処理用生物サンプル調製のための磨砕機および対応法
本発明は、例えば、サンプルから核酸またはタンパク質を単離するための処理のために植物または動物サンプルを調製するための方法に関する。本発明は、磨砕機にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、処理、すなわち、例えば、サンプルから核酸またはタンパク質を単離するための処理のために植物または動物サンプルを調製するための方法、および磨砕機(pulverizer)に関する。このような調製および試験は、標準化処理指令にしたがって実験室において実験技術員によって実行される。いわゆるプロトコールは、このような処理指令の一部である。大腸菌（E.coli）からプラスミドDNAを単離するための、このようなプロトコールの例は、特許文献1から明らかである。
【背景技術】
【０００２】
所望のやり方、すなわち、例えば、核酸またはタンパク質の単離のためにサンプルを処理するには、いわゆる「キット」、例えば、Qiagen（www.Qiagen.com）による"UltraClean Tissue DNA Isolation Kit（超清浄組織DNA単離キット）"が、サンプルおよび所望の結果に応じて市場において入手が可能である。あらかじめ定められたプロトコールにしたがってこのようなキットを用いてサンプルを処理する前に、そのサンプルは、適切な方法で準備しなければならない。
【０００３】
従来技術において公知の、典型的なこのような準備を下記に記述する。
【０００４】
例えば、器官が、ラットなどの実験動物から摘出される。動物の器官の選択は、目的に依存する。
【０００５】
この動物の摘出組織は、洗浄バッファー液、例えば、PBS（リン酸バッファー生理的食塩水で下記を含む：Na2HPO4（乾燥）、NaH2PO4（乾燥）、NaCl、および蒸留水）において洗浄される。この洗浄工程によって、摘出部分の組織は、血液非含有状態で提供され、不要成分とは無縁とされる。
【０００６】
次に、この摘出組織は、特に細胞活性を停止させるために、液体窒素において冷却される。こうしないと、処理後、所望の情報が所望の品質において取得されないことがある。本工程では、体温、例えば、37℃の温度を有する組織は、通常、液体窒素の中に沈められる。気泡が発生する。気泡の形成が止んで始めて、組織は、液体窒素から取り出される。次に、組織は、例えば、ドライアイスを用いて-80℃に保存される。
【０００７】
液体窒素における冷却ステップを回避しなければならない場合、それに代わるものとして、摘出組織は、洗浄後、RNAlater(登録商標)などの安定化試薬を用いて化学的に保存される。RNAlater(登録商標)は、新鮮組織を保存するためにAmbion社（www.ambion.com）によって開発された粘ちょう液である。保存作用は、主に、水分除去によって組織中の全ての酵素が不活性化され、細胞活動が停止されることに基づく。この粘ちょう液は、組織の全ての細胞中に速やかに拡散しなければならない。したがって、組織片のサイズは、一辺の長さがせいぜい0.5センチメートルとなるまで制限されなければならない。この化学的処置後、この処置済み組織は、処理までの間保存するために、さらに-80oCに冷却される。
【０００８】
通常、所望の試験、単離などを実行可能とするためには、処理用に10から100mgの組織が必要とされる。処理の前に、ここで必要量の動物組織を、例えば、メスを用いて切り出す。
【０００９】
切り出したサンプル、すなわち、切り出した組織は、今度は、破砕される。これは、細胞壁を開放しなければならないことを意味する。これは、機械的、化学的、または酵素的に実行することが可能である。機械的破砕は、例えば、Qiagen社によって市販される"TissueRuptor"、これはQiagenによる2006年7月発行のTissueRuptor Handbookで公知である、を用いて実行される。この場合、回転ブレードが、1分当たり35,000回転で組織の細胞壁をバラバラに分解する。通則として、核酸などの内容物に対する損傷を避けるため、機械的破砕はバッファー内で行われる。
【００１０】
バッファー、すなわち、化学物質の存在下に行われる機械的破砕は、特許文献2から公知である。
【００１１】
低温ミルによるサンプルの調製も公知である（例えば、2007年3月12日更新の、http://www.laborpraxis.de/fachartikel/lp_fachartikel_nh_2384859.htmlを参照されたい）。このミルでは、サンプルは、液体窒素の温度において磨砕される。この全磨砕工程を通じて、サンプルは、強く凍結されたままで窒素に接触することはない。この技術的には極めて複雑な方法は、前述の方法では上手く行かないサンプルの場合、例えば、骨などのきわめて硬い材料、または、皮膚などのコラーゲン含有材料の場合に実行することが可能である。さらに、骨を調製しなければならない場合、それを液体窒素で満たした容器の中に入れ、金属棒を用いて潰すことも知られる。骨は、次に、粉末状として利用することが可能である。
【００１２】
顕微鏡によって組織学的検査を行わなければならない場合、サンプルは先ずパラフィンにおいてブロック状とし、次いで、ミクロトームを用いて薄層組織に切断する。
【００１３】
植物組織を処理しなければならない場合は、葉などの軟らかい材料、軟らかい豆などの場合は、メスによる裁断のみが可能である。乾燥または凍結植物サンプルの場合は、それらのサンプルを液体窒素で冷却し、液体窒素で冷却した乳鉢において乳棒を用いて磨砕する。
【００１４】
特許文献3は、分散液と共に細胞を凍結、磨砕して、細胞をバラバラに分解する方法を教示する。
【００１５】
スパイスなどの食品用の圧潰／混合デバイスが、特許文献4および5のそれぞれに開示される。このデバイスは、中にボールを納めた中空体を含み、食品は該ボールによって圧潰される。特許文献6、7、8、および9は、ボールミルおよび類似デバイスの他の例を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】DE 101 53 957 A1
【特許文献２】EP 1577011 A2
【特許文献３】ドイツ特許明細書第738 286号
【特許文献４】DE 602005001256 T2
【特許文献５】WO 2004/082837 A1
【特許文献６】US 2004/0144874 A1
【特許文献７】JP 2006051505 A
【特許文献８】JP 2002-066 366 A
【特許文献９】JP 03-186 360 A
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
前述の方法によるサンプルの調製は、処理後、できるだけ求めるものに近い結果を取得するという目標を追求する。したがって、処理後、求めるものに近い点で改善された結果の取得を可能とする、サンプル調製を実現することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本目的の一解決策は、請求項1の特徴を含む。他の解決策は、同様に方法を主題とする、独立請求項の特徴を含む。本法を実行するためのデバイスは、最終独立請求項の特徴を含む。これらの独立請求項から有利な実施態様が明白となる。
【００１９】
これらの特許請求項による教示は、植物組織でも、動物またはヒト組織でも、植物または組織の安定化サンプルおよび新鮮サンプルのいずれにおいても、有効である。
【００２０】
本目標を実現するために、一実施態様のサンプルは、先ず、前述のように洗浄され、例えば、液体窒素で処置されるか、またはRNAlaterの中に保存される。好ましくは金属から成るか、またはプラスチックから成り、金属インレイ(inlay)を備えた密封可能容器、および、該容器の内部に配される可動実体(movable doby)が、冷却、すなわち、はっきりと0oCよりも低い温度に冷却される。プラスチックから成る容器は、インレイのためのシェルとなる。インレイは、シェルとは別に製造される実体である。例えば、米国特許第6,235,501 B1号、図10から知られる、二重壁容器であって、本発明の意味におけるインレイを含まない容器とははっきりと区別されなければならない。なぜなら、この特許文書から知られる二つの壁は、互いに一体的に接続されるからである。
【００２１】
容器が冷却される温度は、少なくとも-50℃でなければならない。好ましくは、約-80℃、例えば、-70℃から-90℃の温度を選ぶべきである。なぜなら、その方が、0℃から際立って遠ざかるからである。さらに、-80℃または-70oCから-90℃は、ドライアイスを用いれば、コスト有効的なやり方で実現することが可能である。約-80℃まで下げることによって特に良好な結果を得ることが可能であることが見出された。-80℃よりも低い温度もある程度まで可能である。しかしながら、容器が過剰に冷やされることがないよう注意を払わなければならない。例えば、液体窒素の温度、すなわち、-196℃は、良好な結果を得るには低すぎることが判明している。
【００２２】
この容器の中に配される実体は、容器の揺動運動によって、その内部に配される強凍結したサンプルを圧潰する目的に役立つ。容器の内部、および該容器の内部に配される可動実体は、この目的にしたがってその大きさ・形状が決められ、設計される。中空球状末端を持つ円筒形内部は特に適切である。その場合、可動実体は、ボール、または球形末端を有するロッドである。ボールまたはボルトの直径は、可動性を確保するために内部の直径よりも小さい。この可動実体は、サンプルの圧潰(crushing)を可能とするため、硬く、好ましくは重い材料、例えば、金属から成る。
【００２３】
生物サンプル、例えば、ラットの冷却心臓は、良好な結果を得るために、好ましくは、サンプルをあらかじめバラバラに分解することなく丸ごと容器の中に入れる。特に、少なくとも-50oC冷のサンプルを容器の中に入れる。次いで、容器が、特に10から30秒、特に手動で搖動され、そのため、可動実体は、前後に揺り動かされる。次に、このようにして圧潰されたサンプルが取り出され、所望の量が、キットを用いプロトコールにしたがって処理される。サンプルおよび一つ以上の可動実体を別にして、容器の中には基本的には他の物質、特に、冷却剤、例えば、液体窒素、または、例えば、バッファー液は無い。仮にそれらがあるとすると、それは所望の結果を劣化させるだけであろうと考えられる。
【００２４】
驚くべきことに、大した技術的努力もせず、手技は単純であるにも拘わらず、従来技術で公知のサンプル調製に比べ、この形式のサンプル調製の方がより優れた結果が得られることが見出された。中に可動実体を配した容器は、ドライアイスで、例えば、-80℃に冷却するだけなので、技術的努力は大したものではない。次に、この冷却容器は、手で、取り出すことが可能であり−手は、簡単に、手袋によって低温から十分に保護することが可能である−手で、サンプルは導入することが可能であり、容器は密封することが可能である。次に、容器は、1分にも満たない時間搖動され、サンプルを取り出し、別の容器に当座の間冷却状態で保存することが可能である。それとは別に、サンプルは、取り出して別の容器に保存することをせず、直接、可動実体を含む容器の中に置かれる。その場合、容器は、破砕容器としても保存容器としても役立つ。処理のための所望のサンプル量は、正確に、簡単に入手することが可能である。さらに、均一な組織分布がこの工程において実現される。安定化組織、植物の葉および種子でも、このようにしてその後の処理のために調製することが可能である。しかしながら、この方法は、皮膚および骨、および比較的硬いか、または粘っこいサンプルに対しては適切ではない。
【００２５】
冷却、密封容器における処理は長時間を要しないから、搖動工程を中断し、その間に容器を再び適切な低温に冷却する必要はない。このことは、特に、容器が金属から成り十分な厚みの壁を持つ場合には当てはまる。数ミリメートル厚の壁でも十分である。さらに、驚くべきことに、例えば、TissueRupterにおける破砕は省略可能であることが見出された。したがって、このようにして調製されたサンプルは直ちに処理することが可能であり、特に優れた最終結果をもたらす。
【００２６】
サンプルは粉末状で存在するので、それは、その後に使用される薬剤の作用可能部位が、特に大きな表面積を有するという点で有利である。その後のステップのために、所望量の粉末は、例えば、秤量によるか、または、場合によっては、特に簡単に、相当する大きさの測定容器、例えば、計量スプーンによって供給される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】キャップをねじ込んで登載することが可能な容器の断面図を示す。
【図２】比較例と比較した場合の、本法によって調製されたサンプルのDNA分析結果。
【図３】サンプルを磨砕する、密封可能容器の、特に好ましい実施態様を示す。
【図４】本発明のさらに別の改良型実施態様の断面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、例示の実施態様を参照しながら下記にさらに詳細に説明される。
図1は、キャップ2をねじ込んで登載することが可能な容器1の断面図を示す。容器1の直径に比べてより小さい直径を有するボール3が、容器1の中に配される。容器の直径は、数センチメートルの範囲内にある。容器1の内部は円筒形である。密封状態では、容器の末端5および6は半球形状をしている。容器1が適度に搖動されると、内側のボール3は前後に動かされ、末端5および6に衝突する。容器1、キャップ2、およびボール3は、金属、すなわち、ステンレススチールから成る。
【００２９】
容器は先ず、ドライアイス中で-80℃に冷却される。
【００３０】
サンプル7が動物から取り出される。このサンプルは洗浄され、これ以上気泡の形成が無くなるまで窒素の中に沈められるか、または、例えば、RNAlaterの中に24時間保存される。次に、サンプルは、最初に、ドライアイス中でマイナス80℃で保存することが可能である。植物の場合、種子などの乾燥植物組織は、容器1においてドライアイス上で冷却される。葉などの新鮮植物材料は、先ず、-80℃に冷却される。
【００３１】
容器1が所望の温度に冷却されたならば、それは手で取り出すことが可能である。手は、木綿の手袋およびラテックス製グローブによって寒さから保護すると好都合である。サンプル7は、ピンセットによって容器1の中に導入されるが、そこにはボール3も配置されている。次いで、キャップ2が、容器1の上にねじ込まれ、このようにして容器1はしっかりと密封される。ここで、容器1は、手によって前後に揺すられ、そのために、ボール3は、二つの末端5および6に交互に衝突する。したがってサンプル7はバラバラに分解される。この工程は、20から30秒後に終了する。このようにして流動性粉末が生産されるが、これは、先ず容器1に続けて保存することが可能である。直後か、または保存後、キャップ2は、ねじの逆回転によって外され、圧潰サンプルが取り出される。ここで所望量が、例えば、秤量によって採取され、利用可能とされる。
【００３２】
ラットの肝臓が取り出され、PBSにおいて洗浄された。次に、この肝臓は、RNAlater(登録商標)において24時間保存された。次に、このラットの肝臓は、その後に使用されるまで-80℃に保存された。
【００３３】
肝臓は、冷却した密封容器において前述のように20秒間圧潰された。漏斗を用いて、この圧潰サンプルをFalconチューブに充填し、先ず、ドライアイスにおいて-80℃でさらに保存した。
【００３４】
最終的に、Falconチューブ内のサンプル10mgを重量計によって秤量採取した。この工程では、サンプルが解凍することがないよう注意した。
【００３５】
100mM SDS; 100mM EDTA; 50mM Tris; 100mM NaClを含む水溶液（バッファー１）180μlおよびProtK 20μlを、2mlの反応容器に充填し、前述の、秤量サンプル10mgを、渦巻き攪拌下に加えた。これによって、サンプルの塊形成が阻止され、対応するプロトコールまたはキットと連結して使用されるDNeasyまたはRNeasyカラムの凝集が阻止される。
【００３６】
使用したQiagenによるDNeasyプロトコールは、下記のステップを含む。10mgの組織を、180μlのバッファー1 + 20μlのプロテイナーゼKと、搖動(rocking)プラットフォームにおいて56℃で1時間インキュベートする。次に、ピペットにて4μlのRNアーゼAを加え、室温で2分インキュベートする。次に、ピペットにて200μlのAL（分解バッファー）を加え、搖動プラットフォームにおいて70℃で10分インキュベートする。後続工程において、ピペットにて200μlのエタノール(100%)を加え、僅かに反転させて混ぜ合わせる。この瞬間、DNAを「白濁」として認めることが可能である。これは、本法の感度を示す兆候である。なぜなら、これは、分子がほとんど損傷されず、高度の分子形として存在することを示しているからである。カラム効率を上げるため、得られた溶液は、ピペットで吸い上げることによって3度混ぜ合わせる。次に、溶液全体をピペットでDNeasyカラムに移し、8,000rpmにて1分間遠心する。ここで、対応核酸はカラム材料に結合する。上清を廃棄し、ここで、カラムを、500μlの洗浄バッファーAW 1によって、1分当たり8,000回転で1分間洗浄する。プロトコールでは推奨されていないけれども、このステップをさらにもう一度行う。次に、カラムを、プロトコールの記載にしたがって、500μlのバッファーAW 2によって1分当たり14,000回転で3分間洗浄する。再び上清を廃棄する。さらに、プロトコールに記載される、必要ならば選択してもよい、1分当たり14,000回転で1分間の乾燥ステップが実行される。最後に、200μlのRNアーゼ無添加水を、カラム中央にピペットで導入し、室温で1分間インキュベートし、次いで、1分当たり8,000回転（rpm）で1分間遠心する。この溶出液を、分光光度計によって分析する。これは、濃度および純度の定量に役立つ。最後に、DNAの定性および定量分析のために、アガロースゲルを調製する。このアガロースゲルにおいて、そのDNAの品質、変性の程度、分子のサイズ、および、その量を決めることが可能である。
【００３７】
このようにして得られた結果が図2に示され、比較例と比較される。先ず、ラットの肝臓が、背景技術で前述したやり方で従来法にしたがって前処理された場合、すなわち、最初にRNAlaterにおいて洗浄、保存された場合の結果を、"TR"の上に示す。次に、10mgの、所望サンプル量を分離し、TissueRuptor(登録商標)において破砕した。
【００３８】
上記の右隣に、本発明の方法にしたがって得られた結果が"TD+"の上に示される。処理の観点からDNeasyカラムのカラム効率をより良く利用可能とするために、200μlのエタノール(100%)を加えた後、DNeasyプロトコールにしたがって処理された溶液を、3回ピペットで吸い上げ次に吐き出すことによって、混ぜ合わせた。このようにして、DNeasyカラムに結合可能となるように、高分子DNAが調製される。
【００３９】
上記の右隣に、本発明の方法によって得られた結果が、ただしカラム効率を上げるためのピペットによる混合は実行しなかった、"TD-"の上に示される。
【００４０】
上記の右隣に、サンプルが先ず本発明にしたがって調製された場合の結果が、"TD/TR"の上に示される。しかしながら、この圧潰サンプルは最終的にTissueRuptor(登録商標)においてさらに3秒間破砕された。3秒後に既に変性の増大が生じていることが、辺縁のぼやけから明らかに見て取ることができる。
【００４１】
図2における上方の明白区域は、ゲノムDNAを特徴づける。TR上の明白区域は、TD+、TD-、またはTD/TR上のものほど高く延びていない。明白区域が高く延びれば延びるほど、得られるDNAはより高分子であり、したがって、得られる結果はより優れる。従来技術にしたがって得られるTR上の明白区域は、ぼやけており、灰白色区域への移行部となる。これは、DNAが変性している、すなわち、損傷していることの兆候である。このような損傷は、TD+およびTD-にあるように、本発明の方法によって回避することが可能である。
【００４２】
図2は、DNAの量および質を決めるために前述のように使用した、DNAアガロースゲルの写真を示す。この目的のために1%ゲルを注入する。このため、1gのアガロース粉末（重合可能な長鎖炭水化物分子）を秤量採取し、100ml (1x) TEAバッファーに溶解し、マイクロウェーブで加熱する。得られた溶液に5μlの臭化エチジウムを加え、それをフラスコを振とうすることによって混ぜ合わせ、金型の中に注ぐ。ここでコーム(comb)を、この熱い溶液中に固定する。これによって、溶液が冷却し重合すると、ゲルの中に印象が残され、これは後に、5μlの負荷染色液と混ぜ合わされたサンプルがピペット注入されるスロットを形成する。後に紫外光の下に結果を実現することが可能となるように、その後の量的比較のためにゲルに対しさらにマーカーを加える。電圧が印加されると、DNAは、その異なる重量および電荷に基づいて拡散する、すなわち、小型の、変性断片は、高分子DNAよりもゲルの中をより速やかに移動する。
【００４３】
本発明による方法にしたがって得られたDNAは、肉眼でも雲状として見て取ることが可能である。
【００４４】
25mgの「新鮮な」ラット心臓を、別実験の観点に基づいて試験した。「新鮮な」とは、安定化試薬で処置されてはいないが、最初に液体窒素において強凍結されることを意味する。背景技術で前述した従来技術で公知の方法と比較した場合、本発明の方法を用いると二倍のRNA濃度が得られた。
【００４５】
この実験では、前述の実験と同じ磨砕法を用いた。ラットの心臓を取り出し、液体窒素を用いて気泡の形成が止むまで冷却した。次に、心臓をドライアイス（-80℃）上に保存した。処理の直前まで、容器1はドライアイスにて冷却し、そこに凍結した心臓を丸ごと充填し、手で20秒間振とうした。次に、粉末を同じ容器の中に保存した。これは、RNeasy Fibrous Tissue Mini（RNeasy線維性組織ミニ）プロトコール用の試料を得るための時間をかけるためである。これが問題を起こすことはない。なぜなら、該容器は、破砕容器であると同時に、保存容器でもあるからである。前述のプロトコールによる後続処理のために、3.5M GTC; 28mM Na3-クエン酸塩 ｘ 2 H2Oを含む水溶液300μl（RLTバッファー、分解バッファー）を、排気フード下2mlの反応容器において3μlのβ-メルカプトエタノールと混合し、保存心臓組織粉末25 mgを秤量して、該反応容器に入れ、次いで渦巻き攪拌した。590μlのRNアーゼ無添加水および10μlのProtK（酵素）を加え、これらをピペットによって混ぜ合わせ、次いで、搖動プラットフォームにおいて55℃で10分インキュベートし、次に、室温で10,000xgにおいて3分間遠心した。次に、上清をピペットで新規2ml反応容器に移し、0.5倍容量の96%-100%エタノールをピペットで加え、ピペットを用いて混ぜ合わせた。次に、最初、700μlの溶液をピペットでRNeasyカラムに導入し、1分当たり10,000回転で15秒間遠心した。カラムは700μlの容量しか持たないので、全サンプルがカラムの上に注がれるようにするため、このステップを残りの液についても繰り返した。遠心後上清は廃棄した。次にカラムを、1分当たり8,000回転において350μlのバッファーRW1で15秒洗浄し、上清を廃棄した。ここで、各サンプルについて、10μlのDNアーゼ1保存液を70μlのRDDバッファーと混合し、かつ、倒置によって混ぜ合わせた。次に、この溶液80μlを正確にカラムの中央に注ぎ、室温で15分インキュベートした。次に、350μlのバッファーRW1をカラムに注ぎ、8,000gにおいて15秒洗浄した。次に、このRNeasyカラムを、新規2ml収集管に移し、500 μlのRPEを充填し、再び、8,000gにおいて15秒洗浄した。再び上清を廃棄した。最終ステップを繰り返した。ただし、遠心は、今度は、8,000g、2分で行った。ここで、カラムを再び新規2ml反応容器に移し、そこで1分間最大スピードで乾燥させた。最終ステップにおいて、カラムは、新規2 mlの反応容器に移し、30μlのRNアーゼ無添加水を充填し、1分当たり10,000回転で1分遠心して溶出した。次に、この溶出液もまた分光光度計によって分析し、RNAアガロースゲルによって評価した。
【００４６】
さらに、種々の圧潰実験を、特に、乳鉢において-196℃で行った。最終的に、これらの試験は、-196℃の冷却も、乳鉢の使用も、所望の結果の実現には適切ではないことを示した。
【００４７】
図3は、サンプルを磨砕する、密封可能容器の、特に好ましい実施態様を示す。この容器を以後磨砕機と呼ぶことにする。これは、前述の理由から金属から成ることが好ましい、インレイ10を含む。インレイ10は、好ましくはプラスチックから成るシェル11によって包囲される。プラスチックシェルは、主に、振とうの際、低温を維持するための断熱材として役立つ。概して、完全に金属から成る磨砕機に比べ、重量を下げることが可能で、取り扱いを楽にするので有利である。図3に描く磨砕機の下の二重矢印は、サンプル7を圧潰するための運動の好ましい方向を示す。
【００４８】
本出願で述べたバッファーおよび試薬は、別様に言明しない限り、Qiagen GmbH社、Hilden、ドイツから購入することが可能である。
【００４９】
図4は、本発明のさらに別の改良型実施態様を切断する断面図を示す。本磨砕機は、プラスチックから成る、密封可能な、内部容器4を含む。プラスチックから成る内部容器は、好ましくは金属から成る、磨砕機の内壁にきわめて緊密に接するので、このプラスチックから成る内部容器は、磨砕中、ボール3、または類似の手段によって破砕されることはない。プラスチックから成る内部容器4は、磨砕後取り出され、今度は保存容器として使用される。この内部容器はプラスチックから成るため、きわめて安価に生産することが可能であり、したがって、1回切り使用に好適である。その場合、本発明のこの実施態様では内部容器が交換可能なので、操作が単純化される。なぜなら、この場合、磨砕機の内部の洗浄が不要であり、交差汚染が、特に高い信頼度で回避されるからである。
【００５０】
内部容器のキャップは、好ましくは積極的接続によって、容器の残余部分を密封するか、または、該キャップは、残余部分の上にねじ込んで接続することが可能である。積極的接続は、プラスチックが十分に弾性的であることが可能なので可能とされる、すなわち、キャップが、残余の容器本体に対して適切に押しつけられると、例えば、内方に突出したカラー(collar)が、残余の容器本体の環状溝の中にパチンと納まるか、または、その逆が起こることを可能とするほど十分な弾性をプラスチックは持つことが可能である。このような積極的接続は特に好まれる、なぜなら不用意なキャップの逸出が特に高信頼度で回避されるからである。さらに、ねじ込み閉鎖による密封に比べ、容器をより緊密に密封することが可能となるからである。
【００５１】
本発明の一実施態様では、一セットは、磨砕機を別として、複数の内部容器であって、例えば、別様に着色されたキャップ、または別様に浮き出し模様を施されたキャップによって、好ましくは視覚的に異なる内部容器を含む。この異なる視覚的外観は、内容物をマークするために有利に使用することが可能である。例えば、赤く着色されたキャップは、その内部に含まれる「心臓」をマークするために使用することが可能であり、例えば、緑に着色された別のキャップは、別の器官、例えば肺をマークするために使用することが可能である。その場合、磨砕サンプルを保存するために使用される内部容器は、低温のために問題を起こす可能性があるから、別々にマークする必要はない。
【００５２】
視覚的外観に関しては、容器キャップだけを別様にマークすることが、保存コストを低く抑えるために、好ましい。
【００５３】
プラスチックから成る内部容器は、PETばかりでなく、PPまたはPEから成っていてもよい。なぜなら、これらのプラスチックは、原理的に、所期の低温に耐えることが可能だからである。
【００５４】
本発明の一実施態様では、一セットは、磨砕機の外に、磨砕機または内部容器から必要量のサンプルを取り出すのをやり易く、または便利にするために、一つ以上の計量スプーンを含む。したがって、ある計量スプーンは、いくつかのサンプルに対し、それに合わせた大きさを持ち、それらに割り当てられ、そのため、該計量スプーンは、その後の処理のために適切な量の該サンプルを収容することが可能である。したがって、容器から取り出されたサンプルについて、別々の秤量を加速することが可能となり、場合によっては秤量を完全に省略することが可能となる。
【００５５】
本発明の一実施態様では、一セットは、異なるサンプルに割り当てられる、複数の、視覚的にマークされる計量スプーンを含む。赤く着色された計量スプーンは、例えば、心臓サンプルを取り出すのに備えることが可能である。特に、本発明の一実施態様では、内部容器、または内部容器の部分のマークは、計量スプーンのマークに合致する。その場合、このセットはさらに、サンプル、すなわち、例えば、器官に割り当てられる、あらかじめ指定のマークを含む。したがって、緑に着色される計量スプーンが、例えば、肺のために準備される場合、内部容器も、全体的か、または部分的に緑に着色される。この計量スプーンは、「肺」サンプルに一致する大きさ・形状を持つ。その場合、セットは、適切な割り当て案内を含む。案内は、対応する容器および／または計量スプーンの上に描かれる、肺などの対応サンプルから成っていてもよい。
【００５６】
本発明の一実施態様では、セットは、磨砕機の外に、磨砕機の中に含まれるサンプルの破砕を自動的に実行することが可能な搖動装置を含む。一つ以上の磨砕機を、該搖動装置の中に挿入するか、またはそれに対し適切に取り付けることが可能である。
【００５７】
本発明の一実施態様では、搖動装置は、磨砕機を収容するための冷却可能な収容設備を含む。特にこの実施態様では、冷却が十分な程度で為されているならば、破砕は、サンプルの挿入直後に実行する必要はない。したがって、複数のサンプルを同時に、自動的に破砕する前に、複数の磨砕機を準備し、挿入することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、処理、すなわち、例えば、サンプルから核酸またはタンパク質を単離するための処理のために植物または動物サンプルを調製するための方法、および磨砕機(pulverizer)に関する。このような調製および試験は、標準化処理指令にしたがって実験室において実験技術員によって実行される。いわゆるプロトコールは、このような処理指令の一部である。大腸菌（E.coli）からプラスミドDNAを単離するための、このようなプロトコールの例は、特許文献1から明らかである。
【背景技術】
【０００２】
所望のやり方、すなわち、例えば、核酸またはタンパク質の単離のためにサンプルを処理するには、いわゆる「キット」、例えば、Qiagen（www.Qiagen.com）による"UltraClean Tissue DNA Isolation Kit（超清浄組織DNA単離キット）"が、サンプルおよび所望の結果に応じて市場において入手が可能である。あらかじめ定められたプロトコールにしたがってこのようなキットを用いてサンプルを処理する前に、そのサンプルは、適切な方法で準備しなければならない。
【０００３】
従来技術において公知の、典型的なこのような準備を下記に記述する。
【０００４】
例えば、器官が、ラットなどの実験動物から摘出される。動物の器官の選択は、目的に依存する。
【０００５】
この動物の摘出組織は、洗浄バッファー液、例えば、PBS（リン酸バッファー生理的食塩水で下記を含む：Na2HPO4（乾燥）、NaH2PO4（乾燥）、NaCl、および蒸留水）において洗浄される。この洗浄工程によって、摘出部分の組織は、血液非含有状態で提供され、不要成分とは無縁とされる。
【０００６】
次に、この摘出組織は、特に細胞活性を停止させるために、液体窒素において冷却される。こうしないと、処理後、所望の情報が所望の品質において取得されないことがある。本工程では、体温、例えば、37℃の温度を有する組織は、通常、液体窒素の中に沈められる。気泡が発生する。気泡の形成が止んで始めて、組織は、液体窒素から取り出される。次に、組織は、例えば、ドライアイスを用いて-80℃に保存される。
【０００７】
液体窒素における冷却ステップを回避しなければならない場合、それに代わるものとして、摘出組織は、洗浄後、RNAlater(登録商標)などの安定化試薬を用いて化学的に保存される。RNAlater(登録商標)は、新鮮組織を保存するためにAmbion社（www.ambion.com）によって開発された粘ちょう液である。保存作用は、主に、水分除去によって組織中の全ての酵素が不活性化され、細胞活動が停止されることに基づく。この粘ちょう液は、組織の全ての細胞中に速やかに拡散しなければならない。したがって、組織片のサイズは、一辺の長さがせいぜい0.5センチメートルとなるまで制限されなければならない。この化学的処置後、この処置済み組織は、処理までの間保存するために、さらに-80oCに冷却される。
【０００８】
通常、所望の試験、単離などを実行可能とするためには、処理用に10から100mgの組織が必要とされる。処理の前に、ここで必要量の動物組織を、例えば、メスを用いて切り出す。
【０００９】
切り出したサンプル、すなわち、切り出した組織は、今度は、破砕される。これは、細胞壁を開放しなければならないことを意味する。これは、機械的、化学的、または酵素的に実行することが可能である。機械的破砕は、例えば、Qiagen社によって市販される"TissueRuptor"、これはQiagenによる2006年7月発行のTissueRuptor Handbookで公知である、を用いて実行される。この場合、回転ブレードが、1分当たり35,000回転で組織の細胞壁をバラバラに分解する。通則として、核酸などの内容物に対する損傷を避けるため、機械的破砕はバッファー内で行われる。
【００１０】
バッファー、すなわち、化学物質の存在下に行われる機械的破砕は、特許文献2から公知である。
【００１１】
低温ミルによるサンプルの調製も公知である（例えば、2007年3月12日更新の、http://www.laborpraxis.de/fachartikel/lp_fachartikel_nh_2384859.htmlを参照されたい）。このミルでは、サンプルは、液体窒素の温度において磨砕される。この全磨砕工程を通じて、サンプルは、強く凍結されたままで窒素に接触することはない。この技術的には極めて複雑な方法は、前述の方法では上手く行かないサンプルの場合、例えば、骨などのきわめて硬い材料、または、皮膚などのコラーゲン含有材料の場合に実行することが可能である。さらに、骨を調製しなければならない場合、それを液体窒素で満たした容器の中に入れ、金属棒を用いて潰すことも知られる。骨は、次に、粉末状として利用することが可能である。
【００１２】
顕微鏡によって組織学的検査を行わなければならない場合、サンプルは先ずパラフィンにおいてブロック状とし、次いで、ミクロトームを用いて薄層組織に切断する。
【００１３】
植物組織を処理しなければならない場合は、葉などの軟らかい材料、軟らかい豆などの場合は、メスによる裁断のみが可能である。乾燥または凍結植物サンプルの場合は、それらのサンプルを液体窒素で冷却し、液体窒素で冷却した乳鉢において乳棒を用いて磨砕する。
【００１４】
特許文献3は、分散液と共に細胞を凍結、磨砕して、細胞をバラバラに分解する方法を教示する。
【００１５】
スパイスなどの食品用の圧潰／混合デバイスが、特許文献4および5のそれぞれに開示される。このデバイスは、中にボールを納めた中空体を含み、食品は該ボールによって圧潰される。特許文献6、7、8、および9は、ボールミルおよび類似デバイスの他の例を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】DE 101 53 957 A1
【特許文献２】EP 1577011 A2
【特許文献３】ドイツ特許明細書第738 286号
【特許文献４】DE 602005001256 T2
【特許文献５】WO 2004/082837 A1
【特許文献６】US 2004/0144874 A1
【特許文献７】JP 2006051505 A
【特許文献８】JP 2002-066 366 A
【特許文献９】JP 03-186 360 A
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
前述の方法によるサンプルの調製は、処理後、できるだけ求めるものに近い結果を取得するという目標を追求する。したがって、処理後、求めるものに近い点で改善された結果の取得を可能とする、サンプル調製を実現することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本目的の一解決策は、請求項1の特徴を含む。他の解決策は、同様に方法を主題とする、独立請求項の特徴を含む。本法を実行するためのデバイスは、最終独立請求項の特徴を含む。これらの独立請求項から有利な実施態様が明白となる。
【００１９】
これらの特許請求項による教示は、植物組織でも、動物またはヒト組織でも、植物または組織の安定化サンプルおよび新鮮サンプルのいずれにおいても、有効である。
【００２０】
本目標を実現するために、一実施態様のサンプルは、先ず、前述のように洗浄され、例えば、液体窒素で処置されるか、またはRNAlaterの中に保存される。好ましくは金属から成るか、またはプラスチックから成り、金属インレイ(inlay)を備えた密封可能容器、および、該容器の内部に配される可動実体(movable doby)が、冷却、すなわち、はっきりと0oCよりも低い温度に冷却される。プラスチックから成る容器は、インレイのためのシェルとなる。インレイは、シェルとは別に製造される実体である。例えば、米国特許第6,235,501 B1号、図10から知られる、二重壁容器であって、本発明の意味におけるインレイを含まない容器とははっきりと区別されなければならない。なぜなら、この特許文書から知られる二つの壁は、互いに一体的に接続されるからである。
【００２１】
容器が冷却される温度は、少なくとも-50℃でなければならない。好ましくは、約-80℃、例えば、-70℃から-90℃の温度を選ぶべきである。なぜなら、その方が、0℃から際立って遠ざかるからである。さらに、-80℃または-70oCから-90℃は、ドライアイスを用いれば、コスト有効的なやり方で実現することが可能である。約-80℃まで下げることによって特に良好な結果を得ることが可能であることが見出された。-80℃よりも低い温度もある程度まで可能である。しかしながら、容器が過剰に冷やされることがないよう注意を払わなければならない。例えば、液体窒素の温度、すなわち、-196℃は、良好な結果を得るには低すぎることが判明している。
【００２２】
この容器の中に配される実体は、容器の揺動運動によって、その内部に配される強凍結したサンプルを圧潰する目的に役立つ。容器の内部、および該容器の内部に配される可動実体は、この目的にしたがってその大きさ・形状が決められ、設計される。中空球状末端を持つ円筒形内部は特に適切である。その場合、可動実体は、ボール、または球形末端を有するロッドである。ボールまたはボルトの直径は、可動性を確保するために内部の直径よりも小さい。この可動実体は、サンプルの圧潰(crushing)を可能とするため、硬く、好ましくは重い材料、例えば、金属から成る。
【００２３】
生物サンプル、例えば、ラットの冷却心臓は、良好な結果を得るために、好ましくは、サンプルをあらかじめバラバラに分解することなく丸ごと容器の中に入れる。特に、少なくとも-50oC冷のサンプルを容器の中に入れる。次いで、容器が、特に10から30秒、特に手動で搖動され、そのため、可動実体は、前後に揺り動かされる。次に、このようにして圧潰されたサンプルが取り出され、所望の量が、キットを用いプロトコールにしたがって処理される。サンプルおよび一つ以上の可動実体を別にして、容器の中には基本的には他の物質、特に、冷却剤、例えば、液体窒素、または、例えば、バッファー液は無い。仮にそれらがあるとすると、それは所望の結果を劣化させるだけであろうと考えられる。
【００２４】
驚くべきことに、大した技術的努力もせず、手技は単純であるにも拘わらず、従来技術で公知のサンプル調製に比べ、この形式のサンプル調製の方がより優れた結果が得られることが見出された。中に可動実体を配した容器は、ドライアイスで、例えば、-80℃に冷却するだけなので、技術的努力は大したものではない。次に、この冷却容器は、手で、取り出すことが可能であり−手は、簡単に、手袋によって低温から十分に保護することが可能である−手で、サンプルは導入することが可能であり、容器は密封することが可能である。次に、容器は、1分にも満たない時間搖動され、サンプルを取り出し、別の容器に当座の間冷却状態で保存することが可能である。それとは別に、サンプルは、取り出して別の容器に保存することをせず、直接、可動実体を含む容器の中に置かれる。その場合、容器は、破砕容器としても保存容器としても役立つ。処理のための所望のサンプル量は、正確に、簡単に入手することが可能である。さらに、均一な組織分布がこの工程において実現される。安定化組織、植物の葉および種子でも、このようにしてその後の処理のために調製することが可能である。しかしながら、この方法は、皮膚および骨、および比較的硬いか、または粘っこいサンプルに対しては適切ではない。
【００２５】
冷却、密封容器における処理は長時間を要しないから、搖動工程を中断し、その間に容器を再び適切な低温に冷却する必要はない。このことは、特に、容器が金属から成り十分な厚みの壁を持つ場合には当てはまる。数ミリメートル厚の壁でも十分である。さらに、驚くべきことに、例えば、TissueRupterにおける破砕は省略可能であることが見出された。したがって、このようにして調製されたサンプルは直ちに処理することが可能であり、特に優れた最終結果をもたらす。
【００２６】
サンプルは粉末状で存在するので、それは、その後に使用される薬剤の作用可能部位が、特に大きな表面積を有するという点で有利である。その後のステップのために、所望量の粉末は、例えば、秤量によるか、または、場合によっては、特に簡単に、相当する大きさの測定容器、例えば、計量スプーンによって供給される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】キャップをねじ込んで登載することが可能な容器の断面図を示す。
【図２】比較例と比較した場合の、本法によって調製されたサンプルのDNA分析結果。
【図３】サンプルを磨砕する、密封可能容器の、特に好ましい実施態様を示す。
【図４】本発明のさらに別の改良型実施態様の断面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、例示の実施態様を参照しながら下記にさらに詳細に説明される。
図1は、キャップ2をねじ込んで登載することが可能な容器1の断面図を示す。容器1の直径に比べてより小さい直径を有するボール3が、容器1の中に配される。容器の直径は、数センチメートルの範囲内にある。容器1の内部は円筒形である。密封状態では、容器の末端5および6は半球形状をしている。容器1が適度に搖動されると、内側のボール3は前後に動かされ、末端5および6に衝突する。容器1、キャップ2、およびボール3は、金属、すなわち、ステンレススチールから成る。
【００２９】
容器は先ず、ドライアイス中で-80℃に冷却される。
【００３０】
サンプル7が動物から取り出される。このサンプルは洗浄され、これ以上気泡の形成が無くなるまで窒素の中に沈められるか、または、例えば、RNAlaterの中に24時間保存される。次に、サンプルは、最初に、ドライアイス中でマイナス80℃で保存することが可能である。植物の場合、種子などの乾燥植物組織は、容器1においてドライアイス上で冷却される。葉などの新鮮植物材料は、先ず、-80℃に冷却される。
【００３１】
容器1が所望の温度に冷却されたならば、それは手で取り出すことが可能である。手は、木綿の手袋およびラテックス製グローブによって寒さから保護すると好都合である。サンプル7は、ピンセットによって容器1の中に導入されるが、そこにはボール3も配置されている。次いで、キャップ2が、容器1の上にねじ込まれ、このようにして容器1はしっかりと密封される。ここで、容器1は、手によって前後に揺すられ、そのために、ボール3は、二つの末端5および6に交互に衝突する。したがってサンプル7はバラバラに分解される。この工程は、20から30秒後に終了する。このようにして流動性粉末が生産されるが、これは、先ず容器1に続けて保存することが可能である。直後か、または保存後、キャップ2は、ねじの逆回転によって外され、圧潰サンプルが取り出される。ここで所望量が、例えば、秤量によって採取され、利用可能とされる。
【００３２】
ラットの肝臓が取り出され、PBSにおいて洗浄された。次に、この肝臓は、RNAlater(登録商標)において24時間保存された。次に、このラットの肝臓は、その後に使用されるまで-80℃に保存された。
【００３３】
肝臓は、冷却した密封容器において前述のように20秒間圧潰された。漏斗を用いて、この圧潰サンプルをFalconチューブに充填し、先ず、ドライアイスにおいて-80℃でさらに保存した。
【００３４】
最終的に、Falconチューブ内のサンプル10mgを重量計によって秤量採取した。この工程では、サンプルが解凍することがないよう注意した。
【００３５】
100mM SDS; 100mM EDTA; 50mM Tris; 100mM NaClを含む水溶液（バッファー１）180μlおよびProtK 20μlを、2mlの反応容器に充填し、前述の、秤量サンプル10mgを、渦巻き攪拌下に加えた。これによって、サンプルの塊形成が阻止され、対応するプロトコールまたはキットと連結して使用されるDNeasyまたはRNeasyカラムの凝集が阻止される。
【００３６】
使用したQiagenによるDNeasyプロトコールは、下記のステップを含む。10mgの組織を、180μlのバッファー1 + 20μlのプロテイナーゼKと、搖動(rocking)プラットフォームにおいて56℃で1時間インキュベートする。次に、ピペットにて4μlのRNアーゼAを加え、室温で2分インキュベートする。次に、ピペットにて200μlのAL（分解バッファー）を加え、搖動プラットフォームにおいて70℃で10分インキュベートする。後続工程において、ピペットにて200μlのエタノール(100%)を加え、僅かに反転させて混ぜ合わせる。この瞬間、DNAを「白濁」として認めることが可能である。これは、本法の感度を示す兆候である。なぜなら、これは、分子がほとんど損傷されず、高度の分子形として存在することを示しているからである。カラム効率を上げるため、得られた溶液は、ピペットで吸い上げることによって3度混ぜ合わせる。次に、溶液全体をピペットでDNeasyカラムに移し、8,000rpmにて1分間遠心する。ここで、対応核酸はカラム材料に結合する。上清を廃棄し、ここで、カラムを、500μlの洗浄バッファーAW 1によって、1分当たり8,000回転で1分間洗浄する。プロトコールでは推奨されていないけれども、このステップをさらにもう一度行う。次に、カラムを、プロトコールの記載にしたがって、500μlのバッファーAW 2によって1分当たり14,000回転で3分間洗浄する。再び上清を廃棄する。さらに、プロトコールに記載される、必要ならば選択してもよい、1分当たり14,000回転で1分間の乾燥ステップが実行される。最後に、200μlのRNアーゼ無添加水を、カラム中央にピペットで導入し、室温で1分間インキュベートし、次いで、1分当たり8,000回転（rpm）で1分間遠心する。この溶出液を、分光光度計によって分析する。これは、濃度および純度の定量に役立つ。最後に、DNAの定性および定量分析のために、アガロースゲルを調製する。このアガロースゲルにおいて、そのDNAの品質、変性の程度、分子のサイズ、および、その量を決めることが可能である。
【００３７】
このようにして得られた結果が図2に示され、比較例と比較される。先ず、ラットの肝臓が、背景技術で前述したやり方で従来法にしたがって前処理された場合、すなわち、最初にRNAlaterにおいて洗浄、保存された場合の結果を、"TR"の上に示す。次に、10mgの、所望サンプル量を分離し、TissueRuptor(登録商標)において破砕した。
【００３８】
上記の右隣に、本発明の方法にしたがって得られた結果が"TD+"の上に示される。処理の観点からDNeasyカラムのカラム効率をより良く利用可能とするために、200μlのエタノール(100%)を加えた後、DNeasyプロトコールにしたがって処理された溶液を、3回ピペットで吸い上げ次に吐き出すことによって、混ぜ合わせた。このようにして、DNeasyカラムに結合可能となるように、高分子DNAが調製される。
【００３９】
上記の右隣に、本発明の方法によって得られた結果が、ただしカラム効率を上げるためのピペットによる混合は実行しなかった、"TD-"の上に示される。
【００４０】
上記の右隣に、サンプルが先ず本発明にしたがって調製された場合の結果が、"TD/TR"の上に示される。しかしながら、この圧潰サンプルは最終的にTissueRuptor(登録商標)においてさらに3秒間破砕された。3秒後に既に変性の増大が生じていることが、辺縁のぼやけから明らかに見て取ることができる。
【００４１】
図2における上方の明白区域は、ゲノムDNAを特徴づける。TR上の明白区域は、TD+、TD-、またはTD/TR上のものほど高く延びていない。明白区域が高く延びれば延びるほど、得られるDNAはより高分子であり、したがって、得られる結果はより優れる。従来技術にしたがって得られるTR上の明白区域は、ぼやけており、灰白色区域への移行部となる。これは、DNAが変性している、すなわち、損傷していることの兆候である。このような損傷は、TD+およびTD-にあるように、本発明の方法によって回避することが可能である。
【００４２】
図2は、DNAの量および質を決めるために前述のように使用した、DNAアガロースゲルの写真を示す。この目的のために1%ゲルを注入する。このため、1gのアガロース粉末（重合可能な長鎖炭水化物分子）を秤量採取し、100ml (1x) TEAバッファーに溶解し、マイクロウェーブで加熱する。得られた溶液に5μlの臭化エチジウムを加え、それをフラスコを振とうすることによって混ぜ合わせ、金型の中に注ぐ。ここでコーム(comb)を、この熱い溶液中に固定する。これによって、溶液が冷却し重合すると、ゲルの中に印象が残され、これは後に、5μlの負荷染色液と混ぜ合わされたサンプルがピペット注入されるスロットを形成する。後に紫外光の下に結果を実現することが可能となるように、その後の量的比較のためにゲルに対しさらにマーカーを加える。電圧が印加されると、DNAは、その異なる重量および電荷に基づいて拡散する、すなわち、小型の、変性断片は、高分子DNAよりもゲルの中をより速やかに移動する。
【００４３】
本発明による方法にしたがって得られたDNAは、肉眼でも雲状として見て取ることが可能である。
【００４４】
25mgの「新鮮な」ラット心臓を、別実験の観点に基づいて試験した。「新鮮な」とは、安定化試薬で処置されてはいないが、最初に液体窒素において強凍結されることを意味する。背景技術で前述した従来技術で公知の方法と比較した場合、本発明の方法を用いると二倍のRNA濃度が得られた。
【００４５】
この実験では、前述の実験と同じ磨砕法を用いた。ラットの心臓を取り出し、液体窒素を用いて気泡の形成が止むまで冷却した。次に、心臓をドライアイス（-80℃）上に保存した。処理の直前まで、容器1はドライアイスにて冷却し、そこに凍結した心臓を丸ごと充填し、手で20秒間振とうした。次に、粉末を同じ容器の中に保存した。これは、RNeasy Fibrous Tissue Mini（RNeasy線維性組織ミニ）プロトコール用の試料を得るための時間をかけるためである。これが問題を起こすことはない。なぜなら、該容器は、破砕容器であると同時に、保存容器でもあるからである。前述のプロトコールによる後続処理のために、3.5M GTC; 28mM Na3-クエン酸塩 ｘ 2 H2Oを含む水溶液300μl（RLTバッファー、分解バッファー）を、排気フード下2mlの反応容器において3μlのβ-メルカプトエタノールと混合し、保存心臓組織粉末25 mgを秤量して、該反応容器に入れ、次いで渦巻き攪拌した。590μlのRNアーゼ無添加水および10μlのProtK（酵素）を加え、これらをピペットによって混ぜ合わせ、次いで、搖動プラットフォームにおいて55℃で10分インキュベートし、次に、室温で10,000xgにおいて3分間遠心した。次に、上清をピペットで新規2ml反応容器に移し、0.5倍容量の96%-100%エタノールをピペットで加え、ピペットを用いて混ぜ合わせた。次に、最初、700μlの溶液をピペットでRNeasyカラムに導入し、1分当たり10,000回転で15秒間遠心した。カラムは700μlの容量しか持たないので、全サンプルがカラムの上に注がれるようにするため、このステップを残りの液についても繰り返した。遠心後上清は廃棄した。次にカラムを、1分当たり8,000回転において350μlのバッファーRW1で15秒洗浄し、上清を廃棄した。ここで、各サンプルについて、10μlのDNアーゼ1保存液を70μlのRDDバッファーと混合し、かつ、倒置によって混ぜ合わせた。次に、この溶液80μlを正確にカラムの中央に注ぎ、室温で15分インキュベートした。次に、350μlのバッファーRW1をカラムに注ぎ、8,000gにおいて15秒洗浄した。次に、このRNeasyカラムを、新規2ml収集管に移し、500 μlのRPEを充填し、再び、8,000gにおいて15秒洗浄した。再び上清を廃棄した。最終ステップを繰り返した。ただし、遠心は、今度は、8,000g、2分で行った。ここで、カラムを再び新規2ml反応容器に移し、そこで1分間最大スピードで乾燥させた。最終ステップにおいて、カラムは、新規2 mlの反応容器に移し、30μlのRNアーゼ無添加水を充填し、1分当たり10,000回転で1分遠心して溶出した。次に、この溶出液もまた分光光度計によって分析し、RNAアガロースゲルによって評価した。
【００４６】
さらに、種々の圧潰実験を、特に、乳鉢において-196℃で行った。最終的に、これらの試験は、-196℃の冷却も、乳鉢の使用も、所望の結果の実現には適切ではないことを示した。
【００４７】
図3は、サンプルを磨砕する、密封可能容器の、特に好ましい実施態様を示す。この容器を以後磨砕機と呼ぶことにする。これは、前述の理由から金属から成ることが好ましい、インレイ10を含む。インレイ10は、好ましくはプラスチックから成るシェル11によって包囲される。プラスチックシェルは、主に、振とうの際、低温を維持するための断熱材として役立つ。概して、完全に金属から成る磨砕機に比べ、重量を下げることが可能で、取り扱いを楽にするので有利である。図3に描く磨砕機の下の二重矢印は、サンプル7を圧潰するための運動の好ましい方向を示す。
【００４８】
本出願で述べたバッファーおよび試薬は、別様に言明しない限り、Qiagen GmbH社、Hilden、ドイツから購入することが可能である。
【００４９】
図4は、本発明のさらに別の改良型実施態様を切断する断面図を示す。本磨砕機は、プラスチックから成る、密封可能な、内部容器4を含む。プラスチックから成る内部容器は、好ましくは金属から成る、磨砕機の内壁にきわめて緊密に接するので、このプラスチックから成る内部容器は、磨砕中、ボール3、または類似の手段によって破砕されることはない。プラスチックから成る内部容器4は、磨砕後取り出され、今度は保存容器として使用される。この内部容器はプラスチックから成るため、きわめて安価に生産することが可能であり、したがって、1回切り使用に好適である。その場合、本発明のこの実施態様では内部容器が交換可能なので、操作が単純化される。なぜなら、この場合、磨砕機の内部の洗浄が不要であり、交差汚染が、特に高い信頼度で回避されるからである。
【００５０】
内部容器のキャップは、好ましくは積極的接続によって、容器の残余部分を密封するか、または、該キャップは、残余部分の上にねじ込んで接続することが可能である。積極的接続は、プラスチックが十分に弾性的であることが可能なので可能とされる、すなわち、キャップが、残余の容器本体に対して適切に押しつけられると、例えば、内方に突出したカラー(collar)が、残余の容器本体の環状溝の中にパチンと納まるか、または、その逆が起こることを可能とするほど十分な弾性をプラスチックは持つことが可能である。このような積極的接続は特に好まれる、なぜなら不用意なキャップの逸出が特に高信頼度で回避されるからである。さらに、ねじ込み閉鎖による密封に比べ、容器をより緊密に密封することが可能となるからである。
【００５１】
本発明の一実施態様では、一セットは、磨砕機を別として、複数の内部容器であって、例えば、別様に着色されたキャップ、または別様に浮き出し模様を施されたキャップによって、好ましくは視覚的に異なる内部容器を含む。この異なる視覚的外観は、内容物をマークするために有利に使用することが可能である。例えば、赤く着色されたキャップは、その内部に含まれる「心臓」をマークするために使用することが可能であり、例えば、緑に着色された別のキャップは、別の器官、例えば肺をマークするために使用することが可能である。その場合、磨砕サンプルを保存するために使用される内部容器は、低温のために問題を起こす可能性があるから、別々にマークする必要はない。
【００５２】
視覚的外観に関しては、容器キャップだけを別様にマークすることが、保存コストを低く抑えるために、好ましい。
【００５３】
プラスチックから成る内部容器は、PETばかりでなく、PPまたはPEから成っていてもよい。なぜなら、これらのプラスチックは、原理的に、所期の低温に耐えることが可能だからである。
【００５４】
本発明の一実施態様では、一セットは、磨砕機の外に、磨砕機または内部容器から必要量のサンプルを取り出すのをやり易く、または便利にするために、一つ以上の計量スプーンを含む。したがって、ある計量スプーンは、いくつかのサンプルに対し、それに合わせた大きさを持ち、それらに割り当てられ、そのため、該計量スプーンは、その後の処理のために適切な量の該サンプルを収容することが可能である。したがって、容器から取り出されたサンプルについて、別々の秤量を加速することが可能となり、場合によっては秤量を完全に省略することが可能となる。
【００５５】
本発明の一実施態様では、一セットは、異なるサンプルに割り当てられる、複数の、視覚的にマークされる計量スプーンを含む。赤く着色された計量スプーンは、例えば、心臓サンプルを取り出すのに備えることが可能である。特に、本発明の一実施態様では、内部容器、または内部容器の部分のマークは、計量スプーンのマークに合致する。その場合、このセットはさらに、サンプル、すなわち、例えば、器官に割り当てられる、あらかじめ指定のマークを含む。したがって、緑に着色される計量スプーンが、例えば、肺のために準備される場合、内部容器も、全体的か、または部分的に緑に着色される。この計量スプーンは、「肺」サンプルに一致する大きさ・形状を持つ。その場合、セットは、適切な割り当て案内を含む。案内は、対応する容器および／または計量スプーンの上に描かれる、肺などの対応サンプルから成っていてもよい。
【００５６】
本発明の一実施態様では、セットは、磨砕機の外に、磨砕機の中に含まれるサンプルの破砕を自動的に実行することが可能な搖動装置を含む。一つ以上の磨砕機を、該搖動装置の中に挿入するか、またはそれに対し適切に取り付けることが可能である。
【００５７】
本発明の一実施態様では、搖動装置は、磨砕機を収容するための冷却可能な収容設備を含む。特にこの実施態様では、冷却が十分な程度で為されているならば、破砕は、サンプルの挿入直後に実行する必要はない。したがって、複数のサンプルを同時に、自動的に破砕する前に、複数の磨砕機を準備し、挿入することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物サンプルを破砕するための方法であって、-50℃よりも低い温度を持つ、固体生物サンプルが、-50℃よりも低く冷却され、開放・密閉が可能なシェル、インレイ、および可動実体(3)を含む磨砕機中に導入され、-50℃よりも低く冷却される可動実体は、該容器が密封された後、動かされて該生物サンプルを圧潰するように配置される方法において、該容器は、圧潰中冷却されることがなく、破砕時該容器中に依然として存在する冷却媒体または化学物質は、破砕中または破砕前に該容器中に導入されることがないことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
生物サンプルを破砕するための方法であって、-50℃よりも低い温度を持つ、固体生物サンプルが、-50℃よりも低く冷却される密封可能容器に導入され、該容器において、-50℃よりも低く冷却される可動実体が、該容器が密封された後、動かされて該生物サンプルを圧潰するように配置される方法において、該容器は、圧潰中冷却されることがなく、破砕時該容器中に依然として存在する冷却媒体または化学物質は、破砕中または破砕前に該容器中に導入されることがないことを特徴とする、前記方法。
【請求項３】
-70℃から-90℃の範囲の温度を持つ前記生物サンプルが、-70℃から-90℃の範囲の温度に冷却される、密封可能な容器の中に導入されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記生物サンプルが植物サンプルであることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記生物サンプルが、動物またはヒトの組織であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記可動実体が、手動の振とうによって動かされることを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
生物サンプルの分析法であって、請求項1から6のいずれか1項に記載のサンプルを破砕すること、該破砕サンプルを部分的または完全に取り出すこと、および、該破砕サンプルから核酸および／またはタンパク質を単離すること、を含む方法。
【請求項８】
植物または動物サンプルの処理用に調製する方法であって、該サンプルは先ず洗浄され、次に安定化され、安定化に次いで、該サンプルは、強く、好ましくは-50から-110℃に凍結され、その中に可動実体(3)を配置させた密封可能容器(1,2)は、強く、好ましくは-50から-110℃に凍結され、該強凍結サンプルは、その中に可動実体を配置させた該強凍結容器中に導入され、次いで、該強凍結容器は密封され、該強凍結容器は前後に搖動され、それによって圧潰されるサンプルは、その後に取り出されることを特徴とする、方法。
【請求項９】
安定化後の前記サンプル、および／または、その中に可動実体(3)を配置させる密封可能容器(1,2)が、ドライアイスにおいて、強く、好ましくは-80℃に凍結されることを特徴とする、前段請求項に記載の方法。
【請求項１０】
前記密封、強凍結容器が、その中にサンプル(7)を配置させ、かつ、その中に可動実体を配置させたまま、10から40秒間、前後に搖動されることを特徴とする、二つの前段請求項の内のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記容器が、液体窒素またはバッファー液などの液体成分を含まず、特に、前記サンプル(7)が容器(1,2)に配置される間は含まず、および／または、該サンプルが骨でもなく皮膚でもないことを特徴とする、3つの先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
肝臓、心臓、葉、または植物種子がサンプルとして使用されることを特徴とする、4つの先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記可動実体(3)がボールであり、前記密封可能容器の内部が、中空の半球状末端(5,6)を有する円筒形であることを特徴とする、5つの先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記圧潰サンプル(7)は、強凍結された圧潰サンプル(7)が、前記密封可能容器から取り出された後に処理されることを特徴とする、6つの先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが、可動実体(3)と共に、プラスチックから成る内部容器中に導入され、該内部容器(4)は、密封可能容器中に挿入されることを特徴とする、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
先行請求項のいずれか1項に記載の方法を実行するための、生物サンプル用磨砕機であって、開放および密封が可能なシェル(11)、およびインレイ(10)、および可動実体(3)を含む磨砕機。
【請求項１７】
前記シェル(11)が、プラスチックから製造されることを特徴とする、請求項16に記載の磨砕機。
【請求項１８】
前記インレイ(10)が、金属から製造されることを特徴とする、請求項16または17に記載の磨砕機。
【請求項１９】
前記可動実体(3)が、金属または無機物から製造されることを特徴とする、請求項16から18のいずれか1項に記載の磨砕機。
【請求項２０】
前記可動実体(3)が球形であり、前記磨砕機が長円形状内部を有することを特徴とする、請求項16から19のいずれか1項に記載の磨砕機。
【請求項２１】
プラスチックから成る内部容器(4)を含むもので、特に、先行請求項16から20のいずれか1項に記載の磨砕機。
【請求項２２】
開放、密封することが可能な容器、およびその中に可動な実体(3)を有する磨砕機であって、特に、先行請求項16から21のいずれか1項に記載のもので、プラスチックから成る複数の内部容器(4)、および／または複数の計量スプーンを有する磨砕機を含むセット。
【請求項２３】
前記内部容器(4)および／または計量スプーンが、その視覚的外観に関して示差的にマークされることを特徴とする、前段請求項に記載のセット。
【請求項２４】
内部容器および／または計量スプーンの視覚マーキングが、サンプルに対し、あらかじめ設けた指定にしたがって割り当てられることを特徴とする、2つの先行請求項のいずれか1項に記載のセット。
【請求項２５】
磨砕機、および該磨砕機中に配されるサンプルを粉砕するための振動装置を含むもので、特に、先行請求項20から23のいずれか1項に記載のセット。
【請求項１】
生物サンプルを破砕するための方法であって、-50℃よりも低い温度を持つ、固体生物サンプルが、-50℃よりも低く冷却され、開放・密閉が可能なシェル、インレイ、および可動実体(3)を含む磨砕機中に導入され、-50℃よりも低く冷却される可動実体は、該容器が密封された後、動かされて該生物サンプルを圧潰するように配置される方法において、該容器は、圧潰中冷却されることがなく、破砕時該容器中に依然として存在する冷却媒体または化学物質は、破砕中または破砕前に該容器中に導入されることがないことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
生物サンプルを破砕するための方法であって、-50℃よりも低い温度を持つ、固体生物サンプルが、-50℃よりも低く冷却される密封可能容器に導入され、該容器において、-50℃よりも低く冷却される可動実体が、該容器が密封された後、動かされて該生物サンプルを圧潰するように配置される方法において、該容器は、圧潰中冷却されることがなく、破砕時該容器中に依然として存在する冷却媒体または化学物質は、破砕中または破砕前に該容器中に導入されることがないことを特徴とする、前記方法。
【請求項３】
-70℃から-90℃の範囲の温度を持つ前記生物サンプルが、-70℃から-90℃の範囲の温度に冷却される、密封可能な容器の中に導入されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記生物サンプルが植物サンプルであることを特徴とする、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記生物サンプルが、動物またはヒトの組織であることを特徴とする、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記可動実体が、手動の振とうによって動かされることを特徴とする、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
生物サンプルの分析法であって、請求項1から6のいずれか1項に記載のサンプルを破砕すること、該破砕サンプルを部分的または完全に取り出すこと、および、該破砕サンプルから核酸および／またはタンパク質を単離すること、を含む方法。
【請求項８】
植物または動物サンプルの処理用に調製する方法であって、該サンプルは先ず洗浄され、次に安定化され、安定化に次いで、該サンプルは、強く、好ましくは-50から-110℃に凍結され、その中に可動実体(3)を配置させた密封可能容器(1,2)は、強く、好ましくは-50から-110℃に凍結され、該強凍結サンプルは、その中に可動実体を配置させた該強凍結容器中に導入され、次いで、該強凍結容器は密封され、該強凍結容器は前後に搖動され、それによって圧潰されるサンプルは、その後に取り出されることを特徴とする、方法。
【請求項９】
安定化後の前記サンプル、および／または、その中に可動実体(3)を配置させる密封可能容器(1,2)が、ドライアイスにおいて、強く、好ましくは-80℃に凍結されることを特徴とする、前段請求項に記載の方法。
【請求項１０】
前記密封、強凍結容器が、その中にサンプル(7)を配置させ、かつ、その中に可動実体を配置させたまま、10から40秒間、前後に搖動されることを特徴とする、二つの前段請求項の内のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記容器が、液体窒素またはバッファー液などの液体成分を含まず、特に、前記サンプル(7)が容器(1,2)に配置される間は含まず、および／または、該サンプルが骨でもなく皮膚でもないことを特徴とする、3つの先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
肝臓、心臓、葉、または植物種子がサンプルとして使用されることを特徴とする、4つの先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記可動実体(3)がボールであり、前記密封可能容器の内部が、中空の半球状末端(5,6)を有する円筒形であることを特徴とする、5つの先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記圧潰サンプル(7)は、強凍結された圧潰サンプル(7)が、前記密封可能容器から取り出された後に処理されることを特徴とする、6つの先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが、可動実体(3)と共に、プラスチックから成る内部容器中に導入され、該内部容器(4)は、密封可能容器中に挿入されることを特徴とする、先行請求項のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
先行請求項のいずれか1項に記載の方法を実行するための、生物サンプル用磨砕機であって、開放および密封が可能なシェル(11)、およびインレイ(10)、および可動実体(3)を含む磨砕機。
【請求項１７】
前記シェル(11)が、プラスチックから製造されることを特徴とする、請求項16に記載の磨砕機。
【請求項１８】
前記インレイ(10)が、金属から製造されることを特徴とする、請求項16または17に記載の磨砕機。
【請求項１９】
前記可動実体(3)が、金属または無機物から製造されることを特徴とする、請求項16から18のいずれか1項に記載の磨砕機。
【請求項２０】
前記可動実体(3)が球形であり、前記磨砕機が長円形状内部を有することを特徴とする、請求項16から19のいずれか1項に記載の磨砕機。
【請求項２１】
プラスチックから成る内部容器(4)を含むもので、特に、先行請求項16から20のいずれか1項に記載の磨砕機。
【請求項２２】
開放、密封することが可能な容器、およびその中に可動な実体(3)を有する磨砕機であって、特に、先行請求項16から21のいずれか1項に記載のもので、プラスチックから成る複数の内部容器(4)、および／または複数の計量スプーンを有する磨砕機を含むセット。
【請求項２３】
前記内部容器(4)および／または計量スプーンが、その視覚的外観に関して示差的にマークされることを特徴とする、前段請求項に記載のセット。
【請求項２４】
内部容器および／または計量スプーンの視覚マーキングが、サンプルに対し、あらかじめ設けた指定にしたがって割り当てられることを特徴とする、2つの先行請求項のいずれか1項に記載のセット。
【請求項２５】
磨砕機、および該磨砕機中に配されるサンプルを粉砕するための振動装置を含むもので、特に、先行請求項20から23のいずれか1項に記載のセット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５２３９５６（Ｐ２０１０−５２３９５６Ａ）
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０１５０２（Ｐ２０１０−５０１５０２）
【出願日】平成２０年４月２日（２００８．４．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５３８９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２２５５０
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月２日（２００８．４．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５３８９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２２５５０
【国際公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（５９９０７２６１１）キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (83)
【Ｆターム（参考）】
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