分子間相互作用計測装置及び方法
【課題】 リアルタイムで測定を行うことができ、多数の被検溶液をハイスループットで測定することができる分子間相互作用計測装置及び方法を提供する。
【解決手段】 容器に収容された試料から発せられる光を測定し、試料の物理的、あるいは化学的な性質を測定する測定装置において、試験サンプル、試薬、洗浄液の少なくとも１つの溶液をそれぞれ供給する溶液供給手段を有する分子間相互作用計測装置である。
【解決手段】 容器に収容された試料から発せられる光を測定し、試料の物理的、あるいは化学的な性質を測定する測定装置において、試験サンプル、試薬、洗浄液の少なくとも１つの溶液をそれぞれ供給する溶液供給手段を有する分子間相互作用計測装置である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の結合、分解および解離反応の過程をリアルタイム、または、ハイスループットで測定することが可能な分子間相互作用を計測するための装置および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、分子間相互作用を解析する手法として、ＦＣＳ（蛍光相関分光法）やＦＩＤＡ（蛍光強度分布解析法）等が知られている（例えば、非特許文献１参照）。これらの解析手法では、ともに、サンプルを複数の溶液に混合した後、９６あるいは３８４等のマルチウエルのタイタープレートにサンプルを分注し測定する。そして、この測定では、溶液を分注したウエルを所定の測定部に載置して、微小な位置合わせ、サンプルへの焦点合わせが必要である。
【非特許文献１】Biophysical Journal Vol. 79 Dec.2000 2858-2866
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述のように、従来のＦＣＳ、ＦＩＤＡ測定装置では、測定用の容器に溶液を添加して調整した後に、その容器を測定部に載置して、測定しようとするウエルが所定の位置になるように精度良く調整し、更に、フォーカッシングを行う必要がある。しかしながら、これらの調整には時間を要するため、溶液調整後直ちにリアルタイムで測定を行うことは困難であった。従って、急激に起こる反応系に対処することはできず、また、一連の反応を順次展開していく実験、あるいは途中で反応を止めるような実験を行うことができなかった。
【０００４】
さらに、事前準備として上述のように種々の工程（ウエルへの位置合わせ、フォーカッシングなど）が必要であったため、多数の被検溶液をハイスループットで測定することも困難であった。
【０００５】
本発明は係る事情に鑑みてなされたものであって、リアルタイムで測定を行うことができ、多数の被検溶液をハイスループットで測定することができる分子間相互作用計測装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための、本発明に係る請求項１に記載の分子間相互作用計測装置は、容器に収容された試料から発せられる光を測定し、試料の物理的、あるいは化学的な性質を測定する測定装置において、試験サンプル、試薬、洗浄液の少なくとも１つの溶液をそれぞれ供給する溶液供給手段を有する。
【０００７】
また、本発明に係る請求項２に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、供給した少なくとも１つの溶液を攪拌する攪拌手段をさらに有する。
【０００８】
また、本発明に係る請求項３に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、供給された溶液の温度を制御する温度制御手段を更に有する。
【０００９】
また、本発明に係る請求項４に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、供給された溶液を排出する溶液排出手段をさらに具備している。
【００１０】
また、本発明に係る請求項５に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、供給された溶液を保持する保持手段と、前記保持手段を洗浄する洗浄手段と、前記溶液に光を集光する集光手段とを更に有し、前記保持手段に前記集光手段が接続されている。
【００１１】
また、本発明に係る請求項６に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、前記溶液排出手段の排出動作は、コンピュータによって制御される。
【００１２】
また、本発明に係る請求項７に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、前記コンピュータは、入力された一連の測定条件に基づいて、分子間相互作用計測装置の動作を制御する。
【００１３】
また、本発明に係る請求項８に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、手動で前記溶液を注入できる手動注入手段を具備する。
【００１４】
また、本発明に係る請求項９に記載の分子間相互作用計測方法は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置を用いて分子間における相互作用を計測する方法において、 複数の試料と、当該複数の試料の各々の分子と結合または前記分子を分解することができる少なくとも１つの物質とを順次混合して、複数の試験混合物を作成する工程と、前記少なくとも１つの物質と前記分子との結合及び分解状態を測定する工程とを備えた。
【００１５】
また、本発明に係る請求項１０に記載の分子間相互作用計測方法は、上記記載の発明である分子間相互作用計測方法において、前記試料は、核酸、ペプチド、酵素基質からなる群から選ばれた少なくとも１つの物質を蛍光標識したものであり、前記物質は、タンパク質、抗体、ペプチド、核酸からなる群から選ばれる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、リアルタイムで測定を行うことができ、多数の被検溶液をハイスループットで測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［第１の実施の形態］
図１は、第１の実施の形態に係る分子間相互作用計測装置１の構成を示す図である。分子間相互作用計測装置１は、１分子蛍光分析装置２、インジェクション装置３及び制御装置４を備えている。そして、１分子蛍光分析装置２には測定部５が設けられ、インジェクション装置３には複数の溶液容器６と排出容器７が備えられている。
【００１８】
１分子蛍光分析装置２は、ＦＣＳあるいはＦＩＤＡを用いて分子間の相互作用を計測する。インジェクション装置３は、１分子蛍光分析装置２に溶液を供給するとともに、測定に使用した溶液を排液として回収する。制御装置４は、分子間相互作用計測装置１の動作を統括して制御する。この制御装置４により、分子間相互作用計測装置１は自動で動作する。
【００１９】
そして、測定部５は、試料溶液を受け入れて、位置調整を行い、排液を排出などする機構を備えている。溶液容器６は、試料溶液を貯蔵する。排出容器７は、排液を貯蔵する。
【００２０】
図２は、測定部５の構成を示す斜視図である。測定チャンバ１０は、試料溶液を受け入れて保持し、排液を排出する。そして、測定チャンバ１０には、インジェクション装置３から供給される溶液を受け入れるための溶液受入部１１と測定後の溶液をインジェクション装置３に排出するための溶液排出部１２が設けられている。また、この測定チャンバ１０には、試料に対して励起光を収束させ、試料から発せられた蛍光を解析装置に導くための対物レンズ１３が接続されている。
【００２１】
図２に示すように、溶液受入部１１は複数設けられており、複数の溶液を供給することができる。複数の溶液として、サンプル、バッファー、洗浄液等を供給することが可能である。対物レンズ１３は液浸対物レンズを用いることが好ましく、対物レンズ１３と測定チャンバ１０の間に、媒質として、水やオイルを用いることができる。
【００２２】
測定溶液を保持する手段である測定チャンバ１０と測定溶液からの信号を取得する手段である対物レンズ１３とは、対物レンズ１３と測定チャンバ１０との相対的な位置が変わらないように固定されている。ただし、固定されていても装置のセットアップのためのわずかな移動は可能な状態であってもよい。したがって、対物レンズ１３と測定チャンバ１０が一体に構成されていても良く、別体で固定されていても良い。対物レンズと測定チャンバ１０が一体に構成されている場合に、好ましい液浸媒質であるオイルを、両者の間に封入しておくことができる。
【００２３】
図３は、分子間相互作用計測装置１における、溶液の供給、排出、洗浄及び混合機能を説明するためのブロック図である。図３を参照しつつ、構成と動作について説明する。
【００２４】
溶液を受け入れるための測定容器１４は、積載部１５上に載置されている。そして、測定容器１４には、超音波振動子１６が設けられ、測定容器内の溶液、洗浄液を攪拌する。この積載部１５には、流水通路１７が接続され、温度調節機構１８を介して所定温度に制御された温水がポンプ１９により循環され、溶液の温度を制御する。
【００２５】
溶液は、インジェクション装置３の溶液容器６からポンプ２０によって、測定容器１４に供給される。なお、溶液の供給経路には、３方弁２１が設けられている。そこで、この３方弁２１を切り替えることによって、ユーザは、手動で溶液を測定容器１４に供給することもできる。また、積載部１５には対物レンズ１３が固定手段２２を介して接続されている。
【００２６】
なお、この図３に示す各機構は、制御装置４からの制御信号（不図示）によって制御され自動で溶液の供給、排出、洗浄及び混合を行う。本装置を用いた後述する実施例では、制御装置４に一連の測定条件を入力する。この入力データには、例えば、励起波長、測定波長、励起光のパワー、測定間隔、測定回数、測定時間、溶液（タンク）の選択、溶液を添加するタイミング、溶液の添加量、添加する溶液の温度、測定チャンバ１０の温度・溶液の排出タイミング、排出量（排出バルブの空いている時間）、攪拌タイミング、攪拌瞬間、攪拌パワー（周超音波の場合は周波数）等が含まれる。
【００２７】
〔実施例１〕
続いて、本装置を用いて解析を行った実施例について説明する。
【００２８】
（１）溶液は、図４に示す以下の溶液ａ〜ｆを用いて調整した。
【００２９】
溶液ａ：ヒト培養細胞からヒトＤＮＡを抽出し、２０ｎｇ／μｌに調製した。
【００３０】
溶液ｂ：ＨＰＡー１プライマー（５’一ＡＣＴ ＴＡＣ Ａｇｇ ＣＣＣ ＴｇＣ ＣＴＣＴ−３’）を１０μＭに調製した。
【００３１】
溶液ｃ：ＥｖｏＢｌｕｅ（蛍光色素）を５’端にラベルしたＨＰＡ−１プライマー（（ＥＢ）一５’−ＡｇＣ Ｃｇｇ Ａｇｔ ｇＣＡ ＡＴＣ ＣＴＣ Ｔｇー３’）を１０μＭに調製した。
【００３２】
溶液ｄ：ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
溶液ｅ：２ｍＭのｄＮＴＰｓ
溶液ｆ：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ
（２）サンプル溶液Ａは次の手順で調整した。
【００３３】
ＰＣＲ（核酸の増幅）は、溶液ａを１μｌ、溶液ｂを２μｌ、溶液ｃを２μｌ、溶液ｄを１μｌ、溶液ｅを２．５μｌ、溶液ｆを２．５μｌ抽出し、これに純水１５μｌを加えて、全体として２５μｌの溶液とした。
【００３４】
次に、このようにして調整した溶液を図５に示すように、９４℃で２分保持後、（９４℃で８０秒、７４℃で３０秒）を３０回繰り返し、７４℃で５分保持後、４℃で保持した。これによりＰＣＲ産物として１６０ｂｐの核酸を生成することができる。
【００３５】
（３）核酸の精製
続いて、得られた溶液に含まれている一本鎖ＤＮＡを除去するために、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉを上記ＰＣＲ産物２５μｌに対して３〜５μｌ加える。同時にＭｇＣｌ２を最終濃度が１０ｍＭになるように添加し、３７℃で１時間程度反応させる。その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて、未反応のプライマー、核酸、酵素等を取り除く。精製後、３％アガロース／ＴＡＥで泳動してバンドを確認し、全て２本鎖ＤＮＡであることを確認する。精製した２本鎖ＤＮＡを濃度が５ｎＭになるようにＴＥ緩衝液で希釈した。
【００３６】
（４）反応溶液の調整
ＳＳＢ（大腸菌の１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）をＴＥ緩衝液にて１０倍に希釈する（２００ｎｇ／μｌ）。また、ネガティブコントロールとして、ＴＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ， ０．２Ｍ ＮａＣｌ，５０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を調整した。
【００３７】
図６には、調整した反応溶液Ａと反応溶液Ｂの組み合わせを示している。
【００３８】
精製した二本鎖ＤＮＡの一部を９５℃で５分間変性した後、急冷し（エタノール＋氷中で５分程度）、一本鎖ＤＮＡとする（ｓｓＤＮＡ）。また、精製した二本鎖ＤＮＡの一部をそのまま用いた(ｄｓＤＮＡ)。図６に示すように、反応は溶液Ａ １９μｌに対して溶液Ｂを1μlを添加した。
【００３９】
（５）測定結果
図２の装置の溶液受入部Ａから４０℃に保温された測定チャンバ１０に、図６に示した区分１の溶液Ａを注入する。次に、区分１の溶液Ｂを投入口Ｂから注入し、反応液を混合した。その後、直ちに1分子蛍光分析装置にて測定した。
【００４０】
測定条件：６３３ｎｍ、１５秒/回、１００マイクロＷ、１０回測定した。測定後、直ちに溶液受入部Ｃから洗浄液のＴＥ緩衝液を注入して洗浄を行なった。この一連の手順を、区分２から４の組み合わせについて実施した。
【００４１】
その結果を図７に示す。図７の（１）は、一本鎖ＤＮＡの拡散時間の推移を示し、図７の（２）は、二本鎖ＤＮＡの拡散時間の推移を示している。
【００４２】
図７の（１）の測定結果を比較すると、右のグラフに示すように溶液ＢにＳＳＢが含まれている場合には、左のグラフに示すように溶液ＢにＳＳＢが含まれていない場合に比べて拡散時間は約５５％増加し、１本鎖ＤＮＡとＳＳＢが結合して分子量が大きくなったことが分かる。図７の（２）の測定結果を比較すると、右のグラフに示すように溶液ＢにＳＳＢが含まれている場合には、左のグラフに示すように溶液ＢにＳＳＢが含まれていない場合に比べて拡散時間の違いは約４％で、誤差範囲内と考えられ、ＳＳＢは２本鎖ＤＮＡにはほとんど結合していないことが示された。このように、ＳＳＢとＤＮＡの結合に関して、１本鎖および２本鎖ＤＮＡへの結合の特異性が短時間で確認することができた。
【００４３】
また、更に詳細に解析を行った結果、一本鎖ＤＮＡに二本鎖ＤＮＡが含まれている可能性はほとんどないと考えられる（一本鎖ＤＮＡは９６％以上存在した）。また、９０％以上の一本鎖ＤＮＡがＳＳＢと結合していると考えられる。
【００４４】
また、従来は溶液を混合した後に、測定部にセットして測定していたため、サンプルの載置、フォーカッシング、溶液投入、洗浄に時間がかかっていたので、３０分以上の時間必要であった。しかし、この装置を用いることで予め位置合わせ、焦点を合わせておくことで時間の短縮化につながり、１０分の測定時間で測定可能となった。
【００４５】
〔実施例２〕
次に第２の実施例について説明する。第２の実施例では、実施例１での溶液ｂの代わりに、２２ｍｅｒのＮＦκＢプライマー（５’−ＡｇＴＴｇＡｇｇｇｇＡＣＴＴＴＣＣＣＡｇｇＣ）、溶液ｃの代わりに、ＴＡＭＲＡ（蛍光色素）標識した２２ｍｅｒのＮＦκＢプライマー（５’一ＡｇＴＴｇＡｇｇｇｇＡＣＴＴＴＣＣＣＡｇｇＣ）を用いた他は、実施例１と同様にしてＤＮＡの増幅と精製を行い、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をサンプル溶液として用いた。
【００４６】
反応溶液は、ＳＳＢ：２．５マイクロｇ/ｍｌを１/２０に希釈したものを使用した。ＳＳＢ−ＴＥ 緩衝液：ＳＳＢ ５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．４)， １ｍＭ ＥＤＴＡ， １ｍＭ ＤＴＴ， ０．２Ｍ ＮａＣｌ， ５０％ｇｌｙｃｅｒｏｌを１/２０に希釈したものを使用した。２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（界面活性剤）/ＴＥ緩衝液、および２％ ＳＤＳ（界面活性剤）/ＴＥ緩衝液を使用した。
【００４７】
図８に示す溶液をそれぞれ溶液容器にセットし、コンピュータ制御により自動的に、容器Ａから測定チャンバ１０（４０℃）に２本鎖ＤＮＡ用液を注入した。測定開始後７分後に容器Ｂから１/２０ ＳＳＢ/ ＴＥ溶液を添加し、２２分後に容器Ｃから２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００/ＴＥ緩衝液を添加し、皿に、３８分後にイオン性界面活性剤である２％ ＳＤＳ/ＴＥ緩衝液を添加した。測定条件は５４３ｎｍ １５秒/開 ２５０回２００マイクロＷ。はかり定終了後は、測定チャンバ１０内の溶液を排出容器に回収し、更に、容器Ｅから洗浄液を供給して測定チャンバ１０内を洗浄した。
【００４８】
測定結果を図９、図１０に示す。
【００４９】
図９に示すように、測定開始から６分後に１/２０ ＳＳＢを添加したところ拡散時間 が１．３倍増加し、ＤＮＡとＳＳＢの特異的な結合が見られた。また、測定開始から２２分後に非イオン系界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を添加したところ、拡散時間は約３６０μｓでほぼ同じであった。さらに、測定開始から３８分後に陰イオン系界面活性剤であるＳＤＳを添加したところ、拡散時間は減少し、約８００μｓとなった。
【００５０】
図１０に示すように、本発明では反応前、反応時、反応後の３つの工程におけるリアルタイムの詳細な変化を測定することが可能である。これに対して、従来の方法ではマイクロプレートにサンプルとＳＳＢを添加して装置にセットしていたため結合反応直後のデータ取得が不可能で、反応終了後に相当する拡散時間約３８０μｓというデータしか取得できなかった。
【００５１】
以上の実施例では、核酸、ペプチド、酵素の反応を計測する場合について説明したが、糖鎖、リガンドの反応においても同様に適用することが可能である。
【００５２】
〔実施の形態の効果〕
本実施の形態の分子間相互作用計測装置は、反応する生体物質の１つまたはそれ以上の分子を、溶液中でより生体内に近い環境下で計測することができる。さらに１つまたはそれ以上の試料を反応途中に添加・混合できるために、混合後、急速に起こる反応に対して、少量のサンプルでその挙動を見逃すことなくリアルタイムに計測できる。
【００５３】
生物学的試料を極微小領域における分子のゆらぎ、または分子の蛍光強度、または蛍光偏光度から分子の大きさと分子数を測定する装置において、一つまたはそれ以上の試験サンプルと溶液を供給する手段を有するので、あらかじめ測定可能な状態（例えば位置合わせ、フォーカシング）にしておけるので反応させる溶液を添加した直後から測定可能となる。さらに、溶液ＡとＢを混合したときに濃度が高すぎる場合には、供給口からバッファー等を供給し、適切な濃度とした後に測定することができる。
【００５４】
さらに、本装置は攪拌する手段を有しており、例えばモーター、ピペッティング、超音波等を用いると、溶液とサンプルを均一に混合することができる。従って、反応溶液内の溶液を均一な状態で測定できる。
【００５５】
さらに、温度制御手段を有しているので、反応の温度を任意の温度に制御可能となる。例えば、生体内での反応を測定したい時は３７℃に設定することが出来る。
【００５６】
さらに、溶液の排出手段を具備しているので、多量の溶液を順次添加することが出来る。また、測定終了後には、バッファー、蒸留水等で洗浄を行うことで、次のサンプルを迅速に測定できる。
【００５７】
更に、測定溶液を保持する手段と、測定溶液を保持する手段を洗浄する手段と、測定溶液からの光を取得する手段を有し、測定溶液を保持する手段と測定溶液からの光を取得する手段が固定されているので、あらかじめ測定可能な状態（例えば位置合わせ、フォーカシングを調整した状態）としておき、測定部の洗浄手段を有しているので、測定終了後に迅速に洗浄を行なえば、多数の被検溶液をハイスループットで測定可能である。ここで、測定部を複数備えている場合は、ある測定部を洗浄中に、これ以外の測定部にある被検溶液の測定を行うことが可能であり、洗浄時間をふくめたトータルの測定時間が短縮可能となる。
【００５８】
固定された検出セル・チャンバーを用いることで、レーザー焦点が固定となり、したがって、マルチタイタープレートの場合に比べて、高速でしかも、オートフォーカス機能や設備が不要となるため、時間およびコストの軽減につながる。
【００５９】
排出手段として開閉型のコックを用い、自動で開閉するように構成している。測定終了後に洗浄液を供給し、洗浄液を自動で排出できるので、次の測定を更に迅速にハイスループットな測定ができる。
【００６０】
サンプル溶液の添加、混合（結合反応）、測定、測定後のデータ解析、洗浄をすべてコンピュータ上にあらかじめ入力することで自動で制御することができる。また、多数のパラメータを自動で制御することが可能となる。したがって、精度、再現性が高い測定が可能となる。
【００６１】
手動でサンプルを注入できる手段を具備しているとインジェクション装置が不要となり、簡単な装置構成とすることができるので安価に装置を提供することができる。
【００６２】
前記１つまたはそれ以上の物質は、核酸、ペプチド、酵素基質、などからなる群に蛍光標識することを特徴とし、１つまたはそれ以上の物質と相互作用解析の対象をタンパク質、抗体、ペプチド、核酸等の生体分子の組み合わせからなるものを測定可能である。
【００６３】
なお、本発明の分子間相互作用計測装置および方法は、以下に示すような種々の測定手法に適用することができる。
【００６４】
蛍光分子の拡散運動（または現象）を観察するためにＦＣＳ解析を行なう場合は、ＸＹ座標の１点あたり１０〜数十秒の計測が必要となることがある。そのためには、レーザ光を長く照射するために生じてしまう蛍光分子の蛍光退色や細胞へのダメージを避けるために、退色の起こりにくい蛍光色素を使用する、もしくは散乱光を計測する手法を用いることで、蛍光標識の必要がなくなる。また励起のための光源の波長を近赤外もしくは赤外をもちいるか、２光子励起法を用いることによって細胞へのダメージを防ぐ。あるいは、細胞のごく微小な領域を走査することによっても、退色や細胞へのダメージを防ぎながら、ＦＣＳ解析をすることが可能である。
【００６５】
蛍光相互相関分光解析法（ＦｘＣＳ）は、分子の相互作用を解析するための手法として、異なる分子をそれぞれ分光特性の異なる蛍光色素にて標識し、それぞれの蛍光シグナル相互の相関を解析する手法である。この手法を用いてそれぞれの分子からの時系列蛍光シグナルで相互相関解析を実行し、異なる分子の動きに同時性があるかどうかを確認することができる。本解析法は、分子が相互に作用を及ぼしても大きさにあまり変化が無いため、拡散状態の変化を検出しにくい場合に適用すると効果的である。
【００６６】
蛍光強度分布解析（ＦＩＤＡ）は、ＦＣＳと同様のプロセスを用いて得られる蛍光シグナルを統計分布解析することによって、蛍光の１分子あたりの強度および計測している領域に存在する分子の数を算出する解析手法である。この解析法は自己相関関数を求めないため、計測時間が短くても、比較的精度良く解析をすることが可能である。従って、ＦＣＳ解析で１０秒〜数十秒計測時間を必要とする大きな分子の計測あるいは細胞内の計測には、ＦＩＤＡ解析は特に有用である。またＦＩＤＡ解析は蛍光強度分布解析により蛍光分子１分子あたりの蛍光強度および観測する共焦点領域中に存在する蛍光分子の数を算出することが可能である。
【００６７】
仮に蛍光標識された分子が、他の分子と相互作用した場合、分子の構造などが変化するため分子を標識している蛍光色素の環境が変化する場合がある。その際には蛍光色素からのシグナルが変化する。蛍光強度が大きくなるかもしくは小さくなるかは、蛍光色素によって異なる。また、複数の蛍光分子が会合したり、あるいは他の分子に複数の蛍光分子が相互作用する場合は、検出される蛍光分子の数は少なくなる。また、酵素によって蛍光分子が分解される場合には検出される蛍光分子の数が増える。このようにＦＩＤＡを用いて、蛍光強度及び蛍光分子の数を算出することで、蛍光分子の相互作用についての知見を得ることが可能である。
【００６８】
上述のＦＣＳ解析、ＦｘＣＳ解析、ＦＩＤＡ解析は解析する手法はそれぞれ異なるが、その解析に使用する蛍光シグナルの時系列データは同一である。従って、目的の試料について、画像、ＦＣＳ解析、ＦｘＣＳ解析、ＦＩＤＡ解析を同時に行なうことも可能である。これらを同時に解析することで、蛍光分子の拡散などの動きの情報と同時に、蛍光強度の変化に関する知見も得ることが可能である。たとえば分子の相互作用の際に分子の構造変化や存在環境の変化が生じ、その場合に蛍光強度が変化することがある。ＦＣＳ解析にて大きさの変化を観測すると同時にＦＩＤＡを行なうことで蛍光分子の周囲の環境変化による蛍光強度の変化なども知ることができる。
【００６９】
２種類の異なる分光特性をもつ蛍光色素で標識された蛍光分子を使用しＦＩＤＡ解析を行なうと蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の計測が可能である。ＦＲＥＴ計測は２種類の異なる分子間の相互作用を確認するとき用いられる。この場合は分光素子を用いてそれぞれの波長毎に分離した蛍光シグナルを検出する。
【００７０】
次に、ＦＲＥＴ計測を行なう場合の試料解析装置の構成について説明する。ＦＲＥＴ計測を行なう場合は、１もしくは２種類の異なる波長特性をもつ励起光を使用する。従って、試料解析装置は、試料からの波長の異なる複数の蛍光シグナルを分光するためのダイクロイックミラーもしくは分光素子と、波長毎の蛍光を検出する光検出器とを備えていることが望ましい。試料の反応の時間変化を測定すれば、相互作用する試料の結合の強さだけでなく、結合の速さや解離の速さなどの情報も得ることが可能となる。また、細胞計測において、目的の場所のみを蛍光標識することで、目的の試料の拡散を調べることも可能となる。蛍光強度分布解析はシグナルを検出する計測時間が０．１から０．５秒程度で充分であり、励起光を走査しながら細胞画像を取得する時間内で解析が可能である。
【００７１】
もし、相互作用は起こっているが、ＦＲＥＴが観測されなかった場合には、各蛍光分子を励起する波長の光を同時に照射し、蛍光相互相関解析（ＦｘＣｓ）を行なう。そして各分子からの蛍光シグナルについてＦｘＣＳを実行して、相互作用しているかどうかを検出する。
【００７２】
蛍光シグナルを偏光素子を用い入射光の偏光方向に対して平行な成分と垂直な成分に分けて検出し、蛍光１分子あたりの蛍光偏光度解析（ＦＩＤＡ−ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を行なうと分子の運動の速さがわかり、結果として分子の大きさや蛍光分子の存在している溶媒の粘度を知ることができる。蛍光偏光度解析では、たとえば直交偏光成分を検出して各成分ごとに蛍光強度を求める。これから、蛍光偏光度を算出し、計測している分子がどれくらいの速さで回転しているかを知ることができる。
【００７３】
励起光の振動成分の方向と平行に振動する偏光成分Ｉ／／、直角に振動する偏光成分Ｉ⊥とすると蛍光偏光度Ｐは式（１）で表わされる。
【００７４】
Ｐ＝（Ｉ／／−Ｉ⊥）／（Ｉ／／＋ Ｉ⊥） ・・・式（１）
蛍光偏光度Ｐは、蛍光分子の回転の速さ（回転拡散）を知る上での目安となるパラメータである。分子の大きさが小さく回転が速い場合はＰは小さい。また、分子が大きくなる、もしくは分子の回りの溶媒の粘度が高くなるなどで分子の回転が遅くなるとＰが大きくなる。たとえば分子間相互作用が起こっていれば、蛍光偏光度は高くなる。また目的の蛍光分子が細胞膜、オルガネラ、細胞骨格などに捕捉されるなど、動きが制限されると蛍光偏光度は高くなる。目的の蛍光分子が膜や核内に移動するなど、分子の溶媒環境が変化し、溶媒の粘度が高い場所へ移動すると蛍光偏光度は高くなり、逆に溶媒粘度が低い場所へ移動すると蛍光偏光度は小さくなる。このような蛍光分子の挙動を蛍光偏光度から観測することができる。
【００７５】
なお、蛍光偏光解析は蛍光強度分布解析から回転拡散を見ているため、観測点１点あたりの計測時間を０．１から数秒と短縮することができる。そのため、画像取得のための励起光走査の際にデータを取得することが可能である。
【００７６】
化学発光、生物発光は、分子が光を発する現象である。特に細胞機能の解析においては、細胞内のカルシウムイオン濃度変化の観測が頻繁に行なわれている。この際に、あらかじめ標識された分子を用いなくとも、蛍光分子、たとえばエコーリンやルシフェラーゼなどのカルシウムイオン濃度の測定に利用される発光タンパク質などを用いても良い。発光タンパク質は遺伝子工学的に細胞内に導入でき、カルシウムイオン濃度感受性色素とは異なり、目的の細胞内の器官に発現させることが可能である。
【００７７】
これらの蛍光分子では、酸化反応によって発光のためのエネルギーが与えられるので、蛍光分子を励起するための光源を必要としない。従って、これらの分子を測定する装置では、励起光を必要せず発光を検出するための光学系のみを必要とする。
【００７８】
蛍光寿命計測は、溶媒緩和を見るのに適した計測法である。蛍光分子の蛍光寿命はその蛍光分子の周りの溶媒環境に影響される。蛍光分子が他の分子と相互作用して結合したり、もしくは相互作用によって分子の高次構造が変化すると、その蛍光分子の周囲の環境が親水的な状態から疎水的な状態に変化する。このような蛍光分子の局所的な溶媒環境の変化によってその蛍光分子の蛍光寿命が変化する。
【００７９】
たとえば、細胞内の蛍光標識分子が他の分子と相互作用したり、細胞内で何かの刺激によって目的の分子が活性化され蛍光分子が細胞質から細胞膜やオルガネラの膜内に入りこんだり、蛍光分子の構造そのものが変化したりすると、蛍光分子の周りの環境（極性）が変化することがある。
【００８０】
蛍光分子の蛍光寿命の計測はこのような知見を得るには重要な計測法である。また、蛍光寿命計測は、蛍光分子の励起をごく短いパルス光を用いて行なうため、励起光による細胞へのダメージも少なくすることが可能である。
【００８１】
また試料を蛍光標識することができない場合には、散乱計測を行なう方法もある。これは分子に光を照射しその散乱光を観測することで、分子の大きさを知る方法である。散乱計測は、目的の分子を標識することなく観測するので、たとえば蛍光分子によって目的の分子の活性が失われたり、活性に変化が起こったりする危険がない。目的の分子が他の分子と相互作用すると分子の大きさが変化する（この場合は大きくなる）。分子の大きさの変化に伴い散乱が変化する。この変化を観測することによって、分子の相互作用や分子の分解などを見ることができるのである。
【００８２】
散乱計測によって分子の他の分子との相互作用の検出や分解の検出を行なうことができる。また細胞内にあらかじめラテックスや金粒子を注入しておき、細胞からの開口放出や抱食などの減少について細胞質内での局在や拡散などを見ることが可能である。また、ラテックスや金、銀、その他の誘電体粒子を、蛍光物質の変わりに種々の物質に標識して、照明光を照射し、散乱光により検出を行うこともできる。これらの計測方法の場合は蛍光標識を行なわないので、毒性がない、粒子を用いる場合でも金を用いれば毒性に関しては問題ない。また蛍光退色の影響もないので細胞の動きを長時間観測する場合には有利である。さらに、励起波長を選ばないので、細胞へのダメージの少ない波長を用いて計測することができ、他の蛍光標識分子を用いる場合はそれと同様の波長を用いて計測することが可能である。
【００８３】
燐光検出の場合は分子が光を発する時間が蛍光よりも長い（10−4 〜10秒）。そのため、燐光観測には蛍光分子を励起する励起光を遮断しておく必要がある。この場合はレーザ光のシャッターを用い蛍光分子を励起する時は観測せず、分子を励起後シャッターを閉じる制御装置を用い計測を行なえば良い。
【００８４】
なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】第１の実施の形態に係る分子間相互作用計測装置の構成を示す図。
【図２】測定部の構成を示す斜視図。
【図３】分子間相互作用計測装置における、溶液の供給、排出、洗浄及び混合機能を説明するためのブロック図。
【図４】調整に用いる溶液を示す図。
【図５】溶液の調整シーケンスを示す図。
【図６】調整した反応溶液Ａと反応溶液Ｂの組み合わせを示す図。
【図７】計測結果を示す図。
【図８】調整した溶液の組み合わせを示す図。
【図９】測定結果を示す図。
【図１０】測定結果を示す図。
【符号の説明】
【００８６】
１…分子間相互作用計測装置、２…１分子蛍光分析装置、３…インジェクション装置、４…制御装置、６…溶液容器、７…排出容器、１０…測定チャンバ、１１…溶液受入部、１２…溶液排出部、１３…対物レンズ、１４…測定容器、１５…積載部、１６…超音波振動子、１８…温度調節機構、２１…三方弁。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の結合、分解および解離反応の過程をリアルタイム、または、ハイスループットで測定することが可能な分子間相互作用を計測するための装置および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、分子間相互作用を解析する手法として、ＦＣＳ（蛍光相関分光法）やＦＩＤＡ（蛍光強度分布解析法）等が知られている（例えば、非特許文献１参照）。これらの解析手法では、ともに、サンプルを複数の溶液に混合した後、９６あるいは３８４等のマルチウエルのタイタープレートにサンプルを分注し測定する。そして、この測定では、溶液を分注したウエルを所定の測定部に載置して、微小な位置合わせ、サンプルへの焦点合わせが必要である。
【非特許文献１】Biophysical Journal Vol. 79 Dec.2000 2858-2866
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述のように、従来のＦＣＳ、ＦＩＤＡ測定装置では、測定用の容器に溶液を添加して調整した後に、その容器を測定部に載置して、測定しようとするウエルが所定の位置になるように精度良く調整し、更に、フォーカッシングを行う必要がある。しかしながら、これらの調整には時間を要するため、溶液調整後直ちにリアルタイムで測定を行うことは困難であった。従って、急激に起こる反応系に対処することはできず、また、一連の反応を順次展開していく実験、あるいは途中で反応を止めるような実験を行うことができなかった。
【０００４】
さらに、事前準備として上述のように種々の工程（ウエルへの位置合わせ、フォーカッシングなど）が必要であったため、多数の被検溶液をハイスループットで測定することも困難であった。
【０００５】
本発明は係る事情に鑑みてなされたものであって、リアルタイムで測定を行うことができ、多数の被検溶液をハイスループットで測定することができる分子間相互作用計測装置及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための、本発明に係る請求項１に記載の分子間相互作用計測装置は、容器に収容された試料から発せられる光を測定し、試料の物理的、あるいは化学的な性質を測定する測定装置において、試験サンプル、試薬、洗浄液の少なくとも１つの溶液をそれぞれ供給する溶液供給手段を有する。
【０００７】
また、本発明に係る請求項２に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、供給した少なくとも１つの溶液を攪拌する攪拌手段をさらに有する。
【０００８】
また、本発明に係る請求項３に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、供給された溶液の温度を制御する温度制御手段を更に有する。
【０００９】
また、本発明に係る請求項４に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、供給された溶液を排出する溶液排出手段をさらに具備している。
【００１０】
また、本発明に係る請求項５に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、供給された溶液を保持する保持手段と、前記保持手段を洗浄する洗浄手段と、前記溶液に光を集光する集光手段とを更に有し、前記保持手段に前記集光手段が接続されている。
【００１１】
また、本発明に係る請求項６に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、前記溶液排出手段の排出動作は、コンピュータによって制御される。
【００１２】
また、本発明に係る請求項７に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、前記コンピュータは、入力された一連の測定条件に基づいて、分子間相互作用計測装置の動作を制御する。
【００１３】
また、本発明に係る請求項８に記載の分子間相互作用計測装置は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置において、手動で前記溶液を注入できる手動注入手段を具備する。
【００１４】
また、本発明に係る請求項９に記載の分子間相互作用計測方法は、上記記載の発明である分子間相互作用計測装置を用いて分子間における相互作用を計測する方法において、 複数の試料と、当該複数の試料の各々の分子と結合または前記分子を分解することができる少なくとも１つの物質とを順次混合して、複数の試験混合物を作成する工程と、前記少なくとも１つの物質と前記分子との結合及び分解状態を測定する工程とを備えた。
【００１５】
また、本発明に係る請求項１０に記載の分子間相互作用計測方法は、上記記載の発明である分子間相互作用計測方法において、前記試料は、核酸、ペプチド、酵素基質からなる群から選ばれた少なくとも１つの物質を蛍光標識したものであり、前記物質は、タンパク質、抗体、ペプチド、核酸からなる群から選ばれる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、リアルタイムで測定を行うことができ、多数の被検溶液をハイスループットで測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［第１の実施の形態］
図１は、第１の実施の形態に係る分子間相互作用計測装置１の構成を示す図である。分子間相互作用計測装置１は、１分子蛍光分析装置２、インジェクション装置３及び制御装置４を備えている。そして、１分子蛍光分析装置２には測定部５が設けられ、インジェクション装置３には複数の溶液容器６と排出容器７が備えられている。
【００１８】
１分子蛍光分析装置２は、ＦＣＳあるいはＦＩＤＡを用いて分子間の相互作用を計測する。インジェクション装置３は、１分子蛍光分析装置２に溶液を供給するとともに、測定に使用した溶液を排液として回収する。制御装置４は、分子間相互作用計測装置１の動作を統括して制御する。この制御装置４により、分子間相互作用計測装置１は自動で動作する。
【００１９】
そして、測定部５は、試料溶液を受け入れて、位置調整を行い、排液を排出などする機構を備えている。溶液容器６は、試料溶液を貯蔵する。排出容器７は、排液を貯蔵する。
【００２０】
図２は、測定部５の構成を示す斜視図である。測定チャンバ１０は、試料溶液を受け入れて保持し、排液を排出する。そして、測定チャンバ１０には、インジェクション装置３から供給される溶液を受け入れるための溶液受入部１１と測定後の溶液をインジェクション装置３に排出するための溶液排出部１２が設けられている。また、この測定チャンバ１０には、試料に対して励起光を収束させ、試料から発せられた蛍光を解析装置に導くための対物レンズ１３が接続されている。
【００２１】
図２に示すように、溶液受入部１１は複数設けられており、複数の溶液を供給することができる。複数の溶液として、サンプル、バッファー、洗浄液等を供給することが可能である。対物レンズ１３は液浸対物レンズを用いることが好ましく、対物レンズ１３と測定チャンバ１０の間に、媒質として、水やオイルを用いることができる。
【００２２】
測定溶液を保持する手段である測定チャンバ１０と測定溶液からの信号を取得する手段である対物レンズ１３とは、対物レンズ１３と測定チャンバ１０との相対的な位置が変わらないように固定されている。ただし、固定されていても装置のセットアップのためのわずかな移動は可能な状態であってもよい。したがって、対物レンズ１３と測定チャンバ１０が一体に構成されていても良く、別体で固定されていても良い。対物レンズと測定チャンバ１０が一体に構成されている場合に、好ましい液浸媒質であるオイルを、両者の間に封入しておくことができる。
【００２３】
図３は、分子間相互作用計測装置１における、溶液の供給、排出、洗浄及び混合機能を説明するためのブロック図である。図３を参照しつつ、構成と動作について説明する。
【００２４】
溶液を受け入れるための測定容器１４は、積載部１５上に載置されている。そして、測定容器１４には、超音波振動子１６が設けられ、測定容器内の溶液、洗浄液を攪拌する。この積載部１５には、流水通路１７が接続され、温度調節機構１８を介して所定温度に制御された温水がポンプ１９により循環され、溶液の温度を制御する。
【００２５】
溶液は、インジェクション装置３の溶液容器６からポンプ２０によって、測定容器１４に供給される。なお、溶液の供給経路には、３方弁２１が設けられている。そこで、この３方弁２１を切り替えることによって、ユーザは、手動で溶液を測定容器１４に供給することもできる。また、積載部１５には対物レンズ１３が固定手段２２を介して接続されている。
【００２６】
なお、この図３に示す各機構は、制御装置４からの制御信号（不図示）によって制御され自動で溶液の供給、排出、洗浄及び混合を行う。本装置を用いた後述する実施例では、制御装置４に一連の測定条件を入力する。この入力データには、例えば、励起波長、測定波長、励起光のパワー、測定間隔、測定回数、測定時間、溶液（タンク）の選択、溶液を添加するタイミング、溶液の添加量、添加する溶液の温度、測定チャンバ１０の温度・溶液の排出タイミング、排出量（排出バルブの空いている時間）、攪拌タイミング、攪拌瞬間、攪拌パワー（周超音波の場合は周波数）等が含まれる。
【００２７】
〔実施例１〕
続いて、本装置を用いて解析を行った実施例について説明する。
【００２８】
（１）溶液は、図４に示す以下の溶液ａ〜ｆを用いて調整した。
【００２９】
溶液ａ：ヒト培養細胞からヒトＤＮＡを抽出し、２０ｎｇ／μｌに調製した。
【００３０】
溶液ｂ：ＨＰＡー１プライマー（５’一ＡＣＴ ＴＡＣ Ａｇｇ ＣＣＣ ＴｇＣ ＣＴＣＴ−３’）を１０μＭに調製した。
【００３１】
溶液ｃ：ＥｖｏＢｌｕｅ（蛍光色素）を５’端にラベルしたＨＰＡ−１プライマー（（ＥＢ）一５’−ＡｇＣ Ｃｇｇ Ａｇｔ ｇＣＡ ＡＴＣ ＣＴＣ Ｔｇー３’）を１０μＭに調製した。
【００３２】
溶液ｄ：ＴＩＴＡＮＩＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
溶液ｅ：２ｍＭのｄＮＴＰｓ
溶液ｆ：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ
（２）サンプル溶液Ａは次の手順で調整した。
【００３３】
ＰＣＲ（核酸の増幅）は、溶液ａを１μｌ、溶液ｂを２μｌ、溶液ｃを２μｌ、溶液ｄを１μｌ、溶液ｅを２．５μｌ、溶液ｆを２．５μｌ抽出し、これに純水１５μｌを加えて、全体として２５μｌの溶液とした。
【００３４】
次に、このようにして調整した溶液を図５に示すように、９４℃で２分保持後、（９４℃で８０秒、７４℃で３０秒）を３０回繰り返し、７４℃で５分保持後、４℃で保持した。これによりＰＣＲ産物として１６０ｂｐの核酸を生成することができる。
【００３５】
（３）核酸の精製
続いて、得られた溶液に含まれている一本鎖ＤＮＡを除去するために、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉを上記ＰＣＲ産物２５μｌに対して３〜５μｌ加える。同時にＭｇＣｌ２を最終濃度が１０ｍＭになるように添加し、３７℃で１時間程度反応させる。その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて、未反応のプライマー、核酸、酵素等を取り除く。精製後、３％アガロース／ＴＡＥで泳動してバンドを確認し、全て２本鎖ＤＮＡであることを確認する。精製した２本鎖ＤＮＡを濃度が５ｎＭになるようにＴＥ緩衝液で希釈した。
【００３６】
（４）反応溶液の調整
ＳＳＢ（大腸菌の１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）をＴＥ緩衝液にて１０倍に希釈する（２００ｎｇ／μｌ）。また、ネガティブコントロールとして、ＴＥ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＤＴＴ， ０．２Ｍ ＮａＣｌ，５０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を調整した。
【００３７】
図６には、調整した反応溶液Ａと反応溶液Ｂの組み合わせを示している。
【００３８】
精製した二本鎖ＤＮＡの一部を９５℃で５分間変性した後、急冷し（エタノール＋氷中で５分程度）、一本鎖ＤＮＡとする（ｓｓＤＮＡ）。また、精製した二本鎖ＤＮＡの一部をそのまま用いた(ｄｓＤＮＡ)。図６に示すように、反応は溶液Ａ １９μｌに対して溶液Ｂを1μlを添加した。
【００３９】
（５）測定結果
図２の装置の溶液受入部Ａから４０℃に保温された測定チャンバ１０に、図６に示した区分１の溶液Ａを注入する。次に、区分１の溶液Ｂを投入口Ｂから注入し、反応液を混合した。その後、直ちに1分子蛍光分析装置にて測定した。
【００４０】
測定条件：６３３ｎｍ、１５秒/回、１００マイクロＷ、１０回測定した。測定後、直ちに溶液受入部Ｃから洗浄液のＴＥ緩衝液を注入して洗浄を行なった。この一連の手順を、区分２から４の組み合わせについて実施した。
【００４１】
その結果を図７に示す。図７の（１）は、一本鎖ＤＮＡの拡散時間の推移を示し、図７の（２）は、二本鎖ＤＮＡの拡散時間の推移を示している。
【００４２】
図７の（１）の測定結果を比較すると、右のグラフに示すように溶液ＢにＳＳＢが含まれている場合には、左のグラフに示すように溶液ＢにＳＳＢが含まれていない場合に比べて拡散時間は約５５％増加し、１本鎖ＤＮＡとＳＳＢが結合して分子量が大きくなったことが分かる。図７の（２）の測定結果を比較すると、右のグラフに示すように溶液ＢにＳＳＢが含まれている場合には、左のグラフに示すように溶液ＢにＳＳＢが含まれていない場合に比べて拡散時間の違いは約４％で、誤差範囲内と考えられ、ＳＳＢは２本鎖ＤＮＡにはほとんど結合していないことが示された。このように、ＳＳＢとＤＮＡの結合に関して、１本鎖および２本鎖ＤＮＡへの結合の特異性が短時間で確認することができた。
【００４３】
また、更に詳細に解析を行った結果、一本鎖ＤＮＡに二本鎖ＤＮＡが含まれている可能性はほとんどないと考えられる（一本鎖ＤＮＡは９６％以上存在した）。また、９０％以上の一本鎖ＤＮＡがＳＳＢと結合していると考えられる。
【００４４】
また、従来は溶液を混合した後に、測定部にセットして測定していたため、サンプルの載置、フォーカッシング、溶液投入、洗浄に時間がかかっていたので、３０分以上の時間必要であった。しかし、この装置を用いることで予め位置合わせ、焦点を合わせておくことで時間の短縮化につながり、１０分の測定時間で測定可能となった。
【００４５】
〔実施例２〕
次に第２の実施例について説明する。第２の実施例では、実施例１での溶液ｂの代わりに、２２ｍｅｒのＮＦκＢプライマー（５’−ＡｇＴＴｇＡｇｇｇｇＡＣＴＴＴＣＣＣＡｇｇＣ）、溶液ｃの代わりに、ＴＡＭＲＡ（蛍光色素）標識した２２ｍｅｒのＮＦκＢプライマー（５’一ＡｇＴＴｇＡｇｇｇｇＡＣＴＴＴＣＣＣＡｇｇＣ）を用いた他は、実施例１と同様にしてＤＮＡの増幅と精製を行い、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をサンプル溶液として用いた。
【００４６】
反応溶液は、ＳＳＢ：２．５マイクロｇ/ｍｌを１/２０に希釈したものを使用した。ＳＳＢ−ＴＥ 緩衝液：ＳＳＢ ５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７．４)， １ｍＭ ＥＤＴＡ， １ｍＭ ＤＴＴ， ０．２Ｍ ＮａＣｌ， ５０％ｇｌｙｃｅｒｏｌを１/２０に希釈したものを使用した。２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（界面活性剤）/ＴＥ緩衝液、および２％ ＳＤＳ（界面活性剤）/ＴＥ緩衝液を使用した。
【００４７】
図８に示す溶液をそれぞれ溶液容器にセットし、コンピュータ制御により自動的に、容器Ａから測定チャンバ１０（４０℃）に２本鎖ＤＮＡ用液を注入した。測定開始後７分後に容器Ｂから１/２０ ＳＳＢ/ ＴＥ溶液を添加し、２２分後に容器Ｃから２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００/ＴＥ緩衝液を添加し、皿に、３８分後にイオン性界面活性剤である２％ ＳＤＳ/ＴＥ緩衝液を添加した。測定条件は５４３ｎｍ １５秒/開 ２５０回２００マイクロＷ。はかり定終了後は、測定チャンバ１０内の溶液を排出容器に回収し、更に、容器Ｅから洗浄液を供給して測定チャンバ１０内を洗浄した。
【００４８】
測定結果を図９、図１０に示す。
【００４９】
図９に示すように、測定開始から６分後に１/２０ ＳＳＢを添加したところ拡散時間 が１．３倍増加し、ＤＮＡとＳＳＢの特異的な結合が見られた。また、測定開始から２２分後に非イオン系界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を添加したところ、拡散時間は約３６０μｓでほぼ同じであった。さらに、測定開始から３８分後に陰イオン系界面活性剤であるＳＤＳを添加したところ、拡散時間は減少し、約８００μｓとなった。
【００５０】
図１０に示すように、本発明では反応前、反応時、反応後の３つの工程におけるリアルタイムの詳細な変化を測定することが可能である。これに対して、従来の方法ではマイクロプレートにサンプルとＳＳＢを添加して装置にセットしていたため結合反応直後のデータ取得が不可能で、反応終了後に相当する拡散時間約３８０μｓというデータしか取得できなかった。
【００５１】
以上の実施例では、核酸、ペプチド、酵素の反応を計測する場合について説明したが、糖鎖、リガンドの反応においても同様に適用することが可能である。
【００５２】
〔実施の形態の効果〕
本実施の形態の分子間相互作用計測装置は、反応する生体物質の１つまたはそれ以上の分子を、溶液中でより生体内に近い環境下で計測することができる。さらに１つまたはそれ以上の試料を反応途中に添加・混合できるために、混合後、急速に起こる反応に対して、少量のサンプルでその挙動を見逃すことなくリアルタイムに計測できる。
【００５３】
生物学的試料を極微小領域における分子のゆらぎ、または分子の蛍光強度、または蛍光偏光度から分子の大きさと分子数を測定する装置において、一つまたはそれ以上の試験サンプルと溶液を供給する手段を有するので、あらかじめ測定可能な状態（例えば位置合わせ、フォーカシング）にしておけるので反応させる溶液を添加した直後から測定可能となる。さらに、溶液ＡとＢを混合したときに濃度が高すぎる場合には、供給口からバッファー等を供給し、適切な濃度とした後に測定することができる。
【００５４】
さらに、本装置は攪拌する手段を有しており、例えばモーター、ピペッティング、超音波等を用いると、溶液とサンプルを均一に混合することができる。従って、反応溶液内の溶液を均一な状態で測定できる。
【００５５】
さらに、温度制御手段を有しているので、反応の温度を任意の温度に制御可能となる。例えば、生体内での反応を測定したい時は３７℃に設定することが出来る。
【００５６】
さらに、溶液の排出手段を具備しているので、多量の溶液を順次添加することが出来る。また、測定終了後には、バッファー、蒸留水等で洗浄を行うことで、次のサンプルを迅速に測定できる。
【００５７】
更に、測定溶液を保持する手段と、測定溶液を保持する手段を洗浄する手段と、測定溶液からの光を取得する手段を有し、測定溶液を保持する手段と測定溶液からの光を取得する手段が固定されているので、あらかじめ測定可能な状態（例えば位置合わせ、フォーカシングを調整した状態）としておき、測定部の洗浄手段を有しているので、測定終了後に迅速に洗浄を行なえば、多数の被検溶液をハイスループットで測定可能である。ここで、測定部を複数備えている場合は、ある測定部を洗浄中に、これ以外の測定部にある被検溶液の測定を行うことが可能であり、洗浄時間をふくめたトータルの測定時間が短縮可能となる。
【００５８】
固定された検出セル・チャンバーを用いることで、レーザー焦点が固定となり、したがって、マルチタイタープレートの場合に比べて、高速でしかも、オートフォーカス機能や設備が不要となるため、時間およびコストの軽減につながる。
【００５９】
排出手段として開閉型のコックを用い、自動で開閉するように構成している。測定終了後に洗浄液を供給し、洗浄液を自動で排出できるので、次の測定を更に迅速にハイスループットな測定ができる。
【００６０】
サンプル溶液の添加、混合（結合反応）、測定、測定後のデータ解析、洗浄をすべてコンピュータ上にあらかじめ入力することで自動で制御することができる。また、多数のパラメータを自動で制御することが可能となる。したがって、精度、再現性が高い測定が可能となる。
【００６１】
手動でサンプルを注入できる手段を具備しているとインジェクション装置が不要となり、簡単な装置構成とすることができるので安価に装置を提供することができる。
【００６２】
前記１つまたはそれ以上の物質は、核酸、ペプチド、酵素基質、などからなる群に蛍光標識することを特徴とし、１つまたはそれ以上の物質と相互作用解析の対象をタンパク質、抗体、ペプチド、核酸等の生体分子の組み合わせからなるものを測定可能である。
【００６３】
なお、本発明の分子間相互作用計測装置および方法は、以下に示すような種々の測定手法に適用することができる。
【００６４】
蛍光分子の拡散運動（または現象）を観察するためにＦＣＳ解析を行なう場合は、ＸＹ座標の１点あたり１０〜数十秒の計測が必要となることがある。そのためには、レーザ光を長く照射するために生じてしまう蛍光分子の蛍光退色や細胞へのダメージを避けるために、退色の起こりにくい蛍光色素を使用する、もしくは散乱光を計測する手法を用いることで、蛍光標識の必要がなくなる。また励起のための光源の波長を近赤外もしくは赤外をもちいるか、２光子励起法を用いることによって細胞へのダメージを防ぐ。あるいは、細胞のごく微小な領域を走査することによっても、退色や細胞へのダメージを防ぎながら、ＦＣＳ解析をすることが可能である。
【００６５】
蛍光相互相関分光解析法（ＦｘＣＳ）は、分子の相互作用を解析するための手法として、異なる分子をそれぞれ分光特性の異なる蛍光色素にて標識し、それぞれの蛍光シグナル相互の相関を解析する手法である。この手法を用いてそれぞれの分子からの時系列蛍光シグナルで相互相関解析を実行し、異なる分子の動きに同時性があるかどうかを確認することができる。本解析法は、分子が相互に作用を及ぼしても大きさにあまり変化が無いため、拡散状態の変化を検出しにくい場合に適用すると効果的である。
【００６６】
蛍光強度分布解析（ＦＩＤＡ）は、ＦＣＳと同様のプロセスを用いて得られる蛍光シグナルを統計分布解析することによって、蛍光の１分子あたりの強度および計測している領域に存在する分子の数を算出する解析手法である。この解析法は自己相関関数を求めないため、計測時間が短くても、比較的精度良く解析をすることが可能である。従って、ＦＣＳ解析で１０秒〜数十秒計測時間を必要とする大きな分子の計測あるいは細胞内の計測には、ＦＩＤＡ解析は特に有用である。またＦＩＤＡ解析は蛍光強度分布解析により蛍光分子１分子あたりの蛍光強度および観測する共焦点領域中に存在する蛍光分子の数を算出することが可能である。
【００６７】
仮に蛍光標識された分子が、他の分子と相互作用した場合、分子の構造などが変化するため分子を標識している蛍光色素の環境が変化する場合がある。その際には蛍光色素からのシグナルが変化する。蛍光強度が大きくなるかもしくは小さくなるかは、蛍光色素によって異なる。また、複数の蛍光分子が会合したり、あるいは他の分子に複数の蛍光分子が相互作用する場合は、検出される蛍光分子の数は少なくなる。また、酵素によって蛍光分子が分解される場合には検出される蛍光分子の数が増える。このようにＦＩＤＡを用いて、蛍光強度及び蛍光分子の数を算出することで、蛍光分子の相互作用についての知見を得ることが可能である。
【００６８】
上述のＦＣＳ解析、ＦｘＣＳ解析、ＦＩＤＡ解析は解析する手法はそれぞれ異なるが、その解析に使用する蛍光シグナルの時系列データは同一である。従って、目的の試料について、画像、ＦＣＳ解析、ＦｘＣＳ解析、ＦＩＤＡ解析を同時に行なうことも可能である。これらを同時に解析することで、蛍光分子の拡散などの動きの情報と同時に、蛍光強度の変化に関する知見も得ることが可能である。たとえば分子の相互作用の際に分子の構造変化や存在環境の変化が生じ、その場合に蛍光強度が変化することがある。ＦＣＳ解析にて大きさの変化を観測すると同時にＦＩＤＡを行なうことで蛍光分子の周囲の環境変化による蛍光強度の変化なども知ることができる。
【００６９】
２種類の異なる分光特性をもつ蛍光色素で標識された蛍光分子を使用しＦＩＤＡ解析を行なうと蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の計測が可能である。ＦＲＥＴ計測は２種類の異なる分子間の相互作用を確認するとき用いられる。この場合は分光素子を用いてそれぞれの波長毎に分離した蛍光シグナルを検出する。
【００７０】
次に、ＦＲＥＴ計測を行なう場合の試料解析装置の構成について説明する。ＦＲＥＴ計測を行なう場合は、１もしくは２種類の異なる波長特性をもつ励起光を使用する。従って、試料解析装置は、試料からの波長の異なる複数の蛍光シグナルを分光するためのダイクロイックミラーもしくは分光素子と、波長毎の蛍光を検出する光検出器とを備えていることが望ましい。試料の反応の時間変化を測定すれば、相互作用する試料の結合の強さだけでなく、結合の速さや解離の速さなどの情報も得ることが可能となる。また、細胞計測において、目的の場所のみを蛍光標識することで、目的の試料の拡散を調べることも可能となる。蛍光強度分布解析はシグナルを検出する計測時間が０．１から０．５秒程度で充分であり、励起光を走査しながら細胞画像を取得する時間内で解析が可能である。
【００７１】
もし、相互作用は起こっているが、ＦＲＥＴが観測されなかった場合には、各蛍光分子を励起する波長の光を同時に照射し、蛍光相互相関解析（ＦｘＣｓ）を行なう。そして各分子からの蛍光シグナルについてＦｘＣＳを実行して、相互作用しているかどうかを検出する。
【００７２】
蛍光シグナルを偏光素子を用い入射光の偏光方向に対して平行な成分と垂直な成分に分けて検出し、蛍光１分子あたりの蛍光偏光度解析（ＦＩＤＡ−ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を行なうと分子の運動の速さがわかり、結果として分子の大きさや蛍光分子の存在している溶媒の粘度を知ることができる。蛍光偏光度解析では、たとえば直交偏光成分を検出して各成分ごとに蛍光強度を求める。これから、蛍光偏光度を算出し、計測している分子がどれくらいの速さで回転しているかを知ることができる。
【００７３】
励起光の振動成分の方向と平行に振動する偏光成分Ｉ／／、直角に振動する偏光成分Ｉ⊥とすると蛍光偏光度Ｐは式（１）で表わされる。
【００７４】
Ｐ＝（Ｉ／／−Ｉ⊥）／（Ｉ／／＋ Ｉ⊥） ・・・式（１）
蛍光偏光度Ｐは、蛍光分子の回転の速さ（回転拡散）を知る上での目安となるパラメータである。分子の大きさが小さく回転が速い場合はＰは小さい。また、分子が大きくなる、もしくは分子の回りの溶媒の粘度が高くなるなどで分子の回転が遅くなるとＰが大きくなる。たとえば分子間相互作用が起こっていれば、蛍光偏光度は高くなる。また目的の蛍光分子が細胞膜、オルガネラ、細胞骨格などに捕捉されるなど、動きが制限されると蛍光偏光度は高くなる。目的の蛍光分子が膜や核内に移動するなど、分子の溶媒環境が変化し、溶媒の粘度が高い場所へ移動すると蛍光偏光度は高くなり、逆に溶媒粘度が低い場所へ移動すると蛍光偏光度は小さくなる。このような蛍光分子の挙動を蛍光偏光度から観測することができる。
【００７５】
なお、蛍光偏光解析は蛍光強度分布解析から回転拡散を見ているため、観測点１点あたりの計測時間を０．１から数秒と短縮することができる。そのため、画像取得のための励起光走査の際にデータを取得することが可能である。
【００７６】
化学発光、生物発光は、分子が光を発する現象である。特に細胞機能の解析においては、細胞内のカルシウムイオン濃度変化の観測が頻繁に行なわれている。この際に、あらかじめ標識された分子を用いなくとも、蛍光分子、たとえばエコーリンやルシフェラーゼなどのカルシウムイオン濃度の測定に利用される発光タンパク質などを用いても良い。発光タンパク質は遺伝子工学的に細胞内に導入でき、カルシウムイオン濃度感受性色素とは異なり、目的の細胞内の器官に発現させることが可能である。
【００７７】
これらの蛍光分子では、酸化反応によって発光のためのエネルギーが与えられるので、蛍光分子を励起するための光源を必要としない。従って、これらの分子を測定する装置では、励起光を必要せず発光を検出するための光学系のみを必要とする。
【００７８】
蛍光寿命計測は、溶媒緩和を見るのに適した計測法である。蛍光分子の蛍光寿命はその蛍光分子の周りの溶媒環境に影響される。蛍光分子が他の分子と相互作用して結合したり、もしくは相互作用によって分子の高次構造が変化すると、その蛍光分子の周囲の環境が親水的な状態から疎水的な状態に変化する。このような蛍光分子の局所的な溶媒環境の変化によってその蛍光分子の蛍光寿命が変化する。
【００７９】
たとえば、細胞内の蛍光標識分子が他の分子と相互作用したり、細胞内で何かの刺激によって目的の分子が活性化され蛍光分子が細胞質から細胞膜やオルガネラの膜内に入りこんだり、蛍光分子の構造そのものが変化したりすると、蛍光分子の周りの環境（極性）が変化することがある。
【００８０】
蛍光分子の蛍光寿命の計測はこのような知見を得るには重要な計測法である。また、蛍光寿命計測は、蛍光分子の励起をごく短いパルス光を用いて行なうため、励起光による細胞へのダメージも少なくすることが可能である。
【００８１】
また試料を蛍光標識することができない場合には、散乱計測を行なう方法もある。これは分子に光を照射しその散乱光を観測することで、分子の大きさを知る方法である。散乱計測は、目的の分子を標識することなく観測するので、たとえば蛍光分子によって目的の分子の活性が失われたり、活性に変化が起こったりする危険がない。目的の分子が他の分子と相互作用すると分子の大きさが変化する（この場合は大きくなる）。分子の大きさの変化に伴い散乱が変化する。この変化を観測することによって、分子の相互作用や分子の分解などを見ることができるのである。
【００８２】
散乱計測によって分子の他の分子との相互作用の検出や分解の検出を行なうことができる。また細胞内にあらかじめラテックスや金粒子を注入しておき、細胞からの開口放出や抱食などの減少について細胞質内での局在や拡散などを見ることが可能である。また、ラテックスや金、銀、その他の誘電体粒子を、蛍光物質の変わりに種々の物質に標識して、照明光を照射し、散乱光により検出を行うこともできる。これらの計測方法の場合は蛍光標識を行なわないので、毒性がない、粒子を用いる場合でも金を用いれば毒性に関しては問題ない。また蛍光退色の影響もないので細胞の動きを長時間観測する場合には有利である。さらに、励起波長を選ばないので、細胞へのダメージの少ない波長を用いて計測することができ、他の蛍光標識分子を用いる場合はそれと同様の波長を用いて計測することが可能である。
【００８３】
燐光検出の場合は分子が光を発する時間が蛍光よりも長い（10−4 〜10秒）。そのため、燐光観測には蛍光分子を励起する励起光を遮断しておく必要がある。この場合はレーザ光のシャッターを用い蛍光分子を励起する時は観測せず、分子を励起後シャッターを閉じる制御装置を用い計測を行なえば良い。
【００８４】
なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】第１の実施の形態に係る分子間相互作用計測装置の構成を示す図。
【図２】測定部の構成を示す斜視図。
【図３】分子間相互作用計測装置における、溶液の供給、排出、洗浄及び混合機能を説明するためのブロック図。
【図４】調整に用いる溶液を示す図。
【図５】溶液の調整シーケンスを示す図。
【図６】調整した反応溶液Ａと反応溶液Ｂの組み合わせを示す図。
【図７】計測結果を示す図。
【図８】調整した溶液の組み合わせを示す図。
【図９】測定結果を示す図。
【図１０】測定結果を示す図。
【符号の説明】
【００８６】
１…分子間相互作用計測装置、２…１分子蛍光分析装置、３…インジェクション装置、４…制御装置、６…溶液容器、７…排出容器、１０…測定チャンバ、１１…溶液受入部、１２…溶液排出部、１３…対物レンズ、１４…測定容器、１５…積載部、１６…超音波振動子、１８…温度調節機構、２１…三方弁。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器に収容された試料から発せられる光を測定し、試料の物理的、あるいは化学的な性質を測定する測定装置において、
試験サンプル、試薬、洗浄液の少なくとも１つの溶液をそれぞれ供給する溶液供給手段を有することを特徴とする分子間相互作用計測装置。
【請求項２】
供給した少なくとも１つの溶液を攪拌する攪拌手段をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項３】
供給された溶液の温度を制御する温度制御手段を更に有することを特徴とする請求項１または２に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項４】
供給された溶液を排出する溶液排出手段をさらに具備していることを特徴とする請求項１または２に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項５】
供給された溶液を保持する保持手段と、前記保持手段を洗浄する洗浄手段と、前記溶液に光を集光する集光手段とを更に有し、前記保持手段に前記集光手段が接続されていることを特徴とする請求項４に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項６】
前記溶液排出手段の排出動作は、コンピュータによって制御されることを特徴とする請求項５に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項７】
前記コンピュータは、入力された一連の測定条件に基づいて、分子間相互作用計測装置の動作を制御することを特徴とする請求項６に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項８】
手動で前記溶液を注入できる手動注入手段を具備することを特徴とする請求項１に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の装置を用いて、分子間における相互作用を計測する方法において、
複数の試料と、当該複数の試料の各々の分子と結合または前記分子を分解することができる少なくとも１つの物質とを順次混合して、複数の試験混合物を作成する工程と、
前記少なくとも１つの物質と前記分子との結合及び分解状態を測定する工程と
を備えたことを特徴とする分子間相互作用計測方法。
【請求項１０】
前記試料は、核酸、ペプチド、酵素基質からなる群から選ばれた少なくとも１つの物質を蛍光標識したものであり、
前記物質は、タンパク質、抗体、ペプチド、核酸からなる群から選ばれること
を特徴とする請求項９に記載の分子間相互作用計測方法。
【請求項１】
容器に収容された試料から発せられる光を測定し、試料の物理的、あるいは化学的な性質を測定する測定装置において、
試験サンプル、試薬、洗浄液の少なくとも１つの溶液をそれぞれ供給する溶液供給手段を有することを特徴とする分子間相互作用計測装置。
【請求項２】
供給した少なくとも１つの溶液を攪拌する攪拌手段をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項３】
供給された溶液の温度を制御する温度制御手段を更に有することを特徴とする請求項１または２に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項４】
供給された溶液を排出する溶液排出手段をさらに具備していることを特徴とする請求項１または２に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項５】
供給された溶液を保持する保持手段と、前記保持手段を洗浄する洗浄手段と、前記溶液に光を集光する集光手段とを更に有し、前記保持手段に前記集光手段が接続されていることを特徴とする請求項４に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項６】
前記溶液排出手段の排出動作は、コンピュータによって制御されることを特徴とする請求項５に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項７】
前記コンピュータは、入力された一連の測定条件に基づいて、分子間相互作用計測装置の動作を制御することを特徴とする請求項６に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項８】
手動で前記溶液を注入できる手動注入手段を具備することを特徴とする請求項１に記載の分子間相互作用計測装置。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の装置を用いて、分子間における相互作用を計測する方法において、
複数の試料と、当該複数の試料の各々の分子と結合または前記分子を分解することができる少なくとも１つの物質とを順次混合して、複数の試験混合物を作成する工程と、
前記少なくとも１つの物質と前記分子との結合及び分解状態を測定する工程と
を備えたことを特徴とする分子間相互作用計測方法。
【請求項１０】
前記試料は、核酸、ペプチド、酵素基質からなる群から選ばれた少なくとも１つの物質を蛍光標識したものであり、
前記物質は、タンパク質、抗体、ペプチド、核酸からなる群から選ばれること
を特徴とする請求項９に記載の分子間相互作用計測方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−１０５８１９（Ｐ２００６−１０５８１９Ａ）
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２９３８９３（Ｐ２００４−２９３８９３）
【出願日】平成１６年１０月６日（２００４．１０．６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年４月２０日（２００６．４．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月６日（２００４．１０．６）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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