刺激応答型遺伝子スイッチ
【課題】より精度の高い遺伝子発現の「オン」及び／又は「オフ」制御が可能なスイッチを提供することを一つの目的真核細胞を提供する。
【解決手段】ガラクトース誘導系を備えるとともに、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域を備え、プロモーターと、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含む、第２のＤＮＡ領域と、を備える、遺伝子の発現の切替えするための遺伝子スイッチを備える真核細胞を提供する。
【解決手段】ガラクトース誘導系を備えるとともに、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域を備え、プロモーターと、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含む、第２のＤＮＡ領域と、を備える、遺伝子の発現の切替えするための遺伝子スイッチを備える真核細胞を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現のオン・オフのスイッチング技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現のオン・オフを所望のタイミングでスイッチングすることができれば、遺伝子機能の解明や新規な薬剤の開発、毒性の高いタンパク質や化学物質の生産が可能になる、と考えられている。そこで、ゲノム上のＤＮＡを改変して、遺伝子発現のオン・オフを行う技術が検討されてきている。
【０００３】
例えば、Ｇａｌプロモーターを利用して遺伝子組換え酵素Creを発現させることを利用した技術がある(特許文献１)。また、CreなどのＤＮＡ組換え酵素を、タンパ、低分子リガンドを細胞に取り込ませることにより、ＤＮＡ組換え酵素活性を有する技術も知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６２−１７５１８４号公報
【特許文献２】特表２００２−５３９８３９号公報
【特許文献３】特表２０００−５０６２９８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nature Methods(2006), 3, 461-467
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１に開示される技術では、遺伝子の発現を「オフ」できるものの「オン」することはできなかった。また、「オフ」にも、酵母において２４時間を要していた。上記特許文献２及び非特許文献１に開示される技術では、遺伝子の「オン」「オフ」が可能であるが、精製した組換え酵素タンパク質が大量に必要となるため、莫大なコストを要する。また、「オフ」には２４時間を要していた。さらに上記特許文献３に記載の技術は、遺伝子発現の「オン」「オフ」が可能であるが、いずれも数日を要するものであった。
【０００７】
このように、外部からのシグナルで、遺伝子の発現の「オン」「オフ」をスイッチングすることはある程度可能であるというものの、シグナルの付与から現実的な遺伝子発現の「オン」「オフ」の精度は高くなかった。例えば、細胞集団に対して「オン」のシグナルを付与しなくても、いくらかの細胞では遺伝子発現が「オン」になってしまったり、反対に細胞集団に「オン」のシグナルを付与しても、いくらかの細胞は「オン」しなかったりすることがあった。このように、細胞の同調性という観点からの精度が低かった。また、遺伝子の「オン」「オフ」には、それぞれ相当の時間を要するものであった。
【０００８】
そこで、本明細書の開示は、より精度の高い遺伝子発現の「オン」及び／又は「オフ」制御が可能なスイッチを提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｇａｌ誘導系を遺伝子の発現のスイッチングに用い、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でＤＮＡ組換えタンパク質の発現を制御することで、より精度の高い、すなわち、同調性に優れる遺伝子発現のスイッチングに成功した。また、Ｇａｌ誘導系を改変することによってより迅速なスイッチングにも成功した。こうした知見によれば、以下の手段が提供される。
【００１０】
本明細書の開示によれば、ガラクトース誘導系を備えるとともに、グルコースによる抑制効果が増強されたＧＡＬ１プロモーター等のガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域と、プロモーターと、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含む、第２のＤＮＡ領域と、を備える、遺伝子の発現の切替えするための遺伝子スイッチを備える真核細胞が提供される。
（ａ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下から外れ発現停止となる
（ｂ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下で発現可能となる
【００１１】
前記真核細胞においては、前記ガラクトース誘導性プロモーターは、２個以上のＭｉｇ１結合配列を有していてもよい。また、前記ガラクトース誘導性プロモーターは、配列番号２で表される塩基配列を有するものであってもよい。
【００１２】
前記第１のＤＮＡ領域は、前記ＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡの転写産物の寿命をＣＹＣ１遺伝子のターミネーターよりも短くすることができるターミネーターを備えていてもよい。さらに、前記ターミネーターは、ＭＦＡ２遺伝子のターミネーターであってもよい。
【００１３】
前記第２のＤＮＡ領域は、前記条件（ａ）で配置される遺伝子を第１の遺伝子として備えるとともに、前記条件（ｂ）で配置される遺伝子を第２の遺伝子として備えることができる。
【００１４】
前記真核細胞は、Ｇａｌ１タンパク質及び／又はＧａｌ２タンパク質の発現が増強されているものであってもよい。また、前記真核細胞は、前記第１のＤＮＡ領域及び前記第２のＤＮＡ領域を、前記細胞の染色体上に備えるものであってもよい。さらに、前記真核細胞は、酵母細胞とすることができる。
【００１５】
本明細書の開示によれば、また、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域を備える、遺伝子発現のスイッチング用真核細胞材料も提供される。
【００１６】
本明細書の開示によれば、遺伝子の発現の切替えするための遺伝子スイッチングカセットであって、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域を、備える、カセットが提供される。
【００１７】
本明細書の開示によれば、遺伝子発現スイッチング用材料であって、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域と、プロモーターと、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含む、第２のＤＮＡ領域と、を１又は２以上のベクター上に備える、材料が提供される。
（ａ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下から外れ発現停止となる
（ｂ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下で発現可能となる
【００１８】
前記遺伝子発現スイッチング用材料においては、前記１又は２以上のベクターは、構成的プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＧａｌ１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、構成的プロモーターの制御下の発現可能に連結されるＧａｌ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、備えるものであってもよい。
【００１９】
本明細書の開示によれば、ガラクトースを用いた遺伝子発現のスイッチング方法であって、上記いずれかに記載の細胞に対してガラクトースを供給して、前記第２のＤＮＡ領域の前記遺伝子の発現をスイッチングする工程を備える、方法が提供される。前記スイッチング工程は、一時的にのみガラクトースを供給する工程であってもよい。
【００２０】
本明細書の開示によれば、有用物質を生産する方法であって、上記いずれかに記載の細胞であって前記有用物質を生産する細胞に対してガラクトースを供給して、前記第２のＤＮＡ領域の前記遺伝子の発現をスイッチングして、前記有用物質を生産する工程を備える、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本明細書の開示に用いるコンストラクトの概要を示す図である。
【図２】本明細書の開示におけるスイッチングプロセスの一例を示す図である。
【図３】本明細書の開示におけるガラクトース誘導の一例を示す図である。
【図４】コンストラクト１を示す図である。
【図５】コンストラクト２を示す図である。
【図６】コンストラクト３を示す図である。
【図７】実施例５で用いたガラクトース・パルス誘導を従来の誘導方法と対比して示す図である。Ａに、従来の誘導方法を示し、Ｂにガラクトース・パルス誘導を示す。ガラクトース・パルス誘導では、誘導開始後t_1でガラクトースを含まない培地に換え培養を継続する。なお、培養液：a,グルコース液体培地。b,ガラクトース液体培地。c,グルコース液体培地。
【図８】ガラクトース・パルス誘導によるＧＦＰからｍＫＯ２へのスイッチングの顕微鏡観察結果を示す図である。左側は、誘導前のC22株の顕微鏡観察イメージを示し、右側は誘導開始後10時間後のイメージを示す。
【図９】ガラクトース・パルス誘導によるＧＦＰ出力からｍＫＯ２出力へのスイッチングのフローサイトメトリーを示す図である。C22株の出力変化。Ａは、標準株の差分表示を示し、Ｂは、出力重心の移動を示し、Ｃは、誘導前の出力分布を示し、Ｄは誘導開始後10時間の出力分布を示す。軸は出力（FL1/SS及びFL2/SS）の対数で示す。いずれもGFP（緑）、mKO2（赤）。CとDには、標準株における細胞の分布領域を点線でかこって示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書の開示は、遺伝子発現のスイッチングに関し、詳しくは、ガラクトース誘導系を用いた遺伝子発現のスイッチングに関する。本明細書の開示によれば、所望の遺伝子のスイッチングをガラクトースの供給というシグナルに対して良好な精度で行うことができる。すなわち、より良好な同調性で所望の遺伝子のスイッチングが可能となり、さらには、より迅速なスイッチングが可能となる。本明細書の開示におけるかかる効果の発現については、以下の推論が成り立つと考えられる。ただし、以下の推論は本明細書の開示を拘束するものではない。
【００２３】
すなわち、本明細書に開示される、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域を備える真核細胞においては、グルコースの存在下では、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の発現が抑制される。一方、ガラクトースの存在下では、グルコースによる抑制が解除されることにより、ＤＮＡ組換えタンパク質が発現される。この組換えタンパク質が、当該タンパク質の作用部位に作用すると、遺伝子は、その設置条件が上記条件（ａ）のときには、その発現が「オフ」となり、設置条件が上記条件（ｂ）のときには、その発現が「オン」となる。
【００２４】
本明細書に開示される細胞においては、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターを用いているため、ガラクトースの供給に先立つガラクトース誘導性プロモーターの作動が抑制されているため、ＤＮＡ組換えタンパク質の意図しない発現を効果的に抑制できる。結果として、明瞭なスイッチングが可能となっている。さらに、こうしたＤＮＡ組換えタンパク質が、ガラクトースの供給に反応してその作用部位に作用し、その結果、所望の遺伝子を発現させることができる。本明細書の開示によれば、以上の結果、所望の遺伝子のスイッチングをガラクトースの供給というシグナルに対して良好な同調性で行うことができる。
【００２５】
さらに、ＤＮＡ組換えタンパク質の発現量を調整することにより、例えば、その発現量を低くし、あるいはその発現期間を短くすることで、より迅速に所望の遺伝子のスイッチングを行うことが可能となる。また、ガラクトース誘導系において、Ｇａｌ１タンパク質及び／又はＧａｌ２タンパク質の発現を増強することにより、ガラクトースの供給に対する反応性を高めることができる。この結果、より反応性よくＤＮＡ組換えタンパク質を発現させることができる。そして、より迅速に所望の遺伝子のスイッチングを行うことができる。
【００２６】
（遺伝子スイッチを備える真核細胞）
（ガラクトース誘導系）
本明細書に開示される真核細胞は、ガラクトース誘導系を有している。本明細書において、ガラクトース誘導系とは、栄養源としてのガラクトースによって転写活性化されるガラクトース代謝に関連する遺伝子群を意味している。ガラクトース誘導系としては、例えばサッカロマイセス・セレビシエ酵母が備えるＧＡＬ遺伝子群が知られている。サッカロマイセス・セレビシエにおけるＧＡＬ遺伝子群としては、ＧＡＬ４及びＧＡＬ４の遺伝子産物であるＧａｌ４によって正に制御されるＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０が挙げられる。また、同様にＧａｌ４によって正に制御されるＧＡＬ８０、ＧＡＬ３及びＭＥＬ１が挙げられる。なお、ガラクトース誘導系を構成するコンポーネントには、これら構造遺伝子のほか、プロモーターやそのＧａｌ４結合部位などの調節領域が含まれる。
【００２７】
本真核細胞が備えるガラクトース誘導系は、宿主細胞が本来的に有するガラクトース誘導系であることが好ましい。すなわち、宿主細胞としてガラクトース誘導系を有する細胞を用いることが好ましい。こうした細胞は、ガラクトース誘導系を備える細胞であればよく、サッカロマイセス・セレビシエのほか、サッカロマイセス・ポンベ、カルルスベンゲルス、ノルベンシス、ジアストチクス、オビホルミス、ウバルム、ロウキシ、モンタヌス、クルイベリ、エロンギスポルス等の他の種であってもよい。また、ピキア、クルイベロミセス等の他の属の酵母であってもよい。さらに、カンジダ・アルビカンスなどのカンジダ属であってもよい。ガラクトース誘導系を備える真核細胞を宿主細胞として用いることで真核細胞へ導入する外来遺伝子数を抑制できる。
【００２８】
なお、真核細胞の有するガラクトース誘導系は、宿主細胞の内在性遺伝子からなるガラクトース誘導系であってもよいが、一部又は全部が人工的に構築されていてもよい。すなわち、宿主細胞は、ガラクトース誘導系を本来的に有する細胞のほか、ガラクトース誘導系を遺伝子工学的手法により構築された細胞を用いることができる。例えば、ガラクトース誘導系のない宿主細胞にガラクトース誘導系を構築可能な外来遺伝子群を導入したり、ガラクトース代謝能力を有するがガラクトース誘導的でない場合においてガラクトース誘導的に改変したり、宿主のガラクトース誘導系の構造遺伝子や調節領域の一部又は全部を外来性遺伝子で置換したりしてもよい。また、ガラクトース誘導系のコンポーネントは、ガラクトース誘導的にガラクトース代謝が可能である限り、内在性の構造遺伝子や転写調節領域等が改変されていたり、欠損されていたりしてもよい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエのガラクトース誘導系におけるＧａｌ４やＧａｌ８０を改変してＧａｌ４活性タンパク質やＧａｌ８０活性タンパク質を発現するように改変されていてもよい。また、ガラクトース誘導系は、その全てが宿主染色体上にある必要はなく、機能可能に宿主染色体及び／又は宿主染色体外に保持されていればよい。
【００２９】
（第１のＤＮＡ領域）
本真核細胞は、第１のＤＮＡ領域を備えることができる。第１のＤＮＡ領域は、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含んでいる。
【００３０】
（ガラクトース誘導性プロモーター）
第１のＤＮＡ領域に含まれる、ガラクトース誘導性プロモーターとしては、グルコースによる抑制効果を増強可能されたガラクトース誘導性プロモーターであればよい。ガラクトース誘導性プロモーターとしては、ＧＡＬ誘導系遺伝子であるＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０及びＭＥＬ１の各遺伝子のプロモーターが挙げられる。ガラクトース誘導性プロモーターとしては、好ましくは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０のいずれかのプロモーターであり、より好ましくは、ＧＡＬ１プロモーターである。
【００３１】
また、他のガラクトース誘導性プロモーターとしては、ガラクトース代謝遺伝子以外の内在性プロモーター又は外来性プロモーターを改変してガラクトース誘導性プロモーターとして用いることができる。いわゆるガラクトース誘導性プロモーターでないプロモーターであっても、その一部ないしその上流側にＧａｌ４結合部位（Galactose Upstream Activating Sequnce:UASg）を備えることでガラクトース誘導性プロモーターとして機能することはよく知られている。例えば、宿主細胞が本来的に有するプロモーターの上流側にＧａｌ４結合部位を保持させることで該内在性プロモーターをガラクトース誘導性プロモーターとして利用できる。ガラクトース誘導的でない外来性プロモーターについても同様である。こうした内在性プロモーター及び外来性プロモーターとしては、ＣＹＣ１プロモーターを好ましく用いることができる。
【００３２】
こうしたガラクトース誘導性プロモーターは、天然由来の当該プロモーターよりも、グルコースによる抑制効果が増強されている。すなわち、プロモーターグルコースによる抑制効果、すなわち、作動可能に連結される構造遺伝子の転写のグルコースによる抑制効果が増強されている。こうした増強効果は、例えば、Ｍｉｇ１リプレッサーが結合する結合部位を付与あるいは導入することによって得られる。こうしたガラクトース誘導性プロモーターを備えることで、グルコース存在下でのガラクトース誘導性プロモーターの制御下の遺伝子の発現を効果的に抑制できる。
【００３３】
なお、本明細書において、例えば、ＡＤＨ１プロモーターと記載した場合、このプロモーターの塩基配列の一部のみからなる改変体や塩基配列の一部が置換,欠失、挿入等された改変体などの各種の改変体も含んでいる。
【００３４】
Ｍｉｇ１結合部位は、一般に、UASgと転写開始部位との間に存在している。したがって、当該領域においてＭｉｇ１結合部位を導入したり、Ｍｉｇ１のpseudo結合部位をＭｉｇ１結合部位に置換したりすることができる。Ｍｉｇ１結合部位は、２以上備えられていることが好ましい。Ｍｉｇ１結合部位として特定される塩基配列は、プロモーターとして特定される鎖の相補鎖にあってもよい。Ｍｉｇ１結合部位の配列としては、例えば、配列番号３で表される塩基配列が知られているほか、各種配列が公知である。例えば、酵母におけるＭｉｇ１結合部位としては、AAT AAAAA T GCGGGG AA(SUC2A), GGA AATTA T CCGGGG GC(SUC2B),GCC TTATT T CTGGGG TA(GAL1A),TAT GAATA C CTGGGG TA(GAL3),GCT GAAAA T CTGGGG AA(GAL4),GAC ATTAA T GTGGGG GG(MEL1)等が挙げられる（Molecular and cellular Biology, Mar. 1994, p.1979-1985）
【００３５】
例えば、ＧＡＬ１プロモーターは、配列番号１で表される塩基配列を有することができ、改変されたＧＡＬ１プロモーターは、配列番号２で表される塩基配列を有することができる。なお、ＧＡＬ１遺伝子は、S. cerevisiaeのＧａｌ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ３５８８９）が挙げられる。また、ＧＡＬ１遺伝子はS. cerevisiaeのＧＡＬ１に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。
【００３６】
なお、本明細書において、例えば、Ｇａｌ４タンパク質などと表記するとき、該名称に係るタンパク質のほか、該名称に係るタンパク質以外のタンパク質であって該名称に係るタンパク質の生理活性のうち本発明に必要な生理活性を有しているタンパク質も包含している。したがって、こうした生理活性を有している限り、該名称に係る天然のタンパク質を改変したり人工的に合成したタンパク質も包含される。また、当該タンパク質がサッカロマイセス・セレビジエに由来する場合には、サッカロマイセス・セレビシエ以外の他の細胞のガラクトース誘導系におけるＧａｌ４に相当するタンパク質も包含される。なお、タンパク質を改変するには、天然タンパク質における生理活性部位についての情報が必要である。生理活性部位の情報は、部位特異的変異の挿入等の手法を用いて特定することができる。また、天然タンパク質のホモログ、オルソログ又はパラログを公知の相同性検索システムを用いて検索し、これらのタンパク質間において可能性ある生理活性部部位を特定することによっても得ることができる。
【００３７】
（ＤＮＡ組換えタンパク質）
第１のＤＮＡ領域は、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されたＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡを含んでいる。第１のＤＮＡ領域の一例を図１（ａ）に示す。図２に示すように、ＤＮＡ組換えタンパク質は、入力信号としてのガラクトースシグナルの付与により、発現される。
【００３８】
ＤＮＡ組換えタンパク質は、ＤＮＡ組換えを生じさせる作用部位を備えている。こうしたＤＮＡ組換えタンパク質としては、種々のタンパク質が既に知られている。例えば、以下のＤＮＡ組換えタンパク質が挙げられる。Ｃｒｅ：バクテリオファージＰ１由来のタンパク質（ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＨｏｅｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５９（３）：１５０９−１５１４（１９８４））は、ｌｏｘＰ（交叉の遺伝子座）部位と呼ばれる３４ｂｐ ＤＮＡ配列間の交換を触媒することが知られている（Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４（５）：２２８７ （１９８６）を参照のこと）。Ｃｒｅは、マグネシウムまたはスペルミジンのいずれかを含む単純な緩衝液中で働く。多くの変異体ｌｏｘＰ部位が記載されている（Ｈｏｅｓｓら）。
【００３９】
他の組換え系、種々の生物由来の多くの組換え系もまた、本明細書中に提供される教示およびガイダンスに基づいて、使用され得る。例えば、Ｈｏｅｓｓら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（６）：２２８７（１９８６）；Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６１（１）：３９１ （１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４（２３）：７４９５（１９９２）；Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７（１１）：７７９４（１９９２）；Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１）：２５（１９９２）を参照のこと。これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒｇｏｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：４３３−４４０ （１９８６））。おそらく、これらのうち、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ，Ａ． （１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：６９９−７０７）、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；９０−１０９頁）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃｅｌｌ２９：２２７−２３４ （１９８２））が挙げられる。
【００４０】
λＩｎｔに類似の他の部位特異的リコンビナーゼおよびＰ１ Ｃｒｅに類似の他の部位特異的リコンビナーゼは、ＩｎｔおよびＣｒｅを置換してもよい。このようなリコンビナーゼは公知である。
【００４１】
ＤＮＡ組換えタンパク質は、真核細胞での発現を考慮してコドン用法が用いる真核細胞において最適化されていることが好ましい。
【００４２】
（ターミネーター）
第１のＤＮＡ領域は、ＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡについてターミネーターを備えることができる。こうしたターミネーターとしては、真核細胞で利用可能な各種のターミネーターが既に知られている。好ましくは、ターミネーターは、当該ＤＮＡの転写産物の寿命をＣＹＣ１遺伝子のターミネーターよりも短くすることができるターミネーターである。こうしたターミネーターを用いることで、ＤＮＡ組換えタンパク質のｍＲＮＡを、より一過的に存在させることができる。そして、迅速なガラクトース誘導が可能となる。なお、ｍＲＮＡの寿命はマイクロアレイなどを利用して計測できる（ＰＮＡ(2002), 99, 5860-5865）。
【００４３】
こうしたターミネーターとしては、特に限定しないが、例えば、ＭＦＡ２遺伝子のターミネーターや当該遺伝子と同等程度のｍＲＮＡの寿命を有する遺伝子のターミネーターを用いることができる。
【００４４】
本真核細胞は、このような第１のＤＮＡ領域を１又は２以上備えることができる。第１のＤＮＡ領域は、好ましくは、染色体上に備えられる。第１のＤＮＡ領域を複数備える場合、異なる第１のＤＮＡ領域には、それぞれ異なるガラクトース誘導性プロモーターが含まれていてもよい。また、異なる第１のＤＮＡ領域には、それぞれ異なるＤＮＡ組換えタンパク質が含まれていてもよい。本真核細胞は、このような第１のＤＮＡ領域を、通常、外来ＤＮＡとして備えている。
【００４５】
（第２のＤＮＡ領域）
第２のＤＮＡ領域は、プロモーターと、ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含むことができる。第２のＤＮＡ領域の一例を図１（ｂ）に示す。条件（ａ）は、ガラクトースによる遺伝子発現の「オン」から「オフ」へのスイッチングのための条件であり、条件（ｂ）は、ガラクトースによる遺伝子発現の「オフ」から「オン」へのスイッチングのための条件である。
（ａ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下から外れ発現停止となる
（ｂ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下で発現可能となる
【００４６】
プロモーターは、真核細胞で作動するプロモーターを適宜選択して利用できる。こうしたプロモーターは公知であるが、例えば、酵母にあっては、ＡＤＨ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター及びＨＯＲ７プロモーターなどの構成的プロモーターを好ましく用いることができる。
【００４７】
ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位とは、ＤＮＡ組換えタンパク質が認識してＤＮＡの切り出し等の組換えを生じさせる部位である。既に説明したように、ＤＮＡ組換えタンパク質に応じて種々の作用部位が知られている。例えば、Ｃｒｅに対しては、ｌｏｘＰが知られている。こうした部位を特定する塩基配列は公知である。
【００４８】
スイッチングしようとする遺伝子を条件（ａ）で備えるためには、ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位への作用により、当該遺伝子が切り出されるか、あるいは逆位させるように、遺伝子と作用部位を配置すればよい。例えば、遺伝子を切り出すためには、同方向に配置した２つのｌｏｘＰの間に遺伝子を配置する。また、遺伝子を逆位させるには、異なる方向に配置した２つのｌｏｘＰ配列の間に遺伝子を配置する。いずれの場合においても、上流にあるプロモーターの制御下から外れて遺伝子の発現は停止される。
【００４９】
また、遺伝子を条件（ｂ）を備えるためには、ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位への作用により、プロモーターの制御下で発現するように前記遺伝子を逆位させるように遺伝子と作用部位とを配置すればよい。あるいは、予めプロモーターと遺伝子との間に、遺伝子のプロモーターによる発現を妨げる障害領域を備えておき、前記作用により、障害領域が切り出しされるように、遺伝子と作用部位とを配置すればよい。例えば、前者の場合には、異なる方向の２つのｌｏｘＰの間に遺伝子をあらかじめ逆方向に配置し、Ｃｒｅが作用することで、遺伝子が逆位してプロモーターに対して順方向に連結されるようにする。また、後者の場合には、同方向の二つのｌｏｘＰの間に障害領域を備えておき、下流のｌｏｘＰに下流に、プロモーターの制御下で作動可能に遺伝子を配置する。なお、障害領域は、マーカー遺伝子であってもよいし、なんらコードしない領域であってもよい。
【００５０】
本真核細胞は、１又は２以上の第２のＤＮＡ領域を備えることができる。第２のＤＮＡ領域を２以上備える場合、複数の遺伝子を同時に「オン」から「オフ」にスイッチングしたり、逆に複数の遺伝子を同時に「オフ」から「オン」にスイッチングすることができる。また、複数の遺伝子のうちある遺伝子を「オン」から「オフ」にスイッチングし、他の遺伝子を「オフ」から「オン」にスイッチングすることができる。
【００５１】
また、一つの第２のＤＮＡ領域は、２つの遺伝子につき一方を条件（ａ）でスイッチングし、他方を条件（ｂ）でスイッチングするように構成してもよい。例えば、グルコース供給時（Ｃｒｅの非作用時）において、プロモーターの制御下に第１の遺伝子を発現可能に配置する。この第１の遺伝子は、二つのｌｏｘＰを同方向で配置した間に配置する。一方、下流側のｌｏｘＰの下流に、Ｃｒｅ作用時において、プロモーターの制御下に発現可能に第２の遺伝子を配置する。こうすることで、一つの第２のＤＮＡ領域によって、第１の遺伝子の「オン」〜「オフ」と第２の遺伝子の「オフ」〜「オン」を同時に実現できる。こうした第２のＤＮＡ領域を図１（ｂ）に示す。こうした第２のＤＮＡ領域を備えることで、図２に示すように、ＧＦＰからｍＫＯへのスイッチングを同時に行うことができる。なお、こうしたスイッチングは、２以上の第２のＤＮＡ領域によっても実現される。
【００５２】
なお、第２のＤＮＡ領域における遺伝子は、それぞれ、真核細胞の転写開始位置となるTATAボックス配列やターミネーターを備えることができる。また、ＤＮＡ組換えタンパク質の作用の有無を確認するための栄養要求性や薬剤耐性などのマーカー遺伝子を備えていてもよい。第２のＤＮＡ領域は好ましくは、染色体上に備えられる。
【００５３】
（第３のＤＮＡ領域）
本真核細胞は、Ｇａｌ１タンパク質及び/又はＧａｌ２タンパク質の発現が増強されていることが好ましい。これらのタンパク質は、いずれも、転写因子であるＧａｌ４タンパク質による転写活性化を促進するものとして知られている（特開２００７−８９５１２号公報）。本明細書の開示において、これらを発現させることで、ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある遺伝子の発現を、ガラクトースシグナルに対して応答性よく促進できる。これらのタンパク質は、いずれか一方であってもよいが、双方でもよい。双方の発現が増強されていることがより好ましい。さらに、Ｇａｌ３タンパク質の発現が増強されていることも好ましい。こうしたＧａｌ１タンパク質等の発現を増強するには、それぞれ構成的プロモーターの制御下にこれらをコードするＤＮＡを発現可能に備える第３のＤＮＡ領域を、本真核細胞に保持させることが好ましい。好ましくは、こうしたＤＮＡ領域は、本真核細胞の染色体上に備えられる。
【００５４】
こうした第３のＤＮＡ領域の一例を図１（ｃ）に示す。第３のＤＮＡ領域を備えることで、図２に示すように、入力信号としてのガラクトースシグナルを、本来のシグナル伝達経路に加えて、Ｇａｌ２タンパク質及びＧａｌ１タンパク質を介して強化することで、Ｇａｌ４タンパク質による転写活性化を効果的に促進することができる。
【００５５】
なお、Ｇａｌ１タンパク質としては、Ｇａｌ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ３５８８９）のほか。なお、Ｇａｌ１活性タンパク質とは、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ１のほか、Ｇａｌ８０結合活性及び／又はガラクトカイネース活性を有して、Ｇａｌ８０活性タンパク質のＧａｌ４活性タンパク質に対する転写活性阻害作用を解除できるものであればよく、人工的に構築又は改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ１に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。Ｇａｌ２タンパク質としては、Ｇａｌ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ７３２５３）のほか、Ｇａｌ２のガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質を用いることができる。なお、Ｇａｌ２活性タンパク質とは、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ２のほか、ガラクトーストランスポーター活性を有するものであればよく、人工的に構築又は改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ２に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。Ｇａｌ３タンパク質とは、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ７４３０５）のほか、Ｇａｌ８０結合活性を有して、Ｇａｌ８０タンパク質のＧａｌ４タンパク質に対する転写活性阻害作用を解除できるものであればよく、人工的に構築又は改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ３に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。
【００５６】
本真核細胞は、Ｇａｌ４タンパク質をガラクトース誘導的に発現するものであってもよい。すなわち、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にＧａｌ４タンパク質をコードするＤＮＡを保持していてもよい。上記したＧａｌ１、Ｇａｌ２及びＧａｌ３タンパク質等を構成的に発現させるとともに、Ｇａｌ４タンパク質をガラクトース誘導的に発現させることで、ガラクトース誘導系の誘導の応答性を高め、発現強度を増強できる。Ｇａｌ４の全アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ７３６０４）及びＤＮＡ結合活性部位、転写活性化部位等は知られており（D. Lohr et al,TheFASEB Journal (1995), p.777-787）、こうした配列に基づいて人工的なタンパク質を作製するのは当業者であれば容易に行うことができる。ガラクトース誘導性プロモーターとしては、既に開示したプロモーターを用いることができる。好ましくは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０のいずれかのプロモーターであり、より好ましくは、ＧＡＬ１０プロモーターを用いる。
【００５７】
上記各種態様のＤＮＡは、例えば、既に知られた塩基配列やアミノ酸配列に基づいて設計したプライマーを用いて、酵母等の真核微生物等から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリ又はゲノムＤＮＡライブラリ等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリ等由来の核酸を鋳型とし、目的とするＤＮＡの一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００５８】
また、上記各種態様のＤＮＡがタンパク質をコードするものであるとき、例えば、公知のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡを、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００５９】
そのほか、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、例えば、公知配列に基づいて、各種態様のＤＮＡを取得することができる。
【００６０】
本真核細胞は、第１のＤＮＡ領域、第２のＤＮＡ領域のほか、ガラクトース誘導系の構成タンパク質をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入されて得られる形質転換体であることが好ましい。
【００６１】
形質転換体の宿主細胞は、真核細胞であればよく、特に限定されない。物質生産等を考慮すると、麹菌などのカビや酵母が挙げられる。麹菌としては、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus orizae）等のアスペルギルス属が挙げられる。また、酵母としては、公知の各種酵母を利用できるが、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピキア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、クロッケラ属（Klocckera）の酵母、スワニオマイセス属（Schwanniomyces）の酵母及びヤロイア属（Yarrowia）の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母、イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）等のイサトケンキア属の酵母が挙げられる。なかでも、本来的にガラクトース誘導系を有する酵母などの単細胞真核生物が好ましい。こうした宿主細胞としては、なかでも、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクティスが好ましいものとして挙げられる。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティスである。
【００６２】
少なくとも、第１のＤＮＡ領域を保持する真核細胞を、遺伝子発現のスイッチング用細胞材料とすることができる。また、当該細胞材料は、第３のＤＮＡ領域やＧａｌ４タンパク質をガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に保持していてもよい。本細胞材料には、こうしたＤＮＡ領域を染色体上に保持していてもよい。
【００６３】
こうした形質転換体を得るには、第１のＤＮＡ領域等を保持する組換えベクターなどのＤＮＡ構築物を用いて宿主細胞を形質転換する。本明細書において、ＤＮＡ構築物は、典型的には、組換えベクターのほか、ＤＮＡ断片の形態も取ることができる。
【００６４】
ＤＮＡ構築物は、第１のＤＮＡ領域、第２のＤＮＡ領域及び第３のＤＮＡ領域から選択される１種又は２種以上を備える遺伝子カセットであてもよい。これら３種のＤＮＡ領域に加えて、Ｇａｌ４タンパク質をガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に備えるＤＮＡ領域が組み合わされてもよい。このカセット又はこうしたＤＮＡ構築物が、第１のＤＮＡ領域の染色体における遺伝子置換、遺伝子破壊等、染色体への所望のＤＮＡ断片の組み込みを意図する場合は、染色体上の所定の領域との相同領域を有していてもよい。相同領域は、第１のＤＮＡ領域を含む所望のＤＮＡ断片を組み込む領域に応じて適宜選択される。こうした遺伝子カセットは、ＤＮＡ断片の形態を取ることができる。
【００６５】
ＤＮＡ構築物は、、第１のＤＮＡ領域、第２のＤＮＡ領域及び第３のＤＮＡ領域から選択される１種又は２種以上を１又は２以上のベクター上に備える、遺伝子スイッチング用材料であってもよい。ベクターは、１又は２以上の上記ＤＮＡ領域を備えることができる。さらに、ベクターは、Ｇａｌ４タンパク質をガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に保持するＤＮＡ領域を組み合わせて備えていてもよい。ベクターとしては、真核細胞用等の種々の公知のベクターを利用できる。各ＤＮＡ領域は、宿主染色体に当該ＤＮＡ領域を組込み可能に相同領域を備えていてもよい。
【００６６】
なお、こうした組換えベクター、ＤＮＡ断片の作製、組換え体宿主としての酵母等の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。
【００６７】
ＤＮＡ構築物の宿主への導入方法としては、従来公知の各種方法、例えば、リン酸カルシウム法、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法または他の方法が挙げられる。このような手法は、上記した実験書等に記載される。ベクターを導入した酵母等の真核細胞につき、マーカー遺伝子を用いた選抜及び活性発現による選抜により本真核細胞を得ることができる。
【００６８】
以上説明した本明細書の開示によれば、遺伝子発現のスイッチングを精度よく行うことができる。すなわち、優れた同調性とともに迅速に遺伝子発現を切替することができる。本明細書の開示によれば、同調性に関しては、スイッチィングに先立つ意図しない「オン」又は「オフ」を効果的に抑制して厳密な遺伝子発現の「オン」又は「オフ」が可能となっている。さらに、ガラクトースシグナル対して応答性よくＤＮＡ組換えタンパク質が発現されるようになっているため、「オン」又は「オフ」へのスイッチングも高いレスポンスで確実に実現できる。また、迅速性に関しては、本明細書の開示によれば、好ましくは２０時間以内、より好ましくは１８時間以内、さらに好ましくは１５時間以内、一層好ましくは１２時間以内、より一層好ましくは１０時間以内に遺伝子発現の「オン」及び／又は「オフ」を実現できる。こうした迅速性は、ガラクトースへの反応性が高められていることにより一層強調される。また、遺伝子発現の「オン」、「オフ」をそれぞれ実現できるとともに、遺伝子に関し「オン」から「オフ」と「オフ」から「オン」へのスイッチングを同時に実現できる。より具体的には、遺伝子Ａの発現を「オン」から「オフ」とし、遺伝子Ｂの発現を「オフ」から「オン」とを同時に実現できるため、実質的には、Ａ遺伝子の発現「オン」からＢ遺伝子の発現「オン」へのスイッチングを実現できる。
【００６９】
（遺伝子発現のスイッチング方法）
本明細書に開示されるガラクトースを用いた遺伝子発現のスイッチング方法は、本真核細胞に対してガラクトースを供給して、前記第２のＤＮＡ領域の前記遺伝子の発現をスイッチングする工程を備えることができる。このスイッチング方法によれば、より精度のよい遺伝子発現のスイッチングが可能となっている。
【００７０】
スイッチング工程は、本真核細胞を培養する工程のいずれかの段階において、グルコースが非存在でガラクトースが存在する状態（グルコース（−）及びガラクトース（＋））を形成する工程である。当該状態が、ガラクトースシグナルである。ガラクトースシグナルが付与される前の状態は、グルコース（＋）及びガラクトース（−）かあるいはグルコース（＋）及びガラクトース（＋）である。好ましくは、グルコース（＋）及びガラクトース（−）である。ここで、グルコース(＋)とは、少なくともグルコースが０．１w/v％以上存在することが好ましい。また、グルコース（−）は、０．０１w/v％以下の濃度であることが好ましい。ガラクトース(＋)とは、少なくともガラクトースが０．０５w/v％以上存在することが好ましい。また、ガラクトース（−）は、０．０１w/v％以下の濃度であることが好ましい。
【００７１】
スイッチング工程は、図３Ａに示すように、一旦、ガラクトースシグナルのある状態を継続してもよいが、図３Ｂに示すように、一時的にのみガラクトースシグナルを付与してもよい。すなわち、ガラクトースシグナルを付与後に、ガラクトース付与前の状態に戻すことが好ましい。すなわち、グルコース（＋）及びガラクトース（−）かあるいはグルコース（＋）及びガラクトース（＋）である。好ましくは、グルコース（＋）及びガラクトース（−）とする。一時的なガラクトースシグナルの付与によれば、より細胞の同調性に優れより迅速なスイッチングが可能となる。こうした一時的なガラクトースシグナルの付与は、ガラクトース濃度が０．１w/v％以上で行うことが好ましい。
【００７２】
（有用物質を生産する方法）
本明細書に開示される有用物質を生産する方法は、本真核細胞であって前記有用物質を生産する細胞に対してガラクトースを供給して、前記第２のＤＮＡ領域の前記遺伝子の発現をスイッチングして、前記有用物質を生産する工程を備えることができる。本生産方法によれば、生産工程においてスイッチングを行うため、本真核細胞による有用物質の生産プロセスを最適化して、高効率な有用物質の生産を実現できるようになる。本生産方法における遺伝子発現のスイッチングに関しては、遺伝子発現のスイッチング方法の各種態様を適用することができる。
【００７３】
本真核細胞は、培養により所望の有用物質を生産可能とすることができる。有用物質を生産可能な真核細胞は、有用物質生産に関する内因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子を備えることができる。また、所定の内在性遺伝子が破壊されていてもよい。酵母等は通常嫌気性発酵によりエタノールを生産するが、適宜遺伝子工学的な改変等により他の有用物質を生産可能に形質転換体であってもよい。有用物質生産のための外来性遺伝子は、前記第２のＤＮＡ領域に含まれてスイッチングされる遺伝子とすることもできる。
【００７４】
有用物質としては特に限定しないが、酵母が通常グルコースを利用して生産可能なものであればよい。有用物質は、酵母におけるグルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して本来の代謝物でない化合物であってもよい。具体的には、エタノールなどの低級アルコール、乳酸、酢酸などの有機酸の他、１，３−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールのほか、イソプレノド合成経路の追加によるテルペノイド系のファルネソール、ゲラニルゲラニオール、スクアレン、さらには、ファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。
【００７５】
生産工程では、炭素源として、スイッチングシグナル付与時以外は、グルコース又はスクロースを含有する培地を用いることができる。生産工程では、本真核細胞に一般的に適用される培養条件を適宜選択して用いることができる。典型的には、発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００７６】
こうした生産工程の実施により、用いた本発明の形質転換体が有している有用物質生産能力に応じて有用物質が生産される。例えば、本発明の形質転換体がエタノール生産能力を有している場合には、エタノールであり、乳酸を生産可能に改変されている場合には、乳酸等となる。発酵終了後、培養液から有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを精製又は濃縮する工程を実施することもできる。回収工程や精製等の工程は有用物質の種類等に応じて適宜選択される。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、以下に述べる遺伝子組換え操作はMolecular Cloning： A Laboratory Manual (T. Maniatis, et al., Cold Spring Harbor Laboratory) に従い行った。
【実施例１】
【００７８】
（第１のＤＮＡ領域を含むコンストラクトの作製）
本実施例では、改変されたＧＡＬ１プロモーターの制御下にCreＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡを備える第１のＤＮＡ領域を含むコンストラクト１（図４参照）を作製した。このＤＮＡコンストラクト１は、pSP73（プロメガ）ベクターのXhoI部位とBglII部位の間に、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（クロンテック）を用い、以下に示す６つの遺伝子断片を順次導入することにより作製した。遺伝子断片１，４〜６は、酵母ゲノムDNAを鋳型とし、KOD plus ver.2（TOYOBO）を用いてPCR反応により合成した。遺伝子断片２である、酵母のコドンに最適化したCre DNA組換え酵素opCre（配列番号４）は委託して合成した。また、GAL1プロモーターのグルコース抑制能を高めるために、元来１つしかないMIG1リプレッサーの結合配列に加えて、pseudoの結合配列をMIG1リプレッサー結合配列へと置き換えた遺伝子断片３であるGAL1m1p（配列番号５）も委託して合成した。すなわち、GAL1プロモーター配列のMIG1のpseud結合配列（偽結合配列）（-272 to -256; GGCCCCACAAACCTTCA）からMIG1結合配列（TTCCCCGCATTTTTATT）へと置き換えた。opCreは遺伝子断片3、GAL1m1pは遺伝子断片2の鋳型として用いた。PCR反応条件は、pre-PCR：94℃ 2分の後、PCR反応：94℃で30秒、50℃で30秒、68℃で1kbpにつき1分、を、30サイクルとした。エクステンション反応は、６８℃で５分とした。それぞれの遺伝子断片の作製とベクターへのpSP73ベクターへのクローニングには、次に示したPCRプライマーと制限酵素を用いた。
【００７９】
遺伝子断片１：GPD1の5’上流配列（XhoI-SpeI, KpnI-ApaI）
プライマー１）TATAGGGAGACCGGCCTCGAGAAACTAGTTTTCCCAGGCAAGGT GAC（配列番号６）
プライマー２）CATCCAAAAAAAAAGTGGGCCCTTGGTACCAAGCCAGTCTACGT GCGAAT（配列番号７）
遺伝子断片２：GAL1m1pプロモーター（ApaI, BamHI）
プライマー１）ACGTAGACTGGCTTGGTACCAAGGGCCCACTTTTTTTTTGGATG GACG（配列番号８）
プライマー２）CAGGCAAGTATTTCGAGCTCAAAAGCTTAAGCATGCAAGGATCC TATAGTTTTTTCTCCTTGAC（配列番号９）
遺伝子断片３：opCre（BamHI, SphI）
プライマー１）AAAAACTATAGGATCCATAATGTCTAACTTGTTGACTG(配列番号１０)
プライマー２）TCCTCGAAGCTTAAGCATGCTCAATCACCATCTTCCAAC（配列番号１１）
遺伝子断片４：MFA2ターミネーター（SphI, HindIII）
プライマー１）AAGATGGTGATTGAGCATGCTTTTTGACGACAACCAAGAG（配列番号１２）
プライマー２）GTTCTCCTCGAAGCTTGGAGGGAAAGGCGTATCAG（配列番号１３）
遺伝子断片５：LEU2栄養要求性マーカー遺伝子（HindIII, SacI）
プライマー１）TTGCATGCTTAAGCTTCGAGGAGAACTTCTAGTA（配列番号１４）
プライマー２）CAGGCAAGTATTTCGAGCTCGACTACGTCGTAAGGC（配列番号１５）
遺伝子断片６：GPD1の3’下流配列（SacI, BglII）
プライマー１）TACGACGTAGTCGAGCTCGAAATACTTGCCTGGCATC（配列番号１６）
プライマー２）GAACCAGATCTATTGGCCATTCAACAACTC（配列番号１７）
【実施例２】
【００８０】
本実施例では、第２のＤＮＡ領域を含むコンストラクト２（図５参照）を作製した。図５に示すコンストラクト２は、pSP73（プロメガ）のXhoI部位とBglII部位の間に、ライゲーション反応を用いて、以下に示す７種類の遺伝子断片を順次、ライゲーションによって導入して作製した。遺伝子断片１〜３及び７は、酵母ゲノムDNAを鋳型とし、PCR反応により合成した。次に示したPCRプライマーと制限酵素を用いた。遺伝子断片４〜６は委託して合成した。
【００８１】
遺伝子断片１：PDC6の5’上流配列（BglII-ClaI, EcoRI）
プライマー１）AGATCTATCGATTCTTTCCTCACGGACCAT（配列番号１８）
プライマー２）GAATTCGATCTAGGTGCAGATACAG（配列番号１９）
遺伝子断片２：TDH3プロモーター１(-676 to -381)（EcoRI, EcoRI）
プライマー１）GAATTCGAGTTTATCATTATCAATAC(配列番号２０)
プライマー２）GAATTCTTTACCTATGAACTGATG(配列番号２１)
遺伝子断片３：TDH3プロモーター２(-676 to -381)（EcoRI, SacI）
プライマー１）GAATTCGAGTTTATCATTATCAATAC（配列番号２２）
プライマー２）GAGCTCACCTATGAACTGATGGTTG（配列番号２３）
遺伝子断片４：loxP- CYC1 TATA box(-123 to -1)-GFP+PEST-TPS1t合成配列（SacI, BamHI）（配列番号２４）
遺伝子断片５：ハイグロマイシン耐性遺伝子（Hygr）合成配列（BamHI, BlnI-Pst）（配列番号２５）
遺伝子断片６：loxP- CYC1 TATA box(-123 to -1)-mKO2-TPS1t合成配列（BlnI, PstI）（配列番号２６）
遺伝子断片７：PDC6の3’上流配列（PstI, ApaI-XhoI）
プライマー１）CTGCAGCCATTAGTAGTGTACTCA（配列番号２７）
プライマー２）CTCGAGTGGGCCCTGTGCAGATGCAGATGTG（配列番号２８）
【実施例３】
【００８２】
本実施例では、Ｇａｌ１タンパク質及びＧａｌ２タンパク質を構成的に発現させるためのコンストラクト３（図６参照）を作製した。図６に示すコンストラクト３は、pBluescript SK-（Stratagene）のKpnI部位とSacI部位の間に、ライゲーション反応を用いて、以下に示す３つの遺伝子断片を順次、ライゲーションによって導入して作製した。遺伝子断片1と2は、委託して合成した。遺伝子断片3は、酵母ゲノムDNAを鋳型とし、PCR反応により合成した。次に示したPCRプライマーと制限酵素を用いた。
【００８３】
遺伝子断片１：HIS3p (-311 to -1)-GAL1-CYC1t (+1 to +215)（KpnI, SalI）（配列番号２９）
遺伝子断片２： HIS3p (-311 to -1)-GAL1-CYC1t (+1 to +215)（SalI, SalI）（配列番号３０）
遺伝子断片３： URA3栄養要求性マーカー遺伝子（SalI, SacI）
プライマー１）GTCGACGATTCGGTAATCTCCGAAC（配列番号３１）
プライマー２）GAGCTCGGGTAATAACTGATATAATTA（配列番号３２）
【実施例４】
【００８４】
（酵母への遺伝子導入）
本実施例では、野生型酵母W303-1aを親株として図６に示すコンストラクト３を導入した株に対して、図５に示すコンストラクト２を遺伝子導入した。続いて、図５及び６に示すコンストラクトが導入された株に対して、図４に示すコンストラクト１を導入した。具体的には以下の手順で行った。
【００８５】
まず、宿主となる酵母をYPD液体培地を用いて、30℃で対数増殖期（OD660=0.4〜0.6）まで培養し、Frozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH社）で処理してコンピテントセルを調整した。次いで、図５に示すコンストラクト２は制限酵素ClaI, ApaIで、図４に示すコンストラクト１は制限酵素BglII, SpeIで、図６に示すコンストラクト３は制限酵素NcoIでそれぞれ処理して断片化した。次いで、コンピテントセル50μLに断片化したコンストラクト50μgを加え、PEGバッファーで希釈した。これを45分間加温し、形質転換した。これらの形質転換酵母を洗浄後、コンストラクト２の場合は、3mlの2%YPAD培地を加えて30℃で3時間培養した後、培養液250μlをハイグロマイシン選択培地（150μg/ml）に塗布した。コンストラクト１の場合は、滅菌水に懸濁してロイシン選抜培地に塗布した。コンストラクト３の場合は、滅菌水に懸濁してウラシル選抜培地に塗布した。30℃で1昼夜静置培養して形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーをそれぞれの選択培地で培養し、生育能を安定に保持している株を選択して、コロニーPCRを行い、目的遺伝子の導入を確認し、コンストラクト１、２及び３の３つの遺伝子が導入された遺伝子組換え酵母をC22株とした。
【実施例５】
【００８６】
本実施例では、サイリスタ様の遺伝子スイッチとしての特徴を生かすために、通常のガラクトース誘導は図７のＡのように、誘導をかけた後は高ガラクトース状態を継続するところを、図７のＢのようにパルス的に高ガラクトース状態を与えた。誘導終了時刻t_1は１時間に設定した。具体的には以下のように行った。すなわち、酵母C22株をグルコース液体培地に植菌し、濁度（Optical Density、660nm）が0.7-1.0まで培養した。培養液から菌体を回収してグルコース培地を除いて、ガラクトース液体培地に交換して（ガラクトース誘導）培養した。ガラクトース誘導を止めるために、再度グルコース液体培地に交換し振盪を続けた。ガラクトース液体培地への交換により、ガラクトース誘導を始めた時刻を0時とした。誘導開始後10時間まで、1時間ごとにサンプリングし、フローサイトメトリーを行った。また、適宜、顕微鏡観察も行った。
【００８７】
（顕微鏡観察）
培養した酵母用液を遠心分離して菌体を回収し、これに、用いた培養液の1/5容量の生理的食塩水を加えて懸濁した。懸濁液をスライドグラスに取り、オールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000（キーエンス）を用い観察した。視野と焦点を調節したあと、CCDカメラを用いた写真撮影を、光学像、緑色蛍光象、赤色蛍光象のそれぞれについて以下の条件で行った。また、イメージの記録はRGBモード（各色8bit）で行った。合成イメージは、赤色蛍光象のRレイヤーと緑色蛍光象のGレイヤーとをPhotoshop（Adobe社）を用いて重ね合わせた。結果を図８に示す。
【００８８】
スライドグラス：MAS-GP typeA（Matsunami）
カバーグラス：18 x 18mm No.1（Matsunami）
対物レンズ：Plan Apo VC 60xH（Nikon）
励起光：水銀アークランプ
BPフィルターセット： 励起（475/20）、DCM（500）、BA（510/23）。
励起時間：光学像 1/30秒、緑色蛍光 2秒、赤色蛍光 1/2.5秒。
【００８９】
図８左図に示すように、ガラクトース誘導開始時点で、若干の赤く光る細胞（ｍＫＯ２発現細胞）が観察された。これは、培養中にCreがリークして発現したため、誘導を行う前に組み換えが起こった細胞であると考えられる。しかし、重ね合わせイメージでオレンジ色に光っているものは観察されず、両方の遺伝子が同時に発現している細胞はほとんど含まれていないと考えられた。以上のことから誘導開始前においては、Ｃｒｅの意図しない発現を効果的に抑制できていることがわかった。
【００９０】
図８右図に示すように、誘導開始後１０時間の顕微鏡像には、緑色に光る細胞（ＧＦＰ発現細胞）及びオレンジ色（ＧＦＰ及びＭＫＯ２発現細胞）に光る細胞が若干観察されるが、大部分が赤色に光っていた。緑色に光る細胞は、Creが誘導されておらず、組み換えが起こっていないと考えられる。また、オレンジ色に光る細胞では、組み換えが正常に起こっていない、あるいはGFPの分解が十分でないと考えられた。以上のことから、ＧＦＰ遺伝子の「オン」から「オフ」へのスイッチング及びｍＫＯ２遺伝子の「オフ」から「オン」へのスイッチングは優れた同調性でかつ迅速に行われていることがわかった。
【００９１】
（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーは、Beckman-Coulter社のCell Lab Quanta SC MPLを用いた。蛍光はCell Lab Quanta SCに組み込みの488nmのレーザーで励起した。mKO2（及びGFP）に最適化したフィルターセットとして、表１のフィルター及びミラー（Opt Science社）を用いた。
【００９２】
【表１】
【００９３】
フローサイトメーターのゲインとフォトマル電圧は、標準株（B51）の出力（FL2/SS、後述）がおよそ1となるように調整した。また、FL1（蛍光1チャンネル）からの漏れこみを相殺するようにコンペンセーションを設定した。サンプル中のごみ及びノイズを除去するため、SS（側方散乱）、EV（電気体積）及びFL2（蛍光2チャンネル）にウインドウを設定し、データーを選別した。条件を満たす細胞がおよそ5000個（乃至10000個）になるまで測定を続けた。蛍光強度を酵母の細胞の大きさに因らない値で評価するため、SSが細胞の大きさに比例するとの仮定の下、FL1/SS、FL2/SSをそれぞれGFP出力、mKO2出力と定義した。出力の分布をIgor Pro（Wavemetrics社）を用いて以下のように計算した。
【００９４】
【数１】
【００９５】
なお、mKO2の相対蛍光出力が必要な場合は、GFPと同様の方法で計算した（GFPとmKO2を読み換え、FL1をFL2に読み替える）。また、出力分布を表示する場合、度数分布をイメージ表示した。すなわち、Z軸の値0→1が白→黒のグラデーションとなるように着色した。時系列の出力分布イメージをファイルに保存し、ImageMagick (http://www.imagemagick.org) を用いてGIFアニメーションを作成した。出力の経時変化を静的に表示する場合には、標準株の差分表示イメージ上に出力の重心をプロットした。さらに、二つの標準株の出力を同一のイメージに表示するため、差分表示を行った。GFP標準（ρGFP）とmKO2標準（ρmKO2）の度数分布の差ρdiff＝ρmKO2−ρGFPを計算し、これをイメージ表示した。Z軸の値-1→0→1が緑→白→赤のグラデーションとなるように着色した。
【００９６】
さらに、詳細にスイッチの切り替えに伴う遺伝子の出力の変化（GFPとmKO2の蛍光強度の変化）を解析するために、細胞の大きさを相殺することにより、体積あたりの蛍光強度の比較が可能なFL1/SS値とFL2/SS値を使って出力分布の変化を調べた。結果を図９に示す。
【００９７】
図９に示すように、誘導前（図９Ｃ）及び誘導開始後１０時間（図９Ｄ）の出力分布は、それぞれ、GFP標準株及びmKO2標準株のものとほぼ等しかった。また、出力の重心は図９Ｂのように移動した。以上のことから、ＧＦＰ遺伝子の出力は、誘導開始後１０時間でほぼ完全にｍＫＯ遺伝子の出力にスイッチングされたことがわかった。また、誘導開始から４時間後にＧＦＰの出力が低下し始めた。７時間後には、GHP遺伝子の出力がほぼオフになることがわかった。また、別途行ったサザンハイブリダイゼーションの結果から誘導開始後、２時間で遺伝子型の切替えが生じていることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号２，５：改変したＧＡＬ１プロモーター
配列番号６〜２３、２７、２８、３１、３２：プライマー
配列番号２４、２５、２６、２９、３０：コンストラクト用ＤＮＡ断片
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現のオン・オフのスイッチング技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現のオン・オフを所望のタイミングでスイッチングすることができれば、遺伝子機能の解明や新規な薬剤の開発、毒性の高いタンパク質や化学物質の生産が可能になる、と考えられている。そこで、ゲノム上のＤＮＡを改変して、遺伝子発現のオン・オフを行う技術が検討されてきている。
【０００３】
例えば、Ｇａｌプロモーターを利用して遺伝子組換え酵素Creを発現させることを利用した技術がある(特許文献１)。また、CreなどのＤＮＡ組換え酵素を、タンパ、低分子リガンドを細胞に取り込ませることにより、ＤＮＡ組換え酵素活性を有する技術も知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６２−１７５１８４号公報
【特許文献２】特表２００２−５３９８３９号公報
【特許文献３】特表２０００−５０６２９８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nature Methods(2006), 3, 461-467
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１に開示される技術では、遺伝子の発現を「オフ」できるものの「オン」することはできなかった。また、「オフ」にも、酵母において２４時間を要していた。上記特許文献２及び非特許文献１に開示される技術では、遺伝子の「オン」「オフ」が可能であるが、精製した組換え酵素タンパク質が大量に必要となるため、莫大なコストを要する。また、「オフ」には２４時間を要していた。さらに上記特許文献３に記載の技術は、遺伝子発現の「オン」「オフ」が可能であるが、いずれも数日を要するものであった。
【０００７】
このように、外部からのシグナルで、遺伝子の発現の「オン」「オフ」をスイッチングすることはある程度可能であるというものの、シグナルの付与から現実的な遺伝子発現の「オン」「オフ」の精度は高くなかった。例えば、細胞集団に対して「オン」のシグナルを付与しなくても、いくらかの細胞では遺伝子発現が「オン」になってしまったり、反対に細胞集団に「オン」のシグナルを付与しても、いくらかの細胞は「オン」しなかったりすることがあった。このように、細胞の同調性という観点からの精度が低かった。また、遺伝子の「オン」「オフ」には、それぞれ相当の時間を要するものであった。
【０００８】
そこで、本明細書の開示は、より精度の高い遺伝子発現の「オン」及び／又は「オフ」制御が可能なスイッチを提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｇａｌ誘導系を遺伝子の発現のスイッチングに用い、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下でＤＮＡ組換えタンパク質の発現を制御することで、より精度の高い、すなわち、同調性に優れる遺伝子発現のスイッチングに成功した。また、Ｇａｌ誘導系を改変することによってより迅速なスイッチングにも成功した。こうした知見によれば、以下の手段が提供される。
【００１０】
本明細書の開示によれば、ガラクトース誘導系を備えるとともに、グルコースによる抑制効果が増強されたＧＡＬ１プロモーター等のガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域と、プロモーターと、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含む、第２のＤＮＡ領域と、を備える、遺伝子の発現の切替えするための遺伝子スイッチを備える真核細胞が提供される。
（ａ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下から外れ発現停止となる
（ｂ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下で発現可能となる
【００１１】
前記真核細胞においては、前記ガラクトース誘導性プロモーターは、２個以上のＭｉｇ１結合配列を有していてもよい。また、前記ガラクトース誘導性プロモーターは、配列番号２で表される塩基配列を有するものであってもよい。
【００１２】
前記第１のＤＮＡ領域は、前記ＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡの転写産物の寿命をＣＹＣ１遺伝子のターミネーターよりも短くすることができるターミネーターを備えていてもよい。さらに、前記ターミネーターは、ＭＦＡ２遺伝子のターミネーターであってもよい。
【００１３】
前記第２のＤＮＡ領域は、前記条件（ａ）で配置される遺伝子を第１の遺伝子として備えるとともに、前記条件（ｂ）で配置される遺伝子を第２の遺伝子として備えることができる。
【００１４】
前記真核細胞は、Ｇａｌ１タンパク質及び／又はＧａｌ２タンパク質の発現が増強されているものであってもよい。また、前記真核細胞は、前記第１のＤＮＡ領域及び前記第２のＤＮＡ領域を、前記細胞の染色体上に備えるものであってもよい。さらに、前記真核細胞は、酵母細胞とすることができる。
【００１５】
本明細書の開示によれば、また、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域を備える、遺伝子発現のスイッチング用真核細胞材料も提供される。
【００１６】
本明細書の開示によれば、遺伝子の発現の切替えするための遺伝子スイッチングカセットであって、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域を、備える、カセットが提供される。
【００１７】
本明細書の開示によれば、遺伝子発現スイッチング用材料であって、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域と、プロモーターと、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含む、第２のＤＮＡ領域と、を１又は２以上のベクター上に備える、材料が提供される。
（ａ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下から外れ発現停止となる
（ｂ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下で発現可能となる
【００１８】
前記遺伝子発現スイッチング用材料においては、前記１又は２以上のベクターは、構成的プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＧａｌ１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、構成的プロモーターの制御下の発現可能に連結されるＧａｌ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、備えるものであってもよい。
【００１９】
本明細書の開示によれば、ガラクトースを用いた遺伝子発現のスイッチング方法であって、上記いずれかに記載の細胞に対してガラクトースを供給して、前記第２のＤＮＡ領域の前記遺伝子の発現をスイッチングする工程を備える、方法が提供される。前記スイッチング工程は、一時的にのみガラクトースを供給する工程であってもよい。
【００２０】
本明細書の開示によれば、有用物質を生産する方法であって、上記いずれかに記載の細胞であって前記有用物質を生産する細胞に対してガラクトースを供給して、前記第２のＤＮＡ領域の前記遺伝子の発現をスイッチングして、前記有用物質を生産する工程を備える、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本明細書の開示に用いるコンストラクトの概要を示す図である。
【図２】本明細書の開示におけるスイッチングプロセスの一例を示す図である。
【図３】本明細書の開示におけるガラクトース誘導の一例を示す図である。
【図４】コンストラクト１を示す図である。
【図５】コンストラクト２を示す図である。
【図６】コンストラクト３を示す図である。
【図７】実施例５で用いたガラクトース・パルス誘導を従来の誘導方法と対比して示す図である。Ａに、従来の誘導方法を示し、Ｂにガラクトース・パルス誘導を示す。ガラクトース・パルス誘導では、誘導開始後t_1でガラクトースを含まない培地に換え培養を継続する。なお、培養液：a,グルコース液体培地。b,ガラクトース液体培地。c,グルコース液体培地。
【図８】ガラクトース・パルス誘導によるＧＦＰからｍＫＯ２へのスイッチングの顕微鏡観察結果を示す図である。左側は、誘導前のC22株の顕微鏡観察イメージを示し、右側は誘導開始後10時間後のイメージを示す。
【図９】ガラクトース・パルス誘導によるＧＦＰ出力からｍＫＯ２出力へのスイッチングのフローサイトメトリーを示す図である。C22株の出力変化。Ａは、標準株の差分表示を示し、Ｂは、出力重心の移動を示し、Ｃは、誘導前の出力分布を示し、Ｄは誘導開始後10時間の出力分布を示す。軸は出力（FL1/SS及びFL2/SS）の対数で示す。いずれもGFP（緑）、mKO2（赤）。CとDには、標準株における細胞の分布領域を点線でかこって示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書の開示は、遺伝子発現のスイッチングに関し、詳しくは、ガラクトース誘導系を用いた遺伝子発現のスイッチングに関する。本明細書の開示によれば、所望の遺伝子のスイッチングをガラクトースの供給というシグナルに対して良好な精度で行うことができる。すなわち、より良好な同調性で所望の遺伝子のスイッチングが可能となり、さらには、より迅速なスイッチングが可能となる。本明細書の開示におけるかかる効果の発現については、以下の推論が成り立つと考えられる。ただし、以下の推論は本明細書の開示を拘束するものではない。
【００２３】
すなわち、本明細書に開示される、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域を備える真核細胞においては、グルコースの存在下では、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の発現が抑制される。一方、ガラクトースの存在下では、グルコースによる抑制が解除されることにより、ＤＮＡ組換えタンパク質が発現される。この組換えタンパク質が、当該タンパク質の作用部位に作用すると、遺伝子は、その設置条件が上記条件（ａ）のときには、その発現が「オフ」となり、設置条件が上記条件（ｂ）のときには、その発現が「オン」となる。
【００２４】
本明細書に開示される細胞においては、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターを用いているため、ガラクトースの供給に先立つガラクトース誘導性プロモーターの作動が抑制されているため、ＤＮＡ組換えタンパク質の意図しない発現を効果的に抑制できる。結果として、明瞭なスイッチングが可能となっている。さらに、こうしたＤＮＡ組換えタンパク質が、ガラクトースの供給に反応してその作用部位に作用し、その結果、所望の遺伝子を発現させることができる。本明細書の開示によれば、以上の結果、所望の遺伝子のスイッチングをガラクトースの供給というシグナルに対して良好な同調性で行うことができる。
【００２５】
さらに、ＤＮＡ組換えタンパク質の発現量を調整することにより、例えば、その発現量を低くし、あるいはその発現期間を短くすることで、より迅速に所望の遺伝子のスイッチングを行うことが可能となる。また、ガラクトース誘導系において、Ｇａｌ１タンパク質及び／又はＧａｌ２タンパク質の発現を増強することにより、ガラクトースの供給に対する反応性を高めることができる。この結果、より反応性よくＤＮＡ組換えタンパク質を発現させることができる。そして、より迅速に所望の遺伝子のスイッチングを行うことができる。
【００２６】
（遺伝子スイッチを備える真核細胞）
（ガラクトース誘導系）
本明細書に開示される真核細胞は、ガラクトース誘導系を有している。本明細書において、ガラクトース誘導系とは、栄養源としてのガラクトースによって転写活性化されるガラクトース代謝に関連する遺伝子群を意味している。ガラクトース誘導系としては、例えばサッカロマイセス・セレビシエ酵母が備えるＧＡＬ遺伝子群が知られている。サッカロマイセス・セレビシエにおけるＧＡＬ遺伝子群としては、ＧＡＬ４及びＧＡＬ４の遺伝子産物であるＧａｌ４によって正に制御されるＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０が挙げられる。また、同様にＧａｌ４によって正に制御されるＧＡＬ８０、ＧＡＬ３及びＭＥＬ１が挙げられる。なお、ガラクトース誘導系を構成するコンポーネントには、これら構造遺伝子のほか、プロモーターやそのＧａｌ４結合部位などの調節領域が含まれる。
【００２７】
本真核細胞が備えるガラクトース誘導系は、宿主細胞が本来的に有するガラクトース誘導系であることが好ましい。すなわち、宿主細胞としてガラクトース誘導系を有する細胞を用いることが好ましい。こうした細胞は、ガラクトース誘導系を備える細胞であればよく、サッカロマイセス・セレビシエのほか、サッカロマイセス・ポンベ、カルルスベンゲルス、ノルベンシス、ジアストチクス、オビホルミス、ウバルム、ロウキシ、モンタヌス、クルイベリ、エロンギスポルス等の他の種であってもよい。また、ピキア、クルイベロミセス等の他の属の酵母であってもよい。さらに、カンジダ・アルビカンスなどのカンジダ属であってもよい。ガラクトース誘導系を備える真核細胞を宿主細胞として用いることで真核細胞へ導入する外来遺伝子数を抑制できる。
【００２８】
なお、真核細胞の有するガラクトース誘導系は、宿主細胞の内在性遺伝子からなるガラクトース誘導系であってもよいが、一部又は全部が人工的に構築されていてもよい。すなわち、宿主細胞は、ガラクトース誘導系を本来的に有する細胞のほか、ガラクトース誘導系を遺伝子工学的手法により構築された細胞を用いることができる。例えば、ガラクトース誘導系のない宿主細胞にガラクトース誘導系を構築可能な外来遺伝子群を導入したり、ガラクトース代謝能力を有するがガラクトース誘導的でない場合においてガラクトース誘導的に改変したり、宿主のガラクトース誘導系の構造遺伝子や調節領域の一部又は全部を外来性遺伝子で置換したりしてもよい。また、ガラクトース誘導系のコンポーネントは、ガラクトース誘導的にガラクトース代謝が可能である限り、内在性の構造遺伝子や転写調節領域等が改変されていたり、欠損されていたりしてもよい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエのガラクトース誘導系におけるＧａｌ４やＧａｌ８０を改変してＧａｌ４活性タンパク質やＧａｌ８０活性タンパク質を発現するように改変されていてもよい。また、ガラクトース誘導系は、その全てが宿主染色体上にある必要はなく、機能可能に宿主染色体及び／又は宿主染色体外に保持されていればよい。
【００２９】
（第１のＤＮＡ領域）
本真核細胞は、第１のＤＮＡ領域を備えることができる。第１のＤＮＡ領域は、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含んでいる。
【００３０】
（ガラクトース誘導性プロモーター）
第１のＤＮＡ領域に含まれる、ガラクトース誘導性プロモーターとしては、グルコースによる抑制効果を増強可能されたガラクトース誘導性プロモーターであればよい。ガラクトース誘導性プロモーターとしては、ＧＡＬ誘導系遺伝子であるＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０及びＭＥＬ１の各遺伝子のプロモーターが挙げられる。ガラクトース誘導性プロモーターとしては、好ましくは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０のいずれかのプロモーターであり、より好ましくは、ＧＡＬ１プロモーターである。
【００３１】
また、他のガラクトース誘導性プロモーターとしては、ガラクトース代謝遺伝子以外の内在性プロモーター又は外来性プロモーターを改変してガラクトース誘導性プロモーターとして用いることができる。いわゆるガラクトース誘導性プロモーターでないプロモーターであっても、その一部ないしその上流側にＧａｌ４結合部位（Galactose Upstream Activating Sequnce:UASg）を備えることでガラクトース誘導性プロモーターとして機能することはよく知られている。例えば、宿主細胞が本来的に有するプロモーターの上流側にＧａｌ４結合部位を保持させることで該内在性プロモーターをガラクトース誘導性プロモーターとして利用できる。ガラクトース誘導的でない外来性プロモーターについても同様である。こうした内在性プロモーター及び外来性プロモーターとしては、ＣＹＣ１プロモーターを好ましく用いることができる。
【００３２】
こうしたガラクトース誘導性プロモーターは、天然由来の当該プロモーターよりも、グルコースによる抑制効果が増強されている。すなわち、プロモーターグルコースによる抑制効果、すなわち、作動可能に連結される構造遺伝子の転写のグルコースによる抑制効果が増強されている。こうした増強効果は、例えば、Ｍｉｇ１リプレッサーが結合する結合部位を付与あるいは導入することによって得られる。こうしたガラクトース誘導性プロモーターを備えることで、グルコース存在下でのガラクトース誘導性プロモーターの制御下の遺伝子の発現を効果的に抑制できる。
【００３３】
なお、本明細書において、例えば、ＡＤＨ１プロモーターと記載した場合、このプロモーターの塩基配列の一部のみからなる改変体や塩基配列の一部が置換,欠失、挿入等された改変体などの各種の改変体も含んでいる。
【００３４】
Ｍｉｇ１結合部位は、一般に、UASgと転写開始部位との間に存在している。したがって、当該領域においてＭｉｇ１結合部位を導入したり、Ｍｉｇ１のpseudo結合部位をＭｉｇ１結合部位に置換したりすることができる。Ｍｉｇ１結合部位は、２以上備えられていることが好ましい。Ｍｉｇ１結合部位として特定される塩基配列は、プロモーターとして特定される鎖の相補鎖にあってもよい。Ｍｉｇ１結合部位の配列としては、例えば、配列番号３で表される塩基配列が知られているほか、各種配列が公知である。例えば、酵母におけるＭｉｇ１結合部位としては、AAT AAAAA T GCGGGG AA(SUC2A), GGA AATTA T CCGGGG GC(SUC2B),GCC TTATT T CTGGGG TA(GAL1A),TAT GAATA C CTGGGG TA(GAL3),GCT GAAAA T CTGGGG AA(GAL4),GAC ATTAA T GTGGGG GG(MEL1)等が挙げられる（Molecular and cellular Biology, Mar. 1994, p.1979-1985）
【００３５】
例えば、ＧＡＬ１プロモーターは、配列番号１で表される塩基配列を有することができ、改変されたＧＡＬ１プロモーターは、配列番号２で表される塩基配列を有することができる。なお、ＧＡＬ１遺伝子は、S. cerevisiaeのＧａｌ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ３５８８９）が挙げられる。また、ＧＡＬ１遺伝子はS. cerevisiaeのＧＡＬ１に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。
【００３６】
なお、本明細書において、例えば、Ｇａｌ４タンパク質などと表記するとき、該名称に係るタンパク質のほか、該名称に係るタンパク質以外のタンパク質であって該名称に係るタンパク質の生理活性のうち本発明に必要な生理活性を有しているタンパク質も包含している。したがって、こうした生理活性を有している限り、該名称に係る天然のタンパク質を改変したり人工的に合成したタンパク質も包含される。また、当該タンパク質がサッカロマイセス・セレビジエに由来する場合には、サッカロマイセス・セレビシエ以外の他の細胞のガラクトース誘導系におけるＧａｌ４に相当するタンパク質も包含される。なお、タンパク質を改変するには、天然タンパク質における生理活性部位についての情報が必要である。生理活性部位の情報は、部位特異的変異の挿入等の手法を用いて特定することができる。また、天然タンパク質のホモログ、オルソログ又はパラログを公知の相同性検索システムを用いて検索し、これらのタンパク質間において可能性ある生理活性部部位を特定することによっても得ることができる。
【００３７】
（ＤＮＡ組換えタンパク質）
第１のＤＮＡ領域は、グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されたＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡを含んでいる。第１のＤＮＡ領域の一例を図１（ａ）に示す。図２に示すように、ＤＮＡ組換えタンパク質は、入力信号としてのガラクトースシグナルの付与により、発現される。
【００３８】
ＤＮＡ組換えタンパク質は、ＤＮＡ組換えを生じさせる作用部位を備えている。こうしたＤＮＡ組換えタンパク質としては、種々のタンパク質が既に知られている。例えば、以下のＤＮＡ組換えタンパク質が挙げられる。Ｃｒｅ：バクテリオファージＰ１由来のタンパク質（ＡｂｒｅｍｓｋｉおよびＨｏｅｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５９（３）：１５０９−１５１４（１９８４））は、ｌｏｘＰ（交叉の遺伝子座）部位と呼ばれる３４ｂｐ ＤＮＡ配列間の交換を触媒することが知られている（Ｈｏｅｓｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４（５）：２２８７ （１９８６）を参照のこと）。Ｃｒｅは、マグネシウムまたはスペルミジンのいずれかを含む単純な緩衝液中で働く。多くの変異体ｌｏｘＰ部位が記載されている（Ｈｏｅｓｓら）。
【００３９】
他の組換え系、種々の生物由来の多くの組換え系もまた、本明細書中に提供される教示およびガイダンスに基づいて、使用され得る。例えば、Ｈｏｅｓｓら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４（６）：２２８７（１９８６）；Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６１（１）：３９１ （１９８６）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４（２３）：７４９５（１９９２）；Ｑｉａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７（１１）：７７９４（１９９２）；Ａｒａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５（１）：２５（１９９２）を参照のこと。これらの多くは、リコンビナーゼのインテグラーゼファミリーに属する（Ａｒｇｏｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５：４３３−４４０ （１９８６））。おそらく、これらのうち、バクテリオファージλ由来のインテグラーゼ／ａｔｔ系（Ｌａｎｄｙ，Ａ． （１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：６９９−７０７）、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰ系（ＨｏｅｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４巻、ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＬｉｌｌｅｙ編、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；９０−１０９頁）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ２μ環状プラスミド由来のＦＬＰ／ＦＲＴ系（Ｂｒｏａｃｈら、Ｃｅｌｌ２９：２２７−２３４ （１９８２））が挙げられる。
【００４０】
λＩｎｔに類似の他の部位特異的リコンビナーゼおよびＰ１ Ｃｒｅに類似の他の部位特異的リコンビナーゼは、ＩｎｔおよびＣｒｅを置換してもよい。このようなリコンビナーゼは公知である。
【００４１】
ＤＮＡ組換えタンパク質は、真核細胞での発現を考慮してコドン用法が用いる真核細胞において最適化されていることが好ましい。
【００４２】
（ターミネーター）
第１のＤＮＡ領域は、ＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡについてターミネーターを備えることができる。こうしたターミネーターとしては、真核細胞で利用可能な各種のターミネーターが既に知られている。好ましくは、ターミネーターは、当該ＤＮＡの転写産物の寿命をＣＹＣ１遺伝子のターミネーターよりも短くすることができるターミネーターである。こうしたターミネーターを用いることで、ＤＮＡ組換えタンパク質のｍＲＮＡを、より一過的に存在させることができる。そして、迅速なガラクトース誘導が可能となる。なお、ｍＲＮＡの寿命はマイクロアレイなどを利用して計測できる（ＰＮＡ(2002), 99, 5860-5865）。
【００４３】
こうしたターミネーターとしては、特に限定しないが、例えば、ＭＦＡ２遺伝子のターミネーターや当該遺伝子と同等程度のｍＲＮＡの寿命を有する遺伝子のターミネーターを用いることができる。
【００４４】
本真核細胞は、このような第１のＤＮＡ領域を１又は２以上備えることができる。第１のＤＮＡ領域は、好ましくは、染色体上に備えられる。第１のＤＮＡ領域を複数備える場合、異なる第１のＤＮＡ領域には、それぞれ異なるガラクトース誘導性プロモーターが含まれていてもよい。また、異なる第１のＤＮＡ領域には、それぞれ異なるＤＮＡ組換えタンパク質が含まれていてもよい。本真核細胞は、このような第１のＤＮＡ領域を、通常、外来ＤＮＡとして備えている。
【００４５】
（第２のＤＮＡ領域）
第２のＤＮＡ領域は、プロモーターと、ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含むことができる。第２のＤＮＡ領域の一例を図１（ｂ）に示す。条件（ａ）は、ガラクトースによる遺伝子発現の「オン」から「オフ」へのスイッチングのための条件であり、条件（ｂ）は、ガラクトースによる遺伝子発現の「オフ」から「オン」へのスイッチングのための条件である。
（ａ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下から外れ発現停止となる
（ｂ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下で発現可能となる
【００４６】
プロモーターは、真核細胞で作動するプロモーターを適宜選択して利用できる。こうしたプロモーターは公知であるが、例えば、酵母にあっては、ＡＤＨ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター及びＨＯＲ７プロモーターなどの構成的プロモーターを好ましく用いることができる。
【００４７】
ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位とは、ＤＮＡ組換えタンパク質が認識してＤＮＡの切り出し等の組換えを生じさせる部位である。既に説明したように、ＤＮＡ組換えタンパク質に応じて種々の作用部位が知られている。例えば、Ｃｒｅに対しては、ｌｏｘＰが知られている。こうした部位を特定する塩基配列は公知である。
【００４８】
スイッチングしようとする遺伝子を条件（ａ）で備えるためには、ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位への作用により、当該遺伝子が切り出されるか、あるいは逆位させるように、遺伝子と作用部位を配置すればよい。例えば、遺伝子を切り出すためには、同方向に配置した２つのｌｏｘＰの間に遺伝子を配置する。また、遺伝子を逆位させるには、異なる方向に配置した２つのｌｏｘＰ配列の間に遺伝子を配置する。いずれの場合においても、上流にあるプロモーターの制御下から外れて遺伝子の発現は停止される。
【００４９】
また、遺伝子を条件（ｂ）を備えるためには、ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位への作用により、プロモーターの制御下で発現するように前記遺伝子を逆位させるように遺伝子と作用部位とを配置すればよい。あるいは、予めプロモーターと遺伝子との間に、遺伝子のプロモーターによる発現を妨げる障害領域を備えておき、前記作用により、障害領域が切り出しされるように、遺伝子と作用部位とを配置すればよい。例えば、前者の場合には、異なる方向の２つのｌｏｘＰの間に遺伝子をあらかじめ逆方向に配置し、Ｃｒｅが作用することで、遺伝子が逆位してプロモーターに対して順方向に連結されるようにする。また、後者の場合には、同方向の二つのｌｏｘＰの間に障害領域を備えておき、下流のｌｏｘＰに下流に、プロモーターの制御下で作動可能に遺伝子を配置する。なお、障害領域は、マーカー遺伝子であってもよいし、なんらコードしない領域であってもよい。
【００５０】
本真核細胞は、１又は２以上の第２のＤＮＡ領域を備えることができる。第２のＤＮＡ領域を２以上備える場合、複数の遺伝子を同時に「オン」から「オフ」にスイッチングしたり、逆に複数の遺伝子を同時に「オフ」から「オン」にスイッチングすることができる。また、複数の遺伝子のうちある遺伝子を「オン」から「オフ」にスイッチングし、他の遺伝子を「オフ」から「オン」にスイッチングすることができる。
【００５１】
また、一つの第２のＤＮＡ領域は、２つの遺伝子につき一方を条件（ａ）でスイッチングし、他方を条件（ｂ）でスイッチングするように構成してもよい。例えば、グルコース供給時（Ｃｒｅの非作用時）において、プロモーターの制御下に第１の遺伝子を発現可能に配置する。この第１の遺伝子は、二つのｌｏｘＰを同方向で配置した間に配置する。一方、下流側のｌｏｘＰの下流に、Ｃｒｅ作用時において、プロモーターの制御下に発現可能に第２の遺伝子を配置する。こうすることで、一つの第２のＤＮＡ領域によって、第１の遺伝子の「オン」〜「オフ」と第２の遺伝子の「オフ」〜「オン」を同時に実現できる。こうした第２のＤＮＡ領域を図１（ｂ）に示す。こうした第２のＤＮＡ領域を備えることで、図２に示すように、ＧＦＰからｍＫＯへのスイッチングを同時に行うことができる。なお、こうしたスイッチングは、２以上の第２のＤＮＡ領域によっても実現される。
【００５２】
なお、第２のＤＮＡ領域における遺伝子は、それぞれ、真核細胞の転写開始位置となるTATAボックス配列やターミネーターを備えることができる。また、ＤＮＡ組換えタンパク質の作用の有無を確認するための栄養要求性や薬剤耐性などのマーカー遺伝子を備えていてもよい。第２のＤＮＡ領域は好ましくは、染色体上に備えられる。
【００５３】
（第３のＤＮＡ領域）
本真核細胞は、Ｇａｌ１タンパク質及び/又はＧａｌ２タンパク質の発現が増強されていることが好ましい。これらのタンパク質は、いずれも、転写因子であるＧａｌ４タンパク質による転写活性化を促進するものとして知られている（特開２００７−８９５１２号公報）。本明細書の開示において、これらを発現させることで、ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある遺伝子の発現を、ガラクトースシグナルに対して応答性よく促進できる。これらのタンパク質は、いずれか一方であってもよいが、双方でもよい。双方の発現が増強されていることがより好ましい。さらに、Ｇａｌ３タンパク質の発現が増強されていることも好ましい。こうしたＧａｌ１タンパク質等の発現を増強するには、それぞれ構成的プロモーターの制御下にこれらをコードするＤＮＡを発現可能に備える第３のＤＮＡ領域を、本真核細胞に保持させることが好ましい。好ましくは、こうしたＤＮＡ領域は、本真核細胞の染色体上に備えられる。
【００５４】
こうした第３のＤＮＡ領域の一例を図１（ｃ）に示す。第３のＤＮＡ領域を備えることで、図２に示すように、入力信号としてのガラクトースシグナルを、本来のシグナル伝達経路に加えて、Ｇａｌ２タンパク質及びＧａｌ１タンパク質を介して強化することで、Ｇａｌ４タンパク質による転写活性化を効果的に促進することができる。
【００５５】
なお、Ｇａｌ１タンパク質としては、Ｇａｌ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ３５８８９）のほか。なお、Ｇａｌ１活性タンパク質とは、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ１のほか、Ｇａｌ８０結合活性及び／又はガラクトカイネース活性を有して、Ｇａｌ８０活性タンパク質のＧａｌ４活性タンパク質に対する転写活性阻害作用を解除できるものであればよく、人工的に構築又は改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ１に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。Ｇａｌ２タンパク質としては、Ｇａｌ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ７３２５３）のほか、Ｇａｌ２のガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質を用いることができる。なお、Ｇａｌ２活性タンパク質とは、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ２のほか、ガラクトーストランスポーター活性を有するものであればよく、人工的に構築又は改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ２に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。Ｇａｌ３タンパク質とは、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ７４３０５）のほか、Ｇａｌ８０結合活性を有して、Ｇａｌ８０タンパク質のＧａｌ４タンパク質に対する転写活性阻害作用を解除できるものであればよく、人工的に構築又は改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ３に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。
【００５６】
本真核細胞は、Ｇａｌ４タンパク質をガラクトース誘導的に発現するものであってもよい。すなわち、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にＧａｌ４タンパク質をコードするＤＮＡを保持していてもよい。上記したＧａｌ１、Ｇａｌ２及びＧａｌ３タンパク質等を構成的に発現させるとともに、Ｇａｌ４タンパク質をガラクトース誘導的に発現させることで、ガラクトース誘導系の誘導の応答性を高め、発現強度を増強できる。Ｇａｌ４の全アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ７３６０４）及びＤＮＡ結合活性部位、転写活性化部位等は知られており（D. Lohr et al,TheFASEB Journal (1995), p.777-787）、こうした配列に基づいて人工的なタンパク質を作製するのは当業者であれば容易に行うことができる。ガラクトース誘導性プロモーターとしては、既に開示したプロモーターを用いることができる。好ましくは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０のいずれかのプロモーターであり、より好ましくは、ＧＡＬ１０プロモーターを用いる。
【００５７】
上記各種態様のＤＮＡは、例えば、既に知られた塩基配列やアミノ酸配列に基づいて設計したプライマーを用いて、酵母等の真核微生物等から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリ又はゲノムＤＮＡライブラリ等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、上記ライブラリ等由来の核酸を鋳型とし、目的とするＤＮＡの一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
【００５８】
また、上記各種態様のＤＮＡがタンパク質をコードするものであるとき、例えば、公知のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡを、慣用の突然変異誘発法、部位特異的変異法、エラープローンＰＣＲを用いた分子進化的手法等によって改変することによって取得することができる。このような手法としては、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法が挙げられ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。
【００５９】
そのほか、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、例えば、公知配列に基づいて、各種態様のＤＮＡを取得することができる。
【００６０】
本真核細胞は、第１のＤＮＡ領域、第２のＤＮＡ領域のほか、ガラクトース誘導系の構成タンパク質をコードするＤＮＡが宿主細胞に導入されて得られる形質転換体であることが好ましい。
【００６１】
形質転換体の宿主細胞は、真核細胞であればよく、特に限定されない。物質生産等を考慮すると、麹菌などのカビや酵母が挙げられる。麹菌としては、アスペルギルス・アキュリータス（Aspergillus aculeatus）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus orizae）等のアスペルギルス属が挙げられる。また、酵母としては、公知の各種酵母を利用できるが、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属の酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属の酵母、キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）等のキャンディダ属の酵母、ピキア・スティピティス（Pichia stipitis）等のピキア属の酵母、ハンセヌラ（Hansenula）属の酵母、クロッケラ属（Klocckera）の酵母、スワニオマイセス属（Schwanniomyces）の酵母及びヤロイア属（Yarrowia）の酵母、トリコスポロン（Trichosporon）属の酵母、ブレタノマイセス（Brettanomyces）属の酵母、パチソレン（Pachysolen）属の酵母、ヤマダジマ（Yamadazyma）属の酵母、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）等のクルイベロマイセス属の酵母、イサトケンキア・オリエンタリス（Issatchenkia orientalis）等のイサトケンキア属の酵母が挙げられる。なかでも、本来的にガラクトース誘導系を有する酵母などの単細胞真核生物が好ましい。こうした宿主細胞としては、なかでも、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクティスが好ましいものとして挙げられる。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティスである。
【００６２】
少なくとも、第１のＤＮＡ領域を保持する真核細胞を、遺伝子発現のスイッチング用細胞材料とすることができる。また、当該細胞材料は、第３のＤＮＡ領域やＧａｌ４タンパク質をガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に保持していてもよい。本細胞材料には、こうしたＤＮＡ領域を染色体上に保持していてもよい。
【００６３】
こうした形質転換体を得るには、第１のＤＮＡ領域等を保持する組換えベクターなどのＤＮＡ構築物を用いて宿主細胞を形質転換する。本明細書において、ＤＮＡ構築物は、典型的には、組換えベクターのほか、ＤＮＡ断片の形態も取ることができる。
【００６４】
ＤＮＡ構築物は、第１のＤＮＡ領域、第２のＤＮＡ領域及び第３のＤＮＡ領域から選択される１種又は２種以上を備える遺伝子カセットであてもよい。これら３種のＤＮＡ領域に加えて、Ｇａｌ４タンパク質をガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に備えるＤＮＡ領域が組み合わされてもよい。このカセット又はこうしたＤＮＡ構築物が、第１のＤＮＡ領域の染色体における遺伝子置換、遺伝子破壊等、染色体への所望のＤＮＡ断片の組み込みを意図する場合は、染色体上の所定の領域との相同領域を有していてもよい。相同領域は、第１のＤＮＡ領域を含む所望のＤＮＡ断片を組み込む領域に応じて適宜選択される。こうした遺伝子カセットは、ＤＮＡ断片の形態を取ることができる。
【００６５】
ＤＮＡ構築物は、、第１のＤＮＡ領域、第２のＤＮＡ領域及び第３のＤＮＡ領域から選択される１種又は２種以上を１又は２以上のベクター上に備える、遺伝子スイッチング用材料であってもよい。ベクターは、１又は２以上の上記ＤＮＡ領域を備えることができる。さらに、ベクターは、Ｇａｌ４タンパク質をガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に保持するＤＮＡ領域を組み合わせて備えていてもよい。ベクターとしては、真核細胞用等の種々の公知のベクターを利用できる。各ＤＮＡ領域は、宿主染色体に当該ＤＮＡ領域を組込み可能に相同領域を備えていてもよい。
【００６６】
なお、こうした組換えベクター、ＤＮＡ断片の作製、組換え体宿主としての酵母等の取り扱いに必要な一般的な操作は、当業者間で通常行われているものであり、たとえば、T．Maniatis，J. Sambrookらの実験書（Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982,1989、2001)等を適宜参照することにより当業者であれば実施することができる。
【００６７】
ＤＮＡ構築物の宿主への導入方法としては、従来公知の各種方法、例えば、リン酸カルシウム法、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法または他の方法が挙げられる。このような手法は、上記した実験書等に記載される。ベクターを導入した酵母等の真核細胞につき、マーカー遺伝子を用いた選抜及び活性発現による選抜により本真核細胞を得ることができる。
【００６８】
以上説明した本明細書の開示によれば、遺伝子発現のスイッチングを精度よく行うことができる。すなわち、優れた同調性とともに迅速に遺伝子発現を切替することができる。本明細書の開示によれば、同調性に関しては、スイッチィングに先立つ意図しない「オン」又は「オフ」を効果的に抑制して厳密な遺伝子発現の「オン」又は「オフ」が可能となっている。さらに、ガラクトースシグナル対して応答性よくＤＮＡ組換えタンパク質が発現されるようになっているため、「オン」又は「オフ」へのスイッチングも高いレスポンスで確実に実現できる。また、迅速性に関しては、本明細書の開示によれば、好ましくは２０時間以内、より好ましくは１８時間以内、さらに好ましくは１５時間以内、一層好ましくは１２時間以内、より一層好ましくは１０時間以内に遺伝子発現の「オン」及び／又は「オフ」を実現できる。こうした迅速性は、ガラクトースへの反応性が高められていることにより一層強調される。また、遺伝子発現の「オン」、「オフ」をそれぞれ実現できるとともに、遺伝子に関し「オン」から「オフ」と「オフ」から「オン」へのスイッチングを同時に実現できる。より具体的には、遺伝子Ａの発現を「オン」から「オフ」とし、遺伝子Ｂの発現を「オフ」から「オン」とを同時に実現できるため、実質的には、Ａ遺伝子の発現「オン」からＢ遺伝子の発現「オン」へのスイッチングを実現できる。
【００６９】
（遺伝子発現のスイッチング方法）
本明細書に開示されるガラクトースを用いた遺伝子発現のスイッチング方法は、本真核細胞に対してガラクトースを供給して、前記第２のＤＮＡ領域の前記遺伝子の発現をスイッチングする工程を備えることができる。このスイッチング方法によれば、より精度のよい遺伝子発現のスイッチングが可能となっている。
【００７０】
スイッチング工程は、本真核細胞を培養する工程のいずれかの段階において、グルコースが非存在でガラクトースが存在する状態（グルコース（−）及びガラクトース（＋））を形成する工程である。当該状態が、ガラクトースシグナルである。ガラクトースシグナルが付与される前の状態は、グルコース（＋）及びガラクトース（−）かあるいはグルコース（＋）及びガラクトース（＋）である。好ましくは、グルコース（＋）及びガラクトース（−）である。ここで、グルコース(＋)とは、少なくともグルコースが０．１w/v％以上存在することが好ましい。また、グルコース（−）は、０．０１w/v％以下の濃度であることが好ましい。ガラクトース(＋)とは、少なくともガラクトースが０．０５w/v％以上存在することが好ましい。また、ガラクトース（−）は、０．０１w/v％以下の濃度であることが好ましい。
【００７１】
スイッチング工程は、図３Ａに示すように、一旦、ガラクトースシグナルのある状態を継続してもよいが、図３Ｂに示すように、一時的にのみガラクトースシグナルを付与してもよい。すなわち、ガラクトースシグナルを付与後に、ガラクトース付与前の状態に戻すことが好ましい。すなわち、グルコース（＋）及びガラクトース（−）かあるいはグルコース（＋）及びガラクトース（＋）である。好ましくは、グルコース（＋）及びガラクトース（−）とする。一時的なガラクトースシグナルの付与によれば、より細胞の同調性に優れより迅速なスイッチングが可能となる。こうした一時的なガラクトースシグナルの付与は、ガラクトース濃度が０．１w/v％以上で行うことが好ましい。
【００７２】
（有用物質を生産する方法）
本明細書に開示される有用物質を生産する方法は、本真核細胞であって前記有用物質を生産する細胞に対してガラクトースを供給して、前記第２のＤＮＡ領域の前記遺伝子の発現をスイッチングして、前記有用物質を生産する工程を備えることができる。本生産方法によれば、生産工程においてスイッチングを行うため、本真核細胞による有用物質の生産プロセスを最適化して、高効率な有用物質の生産を実現できるようになる。本生産方法における遺伝子発現のスイッチングに関しては、遺伝子発現のスイッチング方法の各種態様を適用することができる。
【００７３】
本真核細胞は、培養により所望の有用物質を生産可能とすることができる。有用物質を生産可能な真核細胞は、有用物質生産に関する内因性遺伝子及び／又は外因性遺伝子を備えることができる。また、所定の内在性遺伝子が破壊されていてもよい。酵母等は通常嫌気性発酵によりエタノールを生産するが、適宜遺伝子工学的な改変等により他の有用物質を生産可能に形質転換体であってもよい。有用物質生産のための外来性遺伝子は、前記第２のＤＮＡ領域に含まれてスイッチングされる遺伝子とすることもできる。
【００７４】
有用物質としては特に限定しないが、酵母が通常グルコースを利用して生産可能なものであればよい。有用物質は、酵母におけるグルコースからの代謝系の１種又は２種以上の酵素を遺伝子組換えにより置換、追加等して本来の代謝物でない化合物であってもよい。具体的には、エタノールなどの低級アルコール、乳酸、酢酸などの有機酸の他、１，３−プロパン−ジオール、プロパノール、ブタノール、コハク酸、エチレン及びグリセロールのほか、イソプレノド合成経路の追加によるテルペノイド系のファルネソール、ゲラニルゲラニオール、スクアレン、さらには、ファインケミカル（コエンザイムＱ１０、ビタミン及びその原料等）、解糖系の改変によるグリセリン、プラスチック・化成品原料など、バイオリファイナリー技術が対象とする材料が挙げられる。
【００７５】
生産工程では、炭素源として、スイッチングシグナル付与時以外は、グルコース又はスクロースを含有する培地を用いることができる。生産工程では、本真核細胞に一般的に適用される培養条件を適宜選択して用いることができる。典型的には、発酵のための培養は、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下及び好気条件等、適宜選択することができる。培養温度も、特に限定しないが、２５℃〜５５℃等の範囲とすることができる。また、培養時間も必要に応じて設定されるが、数時間〜１５０時間程度とすることができる。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００７６】
こうした生産工程の実施により、用いた本発明の形質転換体が有している有用物質生産能力に応じて有用物質が生産される。例えば、本発明の形質転換体がエタノール生産能力を有している場合には、エタノールであり、乳酸を生産可能に改変されている場合には、乳酸等となる。発酵終了後、培養液から有用物質含有画分を回収する工程、さらにこれを精製又は濃縮する工程を実施することもできる。回収工程や精製等の工程は有用物質の種類等に応じて適宜選択される。
【実施例】
【００７７】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、以下に述べる遺伝子組換え操作はMolecular Cloning： A Laboratory Manual (T. Maniatis, et al., Cold Spring Harbor Laboratory) に従い行った。
【実施例１】
【００７８】
（第１のＤＮＡ領域を含むコンストラクトの作製）
本実施例では、改変されたＧＡＬ１プロモーターの制御下にCreＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡを備える第１のＤＮＡ領域を含むコンストラクト１（図４参照）を作製した。このＤＮＡコンストラクト１は、pSP73（プロメガ）ベクターのXhoI部位とBglII部位の間に、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit（クロンテック）を用い、以下に示す６つの遺伝子断片を順次導入することにより作製した。遺伝子断片１，４〜６は、酵母ゲノムDNAを鋳型とし、KOD plus ver.2（TOYOBO）を用いてPCR反応により合成した。遺伝子断片２である、酵母のコドンに最適化したCre DNA組換え酵素opCre（配列番号４）は委託して合成した。また、GAL1プロモーターのグルコース抑制能を高めるために、元来１つしかないMIG1リプレッサーの結合配列に加えて、pseudoの結合配列をMIG1リプレッサー結合配列へと置き換えた遺伝子断片３であるGAL1m1p（配列番号５）も委託して合成した。すなわち、GAL1プロモーター配列のMIG1のpseud結合配列（偽結合配列）（-272 to -256; GGCCCCACAAACCTTCA）からMIG1結合配列（TTCCCCGCATTTTTATT）へと置き換えた。opCreは遺伝子断片3、GAL1m1pは遺伝子断片2の鋳型として用いた。PCR反応条件は、pre-PCR：94℃ 2分の後、PCR反応：94℃で30秒、50℃で30秒、68℃で1kbpにつき1分、を、30サイクルとした。エクステンション反応は、６８℃で５分とした。それぞれの遺伝子断片の作製とベクターへのpSP73ベクターへのクローニングには、次に示したPCRプライマーと制限酵素を用いた。
【００７９】
遺伝子断片１：GPD1の5’上流配列（XhoI-SpeI, KpnI-ApaI）
プライマー１）TATAGGGAGACCGGCCTCGAGAAACTAGTTTTCCCAGGCAAGGT GAC（配列番号６）
プライマー２）CATCCAAAAAAAAAGTGGGCCCTTGGTACCAAGCCAGTCTACGT GCGAAT（配列番号７）
遺伝子断片２：GAL1m1pプロモーター（ApaI, BamHI）
プライマー１）ACGTAGACTGGCTTGGTACCAAGGGCCCACTTTTTTTTTGGATG GACG（配列番号８）
プライマー２）CAGGCAAGTATTTCGAGCTCAAAAGCTTAAGCATGCAAGGATCC TATAGTTTTTTCTCCTTGAC（配列番号９）
遺伝子断片３：opCre（BamHI, SphI）
プライマー１）AAAAACTATAGGATCCATAATGTCTAACTTGTTGACTG(配列番号１０)
プライマー２）TCCTCGAAGCTTAAGCATGCTCAATCACCATCTTCCAAC（配列番号１１）
遺伝子断片４：MFA2ターミネーター（SphI, HindIII）
プライマー１）AAGATGGTGATTGAGCATGCTTTTTGACGACAACCAAGAG（配列番号１２）
プライマー２）GTTCTCCTCGAAGCTTGGAGGGAAAGGCGTATCAG（配列番号１３）
遺伝子断片５：LEU2栄養要求性マーカー遺伝子（HindIII, SacI）
プライマー１）TTGCATGCTTAAGCTTCGAGGAGAACTTCTAGTA（配列番号１４）
プライマー２）CAGGCAAGTATTTCGAGCTCGACTACGTCGTAAGGC（配列番号１５）
遺伝子断片６：GPD1の3’下流配列（SacI, BglII）
プライマー１）TACGACGTAGTCGAGCTCGAAATACTTGCCTGGCATC（配列番号１６）
プライマー２）GAACCAGATCTATTGGCCATTCAACAACTC（配列番号１７）
【実施例２】
【００８０】
本実施例では、第２のＤＮＡ領域を含むコンストラクト２（図５参照）を作製した。図５に示すコンストラクト２は、pSP73（プロメガ）のXhoI部位とBglII部位の間に、ライゲーション反応を用いて、以下に示す７種類の遺伝子断片を順次、ライゲーションによって導入して作製した。遺伝子断片１〜３及び７は、酵母ゲノムDNAを鋳型とし、PCR反応により合成した。次に示したPCRプライマーと制限酵素を用いた。遺伝子断片４〜６は委託して合成した。
【００８１】
遺伝子断片１：PDC6の5’上流配列（BglII-ClaI, EcoRI）
プライマー１）AGATCTATCGATTCTTTCCTCACGGACCAT（配列番号１８）
プライマー２）GAATTCGATCTAGGTGCAGATACAG（配列番号１９）
遺伝子断片２：TDH3プロモーター１(-676 to -381)（EcoRI, EcoRI）
プライマー１）GAATTCGAGTTTATCATTATCAATAC(配列番号２０)
プライマー２）GAATTCTTTACCTATGAACTGATG(配列番号２１)
遺伝子断片３：TDH3プロモーター２(-676 to -381)（EcoRI, SacI）
プライマー１）GAATTCGAGTTTATCATTATCAATAC（配列番号２２）
プライマー２）GAGCTCACCTATGAACTGATGGTTG（配列番号２３）
遺伝子断片４：loxP- CYC1 TATA box(-123 to -1)-GFP+PEST-TPS1t合成配列（SacI, BamHI）（配列番号２４）
遺伝子断片５：ハイグロマイシン耐性遺伝子（Hygr）合成配列（BamHI, BlnI-Pst）（配列番号２５）
遺伝子断片６：loxP- CYC1 TATA box(-123 to -1)-mKO2-TPS1t合成配列（BlnI, PstI）（配列番号２６）
遺伝子断片７：PDC6の3’上流配列（PstI, ApaI-XhoI）
プライマー１）CTGCAGCCATTAGTAGTGTACTCA（配列番号２７）
プライマー２）CTCGAGTGGGCCCTGTGCAGATGCAGATGTG（配列番号２８）
【実施例３】
【００８２】
本実施例では、Ｇａｌ１タンパク質及びＧａｌ２タンパク質を構成的に発現させるためのコンストラクト３（図６参照）を作製した。図６に示すコンストラクト３は、pBluescript SK-（Stratagene）のKpnI部位とSacI部位の間に、ライゲーション反応を用いて、以下に示す３つの遺伝子断片を順次、ライゲーションによって導入して作製した。遺伝子断片1と2は、委託して合成した。遺伝子断片3は、酵母ゲノムDNAを鋳型とし、PCR反応により合成した。次に示したPCRプライマーと制限酵素を用いた。
【００８３】
遺伝子断片１：HIS3p (-311 to -1)-GAL1-CYC1t (+1 to +215)（KpnI, SalI）（配列番号２９）
遺伝子断片２： HIS3p (-311 to -1)-GAL1-CYC1t (+1 to +215)（SalI, SalI）（配列番号３０）
遺伝子断片３： URA3栄養要求性マーカー遺伝子（SalI, SacI）
プライマー１）GTCGACGATTCGGTAATCTCCGAAC（配列番号３１）
プライマー２）GAGCTCGGGTAATAACTGATATAATTA（配列番号３２）
【実施例４】
【００８４】
（酵母への遺伝子導入）
本実施例では、野生型酵母W303-1aを親株として図６に示すコンストラクト３を導入した株に対して、図５に示すコンストラクト２を遺伝子導入した。続いて、図５及び６に示すコンストラクトが導入された株に対して、図４に示すコンストラクト１を導入した。具体的には以下の手順で行った。
【００８５】
まず、宿主となる酵母をYPD液体培地を用いて、30℃で対数増殖期（OD660=0.4〜0.6）まで培養し、Frozen-EZ Yeast Transformation IIキット（ZYMO RESEARCH社）で処理してコンピテントセルを調整した。次いで、図５に示すコンストラクト２は制限酵素ClaI, ApaIで、図４に示すコンストラクト１は制限酵素BglII, SpeIで、図６に示すコンストラクト３は制限酵素NcoIでそれぞれ処理して断片化した。次いで、コンピテントセル50μLに断片化したコンストラクト50μgを加え、PEGバッファーで希釈した。これを45分間加温し、形質転換した。これらの形質転換酵母を洗浄後、コンストラクト２の場合は、3mlの2%YPAD培地を加えて30℃で3時間培養した後、培養液250μlをハイグロマイシン選択培地（150μg/ml）に塗布した。コンストラクト１の場合は、滅菌水に懸濁してロイシン選抜培地に塗布した。コンストラクト３の場合は、滅菌水に懸濁してウラシル選抜培地に塗布した。30℃で1昼夜静置培養して形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーをそれぞれの選択培地で培養し、生育能を安定に保持している株を選択して、コロニーPCRを行い、目的遺伝子の導入を確認し、コンストラクト１、２及び３の３つの遺伝子が導入された遺伝子組換え酵母をC22株とした。
【実施例５】
【００８６】
本実施例では、サイリスタ様の遺伝子スイッチとしての特徴を生かすために、通常のガラクトース誘導は図７のＡのように、誘導をかけた後は高ガラクトース状態を継続するところを、図７のＢのようにパルス的に高ガラクトース状態を与えた。誘導終了時刻t_1は１時間に設定した。具体的には以下のように行った。すなわち、酵母C22株をグルコース液体培地に植菌し、濁度（Optical Density、660nm）が0.7-1.0まで培養した。培養液から菌体を回収してグルコース培地を除いて、ガラクトース液体培地に交換して（ガラクトース誘導）培養した。ガラクトース誘導を止めるために、再度グルコース液体培地に交換し振盪を続けた。ガラクトース液体培地への交換により、ガラクトース誘導を始めた時刻を0時とした。誘導開始後10時間まで、1時間ごとにサンプリングし、フローサイトメトリーを行った。また、適宜、顕微鏡観察も行った。
【００８７】
（顕微鏡観察）
培養した酵母用液を遠心分離して菌体を回収し、これに、用いた培養液の1/5容量の生理的食塩水を加えて懸濁した。懸濁液をスライドグラスに取り、オールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000（キーエンス）を用い観察した。視野と焦点を調節したあと、CCDカメラを用いた写真撮影を、光学像、緑色蛍光象、赤色蛍光象のそれぞれについて以下の条件で行った。また、イメージの記録はRGBモード（各色8bit）で行った。合成イメージは、赤色蛍光象のRレイヤーと緑色蛍光象のGレイヤーとをPhotoshop（Adobe社）を用いて重ね合わせた。結果を図８に示す。
【００８８】
スライドグラス：MAS-GP typeA（Matsunami）
カバーグラス：18 x 18mm No.1（Matsunami）
対物レンズ：Plan Apo VC 60xH（Nikon）
励起光：水銀アークランプ
BPフィルターセット： 励起（475/20）、DCM（500）、BA（510/23）。
励起時間：光学像 1/30秒、緑色蛍光 2秒、赤色蛍光 1/2.5秒。
【００８９】
図８左図に示すように、ガラクトース誘導開始時点で、若干の赤く光る細胞（ｍＫＯ２発現細胞）が観察された。これは、培養中にCreがリークして発現したため、誘導を行う前に組み換えが起こった細胞であると考えられる。しかし、重ね合わせイメージでオレンジ色に光っているものは観察されず、両方の遺伝子が同時に発現している細胞はほとんど含まれていないと考えられた。以上のことから誘導開始前においては、Ｃｒｅの意図しない発現を効果的に抑制できていることがわかった。
【００９０】
図８右図に示すように、誘導開始後１０時間の顕微鏡像には、緑色に光る細胞（ＧＦＰ発現細胞）及びオレンジ色（ＧＦＰ及びＭＫＯ２発現細胞）に光る細胞が若干観察されるが、大部分が赤色に光っていた。緑色に光る細胞は、Creが誘導されておらず、組み換えが起こっていないと考えられる。また、オレンジ色に光る細胞では、組み換えが正常に起こっていない、あるいはGFPの分解が十分でないと考えられた。以上のことから、ＧＦＰ遺伝子の「オン」から「オフ」へのスイッチング及びｍＫＯ２遺伝子の「オフ」から「オン」へのスイッチングは優れた同調性でかつ迅速に行われていることがわかった。
【００９１】
（フローサイトメトリー）
フローサイトメトリーは、Beckman-Coulter社のCell Lab Quanta SC MPLを用いた。蛍光はCell Lab Quanta SCに組み込みの488nmのレーザーで励起した。mKO2（及びGFP）に最適化したフィルターセットとして、表１のフィルター及びミラー（Opt Science社）を用いた。
【００９２】
【表１】
【００９３】
フローサイトメーターのゲインとフォトマル電圧は、標準株（B51）の出力（FL2/SS、後述）がおよそ1となるように調整した。また、FL1（蛍光1チャンネル）からの漏れこみを相殺するようにコンペンセーションを設定した。サンプル中のごみ及びノイズを除去するため、SS（側方散乱）、EV（電気体積）及びFL2（蛍光2チャンネル）にウインドウを設定し、データーを選別した。条件を満たす細胞がおよそ5000個（乃至10000個）になるまで測定を続けた。蛍光強度を酵母の細胞の大きさに因らない値で評価するため、SSが細胞の大きさに比例するとの仮定の下、FL1/SS、FL2/SSをそれぞれGFP出力、mKO2出力と定義した。出力の分布をIgor Pro（Wavemetrics社）を用いて以下のように計算した。
【００９４】
【数１】
【００９５】
なお、mKO2の相対蛍光出力が必要な場合は、GFPと同様の方法で計算した（GFPとmKO2を読み換え、FL1をFL2に読み替える）。また、出力分布を表示する場合、度数分布をイメージ表示した。すなわち、Z軸の値0→1が白→黒のグラデーションとなるように着色した。時系列の出力分布イメージをファイルに保存し、ImageMagick (http://www.imagemagick.org) を用いてGIFアニメーションを作成した。出力の経時変化を静的に表示する場合には、標準株の差分表示イメージ上に出力の重心をプロットした。さらに、二つの標準株の出力を同一のイメージに表示するため、差分表示を行った。GFP標準（ρGFP）とmKO2標準（ρmKO2）の度数分布の差ρdiff＝ρmKO2−ρGFPを計算し、これをイメージ表示した。Z軸の値-1→0→1が緑→白→赤のグラデーションとなるように着色した。
【００９６】
さらに、詳細にスイッチの切り替えに伴う遺伝子の出力の変化（GFPとmKO2の蛍光強度の変化）を解析するために、細胞の大きさを相殺することにより、体積あたりの蛍光強度の比較が可能なFL1/SS値とFL2/SS値を使って出力分布の変化を調べた。結果を図９に示す。
【００９７】
図９に示すように、誘導前（図９Ｃ）及び誘導開始後１０時間（図９Ｄ）の出力分布は、それぞれ、GFP標準株及びmKO2標準株のものとほぼ等しかった。また、出力の重心は図９Ｂのように移動した。以上のことから、ＧＦＰ遺伝子の出力は、誘導開始後１０時間でほぼ完全にｍＫＯ遺伝子の出力にスイッチングされたことがわかった。また、誘導開始から４時間後にＧＦＰの出力が低下し始めた。７時間後には、GHP遺伝子の出力がほぼオフになることがわかった。また、別途行ったサザンハイブリダイゼーションの結果から誘導開始後、２時間で遺伝子型の切替えが生じていることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００９８】
配列番号２，５：改変したＧＡＬ１プロモーター
配列番号６〜２３、２７、２８、３１、３２：プライマー
配列番号２４、２５、２６、２９、３０：コンストラクト用ＤＮＡ断片
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトース誘導系を備えるとともに、
グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域と、
プロモーターと、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含む、第２のＤＮＡ領域と、
を備える、遺伝子の発現の切替えをするための遺伝子スイッチを備える真核細胞。
（ａ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下から外れ発現停止となる
（ｂ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下で発現可能となる
【請求項２】
前記ガラクトース誘導性プロモーターは、２個以上のＭｉｇ１レプレッサー結合部位を有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記ガラクトース誘導性プロモーターは、改変されたＧＡＬ１プロモーターである、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記改変されたＧＡＬ１プロモーターは、配列番号２で表される塩基配列を有する、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記第１のＤＮＡ領域は、前記ＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡの転写産物の寿命をＣＹＣ１遺伝子のターミネーターよりも短くすることができるターミネーターを備えている、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
前記ターミネーターは、ＭＦＡ２遺伝子のターミネーターである、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
前記第２のＤＮＡ領域は、前記条件（ａ）で配置される遺伝子を第１の遺伝子として備えるとともに、前記条件（ｂ）で配置される遺伝子を第２の遺伝子として備える、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
Ｇａｌ１活性を有するタンパク質とＧａｌ２活性を有するタンパク質の発現が増強されている、請求項１〜７のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
前記第１のＤＮＡ領域及び前記第２のＤＮＡ領域を、前記細胞の染色体上に備える、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞は、酵母細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１】
グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域を備える、遺伝子発現のスイッチング用細胞材料。
【請求項１２】
遺伝子の発現の切替えするための遺伝子スイッチングカセットであって、
グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、カセット。
【請求項１３】
遺伝子発現スイッチング用材料であって、
グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域と、
プロモーターと、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含む、第２のＤＮＡ領域と、を１又は２以上のベクター上に備える、材料。
（ａ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下から外れ発現停止となる
（ｂ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下で発現可能となる
【請求項１４】
前記１又は２以上のベクターは、構成的プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＧａｌ１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、構成的プロモーターの制御下の発現可能に連結されるＧａｌ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、備える、請求項１３に記載の材料。
【請求項１５】
ガラクトースを用いた遺伝子発現のスイッチング方法であって、
請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞に対してガラクトースを供給して、前記第１の遺伝子の発現をスイッチングする工程を備える、方法。
【請求項１６】
前記切替え工程は、一時的にのみガラクトースを供給する工程である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
有用物質を生産する方法であって、
請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞であって前記有用物質を生産する細胞に対してガラクトースを供給して、前記遺伝子の発現をスイッチングして、前記有用物質を生産する工程を備える、方法。
【請求項１】
ガラクトース誘導系を備えるとともに、
グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域と、
プロモーターと、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含む、第２のＤＮＡ領域と、
を備える、遺伝子の発現の切替えをするための遺伝子スイッチを備える真核細胞。
（ａ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下から外れ発現停止となる
（ｂ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下で発現可能となる
【請求項２】
前記ガラクトース誘導性プロモーターは、２個以上のＭｉｇ１レプレッサー結合部位を有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記ガラクトース誘導性プロモーターは、改変されたＧＡＬ１プロモーターである、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記改変されたＧＡＬ１プロモーターは、配列番号２で表される塩基配列を有する、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記第１のＤＮＡ領域は、前記ＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡの転写産物の寿命をＣＹＣ１遺伝子のターミネーターよりも短くすることができるターミネーターを備えている、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
前記ターミネーターは、ＭＦＡ２遺伝子のターミネーターである、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞。
【請求項７】
前記第２のＤＮＡ領域は、前記条件（ａ）で配置される遺伝子を第１の遺伝子として備えるとともに、前記条件（ｂ）で配置される遺伝子を第２の遺伝子として備える、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
Ｇａｌ１活性を有するタンパク質とＧａｌ２活性を有するタンパク質の発現が増強されている、請求項１〜７のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
前記第１のＤＮＡ領域及び前記第２のＤＮＡ領域を、前記細胞の染色体上に備える、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞は、酵母細胞である、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１】
グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域を備える、遺伝子発現のスイッチング用細胞材料。
【請求項１２】
遺伝子の発現の切替えするための遺伝子スイッチングカセットであって、
グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、カセット。
【請求項１３】
遺伝子発現スイッチング用材料であって、
グルコースによる抑制効果が増強されたガラクトース誘導性プロモーターと、前記ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＤＮＡ組換えタンパク質をコードするＤＮＡと、を含む、第１のＤＮＡ領域と、
プロモーターと、前記ＤＮＡ組換えタンパク質の作用部位と、以下の条件（ａ）及び（ｂ）のいずれかで前記プロモーターと前記作用部位に対して配置される遺伝子と、を含む、第２のＤＮＡ領域と、を１又は２以上のベクター上に備える、材料。
（ａ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下から外れ発現停止となる
（ｂ）前記ＤＮＡ組換えタンパク質が前記作用部位に作用したときに、前記プロモーターの制御下で発現可能となる
【請求項１４】
前記１又は２以上のベクターは、構成的プロモーターの制御下に発現可能に連結されるＧａｌ１活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、構成的プロモーターの制御下の発現可能に連結されるＧａｌ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡと、備える、請求項１３に記載の材料。
【請求項１５】
ガラクトースを用いた遺伝子発現のスイッチング方法であって、
請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞に対してガラクトースを供給して、前記第１の遺伝子の発現をスイッチングする工程を備える、方法。
【請求項１６】
前記切替え工程は、一時的にのみガラクトースを供給する工程である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
有用物質を生産する方法であって、
請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞であって前記有用物質を生産する細胞に対してガラクトースを供給して、前記遺伝子の発現をスイッチングして、前記有用物質を生産する工程を備える、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−２４０４１（Ｐ２０１２−２４０４１Ａ）
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１６７５３９（Ｐ２０１０−１６７５３９）
【出願日】平成２２年７月２６日（２０１０．７．２６）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月９日（２０１２．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２６日（２０１０．７．２６）
【出願人】（０００００３６０９）株式会社豊田中央研究所 (4,200)
【Ｆターム（参考）】
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