分析物の検出方法
本発明の対象は、以下のプロセス工程を含む、生物学的試料からの分析物の検出方法である：
ａ）固相に固定化される可逆的結合パートナー１の調製（ここに、分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー１と２との結合により固定化される）、
ｂ）生物学的試料の添加、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへの分析物の結合、
ｃ）生物学的試料の分離、
ｄ）分解緩衝液の添加（これは、可逆的結合パートナー１と２との結合を分解し、ここで分析物バインダーへの分析物の結合は任意である）、及び
ｅ）それぞれ、生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中での分析物の検出、及び生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物の欠失の測定。
ａ）固相に固定化される可逆的結合パートナー１の調製（ここに、分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー１と２との結合により固定化される）、
ｂ）生物学的試料の添加、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへの分析物の結合、
ｃ）生物学的試料の分離、
ｄ）分解緩衝液の添加（これは、可逆的結合パートナー１と２との結合を分解し、ここで分析物バインダーへの分析物の結合は任意である）、及び
ｅ）それぞれ、生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中での分析物の検出、及び生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物の欠失の測定。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象は、以下のプロセス工程を含む、生物学的試料からの分析物の検出方法である：
ａ）固相に固定化される可逆的結合パートナー１の調製（ここに、分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー１と２との結合により固定化される）、
ｂ）生物学的試料の添加、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへの分析物の結合、
ｃ）生物学的試料の分離、
ｄ）分解緩衝液の添加（これは、可逆的結合パートナー１と２との結合を分解し、ここで分析物バインダーへの分析物の結合は任意である）、及び
ｅ）生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中での分析物の検出、又は生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物の欠失の測定。
【背景技術】
【０００２】
迅速検査又はポイントオブケア（ＰＯＣ）検査法が、様々な方法で開発されている（１）。しかし、これらのうちで販売できるところまで行ったものはほとんど無い。
【０００３】
現在確立されている迅速検査法、例えばＴＲＩＡＧＥ系（Ｂｉｏｓｉｔｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）（特に最も一般的な方法である免疫クロマトグラフィー）は、低い分析感度、ならびに標準的イムノアッセイ（用手法法又は自動化法）と比較して低い精度を有する欠点があるが、適切な例（２）〜（７）のいずれの場合も未処理の全血試料を処理できる利点がある。
【０００４】
欠点は、主に試料マトリックスへの方法の依存性と、使用可能な試料容量の限界である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って本発明の目的は、未処理の全血試料を処理できて、標準的なイムノアッセイに匹敵する分析感度と精度とを有する、迅速検査で行われる方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の対象は、特に分析物特異的バインダー（例えば抗ＰＣＴ抗体）の固定化のための、本発明の可逆的結合系の使用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】分析物（ＰＣＴ）が、２時間のインキュベーションの標準法と同様の効率で、特にわずかに５分間のインキュベーションという早さで、全血から免疫抽出できることを示す。
【図２】３つの方法（Ａ：ＴＲＡＣＥ法による免疫移送、Ｂ：免疫クロマトグラフィーによる免疫移送、Ｃ：標準的免疫クロマトグラフィーの標準）で測定した、種々のＰＣＴ濃度を有する全血試料の複数回測定値の変動係数を示す。免疫移送を含む２つの方法は、本発明の方法である。標準的免疫クロマトグラフィーは標準法である。
【図３】免疫クロマトグラフィーによる免疫移送の本発明の方法を用いて測定した、種々のＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ濃度を有する全血試料の複数回測定値の変動係数を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の対象は、以下のプロセス工程を含む、生物学的試料からなる分析物の検出方法である：
ａ）固相に固定化される可逆的結合パートナー１の調製（ここに、分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー１と２との結合により固定化される）、
ｂ）生物学的試料の添加、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへの分析物の結合、
ｃ）生物学的試料の分離、
ｄ）分解緩衝液の添加（これは、可逆的結合パートナー１と２との結合を分解し、ここで分析物バインダーへの分析物の結合は任意である）、及び
ｅ）生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中での分析物の検出、又は生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物の欠失の測定。
【０００９】
工程ｂ）とｃ）の間で、あるインキュベーション時間が維持されることは、当業者には明らかである。インキュベーション時間は３０秒以下でも２４時間以上であってもならず、特に好ましくは迅速検査法の範囲内であり、インキュベーション時間は５〜１５分である。工程ｄ）の分解法は、好ましくは最大２４時間であり、好ましくは迅速検査法の範囲内であり、分解法は、１５秒より長く１５分より短く、好ましくは５〜１５分である。
【００１０】
分析物バインダーへの分析物の結合は、ｄ）の分解中及び／又はその後も維持されるか、又は全く維持されない。本発明では両方の選択肢が考えられる。分析物と分析物バインダーとの結合は、好ましくはｄ）の分解緩衝液の添加中及び／又はその後も維持される。結合は好ましくは、分析物分子の少なくとも９０％で維持される。結合が維持されない場合、これは好ましくは後で確立される。最も好ましくは分析物と分析物バインダーとの結合は検出の時間に存在し、すなわちこれは分解工程中維持されるか又は再度確立される。
【００１１】
好適な実施態様において、分析物バインダーは抗分析物抗体である。
本発明の方法の好適な実施態様において、生物学的液体は未処理の全血試料である。
【００１２】
本発明において固定化された可逆的結合パートナー１は、直接又はキャリアータンパク質により固定化される。キャリアータンパク質の例は、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）である。適当なキャリアータンパク質は、当業者に公知である。
【００１３】
本発明において、強固な結合を形成できる種々の結合パートナーが適しているが、ある条件下ではこれらは、結合を破壊でき、従って「可逆的結合系」である。ここで特に関係のあるものは、比較的穏和な条件下で、すなわちタンパク質（特に抗体）のコンフォメーション及びその抗原への結合を大きく障害することのない条件下で、結合を不安定化できる結合系である。
【００１４】
このような可逆的結合系の応用は、複雑なタンパク質混合物（例えば細胞抽出物）からの組換えタンパク質の精製可能性に関連して知られている。この関連で組換えＤＮＡ技術を使用して、目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列が、いわゆる「タグ」をコードする配列に結合され、こうして「タグ」により延長されるタンパク質が発現される。固相に固定化される「タグ」の結合パートナーを介して、タンパク質混合物からの「タグ」タンパク質は、選択的に結合し、次に「タグ」結合の特異的不安定化により固相から再度分離することができる。次に目的のタンパク質は濃縮型又は溶液中の純粋な型になる。一般的に使用される「タグ」、対応する固定化結合パートナー、及び特異的不安定化法のリストは、例えば（８）〜（１０）に存在する。
【００１５】
このような結合系は、結合パートナーとして本発明の範囲内で使用することができる。
【００１６】
本発明の方法の範囲内で、特に可逆的結合パートナー１と２の結合対を以下の結合対の１つから選択することができる：
ａ）陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
ｂ）Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質と、ペプチド／タンパク質がＣａ２＋に結合している時ペプチド／タンパク質が高親和性で結合する抗体、
ｃ）オリゴヒスチジン（例えば、６Ｈｉｓ）とＮｉ−ＮＴＡ、
ｄ）ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン。
【００１７】
本発明の範囲内であるいくつかの可逆的結合系を、ここに簡単に示す：
ペプチド／タンパク質がＣａ２＋に結合している時、高親和性でペプチド／タンパク質が結合するＣａ２＋結合ペプチド／タンパク質及び抗体の例は、ＦＬＡＧ／ＭＩ系であり、ここで、Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質はＦＬＡＧ−ペプチドであり、抗体はＭ１抗体である。別の系では、Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質はＦＬＡＧ−ペプチドであり、及び抗体はＭ１抗体である。別の系では、Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質はプロテインＣペプチドであり、及び抗体はＨＰＣ４抗体である。
【００１８】
ａ）ＦＬＡＧ／Ｍ１
従って１つの例は、モノクローナル抗体Ｍ１（４Ｅ１１としても記載される）といわゆるＦＬＡＧペプチドとの結合である。このペプチドはカルシウム２＋に結合することができ、こうしてあるコンフォメーションを取る。このコンフォメーションのみがＭ１により効率的に結合される。カルシウム２＋錯化剤（例えばＥＤＴＡ）を加えることにより、カルシウム２＋がペプチドから除去され、ペプチドは別のコンフォメーションを取り、これによりＭ１抗体は、ペプチドに対するその親和性を劇的に低下させる；米国特許第４，８５１，３４１号（１１）。
【００１９】
ｂ）Ｃ／ＨＰＣ４タンパク質
このような結合対の別の同様の例は、ヒトプロテインＣから得られ、カルシウム２＋依存性の形を取るタンパク質と、モノクローナル抗体ＨＰＣ４（１２）である。
【００２０】
ｃ）Ｎｉ２＋−ＮＴＡ／６Ｈｉｓ
別の例は、イミダゾールの添加により特異的に不安定化することができるＮｉ２＋−ＮＴＡ／６Ｈｉｓ系である（１３）。
【００２１】
ｄ）荷電ペプチドオリゴマー
別の例は、その互いの結合がイオン強度を上げることにより不安定化することができる、陽性荷電又は陰性荷電ペプチドオリゴマー（例えば、オリゴ−Ｌｙｓ又はオリゴ−Ａｓｐ）である。結合対として、イオン交換マトリックスに関連して荷電ペプチドオリゴマーが記載される；またこの結合はイオン強度を上げることにより不安定化される（１４）〜（１６）。
【００２２】
結合パートナーの１つが組換えタンパク質中に組み込まれる可逆的結合系以外に、結合パートナーの１つが、固定化されるタンパク質に化学的に結合される系も知られている。例えばここでは、ビオチン／アビジン系が言及される。ビオチンは、例えばＮＨＳエステルの形であるタンパク質の１級アミン基に結合することができる（１７）。この結合系もまた、過剰のビオチンを加えることにより不安定化されるが、高温及び長いインキュベーション時間のような劇的な条件下でのみである（１８）。しかし、いわゆるモノマーアビジンを使用するこの系の変更態様が記載されている；ビオチンによる「非可逆的」結合部位の飽和後、残りの「可逆的」結合部位はビオチン化タンパク質への結合に適しており、これは、結合部位からのビオチンにより穏和な条件下で分解することができる（１９）。
【００２３】
組換えタンパク質について上記したペプチド「タグ」はまた、タンパク質にも化学的に結合可能なはずであり、こうして誘導体化されたタンパク質は可逆的結合に適用される。本発明の範囲内で、誘導体化の程度は制御でき、化学的結合は比較的時間が節約でき経済的であるため、化学的結合はタンパク質誘導体化の好適な変更態様と見なすことができる。
【００２４】
可逆的結合系の既に記載したすべての例は、結合パートナーの非共有結合的相互作用に基づく。しかし本発明の範囲内で、これらの系はまた、第１の共有結合が存在して、これは化学的に分解できる可逆的結合系と見なすことができる。例えばヘテロ２官能性架橋剤（例えばＳＰＤＰ）による共有結合性架橋が言及される（２０）；還元剤を加えることにより、ジスルフィド結合を切断でき、こうして結合が分解される。
【００２５】
すなわち本発明の対象は、分析物バインダーが可逆的結合パートナー２に共有結合される、本発明の迅速検査法である。
すなわち本発明の対象は、分析物バインダーが抗プロカルシトニン抗体である好適な実施態様における、本発明の方法である。
すなわち本発明の好適な対象は、分析物特異的バインダー、例えば抗ＰＣＴ抗体の固定化のための可逆的結合系の適用である。
【００２６】
荷電ペプチドオリゴマー（上記参照）の可逆的結合系のための適用が例として以下に明記されるが、同様に他の系用に変化させることができる。オリゴ−Ａｓｐは、キャリアータンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）上に結合され、この結合体は固相（例えば、高結合性ポリスチレンマイクロタイタープレート）上に安定に固定化される。オリゴ−Ｌｙｓは抗ＰＣＴ抗体に結合される。オリゴ−Ｌｙｓ−抗ＰＣＴ抗体と固相とのインキュベーションは、イオン的相互作用によるオリゴ−Ｌｙｓとオリゴ−Ａｓｐ部分の結合により、抗体の固定化を引き起こす。
【００２７】
別の実施態様において抗ＰＣＴ抗体はまた、抗ＰＣＴ抗体に対するオリゴ−Ｌｙｓ誘導体化抗体（例えば、抗ＰＣＴ抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、抗マウスＩｇＧ抗体）により間接的に固定化することができる。
【００２８】
免疫抽出の原理は、例えばＰＣＴ分析について以下に説明される。
【００２９】
第１に、抗ＰＣＴ抗体は可逆的結合系を介して固相上に固定化される。検査すべき全血試料（この例には、荷電ペプチドオリゴマー及びＥＤＴＡ血液）を加え、ＰＣＴを試料から免疫抽出する。この場合、比較的多量の試料を使用することができ、従って比較的多量のＰＣＴが抽出でき、これは、検査の高い分析感度を与える。短いインキュベーション時間後、試料を分離する（洗浄により、又は他の適切な分離法により、例えば吸引又は適切な遠心分離により）。次の工程では、緩衝液を加え（「分解緩衝液」）、これは、固相への抗体の結合を広範に不安定化するのに適しているが、ＰＣＴと抗体との結合は不安定化しない物質（例えば、オリゴ−Ｌｙｓ／オリゴ−Ａｓｐ系中の強く陰性荷電したヘパリン）を含有する。すなわち、測定すべき分析物（特異抗体上に複合体化している）を大量に含有する溶液を利用できる。試料マトリックスはあらかじめ分離されたため、検査される試料の溶液はいつも同じ組成である。この工程の利点は以下の通りである：
【００３０】
−未処理全血を使用できること、
−多量の試料を使用でき、従って比較的多量の分析物を抽出でき、最終的に以後の測定法で高い分析アッセイ感度を達成できること、
−測定法の精度と正確度に有利な影響を与える測定法における以後の工程の、マトリックスへの非依存性。
【００３１】
溶液中に入れられる免疫抽出分析物は、種々の方法で検出することができる。１つの例は、ＴＲＡＣＥ法であり、別の例（後述の追加の方法）は免疫クロマトグラフィーである。
【００３２】
サンドイッチイムノアッセイについてＴＲＡＣＥ法は、異なる蛍光標識物（例えば、シアニン又はクリプテート）で標識された２つの抗体を使用する。溶液中の分析物とのサンドイッチ形成では、両方の標識物が空間中で接近して、これが対応する光励起により特異的発光をする。
【００３３】
例えばＰＣＴの分析に関連して、オリゴ−Ｌｙｓが結合した抗ＰＣＴ抗体は、固定化の前にまずクリプテートで標識される。
【００３４】
ここで、免疫抽出が行われる。分解緩衝液では、分解剤以外に、サンドイッチ形成に必要な第２のシアニン標識抗ＰＣＴ抗体が含まれる。すなわち分解緩衝液を加えることにより、固相からの抗原−抗体複合体の分解とサンドイッチ形成の両方が行われ、これは適切な光励起により検出することができる。分解とサンドイッチ形成への第２抗体の添加はまた、連続して行うことができる。
【００３５】
上記変更態様において、分析物特異的抗体は、オリゴ−Ｌｙｓ誘導体化（例えば、抗マウスＩｇＧ）抗体を介して免疫抽出前に、間接的に固定化される。本実施態様において次に、蛍光標識物は１つの又は別の抗体に結合することができる。
【００３６】
免疫クロマトグラフィーの例では、オリゴ−Ｌｙｓに結合した抗ＰＣＴ抗体は、固定化の前にまずビオチンでさらに標識される。ここで免疫抽出が行われる。分解緩衝液には、分解剤以外に、コロイド金で標識されサンドイッチ形成に必要な第２の抗ＰＣＴ抗体が含まれる。サンドイッチ形成のための分解と第２抗体の添加はまた、連続して行うことができる。次に反応混合物を免疫クロマトグラフィー試験ストリップに添加し、その上に、形成されるサンドイッチの捕捉用物質として、ビオチンバインダー（例えばアビジン）を、試験ストリップの後部に細い線として、反応溶液の供給方向に交差するように噴霧する。
【００３７】
本発明の方法のこの好適な実施態様において、分析物バインダーは標識され、また分解緩衝液の添加後の分析物の検出のための標識物で標識されて維持される。
【００３８】
免疫クロマトグラフィーの実施態様において、以下の追加の変更態様が企図される。
結合パートナー２を用いる誘導体化以外に、免疫抽出抗体はさらにビオチン化される。サンドイッチ形成のための第２抗体が標識される（例えばコロイド金で）。すなわち試験ストリップ上の捕捉用物質は、ビオチンバインダー（例えば、アビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン）であろう。
【００３９】
免疫抽出抗体（例えば、ポリクローナルヒツジ）は、結合パートナー２のみで誘導体化される。サンドイッチ形成のための第２抗体は、別の動物種（例えばモノクローナルマウス）由来でなければならず、これは標識される（例えばコロイド金で）。
【００４０】
試験ストリップ上の捕捉用物質は、抗ヒツジＩｇＧ抗体であろう。免疫抽出抗体が標識を有する形の両方の変更態様が企図され、すなわち第１の変更態様で、第２抗体はビオチン化される（その代わりとして、ここで第２抗体はまたストリップ上に直接噴霧することができる）。
【００４１】
本発明の別の好適な実施態様において、分解緩衝液は、検出に必要な別の標識成分を含有する。
【００４２】
この方法の特に好適な実施態様において、検出に必要な追加の標識成分は、サンドイッチイムノアッセイの実施のための第２の分析物バインダーである。
【００４３】
標識分析物の検出は、特に好ましくはＴＲＡＣＥ法を使用するイムノアッセイにより行われる。
【００４４】
別の好適な実施態様において、標識分析物の検出は免疫クロマトグラフィーにより行われる。
【００４５】
本発明の特に好適な変更態様において、生物学的試料は希釈されず、固相の被覆部分が生物学的試料と完全に接触するような容量で使用される。
【００４６】
試料の添加から検出までは、特に好ましくは３０分を超えず、従ってこの方法は迅速検査法と見なすことができる。
【００４７】
また本発明の対象は、
・分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合される可逆的結合パートナー１が、その中に固定化された固相を含み、
・分解緩衝液を加えることにより可逆的結合パートナー１と２の間の結合が分解されるが、分解緩衝液を加えた時、分析物バインダーへの分析物の結合は任意であることを特徴とする、本発明の方法を実施するための装置である。
【００４８】
同様に、本発明の対象は、
・固定化された可逆的結合パートナー１を有する固相、
・可逆的結合パートナー２に結合した分析物バインダーを含む複合体（ここで複合体は随時、可逆的結合パートナー１と２を固相に結合させることにより、すでに固定化型で存在してもよい）、
・可逆的結合パートナー１と２との結合を分解する分解緩衝液（しかしここで、分析物バインダーへの分析物の結合は任意である）、
を含んでなる、本発明の方法を実施するためのキットである。
【００４９】
特に好適な実施態様においてキット中に存在する分析物バインダーは、抗ＰＣＴ抗体である。
【００５０】
選択された結合対として、最も好適なキットは、以下の結合対
・陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
・Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質と、ペプチド／タンパク質がＣａ２＋に結合している時ペプチド／タンパク質が高親和性で結合する抗体、
・オリゴヒスチジン（例えば６Ｈｉｓ）とＮｉｎ−ＮＴＡ、
・ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン、
の１つから選択される、可逆的結合パートナー１と２を含有する。
【００５１】
以下の例は、本発明の対象を限定することなく、本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
【００５２】
全血からのＰＣＴの免疫抽出
追加の工程の処理のための基礎として、まずＰＣＴ例中で検査される分析物が、固相に固定化された分析物特異的抗体を使用して、未処理のＥＤＴＡ全血から抽出できるか、そして如何に有効に抽出できるかを試験した。全血試料の短時間のインキュベーション（５分）と分離後、結合したＰＣＴを、第２の化学発光標識抗ＰＣＴ抗体を用いて検出した。比較のために、緩衝液で希釈したＰＣＴ含有血清を同じ固相上で、しかしより長時間（２時間）インキュベートし、結合したＰＣＴを希釈試料からの分離後、上記のように検出した。
【００５３】
特に検査は以下のように行った：
免疫抽出を調べるために、ＢＲＡＨＭＳ ＰＣＴ感受性ＬＩＡキットを使用した（ＢＲＡＨＭＳ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。発光標識抗ＰＣＴトレーサー抗体Ａを、操作説明書に従ってトレーサー復元緩衝液Ｂに溶解した。健常血液ドナーのＥＤＴＡ全血に、スタンダードシリーズを以下の濃度で溶解した：ｃ＝０．００７；０．０１４；０．０３６；０．１７１；０．３８３；１．７３；７．９９ｎｇ／ｍｌ。抗ＰＣＴ抗体で被覆された試験管に、各３００μｌの全血スタンダードをピペットで取り、室温で５分間インキュベートした。次に試験管を５×１ｍｌの洗浄液（８ｍＭトリス、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．５）で洗浄した。次に２００μｌの発光標識抗ＰＣＴ抗体をピペットで取り、室温で２時間インキュベートした；試験管を５×１ｍｌの洗浄液で再度洗浄した。試験管に結合した化学発光をルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２Ｔ；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【００５４】
標準法（希釈血清からのＰＣＴの測定）を、ＢＲＡＨＭＳ ＰＣＴ感受性ＬＩＡキット（ＢＲＡＨＭＳ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に基づき以下のように行った。スタンダードシリーズを試験キットからのゼロ血清で以下の濃度で溶解した：ｃ＝０．００８；０．０３１；０．０４２；０．１２６；０．２５１；１．２１；５．６１；２８．０ｎｇ／ｍｌ。抗ＰＣＴ抗体で被覆された試験管に、各５０μｌの血清スタンダードと２５０μｌのトレーサー復元緩衝液Ｂをピペットで取り、室温で２時間インキュベートした。次に試験管を５×１ｍｌの洗浄液（８ｍＭトリス、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．５）で洗浄した。次に２００μｌの発光標識抗ＰＣＴ抗体をピペットで取り、室温で２時間インキュベートした；試験管を５×１ｍｌの洗浄液で再度洗浄した。試験管に結合した化学発光をルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２Ｔ；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した（図１）。
【００５５】
固相に可逆的に結合される抗体の製造
上記したいくつかの可逆的結合系を、固相に可逆的に抗体（本例では抗ＰＣＴ抗体）を結合させる適切性について調べた。この点で、抗体を様々な程度に誘導体化し（表１参照）、化学発光標識物で標識した。こうして、これらの抗体が各誘導体に応じて如何に固相に結合するか、そしてこれらが再度如何に分解されるかを調べた。表１の結果の要約は、ビオチン／アビジン系を除いたすべての調べた可逆的結合系が特異的かつ迅速に不安定化されることを示し、６Ｈｉｓ／Ｎｉｎ−ＮＴＡ系には制限があるが、血液マトリックスにより障害されない。
【００５６】
【表１】
【００５７】
さらに結合と特異的分解の効率が、各誘導体化の程度（結合パートナー１対抗体のモル比）、固相上に固定化される結合パートナー２の濃度（すなわち、結合パートナー１が抗体に結合して、結合パートナー２が固定化されたかどうか、又は結合パートナー２が抗体に結合して、結合パートナー１が固定化されたかどうか）、及びオリゴ−Ａｓｐ／オリゴ−Ｌｙｓ系の場合は２つのオリゴマーの長さ、により影響を受けることが観察された。従って本発明の範囲内で、このような変更態様も可逆的結合系の範囲内に入り、請求項はこのような変更態様を明白に包含するが、例えばここに記載される変更態様は、好適な実施態様と見なすことができる。オリゴ−Ｌｙｓ−ＢＳＡの代替として、ポリリジン固相も適していた。
【００５８】
特に、試験は以下のように行った：
【００５９】
結合パートナー１（液相）
１．ＭＡＣＮ−化学発光標識抗体の製造
ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体を以下のように処理した：
３つの標識物を調製し、これらを、インキュベーション後に示差的に緩衝化した（下記参照）。
【００６０】
抗体の化学発光標識のために、１ｍｌの抗体溶液（ｃ＝３．１９ｍｇ／ｍｌ）を４０μｌの１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．８）及び２．７μｌのＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳエステル（ｃ＝１ｍｇ／ｍｌ；ＩｎＶｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合した（抗体：ＭＡＣＮのモル標識比：１０：１）。次に、これを室温で３０分インキュベートした。次に標識調製物をＮＡＰ−１０ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を通して１．５ｍｌの移動相溶媒で緩衝化し、こうして低分子量成分を除去した。
【００６１】
標識物１ ＰＢＳ ｐＨ７．４ ビオチン化用 ２．１参照
標識物２ １００ｍＭリン酸ナトリウム、
５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６．９ ＳＰＤＰ活性化用 ２．２参照
標識物３ ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ＳＭＣＣ活性化用 ２．３参照
タンパク質含量を比色法により測定した。標識抗体を分注して−２０℃で保存した。
【００６２】
２．ＭＡＣＮ−化学発光標識抗体の誘導体化
２．１．ビオチン化
ＭＡＣＮ抗体をＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２１３２５）を用いて、１：１０のモル比でビオチン化した。
【００６３】
１ｍｇのＭＡＣＮ抗体を５．４１μｌの１．２３３ｍＭビオチン溶液（ＤＭＳＯ中に新に溶解した）と混合し、室温で６０分間インキュベートした。１００μｌの５０ｍＭグリシンを用いて室温で１０分間反応を停止させ、ＮＡＰ５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で精製した。
【００６４】
抗体に結合しなかったビオチンからラジカルを分離するために、ゲルろ過ＨＰＬＣを行った（カラム：Ｂｉｏ−Ｓｉｌ Ｓｅｃ ４００，Ｂｉｏｒａｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。試料を添加し、流速０．８ｍｌ／分でＰＢＳ（ｐＨ７．４）でクロマトグラフィーを行った。フロー比色計を用いて、２８０ｎｍと３５４ｎｍの波長を測定した。μＭビオチン／μＭ抗体標識の程度は、ピークで０．４８であった。抗体含有画分（保持時間１１〜１２分）をプールした。
【００６５】
タンパク質含量を比色法により測定した。結合体を分注して−２０℃で保存した。
【００６６】
２．２．それぞれ抗ＦＬＡＧ−タグＭ１抗体及び抗ＰｒｏｔＣ−タグＨＰＣ４抗体との結合
それぞれ抗ＦＬＡＧ−タグＭ１抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｆ３０４０）及び抗ＰｒｏｔＣ−タグＨＰＣ４抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ，ＵＳＡ，ＵＳＡ，Ａｒｔ Ｎｏ．１１８１４５１６００１）との結合のために、後者とＭＡＣＮ抗体をＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２１８５７）とを、モル比１：７で活性化した（“ＳＰＤＰ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。
【００６７】
各２ｍｇの抗体を４．６７μｌの２０ｍｍｏｌ ＳＰＤＰ（エタノールに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。活性化Ｍ１及びＨＰＣ４抗体のみを２００ｍｍｏｌのＤＴＴ（ジチオスレイトール、１００ｍｍｏｌのリン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ６．９に溶解した）を用いて、最終濃度１０ｍｍｏｌのＤＴＴとし、室温で１５分間還元した。
【００６８】
それぞれ還元したＭ１及びＨＰＣ４抗体を、ＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：１００ｍｍｏｌのリン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ６．９）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【００６９】
還元した生成物を、それぞれ非還元ＳＰＤＰ活性化ＭＡＣＮ抗体とモル比１：１で４℃で一晩結合させた。次に各５０μｌの１００ｍｍｏｌシステインを用いて、反応を１０分間停止させた。
【００７０】
タンパク質含量を比色法により測定した。結合体を分注して−２０℃で保存した。
【００７１】
２．３．それぞれＨｉｓ−タグとオリゴ−Ａｓｐペプチドとの結合
それぞれＨｉｓ−タグペプチド「ＰＲＧ１２」（アミノ酸配列 ＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号１）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１３５９．８）及びオリゴ−Ａｓｐペプチド「Ｄ１４Ｃ」（アミノ酸配列 ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号２）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１７３１．４３）との結合のために、ＭＡＣＮ抗体をＳＭＣＣ（スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２２３６０）と、モル比１：５０で活性化した（“ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。
【００７２】
２ｍｇのＭＡＣＮ抗体を６．６８μｌの１００ｍＭ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【００７３】
次に、直ちにモル比１：１００でＨｉｓ−タグ又はオリゴ−Ａｓｐペプチド（蒸留水に溶解した）との結合が起きた。室温で６０分間インキュベーション後、１００μｌの１００ｍＭシステインを用いて反応を１０分間停止させ、再度ＮＡＰ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で精製し、タンパク質含量を比色法により測定した。
【００７４】
両方の結合体とも分注して−２０℃に保存した。
【００７５】
結合パートナー２（固相）
１．１．ＢＳＡとＦＬＡ−タグ／ＰｒｏｔＣ−タグとの結合
それぞれＦＬＡＧ−タグペプチド「ＰＤＣ１２」（アミノ酸配列 ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧＣ（配列番号３）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１２８６．４６）及びＰｒｏｔＣ−タグペプチドＰＥＧ１５（アミノ酸配列ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧＧＣ（配列番号４）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１６０１．７）との結合のために、プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＳＭＣＣ（スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２２３６０）を用いて、モル比１：２で活性化した（“Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。
【００７６】
２５００μｌの０．５％ＢＳＡ（ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８に溶解した）を３．７８μｌの１００ｍＭ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【００７７】
次に、直ちにモル比１：１００でＦＬＡＧ−タグ又はＰｒｏｔＣ−タグペプチド（蒸留水に溶解した）との結合が起きた。室温で６０分間インキュベーション後、各１００μｌの１００ｍｍｏｌシステインを用いて、結合体を１０分間停止させ、再度ＮＡＰ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｓａｌｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で精製し、タンパク質含量を比色法により測定した。
【００７８】
ＢＳＡ＋ＦＬＡＧ−タグとＢＳＡ＋ＰｒｏｔＣ−タグ結合体とを分注して−２０℃に保存した。
【００７９】
１．２．ＢＳＡとオリゴ−Ｌｙｓペプチドとの結合
オリゴ−Ｌｙｓペプチド「Ｋ１４Ｃ」（アミノ酸配列ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＣ（配列番号５）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１９１４．２７）及びプロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＳＭＣＣを用いて、モル比１：２５で活性化した。
【００８０】
１０００μｌの０．５％ＢＳＡ（ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８に溶解した）を１８．９μｌの１００ｍＭ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【００８１】
次に、直ちにモル比１：１００でオリゴ−Ｌｙｓペプチド（蒸留水に溶解した）との結合が起きた。室温で６０分間インキュベーション後、１００μｌの１００ｍＭシステインを用いて、反応を１０分間停止させ、再度ＮＡＰ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で精製し、タンパク質含量を比色法により測定した。
【００８２】
ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体を分注して−２０℃に保存した。
【００８３】
２．それぞれ結合体とアビジンの結合
放射線照射したスターチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１．１．及び１．２．からの結合体、及びアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２１１２１、蒸留水に溶解した）を用いて、以下のように被覆した。
【００８４】
成分を、１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）の溶液で６．６７μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。１つの試験管当たり各３００μｌの溶液をピペットで取り、２２℃で２０時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を、３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、再度吸引除去した。次に試験管を真空ドライヤー中で乾燥し、４℃で保存した。
【００８５】
３．Ｎｉ−ＮＴＡ固相
Ｎｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレート（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ａｒｔ．Ｎｏ．１００６３８７）を使用した。
【００８６】
４．可逆的に結合した抗体を検出するためのアッセイ
４．１ ＭＡＣＮ抗体結合体の結合
ＭＡＣＮ抗体結合体を希釈緩衝液（表２を参照）を用いて１．５μｇ／ｍｌの濃度にした。各３００μｌをピペットで、対応する固相中のいくつかの平行バッチに入れ、室温で一晩インキュベートした。試験管を５×１ｍｌの洗浄緩衝液で、Ｎｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレートを５×３００μｌの洗浄緩衝液で洗浄した（表２を参照）。
各１つのバッチで、結合したＭＡＣＮ−抗体結合体の量を測定した。
【００８７】
試験管に結合したＭＡＣＮ−抗体結合体の量を、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２Ｔ；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。マイクロタイタープレートに結合したＭＡＣＮ−抗体結合体の量を、マイクロタイタープレートルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＭＰＬ２；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【００８８】
４．２ 全血とのＭＡＣＮ−抗体結合体の非特異的分解の測定
結合ＭＡＣＮ−抗体結合体の追加のバッチで、各３００μｌの全血（表２を参照）をピペットで取り、１０分間インキュベートした。試験管を５×１ｍｌの洗浄緩衝液（表２参照）で、Ｎｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレートを５×３００μｌの洗浄緩衝液で洗浄した。試験管に残ったＭＡＣＮ−抗体結合体の量をルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２Ｔ；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【００８９】
マイクロタイタープレート上に残ったＭＡＣＮ−抗体結合体の量を、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＭＰＬ２；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【００９０】
４．３ 分解緩衝液によるＭＡＣＮ−抗体結合体の特異的分解の測定
結合したＭＡＣＮ−抗体結合体の追加のバッチで、各３００μｌの分解緩衝液（表２を参照）をピペットで取り、１０分間又は３０分間インキュベートした。試験管を５×１ｍｌの洗浄緩衝液（表２参照）で、Ｎｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレートを５×３００μｌの洗浄緩衝液で洗浄した。
【００９１】
試験管に残ったＭＡＣＮ−抗体結合体の量をルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２Ｔ；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【００９２】
マイクロタイタープレート上に残ったＭＡＣＮ−抗体結合体の量を、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＭＰＬ２；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【表２】
【００９３】
オリゴ−Ａｓｐ／オリゴ−Ｌｙｓ系についてのさらなる試験
分解剤
上記したように、０．０１％ヘパリンを加えることにより結合の効率的な分解を行った（表１と関連する説明を参照）。別の分解剤としてＮａＣｌとＫＦも試験した。ＮａＣｌ又はＫＦの濃度＞０．８Ｍでは、結合の分解に対する０．０１％ヘパリンと同等の作用があった。緩衝液組成の多くの他の変更態様も企図され、これらは結合を分解する（低分子量の他の塩、他の荷電オリゴマーもしくはポリマー、他のｐＨ値）。これらの変更態様のすべては、本発明の範囲内の溶解剤として定義される。これらの変更態様は特に好適であると考えられ、これらは、一方ではオリゴ−Ａｓｐ／オリゴ−Ｌｙｓ系の結合を効率的に不安定化するが、他方では、抗体と分析物の結合をできるだけ障害しないように残す。多くのイムノアッセイはヘパリンを試料マトリックスとして使用し、血漿中のヘパリンの濃度は典型的には０．０１％であるため、０．０１％濃度のヘパリンは好適な変更態様である。
【００９４】
固相への分析物の結合の特異性
オリゴ−Ｌｙｓ−ＢＳＡ／オリゴ−Ａｓｐ−分析物バインダーで被覆された固相に生物学的試料を加えると、試料からの目的の分析物が分析物特異的抗体に結合しないばかりでなく、イオン性相互作用を介して非特異的に固相の遊離リジン部分に結合するおそれがある。こういう場合は、以後（分解工程後）の分析物検出の正確度が障害されるであろう。そのような非特異的分析物結合が起きるか、そしてどの程度起きるかを、種々の合成ペプチド（これらはほぼ既知の天然の分析物と同一であり、従って天然の分析物の代表となる）を化学発光標識し、血漿マトリックスで希釈し、試験管（これはオリゴ−Ｌｙｓ−ｏＢＳＡで被覆し、ここにオリゴ−Ａｓｐ−抗ＰＣＴ抗体を結合させた）中でインキュベートすることにより調べた。非特異的に結合したペプチドの検出部分はいつも、与えられたペプチドの７％未満であった。すなわち固相への非特異的分析物結合は問題ではない。
【００９５】
特に試験は以下のように行った：
【００９６】
１． ＭａＣＮ−化学発光標識ペプチド
以下のペプチド（すべてＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから）をＭＡＣＮで標識した：
「ＰＰＬ４１」（アミノ酸配列ＰＥＶＰＰＷＴＧＥＶＳＰＡＱＲＤＧＧＡＬＧＧＧＧＲＧＰＷＤＳＳＤＲＳＡＬＬＫＳＫＬ（配列番号６）、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰから得られる）、「ＰＳＷ４４」（アミノ酸配列ＳＳＥＥＨＬＲＱＴＲＳＥＴＭＲＮＳＶＫＳＳＦＨＤＰＫＬＫＧＫＰＳＲＥＲＹＶＴＨＮＲＡＨＷ（配列番号７）、プロエンドセリンから得られる）、「ＰＡＹ３３」（アミノ酸配列 ＡＴＱＬＤＧＰＡＧＡＬＬＬＲＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ（配列番号８）、コペプチンから得られる）、「ペプチド４５−９２」（アミノ酸配列ＥＬＲＭＳＳＳＹＰＴＧＬＡＤＶＫＡＧＰＡＱＴＬＩＲＰＱＤＭＫＧＡＳＲＳＰＥＤＳＳＰＤＡＡＲＩＲＶ（配列番号９）、プロアドレノメヅリンから得られる）。
【００９７】
化学発光標識のために、モル比１：１でペプチドをＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳエステル（ＩｎＶｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で室温で１時間標識した。次に１ｍＭトリス（ｐＨ７．８）を用いて、１０分間反応を停止させた。
【００９８】
取り込まれなかったＭＡＣＮの分離のために、標識バッチを逆相Ｃ１８カラム（μＢｏｎｄａｐａｋ，Ｗａｔｅｒｓ ＷＡＴ０２７３４２，Ｎｏ．０２０２３５２５８１）で精製した。試料を添加して、１．０ｍｌ／分の流速で、水／アセトニトリル（＋０．１％ＴＦＡ）の上昇勾配を使用してクロマトグラフィーを行った。フロー比色計を用いて、２１４ｎｍ、２８０ｎｍ、及び３６８ｎｍの波長を測定し、ピークを検出した。
【００９９】
標識ペプチドを分注して−２０℃で保存した。
【０１００】
１．１．ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体の製造：上記参照
【０１０１】
１．２．抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の製造
オリゴ−Ａｓｐペプチド「Ｄ１４Ｃ」（アミノ酸配列 ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号２）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１７３１．４３）の結合のために、ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体（「抗ＰＣＴ抗体１」）を、ＳＭＣＣを用いてモル比１：２５で活性化した（“ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅを参照）。
【０１０２】
３ｍｇの抗体（４．５ｍｌのＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８中）を５．０μｌの１００ｍｍｏｌ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１０３】
次に、直ちにモル比１：１００でオリゴ−Ａｓｐペプチド（蒸留水に溶解した）との結合を行った。室温で６０分間インキュベーション後、１００μｌの１００ｍＭシステインを用いて、反応を１０分間停止させ、結合しなかったペプチドをＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で精製し、タンパク質含量を比色法により測定した。
抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体を分注して−２０℃に保存した。
【０１０４】
２．試験管への結合体の結合
２．１．結合：ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体
放射線照射したスターチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＢＳＡ−オリゴ−Ｌｙｓ結合体を用いて以下のように被覆した。
【０１０５】
結合体を１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）で希釈して６．６７μｇ／ｍｌの濃度にした。この溶液３００μｌを各試験管にピペットで取り、２２℃で２０時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を、３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、再度吸引除去した。次に抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の結合を行った。
【０１０６】
２．２ 結合：抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体
結合体を、ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含遊離ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で６６７ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。この溶液３００μｌをピペットで各試験管に取り、２２℃で１時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を再度３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、次に吸引除去した。
【０１０７】
次に試験管を真空ドライヤー中で乾燥し、４℃で保存した。
【０１０８】
３．非特異結合の測定
ＭＡＣＮペプチドを血漿マトリックスで希釈した。各３００μｌをピペットで、オリゴ−Ｌｙｓ−ＢＳＡ及びオリゴ−Ａｓｐ−抗ＰＣＴ抗体で被覆した試験管に入れ、室温で３０分間インキュベートした。試験管を３×１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％プロテアーゼ不含ＢＳＡで洗浄した。試験管に結合した量ならびに使用したＭＡＣＮペプチドの総活性を、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２７；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。総活性に対する非特異結合の割合は以下の通りであった：
【０１０９】
ＰＳＷ４４ ３．０％
ＰＰＬ４１ ３．１％
ＰＡＹ３３ ６．５％
ペプチド４５〜９２ ２．９％
【０１１０】
ＰＣＴ例との比較：全血からの標準的免疫クロマトグラフィー対全血からのＰＣＴの免疫抽出、免疫クロマトグラフィー又はＴＲＡＣＥ法による分解と分析物検出
ＰＣＴ（プロカルシトニン）を、適切なモデル分析物として選択した。これは細菌感染症、特に宿主の全身性炎症反応（敗血症）を引き起こす重症の感染症のマーカーである（２１）。ＰＣＴ検出のためのサンドイッチイムノアッセイは、ペプチドのカルシトニン又はカタカルシン部分に対する抗体を使用する（２２）、（２３）。
【０１１１】
免疫クロマトグラフィーは、今日最も一般的にルーチン使用されている全血からの分析物の免疫学的検出のための迅速検査法であり、従って「標準的免疫クロマトグラフィー」と呼ぶことができる。従ってこの方法を、分析物検出を伴う免疫抽出と分解（「免疫移送」）の本発明の原理の利点を説明するための、標準法として選択した。以下の２つの異なる方法を試験した：一方で免疫クロマトグラフィー、他方ではＴＲＡＣＥ（時間分解増幅クリプテート放射）法。すべての３つの方法で、ＰＣＴ含有全血試料のＰＣＴ濃度を、各場合に１０回測定で測定した。図２では、これらの方法で得られる精度プロフィールを比較する。本発明の対象である両方の方法は、標準法（全血からの直接の標準的免疫クロマトグラフィー）よりも、基本的に正確で高感度な測定法である検出法（これは免疫クロマトグラフィー又はＴＲＡＣＥ法）に関連して、免疫移送（ｉｍｍｕｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を与える。実験を実施するための詳細は以下に記載される。Ａでは、本発明の方法として、免疫移送が、ＴＲＡＣＥ法による同時結合分析物検出とともに記載され、Ｂでは、本発明の方法として、免疫クロマトグラフィーによる結合分析物検出とともに免疫移送が記載され、Ｃでは、標準法として標準的免疫クロマトグラフィーが記載される。変更態様Ａ、Ｂ、及びＣの精度プロフィールの比較を図２に示す。
【０１１２】
Ａ．全血からのＰＣＴの免疫抽出とＴＲＡＣＥ法による分析物検出
固相として、高結合性ポリスチレンからなるマイクロタイタープレートを使用したが、これはオリゴ−Ｌｙｓ−ＢＳＡで被覆されており、ここに第１の抗ＰＣＴ抗体が結合しており、これはあらかじめオリゴ−Ａｓｐとクリプテートで誘導体化されていた。次にＰＣＴ含有全血試料を短時間インキュベートし、ＰＣＴを固相中の試料から抽出した。固相を洗浄後、分解緩衝液を加え、短時間インキュベートした。アリコートを別の低結合性の黒いマイクロタイタープレートに移し、第２のシアニン標識抗ＰＣＴ抗体を含有する溶液と混合した。短時間インキュベーション後、レーザー光を用いて励起後、ＴＲＡＣＥ法によりサンドイッチ形成を検出した。
【０１１３】
特に試験は以下のように行った：
【０１１４】
Ａ．１．固相用結合体の製造
Ａ．１．１．ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体の製造：上記参照
Ａ．１．２．抗カルシトニンヒツジ抗体クリプテートモノＭＰ＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の製造
クリプテート１リン酸（“ＫＭｏｎｏＭＰ”，Ｃｅｚａｎｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｉｍｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で標識するために、ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体（「抗ＰＣＴ抗体１」）をＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２１８５７）を用いて、モル比１：４で活性化した（“ＳＰＤＰ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。
【０１１５】
５ｍｇの抗体（１．５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．９に溶解した）を４１．６μｌの３．２ｍＭ ＳＰＤＰ（エタノールに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。
【０１１６】
活性化した抗体を８１．２μｌの２００ｍｍｏｌ ＤＴＴ（ジチオスレイトール、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ６．９に溶解した）を用いて、室温で１５分間還元した。
【０１１７】
生成物を２つのＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ６．９）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１１８】
次に、直ちに凍結乾燥ＫＭｏｎｏＭＰとモル比１：８で溶出液の結合を行った。４℃で２０時間インキュベーション後、生成物を再度３つのＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１１９】
オリゴ−Ａｓｐペプチド「Ｄ１４Ｃ」（アミノ酸配列ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号２）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１７３１．４３）との結合のために、生成物をＳＭＣＣを用いてモル比１：２５で活性化した（“ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。３ｍｇの生成物（４．５ｍｌのＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８で溶出した）を５．０μｌの１００ｍＭ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物を２つのＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１２０】
次に、直ちにモル比１：１００でオリゴ−Ａｓｐペプチド（蒸留水に溶解した）との結合を行った。室温で６０分間インキュベーション後、１００μｌの１００ｍＭシステインを用いて反応を１０分間停止させ、結合しなかったペプチドをＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で精製し、タンパク質含量を比色法により測定した。
抗カルシトニンヒツジ抗体−ＫｎｏｍｏＭＰ＋オリゴ−Ａｓｐ結合体を分注して−２０℃に保存した。
【０１２１】
Ａ．２．マイクロタイタープレートへの結合体の結合
Ａ．２．１．結合：ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体
放射線照射したマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体を用いて以下のように被覆した。
【０１２２】
結合体を１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）の溶液で希釈して、６．６７μｇ／ｍｌの濃度にした。各ウェルに、この溶液３００μｌをピペットで取り、２２℃で２０時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各ウェルを、３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、再度吸引除去した。次に抗カルシトニンヒツジ抗体−クリプテートモノＭＰ＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の結合を行った。
【０１２３】
Ａ．２．２ 結合：抗カルシトニンヒツジ抗体クリプテートモノＭＰ＋オリゴ−Ａｓｐ結合体
結合体を、ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含遊離ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で６６７ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。この溶液３００μｌをピペットで各ウェルに取り、２２℃で１時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各ウェルを再度３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、次に吸引除去した。
【０１２４】
次にマイクロタイタープレートを真空ドライヤー中で乾燥し、４℃で保存した。
【０１２５】
Ａ．３．液相のための抗カタカルシンマウス抗体−Ｃｙ５結合体の製造
モノクローナル抗カタカルシン抗体（「抗ＰＣＴ抗体２」）を４５％の（２−ヒドロキシ−プロピル）−β−シクロデキストリン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ａｒｔ．Ｎｏ．３３，２６０−７）の存在下で、Ｃｙ５−ＮＨＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｒｔ．Ｎｏ．ＰＡ１５１００）を用いて、モル比１：２０で標識した（製品小冊子“Ａｍｅｒｓｈａｍ ＣｙＤｙｅ Ｍｏｎｏ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒｓ”参照）。
【０１２６】
２１３μｌの抗体（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中ｃ＝１０ｍｇ／ｍｌ）を、７５０μｌの６０％シクロデキストリン（１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９）に溶解した）及び３７．３μｌの７．７ｍＭ Ｃｙｓ−ＮＨＳ（ＤＭＳＯに溶解した）と混合した。室温で１時間インキュベーション後、５０μｌの５０ｍＭグリシンでバッチを１０分間停止させ、ＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ８）上で精製した。
【０１２７】
抗体に結合しなかったＣｙ５−ＮＨＳラジカルの分離のために、ゲルろ過ＨＰＬＣを行った（カラム：Ｂｉｏ−Ｓｉｌ Ｓｅｃ １２５，Ｂｉｏｒａｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。試料を添加して、１ｍｌ／分の流速で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いてクロマトグラフィーを行った。フロー比色計を用いて、２８０ｎｍ及び６４８ｎｍの波長を測定した。抗体の標識の程度の尺度としての６４８ｎｍ／２８０ｎｍの吸光度比は、ピークで１．４８であった。抗体含有画分（保持時間８〜１０分）をプールした。
【０１２８】
抗カタカルシンマウス抗体−Ｃｙ５結合体を分注して−２０℃で保存した。
【０１２９】
Ａ．４．免疫移送とＴＲＡＣＥアッセイ
各試料について１０回測定で、後述のアッセイを行った。ＢＳＡ＋Ｌｙｓと抗カルシトニンヒツジ抗体クリプテートＭｏｎｏＭＰ＋Ｄ１４Ｃ結合体で被覆したマイクロタイタープレートのウェルに、組換えＰＣＴ（ＩｎＶｉｖｏ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに保存した、３００μｌのＥＤＴＡ全血試料をピペットで取り、室温で１５分間インキュベートした（試料のＰＣＴ濃度は、ＬＩＡ感受性ＢＲＡＨＭＳ ＰＣＴアッセイ（ＢＲＡＨＭＳ ＡＧ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、血漿から測定した）。次にこれを３００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回、次に３００μｌの洗浄液（８ｍＭトリス、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．５）で２回洗浄した。次にこれを、３００μｌの分解緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．６Ｍ ＫＦ、０．５％ＢＳＡ、０．０１％ヘパリン）で１０分間インキュベートした。分解した免疫複合体から、１００μｌをＴＲＡＣＥ測定に適したマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｈａｌｆ Ａｒｅａ Ｐｌａｔｅｓ，９６ウェル、黒、ポリスチレン、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｎｏ．ＣＬＳ３６９４−１００ＥＡ）に移し、５０μｌの抗カタカルシンマウス抗体−Ｃｙ５−ＮＨＳ結合体（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．６Ｍ ＫＦ、０．５％ＢＳＡ、０．０１％ヘパリン中ｃ＝２０μｇ／ｍｌ）とともに、室温で１９分間インキュベートした。高性能時間分解蛍光マイクロプレートリーダーＲＵＢＹｓｔａｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＴＥＣＨ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＴＲＡＣＥシグナルの測定（６２０ｎｍと６６５ｎｍ）を行った。
【０１３０】
この場合ＲＵＢＹｓｔａｒについて以下の装置設定を行った：
フラッシュの回数 ２０
積分遅延［μＳ］ ５０
積分時間［μＳ］ ４００
インターバル時間［μＳ］ １０
インターバルの回数 ４５
マルチプリケーター比 １０，０００
【０１３１】
各試料について、比率ＯＤ６６５ｎｍ／ＯＤ６２０ｎｍ ＤｅｌｔａＦから以下を計算した：
ＤｅｌｔａＦ＝（比率ｐｏｓ−比率ｎｅｇ）／比率ｎｅｇ
この場合、比率ｎｅｇは、ＰＣＴ陰性試料（すなわち、ＰＣＴを含有しないか又は検出できない試料）の比率を意味し、比率ｐｏｓは試験すべき試料（すなわち、ＰＣＴ含有試料候補）の比率を意味する。各平均値は、個々の試料の１０回測定から得られた。これらの値は標準濃度であり、すべての個々の試料の濃度はＭｕｌｔｉＣａｌｃ（Ｓｐｌｉｎｅ Ｆｉｔ）ソフトウェアを使用して求めた。各１０回測定について変動係数を求めた。
【０１３２】
Ｂ．全血からのＰＣＴの免疫抽出及び免疫クロマトグラフィーによる分析物検出
固相として、あらかじめオリゴ−Ａｓｐとビオチンで誘導体化されていた、第１抗ＰＣＴ抗体を結合したオリゴ−Ｌｙｓ−ＢＳＡで被覆されたポリスチレン試験管を使用した。次にＰＣＴ含有全血試料を短時間インキュベートし、この場合ＰＣＴを固相中の試料から免疫抽出した。固相を洗浄後、分解緩衝液（これは、コロイド金で標識された第２の抗ＰＣＴ抗体を含有した）を加え、短時間インキュベートした。最後に、試験バンドとしてストレプトアビジンを噴霧した試験ストリップ上で、溶液の免疫クロマトグラフィーを行った。ビオチン化された第１抗ＰＣＴ抗体及びＰＣＴもそこに結合し、次にそこに結合した第２の金標識抗ＰＣＴ抗体がストレプトアビジンに結合した。標識物の検出は反射測定により行った。
【０１３３】
特に試験は以下のように行った：
【０１３４】
Ｂ．１．固相用結合体の製造
Ｂ．１．１．ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体の製造：上記参照
Ｂ．１．２．ビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の製造
ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体（「抗ＰＣＴ抗体１」）をＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（“ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）とモル比１：１０で混合した。１．６ｍｇの抗体（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）を１０ｍＭのＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（蒸留水に新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。
【０１３５】
生成物をＮＡＰ５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１３６】
オリゴ−Ａｓｐペプチド「Ｄ１４Ｃ」（アミノ酸配列ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号２）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１７３１．４３）の結合のために、生成物をＳＭＣＣを用いてモル比１：５０で活性化した（“ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅを参照）。
【０１３７】
１．３ｍｇの生成物（１．０ｍｌのＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８で溶出した）を４．３３μｌの１００ｍＭ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１３８】
次に、直ちにモル比１：１００でオリゴ−Ａｓｐペプチド（蒸留水に溶解した）との結合を行った。室温で６０分間インキュベーション後、１００μｌの１００ｍＭシステインを用いて、反応を１０分間停止させ、結合しなかったペプチドをＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で分離し、タンパク質含量を比色法により測定した。
【０１３９】
ビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体を分注して−２０℃に保存した。
【０１４０】
Ｂ．２．試験管への結合体の結合
Ｂ．２．１．結合：ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体
放射線照射したスターチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体を用いて以下のように被覆した。
結合体を１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）で希釈して６．６７μｇ／ｍｌの濃度にした。各試験管にこの溶液３００μｌをピペットで取り、２２℃で２０時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を、３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、再度吸引除去した。次にビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の結合を行った。
【０１４１】
Ｂ．２．２．結合：ビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体
結合体を、ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含遊離ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で６６７ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。この溶液３００μｌをピペットで各試験管に取り、２２℃で１時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を再度３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、次に吸引除去した。
【０１４２】
次に試験管を真空ドライヤー中で乾燥し、４℃で保存した。
【０１４３】
Ｂ．３．金標識抗カタカルシン抗体の製造：
この成分は、８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。モノクローナル抗カタカルシン抗体をコロイド金（８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｆｒｅｎｓに従う：Ｆｒｅｎｓ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７３，２４１：２０−２２）に、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍａｚｏｎ．ｄｅ／Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ−Ｇｒｅｇ−Ｔ−Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ／ｄｐ／０１２３４２３３６８）に記載のように結合させた。
【０１４４】
Ｂ．４．試験ストリップの製造：
この成分は８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。ＭＤＩのニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，Ａｍｂａｌａ，Ｉｎｄｉａ）を、４μｇ／ｃｍのストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）（試験ライン）ならびに２．５μｇ／ｃｍの抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓａｎｔｅｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）（対照ライン）を用いて被覆した。Ｂｉｏｄｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡのマイクロディスペンサーを使用して、捕捉用分子を適用した。次に５０℃で一晩、膜を乾燥した。吸引パッドとして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡのＡＰ２２を使用した。
【０１４５】
Ｂ．５．免疫移送と免疫クロマトグラフィー
すべての試料について１０回測定で、後述のアッセイを行った。ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ及びビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋Ｄ１４Ｃ結合体で被覆した試験管に、組換えＰＣＴ（ＩｎＶｉｖｏ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに保存した、３００μｌのＥＤＴＡ全血試料をピペットで取り、室温で１５分間インキュベートした（試料のＰＣＴ濃度は、ＬＩＡ感受性ＢＲＡＨＭＳ ＰＣＴアッセイ（ＢＲＡＨＭＳ ＡＧ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、血漿から測定した）。次にこれを３００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回、次に３００μｌの洗浄液（８ｍＭトリス、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．５）で２回洗浄した。次にこれを、１５０μｌの分解緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５％ＢＳＡ、０．５％ツイーン２０、０．０１％ヘパリン）（これは、金標識抗カタカルシンモノクローナル抗体を含有した）を用いて、確認しながら１０分間インキュベートした。低結合性マイクロタイタープレートのウェル中の１５０μｌを、分解した免疫複合体から移した。次に、試験ストリップをウェルに挿入して、直接免疫クロマトグラフィーを行った。３０分後、試験バンドの着色を、ＬＲＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙの反射計を用いて測定した。
【０１４６】
各平均値は、個々の試料の１０回測定から得られた。これらの値は標準濃度として使用し、すべての個々の試料の濃度はＭｕｌｔｉＣａｌｃ（Ｓｐｌｉｎｅ Ｆｉｔ）ソフトウェアを使用して求めた。各１０回測定について変動係数を求めた。
【０１４７】
Ｃ．標準的免疫クロマトグラフィーによる全血からのＰＣＴの検出
適用すべき全血試料の血球を保持するのに適した膜とともに、試料添加領域に試験ストリップを作成した。乾燥状態では、一方で第１ビオチン化抗ＰＣＴ抗体を含有し、他方では第２のコロイド金標識抗ＰＣＴ抗体を含有する多孔性クッション（「試料パッド」）を、この膜と試験ストリップとの間に取り付けた。試験バンドとして、ストレプトアビジンをストリップ上に噴霧した。試験ストリップをプラスチックカセット中に入れた。ＰＣＴ含有全血試料を免疫クロマトグラフィーした。ビオチン化した第１抗ＰＣＴ抗体従ってそこに結合したＰＣＴも、及び次にそこに結合した第２の金標識抗ＰＣＴ抗体も、ストレプトアビジンに結合する。標識の検出は反射測定により行った。
【０１４８】
特に試験は以下のように行った：
【０１４９】
Ｃ．１．固相用結合体の製造
Ｃ．１．１．ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体の製造：上記参照
Ｃ．１．２．ビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の製造：上記参照
【０１５０】
Ｃ．２．金標識抗カタカルシン抗体の製造：上記参照
【０１５１】
Ｃ．３．試験ストリップの製造：
この成分は８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。ＭＤＩのニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，Ａｍｂａｌａ，Ｉｎｄｉａ）を、４μｇ／ｃｍのストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）（試験ライン）ならびに２．５μｇ／ｃｍの抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓａｎｔｅｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）（対照ライン）を用いて被覆した。Ｂｉｏｄｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡのマイクロディスペンサーを使用して、捕捉用分子を適用した。次に５０℃で一晩、膜を乾燥した。吸引パッドとして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡのＡＰ２２を使用した。全血検査の作成のために、８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙの全血構成を使用した。一方では試料添加領域に、コロイド金に結合した抗カタカルシン抗体を、他方ではビオチン化＋オリゴ−Ａｓｐ誘導体化抗カタカルシン抗体を、２つの別々のパッドに固定化した。８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙの標準的ハウジングをカセットとして使用した。
【０１５２】
Ｃ．４．標準的免疫クロマトグラフィー
すべての試料について１０回測定で、後述の免疫クロマトグラフィーを行った。組換えＰＣＴ（ＩｎＶｉｖｏ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに保存した１２０μｌのＥＤＴＡ全血試料を、ピペットで試験ストリップに入れた（試料のＰＣＴ濃度は、ＬＩＡ感受性ＢＲＡＨＭＳ ＰＣＴアッセイ（ＢＲＡＨＭＳ ＡＧ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、血漿から測定した）。３０分後、試験バンドの着色を、ＬＲＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙの反射計を用いて測定した。
【０１５３】
各平均値は、個々の試料の１０回測定から得られた。これらの値は標準濃度として使用し、すべての個々の試料の濃度はＭｕｌｔｉＣａｌｃ（Ｓｐｌｉｎｅ Ｆｉｔ）ソフトウェアを使用して求めた。各１０回測定について変動係数を求めた。
【０１５４】
Ｄ．全血からのＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの免疫抽出と免疫クロマトグラフィーによる分析物検出
全血からの免疫抽出法と免疫クロマトグラフィーによる分析物検出のための別の例として、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（中間領域プロアドレノメジュリン）分析のための試験系を開発した。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、血液中を循環する安定なペプチドであり、アドレノメジュリンの前駆体のタンパク質分解プロセシングから公知である（Ｓｔｒｕｃｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００４ Ａｕｇ；２５（８）：１３６９−７２）。アドレノメジュリンは最も良く知られている内因性血管拡張物質の１つであり、無数の生物学的プロセスの制御、特に心血管系の制御に関与している（Ｂｅｌｔｏｗｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｏｌ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４ Ｊａｎ−Ｆｅｂ；５６（１）：５−２７）。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの測定は、種々の病態の診断と予後の枠内で、信頼して測定することができない成熟アドレノメジュリンの代替マーカーとして有用であることがわかった。これらには、ＣＯＰＤ（Ｓｔｏｌｚ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｓｔ．２００８ Ｍａｙ １９［Ｅｐｕｂ印刷前］）、肺炎（Ｃｈｒｉｓｔ−Ｃａｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ．２０６；１０（３）：Ｒ９６）、敗血症（Ｃｈｒｉｓｔ−Ｃａｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ．２００５；９（６）：Ｒ８１６−２４）、心筋梗塞（Ｋｈａｎ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００７ Ａｐｒ １０；４９（１４）：１５２５−３２）、心不全（Ｇｅｇｅｎｈｕｂｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ Ｃａｒｄ Ｆａｉｌ．２００７ Ｆｅｂ；１３（１）：４２−９）がある。
【０１５５】
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭについて本発明の方法は、正常範囲（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ， Ｎ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｏｃｔ；５１（１０）：１８２３−９）、及び種々の臨床像（上記参照）に関連する高濃度の領域の両方で、高い精度を示す（図３）。
【０１５６】
特に試験は以下のように行った：
【０１５７】
Ｄ．１．固相用結合体の製造
Ｄ．１．１．ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体の製造：上記参照
Ｄ．１．２．抗「ＳＰＣＤ１９」ヒツジ抗体ビオチン化＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の製造
オリゴ−Ａｓｐペプチド「Ｄ１４Ｃ」（アミノ酸配列 ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号２）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１７３１．４３）との結合のために、ポリクローナル抗「ＳＰＣＤ１９」（アミノ酸配列ＣＲＰＱＤＭＫＧＡＳＲＳＰＥＤＳＳＰＤ（配列番号１０）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝２０６３）ヒツジ抗体を、ＳＭＣＣを用いて比率１：２５で活性化した（“ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照） 。
【０１５８】
１．０ｍｇの抗体を１６．６７μｌの１０ｍｍｏｌ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）及び１０３μｌのＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１５９】
次に、直ちにモル比１：１００でオリゴ−Ａｓｐペプチド（蒸留水に溶解した）との結合を行った。室温で６０分間インキュベーション後、結合しなかったペプチドをＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で分離し、タンパク質含量を比色法により測定した。
【０１６０】
生成物をＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２１３３８）とモル比１：２０で混合した（“ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。９００μｇの抗体（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）を１２μｌのＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（蒸留水に新に溶解した）と混合した。室温で３０分間インキュベート後、５０μｌの１Ｍ一時的を用いて反応を１０分間停止させた。生成物をＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１６１】
ビオチン化抗「ＳＰＣＤ１９」ヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体を分注して−２０℃で保存した。
【０１６２】
Ｄ．２．試験管への結合体の結合
Ｄ．２．１．結合：ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体
放射線照射したスターチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＢＳＡ−オリゴ−Ｌｙｓ結合体を用いて以下のように被覆した：
【０１６３】
結合体を、１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）の溶液を用いて６．６７μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。１つの試験管当たりこの溶液各３００μｌをピペットで取り、２２℃で２０時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を、３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、再度吸引除去した。次にビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の結合を行った。
【０１６４】
Ｄ．２．２．結合：ビオチン化抗「ＳＰＣＤ１９」ヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体
結合体を、ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含遊離ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で６６７ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。この溶液３００μｌをピペットで各試験管に取り、２２℃で１時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を再度３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、次に吸引除去した。
【０１６５】
次に試験管を真空ドライヤー中で乾燥し、４℃で保存した。
【０１６６】
Ｄ．３．金標識抗「ＰＳＶ１１」抗体の製造：
モノクローナル抗「ＰＳＶ１１」抗体を使用した（ＰＳＶ１１はＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの部分配列を示す；アミノ酸配列ＣＳＳＰＤＡＡＲＩＲＶ（配列番号１１）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１１７４）。抗体をコロイド金（ＢＢＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＥＭ．ＧＣ ６０ｎｍ）に、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍａｚｏｎ．ｄｅ／Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ−Ｇｒｅｇ−Ｔ−Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ／ｄｐ／０１２３４２３３６８）に記載のように結合させた。
【０１６７】
Ｄ．４．試験ストリップの製造：
この成分は８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。ＭＤＩのニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，Ａｍｂａｌａ，Ｉｎｄｉａ）を、４μｇ／ｃｍのストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）（試験ライン）を用いて被覆した。Ｂｉｏｄｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡのマイクロディスペンサーを使用して、捕捉用分子を適用した。次に５０℃で一晩、膜を乾燥した。吸引パッドとして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡのＡＰ２２を使用した。
【０１６８】
Ｄ．５．免疫移送と免疫クロマトグラフィー
すべての試料について１０回測定で、後述のアッセイを行った。ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ及び抗ビオチン化「ＳＰＣＤ１９」ヒツジ抗体＋「Ｄ１４Ｃ」結合体で被覆した試験管に、合成４５〜９２プロアドレノメジュリン（アミノ酸配列ＥＬＲＭＳＳＳＹＰＴＧＬＡＤＶＫＡＧＰＡＱＴＬＩＲＰＱＤＭＫＧＡＳＲＳＰＥＤＳＳＰＤＡＡＲＩＲＶ（配列番号９）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝５１１５）とともに保存した、３００μｌのＥＤＴＡ全血試料をピペットで取り、室温で１５分間インキュベートした（試料のプロＡＤＭ濃度は、ｐｒｏＡＤＭ ＬＩＡ ＢＲＡＨＭＳアッセイ（ＢＲＡＨＭＳ ＡＧ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、血漿から測定した。次にこれを１ｍｌの洗浄液（８ｍＭトリス、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．５）で５回洗浄した。
【０１６９】
次にこれを１０分間攪拌しながら、１５０μｌの分解緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０、０．１％ヘパリン、０．０８％ＮａＮ３）（これは、金標識抗「ＰＳＶ１１」モノクローナル抗体も含有した）でインキュベートした。分解した免疫複合体から、１００μｌを低結合性マイクロタイタープレートのウェルに移した。次に、試験ストリップをウェルに挿入して、直接免疫クロマトグラフィーを行った。３０分後、試験バンドの着色を、ＬＲＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙの反射計を用いて測定した。
【０１７０】
各平均値は、個々の試料の１０回測定から得られた。これらの値は標準濃度として使用し、すべての個々の試料の濃度はＭｕｌｔｉＣａｌｃ（Ｓｐｌｉｎｅ Ｆｉｔ）ソフトウェアを使用して求めた。各１０回測定について変動係数を求めた。
【０１７１】
文献
【０１７２】
【化１】
【０１７３】
【化２】
【０１７４】
【化３】
【０１７５】
【化４】
【０１７６】
【化５】
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象は、以下のプロセス工程を含む、生物学的試料からの分析物の検出方法である：
ａ）固相に固定化される可逆的結合パートナー１の調製（ここに、分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー１と２との結合により固定化される）、
ｂ）生物学的試料の添加、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへの分析物の結合、
ｃ）生物学的試料の分離、
ｄ）分解緩衝液の添加（これは、可逆的結合パートナー１と２との結合を分解し、ここで分析物バインダーへの分析物の結合は任意である）、及び
ｅ）生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中での分析物の検出、又は生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物の欠失の測定。
【背景技術】
【０００２】
迅速検査又はポイントオブケア（ＰＯＣ）検査法が、様々な方法で開発されている（１）。しかし、これらのうちで販売できるところまで行ったものはほとんど無い。
【０００３】
現在確立されている迅速検査法、例えばＴＲＩＡＧＥ系（Ｂｉｏｓｉｔｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）（特に最も一般的な方法である免疫クロマトグラフィー）は、低い分析感度、ならびに標準的イムノアッセイ（用手法法又は自動化法）と比較して低い精度を有する欠点があるが、適切な例（２）〜（７）のいずれの場合も未処理の全血試料を処理できる利点がある。
【０００４】
欠点は、主に試料マトリックスへの方法の依存性と、使用可能な試料容量の限界である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って本発明の目的は、未処理の全血試料を処理できて、標準的なイムノアッセイに匹敵する分析感度と精度とを有する、迅速検査で行われる方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の対象は、特に分析物特異的バインダー（例えば抗ＰＣＴ抗体）の固定化のための、本発明の可逆的結合系の使用である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】分析物（ＰＣＴ）が、２時間のインキュベーションの標準法と同様の効率で、特にわずかに５分間のインキュベーションという早さで、全血から免疫抽出できることを示す。
【図２】３つの方法（Ａ：ＴＲＡＣＥ法による免疫移送、Ｂ：免疫クロマトグラフィーによる免疫移送、Ｃ：標準的免疫クロマトグラフィーの標準）で測定した、種々のＰＣＴ濃度を有する全血試料の複数回測定値の変動係数を示す。免疫移送を含む２つの方法は、本発明の方法である。標準的免疫クロマトグラフィーは標準法である。
【図３】免疫クロマトグラフィーによる免疫移送の本発明の方法を用いて測定した、種々のＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ濃度を有する全血試料の複数回測定値の変動係数を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の対象は、以下のプロセス工程を含む、生物学的試料からなる分析物の検出方法である：
ａ）固相に固定化される可逆的結合パートナー１の調製（ここに、分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー１と２との結合により固定化される）、
ｂ）生物学的試料の添加、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへの分析物の結合、
ｃ）生物学的試料の分離、
ｄ）分解緩衝液の添加（これは、可逆的結合パートナー１と２との結合を分解し、ここで分析物バインダーへの分析物の結合は任意である）、及び
ｅ）生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中での分析物の検出、又は生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物の欠失の測定。
【０００９】
工程ｂ）とｃ）の間で、あるインキュベーション時間が維持されることは、当業者には明らかである。インキュベーション時間は３０秒以下でも２４時間以上であってもならず、特に好ましくは迅速検査法の範囲内であり、インキュベーション時間は５〜１５分である。工程ｄ）の分解法は、好ましくは最大２４時間であり、好ましくは迅速検査法の範囲内であり、分解法は、１５秒より長く１５分より短く、好ましくは５〜１５分である。
【００１０】
分析物バインダーへの分析物の結合は、ｄ）の分解中及び／又はその後も維持されるか、又は全く維持されない。本発明では両方の選択肢が考えられる。分析物と分析物バインダーとの結合は、好ましくはｄ）の分解緩衝液の添加中及び／又はその後も維持される。結合は好ましくは、分析物分子の少なくとも９０％で維持される。結合が維持されない場合、これは好ましくは後で確立される。最も好ましくは分析物と分析物バインダーとの結合は検出の時間に存在し、すなわちこれは分解工程中維持されるか又は再度確立される。
【００１１】
好適な実施態様において、分析物バインダーは抗分析物抗体である。
本発明の方法の好適な実施態様において、生物学的液体は未処理の全血試料である。
【００１２】
本発明において固定化された可逆的結合パートナー１は、直接又はキャリアータンパク質により固定化される。キャリアータンパク質の例は、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）である。適当なキャリアータンパク質は、当業者に公知である。
【００１３】
本発明において、強固な結合を形成できる種々の結合パートナーが適しているが、ある条件下ではこれらは、結合を破壊でき、従って「可逆的結合系」である。ここで特に関係のあるものは、比較的穏和な条件下で、すなわちタンパク質（特に抗体）のコンフォメーション及びその抗原への結合を大きく障害することのない条件下で、結合を不安定化できる結合系である。
【００１４】
このような可逆的結合系の応用は、複雑なタンパク質混合物（例えば細胞抽出物）からの組換えタンパク質の精製可能性に関連して知られている。この関連で組換えＤＮＡ技術を使用して、目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列が、いわゆる「タグ」をコードする配列に結合され、こうして「タグ」により延長されるタンパク質が発現される。固相に固定化される「タグ」の結合パートナーを介して、タンパク質混合物からの「タグ」タンパク質は、選択的に結合し、次に「タグ」結合の特異的不安定化により固相から再度分離することができる。次に目的のタンパク質は濃縮型又は溶液中の純粋な型になる。一般的に使用される「タグ」、対応する固定化結合パートナー、及び特異的不安定化法のリストは、例えば（８）〜（１０）に存在する。
【００１５】
このような結合系は、結合パートナーとして本発明の範囲内で使用することができる。
【００１６】
本発明の方法の範囲内で、特に可逆的結合パートナー１と２の結合対を以下の結合対の１つから選択することができる：
ａ）陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
ｂ）Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質と、ペプチド／タンパク質がＣａ２＋に結合している時ペプチド／タンパク質が高親和性で結合する抗体、
ｃ）オリゴヒスチジン（例えば、６Ｈｉｓ）とＮｉ−ＮＴＡ、
ｄ）ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン。
【００１７】
本発明の範囲内であるいくつかの可逆的結合系を、ここに簡単に示す：
ペプチド／タンパク質がＣａ２＋に結合している時、高親和性でペプチド／タンパク質が結合するＣａ２＋結合ペプチド／タンパク質及び抗体の例は、ＦＬＡＧ／ＭＩ系であり、ここで、Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質はＦＬＡＧ−ペプチドであり、抗体はＭ１抗体である。別の系では、Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質はＦＬＡＧ−ペプチドであり、及び抗体はＭ１抗体である。別の系では、Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質はプロテインＣペプチドであり、及び抗体はＨＰＣ４抗体である。
【００１８】
ａ）ＦＬＡＧ／Ｍ１
従って１つの例は、モノクローナル抗体Ｍ１（４Ｅ１１としても記載される）といわゆるＦＬＡＧペプチドとの結合である。このペプチドはカルシウム２＋に結合することができ、こうしてあるコンフォメーションを取る。このコンフォメーションのみがＭ１により効率的に結合される。カルシウム２＋錯化剤（例えばＥＤＴＡ）を加えることにより、カルシウム２＋がペプチドから除去され、ペプチドは別のコンフォメーションを取り、これによりＭ１抗体は、ペプチドに対するその親和性を劇的に低下させる；米国特許第４，８５１，３４１号（１１）。
【００１９】
ｂ）Ｃ／ＨＰＣ４タンパク質
このような結合対の別の同様の例は、ヒトプロテインＣから得られ、カルシウム２＋依存性の形を取るタンパク質と、モノクローナル抗体ＨＰＣ４（１２）である。
【００２０】
ｃ）Ｎｉ２＋−ＮＴＡ／６Ｈｉｓ
別の例は、イミダゾールの添加により特異的に不安定化することができるＮｉ２＋−ＮＴＡ／６Ｈｉｓ系である（１３）。
【００２１】
ｄ）荷電ペプチドオリゴマー
別の例は、その互いの結合がイオン強度を上げることにより不安定化することができる、陽性荷電又は陰性荷電ペプチドオリゴマー（例えば、オリゴ−Ｌｙｓ又はオリゴ−Ａｓｐ）である。結合対として、イオン交換マトリックスに関連して荷電ペプチドオリゴマーが記載される；またこの結合はイオン強度を上げることにより不安定化される（１４）〜（１６）。
【００２２】
結合パートナーの１つが組換えタンパク質中に組み込まれる可逆的結合系以外に、結合パートナーの１つが、固定化されるタンパク質に化学的に結合される系も知られている。例えばここでは、ビオチン／アビジン系が言及される。ビオチンは、例えばＮＨＳエステルの形であるタンパク質の１級アミン基に結合することができる（１７）。この結合系もまた、過剰のビオチンを加えることにより不安定化されるが、高温及び長いインキュベーション時間のような劇的な条件下でのみである（１８）。しかし、いわゆるモノマーアビジンを使用するこの系の変更態様が記載されている；ビオチンによる「非可逆的」結合部位の飽和後、残りの「可逆的」結合部位はビオチン化タンパク質への結合に適しており、これは、結合部位からのビオチンにより穏和な条件下で分解することができる（１９）。
【００２３】
組換えタンパク質について上記したペプチド「タグ」はまた、タンパク質にも化学的に結合可能なはずであり、こうして誘導体化されたタンパク質は可逆的結合に適用される。本発明の範囲内で、誘導体化の程度は制御でき、化学的結合は比較的時間が節約でき経済的であるため、化学的結合はタンパク質誘導体化の好適な変更態様と見なすことができる。
【００２４】
可逆的結合系の既に記載したすべての例は、結合パートナーの非共有結合的相互作用に基づく。しかし本発明の範囲内で、これらの系はまた、第１の共有結合が存在して、これは化学的に分解できる可逆的結合系と見なすことができる。例えばヘテロ２官能性架橋剤（例えばＳＰＤＰ）による共有結合性架橋が言及される（２０）；還元剤を加えることにより、ジスルフィド結合を切断でき、こうして結合が分解される。
【００２５】
すなわち本発明の対象は、分析物バインダーが可逆的結合パートナー２に共有結合される、本発明の迅速検査法である。
すなわち本発明の対象は、分析物バインダーが抗プロカルシトニン抗体である好適な実施態様における、本発明の方法である。
すなわち本発明の好適な対象は、分析物特異的バインダー、例えば抗ＰＣＴ抗体の固定化のための可逆的結合系の適用である。
【００２６】
荷電ペプチドオリゴマー（上記参照）の可逆的結合系のための適用が例として以下に明記されるが、同様に他の系用に変化させることができる。オリゴ−Ａｓｐは、キャリアータンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）上に結合され、この結合体は固相（例えば、高結合性ポリスチレンマイクロタイタープレート）上に安定に固定化される。オリゴ−Ｌｙｓは抗ＰＣＴ抗体に結合される。オリゴ−Ｌｙｓ−抗ＰＣＴ抗体と固相とのインキュベーションは、イオン的相互作用によるオリゴ−Ｌｙｓとオリゴ−Ａｓｐ部分の結合により、抗体の固定化を引き起こす。
【００２７】
別の実施態様において抗ＰＣＴ抗体はまた、抗ＰＣＴ抗体に対するオリゴ−Ｌｙｓ誘導体化抗体（例えば、抗ＰＣＴ抗体がマウスモノクローナル抗体である場合、抗マウスＩｇＧ抗体）により間接的に固定化することができる。
【００２８】
免疫抽出の原理は、例えばＰＣＴ分析について以下に説明される。
【００２９】
第１に、抗ＰＣＴ抗体は可逆的結合系を介して固相上に固定化される。検査すべき全血試料（この例には、荷電ペプチドオリゴマー及びＥＤＴＡ血液）を加え、ＰＣＴを試料から免疫抽出する。この場合、比較的多量の試料を使用することができ、従って比較的多量のＰＣＴが抽出でき、これは、検査の高い分析感度を与える。短いインキュベーション時間後、試料を分離する（洗浄により、又は他の適切な分離法により、例えば吸引又は適切な遠心分離により）。次の工程では、緩衝液を加え（「分解緩衝液」）、これは、固相への抗体の結合を広範に不安定化するのに適しているが、ＰＣＴと抗体との結合は不安定化しない物質（例えば、オリゴ−Ｌｙｓ／オリゴ−Ａｓｐ系中の強く陰性荷電したヘパリン）を含有する。すなわち、測定すべき分析物（特異抗体上に複合体化している）を大量に含有する溶液を利用できる。試料マトリックスはあらかじめ分離されたため、検査される試料の溶液はいつも同じ組成である。この工程の利点は以下の通りである：
【００３０】
−未処理全血を使用できること、
−多量の試料を使用でき、従って比較的多量の分析物を抽出でき、最終的に以後の測定法で高い分析アッセイ感度を達成できること、
−測定法の精度と正確度に有利な影響を与える測定法における以後の工程の、マトリックスへの非依存性。
【００３１】
溶液中に入れられる免疫抽出分析物は、種々の方法で検出することができる。１つの例は、ＴＲＡＣＥ法であり、別の例（後述の追加の方法）は免疫クロマトグラフィーである。
【００３２】
サンドイッチイムノアッセイについてＴＲＡＣＥ法は、異なる蛍光標識物（例えば、シアニン又はクリプテート）で標識された２つの抗体を使用する。溶液中の分析物とのサンドイッチ形成では、両方の標識物が空間中で接近して、これが対応する光励起により特異的発光をする。
【００３３】
例えばＰＣＴの分析に関連して、オリゴ−Ｌｙｓが結合した抗ＰＣＴ抗体は、固定化の前にまずクリプテートで標識される。
【００３４】
ここで、免疫抽出が行われる。分解緩衝液では、分解剤以外に、サンドイッチ形成に必要な第２のシアニン標識抗ＰＣＴ抗体が含まれる。すなわち分解緩衝液を加えることにより、固相からの抗原−抗体複合体の分解とサンドイッチ形成の両方が行われ、これは適切な光励起により検出することができる。分解とサンドイッチ形成への第２抗体の添加はまた、連続して行うことができる。
【００３５】
上記変更態様において、分析物特異的抗体は、オリゴ−Ｌｙｓ誘導体化（例えば、抗マウスＩｇＧ）抗体を介して免疫抽出前に、間接的に固定化される。本実施態様において次に、蛍光標識物は１つの又は別の抗体に結合することができる。
【００３６】
免疫クロマトグラフィーの例では、オリゴ−Ｌｙｓに結合した抗ＰＣＴ抗体は、固定化の前にまずビオチンでさらに標識される。ここで免疫抽出が行われる。分解緩衝液には、分解剤以外に、コロイド金で標識されサンドイッチ形成に必要な第２の抗ＰＣＴ抗体が含まれる。サンドイッチ形成のための分解と第２抗体の添加はまた、連続して行うことができる。次に反応混合物を免疫クロマトグラフィー試験ストリップに添加し、その上に、形成されるサンドイッチの捕捉用物質として、ビオチンバインダー（例えばアビジン）を、試験ストリップの後部に細い線として、反応溶液の供給方向に交差するように噴霧する。
【００３７】
本発明の方法のこの好適な実施態様において、分析物バインダーは標識され、また分解緩衝液の添加後の分析物の検出のための標識物で標識されて維持される。
【００３８】
免疫クロマトグラフィーの実施態様において、以下の追加の変更態様が企図される。
結合パートナー２を用いる誘導体化以外に、免疫抽出抗体はさらにビオチン化される。サンドイッチ形成のための第２抗体が標識される（例えばコロイド金で）。すなわち試験ストリップ上の捕捉用物質は、ビオチンバインダー（例えば、アビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン）であろう。
【００３９】
免疫抽出抗体（例えば、ポリクローナルヒツジ）は、結合パートナー２のみで誘導体化される。サンドイッチ形成のための第２抗体は、別の動物種（例えばモノクローナルマウス）由来でなければならず、これは標識される（例えばコロイド金で）。
【００４０】
試験ストリップ上の捕捉用物質は、抗ヒツジＩｇＧ抗体であろう。免疫抽出抗体が標識を有する形の両方の変更態様が企図され、すなわち第１の変更態様で、第２抗体はビオチン化される（その代わりとして、ここで第２抗体はまたストリップ上に直接噴霧することができる）。
【００４１】
本発明の別の好適な実施態様において、分解緩衝液は、検出に必要な別の標識成分を含有する。
【００４２】
この方法の特に好適な実施態様において、検出に必要な追加の標識成分は、サンドイッチイムノアッセイの実施のための第２の分析物バインダーである。
【００４３】
標識分析物の検出は、特に好ましくはＴＲＡＣＥ法を使用するイムノアッセイにより行われる。
【００４４】
別の好適な実施態様において、標識分析物の検出は免疫クロマトグラフィーにより行われる。
【００４５】
本発明の特に好適な変更態様において、生物学的試料は希釈されず、固相の被覆部分が生物学的試料と完全に接触するような容量で使用される。
【００４６】
試料の添加から検出までは、特に好ましくは３０分を超えず、従ってこの方法は迅速検査法と見なすことができる。
【００４７】
また本発明の対象は、
・分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合される可逆的結合パートナー１が、その中に固定化された固相を含み、
・分解緩衝液を加えることにより可逆的結合パートナー１と２の間の結合が分解されるが、分解緩衝液を加えた時、分析物バインダーへの分析物の結合は任意であることを特徴とする、本発明の方法を実施するための装置である。
【００４８】
同様に、本発明の対象は、
・固定化された可逆的結合パートナー１を有する固相、
・可逆的結合パートナー２に結合した分析物バインダーを含む複合体（ここで複合体は随時、可逆的結合パートナー１と２を固相に結合させることにより、すでに固定化型で存在してもよい）、
・可逆的結合パートナー１と２との結合を分解する分解緩衝液（しかしここで、分析物バインダーへの分析物の結合は任意である）、
を含んでなる、本発明の方法を実施するためのキットである。
【００４９】
特に好適な実施態様においてキット中に存在する分析物バインダーは、抗ＰＣＴ抗体である。
【００５０】
選択された結合対として、最も好適なキットは、以下の結合対
・陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
・Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質と、ペプチド／タンパク質がＣａ２＋に結合している時ペプチド／タンパク質が高親和性で結合する抗体、
・オリゴヒスチジン（例えば６Ｈｉｓ）とＮｉｎ−ＮＴＡ、
・ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン、
の１つから選択される、可逆的結合パートナー１と２を含有する。
【００５１】
以下の例は、本発明の対象を限定することなく、本発明をより詳細に説明する。
【実施例】
【００５２】
全血からのＰＣＴの免疫抽出
追加の工程の処理のための基礎として、まずＰＣＴ例中で検査される分析物が、固相に固定化された分析物特異的抗体を使用して、未処理のＥＤＴＡ全血から抽出できるか、そして如何に有効に抽出できるかを試験した。全血試料の短時間のインキュベーション（５分）と分離後、結合したＰＣＴを、第２の化学発光標識抗ＰＣＴ抗体を用いて検出した。比較のために、緩衝液で希釈したＰＣＴ含有血清を同じ固相上で、しかしより長時間（２時間）インキュベートし、結合したＰＣＴを希釈試料からの分離後、上記のように検出した。
【００５３】
特に検査は以下のように行った：
免疫抽出を調べるために、ＢＲＡＨＭＳ ＰＣＴ感受性ＬＩＡキットを使用した（ＢＲＡＨＭＳ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。発光標識抗ＰＣＴトレーサー抗体Ａを、操作説明書に従ってトレーサー復元緩衝液Ｂに溶解した。健常血液ドナーのＥＤＴＡ全血に、スタンダードシリーズを以下の濃度で溶解した：ｃ＝０．００７；０．０１４；０．０３６；０．１７１；０．３８３；１．７３；７．９９ｎｇ／ｍｌ。抗ＰＣＴ抗体で被覆された試験管に、各３００μｌの全血スタンダードをピペットで取り、室温で５分間インキュベートした。次に試験管を５×１ｍｌの洗浄液（８ｍＭトリス、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．５）で洗浄した。次に２００μｌの発光標識抗ＰＣＴ抗体をピペットで取り、室温で２時間インキュベートした；試験管を５×１ｍｌの洗浄液で再度洗浄した。試験管に結合した化学発光をルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２Ｔ；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【００５４】
標準法（希釈血清からのＰＣＴの測定）を、ＢＲＡＨＭＳ ＰＣＴ感受性ＬＩＡキット（ＢＲＡＨＭＳ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に基づき以下のように行った。スタンダードシリーズを試験キットからのゼロ血清で以下の濃度で溶解した：ｃ＝０．００８；０．０３１；０．０４２；０．１２６；０．２５１；１．２１；５．６１；２８．０ｎｇ／ｍｌ。抗ＰＣＴ抗体で被覆された試験管に、各５０μｌの血清スタンダードと２５０μｌのトレーサー復元緩衝液Ｂをピペットで取り、室温で２時間インキュベートした。次に試験管を５×１ｍｌの洗浄液（８ｍＭトリス、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．５）で洗浄した。次に２００μｌの発光標識抗ＰＣＴ抗体をピペットで取り、室温で２時間インキュベートした；試験管を５×１ｍｌの洗浄液で再度洗浄した。試験管に結合した化学発光をルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２Ｔ；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した（図１）。
【００５５】
固相に可逆的に結合される抗体の製造
上記したいくつかの可逆的結合系を、固相に可逆的に抗体（本例では抗ＰＣＴ抗体）を結合させる適切性について調べた。この点で、抗体を様々な程度に誘導体化し（表１参照）、化学発光標識物で標識した。こうして、これらの抗体が各誘導体に応じて如何に固相に結合するか、そしてこれらが再度如何に分解されるかを調べた。表１の結果の要約は、ビオチン／アビジン系を除いたすべての調べた可逆的結合系が特異的かつ迅速に不安定化されることを示し、６Ｈｉｓ／Ｎｉｎ−ＮＴＡ系には制限があるが、血液マトリックスにより障害されない。
【００５６】
【表１】
【００５７】
さらに結合と特異的分解の効率が、各誘導体化の程度（結合パートナー１対抗体のモル比）、固相上に固定化される結合パートナー２の濃度（すなわち、結合パートナー１が抗体に結合して、結合パートナー２が固定化されたかどうか、又は結合パートナー２が抗体に結合して、結合パートナー１が固定化されたかどうか）、及びオリゴ−Ａｓｐ／オリゴ−Ｌｙｓ系の場合は２つのオリゴマーの長さ、により影響を受けることが観察された。従って本発明の範囲内で、このような変更態様も可逆的結合系の範囲内に入り、請求項はこのような変更態様を明白に包含するが、例えばここに記載される変更態様は、好適な実施態様と見なすことができる。オリゴ−Ｌｙｓ−ＢＳＡの代替として、ポリリジン固相も適していた。
【００５８】
特に、試験は以下のように行った：
【００５９】
結合パートナー１（液相）
１．ＭＡＣＮ−化学発光標識抗体の製造
ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体を以下のように処理した：
３つの標識物を調製し、これらを、インキュベーション後に示差的に緩衝化した（下記参照）。
【００６０】
抗体の化学発光標識のために、１ｍｌの抗体溶液（ｃ＝３．１９ｍｇ／ｍｌ）を４０μｌの１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．８）及び２．７μｌのＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳエステル（ｃ＝１ｍｇ／ｍｌ；ＩｎＶｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合した（抗体：ＭＡＣＮのモル標識比：１０：１）。次に、これを室温で３０分インキュベートした。次に標識調製物をＮＡＰ−１０ゲルろ過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を通して１．５ｍｌの移動相溶媒で緩衝化し、こうして低分子量成分を除去した。
【００６１】
標識物１ ＰＢＳ ｐＨ７．４ ビオチン化用 ２．１参照
標識物２ １００ｍＭリン酸ナトリウム、
５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６．９ ＳＰＤＰ活性化用 ２．２参照
標識物３ ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ＳＭＣＣ活性化用 ２．３参照
タンパク質含量を比色法により測定した。標識抗体を分注して−２０℃で保存した。
【００６２】
２．ＭＡＣＮ−化学発光標識抗体の誘導体化
２．１．ビオチン化
ＭＡＣＮ抗体をＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２１３２５）を用いて、１：１０のモル比でビオチン化した。
【００６３】
１ｍｇのＭＡＣＮ抗体を５．４１μｌの１．２３３ｍＭビオチン溶液（ＤＭＳＯ中に新に溶解した）と混合し、室温で６０分間インキュベートした。１００μｌの５０ｍＭグリシンを用いて室温で１０分間反応を停止させ、ＮＡＰ５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で精製した。
【００６４】
抗体に結合しなかったビオチンからラジカルを分離するために、ゲルろ過ＨＰＬＣを行った（カラム：Ｂｉｏ−Ｓｉｌ Ｓｅｃ ４００，Ｂｉｏｒａｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。試料を添加し、流速０．８ｍｌ／分でＰＢＳ（ｐＨ７．４）でクロマトグラフィーを行った。フロー比色計を用いて、２８０ｎｍと３５４ｎｍの波長を測定した。μＭビオチン／μＭ抗体標識の程度は、ピークで０．４８であった。抗体含有画分（保持時間１１〜１２分）をプールした。
【００６５】
タンパク質含量を比色法により測定した。結合体を分注して−２０℃で保存した。
【００６６】
２．２．それぞれ抗ＦＬＡＧ−タグＭ１抗体及び抗ＰｒｏｔＣ−タグＨＰＣ４抗体との結合
それぞれ抗ＦＬＡＧ−タグＭ１抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｆ３０４０）及び抗ＰｒｏｔＣ−タグＨＰＣ４抗体（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ，ＵＳＡ，ＵＳＡ，Ａｒｔ Ｎｏ．１１８１４５１６００１）との結合のために、後者とＭＡＣＮ抗体をＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２１８５７）とを、モル比１：７で活性化した（“ＳＰＤＰ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。
【００６７】
各２ｍｇの抗体を４．６７μｌの２０ｍｍｏｌ ＳＰＤＰ（エタノールに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。活性化Ｍ１及びＨＰＣ４抗体のみを２００ｍｍｏｌのＤＴＴ（ジチオスレイトール、１００ｍｍｏｌのリン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ６．９に溶解した）を用いて、最終濃度１０ｍｍｏｌのＤＴＴとし、室温で１５分間還元した。
【００６８】
それぞれ還元したＭ１及びＨＰＣ４抗体を、ＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：１００ｍｍｏｌのリン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ６．９）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【００６９】
還元した生成物を、それぞれ非還元ＳＰＤＰ活性化ＭＡＣＮ抗体とモル比１：１で４℃で一晩結合させた。次に各５０μｌの１００ｍｍｏｌシステインを用いて、反応を１０分間停止させた。
【００７０】
タンパク質含量を比色法により測定した。結合体を分注して−２０℃で保存した。
【００７１】
２．３．それぞれＨｉｓ−タグとオリゴ−Ａｓｐペプチドとの結合
それぞれＨｉｓ−タグペプチド「ＰＲＧ１２」（アミノ酸配列 ＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＧＣ（配列番号１）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１３５９．８）及びオリゴ−Ａｓｐペプチド「Ｄ１４Ｃ」（アミノ酸配列 ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号２）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１７３１．４３）との結合のために、ＭＡＣＮ抗体をＳＭＣＣ（スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２２３６０）と、モル比１：５０で活性化した（“ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。
【００７２】
２ｍｇのＭＡＣＮ抗体を６．６８μｌの１００ｍＭ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【００７３】
次に、直ちにモル比１：１００でＨｉｓ−タグ又はオリゴ−Ａｓｐペプチド（蒸留水に溶解した）との結合が起きた。室温で６０分間インキュベーション後、１００μｌの１００ｍＭシステインを用いて反応を１０分間停止させ、再度ＮＡＰ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で精製し、タンパク質含量を比色法により測定した。
【００７４】
両方の結合体とも分注して−２０℃に保存した。
【００７５】
結合パートナー２（固相）
１．１．ＢＳＡとＦＬＡ−タグ／ＰｒｏｔＣ−タグとの結合
それぞれＦＬＡＧ−タグペプチド「ＰＤＣ１２」（アミノ酸配列 ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＧＧＣ（配列番号３）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１２８６．４６）及びＰｒｏｔＣ−タグペプチドＰＥＧ１５（アミノ酸配列ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫＧＧＣ（配列番号４）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１６０１．７）との結合のために、プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＳＭＣＣ（スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２２３６０）を用いて、モル比１：２で活性化した（“Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。
【００７６】
２５００μｌの０．５％ＢＳＡ（ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８に溶解した）を３．７８μｌの１００ｍＭ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【００７７】
次に、直ちにモル比１：１００でＦＬＡＧ−タグ又はＰｒｏｔＣ−タグペプチド（蒸留水に溶解した）との結合が起きた。室温で６０分間インキュベーション後、各１００μｌの１００ｍｍｏｌシステインを用いて、結合体を１０分間停止させ、再度ＮＡＰ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｓａｌｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で精製し、タンパク質含量を比色法により測定した。
【００７８】
ＢＳＡ＋ＦＬＡＧ−タグとＢＳＡ＋ＰｒｏｔＣ−タグ結合体とを分注して−２０℃に保存した。
【００７９】
１．２．ＢＳＡとオリゴ−Ｌｙｓペプチドとの結合
オリゴ−Ｌｙｓペプチド「Ｋ１４Ｃ」（アミノ酸配列ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫＣ（配列番号５）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１９１４．２７）及びプロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＳＭＣＣを用いて、モル比１：２５で活性化した。
【００８０】
１０００μｌの０．５％ＢＳＡ（ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８に溶解した）を１８．９μｌの１００ｍＭ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【００８１】
次に、直ちにモル比１：１００でオリゴ−Ｌｙｓペプチド（蒸留水に溶解した）との結合が起きた。室温で６０分間インキュベーション後、１００μｌの１００ｍＭシステインを用いて、反応を１０分間停止させ、再度ＮＡＰ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｓａｌｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で精製し、タンパク質含量を比色法により測定した。
【００８２】
ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体を分注して−２０℃に保存した。
【００８３】
２．それぞれ結合体とアビジンの結合
放射線照射したスターチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、１．１．及び１．２．からの結合体、及びアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２１１２１、蒸留水に溶解した）を用いて、以下のように被覆した。
【００８４】
成分を、１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）の溶液で６．６７μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。１つの試験管当たり各３００μｌの溶液をピペットで取り、２２℃で２０時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を、３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、再度吸引除去した。次に試験管を真空ドライヤー中で乾燥し、４℃で保存した。
【００８５】
３．Ｎｉ−ＮＴＡ固相
Ｎｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレート（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ａｒｔ．Ｎｏ．１００６３８７）を使用した。
【００８６】
４．可逆的に結合した抗体を検出するためのアッセイ
４．１ ＭＡＣＮ抗体結合体の結合
ＭＡＣＮ抗体結合体を希釈緩衝液（表２を参照）を用いて１．５μｇ／ｍｌの濃度にした。各３００μｌをピペットで、対応する固相中のいくつかの平行バッチに入れ、室温で一晩インキュベートした。試験管を５×１ｍｌの洗浄緩衝液で、Ｎｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレートを５×３００μｌの洗浄緩衝液で洗浄した（表２を参照）。
各１つのバッチで、結合したＭＡＣＮ−抗体結合体の量を測定した。
【００８７】
試験管に結合したＭＡＣＮ−抗体結合体の量を、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２Ｔ；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。マイクロタイタープレートに結合したＭＡＣＮ−抗体結合体の量を、マイクロタイタープレートルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＭＰＬ２；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【００８８】
４．２ 全血とのＭＡＣＮ−抗体結合体の非特異的分解の測定
結合ＭＡＣＮ−抗体結合体の追加のバッチで、各３００μｌの全血（表２を参照）をピペットで取り、１０分間インキュベートした。試験管を５×１ｍｌの洗浄緩衝液（表２参照）で、Ｎｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレートを５×３００μｌの洗浄緩衝液で洗浄した。試験管に残ったＭＡＣＮ−抗体結合体の量をルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２Ｔ；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【００８９】
マイクロタイタープレート上に残ったＭＡＣＮ−抗体結合体の量を、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＭＰＬ２；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【００９０】
４．３ 分解緩衝液によるＭＡＣＮ−抗体結合体の特異的分解の測定
結合したＭＡＣＮ−抗体結合体の追加のバッチで、各３００μｌの分解緩衝液（表２を参照）をピペットで取り、１０分間又は３０分間インキュベートした。試験管を５×１ｍｌの洗浄緩衝液（表２参照）で、Ｎｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレートを５×３００μｌの洗浄緩衝液で洗浄した。
【００９１】
試験管に残ったＭＡＣＮ−抗体結合体の量をルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２Ｔ；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【００９２】
マイクロタイタープレート上に残ったＭＡＣＮ−抗体結合体の量を、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＭＰＬ２；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。
【表２】
【００９３】
オリゴ−Ａｓｐ／オリゴ−Ｌｙｓ系についてのさらなる試験
分解剤
上記したように、０．０１％ヘパリンを加えることにより結合の効率的な分解を行った（表１と関連する説明を参照）。別の分解剤としてＮａＣｌとＫＦも試験した。ＮａＣｌ又はＫＦの濃度＞０．８Ｍでは、結合の分解に対する０．０１％ヘパリンと同等の作用があった。緩衝液組成の多くの他の変更態様も企図され、これらは結合を分解する（低分子量の他の塩、他の荷電オリゴマーもしくはポリマー、他のｐＨ値）。これらの変更態様のすべては、本発明の範囲内の溶解剤として定義される。これらの変更態様は特に好適であると考えられ、これらは、一方ではオリゴ−Ａｓｐ／オリゴ−Ｌｙｓ系の結合を効率的に不安定化するが、他方では、抗体と分析物の結合をできるだけ障害しないように残す。多くのイムノアッセイはヘパリンを試料マトリックスとして使用し、血漿中のヘパリンの濃度は典型的には０．０１％であるため、０．０１％濃度のヘパリンは好適な変更態様である。
【００９４】
固相への分析物の結合の特異性
オリゴ−Ｌｙｓ−ＢＳＡ／オリゴ−Ａｓｐ−分析物バインダーで被覆された固相に生物学的試料を加えると、試料からの目的の分析物が分析物特異的抗体に結合しないばかりでなく、イオン性相互作用を介して非特異的に固相の遊離リジン部分に結合するおそれがある。こういう場合は、以後（分解工程後）の分析物検出の正確度が障害されるであろう。そのような非特異的分析物結合が起きるか、そしてどの程度起きるかを、種々の合成ペプチド（これらはほぼ既知の天然の分析物と同一であり、従って天然の分析物の代表となる）を化学発光標識し、血漿マトリックスで希釈し、試験管（これはオリゴ−Ｌｙｓ−ｏＢＳＡで被覆し、ここにオリゴ−Ａｓｐ−抗ＰＣＴ抗体を結合させた）中でインキュベートすることにより調べた。非特異的に結合したペプチドの検出部分はいつも、与えられたペプチドの７％未満であった。すなわち固相への非特異的分析物結合は問題ではない。
【００９５】
特に試験は以下のように行った：
【００９６】
１． ＭａＣＮ−化学発光標識ペプチド
以下のペプチド（すべてＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから）をＭＡＣＮで標識した：
「ＰＰＬ４１」（アミノ酸配列ＰＥＶＰＰＷＴＧＥＶＳＰＡＱＲＤＧＧＡＬＧＧＧＧＲＧＰＷＤＳＳＤＲＳＡＬＬＫＳＫＬ（配列番号６）、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰから得られる）、「ＰＳＷ４４」（アミノ酸配列ＳＳＥＥＨＬＲＱＴＲＳＥＴＭＲＮＳＶＫＳＳＦＨＤＰＫＬＫＧＫＰＳＲＥＲＹＶＴＨＮＲＡＨＷ（配列番号７）、プロエンドセリンから得られる）、「ＰＡＹ３３」（アミノ酸配列 ＡＴＱＬＤＧＰＡＧＡＬＬＬＲＬＶＱＬＡＧＡＰＥＰＦＥＰＡＱＰＤＡＹ（配列番号８）、コペプチンから得られる）、「ペプチド４５−９２」（アミノ酸配列ＥＬＲＭＳＳＳＹＰＴＧＬＡＤＶＫＡＧＰＡＱＴＬＩＲＰＱＤＭＫＧＡＳＲＳＰＥＤＳＳＰＤＡＡＲＩＲＶ（配列番号９）、プロアドレノメヅリンから得られる）。
【００９７】
化学発光標識のために、モル比１：１でペプチドをＭＡＣＮ−アクリジニウム−ＮＨＳエステル（ＩｎＶｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で室温で１時間標識した。次に１ｍＭトリス（ｐＨ７．８）を用いて、１０分間反応を停止させた。
【００９８】
取り込まれなかったＭＡＣＮの分離のために、標識バッチを逆相Ｃ１８カラム（μＢｏｎｄａｐａｋ，Ｗａｔｅｒｓ ＷＡＴ０２７３４２，Ｎｏ．０２０２３５２５８１）で精製した。試料を添加して、１．０ｍｌ／分の流速で、水／アセトニトリル（＋０．１％ＴＦＡ）の上昇勾配を使用してクロマトグラフィーを行った。フロー比色計を用いて、２１４ｎｍ、２８０ｎｍ、及び３６８ｎｍの波長を測定し、ピークを検出した。
【００９９】
標識ペプチドを分注して−２０℃で保存した。
【０１００】
１．１．ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体の製造：上記参照
【０１０１】
１．２．抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の製造
オリゴ−Ａｓｐペプチド「Ｄ１４Ｃ」（アミノ酸配列 ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号２）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１７３１．４３）の結合のために、ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体（「抗ＰＣＴ抗体１」）を、ＳＭＣＣを用いてモル比１：２５で活性化した（“ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅを参照）。
【０１０２】
３ｍｇの抗体（４．５ｍｌのＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８中）を５．０μｌの１００ｍｍｏｌ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１０３】
次に、直ちにモル比１：１００でオリゴ−Ａｓｐペプチド（蒸留水に溶解した）との結合を行った。室温で６０分間インキュベーション後、１００μｌの１００ｍＭシステインを用いて、反応を１０分間停止させ、結合しなかったペプチドをＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で精製し、タンパク質含量を比色法により測定した。
抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体を分注して−２０℃に保存した。
【０１０４】
２．試験管への結合体の結合
２．１．結合：ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体
放射線照射したスターチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＢＳＡ−オリゴ−Ｌｙｓ結合体を用いて以下のように被覆した。
【０１０５】
結合体を１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）で希釈して６．６７μｇ／ｍｌの濃度にした。この溶液３００μｌを各試験管にピペットで取り、２２℃で２０時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を、３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、再度吸引除去した。次に抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の結合を行った。
【０１０６】
２．２ 結合：抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体
結合体を、ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含遊離ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で６６７ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。この溶液３００μｌをピペットで各試験管に取り、２２℃で１時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を再度３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、次に吸引除去した。
【０１０７】
次に試験管を真空ドライヤー中で乾燥し、４℃で保存した。
【０１０８】
３．非特異結合の測定
ＭＡＣＮペプチドを血漿マトリックスで希釈した。各３００μｌをピペットで、オリゴ−Ｌｙｓ−ＢＳＡ及びオリゴ−Ａｓｐ−抗ＰＣＴ抗体で被覆した試験管に入れ、室温で３０分間インキュベートした。試験管を３×１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％プロテアーゼ不含ＢＳＡで洗浄した。試験管に結合した量ならびに使用したＭＡＣＮペプチドの総活性を、ルミノメーター（ＢＥＲＴＨＯＬＤ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＢＡＤ ＷＩＬＤＢＡＤ，ＧＥＲＭＡＮＹ，ＬＢ９５２７；ＢＲＡＨＭＳ ＡＧからの基礎試薬）で測定した。総活性に対する非特異結合の割合は以下の通りであった：
【０１０９】
ＰＳＷ４４ ３．０％
ＰＰＬ４１ ３．１％
ＰＡＹ３３ ６．５％
ペプチド４５〜９２ ２．９％
【０１１０】
ＰＣＴ例との比較：全血からの標準的免疫クロマトグラフィー対全血からのＰＣＴの免疫抽出、免疫クロマトグラフィー又はＴＲＡＣＥ法による分解と分析物検出
ＰＣＴ（プロカルシトニン）を、適切なモデル分析物として選択した。これは細菌感染症、特に宿主の全身性炎症反応（敗血症）を引き起こす重症の感染症のマーカーである（２１）。ＰＣＴ検出のためのサンドイッチイムノアッセイは、ペプチドのカルシトニン又はカタカルシン部分に対する抗体を使用する（２２）、（２３）。
【０１１１】
免疫クロマトグラフィーは、今日最も一般的にルーチン使用されている全血からの分析物の免疫学的検出のための迅速検査法であり、従って「標準的免疫クロマトグラフィー」と呼ぶことができる。従ってこの方法を、分析物検出を伴う免疫抽出と分解（「免疫移送」）の本発明の原理の利点を説明するための、標準法として選択した。以下の２つの異なる方法を試験した：一方で免疫クロマトグラフィー、他方ではＴＲＡＣＥ（時間分解増幅クリプテート放射）法。すべての３つの方法で、ＰＣＴ含有全血試料のＰＣＴ濃度を、各場合に１０回測定で測定した。図２では、これらの方法で得られる精度プロフィールを比較する。本発明の対象である両方の方法は、標準法（全血からの直接の標準的免疫クロマトグラフィー）よりも、基本的に正確で高感度な測定法である検出法（これは免疫クロマトグラフィー又はＴＲＡＣＥ法）に関連して、免疫移送（ｉｍｍｕｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を与える。実験を実施するための詳細は以下に記載される。Ａでは、本発明の方法として、免疫移送が、ＴＲＡＣＥ法による同時結合分析物検出とともに記載され、Ｂでは、本発明の方法として、免疫クロマトグラフィーによる結合分析物検出とともに免疫移送が記載され、Ｃでは、標準法として標準的免疫クロマトグラフィーが記載される。変更態様Ａ、Ｂ、及びＣの精度プロフィールの比較を図２に示す。
【０１１２】
Ａ．全血からのＰＣＴの免疫抽出とＴＲＡＣＥ法による分析物検出
固相として、高結合性ポリスチレンからなるマイクロタイタープレートを使用したが、これはオリゴ−Ｌｙｓ−ＢＳＡで被覆されており、ここに第１の抗ＰＣＴ抗体が結合しており、これはあらかじめオリゴ−Ａｓｐとクリプテートで誘導体化されていた。次にＰＣＴ含有全血試料を短時間インキュベートし、ＰＣＴを固相中の試料から抽出した。固相を洗浄後、分解緩衝液を加え、短時間インキュベートした。アリコートを別の低結合性の黒いマイクロタイタープレートに移し、第２のシアニン標識抗ＰＣＴ抗体を含有する溶液と混合した。短時間インキュベーション後、レーザー光を用いて励起後、ＴＲＡＣＥ法によりサンドイッチ形成を検出した。
【０１１３】
特に試験は以下のように行った：
【０１１４】
Ａ．１．固相用結合体の製造
Ａ．１．１．ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体の製造：上記参照
Ａ．１．２．抗カルシトニンヒツジ抗体クリプテートモノＭＰ＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の製造
クリプテート１リン酸（“ＫＭｏｎｏＭＰ”，Ｃｅｚａｎｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｉｍｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で標識するために、ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体（「抗ＰＣＴ抗体１」）をＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２１８５７）を用いて、モル比１：４で活性化した（“ＳＰＤＰ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。
【０１１５】
５ｍｇの抗体（１．５ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．９に溶解した）を４１．６μｌの３．２ｍＭ ＳＰＤＰ（エタノールに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。
【０１１６】
活性化した抗体を８１．２μｌの２００ｍｍｏｌ ＤＴＴ（ジチオスレイトール、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ６．９に溶解した）を用いて、室温で１５分間還元した。
【０１１７】
生成物を２つのＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍｍｏｌのＥＤＴＡ、ｐＨ６．９）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１１８】
次に、直ちに凍結乾燥ＫＭｏｎｏＭＰとモル比１：８で溶出液の結合を行った。４℃で２０時間インキュベーション後、生成物を再度３つのＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１１９】
オリゴ−Ａｓｐペプチド「Ｄ１４Ｃ」（アミノ酸配列ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号２）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１７３１．４３）との結合のために、生成物をＳＭＣＣを用いてモル比１：２５で活性化した（“ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。３ｍｇの生成物（４．５ｍｌのＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８で溶出した）を５．０μｌの１００ｍＭ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物を２つのＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１２０】
次に、直ちにモル比１：１００でオリゴ−Ａｓｐペプチド（蒸留水に溶解した）との結合を行った。室温で６０分間インキュベーション後、１００μｌの１００ｍＭシステインを用いて反応を１０分間停止させ、結合しなかったペプチドをＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で精製し、タンパク質含量を比色法により測定した。
抗カルシトニンヒツジ抗体−ＫｎｏｍｏＭＰ＋オリゴ−Ａｓｐ結合体を分注して−２０℃に保存した。
【０１２１】
Ａ．２．マイクロタイタープレートへの結合体の結合
Ａ．２．１．結合：ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体
放射線照射したマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体を用いて以下のように被覆した。
【０１２２】
結合体を１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）の溶液で希釈して、６．６７μｇ／ｍｌの濃度にした。各ウェルに、この溶液３００μｌをピペットで取り、２２℃で２０時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各ウェルを、３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、再度吸引除去した。次に抗カルシトニンヒツジ抗体−クリプテートモノＭＰ＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の結合を行った。
【０１２３】
Ａ．２．２ 結合：抗カルシトニンヒツジ抗体クリプテートモノＭＰ＋オリゴ−Ａｓｐ結合体
結合体を、ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含遊離ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で６６７ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。この溶液３００μｌをピペットで各ウェルに取り、２２℃で１時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各ウェルを再度３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、次に吸引除去した。
【０１２４】
次にマイクロタイタープレートを真空ドライヤー中で乾燥し、４℃で保存した。
【０１２５】
Ａ．３．液相のための抗カタカルシンマウス抗体−Ｃｙ５結合体の製造
モノクローナル抗カタカルシン抗体（「抗ＰＣＴ抗体２」）を４５％の（２−ヒドロキシ−プロピル）−β−シクロデキストリン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ａｒｔ．Ｎｏ．３３，２６０−７）の存在下で、Ｃｙ５−ＮＨＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｒｔ．Ｎｏ．ＰＡ１５１００）を用いて、モル比１：２０で標識した（製品小冊子“Ａｍｅｒｓｈａｍ ＣｙＤｙｅ Ｍｏｎｏ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒｓ”参照）。
【０１２６】
２１３μｌの抗体（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中ｃ＝１０ｍｇ／ｍｌ）を、７５０μｌの６０％シクロデキストリン（１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９）に溶解した）及び３７．３μｌの７．７ｍＭ Ｃｙｓ−ＮＨＳ（ＤＭＳＯに溶解した）と混合した。室温で１時間インキュベーション後、５０μｌの５０ｍＭグリシンでバッチを１０分間停止させ、ＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ８）上で精製した。
【０１２７】
抗体に結合しなかったＣｙ５−ＮＨＳラジカルの分離のために、ゲルろ過ＨＰＬＣを行った（カラム：Ｂｉｏ−Ｓｉｌ Ｓｅｃ １２５，Ｂｉｏｒａｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。試料を添加して、１ｍｌ／分の流速で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いてクロマトグラフィーを行った。フロー比色計を用いて、２８０ｎｍ及び６４８ｎｍの波長を測定した。抗体の標識の程度の尺度としての６４８ｎｍ／２８０ｎｍの吸光度比は、ピークで１．４８であった。抗体含有画分（保持時間８〜１０分）をプールした。
【０１２８】
抗カタカルシンマウス抗体−Ｃｙ５結合体を分注して−２０℃で保存した。
【０１２９】
Ａ．４．免疫移送とＴＲＡＣＥアッセイ
各試料について１０回測定で、後述のアッセイを行った。ＢＳＡ＋Ｌｙｓと抗カルシトニンヒツジ抗体クリプテートＭｏｎｏＭＰ＋Ｄ１４Ｃ結合体で被覆したマイクロタイタープレートのウェルに、組換えＰＣＴ（ＩｎＶｉｖｏ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに保存した、３００μｌのＥＤＴＡ全血試料をピペットで取り、室温で１５分間インキュベートした（試料のＰＣＴ濃度は、ＬＩＡ感受性ＢＲＡＨＭＳ ＰＣＴアッセイ（ＢＲＡＨＭＳ ＡＧ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、血漿から測定した）。次にこれを３００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回、次に３００μｌの洗浄液（８ｍＭトリス、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．５）で２回洗浄した。次にこれを、３００μｌの分解緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．６Ｍ ＫＦ、０．５％ＢＳＡ、０．０１％ヘパリン）で１０分間インキュベートした。分解した免疫複合体から、１００μｌをＴＲＡＣＥ測定に適したマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｈａｌｆ Ａｒｅａ Ｐｌａｔｅｓ，９６ウェル、黒、ポリスチレン、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｎｏ．ＣＬＳ３６９４−１００ＥＡ）に移し、５０μｌの抗カタカルシンマウス抗体−Ｃｙ５−ＮＨＳ結合体（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．６Ｍ ＫＦ、０．５％ＢＳＡ、０．０１％ヘパリン中ｃ＝２０μｇ／ｍｌ）とともに、室温で１９分間インキュベートした。高性能時間分解蛍光マイクロプレートリーダーＲＵＢＹｓｔａｒ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＴＥＣＨ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＴＲＡＣＥシグナルの測定（６２０ｎｍと６６５ｎｍ）を行った。
【０１３０】
この場合ＲＵＢＹｓｔａｒについて以下の装置設定を行った：
フラッシュの回数 ２０
積分遅延［μＳ］ ５０
積分時間［μＳ］ ４００
インターバル時間［μＳ］ １０
インターバルの回数 ４５
マルチプリケーター比 １０，０００
【０１３１】
各試料について、比率ＯＤ６６５ｎｍ／ＯＤ６２０ｎｍ ＤｅｌｔａＦから以下を計算した：
ＤｅｌｔａＦ＝（比率ｐｏｓ−比率ｎｅｇ）／比率ｎｅｇ
この場合、比率ｎｅｇは、ＰＣＴ陰性試料（すなわち、ＰＣＴを含有しないか又は検出できない試料）の比率を意味し、比率ｐｏｓは試験すべき試料（すなわち、ＰＣＴ含有試料候補）の比率を意味する。各平均値は、個々の試料の１０回測定から得られた。これらの値は標準濃度であり、すべての個々の試料の濃度はＭｕｌｔｉＣａｌｃ（Ｓｐｌｉｎｅ Ｆｉｔ）ソフトウェアを使用して求めた。各１０回測定について変動係数を求めた。
【０１３２】
Ｂ．全血からのＰＣＴの免疫抽出及び免疫クロマトグラフィーによる分析物検出
固相として、あらかじめオリゴ−Ａｓｐとビオチンで誘導体化されていた、第１抗ＰＣＴ抗体を結合したオリゴ−Ｌｙｓ−ＢＳＡで被覆されたポリスチレン試験管を使用した。次にＰＣＴ含有全血試料を短時間インキュベートし、この場合ＰＣＴを固相中の試料から免疫抽出した。固相を洗浄後、分解緩衝液（これは、コロイド金で標識された第２の抗ＰＣＴ抗体を含有した）を加え、短時間インキュベートした。最後に、試験バンドとしてストレプトアビジンを噴霧した試験ストリップ上で、溶液の免疫クロマトグラフィーを行った。ビオチン化された第１抗ＰＣＴ抗体及びＰＣＴもそこに結合し、次にそこに結合した第２の金標識抗ＰＣＴ抗体がストレプトアビジンに結合した。標識物の検出は反射測定により行った。
【０１３３】
特に試験は以下のように行った：
【０１３４】
Ｂ．１．固相用結合体の製造
Ｂ．１．１．ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体の製造：上記参照
Ｂ．１．２．ビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の製造
ポリクローナル抗カルシトニンヒツジ抗体（「抗ＰＣＴ抗体１」）をＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（“ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）とモル比１：１０で混合した。１．６ｍｇの抗体（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）を１０ｍＭのＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（蒸留水に新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。
【０１３５】
生成物をＮＡＰ５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１３６】
オリゴ−Ａｓｐペプチド「Ｄ１４Ｃ」（アミノ酸配列ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号２）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１７３１．４３）の結合のために、生成物をＳＭＣＣを用いてモル比１：５０で活性化した（“ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅを参照）。
【０１３７】
１．３ｍｇの生成物（１．０ｍｌのＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８で溶出した）を４．３３μｌの１００ｍＭ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１３８】
次に、直ちにモル比１：１００でオリゴ−Ａｓｐペプチド（蒸留水に溶解した）との結合を行った。室温で６０分間インキュベーション後、１００μｌの１００ｍＭシステインを用いて、反応を１０分間停止させ、結合しなかったペプチドをＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で分離し、タンパク質含量を比色法により測定した。
【０１３９】
ビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体を分注して−２０℃に保存した。
【０１４０】
Ｂ．２．試験管への結合体の結合
Ｂ．２．１．結合：ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体
放射線照射したスターチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体を用いて以下のように被覆した。
結合体を１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）で希釈して６．６７μｇ／ｍｌの濃度にした。各試験管にこの溶液３００μｌをピペットで取り、２２℃で２０時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を、３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、再度吸引除去した。次にビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の結合を行った。
【０１４１】
Ｂ．２．２．結合：ビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体
結合体を、ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含遊離ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で６６７ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。この溶液３００μｌをピペットで各試験管に取り、２２℃で１時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を再度３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、次に吸引除去した。
【０１４２】
次に試験管を真空ドライヤー中で乾燥し、４℃で保存した。
【０１４３】
Ｂ．３．金標識抗カタカルシン抗体の製造：
この成分は、８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。モノクローナル抗カタカルシン抗体をコロイド金（８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｆｒｅｎｓに従う：Ｆｒｅｎｓ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７３，２４１：２０−２２）に、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍａｚｏｎ．ｄｅ／Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ−Ｇｒｅｇ−Ｔ−Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ／ｄｐ／０１２３４２３３６８）に記載のように結合させた。
【０１４４】
Ｂ．４．試験ストリップの製造：
この成分は８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。ＭＤＩのニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，Ａｍｂａｌａ，Ｉｎｄｉａ）を、４μｇ／ｃｍのストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）（試験ライン）ならびに２．５μｇ／ｃｍの抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓａｎｔｅｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）（対照ライン）を用いて被覆した。Ｂｉｏｄｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡのマイクロディスペンサーを使用して、捕捉用分子を適用した。次に５０℃で一晩、膜を乾燥した。吸引パッドとして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡのＡＰ２２を使用した。
【０１４５】
Ｂ．５．免疫移送と免疫クロマトグラフィー
すべての試料について１０回測定で、後述のアッセイを行った。ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ及びビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋Ｄ１４Ｃ結合体で被覆した試験管に、組換えＰＣＴ（ＩｎＶｉｖｏ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに保存した、３００μｌのＥＤＴＡ全血試料をピペットで取り、室温で１５分間インキュベートした（試料のＰＣＴ濃度は、ＬＩＡ感受性ＢＲＡＨＭＳ ＰＣＴアッセイ（ＢＲＡＨＭＳ ＡＧ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、血漿から測定した）。次にこれを３００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回、次に３００μｌの洗浄液（８ｍＭトリス、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．５）で２回洗浄した。次にこれを、１５０μｌの分解緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５％ＢＳＡ、０．５％ツイーン２０、０．０１％ヘパリン）（これは、金標識抗カタカルシンモノクローナル抗体を含有した）を用いて、確認しながら１０分間インキュベートした。低結合性マイクロタイタープレートのウェル中の１５０μｌを、分解した免疫複合体から移した。次に、試験ストリップをウェルに挿入して、直接免疫クロマトグラフィーを行った。３０分後、試験バンドの着色を、ＬＲＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙの反射計を用いて測定した。
【０１４６】
各平均値は、個々の試料の１０回測定から得られた。これらの値は標準濃度として使用し、すべての個々の試料の濃度はＭｕｌｔｉＣａｌｃ（Ｓｐｌｉｎｅ Ｆｉｔ）ソフトウェアを使用して求めた。各１０回測定について変動係数を求めた。
【０１４７】
Ｃ．標準的免疫クロマトグラフィーによる全血からのＰＣＴの検出
適用すべき全血試料の血球を保持するのに適した膜とともに、試料添加領域に試験ストリップを作成した。乾燥状態では、一方で第１ビオチン化抗ＰＣＴ抗体を含有し、他方では第２のコロイド金標識抗ＰＣＴ抗体を含有する多孔性クッション（「試料パッド」）を、この膜と試験ストリップとの間に取り付けた。試験バンドとして、ストレプトアビジンをストリップ上に噴霧した。試験ストリップをプラスチックカセット中に入れた。ＰＣＴ含有全血試料を免疫クロマトグラフィーした。ビオチン化した第１抗ＰＣＴ抗体従ってそこに結合したＰＣＴも、及び次にそこに結合した第２の金標識抗ＰＣＴ抗体も、ストレプトアビジンに結合する。標識の検出は反射測定により行った。
【０１４８】
特に試験は以下のように行った：
【０１４９】
Ｃ．１．固相用結合体の製造
Ｃ．１．１．ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体の製造：上記参照
Ｃ．１．２．ビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の製造：上記参照
【０１５０】
Ｃ．２．金標識抗カタカルシン抗体の製造：上記参照
【０１５１】
Ｃ．３．試験ストリップの製造：
この成分は８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。ＭＤＩのニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，Ａｍｂａｌａ，Ｉｎｄｉａ）を、４μｇ／ｃｍのストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）（試験ライン）ならびに２．５μｇ／ｃｍの抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｓａｎｔｅｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）（対照ライン）を用いて被覆した。Ｂｉｏｄｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡのマイクロディスペンサーを使用して、捕捉用分子を適用した。次に５０℃で一晩、膜を乾燥した。吸引パッドとして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡのＡＰ２２を使用した。全血検査の作成のために、８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙの全血構成を使用した。一方では試料添加領域に、コロイド金に結合した抗カタカルシン抗体を、他方ではビオチン化＋オリゴ−Ａｓｐ誘導体化抗カタカルシン抗体を、２つの別々のパッドに固定化した。８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙの標準的ハウジングをカセットとして使用した。
【０１５２】
Ｃ．４．標準的免疫クロマトグラフィー
すべての試料について１０回測定で、後述の免疫クロマトグラフィーを行った。組換えＰＣＴ（ＩｎＶｉｖｏ ＧｍｂＨ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに保存した１２０μｌのＥＤＴＡ全血試料を、ピペットで試験ストリップに入れた（試料のＰＣＴ濃度は、ＬＩＡ感受性ＢＲＡＨＭＳ ＰＣＴアッセイ（ＢＲＡＨＭＳ ＡＧ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、血漿から測定した）。３０分後、試験バンドの着色を、ＬＲＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙの反射計を用いて測定した。
【０１５３】
各平均値は、個々の試料の１０回測定から得られた。これらの値は標準濃度として使用し、すべての個々の試料の濃度はＭｕｌｔｉＣａｌｃ（Ｓｐｌｉｎｅ Ｆｉｔ）ソフトウェアを使用して求めた。各１０回測定について変動係数を求めた。
【０１５４】
Ｄ．全血からのＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの免疫抽出と免疫クロマトグラフィーによる分析物検出
全血からの免疫抽出法と免疫クロマトグラフィーによる分析物検出のための別の例として、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（中間領域プロアドレノメジュリン）分析のための試験系を開発した。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、血液中を循環する安定なペプチドであり、アドレノメジュリンの前駆体のタンパク質分解プロセシングから公知である（Ｓｔｒｕｃｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００４ Ａｕｇ；２５（８）：１３６９−７２）。アドレノメジュリンは最も良く知られている内因性血管拡張物質の１つであり、無数の生物学的プロセスの制御、特に心血管系の制御に関与している（Ｂｅｌｔｏｗｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｏｌ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４ Ｊａｎ−Ｆｅｂ；５６（１）：５−２７）。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの測定は、種々の病態の診断と予後の枠内で、信頼して測定することができない成熟アドレノメジュリンの代替マーカーとして有用であることがわかった。これらには、ＣＯＰＤ（Ｓｔｏｌｚ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｓｔ．２００８ Ｍａｙ １９［Ｅｐｕｂ印刷前］）、肺炎（Ｃｈｒｉｓｔ−Ｃａｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ．２０６；１０（３）：Ｒ９６）、敗血症（Ｃｈｒｉｓｔ−Ｃａｉｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ．２００５；９（６）：Ｒ８１６−２４）、心筋梗塞（Ｋｈａｎ，Ｓ．Ｑ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．２００７ Ａｐｒ １０；４９（１４）：１５２５−３２）、心不全（Ｇｅｇｅｎｈｕｂｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ Ｃａｒｄ Ｆａｉｌ．２００７ Ｆｅｂ；１３（１）：４２−９）がある。
【０１５５】
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭについて本発明の方法は、正常範囲（Ｍｏｒｇｅｎｔｈａｌｅｒ， Ｎ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｏｃｔ；５１（１０）：１８２３−９）、及び種々の臨床像（上記参照）に関連する高濃度の領域の両方で、高い精度を示す（図３）。
【０１５６】
特に試験は以下のように行った：
【０１５７】
Ｄ．１．固相用結合体の製造
Ｄ．１．１．ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体の製造：上記参照
Ｄ．１．２．抗「ＳＰＣＤ１９」ヒツジ抗体ビオチン化＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の製造
オリゴ−Ａｓｐペプチド「Ｄ１４Ｃ」（アミノ酸配列 ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤＣ（配列番号２）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１７３１．４３）との結合のために、ポリクローナル抗「ＳＰＣＤ１９」（アミノ酸配列ＣＲＰＱＤＭＫＧＡＳＲＳＰＥＤＳＳＰＤ（配列番号１０）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝２０６３）ヒツジ抗体を、ＳＭＣＣを用いて比率１：２５で活性化した（“ＳＭＣＣ ａｎｄ Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照） 。
【０１５８】
１．０ｍｇの抗体を１６．６７μｌの１０ｍｍｏｌ ＳＭＣＣ（ＤＭＳＯに新に溶解した）及び１０３μｌのＰＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。生成物をＮＡＰ５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、１０ｍｍｏｌ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１５９】
次に、直ちにモル比１：１００でオリゴ−Ａｓｐペプチド（蒸留水に溶解した）との結合を行った。室温で６０分間インキュベーション後、結合しなかったペプチドをＮＡＰ１０カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で分離し、タンパク質含量を比色法により測定した。
【０１６０】
生成物をＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ，Ａｒｔ．Ｎｏ．２１３３８）とモル比１：２０で混合した（“ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ”、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡを参照）。９００μｇの抗体（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中）を１２μｌのＥＺ−ｌｉｎｋスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（蒸留水に新に溶解した）と混合した。室温で３０分間インキュベート後、５０μｌの１Ｍ一時的を用いて反応を１０分間停止させた。生成物をＮＡＰ２５カラム（移動相溶媒：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）上で精製し、タンパク質含量を比色法で測定した。
【０１６１】
ビオチン化抗「ＳＰＣＤ１９」ヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体を分注して−２０℃で保存した。
【０１６２】
Ｄ．２．試験管への結合体の結合
Ｄ．２．１．結合：ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ結合体
放射線照射したスターチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＢＳＡ−オリゴ−Ｌｙｓ結合体を用いて以下のように被覆した：
【０１６３】
結合体を、１０ｍＭトリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．８）の溶液を用いて６．６７μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。１つの試験管当たりこの溶液各３００μｌをピペットで取り、２２℃で２０時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を、３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、再度吸引除去した。次にビオチン化抗カルシトニンヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体の結合を行った。
【０１６４】
Ｄ．２．２．結合：ビオチン化抗「ＳＰＣＤ１９」ヒツジ抗体＋オリゴ−Ａｓｐ結合体
結合体を、ＰＢＳ、０．５％プロテアーゼ不含遊離ＢＳＡ（ｐＨ７．４）で６６７ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。この溶液３００μｌをピペットで各試験管に取り、２２℃で１時間インキュベートした。溶液を吸引除去した。次に各試験管を再度３００μｌの０．５％ウシ血清アルブミン、２％のＫａｒｉｏｎ ＦＰで２時間飽和させ、次に吸引除去した。
【０１６５】
次に試験管を真空ドライヤー中で乾燥し、４℃で保存した。
【０１６６】
Ｄ．３．金標識抗「ＰＳＶ１１」抗体の製造：
モノクローナル抗「ＰＳＶ１１」抗体を使用した（ＰＳＶ１１はＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの部分配列を示す；アミノ酸配列ＣＳＳＰＤＡＡＲＩＲＶ（配列番号１１）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝１１７４）。抗体をコロイド金（ＢＢＩ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＥＭ．ＧＣ ６０ｎｍ）に、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍａｚｏｎ．ｄｅ／Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ−Ｇｒｅｇ−Ｔ−Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ／ｄｐ／０１２３４２３３６８）に記載のように結合させた。
【０１６７】
Ｄ．４．試験ストリップの製造：
この成分は８ｓｅｎｓ ｂｉｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入した。ＭＤＩのニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，Ａｍｂａｌａ，Ｉｎｄｉａ）を、４μｇ／ｃｍのストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）（試験ライン）を用いて被覆した。Ｂｉｏｄｏｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡのマイクロディスペンサーを使用して、捕捉用分子を適用した。次に５０℃で一晩、膜を乾燥した。吸引パッドとして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡのＡＰ２２を使用した。
【０１６８】
Ｄ．５．免疫移送と免疫クロマトグラフィー
すべての試料について１０回測定で、後述のアッセイを行った。ＢＳＡ＋オリゴ−Ｌｙｓ及び抗ビオチン化「ＳＰＣＤ１９」ヒツジ抗体＋「Ｄ１４Ｃ」結合体で被覆した試験管に、合成４５〜９２プロアドレノメジュリン（アミノ酸配列ＥＬＲＭＳＳＳＹＰＴＧＬＡＤＶＫＡＧＰＡＱＴＬＩＲＰＱＤＭＫＧＡＳＲＳＰＥＤＳＳＰＤＡＡＲＩＲＶ（配列番号９）、ＪＰＴ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｍ＝５１１５）とともに保存した、３００μｌのＥＤＴＡ全血試料をピペットで取り、室温で１５分間インキュベートした（試料のプロＡＤＭ濃度は、ｐｒｏＡＤＭ ＬＩＡ ＢＲＡＨＭＳアッセイ（ＢＲＡＨＭＳ ＡＧ，Ｈｅｎｎｉｇｓｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、血漿から測定した。次にこれを１ｍｌの洗浄液（８ｍＭトリス、６０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ツイーン２０、ｐＨ７．５）で５回洗浄した。
【０１６９】
次にこれを１０分間攪拌しながら、１５０μｌの分解緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡ、０．１％ツイーン２０、０．１％ヘパリン、０．０８％ＮａＮ３）（これは、金標識抗「ＰＳＶ１１」モノクローナル抗体も含有した）でインキュベートした。分解した免疫複合体から、１００μｌを低結合性マイクロタイタープレートのウェルに移した。次に、試験ストリップをウェルに挿入して、直接免疫クロマトグラフィーを行った。３０分後、試験バンドの着色を、ＬＲＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ＧｍｂＨ， Ｍｕｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙの反射計を用いて測定した。
【０１７０】
各平均値は、個々の試料の１０回測定から得られた。これらの値は標準濃度として使用し、すべての個々の試料の濃度はＭｕｌｔｉＣａｌｃ（Ｓｐｌｉｎｅ Ｆｉｔ）ソフトウェアを使用して求めた。各１０回測定について変動係数を求めた。
【０１７１】
文献
【０１７２】
【化１】
【０１７３】
【化２】
【０１７４】
【化３】
【０１７５】
【化４】
【０１７６】
【化５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のプロセス工程：
ａ）固相に固定化される可逆的結合パートナー１の調製、ここに、分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー１と２との結合により固定化される、
ｂ）生物学的試料の添加、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへの分析物の結合、
ｃ）生物学的試料の分離、
ｄ）分解緩衝液の添加、ここで、該分解緩衝液は、可逆的結合パートナー１と２との結合を分解し、ここで分析物バインダーへの分析物の結合は任意である、及び
ｅ）それぞれ、生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中での分析物の検出、及び生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物の欠失の測定
を含む、生物学的試料からの分析物の検出方法。
【請求項２】
生物学的液体が未処理の全血試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固定化された可逆的結合パートナー１が、直接又はキャリアータンパク質を用いて固定化される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分析物バインダーが、共有結合的に可逆的結合パートナー２に結合される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
分析物バインダーが抗プロカルシトニン抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
可逆的結合パートナー１と２の結合対が、以下の結合対：
ａ）陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
ｂ）Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質と、ペプチド／タンパク質がＣａ２＋に結合している時ペプチド／タンパク質が高親和性で結合する抗体、
ｃ）オリゴヒスチジン（例えば、６Ｈｉｓ）とＮｉ−ＮＴＡ、
ｄ）ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン
の１つから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質がＦＬＡＧ−ペプチドであり、かつ抗体がＭ１抗体であるか、又はＣａ２＋結合ペプチド／タンパク質がプロテインＣペプチドであり、かつ抗体がＨＰＣ４抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
分析物バインダーが標識され、分解緩衝液が添加された後も、分析物検出のための標識物で標識されたままである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
分解緩衝液が検出に必要な別の標識成分を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
検出に必要な他の標識成分が、サンドイッチイムノアッセイの実施のための第２の分析物バインダーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
標識分析物の検出は、ＴＲＡＣＥ法を使用するイムノアッセイにより行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
標識分析物の検出が、免疫クロマトグラフィーにより行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的試料が、未希釈のままで、かつ固相の被覆部分が生物学的試料と完全に接触するような容量で使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
試料の添加から検出までの時間が３０分を超えず、方法は迅速検査法と見なすことができる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施するための装置であって、
ａ）分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合される可逆的結合パートナー１が、その中に固定化された固相を含み、
ｂ）分解緩衝液を加えることにより可逆的結合パートナー１と２の間の結合が分解されるが、分解緩衝液を加えた時、分析物バインダーへの分析物の結合は任意であることを特徴とする装置。
【請求項１６】
以下：
ａ）固定化された可逆的結合パートナー１を有する固相、
ｂ）可逆的結合パートナー２に結合した分析物バインダーを含む複合体、それにより、複合体は、場合により、可逆的結合パートナー１と２を固相に結合させることにより、すでに固定化型で存在してもよい、
ｃ）可逆的結合パートナー１と２との結合を分解する分解緩衝液、しかし、それにより、分析物バインダーへの分析物の結合は任意である
を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１７】
分析物バインダーが抗ＰＣＴ抗体である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
可逆的結合パートナー１と２の結合対が、以下の結合対：
ａ）陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
ｂ）Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質と、ペプチド／タンパク質がＣａ２＋に結合している時ペプチド／タンパク質が高親和性で結合する抗体、
ｃ）オリゴヒスチジン（例えば、６Ｈｉｓ）とＮｉ−ＮＴＡ、
ｄ）ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン
の１つから選択される、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１】
以下のプロセス工程：
ａ）固相に固定化される可逆的結合パートナー１の調製、ここに、分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合し、こうして分析物バインダーは、可逆的結合パートナー１と２との結合により固定化される、
ｂ）生物学的試料の添加、及び生物学的試料が分析物を含む場合に、可逆的固定化分析物バインダーへの分析物の結合、
ｃ）生物学的試料の分離、
ｄ）分解緩衝液の添加、ここで、該分解緩衝液は、可逆的結合パートナー１と２との結合を分解し、ここで分析物バインダーへの分析物の結合は任意である、及び
ｅ）それぞれ、生物学的試料が分析物を含有する場合、分解緩衝液中での分析物の検出、及び生物学的試料が分析物を含有しない場合、分析物の欠失の測定
を含む、生物学的試料からの分析物の検出方法。
【請求項２】
生物学的液体が未処理の全血試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固定化された可逆的結合パートナー１が、直接又はキャリアータンパク質を用いて固定化される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分析物バインダーが、共有結合的に可逆的結合パートナー２に結合される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
分析物バインダーが抗プロカルシトニン抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
可逆的結合パートナー１と２の結合対が、以下の結合対：
ａ）陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
ｂ）Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質と、ペプチド／タンパク質がＣａ２＋に結合している時ペプチド／タンパク質が高親和性で結合する抗体、
ｃ）オリゴヒスチジン（例えば、６Ｈｉｓ）とＮｉ−ＮＴＡ、
ｄ）ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン
の１つから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質がＦＬＡＧ−ペプチドであり、かつ抗体がＭ１抗体であるか、又はＣａ２＋結合ペプチド／タンパク質がプロテインＣペプチドであり、かつ抗体がＨＰＣ４抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
分析物バインダーが標識され、分解緩衝液が添加された後も、分析物検出のための標識物で標識されたままである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
分解緩衝液が検出に必要な別の標識成分を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
検出に必要な他の標識成分が、サンドイッチイムノアッセイの実施のための第２の分析物バインダーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
標識分析物の検出は、ＴＲＡＣＥ法を使用するイムノアッセイにより行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
標識分析物の検出が、免疫クロマトグラフィーにより行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的試料が、未希釈のままで、かつ固相の被覆部分が生物学的試料と完全に接触するような容量で使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
試料の添加から検出までの時間が３０分を超えず、方法は迅速検査法と見なすことができる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施するための装置であって、
ａ）分析物バインダーに結合される可逆的結合パートナー２を介して、分析物バインダーが可逆的に結合される可逆的結合パートナー１が、その中に固定化された固相を含み、
ｂ）分解緩衝液を加えることにより可逆的結合パートナー１と２の間の結合が分解されるが、分解緩衝液を加えた時、分析物バインダーへの分析物の結合は任意であることを特徴とする装置。
【請求項１６】
以下：
ａ）固定化された可逆的結合パートナー１を有する固相、
ｂ）可逆的結合パートナー２に結合した分析物バインダーを含む複合体、それにより、複合体は、場合により、可逆的結合パートナー１と２を固相に結合させることにより、すでに固定化型で存在してもよい、
ｃ）可逆的結合パートナー１と２との結合を分解する分解緩衝液、しかし、それにより、分析物バインダーへの分析物の結合は任意である
を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１７】
分析物バインダーが抗ＰＣＴ抗体である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
可逆的結合パートナー１と２の結合対が、以下の結合対：
ａ）陽性荷電ペプチドオリゴマーと陰性荷電ペプチドオリゴマー、
ｂ）Ｃａ２＋結合ペプチド／タンパク質と、ペプチド／タンパク質がＣａ２＋に結合している時ペプチド／タンパク質が高親和性で結合する抗体、
ｃ）オリゴヒスチジン（例えば、６Ｈｉｓ）とＮｉ−ＮＴＡ、
ｄ）ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジン
の１つから選択される、請求項１６又は１７に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１０−５３０９６６（Ｐ２０１０−５３０９６６Ａ）
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１２７０９（Ｐ２０１０−５１２７０９）
【出願日】平成２０年６月２０日（２００８．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７９１３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０００７８４
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５０８０９３５８４）ブラームス アクチェンゲゼルシャフト (27)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２０日（２００８．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５７９１３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０００７８４
【国際公開日】平成２０年１２月３１日（２００８．１２．３１）
【出願人】（５０８０９３５８４）ブラームス アクチェンゲゼルシャフト (27)
【Ｆターム（参考）】
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