分析対象の検出のための生物学的アッセイの改良
【課題】従来の方法に比較してシグナルのバックグラウンドが有意に低下した、試料中の分析対象を検出するための蛍光に基づく方法であり、核酸を金属または半金属表面に効率的に結合させる方法を提供する。
【解決手段】試料に接触する反射表面を提供し、ここで分析対象は試料中に存在する場合、蛍光色素で標識されており；蛍光色素を励起させる波長の光を表面に照射し；そして、試料中の分析対象の存在の指標として表面から生じる蛍光放射光を検出する、ことを含んでなる上記方法、及び、金属または半金属表面に核酸を結合させる方法であって、核酸を含有する溶液を提供し；溶液中で核酸を変性させ；溶液を金属または半金属表面に適用し；そして、溶液を表面上で乾燥させることにより核酸を表面に結合させる、ことを含んでなる上記方法。
【解決手段】試料に接触する反射表面を提供し、ここで分析対象は試料中に存在する場合、蛍光色素で標識されており；蛍光色素を励起させる波長の光を表面に照射し；そして、試料中の分析対象の存在の指標として表面から生じる蛍光放射光を検出する、ことを含んでなる上記方法、及び、金属または半金属表面に核酸を結合させる方法であって、核酸を含有する溶液を提供し；溶液中で核酸を変性させ；溶液を金属または半金属表面に適用し；そして、溶液を表面上で乾燥させることにより核酸を表面に結合させる、ことを含んでなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分析対象をアッセイする生物学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に分析対象の検出のための生物学的アッセイは、分析対象（例えば、核酸、タンパク質、ホルモン、脂質、または細胞）へのシグナル生成部分の付加を含む。蛍光に基づくバイオアッセイでは微弱な蛍光シグナルの検出が必要とされる。典型的なアッセイでは、分析対象をスライドガラスやガラスチップのような固体基体上に付着させる。生化学的処理および蛍光染色を行った後、スライドを蛍光顕微鏡のような光学機器で分析する。一定の波長の光をスライドに適用し、付着させた生体物質から生じる蛍光放射光をシグナルとして収集する。
【０００３】
透明ソーダ石灰およびホウケイ酸ガラスは、蛍光で標識した試料を保持する基体として一般に使用される。しかしながら、これらの物質の多くは有意な自己蛍光を示し、測定可能な吸光度を有し、可視領域にわたって蛍光放射光を生じる。典型的なソーダ石灰スライドガラスは、一般に使用される蛍光色素の層に相当する、１ｘ１０9蛍光体／ｃｍ2より高い表面密度のバックグラウンド蛍光を生じる。拡散光、レイリー散乱、およびラマン散乱のような他の起源から生じるノイズを伴うこのバックグラウンド蛍光は、分析対象から生じる微弱な蛍光シグナルの検出を不明瞭とし、アッセイの感度を限定する。
【０００４】
更に、核酸検出のための多くの蛍光アッセイでは、化学リンカーを介して核酸を固相支持体に結合させる。それらのリンカーはしばしば自己蛍光を有し、バックグラウンド蛍光を生成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は生物学的アッセイの向上を特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ある観点では、本発明は、従来のアッセイに比較してシグナルのバックグラウンドが有意に低下した蛍光に基づくアッセイを特徴とする。これらのアッセイは以下の段階を含む：（i）分析対象（例えばタンパク質、核酸、多糖類、脂質、または細胞）を含有する試料と接触する表面を有する不透明ガラス支持体を提供し、ここで分析対象は試料中に存在する場合、蛍光色素で標識されており；（ii）蛍光色素を励起する波長の光を表面に照射し；そして（iii）試料中の化合物の存在の指標として表面から生じる蛍光放射光を検出する。ここで使用するところの“不透明ガラス支持体”とは、アッセイに使用される蛍光色素の励起光および放射光を透過しないガラス支持体をいう。
【０００７】
上記のアッセイにおいて、不透明ガラス支持体の代わりに反射表面を使用することができる。“反射表面”とは、入射光を表面に垂直に照射した場合、表面が入射光の少なくとも約１５％（例えば少なくとも２５％、５０％、７５％、または９０％）を反射し、２０％未満（例えば１０％、５％、または１％未満）の光を透過することをいう。反射表面を使用するアッセイでは、励起光をある角度で、すなわち垂直ではなく表面に照射することができる。例えば、反射表面は金属（例えばクロムまたはアルミニウム）表面、または半金属（例えばシリコン）表面であってもよい。
【０００８】
本発明の蛍光アッセイでは、分析対象と特異的に結合し、表面に固定化された捕獲プローブを介して、分析対象を表面に結合させることができる。
別の観点では、本発明は、核酸を金属または半金属表面に効率的に結合させる方法を特徴とする。これらの方法は以下の段階を含む：（i）所望の核酸を含有する溶液を提供し；（ii）溶液中で核酸を変性させ；（iii）金属（例えばクロムまたはアルミニウム）または半金属（例えばシリコン）表面に溶液を適用し；そして（）溶液を表面上で乾燥させることにより核酸を表面に結合させる。これらの方法では、ｐＨが少なくとも約１１であるアルカリ溶液（例えばＮａＯＨ溶液）中で、または核酸を変性させるに十分な温度および時間で加熱することにより、核酸を変性させることができる。必要により顕微鏡用固定媒体、例えばＧｅｌ／ＭｏｕｎｔTM（Biomeda社、Foster City、CA）を金属または半金属表面に適用して、表面への核酸の結合を向上させることができる。
【０００９】
別に定義しない限り、ここで使用する技術的および科学的用語は全て、本発明の属する分野で当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。代表的な方法および物質を以下に記載するが、ここに記載するものと同様または同等の方法および物質を本発明の実施または試験に使用することができる。ここに記載する全ての出版物および他の参考文献は、その全体を本明細書の一部としてここに引用する。矛盾が生じる場合は、定義を含み、本明細書が優先する。物質、方法、および実施例は単に例証であり、制限を意図するものではない。
【００１０】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および上記の特許請求の範囲から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、分析対象であるＤＮＡの支持体としてクロムでコーティングしたソーダ石灰スライドガラスを使用した蛍光アッセイを示す図式である。
【図２】図２は、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM（耐久水性固定媒体（permanent aqueous mounting medium）。Biomeda社（Foster City、CA）製）による処理でクロムチップへのＤＮＡ、特に短鎖ＤＮＡの結合が向上することを示すグラフである。Ｙ軸は、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMで処理したＤＮＡスポットから生じるシグナルと、２ＸＳＳＣで処理した対照ＤＮＡスポットから生じるシグナルの比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は（i）バックグラウンド蛍光が従来の方法に比較して有意に低下した改良型蛍光バイオアッセイ法、および（ii）固相支持体に核酸を結合させるための改良法を特徴とする。
【００１３】
蛍光バックグラウンドを低下させる方法
蛍光標識が吸収および放射する波長領域において不透明な基体（例えば黒色ガラス）上で、蛍光で標識した分析対象を検出する。基体の不透明性により、基体内への励起光の透過、および反射する蛍光が実質的に低下する。基体内部からのレイリーおよびラマン散乱も防止されるであろう。更に、基体の側面および裏面上の汚染および粉塵は実際のシグナルより強度のかなり高いバックグラウンドを生じうるが、これらは検出されない。基体下部からの拡散光由来のバックグラウンドも低下または除去される。従って、この種の基体からのバックグラウンドノイズは、従来の基体（例えばソーダ石灰ガラス）から生じるものより有意に低い。
【００１４】
基体は蛍光を有しないか、または低度の自己蛍光を有するのが好ましい。基体物質の化学的および物理的特性もアッセイに適合したものであるべきである。好適な物質には、着色または不透明ガラス、および不透明のプラスチック系の物質があるが、それらに限定されるものではない。代表的な着色ガラスは、Ｓｃｈｏｔｔ Ｍ−ＵＧ−２、Ｍ−ＵＧ−６、ＵＧ−１、ＵＧ−１１、ＮＤ、ＲＧ７１５、ＲＧ９、ＲＧ７８０、ＮＤ−１、およびＮＤ−１０（ドイツ）；そしてＣｏｒｎｉｎｇ ２０３０、２５４０、２５５０、２６００、５８４０、５８６０、５８７４、および９８６３である。基体はスライド、ウェーハー、またはチップのような形態にすることができる。
【００１５】
あるいはまた、基体の分析対象を受容する側の表面は反射性のものであり、例えば半金属もしくは金属の薄いフィルムでコーティングした固相支持体の表面、または金属もしくは半金属プレートの光沢表面であってもよい。基体が励起光および放射光を透過する場合でも、反射表面は励起光および蛍光放射光を基体に透過させない。適当な角度で表面を照射することにより、励起光は収集レンズ（collection optics）から逸れて反射し、収集レンズからの自己蛍光が除去される；従って、より効率の低いフィルターを使用して自己蛍光を吸収させることができる。
【００１６】
コーティング物質の化学的および物理的性質がアッセイに適合し、分析対象が効率的に結合される限り、種々の反射コーティングを使用することができる。好適な基体には、例えばNanofilm社（Westlake Village、CA）製のクロムでコーティングされたガラスのような、ガラスリトグラフィーで使用されるコーティングされたガラス物質があるが、それに限定されるものではない。
【００１７】
図１は、従来のスライドガラスの形状で、薄いクロムフィルム２でコーティングした平滑な表面を有する基体１を示す。蛍光標識したＤＮＡフラグメント３を無作為に、または位置を特定できるように（addressably）配列させて表面上に付着させる。付着させた分子を生化学的に処理した後、必要により、適当なｐＨを提供する液体媒体５をスライド上に適用し、薄いカバーガラス６で被覆する。液体媒体は必要により、蛍光色素の酸化を防止する組成物である抗退色剤を含有することができる。代表的な抗退色剤は、Aldrich Chem.Co.（Milwaukee、WI）製のｐ−フェニレンジアミンである。また液体媒体は、例えば４’，６−ジアミジノ−２−フィルインドール（“ＤＡＰＩ”）のような対比染色剤を含有することができる。次いで、励起光をスライドのクロムコーティング面に照射する蛍光イメージングシステムでスライドを分析する。蛍光放射光の収集レンズ４を、照射する表面のすぐ上に、コーティングした表面に垂直な光学軸で配する。そのような配置により収集レンズへ蛍光が反射し、レンズで検出される蛍光シグナル強度が約二倍になる。励起光をある角度で適用し、反射光が収集レンズに入らないようにする。また、ミラー７を使用して励起光の強度を向上することもできる。
【００１８】
この新規方法は、蛍光イムノアッセイ、蛍光インサイチオハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション（“ＣＧＨ”）、ゲノセンサー系（genosensor-based）ＣＧＨ（“ｇＣＧＨ”；例えばKallioniemiら，Science，258：818-821，1992を参照すること）、分子芝（molecular lawn）（米国特許出願第08/768,177号および08/991,675号を参照すること）、または一般的なＤＮＡチップを使用するアッセイ（例えば米国特許第5,445,934号、5,510,270号、および5,556,752号を参照すること）のような種々の蛍光アッセイに使用することができる。
【００１９】
十分確立された方法を使用して、分析対象核酸または分析対象核酸に特異的な捕獲プローブを、ガラスまたは金属でコーティングした表面に結合させることができる。例えばJoosら，Analytical Biochemistry，247：96-101，1997；Maskosら，Nucleic Acids Research，20：1679-1684，1992；Fodorら，Science，251：767-773，1991；Lowe，Chemical Society Reviews，24：309-317，1995；Guoら，Nucleic Acids Research，22：5646-5465，1994；そしてBischoff，Analytical Biochemistry，164：336-344，1987を参照されたい。ガラス表面に使用できる結合方法はシリコン基体にも使用できる。これを行うためには、シリコン基体を加熱して表面層を酸化し、表面にスライドガラスと同様の化学的性質をもたせる。
【００２０】
核酸を金属表面に結合させるために、第一のシラン化合物（例えばGelestのWAS 7021（Tullytown，PA））、次いで第二のシラン化合物（例えば（３−グリシドオキシプロピル）−トリメトキシシラン）で表面を処理することができる。第一のシランコーティングは金属表面に結合し、第二のシランコーティングは、好適に修飾された核酸（例えばアミノ化した核酸）を結合させるための反応基（例えばエポキシ基）を供する。好ましくは、これら二つのシランコーティングは、最も頻繁に使用される波長領域で透過性である。
【００２１】
分析対象タンパク質（例えば細胞表面タンパク質）を多くの標準的な方法のいずれかによって固相支持体に結合させることができるが、それらの方法には直接吸着、または表面上の反応基との化学結合がある。例えば、固相表面を誘導化して活性アミン基を生成し；次いでアミン−およびスルフヒドリル−反応性ヘテロ２官能基クロスリンカー（例えばスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、または他のPierce（Rockford、IL）製 ＤＯＵＢＬＥ−ＡＧＥＮＴTMクロスリンカー）を使用して、ポリペプチド中の遊離のシステイン基を固相表面上のアミノ基に結合させることができる。ホモ２官能基クロスリンカーも同様に使用することができる。
【００２２】
分析対象は、蛍光色素（例えばフルオレセイン、フィコエリトリン、テキサスレッド、またはアロフィコシアニン）または蛍光反応を触媒する酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）のような検出可能な標識成分に（直接または間接的に）共有または非共有結合させることができる。一例として、分析対象核酸を蛍光色素に結合させたプローブで標識してもよい；またホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた特定の抗体で抗原を標識することができる。
【００２３】
以下に記載する実験は、新規蛍光バイオアッセイ法の実施態様のいくつかを例証する。
蛍光で標識された化合物から放射されるシグナルの定量は、Vysis，Inc.（Downers Grove、IL）で開発された広域蛍光イメージングシステムを使用して実施した。イメージングシステムは、４５０Ｗ キセノンアークランプ（SLM Instruments Inc.、Champaign Urbana、IL）、電荷結合素子検出器（ＣＨ２００、Photometrics、Tucson、AR）、および通常使用される３つの蛍光色素−−青にＤＡＰＩ、緑にフルオレセインイソチオシアネート（“ＦＩＴＣ”）、および赤にテキサスレッド（“ＴＲＥＤ”）用のフィルターセット（Chroma Technology、Brattleboro、VT）からなる。イメージングシステムは、Ｐｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ７１００／８０で、イメージング取り込み（acquisition）／分析ソフトウェア（IpLab、Signal Analytics，Corp.、Vienna、VA）を使用して制御した。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
表１は、一般的に使用されるソーダ石灰スライドガラス（VWR Scientific Products、West Chester、PA）に対する未処理の物質の相対バックグラウンド蛍光を表す。相対バックグラウンド蛍光には光散乱、拡散光、およびフィルターの瑕疵（imperfection）からの寄与があるが、電子ノイズは全て控除した。結果は、黒色ガラススライドおよび金属でコーティングしたスライドでは、バックグラウンドが溶融シリカに対してそれぞれ４倍および１０倍減少することを示した。
【００２６】
別の実験で、フルオレセインコンジュゲートビーズ（Flow Cytometry Standards Corp.、Hata Rey、PR）を一般に使用される抗退色媒体（カタログ番号824-28、Flow Cytometry Standards Corp.）と混合し、スライドとカバーガラスの間に挟んで、蛍光強度を測定した。イメージの定量分析により、Ｃｒ−コーティングスライドの総バックグラウンドは通常のガラスのわずか２１％であることが明らかとなった。総バックグラウンドには光散乱、拡散光、およびフィルターの瑕疵だけでなく、固定媒体およびカバーガラスからの自己蛍光も含まれる。特に、正味のシグナル強度は２倍であり、これは入射光が反射して蛍光体を２度通過し、また、反射した蛍光は検出（detection optics）に入らないからである。
【００２７】
別の実験から、新規蛍光アッセイ法を使用してＤＮＡ複合体分析対象を検出できることが示された。この実験では、表１に示すスライド物質をゲノセンサー系比較ゲノムハイブリダイゼーション（“ｇＣＧＨ”）のアレイ支持体（すなわちチップ）として使用した。ｇＣＧＨの技術は標準的なＣＧＨを改良して開発されたものであり、試料組織由来のＤＮＡを１つの蛍光体（例えばＴＲＥＤ）で標識し、別の蛍光体（例えばＦＩＴＣ）で標識した等量の参照ＤＮＡと混合し、次いでスライドガラスに付着させた分裂中期染色体と共ハイブリダイズさせる。ｇＣＧＨでは、中期染色体の代わりに、アレイ形式でチップ表面に固定化されたクローン化ＤＮＡフラグメントを使用する。ハイブリダイゼーションの後、標的のスポットを洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色して全てのＤＮＡを青色に染色する。次いでスライドを多色蛍光イメージングシステムで分析する。イメージ分析ソフトウェアを用いてＤＡＰＩの蛍光によって標的スポットの存在を測定し、次いで赤色と緑色の蛍光の比率を測定して試料と対照ＤＮＡのハイブリダイゼーションの相対量を測定する。
【００２８】
Ｃｒ−コーティングスライドガラスはNanofilm社製のＣｒ−コーティングガラスで作成した。以下の段階を実施してＤＮＡを結合させるための金属表面を調製した。これらの段階はまた、Ａｌ−コーティング表面のような他の金属表面にも適用できる。要約すれば、金属表面をシレスキオキサン（silesquioxane）オリゴマー（Gelest，Inc.）の２％水溶液で、室温で１０分間処理し、水で洗浄した。次いで、グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（“ＧＰＴＳ”；Gelest，Inc.）の５％水溶液を用いて、室温で２時間、シラン処理をした。その後第１級アミンをエポキシ基と反応させて、処理した表面にアミノ化したＤＮＡを結合させた。
【００２９】
標準的な条件下でＣＯＬＯ ３２０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”）＃ＣＣＬ−２２０）またはＨＴＢ−１８（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１８）細胞から抽出したＤＮＡを実験に使用した。ハイブリダイゼーション混合液２０μｌ中に、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄで標識したヒト参照ＤＮＡ（すなわちヒト血液ＤＮＡ）プローブ２００ｎｇ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎで標識した被験ＤＮＡプローブ（ＣＯＬＯ３２０またはＨＴＢ−１８細胞由来）２００ｎｇ、２Ｘ ＳＳＣ、１０％ 硫酸デキストラン、１μｇ／μｌ Ｃｏｔ１ ＤＮＡ、１μｇ／μｌ サケ精子ＤＮＡ、および５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液を含有させた。混合液を３７℃で４時間インキュベートした後、標的ＤＮＡを固定化させておいたチップに添加した。
【００３０】
チップ上でのハイブリダイゼーションは３７℃で一晩実施した。２Ｘ ＳＳＣを用いて室温で５分間、２Ｘ ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを用いて４０℃で３０分間、更にその後、２Ｘ ＳＳＣを用いて室温で１０分間、チップを洗浄した。次いで、チップを暗所において室温で乾燥した。イメージングに先立ち、１０μｌのＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMをチップ上のアレイ部分に配し、次にこれをカバーガラスで被覆した。積算時間２０秒でクロムチップをイメージングした。比較のために、標準的なエポキシシラン化学を経てＤＮＡをソーダ石灰ガラスチップ（すなわちスライドガラス）に結合させ、同一条件下でハイブリダイズさせた；そしてガラスチップを１０秒間イメージングした。結果は、Ｃｒ−コーティングスライドでは総バックグラウンドが４倍より多く減少することを示した。暗色ガラススライド、シリコンスライド、およびＡｌ−コーティングスライドでも同様の結果が得られた。
【００３１】
Ｃｒ−コーティング表面を使用する利点は、適当なハイブリダイゼーション溶液であれば、クロムの疎水性により、チップ表面から未結合のプローブを除去するのが非常に容易なことである。適当なハイブリダイゼーション溶液は、クロム表面の疎水性を変化させうる界面活性剤を含有しないものであればよい。結果として、プローブの非特異的結合による蛍光バックグラウンドは減少するか、あるいは除去されることさえある。非特異的結合が減少することにより特異的結合に利用可能なプローブが増加するため、ハイブリダイゼーションの効率も向上しうる。
【００３２】
基体への核酸の結合方法
本発明は、核酸を固相表面に結合させるための迅速で非常に簡便な方法を提供する。新規結合法では、核酸を基体表面、例えば金属または半金属表面に非共有結合させる。これを行うためには、変性させた核酸を含有する溶液を基体に適用し、室温またはオーブンで乾燥させる。溶液のｐＨを約１１．０以上に上げることにより核酸を変性させることができる。種々のアルカリ物質、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨなどのようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物を使用して溶液を高ｐＨにすることができる。
【００３３】
あるいはまた、加熱により、例えば核酸を含有する溶液を９５℃以上で２〜５分間加熱することにより、核酸を変性させることができる。次いで、変性させた核酸を含有する溶液を金属または半金属表面に適用して乾燥させる。
【００３４】
変性した一本鎖核酸に存在する静電力は、一般に基体へ効率的に結合するのに十分であると考えられる。上記の方法は長鎖ポリヌクレオチド（例えば約５５０ヌクレオチド（“ｎｔ”）より長いもの）について特に良く機能する。
【００３５】
約５５０ｎｔより短いポリヌクレオチドの結合を向上するために、基体表面にスポットした核酸を、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMまたはＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM均等物のような顕微鏡用固定媒体で処理することができる。特定の理論に拘束されることは望まないが、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMはポリマー分子を含有しており、容量排出剤（volume displacement reagent）として作用し、基体表面に核酸をより近接させると考えられる。あるいはまた、この固定剤は核酸を互いにより接近させ、それによって基体表面に直接結合していない核酸を捕捉する核酸のネットワークの形成を促進するのかもしれない。核酸に対して同様の効果を有する試薬のいずれも使用できる。
【００３６】
従来の核酸の結合法では、ほとんどの化学リンカーが自己蛍光を有するため、バックグラウンド蛍光が生成されることが知られている。新規結合法では、そのようなリンカーを使用しないことによりこの問題を回避する。
【００３７】
一つの実施例では、水または１００ｍＭ ＮａＯＨに溶解した０．９μｇ／μｌの未修飾かつ未消化のプラスミドＤＮＡ（６ｋｂ）を未処理のＣｒ−コーティングチップ上に手作業でスポットして乾燥した。２Ｘ ＳＳＣで洗浄した後、ＤＮＡをＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM／ＤＡＰＩで染色し、ＤＡＰＩの蛍光シグナルを測定した。結果は、未変性のＤＮＡ、すなわち水に溶解したＤＮＡのスポットは洗い出され；これに対し、変性したＤＮＡ、すなわちＮａＯＨ処理したＤＮＡのスポットは十分結合し、ＮａＯＨ変性条件下で生成した４９ｋｂの長さのラムダＤＮＡのスポットと同様のＤＡＰＩ強度であることを示した。ニックトランスレーション処理をしたプラスミドプローブを使用し、標準的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、結合させたＤＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションが観察された。
【００３８】
上記のアルカリ法が短鎖ＤＮＡ分子にも十分機能するかどうかを試験するために、平均約５００ｎｔの長さである、ＮａＯＨで処理して超音波処理をしたラムダＤＮＡを、ここに記載したようにＣｒ−コーティングチップにスポットした。２Ｘ ＳＳＣで洗浄した後、スポットしたＤＮＡをＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM／ＤＡＰＩで染色し、蛍光シグナルを測定した。結果は、ＤＮＡが洗浄後もなおチップに結合したままであることを示した。
【００３９】
これらの結果は、新規方法によって得られるＤＮＡのＣｒ−またはＡｌ−コーティング表面への結合が、従来の共有結合法によって得られる結合と同程度に過酷なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に耐えることを示している。
【００４０】
別の実施例で、ＤＮＡの結合およびハイブリダイゼーションに対するＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理の効果を試験した。超音波処理した種々の長さ（すなわち、それぞれ４８ｋｂ、２．５ｋｂ、９００ｎｔ、５５０ｎｔ、４００ｎｔ、および３００ｎｔ）のラムダＤＮＡをこの実験に使用した。
【００４１】
超音波処理したＤＮＡを１００ｍＭ ＮａＯＨに懸濁して上記のように未処理のクロムチップに結合させた。次いで１５μｌのＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMをＤＮＡチップに添加し、室温で１時間インキュベートした。チップを２Ｘ ＳＳＣで洗浄し、ＤＡＰＩで染色した。図２に示すデータは、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理によりクロムチップへのＤＮＡ、特に短鎖ＤＮＡ（例えば約３００〜４００ｎｔの長さ）の結合が有意に向上することを示している。例えば、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理した３００ｎｔのスポットからの青色ＤＡＰＩシグナルは、相当するＳＳＣ−処理スポットから生じるものより７倍高いことが見出された。
【００４２】
ハイブリダイゼーションに対するＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMの効果を試験するために、ＤＮＡチップをＳｐｅｃｔｒｕｍ ｇｒｅｅｎで標識したラムダＤＮＡ２０ｎｇおよびＳｐｅｃｔｒｕｍ ｒｅｄで標識したラムダＤＮＡ２０ｎｇと共にインキュベートした。３００ｎｔまたは４００ｎｔの長さの標的ＤＮＡを含むスポットについて、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理チップの蛍光シグナルは未処理のチップのものより４〜７倍高かった。
【００４３】
他の態様
本発明について、その詳細な説明と関連して記載してきたが、上記の説明は例証を意図するものであり、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を制限するものではない。
【００４４】
他の観点、利点、および変更は下記の特許請求の範囲内のものである。
【符号の説明】
【００４５】
１ 基体
２ クロムフィルム
３ ＤＮＡフラグメント
４ 収集レンズ
５ 液体媒体
６ カバーガラス
７ ミラー
【技術分野】
【０００１】
本発明は分析対象をアッセイする生物学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に分析対象の検出のための生物学的アッセイは、分析対象（例えば、核酸、タンパク質、ホルモン、脂質、または細胞）へのシグナル生成部分の付加を含む。蛍光に基づくバイオアッセイでは微弱な蛍光シグナルの検出が必要とされる。典型的なアッセイでは、分析対象をスライドガラスやガラスチップのような固体基体上に付着させる。生化学的処理および蛍光染色を行った後、スライドを蛍光顕微鏡のような光学機器で分析する。一定の波長の光をスライドに適用し、付着させた生体物質から生じる蛍光放射光をシグナルとして収集する。
【０００３】
透明ソーダ石灰およびホウケイ酸ガラスは、蛍光で標識した試料を保持する基体として一般に使用される。しかしながら、これらの物質の多くは有意な自己蛍光を示し、測定可能な吸光度を有し、可視領域にわたって蛍光放射光を生じる。典型的なソーダ石灰スライドガラスは、一般に使用される蛍光色素の層に相当する、１ｘ１０9蛍光体／ｃｍ2より高い表面密度のバックグラウンド蛍光を生じる。拡散光、レイリー散乱、およびラマン散乱のような他の起源から生じるノイズを伴うこのバックグラウンド蛍光は、分析対象から生じる微弱な蛍光シグナルの検出を不明瞭とし、アッセイの感度を限定する。
【０００４】
更に、核酸検出のための多くの蛍光アッセイでは、化学リンカーを介して核酸を固相支持体に結合させる。それらのリンカーはしばしば自己蛍光を有し、バックグラウンド蛍光を生成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は生物学的アッセイの向上を特徴とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ある観点では、本発明は、従来のアッセイに比較してシグナルのバックグラウンドが有意に低下した蛍光に基づくアッセイを特徴とする。これらのアッセイは以下の段階を含む：（i）分析対象（例えばタンパク質、核酸、多糖類、脂質、または細胞）を含有する試料と接触する表面を有する不透明ガラス支持体を提供し、ここで分析対象は試料中に存在する場合、蛍光色素で標識されており；（ii）蛍光色素を励起する波長の光を表面に照射し；そして（iii）試料中の化合物の存在の指標として表面から生じる蛍光放射光を検出する。ここで使用するところの“不透明ガラス支持体”とは、アッセイに使用される蛍光色素の励起光および放射光を透過しないガラス支持体をいう。
【０００７】
上記のアッセイにおいて、不透明ガラス支持体の代わりに反射表面を使用することができる。“反射表面”とは、入射光を表面に垂直に照射した場合、表面が入射光の少なくとも約１５％（例えば少なくとも２５％、５０％、７５％、または９０％）を反射し、２０％未満（例えば１０％、５％、または１％未満）の光を透過することをいう。反射表面を使用するアッセイでは、励起光をある角度で、すなわち垂直ではなく表面に照射することができる。例えば、反射表面は金属（例えばクロムまたはアルミニウム）表面、または半金属（例えばシリコン）表面であってもよい。
【０００８】
本発明の蛍光アッセイでは、分析対象と特異的に結合し、表面に固定化された捕獲プローブを介して、分析対象を表面に結合させることができる。
別の観点では、本発明は、核酸を金属または半金属表面に効率的に結合させる方法を特徴とする。これらの方法は以下の段階を含む：（i）所望の核酸を含有する溶液を提供し；（ii）溶液中で核酸を変性させ；（iii）金属（例えばクロムまたはアルミニウム）または半金属（例えばシリコン）表面に溶液を適用し；そして（）溶液を表面上で乾燥させることにより核酸を表面に結合させる。これらの方法では、ｐＨが少なくとも約１１であるアルカリ溶液（例えばＮａＯＨ溶液）中で、または核酸を変性させるに十分な温度および時間で加熱することにより、核酸を変性させることができる。必要により顕微鏡用固定媒体、例えばＧｅｌ／ＭｏｕｎｔTM（Biomeda社、Foster City、CA）を金属または半金属表面に適用して、表面への核酸の結合を向上させることができる。
【０００９】
別に定義しない限り、ここで使用する技術的および科学的用語は全て、本発明の属する分野で当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。代表的な方法および物質を以下に記載するが、ここに記載するものと同様または同等の方法および物質を本発明の実施または試験に使用することができる。ここに記載する全ての出版物および他の参考文献は、その全体を本明細書の一部としてここに引用する。矛盾が生じる場合は、定義を含み、本明細書が優先する。物質、方法、および実施例は単に例証であり、制限を意図するものではない。
【００１０】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および上記の特許請求の範囲から明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、分析対象であるＤＮＡの支持体としてクロムでコーティングしたソーダ石灰スライドガラスを使用した蛍光アッセイを示す図式である。
【図２】図２は、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM（耐久水性固定媒体（permanent aqueous mounting medium）。Biomeda社（Foster City、CA）製）による処理でクロムチップへのＤＮＡ、特に短鎖ＤＮＡの結合が向上することを示すグラフである。Ｙ軸は、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMで処理したＤＮＡスポットから生じるシグナルと、２ＸＳＳＣで処理した対照ＤＮＡスポットから生じるシグナルの比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は（i）バックグラウンド蛍光が従来の方法に比較して有意に低下した改良型蛍光バイオアッセイ法、および（ii）固相支持体に核酸を結合させるための改良法を特徴とする。
【００１３】
蛍光バックグラウンドを低下させる方法
蛍光標識が吸収および放射する波長領域において不透明な基体（例えば黒色ガラス）上で、蛍光で標識した分析対象を検出する。基体の不透明性により、基体内への励起光の透過、および反射する蛍光が実質的に低下する。基体内部からのレイリーおよびラマン散乱も防止されるであろう。更に、基体の側面および裏面上の汚染および粉塵は実際のシグナルより強度のかなり高いバックグラウンドを生じうるが、これらは検出されない。基体下部からの拡散光由来のバックグラウンドも低下または除去される。従って、この種の基体からのバックグラウンドノイズは、従来の基体（例えばソーダ石灰ガラス）から生じるものより有意に低い。
【００１４】
基体は蛍光を有しないか、または低度の自己蛍光を有するのが好ましい。基体物質の化学的および物理的特性もアッセイに適合したものであるべきである。好適な物質には、着色または不透明ガラス、および不透明のプラスチック系の物質があるが、それらに限定されるものではない。代表的な着色ガラスは、Ｓｃｈｏｔｔ Ｍ−ＵＧ−２、Ｍ−ＵＧ−６、ＵＧ−１、ＵＧ−１１、ＮＤ、ＲＧ７１５、ＲＧ９、ＲＧ７８０、ＮＤ−１、およびＮＤ−１０（ドイツ）；そしてＣｏｒｎｉｎｇ ２０３０、２５４０、２５５０、２６００、５８４０、５８６０、５８７４、および９８６３である。基体はスライド、ウェーハー、またはチップのような形態にすることができる。
【００１５】
あるいはまた、基体の分析対象を受容する側の表面は反射性のものであり、例えば半金属もしくは金属の薄いフィルムでコーティングした固相支持体の表面、または金属もしくは半金属プレートの光沢表面であってもよい。基体が励起光および放射光を透過する場合でも、反射表面は励起光および蛍光放射光を基体に透過させない。適当な角度で表面を照射することにより、励起光は収集レンズ（collection optics）から逸れて反射し、収集レンズからの自己蛍光が除去される；従って、より効率の低いフィルターを使用して自己蛍光を吸収させることができる。
【００１６】
コーティング物質の化学的および物理的性質がアッセイに適合し、分析対象が効率的に結合される限り、種々の反射コーティングを使用することができる。好適な基体には、例えばNanofilm社（Westlake Village、CA）製のクロムでコーティングされたガラスのような、ガラスリトグラフィーで使用されるコーティングされたガラス物質があるが、それに限定されるものではない。
【００１７】
図１は、従来のスライドガラスの形状で、薄いクロムフィルム２でコーティングした平滑な表面を有する基体１を示す。蛍光標識したＤＮＡフラグメント３を無作為に、または位置を特定できるように（addressably）配列させて表面上に付着させる。付着させた分子を生化学的に処理した後、必要により、適当なｐＨを提供する液体媒体５をスライド上に適用し、薄いカバーガラス６で被覆する。液体媒体は必要により、蛍光色素の酸化を防止する組成物である抗退色剤を含有することができる。代表的な抗退色剤は、Aldrich Chem.Co.（Milwaukee、WI）製のｐ−フェニレンジアミンである。また液体媒体は、例えば４’，６−ジアミジノ−２−フィルインドール（“ＤＡＰＩ”）のような対比染色剤を含有することができる。次いで、励起光をスライドのクロムコーティング面に照射する蛍光イメージングシステムでスライドを分析する。蛍光放射光の収集レンズ４を、照射する表面のすぐ上に、コーティングした表面に垂直な光学軸で配する。そのような配置により収集レンズへ蛍光が反射し、レンズで検出される蛍光シグナル強度が約二倍になる。励起光をある角度で適用し、反射光が収集レンズに入らないようにする。また、ミラー７を使用して励起光の強度を向上することもできる。
【００１８】
この新規方法は、蛍光イムノアッセイ、蛍光インサイチオハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション（“ＣＧＨ”）、ゲノセンサー系（genosensor-based）ＣＧＨ（“ｇＣＧＨ”；例えばKallioniemiら，Science，258：818-821，1992を参照すること）、分子芝（molecular lawn）（米国特許出願第08/768,177号および08/991,675号を参照すること）、または一般的なＤＮＡチップを使用するアッセイ（例えば米国特許第5,445,934号、5,510,270号、および5,556,752号を参照すること）のような種々の蛍光アッセイに使用することができる。
【００１９】
十分確立された方法を使用して、分析対象核酸または分析対象核酸に特異的な捕獲プローブを、ガラスまたは金属でコーティングした表面に結合させることができる。例えばJoosら，Analytical Biochemistry，247：96-101，1997；Maskosら，Nucleic Acids Research，20：1679-1684，1992；Fodorら，Science，251：767-773，1991；Lowe，Chemical Society Reviews，24：309-317，1995；Guoら，Nucleic Acids Research，22：5646-5465，1994；そしてBischoff，Analytical Biochemistry，164：336-344，1987を参照されたい。ガラス表面に使用できる結合方法はシリコン基体にも使用できる。これを行うためには、シリコン基体を加熱して表面層を酸化し、表面にスライドガラスと同様の化学的性質をもたせる。
【００２０】
核酸を金属表面に結合させるために、第一のシラン化合物（例えばGelestのWAS 7021（Tullytown，PA））、次いで第二のシラン化合物（例えば（３−グリシドオキシプロピル）−トリメトキシシラン）で表面を処理することができる。第一のシランコーティングは金属表面に結合し、第二のシランコーティングは、好適に修飾された核酸（例えばアミノ化した核酸）を結合させるための反応基（例えばエポキシ基）を供する。好ましくは、これら二つのシランコーティングは、最も頻繁に使用される波長領域で透過性である。
【００２１】
分析対象タンパク質（例えば細胞表面タンパク質）を多くの標準的な方法のいずれかによって固相支持体に結合させることができるが、それらの方法には直接吸着、または表面上の反応基との化学結合がある。例えば、固相表面を誘導化して活性アミン基を生成し；次いでアミン−およびスルフヒドリル−反応性ヘテロ２官能基クロスリンカー（例えばスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、または他のPierce（Rockford、IL）製 ＤＯＵＢＬＥ−ＡＧＥＮＴTMクロスリンカー）を使用して、ポリペプチド中の遊離のシステイン基を固相表面上のアミノ基に結合させることができる。ホモ２官能基クロスリンカーも同様に使用することができる。
【００２２】
分析対象は、蛍光色素（例えばフルオレセイン、フィコエリトリン、テキサスレッド、またはアロフィコシアニン）または蛍光反応を触媒する酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）のような検出可能な標識成分に（直接または間接的に）共有または非共有結合させることができる。一例として、分析対象核酸を蛍光色素に結合させたプローブで標識してもよい；またホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた特定の抗体で抗原を標識することができる。
【００２３】
以下に記載する実験は、新規蛍光バイオアッセイ法の実施態様のいくつかを例証する。
蛍光で標識された化合物から放射されるシグナルの定量は、Vysis，Inc.（Downers Grove、IL）で開発された広域蛍光イメージングシステムを使用して実施した。イメージングシステムは、４５０Ｗ キセノンアークランプ（SLM Instruments Inc.、Champaign Urbana、IL）、電荷結合素子検出器（ＣＨ２００、Photometrics、Tucson、AR）、および通常使用される３つの蛍光色素−−青にＤＡＰＩ、緑にフルオレセインイソチオシアネート（“ＦＩＴＣ”）、および赤にテキサスレッド（“ＴＲＥＤ”）用のフィルターセット（Chroma Technology、Brattleboro、VT）からなる。イメージングシステムは、Ｐｏｗｅｒ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ７１００／８０で、イメージング取り込み（acquisition）／分析ソフトウェア（IpLab、Signal Analytics，Corp.、Vienna、VA）を使用して制御した。結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
表１は、一般的に使用されるソーダ石灰スライドガラス（VWR Scientific Products、West Chester、PA）に対する未処理の物質の相対バックグラウンド蛍光を表す。相対バックグラウンド蛍光には光散乱、拡散光、およびフィルターの瑕疵（imperfection）からの寄与があるが、電子ノイズは全て控除した。結果は、黒色ガラススライドおよび金属でコーティングしたスライドでは、バックグラウンドが溶融シリカに対してそれぞれ４倍および１０倍減少することを示した。
【００２６】
別の実験で、フルオレセインコンジュゲートビーズ（Flow Cytometry Standards Corp.、Hata Rey、PR）を一般に使用される抗退色媒体（カタログ番号824-28、Flow Cytometry Standards Corp.）と混合し、スライドとカバーガラスの間に挟んで、蛍光強度を測定した。イメージの定量分析により、Ｃｒ−コーティングスライドの総バックグラウンドは通常のガラスのわずか２１％であることが明らかとなった。総バックグラウンドには光散乱、拡散光、およびフィルターの瑕疵だけでなく、固定媒体およびカバーガラスからの自己蛍光も含まれる。特に、正味のシグナル強度は２倍であり、これは入射光が反射して蛍光体を２度通過し、また、反射した蛍光は検出（detection optics）に入らないからである。
【００２７】
別の実験から、新規蛍光アッセイ法を使用してＤＮＡ複合体分析対象を検出できることが示された。この実験では、表１に示すスライド物質をゲノセンサー系比較ゲノムハイブリダイゼーション（“ｇＣＧＨ”）のアレイ支持体（すなわちチップ）として使用した。ｇＣＧＨの技術は標準的なＣＧＨを改良して開発されたものであり、試料組織由来のＤＮＡを１つの蛍光体（例えばＴＲＥＤ）で標識し、別の蛍光体（例えばＦＩＴＣ）で標識した等量の参照ＤＮＡと混合し、次いでスライドガラスに付着させた分裂中期染色体と共ハイブリダイズさせる。ｇＣＧＨでは、中期染色体の代わりに、アレイ形式でチップ表面に固定化されたクローン化ＤＮＡフラグメントを使用する。ハイブリダイゼーションの後、標的のスポットを洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色して全てのＤＮＡを青色に染色する。次いでスライドを多色蛍光イメージングシステムで分析する。イメージ分析ソフトウェアを用いてＤＡＰＩの蛍光によって標的スポットの存在を測定し、次いで赤色と緑色の蛍光の比率を測定して試料と対照ＤＮＡのハイブリダイゼーションの相対量を測定する。
【００２８】
Ｃｒ−コーティングスライドガラスはNanofilm社製のＣｒ−コーティングガラスで作成した。以下の段階を実施してＤＮＡを結合させるための金属表面を調製した。これらの段階はまた、Ａｌ−コーティング表面のような他の金属表面にも適用できる。要約すれば、金属表面をシレスキオキサン（silesquioxane）オリゴマー（Gelest，Inc.）の２％水溶液で、室温で１０分間処理し、水で洗浄した。次いで、グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（“ＧＰＴＳ”；Gelest，Inc.）の５％水溶液を用いて、室温で２時間、シラン処理をした。その後第１級アミンをエポキシ基と反応させて、処理した表面にアミノ化したＤＮＡを結合させた。
【００２９】
標準的な条件下でＣＯＬＯ ３２０（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”）＃ＣＣＬ−２２０）またはＨＴＢ−１８（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−１８）細胞から抽出したＤＮＡを実験に使用した。ハイブリダイゼーション混合液２０μｌ中に、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄで標識したヒト参照ＤＮＡ（すなわちヒト血液ＤＮＡ）プローブ２００ｎｇ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｇｒｅｅｎで標識した被験ＤＮＡプローブ（ＣＯＬＯ３２０またはＨＴＢ−１８細胞由来）２００ｎｇ、２Ｘ ＳＳＣ、１０％ 硫酸デキストラン、１μｇ／μｌ Ｃｏｔ１ ＤＮＡ、１μｇ／μｌ サケ精子ＤＮＡ、および５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液を含有させた。混合液を３７℃で４時間インキュベートした後、標的ＤＮＡを固定化させておいたチップに添加した。
【００３０】
チップ上でのハイブリダイゼーションは３７℃で一晩実施した。２Ｘ ＳＳＣを用いて室温で５分間、２Ｘ ＳＳＣおよび５０％ホルムアミドを用いて４０℃で３０分間、更にその後、２Ｘ ＳＳＣを用いて室温で１０分間、チップを洗浄した。次いで、チップを暗所において室温で乾燥した。イメージングに先立ち、１０μｌのＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMをチップ上のアレイ部分に配し、次にこれをカバーガラスで被覆した。積算時間２０秒でクロムチップをイメージングした。比較のために、標準的なエポキシシラン化学を経てＤＮＡをソーダ石灰ガラスチップ（すなわちスライドガラス）に結合させ、同一条件下でハイブリダイズさせた；そしてガラスチップを１０秒間イメージングした。結果は、Ｃｒ−コーティングスライドでは総バックグラウンドが４倍より多く減少することを示した。暗色ガラススライド、シリコンスライド、およびＡｌ−コーティングスライドでも同様の結果が得られた。
【００３１】
Ｃｒ−コーティング表面を使用する利点は、適当なハイブリダイゼーション溶液であれば、クロムの疎水性により、チップ表面から未結合のプローブを除去するのが非常に容易なことである。適当なハイブリダイゼーション溶液は、クロム表面の疎水性を変化させうる界面活性剤を含有しないものであればよい。結果として、プローブの非特異的結合による蛍光バックグラウンドは減少するか、あるいは除去されることさえある。非特異的結合が減少することにより特異的結合に利用可能なプローブが増加するため、ハイブリダイゼーションの効率も向上しうる。
【００３２】
基体への核酸の結合方法
本発明は、核酸を固相表面に結合させるための迅速で非常に簡便な方法を提供する。新規結合法では、核酸を基体表面、例えば金属または半金属表面に非共有結合させる。これを行うためには、変性させた核酸を含有する溶液を基体に適用し、室温またはオーブンで乾燥させる。溶液のｐＨを約１１．０以上に上げることにより核酸を変性させることができる。種々のアルカリ物質、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨなどのようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物を使用して溶液を高ｐＨにすることができる。
【００３３】
あるいはまた、加熱により、例えば核酸を含有する溶液を９５℃以上で２〜５分間加熱することにより、核酸を変性させることができる。次いで、変性させた核酸を含有する溶液を金属または半金属表面に適用して乾燥させる。
【００３４】
変性した一本鎖核酸に存在する静電力は、一般に基体へ効率的に結合するのに十分であると考えられる。上記の方法は長鎖ポリヌクレオチド（例えば約５５０ヌクレオチド（“ｎｔ”）より長いもの）について特に良く機能する。
【００３５】
約５５０ｎｔより短いポリヌクレオチドの結合を向上するために、基体表面にスポットした核酸を、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMまたはＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM均等物のような顕微鏡用固定媒体で処理することができる。特定の理論に拘束されることは望まないが、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMはポリマー分子を含有しており、容量排出剤（volume displacement reagent）として作用し、基体表面に核酸をより近接させると考えられる。あるいはまた、この固定剤は核酸を互いにより接近させ、それによって基体表面に直接結合していない核酸を捕捉する核酸のネットワークの形成を促進するのかもしれない。核酸に対して同様の効果を有する試薬のいずれも使用できる。
【００３６】
従来の核酸の結合法では、ほとんどの化学リンカーが自己蛍光を有するため、バックグラウンド蛍光が生成されることが知られている。新規結合法では、そのようなリンカーを使用しないことによりこの問題を回避する。
【００３７】
一つの実施例では、水または１００ｍＭ ＮａＯＨに溶解した０．９μｇ／μｌの未修飾かつ未消化のプラスミドＤＮＡ（６ｋｂ）を未処理のＣｒ−コーティングチップ上に手作業でスポットして乾燥した。２Ｘ ＳＳＣで洗浄した後、ＤＮＡをＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM／ＤＡＰＩで染色し、ＤＡＰＩの蛍光シグナルを測定した。結果は、未変性のＤＮＡ、すなわち水に溶解したＤＮＡのスポットは洗い出され；これに対し、変性したＤＮＡ、すなわちＮａＯＨ処理したＤＮＡのスポットは十分結合し、ＮａＯＨ変性条件下で生成した４９ｋｂの長さのラムダＤＮＡのスポットと同様のＤＡＰＩ強度であることを示した。ニックトランスレーション処理をしたプラスミドプローブを使用し、標準的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、結合させたＤＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションが観察された。
【００３８】
上記のアルカリ法が短鎖ＤＮＡ分子にも十分機能するかどうかを試験するために、平均約５００ｎｔの長さである、ＮａＯＨで処理して超音波処理をしたラムダＤＮＡを、ここに記載したようにＣｒ−コーティングチップにスポットした。２Ｘ ＳＳＣで洗浄した後、スポットしたＤＮＡをＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM／ＤＡＰＩで染色し、蛍光シグナルを測定した。結果は、ＤＮＡが洗浄後もなおチップに結合したままであることを示した。
【００３９】
これらの結果は、新規方法によって得られるＤＮＡのＣｒ−またはＡｌ−コーティング表面への結合が、従来の共有結合法によって得られる結合と同程度に過酷なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件に耐えることを示している。
【００４０】
別の実施例で、ＤＮＡの結合およびハイブリダイゼーションに対するＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理の効果を試験した。超音波処理した種々の長さ（すなわち、それぞれ４８ｋｂ、２．５ｋｂ、９００ｎｔ、５５０ｎｔ、４００ｎｔ、および３００ｎｔ）のラムダＤＮＡをこの実験に使用した。
【００４１】
超音波処理したＤＮＡを１００ｍＭ ＮａＯＨに懸濁して上記のように未処理のクロムチップに結合させた。次いで１５μｌのＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMをＤＮＡチップに添加し、室温で１時間インキュベートした。チップを２Ｘ ＳＳＣで洗浄し、ＤＡＰＩで染色した。図２に示すデータは、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理によりクロムチップへのＤＮＡ、特に短鎖ＤＮＡ（例えば約３００〜４００ｎｔの長さ）の結合が有意に向上することを示している。例えば、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理した３００ｎｔのスポットからの青色ＤＡＰＩシグナルは、相当するＳＳＣ−処理スポットから生じるものより７倍高いことが見出された。
【００４２】
ハイブリダイゼーションに対するＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMの効果を試験するために、ＤＮＡチップをＳｐｅｃｔｒｕｍ ｇｒｅｅｎで標識したラムダＤＮＡ２０ｎｇおよびＳｐｅｃｔｒｕｍ ｒｅｄで標識したラムダＤＮＡ２０ｎｇと共にインキュベートした。３００ｎｔまたは４００ｎｔの長さの標的ＤＮＡを含むスポットについて、ＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTM処理チップの蛍光シグナルは未処理のチップのものより４〜７倍高かった。
【００４３】
他の態様
本発明について、その詳細な説明と関連して記載してきたが、上記の説明は例証を意図するものであり、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を制限するものではない。
【００４４】
他の観点、利点、および変更は下記の特許請求の範囲内のものである。
【符号の説明】
【００４５】
１ 基体
２ クロムフィルム
３ ＤＮＡフラグメント
４ 収集レンズ
５ 液体媒体
６ カバーガラス
７ ミラー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析対象を検出する方法であって、
試料に接触する反射表面を提供し、ここで分析対象は試料中に存在する場合、蛍光色素で標識されており；
蛍光色素を励起させる波長の光を表面に照射し；そして、
試料中の分析対象の存在の指標として表面から生じる蛍光放射光を検出する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
分析対象が、分析対象に特異的に結合し、表面に固定化された捕獲プローブを介して反射表面に結合している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
分析対象が核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
反射表面が金属または半金属表面である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
金属表面がクロム表面である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
金属表面がアルミニウム表面である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
半金属表面がシリコン表面である、請求項４記載の方法。
【請求項８】
金属または半金属表面に核酸を結合させる方法であって、
核酸を含有する溶液を提供し；
溶液中で核酸を変性させ；
溶液を金属または半金属表面に適用し；そして、
溶液を表面上で乾燥させることにより核酸を表面に結合させる、ことを含んでなる上記方法。
【請求項９】
溶液のｐＨが少なくとも約１１である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
溶液が水酸化ナトリウムを含有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
核酸を変性させるに十分な温度および時間で溶液を加熱することにより核酸を変性させる、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
金属表面がクロム表面である、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
金属表面がアルミニウム表面である、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
半金属表面がシリコン表面である、請求項８記載の方法。
【請求項１５】
表面への核酸の結合を向上させるために金属または半金属表面に顕微鏡用固定媒体を適用することを更に含む、請求項８記載の方法。
【請求項１６】
顕微鏡用固定媒体がＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
励起光をある角度で表面に照射する、請求項１記載の方法。
【請求項１】
試料中の分析対象を検出する方法であって、
試料に接触する反射表面を提供し、ここで分析対象は試料中に存在する場合、蛍光色素で標識されており；
蛍光色素を励起させる波長の光を表面に照射し；そして、
試料中の分析対象の存在の指標として表面から生じる蛍光放射光を検出する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
分析対象が、分析対象に特異的に結合し、表面に固定化された捕獲プローブを介して反射表面に結合している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
分析対象が核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
反射表面が金属または半金属表面である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
金属表面がクロム表面である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
金属表面がアルミニウム表面である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
半金属表面がシリコン表面である、請求項４記載の方法。
【請求項８】
金属または半金属表面に核酸を結合させる方法であって、
核酸を含有する溶液を提供し；
溶液中で核酸を変性させ；
溶液を金属または半金属表面に適用し；そして、
溶液を表面上で乾燥させることにより核酸を表面に結合させる、ことを含んでなる上記方法。
【請求項９】
溶液のｐＨが少なくとも約１１である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
溶液が水酸化ナトリウムを含有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
核酸を変性させるに十分な温度および時間で溶液を加熱することにより核酸を変性させる、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
金属表面がクロム表面である、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
金属表面がアルミニウム表面である、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
半金属表面がシリコン表面である、請求項８記載の方法。
【請求項１５】
表面への核酸の結合を向上させるために金属または半金属表面に顕微鏡用固定媒体を適用することを更に含む、請求項８記載の方法。
【請求項１６】
顕微鏡用固定媒体がＧＥＬ／ＭＯＵＮＴTMである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
励起光をある角度で表面に照射する、請求項１記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−４６０８２（Ｐ２０１０−４６０８２Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４２５７８（Ｐ２００９−２４２５７８）
【出願日】平成２１年１０月２１日（２００９．１０．２１）
【分割の表示】特願平１１−１４８２５５の分割
【原出願日】平成１１年５月２７日（１９９９．５．２７）
【出願人】（５９７０６０３５７）ヴァイシス・インコーポレーテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＶＹＳＩＳ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】３１００ Ｗｏｏｄｃｒｅｅｋ Ｄｒｉｖｅ，Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６０５１５−５４００，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２１日（２００９．１０．２１）
【分割の表示】特願平１１−１４８２５５の分割
【原出願日】平成１１年５月２７日（１９９９．５．２７）
【出願人】（５９７０６０３５７）ヴァイシス・インコーポレーテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＶＹＳＩＳ，ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】３１００ Ｗｏｏｄｃｒｅｅｋ Ｄｒｉｖｅ，Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ６０５１５−５４００，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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