分裂酵母由来のＩ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼの特徴
【課題】酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする単離されたＤＮＡならびにその認識および切断部位の提供。
【解決手段】分裂酵母由来の特定の塩基配列を有するＩ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼＤＮＡ配列。該ＤＮＡ配列を含む、クローニングおよび発現ベクター。該ＤＮＡ配列を含む、形質転換された細胞株ならびにトランスジェニック動物。ベクターは、遺伝子マッピングおよび遺伝子の部位指定挿入に有用である。
【解決手段】分裂酵母由来の特定の塩基配列を有するＩ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼＤＮＡ配列。該ＤＮＡ配列を含む、クローニングおよび発現ベクター。該ＤＮＡ配列を含む、形質転換された細胞株ならびにトランスジェニック動物。ベクターは、遺伝子マッピングおよび遺伝子の部位指定挿入に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制限エンドヌクレアーゼＩ−ＳｐｏｍＩおよびＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位に対応するヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明は、またヌクレオチド配列を含有するベクター、ベクターで形質転換された細胞、ベクターに基づくトランスジェニック動物、および生物の細胞に由来する細胞株にも関する。本発明は、また真核生物ゲノムのマッピングおよびインビボ部位指定遺伝子組換えに関するＩ−ＳｐｏｍＩの使用にも関する。
【０００２】
発明の背景
遺伝子を生物、例えば哺乳動物の生殖細胞系列に導入できることは、生物学において非常に興味深い。外来的に加えられたＤＮＡを取り込み、そしてＤＮＡに含まれた遺伝子を発現する哺乳動物細胞の性向は、何年も前から解っている。遺伝子操作の結果は、これらの動物の子孫に遺伝される。これらの子孫のすべての細胞は、その遺伝的構成の一部として導入遺伝子を受け継ぐ。かかる動物が、トランスジェニックであると称される。
【０００３】
トランスジェニック哺乳動物は、胚形成期および分化における遺伝子制御の研究、遺伝子作用の研究、および免疫系における細胞の複雑な相互作用の研究に関する手段を提供してきた。まるごとの動物は複雑な生物学的過程を志向する、操作された遺伝子に関する究極のアッセイ系である。
【０００４】
トランスジェニック動物は、種々の遺伝子の組織特異的な、または発達上の制御に寄与するＤＮＡ配列を機能的に分析するための一般的なアッセイを提供できる。加えて、トランスジェニック動物は、組換えタンパク質を発現するための、およびヒトの遺伝的障害の正確な動物モデルを作製するための有用な手段を提供する。
【０００５】
遺伝子クローニングならびに動物および動物細胞における発現の一般的な議論に関しては、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)、およびGreenら、Genome Analysis: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1977)を参照されたい。
【０００６】
特定の疾患および遺伝的障害に対する素因を有するトランスジェニック系は、これらの状態に導く事象の研究において非常に価値がある。遺伝的障害の処置の有効性は、障害の１次的原因である遺伝子欠損の同定に依存し得るということは周知である。疾患または障害を導く動物モデルを提供することにより有効な処置の発見を促すことができ、これにより、例えば遺伝子組換え処置プロトコルの効率、安全性および作用様式の研究が可能になる。
【０００７】
染色体と外来性ＤＮＡとの間の相同組換え（ＨＲ）は、ゲノムへの遺伝的変化を導入するための方法の基礎である（Capecchi、Science 244: 1288〜1292(1989)、Smithieら、Nature 317: 230〜234(1985))。組換えメカニズムのパラメーターは、細胞(Bernsteinら、Mol.Cell.Biol.12: 360〜367(1992); Brennerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83: 1762〜1766(1986); Linら、Mol.Cell.Biol.10: 113〜119(1990); Linら、Mol.Cell.Biol.10: 103〜112(1990))およびインビトロ系（JessbergerおよびBerg、Mol.Cell.Biol.11: 445〜457(1991)）に導入されたプラスミド配列を研究することにより決定されている。ＨＲは、ＤＮＡにおける二本鎖切断により促進される。
【０００８】
エンドヌクレアーゼの中でパン酵母（Saccharomyces cerevisiae）ミトコンドリアエンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩ（JacquierおよびDujon、Cell 41: 383〜394(1985)）は、特徴的であり、特定の染色体標的を切断するための、したがって生きた生物における染色体を操作するための手段として開発され得る（米国特許第５，４７４，８９６号）。Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質は、予め決定された配列が予め決定された部位に挿入されるようになる非相互的メカニズムである、酵母のミトコンドリアにおけるイントロンホーミングに寄与するエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩは、2本鎖切断を開始することにより、酵母の核における組換えを触媒できるということが証明されている（Plessisら、Genetics 130: 451〜460(1992)）。エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの認識部位は、１８ｂｐの長さであり、したがってＩ−ＳｃｅＩタンパク質は、非常に稀な、ゲノムにおける切断制限エンドヌクレアーゼである（Thierryら、Nucleic Acids Res.19: 189〜190(1991)）。加えて、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質は、リコンビナーゼではないので、その染色体操作の可能性は、宿主およびドナー分子の双方に関する標的部位要件を有する系の可能性よりも大きい（Kilbyら、Reviews 9: 413〜421(1993)）。
【０００９】
酵母Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼは、哺乳動物細胞における染色体標的で２本鎖切断を効率的に誘起でき、そして部位特異的組換え、遺伝子置換または挿入に至る切断をフランキングする領域と相同性を共有するドナー分子を用いて切断を修復できる（米国特許第５，４７４，８９６号）。酵素は、高い効率で組換えを触媒する。これは、２本鎖切断修復経路により染色体ＤＮＡと外来性ＤＮＡ間の組換えが哺乳動物細胞において生じ得ることを明示している（Szostakら、Cell 33: 25〜35(1983)）。
【００１０】
Ｉ−ＳｃｅＩは、多くの異なる適用に用いられている。かかる適用は、２本鎖切断の研究、染色体構造の調査、哺乳動物および細菌細胞における遺伝子置換を含む遺伝子転移の研究、ショウジョウバエにおける相同組換えによる遺伝子標的化（gene targeting）、ならびに植物における染色体切断の生成に関連している。AnglanaおよびBacchetti、Nucl.Acids.Res.27: 4276〜4281(1999); Bellaicheら、Genetics 152: 1037〜1044(1999); Choulikaら、CR Acad.Sci.III317: 1013〜1019(1994); Choulikaら、Mol.Cell.Biol.15: 1968〜1973(1994); Cohen-Tannoudjiら、Mol.Cell.Biol.18: 1444〜1448(1998); Liangら、およびGarrard、Methods 17: 95〜103(1999); Machidaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94: 8675〜8680(1997); Melkerson-Watsonら、Infect.Immun.69: 5933〜5942(2000); Mogilaら、Methods Mol.Biol.113: 439〜445(1999); Monteilhetら、Nucl.Acids.Res.18: 1407〜1413; NahonおよびRaveh、Adv.Exp.Med.Biol.451: 411〜414(1998); Neuvegliseら、Gene 213: 37〜46(1998); Nicolasら、Virology 266: 211〜224(2000); Perrinら、Embo J.12: 2939〜2947(1993); Posfaiら、Nucl.Acids.Res.27: 4409〜4415; Puchta、Methods Mol.Biol.113: 447〜451(1999); Rongら、Science 288: 2013〜2018; Thierryら、Nucl.Acids.Res.19: 189〜190; ならびにA.Plessisら、Genetics 130: 451〜460(1992)。
【００１１】
グループＩイントロンは、その効率のよい増殖メカニズムのために多くの進化的門に広範に及んでいる。そのいくつかは、イントロンを含まない同族ＤＮＡ配列においてイントロン挿入部位を認識し、そしてその部位近くのＤＮＡにおいて２本鎖切断を導入するホーミングエンドヌクレアーゼをコードする。その後、遺伝子変換過程でイントロン含有遺伝子は、切断されたレシピエントアレルの修復のための鋳型として作用し、介在配列の複製を導く（１−４）。グループＩイントロンホーミングと対照的に、グループIIイントロン可動性は、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）粒子を形成する、イントロンラリアット（intron lariat）に結合するイントロンコード化タンパク質により促進されるレトロホーミングメカニズムに基づく。ＲＮＰ粒子は、イントロンＲＮＡの逆スプライシングおよび逆転写によるＤＮＡ標的部位へのイントロンの組み込みを導く（５）。これに加えて、タンパク質成分は、エンドヌクレオチド結合分解活性を有し、アンチセンス鎖を切断する。ＲＮＡは、ＤＮＡ上に配置された後、アンチセンス鎖が、タンパク質部分により切断される前にセンス鎖に組み込まれる（６）。したがって、イントロンＲＮＡおよびＲＮＰ粒子のタンパク質成分の双方が、イントロン標的部位の認識に関与する。後者のエレメントは、またＤＮＡ巻き戻しに必須である（７）。グループＩのみならずグループIIイントロンもホーミングを行う。翻訳後除去されるポリペプチドであるインテインをコードするいくつかのＤＮＡ配列は、グループＩイントロンで記載されたのと同一の様式で増殖する。インテインは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーまたはＨ−Ｎ−Ｈファミリーのエンドヌクレアーゼを含有する（３、８−１２）。これらの酵素は、タンパク質スプライシング活性を担持する既存のインテインへのエンドヌクレアーゼ遺伝子の侵入により進化してきた可能性がある（１３）。インテインエンドヌクレアーゼＰＩ−ＳｃｅＩおよびＰＩ−ＰｆｕＩの結晶に関する構造研究により、グループＩイントロンエンドヌクレアーゼとは対照的に、これは別のＤＮＡ結合ドメインを用いてその特異性を増強していることが強く示されている。Ｉ−ＳｃｅＩでは、ＤＮＡ認識領域（ＤＲＲ）は、特異的基質が切断部位からおよそ２個のらせん回転離れて接触することを確立させるが（１４）、ＰＩ−ＰｆｕＩでは、スターラップドメイン（stirrup domain）が、同一の目的を満たしている（１５）。
【００１２】
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼは、イントロン挿入部位の近くで４ｂｐの３′−ＯＨのオーバーハングを作る（１６−１８）。最適な活性の条件は、酵素に基づく。例えばミトコンドリアの外で調製されたＩ−ＳｃｅII（１９）は、およそ３０℃の温度および中性のpHを好むが、一方、Ｉ−ＤｏｍＩ（１８、２０）は、およそ７０℃の温度およびアルカリ性のpH値を好む。細菌性II型制限酵素と異なって、同族の修飾系が存在しないので、ホーミングエンドヌクレアーゼは、宿主ゲノムに及ぼす有害な影響を排除するために非常に高度な認識配列特異性を有していなければならない。したがって、その認識部位は、更に長い（１４〜３０ｂｐ、ある種のインテインコード化エンドヌクレアーゼに関しては４０ｂｐまで）。結晶化酵素、Ｉ−ＣｒｅＩ（２１）、ＰＩ−ＳｃｅＩ（２２）、Ｉ−ＤｍｏＩ（２３）およびＨｉｓ−ＣｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＰｐｏＩ（２４）に関して示されているように、イントロンコード化ホーミングエンドヌクレアーゼは、βシートに依存してＤＮＡの主溝と接触する。それゆえにそのプロファイルは、非常に単調で、そしてＤＮＡ（２３、２５）の広い面積を覆うが、一方、球状の制限エンドヌクレアーゼ（２６）は、通常、標的配列（４）とそのα−ヘリックスからの側鎖を介して相互作用する。公知のホーミングエンドヌクレアーゼは、コンセンサスモチーフの出現に依存して４つのファミリーに分類された（ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−ＨおよびＨｉｓ−Ｃｙｓボックス）。後者の２つの群は、今では構造に基づいて単一の群、ββα−Ｍｅ群に分類されている（２７）。これとは対照的に細菌性II型制限酵素のメンバーは、更に多岐にわたる。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質ファミリーに属するエンドヌクレアーゼは、最も一般的な代表である。このクラスの主な特徴は、タンパク質において１または２回出現するドデカペプチドモチーフである。
【００１３】
１つのモチーフを有するエンドヌクレアーゼは、ホモ２量体としてその基質と結合し、一方、２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有する酵素は、単量体として作用する傾向がある。例外は、パン酵母（S. cerevisiae）のｃｏｘ１遺伝子のイントロンａＩ４αによりコードされるＩ−ＳｃｅII、および同一生物のイントロンｃｏｘ１Ｉ５αからのＩ−ＳｃｅIVである。Ｉ−ＳｃｅIIは、２つのドデカペプチドモチーフを有するが、ホモ２量体として活性である（１９）。Ｉ−ＳｃｅIVは、ヘテロ２量体として作用する（２８）。Ｉ−ＳｃｅＩ（２９）またはＩ−ＤｍｏＩ（１８）のような２ドメインの酵素は、遺伝子複製事象によりＩ−ＣｒｅＩ（１７）およびＩ−ＣｅｕＩ（３０）のような１ドメインのホーミングエンドヌクレアーゼから生じると推測された。（３、４、２１、２３、３１）。
【００１４】
２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するいくつかのタンパク質は、そのイントロンＲＮＡのスプライシングに関与している。それらは、マチュラーゼと称される（３２、３３）。マチュラーゼは、コファクターとして作用し、そしてスプライシング事象のためのイントロンＲＮＡ構造の触媒性コアを安定化する（３４、３５）。いくつかのドデカペプチドエンドヌクレアーゼもまた潜在性のマチュラーゼ活性を有し、これは、いくつかのアミノ酸の変異により顕示され得る（３６〜３８）。そのうちのわずかなものだけが、Ｉ−ＡｎｉＩ（３９、４０）およびＩ−ＳｃａＩ（４１〜４３）に関して報告されたように、双方の活性を同時に顕示する。
【００１５】
分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のミトコンドリアｃｏｘ１遺伝子では、４つまでのグループＩイントロンが見出された（４４）。そのうちの２つは、ドデカペプチドファミリーのタンパク質をコードするオープン・リーディグ・フレームを含有する（４５、４６）。
【００１６】
要約すると、ヒト疾患および遺伝的障害のトランスジェニック動物モデルを提供するための試薬および方法に関する技術的な必要性が存在する。試薬は、特に高度な特異性を有する制限酵素、その対応する制限部位およびこの酵素をコードする遺伝子に基づくことができる。とりわけ天然遺伝子またはそのフラグメントを、疾患を緩解できる、または細胞もしくは動物を修飾することにより、かかる疾患の研究のための分子手段を提供できる別の遺伝子または遺伝子フラグメントと置換するための試薬および方法に関する必要性が存在する。
【００１７】
発明の概要
したがって本発明は、技術的にこれらの必要性を満たすことを補助する。とりわけ本発明は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする単離されたＤＮＡに関する。
【００１８】
本発明の１つの実施態様では、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列に機能的に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ配列が提供される。
【００１９】
本発明は、更に酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列および本明細書にて記載される別のＤＮＡ配列に相補的な単離されたＲＮＡに関する。
【００２０】
本発明の別の実施態様では、ベクターが提供される。ベクターは、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列を含有するプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、またはウイルス、特にレトロウイルスベクターでよい。
【００２１】
本発明の別の実施態様では、ベクターは、Ｉ−ＳｐｏｍＩ制限部位をコードする本発明のＤＮＡ配列を含有するプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、またはウイルス、特にレトロウイルスベクターでよい。
【００２２】
本発明は、またＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位を含有する組換え染色体および細胞を作製するための方法にも関する。１つの実施態様では、Ｉ−ＳｐｏｍＩ制限部位は、組換えにより導入される。
【００２３】
本発明は、更にＩ−ＳｐｏｍＩ酵素を発現する組換え染色体および細胞を作製するための方法に関する。１つの実施態様では、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする配列は、組換えにより導入される。
【００２４】
本発明は、更にＩ−ＳｐｏｍＩ部位または酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードするＤＮＡ配列を含む組換え染色体にも関する。組換え染色体は、原核または真核生物に由来してよい。１つの実施態様では、本発明は、組換え哺乳動物、酵母、菌類、細菌、植物、線虫または昆虫染色体に関する。好ましい態様では、本発明は、組換えショウジョウバエ、線虫（C.elegans）、植物またはマウス染色体に関する。
【００２５】
加えて、本発明は、本発明のベクターで形質転換された原核細胞、例えば大腸菌（E.coli）または真核細胞に関する。１つの実施態様では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された哺乳動物、酵母、菌類、細菌、植物、線虫または昆虫細胞に関する。好ましい実施態様では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された組換えショウジョウバエ、線虫（C.elegans）、植物またはマウス細胞に関する。別の実施態様では、細胞は、幹細胞、好ましくは哺乳動物幹細胞および最も好ましくはマウス幹細胞である。本発明は、更にこれらの細胞に由来する細胞株に関する。
【００２６】
また、本発明は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードするＤＮＡ配列を含有するトランスジェニック生物、およびトランスジェニック生物の細胞から培養された細胞株にも関する。
【００２７】
加えて、本発明は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩに関する少なくとも１つの制限部位が生物の染色体に挿入されているトランスジェニック生物に関する。
【００２８】
更に、本発明は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩを用いる真核生物ゲノムを遺伝子マッピングする方法に関する。
【００２９】
本発明は、また酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩを用いる生物におけるインビボ部位指定組換えの方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】図１は、プラスミドインサートを表す。分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のｃｏｘ１ＩｂイントロンのＲＮＡ２次構造である。２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフ（Ｐ１およびＰ２）から成るエンドヌクレアーゼのコアをコードするヌクレオチドは、ループ８（Ｌ８）に位置する。Ｉ−ＳｐｏｍＩの生化学的特性に関して、Ｌ８の全コドンを含むＰＣＲフラグメントを発現ベクターｐＥＴ１６ｂにクローニングした。＊は、プライマーＳＰ００３における人工開始コドンを示す。ループの終末のボックスは、停止コドン示している。
【図１Ｂ】図１は、プラスミドインサートを表す。Ｉ−ＳｐｏｍＩリーディグ・フレームのクローン化されたフラグメントである。最上の図式は、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）の第１エクソン（ｃｏｘ１Ｅ１）の全配列およびｃｏｘ１遺伝子におけるイントロンを表す。灰色：元来の出発コドンＡＴＧを有するエクソンｃｏｘ１Ｅ１。暗灰色：全ＯＲＦ１５６０ヌクレオチドのうちの９１２ヌクレオチドはＲＮＡレベルでＬ８を構築する領域に位置する。黒色：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのコード化配列。淡灰色：ループの配列に関しては、１から７は領域ａに位置する。白色：ＴＡＡ停止コドンに対して下流の配列非コード化領域はループ９に位置する。 エクソンで出発し、イントロンｃｏｘ１Ｉ１ｂの停止コドンに及ぶ全リーディグ・フレーム１５６０ヌクレオチドにわたるＰＣＲフラグメントをｐＥＴ１６ｂにクローニングし、プラスミドｐＳＰ００１を得た。プラスミドｐＳＰ００５は、ＯＲＦの全５′−エクソン部分を欠如するが、一方、ｐＳＰ００３は、配列のループ８部分に限定されるフラグメントを含有した。クローニングに用いられた制限酵素を示す。 図２は、Ｉ−ＳｐｏｍＩの発現および精製を示す。
【図２Ａ】精製クロマグラムである。Ｈｉｓタグ化Ｉ−ＳｐｏｍＩを、参考書にて説明されるように大腸菌（E.coli）に発現させた。大腸菌細胞破壊に続いて、上澄をＮｉ2+で荷電したＨｉＴｒａｐ キレーティング・アフィニティ・カラム １ml（アメルシャム・ファルマシア・バイオテックAmercham Pharmacia Biotech、Little、リトルチャルフォント）に負荷し、溶解バッファー（ＨＥＰＥＳ ３０mM、pH８、ＮａＣｌ ３００mM、イミダゾール ２０mM）で流速１ml／分で平衡化した。Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼは、そのＮ末端Ｈｉｓタグを介して結合し、一方、不純物は、溶解バッファーと共に洗い流される。伝導率により測定したバッファー中のイミダゾール濃度を増加させることによりタンパク質の溶出を実施した。イミダゾール濃度２００mMでカラムから洗い流した画分にエンドヌクレアーゼバンドが見出された。λ＝２６０nmおよびλ＝２８０nmでの吸光度をモニター観察した。
【図２Ｂ】ピーク画分４〜１１の１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。画分６をアッセイに使用した。
【図２Ｃ】アフィニティクロマトグラフィー後のＩ−ＳｐｏｍＩ調製物のウェスタンブロットである。トランケートされたタンパク質のバンドは、未染色New England Biolabs Broad Rangeマーカー３６．５kDaバンドより上に現れ、これは３８．７kDaの推定された大きさとよく相関する。 図３は、Ｉ−ＳｐｏｍＩの切断部位の決定を表す。
【図３Ａ】５′−末端標識Ｉ−ＳｐｏｍＩ基質を作製するために用いられたプライマーである。各オリゴヌクレオチドの双方の末端は、イントロン挿入部位からの距離に応じて数字が付けられている。
【図３Ｂ】Ｉ−ＳｐｏｍＩの切断部位である。２つの異なる末端標識ＤＮＡ鋳型を、５′−γ32Ｐ末端標識プライマーＳＰ００９、ＳＰ００８またはＳＰ０１０を用いてＰＣＲ反応により調製した。次いでＤＮＡ基質を、Ｉ−ＳｐｏｍＩと共にインキュベートした。切断後、ＤＮＡフラグメントを、同一ＤＮＡ配列のシークエンシングラダーの隣のシークエンシングゲル上で電気泳動した。矢印は、センス鎖（左）およびアンチセンス鎖（右）のリン酸ジエステル結合の切断を示す。切断パターンを下部の図にまとめているが、これは、ねじれた線で表され、点線は、イントロン挿入部位の位置を示す。部位の配列は、部分的対称を示している。 図４は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ切断の最適条件の決定を表す。切断生成物％は、１７３ｂｐの長さの切断フラグメントからのシグナルと合計シグナル（このフラグメントのシグナルに未切断基質２７３ｂｐの放射活性を加える）との間の比率により表される。
【図４Ａ】Ｍｇ2+濃度である。ＰＣＲ生成物ＳＰ００９〜ＳＰ００８ １μlを、Ｉ−ＳｐｏｍＩ溶液 ５μlと共に全量２５μlでインキュベートした。反応バッファーはpH９．０のジエタノールアミン／ＨＣｌ ０．１Ｍ、ＮａＣｌ ０．１Ｍおよび１mM〜４０mMの種々濃度のＭｇＣｌ2を含有した。３７℃で２０分間反応を実施した。
【図４Ｂ】Ｎａ+濃度である。反応容量およびＰＣＲ生成物の加えた容量は、Ａの下に記載した。反応バッファーは、pH９．０のジエタノールアミン／ＨＣｌ ０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 ２．５mMおよび０Ｍ〜０．２Ｍの種々濃度のＮａＣｌを含有した。３７℃で２０分間反応を実施した。
【図４Ｃ】温度である。反応容量およびＰＣＲ生成物の加えた容量は、Ａの下に記載した。反応バッファーは、pH９．０のジエタノールアミン／ＨＣｌ ０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 ２．５mMおよびＮａＣｌ ０．１Ｍを含有した。反応物を、２５〜６５℃で２０分間インキュベートした。
【図４Ｄ】pHである。反応容量およびＰＣＲ生成物の加えた容量は、Ａの下に記載した。反応バッファーは、pH６．０のＭＥＳ ０．０３Ｍ、pH７．０またはpH８．０のＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ、pH９．０、９．２、９．４、９．６、９．８または１０のジエタノールアミン／ＨＣｌ ０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 ２．５mMおよびＮａＣｌ ０．１Ｍを含有した。３７℃で２０分間反応を実施した。 なお、ＭＧ2+、Ｎａ+および温度に関するアッセイを、同一の酵素調製物で実施したことに留意されたい。３７℃で２０分の消化の後、切断された生成物の最大値は、全ＤＮＡの約３０％であった。異なるpH値でのアッセイを、別の酵素調製物で実施し、そして最適条件下での切断効率は約８５％であった。 図５は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ認識配列の決定を表す。
【図５Ａ】Ｉ−ＳｐｏｍＩと共にインキュベートした後のプラスミドｐＰ３Ｅ５〜２のＮｄｅＩ−ＡｌｗＮＩフラグメントの電気泳動分析である。サザンブロッティングおよびランダム標識ｐＵＣ１９でのハイブリダイゼーションによりＤＮＡフラグメントを顕示した。１kbフラグメントは、Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位を含有し、これはＩ−ＳｐｏｍＩによる切断の後各々０．８kbおよび０．２kbの２つのフラグメントを生じる。一連のプラスミドをアッセイに用い、各々のプラスミドは、下に示す野生型エクソン−エクソン配列の単一のヌクレオチド変異を含有する。各々の変異は、野生型配列に比較して塩基転換に相当する。 ねじれた線は、切断部位を示す。「切断」と記されたボックスでは、各変異体の効果を示す：＋＝変異体は、野生型と同様に切断される；０＝切断低下；−＝切断なし。％値は、野生型配列に対する各変異配列におけるＩ−ＳｐｏｍＩの相対切断効率を指している。値は、切断生成物と野生型配列に関する変異配列の間の比率を％で示す。０．８kbバンドを１．０kbおよび０．８kbバンドに存在する全ＤＮＡと比較する。
【図５Ｂ】ＤＮＡ領域のらせん表示である。矢印は、鎖切断が導入される位置を示す。
【図６】グループＩイントロンの末梢ループのＯＲＦを示す。グループＩイントロン２次構造の概略図は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ型タンパク質のＯＲＦの挿入部位を示す。Ｃｅ：クラミドモナス・ユーガメトス（Chlamydomonas eugametos）。Ｃｒ：クラミドモナス・レインハルディッティ（Chlamydomonas reinhardtii）。Ｃｓ：クラミドモナス・スミティ（Chlamydomonas smithii）。Ｅｎ：エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）。Ｋｔ：クルイベロミセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermolerans）。Ｎｅ：ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）。Ｐａ：ポドスポラ・アンセリナ（Podospora anserina）。Ｓｃ：パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）。Ｓｐ：分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）。
【図７】ｃｏｘ１の第１のエクソンのヌクレオチド配列にＩ−ＳｐｏｍＩをコードするイントロンを加えたものを示す（配列番号：８）。
【図８】Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードするヌクレオチド配列を表す（配列番号：９）。
【図９】Ｉ−ＳｐｏｍＩ認識部位のヌクレオチド配列を表す（配列番号：１０）。
【図１０】天然Ｉ−ＳｐｏｍＩタンパク質のアミノ酸配列を表す（配列番号：１１）。
【図１１】Ｉ−ＳｐｏｍＩタンパク質のアミノ酸配列を表す（配列番号：１２）。
【００３１】
発明の詳細な説明
分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のミトコンドリアｃｏｘ１遺伝子における第１のグループＩイントロンの遺伝子産物であるＩ−ＳｐｏｍＩは、エンドヌクレアーゼ活性を有している。これは、イントロンを含まないｃｏｘ１アレル内のイントロン挿入近くのフランキング配列を認識する。Ｎ末端で大幅に修飾したＩ−ＳｐｏｍＩは、元来のリーディグ・フレームの遺伝子産物に比較して切断能力に影響がなく、またエンドヌクレアーゼの配列特異性にも影響がなかった。ホーミングエンドヌクレアーゼの開始コドンの位置は、可変性であり、そして宿主遺伝子の種々の部分に位置することができる。代表的なのは先行するエクソン配列を有するフレームにＯＲＦを有するもの、また別にイントロン配列に限定されるリーディグ・フレームを有するもの、またはイントロン内にイントロン性ＯＲＦを有するものさえもある。もう１つの基本的な問題は、エンドヌクレアーゼが活性化するために修飾またはプロセシングされる必要があるかどうかである。Ｉ−ＳｃｅII（１９）およびＩ−ＳｃｅIII（５５）に関しては、これらが前駆体タンパク質として合成され、そしてプロセシングされると報告されている。
【００３２】
本発明者らは、分裂酵母（S.pombe）のｃｏｘ１Ｉ１ｂのループ８イントロンの２次構造の配列が、インビトロで特異的エンドヌクレアーゼとして作用するタンパク質をコードすることを決定した。Ｉ−ＳｐｏｍＩの配列は、ジーンバンク受入番号ＮＣ ００１３２６ Ｘ００８８６ Ｘ０２８１９ Ｘ１５７３８（遺伝子＝「ｃｏｘ１」；イントロンＯＲＦ）またはＸ５４４２１ Ｘ００８８６ Ｘ０２８１９ Ｘ１５７３８で見出すことができる。
【００３３】
Ｉ−ＳｐｏｍＩのインビトロ活性に関する最適条件は、Ｉ−ＳｃｅＩ（２９）にとって好ましい条件に非常に類似している。９．０と１０．０の間の高pH値の嗜好は、むしろ異常である。例えば、Ｉ−ＳｃａＩ（４３）は、pH８．０〜９．０で、およびＩ−ＣｒｅＩ（５１）は７．０〜９．０の間で最高の活性を示す。他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼと共有する特徴的な様相は、２価カチオンＭｇ2+への依存性であるが、切断活性に及ぼすＭｎ2+またはＺｎ2+のような他のコファクターの影響は調査されなかった。
【００３４】
Ｉ−ＳｐｏｍＩの切断パターンは、異なる分野のＬＡＧＬＩＤＡＤＧ型の多くの他のエンドヌクレアーゼ、例えばＩ−ＡｎｉＩ（３９）、Ｉ−ＳｃａＩ（４３）、Ｉ−ＳｃｅＩ（１６）、II（３７）およびIII（５６）、Ｉ−ＣｅｕＩ（３０）、Ｉ−ＣｈｕＩ（５７）、Ｉ−ＣｒｅＩ（１７）、Ｉ−ＣｐａII（５８）、Ｉ−ＤｍｏＩ（２０）、Ｉ−ＰｏｒＩ（５９）、ＰＩ−ＳｃｅＩ（６０）、ＰＩ−ＴｈｙＩ（６１）、ＰＩ−ＴｌｉＩ（６２）およびＰＩ−ＴｆｕII（６３）、ならびにパン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨＯエンドヌクレアーゼ（６４）に関して記載されているように、４ヌクレオチドの長さの典型的な３′オーバーハングを示す。Ｉ−ＳｐｏｍＩは、イントロン挿入部位から２ヌクレオチド離れているセンス鎖およびアンチセンス鎖を切断する。Ｉ−ＳｐｏｍＩの認識部位は、２０ヌクレオチドの長さである。部位の中央の４つの塩基は、酵素のエンドヌクレオチド鎖切断の位置とほぼ一致し、Ｉ−ＣｒｅＩで報告されている（６５）のと同様に基質認識を必要としない。これらは、各側の５つの必須ヌクレオチドによりフランキングされている。必要とされる配列の各々の縁には別の２つの塩基が存在し、これを変化させることはできない（図５Ａ）。したがって、−１１と＋９位間の１４個の単一変異は切断に影響する。イントロンコード化ホーミングエンドスクレアーゼと同様に、Ｉ−ＳｐｏｍＩは、長いＤＮＡ配列を認識するが、タンパク質は、細菌性制限エンドヌクレアーゼと比較するとむしろ小型である。細菌性II型制限酵素は、ＤＮＡを取り込み、そして主溝の水素結合ドナーをほとんど飽和し、そしてそれに加えてしばしば認識部位の副溝に接触する（２６）。イントロンコード化ホーミングエンドヌクレアーゼのプロファイルは、β−シートに基づいて単調であるので、さらなる鎖を用いることなくＤＮＡの主溝上の認識部位の特異的塩基と相互作用し、亜飽和接触を行う（４）。認識パターンにしたがって、Ｉ−ＳｐｏｍＩに関して本発明者らは、酵素の触媒ドメインがＤＮＡの副溝に面するが、一方２つの認識ドメインは隣の主溝に面する一方の側からの基質ＤＮＡへの接触を仮説として取り上げる。これは、また必須塩基によりフランキングされた４つの中央の塩基における認識の独立性をも説明する。Ｉ−ＳｐｏｍＩ認識部位内の必須および非必須ヌクレオチドの順序は、対称的であるが、Ｉ−ＣｒｅＩ（６６）のようなホモ２量体ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ酵素に関して存在するようなパリンドローム配列はない。一般に、単量体ドデカペプチドエンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインは、ホモ２量体酵素と比較して顕著な非対称性を有している。これが認識部位に関してゆるやかな対称性要件の原因となり、そして基質の拡張された範囲の獲得を可能にする（３、６７）。ドデカペプチドホーミングエンドヌクレアーゼの認識および切断配列は、非常に多岐にわたっている。
【００３５】
１３１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質（１０）のアラインメントによれば、Ｉ−ＡｎｉＩ（３９）は、Ｉ−ＳｐｏｍＩに最もよく相対するが、切断部位も認識部位もＩ−ＳｐｏｍＩには類似していない。
【００３６】
ホーミングエンドヌクレアーゼＯＲＦｓは、これらの露出されたループの侵入の後、グループＩイントロンのＲＮＡ２次構造の異なる末梢ループに生じる（２、６８−７０）。したがって、イントロンおよびイントロンＯＲＦは、独立した遺伝子エレメントであると考えられる（７１）。ＧＩＹ−ＹＩＧ酵素Ｉ−ＴｅｖIIに対しての、ファージＴ４ｓｕｎＹ遺伝子のエクソン接合部配列およびループＬ９．１のＯＲＦをフランキングするイントロン配列のアラインメントは、Ｉ−ＴｅｖII認識配列にわたる高度な類似性を示した（７２）。この知見および触媒コア配列をコードするＤＮＡ上のイントロン可動性の独立性は、トランスでエンドヌクレアーゼに適用する場合（７３）、イントロン侵入の仮説を支持する。ドデカペプチドホーミングエンドヌクレアーゼのＯＲＦｓは、ループＬ１（Ｉ−ＳｃｅIII（５６））、Ｌ２（Ｉ−ＳｃｅIV（２８）、Ｉ−ＳｃｅVII（７４）、Ｉ−ＳｃａＩ（４１））、Ｌ６（Ｉ−ＣｅｕＩ（３０）、Ｉ−ＣｒｅＩ（７５））およびＬ８（Ｉ−ＡｎｉＩ（３９、７４）、Ｉ−ＤｄｉＩ（７１）（７６）、Ｉ−ＳｃｅＩ（１６、７４）、Ｉ−ＳｃｅII（１９、７４））に挿入される（図６）。
【００３７】
最近精製されたＩ−ＳｃａＩは、エンドヌクレアーゼおよびマチュラーゼの双方の活性を有していると報告された最初のタンパク質であったが、一方パン酵母（S.cerevisiae）のｃｙｔ ｂ遺伝子のイントロンｂｉ２におけるマチュラーゼ相同体が、エンドヌクレアーゼ活性を得るためには２つの非隣接アミノ酸の置換に依存する（３８、４１、４２）。双方の活性を含有する別のタンパク質は、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）（３９）のミトコンドリア性グループＩイントロンＩによりコードされるＩ−ＡｎｉＩである。双方の活性を含有するタンパク質は、この進化の中間体であることを意味する。
【００３８】
異なる界からのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ酵素の複数の配列アラインメントに基づいて、以前は、異なる遺伝子間および種々の宿主間のエンドヌクレアーゼの交換は、非常に起こりにくいことが示されてきた（１０）。代わりに、これらの可動性エレメントの獲得は何度も独立して起こり、そして共通の始祖において一度だけとは限らない。元来のイントロンは、自己スプライシングするので、エンドヌクレアーゼＯＲＦは、本質的なリボザイム機能を維持するためにイントロン２次構造の末梢ループに挿入されなければならない（図６）。したがってこの侵入の位置は、宿主生物または遺伝子に依存するのではなく、各々のイントロンの２次構造に依存する。それにもかかわらず、ＯＲＦのイントロンへの挿入により自己スプライシングの損傷が引き起こされることがあり、この方法を改善するためにマチュラーゼタンパク質の必要性が生じる。分裂酵母（S.pombe）のｃｏｘ１の４つのグループＩイントロンで、インビトロで自己触媒的にスプライシングするものはないことが報告されているが、パン酵母（S.cerevisiae）ｒｎｌイントロンの自己触媒的スプライシングが観察されており（４４）、これは恐らくインビボでのスプライシング過程におけるマチュラーゼタンパク質の関与のためであろう。この研究では、本発明者らは、分裂酵母（S.pombe）のイントロンｃｏｘ１Ｉ１ｂにおける２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含む酵素コアがＩ−ＳｐｏｍＩからエンドヌクレアーゼ活性を得るのに十分であることを示し、始祖ＯＲＦが、ループＬ８の挿入部位に依然存在するが、全遺伝子産物の開始コドンにより調節されると結論づけた。
【００３９】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ遺伝子配列
本発明は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする単離されたＤＮＡ配列に関する。酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩは、エンドヌクレアーゼ、とりわけＤＮＡエンドヌクレアーゼである。
【００４０】
分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のミトコンドリアゲノムのｃｏｘ１遺伝子の第１のグループＩイントロン（ｃｏｘ１Ｉ１ｂ）は、２つのコンセンサスモチーフを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質ファミリーの典型的なメンバーであるポリペプチドをコードするオープン・リーディグ・フレームを含有する。
【００４１】
大腸菌（E.coli）において人工的に発現されるこのタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性の生化学的な特徴づけが行われ、そしてイントロンＲＮＡ２次構造のループ８に位置するｃｏｘ１Ｉ１ｂ ＯＲＦの３０４コドンの翻訳産物は、インビトロで特異的なエンドヌクレアーゼ活性を呈する。ヌクレオチド鎖切断の最適なインビトロ条件が特徴づけられ、そしてかかる条件を用いてタンパク質の切断および認識部位を決定した。他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質からの知見に合致して、Ｉ−ＳｐｏｍＩは、イントロン挿入部位の近くで４ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する２本鎖切断を生じ、そして２０ヌクレオチドの新規な配列を認識する。
【００４２】
酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードするＤＮＡ配列は、精製された形態であることが好ましい。加えて、本発明のＤＮＡ配列は、外来性のタンパク質および脂質、ならびに外来性の微生物、例えば細菌およびウイルスを含まないことが好ましい。Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本質的に精製されそして単離されたＤＮＡ配列は、とりわけ発現ベクターを調製するのに有用である。
【００４３】
従来の化学合成技術を用いて、ヌクレオシド単位間の３′――――＞５′リン酸結合の形成により本発明の遺伝子を調製できる。例えば、周知のリン酸ジエステル、リン酸トリエステル、および亜リン酸トリエステル技術、ならびに公知のこれらの研究法を修飾した方法を用いることができる。ホスホロアミダイト研究法に基づくもののような自動合成機を用いてデオキシリボヌクレオチドを調製することができる。オリゴおよびポリリボヌクレオチドもまた、従来の技術を用いてＲＮＡポリメラーゼおよびリガーゼの助けを借りて入手することができる。
【００４４】
本発明は、勿論、本発明の配列と同一の特性を実質的に呈する本発明のＤＮＡ配列の変種を含む。これは、ＤＮＡ配列が本明細書にて開示する配列と同一である必要はないことを意味している。例えば、１つ以上のコドンが同一アミノ酸をコードできる公知の遺伝子コードの縮重のために、ＤＮＡ配列は、図７で示されるものから変化でき、そして依然として図７でコードされるのと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。変化は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩの切断特性を有する酵素をコードするようなＤＮＡ配列の特性を実質的に損なわない１つまたはそれ以上のヌクレオチドに関与する単一もしくは複数の塩基置換、欠失、または挿入もしくは局所変異に起因し得る。
【００４５】
本発明は、酵素的に活性なＩ−ＳｐｏｍＩをコードできる、精製された形態のＤＮＡ配列のフラグメントを包含することを意図する。実施例のように活性を決定することができる。したがって、「Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素」なる用語は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ制限部位を切断する能力を維持している元来のタンパク質の変種およびフラグメントを含むことを意味する。
【００４６】
本発明は、単離および精製された、すなわち均質な、組換えおよび非組換え双方のＩ−ＳｐｏｍＩポリペプチドを提供する。望ましい生物学的活性を保持する元来のＩ−ＳｐｏｍＩタンパク質の変種および誘導体を、元来のＩ−ＳｐｏｍＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の変異により入手することができる。多くの従来の方法のいずれかにより元来のアミノ酸配列を変化させることができる。元来の配列のフラグメントへのライゲーションを可能にする制限部位によりフランキングされた変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の座で変異を導入することができる。ライゲーションの後、得られた再構築された配列は、望ましいアミノ酸挿入、置換、または欠失を有するアナログをコードする。
【００４７】
または、オリゴヌクレオチドを指定する部位特異的変異誘発手段を用いて、変化した遺伝子を提供することができる、この場合予め決定されたコドンを置換、欠失または挿入により変化させることができる。前記した変化させる方法の実例は、Walderら(Gene 42: 133(1986)); Bauerら(Gene 37: 73(1985)); Craik(BioTechniques,January 12〜19(1985)); Smithら(Genetic Engineering: Principles and Methods,Plenum Press(1981)); Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82: 488(1985)); Kunkelら(Methods in Enzymol.154: 367(1987)); Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001）、および米国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号により開示されており、そのすべてを参照として本明細書に組み入れられる。
【００４８】
酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列を、遺伝子のすべてまたは特定の領域を増幅するのに有用な、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅することができる。例えばS.Kwokら、J.Virol.,61: 1690〜1694(1987)；米国特許第４，６８３，２０２号；および米国特許第４，６８３，１９５号を参照されたい。より具体的には、増幅すべきＤＮＡのプラスおよびマイナス鎖に相補的である、１０〜３００塩基対離れて位置する公知の配列のＤＮＡプライマーペアをオリゴヌクレオチドの合成のための周知の技術により調製することができる。プライマーがＤＮＡにアニーリングするとき、各プライマーの１つの末端を伸長させ、そして修飾して制限エンドヌクレアーゼ部位を作ることができる。ＰＣＲ反応混合物は、ＤＮＡ、ＤＮＡプライマーペア、４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＭｇＣｌ2、ＤＮＡポリメラーゼ、および従来のバッファーを含有できる。ＤＮＡを多くのサイクルで増幅することができる。一般に、各サイクルが短時間の高温でのＤＮＡの変性、反応混合物の冷却、およびＤＮＡポリメラーゼを用いる重合からなる、多くのサイクルを用いることにより検出の感度を上げることができる。増幅された配列を当業者に公知の技術を用いて検出することができる。
【００４９】
２．本発明のＩ−ＳｐｏｍＩ遺伝子を含有するヌクレオチドプローブ
酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列を、生物学的材料におけるヌクレオチド配列を検出するためのプローブとして用いることもできる。プローブを原子または無機ラジカルで、最も一般的には放射性核種を用いて、または分子生物学的実験で一般に用いられるいずれかの非放射性材料で標識することができる。放射性標識には32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ等がある。適切なシグナルを提供し、そして十分な半減期を有するいずれかの放射性標識を用いることができる。他の標識には、標識抗体に対する特異的結合メンバーとして提供され得るリガンド、蛍光物質、化学発光物質、酵素、標識リガンドの特異的結合対メンバーとして機能できる抗体などが含まれる。標識の選択は、ハイブリダイゼーションの速度およびＤＮＡまたはＲＮＡに対するプローブの結合に及ぼす標識の影響により規定される。標識は、ハイブリダイゼーションに利用できるＤＮＡまたはＲＮＡの量を検出するのに十分な感度を提供することが必要であろう。
【００５０】
本発明のヌクレオチド配列を遺伝子へのハイブリダイズするためのプローブとして用いる場合、プローブで試験されるヌクレオチド配列は、好ましくは水不溶性固体、多孔性支持体、例えばナイロン膜に添加される。本発明の標識ポリヌクレオチドおよび従来のハイブリダイゼーション試薬を用いてハイブリダイゼーションを実施できる。特別なハイブリダイゼーション技術は、本発明には必要でない。
【００５１】
ハイブリダイゼーション溶液に存在する標識プローブの量は、標識の特性、支持体に合理的に結合できる標識プローブの量、およびハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して広範に変化する。一般に、実質的に化学量論よりも過剰なプローブを用いて、固定されたＤＮＡまたはＲＮＡへのプローブ結合率を高める。
【００５２】
様々な程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを用いることができる。条件が厳密になるほど、2本鎖形成のためのプローブとポリヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションに必要である相補性が大きくなる。温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間等により厳密性を調節できる。便宜的にはハイブリダイゼーションの厳密性は、反応溶液の極性の変化により変化する。用いる温度を経験的に決定できるか、またはこの目的に開発された周知の式から決定できる。
【００５３】
好ましいハイブリダイゼーション条件には、標準的なハイブリダイゼーション条件、例えばChurchおよびGilbert、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(7): 1991〜1995(1984年4月)、およびChurchおよびGilbert、Prog.Clin.Biol.Res.177(2): 17〜21(1985）に記載された条件などが挙げられ、双方共に参照として具体的に本明細書に組み入れられる。
【００５４】
３．Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードするヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列
本発明は、また酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩまたはＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位をコードする本発明のＤＮＡ配列に関するもので、この場合ヌクレオチド配列は、他の核酸に連結されている。核酸はいずれかの供給源、例えばプラスミド、クローン化ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または原核および真核生物を含むいずれかの供給源に由来する天然ＤＮＡもしくはＲＮＡから入手することができる。核酸は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする核酸が導入されている組換え染色体でよい。同様に、核酸は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ制限部位が導入されている組換え染色体でよい。Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク（2001）に記載される技術を含む種々の技術により、生物学的材料、例えば微生物の培養物、生物学的液体または組織からＤＮＡまたはＲＮＡを抽出することができる。一般に細菌、酵母、ウイルス、または高等生物、例えば植物または動物から核酸を入手する。核酸は、更に複雑な混合物のフラクション、例えばヒトの全ＤＮＡに含まれる遺伝子の一部、または特定の微生物の核酸配列の一部でよい。核酸は、巨大分子のフラクションでよいか、または核酸は、連続した遺伝子もしくは遺伝子の集合体からなってもよい。ＤＮＡは１本鎖または２本鎖形態でよい。フラグメントが１本鎖形態である場合、従来の技術にしたがって、ＤＮＡポリメラーゼを用いてこれを２本鎖形態に変換することができる。
【００５５】
本発明のＤＮＡ配列を構造遺伝子に連結することができる。本明細書で用いる「構造遺伝子」なる用語は、その鋳型またはメッセンジャーｍＲＮＡにより具体的なタンパク質またはポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。本発明のヌクレオチド配列は、発現調節配列、すなわち遺伝子に機能的に連結されている場合、遺伝子の発現を調節および制御するＤＮＡ配列と共に機能できる。
【００５６】
４．本発明のヌクレオチド配列を含有するベクター
本発明は、また酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩまたはＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位をコードする本発明のＤＮＡ配列を含有するクローニングおよび発現ベクターにも関する。
【００５７】
更にとりわけ、酵素をコードするＤＮＡ配列を、配列をクローニングするためのビークルにライゲートすることができる。遺伝子クローニングに関与する主要な工程は、原核生物または真核生物からの目的の遺伝子を含有するＤＮＡを分離する、特定の部位で、得られたＤＮＡフラグメントおよびクローニングビークルからのＤＮＡを切断する、２つのＤＮＡフラグメントを一緒に混合する、そしてフラグメントをライゲートして組換えＤＮＡ分子を得るための手段を含む。次いで組換え分子を宿主細胞に移すことができ、そして細胞を複製させて元来のＤＮＡ配列のクローンを含有する同一の細胞を生成させることが可能になる。
【００５８】
本発明で用いるビークルは、本発明のヌクレオチド配列を宿主細胞に輸送することができるいずれかの１本鎖または２本鎖ＤＮＡ分子でよい。ビークルが細胞内で複製することもできる場合、これは少なくとも１つの、宿主細胞内の複製起点として作用できるＤＮＡ配列を含有しなければならない。加えて、ビークルは、本発明の遺伝子をコードするＤＮＡ配列を挿入するための１つまたはそれ以上の部位を含有しなければならない。これらの部位は、通常付着末端を形成できる制限酵素部位に相当し、これは、ビークルにライゲートされるプロモーター配列における付着末端と相補的である。一般に、これらの特性を有するプラスミド、バクテリオファージ、コスミドビークル、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母性人工染色体（ＹＡＣ）を用いて本発明を実施できる。
【００５９】
本発明のヌクレオチド配列は、ビークルの部位のいずれかの組み合わせに適合する付着末端を有することができる。または、配列は、ビークルのクローニング部位における対応する平滑末端にライゲートすることができる１つまたはそれ以上の平滑末端を有することができる。望む場合、例えば酵素Ｂａｌ ３１またはλ ｅｘｏIIIを用いて連続的なエクソヌクレアーゼ欠失により、ライゲートされるヌクレオチド配列を更に加工することができる。本発明のヌクレオチド配列が付着末端の望ましい組み合わせを含有しない事象においては、リンカー、アダプター、またはホモ重合体テーリング（homopolymer tailing）を加えることにより配列を修飾することができる。
【００６０】
本発明のヌクレオチド配列をクローニングするために用いられるビークル、例えばプラスミドは、宿主細胞により示される有用な特性に寄与する１つまたはそれ以上の遺伝子、例えば選択マーカーを担持することが好ましい。好ましい試験計画では、２つの異なる薬物に抵抗するための遺伝子を有するビークルを選択する。例えば抗生物質に関する遺伝子へのＤＮＡ配列の挿入により遺伝子を不活性化し、薬物抵抗性を破壊する。細胞が組換え体で形質転換されている場合、第２の薬物抵抗性遺伝子は影響を受けず、第２の薬物に対する抵抗性および第１の薬物に対する感受性により目的の遺伝子を含有するコロニーを選択することができる。好ましい抗生物質マーカーは、宿主細胞にクロラムフェニコール、アンピシリンまたはテトラサイクリン抵抗性を付与する遺伝子である。
【００６１】
種々の制限酵素を用いてビークルを切断することができる。制限酵素の同一性は、一般に、ライゲートされるＤＮＡ配列の末端およびビークルの制限部位の同一性に依存する。制限酵素は、ビークルの制限部位に合致し、これが今度はライゲートされる核酸フラグメントの末端に合致する。
【００６２】
ライゲーション反応を周知の技術および従来の試薬を用いて設定できる。ＤＮＡ2本鎖の隣接する５′−リン酸および遊離の３′−ヒドロキシ基間のリン酸ジエステル結合の形成を触媒するＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションを実施する。ＤＮＡリガーゼは、種々の微生物に由来してよい。好ましいＤＮＡリガーゼは、大腸菌（E.coli）およびバクテリオファージＴ４に由来する酵素である。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡフラグメントを平滑または粘着末端、例えば制限酵素消化により作製できる末端とライゲートすることができる。大腸菌（E.coli）ＤＮＡリガーゼを用いて、付着末端を含有する２本鎖ＤＮＡ分子の末端の間のリン酸ジエステル結合の形成を触媒することができる。
【００６３】
原核または真核細胞においてクローニングを実施できる。クローニングビークルを複製するための宿主は、勿論、ビークルと適合し、そしてビークルがそこで複製できるものである。プラスミドを用いる場合、プラスミドは、細菌もしくはその他の生物に由来してよいか、またはプラスミドを合成により調製することができる。プラスミドは、宿主細胞染色体とは独立して複製することができるか、または組み込みプラスミドを用いることができる。プラスミドは、宿主細胞のＤＮＡ複製酵素を利用して複製することができるか、またはプラスミドは、プラスミド複製に必要な酵素をコードする遺伝子を担持することができる。多くの異なるプラスミドを本発明の実施に用いることができる。
【００６４】
酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列をビークルにライゲートさせて発現ベクターを形成することもできる。この場合に用いるビークルは、適当な宿主細胞のプロモーターに機能的に連結された遺伝子を発現することができるものである。細菌、例えば大腸菌（E.coli）、酵母、昆虫、菌類、線虫、植物または哺乳動物細胞の遺伝子を発現するのに用いられることが知られているビークルを用いるのが好ましい。
【００６５】
ビークルを修飾するのに当業者に公知のいずれか代替の技術を用いることができる。
【００６６】
発現系
本発明は、また組換えクローニングおよびＤＮＡを含有する発現ベクター、ならびに組換えベクターを含有する宿主細胞をも提供する。実験室手引書、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubelら、Wiley(1998)）に手引きを見出すことができる。
【００６７】
ＤＮＡを含む発現ベクターを用いてＩ−ＳｐｏｍＩ酵素を調製することができる。Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素を生成する方法には、酵素の発現を促進する条件下で、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することと、次いで培養物から発現された酵素を収集することとが含まれる。発現された酵素を精製するための手順が、用いられる宿主細胞のタイプのような因子により、およびペプチドが膜結合しているか、または宿主細胞から分泌される可溶性形態であるかどうかにより変化することは当業者に理解されよう。
【００６８】
いずれか適当な発現系を用いることができる。ベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する、適当な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列に機能的に連結された本発明のポリペプチドまたはフラグメントをコードするＤＮＡを含む。制御配列の実例としては、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳開始および終止を調節する適当な配列などが挙げられる。制御配列が機能的にＤＮＡ配列に関係している場合、ヌクレオチド配列は、動作可能なように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列の転写を調節する場合、プロモーターヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されている。望ましい宿主細胞において複製する能力を付与する複製起点、および形質転換体が同定される選択遺伝子を一般に発現ベクターに組み込む。
【００６９】
加えて、ペプチド、例えば（元来のまたは異種性の）適当なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）に関するＤＮＡ配列をフレーム内で本発明の核酸配列に融合して、最初にＤＮＡを転写し、そしてｍＲＮＡを、シグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳することができる。目的の宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。細胞からのポリペプチドの分泌時にポリペプチドペプチドからシグナルペプチドが切断される。
【００７０】
シグナルペプチドが切断される（複数の）位置がコンピュータープログラムにより推定されるものとは異なることがあり、そして組換えポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞のタイプのような因子にしたがって変化し得ることもまた当業者に理解されよう。タンパク質調製物は１つ以上の部位でのシグナルペプチドの切断により得られる、異なるＮ末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含んでよい。
【００７１】
ポリペプチドの発現のための適当な宿主細胞には、原核生物、酵母または高等真核生物細胞などが挙げられる。哺乳動物、線虫、植物、細菌、菌類、酵母または昆虫細胞が宿主細胞として用いられるのが一般的に好ましい。細菌、菌類、酵母および哺乳動物宿主細胞で用いるための適当なクローニングおよび発現ベクターは、例えばPouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual,Elsevier、ニューヨーク（1985）に記載されている。細胞を含まない翻訳系を用いて、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてポリペプチドを生成することもできる。
【００７２】
原核生物系
原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性生物などが挙げられる。形質転換に適した原核生物宿主細胞には、例えば大腸菌（E.coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）およびシュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）およびブドウ球菌（Straphylococcus）属内のその他の様々な種などが挙げられる。原核生物宿主細胞、例えば大腸菌（E.coli）では、原核生物宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を促進するために、ポリペプチドはＮ末端メチオニン残基を含んでよい。Ｎ末端Ｍｅｔを、発現された組換えポリペプチドから切断することができる。
【００７３】
原核生物宿主細胞で使用するための発現ベクターは、一般に１つまたはそれ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカー遺伝子は例えば抗生物質抵抗性を付与するか、または独立栄養性の要件を提供するタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞のための有用な発現ベクターの実例としては、市販により入手可能なプラスミド、例えばクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）またはｐＢＲ３２２から誘導されるベクター、例えばｐｕＣグループからのベクターなどが挙げられる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性に関する遺伝子を含有し、したがって形質転換された細胞を同定するための単純な手段を提供する。適当なプロモーターおよびＤＮＡ配列を、ｐＢＲ３２２ベクターに挿入する。他の市販により入手可能なベクターには、例えばｐＫＫ２２３〜３（Pharmacia Fine Chemicals、ウプサラ、スゥエーデン）およびｐＧＥＭ１（Promega Biotec、マジソン、ウィスコンシン州、米国）などが挙げられる。
【００７４】
組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Changら、Nature 275: 615(1978); およびGoeddelら、Nature 281: 544(1979))、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddelら、Nucl.Acids.Res.8: 4057(1980)；およびＥＰ−Ａ−３６７７６）、およびｔａｃプロモーター（Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、412頁(1982)）などが挙げられる。特に有用な原核生物宿主細胞発現系は、ファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性レプレッサー配列を用いる。λＰＬプロモーターの誘導体を組み込む、American Type Culture Collectionから入手可能なプラスミドベクターには、プラスミドpHＵＢ２（大腸菌（E.coli）ＪＭＢ９株に常在する、ＡＴＣＣ３７０９２）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌（E.coli）ＲＲ１に常在する、ＡＴＣＣ５３０８２）などが挙げられる。
【００７５】
酵母系
または、酵母宿主細胞において、好ましくは酵母菌属（例えばパン酵母（S.cerevisiae)）からポリペプチドを発現させることができる。酵母の他の属、例えばピチア（pichia）またはクルイベロマイセス（Kluyveromyces）を用いることもできる。酵母ベクターは、しばしば２μ酵母プラスミドからの複製配列の起点、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終止のための配列、および選択マーカー遺伝子を含有する。酵母ベクターのための適当なプロモーター配列には、とりわけガラクトース制御プロモーター、例えばＧＲＡＰ１配列（Molecular Genetics of Yeast,John R.Johnston、Oxford University Press(1994)）、メタロチオネインのためのプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら、J.Biol.Chem.255: 2073(1980)）または他の糖分解酵素（Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.7: 149(1968); およびHollandら、Biochem.17: 4900(1978)）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどが挙げられる。他の酵母発現に適したベクターおよびプロモーターは、更にHitzeman、ＥＰＡ−７３，６５７に記載されている。別の代替は、Russellら(J.Biol.Chem.258: 2674(1982)）およびBeierら(Nature 300: 724(1982)）に記載されるグルコース抑制ＡＤＨ２プロモーターである。酵母宿主細胞では、ベクターは、好ましくはシャトルベクターである。酵母および大腸菌（E.coli）の双方で複製可能なシャトルベクターを、大腸菌（E.coli）における選択および複製のためにｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ′遺伝子および複製起点）を前記した酵母ベクターに挿入することにより構築することができる。
【００７６】
酵母α−因子リーダー配列を用いてポリペプチドの分泌を指示することができる。α−因子リーダー配列は、しばしばプロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される。例えばKurjanら、Cell 30: 933(1982)およびBitterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81: 5330(1984）を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適した他のリーダー配列は、当業者に公知である。リーダー配列をその３′末端の近くで修飾して、１つまたはそれ以上の制限部位を含有させることができる。これはリーダー配列の構造遺伝子への融合を促進する。
【００７７】
酵母形質転換プロトコルは当業者に公知である。かかるプロトコルの１つは、Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75: 1929(1978)に記載されている。Hinnenらのプロトコルは選択培地中でＬｅｕ+形質転換体を選択し、その場合、選択培地は、酵母窒素塩基 ０．６７％、グルコース ２％、アデニン １０mg/mlおよびウラシル ２０mg/mlから成る。
【００７８】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を、発現を誘導するために「富化」培地で増殖させることができる。富化培地の例としては、酵母抽出物 １％、ペプトン １％およびグルコース ２％から成るものが挙げられる。グルコースが培地から枯渇した場合ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制が起こる。
【００７９】
哺乳動物または昆虫系
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系用いて組換えポリペプチドを発現させることもできる。昆虫細胞内で異種性タンパク質を生成するためのバキュロウイルス系は、LuckowおよびSummers、Bio/Technology 6: 47(1988）により説明されている。哺乳動物起源の確立された細胞系を用いることもできる。適当な哺乳動物宿主細胞系の実例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）（Gluzmanら、Cell 23: 175(1981)）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞株、ならびにMcMahanら（EMBO J.10: 2821(1991)）に記載されるアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）から誘導されるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株などが挙げられる。
【００８０】
哺乳動物細胞にＤＮＡを導入するための確立された方法が記載されている（Kaufman,R.J.、Large Scale Mammalian Cell Culture 15〜69頁(1990)）。市販により入手可能な試薬を用いる別のプロトコル、例えばリポフェクタミン脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはリポフェクタミン・プラス脂質試薬を用いて細胞をトランスフェクトすることができる（Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 7413〜7417(1987)）。加えて、エレクトロポレーションを用いて従来の手段、例えばSambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual第3版、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)）を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトすることができる。技術分野で公知の方法、例えば細胞毒性薬物に対する抵抗性を用いて安定した形質転換体の選択を実施することができる。Kaufmanら、Meth.in Enzymology 185: 487〜511(1990)は、いくつかの選択スキーム、例えばジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）抵抗性について記載している。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株は、ＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ ＤＸ−Ｂ１１株でよい（UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77: 4216〜4220(1980)）。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現するプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入することができ、プラスミドを含有する細胞のみが適当な選択培地中で増殖できる。発現ベクターに組み込むことができる選択マーカー他の実例としては、抗生物質に対して抵抗性を付与するｃＤＮＡ、例えばＧ４１８およびヒグロマイシンＢなどが挙げられる。これらの化合物に対する抵抗性に基づいてベクターを宿す細胞を選択することができる。
【００８１】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターの転写および翻訳調節配列をウイルスゲノムから切り出すことができる。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起源の初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を用いて哺乳動物宿主細胞において構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝的エレメントを提供することができる。ウイルス性初期および後期プロモーターは、共にウイルスゲノムからフラグメントとして容易に得られるのでとりわけ有用であり、これは、ウイルス性の複製起点を含有することもできる（Fiersら、Nature 273: 113(1978); Kaufman、Meth.in Enzymology(1990)）。複製部位のＳＶ４０ウイルス起点に位置する、ＨｉｎｄIII部位からＢｇｌＩ部位に伸びるおよそ２５０ｂｐの配列が含まれる場合、より小型のまたは大型のＳＶ４０フラグメントを用いることもできる。
【００８２】
哺乳動物発現ベクターからの異種性遺伝子の発現を改善することが示されている別の調節配列には、ＣＨＯ細胞から誘導される発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）（Morrisら、Animal Cell Technology、529〜534頁(1997)；およびＰＣＴ出願ＷＯ９７／２５４２０）ならびにアデノウイルス２のトリパータイトリーダー（tripartite leader, ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡｓ（Gingerasら、J.Biol.Chem.257: 13475〜13491(1982)）のようなエレメントなどがある。ウイルス起源の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によりジシストロンのｍＲＮＡが効率的に翻訳されるようになる（OhおよびSarnow、Current Opinion in Genetics and Development 3: 295〜300(1993); Rameshら、Nucleic Acids Research 24: 2697〜2700(1996)）。選択マーカーのための遺伝子（例えばＤＨＦＲ）が続く、ジシストロンのｍＲＮＡの一部としての異種性ｃＤＮＡの発現が、宿主のトランスフェクション能力および異種性ｃＤＮＡの発現を改善することが示されている（Kaufman、Meth.in Enzymology(1990)）。ジシストロンのｍＲＮＡを用いる発現ベクターの実例には、Mosserら、Biotechnique 22: 150〜161(1997)に記載されるpTR-DC/GFP、およびMorrisら、Animal Cell Technology 529〜534頁(1997)に記載されるｐ２Ａ５Ｉである。
【００８３】
有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴは、Mosleyら、Cell 59: 335〜348(1989)に記載されている。哺乳動物宿主細胞において使用される他の発現ベクターを、例えばOkayamaおよびBerg(Mol.Cell.Biol.3: 280(1983))ならびにSambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク（2001)）に開示されるように構築することができる。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現のための有用な系、を実質的にCosmanら(Mol.Immunol.23: 935(1986)）に記載されるように構築することができる。別の有用な哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ９１／１８９８２に記載されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【００８４】
別の有用な発現ベクター、ｐＦＬＡＧ（登録商標）およびｐＤＣ３１１を使用することもできる。ＦＬＡＧ（登録商標）技術は、ｐＦＬＡＧ（登録商標）発現ベクターにより発現された組換えタンパク質のＮ末端への低分子量（１ｋＤ）、親水性ＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドの融合を中心としている。ｐＤＣ３１１は、ＣＨＯ細胞におけるタンパク質の発現に用いられる別の特殊なベクターである。ｐＤＣ３１１は、目的の遺伝子およびＤＨＦＲ翻訳のための配列内リボソーム結合部位、発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）、ヒトＣＭＶプロモーター、トリパータイトリーダー配列、およびポリアデニル化部位を有するジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有するバイシストロン配列により特徴づけられる。
【００８５】
用いることができるシグナルペプチドに関しては、望む場合、元来のシグナルペプチドを異種性のシグナルペプチドまたはリーダー配列と置換することができる。シグナルペプチドまたはリーダー配列の選択は、組換えポリペプチドが生成される宿主細胞のタイプのような因子に依存し得る。説明のために、哺乳動物宿主細胞において機能的である異種性シグナルペプチドの実例としては、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Cosmanら、Nature 312: 768(1984)に記載されるインターロイキン−２レセプターのシグナル配列；欧州特許第３６７，５６６号に記載されるインターロイキン−４レセプターシグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチド；および欧州特許第４６０，８４６号に記載されるII型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチドなどが挙げられる。
【００８６】
Ｉ−ＳｐｏｍＩの発現は、恒常的または誘導的のいずれかでよい。誘導能が望ましい場合、誘導プロモーターを用いることができる。誘導系の実例にはBrown、米国特許第６，１８０，３９１号；Yeeら、米国特許第６，１３３，０２７号；Reeves、米国特許第５，９６５，４４０号；およびFilmusら、米国特許第５，８７７，０１８号が挙げられる。
【００８７】
精製
本発明は、またポリペプチドおよびそのフラグメントを単離および精製する方法をも含む。
【００８８】
単離および精製
１つの好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドまたはフラグメントの、本発明のポリペプチドまたはフラグメントの精製を助ける別のポリペプチドへの融合を用いて組換えポリペプチドまたはフラグメントの精製を行うことができる。かかる融合パートナーには、ポリＨｉｓ、ＨＡ−ＧＳＴ、またはその他の抗原同定ペプチド、およびＦｃ部分などが含まれ得る。
【００８９】
別の好ましい実施態様では、Ｔａｐ−Ｔａｇ技術により精製を行う（Rigautら、Nat.Biotechnol.17(10): 1030〜1032(1999年10月)）。
【００９０】
宿主細胞のいずれかのタイプに関しては、当業者に公知であるように、組換えポリペプチドまたはフラグメントを精製するための手段は、用いる宿主細胞のタイプのような因子、および組換えポリペプチドまたはフラグメントが培養培地に分泌されるか、またはされないかによって変わる。
【００９１】
一般に、分泌されない場合は、組換えポリペプチドまたはフラグメントを宿主細胞から、または可溶性であり、そして分泌される場合は、培地もしくは上澄から単離し、続いて１回またはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティ精製またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を行うことができる。これらの工程を達成するための具体的な方法に関しては、最初に市販により入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて培養培地を濃縮することができる。濃縮工程に続いて、濃縮物を精製マトリックス、例えばゲル濾過媒体に適用することができる。また別に、アニオン交換樹脂、例えば吊り下がったジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基質を用いることができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは通常タンパク質精製に用いられる他の型でよい。または、カチオン交換工程を用いることができる。適当なカチオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスを含む。加えて、クロマトフォーカシングステップを用いることができる。または、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を用いることができる。適当なマトリックスは、樹脂に結合したフェニルまたはオクチル基でよい。加えて、選択的に組換えタンパク質に結合するマトリックスを有するアフィニティクロマトグラフィーを用いることができる。用いられるかかる樹脂の実例は、レクチンカラム、色素カラムおよび金属キレートカラムである。最後に、１回またはそれ以上の疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば吊り下がったメチル、オクチル、オクチルデシルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルまたは重合体樹脂）を用いて更にポリペプチドを精製することができる。前記の精製工程のいくつかまたはすべては種々の組み合わせで周知であり、これを用いて単離および精製された組換えタンパク質を提供することができる。
【００９２】
本発明のポリペプチド結合タンパク質、例えば本発明のポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体を含むアフィニティカラムを利用して発現されたポリペプチドをアフィニティ精製することも可能である。従来の技術を用いて、例えばこれらのポリペプチドを例えば高塩分溶出バッファー中で、次いで使用するための低塩分バッファーに透析するか、もしくは利用するアフィニティマトリックスに依存してpHまたは他の成分を変化させることにより、アフィニティマトリックスから除去するか、または例えば本発明から誘導されるポリペプチドのようなアフィニティ部分の天然に生じる基質を用いて競合的に除去することができる。
【００９３】
本発明のこの実施態様では、ポリペプチド結合タンパク質、例えば抗ポリペプチド抗体または本発明のポリペプチドと相互作用する他のタンパク質を固相支持体、例えばカラムクロマトグラフィーマトリックスまたはその表面に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定、分離、もしくは精製するのに適した類似の基質に結合させることができる。本発明のポリペプチド結合タンパク質の、表面に接触する固相への粘着をいずれかの手段により達成できる、例えば磁性微粒子をこれらのポリペプチド結合タンパク質で被覆し、磁場を通るインキュベーション容器中に維持することができる。細胞混合物の懸濁液を、そこにかかるポリペプチド結合タンパク質を有している固相と接触させる。その表面に本発明のポリペプチドを有している細胞は、固定されたポリペプチド結合タンパク質に結合し、次いで未結合細胞は、洗い流される。このアフィニティ結合方法は、かかるポリペプチドを発現する細胞を溶液から精製、スクリーニング、または分離するのに有用である。固相から陽性として選択された細胞を放出する方法は、当業界で公知であり、そして例えば酵素の使用を包含する。かかる酵素は、好ましくは無毒であり、そして細胞に対して無害であり、ならびに細胞表面結合パートナーを切断するように志向させるのが好ましい。
【００９４】
また別に、本発明のポリペプチド発現細胞を含有すると推定される細胞の混合物を最初に本発明のビオチン化ポリペプチド結合タンパク質と共にインキュベートすることができる。インキュベーション時間は、典型的には、本発明のポリペプチドに十分に結合することを確実にする時間である、少なくとも１時間である。次いで、得られた混合物を、アビジン被覆ビーズを充填したカラムを通過させ、それによりアビジンに関するビオチンの高親和性のためにポリペプチド結合細胞がビーズに結合する。アビジン被覆ビーズの仕様は、当業界で公知である。Berensonら、J.Cell.Biochem.10D: 239(1986)を参照されたい。未結合材料の洗浄および結合細胞の遊離は従来の方法を用いて実施する。
【００９５】
精製の望ましい程度は、タンパク質の使用目的に依存する。例えば、ポリペプチドが、インビボで投与される場合、比較的高純度であるのが望ましい。かかる場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析したときに、他のタンパク質に相当するタンパク質バンドが検出されないようにポリペプチドを精製する。異なったグリコシル化、異なった翻訳後プロセシング等のために、ポリペプチドに相当する複数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化され得ることは当業者には理解されよう。本発明のポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したときに、単一のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均一になるまで精製するのが最も好ましい。銀染色、クーマシー青色染色または（タンパク質が放射性標識されている場合）オートラジオグラフィーによりタンパク質バンドを可視化することができる。
【００９６】
５．本発明の核酸を含有する細胞および染色体
従来の技術を用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入することができる。例えばリン酸カルシウム沈殿（GrahamおよびVan Der Eb、Virology 52: 456〜467(1973); ChenおよびOkayama、Mol.Cell.Biol.7: 2745〜2752(1987); Rippeら、Mol.Cell.Biol.10: 689〜695(1990)）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Gopal、Mol.Cell.Biol.5: 1188〜1190(1985)）、エレクトロポレーション（Tur-Kaspaら、Mol.Cell.Biol.6: 716〜718(1986)）、直接マイクロインジェクション（HarlandおよびWeintraub、J.Cell Biol.101: 1094〜1099(1985)）、ＤＮＡ充填リポソーム（NicolauおよびSene、Biochim.Biophys.Acta 721: 185〜190(1982); Fraleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76: 3348〜3352(1979)）およびリポフェクタミンＤＮＡ複合体、細胞ソニケーション（Fechheimerら、「スクレープローディングおよびソニケーションローディングによるプラスミドＤＮＡでの哺乳動物細胞のトランスフェクション」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 8463〜8467(1987)）、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子衝撃（Yangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 9568〜9572(1990)）、ならびにレセプター媒介トランスフェクション（WuおよびWu、Biochemistry、27: 887〜892(1988)；WuおよびWu、J.Biol.Chem.262: 4429〜4432(1987)）により核酸を導入することができる。以下で論じるように、ウイルスベクターを用いることもできる。
【００９７】
好ましい細胞は、細菌、植物、線虫、酵母、昆虫および哺乳動物である。微生物純粋培養を用いることができる。とりわけ好ましいものは、ショウジョウバエおよびマウス細胞である。細胞は、初代細胞または細胞株でよい。細胞は、ゲノムに組み込まれた核酸を含有できる。または、核酸は、組み込まれていないままでもよい。好ましい実施態様では、組換え哺乳動物または昆虫染色体は、組み込まれたＩ−ＳｐｏｍＩ部位を含有する。とりわけ好ましいのは、ショウジョウバエ、線虫（C.elegans）またはげっ歯類染色体である。
【００９８】
別の好ましい態様では、組換え細胞、植物、線虫、酵母、哺乳動物、または昆虫染色体は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素を発現する核酸を含有する。とりわけ好ましいものは、ショウジョウバエ、線虫（C.elegans）、またはマウス染色体である。
【００９９】
原核または真核細胞においてクローニングを実施することができる。クローニングビークルを複製するための宿主は、もちろんビークルに適合し、そしてそこでビークルが複製できる。好ましくはクローニングは、細菌または酵母細胞内で実施されるが、菌類、動物および植物起源の細胞を用いることもできる。クローニング作業を行うのに好ましい宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌（E.coli）である。大腸菌（E.coli）細胞の使用は、たいていのクローニングビークル、例えば細菌ブラスミドおよびバクテリオファージがこれらの細胞内で複製するので特に好ましい。
【０１００】
本発明の好ましい実施態様では、従来の技術を用いて、動作可能なようにプロモーターに連結された本発明のヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを哺乳動物細胞に挿入する。
【０１０１】
６．ウイルスベクター
（ａ）アデノウイルスベクター
インビボ分配のための１つの方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用に関連する。アデノウイルスを用いてＩ−ＳｃｅＩをヒト細胞に効率よく分配している（AnglanaおよびBacchetti、Nucleic Acids Research 27: 4276〜4281(1999)）。またアデノウイルスをベクターとして用いてＨＯエンドヌクレアーゼを分配している（Nicolasら、Virology 266: 211〜244(2000)）。アデノウイルスベクターを用いてＩ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする核酸を分配することができる。
【０１０２】
遺伝子構成、すなわち、３６kB、直線状、２本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの知識によりアデノウイルスＤＮＡの大きな切片の７kBまでの外来性配列との置換が可能になる（GrunhausおよびHorwitz、クローニングベクターとしてのアデノウイルス、Seminar in Virology 3: 237〜252(1992)）。アデノウイルスＤＮＡは、遺伝毒性の可能性なしにエピソームの様式で複製できるので、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み込みには至らない。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、大規模な増幅の後のゲノムの再構成は、検出されていない。アデノウイルスは、その細胞サイクル段階にかかわらず、本質的にすべての上皮細胞に感染できる。アデノウイルスは、それが中程度の大きさのゲノムであり、操作が容易であり、高力価で、広範な標的細胞範囲を有し、そして感染性が高いために、遺伝子移入ベクターとして使用するのにとりわけ適している。複製欠損であるアデノウイルスベクターの作製および増殖は、ヘルパー細胞株に依存し、これは、恒常的にアデノウイルスタンパク質を発現する（例えばGrahamら、「ヒトアデノウイルス５型からのＤＮＡにより形質転換されたヒト細胞株の特徴」J.Gen.Virol.36: 59〜79(1977)）。
【０１０３】
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Leveroら、「インビトロおよびインビボでの外来性遺伝子の発現のための欠損および非欠損アデノウイルスベクター」Gene 101: 195〜202(1991); Gomez-Foixら、「筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ遺伝子の肝細胞へのアデノウイルス媒介移入が、グリコーゲンの制御変化に寄与する」J.Biol.Chem.267: 25129〜25134(1992)）およびワクチン開発（GrunhausおよびHorwitz、Seminar in Virology 3: 237〜252(1992); GrahamおよびPrevec、「アデノウイルス基盤発現ベクターおよび組換えワクチン」Biotechnology 20: 363〜390(1992)）に用いられている。組換えアデノウイルスを遺伝子治療に使用できることが動物実験により示唆されている（Stratford-PerricaudetおよびPerricaudet、Human Gene Transfer(Cohen-HaguenauerおよびBorion(編)、Editions John Libbey Eurotext、フランス（1991)）、51〜61頁; Stratford-Perricaudetら、Hum.Gene Ther.1: 241-256(1990)）。組換えアデノウイルスの異なる組織への投与における研究には、気管点滴注入（Rosenfeldら、「組換えアルファ１−アンチトリプシン遺伝子の肺上皮へのインビボアデノウイルス媒介移入」）Science 252: 431〜434(1991); Rosenfeldら、「ヒトシスチン繊維症膜コンダクタンスレギュレーター遺伝子の気道上皮へのインビボ移入」Cell 68: 143〜155(1992)）筋肉注射（Ragotら、「ヒトミニジストロフィン遺伝子のｍｄｘマウスの骨格筋への効率のよいアデノウイルス媒介移入」Nature 361: 647〜650(1993)）、末梢静脈内注射（HerzおよびGerard、「低密度リポタンパク質レセプター遺伝子のアデノウイルス媒介移入は、正常マウスにおいてコレステロールクリアランスを急速に促進する」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 2812〜2816(1993)）および脳への定位的接種（Le Gal La Salleら、「脳のニューロンおよびグリアへの遺伝子移入のためのアデノウイルスベクター」Science 259: 988〜990(1993)）などがある。
【０１０４】
（ｂ）レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターを用いてＩ−ＳｐｏｍＩ酵素またはＩ−ＳｐｏｍＩ部位をコードする核酸を細胞に分配することができる。レトロウイルスベクターの使用により核酸の宿主染色体への組み込みが促進される。
【０１０５】
レトロウイルスは、逆転写の方法により感染された細胞内でそのＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに変換する能力により特徴づけられる１本鎖ＲＮＡウイルスの一群である（Ｃｏｆｆｉｎ、「レトロウイルス科およびその複製」、Virology（Fieldsら(編)、ニューヨーク：Raven Press)1437〜1500頁(1990)）。次いで得られたＤＮＡをプロウイルスとして安定して細胞染色体に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を志向させる。組み込みによりレシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持に至る。レトロウイルスベクターを構築するために、特定のウイルス配列の代わりに目的の遺伝子をコードする核酸をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲを含有しないパッケージング細胞株およびパッケージング成分を構築する（Mannら、「レトロウイルスパッケージング変異体の構築およびヘルパー不含の欠損レトロウイルスを生成するためのその使用」、Cell 33: 153〜159(1983)）。レトロウイルスＬＴＲと一緒にヒトｃＤＮＡおよびパッケージング配列を含有する組換えプラスミドをこの細胞株に導入する場合、パッケージング配列により組換えプラスミドのＲＮＡ転写がウイルス粒子にパッケージングされ、次いでこれが培養培地に分泌される（NicolasおよびRubenstein、「レトロウイルス」、ベクター：分子クローニングベクターおよびその使用に関する調査、RodriguezおよびDenhardt(編)、Stoneham: Butterworth、493〜513頁(1988); Temin、Gene Transfer、(Kucherlapati(編)、ニューヨーク：Plenum Press)149〜188頁(1986); Mannら、Cell 33: 153〜159(1983))。次いで組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、場合によっては濃縮してもよく、そして遺伝子移入に用いる。レトロウイルスベクターは、広範な細胞タイプに感染できる。
【０１０６】
（ｃ）発現構築物としてのその他のウイルスベクター
他のウイルスベクターを、本発明の発現または分配構築物として用いることができる。ウイルス、例えばワクシナウイルス（Ridgeway、「哺乳動物発現ベクター」、ベクター：分子クローニングベクター及びその使用に関する調査（RodriguezおよびDenhardt(編)、Stoneham: Butterworth)467〜492頁(1988)；BaichwalおよびSugden、「動物ＤＮＡウイルスに由来する遺伝子移入のためのベクター：移入された遺伝子の一過性および安定した発現」、Gene transfer, (Kucherlapati(編)、ニューヨーク：Plenum Press)117〜148頁(1986); Couparら、「複数の外来性遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスの構築のための一般法」、Gene 68: 1〜10(1988)）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ridgeway、RodriguezおよびDenhardt(編)、Stoneham: Butterworth、467〜492頁(1988); BaichwalおよびSugden、Gene transfer (Kucherlapati(編)、ニューヨーク：Plenum Press)117〜148頁(1986)）およびヘルペスウイルスに由来するベクターを用いることができる。
【０１０７】
他のベクターは、例えばアフリカツメガエル卵母細胞に関してはSegalら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 806-810(1995)）、植物に関してはMachidaら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94: 8675〜8680(1997)）およびKirikら(EMBO 19(20): 5562〜5566(2000)）、ならびにショウジョウバエに関してはBellaicheら(Genetics 152: 1037〜1044(1999)）に開示されている。
【０１０８】
７．幹細胞
１つの実施態様では、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素またはＩ−ＳｐｏｍＩ部位をコードする核酸を含有する幹細胞を調製することができる。特定の遺伝子のマウスゲノムへの通常の挿入は、マウスＥＳ細胞の使用により達成することができる（例えばKusakabeら、米国特許第６，１９０，９１０号参照）。マウスＥＳ細胞は、インビトロで着床前胚（Evansら、Nature 292: 154〜159(1981); Martin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78: 7634〜7638(1981)）または胎児生殖細胞（Matsuiら、Cell 70: 841〜847(1992)）から誘導された未分化の多能性細胞である。マウスＥＳ細胞は、連続継代で未分化状態を維持する（Williamsら、Nature 336: 684〜687(1988)）。
【０１０９】
通常の着床前胚と共にキメラに合体させ、そして子宮に戻したマウスＥＳ細胞は、通常の発生に参加する（Richardら、Cytogenet.Cell Genet.65: 169〜171(1994)）。キメラにおいてマウスＥＳ細胞が、機能的生殖細胞に寄与する能力により、マウス系に部位特異的変異を導入する方法が提供される。適当なトランスフェクションおよび選択計画を用いれば、相同組換えを用いて特定遺伝子の計画的な変化を伴うＥＳ細胞株を誘導することができる（例えばJaisserら、米国特許第５，８３０，７２９号）。これらの遺伝的に操作された細胞を用いて正常な胚を有するキメラを形成することができ、キメラ動物が回収される。ＥＳ細胞が、キメラ動物の生殖系列に寄与する場合、次いで次世代で、計画された変異のためのマウス系統が確立される。好ましい実施態様では、マウスＤ３胚幹細胞株を用いる。他のＥＳ細胞、例えばウシ胎児幹細胞（Simsら、米国特許第６，１０７，５４３号）を同様に用いることができる。
【０１１０】
８．トランスジェニク動物
トランスジェニク動物を作製するために、従来の技術を用いることができる。１つの実施態様では、ＥＳ細胞を用いてトランスジェニク動物を作製することができる。別の実施態様では、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素またはＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位をコードするプラスミドを１−細胞期マウス受精卵の雄前核に注射できる。次いで注射した卵を偽妊娠代理母の雌に移すことができる。代理母の雌の卵を出産まで成長させる。
【０１１１】
トランスジェニク動物は、初期発達段階（通常１−細胞期）で、動物または動物の祖先の生殖系列に導入されている遺伝子を担持する。Wagnerら、P.N.A.S.USA 78: 5016(1981); およびStewartら、Science 217: 1046(1982)は、ヒトグロビン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。Constantiniら、Nature 294: 92(1981); およびLacyら、Cell 34: 343(1983）は、ウサギグロビン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。McKnightら、Cell 34: 335(1983)は、ニワトリトランスフェリン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。Brinsterら、Nature 306: 332(1983)は、機能的に再構成された免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。Palmiterら、Nature 300: 611(1982)は、重金属誘導メタロチオネインプロモーター配列に融合されたラット成長ホルモン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。Palmiterら、Cell 29: 701(1982)は、メタロチオネインプロモーター配列に融合されたチミジンキナーゼ遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。Palmiterら、Science 222: 809(1983)は、メタロチオネインプロモーター配列に融合されたヒト成長ホルモン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。
【０１１２】
９．ネスト化染色体フラグメンテーション計画
真核生物ゲノムを遺伝子マッピングするためのネスト化染色体フラグメンテーション（the nested chromosomal fragmentation）計画は、制限エンドヌクレアーゼＩ−ＳｐｏｍＩの独特な特性、例えば２０ｂｐの長さの認識部位を利用する。たいていの真核生物ゲノムにおける天然のＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位の不在も、またこのマッピング計画に利用される。
【０１１３】
最初に、前記したように選択マーカーを含有する特定のカセットを用いる相同組換えによるか、または無作為挿入により１つまたはそれ以上のＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位が、ゲノムの種々の位置で人工的に挿入される。次いでＩ−ＳｐｏｍＩ制限酵素と共にインキュベートしたときに、得られたトランスジェニック系統のゲノムを、人工的に挿入された（複数の）Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位で完全に切断する。切断によりネスト化染色体フラグメントが生成される。
【０１１４】
次いで染色体フラグメントを精製し、そしてパルスフィールドゲル（ＰＦＧ）電気泳動により分離して、染色体において挿入された部位の位置を「マッピング」することが可能になる。全ＤＮＡが、制限酵素で切断される場合、各々の人工的に導入されたＩ−ＳｐｏｍＩ部位が、ゲノムにおける独特な「分子道標」を提供する。したがって各々が、道標間の物理学的なゲノムの間隔を決定する単一のＩ−ＳｐｏｍＩ部位を担持する１組のトランスジェニック系統を作成できる。結果的に、人工的に導入されたＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位を用いてゲノム全体、染色体またはいずれかの目的のセグメントをマッピングすることができる。
【０１１５】
ネスト化染色体フラグメントを固体膜に移し、フラグメントのＤＮＡに相補的なＤＮＡを含有する標識プローブをハイブリダイズすることができる。観察されるハイブリダイゼーションバンドパターンに基づいて、真核生物ゲノムをマッピングすることができる。適当な「道標」を有する１組のトランスジェニック系統を参照として用いて、直接ハイブリダイゼーションによりいずれかの新規遺伝子またはクローンをマッピングする。
【０１１６】
１０．インビボ部位指定組換え
半数体細胞では、人工的なＩ−ＳｐｏｍＩ部位での染色体内の単一の切断の結果、死に至る細胞分割停止の結果を招く（生存率わずか数％）。切断部位に相同的な無傷配列の存在は、結果的に修復され、１００％の細胞が生存する。２倍体細胞では、Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位での染色体内の単一の切断の結果、染色体相同性を用いる修復に至り、１００％の細胞が生存する。双方の場合、誘導された２本鎖切断の修復の結果、ドナーＤＮＡ分子からの非相同性配列の切断および挿入をフランキングする非相同性配列の欠損を有するヘテロ接合性の喪失に至る。FairheadおよびDujon、Mol.Gen.Genet.240: 170〜180(1993)。
【０１１７】
ＤＮＡフラグメントのプラスミドから染色体への部位特異的挿入のために、いくつかの試験計画を試みることができる。これにより骨の折れるスクリーニング工程を行わずに予め決定された部位に導入遺伝子を挿入することが可能になる。試験計画には：
−１− Ｉ−ＳｐｏｍＩ認識部位が染色体の独特な位置で挿入されているトランスジェニック細胞の構築。トランスジェニック細胞におけるＩ−ＳｐｏｍＩ酵素の発現、ならびに目的の遺伝子およびＩ−ＳｐｏｍＩ部位が挿入されている配列に相同なセグメントを含有する核酸分子の導入。
【０１１８】
活性酵素の直接導入（例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、タンパク質のスクレープローディング）および誘導または恒常性ウイルスまたはプラスミドベクター（例えばアデノウイルスまたはレトロウイルスベクター）からのタンパク質発現などの多くの技術によりＩ−ＳｐｏｍＩ酵素の発現を達成できる。
【０１１９】
−２− プラスミドに担持される目的の遺伝子に隣接してまたはその内部でのＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位の挿入。合成Ｉ−ＳｐｏｍＩ遺伝子を担持する発現ベクターおよびＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位を含有するプラスミドでの正常な細胞の同時形質転換。
【０１２０】
−３− 誘導または恒常性細胞プロモーターの調節下でＩ−ＳｐｏｍＩ遺伝子がゲノムに組み込まれている安定したトランスジェニック細胞株の構築。目的の遺伝子に隣接してまたはその内部でＩ−ＳｐｏｍＩ部位を含有するプラスミドによる細胞株の形質転換。
【０１２１】
部位指定相同組換え
１．部位特異的遺伝子挿入
方法により種々の遺伝子または特定の遺伝子の変異体が、Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位の以前の組み込みにより定義される予め決定された位置で挿入され得る細胞および細胞株を無制限に生成することが可能になる。したがって、かかる細胞および細胞株は、表現型、リガンド、薬物のためのスクリーニング手段に、および細胞株がレトロウイルス生成に関してトランスに補完する細胞株である場合には、非常に高レベルでの組換えレトロウイルスの再生産発現に有用である。
【０１２２】
（２つの相同性染色体の１つにのみ存在する）ヘテロ接合性であるＩ−ＳｐｏｍＩ部位で、前記の細胞株を最初に作製する。これをそのように増殖させることができ、および／またはこれを用いてトランスジェニック動物を作成することができる。かかる場合、通常の方法、例えば交配によりホモ接合性トランスジェニック（２つの相同性染色体において同等の位置でＩ−ＳｐｏｍＩ部位を有する）を構築することができる。ホモ接合性細胞株を、かかる動物から単離することができる。または、適当なＤＮＡ構築物での２次形質転換によりホモ接合性細胞株をヘテロ接合性細胞系から構築することができる。同一遺伝子または近隣遺伝子の近くの部位で、代償性へテロ接合性Ｉ−ＳｐｏｍＩ挿入を含有する細胞株は、本発明の一部であることも理解されよう。
【０１２３】
前記のマウス細胞またはヒトなどの他脊椎動物からの同等物を用いることができる。無脊椎動物からの細胞を用いることもできる。培養物中で維持され得るいずれかの植物細胞を、それが再生する能力があるかないか、またはそれが繁殖可能な植物を生み出しているかどうかとは関係なく使用することもできる。トランスジェニック動物で方法を用いることもできる。
【０１２４】
２．部位特異的遺伝子発現
類似の細胞株を用いて導入遺伝子、種々のプロモーター、レギュレーターおよび／または構造遺伝子を用いる生物学的またはバイオテクノロジー目的のタンパク質、代謝物または他の化合物を生成することもできる。遺伝子は、いつも染色体の同一の局在性で挿入される。トランスジェニック動物では、組織特異的な様式で複数の薬物、リガンドまたは医薬用タンパク質を試験することが可能になる。
【０１２５】
３．例えばＥＰ０４１９６２１Ｂ１に開示されるように、Ｉ−ＳｐｏｍＩ認識部位およびＩ−ＳｐｏｍＩ酵素を相同組換え技術と組み合わせて用いることもできる。例えば、ＣＦＴＲ座におけるＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位の挿入を、ゲノムＤＮＡのＣＦＴＲ遺伝子をフランキングする相同配列を用いて行うことができる。二重交差による自然遺伝子置換によりＩ−ＳｐｏｍＩ部位を挿入することができる（Le Mouellicら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 4712〜4716(1990)）。
【０１２６】
挿入された配列をヘテロ接合状態またはホモ接合状態で維持できることは理解されよう。ヘテロ接合状態で挿入された配列を有するトランスジェニック動物の場合、例えば組織特異的様式で、誘導プロモーターからのＩ−ＳｐｏｍＩ発現の誘導によりホモ接合を誘導することができる。
【０１２７】
標的細胞にＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位および染色体配列と相同性を共有する配列を含有するプラスミド構築物を導入することにより、自然相同組換えによるＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位のゲノムへの挿入を達成することができる。入力プラスミドを染色体標的で組換え的に構築する。この組換えにより少なくとも１つのＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位が染色体に部位指定挿入されることになる。標的化構築物は、環状または直線状のいずれかでよく、そして標的細胞に含まれるいずれかの配列と１、２またはそれ以上の部分の相同性を含有し得る。プラスミド構築物の標的（Ｏ型ベクター）への挿入によるか、またはＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位を含有する配列（＾Ｌ型ベクター）による染色体の置換より標的化メカニズムを生じることができる。ValanciusおよびSmithies、Mol.Cell Biol.11: 4389〜4397(1991)参照。
【０１２８】
染色体標的化された座は、エクソン、イントロン、プロモーター領域、座調節領域、擬似遺伝子、レトロエレメント、反復エレメント、非機能的ＤＮＡ、テロメアおよびミニサテライトでよい。１つの座または複数の座で標的化を生じることができ、結果的に１つまたはそれ以上のＩ−ＳｐｏｍＩ部位を細胞ゲノムに挿入することになる。
【０１２９】
ゲノムの正確な座にＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位を導入するための胚幹細胞の使用により、これらの細胞の初期胚（桑実期または胚盤胞段階）への再移植により、正確な座でＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位を含有する変異マウスの生成が可能になる。これらのマウスを用いてＩ−ＳｐｏｍＩ酵素の体細胞または生殖系列への発現においてゲノムを修飾することができる。
【０１３０】
４．生物医学的適用
本発明による配列、細胞、動物、染色体および方法で種々の適用を行うことができる。
【０１３１】
１つの適用は、遺伝子治療である。遺伝子治療の具体的な実例には、免疫変調（すなわちＩＬ遺伝子の範囲または発現を変化させること）；欠損遺伝子の置換；およびタンパク質の排泄（すなわちオルガネラにおける種々分泌性タンパク質の発現）などが挙げられる。
【０１３２】
本発明は、更にＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位がゲノム配列の座に、または遺伝子のエクソンに対応するｃＤＮＡの一部に導入されているトランスジェニック生物、例えば動物を具現化する。Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位が導入されているゲノム（動物、ヒト、昆虫、または植物等）のいずれかの遺伝子を、対応するエンドヌクレアーゼをコードする配列を含有するプラスミドにより標的化することができる。Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位の導入を相同組換えにより達成することができる。このように、いずれかの遺伝子を発現のために特定の座に標的化することができる。
【０１３３】
トランスジェニック生物をスクリーニング法に用いることができる。
Ｉ−ＳｐｏｍＩにより遺伝子活性化を調節することができる。例えばＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位を、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター（ｐＮＳＥ）（Forss-Petterら、Neuron 5: 187〜197(1990)）の調節下で、タンデム反復でｎｌｓＬａｃＺ遺伝子の一部（例えば６２ｂｐ）の重複を含有するトランスジェニックマウス系統に導入し、したがってオープン・リーディグ・フレームへの停止コドンの導入により遺伝子機能を損失させることができる。これらのマウスにおけるＩ−ＳｐｏｍＩ酵素の発現は、２つのタンデム反復間の組換えを再活性化することができ、すべての中枢神経系（ＣＮＳ）で遺伝子の再活性化に至る。全ＣＮＳの遺伝手術に至るジフテリア毒素のＤＴ−Ａフラグメントを用いて同一の実験を実現できる。組織特異的プロモーターによるかまたは遺伝子標的化により得られる天然の座におけるＩ−ＳｐｏｍＩ修飾ＤＴ−Ａの発現により遺伝手術を実施することができる。
【０１３４】
インビボでＩ−ＳｐｏｍＩ誘導組換えにより特定の遺伝子を活性化することが可能である。Ｉ−ＳｐｏｍＩ切断部位をタンデム反復における遺伝子の重複の間に導入し、機能を喪失させる。エンドヌクレアーゼＩ−ＳｐｏｍＩの発現により２つのコピー間で切断を誘導することができる。組換えによる回復が刺激され、そして機能的遺伝子に至る。
【０１３５】
染色体の特定の転座または欠失をＩ−ＳｐｏｍＩ切断により誘導できる。「古典的な遺伝子置換」により染色体の特定の位置で遺伝子を組み込むことにより座挿入を行うことができる。非致死的な転座によるか、または欠失続いて末端結合によりＩ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼによる認識配列の切断を修復することができる。座のフランキング領域における２つまたはそれ以上のＩ−ＳｐｏｍＩ部位の挿入により染色体のフラグメントの欠失を得ることもできる。組換えにより切断を修復でき、そして２つの部位の間の完全領域の欠失に至る。
【０１３６】
Ｉ−ＳｐｏｍＩは、タンパク質の進化的に保存されたファミリーの一部であるので、その切断特異性が複合生物、例えば菌類、動物または植物のゲノムの独特な部位として認識できるほどに十分に高い場合、Ｉ−ＳｐｏｍＩで開発されたすべての適用を他のエンドヌクレアーゼで行うこともできると解される。エンドヌクレアーゼをその天然の遺伝子から直接発現させることができる場合がある。またかかる酵素が天然にコードされる細胞区画における遺伝コードの可変性のために、人工遺伝子を構築する必要がある場合もある。構築物ならびにＩ−ＳｐｏｍＩおよびその部位で実施される全系列の操作を他のエンドヌクレアーゼで容易に変換することができる。同様に、適用においてＩ−ＳｐｏｍＩを他の酵素、例えばＩ−ＳｃｅＩと置き換えることができる。
【０１３７】
Ｉ−ＳｐｏｍＩを他の酵素、例えばＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＩ−ＤｍｏＩと組み合わせて用いることができる。例えば、米国特許第５，４７４，８９６号を参照されたい。例えば、１つまたはそれ以上のＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位および１つまたはそれ以上のグループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼ部位（例えばＩ−ＳｃｅＩ部位）を含有する組換え染色体または細胞を構築することができる。別の実施態様では、１つまたはそれ以上のＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位および１つまたはそれ以上のグループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼ部位（例えばＩ−ＳｃｅＩ部位）を含有するトランスジェニックマウスを構築することができる。部位は、同一または異なる染色体座でよい。
【０１３８】
Ｉ−ＳｐｏｍＩを他の酵素、例えばＩ−ＳｃｅＩと組み合わせて用いてインビボ組換えを促進することができる。例えばＩ−ＳｐｏｍＩおよびＩ−ＳｃｅＩを発現する１つの発現ベクター、または酵素を発現する２つの別個の発現ベクターを用いて、これらの酵素の双方の発現を細胞に導入することができる。これらの酵素の発現により、２本鎖切断をゲノムの異なる部分に同時に、または連続的に導入することが可能になる。この研究法を用いて、例えばひと続きのＤＮＡを欠失させるか、または複数の組換え事象を促進させることができる
【０１３９】
本明細書に引用したすべての参考文献のすべての開示は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１４０】
生物の寄託
ＯＲＦ Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドは、２００１年３月６日、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)、25、Rue du Docteur Roux75724、パリ、Cedex 15、フランスに受入番号Ｉ−２６４３のもとに寄託されている（参照同定：大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＳＰ００３）。
本発明は以下の実施例を参照することで更に完全に理解されよう。
【実施例１】
【０１４１】
Ｉ−ＳｐｏｍＩの発現のためのプラスミドの構築および活性アッセイ
大腸菌（E.coli）におけるＩ−ＳｐｏｍＩの発現のために、分裂酵母（S.pomb）Ｘ３９株ゲノムＤＮＡ（４７）から増幅した種々のＰＣＲフラグメントを、発現ベクターｐＥＴ１６ｂ（Novagen、マジソン）にクローン化した。発現されたタンパク質をＮ末端１０ｘＨｉｓタグと融合してさらなる精製を容易にした。３つの組換えプラスミドを構築した（図１）；（ｉ）プラスミドｐＳＰ００１は、ｃｏｘ１Ｅ１のイニシエーターＡＴＧコドンからｃｏｘ１Ｉ１ｂ（プライマーＳＰ００１ｍ：５′−ＧＣＡＣＧＣＡＴＧＴＣＡＴＡＴＧＧＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＧ−３′［配列番号：１］、プライマーＳＰ００２ｍ：５′−ＧＣＧＴＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＧＡＴＡＣＴＴＧＡＴＡＧＴＧＧＴＧＧ−３′［配列番号：２］）の配列内停止コドンまでのすべてのオープン・リーディグ・フレームに対応する５２０コドンのフラグメントを含有する。（ii）プラスミドｐＳＰ００３は、２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフ（プライマーＳＰ００２ｍと一緒に、プライマーＳＰ００３ ５′−ＧＡＧＡＧＣＧＣＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＡＣＡＴＣＣ−３′［配列番号：３］）を含むイントロン２次構造のループ８（図１Ａ）に位置する３０４コドンをカバーする最短のインサートを含有する。（iii）プライマーＳＰ００５をプライマーＳＰ００２と共に用いて第３のプラスミドｐＳＰ００５を構築し、ｃｏｘ１Ｉ１ｂ ＯＲＦ（プライマーＳＰ００２ｍと一緒に、プライマーＳＰ００５：５′−ＧＣＡＴＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＧＡＣＡＡＡＡＴＴＧ−３′［配列番号：４］）の全配列をカバーする３８６コドンの生成物を得た。各々のプラスミドを発現宿主大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen、マジソン）に形質転換した。
【０１４２】
プラスミドｐＰ３Ｅ５−２（４８）をＩ−ＳｐｏｍＩ切断部位を決定するための鋳型として、および活性試験のために提供した。このｐＵＣ１８の誘導体は、イントロン不含Ｐ３株（４９）のｃｏｘ１配列のクローン化ｍｔＤＮＡフラグメントを含有する。
【０１４３】
認識部位を特徴づけるために、オリゴヌクレオチドの合成によりイントロン不含遺伝子からのイントロン挿入部位をフランキングする領域の一連の変異体を作製した。各々の変異体は、イントロン挿入部位近くの−１３〜＋１２ヌクレオチド位置までの単一の塩基転換に相当する。アニーリングされた相補的オリゴヌクレオチドを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII部位を用いてｐＵＣ１９にクローン化した。別のＥｃｏＲＶ部位をオリゴヌクレオチド配列に組み込み、適切な組換え分子をスクリーニングした。各々のライゲーション実験の２つの別個のクローンを試験で用いて、２本鎖における切断反応を実施した。
【実施例２】
【０１４４】
エンドヌクレアーゼの発現および精製
Novagen，マジソンにより提供されるＴ７発現系を用いて組換えタンパク質を発現した。ｐＳＰ００３で形質転換した大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの前培養を、ＬＢ培地５０ml中アンピシリン（１００μg/ml）およびクロラムフェニコール（３４μg/ml）と共に３７℃で一晩増殖させ、次いで新鮮な予め加温した同一組成の培地３ｌ中１００倍希釈した。細胞を３７℃でＯＤ600が０．６〜０．８になるまで成長させた後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより発現を誘導した。誘導の後、細胞を更に３時間、ＯＤ600が２．３〜２．８になるまで増殖させ、収穫し、水で洗浄し、そして一定分量を−７０℃で保存した。精製用に、主培養物１ｌから細胞を収穫した。細胞を使用する直前にペレットを氷上で解凍し、そしてプロテアーゼインヒビター（ペファブロック １μg/ml、アプロチニン ２μg/ml、ロイペプチン ０．５μg/ml、ペプスタチン １μg/ml）を含む溶解バッファー ３０ml（ＨＥＰＥＳ ３０mM pH８、ＮａＣｌ ３００mM、イミダゾール ２０mM）に再懸濁した。後続の精製工程すべてを４℃で実施した。細胞破壊は、フレンチ・プレスを用いて実施し、そして続いて粗製ホモジネートをBeckman JA２５．５０ローター中４００００ｘｇで４５分間遠心した。即座に上澄をデカンテーションし、Ｎｉ2+で荷電したＨｉＴｒａｐキレーティング・アフィニティ・カラム（Amersham Pharmacia Biotech、リトルチャルフォント）１mlに負荷した。アフィニティカラムを用いる精製工程をAkta Purifier（Amersham Pharmacia Biotech、リトルチャルフォント）で実施した（図２）。溶出工程の後に酵素が存在する溶出バッファーを、Micro Bio-Spinサイズ排除カラム（BioRad、ヘルクレス）を用いてジエタノールアミン １００mM、pH９．０に変えた。最終容量の５０％までグリセロールを添加した後、タンパク質を−２０℃で保存し、そしてBio-Rad Bradford（BioRad、ヘルクレス）タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１４５】
精製を実証し、そして発現されたＩ−ＳｐｏｍＩのバンドを同定するために、手順の様々な段階でサンプルを採取し、そしてＳＤＳ−１２％ ポリアクリルアミドゲルに流した。その後、（５０）にしたがってセミドライトランスファーセル（BioRad、ヘルクレス）を用いて、それをニトロセルロース膜に移した。次いで膜を粉乳 ２％を含有するＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０mM（pH８．０）、ＮａＣｌ １５０mM、Tween20 ０．５％および脱脂粉乳２％）中３７℃で１時間膜をインキュベートした。その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたＨｉｓタグに対する抗体をＴＢＳＴ乳溶液中１：４５００で希釈し、そして膜を３７℃で１時間インキュベートした。次いでこれをＴＢＳＴで２回およびＰＢＳで１回洗浄した（５０）。ＥＣＬキット（Amersham Pharmacia Biotech、リトルチャルフォント）のマニュアルにしたがって、ＨＲＰ活性の検出を実施した。ＩＰＴＧでの誘導（粗製ホモジネート、溶解細胞、遠心後の上澄、ピークおよびピーク以外の流動画分）の前または後に異なるサンプルを採取した。最初の１５画分の各々のサンプルをＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、そしてCoomassieブリリアントブルーＲ２５０で染色して、他の存在するタンパク質に相対して最高の比率で発現した酵素を含む画分を同定した。
【０１４６】
交雑におけるイントロンｃｏｘ１Ｉ１ｂのホーミングを示す以前の実験から（４７、４８）、イントロンｃｏｘ１Ｉ１ｂの生成物は、エンドヌクレアーゼ活性を有していると推定された。エクソン部分を含むリーディグ・フレーム全体が機能的タンパク質に必須であるかどうかは不明であったので、イントロンおよびエクソン配列を含むＯＲＦ全体、または単純にイントロン全体およびＲＮＡ２次構造のループ８に相当する領域を発現させた（図１）。ミトコンドリアイントロンのリーディグ・フレームがユニバーサルでないコードを用いて翻訳されるたいていのその他の場合と対照的に、このイントロンＯＲＦは、ＵＧＡコドンを全く含まない（４５）。したがって遺伝子の配列におけるいずれかのヌクレオチドを変化させる必要はなかった。
【０１４７】
時間経過実験で大腸菌（E.coli）において発現を検定し、そして最も小さなＯＲＧの遺伝子産物の最高の発現が誘導後３時間であることが見出された（データは示していない）。したがって、ｐＳＰ００３と称される発現プラスミドで進めることに決定した。細胞溶解後の可溶性画分は、エンドヌクレアーゼ活性を含有する（後記で示すように）。この画分で、Ｈｉｓタグ抗体を用いるウェスタンブロット実験においても検出可能な２つの主要なバンドを見出した。より強いバンドの大きさは融合遺伝子産物の推定される分子量（３８．７kDa）に従い、可能な分解産物としておよそ３０kDaの大きさの弱いバンドを伴う（図２Ｂ、Ｃ）。Ｎｉカラムでの単一の精製工程からの典型的な溶出プロファイルを図２Ａに示す。タンパク質ピークは、いつも強い核酸シグナルと同時溶出される。Bradfordアッセイは、全タンパク質濃度０．３μg/μlを示した。全体の約３分の１に相当する３８．７kDaの主要なタンパク質バンドで、Ｉ−ＳｐｏｍＩの濃度がおよそ０．１μg/μlであると見積もられた。調製物をジエタノールアミン １００mM（pH９．０）／５０％ グリセロール中−２０℃で保存し、そしてこれらの条件が数ヶ月間安定してエンドヌクレアーゼ活性を保持することが示された。
【実施例３】
【０１４８】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ切断部位の決定
エクソンｃｏｘ１Ｅ１およびｃｏｘ１Ｅ２の配列の接合部での推定されるホーミング部位を含む短いＰＣＲ産物でＩ−ＳｐｏｍＩでの切断パターンの決定を実施した。センス鎖ＳＰ００９のプライマー（５′−ＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＣＡＣＡＴＴＣ−３′［配列番号：５］）は、イントロン挿入部位に相対して−１００の位置でアニーリングした。相補鎖のプライマーＳＰ００８（５′−ＡＴＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＧＣＡＴＴＴＧＡＴＡＴ−３′［配列番号：６］）およびＳＰ０１０（５′−ＡＡＴＴＴＡＣＴＧＡＴＣＣＴＡＡＴＧＴＴＧＡＴ−３′［配列番号：７］）は、各々下流の＋１７３ヌクレオチド、＋１２９ヌクレオチドにハイブリダイズした（図３Ａ）。ＰｓｔＩで直線化したプラスミドｐＰ３Ｅ５−２（４８）は切断部位を決定するためのＤＮＡ材料を調製するためにＰＣＲの鋳型として提供された。材料をシュリンプアルカリ性ホスファターゼおよびエクソヌクレアーゼＩと反応させ、過剰のヌクレオチドおよびプライマーを除去し、次いで変性させた。このように調製したＰＣＲ産物を鋳型として用いてサイクルシークエンシング（Thermo Sequenaseサイクルシークエンシングキット、ＵＳＢ、マイルスロード）および５′−末端標識プライマーＳＰ００９またはＳＰ００８／ＳＰ０１０を用いてＤＮＡシークエンシングラダーを作製した。また鋳型として５′−末端標識プライマーを用いて、プラスミドｐＰ３Ｅ５−２（４８）のＰＣＲ増幅によりＩ−ＳｐｏｍＩのための単一の末端標識基質を生成した。切断の前にAmicon Microcon ＰＣＲ遠心フィルター装置（Millipore、ベッドフォード）によりマニュアルにしたがって、ＤＮＡフラグメントを組み込まれていないデオキシヌクレオチドおよび放射性オリゴヌクレオチドから精製し、続いてフェノール抽出および沈殿を行った。最後にＰＣＲ産物を水１５μlに再懸濁した。Ｉ−ＳｐｏｍＩでの消化を全反応容量 ２５μl（エンドヌクレアーゼ調製物 ６μl、ジエタノールアミン １００mM（pH９．０）、ＭｇＣｌ2 ２．５mM、溶解したＰＣＲ産物１μl）中３７℃で１０分間実施した。１０ｘ停止溶液（（５１）にしたがって、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ０．１Ｍ（pH７．５）、ＥＤＴＡ ０．２５Ｍ、ＳＤＳ ５％、プロテイナーゼＫ ０．５mg/ml）０．１容量添加することにより反応を停止させ、そして５０℃に１５分間、そして９５℃に上げて３分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化した。フェノール抽出によりプロテイナーゼＫを除去し、そしてサンプルを沈殿させた。未消化サンプルを対照としてＩ−ＳｐｏｍＩの不在下で処理した。エンドヌクレアーゼ消化の後、ＰＣＲ産物をＤＮＡシークエンシング反応と平行して実行した。Sequenazeキットと共に供給された停止溶液を添加した後７５℃で２分間、すべてのサンプルを変性させ、そして６％ ポリアクリルアミド／５０％ 尿素ゲル上で分離した。続いてゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーフィルムまたはPhosphor Imagerスクリーン（Molecular Dynamics、サニーベール）にそれぞれ−７０℃でまたは２５℃で一晩焼き付けした。結果の評価をImage Quant 5.0ソフトウェアで実施した。
【０１４９】
材料および方法で記載されている分裂酵母（S.pombe）Ｐ３株（４４）のｃｏｘ１遺伝子の連続配列内のイントロン挿入部位をフランキングする領域に相当する５′末端標識ＰＣＲ産物を用いてＩ−ＳｐｏｍＩの切断パターンを決定した。ＤＮＡをＩ−ＳｐｏｍＩで消化し、そしてシークエンシングゲル上で分離した（図３）。各々のＤＮＡ鎖は、Ｉ−ＳｐｏｍＩでの消化の後、強いシグナルを示し、これは切断されていないＤＮＡでは存在しない。同一ＤＮＡフラグメントのシークエンシングラダーと比較して、切断位置は、正確に局在した。これにより、切断は、センス鎖のイントロン挿入部位の２ｂｐ下流で生じ、下方の鎖の２ｂｐが４ヌクレオチドの３′オーバーハングを作製する。この切断パターンは、他のホーミングエンドヌクレアーゼから周知である。Ｉ−Ｃｒｅｌ（１７）、Ｉ−ＳｃｅＩ（１６）およびII（３７）、Ｉ−ＣｅｕＩ（３０）およびＩ−ＤｍｏＩ（２０）のようなドデカペプチドファミリーのメンバーに関して、ならびにＨｉｓ−Ｃｙｓ Ｂｏｘ／ββα−Ｍｅタンパク質Ｉ−ＰｐｏＩ（５３）に関して報告されている。
【実施例４】
【０１５０】
活性試験
プライマーＳＰ００９および前のパラグラフで記載した放射性標識プライマーＳＰ００８を用いるＰＣＲにより、Ｉ−ＳｐｏｍＩの基質が得られた。エンドヌクレアーゼ切断のための標準的な条件は全容量２５μl中ジエタノールアミン １００mM（pH９．０）、ＭｇＣｌ2 ０．５mM、ＮａＣｌ １００mM、水 １５μl中精製されたＰＣＲ産物１μlおよび最終的に調製されたエンドヌクレアーゼ５μlであった。反応物を３７℃で２０分間インキュベートした。ＭｇＣｌ2濃度は、１mM〜４０mMまで変化し、ＮａＣｌは、０mM〜２００mMまで変化した。温度の影響を２５℃〜６５℃の間でモニター観察した。試験したpH値は、pH６．０（ＭＥＳ ３０mM）、pH７．０、pH８．０（ＨＥＰＥＳ １００mM）およびpH９．０〜１０．０（ジエタノールアミン １００mM）の範囲であった。前記したように反応を停止させた。これを５％ ポリアクリルアミド／５０％ 尿素ゲル上で分離した。これを流した後、ゲルを１０％ 酢酸／２０％ エタノールの溶液に浸し、ワットマン 3MMペーパー（ワットマン、メイドストン）上に載せ、そして乾燥させた。Phosphor Imager スクリーン（Molecular Dynamics、サニーベール）に乾燥したゲルを２５℃で２．５時間焼き付けし、結果を前記したソフトウェアで定量化した。
【０１５１】
他のホーミングエンドヌクレアーゼの活性に影響する公知のパラメーターは、溶液の１価（Ｎａ+およびＫ+）および２価カチオン（Ｍｇ2+およびＭｎ2+）の濃度、温度およびプロトン濃度である。Ｉ−ＳｐｏｍＩの活性のための最適条件を決定するために、Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性アッセイのための基質として、イントロン挿入部位（図３Ａ）に相対して−１００ｂｐ（ＳＰ００９）〜＋１７３ｂｐ（ＳＰ００８）位置にわたるＰＣＲ産物を使用する。アッセイに関しては、プライマーの１つを［γ−32Ｐ］−ＡＴＰで５′末端標識した。ＳｐｏｍＩによる切断により１７３ｂｐの長さのより小型の検出可能なバンドが作製されるはずである。その他のすべての公知のホーミングエンドヌクレアーゼに関して以前から報告されているように、Ｉ−ＳｐｏｍＩの切断能力にＭｇ2+が必須であることが見出された。Ｍｇ2+の不在下では、活性は検出されない（示していない）。最適Ｍｇ2+濃度は５mM〜７．５mMの範囲である（図４Ａ）。より低いまたは高い濃度は、酵素活性には不利である。Ｉ−ＳｐｏｍＩには、Ｎａ+が必要であるが、許容される濃度範囲は広くなる（図４Ｂ）。２５℃〜６５℃の異なる温度での基質の切断は、４２℃で明らかに最適であった（図４Ｃ）。３０℃およびそれより低い温度では、ほとんど活性が見出されなかった。Ｉ−ＳｐｏｍＩは、６５℃まで活性である。プロトン濃度の影響は、明らかにＩ−ＳｐｏｍＩのアルカリ性pH条件への嗜好性を示した（図４Ｄ）。６．０〜８．０の間のpH値では、切断されたＤＮＡの量は、約３０％の低レベルに留まったが、pH９．０およびそれより高い値では、切断は、８５％まで上昇した。
【０１５２】
Ｉ−ＳｃａＩ（４３）に関しては、最適切断条件は以下のように報告されている：Ｍｇ2+ ８mM、Ｎａ+ 約５０mM、２８℃〜４０℃の間の温度、８．５〜９．０の間のpH。高温およびアルカリ性pH値の嗜好性は、Ｉ−ＳｃｅＩ（２９）およびIII（５４）に非常に類似しており、双方共に細菌内で発現される。対照的に酵母ミトコンドリアから抽出されるＩ−ＳｃｅII（１９）は、中性pHおよびおよそ３０℃の温度を好む。
【実施例５】
【０１５３】
認識配列の決定
前記したように、イントロンｃｏｘ１Ｉ１ｂの挿入部位近くの−１３〜＋１２位置までのヌクレオチド配列を含有するプラスミドを使用した（図５Ａ参照）。混合物を９５℃で３分間変性し、そして４℃までゆっくりと冷却した後、相補的オリゴヌクレオチドをＮＥＢｕｆｆｅｒ２（New England Biolabs、ベバリー）中でアニーリングした。これをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII消化ｐＵＣ１９にクローン化した。組換えプラスミドを大腸菌（E.coli）ＤＨ１０Ｂ株内でエレクトロポレーションにより形質転換し、そしてその後、アルカリ性プラスミド調製物のＥｃｏＲＶ／ＸｍｎＩ消化により検査した（５０）。ＱＩＡフィルターチップ１００プロトコル（QLAGEN、ヒルデン）にしたがってＬＢＡ４０mlの培養物から組換えプラスミドのＤＮＡを調製した。調製したプラスミドの濃度を０．３μg/μlに調整した。プラスミドをＩ−ＳｐｏｍＩに暴露する前に、ＮｄｅＩおよびＡｌｗＮＩで３７℃で３時間消化し、続いて６５℃で２０分間処理し、沈殿させ、そして最終濃度０．１μg/mlになるまで水に溶解した。Ｉ−ＳｐｏｍＩ消化を容量５０μl（ＤＮＡ ２５０ｎｇ、ジエタノールアミン １００mM（pH９．６）、ＭｇＣｌ2 ５mM、ＮａＣｌ １００mM、Ｉ−ＳｐｏｍＩ ５μl）で実施した。停止溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ０．１Ｍ（pH７．５）、ＥＤＴＡ ０．２５Ｍ、ＳＤＳ ５％）０．１容量を添加し、そして６５℃で３分間インキュベートして消化を停止させ、続いてフェノール抽出および沈殿を行った。消化産物を水１０μlに再懸濁し、そしてアガロースゲル ０．８％上で分離した。泳動後、ゲルを臭化エチジウム ０．５μg/μlで染色し、そしてＤＮＡを真空ブロットによりＨｙｂｏｎｄ−Ｎ+ナイロン膜（Amersham Pharmcia Biotech、リトルチャルフォント）に移した。移した後、膜をハイブリダイゼーションバッファー（リン酸バッファー ０．２５Ｍ、ＳＤＳ ７％、ＥＤＴＡ １mM、ＢＳＡ １％）中６５℃で１．５時間プレハイブリダイズし、次いでプローブとしてランダム標識ｐＵＣ１９を用いて一晩ハイブリダイズした（５２）。シンチレーションカウンターで最終プローブ調製物１μlアリコート中の標識の組み込みを決定した。ハイブリダイゼーションの後、プローブを含有するバッファーを除去し、膜をハイブリダイゼーションバッファーで６５℃で洗浄し、そしてPhosphor Imager スクリーン（Molecular Dynamics、サニーベール）に２５℃で２．５時間焼き付けし、そして結果を前記したように記述した。
【０１５４】
Ｉ−ＳｐｏｍＩの認識部位の範囲を決定するために、イントロン挿入部位をフランキングする−１３〜＋１２の領域に一度に１つの塩基転換を導入することにより変異された配列を合成した。材料および方法に記載するように変異アレルを合成することによりこれを行った。プラスミドのＮｄｅｌおよびＡ１ｗＮＩでの消化の結果、それぞれ１６５２ｂｐおよび１０４１ｂｐの２つのバンドになり、最も小型のものは、Ｉ−ＳｐｏｍＩ切断部位を含有する。Ｉ−ＳｐｏｍＩによるこのフラグメントの消化により８０１ｂｐおよび２４０ｂｐの２つのバンドを生じ、これを図５Ａに示す。異なる変異体の切断実験の結果を図５Ａの囲み「切断」および「％」にまとめる。−１１、−１０、−８〜−４、＋２〜＋６、＋８および＋９は、Ｉ−ＳｐｏｍＩによる基質認識に必須である。−４および＋２位置でのヌクレオチドの塩基転換は、ほぼ完全に切断を無効にする。中央の位置−３〜＋１まで、および−９および＋７の位置の配列の縁でのいくつかのヌクレオチドにおける変化は、認識事象に影響しない。このように部位の範囲は、全部で２０ｂｐである。これらの２０ｂｐ内では、１４個のみがＩ−ＳｐｏｍＩ特異性に必須である。
【０１５５】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制限エンドヌクレアーゼＩ−ＳｐｏｍＩおよびＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位に対応するヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明は、またヌクレオチド配列を含有するベクター、ベクターで形質転換された細胞、ベクターに基づくトランスジェニック動物、および生物の細胞に由来する細胞株にも関する。本発明は、また真核生物ゲノムのマッピングおよびインビボ部位指定遺伝子組換えに関するＩ−ＳｐｏｍＩの使用にも関する。
【０００２】
発明の背景
遺伝子を生物、例えば哺乳動物の生殖細胞系列に導入できることは、生物学において非常に興味深い。外来的に加えられたＤＮＡを取り込み、そしてＤＮＡに含まれた遺伝子を発現する哺乳動物細胞の性向は、何年も前から解っている。遺伝子操作の結果は、これらの動物の子孫に遺伝される。これらの子孫のすべての細胞は、その遺伝的構成の一部として導入遺伝子を受け継ぐ。かかる動物が、トランスジェニックであると称される。
【０００３】
トランスジェニック哺乳動物は、胚形成期および分化における遺伝子制御の研究、遺伝子作用の研究、および免疫系における細胞の複雑な相互作用の研究に関する手段を提供してきた。まるごとの動物は複雑な生物学的過程を志向する、操作された遺伝子に関する究極のアッセイ系である。
【０００４】
トランスジェニック動物は、種々の遺伝子の組織特異的な、または発達上の制御に寄与するＤＮＡ配列を機能的に分析するための一般的なアッセイを提供できる。加えて、トランスジェニック動物は、組換えタンパク質を発現するための、およびヒトの遺伝的障害の正確な動物モデルを作製するための有用な手段を提供する。
【０００５】
遺伝子クローニングならびに動物および動物細胞における発現の一般的な議論に関しては、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)、およびGreenら、Genome Analysis: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1977)を参照されたい。
【０００６】
特定の疾患および遺伝的障害に対する素因を有するトランスジェニック系は、これらの状態に導く事象の研究において非常に価値がある。遺伝的障害の処置の有効性は、障害の１次的原因である遺伝子欠損の同定に依存し得るということは周知である。疾患または障害を導く動物モデルを提供することにより有効な処置の発見を促すことができ、これにより、例えば遺伝子組換え処置プロトコルの効率、安全性および作用様式の研究が可能になる。
【０００７】
染色体と外来性ＤＮＡとの間の相同組換え（ＨＲ）は、ゲノムへの遺伝的変化を導入するための方法の基礎である（Capecchi、Science 244: 1288〜1292(1989)、Smithieら、Nature 317: 230〜234(1985))。組換えメカニズムのパラメーターは、細胞(Bernsteinら、Mol.Cell.Biol.12: 360〜367(1992); Brennerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83: 1762〜1766(1986); Linら、Mol.Cell.Biol.10: 113〜119(1990); Linら、Mol.Cell.Biol.10: 103〜112(1990))およびインビトロ系（JessbergerおよびBerg、Mol.Cell.Biol.11: 445〜457(1991)）に導入されたプラスミド配列を研究することにより決定されている。ＨＲは、ＤＮＡにおける二本鎖切断により促進される。
【０００８】
エンドヌクレアーゼの中でパン酵母（Saccharomyces cerevisiae）ミトコンドリアエンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩ（JacquierおよびDujon、Cell 41: 383〜394(1985)）は、特徴的であり、特定の染色体標的を切断するための、したがって生きた生物における染色体を操作するための手段として開発され得る（米国特許第５，４７４，８９６号）。Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質は、予め決定された配列が予め決定された部位に挿入されるようになる非相互的メカニズムである、酵母のミトコンドリアにおけるイントロンホーミングに寄与するエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩは、2本鎖切断を開始することにより、酵母の核における組換えを触媒できるということが証明されている（Plessisら、Genetics 130: 451〜460(1992)）。エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの認識部位は、１８ｂｐの長さであり、したがってＩ−ＳｃｅＩタンパク質は、非常に稀な、ゲノムにおける切断制限エンドヌクレアーゼである（Thierryら、Nucleic Acids Res.19: 189〜190(1991)）。加えて、Ｉ−ＳｃｅＩタンパク質は、リコンビナーゼではないので、その染色体操作の可能性は、宿主およびドナー分子の双方に関する標的部位要件を有する系の可能性よりも大きい（Kilbyら、Reviews 9: 413〜421(1993)）。
【０００９】
酵母Ｉ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼは、哺乳動物細胞における染色体標的で２本鎖切断を効率的に誘起でき、そして部位特異的組換え、遺伝子置換または挿入に至る切断をフランキングする領域と相同性を共有するドナー分子を用いて切断を修復できる（米国特許第５，４７４，８９６号）。酵素は、高い効率で組換えを触媒する。これは、２本鎖切断修復経路により染色体ＤＮＡと外来性ＤＮＡ間の組換えが哺乳動物細胞において生じ得ることを明示している（Szostakら、Cell 33: 25〜35(1983)）。
【００１０】
Ｉ−ＳｃｅＩは、多くの異なる適用に用いられている。かかる適用は、２本鎖切断の研究、染色体構造の調査、哺乳動物および細菌細胞における遺伝子置換を含む遺伝子転移の研究、ショウジョウバエにおける相同組換えによる遺伝子標的化（gene targeting）、ならびに植物における染色体切断の生成に関連している。AnglanaおよびBacchetti、Nucl.Acids.Res.27: 4276〜4281(1999); Bellaicheら、Genetics 152: 1037〜1044(1999); Choulikaら、CR Acad.Sci.III317: 1013〜1019(1994); Choulikaら、Mol.Cell.Biol.15: 1968〜1973(1994); Cohen-Tannoudjiら、Mol.Cell.Biol.18: 1444〜1448(1998); Liangら、およびGarrard、Methods 17: 95〜103(1999); Machidaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94: 8675〜8680(1997); Melkerson-Watsonら、Infect.Immun.69: 5933〜5942(2000); Mogilaら、Methods Mol.Biol.113: 439〜445(1999); Monteilhetら、Nucl.Acids.Res.18: 1407〜1413; NahonおよびRaveh、Adv.Exp.Med.Biol.451: 411〜414(1998); Neuvegliseら、Gene 213: 37〜46(1998); Nicolasら、Virology 266: 211〜224(2000); Perrinら、Embo J.12: 2939〜2947(1993); Posfaiら、Nucl.Acids.Res.27: 4409〜4415; Puchta、Methods Mol.Biol.113: 447〜451(1999); Rongら、Science 288: 2013〜2018; Thierryら、Nucl.Acids.Res.19: 189〜190; ならびにA.Plessisら、Genetics 130: 451〜460(1992)。
【００１１】
グループＩイントロンは、その効率のよい増殖メカニズムのために多くの進化的門に広範に及んでいる。そのいくつかは、イントロンを含まない同族ＤＮＡ配列においてイントロン挿入部位を認識し、そしてその部位近くのＤＮＡにおいて２本鎖切断を導入するホーミングエンドヌクレアーゼをコードする。その後、遺伝子変換過程でイントロン含有遺伝子は、切断されたレシピエントアレルの修復のための鋳型として作用し、介在配列の複製を導く（１−４）。グループＩイントロンホーミングと対照的に、グループIIイントロン可動性は、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）粒子を形成する、イントロンラリアット（intron lariat）に結合するイントロンコード化タンパク質により促進されるレトロホーミングメカニズムに基づく。ＲＮＰ粒子は、イントロンＲＮＡの逆スプライシングおよび逆転写によるＤＮＡ標的部位へのイントロンの組み込みを導く（５）。これに加えて、タンパク質成分は、エンドヌクレオチド結合分解活性を有し、アンチセンス鎖を切断する。ＲＮＡは、ＤＮＡ上に配置された後、アンチセンス鎖が、タンパク質部分により切断される前にセンス鎖に組み込まれる（６）。したがって、イントロンＲＮＡおよびＲＮＰ粒子のタンパク質成分の双方が、イントロン標的部位の認識に関与する。後者のエレメントは、またＤＮＡ巻き戻しに必須である（７）。グループＩのみならずグループIIイントロンもホーミングを行う。翻訳後除去されるポリペプチドであるインテインをコードするいくつかのＤＮＡ配列は、グループＩイントロンで記載されたのと同一の様式で増殖する。インテインは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーまたはＨ−Ｎ−Ｈファミリーのエンドヌクレアーゼを含有する（３、８−１２）。これらの酵素は、タンパク質スプライシング活性を担持する既存のインテインへのエンドヌクレアーゼ遺伝子の侵入により進化してきた可能性がある（１３）。インテインエンドヌクレアーゼＰＩ−ＳｃｅＩおよびＰＩ−ＰｆｕＩの結晶に関する構造研究により、グループＩイントロンエンドヌクレアーゼとは対照的に、これは別のＤＮＡ結合ドメインを用いてその特異性を増強していることが強く示されている。Ｉ−ＳｃｅＩでは、ＤＮＡ認識領域（ＤＲＲ）は、特異的基質が切断部位からおよそ２個のらせん回転離れて接触することを確立させるが（１４）、ＰＩ−ＰｆｕＩでは、スターラップドメイン（stirrup domain）が、同一の目的を満たしている（１５）。
【００１２】
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼは、イントロン挿入部位の近くで４ｂｐの３′−ＯＨのオーバーハングを作る（１６−１８）。最適な活性の条件は、酵素に基づく。例えばミトコンドリアの外で調製されたＩ−ＳｃｅII（１９）は、およそ３０℃の温度および中性のpHを好むが、一方、Ｉ−ＤｏｍＩ（１８、２０）は、およそ７０℃の温度およびアルカリ性のpH値を好む。細菌性II型制限酵素と異なって、同族の修飾系が存在しないので、ホーミングエンドヌクレアーゼは、宿主ゲノムに及ぼす有害な影響を排除するために非常に高度な認識配列特異性を有していなければならない。したがって、その認識部位は、更に長い（１４〜３０ｂｐ、ある種のインテインコード化エンドヌクレアーゼに関しては４０ｂｐまで）。結晶化酵素、Ｉ−ＣｒｅＩ（２１）、ＰＩ−ＳｃｅＩ（２２）、Ｉ−ＤｍｏＩ（２３）およびＨｉｓ−ＣｙｓボックスホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＰｐｏＩ（２４）に関して示されているように、イントロンコード化ホーミングエンドヌクレアーゼは、βシートに依存してＤＮＡの主溝と接触する。それゆえにそのプロファイルは、非常に単調で、そしてＤＮＡ（２３、２５）の広い面積を覆うが、一方、球状の制限エンドヌクレアーゼ（２６）は、通常、標的配列（４）とそのα−ヘリックスからの側鎖を介して相互作用する。公知のホーミングエンドヌクレアーゼは、コンセンサスモチーフの出現に依存して４つのファミリーに分類された（ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−ＨおよびＨｉｓ−Ｃｙｓボックス）。後者の２つの群は、今では構造に基づいて単一の群、ββα−Ｍｅ群に分類されている（２７）。これとは対照的に細菌性II型制限酵素のメンバーは、更に多岐にわたる。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質ファミリーに属するエンドヌクレアーゼは、最も一般的な代表である。このクラスの主な特徴は、タンパク質において１または２回出現するドデカペプチドモチーフである。
【００１３】
１つのモチーフを有するエンドヌクレアーゼは、ホモ２量体としてその基質と結合し、一方、２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有する酵素は、単量体として作用する傾向がある。例外は、パン酵母（S. cerevisiae）のｃｏｘ１遺伝子のイントロンａＩ４αによりコードされるＩ−ＳｃｅII、および同一生物のイントロンｃｏｘ１Ｉ５αからのＩ−ＳｃｅIVである。Ｉ−ＳｃｅIIは、２つのドデカペプチドモチーフを有するが、ホモ２量体として活性である（１９）。Ｉ−ＳｃｅIVは、ヘテロ２量体として作用する（２８）。Ｉ−ＳｃｅＩ（２９）またはＩ−ＤｍｏＩ（１８）のような２ドメインの酵素は、遺伝子複製事象によりＩ−ＣｒｅＩ（１７）およびＩ−ＣｅｕＩ（３０）のような１ドメインのホーミングエンドヌクレアーゼから生じると推測された。（３、４、２１、２３、３１）。
【００１４】
２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するいくつかのタンパク質は、そのイントロンＲＮＡのスプライシングに関与している。それらは、マチュラーゼと称される（３２、３３）。マチュラーゼは、コファクターとして作用し、そしてスプライシング事象のためのイントロンＲＮＡ構造の触媒性コアを安定化する（３４、３５）。いくつかのドデカペプチドエンドヌクレアーゼもまた潜在性のマチュラーゼ活性を有し、これは、いくつかのアミノ酸の変異により顕示され得る（３６〜３８）。そのうちのわずかなものだけが、Ｉ−ＡｎｉＩ（３９、４０）およびＩ−ＳｃａＩ（４１〜４３）に関して報告されたように、双方の活性を同時に顕示する。
【００１５】
分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のミトコンドリアｃｏｘ１遺伝子では、４つまでのグループＩイントロンが見出された（４４）。そのうちの２つは、ドデカペプチドファミリーのタンパク質をコードするオープン・リーディグ・フレームを含有する（４５、４６）。
【００１６】
要約すると、ヒト疾患および遺伝的障害のトランスジェニック動物モデルを提供するための試薬および方法に関する技術的な必要性が存在する。試薬は、特に高度な特異性を有する制限酵素、その対応する制限部位およびこの酵素をコードする遺伝子に基づくことができる。とりわけ天然遺伝子またはそのフラグメントを、疾患を緩解できる、または細胞もしくは動物を修飾することにより、かかる疾患の研究のための分子手段を提供できる別の遺伝子または遺伝子フラグメントと置換するための試薬および方法に関する必要性が存在する。
【００１７】
発明の概要
したがって本発明は、技術的にこれらの必要性を満たすことを補助する。とりわけ本発明は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする単離されたＤＮＡに関する。
【００１８】
本発明の１つの実施態様では、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列に機能的に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ配列が提供される。
【００１９】
本発明は、更に酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列および本明細書にて記載される別のＤＮＡ配列に相補的な単離されたＲＮＡに関する。
【００２０】
本発明の別の実施態様では、ベクターが提供される。ベクターは、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列を含有するプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、またはウイルス、特にレトロウイルスベクターでよい。
【００２１】
本発明の別の実施態様では、ベクターは、Ｉ−ＳｐｏｍＩ制限部位をコードする本発明のＤＮＡ配列を含有するプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、またはウイルス、特にレトロウイルスベクターでよい。
【００２２】
本発明は、またＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位を含有する組換え染色体および細胞を作製するための方法にも関する。１つの実施態様では、Ｉ−ＳｐｏｍＩ制限部位は、組換えにより導入される。
【００２３】
本発明は、更にＩ−ＳｐｏｍＩ酵素を発現する組換え染色体および細胞を作製するための方法に関する。１つの実施態様では、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする配列は、組換えにより導入される。
【００２４】
本発明は、更にＩ−ＳｐｏｍＩ部位または酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードするＤＮＡ配列を含む組換え染色体にも関する。組換え染色体は、原核または真核生物に由来してよい。１つの実施態様では、本発明は、組換え哺乳動物、酵母、菌類、細菌、植物、線虫または昆虫染色体に関する。好ましい態様では、本発明は、組換えショウジョウバエ、線虫（C.elegans）、植物またはマウス染色体に関する。
【００２５】
加えて、本発明は、本発明のベクターで形質転換された原核細胞、例えば大腸菌（E.coli）または真核細胞に関する。１つの実施態様では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された哺乳動物、酵母、菌類、細菌、植物、線虫または昆虫細胞に関する。好ましい実施態様では、本発明は、本発明のベクターで形質転換された組換えショウジョウバエ、線虫（C.elegans）、植物またはマウス細胞に関する。別の実施態様では、細胞は、幹細胞、好ましくは哺乳動物幹細胞および最も好ましくはマウス幹細胞である。本発明は、更にこれらの細胞に由来する細胞株に関する。
【００２６】
また、本発明は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードするＤＮＡ配列を含有するトランスジェニック生物、およびトランスジェニック生物の細胞から培養された細胞株にも関する。
【００２７】
加えて、本発明は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩに関する少なくとも１つの制限部位が生物の染色体に挿入されているトランスジェニック生物に関する。
【００２８】
更に、本発明は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩを用いる真核生物ゲノムを遺伝子マッピングする方法に関する。
【００２９】
本発明は、また酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩを用いる生物におけるインビボ部位指定組換えの方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】図１は、プラスミドインサートを表す。分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のｃｏｘ１ＩｂイントロンのＲＮＡ２次構造である。２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフ（Ｐ１およびＰ２）から成るエンドヌクレアーゼのコアをコードするヌクレオチドは、ループ８（Ｌ８）に位置する。Ｉ−ＳｐｏｍＩの生化学的特性に関して、Ｌ８の全コドンを含むＰＣＲフラグメントを発現ベクターｐＥＴ１６ｂにクローニングした。＊は、プライマーＳＰ００３における人工開始コドンを示す。ループの終末のボックスは、停止コドン示している。
【図１Ｂ】図１は、プラスミドインサートを表す。Ｉ−ＳｐｏｍＩリーディグ・フレームのクローン化されたフラグメントである。最上の図式は、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）の第１エクソン（ｃｏｘ１Ｅ１）の全配列およびｃｏｘ１遺伝子におけるイントロンを表す。灰色：元来の出発コドンＡＴＧを有するエクソンｃｏｘ１Ｅ１。暗灰色：全ＯＲＦ１５６０ヌクレオチドのうちの９１２ヌクレオチドはＲＮＡレベルでＬ８を構築する領域に位置する。黒色：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのコード化配列。淡灰色：ループの配列に関しては、１から７は領域ａに位置する。白色：ＴＡＡ停止コドンに対して下流の配列非コード化領域はループ９に位置する。 エクソンで出発し、イントロンｃｏｘ１Ｉ１ｂの停止コドンに及ぶ全リーディグ・フレーム１５６０ヌクレオチドにわたるＰＣＲフラグメントをｐＥＴ１６ｂにクローニングし、プラスミドｐＳＰ００１を得た。プラスミドｐＳＰ００５は、ＯＲＦの全５′−エクソン部分を欠如するが、一方、ｐＳＰ００３は、配列のループ８部分に限定されるフラグメントを含有した。クローニングに用いられた制限酵素を示す。 図２は、Ｉ−ＳｐｏｍＩの発現および精製を示す。
【図２Ａ】精製クロマグラムである。Ｈｉｓタグ化Ｉ−ＳｐｏｍＩを、参考書にて説明されるように大腸菌（E.coli）に発現させた。大腸菌細胞破壊に続いて、上澄をＮｉ2+で荷電したＨｉＴｒａｐ キレーティング・アフィニティ・カラム １ml（アメルシャム・ファルマシア・バイオテックAmercham Pharmacia Biotech、Little、リトルチャルフォント）に負荷し、溶解バッファー（ＨＥＰＥＳ ３０mM、pH８、ＮａＣｌ ３００mM、イミダゾール ２０mM）で流速１ml／分で平衡化した。Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼは、そのＮ末端Ｈｉｓタグを介して結合し、一方、不純物は、溶解バッファーと共に洗い流される。伝導率により測定したバッファー中のイミダゾール濃度を増加させることによりタンパク質の溶出を実施した。イミダゾール濃度２００mMでカラムから洗い流した画分にエンドヌクレアーゼバンドが見出された。λ＝２６０nmおよびλ＝２８０nmでの吸光度をモニター観察した。
【図２Ｂ】ピーク画分４〜１１の１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。画分６をアッセイに使用した。
【図２Ｃ】アフィニティクロマトグラフィー後のＩ−ＳｐｏｍＩ調製物のウェスタンブロットである。トランケートされたタンパク質のバンドは、未染色New England Biolabs Broad Rangeマーカー３６．５kDaバンドより上に現れ、これは３８．７kDaの推定された大きさとよく相関する。 図３は、Ｉ−ＳｐｏｍＩの切断部位の決定を表す。
【図３Ａ】５′−末端標識Ｉ−ＳｐｏｍＩ基質を作製するために用いられたプライマーである。各オリゴヌクレオチドの双方の末端は、イントロン挿入部位からの距離に応じて数字が付けられている。
【図３Ｂ】Ｉ−ＳｐｏｍＩの切断部位である。２つの異なる末端標識ＤＮＡ鋳型を、５′−γ32Ｐ末端標識プライマーＳＰ００９、ＳＰ００８またはＳＰ０１０を用いてＰＣＲ反応により調製した。次いでＤＮＡ基質を、Ｉ−ＳｐｏｍＩと共にインキュベートした。切断後、ＤＮＡフラグメントを、同一ＤＮＡ配列のシークエンシングラダーの隣のシークエンシングゲル上で電気泳動した。矢印は、センス鎖（左）およびアンチセンス鎖（右）のリン酸ジエステル結合の切断を示す。切断パターンを下部の図にまとめているが、これは、ねじれた線で表され、点線は、イントロン挿入部位の位置を示す。部位の配列は、部分的対称を示している。 図４は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ切断の最適条件の決定を表す。切断生成物％は、１７３ｂｐの長さの切断フラグメントからのシグナルと合計シグナル（このフラグメントのシグナルに未切断基質２７３ｂｐの放射活性を加える）との間の比率により表される。
【図４Ａ】Ｍｇ2+濃度である。ＰＣＲ生成物ＳＰ００９〜ＳＰ００８ １μlを、Ｉ−ＳｐｏｍＩ溶液 ５μlと共に全量２５μlでインキュベートした。反応バッファーはpH９．０のジエタノールアミン／ＨＣｌ ０．１Ｍ、ＮａＣｌ ０．１Ｍおよび１mM〜４０mMの種々濃度のＭｇＣｌ2を含有した。３７℃で２０分間反応を実施した。
【図４Ｂ】Ｎａ+濃度である。反応容量およびＰＣＲ生成物の加えた容量は、Ａの下に記載した。反応バッファーは、pH９．０のジエタノールアミン／ＨＣｌ ０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 ２．５mMおよび０Ｍ〜０．２Ｍの種々濃度のＮａＣｌを含有した。３７℃で２０分間反応を実施した。
【図４Ｃ】温度である。反応容量およびＰＣＲ生成物の加えた容量は、Ａの下に記載した。反応バッファーは、pH９．０のジエタノールアミン／ＨＣｌ ０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 ２．５mMおよびＮａＣｌ ０．１Ｍを含有した。反応物を、２５〜６５℃で２０分間インキュベートした。
【図４Ｄ】pHである。反応容量およびＰＣＲ生成物の加えた容量は、Ａの下に記載した。反応バッファーは、pH６．０のＭＥＳ ０．０３Ｍ、pH７．０またはpH８．０のＨＥＰＥＳ ０．１Ｍ、pH９．０、９．２、９．４、９．６、９．８または１０のジエタノールアミン／ＨＣｌ ０．１Ｍ、ＭｇＣｌ2 ２．５mMおよびＮａＣｌ ０．１Ｍを含有した。３７℃で２０分間反応を実施した。 なお、ＭＧ2+、Ｎａ+および温度に関するアッセイを、同一の酵素調製物で実施したことに留意されたい。３７℃で２０分の消化の後、切断された生成物の最大値は、全ＤＮＡの約３０％であった。異なるpH値でのアッセイを、別の酵素調製物で実施し、そして最適条件下での切断効率は約８５％であった。 図５は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ認識配列の決定を表す。
【図５Ａ】Ｉ−ＳｐｏｍＩと共にインキュベートした後のプラスミドｐＰ３Ｅ５〜２のＮｄｅＩ−ＡｌｗＮＩフラグメントの電気泳動分析である。サザンブロッティングおよびランダム標識ｐＵＣ１９でのハイブリダイゼーションによりＤＮＡフラグメントを顕示した。１kbフラグメントは、Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位を含有し、これはＩ−ＳｐｏｍＩによる切断の後各々０．８kbおよび０．２kbの２つのフラグメントを生じる。一連のプラスミドをアッセイに用い、各々のプラスミドは、下に示す野生型エクソン−エクソン配列の単一のヌクレオチド変異を含有する。各々の変異は、野生型配列に比較して塩基転換に相当する。 ねじれた線は、切断部位を示す。「切断」と記されたボックスでは、各変異体の効果を示す：＋＝変異体は、野生型と同様に切断される；０＝切断低下；−＝切断なし。％値は、野生型配列に対する各変異配列におけるＩ−ＳｐｏｍＩの相対切断効率を指している。値は、切断生成物と野生型配列に関する変異配列の間の比率を％で示す。０．８kbバンドを１．０kbおよび０．８kbバンドに存在する全ＤＮＡと比較する。
【図５Ｂ】ＤＮＡ領域のらせん表示である。矢印は、鎖切断が導入される位置を示す。
【図６】グループＩイントロンの末梢ループのＯＲＦを示す。グループＩイントロン２次構造の概略図は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ型タンパク質のＯＲＦの挿入部位を示す。Ｃｅ：クラミドモナス・ユーガメトス（Chlamydomonas eugametos）。Ｃｒ：クラミドモナス・レインハルディッティ（Chlamydomonas reinhardtii）。Ｃｓ：クラミドモナス・スミティ（Chlamydomonas smithii）。Ｅｎ：エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）。Ｋｔ：クルイベロミセス・サーモトレランス（Kluyveromyces thermolerans）。Ｎｅ：ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）。Ｐａ：ポドスポラ・アンセリナ（Podospora anserina）。Ｓｃ：パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）。Ｓｐ：分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）。
【図７】ｃｏｘ１の第１のエクソンのヌクレオチド配列にＩ−ＳｐｏｍＩをコードするイントロンを加えたものを示す（配列番号：８）。
【図８】Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードするヌクレオチド配列を表す（配列番号：９）。
【図９】Ｉ−ＳｐｏｍＩ認識部位のヌクレオチド配列を表す（配列番号：１０）。
【図１０】天然Ｉ−ＳｐｏｍＩタンパク質のアミノ酸配列を表す（配列番号：１１）。
【図１１】Ｉ−ＳｐｏｍＩタンパク質のアミノ酸配列を表す（配列番号：１２）。
【００３１】
発明の詳細な説明
分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のミトコンドリアｃｏｘ１遺伝子における第１のグループＩイントロンの遺伝子産物であるＩ−ＳｐｏｍＩは、エンドヌクレアーゼ活性を有している。これは、イントロンを含まないｃｏｘ１アレル内のイントロン挿入近くのフランキング配列を認識する。Ｎ末端で大幅に修飾したＩ−ＳｐｏｍＩは、元来のリーディグ・フレームの遺伝子産物に比較して切断能力に影響がなく、またエンドヌクレアーゼの配列特異性にも影響がなかった。ホーミングエンドヌクレアーゼの開始コドンの位置は、可変性であり、そして宿主遺伝子の種々の部分に位置することができる。代表的なのは先行するエクソン配列を有するフレームにＯＲＦを有するもの、また別にイントロン配列に限定されるリーディグ・フレームを有するもの、またはイントロン内にイントロン性ＯＲＦを有するものさえもある。もう１つの基本的な問題は、エンドヌクレアーゼが活性化するために修飾またはプロセシングされる必要があるかどうかである。Ｉ−ＳｃｅII（１９）およびＩ−ＳｃｅIII（５５）に関しては、これらが前駆体タンパク質として合成され、そしてプロセシングされると報告されている。
【００３２】
本発明者らは、分裂酵母（S.pombe）のｃｏｘ１Ｉ１ｂのループ８イントロンの２次構造の配列が、インビトロで特異的エンドヌクレアーゼとして作用するタンパク質をコードすることを決定した。Ｉ−ＳｐｏｍＩの配列は、ジーンバンク受入番号ＮＣ ００１３２６ Ｘ００８８６ Ｘ０２８１９ Ｘ１５７３８（遺伝子＝「ｃｏｘ１」；イントロンＯＲＦ）またはＸ５４４２１ Ｘ００８８６ Ｘ０２８１９ Ｘ１５７３８で見出すことができる。
【００３３】
Ｉ−ＳｐｏｍＩのインビトロ活性に関する最適条件は、Ｉ−ＳｃｅＩ（２９）にとって好ましい条件に非常に類似している。９．０と１０．０の間の高pH値の嗜好は、むしろ異常である。例えば、Ｉ−ＳｃａＩ（４３）は、pH８．０〜９．０で、およびＩ−ＣｒｅＩ（５１）は７．０〜９．０の間で最高の活性を示す。他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼと共有する特徴的な様相は、２価カチオンＭｇ2+への依存性であるが、切断活性に及ぼすＭｎ2+またはＺｎ2+のような他のコファクターの影響は調査されなかった。
【００３４】
Ｉ−ＳｐｏｍＩの切断パターンは、異なる分野のＬＡＧＬＩＤＡＤＧ型の多くの他のエンドヌクレアーゼ、例えばＩ−ＡｎｉＩ（３９）、Ｉ−ＳｃａＩ（４３）、Ｉ−ＳｃｅＩ（１６）、II（３７）およびIII（５６）、Ｉ−ＣｅｕＩ（３０）、Ｉ−ＣｈｕＩ（５７）、Ｉ−ＣｒｅＩ（１７）、Ｉ−ＣｐａII（５８）、Ｉ−ＤｍｏＩ（２０）、Ｉ−ＰｏｒＩ（５９）、ＰＩ−ＳｃｅＩ（６０）、ＰＩ−ＴｈｙＩ（６１）、ＰＩ−ＴｌｉＩ（６２）およびＰＩ−ＴｆｕII（６３）、ならびにパン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＨＯエンドヌクレアーゼ（６４）に関して記載されているように、４ヌクレオチドの長さの典型的な３′オーバーハングを示す。Ｉ−ＳｐｏｍＩは、イントロン挿入部位から２ヌクレオチド離れているセンス鎖およびアンチセンス鎖を切断する。Ｉ−ＳｐｏｍＩの認識部位は、２０ヌクレオチドの長さである。部位の中央の４つの塩基は、酵素のエンドヌクレオチド鎖切断の位置とほぼ一致し、Ｉ−ＣｒｅＩで報告されている（６５）のと同様に基質認識を必要としない。これらは、各側の５つの必須ヌクレオチドによりフランキングされている。必要とされる配列の各々の縁には別の２つの塩基が存在し、これを変化させることはできない（図５Ａ）。したがって、−１１と＋９位間の１４個の単一変異は切断に影響する。イントロンコード化ホーミングエンドスクレアーゼと同様に、Ｉ−ＳｐｏｍＩは、長いＤＮＡ配列を認識するが、タンパク質は、細菌性制限エンドヌクレアーゼと比較するとむしろ小型である。細菌性II型制限酵素は、ＤＮＡを取り込み、そして主溝の水素結合ドナーをほとんど飽和し、そしてそれに加えてしばしば認識部位の副溝に接触する（２６）。イントロンコード化ホーミングエンドヌクレアーゼのプロファイルは、β−シートに基づいて単調であるので、さらなる鎖を用いることなくＤＮＡの主溝上の認識部位の特異的塩基と相互作用し、亜飽和接触を行う（４）。認識パターンにしたがって、Ｉ−ＳｐｏｍＩに関して本発明者らは、酵素の触媒ドメインがＤＮＡの副溝に面するが、一方２つの認識ドメインは隣の主溝に面する一方の側からの基質ＤＮＡへの接触を仮説として取り上げる。これは、また必須塩基によりフランキングされた４つの中央の塩基における認識の独立性をも説明する。Ｉ−ＳｐｏｍＩ認識部位内の必須および非必須ヌクレオチドの順序は、対称的であるが、Ｉ−ＣｒｅＩ（６６）のようなホモ２量体ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ酵素に関して存在するようなパリンドローム配列はない。一般に、単量体ドデカペプチドエンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインは、ホモ２量体酵素と比較して顕著な非対称性を有している。これが認識部位に関してゆるやかな対称性要件の原因となり、そして基質の拡張された範囲の獲得を可能にする（３、６７）。ドデカペプチドホーミングエンドヌクレアーゼの認識および切断配列は、非常に多岐にわたっている。
【００３５】
１３１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質（１０）のアラインメントによれば、Ｉ−ＡｎｉＩ（３９）は、Ｉ−ＳｐｏｍＩに最もよく相対するが、切断部位も認識部位もＩ−ＳｐｏｍＩには類似していない。
【００３６】
ホーミングエンドヌクレアーゼＯＲＦｓは、これらの露出されたループの侵入の後、グループＩイントロンのＲＮＡ２次構造の異なる末梢ループに生じる（２、６８−７０）。したがって、イントロンおよびイントロンＯＲＦは、独立した遺伝子エレメントであると考えられる（７１）。ＧＩＹ−ＹＩＧ酵素Ｉ−ＴｅｖIIに対しての、ファージＴ４ｓｕｎＹ遺伝子のエクソン接合部配列およびループＬ９．１のＯＲＦをフランキングするイントロン配列のアラインメントは、Ｉ−ＴｅｖII認識配列にわたる高度な類似性を示した（７２）。この知見および触媒コア配列をコードするＤＮＡ上のイントロン可動性の独立性は、トランスでエンドヌクレアーゼに適用する場合（７３）、イントロン侵入の仮説を支持する。ドデカペプチドホーミングエンドヌクレアーゼのＯＲＦｓは、ループＬ１（Ｉ−ＳｃｅIII（５６））、Ｌ２（Ｉ−ＳｃｅIV（２８）、Ｉ−ＳｃｅVII（７４）、Ｉ−ＳｃａＩ（４１））、Ｌ６（Ｉ−ＣｅｕＩ（３０）、Ｉ−ＣｒｅＩ（７５））およびＬ８（Ｉ−ＡｎｉＩ（３９、７４）、Ｉ−ＤｄｉＩ（７１）（７６）、Ｉ−ＳｃｅＩ（１６、７４）、Ｉ−ＳｃｅII（１９、７４））に挿入される（図６）。
【００３７】
最近精製されたＩ−ＳｃａＩは、エンドヌクレアーゼおよびマチュラーゼの双方の活性を有していると報告された最初のタンパク質であったが、一方パン酵母（S.cerevisiae）のｃｙｔ ｂ遺伝子のイントロンｂｉ２におけるマチュラーゼ相同体が、エンドヌクレアーゼ活性を得るためには２つの非隣接アミノ酸の置換に依存する（３８、４１、４２）。双方の活性を含有する別のタンパク質は、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）（３９）のミトコンドリア性グループＩイントロンＩによりコードされるＩ−ＡｎｉＩである。双方の活性を含有するタンパク質は、この進化の中間体であることを意味する。
【００３８】
異なる界からのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ酵素の複数の配列アラインメントに基づいて、以前は、異なる遺伝子間および種々の宿主間のエンドヌクレアーゼの交換は、非常に起こりにくいことが示されてきた（１０）。代わりに、これらの可動性エレメントの獲得は何度も独立して起こり、そして共通の始祖において一度だけとは限らない。元来のイントロンは、自己スプライシングするので、エンドヌクレアーゼＯＲＦは、本質的なリボザイム機能を維持するためにイントロン２次構造の末梢ループに挿入されなければならない（図６）。したがってこの侵入の位置は、宿主生物または遺伝子に依存するのではなく、各々のイントロンの２次構造に依存する。それにもかかわらず、ＯＲＦのイントロンへの挿入により自己スプライシングの損傷が引き起こされることがあり、この方法を改善するためにマチュラーゼタンパク質の必要性が生じる。分裂酵母（S.pombe）のｃｏｘ１の４つのグループＩイントロンで、インビトロで自己触媒的にスプライシングするものはないことが報告されているが、パン酵母（S.cerevisiae）ｒｎｌイントロンの自己触媒的スプライシングが観察されており（４４）、これは恐らくインビボでのスプライシング過程におけるマチュラーゼタンパク質の関与のためであろう。この研究では、本発明者らは、分裂酵母（S.pombe）のイントロンｃｏｘ１Ｉ１ｂにおける２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含む酵素コアがＩ−ＳｐｏｍＩからエンドヌクレアーゼ活性を得るのに十分であることを示し、始祖ＯＲＦが、ループＬ８の挿入部位に依然存在するが、全遺伝子産物の開始コドンにより調節されると結論づけた。
【００３９】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ遺伝子配列
本発明は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする単離されたＤＮＡ配列に関する。酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩは、エンドヌクレアーゼ、とりわけＤＮＡエンドヌクレアーゼである。
【００４０】
分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）のミトコンドリアゲノムのｃｏｘ１遺伝子の第１のグループＩイントロン（ｃｏｘ１Ｉ１ｂ）は、２つのコンセンサスモチーフを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質ファミリーの典型的なメンバーであるポリペプチドをコードするオープン・リーディグ・フレームを含有する。
【００４１】
大腸菌（E.coli）において人工的に発現されるこのタンパク質のエンドヌクレアーゼ活性の生化学的な特徴づけが行われ、そしてイントロンＲＮＡ２次構造のループ８に位置するｃｏｘ１Ｉ１ｂ ＯＲＦの３０４コドンの翻訳産物は、インビトロで特異的なエンドヌクレアーゼ活性を呈する。ヌクレオチド鎖切断の最適なインビトロ条件が特徴づけられ、そしてかかる条件を用いてタンパク質の切断および認識部位を決定した。他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質からの知見に合致して、Ｉ−ＳｐｏｍＩは、イントロン挿入部位の近くで４ヌクレオチドの３′オーバーハングを有する２本鎖切断を生じ、そして２０ヌクレオチドの新規な配列を認識する。
【００４２】
酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードするＤＮＡ配列は、精製された形態であることが好ましい。加えて、本発明のＤＮＡ配列は、外来性のタンパク質および脂質、ならびに外来性の微生物、例えば細菌およびウイルスを含まないことが好ましい。Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本質的に精製されそして単離されたＤＮＡ配列は、とりわけ発現ベクターを調製するのに有用である。
【００４３】
従来の化学合成技術を用いて、ヌクレオシド単位間の３′――――＞５′リン酸結合の形成により本発明の遺伝子を調製できる。例えば、周知のリン酸ジエステル、リン酸トリエステル、および亜リン酸トリエステル技術、ならびに公知のこれらの研究法を修飾した方法を用いることができる。ホスホロアミダイト研究法に基づくもののような自動合成機を用いてデオキシリボヌクレオチドを調製することができる。オリゴおよびポリリボヌクレオチドもまた、従来の技術を用いてＲＮＡポリメラーゼおよびリガーゼの助けを借りて入手することができる。
【００４４】
本発明は、勿論、本発明の配列と同一の特性を実質的に呈する本発明のＤＮＡ配列の変種を含む。これは、ＤＮＡ配列が本明細書にて開示する配列と同一である必要はないことを意味している。例えば、１つ以上のコドンが同一アミノ酸をコードできる公知の遺伝子コードの縮重のために、ＤＮＡ配列は、図７で示されるものから変化でき、そして依然として図７でコードされるのと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。変化は、酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩの切断特性を有する酵素をコードするようなＤＮＡ配列の特性を実質的に損なわない１つまたはそれ以上のヌクレオチドに関与する単一もしくは複数の塩基置換、欠失、または挿入もしくは局所変異に起因し得る。
【００４５】
本発明は、酵素的に活性なＩ−ＳｐｏｍＩをコードできる、精製された形態のＤＮＡ配列のフラグメントを包含することを意図する。実施例のように活性を決定することができる。したがって、「Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素」なる用語は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ制限部位を切断する能力を維持している元来のタンパク質の変種およびフラグメントを含むことを意味する。
【００４６】
本発明は、単離および精製された、すなわち均質な、組換えおよび非組換え双方のＩ−ＳｐｏｍＩポリペプチドを提供する。望ましい生物学的活性を保持する元来のＩ−ＳｐｏｍＩタンパク質の変種および誘導体を、元来のＩ−ＳｐｏｍＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の変異により入手することができる。多くの従来の方法のいずれかにより元来のアミノ酸配列を変化させることができる。元来の配列のフラグメントへのライゲーションを可能にする制限部位によりフランキングされた変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の座で変異を導入することができる。ライゲーションの後、得られた再構築された配列は、望ましいアミノ酸挿入、置換、または欠失を有するアナログをコードする。
【００４７】
または、オリゴヌクレオチドを指定する部位特異的変異誘発手段を用いて、変化した遺伝子を提供することができる、この場合予め決定されたコドンを置換、欠失または挿入により変化させることができる。前記した変化させる方法の実例は、Walderら(Gene 42: 133(1986)); Bauerら(Gene 37: 73(1985)); Craik(BioTechniques,January 12〜19(1985)); Smithら(Genetic Engineering: Principles and Methods,Plenum Press(1981)); Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82: 488(1985)); Kunkelら(Methods in Enzymol.154: 367(1987)); Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001）、および米国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号により開示されており、そのすべてを参照として本明細書に組み入れられる。
【００４８】
酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列を、遺伝子のすべてまたは特定の領域を増幅するのに有用な、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅することができる。例えばS.Kwokら、J.Virol.,61: 1690〜1694(1987)；米国特許第４，６８３，２０２号；および米国特許第４，６８３，１９５号を参照されたい。より具体的には、増幅すべきＤＮＡのプラスおよびマイナス鎖に相補的である、１０〜３００塩基対離れて位置する公知の配列のＤＮＡプライマーペアをオリゴヌクレオチドの合成のための周知の技術により調製することができる。プライマーがＤＮＡにアニーリングするとき、各プライマーの１つの末端を伸長させ、そして修飾して制限エンドヌクレアーゼ部位を作ることができる。ＰＣＲ反応混合物は、ＤＮＡ、ＤＮＡプライマーペア、４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＭｇＣｌ2、ＤＮＡポリメラーゼ、および従来のバッファーを含有できる。ＤＮＡを多くのサイクルで増幅することができる。一般に、各サイクルが短時間の高温でのＤＮＡの変性、反応混合物の冷却、およびＤＮＡポリメラーゼを用いる重合からなる、多くのサイクルを用いることにより検出の感度を上げることができる。増幅された配列を当業者に公知の技術を用いて検出することができる。
【００４９】
２．本発明のＩ−ＳｐｏｍＩ遺伝子を含有するヌクレオチドプローブ
酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列を、生物学的材料におけるヌクレオチド配列を検出するためのプローブとして用いることもできる。プローブを原子または無機ラジカルで、最も一般的には放射性核種を用いて、または分子生物学的実験で一般に用いられるいずれかの非放射性材料で標識することができる。放射性標識には32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ等がある。適切なシグナルを提供し、そして十分な半減期を有するいずれかの放射性標識を用いることができる。他の標識には、標識抗体に対する特異的結合メンバーとして提供され得るリガンド、蛍光物質、化学発光物質、酵素、標識リガンドの特異的結合対メンバーとして機能できる抗体などが含まれる。標識の選択は、ハイブリダイゼーションの速度およびＤＮＡまたはＲＮＡに対するプローブの結合に及ぼす標識の影響により規定される。標識は、ハイブリダイゼーションに利用できるＤＮＡまたはＲＮＡの量を検出するのに十分な感度を提供することが必要であろう。
【００５０】
本発明のヌクレオチド配列を遺伝子へのハイブリダイズするためのプローブとして用いる場合、プローブで試験されるヌクレオチド配列は、好ましくは水不溶性固体、多孔性支持体、例えばナイロン膜に添加される。本発明の標識ポリヌクレオチドおよび従来のハイブリダイゼーション試薬を用いてハイブリダイゼーションを実施できる。特別なハイブリダイゼーション技術は、本発明には必要でない。
【００５１】
ハイブリダイゼーション溶液に存在する標識プローブの量は、標識の特性、支持体に合理的に結合できる標識プローブの量、およびハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して広範に変化する。一般に、実質的に化学量論よりも過剰なプローブを用いて、固定されたＤＮＡまたはＲＮＡへのプローブ結合率を高める。
【００５２】
様々な程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを用いることができる。条件が厳密になるほど、2本鎖形成のためのプローブとポリヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションに必要である相補性が大きくなる。温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間等により厳密性を調節できる。便宜的にはハイブリダイゼーションの厳密性は、反応溶液の極性の変化により変化する。用いる温度を経験的に決定できるか、またはこの目的に開発された周知の式から決定できる。
【００５３】
好ましいハイブリダイゼーション条件には、標準的なハイブリダイゼーション条件、例えばChurchおよびGilbert、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(7): 1991〜1995(1984年4月)、およびChurchおよびGilbert、Prog.Clin.Biol.Res.177(2): 17〜21(1985）に記載された条件などが挙げられ、双方共に参照として具体的に本明細書に組み入れられる。
【００５４】
３．Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードするヌクレオチド配列を含有するヌクレオチド配列
本発明は、また酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩまたはＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位をコードする本発明のＤＮＡ配列に関するもので、この場合ヌクレオチド配列は、他の核酸に連結されている。核酸はいずれかの供給源、例えばプラスミド、クローン化ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または原核および真核生物を含むいずれかの供給源に由来する天然ＤＮＡもしくはＲＮＡから入手することができる。核酸は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする核酸が導入されている組換え染色体でよい。同様に、核酸は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ制限部位が導入されている組換え染色体でよい。Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク（2001）に記載される技術を含む種々の技術により、生物学的材料、例えば微生物の培養物、生物学的液体または組織からＤＮＡまたはＲＮＡを抽出することができる。一般に細菌、酵母、ウイルス、または高等生物、例えば植物または動物から核酸を入手する。核酸は、更に複雑な混合物のフラクション、例えばヒトの全ＤＮＡに含まれる遺伝子の一部、または特定の微生物の核酸配列の一部でよい。核酸は、巨大分子のフラクションでよいか、または核酸は、連続した遺伝子もしくは遺伝子の集合体からなってもよい。ＤＮＡは１本鎖または２本鎖形態でよい。フラグメントが１本鎖形態である場合、従来の技術にしたがって、ＤＮＡポリメラーゼを用いてこれを２本鎖形態に変換することができる。
【００５５】
本発明のＤＮＡ配列を構造遺伝子に連結することができる。本明細書で用いる「構造遺伝子」なる用語は、その鋳型またはメッセンジャーｍＲＮＡにより具体的なタンパク質またはポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。本発明のヌクレオチド配列は、発現調節配列、すなわち遺伝子に機能的に連結されている場合、遺伝子の発現を調節および制御するＤＮＡ配列と共に機能できる。
【００５６】
４．本発明のヌクレオチド配列を含有するベクター
本発明は、また酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩまたはＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位をコードする本発明のＤＮＡ配列を含有するクローニングおよび発現ベクターにも関する。
【００５７】
更にとりわけ、酵素をコードするＤＮＡ配列を、配列をクローニングするためのビークルにライゲートすることができる。遺伝子クローニングに関与する主要な工程は、原核生物または真核生物からの目的の遺伝子を含有するＤＮＡを分離する、特定の部位で、得られたＤＮＡフラグメントおよびクローニングビークルからのＤＮＡを切断する、２つのＤＮＡフラグメントを一緒に混合する、そしてフラグメントをライゲートして組換えＤＮＡ分子を得るための手段を含む。次いで組換え分子を宿主細胞に移すことができ、そして細胞を複製させて元来のＤＮＡ配列のクローンを含有する同一の細胞を生成させることが可能になる。
【００５８】
本発明で用いるビークルは、本発明のヌクレオチド配列を宿主細胞に輸送することができるいずれかの１本鎖または２本鎖ＤＮＡ分子でよい。ビークルが細胞内で複製することもできる場合、これは少なくとも１つの、宿主細胞内の複製起点として作用できるＤＮＡ配列を含有しなければならない。加えて、ビークルは、本発明の遺伝子をコードするＤＮＡ配列を挿入するための１つまたはそれ以上の部位を含有しなければならない。これらの部位は、通常付着末端を形成できる制限酵素部位に相当し、これは、ビークルにライゲートされるプロモーター配列における付着末端と相補的である。一般に、これらの特性を有するプラスミド、バクテリオファージ、コスミドビークル、細菌性人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母性人工染色体（ＹＡＣ）を用いて本発明を実施できる。
【００５９】
本発明のヌクレオチド配列は、ビークルの部位のいずれかの組み合わせに適合する付着末端を有することができる。または、配列は、ビークルのクローニング部位における対応する平滑末端にライゲートすることができる１つまたはそれ以上の平滑末端を有することができる。望む場合、例えば酵素Ｂａｌ ３１またはλ ｅｘｏIIIを用いて連続的なエクソヌクレアーゼ欠失により、ライゲートされるヌクレオチド配列を更に加工することができる。本発明のヌクレオチド配列が付着末端の望ましい組み合わせを含有しない事象においては、リンカー、アダプター、またはホモ重合体テーリング（homopolymer tailing）を加えることにより配列を修飾することができる。
【００６０】
本発明のヌクレオチド配列をクローニングするために用いられるビークル、例えばプラスミドは、宿主細胞により示される有用な特性に寄与する１つまたはそれ以上の遺伝子、例えば選択マーカーを担持することが好ましい。好ましい試験計画では、２つの異なる薬物に抵抗するための遺伝子を有するビークルを選択する。例えば抗生物質に関する遺伝子へのＤＮＡ配列の挿入により遺伝子を不活性化し、薬物抵抗性を破壊する。細胞が組換え体で形質転換されている場合、第２の薬物抵抗性遺伝子は影響を受けず、第２の薬物に対する抵抗性および第１の薬物に対する感受性により目的の遺伝子を含有するコロニーを選択することができる。好ましい抗生物質マーカーは、宿主細胞にクロラムフェニコール、アンピシリンまたはテトラサイクリン抵抗性を付与する遺伝子である。
【００６１】
種々の制限酵素を用いてビークルを切断することができる。制限酵素の同一性は、一般に、ライゲートされるＤＮＡ配列の末端およびビークルの制限部位の同一性に依存する。制限酵素は、ビークルの制限部位に合致し、これが今度はライゲートされる核酸フラグメントの末端に合致する。
【００６２】
ライゲーション反応を周知の技術および従来の試薬を用いて設定できる。ＤＮＡ2本鎖の隣接する５′−リン酸および遊離の３′−ヒドロキシ基間のリン酸ジエステル結合の形成を触媒するＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションを実施する。ＤＮＡリガーゼは、種々の微生物に由来してよい。好ましいＤＮＡリガーゼは、大腸菌（E.coli）およびバクテリオファージＴ４に由来する酵素である。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡフラグメントを平滑または粘着末端、例えば制限酵素消化により作製できる末端とライゲートすることができる。大腸菌（E.coli）ＤＮＡリガーゼを用いて、付着末端を含有する２本鎖ＤＮＡ分子の末端の間のリン酸ジエステル結合の形成を触媒することができる。
【００６３】
原核または真核細胞においてクローニングを実施できる。クローニングビークルを複製するための宿主は、勿論、ビークルと適合し、そしてビークルがそこで複製できるものである。プラスミドを用いる場合、プラスミドは、細菌もしくはその他の生物に由来してよいか、またはプラスミドを合成により調製することができる。プラスミドは、宿主細胞染色体とは独立して複製することができるか、または組み込みプラスミドを用いることができる。プラスミドは、宿主細胞のＤＮＡ複製酵素を利用して複製することができるか、またはプラスミドは、プラスミド複製に必要な酵素をコードする遺伝子を担持することができる。多くの異なるプラスミドを本発明の実施に用いることができる。
【００６４】
酵素Ｉ−ＳｐｏｍＩをコードする本発明のＤＮＡ配列をビークルにライゲートさせて発現ベクターを形成することもできる。この場合に用いるビークルは、適当な宿主細胞のプロモーターに機能的に連結された遺伝子を発現することができるものである。細菌、例えば大腸菌（E.coli）、酵母、昆虫、菌類、線虫、植物または哺乳動物細胞の遺伝子を発現するのに用いられることが知られているビークルを用いるのが好ましい。
【００６５】
ビークルを修飾するのに当業者に公知のいずれか代替の技術を用いることができる。
【００６６】
発現系
本発明は、また組換えクローニングおよびＤＮＡを含有する発現ベクター、ならびに組換えベクターを含有する宿主細胞をも提供する。実験室手引書、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubelら、Wiley(1998)）に手引きを見出すことができる。
【００６７】
ＤＮＡを含む発現ベクターを用いてＩ−ＳｐｏｍＩ酵素を調製することができる。Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素を生成する方法には、酵素の発現を促進する条件下で、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することと、次いで培養物から発現された酵素を収集することとが含まれる。発現された酵素を精製するための手順が、用いられる宿主細胞のタイプのような因子により、およびペプチドが膜結合しているか、または宿主細胞から分泌される可溶性形態であるかどうかにより変化することは当業者に理解されよう。
【００６８】
いずれか適当な発現系を用いることができる。ベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する、適当な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列に機能的に連結された本発明のポリペプチドまたはフラグメントをコードするＤＮＡを含む。制御配列の実例としては、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、ならびに転写および翻訳開始および終止を調節する適当な配列などが挙げられる。制御配列が機能的にＤＮＡ配列に関係している場合、ヌクレオチド配列は、動作可能なように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列が、ＤＮＡ配列の転写を調節する場合、プロモーターヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列に動作可能なように連結されている。望ましい宿主細胞において複製する能力を付与する複製起点、および形質転換体が同定される選択遺伝子を一般に発現ベクターに組み込む。
【００６９】
加えて、ペプチド、例えば（元来のまたは異種性の）適当なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチド（分泌リーダー）に関するＤＮＡ配列をフレーム内で本発明の核酸配列に融合して、最初にＤＮＡを転写し、そしてｍＲＮＡを、シグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳することができる。目的の宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。細胞からのポリペプチドの分泌時にポリペプチドペプチドからシグナルペプチドが切断される。
【００７０】
シグナルペプチドが切断される（複数の）位置がコンピュータープログラムにより推定されるものとは異なることがあり、そして組換えポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞のタイプのような因子にしたがって変化し得ることもまた当業者に理解されよう。タンパク質調製物は１つ以上の部位でのシグナルペプチドの切断により得られる、異なるＮ末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物を含んでよい。
【００７１】
ポリペプチドの発現のための適当な宿主細胞には、原核生物、酵母または高等真核生物細胞などが挙げられる。哺乳動物、線虫、植物、細菌、菌類、酵母または昆虫細胞が宿主細胞として用いられるのが一般的に好ましい。細菌、菌類、酵母および哺乳動物宿主細胞で用いるための適当なクローニングおよび発現ベクターは、例えばPouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual,Elsevier、ニューヨーク（1985）に記載されている。細胞を含まない翻訳系を用いて、本明細書に開示されるＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いてポリペプチドを生成することもできる。
【００７２】
原核生物系
原核生物にはグラム陰性またはグラム陽性生物などが挙げられる。形質転換に適した原核生物宿主細胞には、例えば大腸菌（E.coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）およびシュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）およびブドウ球菌（Straphylococcus）属内のその他の様々な種などが挙げられる。原核生物宿主細胞、例えば大腸菌（E.coli）では、原核生物宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を促進するために、ポリペプチドはＮ末端メチオニン残基を含んでよい。Ｎ末端Ｍｅｔを、発現された組換えポリペプチドから切断することができる。
【００７３】
原核生物宿主細胞で使用するための発現ベクターは、一般に１つまたはそれ以上の表現型選択マーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカー遺伝子は例えば抗生物質抵抗性を付与するか、または独立栄養性の要件を提供するタンパク質をコードする遺伝子である。原核生物宿主細胞のための有用な発現ベクターの実例としては、市販により入手可能なプラスミド、例えばクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）またはｐＢＲ３２２から誘導されるベクター、例えばｐｕＣグループからのベクターなどが挙げられる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性に関する遺伝子を含有し、したがって形質転換された細胞を同定するための単純な手段を提供する。適当なプロモーターおよびＤＮＡ配列を、ｐＢＲ３２２ベクターに挿入する。他の市販により入手可能なベクターには、例えばｐＫＫ２２３〜３（Pharmacia Fine Chemicals、ウプサラ、スゥエーデン）およびｐＧＥＭ１（Promega Biotec、マジソン、ウィスコンシン州、米国）などが挙げられる。
【００７４】
組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Changら、Nature 275: 615(1978); およびGoeddelら、Nature 281: 544(1979))、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddelら、Nucl.Acids.Res.8: 4057(1980)；およびＥＰ−Ａ−３６７７６）、およびｔａｃプロモーター（Maniatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、412頁(1982)）などが挙げられる。特に有用な原核生物宿主細胞発現系は、ファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性レプレッサー配列を用いる。λＰＬプロモーターの誘導体を組み込む、American Type Culture Collectionから入手可能なプラスミドベクターには、プラスミドpHＵＢ２（大腸菌（E.coli）ＪＭＢ９株に常在する、ＡＴＣＣ３７０９２）およびｐＰＬｃ２８（大腸菌（E.coli）ＲＲ１に常在する、ＡＴＣＣ５３０８２）などが挙げられる。
【００７５】
酵母系
または、酵母宿主細胞において、好ましくは酵母菌属（例えばパン酵母（S.cerevisiae)）からポリペプチドを発現させることができる。酵母の他の属、例えばピチア（pichia）またはクルイベロマイセス（Kluyveromyces）を用いることもできる。酵母ベクターは、しばしば２μ酵母プラスミドからの複製配列の起点、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終止のための配列、および選択マーカー遺伝子を含有する。酵母ベクターのための適当なプロモーター配列には、とりわけガラクトース制御プロモーター、例えばＧＲＡＰ１配列（Molecular Genetics of Yeast,John R.Johnston、Oxford University Press(1994)）、メタロチオネインのためのプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら、J.Biol.Chem.255: 2073(1980)）または他の糖分解酵素（Hessら、J.Adv.Enzyme Reg.7: 149(1968); およびHollandら、Biochem.17: 4900(1978)）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどが挙げられる。他の酵母発現に適したベクターおよびプロモーターは、更にHitzeman、ＥＰＡ−７３，６５７に記載されている。別の代替は、Russellら(J.Biol.Chem.258: 2674(1982)）およびBeierら(Nature 300: 724(1982)）に記載されるグルコース抑制ＡＤＨ２プロモーターである。酵母宿主細胞では、ベクターは、好ましくはシャトルベクターである。酵母および大腸菌（E.coli）の双方で複製可能なシャトルベクターを、大腸菌（E.coli）における選択および複製のためにｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ′遺伝子および複製起点）を前記した酵母ベクターに挿入することにより構築することができる。
【００７６】
酵母α−因子リーダー配列を用いてポリペプチドの分泌を指示することができる。α−因子リーダー配列は、しばしばプロモーター配列および構造遺伝子配列の間に挿入される。例えばKurjanら、Cell 30: 933(1982)およびBitterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81: 5330(1984）を参照されたい。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適した他のリーダー配列は、当業者に公知である。リーダー配列をその３′末端の近くで修飾して、１つまたはそれ以上の制限部位を含有させることができる。これはリーダー配列の構造遺伝子への融合を促進する。
【００７７】
酵母形質転換プロトコルは当業者に公知である。かかるプロトコルの１つは、Hinnenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75: 1929(1978)に記載されている。Hinnenらのプロトコルは選択培地中でＬｅｕ+形質転換体を選択し、その場合、選択培地は、酵母窒素塩基 ０．６７％、グルコース ２％、アデニン １０mg/mlおよびウラシル ２０mg/mlから成る。
【００７８】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を、発現を誘導するために「富化」培地で増殖させることができる。富化培地の例としては、酵母抽出物 １％、ペプトン １％およびグルコース ２％から成るものが挙げられる。グルコースが培地から枯渇した場合ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制が起こる。
【００７９】
哺乳動物または昆虫系
哺乳動物または昆虫宿主細胞培養系用いて組換えポリペプチドを発現させることもできる。昆虫細胞内で異種性タンパク質を生成するためのバキュロウイルス系は、LuckowおよびSummers、Bio/Technology 6: 47(1988）により説明されている。哺乳動物起源の確立された細胞系を用いることもできる。適当な哺乳動物宿主細胞系の実例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）（Gluzmanら、Cell 23: 175(1981)）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞株、ならびにMcMahanら（EMBO J.10: 2821(1991)）に記載されるアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）から誘導されるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株などが挙げられる。
【００８０】
哺乳動物細胞にＤＮＡを導入するための確立された方法が記載されている（Kaufman,R.J.、Large Scale Mammalian Cell Culture 15〜69頁(1990)）。市販により入手可能な試薬を用いる別のプロトコル、例えばリポフェクタミン脂質試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはリポフェクタミン・プラス脂質試薬を用いて細胞をトランスフェクトすることができる（Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 7413〜7417(1987)）。加えて、エレクトロポレーションを用いて従来の手段、例えばSambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual第3版、1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)）を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトすることができる。技術分野で公知の方法、例えば細胞毒性薬物に対する抵抗性を用いて安定した形質転換体の選択を実施することができる。Kaufmanら、Meth.in Enzymology 185: 487〜511(1990)は、いくつかの選択スキーム、例えばジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）抵抗性について記載している。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株は、ＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ ＤＸ−Ｂ１１株でよい（UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77: 4216〜4220(1980)）。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現するプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株に導入することができ、プラスミドを含有する細胞のみが適当な選択培地中で増殖できる。発現ベクターに組み込むことができる選択マーカー他の実例としては、抗生物質に対して抵抗性を付与するｃＤＮＡ、例えばＧ４１８およびヒグロマイシンＢなどが挙げられる。これらの化合物に対する抵抗性に基づいてベクターを宿す細胞を選択することができる。
【００８１】
哺乳動物宿主細胞発現ベクターの転写および翻訳調節配列をウイルスゲノムから切り出すことができる。通常用いられるプロモーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起源の初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を用いて哺乳動物宿主細胞において構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝的エレメントを提供することができる。ウイルス性初期および後期プロモーターは、共にウイルスゲノムからフラグメントとして容易に得られるのでとりわけ有用であり、これは、ウイルス性の複製起点を含有することもできる（Fiersら、Nature 273: 113(1978); Kaufman、Meth.in Enzymology(1990)）。複製部位のＳＶ４０ウイルス起点に位置する、ＨｉｎｄIII部位からＢｇｌＩ部位に伸びるおよそ２５０ｂｐの配列が含まれる場合、より小型のまたは大型のＳＶ４０フラグメントを用いることもできる。
【００８２】
哺乳動物発現ベクターからの異種性遺伝子の発現を改善することが示されている別の調節配列には、ＣＨＯ細胞から誘導される発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）（Morrisら、Animal Cell Technology、529〜534頁(1997)；およびＰＣＴ出願ＷＯ９７／２５４２０）ならびにアデノウイルス２のトリパータイトリーダー（tripartite leader, ＴＰＬ）およびＶＡ遺伝子ＲＮＡｓ（Gingerasら、J.Biol.Chem.257: 13475〜13491(1982)）のようなエレメントなどがある。ウイルス起源の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によりジシストロンのｍＲＮＡが効率的に翻訳されるようになる（OhおよびSarnow、Current Opinion in Genetics and Development 3: 295〜300(1993); Rameshら、Nucleic Acids Research 24: 2697〜2700(1996)）。選択マーカーのための遺伝子（例えばＤＨＦＲ）が続く、ジシストロンのｍＲＮＡの一部としての異種性ｃＤＮＡの発現が、宿主のトランスフェクション能力および異種性ｃＤＮＡの発現を改善することが示されている（Kaufman、Meth.in Enzymology(1990)）。ジシストロンのｍＲＮＡを用いる発現ベクターの実例には、Mosserら、Biotechnique 22: 150〜161(1997)に記載されるpTR-DC/GFP、およびMorrisら、Animal Cell Technology 529〜534頁(1997)に記載されるｐ２Ａ５Ｉである。
【００８３】
有用な高発現ベクター、ｐＣＡＶＮＯＴは、Mosleyら、Cell 59: 335〜348(1989)に記載されている。哺乳動物宿主細胞において使用される他の発現ベクターを、例えばOkayamaおよびBerg(Mol.Cell.Biol.3: 280(1983))ならびにSambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク（2001)）に開示されるように構築することができる。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定した高レベル発現のための有用な系、を実質的にCosmanら(Mol.Immunol.23: 935(1986)）に記載されるように構築することができる。別の有用な哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ９１／１８９８２に記載されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【００８４】
別の有用な発現ベクター、ｐＦＬＡＧ（登録商標）およびｐＤＣ３１１を使用することもできる。ＦＬＡＧ（登録商標）技術は、ｐＦＬＡＧ（登録商標）発現ベクターにより発現された組換えタンパク質のＮ末端への低分子量（１ｋＤ）、親水性ＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドの融合を中心としている。ｐＤＣ３１１は、ＣＨＯ細胞におけるタンパク質の発現に用いられる別の特殊なベクターである。ｐＤＣ３１１は、目的の遺伝子およびＤＨＦＲ翻訳のための配列内リボソーム結合部位、発現増強配列エレメント（ＥＡＳＥ）、ヒトＣＭＶプロモーター、トリパータイトリーダー配列、およびポリアデニル化部位を有するジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有するバイシストロン配列により特徴づけられる。
【００８５】
用いることができるシグナルペプチドに関しては、望む場合、元来のシグナルペプチドを異種性のシグナルペプチドまたはリーダー配列と置換することができる。シグナルペプチドまたはリーダー配列の選択は、組換えポリペプチドが生成される宿主細胞のタイプのような因子に依存し得る。説明のために、哺乳動物宿主細胞において機能的である異種性シグナルペプチドの実例としては、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Cosmanら、Nature 312: 768(1984)に記載されるインターロイキン−２レセプターのシグナル配列；欧州特許第３６７，５６６号に記載されるインターロイキン−４レセプターシグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されるＩ型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチド；および欧州特許第４６０，８４６号に記載されるII型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチドなどが挙げられる。
【００８６】
Ｉ−ＳｐｏｍＩの発現は、恒常的または誘導的のいずれかでよい。誘導能が望ましい場合、誘導プロモーターを用いることができる。誘導系の実例にはBrown、米国特許第６，１８０，３９１号；Yeeら、米国特許第６，１３３，０２７号；Reeves、米国特許第５，９６５，４４０号；およびFilmusら、米国特許第５，８７７，０１８号が挙げられる。
【００８７】
精製
本発明は、またポリペプチドおよびそのフラグメントを単離および精製する方法をも含む。
【００８８】
単離および精製
１つの好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドまたはフラグメントの、本発明のポリペプチドまたはフラグメントの精製を助ける別のポリペプチドへの融合を用いて組換えポリペプチドまたはフラグメントの精製を行うことができる。かかる融合パートナーには、ポリＨｉｓ、ＨＡ−ＧＳＴ、またはその他の抗原同定ペプチド、およびＦｃ部分などが含まれ得る。
【００８９】
別の好ましい実施態様では、Ｔａｐ−Ｔａｇ技術により精製を行う（Rigautら、Nat.Biotechnol.17(10): 1030〜1032(1999年10月)）。
【００９０】
宿主細胞のいずれかのタイプに関しては、当業者に公知であるように、組換えポリペプチドまたはフラグメントを精製するための手段は、用いる宿主細胞のタイプのような因子、および組換えポリペプチドまたはフラグメントが培養培地に分泌されるか、またはされないかによって変わる。
【００９１】
一般に、分泌されない場合は、組換えポリペプチドまたはフラグメントを宿主細胞から、または可溶性であり、そして分泌される場合は、培地もしくは上澄から単離し、続いて１回またはそれ以上の濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティ精製またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を行うことができる。これらの工程を達成するための具体的な方法に関しては、最初に市販により入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて培養培地を濃縮することができる。濃縮工程に続いて、濃縮物を精製マトリックス、例えばゲル濾過媒体に適用することができる。また別に、アニオン交換樹脂、例えば吊り下がったジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基質を用いることができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは通常タンパク質精製に用いられる他の型でよい。または、カチオン交換工程を用いることができる。適当なカチオン交換体は、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスを含む。加えて、クロマトフォーカシングステップを用いることができる。または、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を用いることができる。適当なマトリックスは、樹脂に結合したフェニルまたはオクチル基でよい。加えて、選択的に組換えタンパク質に結合するマトリックスを有するアフィニティクロマトグラフィーを用いることができる。用いられるかかる樹脂の実例は、レクチンカラム、色素カラムおよび金属キレートカラムである。最後に、１回またはそれ以上の疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば吊り下がったメチル、オクチル、オクチルデシルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルまたは重合体樹脂）を用いて更にポリペプチドを精製することができる。前記の精製工程のいくつかまたはすべては種々の組み合わせで周知であり、これを用いて単離および精製された組換えタンパク質を提供することができる。
【００９２】
本発明のポリペプチド結合タンパク質、例えば本発明のポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体を含むアフィニティカラムを利用して発現されたポリペプチドをアフィニティ精製することも可能である。従来の技術を用いて、例えばこれらのポリペプチドを例えば高塩分溶出バッファー中で、次いで使用するための低塩分バッファーに透析するか、もしくは利用するアフィニティマトリックスに依存してpHまたは他の成分を変化させることにより、アフィニティマトリックスから除去するか、または例えば本発明から誘導されるポリペプチドのようなアフィニティ部分の天然に生じる基質を用いて競合的に除去することができる。
【００９３】
本発明のこの実施態様では、ポリペプチド結合タンパク質、例えば抗ポリペプチド抗体または本発明のポリペプチドと相互作用する他のタンパク質を固相支持体、例えばカラムクロマトグラフィーマトリックスまたはその表面に本発明のポリペプチドを発現する細胞を同定、分離、もしくは精製するのに適した類似の基質に結合させることができる。本発明のポリペプチド結合タンパク質の、表面に接触する固相への粘着をいずれかの手段により達成できる、例えば磁性微粒子をこれらのポリペプチド結合タンパク質で被覆し、磁場を通るインキュベーション容器中に維持することができる。細胞混合物の懸濁液を、そこにかかるポリペプチド結合タンパク質を有している固相と接触させる。その表面に本発明のポリペプチドを有している細胞は、固定されたポリペプチド結合タンパク質に結合し、次いで未結合細胞は、洗い流される。このアフィニティ結合方法は、かかるポリペプチドを発現する細胞を溶液から精製、スクリーニング、または分離するのに有用である。固相から陽性として選択された細胞を放出する方法は、当業界で公知であり、そして例えば酵素の使用を包含する。かかる酵素は、好ましくは無毒であり、そして細胞に対して無害であり、ならびに細胞表面結合パートナーを切断するように志向させるのが好ましい。
【００９４】
また別に、本発明のポリペプチド発現細胞を含有すると推定される細胞の混合物を最初に本発明のビオチン化ポリペプチド結合タンパク質と共にインキュベートすることができる。インキュベーション時間は、典型的には、本発明のポリペプチドに十分に結合することを確実にする時間である、少なくとも１時間である。次いで、得られた混合物を、アビジン被覆ビーズを充填したカラムを通過させ、それによりアビジンに関するビオチンの高親和性のためにポリペプチド結合細胞がビーズに結合する。アビジン被覆ビーズの仕様は、当業界で公知である。Berensonら、J.Cell.Biochem.10D: 239(1986)を参照されたい。未結合材料の洗浄および結合細胞の遊離は従来の方法を用いて実施する。
【００９５】
精製の望ましい程度は、タンパク質の使用目的に依存する。例えば、ポリペプチドが、インビボで投与される場合、比較的高純度であるのが望ましい。かかる場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析したときに、他のタンパク質に相当するタンパク質バンドが検出されないようにポリペプチドを精製する。異なったグリコシル化、異なった翻訳後プロセシング等のために、ポリペプチドに相当する複数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより可視化され得ることは当業者には理解されよう。本発明のポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したときに、単一のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均一になるまで精製するのが最も好ましい。銀染色、クーマシー青色染色または（タンパク質が放射性標識されている場合）オートラジオグラフィーによりタンパク質バンドを可視化することができる。
【００９６】
５．本発明の核酸を含有する細胞および染色体
従来の技術を用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入することができる。例えばリン酸カルシウム沈殿（GrahamおよびVan Der Eb、Virology 52: 456〜467(1973); ChenおよびOkayama、Mol.Cell.Biol.7: 2745〜2752(1987); Rippeら、Mol.Cell.Biol.10: 689〜695(1990)）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Gopal、Mol.Cell.Biol.5: 1188〜1190(1985)）、エレクトロポレーション（Tur-Kaspaら、Mol.Cell.Biol.6: 716〜718(1986)）、直接マイクロインジェクション（HarlandおよびWeintraub、J.Cell Biol.101: 1094〜1099(1985)）、ＤＮＡ充填リポソーム（NicolauおよびSene、Biochim.Biophys.Acta 721: 185〜190(1982); Fraleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76: 3348〜3352(1979)）およびリポフェクタミンＤＮＡ複合体、細胞ソニケーション（Fechheimerら、「スクレープローディングおよびソニケーションローディングによるプラスミドＤＮＡでの哺乳動物細胞のトランスフェクション」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 8463〜8467(1987)）、高速マイクロプロジェクタイルを用いる遺伝子衝撃（Yangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 9568〜9572(1990)）、ならびにレセプター媒介トランスフェクション（WuおよびWu、Biochemistry、27: 887〜892(1988)；WuおよびWu、J.Biol.Chem.262: 4429〜4432(1987)）により核酸を導入することができる。以下で論じるように、ウイルスベクターを用いることもできる。
【００９７】
好ましい細胞は、細菌、植物、線虫、酵母、昆虫および哺乳動物である。微生物純粋培養を用いることができる。とりわけ好ましいものは、ショウジョウバエおよびマウス細胞である。細胞は、初代細胞または細胞株でよい。細胞は、ゲノムに組み込まれた核酸を含有できる。または、核酸は、組み込まれていないままでもよい。好ましい実施態様では、組換え哺乳動物または昆虫染色体は、組み込まれたＩ−ＳｐｏｍＩ部位を含有する。とりわけ好ましいのは、ショウジョウバエ、線虫（C.elegans）またはげっ歯類染色体である。
【００９８】
別の好ましい態様では、組換え細胞、植物、線虫、酵母、哺乳動物、または昆虫染色体は、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素を発現する核酸を含有する。とりわけ好ましいものは、ショウジョウバエ、線虫（C.elegans）、またはマウス染色体である。
【００９９】
原核または真核細胞においてクローニングを実施することができる。クローニングビークルを複製するための宿主は、もちろんビークルに適合し、そしてそこでビークルが複製できる。好ましくはクローニングは、細菌または酵母細胞内で実施されるが、菌類、動物および植物起源の細胞を用いることもできる。クローニング作業を行うのに好ましい宿主細胞は、細菌細胞、例えば大腸菌（E.coli）である。大腸菌（E.coli）細胞の使用は、たいていのクローニングビークル、例えば細菌ブラスミドおよびバクテリオファージがこれらの細胞内で複製するので特に好ましい。
【０１００】
本発明の好ましい実施態様では、従来の技術を用いて、動作可能なようにプロモーターに連結された本発明のヌクレオチド配列をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを哺乳動物細胞に挿入する。
【０１０１】
６．ウイルスベクター
（ａ）アデノウイルスベクター
インビボ分配のための１つの方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用に関連する。アデノウイルスを用いてＩ−ＳｃｅＩをヒト細胞に効率よく分配している（AnglanaおよびBacchetti、Nucleic Acids Research 27: 4276〜4281(1999)）。またアデノウイルスをベクターとして用いてＨＯエンドヌクレアーゼを分配している（Nicolasら、Virology 266: 211〜244(2000)）。アデノウイルスベクターを用いてＩ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする核酸を分配することができる。
【０１０２】
遺伝子構成、すなわち、３６kB、直線状、２本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの知識によりアデノウイルスＤＮＡの大きな切片の７kBまでの外来性配列との置換が可能になる（GrunhausおよびHorwitz、クローニングベクターとしてのアデノウイルス、Seminar in Virology 3: 237〜252(1992)）。アデノウイルスＤＮＡは、遺伝毒性の可能性なしにエピソームの様式で複製できるので、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み込みには至らない。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、大規模な増幅の後のゲノムの再構成は、検出されていない。アデノウイルスは、その細胞サイクル段階にかかわらず、本質的にすべての上皮細胞に感染できる。アデノウイルスは、それが中程度の大きさのゲノムであり、操作が容易であり、高力価で、広範な標的細胞範囲を有し、そして感染性が高いために、遺伝子移入ベクターとして使用するのにとりわけ適している。複製欠損であるアデノウイルスベクターの作製および増殖は、ヘルパー細胞株に依存し、これは、恒常的にアデノウイルスタンパク質を発現する（例えばGrahamら、「ヒトアデノウイルス５型からのＤＮＡにより形質転換されたヒト細胞株の特徴」J.Gen.Virol.36: 59〜79(1977)）。
【０１０３】
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Leveroら、「インビトロおよびインビボでの外来性遺伝子の発現のための欠損および非欠損アデノウイルスベクター」Gene 101: 195〜202(1991); Gomez-Foixら、「筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ遺伝子の肝細胞へのアデノウイルス媒介移入が、グリコーゲンの制御変化に寄与する」J.Biol.Chem.267: 25129〜25134(1992)）およびワクチン開発（GrunhausおよびHorwitz、Seminar in Virology 3: 237〜252(1992); GrahamおよびPrevec、「アデノウイルス基盤発現ベクターおよび組換えワクチン」Biotechnology 20: 363〜390(1992)）に用いられている。組換えアデノウイルスを遺伝子治療に使用できることが動物実験により示唆されている（Stratford-PerricaudetおよびPerricaudet、Human Gene Transfer(Cohen-HaguenauerおよびBorion(編)、Editions John Libbey Eurotext、フランス（1991)）、51〜61頁; Stratford-Perricaudetら、Hum.Gene Ther.1: 241-256(1990)）。組換えアデノウイルスの異なる組織への投与における研究には、気管点滴注入（Rosenfeldら、「組換えアルファ１−アンチトリプシン遺伝子の肺上皮へのインビボアデノウイルス媒介移入」）Science 252: 431〜434(1991); Rosenfeldら、「ヒトシスチン繊維症膜コンダクタンスレギュレーター遺伝子の気道上皮へのインビボ移入」Cell 68: 143〜155(1992)）筋肉注射（Ragotら、「ヒトミニジストロフィン遺伝子のｍｄｘマウスの骨格筋への効率のよいアデノウイルス媒介移入」Nature 361: 647〜650(1993)）、末梢静脈内注射（HerzおよびGerard、「低密度リポタンパク質レセプター遺伝子のアデノウイルス媒介移入は、正常マウスにおいてコレステロールクリアランスを急速に促進する」Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 2812〜2816(1993)）および脳への定位的接種（Le Gal La Salleら、「脳のニューロンおよびグリアへの遺伝子移入のためのアデノウイルスベクター」Science 259: 988〜990(1993)）などがある。
【０１０４】
（ｂ）レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターを用いてＩ−ＳｐｏｍＩ酵素またはＩ−ＳｐｏｍＩ部位をコードする核酸を細胞に分配することができる。レトロウイルスベクターの使用により核酸の宿主染色体への組み込みが促進される。
【０１０５】
レトロウイルスは、逆転写の方法により感染された細胞内でそのＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに変換する能力により特徴づけられる１本鎖ＲＮＡウイルスの一群である（Ｃｏｆｆｉｎ、「レトロウイルス科およびその複製」、Virology（Fieldsら(編)、ニューヨーク：Raven Press)1437〜1500頁(1990)）。次いで得られたＤＮＡをプロウイルスとして安定して細胞染色体に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を志向させる。組み込みによりレシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持に至る。レトロウイルスベクターを構築するために、特定のウイルス配列の代わりに目的の遺伝子をコードする核酸をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲを含有しないパッケージング細胞株およびパッケージング成分を構築する（Mannら、「レトロウイルスパッケージング変異体の構築およびヘルパー不含の欠損レトロウイルスを生成するためのその使用」、Cell 33: 153〜159(1983)）。レトロウイルスＬＴＲと一緒にヒトｃＤＮＡおよびパッケージング配列を含有する組換えプラスミドをこの細胞株に導入する場合、パッケージング配列により組換えプラスミドのＲＮＡ転写がウイルス粒子にパッケージングされ、次いでこれが培養培地に分泌される（NicolasおよびRubenstein、「レトロウイルス」、ベクター：分子クローニングベクターおよびその使用に関する調査、RodriguezおよびDenhardt(編)、Stoneham: Butterworth、493〜513頁(1988); Temin、Gene Transfer、(Kucherlapati(編)、ニューヨーク：Plenum Press)149〜188頁(1986); Mannら、Cell 33: 153〜159(1983))。次いで組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、場合によっては濃縮してもよく、そして遺伝子移入に用いる。レトロウイルスベクターは、広範な細胞タイプに感染できる。
【０１０６】
（ｃ）発現構築物としてのその他のウイルスベクター
他のウイルスベクターを、本発明の発現または分配構築物として用いることができる。ウイルス、例えばワクシナウイルス（Ridgeway、「哺乳動物発現ベクター」、ベクター：分子クローニングベクター及びその使用に関する調査（RodriguezおよびDenhardt(編)、Stoneham: Butterworth)467〜492頁(1988)；BaichwalおよびSugden、「動物ＤＮＡウイルスに由来する遺伝子移入のためのベクター：移入された遺伝子の一過性および安定した発現」、Gene transfer, (Kucherlapati(編)、ニューヨーク：Plenum Press)117〜148頁(1986); Couparら、「複数の外来性遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスの構築のための一般法」、Gene 68: 1〜10(1988)）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ridgeway、RodriguezおよびDenhardt(編)、Stoneham: Butterworth、467〜492頁(1988); BaichwalおよびSugden、Gene transfer (Kucherlapati(編)、ニューヨーク：Plenum Press)117〜148頁(1986)）およびヘルペスウイルスに由来するベクターを用いることができる。
【０１０７】
他のベクターは、例えばアフリカツメガエル卵母細胞に関してはSegalら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92: 806-810(1995)）、植物に関してはMachidaら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94: 8675〜8680(1997)）およびKirikら(EMBO 19(20): 5562〜5566(2000)）、ならびにショウジョウバエに関してはBellaicheら(Genetics 152: 1037〜1044(1999)）に開示されている。
【０１０８】
７．幹細胞
１つの実施態様では、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素またはＩ−ＳｐｏｍＩ部位をコードする核酸を含有する幹細胞を調製することができる。特定の遺伝子のマウスゲノムへの通常の挿入は、マウスＥＳ細胞の使用により達成することができる（例えばKusakabeら、米国特許第６，１９０，９１０号参照）。マウスＥＳ細胞は、インビトロで着床前胚（Evansら、Nature 292: 154〜159(1981); Martin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78: 7634〜7638(1981)）または胎児生殖細胞（Matsuiら、Cell 70: 841〜847(1992)）から誘導された未分化の多能性細胞である。マウスＥＳ細胞は、連続継代で未分化状態を維持する（Williamsら、Nature 336: 684〜687(1988)）。
【０１０９】
通常の着床前胚と共にキメラに合体させ、そして子宮に戻したマウスＥＳ細胞は、通常の発生に参加する（Richardら、Cytogenet.Cell Genet.65: 169〜171(1994)）。キメラにおいてマウスＥＳ細胞が、機能的生殖細胞に寄与する能力により、マウス系に部位特異的変異を導入する方法が提供される。適当なトランスフェクションおよび選択計画を用いれば、相同組換えを用いて特定遺伝子の計画的な変化を伴うＥＳ細胞株を誘導することができる（例えばJaisserら、米国特許第５，８３０，７２９号）。これらの遺伝的に操作された細胞を用いて正常な胚を有するキメラを形成することができ、キメラ動物が回収される。ＥＳ細胞が、キメラ動物の生殖系列に寄与する場合、次いで次世代で、計画された変異のためのマウス系統が確立される。好ましい実施態様では、マウスＤ３胚幹細胞株を用いる。他のＥＳ細胞、例えばウシ胎児幹細胞（Simsら、米国特許第６，１０７，５４３号）を同様に用いることができる。
【０１１０】
８．トランスジェニク動物
トランスジェニク動物を作製するために、従来の技術を用いることができる。１つの実施態様では、ＥＳ細胞を用いてトランスジェニク動物を作製することができる。別の実施態様では、Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素またはＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位をコードするプラスミドを１−細胞期マウス受精卵の雄前核に注射できる。次いで注射した卵を偽妊娠代理母の雌に移すことができる。代理母の雌の卵を出産まで成長させる。
【０１１１】
トランスジェニク動物は、初期発達段階（通常１−細胞期）で、動物または動物の祖先の生殖系列に導入されている遺伝子を担持する。Wagnerら、P.N.A.S.USA 78: 5016(1981); およびStewartら、Science 217: 1046(1982)は、ヒトグロビン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。Constantiniら、Nature 294: 92(1981); およびLacyら、Cell 34: 343(1983）は、ウサギグロビン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。McKnightら、Cell 34: 335(1983)は、ニワトリトランスフェリン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。Brinsterら、Nature 306: 332(1983)は、機能的に再構成された免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。Palmiterら、Nature 300: 611(1982)は、重金属誘導メタロチオネインプロモーター配列に融合されたラット成長ホルモン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。Palmiterら、Cell 29: 701(1982)は、メタロチオネインプロモーター配列に融合されたチミジンキナーゼ遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。Palmiterら、Science 222: 809(1983)は、メタロチオネインプロモーター配列に融合されたヒト成長ホルモン遺伝子を含有するトランスジェニクマウスについて記載している。
【０１１２】
９．ネスト化染色体フラグメンテーション計画
真核生物ゲノムを遺伝子マッピングするためのネスト化染色体フラグメンテーション（the nested chromosomal fragmentation）計画は、制限エンドヌクレアーゼＩ−ＳｐｏｍＩの独特な特性、例えば２０ｂｐの長さの認識部位を利用する。たいていの真核生物ゲノムにおける天然のＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位の不在も、またこのマッピング計画に利用される。
【０１１３】
最初に、前記したように選択マーカーを含有する特定のカセットを用いる相同組換えによるか、または無作為挿入により１つまたはそれ以上のＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位が、ゲノムの種々の位置で人工的に挿入される。次いでＩ−ＳｐｏｍＩ制限酵素と共にインキュベートしたときに、得られたトランスジェニック系統のゲノムを、人工的に挿入された（複数の）Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位で完全に切断する。切断によりネスト化染色体フラグメントが生成される。
【０１１４】
次いで染色体フラグメントを精製し、そしてパルスフィールドゲル（ＰＦＧ）電気泳動により分離して、染色体において挿入された部位の位置を「マッピング」することが可能になる。全ＤＮＡが、制限酵素で切断される場合、各々の人工的に導入されたＩ−ＳｐｏｍＩ部位が、ゲノムにおける独特な「分子道標」を提供する。したがって各々が、道標間の物理学的なゲノムの間隔を決定する単一のＩ−ＳｐｏｍＩ部位を担持する１組のトランスジェニック系統を作成できる。結果的に、人工的に導入されたＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位を用いてゲノム全体、染色体またはいずれかの目的のセグメントをマッピングすることができる。
【０１１５】
ネスト化染色体フラグメントを固体膜に移し、フラグメントのＤＮＡに相補的なＤＮＡを含有する標識プローブをハイブリダイズすることができる。観察されるハイブリダイゼーションバンドパターンに基づいて、真核生物ゲノムをマッピングすることができる。適当な「道標」を有する１組のトランスジェニック系統を参照として用いて、直接ハイブリダイゼーションによりいずれかの新規遺伝子またはクローンをマッピングする。
【０１１６】
１０．インビボ部位指定組換え
半数体細胞では、人工的なＩ−ＳｐｏｍＩ部位での染色体内の単一の切断の結果、死に至る細胞分割停止の結果を招く（生存率わずか数％）。切断部位に相同的な無傷配列の存在は、結果的に修復され、１００％の細胞が生存する。２倍体細胞では、Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位での染色体内の単一の切断の結果、染色体相同性を用いる修復に至り、１００％の細胞が生存する。双方の場合、誘導された２本鎖切断の修復の結果、ドナーＤＮＡ分子からの非相同性配列の切断および挿入をフランキングする非相同性配列の欠損を有するヘテロ接合性の喪失に至る。FairheadおよびDujon、Mol.Gen.Genet.240: 170〜180(1993)。
【０１１７】
ＤＮＡフラグメントのプラスミドから染色体への部位特異的挿入のために、いくつかの試験計画を試みることができる。これにより骨の折れるスクリーニング工程を行わずに予め決定された部位に導入遺伝子を挿入することが可能になる。試験計画には：
−１− Ｉ−ＳｐｏｍＩ認識部位が染色体の独特な位置で挿入されているトランスジェニック細胞の構築。トランスジェニック細胞におけるＩ−ＳｐｏｍＩ酵素の発現、ならびに目的の遺伝子およびＩ−ＳｐｏｍＩ部位が挿入されている配列に相同なセグメントを含有する核酸分子の導入。
【０１１８】
活性酵素の直接導入（例えばマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、タンパク質のスクレープローディング）および誘導または恒常性ウイルスまたはプラスミドベクター（例えばアデノウイルスまたはレトロウイルスベクター）からのタンパク質発現などの多くの技術によりＩ−ＳｐｏｍＩ酵素の発現を達成できる。
【０１１９】
−２− プラスミドに担持される目的の遺伝子に隣接してまたはその内部でのＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位の挿入。合成Ｉ−ＳｐｏｍＩ遺伝子を担持する発現ベクターおよびＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位を含有するプラスミドでの正常な細胞の同時形質転換。
【０１２０】
−３− 誘導または恒常性細胞プロモーターの調節下でＩ−ＳｐｏｍＩ遺伝子がゲノムに組み込まれている安定したトランスジェニック細胞株の構築。目的の遺伝子に隣接してまたはその内部でＩ−ＳｐｏｍＩ部位を含有するプラスミドによる細胞株の形質転換。
【０１２１】
部位指定相同組換え
１．部位特異的遺伝子挿入
方法により種々の遺伝子または特定の遺伝子の変異体が、Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位の以前の組み込みにより定義される予め決定された位置で挿入され得る細胞および細胞株を無制限に生成することが可能になる。したがって、かかる細胞および細胞株は、表現型、リガンド、薬物のためのスクリーニング手段に、および細胞株がレトロウイルス生成に関してトランスに補完する細胞株である場合には、非常に高レベルでの組換えレトロウイルスの再生産発現に有用である。
【０１２２】
（２つの相同性染色体の１つにのみ存在する）ヘテロ接合性であるＩ−ＳｐｏｍＩ部位で、前記の細胞株を最初に作製する。これをそのように増殖させることができ、および／またはこれを用いてトランスジェニック動物を作成することができる。かかる場合、通常の方法、例えば交配によりホモ接合性トランスジェニック（２つの相同性染色体において同等の位置でＩ−ＳｐｏｍＩ部位を有する）を構築することができる。ホモ接合性細胞株を、かかる動物から単離することができる。または、適当なＤＮＡ構築物での２次形質転換によりホモ接合性細胞株をヘテロ接合性細胞系から構築することができる。同一遺伝子または近隣遺伝子の近くの部位で、代償性へテロ接合性Ｉ−ＳｐｏｍＩ挿入を含有する細胞株は、本発明の一部であることも理解されよう。
【０１２３】
前記のマウス細胞またはヒトなどの他脊椎動物からの同等物を用いることができる。無脊椎動物からの細胞を用いることもできる。培養物中で維持され得るいずれかの植物細胞を、それが再生する能力があるかないか、またはそれが繁殖可能な植物を生み出しているかどうかとは関係なく使用することもできる。トランスジェニック動物で方法を用いることもできる。
【０１２４】
２．部位特異的遺伝子発現
類似の細胞株を用いて導入遺伝子、種々のプロモーター、レギュレーターおよび／または構造遺伝子を用いる生物学的またはバイオテクノロジー目的のタンパク質、代謝物または他の化合物を生成することもできる。遺伝子は、いつも染色体の同一の局在性で挿入される。トランスジェニック動物では、組織特異的な様式で複数の薬物、リガンドまたは医薬用タンパク質を試験することが可能になる。
【０１２５】
３．例えばＥＰ０４１９６２１Ｂ１に開示されるように、Ｉ−ＳｐｏｍＩ認識部位およびＩ−ＳｐｏｍＩ酵素を相同組換え技術と組み合わせて用いることもできる。例えば、ＣＦＴＲ座におけるＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位の挿入を、ゲノムＤＮＡのＣＦＴＲ遺伝子をフランキングする相同配列を用いて行うことができる。二重交差による自然遺伝子置換によりＩ−ＳｐｏｍＩ部位を挿入することができる（Le Mouellicら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87: 4712〜4716(1990)）。
【０１２６】
挿入された配列をヘテロ接合状態またはホモ接合状態で維持できることは理解されよう。ヘテロ接合状態で挿入された配列を有するトランスジェニック動物の場合、例えば組織特異的様式で、誘導プロモーターからのＩ−ＳｐｏｍＩ発現の誘導によりホモ接合を誘導することができる。
【０１２７】
標的細胞にＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位および染色体配列と相同性を共有する配列を含有するプラスミド構築物を導入することにより、自然相同組換えによるＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位のゲノムへの挿入を達成することができる。入力プラスミドを染色体標的で組換え的に構築する。この組換えにより少なくとも１つのＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位が染色体に部位指定挿入されることになる。標的化構築物は、環状または直線状のいずれかでよく、そして標的細胞に含まれるいずれかの配列と１、２またはそれ以上の部分の相同性を含有し得る。プラスミド構築物の標的（Ｏ型ベクター）への挿入によるか、またはＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位を含有する配列（＾Ｌ型ベクター）による染色体の置換より標的化メカニズムを生じることができる。ValanciusおよびSmithies、Mol.Cell Biol.11: 4389〜4397(1991)参照。
【０１２８】
染色体標的化された座は、エクソン、イントロン、プロモーター領域、座調節領域、擬似遺伝子、レトロエレメント、反復エレメント、非機能的ＤＮＡ、テロメアおよびミニサテライトでよい。１つの座または複数の座で標的化を生じることができ、結果的に１つまたはそれ以上のＩ−ＳｐｏｍＩ部位を細胞ゲノムに挿入することになる。
【０１２９】
ゲノムの正確な座にＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位を導入するための胚幹細胞の使用により、これらの細胞の初期胚（桑実期または胚盤胞段階）への再移植により、正確な座でＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位を含有する変異マウスの生成が可能になる。これらのマウスを用いてＩ−ＳｐｏｍＩ酵素の体細胞または生殖系列への発現においてゲノムを修飾することができる。
【０１３０】
４．生物医学的適用
本発明による配列、細胞、動物、染色体および方法で種々の適用を行うことができる。
【０１３１】
１つの適用は、遺伝子治療である。遺伝子治療の具体的な実例には、免疫変調（すなわちＩＬ遺伝子の範囲または発現を変化させること）；欠損遺伝子の置換；およびタンパク質の排泄（すなわちオルガネラにおける種々分泌性タンパク質の発現）などが挙げられる。
【０１３２】
本発明は、更にＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位がゲノム配列の座に、または遺伝子のエクソンに対応するｃＤＮＡの一部に導入されているトランスジェニック生物、例えば動物を具現化する。Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位が導入されているゲノム（動物、ヒト、昆虫、または植物等）のいずれかの遺伝子を、対応するエンドヌクレアーゼをコードする配列を含有するプラスミドにより標的化することができる。Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位の導入を相同組換えにより達成することができる。このように、いずれかの遺伝子を発現のために特定の座に標的化することができる。
【０１３３】
トランスジェニック生物をスクリーニング法に用いることができる。
Ｉ−ＳｐｏｍＩにより遺伝子活性化を調節することができる。例えばＩ−ＳｐｏｍＩ認識部位を、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター（ｐＮＳＥ）（Forss-Petterら、Neuron 5: 187〜197(1990)）の調節下で、タンデム反復でｎｌｓＬａｃＺ遺伝子の一部（例えば６２ｂｐ）の重複を含有するトランスジェニックマウス系統に導入し、したがってオープン・リーディグ・フレームへの停止コドンの導入により遺伝子機能を損失させることができる。これらのマウスにおけるＩ−ＳｐｏｍＩ酵素の発現は、２つのタンデム反復間の組換えを再活性化することができ、すべての中枢神経系（ＣＮＳ）で遺伝子の再活性化に至る。全ＣＮＳの遺伝手術に至るジフテリア毒素のＤＴ−Ａフラグメントを用いて同一の実験を実現できる。組織特異的プロモーターによるかまたは遺伝子標的化により得られる天然の座におけるＩ−ＳｐｏｍＩ修飾ＤＴ−Ａの発現により遺伝手術を実施することができる。
【０１３４】
インビボでＩ−ＳｐｏｍＩ誘導組換えにより特定の遺伝子を活性化することが可能である。Ｉ−ＳｐｏｍＩ切断部位をタンデム反復における遺伝子の重複の間に導入し、機能を喪失させる。エンドヌクレアーゼＩ−ＳｐｏｍＩの発現により２つのコピー間で切断を誘導することができる。組換えによる回復が刺激され、そして機能的遺伝子に至る。
【０１３５】
染色体の特定の転座または欠失をＩ−ＳｐｏｍＩ切断により誘導できる。「古典的な遺伝子置換」により染色体の特定の位置で遺伝子を組み込むことにより座挿入を行うことができる。非致死的な転座によるか、または欠失続いて末端結合によりＩ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼによる認識配列の切断を修復することができる。座のフランキング領域における２つまたはそれ以上のＩ−ＳｐｏｍＩ部位の挿入により染色体のフラグメントの欠失を得ることもできる。組換えにより切断を修復でき、そして２つの部位の間の完全領域の欠失に至る。
【０１３６】
Ｉ−ＳｐｏｍＩは、タンパク質の進化的に保存されたファミリーの一部であるので、その切断特異性が複合生物、例えば菌類、動物または植物のゲノムの独特な部位として認識できるほどに十分に高い場合、Ｉ−ＳｐｏｍＩで開発されたすべての適用を他のエンドヌクレアーゼで行うこともできると解される。エンドヌクレアーゼをその天然の遺伝子から直接発現させることができる場合がある。またかかる酵素が天然にコードされる細胞区画における遺伝コードの可変性のために、人工遺伝子を構築する必要がある場合もある。構築物ならびにＩ−ＳｐｏｍＩおよびその部位で実施される全系列の操作を他のエンドヌクレアーゼで容易に変換することができる。同様に、適用においてＩ−ＳｐｏｍＩを他の酵素、例えばＩ−ＳｃｅＩと置き換えることができる。
【０１３７】
Ｉ−ＳｐｏｍＩを他の酵素、例えばＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＩ−ＤｍｏＩと組み合わせて用いることができる。例えば、米国特許第５，４７４，８９６号を参照されたい。例えば、１つまたはそれ以上のＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位および１つまたはそれ以上のグループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼ部位（例えばＩ−ＳｃｅＩ部位）を含有する組換え染色体または細胞を構築することができる。別の実施態様では、１つまたはそれ以上のＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位および１つまたはそれ以上のグループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼ部位（例えばＩ−ＳｃｅＩ部位）を含有するトランスジェニックマウスを構築することができる。部位は、同一または異なる染色体座でよい。
【０１３８】
Ｉ−ＳｐｏｍＩを他の酵素、例えばＩ−ＳｃｅＩと組み合わせて用いてインビボ組換えを促進することができる。例えばＩ−ＳｐｏｍＩおよびＩ−ＳｃｅＩを発現する１つの発現ベクター、または酵素を発現する２つの別個の発現ベクターを用いて、これらの酵素の双方の発現を細胞に導入することができる。これらの酵素の発現により、２本鎖切断をゲノムの異なる部分に同時に、または連続的に導入することが可能になる。この研究法を用いて、例えばひと続きのＤＮＡを欠失させるか、または複数の組換え事象を促進させることができる
【０１３９】
本明細書に引用したすべての参考文献のすべての開示は参照として本明細書に組み入れられる。
【０１４０】
生物の寄託
ＯＲＦ Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミドは、２００１年３月６日、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)、25、Rue du Docteur Roux75724、パリ、Cedex 15、フランスに受入番号Ｉ−２６４３のもとに寄託されている（参照同定：大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／ｐＳＰ００３）。
本発明は以下の実施例を参照することで更に完全に理解されよう。
【実施例１】
【０１４１】
Ｉ−ＳｐｏｍＩの発現のためのプラスミドの構築および活性アッセイ
大腸菌（E.coli）におけるＩ−ＳｐｏｍＩの発現のために、分裂酵母（S.pomb）Ｘ３９株ゲノムＤＮＡ（４７）から増幅した種々のＰＣＲフラグメントを、発現ベクターｐＥＴ１６ｂ（Novagen、マジソン）にクローン化した。発現されたタンパク質をＮ末端１０ｘＨｉｓタグと融合してさらなる精製を容易にした。３つの組換えプラスミドを構築した（図１）；（ｉ）プラスミドｐＳＰ００１は、ｃｏｘ１Ｅ１のイニシエーターＡＴＧコドンからｃｏｘ１Ｉ１ｂ（プライマーＳＰ００１ｍ：５′−ＧＣＡＣＧＣＡＴＧＴＣＡＴＡＴＧＧＴＣＴＴＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＴＧ−３′［配列番号：１］、プライマーＳＰ００２ｍ：５′−ＧＣＧＴＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧＴＧＡＴＡＣＴＴＧＡＴＡＧＴＧＧＴＧＧ−３′［配列番号：２］）の配列内停止コドンまでのすべてのオープン・リーディグ・フレームに対応する５２０コドンのフラグメントを含有する。（ii）プラスミドｐＳＰ００３は、２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフ（プライマーＳＰ００２ｍと一緒に、プライマーＳＰ００３ ５′−ＧＡＧＡＧＣＧＣＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＧＡＣＡＴＣＣ−３′［配列番号：３］）を含むイントロン２次構造のループ８（図１Ａ）に位置する３０４コドンをカバーする最短のインサートを含有する。（iii）プライマーＳＰ００５をプライマーＳＰ００２と共に用いて第３のプラスミドｐＳＰ００５を構築し、ｃｏｘ１Ｉ１ｂ ＯＲＦ（プライマーＳＰ００２ｍと一緒に、プライマーＳＰ００５：５′−ＧＣＡＴＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＡＡＡＧＣＣＧＣＡＧＡＣＡＡＡＡＴＴＧ−３′［配列番号：４］）の全配列をカバーする３８６コドンの生成物を得た。各々のプラスミドを発現宿主大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen、マジソン）に形質転換した。
【０１４２】
プラスミドｐＰ３Ｅ５−２（４８）をＩ−ＳｐｏｍＩ切断部位を決定するための鋳型として、および活性試験のために提供した。このｐＵＣ１８の誘導体は、イントロン不含Ｐ３株（４９）のｃｏｘ１配列のクローン化ｍｔＤＮＡフラグメントを含有する。
【０１４３】
認識部位を特徴づけるために、オリゴヌクレオチドの合成によりイントロン不含遺伝子からのイントロン挿入部位をフランキングする領域の一連の変異体を作製した。各々の変異体は、イントロン挿入部位近くの−１３〜＋１２ヌクレオチド位置までの単一の塩基転換に相当する。アニーリングされた相補的オリゴヌクレオチドを、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII部位を用いてｐＵＣ１９にクローン化した。別のＥｃｏＲＶ部位をオリゴヌクレオチド配列に組み込み、適切な組換え分子をスクリーニングした。各々のライゲーション実験の２つの別個のクローンを試験で用いて、２本鎖における切断反応を実施した。
【実施例２】
【０１４４】
エンドヌクレアーゼの発現および精製
Novagen，マジソンにより提供されるＴ７発現系を用いて組換えタンパク質を発現した。ｐＳＰ００３で形質転換した大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの前培養を、ＬＢ培地５０ml中アンピシリン（１００μg/ml）およびクロラムフェニコール（３４μg/ml）と共に３７℃で一晩増殖させ、次いで新鮮な予め加温した同一組成の培地３ｌ中１００倍希釈した。細胞を３７℃でＯＤ600が０．６〜０．８になるまで成長させた後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより発現を誘導した。誘導の後、細胞を更に３時間、ＯＤ600が２．３〜２．８になるまで増殖させ、収穫し、水で洗浄し、そして一定分量を−７０℃で保存した。精製用に、主培養物１ｌから細胞を収穫した。細胞を使用する直前にペレットを氷上で解凍し、そしてプロテアーゼインヒビター（ペファブロック １μg/ml、アプロチニン ２μg/ml、ロイペプチン ０．５μg/ml、ペプスタチン １μg/ml）を含む溶解バッファー ３０ml（ＨＥＰＥＳ ３０mM pH８、ＮａＣｌ ３００mM、イミダゾール ２０mM）に再懸濁した。後続の精製工程すべてを４℃で実施した。細胞破壊は、フレンチ・プレスを用いて実施し、そして続いて粗製ホモジネートをBeckman JA２５．５０ローター中４００００ｘｇで４５分間遠心した。即座に上澄をデカンテーションし、Ｎｉ2+で荷電したＨｉＴｒａｐキレーティング・アフィニティ・カラム（Amersham Pharmacia Biotech、リトルチャルフォント）１mlに負荷した。アフィニティカラムを用いる精製工程をAkta Purifier（Amersham Pharmacia Biotech、リトルチャルフォント）で実施した（図２）。溶出工程の後に酵素が存在する溶出バッファーを、Micro Bio-Spinサイズ排除カラム（BioRad、ヘルクレス）を用いてジエタノールアミン １００mM、pH９．０に変えた。最終容量の５０％までグリセロールを添加した後、タンパク質を−２０℃で保存し、そしてBio-Rad Bradford（BioRad、ヘルクレス）タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１４５】
精製を実証し、そして発現されたＩ−ＳｐｏｍＩのバンドを同定するために、手順の様々な段階でサンプルを採取し、そしてＳＤＳ−１２％ ポリアクリルアミドゲルに流した。その後、（５０）にしたがってセミドライトランスファーセル（BioRad、ヘルクレス）を用いて、それをニトロセルロース膜に移した。次いで膜を粉乳 ２％を含有するＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １０mM（pH８．０）、ＮａＣｌ １５０mM、Tween20 ０．５％および脱脂粉乳２％）中３７℃で１時間膜をインキュベートした。その後、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたＨｉｓタグに対する抗体をＴＢＳＴ乳溶液中１：４５００で希釈し、そして膜を３７℃で１時間インキュベートした。次いでこれをＴＢＳＴで２回およびＰＢＳで１回洗浄した（５０）。ＥＣＬキット（Amersham Pharmacia Biotech、リトルチャルフォント）のマニュアルにしたがって、ＨＲＰ活性の検出を実施した。ＩＰＴＧでの誘導（粗製ホモジネート、溶解細胞、遠心後の上澄、ピークおよびピーク以外の流動画分）の前または後に異なるサンプルを採取した。最初の１５画分の各々のサンプルをＳＤＳ−１２％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、そしてCoomassieブリリアントブルーＲ２５０で染色して、他の存在するタンパク質に相対して最高の比率で発現した酵素を含む画分を同定した。
【０１４６】
交雑におけるイントロンｃｏｘ１Ｉ１ｂのホーミングを示す以前の実験から（４７、４８）、イントロンｃｏｘ１Ｉ１ｂの生成物は、エンドヌクレアーゼ活性を有していると推定された。エクソン部分を含むリーディグ・フレーム全体が機能的タンパク質に必須であるかどうかは不明であったので、イントロンおよびエクソン配列を含むＯＲＦ全体、または単純にイントロン全体およびＲＮＡ２次構造のループ８に相当する領域を発現させた（図１）。ミトコンドリアイントロンのリーディグ・フレームがユニバーサルでないコードを用いて翻訳されるたいていのその他の場合と対照的に、このイントロンＯＲＦは、ＵＧＡコドンを全く含まない（４５）。したがって遺伝子の配列におけるいずれかのヌクレオチドを変化させる必要はなかった。
【０１４７】
時間経過実験で大腸菌（E.coli）において発現を検定し、そして最も小さなＯＲＧの遺伝子産物の最高の発現が誘導後３時間であることが見出された（データは示していない）。したがって、ｐＳＰ００３と称される発現プラスミドで進めることに決定した。細胞溶解後の可溶性画分は、エンドヌクレアーゼ活性を含有する（後記で示すように）。この画分で、Ｈｉｓタグ抗体を用いるウェスタンブロット実験においても検出可能な２つの主要なバンドを見出した。より強いバンドの大きさは融合遺伝子産物の推定される分子量（３８．７kDa）に従い、可能な分解産物としておよそ３０kDaの大きさの弱いバンドを伴う（図２Ｂ、Ｃ）。Ｎｉカラムでの単一の精製工程からの典型的な溶出プロファイルを図２Ａに示す。タンパク質ピークは、いつも強い核酸シグナルと同時溶出される。Bradfordアッセイは、全タンパク質濃度０．３μg/μlを示した。全体の約３分の１に相当する３８．７kDaの主要なタンパク質バンドで、Ｉ−ＳｐｏｍＩの濃度がおよそ０．１μg/μlであると見積もられた。調製物をジエタノールアミン １００mM（pH９．０）／５０％ グリセロール中−２０℃で保存し、そしてこれらの条件が数ヶ月間安定してエンドヌクレアーゼ活性を保持することが示された。
【実施例３】
【０１４８】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ切断部位の決定
エクソンｃｏｘ１Ｅ１およびｃｏｘ１Ｅ２の配列の接合部での推定されるホーミング部位を含む短いＰＣＲ産物でＩ−ＳｐｏｍＩでの切断パターンの決定を実施した。センス鎖ＳＰ００９のプライマー（５′−ＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＴＡＡＴＴＴＣＡＣＡＴＴＣ−３′［配列番号：５］）は、イントロン挿入部位に相対して−１００の位置でアニーリングした。相補鎖のプライマーＳＰ００８（５′−ＡＴＧＣＡＡＡＴＡＡＴＧＧＣＡＴＴＴＧＡＴＡＴ−３′［配列番号：６］）およびＳＰ０１０（５′−ＡＡＴＴＴＡＣＴＧＡＴＣＣＴＡＡＴＧＴＴＧＡＴ−３′［配列番号：７］）は、各々下流の＋１７３ヌクレオチド、＋１２９ヌクレオチドにハイブリダイズした（図３Ａ）。ＰｓｔＩで直線化したプラスミドｐＰ３Ｅ５−２（４８）は切断部位を決定するためのＤＮＡ材料を調製するためにＰＣＲの鋳型として提供された。材料をシュリンプアルカリ性ホスファターゼおよびエクソヌクレアーゼＩと反応させ、過剰のヌクレオチドおよびプライマーを除去し、次いで変性させた。このように調製したＰＣＲ産物を鋳型として用いてサイクルシークエンシング（Thermo Sequenaseサイクルシークエンシングキット、ＵＳＢ、マイルスロード）および５′−末端標識プライマーＳＰ００９またはＳＰ００８／ＳＰ０１０を用いてＤＮＡシークエンシングラダーを作製した。また鋳型として５′−末端標識プライマーを用いて、プラスミドｐＰ３Ｅ５−２（４８）のＰＣＲ増幅によりＩ−ＳｐｏｍＩのための単一の末端標識基質を生成した。切断の前にAmicon Microcon ＰＣＲ遠心フィルター装置（Millipore、ベッドフォード）によりマニュアルにしたがって、ＤＮＡフラグメントを組み込まれていないデオキシヌクレオチドおよび放射性オリゴヌクレオチドから精製し、続いてフェノール抽出および沈殿を行った。最後にＰＣＲ産物を水１５μlに再懸濁した。Ｉ−ＳｐｏｍＩでの消化を全反応容量 ２５μl（エンドヌクレアーゼ調製物 ６μl、ジエタノールアミン １００mM（pH９．０）、ＭｇＣｌ2 ２．５mM、溶解したＰＣＲ産物１μl）中３７℃で１０分間実施した。１０ｘ停止溶液（（５１）にしたがって、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ０．１Ｍ（pH７．５）、ＥＤＴＡ ０．２５Ｍ、ＳＤＳ ５％、プロテイナーゼＫ ０．５mg/ml）０．１容量添加することにより反応を停止させ、そして５０℃に１５分間、そして９５℃に上げて３分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化した。フェノール抽出によりプロテイナーゼＫを除去し、そしてサンプルを沈殿させた。未消化サンプルを対照としてＩ−ＳｐｏｍＩの不在下で処理した。エンドヌクレアーゼ消化の後、ＰＣＲ産物をＤＮＡシークエンシング反応と平行して実行した。Sequenazeキットと共に供給された停止溶液を添加した後７５℃で２分間、すべてのサンプルを変性させ、そして６％ ポリアクリルアミド／５０％ 尿素ゲル上で分離した。続いてゲルを乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーフィルムまたはPhosphor Imagerスクリーン（Molecular Dynamics、サニーベール）にそれぞれ−７０℃でまたは２５℃で一晩焼き付けした。結果の評価をImage Quant 5.0ソフトウェアで実施した。
【０１４９】
材料および方法で記載されている分裂酵母（S.pombe）Ｐ３株（４４）のｃｏｘ１遺伝子の連続配列内のイントロン挿入部位をフランキングする領域に相当する５′末端標識ＰＣＲ産物を用いてＩ−ＳｐｏｍＩの切断パターンを決定した。ＤＮＡをＩ−ＳｐｏｍＩで消化し、そしてシークエンシングゲル上で分離した（図３）。各々のＤＮＡ鎖は、Ｉ−ＳｐｏｍＩでの消化の後、強いシグナルを示し、これは切断されていないＤＮＡでは存在しない。同一ＤＮＡフラグメントのシークエンシングラダーと比較して、切断位置は、正確に局在した。これにより、切断は、センス鎖のイントロン挿入部位の２ｂｐ下流で生じ、下方の鎖の２ｂｐが４ヌクレオチドの３′オーバーハングを作製する。この切断パターンは、他のホーミングエンドヌクレアーゼから周知である。Ｉ−Ｃｒｅｌ（１７）、Ｉ−ＳｃｅＩ（１６）およびII（３７）、Ｉ−ＣｅｕＩ（３０）およびＩ−ＤｍｏＩ（２０）のようなドデカペプチドファミリーのメンバーに関して、ならびにＨｉｓ−Ｃｙｓ Ｂｏｘ／ββα−Ｍｅタンパク質Ｉ−ＰｐｏＩ（５３）に関して報告されている。
【実施例４】
【０１５０】
活性試験
プライマーＳＰ００９および前のパラグラフで記載した放射性標識プライマーＳＰ００８を用いるＰＣＲにより、Ｉ−ＳｐｏｍＩの基質が得られた。エンドヌクレアーゼ切断のための標準的な条件は全容量２５μl中ジエタノールアミン １００mM（pH９．０）、ＭｇＣｌ2 ０．５mM、ＮａＣｌ １００mM、水 １５μl中精製されたＰＣＲ産物１μlおよび最終的に調製されたエンドヌクレアーゼ５μlであった。反応物を３７℃で２０分間インキュベートした。ＭｇＣｌ2濃度は、１mM〜４０mMまで変化し、ＮａＣｌは、０mM〜２００mMまで変化した。温度の影響を２５℃〜６５℃の間でモニター観察した。試験したpH値は、pH６．０（ＭＥＳ ３０mM）、pH７．０、pH８．０（ＨＥＰＥＳ １００mM）およびpH９．０〜１０．０（ジエタノールアミン １００mM）の範囲であった。前記したように反応を停止させた。これを５％ ポリアクリルアミド／５０％ 尿素ゲル上で分離した。これを流した後、ゲルを１０％ 酢酸／２０％ エタノールの溶液に浸し、ワットマン 3MMペーパー（ワットマン、メイドストン）上に載せ、そして乾燥させた。Phosphor Imager スクリーン（Molecular Dynamics、サニーベール）に乾燥したゲルを２５℃で２．５時間焼き付けし、結果を前記したソフトウェアで定量化した。
【０１５１】
他のホーミングエンドヌクレアーゼの活性に影響する公知のパラメーターは、溶液の１価（Ｎａ+およびＫ+）および２価カチオン（Ｍｇ2+およびＭｎ2+）の濃度、温度およびプロトン濃度である。Ｉ−ＳｐｏｍＩの活性のための最適条件を決定するために、Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性アッセイのための基質として、イントロン挿入部位（図３Ａ）に相対して−１００ｂｐ（ＳＰ００９）〜＋１７３ｂｐ（ＳＰ００８）位置にわたるＰＣＲ産物を使用する。アッセイに関しては、プライマーの１つを［γ−32Ｐ］−ＡＴＰで５′末端標識した。ＳｐｏｍＩによる切断により１７３ｂｐの長さのより小型の検出可能なバンドが作製されるはずである。その他のすべての公知のホーミングエンドヌクレアーゼに関して以前から報告されているように、Ｉ−ＳｐｏｍＩの切断能力にＭｇ2+が必須であることが見出された。Ｍｇ2+の不在下では、活性は検出されない（示していない）。最適Ｍｇ2+濃度は５mM〜７．５mMの範囲である（図４Ａ）。より低いまたは高い濃度は、酵素活性には不利である。Ｉ−ＳｐｏｍＩには、Ｎａ+が必要であるが、許容される濃度範囲は広くなる（図４Ｂ）。２５℃〜６５℃の異なる温度での基質の切断は、４２℃で明らかに最適であった（図４Ｃ）。３０℃およびそれより低い温度では、ほとんど活性が見出されなかった。Ｉ−ＳｐｏｍＩは、６５℃まで活性である。プロトン濃度の影響は、明らかにＩ−ＳｐｏｍＩのアルカリ性pH条件への嗜好性を示した（図４Ｄ）。６．０〜８．０の間のpH値では、切断されたＤＮＡの量は、約３０％の低レベルに留まったが、pH９．０およびそれより高い値では、切断は、８５％まで上昇した。
【０１５２】
Ｉ−ＳｃａＩ（４３）に関しては、最適切断条件は以下のように報告されている：Ｍｇ2+ ８mM、Ｎａ+ 約５０mM、２８℃〜４０℃の間の温度、８．５〜９．０の間のpH。高温およびアルカリ性pH値の嗜好性は、Ｉ−ＳｃｅＩ（２９）およびIII（５４）に非常に類似しており、双方共に細菌内で発現される。対照的に酵母ミトコンドリアから抽出されるＩ−ＳｃｅII（１９）は、中性pHおよびおよそ３０℃の温度を好む。
【実施例５】
【０１５３】
認識配列の決定
前記したように、イントロンｃｏｘ１Ｉ１ｂの挿入部位近くの−１３〜＋１２位置までのヌクレオチド配列を含有するプラスミドを使用した（図５Ａ参照）。混合物を９５℃で３分間変性し、そして４℃までゆっくりと冷却した後、相補的オリゴヌクレオチドをＮＥＢｕｆｆｅｒ２（New England Biolabs、ベバリー）中でアニーリングした。これをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII消化ｐＵＣ１９にクローン化した。組換えプラスミドを大腸菌（E.coli）ＤＨ１０Ｂ株内でエレクトロポレーションにより形質転換し、そしてその後、アルカリ性プラスミド調製物のＥｃｏＲＶ／ＸｍｎＩ消化により検査した（５０）。ＱＩＡフィルターチップ１００プロトコル（QLAGEN、ヒルデン）にしたがってＬＢＡ４０mlの培養物から組換えプラスミドのＤＮＡを調製した。調製したプラスミドの濃度を０．３μg/μlに調整した。プラスミドをＩ−ＳｐｏｍＩに暴露する前に、ＮｄｅＩおよびＡｌｗＮＩで３７℃で３時間消化し、続いて６５℃で２０分間処理し、沈殿させ、そして最終濃度０．１μg/mlになるまで水に溶解した。Ｉ−ＳｐｏｍＩ消化を容量５０μl（ＤＮＡ ２５０ｎｇ、ジエタノールアミン １００mM（pH９．６）、ＭｇＣｌ2 ５mM、ＮａＣｌ １００mM、Ｉ−ＳｐｏｍＩ ５μl）で実施した。停止溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ０．１Ｍ（pH７．５）、ＥＤＴＡ ０．２５Ｍ、ＳＤＳ ５％）０．１容量を添加し、そして６５℃で３分間インキュベートして消化を停止させ、続いてフェノール抽出および沈殿を行った。消化産物を水１０μlに再懸濁し、そしてアガロースゲル ０．８％上で分離した。泳動後、ゲルを臭化エチジウム ０．５μg/μlで染色し、そしてＤＮＡを真空ブロットによりＨｙｂｏｎｄ−Ｎ+ナイロン膜（Amersham Pharmcia Biotech、リトルチャルフォント）に移した。移した後、膜をハイブリダイゼーションバッファー（リン酸バッファー ０．２５Ｍ、ＳＤＳ ７％、ＥＤＴＡ １mM、ＢＳＡ １％）中６５℃で１．５時間プレハイブリダイズし、次いでプローブとしてランダム標識ｐＵＣ１９を用いて一晩ハイブリダイズした（５２）。シンチレーションカウンターで最終プローブ調製物１μlアリコート中の標識の組み込みを決定した。ハイブリダイゼーションの後、プローブを含有するバッファーを除去し、膜をハイブリダイゼーションバッファーで６５℃で洗浄し、そしてPhosphor Imager スクリーン（Molecular Dynamics、サニーベール）に２５℃で２．５時間焼き付けし、そして結果を前記したように記述した。
【０１５４】
Ｉ−ＳｐｏｍＩの認識部位の範囲を決定するために、イントロン挿入部位をフランキングする−１３〜＋１２の領域に一度に１つの塩基転換を導入することにより変異された配列を合成した。材料および方法に記載するように変異アレルを合成することによりこれを行った。プラスミドのＮｄｅｌおよびＡ１ｗＮＩでの消化の結果、それぞれ１６５２ｂｐおよび１０４１ｂｐの２つのバンドになり、最も小型のものは、Ｉ−ＳｐｏｍＩ切断部位を含有する。Ｉ−ＳｐｏｍＩによるこのフラグメントの消化により８０１ｂｐおよび２４０ｂｐの２つのバンドを生じ、これを図５Ａに示す。異なる変異体の切断実験の結果を図５Ａの囲み「切断」および「％」にまとめる。−１１、−１０、−８〜−４、＋２〜＋６、＋８および＋９は、Ｉ−ＳｐｏｍＩによる基質認識に必須である。−４および＋２位置でのヌクレオチドの塩基転換は、ほぼ完全に切断を無効にする。中央の位置−３〜＋１まで、および−９および＋７の位置の配列の縁でのいくつかのヌクレオチドにおける変化は、認識事象に影響しない。このように部位の範囲は、全部で２０ｂｐである。これらの２０ｂｐ内では、１４個のみがＩ−ＳｐｏｍＩ特異性に必須である。
【０１５５】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：８のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む単離されたＤＮＡ配列であって、ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】
配列番号：９のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む単離されたＤＮＡ配列であって、Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項３】
請求項１または２のヌクレオチド配列に相補的な単離されたＲＮＡ。
【請求項４】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素の発現を指示する発現ベクター。
【請求項５】
上記ベクターが、哺乳動物細胞において上記酵素を発現する、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
上記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項５記載のベクター。
【請求項７】
上記ベクターが、昆虫細胞において上記酵素を発現する、請求項４記載のベクター。
【請求項８】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ制限部位を含むベクター。
【請求項９】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位を含む組換え染色体。
【請求項１０】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位を含む組換え細胞。
【請求項１１】
上記染色体が、真核または原核生物に由来する、請求項９記載の組換え染色体。
【請求項１２】
上記細胞が、真核または原核生物に由来する、請求項１０記載の組換え細胞。
【請求項１３】
更にグループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼ部位を含む、請求項１０記載の細胞。
【請求項１４】
上記グループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼ部位が、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩおよびＩ−ＳｃｅＩ部位から選択される、請求項１３記載の細胞。
【請求項１５】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする核酸を含む組換え染色体。
【請求項１６】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする核酸を含む組換え細胞。
【請求項１７】
上記染色体が、真核または原核生物に由来する、請求項１５記載の組換え染色体。
【請求項１８】
上記細胞が、真核または原核生物に由来する、請求項１６記載の組換え細胞。
【請求項１９】
上記染色体が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫生物に由来する、請求項１１または１７記載の組換え染色体。
【請求項２０】
上記細胞が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫生物に由来する、請求項１２または１８記載の組換え細胞。
【請求項２１】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位を含む組換え染色体を含むトランスジェニック生物。
【請求項２２】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする核酸を含むトランスジェニック生物。
【請求項２３】
上記生物が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫生物である、請求項２１または２２記載のトランスジェニック生物。
【請求項２４】
（ａ）少なくとも１つのＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位を含む２本鎖ＤＮＡを含有する細胞を提供すること；
（ｂ）Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼを有する細胞を提供すること；および
（ｃ）少なくとも１つの２本鎖切断が誘導されている細胞を選択すること；
を含む、細胞のＤＮＡにおいて少なくとも１つの部位指定２本鎖切断を誘導する方法。
【請求項２５】
上記細胞が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫細胞である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）少なくとも１つのＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位を含む染色体ＤＮＡを含有する細胞を提供すること；
（ｂ）上記細胞にＩ−ＳｐｏｍＩ酵素および外来性ＤＮＡを提供すること；および
（ｃ）上記外来性ＤＮＡが、上記染色体ＤＮＡに挿入されている細胞を選択すること；
を含む、細胞の染色体ＤＮＡおよび上記細胞に加えられた外来性ＤＮＡ間で相同組換えを誘導する方法。
【請求項２７】
上記細胞が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫細胞である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）少なくとも１つのＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位および少なくとも１つのさらなるグループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼ部位を含むＤＮＡを含有する細胞を提供すること；
（ｂ）Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼおよびグループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼを有する細胞を提供すること；および
（ｃ）少なくとも２つの２本鎖切断が誘導されている細胞を選択すること；
を含む、細胞のＤＮＡにおいて少なくとも１つの部位指定２本鎖切断を誘導する方法。
【請求項２９】
上記グループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼが、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩおよびＩ−ＳｃｅＩ部位から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
上記細胞が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫細胞である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項３２】
上記ベクターが、受入番号Ｉ−２６４３のもとでＣＮＣＭに寄託されているプラスミドである、請求項３２記載のベクター。
【請求項３３】
配列番号：１１のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号：１２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項１】
配列番号：８のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む単離されたＤＮＡ配列であって、ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項２】
配列番号：９のヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む単離されたＤＮＡ配列であって、Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項３】
請求項１または２のヌクレオチド配列に相補的な単離されたＲＮＡ。
【請求項４】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素の発現を指示する発現ベクター。
【請求項５】
上記ベクターが、哺乳動物細胞において上記酵素を発現する、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
上記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項５記載のベクター。
【請求項７】
上記ベクターが、昆虫細胞において上記酵素を発現する、請求項４記載のベクター。
【請求項８】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ制限部位を含むベクター。
【請求項９】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位を含む組換え染色体。
【請求項１０】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位を含む組換え細胞。
【請求項１１】
上記染色体が、真核または原核生物に由来する、請求項９記載の組換え染色体。
【請求項１２】
上記細胞が、真核または原核生物に由来する、請求項１０記載の組換え細胞。
【請求項１３】
更にグループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼ部位を含む、請求項１０記載の細胞。
【請求項１４】
上記グループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼ部位が、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩおよびＩ−ＳｃｅＩ部位から選択される、請求項１３記載の細胞。
【請求項１５】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする核酸を含む組換え染色体。
【請求項１６】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする核酸を含む組換え細胞。
【請求項１７】
上記染色体が、真核または原核生物に由来する、請求項１５記載の組換え染色体。
【請求項１８】
上記細胞が、真核または原核生物に由来する、請求項１６記載の組換え細胞。
【請求項１９】
上記染色体が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫生物に由来する、請求項１１または１７記載の組換え染色体。
【請求項２０】
上記細胞が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫生物に由来する、請求項１２または１８記載の組換え細胞。
【請求項２１】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ部位を含む組換え染色体を含むトランスジェニック生物。
【請求項２２】
Ｉ−ＳｐｏｍＩ酵素をコードする核酸を含むトランスジェニック生物。
【請求項２３】
上記生物が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫生物である、請求項２１または２２記載のトランスジェニック生物。
【請求項２４】
（ａ）少なくとも１つのＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位を含む２本鎖ＤＮＡを含有する細胞を提供すること；
（ｂ）Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼを有する細胞を提供すること；および
（ｃ）少なくとも１つの２本鎖切断が誘導されている細胞を選択すること；
を含む、細胞のＤＮＡにおいて少なくとも１つの部位指定２本鎖切断を誘導する方法。
【請求項２５】
上記細胞が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫細胞である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
（ａ）少なくとも１つのＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位を含む染色体ＤＮＡを含有する細胞を提供すること；
（ｂ）上記細胞にＩ−ＳｐｏｍＩ酵素および外来性ＤＮＡを提供すること；および
（ｃ）上記外来性ＤＮＡが、上記染色体ＤＮＡに挿入されている細胞を選択すること；
を含む、細胞の染色体ＤＮＡおよび上記細胞に加えられた外来性ＤＮＡ間で相同組換えを誘導する方法。
【請求項２７】
上記細胞が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫細胞である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）少なくとも１つのＩ−ＳｐｏｍＩ制限部位および少なくとも１つのさらなるグループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼ部位を含むＤＮＡを含有する細胞を提供すること；
（ｂ）Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼおよびグループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼを有する細胞を提供すること；および
（ｃ）少なくとも２つの２本鎖切断が誘導されている細胞を選択すること；
を含む、細胞のＤＮＡにおいて少なくとも１つの部位指定２本鎖切断を誘導する方法。
【請求項２９】
上記グループＩイントロンコード化エンドヌクレアーゼが、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩおよびＩ−ＳｃｅＩ部位から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
上記細胞が、哺乳動物、昆虫、菌類、植物、酵母、細菌または線虫細胞である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項３２】
上記ベクターが、受入番号Ｉ−２６４３のもとでＣＮＣＭに寄託されているプラスミドである、請求項３２記載のベクター。
【請求項３３】
配列番号：１１のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号：１２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む単離されたポリペプチドであって、Ｉ−ＳｐｏｍＩエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−１６２０４１（Ｐ２０１０−１６２０４１Ａ）
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−６０４０９（Ｐ２０１０−６０４０９）
【出願日】平成２２年３月１７日（２０１０．３．１７）
【分割の表示】特願２００２−５７４３５５（Ｐ２００２−５７４３５５）の分割
【原出願日】平成１４年３月１２日（２００２．３．１２）
【出願人】（５９３２１８４６２）インスティチュート・パスツール (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５９６０７６５７３）
【復代理人】
【識別番号】１００１４７５３３
【弁理士】
【氏名又は名称】岡崎 祐一
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−６０４０９（Ｐ２０１０−６０４０９）
【出願日】平成２２年３月１７日（２０１０．３．１７）
【分割の表示】特願２００２−５７４３５５（Ｐ２００２−５７４３５５）の分割
【原出願日】平成１４年３月１２日（２００２．３．１２）
【出願人】（５９３２１８４６２）インスティチュート・パスツール (19)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＰＡＳＴＥＵＲ
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５９６０７６５７３）
【復代理人】
【識別番号】１００１４７５３３
【弁理士】
【氏名又は名称】岡崎 祐一
【Ｆターム（参考）】
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