチン／Ｌの比電導度約70μＳｃｍ-1
・ゼラチンは精製中分解しなかった
【０１２９】
ＧＡＴＯ１０（ｃｏｌ１ａ１−２）ここで両ＭＧＰＲ配列はＲＧＰＭに変更した
・６ｇ
・精製：ＧＡＴＯ８を参照
・ＤＮＡ：0.04ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：２ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：２％（ｗ／ｗ）
・ゼラチンは精製中分解しなかった
・Ｎ末端アミノ酸配列はプロペプチドの不完全な除去のためにＮ末端伸長としてＧｌｕ−Ａｌａを有し、予想された通りであった。
その結果を図１８に示す。
【０１３０】
結論として、すべての試料のアミノ酸組成は理論的組成に合致した。外来タンパク質による不純物は非常に低かった。グリシンベースでは、ＧＡＴＯ４−ＧＡＴＯ８は不純物として１％未満の外来タンパク質を有している。ＧＡＴＯ９およびＧＡＴＯ１０は５％未満を有する。
【０１３１】
実施例１で挙げられた参考文献
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[12] Butkowsky R. J., Noelken, M. E. & Hudson, B. G. (1982) Estimation of the size of colagenous proteins by electrophoresis and gel chromatography. Meth. Enzymol. 82: 410-423。
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【０１３２】
［実施例２］（コントロール）
従来の標準タイプのゼラチンを有する臭化銀結晶の調製
核形成： 2.1ｇ／ｌ標準ゼラチン（ＰＢゼラチンズ社の標準的な脱イオン化ＩＡＧ骨ゼラチン、テッセンデルロー、ベルギー）および7.3 ｍＭ臭化カリウムを含有する反応溶液中35℃の温度で、そのｐＨを水酸化ナトリウムまたは硫酸により5.5 の値に調整する。一回の噴射添加により、144 ｍＭ硝酸銀の水溶液を10秒間一定の速度で、激しい攪拌下、加える。硝酸銀の添加後、反応混合物中のゼラチン濃度は2.0 ｇ／ｌとなり、臭素化物濃度は１ｍＭとなった。
【０１３３】
成熟：核形成後、容器の内容物を成熟容器に移し、温度を徐々に75℃まで上げて、3.4 Ｍ臭化カリウム溶液を加えて臭化物濃度を15ｍｍｏｌ／ｌに上げる。成熟を56分間続け、その後に標準的な脱イオン化ゼラチンを５ｇ／ｌの濃度まで加え；58分後に、メチルフェニルテトラゾール溶液を加えて冷却することによりオストワルド成熟を強く低下させる。この調製された乳剤試料を直接透過型電子顕微鏡ならびにそのレプリカにより分析した。
【０１３４】
結果： 表ＩＩに見られるように、平板状粒子が非常に低い率で形成される。
【０１３５】
［実施例３］（コントロール）
従来の加水分解ゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製
核形成： 反応混合物中のゼラチンを従来の加水分解ゼラチン試料（日本のニッタゼラチン社により脱イオン化されて供給されるもの）で置き換えた以外は実施例２と同じ条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形成を行う。
【０１３６】
成熟：成熟を実施例２で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１３７】
結果：平板状粒子の平均％が約40％であるものが表ＩＩに示されている。
【０１３８】
［実施例４］（コントロール）
酸化ゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製
核形成： 反応混合物中のゼラチンを従来の酸化ゼラチン試料（ベルギー、テッセンデルローのＰＢゼラチンズ社により供給されるもの）で置き換えた以外は実施例１と同じ条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形成を行う。
【０１３９】
成熟：成熟を実施例２で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１４０】
結果：平均アスペクト比が５：１の平板状粒子％が70％と高い、ｐＨ5.5 での酸化ゼラチンに対して表ＩＩに示されている。加水分解され標準のゼラチンによるよりも良好な結果はこのゼラチンの低いメチオニン含量によるものと説明がつく（11μｍｏｌ／ｇゼラチン対50〜60μｍｏｌ／ｇの従来のゼラチン）。
【０１４１】
［実施例５］（本発明）
発明の天然組換えゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製
核形成： 反応混合物中のゼラチンを発明の天然ＣＯＬ３Ａ１ゼラチン試料で置き換えた以外は実施例２と同じ条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形成を行う。
【０１４２】
成熟：成熟を実施例２で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１４３】
結果：平均アスペクト比が５：１、平板状粒子の％が85％を超える高さのものが表ＩＩに示されている。
【０１４４】
［実施例６］（コントロール）
異なるｐＨでの従来の標準ゼラチン（ベルギー、テッセンデルローのＰＢゼラチンズ社の標準的脱イオンＩＡＧ骨ゼラチン）を用いる臭化銀結晶の調製
核形成：核形成をｐＨ＝７の条件を適用する一方で他の条件を実施例２に維持することで行う。
【０１４５】
成熟：成熟を、ｐＨを核形成中と同じｐＨ＝７に保持する以外は実施例２で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１４６】
結果：アスペクト比が５を超える平板状粒子は、従来の市販ゼラチンでは表ＩＩに示されたように得られなかった。
【０１４７】
［実施例７］（コントロール）
異なるｐＨでの従来の標準ゼラチン（ニッタゼラチンズ、日本）を用いる臭化銀結晶の調製
核形成：核形成をｐＨ＝７の条件を適用する一方で他の条件を実施例２に維持することで行う。
【０１４８】
成熟：ｐＨを核形成中と同じｐＨ＝７に保持する以外、成熟を実施例２で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１４９】
結果：５％程度の平板状粒子の非常に低い％が表ＩＩで示されたように得られた。
【０１５０】
［実施例８］（本発明）
異なるｐＨでの発明の天然組換えゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製
核形成：核形成を異なるｐＨ条件、すなわちｐＨ＝７の条件を適用する一方で他の条件は実施例４に維持することで行う。
【０１５１】
成熟：ｐＨを核形成中と同じｐＨ＝７に保持する以外、成熟を実施例４で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１５２】
結果：表ＩＩに示されたように、非常に高い平板状粒子％（約80％、これは最新技術のゼラチンよりも明らかに高い）がこの条件で驚くべきことに見出されている。
【０１５３】
［実施例９］
結合力と平板状粒子形態との関係
ゼラチン45ｍｇを正確に計り取り、0.1 Ｍ硝酸カリウムを含有する0.1 Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）15ｇを加える。この溶液を水浴中、45℃で15分間置く。溶液を室温（23℃）まで冷却する。
（ゼラチンを含有する）このｐＨ7.0 のリン酸緩衝液溶液10ｍｌを23℃で0.5
ｍＭ硝酸銀100 μｌと混合する。「ｖＡｇ」と称されるこの溶液のポテンシャルをＡｇ／ＡｇＣｌ参照二重接点電極（Orion モデル90-02)に対するＡｇ電極（Orion モデル97-81)を用いて測定する。ゼラチンのない同じ緩衝液溶液も硝酸銀溶液と混合し、ポテンシャル「ｖＡｇ」を同一の方法で測定する。二つの測定されたポテンシャル間の違いを計算して、これを、Ａｇイオンに対するゼラチンの結合親和性である「デルタｖＡｇ」として表す。下記の表ＩＩは、ｐＨ5.5 およびｐＨ７について、試験されたペプタイザー、平板状粒子％およびゼラチン結合親和性「デルタＶＡｇ」を有し、ここでは平板状の基準はアスペクト比＞５として定義されている。
【０１５４】
【表２】
* 測定せず。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】ベクターｐＣＯＬ３Ａ１。
【図２】ｐＣＯＬ３Ａ１構築物コントロール用ＰＣＲプライマー。
【図３】予想されたＣＯＬ３Ａ１配列。Ｎ末端ＹはｐＰＩＣ９ベクターに由来する。配列の残りはラットのＣＯＬ３Ａ１に由来する。下線を付けた配列はＣＯＬ３Ａ１断片について得られたＮ末端配列に対応する。
【図４】ベクターｐＣＯＬ３ＡＩＫ。
【図５】ＣＯＬＩＡ１のクローニング用オリゴ配列。下の配列はアニーリング後のアダプター。
【図６】クローニング法。
【図７】ベクターｐＣＯＬ１Ａ１−１。
【図８】予想されたＣＯＬ１Ａ１−１配列。一本下線の配列はＣＯＬ１Ａ１断片について得られたＮ末端配列に対応する。二重下線はこの配列を分け合っている。両断片はＥＡによりＮ末端で延長する。
【図９】ベクターｐＣＯＬ１Ａ１−２。
【図１０】予想されたＣＯＬ１Ａ１−２配列。
【図１１】ベクターｐＣＯＬ１Ａ１−３。
【図１２】予想されたＣＯＬ１Ａ１−３* 配列。
【図１３】予想されたＣＯＬ１Ａ１−２配列中のＭＧＰＲ配列。一本下線の配列はＣＯＬ１Ａ１−１断片について得られたＮ末端配列に対応する。二重下線はＭＰＰＲ配列である。
【図１４】ＧＡＴＯ４のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。左から第二と第三のレーンは精製後のＧＡＴＯ４を示す。
【図１５】ＧＡＴＯ５のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。最も右のレーンにおいて、分子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。右から第二と第三のレーンは精製後のＧＡＴＯ５を示す。
【図１６】発現産物ｃｏｌ１Ａ１−２のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。
【図１７】ＭＧＰＲ配列がＲＧＰＭに変異された発現産物ｃｏｌ１Ａ１−１のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。
【図１８】ＭＧＰＲ配列がＲＧＰＭに変異された発現産物ｃｏｌ１Ａ１−２のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良された写真製品と、該製品の改良された生産方法に関する。特に、この改良は写真製品の成分の製造において組換えＤＮＡ技術を利用することによりなされた。この興味ある成分とはコラーゲンである。
【背景技術】
【０００２】
写真製品の製造過程は、多くのことが開示され、特許された複雑な操作である。一般的に言えば、印画紙やトリアセテート・セルロースフィルム等の写真製品を製造する方法は、ラミネート紙又は透明なポリマー支持体上部に幾つかの層でコーティングすることからなる。これらの層は、最も重要な成分として放射線感受性ハロゲン化銀の結晶を含み得る乳剤層又はこれらの感光性成分を持たない中間層として知られている。本発明は感光層それ自体を向上させ、かつ写真層の製造方法を向上させることに関する。
【０００３】
フィルムの製造方法においてゼラチンが使われる段階がいくつかある。ゼラチンの機能は各段階で異なるために各段階で必要とされる特性も異なり、コラーゲン様物質がそれぞれの特定の応用に合うように明確に適応させることが期待されることになる。
【０００４】
写真応用のためのハロゲン化銀乳剤の製造方法に多くの注目が集められている。ＡｇＸ核形成の過程およびその後の成熟過程に影響を与える、ハロゲン化銀の粒子構造の役割及び特徴に多くの注意が払われている。写真製品の乳剤層で最も重要な成分は、ハロゲン化銀粒子と普通呼ばれ、ヨウ化物を任意に含む放射線感受性臭化銀、放射線感受性塩化銀、または放射線感受性塩化臭化銀微結晶からなる。粒子の析出中にペプタイザーを導入して、制御できない凝集を避ける。さもなければ、その凝集は多くの欠点を示す。即ち、薄い中間物および高いアスペクト比の平板粒子乳剤の形成を制限して、その後の写真撮影に不利をもたらす。多様な形態のゼラチンはペプタイザーとして写真の製造方法で用いられてきた。高いアスペクト比を有する平板状粒子は、鮮明度の高さ、感度粒状性関係の向上、青色とマイナス青色（minus blue）との感度分離の増大、より速い現像能力およびより高い銀被覆力等の幾つかの写真上の利点を持つことがよく知られている（例えば、非特許文献１、特許文献１参照）。アスペクト比が高いだけではなく、粒子サイズ分布が狭い（これらは単分散あるいは均質拡散の要望として表される）平板状粒子を生産することも望まれている。
【０００５】
現在まで、工業的な方法に用いられるゼラチンは一般に、単に動物の骨及び皮からの導出により動物源から得られている。この物質の欠点は、不純物の存在と、その組成の性質が明確に定められていないため再現性がないことである。どのような成分が存在し、どのような量であるのかも明らかでない。さらに、最適活性に、どの成分が実際に必要とされるのかも不明である。写真製造方法の種々の段階で使用されるゼラチン組成のばらつきがあるため写真製造方法の再現性は疑わしい。
【０００６】
写真応用でのゼラチンの欠点は、長年にわたり詳細に取り組まれ、種々の特許出願の課題となってきた。これらの文献のほとんどは、修飾ゼラチンの特性に特別な改良を取り入れるために、動物源からの導出後の該修飾ゼラチンを改良する方法に取り組むことに向けられている。文献は、結晶の50％以上がアスペクト比８を越えることが望ましいと記載しているが、これによって青色の感度が高められるからである（特許文献２参照）。メチオニン含量が１グラムあたり30マイクロモル以下、好ましくは１グラムあたり５マイクロモル以下のゼラチンを使用して、台形、六角形および三角形の薄い平板状粒子を得ることが記載されている（特許文献３参照）。ゼラチン１グラムあたり30マイクロモル以下のメチオニンレベルを得るために酸化しておいた正常な骨由来のゼラチンが使用された。それよりも低いメチオニン含量は、析出条件中に広い範囲のｐＢｒを提供するものとして記載されている（特許文献４）。多くの刊行物がゼラチンのメチオニン含量を減少させる方法を包含している。アルカリ次亜塩素酸塩またはＨ2 Ｏ2 の酸化性試薬反応が記載されている（例えば、特許文献５、非特許文献２〜４参照）。1959年の初期でさえ、酸化が不純物を除去するための方法として示唆されていた。
【０００７】
組換え核酸技術を用いてコラーゲンおよびコラーゲン様タンパク質自体になされた多くの研究も存在する。しかし、コラーゲンと組合わせて組換えＤＮＡ技術を用いることおよび写真応用においてそれを適用することは意外なことに欠如している。組換えコラーゲンの領域で発表された文献のほとんどはコラーゲンをコードする配列の発現を必要とさえしない染色体核酸のＰＣＲ技術を用いる診断応用に向けられていた。染色体中の該配列の単なる存在がこれらの実例での診断にとっては十分である。コラーゲンをコードする配列の発現を実際に示すそうした文献のいずれもが、確かに高レベルの発現を必要としなかった。もしくは、発現が示されていても、完全な配列ではなく、むしろコード配列の単なる部分が発現された。しばしば、これらの部分的な配列は、必要とされるタンパク質材料の量が最小となるように抗体を得るために用いられている。さらに、抗体がいったん得られたら、該配列は医薬応用のためにはそれ以上は必要とされない。したがって、これらの例では、低い発現は実際的な問題ではない。また、コード配列の小さい部分の発現は、コード配列の高い程度の繰返しが原因となる発現問題を排除することが期待できる。
【０００８】
長い繰返し配列に関連する発現問題を克服する努力において、および新しいタイプのタンパク質、即ち合成タンパク質を設計する努力において合成核酸が設計されてきた。しかし、そのような合成ポリペプチドは生産に非常に費用がかかる。よって、写真フィルム生産の分野に必要とされるラージスケール生産を必要とする利用にそれを応用することはできない。
【０００９】
よって、先行技術の多くの応用は工業的規模での生産に必要とされる高い程度の発現を必要としないし、実際に所望の結果も提供してはいない。その結果、これらの種類の応用を考察する文献は天然コラーゲン配列または対応する長さと構造の配列の高い発現を得る問題を扱ってもいないし解決もしていない。
【００１０】
先行技術が天然の配列またはその部分を発現することを示唆する場合は一般に、一般用語が用いられ、さらに詳細を示すことなく一般的な形質転換法のハンドブックが照会される。生産用生物と発現程度は重要性が低く、注目されてこなかったために、提供されるどの具体例も大腸菌およびサッカロミセス・セレビシアエである。
【００１１】
コラーゲン様タンパク質の発現問題を扱う場合、これは修飾大腸菌または高等動物細胞および昆虫細胞のいずれかを用いることにより生じている。後者の生物は、翻訳後プロセッシングについても修飾される。しかし、後者の種類の細胞利用は、細胞、培地および産物の単離の費用が高いために、大規模生産ではひどく費用がかさむ。大腸菌の欠点は、それが所望の産物を分泌できないことである。さらに、発現される核酸配列の繰返しは形質転換バクテリアの不安定性をもたらし、その結果、コラーゲン様コード配列の発現量が低下する。よって、写真フィルム生産の分野で要求される大規模生産を必要とする応用においてそのような生産（微）生物を適用することができない。
【００１２】
多くの研究努力は、動物源に存在するコラーゲンの状態、すなわち工業的規模の写真応用で現在使用されているコラーゲンの状態である繊維原状または三重らせんを得るために必要とされる翻訳後修飾を行うことに向けられている。三重らせんを有するコラーゲンを達成するため、より具体的には繊維原コラーゲンを達成するためにコラーゲン様材料を発現させる場合、翻訳後プロセッシング装置それ自体を有するか、または翻訳後プロセシング酵素のコード配列を付加することにより該プロセッシング装置を有する宿主細胞を用いるべきであることは一般的に認められている。この形態のコラーゲンが応用に有用な形態であることが通常認められている。
【００１３】
組換えコラーゲンが写真応用に利用できることを確定的でないにせよ、先行技術が実際に示唆している場合、コラーゲン材料の特別な形態の関連性は、応用のために特異な要件に対して通常は取り上げられなかった。ある特許出願は、組換えコラーゲンを写真フィルム用に用いることを見過ごしてきた一方で、他の特許出願は写真応用を具体的にさえ示している。しかし、そうした文献の教示は明らかに他の問題に関するもので、写真応用およびその特定の要件には具体的には向けられていない。さらに分析するならば、さまざまな理由から、それら出願で提供される具体例のいずれも写真フィルムへの応用に実際に適することを示してはいない。これら特許出願は組換えコラーゲンを写真製造方法に応用しようとするときには実施不能であり、単なる自然の推論とみなされる。そのような文献の具体例を以下に示す。
【００１４】
特許文献６は、小さい繰返し配列を有する新規なポリマーの生産を記載し、具体的には絹等の繰返し基が開示されている。コラーゲンは繰返し単位を提供することのできる構造の一つとして示唆されている。「ＣＬＰの性質は高温で熱可逆的なゲル化を受け、ならびに免疫原性を有さないように設計される。らせんの高い安定性により、ＣＬＰから形成された繊維または膜が高い引張り強度をもたらすに違いない。これらの鎖性質により、硬質基体に塗布される場合に柔軟な被膜として働くに違いない水溶液中のハイドロゲルコロイドが生成されるべきである」ことが述べられている。次に、細胞レセプターのリガンドを有する柔軟な被膜材料が示唆されている。ＧＬＰＧＰＫＧＤＲＧＤＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰの配列がＣＬＰモノマーに加えられるべきであって、大腸菌から発現される構築物の一例が提供されている。この組成物に関して、「本組成物は傷の包帯としての利用を見出し、血管新生、目への適用、人工器官のマトリックス等を可能とする」と開示されている。ＣＬＰと他の繰返しの機能単位との組合せにより機能を組み合せることも示唆されている。しかし、使用される配列の具体例は提供されていない。
【００１５】
提供された唯一の具体例は、Ｎ末端およびＣ末端スペーサーを有する組換えで作られた合成ＣＬＰポリペプチド［［ＧＡＰ（ＧＰＰ）３］２［ＧＰＶＧＳＰ］ｎを示している。該スペーサーは長さがそれぞれ３３アミノ酸および２５アミノ酸である。例えば、長さが２４アミノ酸のポリマーの繰返しＧＰＰ部分は３３＋２５＋６アミノ酸により分けられる。このようにして、大腸菌は７６０アミノ酸、すなわちＭｗ63,800のＣＬＰタンパク質を見かけ上うまく発現する。細胞結合性ＣＬＰは同一の基本的な構造を有するが、ヘキサマーが上記の細胞配列により置き換えられるために、８１４アミノ酸のアミノ酸長およびＭｗ70,560をもたらす。発現される繰返しＧＸＹ部分は短く、長い非繰返し配列により分けられている。スペーサーＤＮＡは２個のシステイン残基および３個のメチオニン残基もコードする。
【００１６】
この挙げられた文献は、コラーゲンに関する導入部で「化学的に加水分解された天然コラーゲンを加熱と冷却により変成、再生させて、他の応用の中でも写真および医薬応用に用いられるゼラチンを作ることができる。この現象の原因となるコラーゲンの鎖性質は、三重らせんと呼ばれる高次構造を有する相互鎖凝集体を自発的に形成する能力である。」と述べている。よって、この先行技術の文献では、らせん構造が必要とされることが特に注目されている。その後の文章は写真応用については実際のところ何も示していなく、明らかに完全に他の事項に向けられている。その後の文章も大腸菌により得られた発現の実際の程度について何も示していない。繰返し構造は低い程度で存在しているので、写真応用に有用なように十分なコラーゲン様活性を保持することは起こりにくい。さらに、発現生成物中において、システインとメチオニン残基が実際に提供されるレベルで存在することにより、実際に写真応用にＡｇＸ乳剤中で使用するのを不適当なものとしている。さらに、ここで記載の繰返しの少ない配列の利用が大腸菌の向上レベルの発現を実際に提供したのかどうかが明らかでない。よって、写真応用の当業者らは写真応用におけるこの文献の教示を適用することを思いとどまるであろう。第一に、工業的な規模の生産が可能かどうか明らかでないからである。繰返し配列の不安定性を考慮すると、このことはありそうにもない。第二に、それは、写真応用のためのＡｇＸ乳剤における不所望なシステインおよびメチオニンの存在のためにありそうにもない。第三に、このことは、発現生成物のらせん構造がないためにありそうにもない。その影響は発現産物の安定性に対して、および現在のゼラチンの主要な構造的違いを鑑みて写真での利用可能性に対して完全には予測することはできない。
【００１７】
前述の特許出願と同一の発明者らは、プロリン含量が減少した繰返し三つ組残基（repetitive triads)を有する高分子量コラーゲン様タンパク質ポリマーを開示する（特許文献７参照）。該ポリマーは、高分子量および高頻度で単細胞微生物において産生が可能なものとして述べられている。これらは、「コラーゲン繰返しトリペプチドの独自性は、配列中の高い繰返し性と組成中のアミノ酸であるグリシン及びプロリンの配列を頻繁に利用する観点から組換え技術に対する挑戦である。グリシンおよびプロリンを高レベルで有するタンパク質をコードする遺伝子は、必要により自己相補的配列中の高レベルのヌクレオチドであるグアニジン及びシチジンからなる。例えば、遺伝子を合成するにしたがって、ストランドがループから外れ、一本鎖ＤＮＡが切除され、組換えが起こって遺伝子セグメントの損失と非能率的な転写および／または翻訳をもたらしうる実質的な機会が存在する。よって、コラーゲンの有利な性質を提供しながら、同時に高分子量コラーゲン様タンパク質の安定な発現を可能とする技術および組成物の開発に実質的な興味がある。」ことを示している。さらに、「該ポリマーは、らせんを提供し、コラーゲンのように変成と再生が可能であり、ゲルを形成するなどの点でさらに特性付けられよう」と述べられている。分子量30〜150 ｋＤが示唆され、グリシン間のアミノ酸の数の少なくとも45％がプロリンであり、三つ組残基の少なくとも80重量％が第一のアミノ酸としてグリシンを有し、三つ組残基の数の少なくとも40％は少なくとも一つのプロリンを有する。その具体例は、繰返しＧＸＯをコードする配列およびＮ末端とＣ末端スペーサー配列の３タイプの使用を示している。前記特許出願と同じスペーサー配列が用いられた。繰返し配列の構造は［［ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ］２（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰ）２４（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）２］２＝［［Ｃ］２［Ａ］２４［Ｃ］２］２であった。作られたポリペプチドの長さは、Ｍｗ46.409ダルトンの 561アミノ酸であった。別の実施例において、繰り返し配列は、［［ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ］２（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰ）１２（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）２］５＝［［Ｃ］２［Ａ］１２［Ｃ］２］５であった。作られたポリペプチドの長さは、Ｍｗ64.094ダルトンの777 アミノ酸であり、100ｋＤの観察されたタンパク質バンドを有した。第三の具体例において、その構造は［［ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ］２（ＧＡＰＧＰＡＧＰＰＧＳＲＤＰＧＰＰ）１２（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）２］４＝［［Ｃ］２［ＡＢ］１２［Ｃ］２］４であった。その具体例は1065アミノ酸およびＭｗ91,966を有し、 135ｋＤに見えるタンパク質バンドを有した。明らかに小さいバージョンも28ｋＤ、64ｋＤおよび98ｋＤのタンパク質バンド重量を有して作られた。発現に関して、提供される唯一の詳細は、抗血清を用いるウエスタンブロットによる検出が実施され、全長ポリマーの発現が遺伝子サイズとともに減少する一方で、全長ｍＲＮＡの合成は等しいレベルにあったことである。二つの異なる繰返し単位を有するポリマーのもう一つのグループは、作られた［［Ｃ］２［ＤＢ］１２［Ｃ］２］４、［［Ｃ］２［ＤＢ］６［Ｃ］２］４および［［Ｃ］２［Ｄ］２４［Ｃ］２］４であり、ここでＢとＣは上記の通りであり、Ｄ＝ＧＡＱＧＰＡＧＰＧである。これらの３つのタンパク質はそれぞれ、1065アミノ酸およびＭｗ91,533Ｄ、 633アミノ酸およびＭｗ55,228Ｄ、1065アミノ酸およびＭｗ85,386Ｄを有し、140 ｋＤに見えるタンパク質バンドを有した。これらの例のうち、産物の特性に関する唯一の情報はナンバー６について提供されている。この産物は非常に水溶性である。室温以上では、８％を超えるその水溶液は粘性があるが、流動性があり０℃に冷却すると固体のゲルを形成する。28℃以上の加熱で、ゲルは濃厚な溶液を形成する。液体とゲルとの熱的可逆性変移がこうして示される。最終的な具体例は、同一のスペーサーと1077アミノ酸およびＭｗ91.266Ｄを有する構造（ＧＡＰＳＱＧＡＰＧＬＱ）６８に関した。そのようなポリペプチドの利用に関して、これらの発明者らの前に挙げた出願以上のことは何も述べられていない。明らかに、繰返しＧＸＯ部分のブロックコポリマー構造を変えることにより、さらに長い繰返し配列の発現が起こることは可能となった。しかし、そのようなタンパク質が如何に効率的に発現されるかは明らかでない。さらにまた、繰返しによる発現の問題は解決されているものとしては示されていない。工業的規模の発現が達成できたことには疑問がある。具体的に写真応用に関する教示は提供されていない。特に、すべての具体例は写真応用で望まれないシステインとメチオニンを有するスペーサーを利用する。よって、写真応用の当業者はこの文献の教示を写真応用に適用することを思いとどまったであろう。
【００１８】
また、ゼラチンに性質の類似する組換え材料を作ることが望ましいことが論じられている（特許文献８参照）。その利点は、再現性の問題を解決するさらに均質な製品およびその化学的機能を改良する機会であろう。その考えはオリゴペプチドをゼラチン代用物として作ることである。選択された微生物は大腸菌であり、大腸菌に共通するグリコシル化等の翻訳後修飾がないことは問題ではないことが述べられている。他の宿主が可能であることが述べられている。しかし、そうした可能な宿主の具体例は示されていない。適用される核酸配列は、選択を起こすためのＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔコドンに結合させた（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎのゼラチンペプチドをコードする配列を有さなければならない。具体的に挙げられた配列はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔをコードする。当該発明者による後の論文で、発現度は実際にどのような種類の工業的な応用にも不十分であることが実際にわかったことが明らかとなった。さらに、作られたアミノ酸の回収方法は複雑であった。大腸菌は上記の宿主細胞であり、実際のところ、工業的な規模での生産に興味のある当業者のために上記で既に紹介された欠点、すなわち分泌の欠如、繰返し配列の不安定性、よって低い発現度を、事実として明らかに示していた。最終的に、この先行技術において提案されたコラーゲンの写真フィルムへの応用に関して実際には何も示されなかった。よって、そのような構造的に異なる材料の予想できない結果のために当業者はこの文献の教示を写真応用に適用することを思いとどまったであろう。
【００１９】
最後に、具体的に改良されたコラーゲン様ポリペプチドおよび写真応用目的のためのその利用に関する1996年にイーストマンコダックに交付された米国特許は、銀結合力が50ｍＶ以下のコラーゲン様ペプタイザーが高度の薄い平板状粒子を導きうることを記載している（特許文献９参照）。この文献はこれを２５アミノ酸の長さを有する多くの合成ポリペプチドを示している。この文献はコラーゲン様構造が組換え技術により作られたことも示している。この組換えポリペプチドは単に４つの異なるアミノ酸からなるブロックコポリマー構造の合成ポリペプチドである。実際の発現の詳細はこの組換えポリペプチドには提供されていなく、標準的な分子生物学生産方法およびサッカロミセス・セレビシアエの発現宿主としての利用が単に言及されているだけである。その分子量は約26ｋＤａである。よって、それと同じ日およびそれ以降の他の文献に詳細に示された発現の問題に親しい分子生物学者がそうした生産に真摯に取り組んだかどうかは疑問がある。さらに、組換えで生産された産物の結合力に関して詳細が提供されていないので、写真応用の当業者が写真製品のためにハロゲン化銀乳剤にこの製品を用いることを真摯に考えるか、もしくはそれが、開示された短い合成ポリペプチドの特性を示すことを真摯に期待するかどうも疑問がある。また、当文献は、ヒスチジンおよびメチオニンを特定の部位、つまり下記式のＸａａに有する開示された特定のポリペプチドが高い結合力を示し、非平板状粒子形成を示すことを示唆している。該化合物の式は、ＧｌｙＰｒｏＸａａ１ＧｌｙＬｅｕＸａａ２ＧｌｙＰｒｏＡｒｇＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｙＡｌａＳｅｒＧｌｙＡｌａＰｒｏＧｌｙＰｈｅＧｌｎＧｌｙである。イーストマンコダックにより研究された化合物の詳細を提供する表を分析すると、高い結合力を有する化合物は全て、２５アミノ酸毎に少なくとも一つの還元アミノ酸（＝ヒスチジンまたはメチオニン）を有することでポリペプチド１グラムあたりのメチオニン含量が 400マイクロモルを超えることとなる。そのような化合物は、写真応用の核形成／成長ＡｇＸ−乳剤プロセスに有用ではないであろう。低い結合力と平板状粒子形成に利するものとして示されている合成化合物は、還元アミノ酸のＭｅｔもＨｉｓも有さない。多くの他の米国特許が関連する主題でイーストマンコダックに交付されている。これらの特許（特許文献１０、１１参照）は、平板状粒子形成のために有用であると主張された他の合成断片を明らかにしたが、同じ単一の組換え産物の実例が記載されているので、これらの特許は組換えコラーゲン発現およびＡｇＥ乳剤を用いた写真応用への組換えコラーゲンの利用に対して何の新しいことも提供していない。
【００２０】
イーストマンコダックのこれらの記載から、サッカロミセス・セレビシアエに存在し、示された特定の配列の発現は実際のところ非常に低かったと推論することもできる。20リットルの培養物を用いて、単に約600 ｍｇの生成物を単離することができただけであった。しかし、この記載におけるこの点には何の注意も払われていない。実際、これらの記載から推論できる情報は当業者がこのシステムをコラーゲンを作るために用いることを思いとどまったことであろう。既に扱ったように、この低い発現度は転写および／または翻訳される配列の繰返し、および／またはプロテアーゼの存在によるものであろう。特に、非らせんコラーゲンの開口構造のために、非らせんコラーゲン発現産物はプロテアーゼの攻撃を著しく受け易い。
【００２１】
【非特許文献１】Research Disclosure Vol. 225 Jan. 1983, Item 22534
【非特許文献２】J. Phot. Sci., 40, 230-230(Nippi)
【非特許文献３】J. Photo. Sci., 37, 14-18(AGFA)
【非特許文献４】J. Imag. Sci., 33, 13-17
【特許文献１】欧州特許第０，６１０，７９６Ａ号
【特許文献２】米国特許第４，４３９，５２０ 号
【特許文献３】米国特許第４，７１３，３２０ 号
【特許文献４】米国特許第４，９１４，０１４ 号
【特許文献５】欧州特許第５５８，４１０号
【特許文献６】国際特許第９０/０５１７７ 号
【特許文献７】国際特許第９３/１０１５４ 号
【特許文献８】フランス特許第２６８５３４７ 号
【特許文献９】米国特許第５，５８０，７１２ 号
【特許文献１０】米国特許第５，５８０，７１２ 号
【特許文献１１】米国特許第５，６７０，６１６ 号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、組換えＤＮＡ技術の利用に向けられることで、今回最終的に大量の実質的に純粋なコラーゲン材料の生産を可能として上記の困難性を克服した。組換えコラーゲン産生方法を実行して、高価な培地、発現宿主または非分泌発現宿主を必要とせずに高レベルの発現を初めて提供する。さらに、現在までゼラチンを適用すべき写真製品の製造方法の特定の各段階での最適使用のために選択されるか、および／または適合させたコラーゲンを作ることが今回可能となった。それによりさらに向上を可能とする。また、改良ＡｇＸ乳剤生産方法が現在可能であり生産費用の減少を導く。
本発明者らは、より均一な写真用ＡｇＸ乳剤材料を得ることに興味を持ち、工業的写真紙およびフィルム生産方法で現在用いられている動物源由来のコラーゲンに匹敵するコラーゲンを作る可能性を研究する決心をした。本発明者らは、組換えで作られたコラーゲンを利用することにより、多数の不純物及び定義されていない性質とコラーゲンのタイプＩを主要な成分として有する可変的な性質のコラーゲンタイプの混合物とを有する天然源に対してより均一な性質のためにハロゲン化銀乳剤生産に向上がもたらすことができることを予期した。この考えは、各ブロックコポリマー構造を多く有する新しく設計されたコラーゲン様ポリペプチドを使用するよりも、天然コラーゲンに近くなっている物質を用いることであった。この希望は、天然配列に対応する配列の発現問題が、先行技術に詳細に記載されているように、合成的に設計されたコラーゲン様ポリペプチド配列において遭遇する問題よりも小さいことであった。これは、発現される配列の低い繰返し性に基づいて予想することができた。一方、よりランダムな配列を利用することは、多様なプロテアーゼによる攻撃をさらに受け易くするだろう。
【００２３】
コラーゲンの天然の条件とはどんなに異なっても、我々は組換え技術を用いるらせん様構造を作る試みを放棄することを決定した。「適当な数のｙ位プロリル残基がプロリル４ヒドロキラーゼにより4-ヒドロキシプロリンにヒドロキシル化されていない場合、新しく合成された鎖は、37℃で三重らせん立体配置に折りたたむことができない。ヒドロキシル化が起こらない場合、ポリペプチドは非らせんのままであり、細胞から十分には分泌されず、コラーゲン繊維原に自己集合することはできない」と述べられているWO93／07889 の１ページを参考にして、分泌を確実とするために分泌細胞を用いる際に問題が起こることが予想することができた。また、プロテアーゼ攻撃の潜在性は、得られたオープンな非折りたたみ構造のためにかなり高いものであろう。よって、我々の組換え配列が、発現宿主により高い量でかなり容易に分泌される発現産物をもたらすことは驚くべきことである。また、組換えコラーゲン化合物が、写真応用に現在用いられている天然コラーゲンに特徴的な繊維原構造または三重らせん構造を形成できないような条件下で組換えコラーゲンを産生することは、写真応用自体に対して疑問のある効果も有しえた。現在の市販されている製品とのこの違いを鑑みて、得られた組換え化合物が、現在使用されている化合物を有するらせんと同じように写真応用に適するかどうかも勿論疑問があった。
【００２４】
しかし、コラーゲンタイプのＩおよびＩＩＩのゲノム配列をクローニングする際の、十分な量を作ってそれを写真応用に利用するための発現の問題を克服する多くの難しい研究後の結果は、すべての有り得る失敗にもかかわらず、思いかけなかったことに良好であった。第一に、発現速度は意外に高く、0.95グラム／リットルより高く、実際には全体として３グラム／リットルより高かった。これは、コラーゲンまたはコラーゲン様材料を発現しようとする試みがあったとしても１リットルあたり数ミリグラムより多くは産生できなかった先行技術とは顕著な対照である。よって、この驚くべき高い発現速度は、先行技術に記載された全ての問題を鑑みて当初はまったく予想されないと思われた。しかし、発現速度は、他のタンパク質に関しての発現宿主ピヒア・パストリスにより得られた生産速度をかなり上回りさえした。かなり具体的には、コラーゲンのような高い量で作ることは難しいとは予想されなかったタンパク質の生産速度さえも上回った。遂には、組換えコラーゲンの形態が経済的に興味のある量で経済的に興味のある発現宿主により作ることができると今や考えられている。発現が多い他の宿主は、真菌タイプの微生物中に見出すことができる。特に高い発現酵母および最も具体的には低いタンパク質分解活性を有するプロテアーゼ陰性株が望ましい。適切に使用することができる酵母は、かなり特異的にメチルトローフである酵母（methylotropic yeasts）である。特に適切な例は酵母のピヒア・パストリスである。コラーゲンの発現のために関連があるものとして達成された基準に基づいて、十分に高い程度までおよび経済的に実施可能な条件下で発現が可能な適当な宿主細胞が発見され使用できる。
【００２５】
大規模生産が本発明者らにより可能とされたことは、写真応用分野での実際の試験を最終的に実施可能とさえもした。写真応用のための試験は、十分な組換えコラーゲンが比較的大量に作られた後にのみ可能であり、これは先行技術で詳細に記載された医薬応用のために必要とされる少量とは対照的である。写真応用に関するこれらの試験を行った後、平板状粒子形成が高いことがわかった（表ＩＩを参照されたい）。実質的に純粋なコラーゲンタイプＩＩＩの利用がペプタイザーとして写真乳剤に初めて利用された。その結果は傑出したものであった。しかし、我々は、平板状粒子形成が80％を超えるものであることを思いもかけずに発見した。これは低い結合力を有するポリペプチドのイーストマンコダックポリペプチド性能よりもまさり、これは、69.5ｍＶの結合力がこの生成物に関して見出されたので、イーストマンコダック教示にしたがえば非平板状粒子形成を予想しなければならなかったことを鑑みれば最も驚くべきものと思われた。よって、80％の平板状粒子形成を得るためには結合力が50ｍＶ以下でなければならないとする要件に関するイーストマンコダックによって仮定された理論が覆された。よって、80％を超えるレベルでの平板状粒子を必要とするハロゲン化銀乳剤における応用のために適当であると先行技術に述べられているものよりもさらに高い銀結合力を有する多くのペプタイザーを開発するための経路が開かれた。この経路は、写真乳剤におけるペプタイザーの主要コラーゲン成分としてタイプＩＩＩ以外のコラーゲンのタイプを適用するためにも開かれた。種々の天然コラーゲン間の相同性の程度が40〜50％であることを考慮すれば、わずかに操作された天然配列からも良好な結果を期待することができる。天然コラーゲンアミノ酸配列に対して50％を超える相同性を示すアミノ酸配列が良好な結果を提供すると期待することができる。天然配列の変異は、天然配列に対する挿入、欠損および置換を有してもよい。それ以外に、天然ＤＮＡ配列に対してある程度の相同性を有する合成ＤＮＡ配列を使用することができる。しかし、本発明に有用な配列は、それらのコードする核酸配列の発現の問題を防止するために、最小程度の可変性を保持しなければならない。例えば、変異は４個を超えて異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を常にもたらさななければならない。ＧＸＹ部分はブロックコポリマーの形態であってはならず、多くのＧＸＹ部分間のスペーサー配列を有してはならない。好ましくは、８個を超え、さらには９個を超えて異なるアミノ酸が存在しなければならない。実施例において、19個もの多くの異なるアミノ酸を有するタンパク質が用いられる。天然に存在するのは僅かに20アミノ酸である。適切には、10〜20アミノ酸または10〜19アミノ酸を用いることができる（しかし好ましくはシステインは避けられる）。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、コラーゲン様ポリペプチドをコードする核酸配列の高い発現を含む組換えコラーゲン様ポリペプチドの高い生産性の製造方法、並びに該ポリペプチド、及びそれを用いたより均一な写真用ＡｇＸ乳剤材料を提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
よって、本発明は、平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤を有し、該乳剤が核形成ペプタイザーの存在下で核化され、その後成長ペプタイザーの存在下で成長するハロゲン化銀粒子を有し、少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。このような乳剤は、適切には天然コラーゲンに対して50％を超え、好ましくは60％を超える相同性を示すアミノ酸配列を有するペプタイザーを有することができる。適切には、ペプタイザーは少なくとも10ｋＤａのサイズを有する。実施例から明らかであるように、20〜80ｋＤａのサイズが写真応用に有用である。約 600アミノ酸のペプタイザーを示す。
乳剤は、コラーゲンに関して自然に存在するものと同等のアミノ酸を有することができる。ここで同等であるとは天然に存在するものとアミノ酸同一性が少なくとも80％、好ましくは90％であることを意味する。
【００２８】
乳剤は、天然に存在するものと実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプタイザーを有することができる。ここで実質的とは、アミノ酸の変異が５個未満、好ましくは３個未満であることを意味する。適切な種類のコラーゲンはＩ、ＩＩおよびＩＩＩである。活性を確保し、且つ発現問題を避けるために、配列は天然配列に近いことが好ましい。ペプタイザーのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、天然であっても合成であってもよい。本発明によるコラーゲンタイプＩＩＩアミノ酸配列は、適切には図３の配列を有するか、またはそれである。本発明によるコラーゲンタイプＩアミノ酸配列は、図８、１0 または12の配列を有するか、またはそれである。コラーゲンタイプＩＩＩは実施例１の参考文献５に定められたアミノ酸を有する。この文献は、参照により本明細書に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
ペプタイザーが実質的に純粋な形で存在する本発明の乳剤とは、ペプタイザーが、核酸、多糖類および他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。本実施例は、これが実際に可能であることを具体的に示している。糖および核酸の存在が微量でさえ、結晶形成に対して幾分かの影響を持つことができ、具体的な写真応用のための十分に純粋な組換え材料が作ることができるかどうかを実際に疑ってみなければならなかった。
【００３０】
ピヒア・パストリスを発現宿主として用いるとき、ＭＧＰＲの配列がコラーゲンＩの天然配列には存在していたとしても、それを持たないアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いるのが有利である。なぜならばこの配列は、一部のコラーゲンタイプが受けるピヒア・パストリスに存在するプロテアーゼの新しい認識部位であることを我々が思いもかけずに発見したからである。プロテアーゼはＫｅｘ−２様プロテアーゼであり、Ｋｅｘ−２様プロテアーゼのネガティブ宿主株が適当な宿主細胞であろうと予想されている。宿主としてピヒア・パストリスを用いるときの一般条件において、対応するアミノ酸配列が［Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ］−Ｘａａ−Ｙａａ−Ａｒｇ（式中、ＸａａおよびＹａａはＧｌｙおよびＰｒｏまたは他のアミノ酸に対応しており、括弧内のアミノ酸の少なくとも一つが変えられる）のないコラーゲンをコードする核酸配列を用いるのが有利であろう。非らせんコラーゲンのオープン構造はタンパク質分解を受け易いので、宿主が選択され、および／または発現しようとする配列が宿主および発現配列の特定の組合せについてタンパク質分解が最小化されるように好ましくは変異されるか、選択されなければならない。共通する一般的知識、および挙げられた文献の内容を含めた本開示に基づいて、これを実現するために当業者に開かれた多数のオプションが存在する。
【００３１】
発現を増加させるための別の方法は、配列が発現のために導入されている宿主細胞のために最適化されたコドン利用に存在するであろう。マルチコピー形質転換体の利用は、発現の増大が達成できる方法でもある。最大レベルのタンパク質分泌が小胞体のタンパク質折り畳み能力により最終的に決定されることが、ウシ膵臓トリプシンインヒビターのサッカロミセス・セレビシアエ発現の技術で示唆されている。マルチコピー形質転換体を利用することによりこの能力を超えることは、小胞体での折り畳まれていないタンパク質の蓄積および生理学的不安定性による発現レベルでの付随的な莫大な減少をもたらすと考えられている。これは1995年Parekh（Protein Expr. Purif. 6, 537-545 ）および1997年Parekh及びWittrup （Biotechnol. Prog. 13, 117-122 ）に記載されている。折りたたまれていない分子として発現されている我々の組換えコラーゲンの場合、このネガティブな特徴が打ち消されるか、および／またはこの現象が他の発現宿主で、特に他の酵母宿主であまり関連がないようである。酵母宿主および細菌宿主において、プロリルヒドロキシル化機構が存在せず、それ自体ではコラーゲンのそれら宿主内での発現は折りたたまれていないコラーゲンをもたらすであろう。コラーゲンが折りたたまれていない場合、それは小胞体の折りたたみ能力を消耗させないだろう。また、顕著な可溶性のために、折りたたまれておらず、かつヒドロキシル化されていないコラーゲンは、小胞体中で凝集も蓄積もしないだろう。発現の程度に関連するようになる、そうした折り畳みの危険を除くために、コラーゲンはヒドロキシル化されず、またはできるだけ低い程度まで少なくともヒドロキシル化されているのが望ましい。
【００３２】
サッカロミセス・セレビシアエおよびピヒア・パストリス等の酵母細胞中で、不均一プロリル−4-ヒドロキシラーゼの共発現によりヒドロキシル化を行うことができることが最近わかった。これは1997年にVuorela ら（EMBO J. 16, 6702-6712 ）および1998年にVaughan ら（DNA cell Biol. 17, 511-518）により記載されている。ゼラチンのゲル化温度がヒドロキシル化度に依存するので、現在、種々のゲル化温度を有する発現産物をもたらす方法でヒドロキシル化度を変えることができるであろう。これは、コラーゲンの経済的利用を以前に禁止した特異的温度要件を有する方法、すなわち所望とされないゲル化を妨げるために室温以上の温度を必要とする方法に特別な興味を有するだろう。
【００３３】
ペプタイザーは、それが、天然コラーゲンをコードする配列由来の一定の長さおよび組成の断片であり、該断片がコラーゲンに特徴的なＧＸＹ部分を有し、アミノ酸ベースで該断片の重さが少なくとも 2.5ｋＤａであるような長さである点で、天然配列と同一である必要はない。適切には、重量は 2.5〜 100ｋＤａであってよい。多様な大きさの断片が適切である。５〜50ｋＤａ、さらには20〜50ｋＤａが適用される適切な態様である。該ペプタイザーは、合成核酸配列から新たに（de novo)で作ることができる。
【００３４】
らせん構造の非存在を確保する多様な方法が利用可能である。例えば、ペプタイザーにヒドロキシプロリンが存在しないこと、および／またはプロコラーゲンおよびテロペプチドが存在しないことを確保することである。好ましくは、写真応用のために、ペプタイザーはシステインが存在すべきではない。ペプタイザーが脱アミン化されていない本発明によるＡｇＸ乳剤は、等電点が７〜10のペプタイザーである本発明の興味あるさらなる態様である。
【００３５】
さらに、他のどのパラメーターを用いてその結果を向上させることができるかを定義するために他に何を発見することができるかを確認するために、さらに研究が行われた。これを行うために、我々は多数の修飾コラーゲン、すなわち非組換え産生コラーゲンを我々の組換えコラーゲンで試験に用いて分析し、関連するパラメーターを決定した。次に我々は、平板状粒子形成に必要とされる程度のハロゲン化銀を作成するのに適切なものとして種々のカテゴリーの化合物を定めた。
【００３６】
さらに、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力 0.1〜 200マイクロモルに等しいレベルで存在する程度に酸化された還元性アミノ酸を有するペプタイザーを有する、既に示された他の態様のいずれかにおける本発明の乳剤が適切な態様である。好ましくは、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンが 160マイクロモル未満、好ましくは120 マイクロモル未満で存在するのがよい。還元力は低いレベルが好ましいので、本発明による好ましい乳剤は、還元性アミノ酸が該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力 0.1〜80マイクロモルに等しいレベルで存在する程度に酸化された還元性アミノ酸を有するペプタイザーを含有するのがよい。該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力30〜80マイクロモルに等しいレベルで還元性アミノ酸が存在する程度のかなり高いレベルの還元性アミノ酸も十分な結果を提供することができる。これは、多くの先行技術刊行物における平板状粒子形成のための要件、低い還元力値という要件に関する以前の教示を考慮すれば、かなり驚くべきことである。本発明は、80μｍｏｌｅ以下のレベルのメチオニンを有するそれら修飾コラーゲン、例えば修飾タイプＩも包含する。例えばタイプＩコラーゲンへの修飾は、必ずしも酸化によるものではなく、還元性アミノ酸が非還元アミノ酸により必要とされる程度まで置換されたコード配列の変異の結果であってもよい。このことは、ハロゲン化銀乳剤中における使用前のコラーゲンの化学処置工程を省略することができ、付随的に生産工程に対する時間と費用の利点をもたらす。明らかに、80μｍｏｌｅを超える還元アミノ酸を有さない天然コラーゲン、例えば修飾タイプＩＩＩも適用できる。
【００３７】
さらに、最初に示され、1996年に発表されたイーストマンコダックの教示とは対照的に、示された他の実施態様のいずれかにおいても本発明の乳剤は50ｍＶを超える銀の結合力を有するペプタイザーを有し、平板状粒子の高い形成レベルを有す乳剤としてかなりよく機能できる。適切なペプタイザーは、銀への結合力100 ｍＶ以下を有する。先行技術の教示とは対照的に、ペプタイザーは銀への結合力50〜100 ｍＶを有することができ、優れた平板状粒子パーセントを有する乳剤を提供する。
【００３８】
そのようなコラーゲン様材料の適用から得られるハロゲン化銀乳剤は、適切には80％を超える平板状粒子、好ましくは90％を超える平板状粒子を示すだろう。95％を超える平板状粒子パーセントが最も好ましい。粒子は、実施例記載の反応条件下の単一噴流法を用いて測定した場合、平均アスペクト比が５を超える値を示すだろう。これらの反応条件は最大のアスペクト比を得るための実際の写真乳剤方法に用いられる最適化反応条件ではなく、そのような最適化条件が使用されるときに高いアスペクト比を達成するのに適切かどうかを示すことを単に提供していることに注意されたい。例えば二重噴流法および付加的な成熟法を用いる通常のコラーゲンに現在用いられている最適化条件を適用すると、本発明の化合物はさらに高いアスペクト比を示すと予想される。使用される試験は高いアスペクト比形成能の迅速な単なる指標であり、当業者はその結果をさらに高めるためにどのような対策を取ることができるかを理解しよう。
【００３９】
我々の試験において、成熟プロセスを、ペプタイザーまたは余分な銀をさらに添加することなしに行う。明らかに、本発明の方法において、成熟工程は、そのような、さらに添加することを有することができる。ペプタイザーは核形成および成熟段階の双方で同一の材料とすることができる。成熟段階でさらに添加することは、この段階での立体安定性の増大のために有利でありえよう。
【００４０】
本発明による好ましいＡｇＸ乳剤は、ｐＨ４〜８でハロゲン化銀平板状粒子形成に対して安定なペプタイザーを有する。石灰骨およびヒドロキシル化ゼラチン由来の従来のゼラチンは、ｐＨ 5.5を超えた値で、そのような平板状粒子形成の結果を示さない。本発明によるペプタイザー、例えば天然組換えコラーゲンＩＩＩはそのような特徴を示さず、乳剤生産保存と適用中の厳密なｐＨ調節を不要にする。天然組換えコラーゲンはメチオニンの酸化を受け、向上した挙動を示すこともできる。適切には、メチオニンレベルは１グラムあたり80マイクロモル未満である。よって、本発明による乳剤は、平板状粒子形成に否定的な影響を与えずにｐＨ４〜８で核形成および成長することができる。乳剤生産の工程において、ｐＨの変化は、写真生産に関して得られる乳剤をさらに処理する際に、否定的な影響をその結果に与えることはないであろう。
【００４１】
本発明による乳剤は、ハロゲン化銀乳剤を有する従来のコラーゲンよりも、ペプタイザーが均質分散性を有するとの利点を提供する。このために結晶化法はすべての上記利点によりさらに均質でもある。ハロゲン化銀の核形成および成長の多様な段階で、明確に定義され、実質的に純粋なさらに均質なペプタイザーを添加することで、コスト効果性と組合わせて、かつコラーゲン様ペプタイザーによっては以前には可能ではなかった調節された方法で結晶化性質を調節することができる。多くのタイプのコラーゲンが自然に存在するので、これらは本発明による写真ハロゲン化乳剤に適用することもできる。
【００４２】
現在まで発見された２３コラーゲン遺伝子が存在する。これらの多くが部分的または全体として配列決定されている。データバンクはそのための多様な配列を有している。例えばGenbank は寄託番号Genbank U08020でｃｏｌＩ配列を有しており、ｃｏｌＩＩＩ配列が実施例１の参考文献５で示されている。これらの天然コラーゲン遺伝子は、それら自体と比較して40〜50％の相同性を示す。配列データに関して挙げられた参考文献の関連情報は、本明細書で参考として含まれる。例えばWO95／31473 の５ページを参照のこと。上述のように、本発明のコラーゲン様化合物（この化合物はその後写真応用のためにハロゲン化銀乳剤で使用される）を作るために、天然源からの単離または化学合成により得られた、これらの天然配列それ自体または修飾しての利用が本発明に包含される。適切には、これら配列が利用され、すなわち天然アミノ酸配列または天然アミノ酸配列に類似したポリペプチドをコードする配列は、コードされたポリペプチドが上記のパラメーターに入る限り利用される。ハロゲン化銀乳剤ゼラチンの源は動物の骨であり、そのうちタイプＩコラーゲンが最も主要に存在するコラーゲンタイプであるために、タイプＩがハロゲン化銀乳剤で最も多く適用されるタイプであった。現在、ハロゲン化銀乳剤での適性のために他のコラーゲンタイプも試験し、適用することもできる。他のコラーゲンタイプは、写真応用での先行技術ではそれ自体として適用されず、ハロゲン化乳剤中ではそれ自体では確かに適用されていない。当然、多くのコラーゲンタイプは現在まで使用されてきた動物組織中に存在している。現在、これらのコラーゲンタイプは、以前に認識されなかった写真製品に対するさらに有利な性質に実際にもたらしているのかどうか、または寄与しているのかどうかを理解することもできるようになっている。コラーゲン様成分としてタイプＩ以外の組換えコラーゲン様ポリペプチドを有する写真感光性乳剤も、上記の特定要件が満足される限り、本発明の適切な態様を形成するとみなされる。具体的には、ハロゲン化銀中の利用が包含される。ハロゲン化乳剤の場合、コラーゲンの100 ％の均一な源は、結晶形成の最大均質分散性を提供することが予想される。均質分散性の要件およびその値が本発明の説明のいずれかで扱われている。ペプタイザーは全長コラーゲンを有することは必要でなく、その断片を有してもよい。しかし、適切には、そのような断片は少なくとも2.5 ｋＤａ、好ましくは10ｋＤａ以上の長さで、ペプタイザーに必要とされるコラーゲン特徴を保持しながら、発現の十分なランダム性を確保する。
【００４３】
上記の乳剤以外に、本発明は、平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤の調製方法も関する。該方法は、核形成ペプタイザーの存在下でハロゲン化銀粒子を核化し、その後成長ペプタイザーの存在下でハロゲン化銀粒子を成長させることを有し、双方のペプタイザーが所定の量で存在し、少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製されたコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する。本発明のそのような方法は、核形成工程において、および／または粒子成長工程中で、ペプタイザーを添加することを有することができ、該ペプタイザーが上記態様のいずれかまたは請求の範囲から選択できる。ある特別の態様において、本方法は、核角形成工程において、及び粒子成長工程中の双方において、ペプタイザーを添加することを有することができる。両工程が取られる場合に用いられるペプタイザーは、その場合の環境によるが、同一であっても異なってもよい。
【００４４】
本発明にしたがってＡｇＸ乳剤を調製した後、ＡｇＸ乳剤は、写真要素を調製する標準的操作を受けることができる。該乳剤は、写真材料上にハロゲン化銀乳剤層を得るためにそれ自体公知の方法で塗布することができ、該層のハロゲン化銀結晶は５以上のアスペクト比を有する。
【００４５】
該写真要素は、適切には、光、レーザーまたはＸ線照射に感光性のある材料であり、該要素は白黒リバーサルフィルム、白黒ネガフィルム、カラーネガフィルム、カラーリバーサルフィルム、感光性写真成分がデジタルスキャンされたフィルム、白黒反転紙、白黒紙、カラー紙、反転カラー紙、感光性写真成分がデジタルデータベースからのレーザー照射により感光された紙から選択される。そのような方法にしたがって得られる写真要素、ならびに内部感光化ハロゲン化銀乳剤を用いる直接ポジプロセスおよび熱現像を用いる要素も本発明に包含される。
【００４６】
本発明のもう一つの特徴は、0.95グラム／リットルを超える程度までの微生物によるコラーゲン様ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を有する組換えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法にある。該組換えコラーゲンはらせん構造が存在しない。発現は、高い発現および好ましくは分泌を確実とするように大腸菌またはサッカロミセス・セレビシアエ以外の微生物中で起こるのが好ましい。本方法は、真菌細胞、好ましくは酵母細胞を用いて適切に実施することができる。適切には、宿主細胞は、ハンセヌラ属、トリコデルマ属、アスペルギルス属およびピヒア属のような高い発現宿主細胞からなる群から選択される。真菌および特に酵母細胞は、繰り返し配列の悪い発現をあまり受けないので、バクテリアよりも好ましい。最も好ましくは、宿主は、発現されるコラーゲン構造を攻撃する高いレベルのプロテアーゼを有さないのがよい。この点で、ピヒア属は非常に適切な発現システムの具体例を提供する。好ましくは、該微生物は、コラーゲン様配列を繊維原へと処理する活性のある翻訳後プロセッシング機構がないことにより、発現産物中にらせん構造の欠如を確実とする。また、そうしたプロセスは、微生物が、コラーゲン様配列を三重らせんに処理する活性のある翻訳後プロセッシング機構を持たないとき、および／または発現される核酸配列がプロコラーゲンおよびテロペプチドをコードする配列を持たないときに起こりうる。使用される宿主は、コラーゲン生産に関して当分野での以前の示唆とは対照的に、コラーゲン三重らせん構築物に必要とされる酵素であるプロリル−4-ヒドロキシラーゼの発現のために遺伝子の存在を必要としない。本発明の組換えコラーゲンの発現に適する宿主細胞を、発現される配列と宿主細胞に関する知識との組合せにおける写真技術に適するようにするために、本明細書に記載される必要なパラメーターに基づいて、公知の工業的な酵素産生真菌宿主細胞、具体的には酵母細胞からの適切な宿主細胞の選択は当業者には可能であろう。
【００４７】
非切断配列の生産を確実とするために、組換えコラーゲン様材料を作るための本発明の方法は、発現宿主細胞でプロテアーゼ活性のあるプロテアーゼ切断部位が実質的に存在しない組換えコラーゲンアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いることを有する。例えばピヒア・パストリスの場合、およびおそらく他の宿主細胞にも関しても、対応するアミノ酸が［Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ］−Ｘａａ−Ｙａａ−Ａｒｇ（ここで、ＸａａおよびＹａａはＧｌｙおよびＰｒｏまたは他のアミノ酸に対応しており、括弧内のアミノ酸の少なくとも一つが変えられる）を有さないコラーゲンをコードする核酸配列が望ましいであろう。本発明の好ましい方法は、発現宿主として微生物ピヒア・パストリスを用いることを有する。
【００４８】
本方法は、３グラム／リットルを超えるペプチド収穫をもたらす発現を適切に提供する。本方法は、本発明の乳剤に対して上記で定義した組換えコラーゲン様ペプタイザーのいずれかを用いて適切に実施することができる。そこに記載の環境下の実施例から明らかであるように、マルチコピー形質転換体は、バイオマス湿潤重量 435ｇ／リットルで、清澄化ブロス１リットルあたり14ｇを超えるゼラチンを提供する。最も適切には、他のタンパク質、多糖類および核酸が実質的に存在しなくなるまで、微生物発現から得られる生成物を単離し、精製する。実施例から明らかなように、多くの方法がこれを達成するために当業者に利用できる。本発明による方法は、核酸含量 100ｐｐｍ未満、多糖類含量５％未満、他のタンパク質が市販製品中の含量未満の程度まで少なくとも単離され精製された発現生成物を提供することができる。より好ましくは、ＤＮＡ含量１ｐｐｍ未満、ＲＮＡ含量10ｐｐｍ未満、さらには５ｐｐｍ未満、および多糖類含量１％未満を得ることができる。
【００４９】
本発明のもう一つの特徴は、新規な組換えコラーゲン様ペプチドを包含する。特に、本発明は、コラーゲンをコードする核酸の遺伝子工学により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料を包含し、該ペプタイザーが天然コラーゲンに対して40％を超える相同性を示すアミノ酸配列を有し、４個を超える異なるアミノ酸タイプを有する。核酸配列は天然配列に由来するか、または新たに（de novo)合成された合成核酸であってよい。他の適切な態様は、本発明による乳剤の態様に記載したペプタイザーである。相同性が50％を超える、好ましくは80％のオーダー、さらに80〜100 ％が好ましいので、できるだけ近い相同性が望ましい。具体的には、産物はＧＸＹ部分配列内にブロックコポリマー構造がないのが好ましい。
【００５０】
本発明の好ましい態様として、コラーゲン様材料はシステイン残基を有さない。写真製品にシステインが存在することにより、製品製造方法が妨げられるであろう。よって、システインはできるだけ少量で存在するのが好ましい。これは、組換え産物の化学的修飾によるか、またはシステインがもはやコードされない程度にシステインをコードする配列の変異または削除による産物をコードする核酸配列の変異により達成することができる。適切には、写真応用は、システインを 0.1％未満で有する材料を用いる。
【００５１】
特に、最適なハロゲン化銀乳剤のために、コラーゲン材料の相同性が最も重要性を持つ。それは、改良を提供する不純物がないという単なる問題ではなく、結晶化の非常に感受性のある方法の良好なコントロールを可能とし、均一な結晶成長をも可能とする正確に同一の組成と長さの分子を提供する可能性である。このため、組換えコラーゲン様材料は、写真製造法のこの部分に価値を持ちうるだろう。さらに、現在まで完全に見過ごされてきた特徴である、繊維原形成と三重らせんの形成がないことが写真製造方法におけるこの特別な利用に必要とされる。写真材料における還元基の数の関連性における洞察も大きな重要性を有する。これは平板状粒子形成に必要とされる先行技術に示唆された厳密な低い量ではない。よって、適用されるコラーゲン様材料において、システイン、ヒスチジンおよびメチオニンレベルを低減することにより、本発明の好ましい態様が形成される。
【００５２】
本発明による化合物はさらに別の利点も明らかにした。公知のコラーゲン材料、例えば、骨および皮等の動物源からの規則的で加水分解されたコラーゲンは、ｐＨ5.5 を超えるｐＨで写真フィルム乳剤の低い平板状粒子形成をもたらす。組換えコラーゲンの新しいグループは、ｐＨ5.5 だけでなく、より高いｐＨ、例えばｐＨ７以上でも、同一で目覚しく高い平板状粒子形成程度をもたらすことがわかった。これにより、新しい化合物が非組換えコラーゲンよりも明らかに低いｐＨ依存性を有するので、厳密性を低くして調整したｐＨを有するハロゲン化銀乳剤を調製する可能性がもたらされる。よって、本発明は、高い平板状粒子パーセント、すなわち50％を超え、好ましくは80％を超えるパーセントに到達しながらｐＨ４〜８でハロゲン化銀乳剤の生産に用いることのできる組換えコラーゲン様化合物にも関する。有用であると考えることのできる組換えコラーゲンの付加的な特徴は、等電点が、酸性ＩＥＰを有する1996年に記載されたイーストマンコダック組換えポリペプチドとは反対に塩基性である。本発明による組換えコラーゲンが、４個を超えるアミノ酸が存在するアミノ酸組成物を有することは、コード配列において可変性の増大がもたらされ、よって高い発現度を可能とすることが予期される。全ＧＸＹ配列中で33％プロリン未満のＧＸＹ部分を有する配列を用いることにより、付加的な変化が導入される。この良好な発現は、ＧＸＹ配列におけるブロックコポリマーアミノ酸配列構造を用いることなく達成される。
【実施例】
【００５３】
本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。
【００５４】
［実施例１］
組換えＤＮＡ技術による写真応用のための酵母、真菌等の発現宿主生物中で組換え異種タンパク質として発現されたゼラチン、コラーゲンまたはコラーゲン断片は幾つかの利点を有している。（ｉ）例えば慣用のゼラチンとは対照的に、組換え分子が厳密に非架橋物として作ることができる。（ii）分子組成が正確に定められる。（iii)作られる分子は単一種類（またはわずかに数個の分子の明確な混合物）を有し、他のタンパク質性分子または非タンパク質性分子による汚染が少量であるかまたは無視できる。分子量分布は非常に狭く、単分散（単一成分ゼラチン）または多分散（oligo-disperse）である。（iv）生成物は高い再現性のある方法で、すなわち一定の品質をもって産生することができる。特に、酵母は、繰り返し性の高いグリシンに富んだ配列及びプロリンに富んだ配列を有するポリペプチドのためによく適した産生生物である。
【００５５】
これらの分子的特徴が細菌システム中で遺伝的不安定性（例えば遺伝子の一部の組換えおよびシャフリング（shuffling)）をしばしば引き起こす一方で、これは酵母中では大きな問題ではないように思えた［1, 2］。それらは真核細胞であり、該細胞中ではヒドロキシル化等の翻訳後修飾が引き起こされうるが、効率的な分泌または細胞内発現のいずれかのための選択を可能とさせる。幾つかの種は、動物細胞培養とは対照的にメタノール等の安い基質で効率的に生育する。分泌産生は（植物とは対照的に）培養中または培養後の産物の十分な回収を可能とする。幾つかの強くしっかりと調節された誘導性プロモーターが酵母システムに利用可能であり、効率の良い発現が可能となり、宿主細胞の生存と成長に対する起こりうる否定的な効果を最小限にする。利用可能な幾つかのよく適合させたシステムの一つとして、我々はメチロトローフである（methylotropic)酵母ピヒア・パストリスによる分泌産生のために選択した。我々の発現レベルは組換えタンパク質についてこれまで報告された最大のものの中にあり、遺伝子（ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびタンパク質レベルでのゼラチン／コラーゲン構造の上述のものを処理することのできるこの発現宿主の能力を示している。宿主の形質転換後、統合物は酵母の染色体中に取り込まれ、形質転換体の遺伝的安定性をもたらす（プラスミドの損失は、その後は重要性ではない）。組換え遺伝子がＨＩＳ４座またはＡＯＸ１座のいずれかに導入されている形質転換体（例えばアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ）プロモーターの調節下に外来標的遺伝子を有するもの）を作ることができる。後者の場合、統合のタイプにしたがって、ＡＯＸ１遺伝子が壊され、メタノールの遅い利用およびメタノールによる遅い成長をもたらす（ＭｕｔS 表現型）。機能的ＡＯＸ１遺伝子がなおも存在する場合、表現型はＭｕｔ+ である。両表現型を用いることができるが、我々は一般的には迅速な成長を好むので、我々のプロトコールは主にＭｕｔ+ 形質転換体の生成と選択に向けられた。Ｐ．パストリス発現系以外の酵母または真菌発現系が、原則として、産生される分子の正確な種類および品質、意図される産生規模、並びに生産コスト及び適用可能な市場価格に依存するが、組換えゼラチンの効率的な産生に同じくよく用いることができることは自明である。ピヒア属系がパイロット生産および比較的容易な産物回収のための迅速で効率的なシステムとして用いられた。
【００５６】
材料、方法および分析
一般的な分子生物学的技術
クローニング操作は基本的にはManiatisら［３］にしたがって行った。ウィザードプラスＳＶミニプレプ（Wizard Plus SV miniprep)、またはキアゲン（Qiagen）ミジプレプシステム（midiprep systems）を用いてＤＮＡを単離した。ＤＮＡをＱＩＡクイックゲル抽出キット（QIAquick Gel Extraction Kit)（キアゲン）を用いてアガロースゲルから単離した。用いられる酵素はすべて、特記しない限り、ファルマシア（Pharmacia)からのものであり、製造業者の推薦にしたがって用いた。大腸菌の形質転換を、バイオラッド（BioRad）のジーンパルサー（GenePulser）を用いる標準的な泳動により行った。ピヒア・パストリスの扱いと形質転換を伴なうすべての操作およびこの宿主微生物におけるタンパク質の発現は、ピヒア発現キット（インビトロゲン（Invitrogen))のマニュアルにしたがって行った［４］。
【００５７】
ラットＣＯＬ３Ａ１ ｃＤＮＡ断片の酵母（ピヒア・パストリス）発現ベクターへの挿入
部分的ラットプロα１（ＩＩＩ）コラーゲンｃＤＮＡを含むプラスミドｐＲＧＲ５は、Vuorio博士より贈呈されたものである［５］。それをＰｓｔＩで消化し、らせん領域の約０．７ｋｂ断片を得た。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの3'−5'エキソヌクレアーゼ活性を用いて、該断片を平滑末端化し、次にＳｎａＢＩ消化されたＣＩＰ脱リン酸化ｐＰＩＣ９ピヒア・パストリス発現ベクター（インビトロゲン）にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。次に、この連結反応物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
【００５８】
可能で適当なベクターの選択はｐＰＩＣ９に限定されないことは理解されよう。当業者であれば誰でもｐＨＩＬ−Ｓ１等の多くの他の可能なベクターを使用し、適合させることができ、ここで、サッカロマイセスセレビシアエ由来のα接合因子（alpha-mating factor)（αＭＦ）プレプロ（prepro）シグナルのかわりにピヒア・パストリス酸性ホスファターゼ１（Ｐｈｏ１）−シグナルが用いられるか、または細胞内発現のためにｐＨＩＬ−Ｄ１および多くの他のものが用いられる。
【００５９】
プラスミドＤＮＡを単離し、こうして作られたｐＣＯＬ３Ａ１構築物の配列（図１）を、自動化シーケンサー（ＡＬＦ ＤＮＡシーケンサー、ファルマシア）およびピヒア・パストリス発現キットで示唆された5'ＡＯＸ１、3'ＡＯＸ１およびα−因子（αＭＦ）配列決定プライマーを用いてサンガー（Sanger）の方法［６］による配列決定で確認した（図２を参照のこと）。発現したタンパク質について予想されたタンパク質配列を図３に示す。
【００６０】
ｐＣＯＬ３Ａ１によるピヒア・パストリスの形質転換
ピヒア・パストリスの形質転換でＭｕｔ+ 形質転換体を得るために、該構築物をＳａｌＩで一本鎖とした。ＭｕｔS 形質転換体を得るために、構築物をＢｇｌＩＩで消化した。フェノール抽出およびエタノール析出後、次にこの構築物を用いて、バイオラッドジーンパルサー（1500Ｖ、25μＦおよび 200Ωに設定し、 0.2ｃｍキュベットを用いたもの）を用いて、BeckerおよびGuarente［７］によるエレクトロポレーションを用いて、ピヒア・パストリス株ＧＳ１１５（インビトロゲン）を形質転換した。Ｈｉｓ- 株ＧＳ１１５をＨｉｓ+ に変換するベクターの存在について選択するために最小デキストロースプレート（ＭＤプレート；1.34％ＹＮＢ、４×10-5％ビオチン、１％デキストロースおよび1.5 ％寒天）に形質転換混合物を塗布した。30℃で３日間の生育後、幾つかのコロニーがＭｕｔ遺伝子型のＰＣＲ確認のために選択した。ゲノムＤＮＡを Lee［８］の酵母ミニプレプ法にしたがって単離し、ＲＮａｓｅＡで処理した。ＰＣＲを、全体積50μｌに、ゲノムＤＮＡ 100ｎｇ、5'ＡＯＸ１プライマー50ｐｍｏｌ、3'ＡＯＸ１プライマー50ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ1.25Ｕ（ファルマシア）、0.2 ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ファルマシア）および１×Ｔａｑ緩衝液（ファルマシア）を用いて行った。94℃で５分間の最初の変成後、94℃で１分間、57℃で１分間および72℃で２分間からなるサイクルを30回行った。最終的な伸長は72℃で10分間であった。使用されたＰＣＲ装置はパーキンエルマー（Perkin-Elmer）GeneAmp 480 であった。アガロースゲル電気泳動により、Ｍｕｔ+ 形質転換体に関して 2.2ｋｂ内因性ＡＯＸ１バンドを示すはずである。 2.2ｋｂバンドのない形質転換体はＭｕｔS である。Ｍｕｔ+ およびＭｕｔS 遺伝子型の双方の確認済形質転換体を、50ｍｌコニカルチューブ（角度をつけて置かれ、キャップをゆるく付けた）中、または100 ｍｌもしくは１Ｌ（バッフル付き）フラスコ中での小規模発現について選択した。
【００６１】
ＣＯＬ３Ａ１断片の発現
基本的にはピヒア・パストリス発現キットマニュアルに記載のように発現を行った。簡単には、形質転換体を一晩ＢＭＧ（100 ｍＭリン酸カリウムｐＨ6.0 、1.34％ＹＮＢ、４×10-5％ビオチンおよび１％グリセロール）をＯＤ600 ＝２〜６まで生育させた。次に培養物を遠心してＢＭＭ（グリセロールを 0.5％メタノール変えた以外はＢＭＧと同じ）でＯＤ600 が 1.0になるまで再懸濁した。細胞を４日間30℃および 250ｒｐｍで、毎日メタノールを 0.5％まで加えて生育させた。
【００６２】
培養上清10μｌをLaemmli ［９］によるＳＤＳ−ＰＡＧＥで、バイオラッドのミニPROTEAN IIシステムを用いて分析した。クーマシーブリリアントブルー染色から、幾つかのバンドが明らかになり、そのうちの最大のバンドは、見掛けの長さが約29ｋＤという予想された値を有していた。ゼラチン、コラーゲンおよびコラーゲン断片は、見掛けのＭｗにより移動し、少なくとも部分的には比較的低い平均残基Ｍｗ［12］のため、真のＭｗよりも約 1.4倍高い見掛けのＭｗにより移動することに注意すべきである。
【００６３】
それらを同定するために、アセトン分画されたＣＯＬ３Ａ１発酵上清（分画操作については下記を参照のこと）をかけたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、バイオラッドミニトランスブロットセルを用いてImmobilon ＰSQメンブレン（ミリポア）にブロットした。定量的な移動が、ＣＡＰＳ緩衝液（10％ＭｅＯＨ１リットルあたりＣＡＰＳ2.2 ｇ、ｐＨ11）を用いて、100 Ｖを１時間かけることにより得られた。クーマシーブリリアントブルーによる染色後、４本の最も主なバンドを切り出して、そのＮ末端配列をエドマン分解により決定した。29ｋＤバンドは何のシグナルも示さなかったが、おそらくＮ末端がブロックされているためであろう。二つの小さい断片のうち一つは、配列決定するほどには純粋ではなかった。他の二つの小さいバンドは読み取り可能なシグナルを示し、図３で下線を付けている。バンドはタンパク質分解の一部の形により引き起こされていることは明らかである。これは、ゼラチンがランダムコイル立体配座中の非常にオープンなタンパク質であるためにタンパク質分解を非常に受け易いとのことにより説明することができる。
【００６４】
プロテアーゼ活性
コラーゲンの分解は、ｐＨ5.0 での発酵中にコラーゲンタイプＩおよびＩＩＩで観察された。この分解をさらに特性付けるために試験を行った。この分解は、低いｐＨで発酵プロセスを実施するとき、顕著に減少した。具体的には、ｐＨ3.0 で良好な結果を得た。我々はカザミノ酸の添加の効果も調べた。この添加により、ｐＨ5.0 で両タイプのコラーゲンが保護された。さらに、この添加により、ｐＨ3.0 でコラーゲンタイプＩに対して良好な保護をもたらした。この添加保護は、ｐＨ3.0 でコラーゲンタイプＩＩＩの場合には観察できなかった。細胞外中性プロテアーゼは、ランダムな立体配座から起こるタンパク質分解にかなり冒されやすいコラーゲンを攻撃すると思われる。（発酵操作の記載について下記参照のこと。）ｐＨ3.0 でのｐＣＯＬ３ＡＩ発酵のコラーゲン含有上清を用いて試験を行い、発酵中の分解を最小限とした。遠心分離により細胞を除去した後、上清のｐＨを5.0 に調整した。次に、平行インキュベーションを下記の添加と共に行った。
（１）新しいピヒア・パストリス細胞（ミリＱ（MilliQ）で洗浄したもの）
（２）新しいピヒア・パストリス細胞（ミリＱで洗浄したもの）およびガラスビーズ：この混合物を攪拌した（陽性コントロールＩ）。
（３）何も加えないもの（陰性コントロール）
（４）トリプシン（５ｍｇ／ｍｌ）（陽性コントロールＩＩ）。
【００６５】
すべての試料を96時間、30℃、ｐＨ5.0 でインキュベートした（これらは発酵中ゼラチンの分解を引き起こす条件であった）。最後に、インキュベートされた試料をバイオラッドミニPROTEAN IIシステムでLaemmli ［９］によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行った後、クーマシーブリリアントブルー染色により分析した。
【００６６】
結果は以下通りであった。
（１）ｐＨ5.0 で、洗浄された無傷の細胞とのインキュベーションは、おそらく細胞表面会合タンパク質分解酵素活性の結果としてｐＣＯＬ３Ａ１（元々はｐＨ3.0 で作られたもの）を４〜５の別々のバンドへの分解を引き起こした。
（２）壊れた細胞を添加することにより、両方のコラーゲンタイプが多くのタンパク質分解産物へとその分解が引き起こされた（陽性コントロールＩ）。
（３）ｐＨ5.0 で細胞の不存在下で、分解は起こらなかった。
（４）トリプシンの添加はゼラチンの大量分解を引き起こした（陽性コントロールＩＩ）。
【００６７】
異なる実験において、我々は、発酵の最後に細胞の除去後、無細胞発酵ブロス中の組換えゼラチンが温度範囲０〜30℃で、ｐＨ範囲3.0 〜7.0 で７日間安定であったことを確かめた。よって、ゼラチンのタンパク質分解の一部が発酵中に起こったが、細胞の除去後、関連性のあるタンパク質分解活性は保持されず、生成物を安定化するためのさらなる注意は必要ではない。類似の安定性が下記のＣＯＬ−１Ａ１生成物について観察された。組換えゼラチンは（下記のようにアミノ酸組成の分析により示されているように）ヒドロキシル化されないので、非らせん、すなわち二次構造を持たないために、それら組換えゼラチンの安定性は驚きであった。二次構造（すなわちコラーゲンタイプのらせん）およびヒドロキシプロリンがまったくないことを、参考文献［13］による円偏光二色性スペクトロスコピー（ＣＤ）により、およびペプチド結合の全加水分解後のアミノ酸組成のＨＰＬＣ分析によりそれぞれ確認した。５℃で、発現産物は主にランダムコイル立体配置にとどまり、よって基本的にはゲル化しないことが確認された。これは、実験により確認されたように、らせん安定化させるヒドロキシプロリンがないことによる。よって、組換えゼラチンは、タンパク質分解を著しく受けやすいのに違いない、著しくオープンな分子（およびそれ自体として非平行ポリペプチド）である。この発現宿主での生成物の予想されない安定性は（分泌後でも）、この発現系からの生成物の下流プロセシングおよび単離を非常に容易にし、タンパク質分解活性の高価で不安定な阻害剤（例えばパラ−メチル−スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））を繰返し添加する必要がない。さらに、単純なマイクロ濾過または栄養ブロスに対する透析により、および細胞を発酵糟（fermenter)へ再循環させることによって、発酵中細胞からの生成物を連続的に分離することに対して、高い細胞密度発酵中のゼラチン分解を最小限にする可能性を開発している。前もって三重らせんコラーゲンまたは折りたたみポリペプチドのみが作られている。これらはプロテアーゼに対してより耐性がある。三重らせんコラーゲンはトリプシン、ペプシン、および他の周知のプロテアーゼに対してさえも十分に耐性がある。対照的に、そのままの非ヒドロキシル化で折りたたまれていないゼラチンの保護はしたがって著しく難しいと予想された。
【００６８】
プロテアーゼ欠損株における産生
ｐｅｐ４プロテアーゼＡ欠損株ＳＤＭ１１６８（インビトロゲン）がプロテアーゼ感受性ゼラチン配列の発現によく適合しているかどうかを調べるために、この株もｐＣＯＬ３Ａ１構築物で形質転換した。方法論は上記のとおりであった。不幸にも、振とうフラスコおよび発酵糟発現実験の両方で明らかな陽性の（positive）効果は存在しなかった。
【００６９】
グリコシル化の分析
該タンパク質がグリコシル化されているかどうかを証明するために、過ヨウ素酸による酸化後にシッフ試薬の適用を伴なうＰＡＳ染色をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で行った。ゲルを、12.5％ＴＣＡ中で１時間、１％過ヨウ素酸／３％酢酸中で１時間、15％酢酸中で１時間（10分毎に交換）およびシッフ試薬中で１時間（暗室中４℃で）インキュベートした。次にゲルを 0.5％亜硫酸水素ナトリウムで５分間、２度洗浄し、７％酢酸で脱色した。発現されたタンパク質バンドはシグナルを示さなかったが、陽性コントロール（カルボキシぺプチダーゼＹ）からのシグナルが存在した。予想されたように、陰性コントロール（大腸菌抽出物）を用いてシグナルは得られなかった。発現されたタンパク質はグリコシル化しないと結論することができる。
【００７０】
ノーザンブロット
メタノール成長細胞のノーザンブロットを行った。Schmitt らの方法［10］にしたがってＲＮＡを単離した。ｐＣＯＬ３ＡｌベクターをＥｃｏ−ＲＩ／ＳｐｈＩで消化して 0.5ｋｂのＣＯＬ３Ａ１断片を得た。該断片を32Ｐランダムプライマーで標識し、ブロットにハイブリダイズし、その後ブロットを0.2 ×ＳＳＣの最終濃度になるまで65℃で洗浄した。オートラジオグラフィーは予期された長さ(1.3ｋｂ）のメッセンジャーを明らかにした。
【００７１】
異種ＣＯＬ３Ａ１遺伝子のマルチコピーを含むピヒア形質転換体
ゼラチン発現量をさらに高めることができるかどうかを調べるために、ScorerらのＧ４１８マルチコピー選択法［11］が利用された。ｐＰＩＣ９ＫベクターをＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、9.0 ｋｂバンドを単離した。ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターもＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、得られた1.0 ｋｂ断片を9.0 ｋｂのｐＰＩＣ９Ｋバンドに連結し、その後それを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。こうして得られた構築物ｐＣＯＬ３Ａ１Ｋ（図４）を制限消化により確認した。
【００７２】
ピヒア・パストリスＧＳ１１５を上記のように（Ｍｕｔ+ 形質転換体を得るためにＳａｌＩで消化された）ｐＣＯＬ３Ａ１Ｋベクターで形質転換した。マルチコピー形質転換体を選択するために、ＭＤプレート上のｈｉｓ+ コロニーを集め（約6000個）、0.25〜4.0 ｍｇ／ｍｌの範囲の一連の10種類の異なるＧ４１８（ギブコＢＲＬ）濃度を含有するプレート上で二次スクリーニングに供した。細胞をプレート１枚あたり約105 個の細胞の密度で塗布した。４日間、30℃でのインキュベーション後、各Ｇ４１８濃度の幾つかの耐性コロニーをＧ４１８の対応する量の新しいプレートに移してそれらの耐性を確認した。
【００７３】
Ｇ４１８耐性形質転換体におけるｐＣＯＬ３Ａ１Ｋのコピー数を決定するために、半定量的ドットブロットを行った。確認されたＧ４１８耐性形質転換体のゲノムＤＮＡをLee の方法［８］にしたがって単離し、ＲＮａｓｅ Ａ処理した。40個（Ｇ４１８の濃度あたり４）の形質転換体のそれぞれの染色体ＤＮＡ約 200ｎｇを、真空ブロット装置（ギブコＢＲＬ変換システム）を用いて、正電荷ナイロンメンブレン（ベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim)）に移した。１コピーコントロールとして、サザンブロットにより僅かに１コピーを含むと証明されたｐＣＯＬ３Ａ１形質転換体をブロットに（デュプロで（in duplo))移し、また非形質転換コントロールもブロットに（デュプロで）移した。
【００７４】
ｐＣＯＬ３ＡｌベクターをＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩで消化し0.5 ｋｂのＣＯＬ３Ａ１断片を得た。この断片は32Ｐプライマー標識し、ドットブロットフィルターにハイブリダイズさせた。65℃で0.5 ×ＳＳＣの最終濃度まで洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。（効率をチェックした）ストリップ後、メンブレンを確認済ピヒア・パストリスＵＲＡ−３断片由来のプローブにハイブリダイズさせ、異種ＵＲＡ３プライマーによるＰＣＲにより選択した。このコントロールは、かけられたＤＮＡの量に関してＣＯＬ３Ａ１シグナルの標準化に役立つ。メンブレンを洗浄し、ＣＯＬ−３Ａｌプローブについて記載したようにオートラジオグラフィーに供した。両オートラジオグラフにおけるシグナルをゲルスキャナー（ＰＤＩ、ファルマシア）を用いて濃度による定量を行った。予想されたように、０コピーコントロールについてはＣＯＬ３Ａ１シグナルが存在しなかった一方、ＵＲＡ３シグナルは存在した。そのコピー数は、各ＵＲＡ３シグナルの比により標準化するように、各形質転換体についてのＣＯＬ３Ａ１シグナルと１コピーコントロールに対して得られた平均ＣＯＬ３Ａ１シグナルとの比を計算することで見積もることができる（即ち、メンブレンにブロットされたＤＮＡ量の違いを計算に入れる）。約１〜15コピーを含む形質転換体がこうして得られた。
【００７５】
マルチコピー形質転換体におけるＣＯＬ３Ａ１断片の発現
１〜15コピーを含有する一連の形質転換体を上記のように小規模発現に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、高いコピー数で高い収量を示したので、さらに試験を100 ｍｌの規模で２、５、10および15コピーの形質転換体を用いて行った。これらを、ＢＭＧ25ｍｌ（100 ｍＭリン酸カリウムｐＨ6.0 、1.34％ＹＮＢ、４×10-5％ビオチンおよび１％グリセロール）を含む100 ｍｌフラスコ中で一晩生育させた。1500〜3000ｇで５分間の遠心後、細胞をＢＭＭ100 ｍｌ（グリセロールの代りに0.5 ％メタノールとした以外はＢＭＧと同じ）に再懸濁した。１リットルのバッフル付きフラスコ中、30℃、 250ｒｐｍ、４日間、メタノールを毎日 0.5％まで加えながら細胞を生育させた。試料１ｍｌを毎日採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。高いコピー数は、高い量のゼラチン産物をもたらした。選択された５〜15コピーの形質転換体を発酵糟で１Ｌの規模で発現試験のために用いた。最大のＣＯＬ３Ａ１生産が15コピー形質転換体を用いて得られた（乾燥バイオマス177 ｇ／Ｌで約184 時間発酵後に細胞外培地中約14.8ｇゼラチン／Ｌ、即ち全体で約7.7 ｇ／Ｌ、即ち42ｍｇ／（Ｌ．時間）；乾燥バイオマス110 ｇ／Ｌで約120 時間発酵後、細胞外培地中約７ｇゼラチン／Ｌ、すなわち全体で約3.7 ｇ／Ｌ、または31ｍｇ／（Ｌ．時間））。
【００７６】
マウスＣＯＬ１Ａ１断片（ＣＯＬ１Ａ１−１）マウスのクローニング
プライマーを公知の配列に基づいて設計した（図５）。全体積20μｌ中、マウス17日目の胎児QUICK クローン（QUICK-Clone)（登録商標）（繊維芽細胞）ｃＤＮＡ（クローンテック（Clontech))に対して、ｃＤＮＡ 0.4ｎｇ、0.4 μＭ Ｃ１Ａ１−ＦＷプライマー（図５）、0.4 μＭ Ｃ１Ａ１−ＲＶ１プライマー（図５）、１×Advantage Klen Taqポリメラーゼミックス（クローンテック）、0.2
ｍＭのｄＮＴＰ'ｓ（ファルマシア）および１×Klen TaqＰＣＲ反応緩衝液（クローンテック）を用いて、ＰＣＲを行った。94℃で４分間の最初の変成後に、94℃で１分間、68℃で１分間および72℃で２分間からなるサイクルを35回行った。最終的な伸長（extension)は72℃で10分間であった。アガロースゲル電気泳動は、配列から予想された大きさである１ｋｂバンドを示している。ＤＮＡをアガロースゲルから単離し、次にＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化した。消化された断片をアガロースゲルから単離して、下記の方法にしたがってピヒア・パストリス発現ベクターｐＰＩＣ９にクローニングした（図６）。最初に、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位を有するアダプターをｐＰＩＣ９のマルチクローニング部位に挿入して、ｐＰＩＣ９* を得た。該アダプターを、図５と図６に示されたように合成オリゴヌクレオチドＮ−Ｘ−ＦＷおよびＮ−Ｘ−ＲＶにアニーリングすることにより調製した。オリゴヌクレオチドＮ−Ｘ−ＲＶの5'末端から生じた一本鎖の突出部は、ＥｃｏＲＩ消化ベクターでのアニーリング後にＥｃｏＲＩ部位を形成するように設計した。Ｎ−Ｘ−ＦＷ（ＸｈｏＩ* ）からの5'突出部はベクター上のＸｈｏＩの作用により作られた突出部に相補的であったが、連結後、ＸｈｏＩ部位を作らなかった。標的ベクターであるｐＰＩＣ９がマルチクローニング部位の外側にＮｃｏＩ部位を有しているため、ｐＵＣ１８をこの断片のクローニング用中間ベクターとして用いた。ｐＰＩＣ９* の変更マルチクローニング部位のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩとの間の部分を、ｐＵＣ１８ベクターのマルチクローニング部位に移して、ｐＵＣ１８* が得られた。ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ消化断片ＣＯＬ−１Ａ１−１をＮｃｏＩとＸｈｏＩ部位との間のｐＵＣ１８* ベクターに連結した。このｐＵＣ１８−ＣＯＬ１Ａ１−１構築物から、ＣＯＬ１Ａ１−１断片を、ｐＰＩＣ９からのマルチクローニング部位の部分とともに、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｐＰＩＣ９に連結して、構築物ｐＣＯＬ１Ａ−１が得られた（図７）。よって、ｐＰＩＣ９の部分的ＮｃｏＩ消化は必要ではなかった。ｐＰＩＣ９の正しい挿入を制限分析により最初にチェックし、次にＤＮＡ配列決定によりチェックした。
【００７７】
ｐＣＯＬ１Ａ１−１によるピヒアの形質転換およびＣＯＬ１Ａ１−１断片の発現
ピヒア・パストリスＧＳ１１５を、ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターについて記載されたようにｐＣＯＬ１Ａ１−１で形質転換した。ＳａｌＩ消化ＤＮＡを、具体的にはＭｕｔ+ 形質転換体を作るために用いた。いくつかの形質転換体を振とうフラスコ中の小規模発現のために用い、そのうちの一形質転換体を発酵糟中で１〜100 Ｌの規模での発現のために選択した。典型的な収率は（細胞外）培地１リットルあたり、乾燥バイオマス100 〜120 ｇ／Ｌ（全体でゼラチン約３ｇ／Ｌ）であり、ゼラチン４〜５ｇ（下記のようにアセトン分画後に測定されたもの）の範囲にある。目的のゼラチン（図８）は、理論Ｍｗ27.4ｋＤを有している。コラーゲン性タンパク質およびゼラチンは、見掛けのＭｗであり、真のＭｗよりも1.4 倍速く移動することが知られている［10］。一致するように、約38ｋＤの見掛けのＭｗで移動するＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドが観察された（球状タンパク質Ｍｗマーカーを用いて得られた内挿値）。さらに、見掛けのＭｗ24、18および15ｋＤ（内挿値）を有する３種類の短い産物が観察された。これらは、細胞間の細胞表面会合もしくは細胞外区画中、または翻訳レベルでの問題からの初期タンパク質分解活性の結果であろう。分解産物は、誘導のごく初期段階に存在し、それ以上の分解は起こらなかった。ｐＨ5.0 および30℃での96時間の洗浄されたそのままの細胞の存在下でのインキュベーションでさえ、ｐＨ3.0 での発酵後の場合についてｐＣＯＬ１Ａ１−１のそれ以上の分解を引き起こさなかった。（大量の分解は、陽性コントロールとしてのトリプシンの存在下で起こった）。ｍＲＮＡレベルでの問題が24、18および15ｋＤ産物の存在の原因ではないことを確認するために、プローブとして、ｐＣＯＬ１Ａ１−１からの32Ｐランダムプライマー標識化 1.0ｋｂＮｃｏＩ／ＸｈｏＩＣＯＬ−１Ａ１−１断片を用いて、ＣＯＬ３Ａ１について記載されたように、ノーザンブロットを行った。予想された 1.6ｋｂメッセンジャーが見出された。
【００７８】
観察されたフラグメントの同定を確立するために、アセトン分画化ＣＯＬ１Ａ１−１発酵上清を充填したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをバイオラッドミニトランスブロットセルを用いるImmobilon ＰSQメンブラン（ミリポア）にブロットした。（アセトン分画操作の記載については下記を参照のこと）。定量的移動は、ＣＡＰＳ緩衝液（10％ＭｅＯＨ１リットルあたりＣＡＰＳ2.2 ｇ、ｐＨ11）を用いて、100 Ｖを１時間印加することにより行った。クーマシーブリリアントブルーによる染色後、４本の主なバンドを切り出し、そのＮ末端配列をエドマン分解により決定した。得られた配列決定シグナルは、充填された材料の量と比較して著しく低かった（平均５％程度）。したがって、該断片はほとんどがＮ末端でブロックされていると思われる。これは、ＣＯＬ１Ａ１−１のタンパク質分解が細胞内で起こるとの考えを支持する。それにもかかわらず、供給された大量のＣＯＬ１Ａ１はＮ末端配列の容易な決定を可能とした。得られたＮ末端配列は、トランスフェクトされたＣＯＬ１Ａ１−１遺伝子によりコードされたタンパク質配列（図８）に下線を付す。38ｋＤと18ｋＤの両方の見掛けのＭｗを有する断片は、該タンパク質のＮ末端について予想された配列を与えたが、'ＥＡ'により伸長した。この伸長（即ちＥＡＥＡ）は、サッカロミセス・セレビシアエ由来のα接合因子（αＭＦ）プレプロシグナルを利用する発現ベクターから発現される幾つかのタンパク質上に存在することが知られている。この効果はＳＴＥ１３切断活性の立体的妨げによるものと思われる。しかし、タンパク質のほとんどがおそらくＮ末端でブロックされているために、この伸長したバージョンは配列決定可能な小さいフラクションのみを表すのであろう。Ｎ末端および内部配列に基づいて、見掛けのＭｗ38、24、18および15ｋＤを有する断片が、図８に示されているように、標的産物の残基１〜310 、126 〜310 、１〜125 および42〜125 からそれぞれなる断片であると割り当てられた。残基１〜41（理論Ｍｗ４ｋＤ）および42〜310
（理論Ｍｗ24ｋＤ、見掛けのＭｗ34ｋＤ）に対応する断片は観察されなかった。これは、残基41と42との間よりも残基125 と126 との間の（さらに）多くの頻繁な切断によるものであろう。
【００７９】
マウスＣＯＬ１Ａ１−２のクローニングと発現
マウス１７日目の胎児QUICK-Clone(登録商標）ｃＤＮＡ（クローンテック）に対してマウスＣＯＬ１Ａ１−Ｉと同じように、Ｃ１Ａ１−ＦＷおよびＣ１Ａ１−ＲＶ２プライマーを用いてＰＣＲを行った。94℃で４分間での変成後に、94℃で１分間、65℃で１分間および72℃で３分間からなるサイクルを35回行った。最終的な伸長は72℃で10分間であった。アガロースゲル電気泳動は、配列から予想された大きさである1.8 ｋｂバンドを示している。ＣＯＬ１Ａ１−２のｐＰＩＣ９発現ベクターへのクローニングが、ＣＯＬＩＡ−１と同じように、さらに行われてｐＣＯＬ１Ａ１−２が得られた（図９）。
【００８０】
ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターについて記載したように、ピヒア・パストリスＧＳ１１５をｐＣＯＬ１Ａ１−２ベクターで形質転換した。Ｍｕｔ+ 形質転換体を特異的に作るためにＳａｌＩ消化ＤＮＡを用いた。振とうフラスコ中での小規模での発現のために幾つかの形質転換体を用いて、それらの一つを、１〜100 Ｌ規模での発酵糟中発現のために選択した。図10は予想されたＣＯＬ１Ａ１−２アミノ酸配列を示す。典型的な収量は、バイオマス100 〜120 ｇ／Ｌ（全体でゼラチン３ｇ／Ｌ）において、（細胞外）培地中、４〜５ｇ／Ｌゼラチンの範囲である。標的ゼラチン（図10）は、理論Ｍｗ53ｋＤを有する。この値と一致して（およびＳＤＳ−ＰＡＧＥでのゼラチンの公知の異常な移動［10］により）、見掛けのＭｗ約74ｋＤ（球状タンパク質Ｍｗマーカーを用いて得られた内挿値）で移動するＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドが観察された。さらに、見掛けのＭｗ56、18および15ｋＤ（内挿値）を有する３つの短い産物が観察された。タンパク質分解切断がＣＯＬ１Ａ１−１およびＣＯＬ１Ａ１−２の発現産物に対応する部位で生じる場合（図８、10）、ＣＯＬ１Ａ１−２産物の残基１〜595 、126 〜595 、１〜125 、および42〜125 からなる断片が生じることが予想されよう。これらは、見掛けのＭｗが74、58、17および11ｋＤに対応する、理論Ｍｗそれぞれ53、42、12および８ｋＤを有するだろう。驚くことに、これは、観察された見掛けのＭｗによく対応し、ＣＯＬ１Ａ１−２の切断が主に残基125 と126 の間の結合、および（さらに）41と42の結合に制限されていたことを示している。また、残基１〜41（理論Ｍｗ４ｋＤ）および42〜595 （理論Ｍｗ50ｋＤ、見掛けのＭｗ70ｋＤ）に対応する断片は観察されなかった。ＣＯＬ１Ａ１−１で示されたように、これは残基41と42との間よりも残基125 と126 との（さらに）多くの頻繁な切断によるものであろう。
【００８１】
マウスＣＯＬ１Ａ１−３のクローニングと発現
マウス１７日目の胎児QUICK-Clone(登録商標）ｃＤＮＡ（クローンテック）に対して、マウスＣＯＬ１Ａ１−１と同じように、Ｃ１Ａ１−ＦＷおよびＣ１Ａ１−ＲＶ３プライマーを用いてＰＣＲを実施した。94℃で４分間の変成後に、94℃で１分間、65℃で１分間および72℃で３分間からなるサイクルを35回行った。最終的な伸長は72℃で10分間であった。アガロースゲル電気泳動は、配列から予想された大きさである 2.8ｋｂバンドを示している。
【００８２】
ＰＵＣ１８* プラスミドをＮｃｏＩで消化し、脱リン酸化した。Ｃ１Ａ１−ＦＷ／Ｃ１Ａ１−ＲＶ３ ＰＣＲ生成物をＮｃｏＩで消化し、得られた 2.5ｋｂ断片をゲル精製し、これを、該ＮｃｏＩ消化され且つ脱リン酸化したベクターに連結した。大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅの形質転換後、得られたクローンの挿入物の正確な向きをＰｖｕＩＩ消化により確認した。さらに、ＣＯＬ１Ａ１−３のｐＰＩＣ９発現ベクターへのクローニングが、ＣＯＬＩＡ−１について記載した方法と同じようにさらに行われて、ｐＣＯＬ１Ａ１−３が得られた（図11）。
【００８３】
ピヒア・パストリスＧＳ１１５をｐＣＯＬ１Ａ１−３ベクターで、ｐＣＯＬ３Ａ１ベクターについ記載したように形質転換した。Ｍｕｔ+ 形質転換体を特異的に作るためにＳａｌＩ消化ＤＮＡを用いた。幾つかの形質転換体を振とうフラスコ中での小規模発現のために用いて、それらの一つを発酵糟中、１〜100 Ｌ規模での発現のために選択した。図12は予想されたＣＯＬ１Ａ１−３アミノ酸配列を示す。典型的な収量は、（細胞外）培地中、乾燥バイオマス100 〜120 ｇ／Ｌにおいて、４〜５ｇゼラチン／Ｌの範囲（アセトン分画後に測定）である（全体で３ｇゼラチン／Ｌ）。標的ゼラチン（図12）は、理論Ｍｗ72ｋＤである。この値に一致して、見掛けのＭｗ約100 ｋＤ（球状タンパク質Ｍｗマーカーを用いて得られた内挿値）で移動するＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドが観察された。さらに、見掛けのＭｗが85、18および15ｋＤ（内挿値）の３つの短い産物が観察された。タンパク質分解がＣＯＬ１Ａ１−１およびＣＯＬ１Ａ１−３の発現産物の均一部位で起こる場合（図８，12）、ＣＯＬ１Ａ１−３産物の残基１〜812 、126 〜812 、１〜125 、および42〜125 からなる断片が存在することが予想されよう。これらは、見掛けのＭｗが100 、84、17および11ｋＤのそれぞれに対応する理論上のＭｗ72、60、12および８ｋＤを有するだろう。驚くことに、これは観察された見掛けのＭｗによく対応し、ＣＯＬ１Ａ１−３の切断が主に残基125 と126 の間の結合および（さらに少ない程度で）41と42の結合に限定されていることを示している。再び、残基１〜41（理論Ｍｗ４ｋＤ）および42〜812 （理論Ｍｗ68ｋＤ、見掛けのＭｗ96ｋＤ）に対応する断片は観察されなかった。これは、ＣＯＬ１Ａ１−１に示されたように、残基41と42との間よりも残基125 と126 との間の（さらに）多くの頻繁な切断によるものであろう。
【００８４】
表１は、分子量マーカータンパク質（ＬＭＷキャリブレーションキット；ファルマシア）との比較により得られた見掛けＣＯＬ１Ａ１断片サイズを、配列から計算したサイズとともにまとめた。
【００８５】
ＣＯＬ１Ａ１断片の見掛けの分子量および理論分子量
【表１】
【００８６】
表１から、「ＭＧＰＲ」モデルは、実際に見出された断片によく適合していることがわかる。
【００８７】
残基１〜41（４ｋＤ；１Ａ１−１，２，３）および残基42〜310 （理論Ｍｗ：24ｋＤ、見掛けのＭｗ：34ｋＤ；１Ａ１−１）、残基42〜595 （理論Ｍｗ：50ｋＤ、見掛けのＭｗ：70ｋＤ；１Ａ１−２）、または残基42〜595 （理論Ｍｗ：68ｋＤ、見掛けのＭｗ：96ｋＤ；１Ａ１−３）の断片も予想できるであろう。これらの断片がゲル上に見られないということは、第２の「ＭＧＰＲ」部位での切断速度が、第１の部位よりもさらに高いとみなすことにより説明がつくだろう。このことは、タンパク質分子が切断される場合、それが常に第２の部位で最初に起こることを意味する。切断速度におけるこの違いは、第１の部位がプロテアーゼを立体的に妨げる可能性のあるプロリン残基の前に存在するとのことで説明がつくだろう。
【００８８】
マウスＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２およびＣＯＬ１Ａ１−３'ＲＧＰＭ'変異体
我々は、タンパク質分解酵素の認識部位として働く同じアミノ酸配列がすべてのＣＯＬ１Ａ１産物（ＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２、ＣＯＬＩＡ１−３）の分解の原因である可能性を考慮した。驚くことに、ＣＯＬ１Ａ１−１断片15ｋＤおよび24ｋＤから得られた両内部Ｎ末端配列は、同一の配列「ＭＧＰＲ」よりも前に存在する。さらに、この配列は、残基83〜41および残基 122〜 125に対して、マウスＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２、またはＣＯＬ１Ａ１−３遺伝子中に２回のみ存在する。（ＣＯＬ１Ａ１−１と比較して、ＣＯＬ１Ａ１−２及びＣＯＬ１Ａ１−３は、付加的なＭＧＰＲ部位を含まない。）また、ラットからのＣＯＬ３Ａ１断片はそのような部位を含まなかった。これは観察された切断パターンにうまく対応する。したがって、我々は、「ＭＧＰＲ」が特定のプロテアーゼにより認識される部分であり、ＣＯＬ１Ａ１タンパク質の切断をもたらすと考えている。このＭＧＰＲプロテアーゼ認識部位は以前には記載されていない。この部分のさらに一般化された表示は、おそらくＭＸＸＲ、ＭＸＸ［ＲＫ］、または［ＭＬＩＶ］ＸＸ［ＲＫＨ］であろう。前者２つの部分は実際に全マウスＣＯＬ１Ａ１遺伝子中にわずかに２回存在するだけであり、ＣＯＬ３Ａ１断片には存在いない。一方、三番目の部分は広いために非切断部位（ＣＯＬ１Ａ１中の残基85〜88のＭＫＧＨおよび残基169 〜172 のＶＧＡＫ、並びにＣＯＬ３Ａ１中の残基198 〜201 のＩＫＧＨ）を含む。よって、ＭＸＸＲまたはＭＸＸ［ＲＫ］は［ＭＬＩＶ］ＸＸ［ＲＫＨよりもさらに一般化された部分である。図13はＣＯＬ−１Ａ１−２配列中の「ＭＧＰＲ」部分を示している。このタンパク質切断部位が、それが比較的オープンで、折りたたまれていない構造（我々のゼラチンのように）で存在するが、さらにコンパクトに折りたたまれた構造（球状タンパク質のように）では容易に存在しない場合、関与する酵素により単に認識されることが予想できる。よって、それは、ゼラチンおよび折りたたまれていないコラーゲン等のある種のタンパク質及びポリペプチドにのみ重要であろう。
【００８９】
３つの他の主要バンドが存在することなく、完全長のＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−２およびＣＯＬ１Ａ１−３を作ることができるために、「ＭＧＰＲ」部分が部位特異的変異誘発により除去しなければならない。天然のＣＯＬ１Ａ１ゼラチンの元のアミノ酸組成を保持するために、「ＭＧＰＲ」部分を「ＲＧＰＭ」に変換することにより除去した。下記の相補的プライマーの二対が合成された。
【００９０】
ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＦＷ：
Ｒ Ｇ Ｐ Ｍ
5'-GAG-CCT-GGC-GGT-TCA-GGT-CCA-CGA-GGT-CCA-ATG-GGT-CCC-CCT-GG-3'
ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＲＶ：
5'-CC-AGG-GGG-ACC-CAT-TGG-ACC-TCG-TGG-ACC-TGA-ACC-GCC-AGG-CTC-3'
ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＦＷ：
Ｒ Ｇ Ｐ Ｍ
5'-GGA-GCT-CCT-GGC-CAG-CGA-GGT-CCA-ATG-GGT-CTG-CCC-GGT-GAG-AG-3'
ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＲＶ：
5'-CT-CTC-ACC-GGG-CAG-ACC-CAT-TGG-ACC-TCG-CTG-GCC-AGG-AGC-TCC-3'
注意：変異部位に下線が引かれている；Ｐｒｏ残基の元のＣがＡに変換されてＮｃｏＩ部位の生成を避ける。
【００９１】
３プライマーの組合せが用いられた：
１．5'ＡＯＸ１プライマーとＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＲＶ
２．ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ１ＦＷとＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＲＶ
３．ＣＯＬ１Ａ１ＭＵＴ２ＦＷと3'ＡＯＸ１
【００９２】
反応物は、1.25Ｕ Ｐｗｏポリメラーゼ（ユーロゲンテック（Eurogentec))、各プライマー50ｐｍｏｌ、0.2 ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ファルマシア）、１×Ｐｗｏ緩衝液（ユーロゲンテック）およびｐＣＯＬ−１Ａ１−１テンプレートＤＮＡ15ｎｇを全反応体積50μｌ中に含んだ。使用したＰＣＲ装置は、GeneAmp 9700（パーキンエルマー）であった。94℃で５分間の最初のインキュベーション後、94℃で30秒間、60℃で30秒間および72℃で45秒間からなるサイクルを18回行った。最終伸長は72℃で10分間行った。ＰＣＲ反応のアガロース電気泳動は予想された大きさ（それぞれ0.5 、0.3 および0.7 ｋｂ）の産物であることがわかった。バンドをゲルから切り出して精製した。次に、単離した断片をオーバーラップ伸長ＰＣＲに供した。各断片約0.1 ｐｍｏｌを共に混合した。5'ＡＯＸ１ 50ｐｍｏｌおよび3'ＡＯＸ１プライマー、ならびにＰｗｏポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよび上記の緩衝液を加えた。72℃での伸長を45秒間の代りに90秒間実施した以外、サイクル条件は上記と同じである。アガロースゲル電気泳動により、予期された1.5 ｋｂ産物であることがわかった。ＰＣＲ反応の残りはＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精製した。精製されたＤＮＡを次にＢａｍＨＩ／ＡｐａＩで消化し、その後、得られた1.0 ｋｂ断片をゲルから精製した。ＡｐａＩ部位のｄｃｍメチル化を除去するために、大腸菌株ＪＭ１１０をｐＣＯＬ１Ａ１−１、ｐＣＯＬ１Ａ１−２およびｐＣＯＬ１Ａ１−３で形質転換した。ＤＮＡ単離後、プラスミドをＢａｍＨＩ／ＡｐａＩで消化した。それぞれ7.9 、8.8 および9.5 ｋｂの得られたベクター断片をアガロースゲルから精製し、ＢａｍＨＩ／ＡｐａＩ消化ＰＣＲ生成物に連結した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅをこれらの連結反応物で形質転換し、ＰＣＲで証明された挿入物を含有するクローンのプラスミドＤＮＡを単離し、自動化配列決定法により証明した。こうして作られた変異体プラスミドｐＣＯＬ１Ａ１−１* 、ｐＣＯＬＩＡ１−２* およびｐＣＯＬＩＡ１−３* をＳａｌＩで消化してピヒア・パストリス株ＧＳ１１５を形質転換するために用いた。小規模および発酵糟規模の発現を、ＣＯＬＩＡ１−１で記載したように行った。
【００９３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、予期された完全長サイズの僅かに一つの主要バンドがｐＣＯＬ１Ａ１−１* ならびにｐＣＯＬＩＡ１−２* およびｐＣＯＬＩＡ１−３* について形成された。
【００９４】
合成遺伝子の構築と発現
極性ゼラチン（Ｐ単量体）をコードする合成遺伝子は、オーラーラップ伸長ＰＣＲにより構築した。理論上の分子量及び等電点は、それぞれ9.1 ｋＤ及び4.9
であった。該遺伝子は、ピヒア・パストリスの高度に発現された遺伝子のコドン利用を有するように設計された（Sreekrishna, K. and Kropp, K. E. (1996) Pichia pastoris, Wolf, K. (Ed), Nonconventional yeasts in biotechnology. A handbook, Springer-Verlag, pp. 6/203-6/253 ）。二つの別々のＰＣＲ反応を下記のオリゴヌクレオチドを用いて実施した。
【００９５】
ＯＶＬ−ＰＡ−ＦＷ １ｐｍｏｌ、ＯＶＬ−ＰＡ−ＲＶ １ｐｍｏｌ、ＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ 50ｐｍｏｌおよびＨＬＰ−ＰＡ−ＲＶ 50ｐｍｏｌ。
ＯＶＬ−ＰＢ−ＦＷ １ｐｍｏｌ、ＯＶＬ−ＰＢ−ＲＶ １ｐｍｏｌ、ＨＬＰ−ＰＢ−ＦＷ 50ｐｍｏｌおよびＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶ 50ｐｍｏｌ。
【００９６】
オリゴヌクレオチド配列は次の通りである。
ＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ：5'-GCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGC-3'
ＯＶＡＬ−ＰＡ−ＦＷ：
5'-GCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTCCACCCGGTGAGCCAGGTAACCCAGGATCTCCTGGTAACCAAGGACAGCCCGGTAACAAGGGTTCTCCAGGTAATCCA-3'
ＯＶＬ−ＰＡ−ＲＶ：
5'-TGAGAACCTTGTGGACCGTTGGAACCTGGCTCACCAGGTTGTCCGTTCTGACCAGGTTGACCAGGTTGACCTTCGTTTCCTGGTTGACCTGGATTACCTGGAGAACCCTT-3'
ＨＬＰ−ＰＡ−ＲＶ：5'-TGAGAACCTTGTGGACCGTTGGAA-3'
ＨＬＰ−ＰＢ−ＦＷ：5'-TTCCAACGGTCCACAAGGTTCTCA-3'
ＯＶＬ−ＰＢ−ＦＷ：
5'-TTCCAACGGTCCACAAGGTTCTCAGGGTAACCCTGGAAAGAATGGTCAACCTGGATCCCCAGGTTCACAAGGCTCTCCAGGTAACCAAGGTTCCCCTGGTCAGCCAGGTAACCCT-3'
ＯＶＬ−ＰＢ−ＲＶ：
5'-GCGTCTGCAGTACGAATTCTATTAGCCACCGGCTGGACCCTGGTTTCCTGGTTTACCTTGTTCACCTGGTTGACCAGGGTTACCTGGCTGACCAGGGGAACCTTGGTT-3'
ＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶ：5'-GCGTCTGCAGTACGAATTCTATTAGC-3'
【００９７】
ＰＣＲ反応物50μｌは、0.2 ｍＭ ｄＮＴＰ'ｓ（ファルマシア）、１×Ｐｗｏ緩衝液（ユーロゲンテック）および1.25Ｕ Ｐｗｏポリメラーゼ（ユーロゲンテック）を含んでいた。反応１は、94℃で15秒間および72℃で15秒間からなる18サイクルを伴なった。反応２はタッチダウンＰＣＲを伴なうことで、各サイクルは94℃で15秒間、アニーリング温度で15秒間および72℃で15秒間からなった。アニーリング温度は最初の５サイクルで72℃から68℃まで低下させ、その後、67℃でのアニーリング温度でさらに20サイクルを行った。
【００９８】
ＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離した。各断片0.3 ｐｍｏｌと外側プライマーＨＬＰ−ＰＡ−ＦＷ50ｐｍｏｌおよびＨＬＰ−ＰＢ−ＲＶをオーバーラップ伸長ＰＣＲに供した。94℃で15秒間、67℃で15秒間および72℃で15秒間からなる25サイクルを行った。得られた0.3 ｋｂ ＰＣＲ断片をＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、クローニングベクターｐＭＴＬ２３にクローニングした。遺伝子の配列を自動化ＤＮＡ配列決定により確認した。
【００９９】
Ｐテトラマー（Ｐ４；理論分子量36.8ｋＤ）を作るために、ベクターをＤｒａＩＩＩ／Ｖａｎ９１Ｉで消化することにより該断片を放出させた。別の反応において、ベクターをＶａｎ９１Ｉで消化し、脱リン酸化した。次に、ＤｒａＩＩＩ／Ｖａｎ９１Ｉ断片をこのＶａｎ９１Ｉ消化ベクターに挿入した。これによりＰダイマーを有するベクターを得た。このダイマーはＤｒａＩＩＩ／Ｖａｎ９１Ｉによる消化により放出させ、ダイマーを有するベクターのＶａｎ９１Ｉ部位中に再挿入して、Ｐテトラマー（Ｐ４）を得た。次に、Ｐ断片とＰ４断片をベクターｐＩＣ９のＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。成熟（プロセシング後の）Ｐモノマーおよびテトラマーのコードされたアミノ酸配列は下記の通りである。
【０１００】
モノマー（Ｐ）：
１ GPPGEPGNPG SPGNQGQPGN KGSPGNPGQP GNEGQPGQPG QNGQPGEPGS NGPQGSQGNP
61 GKNGQPGSPG SQGSPGNQGS PGQPGNPGQP GEQGKPGNQG PAGG
テトラマー（Ｐ４）：
１ GPPGEPGNPG SPGNQGQPGN KGSPGNPGQP GNEGQPGQPG QNGQPGEPGS NGPQGSQGNP
61 GKNGQPGSPG SQGSPGNQGS PGQPGNPGQP GEQGKPGNQG PAGEPGNPGS PGNQGQPGNK
121 GSPGNPGQPG NEGQPGQPGQ NGQPGEPGSN GPQGSQGNPG KNGQPGSPGS QGSPGNQGSP
181 GQPGNPGQPG EQGKPGNQGP AGEPGNPGSP GNQGQPGNKG SPGNPGQPGN EGQPGQPGQN
241 GQPGEPGSNG PQGSQGNPGK NGQPGSPGSQ GSPGNQGSPG QPGNPGQPGE QGKPGNQGPA
301 GEPGNPGSPG NQGQPGNKGS PGNPGQPGNE GQPGQPGQNG QPGEPGSNGP QGSQGNPGKN
361 GQPGSPGSQG SPGNQGSPGQ PGNPGQPGEQ GKPGNQGPAG G
【０１０１】
ＰおよびＰ４ゼラチンの起こりうるＣ末端分解を防止するために、ＰとＰ４と同一の配列を有するが、Ｇｌｙ残基の代りにＣ末端Ｐｒｏを有する構築物を作った（それぞれをＰＣとＰ４Ｃとした）。
【０１０２】
ベクターをＳａｌＩによる消化により直鎖とし、これを用いてピヒア・パストリス株ＧＳ１１５を形質転換した。発酵を、ＣＯＬ１Ａ１について記載したように（すなわちｐＨ３およびカザミノ酸の存在下での成長）行った。培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、予想されたＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質バンドを明らかにした。収率は１グラム／Ｌ発酵培地と算出された。生産物を上天然のゼラチンについて上記したようにアセトン分画（すなわち40％アセトンでの内因性タンパク質の除去と80％アセトンでのゼラチンの析出）により精製することができた。
【０１０３】
発酵糟中のゼラチンの発現／産生
供給バッチ発酵をインビトロゲン社のピヒア発酵法指針にしたがって行った。細胞を、最初の実験段階で１リットルの発酵糟（アップリコン）中で生育させて、タンパク質産生を最適化した。その後、コラーゲンのパイロット規模生産のために、細胞を20リットルまたは140 リットルの発酵糟（バイオベンチ２０、バイオパイロット１４０、アップリコン（Aplikon)）で生育させた。作動体積はそれぞれ１リットル、15リットルおよび100 リットルであった。AD1020コントローラ（アップリコン）を用いて発酵パラメータをモニターし、調節した。プログラムBioXpert（アップリコン）をデータ保存のために用いた。溶解酸素レベルを、酸素電極（１リットル発酵についてはインゴールド（Ingold）、大規模発酵についてメトラー・トレド（Mettler Toledo))を用いて発酵糟中でモニターした。攪拌（500 〜1000ｒｐｍ）と通気（１〜２ｖｖｍ、すなわち１〜２ＬＬ-1／分）を手動で調整して溶解酸素濃度を20％以上に保った。ｐＨをｐＨ電極（ブロードリージェームス（Broadly James)社）で測定し、水酸化アンモニウム（25％）の添加によりｐＨ3.0 またはｐＨ5.0 に自動的に維持し、該水酸化アンモニウムは微生物成長のための窒素源としても機能した。消泡電極を用いて過剰の発泡を防止した。必要であれば、消泡Strutol J673（チル＆ザイラッハー（Schill & Seilacher）、ハンブルグ、ドイツ）を用いた。微生物の成長を細胞乾燥重量の測定によりモニターした。検量線を作成することで細胞湿重量を細胞乾燥重量に換算することができた。細胞湿重量は、試料２ｍｌを５分間15,000ｒｐｍで遠心分離後、上清を除去することにより測定した。細胞乾燥重量は、細胞 200μｌを予備乾燥フィルター（0.45μｍメンブレン、シュライヒナー＆シェル、ダッセル、ドイツ）に加え、脱イオン水25ｍｌで洗浄し、乾燥（例えば電子レンジで1000Ｗ、15分間）した後に測定した。細胞乾燥重量は、細胞湿重量の約１／３であった。前培養はＭＧＹの初期発酵体積の合計10％を含有するフラスコ中でＭＧＹプレート上のコロニーから開始した。培地の体積は全フラスコ体積の20％以下であった。細胞を30℃、200 ｒｐｍでロータリーシェーカー（ギャレンカンプ）で24〜60時間生育させた。
【０１０４】
発酵培地
発酵糟中の発酵基礎塩培地は、１リットルあたり、リン酸26.7ｍｌ（85％）、硫酸カルシウム0.93ｇ、硫酸カリウム18.2ｇ、硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ 14.9ｇ、水酸化カリウム4.13ｇおよびグリセロール40.0ｇを含んでいた。ＰＴＭ1 微量塩4.3 ｍｌの量を発酵基礎塩培地１リットルあたり加えた。ＰＴＭ1 微量塩は、１リットルあたり、塩化第二銅・２Ｈ2 Ｏ 4.5ｇ、ヨウ化カリウム0.09ｇ、塩化マンガン・４Ｈ2 Ｏ 3.5ｇ、モリブデン酸ナトリウム・２Ｈ2 Ｏ 0.2ｇ、ホウ酸0.02ｇ、硫酸コバルト・７Ｈ2 Ｏ1.08ｇ、硫酸亜鉛・７Ｈ2 Ｏ42.3ｇ、硫酸鉄・７Ｈ2 Ｏ65.0ｇ、ビオチン 0.2ｇおよび硫酸5.0 ｍｌを含んでいた。微量塩はフィルター濾過（ポアサイズ0.22μｍ、コスター、米国）で除菌した。カザミノ酸（カゼイン加水分解物、メルク）を別に滅菌し、マウスのコラーゲンタイプＩが発現されたときに（ＣＯＬ１Ａ１−１、ＣＯＬ１Ａ１−１* 、ＣＯＬ１Ａ１−２、ＣＯＬ１Ａ１−２* 、ＣＯＬ１Ａ１−３、ＣＯＬ１Ａ１−３* ）、５ｇ／ｌの量で発酵培地に加えた。発酵中、50時間後に、５ｇ／ｌ滅菌カザミノ酸をさらに発酵培地に加えた。
【０１０５】
ｍｕｔ+ 培養物の発酵
発酵糟を発酵基本塩培地とともに滅菌した。20リットルと120 リットルの発酵糟をそれぞれ５〜7.5 リットルと50リットルの容量の初期培地とともにその場で滅菌した。１リットル発酵糟を培地500 ｍｌとともにオートクレーブ中で滅菌した。滅菌後、温度を30℃に設定し、攪拌と通気をそれぞれ500 ｒｐｍと１ｖｖｍ（すなわ、１ＬＬ-1／分）に設定した。ｐＨを25％水酸化アンモニウムで設定点（通常ｐＨ5.0 ）に調整した。微量塩を培地に無菌的に加えた。発酵糟にＭＧＹの前培養培地の初期発酵体積の10％を接種した。バッチ培養物を、グリセロールが完全に消費されるまで（18〜24時間）生育させた。これは、溶解酸素濃度の100 ％までの増加により示された。細胞乾燥重量はこの段階で25〜35ｇ／ｌであった。その後、グリセロール供給バッチ相を、グリセロール１リットルあたりＰＴＭ1 微量塩を12ｍｌ含む50％（ｖ／ｖ）グリセロールの供給を始めることにより開始した。グリセロール供給は、18ｍｌ／時間／１リットル初期発酵体積に設定した。グリセロール供給は４時間、または長期ラグ相の場合は一晩実施した。グリセロールバッチ相中、発酵培地のｐＨを3.0 まで低下させた。タンパク質誘導相は、メタノール１リットルあたりＰＴＭ1 微量塩を12ｍｌ含む100 ％メタノール供給を始めることにより開始した。供給速度は３ｍｌ／時間／リットルの初期発酵糟体積に設定した。最初の数時間、メタノールは発酵糟中に蓄積した。２〜４時間後、溶解酸素量はメタノールへの順応のために減少した。迅速溶解酸素の上昇の場合、メタノール供給を、６ｍｌ／時間／リットルの初期発酵糟体積まで増加させた。炭素源が制限されている場合、炭素源を封じることにより培養の代謝速度が減少して、溶解酸素濃度が高まる。さらに２時間後、メタノール速度は９ｍｌ／時間／リットルの初期発酵糟体積まで増加させた。この供給速度は残りの培養中にわたって維持した。培養は、70〜130 時間のメタノール供給バッチ相後に止めた。培養中、試料２ｍｌを取り、遠心し（５分間、15,000ｒｐｍ）、上清を−20℃で保存した。
【０１０６】
ゼラチンおよび全タンパク質の濃度を、試料（0.22μｍ）の濾過およびその後のアセトン分画（40体積％アセトン後に60〜80体積％アセトン）後に測定した。メルクのゼラチンをリファレンスとして用いて、ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアス（Pierce))を慣用的に用いた。アミノ酸組成のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび分析にしたがって、非コラーゲンタンパク質は40％アセトンで析出した一方、ＣＯＬ３Ａ１およびＣＯＬ１Ａ１断片は60〜80％で析出した。60％アセトンで、好ましくは高分子量のゼラチン成分が析出した。増加アセトン濃度で、上記の主要な分解生成物の増加する析出が得られた。80％で、すべての主要な分解生成物が（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりチェックされたように）析出物中に回収された。小ペプチドと他の低分子量不純物が80％アセトンでは溶液中にとどまった。
【０１０７】
１リットルの培養の場合、培養の最後に、細胞を遠心分離すること（10,000ｒｐｍ、30分、４℃）により除去した。20リットルの培養の場合は、マイクロフィルター濾過により細胞を除去した。細胞ブロスを、最初に孔径が0.50μｍのポリエーテルスルホンメンブレンを含むマイクロ濾過モジュール（X-Flow社のRX 300濾過モジュールに合わせたX-Flow社のタイプMF 05 M2）に適用した。その後、上清を孔径が0.2 μｍのポリエーテルスルホンメンブレンを含む類似のタイプのマイクロ濾過モジュール（同様にX-Flow社のタイプMF 02 M1）に適用した。120 リットルの発酵の場合、細胞を、孔径が0.2 μｍのポリエーテルスルホンメンブレンを有するパイロットプラント規模のマイクロ濾過ユニット（R-10メンブレンモジュールに合わせたX-Flow社のタイプMF 02 M1）により除去した。これらの濾過ユニットは、単に例として示しただけである。細胞を除去するためにどのような適当なマイクロ濾過システムも利用できることを理解されたい。任意に、細胞およびデブリ（debris）の塊を遠心分離により除去し、上清および細胞を洗浄するために用いられた培地のみをマイクロ濾過ユニットに適用した。または、発酵ブロスから産物を回収し、産生したゼラチンを特異的に結合させる樹脂を用いる、適切な膨張層クロマトグラフィーシステムに該発酵ブロスを適用することにより産物を細胞から分離することができる。我々は、ファルマシアのＳＰセファロースＸＬストリームラインを膨張層モード中のカチオン交換体（ｐＨ３〜４）としてうまく利用することができた。
【０１０８】
Ｍｕｔs 培養物の発酵
グリセロールバッチおよび供給バッチ相を、ｍｕｔ+ 培養物について記載されたように行った。Ｍｕｔs 培養物はメタノールを十分には代謝しないので、それらの酸素消費は低い。したがって、溶解酸素濃度の上昇は、培養物を評価するのに用いることはできない。メタノール供給は、0.3 ％を超えない培地中の過剰のメタノールを保持するために調整した。メタノール供給は、１ｍｌ／ｈ／リットルの初期発酵糟体積で始められ、ゆっくりと３ｍｌ／ｈ／リットルまで高めた。Ｍｕｔs 培養物を用いるときに必要とされる全発酵時間は、Ｍｕｔs 培養物が用いられたときよりも比較的長い。
【０１０９】
コラーゲン／ゼラチンの調製規模での調製的精製
マイクロ濾過工程後、二つの代用精製方法にしたがった（下記のＩ、ＩＩを参照のこと）。
【０１１０】
Ｉ．析出差（differential precipitation）による精製
アセトン分画
コラーゲンタイプＩおよびタイプＩＩＩを、40〜80％アセトン分画により上清のバッチ500 ｍｌ〜２リットルから部分精製した。40％アセトンで、（ピヒア由来の）非コラーゲンタンパク質が析出した一方、60〜80％アセトンで、コラーゲンならびにコラーゲン分解生成物が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアミノ酸組成物の分析により示されたように、析出した。60％アセトンで、好ましくは高分子量のゼラチン成分が析出した。増加アセトン濃度で、上記の主要な分解生成物の増加する析出が得られた。80％で、すべての主要な分解生成物が（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりチェックしたように）析出物中に回収された。小ペプチドと他の低分子量の不純物が80％アセトンでは溶液中にとどまった。アセトンを２〜４時間、−20℃で冷却した。40％の氷冷アセトン（ｖ／ｖ）をマグネテックスターラーによる４℃での攪拌下で発酵からの予備冷却した上清にゆっくりと加えた。上清を４℃で一晩攪拌した。析出したタンパク質と粒子を遠心分離により除去した（４℃、10,000ｒｐｍ、30分間）。ペレットを40％の氷冷アセトンに再懸濁し、再び遠心分離した。両方の40％アセトン上清フラクションを収集した。その後、上清を60〜80％アセトン（ｖ／ｖ）とし、一晩攪拌した。析出したタンパク質は遠心分離により収集した。ペレットを60〜80％アセトンに懸濁し、再び遠心分離した。ペレットを５ｍＭ酢酸／水酸化アンモニウム緩衝液、ｐＨ3.0 （緩衝液Ａ）の適切な量で20〜50ｇ／ｌタンパク質濃度まで溶解した。
【０１１１】
硫酸アンモニウム沈殿
次に、多糖類を60％飽和硫酸アンモニウムでのゼラチン／コラーゲンの析出により除去する。ここで多糖類は溶液中に残った。硫酸アンモニウムをゆっくりと４℃で60％飽和まで加えた。60分間の攪拌後、試料を遠心分離した（30分間、４℃、１0,000 ｒｐｍ）。そのペレットを60％硫酸アンモニウムに再懸濁し、再び遠心分離した。１％（ｗ／ｗ）を超える多糖類または糖が残っている場合、硫酸アンモニウムの不存在下でゼラチン／コラーゲンを完全に再溶解した後、上記の完全な硫酸アンモニウム析出法を繰り返した。最後に、ペレットを脱イオン水または緩衝液Ａに溶解し、タンパク質濃度を20〜50ｇ／ｌとした。試料のｐＨを3.0
に調整した。試料を緩衝液Ａに対する透析により脱塩した。該緩衝液は４時間毎に取替えた。排除分子量８ｋＤの再生セルロースの透析膜（Spectra Por （登録商標）、スペクトラム（Spektrum）社）を用いた。透析は、試料の電導度が十分に低い（典型的にはバックグランド上の20〜150 μＳ．ｃｍ-1）と判定されたときの２〜７日後に止めた。電導度は、１ｍＭおよび10ｍＭのＫＣｌ溶液（それぞれ140 および1400μＳ．ｃｍ-1）で検量したデジタル電導測定計（ラジオメーター）を用いて測定した。透析に変わるものとして、限外濾過および透析濾過を用いて試料を脱塩し、（任意に）濃縮した。適用可能であれば、生成物を次に高濃度のアセトンによる析出およびアセトンの蒸発により前乾燥し（任意）、最終的に凍結乾燥した。
【０１１２】
ＩＩ．陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製
陽イオン交換樹脂は、ＳＰセファロースＸＬ（ファルマシア バイオテク）であったが、他の適当な樹脂も用いることができた。精製を、幾つかの規模で行った。よって、ＸＫ１６カラム（ファルマシア）の25ｍｌベッドを用いた。運転はＦＰＬＣ（ファルマシア）を用いて行った。ベッドの高さは12.5ｃｍであった。流速は典型的には１ｍｌ／分であった。中間規模では、100 ｍｌのベットを用いて、運転はエクタ・エクスプローラー統合ポンプ／プロセッサー／複数バルブ／複数検出器装置（ファルマシア）により調節した。パイロット規模では、インデックス１４０／２００カラム中の２リットルのベッドを用いた。ベッドの高さは少なくとも13ｃｍであった。運転はエクタ・エクスプローラーポンプ／プロセッサー装置（ファルマシア）または他のポンプシステムを用いて行った。流速は50〜100 ｍｌ／分以上であった。具体例として、下記の緩衝液系と溶出条件を用いた。緩衝液Ｘは５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ3.2)であり、緩衝液Ｙは１ＭのＮａＣｌを有する５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ3.0)であった。カラムを２〜５ベッド体積の緩衝液Ｘで平衡化した。目的タンパク質を、５〜10カラム体積分の０〜0.5 Ｍ ＮａＣｌの直線グラジエントで溶出した。コラーゲンタイプＩＩＩのメインバンドを50〜100 ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。コラーゲンタイプＩのメインバンドを70ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、他のバンドは30〜150 ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、それらの理論的等電点と合致した。該カラムを１ベッド容積分の緩衝液Ｙで洗った。パイロット規模では、プールしたフラクションを脱塩し、例えば80％アセトンを加えることにより濃縮した後に凍結乾燥した。
【０１１３】
ゼラチン／コラーゲン生成物の特性決定
アミノ酸組成を、非常に低いｐＨおよび高温で、ペプチド結合をＨＣｌ媒介で完全に加水分解した後、アミノ酸を蛍光体で誘導体化し、かつＨＰＬＣにより決定した。
【０１１４】
純粋なコラーゲンから予測されたＧｌｙのパーセントは33％である。これは、産生組換えゼラチンの純度を評価する手段を提供する。ピヒア・パストリスの内因性分泌タンパク質中のＧｌｙのパーセントを補正するために、ｐＰＩＣ９のＭｕｔ+ 変異体の発酵上清のアミノ酸組成分析を行った。観測されたＧｌｙのパーセントは９％であった。試料の純度はここで下記式により推定することができる。
（Ｇｌｙ（％）−９）／（３３−９）＝（Ｇｌｙ（％）−９）／２４。
【０１１５】
試料のミリＱ水（MilliQ water）への溶解後、下記のアッセイを行った。
【０１１６】
タンパク質含量は、メルク社のゼラチンを参照として用いて、ピアス社のＢＣＡアッセイにより決定した。
【０１１７】
タンパク質Ｍｗ分布を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。
【０１１８】
糖含量はフェノールに基づくアッセイで決定した。試料200 μＬを５％（ｗ／ｗ）フェノール200 μＬと混合した。Vortexミキサーを用いて完全に混合した後、濃硫酸１ｍｌを加えた。混合後、試料を室温で10分間、続いて30℃で20分間インキュベートした。冷却後、試料の 485ｎｍの光吸収を測定した。デンプン、グルコースおよびスクロースを用いて検量線を作成した。
【０１１９】
ＤＮＡ含量は、モレキュラープローブ社の希釈ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ核酸「ゲル」染色（ＤＭＳＯ中10,000×濃度）のアリコートを試料と混合することによって決定した。完全なスペクトル分析後に、励起波長を 490ｎｍに選択し、発光波長を 523ｎｍに選択した。その検量は、内部標準としてわかっている量のＤＮＡをこの同じ混合物に加えることによった。こうして、検量線を作った。さらに、ＤＮＡ−分解酵素をその後に添加することにより、蛍光シグナルの完全な分解がもたらされることがチェックされた。
【０１２０】
ＲＮＡプラスＤＮＡ−含量を定量的に示すものを、次にＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩの代りにＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩＩ「ＲＮＡゲルステイン」を用いることにより得られた。完全なスペクトル分析後に、励起波長を490 ｎｍに選択し、発光波長を514 ｎｍに選択した。検量は、既知量のＲＮＡを加えることによった。得られた値が該試料の「ＲＮＡ」含量を示した。ＤＮＡの不存在下では、それは真のＲＮＡ含量に対応する。存在する場合、ＤＮＡに関連した蛍光はＲＮＡ値に影響を与えたかもしれないが、ＲＮＡｓｅの最終添加を用いて蛍光に対するＤＮＡおよびＲＮＡ由来の寄与を見分けた。
【０１２１】
試料の電導度を、デジタルラジオメーター電導計を用いて測定して、ミリＱ水中の１ｍＭ及び10ｍＭ ＫＣｌ溶液がそれぞれ 140μＳ．ｃｍ-1及び1400μＳ．ｃｍ-1の読みを与えることをチェックした。
【０１２２】
本発明により作られた幾つかのゼラチンバッチの純度に関するデータ（実施例）
ＧＡＴＯ４ａ（ｃｏｌ３ａｌ）
・約 2.4グラム
・精製
マイクロ濾過、析出（１×アセトン分画（40％／80％）、１×（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ）、試料をｐＨ４以下に保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐＨ3.0 に調整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製された緩衝液）に対する透析、凍結乾燥
・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：12.7ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：4.5 ％（ｗ／ｗ）
・ゼラチンは精製中分解しなかった（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：図１４）
【０１２３】
ＧＡＴＯ４ｂ（ｃｏｌ３ａｌ、ＧＡＴＯ４ａよりもさらに精製されたもの）
・約１グラム
・精製
繰返し（２×追加）硫酸アンモニウム析出後に、試料をｐＨ４以下に保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐＨ3.0 に調整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製された緩衝液）に対する透析、凍結乾燥
・ＤＮＡ：0.56ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：3.2 ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：0.94％（ｗ／ｗ）
・ゼラチンは精製中分解しなかった。
・10ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約180 μＳｃｍ-1
（緩衝液の比電導度約100 μＳｃｍ-1）
・凍結乾燥および試料の溶解後の比電導度：10ｇゼラチン／Ｌで180 μＳｃｍ-1、５ｇゼラチン／Ｌで100 μＳｃｍ-1
【０１２４】
ＧＡＴＯ５（ｃｏｌ１ａ１−１）
・約0.9 グラム
・精製
マイクロ濾過、析出（１×アセトン分画（40％／80％）、１×（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ）、試料をｐＨ４以下に保つ５ｍＭのＣＨ3 ＣＯＯＨ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液（初期ｐＨ約3.5 ；25％ＮＨ4 ＯＨによりｐＨ3.0 に調整された500 ｍＭ酢酸の希釈により調製された緩衝液）に対する透析、凍結乾燥
・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：87ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：4.5 ％（ｗ／ｗ）
・ゼラチンは精製中分解しなかった（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：図15）
【０１２５】
ＧＡＴＯ６（膨張層陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製されたｃｏｌ３ａ１）
・約50ｍｇ
・精製
ｐＨ３〜3.5 での膨張層陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−セファロースＸＬ"ストリームライン"樹脂（ファルマシアバイオテック；カラムの副最適洗浄および0.3 ＭＮａＣｌの溶出後の糖含量：1.8 ％（ｗ／ｗ））、さらに一回の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 析出による糖の除去後、５ｍＭのＮＨ4 + ／ＣＨ3 ＣＯＯ- 緩衝液（ｐＨ約3.5 ）に対する透析、凍結乾燥
・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ、すでに（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 析出および透析）・ＲＮＡ：＜９ｐｐｍ（ｗ／ｗ、すでに（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 析出および透析）・全糖類：1.1 ％（ｗ／ｗ）
・0.55ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約94μＳｃｍ-1
（緩衝液の比電導度：約100 μＳｃｍ-1）
・ゼラチンは精製中分解しなかった
【０１２６】
ＧＡＴＯ７（ｃｏｌ１ａ１−２）
・400 ｍｇ
・精製
マイクロ濾過、析出（１×アセトン分画（40％／71.5％）、３×（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ）、アセトン沈殿による予備脱塩：１×71.5％、１×80％、ミリＱ水に対する透析、凍結乾燥
・ＤＮＡ：0.79ｐｐｍ
・ＲＮＡ：9.5 ｐｐｍ
・全糖類：0.7 ％（ｗ／ｗ）
・４ｇゼラチン／Ｌで透析後の比電導度約15.5μＳｃｍ-1
・ゼラチンは精製中分解しなかった
【０１２７】
ＧＡＴＯ８（ｃｏｌ３ａ１）
・約６ｍｇ
・精製
マイクロ濾過、希釈、20ｍＭクエン酸、ｐＨ3.5 で平衡化させた2.1 リットル層ＳＰセファロース−ＸＬ中の陽イオン交換クロマトグラフィー（ファルマシアバイオテック）および同緩衝液中の0.1 〜１ＭＮａＣｌのグラジエントによる0.15ＭＮａＣｌでの溶出、濃縮、80％アセトンによる部分的な脱塩、遠心、ミリＱ水への再溶解、ミリＱ水に対する透析および凍結乾燥
・ＤＮＡ：1.55ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：10.9ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：1.2 ％（ｗ／ｗ）
・透析後の7.5 ｇゼラチン／Ｌの比電導度約90μＳｃｍ-1
・ゼラチンは精製中分解しなかった
図16は精製の結果を示す。
【０１２８】
ＧＡＴＯ９（ｃｏｌ１ａ１−１）
・ 1.7ｇ
・精製：ＧＡＴＯ８を参照。陽イオン交換体から0.74Ｍ ＮａＣｌの１つの塩段階での溶出だけが異なる。
・ＤＮＡ：＜１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：1.3 ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：2.2 ％（ｗ／ｗ）
・透析後の12ｇゼラチン／Ｌの比電導度約70μＳｃｍ-1
・ゼラチンは精製中分解しなかった
【０１２９】
ＧＡＴＯ１０（ｃｏｌ１ａ１−２）ここで両ＭＧＰＲ配列はＲＧＰＭに変更した
・６ｇ
・精製：ＧＡＴＯ８を参照
・ＤＮＡ：0.04ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・ＲＮＡ：２ｐｐｍ（ｗ／ｗ）
・全糖類：２％（ｗ／ｗ）
・ゼラチンは精製中分解しなかった
・Ｎ末端アミノ酸配列はプロペプチドの不完全な除去のためにＮ末端伸長としてＧｌｕ−Ａｌａを有し、予想された通りであった。
その結果を図１８に示す。
【０１３０】
結論として、すべての試料のアミノ酸組成は理論的組成に合致した。外来タンパク質による不純物は非常に低かった。グリシンベースでは、ＧＡＴＯ４−ＧＡＴＯ８は不純物として１％未満の外来タンパク質を有している。ＧＡＴＯ９およびＧＡＴＯ１０は５％未満を有する。
【０１３１】
実施例１で挙げられた参考文献
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[13] De Wolf, F. A. & Keller R. C. A (1996) Characterization of the helical structures in gelatin networks and model polypeptides by circular dichroism. Progr. Colloid Polym. Sci. 102: 9-14。
【０１３２】
［実施例２］（コントロール）
従来の標準タイプのゼラチンを有する臭化銀結晶の調製
核形成： 2.1ｇ／ｌ標準ゼラチン（ＰＢゼラチンズ社の標準的な脱イオン化ＩＡＧ骨ゼラチン、テッセンデルロー、ベルギー）および7.3 ｍＭ臭化カリウムを含有する反応溶液中35℃の温度で、そのｐＨを水酸化ナトリウムまたは硫酸により5.5 の値に調整する。一回の噴射添加により、144 ｍＭ硝酸銀の水溶液を10秒間一定の速度で、激しい攪拌下、加える。硝酸銀の添加後、反応混合物中のゼラチン濃度は2.0 ｇ／ｌとなり、臭素化物濃度は１ｍＭとなった。
【０１３３】
成熟：核形成後、容器の内容物を成熟容器に移し、温度を徐々に75℃まで上げて、3.4 Ｍ臭化カリウム溶液を加えて臭化物濃度を15ｍｍｏｌ／ｌに上げる。成熟を56分間続け、その後に標準的な脱イオン化ゼラチンを５ｇ／ｌの濃度まで加え；58分後に、メチルフェニルテトラゾール溶液を加えて冷却することによりオストワルド成熟を強く低下させる。この調製された乳剤試料を直接透過型電子顕微鏡ならびにそのレプリカにより分析した。
【０１３４】
結果： 表ＩＩに見られるように、平板状粒子が非常に低い率で形成される。
【０１３５】
［実施例３］（コントロール）
従来の加水分解ゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製
核形成： 反応混合物中のゼラチンを従来の加水分解ゼラチン試料（日本のニッタゼラチン社により脱イオン化されて供給されるもの）で置き換えた以外は実施例２と同じ条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形成を行う。
【０１３６】
成熟：成熟を実施例２で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１３７】
結果：平板状粒子の平均％が約40％であるものが表ＩＩに示されている。
【０１３８】
［実施例４］（コントロール）
酸化ゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製
核形成： 反応混合物中のゼラチンを従来の酸化ゼラチン試料（ベルギー、テッセンデルローのＰＢゼラチンズ社により供給されるもの）で置き換えた以外は実施例１と同じ条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形成を行う。
【０１３９】
成熟：成熟を実施例２で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１４０】
結果：平均アスペクト比が５：１の平板状粒子％が70％と高い、ｐＨ5.5 での酸化ゼラチンに対して表ＩＩに示されている。加水分解され標準のゼラチンによるよりも良好な結果はこのゼラチンの低いメチオニン含量によるものと説明がつく（11μｍｏｌ／ｇゼラチン対50〜60μｍｏｌ／ｇの従来のゼラチン）。
【０１４１】
［実施例５］（本発明）
発明の天然組換えゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製
核形成： 反応混合物中のゼラチンを発明の天然ＣＯＬ３Ａ１ゼラチン試料で置き換えた以外は実施例２と同じ条件（またｐＨ＝5.5)を適用することにより核形成を行う。
【０１４２】
成熟：成熟を実施例２で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１４３】
結果：平均アスペクト比が５：１、平板状粒子の％が85％を超える高さのものが表ＩＩに示されている。
【０１４４】
［実施例６］（コントロール）
異なるｐＨでの従来の標準ゼラチン（ベルギー、テッセンデルローのＰＢゼラチンズ社の標準的脱イオンＩＡＧ骨ゼラチン）を用いる臭化銀結晶の調製
核形成：核形成をｐＨ＝７の条件を適用する一方で他の条件を実施例２に維持することで行う。
【０１４５】
成熟：成熟を、ｐＨを核形成中と同じｐＨ＝７に保持する以外は実施例２で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１４６】
結果：アスペクト比が５を超える平板状粒子は、従来の市販ゼラチンでは表ＩＩに示されたように得られなかった。
【０１４７】
［実施例７］（コントロール）
異なるｐＨでの従来の標準ゼラチン（ニッタゼラチンズ、日本）を用いる臭化銀結晶の調製
核形成：核形成をｐＨ＝７の条件を適用する一方で他の条件を実施例２に維持することで行う。
【０１４８】
成熟：ｐＨを核形成中と同じｐＨ＝７に保持する以外、成熟を実施例２で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１４９】
結果：５％程度の平板状粒子の非常に低い％が表ＩＩで示されたように得られた。
【０１５０】
［実施例８］（本発明）
異なるｐＨでの発明の天然組換えゼラチンを用いる臭化銀結晶の調製
核形成：核形成を異なるｐＨ条件、すなわちｐＨ＝７の条件を適用する一方で他の条件は実施例４に維持することで行う。
【０１５１】
成熟：ｐＨを核形成中と同じｐＨ＝７に保持する以外、成熟を実施例４で用いられた同じ操作にしたがって行う。
【０１５２】
結果：表ＩＩに示されたように、非常に高い平板状粒子％（約80％、これは最新技術のゼラチンよりも明らかに高い）がこの条件で驚くべきことに見出されている。
【０１５３】
［実施例９］
結合力と平板状粒子形態との関係
ゼラチン45ｍｇを正確に計り取り、0.1 Ｍ硝酸カリウムを含有する0.1 Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）15ｇを加える。この溶液を水浴中、45℃で15分間置く。溶液を室温（23℃）まで冷却する。
（ゼラチンを含有する）このｐＨ7.0 のリン酸緩衝液溶液10ｍｌを23℃で0.5
ｍＭ硝酸銀100 μｌと混合する。「ｖＡｇ」と称されるこの溶液のポテンシャルをＡｇ／ＡｇＣｌ参照二重接点電極（Orion モデル90-02)に対するＡｇ電極（Orion モデル97-81)を用いて測定する。ゼラチンのない同じ緩衝液溶液も硝酸銀溶液と混合し、ポテンシャル「ｖＡｇ」を同一の方法で測定する。二つの測定されたポテンシャル間の違いを計算して、これを、Ａｇイオンに対するゼラチンの結合親和性である「デルタｖＡｇ」として表す。下記の表ＩＩは、ｐＨ5.5 およびｐＨ７について、試験されたペプタイザー、平板状粒子％およびゼラチン結合親和性「デルタＶＡｇ」を有し、ここでは平板状の基準はアスペクト比＞５として定義されている。
【０１５４】
【表２】
* 測定せず。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】ベクターｐＣＯＬ３Ａ１。
【図２】ｐＣＯＬ３Ａ１構築物コントロール用ＰＣＲプライマー。
【図３】予想されたＣＯＬ３Ａ１配列。Ｎ末端ＹはｐＰＩＣ９ベクターに由来する。配列の残りはラットのＣＯＬ３Ａ１に由来する。下線を付けた配列はＣＯＬ３Ａ１断片について得られたＮ末端配列に対応する。
【図４】ベクターｐＣＯＬ３ＡＩＫ。
【図５】ＣＯＬＩＡ１のクローニング用オリゴ配列。下の配列はアニーリング後のアダプター。
【図６】クローニング法。
【図７】ベクターｐＣＯＬ１Ａ１−１。
【図８】予想されたＣＯＬ１Ａ１−１配列。一本下線の配列はＣＯＬ１Ａ１断片について得られたＮ末端配列に対応する。二重下線はこの配列を分け合っている。両断片はＥＡによりＮ末端で延長する。
【図９】ベクターｐＣＯＬ１Ａ１−２。
【図１０】予想されたＣＯＬ１Ａ１−２配列。
【図１１】ベクターｐＣＯＬ１Ａ１−３。
【図１２】予想されたＣＯＬ１Ａ１−３* 配列。
【図１３】予想されたＣＯＬ１Ａ１−２配列中のＭＧＰＲ配列。一本下線の配列はＣＯＬ１Ａ１−１断片について得られたＮ末端配列に対応する。二重下線はＭＰＰＲ配列である。
【図１４】ＧＡＴＯ４のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。左から第二と第三のレーンは精製後のＧＡＴＯ４を示す。
【図１５】ＧＡＴＯ５のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。最も右のレーンにおいて、分子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。右から第二と第三のレーンは精製後のＧＡＴＯ５を示す。
【図１６】発現産物ｃｏｌ１Ａ１−２のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。
【図１７】ＭＧＰＲ配列がＲＧＰＭに変異された発現産物ｃｏｌ１Ａ１−１のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。
【図１８】ＭＧＰＲ配列がＲＧＰＭに変異された発現産物ｃｏｌ１Ａ１−２のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色された。最も左のレーンにおいて、分子量マーカータンパク質混合物が見える。上から下へ、バンドは分子量94、67、43、30、20.1および14.4ｋＤに対応する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤であって、該乳剤が核形成ペプタイザーの存在下で核化され、その後成長ペプタイザーの存在下で成長したハロゲン化銀粒子を有し、少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する、平板状ハロゲン化銀乳剤。
【請求項２】
該ペプタイザーが、４個を超え、さらに10個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する請求項１記載の乳剤。
【請求項３】
ペプタイザーのアミノ酸配列が、天然コラーゲンと40％を超える相同性を示し、好ましくは50％を超える相同性を示す請求項１または２記載の乳剤。
【請求項４】
ペプタイザーが、コラーゲンに関して天然に存在するものと同等であるアミノ酸配列を有し、ここで同等とは天然に存在するものとアミノ酸同一性が少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは同一であることを意味する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項５】
ペプタイザーが、天然に存在するものと実質的に同じアミノ酸配列を有し、ここで実質的とはアミノ酸の変異が５個未満、好ましくは３個未満を意味する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項６】
ペプタイザーが、天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料である、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項７】
ペプタイザーが、コラーゲンタイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩに関して天然に存在するものと実質的に同じアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項８】
ペプタイザーが、コラーゲンタイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩに関して天然に存在するものと同等であるアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項９】
ペプタイザーが、コラーゲンタイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩに関して天然に存在するものと同じアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１０】
コラーゲンタイプＩが、図８、10または12またはＧｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ０８０２０のアミノ酸配列を有するか、またはそれである、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１１】
コラーゲンタイプＩＩＩが、図３またはＥＭＢＬ寄託番号Ｘ７０−３６９のアミノ酸配列を有するか、またはそれである、前記請求項１〜８のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１２】
ペプタイザーがコラーゲンタイプＩに関して天然に存在するものと実質的に同じアミノ酸配列を有し、ペプタイザーが配列［ＭＬＩＶ］ＸＸＲおよび好ましくはＭＧＰＲを有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１３】
ペプタイザーが、天然コラーゲンをコードする配列由来の一定の長さおよび組成の断片であり、該断片がコラーゲンに特徴的なＧＸＹ部分を有し、該断片量がアミノ酸をベースとして少なくとも2.5 ｋＤａであるような長さである、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１４】
ペプタイザーがヒドロキシルプリンを有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１５】
ペプタイザーが脱アミン化されていない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１６】
ペプタイザーが等電点７〜10である、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１７】
ペプタイザーがアミノ酸をベースとして2.5 〜100 ｋＤａの質量である前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１８】
ペプタイザーがプロコラーゲンおよびテロペプチドを有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１９】
ペプタイザーがらせん構造を有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２０】
ペプタイザーがシステインを有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２１】
ペプタイザーは、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力0.1 〜200 マイクロモル、好ましくは0.1 〜120 マイクロモルと等しいレベルで還元アミノ酸であるメチオニン及びヒスチジンが存在する程度に、（酸化）還元アミノ酸を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２２】
ペプタイザーは、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力0.1 〜80マイクロモルと等しいレベルで還元アミノ酸が存在する程度に、（酸化）還元アミノ酸を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２３】
ペプタイザーは、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力30〜80マイクロモルと等しいレベルで還元アミノ酸が存在する程度に、（酸化）還元アミノ酸を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２４】
ペプタイザーが50ｍＶよりも高い銀への結合力を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２５】
ペプタイザーが100 ｍＶよりも低い銀への結合力を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２６】
ペプタイザーが50〜100 ｍＶの銀への結合力を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２７】
ハロゲン化銀粒子が５を超える平均アスペクト比を示す、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２８】
ペプタイザーが、ｐＨ４〜８でのハロゲン化銀平板状粒子形成に対して安定である、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２９】
平板状粒子を、90％を超えるレベル、好ましくは95％を超えるレベルで有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項３０】
ペプタイザーが均質分散性を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項３１】
ペプタイザーが実質的に純粋な形で存在する、すなわち核酸、多糖類および他のタンパク質を実質的に有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項３２】
乳剤が、写真応用に適するものであり、さらに該応用に許容できる化合物、例えば明確に定義された第二の量の成長ペプタイザーを含有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項３３】
平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤の調製方法であって、該方法が核形成ペプタイザーの存在下でハロゲン化銀粒子を核化し、その後成長ペプタイザーの存在下で該ハロゲン化銀粒子を成長させることを有し、両ペプタイザーが一定の量で存在し、少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製されたコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーは４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する、乳剤の調製方法。
【請求項３４】
核形成工程で、および／または粒子成長工程中にペプタイザーを添加することを有し、該ペプタイザーが請求項１〜32、52または53のいずれかに開示された態様のいずれかから選択される、請求項33記載の乳剤の製造方法。
【請求項３５】
核形成工程で、および粒子成長工程中の双方でペプタイザーを添加することを有する、請求項33または34記載の乳剤の製造方法。
【請求項３６】
核形成工程で、および粒子成長工程中で同一のペプタイザーを添加することを有する、請求項33〜35のいずれか１項記載の乳剤の製造方法。
【請求項３７】
請求項１〜32のいずれか１項記載の乳剤を利用すること、または少なくとも一つのハロゲン化銀乳剤層を用いた写真要素生産のためにそれ自体公知の方法で適用されるハロゲン化銀乳剤を得るための請求項33〜36のいずれか１項記載の方法により得られる乳剤を利用することを有し、該層のハロゲン化銀結晶がアスペクト比５以上である、写真要素生産の方法。
【請求項３８】
写真要素が、光、レーザーまたはＸ線照射に感光性のある材料であり、該要素が例えば白黒リバーサルフィルム、白黒ネガフィルム、カラーネガフィルム、カラーリバーサルフィルム、感光性写真成分がデジタルスキャンされたフィルム、白黒反転紙、白黒紙、カラー紙、反転カラー紙、感光性写真成分がデジタルデータベースからのレーザー照射により感光された紙から選択される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
請求項37または38記載の方法にしたがって得られる写真要素。
【請求項４０】
0.95グラム／リットルを超える程度までの微生物によるコラーゲン様ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を有する組換えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法であって、該組換えコラーゲンがらせん構造を有さず、好ましくは該発現が大腸菌またはサッカロミセス・セレビシアエ以外の微生物で起こる、組換えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法。
【請求項４１】
発現が３グラム／リットルを超える、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
組換えコラーゲン様ペプチドが請求項１〜32、52または53に開示された態様のいずれかから選択される、請求項40または41記載の方法。
【請求項４３】
微生物が発現産物を分泌することができる、請求項40〜42のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
微生物が真菌細胞、好ましくは酵母細胞である、請求項40〜43のいずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
微生物が、コラーゲン様配列を原繊維へ処理するための活性のある翻訳後プロセッシング機構を持たない、請求項40〜44のいずれ１項記載の方法。
【請求項４６】
微生物が、コラーゲン様配列を三重らせんへ処理するための活性のある翻訳後プロセッシング機構を持たない、請求項40〜45のいずれか１項記載の方法。
【請求項４７】
発現される核酸配列が、プロコラーゲンおよびテロペプチドをコードする配列を有さない、請求項40〜46のいずれか１項記載の方法。
【請求項４８】
微生物が、ハンセヌラ、トリコデルマ、アスペルギルスおよび好ましくはピヒア・パストリスからなる群から選択される請求項40〜47のいずれか１項記載の方法。
【請求項４９】
組換えコラーゲンが、発現宿主細胞で活性のあるプロテアーゼのプロテアーゼ切断部位を持たないアミノ酸配列を有する、請求項40〜48のいずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
発現産物が単離され、他のタンパク質、多糖類および核酸を実質的に有さなくなるまで精製される、請求項40〜49のいずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
発現産物を単離し、核酸の量100 ｐｐｍ未満、多糖類の量５％未満、適切にはＲＮＡの量10ｐｐｍ未満、適切には、最も適切なＤＮＡの量１ｐｐｍ未満になる程度まで少なくとも精製される、請求項40〜50のいずれか１項記載の方法。
【請求項５２】
ペプタイザーが、天然コラーゲンに対して40％を超える相同性を示すアミノ酸配列を有し、４個を超える異なるアミノ酸タイプを有する、遺伝子工学により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料。
【請求項５３】
請求項１〜32のいずれか１項で定義される組換えコラーゲン化合物。
【請求項１】
平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤であって、該乳剤が核形成ペプタイザーの存在下で核化され、その後成長ペプタイザーの存在下で成長したハロゲン化銀粒子を有し、少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーが４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する、平板状ハロゲン化銀乳剤。
【請求項２】
該ペプタイザーが、４個を超え、さらに10個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する請求項１記載の乳剤。
【請求項３】
ペプタイザーのアミノ酸配列が、天然コラーゲンと40％を超える相同性を示し、好ましくは50％を超える相同性を示す請求項１または２記載の乳剤。
【請求項４】
ペプタイザーが、コラーゲンに関して天然に存在するものと同等であるアミノ酸配列を有し、ここで同等とは天然に存在するものとアミノ酸同一性が少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは同一であることを意味する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項５】
ペプタイザーが、天然に存在するものと実質的に同じアミノ酸配列を有し、ここで実質的とはアミノ酸の変異が５個未満、好ましくは３個未満を意味する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項６】
ペプタイザーが、天然コラーゲンをコードする核酸により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料である、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項７】
ペプタイザーが、コラーゲンタイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩに関して天然に存在するものと実質的に同じアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項８】
ペプタイザーが、コラーゲンタイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩに関して天然に存在するものと同等であるアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項９】
ペプタイザーが、コラーゲンタイプＩ、ＩＩまたはＩＩＩに関して天然に存在するものと同じアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１０】
コラーゲンタイプＩが、図８、10または12またはＧｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ０８０２０のアミノ酸配列を有するか、またはそれである、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１１】
コラーゲンタイプＩＩＩが、図３またはＥＭＢＬ寄託番号Ｘ７０−３６９のアミノ酸配列を有するか、またはそれである、前記請求項１〜８のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１２】
ペプタイザーがコラーゲンタイプＩに関して天然に存在するものと実質的に同じアミノ酸配列を有し、ペプタイザーが配列［ＭＬＩＶ］ＸＸＲおよび好ましくはＭＧＰＲを有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１３】
ペプタイザーが、天然コラーゲンをコードする配列由来の一定の長さおよび組成の断片であり、該断片がコラーゲンに特徴的なＧＸＹ部分を有し、該断片量がアミノ酸をベースとして少なくとも2.5 ｋＤａであるような長さである、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１４】
ペプタイザーがヒドロキシルプリンを有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１５】
ペプタイザーが脱アミン化されていない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１６】
ペプタイザーが等電点７〜10である、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１７】
ペプタイザーがアミノ酸をベースとして2.5 〜100 ｋＤａの質量である前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１８】
ペプタイザーがプロコラーゲンおよびテロペプチドを有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項１９】
ペプタイザーがらせん構造を有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２０】
ペプタイザーがシステインを有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２１】
ペプタイザーは、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力0.1 〜200 マイクロモル、好ましくは0.1 〜120 マイクロモルと等しいレベルで還元アミノ酸であるメチオニン及びヒスチジンが存在する程度に、（酸化）還元アミノ酸を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２２】
ペプタイザーは、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力0.1 〜80マイクロモルと等しいレベルで還元アミノ酸が存在する程度に、（酸化）還元アミノ酸を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２３】
ペプタイザーは、該ペプタイザー１グラムあたりのメチオニンの還元力30〜80マイクロモルと等しいレベルで還元アミノ酸が存在する程度に、（酸化）還元アミノ酸を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２４】
ペプタイザーが50ｍＶよりも高い銀への結合力を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２５】
ペプタイザーが100 ｍＶよりも低い銀への結合力を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２６】
ペプタイザーが50〜100 ｍＶの銀への結合力を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２７】
ハロゲン化銀粒子が５を超える平均アスペクト比を示す、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２８】
ペプタイザーが、ｐＨ４〜８でのハロゲン化銀平板状粒子形成に対して安定である、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項２９】
平板状粒子を、90％を超えるレベル、好ましくは95％を超えるレベルで有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項３０】
ペプタイザーが均質分散性を有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項３１】
ペプタイザーが実質的に純粋な形で存在する、すなわち核酸、多糖類および他のタンパク質を実質的に有さない、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項３２】
乳剤が、写真応用に適するものであり、さらに該応用に許容できる化合物、例えば明確に定義された第二の量の成長ペプタイザーを含有する、前記請求項のいずれか１項記載の乳剤。
【請求項３３】
平板状粒子が全粒子投影面積の75％以上を占める平板状ハロゲン化銀乳剤の調製方法であって、該方法が核形成ペプタイザーの存在下でハロゲン化銀粒子を核化し、その後成長ペプタイザーの存在下で該ハロゲン化銀粒子を成長させることを有し、両ペプタイザーが一定の量で存在し、少なくとも一つのペプタイザーが遺伝子工学で調製されたコラーゲン様材料であり、該ペプタイザーは４個を超える異なるアミノ酸を有するアミノ酸配列を有する、乳剤の調製方法。
【請求項３４】
核形成工程で、および／または粒子成長工程中にペプタイザーを添加することを有し、該ペプタイザーが請求項１〜32、52または53のいずれかに開示された態様のいずれかから選択される、請求項33記載の乳剤の製造方法。
【請求項３５】
核形成工程で、および粒子成長工程中の双方でペプタイザーを添加することを有する、請求項33または34記載の乳剤の製造方法。
【請求項３６】
核形成工程で、および粒子成長工程中で同一のペプタイザーを添加することを有する、請求項33〜35のいずれか１項記載の乳剤の製造方法。
【請求項３７】
請求項１〜32のいずれか１項記載の乳剤を利用すること、または少なくとも一つのハロゲン化銀乳剤層を用いた写真要素生産のためにそれ自体公知の方法で適用されるハロゲン化銀乳剤を得るための請求項33〜36のいずれか１項記載の方法により得られる乳剤を利用することを有し、該層のハロゲン化銀結晶がアスペクト比５以上である、写真要素生産の方法。
【請求項３８】
写真要素が、光、レーザーまたはＸ線照射に感光性のある材料であり、該要素が例えば白黒リバーサルフィルム、白黒ネガフィルム、カラーネガフィルム、カラーリバーサルフィルム、感光性写真成分がデジタルスキャンされたフィルム、白黒反転紙、白黒紙、カラー紙、反転カラー紙、感光性写真成分がデジタルデータベースからのレーザー照射により感光された紙から選択される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
請求項37または38記載の方法にしたがって得られる写真要素。
【請求項４０】
0.95グラム／リットルを超える程度までの微生物によるコラーゲン様ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を有する組換えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法であって、該組換えコラーゲンがらせん構造を有さず、好ましくは該発現が大腸菌またはサッカロミセス・セレビシアエ以外の微生物で起こる、組換えコラーゲン様ポリペプチドの製造方法。
【請求項４１】
発現が３グラム／リットルを超える、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
組換えコラーゲン様ペプチドが請求項１〜32、52または53に開示された態様のいずれかから選択される、請求項40または41記載の方法。
【請求項４３】
微生物が発現産物を分泌することができる、請求項40〜42のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
微生物が真菌細胞、好ましくは酵母細胞である、請求項40〜43のいずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
微生物が、コラーゲン様配列を原繊維へ処理するための活性のある翻訳後プロセッシング機構を持たない、請求項40〜44のいずれ１項記載の方法。
【請求項４６】
微生物が、コラーゲン様配列を三重らせんへ処理するための活性のある翻訳後プロセッシング機構を持たない、請求項40〜45のいずれか１項記載の方法。
【請求項４７】
発現される核酸配列が、プロコラーゲンおよびテロペプチドをコードする配列を有さない、請求項40〜46のいずれか１項記載の方法。
【請求項４８】
微生物が、ハンセヌラ、トリコデルマ、アスペルギルスおよび好ましくはピヒア・パストリスからなる群から選択される請求項40〜47のいずれか１項記載の方法。
【請求項４９】
組換えコラーゲンが、発現宿主細胞で活性のあるプロテアーゼのプロテアーゼ切断部位を持たないアミノ酸配列を有する、請求項40〜48のいずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
発現産物が単離され、他のタンパク質、多糖類および核酸を実質的に有さなくなるまで精製される、請求項40〜49のいずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
発現産物を単離し、核酸の量100 ｐｐｍ未満、多糖類の量５％未満、適切にはＲＮＡの量10ｐｐｍ未満、適切には、最も適切なＤＮＡの量１ｐｐｍ未満になる程度まで少なくとも精製される、請求項40〜50のいずれか１項記載の方法。
【請求項５２】
ペプタイザーが、天然コラーゲンに対して40％を超える相同性を示すアミノ酸配列を有し、４個を超える異なるアミノ酸タイプを有する、遺伝子工学により調製された実質的に純粋なコラーゲン様材料。
【請求項５３】
請求項１〜32のいずれか１項で定義される組換えコラーゲン化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２００９−４５０６９（Ｐ２００９−４５０６９Ａ）
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００８−２６５２２７（Ｐ２００８−２６５２２７）
【出願日】平成２０年１０月１４日（２００８．１０．１４）
【分割の表示】特願平１０−３７８４３０の分割
【原出願日】平成１０年１２月２４日（１９９８．１２．２４）
【出願人】（５０５２３２７８２）フジフィルム マニュファクチャリング ユーロプ ビー．ブイ． (50)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６５２２７（Ｐ２００８−２６５２２７）
【出願日】平成２０年１０月１４日（２００８．１０．１４）
【分割の表示】特願平１０−３７８４３０の分割
【原出願日】平成１０年１２月２４日（１９９８．１２．２４）
【出願人】（５０５２３２７８２）フジフィルム マニュファクチャリング ユーロプ ビー．ブイ． (50)
【Ｆターム（参考）】
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