凝集検査用微粒子
【課題】抗原あるいは抗体との非特異的な結合性が低く、検査感度を大幅に向上させることのできる凝集検査用微粒子、その製法、及びこれらを用いた凝集検査試薬を提供する。
【解決手段】その表面に、特定抗原あるいは特定抗体に対する結合性の低い部位を有し、当該部位が、下記式（１）で表される構造及び／又は下記式（２）で表される構造を含むものであることを特徴とする、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの、凝集検査用微粒子。
【解決手段】その表面に、特定抗原あるいは特定抗体に対する結合性の低い部位を有し、当該部位が、下記式（１）で表される構造及び／又は下記式（２）で表される構造を含むものであることを特徴とする、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの、凝集検査用微粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝集反応を利用した検査に用いる凝集検査用微粒子、特に試料中の抗原あるいは抗体の有無を凝集反応を利用して検査するのに適した凝集検査用微粒子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応をはじめとした分子間の特異的相互作用を利用した凝集反応は、生体試料、食品、環境中の特定の成分等の測定、検査に広く用いられている。
特にポリスチレン系ラテックス粒子は、他の担体に比べ保存時の安定性に優れ、抗原抗体反応等のタンパク質や脂質等の生理活性物質を強く吸着固定化し、さらに固定化した抗原あるいは抗体を長期間安定に保存しうる点でも優れているため、多くの検査反応試薬、特に凝集反応試薬の担体として汎用されている。
こうした検査用微粒子は、ポリスチレン微粒子の表面に特定物質に対する特異的な結合性を有する分子、例えば抗体等、を物理吸着、あるいは共有結合によって固定化した後に、非特異的吸着の低減のためウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎｅ, ＢＳＡ）やカゼイン、スキムミルク等を飽和吸着させる等のブロッキング操作を行う（例えば特許文献１等）。
【０００３】
しかし、このようにして調製したポリスチレン粒子は分散・保存安定性に欠け非特異的吸着の低減も十分ではない。このため、微粒子表面に固定化した抗体本来の感度を大きく低下させてしまうことが多く、擬陽性の原因ともなっている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２１５１２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、抗原あるいは抗体に対する特異的な結合性の高い部位を有するだけでなく、これ以外の部位においてこれら抗原あるいは抗体との非特異的な結合性が低く、検査感度を大幅に向上させることのできる凝集検査用微粒子、その製法、及びこれらを用いた凝集検査試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、その表面に、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位を有するか、又は、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位を有する、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの凝集検査用微粒子であって、当該特定抗原に対する結合性の低い部位あるいは当該特定抗体に対する結合性の低い部位が、下記式（１）で表される構造及び／又は下記式（２）で表される構造を含むものであることを特徴とする、凝集検査用微粒子を提供することにより、上記目的を達成したものである。
【０００７】
【化１】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表し、ｎは１０〜６００の数を表す。）
【０００８】
【化２】
（式中、ｍは１０〜６００の数を表す。）
【０００９】
また本発明は、上記凝集検査用微粒子の好ましい製造方法として、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー粒子を得、次いでこのポリマー粒子の表面に抗原又は抗体を、結合又は吸着させることを特徴とする、凝集検査用粒子の製造方法を提供することにより、上記目的を達成したものである。
【００１０】
【化３】
（式中、ｎは上記式（３）と同義である。）
【００１１】
【化４】
（式中、Ｒ’及びｍは上記式（３）と同義である。）
【００１２】
【化５】
（式中、ｋは上記式（３）と同義である。）
【００１３】
また本発明は、上記凝集検査用微粒子を、リン酸緩衝食塩水に分散させたことを特徴とする、凝集検査用試薬を提供することにより、上記目的を達成したものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の効果は、抗原あるいは抗体に対する特異的な結合性の高い部位を有するだけでなく、これ以外の部位においてこれら抗原あるいは抗体との非特異的な結合性が低く、検査感度を大幅に向上させることのできる凝集検査用微粒子、その製法、及びこれらを用いた凝集検査試薬を提供したことにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
まず、本発明の凝集検査用微粒子について、好ましい実施態様を例に説明する。
本発明の凝集検査用微粒子は、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの粒子であって、その粒子の表面に、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位を有するか、又は、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位を有し、当該特定抗原に対する結合性の低い部位あるいは当該特定抗体に対する結合性の低い部位が、上記式（１）で表される構造及び／又は上記式（２）で表される構造を含むものであれば特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明の凝集検査用微粒子において、ベースとなる粒子は、特に限定されるものではなく、シリカ、金、磁性微粒子、半導体粒子等の金属化合物微粒子等の無機粒子でも、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、有機ポリシロキサン、有機ポリシルセスキオキサン、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリロニトリル等の有機ポリマーでもよいが、好ましくは水中や生理食塩水中での分散安定性の観点からは有機ポリマーが適しており、特にポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステルが好ましい。
【００１７】
上記凝集検査用微粒子は、その粒子径が１ｎｍ〜１００μｍの粒子であることが必要であり、好ましくは１０ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは５０ｎｍ〜１００μｍ、最も好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍの粒子であることがよい。粒子径が１ｎｍ未満であると検査時の凝集効率が悪く検査精度が低下する。また粒子径が１００μｍ超であると安定性が悪くなり不要な凝集を来たす等のためやはり検査精度が低下する。
【００１８】
本発明の凝集検査用微粒子は、上記粒子表面に、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原にに対する結合性の低い部位を有するか、又は、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位を有するものである。
【００１９】
この特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、抗体、若しくはレクチンを例示することができる。レクチンとしては、特に限定されるものではなく、天然のレクチンでも人工のレクチンでもよく、例えばＡｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ(ピーナッツレクチンとも称される。以下ＰＮＡと略記する場合がある。）、Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｂａｕｈｉｎｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ等を例示することができる。
具体的には、特定抗原としての腫瘍マーカーである癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対しては、抗癌胎児性抗原（癌胎児性抗体）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）に対しては、抗α−フェトプロテイン、ヒト絨毛性刺激ホルモンβ鎖に対しては抗ヒト絨毛性刺激ホルモンβ鎖、炎症マーカーであるＣ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）に対しては抗Ｃ−反応性蛋白質（Ｃ−反応性蛋白質抗体）、ガラクトシルβ１−３−N−アセチルガラクトサミン残基を有するＴｈｏｍｓｅｎ Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原)に対してはＰＮＡ、等を例示することができ、より好ましくはＣ-反応性蛋白質(ＣＲＰ）に対して抗Ｃ−反応性蛋白質（Ｃ−反応性蛋白質抗体）、Ｔｈｏｍｓｅｎ Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）に対してはＰＮＡを有することが特性の高さ等から好ましい。
【００２０】
また、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、抗原を例示することができる。
具体的には、特定抗体としてのリウマチ因子に対してはヒト変性ＩｇＧ、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）に対しては抗イムノグロブリンＧ（Ａｎｔｉ−ＩｇＧ）、インフルエンザ等のウイルス抗体に対してはウイルス自体や抗原性部位、感染症マーカーである抗ストレプトリジン−Ｏ（ＡＳＯ）に対してはストレプトリジンＯ、等を例示することができ、より好ましくは感染症マーカーである抗ストレプトリジン−Ｏ（ＡＳＯ）に対してストレプトリジンＯを有することが特性の高さ等から好ましい。
【００２１】
上記粒子表面をこれらの特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位、あるいは特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位とするため、上記抗原あるいは抗体を粒子表面に導入する方法については、特に限定されない。共有結合による方法が最も好ましいが、物理的吸着によってもよい。
【００２２】
上記抗原あるいは抗体を共有結合で結合させる場合、その方法は限定されないが、一般的にタンパク質やペプチドの固定化に用いられる縮合剤（カルボジイミド等）を用いたアミド結合の形成による導入が最も好ましい。ここで用いられる縮合剤は特に限定されないが、特に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）や１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＩ）が好ましい。
【００２３】
本発明の凝集検査用微粒子における、粒子の表面に有する特定抗原に対する結合性の低い部位又は特定抗体に対する結合性の低い部位は、ノニオン性で且つ水和力が高い、Ｎ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖及び／又はポリエチレングリコール鎖、具体的には、下記式（１）で表される構造及び／又は下記式（２）で表される構造を含む。
【００２４】
【化６】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表し、ｎは１０〜６００、好ましくは３０〜３００、より好ましくは５０〜２００の数を表す。）
【００２５】
【化７】
（式中、ｍは１０〜６００、好ましくは５０〜３００、より好ましくは８０〜２００の数を表す。）
【００２６】
このような、特定抗原に対する結合性の低い部位又は特定抗体に対する結合性の低い部位を、その表面に有する粒子として、好ましくは、下記式（３）で表される構造を有するポリマーを主成分とする粒子を例示することができる。
【００２７】
【化８】
（式中、Ｒ’は水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表す。ｎは上記式（１）と同義である。ｍは上記式（２）と同義である。ｋは１０〜６００、好ましくは３０〜３００、より好ましくは５０〜２００の数を表す。Ａは抗原又は抗体を表す。ｗ、ｘ、ｙ、ｚはポリマーの分子量を１万〜１００万、好ましくは５万〜１００万、より好ましくは１０万〜１００万とする数であり、且つ（ｘ＋ｙ）：ｚ：ｗ＝１：０．２〜２．５：５〜３００、好ましくは１：０．２〜２．５：１０〜２００、より好ましくは１：０．２〜２．５：２０〜１００の割合である。尚、ｘとｙは何れか一方が０であってもよい。ｗ、ｘ、ｙ、ｚの各繰り返し数に対応する各繰り返し単位の主鎖における順序は任意である。）
【００２８】
尚、上記式（３）で表される構造を有するポリマーは、本発明の効果を阻害しない範囲内（好ましくは０〜５０質量％、より好ましくは０〜２５質量％）でその他の構造（例えば、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリル酸、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）を有していてもよい。
【００２９】
本発明の凝集検査用微粒子は、上記のような特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位を有するか、又は、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位を、粒子の表面に有するものである。
本発明の凝集検査用微粒子においては、これら特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位、あるいは、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位が存在する、本発明で言うところの「粒子の表面」とは、必ずしも粒子の最外層末端にこれらの部位が存在する必要はなく、概ね最外層末端から１０ｎｍの深さまでのなかに存在すればよい。従って、粒子径が２０ｎｍ以下の粒子の場合は、単に粒子中に有することと同義であり、そのような状態でも差し支えない。
尚、最外層末端から１０ｎｍの深さまでのなかの分子構造の存在量は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって分析可能である。また、抗原あるいは抗体を結合させる場合、粒子形成後に結合させれば当然に粒子表面に存在することとなり、粒子全体としての抗原あるいは抗体の存在量を分析すれば得ることができる。
【００３０】
本発明の凝集検査用微粒子において、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位の存在量（濃度）は、それぞれ下記の通りである。
特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位の存在量（濃度）：粒子１ｇ当たりの該部位の存在質量として、好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１ｇ／ｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１００ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは２ｍｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ。
当該特定抗原に対する結合性の低い部位の存在量（濃度）：好ましくは１〜９９質量％、より好ましくは５〜９０質量％、さらに好ましくは２０〜７０質量％。
また、本発明の凝集検査用微粒子において、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位と当該特定抗原に対する結合性の低い部位との存在比率（質量比）は、好ましくは１：９〜９：１（前者：後者）、より好ましくは２：８〜８：２である。
【００３１】
本発明の凝集検査用微粒子において、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位の存在量（濃度）は、それぞれ下記の通りである。
特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位の存在量（濃度）：粒子１ｇ当たりの該部位の存在質量として、好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１ｇ／ｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１００ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは２ｍｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ。
当該特定抗体に対する結合性の低い部位の存在量（濃度）：好ましくは１〜９９質量％、より好ましくは５〜９０質量％、さらに好ましくは２０〜７０質量％。
また、本発明の凝集検査用微粒子において、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位と当該特定抗体に対する結合性の低い部位との存在比率（質量比）は、好ましくは１：９〜９：１（前者：後者）、より好ましくは２：８〜８：２である。
【００３２】
本発明の凝集検査用微粒子は、どのような態様で用いてもよいが、好ましくは該凝集検査用微粒子を分散媒に分散させた態様であることがよい。この場合、分散媒としては、該凝集用検査微粒子中のタンパク質を失活させないものであれば特に限定されず、例えば、免疫反応を利用した通常の凝集検査用試薬に使用されることが知られている水性の分散媒であれば使用することができる。このような分散媒の一例としては、例えば生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＣａやＭｇを含有しているものでも、していないものでも可）等を例示することができる。
【００３３】
次に本発明の凝集検査用微粒子の好ましい製造方法について説明する。
本発明の凝集検査用微粒子は、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー微粒子を得、次いでこのポリマー微粒子の表面に抗原又は抗体を、結合又は吸着させることにより、製造される。
【００３４】
【化９】
（式中、ｎは上記式（３）と同義である。）
【００３５】
【化１０】
（式中、Ｒ’及びｍは上記式（３）と同義である。）
【００３６】
【化１１】
（式中、ｋは上記式（３）と同義である。）
【００３７】
上記式（４）で表されるマクロモノマーの製造方法は、任意であり特に限定されず常法によればよいが、例えばまず、２−メルカプトエタノールを出発物質としてＮ−ビニルアセトアミド（ＮＶＡ）を、重合開始剤（例えば、Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）等）の存在下に、有機溶媒（例えばトルエン等）中で重合させる等して次式で表されるポリマーを得る。
【００３８】
【化１２】
（式中、ｎは上記式（４）と同義である。）
【００３９】
次いで、このポリマーをビニルベンジルクロライドと反応（例えばジメチルフォルムアミド溶媒中で、ＮａＨ及びテトラブチルホスホニウムブロマイドの存在下で反応）させることにより得ることができる。
【００４０】
上記式（５）で表されるマクロモノマーの製造方法は、任意であり特に限定されず常法によればよいが、例えば、常法により重合させたポリエチレングリコール（或いはさらに水酸化ナトリウム等を反応させた後にメチルクロライド等のアルキルクロライド等を反応させて末端をアルキル化した誘導体）を、ビニルベンジルクロライドと反応させることにより得ることができる。
【００４１】
上記式（６）で表されるマクロモノマーの製造方法は、任意であり特に限定されず常法によればよいが、例えばまず、２−メルカプトエタノールを出発物質として、メタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−ＢＭＡ）を、重合開始剤（例えば、Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）等）の存在下に、有機溶媒（例えばＴＨＦ等）中で重合させる等して次式で表されるポリマーを得る。
【００４２】
【化１３】
（式中、ｋは上記式（６）と同義である。）
【００４３】
次いで、このポリマーをビニルベンジルクロライドと反応（例えばジメチルフォルムアミド溶媒中で、ＮａＨ及びテトラブチルホスホニウムブロマイドの存在下で反応）させた後、加水分解することによりｔ−Ｂｕ基を外すことによって得ることができる。
【００４４】
本発明の凝集検査用微粒子の製造方法はまず、上記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は上記式（５）で表されるマクロモノマーと、上記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー微粒子を得る。
【００４５】
上記式（４）で表されるマクロモノマーのモル数を〔４〕、上記式（５）で表されるマクロモノマーのモル数を〔５〕、上記式（６）で表されるマクロモノマーのモル数を〔６〕、スチレンのモル数を〔Ｓ〕とすると、本発明の微粒子の製造方法においては、これらの割合は、（〔４〕＋〔５〕）：〔６〕：〔Ｓ〕＝１：０．２〜２．５：５〜３００となる割合である。尚、この割合は、それぞれのマクロモノマー或いはモノマーの実際に重合反応する割合であり、反応条件等によってそれぞれのマクロモノマー或いはモノマーの反応率が１００％に満たなければ反応率を勘案して、実際に使用するマクロモノマー或いはモノマーの割合は上記範囲の通りでなくても差し支えない。
【００４６】
上記極性溶媒としては、特に限定されるものではなく、例えば、水等の無機極性溶媒、エタノール等の有機極性溶媒、或いはこれら無機極性溶媒と有機極性溶媒の混合溶媒等、周知の極性溶媒を利用することができるが、マクロモノマー或いはモノマーの溶解性ないしは分散性の観点からエタノール等の極性有機溶媒、若しくはこれと水等の無機極性溶媒との混合溶媒（混合溶媒の場合、好ましくは無機極性溶媒は３０容量％以下がよい）を用いることが好ましい。
【００４７】
これらマクロモノマー或いはモノマーの重合は、周知の反応条件、例えば、ＡＩＢＮ等の触媒を用いて、例えば４０℃〜８０℃の温度で３時間〜４８時間程度反応させることにより行なうことができる。
【００４８】
これらマクロモノマー或いはモノマーは、上記極性溶媒中で重合させると、重合したポリマーは、極性溶媒に対する溶解性の高い、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマーに由来する構造部分を外側に、上記極性溶媒に対する溶解性の低いスチレンに由来する構造部分を内側となるように集積されて粒子化する。その結果、このようにして得られるポリマー微粒子は、粒子表面に、上記式（１）で表される構造及び／又は上記式（２）で表される構造を含むものとなる。また同様に粒子表面に、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマーに由来する構造部分を有するものとなる。
得られたポリマー微粒子の粒子径は、使用するマクロモノマー或いはモノマーの割合や極性溶媒の種類にもよるが、得られるポリマーの分子量を概ね１万〜１００万程度に制御すれば、概ね５０ｎｍ〜１００μｍ程度の微粒子となる。
【００４９】
尚、本発明の効果を阻害しない範囲内（好ましくは０〜５０質量％、より好ましくは０〜２０質量％）で、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマー及びスチレンの他に、その他のモノマーを使用してもよく、例えば、ポリマー構造として、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリル酸、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリシジルメタクリレート等を導入しても差し支えない。
【００５０】
次に、上記のようにして得たポリマー微粒子の表面に、抗原又は抗体を、結合又は吸着させる。
ここで用いる抗原又は抗体は上記と同様であり、好ましい抗原又は抗体も上記と同様である。
抗原又は抗体をポリマー微粒子の表面に結合又は吸着させる方法については特に限定されず、共有結合によっても物理的吸着によってもよいが、好ましくは共有結合によることがよい。
抗原又は抗体をポリマー微粒子の表面に共有結合させる方法も特に限定されないが、一般的にタンパク質やペプチドの固定化に用いられる縮合剤（例えばカルボジイミド等）を用いたアミド結合の形成による導入が最も好ましい。ここで用いられる縮合剤は特に限定されないが、特に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）や１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＩ）が好ましい。
【００５１】
次に本発明の凝集検査用試薬について説明する。
本発明の凝集検査用試薬は、上記本発明の凝集検査用微粒子、好ましくは上記本発明の凝集検査用微粒子の製造方法で製造された凝集検査用微粒子を、リン酸緩衝食塩水に分散させたものである。
【００５２】
上記リン酸緩衝食塩水としては特に限定されるものではなく、免疫反応を利用した通常の凝集検査用試薬に用いられるリン酸緩衝食塩水であればどのようなものでもよく、市販のリン酸緩衝食塩水を利用することもでき、例えば、商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｄ８５３７（シグマアルドリッチジャパン社製。以下ＰＢＳと略記する。）等を例示することができる。
【００５３】
本発明の凝集検査用試薬は、上記本発明の凝集検査用微粒子、好ましくは上記本発明の凝集検査用微粒子の製造方法で製造された凝集検査用微粒子を５０〜０．００１質量％、好ましくは１０〜０．０１質量％含有することが好ましい。
【００５４】
また、本発明の凝集検査用試薬には、本発明の効果を阻害しない範囲で、免疫反応を利用した通常の凝集検査用試薬に使用される添加剤を添加することができる。
このような添加剤としては、例えば界面活性剤やアジ化ナトリウム等の防腐剤等が挙げられ、これら添加剤の添加量は、本発明の凝集検査用試薬中、好ましくは５０質量％以下とする。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例及び比較例を挙げ本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５６】
〔上記式（４）で表されるマクロモノマーＡの製造〕
Ｎ−ビニルアセトアミド５０ｇ、２−メルカプトエタノール１８．４ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル０．９６ｇをトルエン２５０ｍＬに加えて、窒素バブリングしながら６０℃で６時間攪拌還流させた。沈殿物をエタノールに溶解させて、アセトンへ再沈殿させることで生成物２４ｇを回収した。生成物であるＮ−ビニルアセトアミドポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した結果、その分子量はＭｗ／Ｍｎ＝９，５００／４，０００であった。前記式（４）のｎに相当する数としては約１００であった。
【００５７】
得られたＮ−ビニルアセトアミドポリマー２０ｇをＤＭＦ１００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．２６ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド０．３４ｇ加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド２．６ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１５ｇを回収した。生成物であるビニルベンジル末端Ｎ−ビニルアセトアミドポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これをマクロモノマーＡとする。
【００５８】
〔上記式（６）で表されるマクロモノマーＢの製造〕
メタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル５０ｇ、２−メルカプトエタノール０．２９ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル０．５５ｇをＴＨＦ１００ｍＬに溶解させて、窒素バブリングしながら６０℃で６時間攪拌還流させた。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物３５ｇを回収した。生成物であるメタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した結果、その分子量はＭｗ／Ｍｎ＝１８，０００／９，６００であった。前記式（６）のｋに相当する数としては約７０であった。
【００５９】
得られたメタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルポリマー２０ｇをＤＭＦ４００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．４３ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド３．２０ｇ加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド３．０ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１８ｇを回収した。得られた生成物１８ｇをエタノール２００ｍＬに溶解し、これに濃塩酸２０ｍＬ及びヒドロキノン０．８ｇを加えた。これを７０℃で６時間還流させることで加水分解を行いポリメタクリル酸に誘導した。エタノールを留去後、イオン交換水に溶媒を置換して、さらに中性になるまでイオン交換水で透析を行った。これを凍結乾燥してビニルベンジル末端メタクリル酸ポリマーを得た。得られたビニルベンジル末端メタクリル酸ポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これをマクロモノマーＢとする。
【００６０】
〔実施例１〕
上記で得られたマクロモノマーＡ０．５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬ及びエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで、封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。
遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間）によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は２３０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１０ｍｇを０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μＬに分散させた。
【００６１】
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記で得られた微粒子分散液８００μＬを加えて４℃で３０分間震盪した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡともいう）１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを２４時間震盪させることで微粒子の表面に抗原としてのウシ血清アルブミンを結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの再分散を３回繰り返すことで、未反応ＢＳＡを除去して本発明の凝集検査用微粒子１の９．５ｍｇ（収率９５％）を得た。この凝集性検査用微粒子１の９．５ｍｇをＰＢＳ９．５ｍＬに分散させることで、本発明の凝集検査用試薬１を製造した。
尚、上記凝集検査用微粒子１は、上記式（３）における各繰り返し数（ｗ、ｘ、ｙ、ｚ）が、（１００、１．３、０、０．９３）であり、ポリマーの平均分子量が、３０万であって、上記凝集検査用微粒子中の、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位の存在量は、８ｍｇ／ｇであり、特定抗原に対する特異的な結合性の低い部位の存在量は、２０質量％であった。
【００６２】
〔実施例２〕
実施例１と同様に、上記で得られたマクロモノマーＡ０．５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬ及びエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで、封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間）によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は２３０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１０ｍｇを０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μＬに分散させた。
【００６３】
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記で得られた微粒子分散液８００μＬを加えて４℃で３０分間震盪した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ＢＳＡポリクローナル抗体（ＲｏｃｋＬａｎｄ ｉｎｃ．， Ａｎｔｉ−Ａｌｂｕｍｉｎ [Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ][Ｒａｂｂｉｔ]）１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを２４時間震盪させることで微粒子の表面に抗原としてＢＳＡポリクローナル抗体を結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの再分散を３回繰り返すことで、未反応ＢＳＡポリクローナル抗体を除去して本発明の凝集検査用微粒子２の９．５ｍｇ（収率９５％）を得た。この凝集性検査用微粒子２の９．５ｍｇをＰＢＳ９．５ｍＬに分散させることで、本発明の凝集検査用試薬２を製造した。
尚、上記凝集検査用微粒子２は、上記式（３）における各繰り返し数（ｗ、ｘ、ｙ、ｚ）が、（１００、１．３、０、０．９３）であり、ポリマーの平均分子量が、３０万であって、上記凝集検査用微粒子中の、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位の存在量は、８ｍｇ／ｇであり、特定抗体に対する特異的な結合性の低い部位の存在量は、２０質量％であった。
【００６４】
〔比較例１〕
市販のカルボキシル化微粒子（ＰＯＬＹＢＥＡＤ（登録商標) 0.25μｍ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ ２．５ｗｔ％，ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製）４００μＬを遠心分離で上澄みを除き、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μLに分散させた。
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３‘−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記分散液を加えて４℃で３０分震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることで微粒子の表面に、抗原としてウシ血清アルブミンを結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの再分散を３回繰り返すことで、未反応ＢＳＡを除去して比較凝集検査用微粒子１を製造した。
この比較凝集検査用微粒子１をＰＢＳ１．０ｍＬに分散させ、ブロッキング処理として、ヒト血清アルブミン１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を１．０ｍＬ加えて１時間室温で震蕩した後に遠心分離後、上澄みを除き、１０ｍＬのＰＢＳへ再分散して比較凝集検査用試薬１を得た。
【００６５】
〔比較例２〕
市販のカルボキシル化微粒子（ＰＯＬＹＢＥＡＤ(登録商標) 0.25μｍ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ ２．５ｗｔ％，ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製）４００μＬを遠心分離で上澄みを除き、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μLに分散させた。
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３‘−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記分散液を加えて４℃で３０分震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ＢＳＡポリクローナル抗体（ＲｏｃｋＬａｎｄ ｉｎｃ．， Ａｎｔｉ−Ａｌｂｕｍｉｎ [Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ][Ｒａｂｂｉｔ]）１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることで微粒子の表面に、抗原としてウシ血清アルブミンを結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの再分散を３回繰り返すことで、未反応ＢＳＡを除去して比較凝集検査用微粒子２を製造した。
この比較凝集検査用微粒子２をＰＢＳ１．０ｍＬに分散させ、ブロッキング処理として、ヒト血清アルブミン１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を１．０ｍＬ加えて１時間室温で震蕩した後に遠心分離後、上澄みを除き、１０ｍＬのＰＢＳへ再分散して比較凝集検査用試薬２を得た。
【００６６】
〔検体溶液の作成〕
ブランク溶液はＰＢＳそのものを用いた。
検体１−１：ＢＳＡポリクローナル抗体（ＲｏｃｋＬａｎｄ ｉｎｃ．， Ａｎｔｉ−Ａｌｂｕｍｉｎ ［Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ］［Ｒａｂｂｉｔ］）を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ［Ｒａｂｂｉｔ］）を０．１ｍｇ／ｍＬになるようＰＢＳで希釈した溶液を検体溶液１−１とした。
検体２−１：ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈した溶液を検体溶液２−１とした。
検体１−２：ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．０１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈した溶液を検体溶液１−２とした。
検体２−２：ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．０１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈した溶液を検体溶液２−２とした。
【００６７】
〔凝集量試験〕
実施例１の凝集検査用試薬１と、検体１−１をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、１時間静置した後、ポアサイズ１μｍのフィルターでこの混合液を濾過し、粒径１μｍ以上の凝集体を濾別して、その重量を測定したところ９．３ｍｇであった。
一方、実施例１の凝集検査用試薬１と、検体２−１をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ、０．２ｍｇであった。このことから、本発明の凝集検査用試薬１は、ＢＳＡポリクローナル抗体の存在を検出するための凝集検査用試薬として極めて高感度であることがわかった。
【００６８】
実施例２の凝集検査用試薬２と、検体１−２をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ９．１ｍｇであった。
また、実施例２の凝集検査用試薬２と、検体２−２をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ、０．３ｍｇであった。このことから、本発明の凝集検査用試薬２は、ＢＳＡの存在を検出するための凝集検査用試薬として極めて高感度であることがわかった。
【００６９】
同様に比較例１の比較凝集検査用試薬１と、検体１−１をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ９．０ｍｇであった。
また、比較例１の比較凝集検査用試薬１と、検体２−１をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ、７．３ｍｇであった。このことから、比較凝集検査用試薬１は、ＢＳＡポリクローナル抗体の存在を検出するための凝集検査用試薬としては感度が低いものであった。
【００７０】
同様に比較例２の比較凝集検査用試薬２と、検体１−２をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ９．１ｍｇであった。
また、比較例２の比較凝集検査用試薬２と、検体２−２をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ、７．６ｍｇであった。このことから、比較凝集検査用試薬２は、ＢＳＡの存在を検出するための凝集検査用試薬としては感度が低いものであった。
【００７１】
〔実施例３〕
実施例１と同様に、上記で得られたマクロモノマーＡ０．５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬ及びエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで、封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間）によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は２３０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１０ｍｇを０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μＬに分散させた。
【００７２】
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記で得られた微粒子分散液８００μＬを加えて４℃で３０分間震盪した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ピーナッツレクチン（PNA）１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを２４時間震盪させることで微粒子の表面にＰＮＡを結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの再分散を３回繰り返すことで、未反応ＰＮＡを除去して本発明の凝集検査用微粒子３の９．５ｍｇ（収率９５％）を得た。この凝集性検査微粒子３の９．５ｍｇをＰＢＳ９．５ｍＬに分散させることで、本発明の凝集検査用試薬３を製造した。
尚、上記凝集検査用微粒子３は、上記式（３）における各繰り返し数（ｗ、ｘ、ｙ、ｚ）が、（１００、１．３、０、０．９３）であり、ポリマーの平均分子量が、３０万であって、上記凝集検査用微粒子中の、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位の存在量は、８ｍｇ／ｇであり、特定抗体に対する特異的な結合性の低い部位の存在量は、２０質量％であった。
【００７３】
〔比較例３〕
市販のカルボキシル化微粒子（ＰＯＬＹＢＥＡＤ(登録商標) ０．２５μｍ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ ２．５ｗｔ％，ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製）４００μＬを遠心分離で上澄みを除き、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μLに分散させた。
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記分散液を加えて４℃で３０分震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ＰＮＡ1ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることで微粒子の表面にＰＮＡを結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの際分散を３回繰り返すことで、未反応ＢＳＡを除去して比較凝集検査用微粒子３を製造した。この比較凝集検査用微粒子３をＰＢＳ１０ｍＬに分散させることで比較凝集検査用試薬３を得た。
【００７４】
〔ＴＦ抗原への特異的結合性評価試験〕
ウサギ保存血液３ｍＬをＰＢＳで５倍希釈し、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、上澄みを捨ててさらにこれをＰＢＳで５倍希釈する。この操作を３回繰り返して赤血球分画を取り出す。
赤血球分画と等量のシアリダーゼ（由来：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｏｃｈｅ社製）１Ｕ／ｍＬを加えて、３７℃で１時間静かに震蕩した。これをＰＢＳで４倍に希釈して、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、リン酸緩衝食塩水（Ｃａ及びＭｇ含有）（商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｄ８６６２、シグマアルドリッチジャパン社製。以下ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）と略記する。）に分散させる。その後、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させる操作を３回繰り返して、シアリダーゼ処理赤血球分画を得る。
これをＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に対して２ｖ／ｖ％溶液としてシアリダーゼ処理赤血球浮遊液とする。９６穴のタイタープレート（Ｕ底）に各ウェルの２列目以降に５０μＬずつＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）を分注する。固定化されたＰＮＡ量を基に、ＰＮＡ濃度が同じになるように調製した凝集検査用試薬の１００μＬを１列目に入れて２倍希釈列を作る。
各ウェルにシアリダーゼ処理赤血球浮遊液を５０μＬずつ分注し、室温で６０分間放置する。各ウェルの底部への沈殿状態（凝集の有無）により結合性を判定する。底部の中心部のみに丸く固まって沈殿したものは、赤血球のみが強く凝集しており、凝集検査用試薬との結合性が低い（陰性）。一方、底部全体に広がって沈殿したものは凝集検査用試薬との結合性が強い（陽性）。ここで、陽性であった最も薄い濃度を最低結合活性濃度（試料１ｍＬ当たりに含まれるＰＮＡ質量）とする。この評価法では、最低結合活性濃度が低いほど、ＴＦ抗原への特異的結合性が高いと評価できる。
このような評価法にて、本発明の凝集検査用試薬３について評価したところ、１．０μｇ／ｍＬであり、比較凝集検査用試薬３について評価したところ、１．０μｇ／ｍＬであった。
【００７５】
一方、ウサギ保存血液３ｍＬをＰＢＳで５倍希釈し、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、上澄みを捨ててさらにこれをＰＢＳで５倍希釈する。この操作を３回繰り返して赤血球分画を取り出す。
これをＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に対して２ｖ／ｖ％溶液として赤血球浮遊液とする。９６穴のタイタープレート（Ｕ底）に各ウェルの２列目以降に５０μＬずつＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）を分注する。固定化されたＰＮＡ量を基に、ＰＮＡ濃度が同じになるように調製した凝集検査用試薬の１００μＬを１列目に入れて２倍希釈列を作る。
各ウェルにシアリダーゼ処理赤血球浮遊液を５０μＬずつ分注し、室温で６０分間放置する。各ウェルの底部への沈殿状態（凝集の有無）により結合性を判定する。底部の中心部のみに丸く固まって沈殿したものは、赤血球のみが強く凝集しており、凝集検査用試薬との結合性が低い（陰性）。一方、底部全体に広がって沈殿したものは凝集検査用試薬との結合性が強い（陽性）。ここで、陽性であった最も薄い濃度を最低結合活性濃度（試料１ｍＬ当たりに含まれるＰＮＡ質量）とする。この評価法では、最低結合活性濃度が低いほど、非特異的結合性が高いと評価できる。
このような評価法にて、本発明の凝集検査用試薬３について評価したところ、１２．５μｇ／ｍＬ以上であり、比較凝集検査用試薬３について評価したところ、１．０μｇ／ｍＬであった。
【００７６】
以上から、本発明の凝集検査用試薬３はＴＦ抗原への特異的結合性が極めて高く、ＴＦ抗原の存在を検出するための凝集検査用試薬として極めて高感度であることがわかった。
一方、比較凝集検査用試薬３はＴＦ抗原への特異的結合性が低く、ＴＦ抗原の存在を検出するための凝集検査用試薬として低感度であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凝集反応を利用した検査に用いる凝集検査用微粒子、特に試料中の抗原あるいは抗体の有無を凝集反応を利用して検査するのに適した凝集検査用微粒子に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応をはじめとした分子間の特異的相互作用を利用した凝集反応は、生体試料、食品、環境中の特定の成分等の測定、検査に広く用いられている。
特にポリスチレン系ラテックス粒子は、他の担体に比べ保存時の安定性に優れ、抗原抗体反応等のタンパク質や脂質等の生理活性物質を強く吸着固定化し、さらに固定化した抗原あるいは抗体を長期間安定に保存しうる点でも優れているため、多くの検査反応試薬、特に凝集反応試薬の担体として汎用されている。
こうした検査用微粒子は、ポリスチレン微粒子の表面に特定物質に対する特異的な結合性を有する分子、例えば抗体等、を物理吸着、あるいは共有結合によって固定化した後に、非特異的吸着の低減のためウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎｅ, ＢＳＡ）やカゼイン、スキムミルク等を飽和吸着させる等のブロッキング操作を行う（例えば特許文献１等）。
【０００３】
しかし、このようにして調製したポリスチレン粒子は分散・保存安定性に欠け非特異的吸着の低減も十分ではない。このため、微粒子表面に固定化した抗体本来の感度を大きく低下させてしまうことが多く、擬陽性の原因ともなっている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−２１５１２８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、抗原あるいは抗体に対する特異的な結合性の高い部位を有するだけでなく、これ以外の部位においてこれら抗原あるいは抗体との非特異的な結合性が低く、検査感度を大幅に向上させることのできる凝集検査用微粒子、その製法、及びこれらを用いた凝集検査試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、その表面に、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位を有するか、又は、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位を有する、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの凝集検査用微粒子であって、当該特定抗原に対する結合性の低い部位あるいは当該特定抗体に対する結合性の低い部位が、下記式（１）で表される構造及び／又は下記式（２）で表される構造を含むものであることを特徴とする、凝集検査用微粒子を提供することにより、上記目的を達成したものである。
【０００７】
【化１】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表し、ｎは１０〜６００の数を表す。）
【０００８】
【化２】
（式中、ｍは１０〜６００の数を表す。）
【０００９】
また本発明は、上記凝集検査用微粒子の好ましい製造方法として、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー粒子を得、次いでこのポリマー粒子の表面に抗原又は抗体を、結合又は吸着させることを特徴とする、凝集検査用粒子の製造方法を提供することにより、上記目的を達成したものである。
【００１０】
【化３】
（式中、ｎは上記式（３）と同義である。）
【００１１】
【化４】
（式中、Ｒ’及びｍは上記式（３）と同義である。）
【００１２】
【化５】
（式中、ｋは上記式（３）と同義である。）
【００１３】
また本発明は、上記凝集検査用微粒子を、リン酸緩衝食塩水に分散させたことを特徴とする、凝集検査用試薬を提供することにより、上記目的を達成したものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の効果は、抗原あるいは抗体に対する特異的な結合性の高い部位を有するだけでなく、これ以外の部位においてこれら抗原あるいは抗体との非特異的な結合性が低く、検査感度を大幅に向上させることのできる凝集検査用微粒子、その製法、及びこれらを用いた凝集検査試薬を提供したことにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
まず、本発明の凝集検査用微粒子について、好ましい実施態様を例に説明する。
本発明の凝集検査用微粒子は、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの粒子であって、その粒子の表面に、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位を有するか、又は、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位を有し、当該特定抗原に対する結合性の低い部位あるいは当該特定抗体に対する結合性の低い部位が、上記式（１）で表される構造及び／又は上記式（２）で表される構造を含むものであれば特に限定されるものではない。
【００１６】
本発明の凝集検査用微粒子において、ベースとなる粒子は、特に限定されるものではなく、シリカ、金、磁性微粒子、半導体粒子等の金属化合物微粒子等の無機粒子でも、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、有機ポリシロキサン、有機ポリシルセスキオキサン、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリロニトリル等の有機ポリマーでもよいが、好ましくは水中や生理食塩水中での分散安定性の観点からは有機ポリマーが適しており、特にポリスチレン、ポリ（メタ）アクリル酸エステルが好ましい。
【００１７】
上記凝集検査用微粒子は、その粒子径が１ｎｍ〜１００μｍの粒子であることが必要であり、好ましくは１０ｎｍ〜１００μｍ、より好ましくは５０ｎｍ〜１００μｍ、最も好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍの粒子であることがよい。粒子径が１ｎｍ未満であると検査時の凝集効率が悪く検査精度が低下する。また粒子径が１００μｍ超であると安定性が悪くなり不要な凝集を来たす等のためやはり検査精度が低下する。
【００１８】
本発明の凝集検査用微粒子は、上記粒子表面に、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原にに対する結合性の低い部位を有するか、又は、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位を有するものである。
【００１９】
この特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、抗体、若しくはレクチンを例示することができる。レクチンとしては、特に限定されるものではなく、天然のレクチンでも人工のレクチンでもよく、例えばＡｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ(ピーナッツレクチンとも称される。以下ＰＮＡと略記する場合がある。）、Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｂａｕｈｉｎｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ等を例示することができる。
具体的には、特定抗原としての腫瘍マーカーである癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対しては、抗癌胎児性抗原（癌胎児性抗体）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）に対しては、抗α−フェトプロテイン、ヒト絨毛性刺激ホルモンβ鎖に対しては抗ヒト絨毛性刺激ホルモンβ鎖、炎症マーカーであるＣ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）に対しては抗Ｃ−反応性蛋白質（Ｃ−反応性蛋白質抗体）、ガラクトシルβ１−３−N−アセチルガラクトサミン残基を有するＴｈｏｍｓｅｎ Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原)に対してはＰＮＡ、等を例示することができ、より好ましくはＣ-反応性蛋白質(ＣＲＰ）に対して抗Ｃ−反応性蛋白質（Ｃ−反応性蛋白質抗体）、Ｔｈｏｍｓｅｎ Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ抗原）に対してはＰＮＡを有することが特性の高さ等から好ましい。
【００２０】
また、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、抗原を例示することができる。
具体的には、特定抗体としてのリウマチ因子に対してはヒト変性ＩｇＧ、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）に対しては抗イムノグロブリンＧ（Ａｎｔｉ−ＩｇＧ）、インフルエンザ等のウイルス抗体に対してはウイルス自体や抗原性部位、感染症マーカーである抗ストレプトリジン−Ｏ（ＡＳＯ）に対してはストレプトリジンＯ、等を例示することができ、より好ましくは感染症マーカーである抗ストレプトリジン−Ｏ（ＡＳＯ）に対してストレプトリジンＯを有することが特性の高さ等から好ましい。
【００２１】
上記粒子表面をこれらの特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位、あるいは特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位とするため、上記抗原あるいは抗体を粒子表面に導入する方法については、特に限定されない。共有結合による方法が最も好ましいが、物理的吸着によってもよい。
【００２２】
上記抗原あるいは抗体を共有結合で結合させる場合、その方法は限定されないが、一般的にタンパク質やペプチドの固定化に用いられる縮合剤（カルボジイミド等）を用いたアミド結合の形成による導入が最も好ましい。ここで用いられる縮合剤は特に限定されないが、特に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）や１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＩ）が好ましい。
【００２３】
本発明の凝集検査用微粒子における、粒子の表面に有する特定抗原に対する結合性の低い部位又は特定抗体に対する結合性の低い部位は、ノニオン性で且つ水和力が高い、Ｎ−ビニルアセトアミドを構成単位とする重合鎖及び／又はポリエチレングリコール鎖、具体的には、下記式（１）で表される構造及び／又は下記式（２）で表される構造を含む。
【００２４】
【化６】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表し、ｎは１０〜６００、好ましくは３０〜３００、より好ましくは５０〜２００の数を表す。）
【００２５】
【化７】
（式中、ｍは１０〜６００、好ましくは５０〜３００、より好ましくは８０〜２００の数を表す。）
【００２６】
このような、特定抗原に対する結合性の低い部位又は特定抗体に対する結合性の低い部位を、その表面に有する粒子として、好ましくは、下記式（３）で表される構造を有するポリマーを主成分とする粒子を例示することができる。
【００２７】
【化８】
（式中、Ｒ’は水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表す。ｎは上記式（１）と同義である。ｍは上記式（２）と同義である。ｋは１０〜６００、好ましくは３０〜３００、より好ましくは５０〜２００の数を表す。Ａは抗原又は抗体を表す。ｗ、ｘ、ｙ、ｚはポリマーの分子量を１万〜１００万、好ましくは５万〜１００万、より好ましくは１０万〜１００万とする数であり、且つ（ｘ＋ｙ）：ｚ：ｗ＝１：０．２〜２．５：５〜３００、好ましくは１：０．２〜２．５：１０〜２００、より好ましくは１：０．２〜２．５：２０〜１００の割合である。尚、ｘとｙは何れか一方が０であってもよい。ｗ、ｘ、ｙ、ｚの各繰り返し数に対応する各繰り返し単位の主鎖における順序は任意である。）
【００２８】
尚、上記式（３）で表される構造を有するポリマーは、本発明の効果を阻害しない範囲内（好ましくは０〜５０質量％、より好ましくは０〜２５質量％）でその他の構造（例えば、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリル酸、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）を有していてもよい。
【００２９】
本発明の凝集検査用微粒子は、上記のような特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位を有するか、又は、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位を、粒子の表面に有するものである。
本発明の凝集検査用微粒子においては、これら特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位、あるいは、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位が存在する、本発明で言うところの「粒子の表面」とは、必ずしも粒子の最外層末端にこれらの部位が存在する必要はなく、概ね最外層末端から１０ｎｍの深さまでのなかに存在すればよい。従って、粒子径が２０ｎｍ以下の粒子の場合は、単に粒子中に有することと同義であり、そのような状態でも差し支えない。
尚、最外層末端から１０ｎｍの深さまでのなかの分子構造の存在量は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって分析可能である。また、抗原あるいは抗体を結合させる場合、粒子形成後に結合させれば当然に粒子表面に存在することとなり、粒子全体としての抗原あるいは抗体の存在量を分析すれば得ることができる。
【００３０】
本発明の凝集検査用微粒子において、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位の存在量（濃度）は、それぞれ下記の通りである。
特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位の存在量（濃度）：粒子１ｇ当たりの該部位の存在質量として、好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１ｇ／ｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１００ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは２ｍｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ。
当該特定抗原に対する結合性の低い部位の存在量（濃度）：好ましくは１〜９９質量％、より好ましくは５〜９０質量％、さらに好ましくは２０〜７０質量％。
また、本発明の凝集検査用微粒子において、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位と当該特定抗原に対する結合性の低い部位との存在比率（質量比）は、好ましくは１：９〜９：１（前者：後者）、より好ましくは２：８〜８：２である。
【００３１】
本発明の凝集検査用微粒子において、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位の存在量（濃度）は、それぞれ下記の通りである。
特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位の存在量（濃度）：粒子１ｇ当たりの該部位の存在質量として、好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１ｇ／ｇ、より好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１００ｍｇ／ｇ、さらに好ましくは２ｍｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇ。
当該特定抗体に対する結合性の低い部位の存在量（濃度）：好ましくは１〜９９質量％、より好ましくは５〜９０質量％、さらに好ましくは２０〜７０質量％。
また、本発明の凝集検査用微粒子において、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位と当該特定抗体に対する結合性の低い部位との存在比率（質量比）は、好ましくは１：９〜９：１（前者：後者）、より好ましくは２：８〜８：２である。
【００３２】
本発明の凝集検査用微粒子は、どのような態様で用いてもよいが、好ましくは該凝集検査用微粒子を分散媒に分散させた態様であることがよい。この場合、分散媒としては、該凝集用検査微粒子中のタンパク質を失活させないものであれば特に限定されず、例えば、免疫反応を利用した通常の凝集検査用試薬に使用されることが知られている水性の分散媒であれば使用することができる。このような分散媒の一例としては、例えば生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＣａやＭｇを含有しているものでも、していないものでも可）等を例示することができる。
【００３３】
次に本発明の凝集検査用微粒子の好ましい製造方法について説明する。
本発明の凝集検査用微粒子は、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー微粒子を得、次いでこのポリマー微粒子の表面に抗原又は抗体を、結合又は吸着させることにより、製造される。
【００３４】
【化９】
（式中、ｎは上記式（３）と同義である。）
【００３５】
【化１０】
（式中、Ｒ’及びｍは上記式（３）と同義である。）
【００３６】
【化１１】
（式中、ｋは上記式（３）と同義である。）
【００３７】
上記式（４）で表されるマクロモノマーの製造方法は、任意であり特に限定されず常法によればよいが、例えばまず、２−メルカプトエタノールを出発物質としてＮ−ビニルアセトアミド（ＮＶＡ）を、重合開始剤（例えば、Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）等）の存在下に、有機溶媒（例えばトルエン等）中で重合させる等して次式で表されるポリマーを得る。
【００３８】
【化１２】
（式中、ｎは上記式（４）と同義である。）
【００３９】
次いで、このポリマーをビニルベンジルクロライドと反応（例えばジメチルフォルムアミド溶媒中で、ＮａＨ及びテトラブチルホスホニウムブロマイドの存在下で反応）させることにより得ることができる。
【００４０】
上記式（５）で表されるマクロモノマーの製造方法は、任意であり特に限定されず常法によればよいが、例えば、常法により重合させたポリエチレングリコール（或いはさらに水酸化ナトリウム等を反応させた後にメチルクロライド等のアルキルクロライド等を反応させて末端をアルキル化した誘導体）を、ビニルベンジルクロライドと反応させることにより得ることができる。
【００４１】
上記式（６）で表されるマクロモノマーの製造方法は、任意であり特に限定されず常法によればよいが、例えばまず、２−メルカプトエタノールを出発物質として、メタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−ＢＭＡ）を、重合開始剤（例えば、Ｎ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）等）の存在下に、有機溶媒（例えばＴＨＦ等）中で重合させる等して次式で表されるポリマーを得る。
【００４２】
【化１３】
（式中、ｋは上記式（６）と同義である。）
【００４３】
次いで、このポリマーをビニルベンジルクロライドと反応（例えばジメチルフォルムアミド溶媒中で、ＮａＨ及びテトラブチルホスホニウムブロマイドの存在下で反応）させた後、加水分解することによりｔ−Ｂｕ基を外すことによって得ることができる。
【００４４】
本発明の凝集検査用微粒子の製造方法はまず、上記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は上記式（５）で表されるマクロモノマーと、上記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー微粒子を得る。
【００４５】
上記式（４）で表されるマクロモノマーのモル数を〔４〕、上記式（５）で表されるマクロモノマーのモル数を〔５〕、上記式（６）で表されるマクロモノマーのモル数を〔６〕、スチレンのモル数を〔Ｓ〕とすると、本発明の微粒子の製造方法においては、これらの割合は、（〔４〕＋〔５〕）：〔６〕：〔Ｓ〕＝１：０．２〜２．５：５〜３００となる割合である。尚、この割合は、それぞれのマクロモノマー或いはモノマーの実際に重合反応する割合であり、反応条件等によってそれぞれのマクロモノマー或いはモノマーの反応率が１００％に満たなければ反応率を勘案して、実際に使用するマクロモノマー或いはモノマーの割合は上記範囲の通りでなくても差し支えない。
【００４６】
上記極性溶媒としては、特に限定されるものではなく、例えば、水等の無機極性溶媒、エタノール等の有機極性溶媒、或いはこれら無機極性溶媒と有機極性溶媒の混合溶媒等、周知の極性溶媒を利用することができるが、マクロモノマー或いはモノマーの溶解性ないしは分散性の観点からエタノール等の極性有機溶媒、若しくはこれと水等の無機極性溶媒との混合溶媒（混合溶媒の場合、好ましくは無機極性溶媒は３０容量％以下がよい）を用いることが好ましい。
【００４７】
これらマクロモノマー或いはモノマーの重合は、周知の反応条件、例えば、ＡＩＢＮ等の触媒を用いて、例えば４０℃〜８０℃の温度で３時間〜４８時間程度反応させることにより行なうことができる。
【００４８】
これらマクロモノマー或いはモノマーは、上記極性溶媒中で重合させると、重合したポリマーは、極性溶媒に対する溶解性の高い、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマーに由来する構造部分を外側に、上記極性溶媒に対する溶解性の低いスチレンに由来する構造部分を内側となるように集積されて粒子化する。その結果、このようにして得られるポリマー微粒子は、粒子表面に、上記式（１）で表される構造及び／又は上記式（２）で表される構造を含むものとなる。また同様に粒子表面に、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマーに由来する構造部分を有するものとなる。
得られたポリマー微粒子の粒子径は、使用するマクロモノマー或いはモノマーの割合や極性溶媒の種類にもよるが、得られるポリマーの分子量を概ね１万〜１００万程度に制御すれば、概ね５０ｎｍ〜１００μｍ程度の微粒子となる。
【００４９】
尚、本発明の効果を阻害しない範囲内（好ましくは０〜５０質量％、より好ましくは０〜２０質量％）で、上記の式（４）〜式（６）で表されるマクロモノマー及びスチレンの他に、その他のモノマーを使用してもよく、例えば、ポリマー構造として、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリル酸、ポリビニルピリジン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリアクリル酸、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリグリシジルメタクリレート等を導入しても差し支えない。
【００５０】
次に、上記のようにして得たポリマー微粒子の表面に、抗原又は抗体を、結合又は吸着させる。
ここで用いる抗原又は抗体は上記と同様であり、好ましい抗原又は抗体も上記と同様である。
抗原又は抗体をポリマー微粒子の表面に結合又は吸着させる方法については特に限定されず、共有結合によっても物理的吸着によってもよいが、好ましくは共有結合によることがよい。
抗原又は抗体をポリマー微粒子の表面に共有結合させる方法も特に限定されないが、一般的にタンパク質やペプチドの固定化に用いられる縮合剤（例えばカルボジイミド等）を用いたアミド結合の形成による導入が最も好ましい。ここで用いられる縮合剤は特に限定されないが、特に１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）や１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＩ）が好ましい。
【００５１】
次に本発明の凝集検査用試薬について説明する。
本発明の凝集検査用試薬は、上記本発明の凝集検査用微粒子、好ましくは上記本発明の凝集検査用微粒子の製造方法で製造された凝集検査用微粒子を、リン酸緩衝食塩水に分散させたものである。
【００５２】
上記リン酸緩衝食塩水としては特に限定されるものではなく、免疫反応を利用した通常の凝集検査用試薬に用いられるリン酸緩衝食塩水であればどのようなものでもよく、市販のリン酸緩衝食塩水を利用することもでき、例えば、商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｄ８５３７（シグマアルドリッチジャパン社製。以下ＰＢＳと略記する。）等を例示することができる。
【００５３】
本発明の凝集検査用試薬は、上記本発明の凝集検査用微粒子、好ましくは上記本発明の凝集検査用微粒子の製造方法で製造された凝集検査用微粒子を５０〜０．００１質量％、好ましくは１０〜０．０１質量％含有することが好ましい。
【００５４】
また、本発明の凝集検査用試薬には、本発明の効果を阻害しない範囲で、免疫反応を利用した通常の凝集検査用試薬に使用される添加剤を添加することができる。
このような添加剤としては、例えば界面活性剤やアジ化ナトリウム等の防腐剤等が挙げられ、これら添加剤の添加量は、本発明の凝集検査用試薬中、好ましくは５０質量％以下とする。
【実施例】
【００５５】
以下に実施例及び比較例を挙げ本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５６】
〔上記式（４）で表されるマクロモノマーＡの製造〕
Ｎ−ビニルアセトアミド５０ｇ、２−メルカプトエタノール１８．４ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル０．９６ｇをトルエン２５０ｍＬに加えて、窒素バブリングしながら６０℃で６時間攪拌還流させた。沈殿物をエタノールに溶解させて、アセトンへ再沈殿させることで生成物２４ｇを回収した。生成物であるＮ−ビニルアセトアミドポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した結果、その分子量はＭｗ／Ｍｎ＝９，５００／４，０００であった。前記式（４）のｎに相当する数としては約１００であった。
【００５７】
得られたＮ−ビニルアセトアミドポリマー２０ｇをＤＭＦ１００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．２６ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド０．３４ｇ加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド２．６ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１５ｇを回収した。生成物であるビニルベンジル末端Ｎ−ビニルアセトアミドポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これをマクロモノマーＡとする。
【００５８】
〔上記式（６）で表されるマクロモノマーＢの製造〕
メタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル５０ｇ、２−メルカプトエタノール０．２９ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル０．５５ｇをＴＨＦ１００ｍＬに溶解させて、窒素バブリングしながら６０℃で６時間攪拌還流させた。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物３５ｇを回収した。生成物であるメタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルポリマーをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した結果、その分子量はＭｗ／Ｍｎ＝１８，０００／９，６００であった。前記式（６）のｋに相当する数としては約７０であった。
【００５９】
得られたメタクリル酸ｔｅｒｔ−ブチルポリマー２０ｇをＤＭＦ４００ｍＬに溶解させて、ＮａＨ（オイルディスパージョン）０．４３ｇ及びテトラブチルホスホニウムブロマイド３．２０ｇ加えて室温で３時間攪拌した後、４―ビニルベンジルクロライド３．０ｇを添加して室温で２４時間攪拌した。反応溶液を水／メタノール＝１／１混合溶媒へ再沈殿させることで生成物１８ｇを回収した。得られた生成物１８ｇをエタノール２００ｍＬに溶解し、これに濃塩酸２０ｍＬ及びヒドロキノン０．８ｇを加えた。これを７０℃で６時間還流させることで加水分解を行いポリメタクリル酸に誘導した。エタノールを留去後、イオン交換水に溶媒を置換して、さらに中性になるまでイオン交換水で透析を行った。これを凍結乾燥してビニルベンジル末端メタクリル酸ポリマーを得た。得られたビニルベンジル末端メタクリル酸ポリマーを 1Ｈ−ＮＭＲで分析した結果、ビニルベンジル基のプロトン由来のピークを確認した。これをマクロモノマーＢとする。
【００６０】
〔実施例１〕
上記で得られたマクロモノマーＡ０．５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬ及びエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで、封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。
遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間）によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は２３０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１０ｍｇを０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μＬに分散させた。
【００６１】
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記で得られた微粒子分散液８００μＬを加えて４℃で３０分間震盪した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡともいう）１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを２４時間震盪させることで微粒子の表面に抗原としてのウシ血清アルブミンを結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの再分散を３回繰り返すことで、未反応ＢＳＡを除去して本発明の凝集検査用微粒子１の９．５ｍｇ（収率９５％）を得た。この凝集性検査用微粒子１の９．５ｍｇをＰＢＳ９．５ｍＬに分散させることで、本発明の凝集検査用試薬１を製造した。
尚、上記凝集検査用微粒子１は、上記式（３）における各繰り返し数（ｗ、ｘ、ｙ、ｚ）が、（１００、１．３、０、０．９３）であり、ポリマーの平均分子量が、３０万であって、上記凝集検査用微粒子中の、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位の存在量は、８ｍｇ／ｇであり、特定抗原に対する特異的な結合性の低い部位の存在量は、２０質量％であった。
【００６２】
〔実施例２〕
実施例１と同様に、上記で得られたマクロモノマーＡ０．５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬ及びエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで、封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間）によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は２３０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１０ｍｇを０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μＬに分散させた。
【００６３】
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記で得られた微粒子分散液８００μＬを加えて４℃で３０分間震盪した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ＢＳＡポリクローナル抗体（ＲｏｃｋＬａｎｄ ｉｎｃ．， Ａｎｔｉ−Ａｌｂｕｍｉｎ [Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ][Ｒａｂｂｉｔ]）１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを２４時間震盪させることで微粒子の表面に抗原としてＢＳＡポリクローナル抗体を結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの再分散を３回繰り返すことで、未反応ＢＳＡポリクローナル抗体を除去して本発明の凝集検査用微粒子２の９．５ｍｇ（収率９５％）を得た。この凝集性検査用微粒子２の９．５ｍｇをＰＢＳ９．５ｍＬに分散させることで、本発明の凝集検査用試薬２を製造した。
尚、上記凝集検査用微粒子２は、上記式（３）における各繰り返し数（ｗ、ｘ、ｙ、ｚ）が、（１００、１．３、０、０．９３）であり、ポリマーの平均分子量が、３０万であって、上記凝集検査用微粒子中の、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位の存在量は、８ｍｇ／ｇであり、特定抗体に対する特異的な結合性の低い部位の存在量は、２０質量％であった。
【００６４】
〔比較例１〕
市販のカルボキシル化微粒子（ＰＯＬＹＢＥＡＤ（登録商標) 0.25μｍ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ ２．５ｗｔ％，ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製）４００μＬを遠心分離で上澄みを除き、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μLに分散させた。
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３‘−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記分散液を加えて４℃で３０分震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることで微粒子の表面に、抗原としてウシ血清アルブミンを結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの再分散を３回繰り返すことで、未反応ＢＳＡを除去して比較凝集検査用微粒子１を製造した。
この比較凝集検査用微粒子１をＰＢＳ１．０ｍＬに分散させ、ブロッキング処理として、ヒト血清アルブミン１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を１．０ｍＬ加えて１時間室温で震蕩した後に遠心分離後、上澄みを除き、１０ｍＬのＰＢＳへ再分散して比較凝集検査用試薬１を得た。
【００６５】
〔比較例２〕
市販のカルボキシル化微粒子（ＰＯＬＹＢＥＡＤ(登録商標) 0.25μｍ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ ２．５ｗｔ％，ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製）４００μＬを遠心分離で上澄みを除き、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μLに分散させた。
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３‘−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記分散液を加えて４℃で３０分震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ＢＳＡポリクローナル抗体（ＲｏｃｋＬａｎｄ ｉｎｃ．， Ａｎｔｉ−Ａｌｂｕｍｉｎ [Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ][Ｒａｂｂｉｔ]）１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることで微粒子の表面に、抗原としてウシ血清アルブミンを結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの再分散を３回繰り返すことで、未反応ＢＳＡを除去して比較凝集検査用微粒子２を製造した。
この比較凝集検査用微粒子２をＰＢＳ１．０ｍＬに分散させ、ブロッキング処理として、ヒト血清アルブミン１ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を１．０ｍＬ加えて１時間室温で震蕩した後に遠心分離後、上澄みを除き、１０ｍＬのＰＢＳへ再分散して比較凝集検査用試薬２を得た。
【００６６】
〔検体溶液の作成〕
ブランク溶液はＰＢＳそのものを用いた。
検体１−１：ＢＳＡポリクローナル抗体（ＲｏｃｋＬａｎｄ ｉｎｃ．， Ａｎｔｉ−Ａｌｂｕｍｉｎ ［Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ］［Ｒａｂｂｉｔ］）を１．０ｍｇ／ｍＬ、ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ［Ｒａｂｂｉｔ］）を０．１ｍｇ／ｍＬになるようＰＢＳで希釈した溶液を検体溶液１−１とした。
検体２−１：ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈した溶液を検体溶液２−１とした。
検体１−２：ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．０１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈した溶液を検体溶液１−２とした。
検体２−２：ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．０１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈した溶液を検体溶液２−２とした。
【００６７】
〔凝集量試験〕
実施例１の凝集検査用試薬１と、検体１−１をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、１時間静置した後、ポアサイズ１μｍのフィルターでこの混合液を濾過し、粒径１μｍ以上の凝集体を濾別して、その重量を測定したところ９．３ｍｇであった。
一方、実施例１の凝集検査用試薬１と、検体２−１をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ、０．２ｍｇであった。このことから、本発明の凝集検査用試薬１は、ＢＳＡポリクローナル抗体の存在を検出するための凝集検査用試薬として極めて高感度であることがわかった。
【００６８】
実施例２の凝集検査用試薬２と、検体１−２をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ９．１ｍｇであった。
また、実施例２の凝集検査用試薬２と、検体２−２をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ、０．３ｍｇであった。このことから、本発明の凝集検査用試薬２は、ＢＳＡの存在を検出するための凝集検査用試薬として極めて高感度であることがわかった。
【００６９】
同様に比較例１の比較凝集検査用試薬１と、検体１−１をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ９．０ｍｇであった。
また、比較例１の比較凝集検査用試薬１と、検体２−１をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ、７．３ｍｇであった。このことから、比較凝集検査用試薬１は、ＢＳＡポリクローナル抗体の存在を検出するための凝集検査用試薬としては感度が低いものであった。
【００７０】
同様に比較例２の比較凝集検査用試薬２と、検体１−２をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ９．１ｍｇであった。
また、比較例２の比較凝集検査用試薬２と、検体２−２をそれぞれ９．５ｍLずつ混合し、同様にして測定したところ、７．６ｍｇであった。このことから、比較凝集検査用試薬２は、ＢＳＡの存在を検出するための凝集検査用試薬としては感度が低いものであった。
【００７１】
〔実施例３〕
実施例１と同様に、上記で得られたマクロモノマーＡ０．５ｇ、上記で得られたマクロモノマーＢ０．５ｇ、スチレン１．０ｇ及びＮ，Ｎ−アゾビスイソブチロニトリル１５ｍｇを、イオン交換水５ｍＬ及びエタノール１０ｍＬの混合液に溶解させ、窒素バブリングを３０分間行った。次いで、封をして、これを６０℃の湯浴中で２４時間震蕩することで微粒子を生成させた。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１５分間）によって微粒子を分離した後、凍結乾燥させて生成物としての微粒子を得た。微粒子の平均粒子径は２３０ｎｍ（動的光散乱法にて測定）であった。
得られた微粒子１０ｍｇを０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μＬに分散させた。
【００７２】
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記で得られた微粒子分散液８００μＬを加えて４℃で３０分間震盪した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ピーナッツレクチン（PNA）１ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを２４時間震盪させることで微粒子の表面にＰＮＡを結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの再分散を３回繰り返すことで、未反応ＰＮＡを除去して本発明の凝集検査用微粒子３の９．５ｍｇ（収率９５％）を得た。この凝集性検査微粒子３の９．５ｍｇをＰＢＳ９．５ｍＬに分散させることで、本発明の凝集検査用試薬３を製造した。
尚、上記凝集検査用微粒子３は、上記式（３）における各繰り返し数（ｗ、ｘ、ｙ、ｚ）が、（１００、１．３、０、０．９３）であり、ポリマーの平均分子量が、３０万であって、上記凝集検査用微粒子中の、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位の存在量は、８ｍｇ／ｇであり、特定抗体に対する特異的な結合性の低い部位の存在量は、２０質量％であった。
【００７３】
〔比較例３〕
市販のカルボキシル化微粒子（ＰＯＬＹＢＥＡＤ(登録商標) ０．２５μｍ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ ２．５ｗｔ％，ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製）４００μＬを遠心分離で上澄みを除き、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液８００μLに分散させた。
一方、０．０５Ｍ−ＫＨ2ＰＯ4水溶液に水溶性カルボジイミドである１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを１質量％溶解させた溶液２００μＬを用意しておき、上記分散液を加えて４℃で３０分震蕩した。これを遠心分離（６０００ｒｐｍ、１０分間）で上澄みを除去し、ＰＮＡ1ｍｇをＰＢＳ１ｍＬに溶解した溶液を１ｍＬ加えて攪拌して微粒子を分散させた。これを４℃で２４時間震蕩させることで微粒子の表面にＰＮＡを結合させた。
これをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）後、上澄みを除去し、ＰＢＳへの際分散を３回繰り返すことで、未反応ＢＳＡを除去して比較凝集検査用微粒子３を製造した。この比較凝集検査用微粒子３をＰＢＳ１０ｍＬに分散させることで比較凝集検査用試薬３を得た。
【００７４】
〔ＴＦ抗原への特異的結合性評価試験〕
ウサギ保存血液３ｍＬをＰＢＳで５倍希釈し、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、上澄みを捨ててさらにこれをＰＢＳで５倍希釈する。この操作を３回繰り返して赤血球分画を取り出す。
赤血球分画と等量のシアリダーゼ（由来：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、Ｒｏｃｈｅ社製）１Ｕ／ｍＬを加えて、３７℃で１時間静かに震蕩した。これをＰＢＳで４倍に希釈して、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、リン酸緩衝食塩水（Ｃａ及びＭｇ含有）（商品名：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｄ８６６２、シグマアルドリッチジャパン社製。以下ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）と略記する。）に分散させる。その後、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、ＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に分散させる操作を３回繰り返して、シアリダーゼ処理赤血球分画を得る。
これをＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に対して２ｖ／ｖ％溶液としてシアリダーゼ処理赤血球浮遊液とする。９６穴のタイタープレート（Ｕ底）に各ウェルの２列目以降に５０μＬずつＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）を分注する。固定化されたＰＮＡ量を基に、ＰＮＡ濃度が同じになるように調製した凝集検査用試薬の１００μＬを１列目に入れて２倍希釈列を作る。
各ウェルにシアリダーゼ処理赤血球浮遊液を５０μＬずつ分注し、室温で６０分間放置する。各ウェルの底部への沈殿状態（凝集の有無）により結合性を判定する。底部の中心部のみに丸く固まって沈殿したものは、赤血球のみが強く凝集しており、凝集検査用試薬との結合性が低い（陰性）。一方、底部全体に広がって沈殿したものは凝集検査用試薬との結合性が強い（陽性）。ここで、陽性であった最も薄い濃度を最低結合活性濃度（試料１ｍＬ当たりに含まれるＰＮＡ質量）とする。この評価法では、最低結合活性濃度が低いほど、ＴＦ抗原への特異的結合性が高いと評価できる。
このような評価法にて、本発明の凝集検査用試薬３について評価したところ、１．０μｇ／ｍＬであり、比較凝集検査用試薬３について評価したところ、１．０μｇ／ｍＬであった。
【００７５】
一方、ウサギ保存血液３ｍＬをＰＢＳで５倍希釈し、２０００ｒｐｍ×５分間の遠心分離を行い、上澄みを捨ててさらにこれをＰＢＳで５倍希釈する。この操作を３回繰り返して赤血球分画を取り出す。
これをＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）に対して２ｖ／ｖ％溶液として赤血球浮遊液とする。９６穴のタイタープレート（Ｕ底）に各ウェルの２列目以降に５０μＬずつＰＢＳ（Ｃａ＋Ｍｇ）を分注する。固定化されたＰＮＡ量を基に、ＰＮＡ濃度が同じになるように調製した凝集検査用試薬の１００μＬを１列目に入れて２倍希釈列を作る。
各ウェルにシアリダーゼ処理赤血球浮遊液を５０μＬずつ分注し、室温で６０分間放置する。各ウェルの底部への沈殿状態（凝集の有無）により結合性を判定する。底部の中心部のみに丸く固まって沈殿したものは、赤血球のみが強く凝集しており、凝集検査用試薬との結合性が低い（陰性）。一方、底部全体に広がって沈殿したものは凝集検査用試薬との結合性が強い（陽性）。ここで、陽性であった最も薄い濃度を最低結合活性濃度（試料１ｍＬ当たりに含まれるＰＮＡ質量）とする。この評価法では、最低結合活性濃度が低いほど、非特異的結合性が高いと評価できる。
このような評価法にて、本発明の凝集検査用試薬３について評価したところ、１２．５μｇ／ｍＬ以上であり、比較凝集検査用試薬３について評価したところ、１．０μｇ／ｍＬであった。
【００７６】
以上から、本発明の凝集検査用試薬３はＴＦ抗原への特異的結合性が極めて高く、ＴＦ抗原の存在を検出するための凝集検査用試薬として極めて高感度であることがわかった。
一方、比較凝集検査用試薬３はＴＦ抗原への特異的結合性が低く、ＴＦ抗原の存在を検出するための凝集検査用試薬として低感度であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その表面に、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位を有するか、又は、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位を有する、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの凝集検査用微粒子であって、当該特定抗原に対する結合性の低い部位あるいは当該特定抗体に対する結合性の低い部位が、下記式（１）で表される構造及び／又は下記式（２）で表される構造を含むものであることを特徴とする、凝集検査用微粒子。
【化１】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表し、ｎは１０〜６００の数を表す。）
【化２】
（式中、ｍは１０〜６００の数を表す。）
【請求項２】
上記の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位が抗体であり、上記の特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位が抗原である、請求項１に記載の凝集検査用微粒子。
【請求項３】
下記式（３）で表される構造を有するポリマーを主成分とするものである、請求項１又は２に記載の凝集検査用微粒子。
【化３】
（式中、Ｒ’は水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表す。ｎは上記式（１）と同義である。ｍは上記式（２）と同義である。ｋは１０〜６００の数を表す。Ａは抗原又は抗体を表す。ｗ、ｘ、ｙ、ｚはポリマーの分子量を１万〜１００万とする数であり、且つ（ｘ＋ｙ）：ｚ：ｗ＝１：０．２〜２．５：５〜３００の割合である。尚、ｘとｙは何れか一方が０であってもよい。ｗ、ｘ、ｙ、ｚの各繰り返し数に対応する各繰り返し単位の主鎖における順序は任意である。）
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載の凝集検査用微粒子の製造方法であって、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー粒子を得、次いでこのポリマー粒子の表面に抗原又は抗体を、結合又は吸着させることを特徴とする、凝集検査用微粒子の製造方法。
【化４】
（式中、ｎは上記式（３）と同義である。）
【化５】
（式中、Ｒ’及びｍは上記式（３）と同義である。）
【化６】
（式中、ｋは上記式（３）と同義である。）
【請求項５】
請求項１〜３の何れかに記載の凝集検査用微粒子を、リン酸緩衝食塩水に分散させたことを特徴とする凝集検査用試薬。
【請求項６】
上記凝集検査用微粒子が、請求項４に記載の凝集検査用微粒子の製造方法で製造されたものである、請求項５記載の凝集検査用試薬。
【請求項１】
その表面に、特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗原に対する結合性の低い部位を有するか、又は、特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位及び当該特定抗体に対する結合性の低い部位を有する、粒子径１ｎｍ〜１００μｍの凝集検査用微粒子であって、当該特定抗原に対する結合性の低い部位あるいは当該特定抗体に対する結合性の低い部位が、下記式（１）で表される構造及び／又は下記式（２）で表される構造を含むものであることを特徴とする、凝集検査用微粒子。
【化１】
（式中、Ｒは水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表し、ｎは１０〜６００の数を表す。）
【化２】
（式中、ｍは１０〜６００の数を表す。）
【請求項２】
上記の特定抗原に対する特異的な結合性の高い部位が抗体であり、上記の特定抗体に対する特異的な結合性の高い部位が抗原である、請求項１に記載の凝集検査用微粒子。
【請求項３】
下記式（３）で表される構造を有するポリマーを主成分とするものである、請求項１又は２に記載の凝集検査用微粒子。
【化３】
（式中、Ｒ’は水素原子又は炭素原子数１〜４の炭化水素基を表す。ｎは上記式（１）と同義である。ｍは上記式（２）と同義である。ｋは１０〜６００の数を表す。Ａは抗原又は抗体を表す。ｗ、ｘ、ｙ、ｚはポリマーの分子量を１万〜１００万とする数であり、且つ（ｘ＋ｙ）：ｚ：ｗ＝１：０．２〜２．５：５〜３００の割合である。尚、ｘとｙは何れか一方が０であってもよい。ｗ、ｘ、ｙ、ｚの各繰り返し数に対応する各繰り返し単位の主鎖における順序は任意である。）
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載の凝集検査用微粒子の製造方法であって、下記式（４）で表されるマクロモノマー及び／又は下記式（５）で表されるマクロモノマーと、下記式（６）で表されるマクロモノマーと、スチレンとを、極性溶媒中で重合させてポリマー粒子を得、次いでこのポリマー粒子の表面に抗原又は抗体を、結合又は吸着させることを特徴とする、凝集検査用微粒子の製造方法。
【化４】
（式中、ｎは上記式（３）と同義である。）
【化５】
（式中、Ｒ’及びｍは上記式（３）と同義である。）
【化６】
（式中、ｋは上記式（３）と同義である。）
【請求項５】
請求項１〜３の何れかに記載の凝集検査用微粒子を、リン酸緩衝食塩水に分散させたことを特徴とする凝集検査用試薬。
【請求項６】
上記凝集検査用微粒子が、請求項４に記載の凝集検査用微粒子の製造方法で製造されたものである、請求項５記載の凝集検査用試薬。
【公開番号】特開２００９−５３０７１（Ｐ２００９−５３０７１Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２０６３３（Ｐ２００７−２２０６３３）
【出願日】平成１９年８月２８日（２００７．８．２８）
【出願人】（００００００３８７）株式会社ＡＤＥＫＡ (987)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２８日（２００７．８．２８）
【出願人】（００００００３８７）株式会社ＡＤＥＫＡ (987)
【Ｆターム（参考）】
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