動物細胞培養用培地
【課題】血清培地又は無血清培地に添加することで、動物細胞の増殖率を高めることができる因子を提供すること。
【解決手段】β−コングリシニン濃縮物の加水分解物は動物細胞の増殖促進活性を示す。
【解決手段】β−コングリシニン濃縮物の加水分解物は動物細胞の増殖促進活性を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞培養用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞、特に哺乳動物細胞を培養する際に、細胞を効率的に増殖させることは重要である。例えば、抗体、酵素、ホルモンなどの有用物質を産生する細胞であれば、細胞の増殖率を高めることで、有用物質を効率よく製造することが可能である。あるいは、皮膚細胞、軟骨細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞といった細胞の増殖率を高めることで、効率のよい再生医療が行われることが期待できる。
【０００３】
細胞増殖率を高めることを目的として、培地にウシ血清やウシ血清から分離した蛋白質成分を添加することがよく行われている。しかしながら近年では、血清中に混入する不要物、例えば、ウシ由来の抗体、ウイルス、病原性プリオンなどが混入することは好ましくなく、無血清培地の開発が進められている。そして、特許文献１では、大豆蛋白質加水分解物及び酵母抽出物を無血清培地に添加して、細胞増殖率を高めることが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５２００１４号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１２９６４７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００２／０２８１９８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９８／４４８０７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００９／０３５８５２号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００６／１３４７５２号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍ．Ｓａｍｏｔｏら，Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０２巻，３１７−３２２頁，２００７年
【非特許文献２】Ｓ．Ｋｕｄｏｕら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５巻，２２２７?２２３３頁、１９９１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血清培地又は無血清培地に添加することで、動物細胞の増殖率を高めることができる因子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、大豆β−コングリシニン濃縮物の加水分解物を血清培地又は無血清培地に添加した培地で動物細胞を培養すると、細胞増殖率を高めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
（１）β−コングリシニン濃縮物の加水分解物を含む動物細胞培養用培地。
（２）無血清培地である、上記（１）に記載の培地。
（３）β−コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる動物細胞増殖促進剤。
（４）β−コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる抗体産生促進剤。
（５）上記（１）又は（２）に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
（６）上記（１）又は（２）に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の増殖を促進する方法。
（７）動物細胞培養用培地にβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加する、上記（１）又は（２）に記載の培地の製造方法。
（８）上記（１）又は（２）に記載の培地中で動物細胞を培養し、動物細胞から産生される有用物質を培地から単離する、有用物質の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、動物細胞の増殖率を高めることができ、その結果、有用物質を効率よく製造することができ、また、再生医療の効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図である。
【図２】ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
【図３】無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図である。
【図４】無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
（大豆蛋白質）
一般の大豆に含まれる蛋白質は、超遠心分析による沈降係数から、２Ｓ、７Ｓ、１１Ｓ及び１５Ｓの各種グロブリンが含まれている。このうち、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンは主要な酸沈殿生の構成蛋白質成分である。本発明におけるβ−コングリシニンは７Ｓグロブリンに相当するものであり、β−コングリシニン濃縮物は蛋白質中のβ−コングリシニンの割合が高められたものをいう。一方、グリシニンは１１Ｓグロブリンに相当するものである。さらに、大豆蛋白質中には上記グロブリン以外にも酸沈殿性大豆蛋白質群が存在し、これらはレシチンや糖脂質などの極性脂質を多く随伴するために、包括的に、脂質親和性蛋白質（ＬＰ）と呼ばれている（特許文献２参照）。
【００１３】
（β−コングリシニンの濃縮）
本発明の動物細胞培養用培地に添加される窒素源としては、通常の大豆粉末や分離大豆蛋白質から調製された加水分解物ではなく、動物細胞用培地が優れた細胞増殖促進活性を発揮するために、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物が必須である。該濃縮物中のβ−コングリシニン含量は、粗蛋白質に対して４０重量％以上含まれていることが好ましく、５０重量％以上含まれていることがより好ましい。大豆からβ−コングリシニン濃縮物を調製する方法は公知であり、大きく類別して一般的な組成の大豆から蛋白質を抽出又は濃縮したものからβ−コングリシニンを分画する方法と、予め育種や遺伝子組換技術によりβ−コングリシニンを濃縮させた大豆から蛋白質を抽出又は濃縮する方法がある。例えば、前者の例としては非特許文献１、特許文献２及び特許文献３などに記載の方法が挙げられる。また後者の例としては特許文献４や特許文献５などに記載の方法が挙げられる。これらの調製方法によれば、β−コングリシニン濃縮物におけるβ−コングリシニンの含量を、粗蛋白質に対して６０重量％以上あるいは８０重量％以上とすることが可能である。
【００１４】
（β−コングリシニン濃縮物の加水分解）
本発明に係るβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物は、上記β−コングリシニン濃縮物をプロテアーゼ処理することによって得られるペプチド混合物である。β−コングリシニン濃縮物の加水分解物は分解度がより高いことが好ましく、特に加水分解物中におけるペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及びトリペプチドの割合が高いことが好ましい。具体的には、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及びトリペプチドの割合が６０重量％以上であることが好ましく、６４重量％以上であることがより好ましい。なお本願では、ジペプチド及びトリペプチドを、分子量５００以下の画分から遊離アミノ酸を除いた画分と規定した。したがって、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及びトリペプチドの割合は、ペプチド用ゲルろ過クロマトグラフィーにより加水分解物中の分子量５００以下のペプチド画分の割合を測定した後、アミノ酸分析により測定した加水分解物中の遊離アミノ酸含量を差し引くことにより算出することが可能である。蛋白質中の遊離アミノ酸含量は１０重量％以下であることが好ましく、５重量％以下であることがより好ましい。さらに、ペプチド体はより低分子であることが望ましいことから、加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める分子量５００以上の画分の割合は４０重量％以下であることが好ましく、３５重量％以下であることがより好ましい。
【００１５】
加水分解物を得るために使用するプロテアーゼは、動物起源、植物起源又は微生物起源を問わず、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」、「酸性プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼ、好ましくは「金属プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から適宜選択することができる。特に２種類以上、あるいは３種類以上の異なった分類に属する酵素を、順次若しくは同時に作用させる分解方法がジペプチドやトリペプチド等の比較的分子量の低いペプチドの割合を増加させることができ好ましい。
【００１６】
このプロテアーゼの分類は、酵素科学の分野において通常行なわれている活性中心のアミノ酸の種類による分類方法である。各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはＢａｃｉｌｌｕｓ中性プロテアーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ中性プロテアーゼ、サモアーゼ等、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ酸性プロテアーゼ、スミチュームＡＰ等、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン、パパイン等、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓアルカリプロテアーゼ、アルカラーゼ、ビオプラーゼ等が挙げられる。これら以外の酵素でも作用ｐＨや阻害剤との反応性により、その分類を確認することができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なるため、「切れ残り」を減らし、効率よく酵素分解物を得ることができる。また、異なった起源の（起源生物）の酵素を併用することで、更に効率よく酵素分解物を製造することができる。同分類でも起源が異なれば、基質である蛋白質への作用部位も異なり、結果としてジペプチドやトリペプチドの割合を増やすことができる。これらプロテアーゼはエキソ活性が少ないことが好ましい。
【００１７】
プロテアーゼ処理の反応ｐＨや反応温度は、用いるプロテアーゼの特性に合わせて設定すれば良く、通常、反応ｐＨは至適ｐＨ付近で行ない、反応温度は至適温度付近で行なえば良い。概ね反応温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃である。反応後は酵素を失活させるのに十分な温度（６０〜１７０℃程度）まで加熱し、残存酵素活性を失活させる。
【００１８】
プロテアーゼ処理後の反応液は、そのまま又は濃縮して用いることもできるが、通常、殺菌し、噴霧乾燥、凍結乾燥等して乾燥粉末の状態で利用する。殺菌は、加熱殺菌が好ましく、加熱温度は１１０〜１７０℃が好ましく、１３０〜１７０℃が更に好ましい。加熱時間は３〜２０秒間が好ましい。また、反応液を任意のｐＨに調整してもよく、またｐＨ調整時に発生する沈殿物や懸濁物を遠心分離や濾過等により除去してもよい。更に活性炭や吸着樹脂により精製してもよい。
【００１９】
（動物細胞培養用培地への利用）
このようにして得られたβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物を動物細胞培養用培地に添加することで、本発明の動物細胞培養用培地を製造することができる。β−コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加する基本培地は、血清含有培地であってもよく無血清培地であってもよく、基本培地の種類は特に限定されず市販されている培地を使用することができる。好ましい基本培地は培養する動物細胞の種類によって異なり、当業者が適宜選択することができる。β−コングリシニン濃縮物の加水分解物の添加量は、培養する動物細胞の種類によって異なるが、望ましくは動物細胞培養用培地当たり、乾燥させた加水分解物として０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜２重量％の濃度にて高い効果を得ることができる。
【００２０】
（動物細胞の増殖促進効果及び有用物質の産生促進効果）
本発明の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養すると、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物により動物細胞の細胞増殖が促進される。これにより、増殖が促進される動物細胞がヒトの生体に有用な物質を産生する種類のものである場合は、動物細胞による該有用物質の産生も促進されうる。例えば、培養する動物細胞が抗体産生細胞の場合は、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物の作用により抗体産生が促進される。したがって、本発明の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養して有用物質を産生させ、これを培地から常法により単離することにより、有用物質を効率的に製造することができる。動物細胞から産生される各種有用物質としては抗体の他、酵素やホルモン等が挙げられる。
【００２１】
本発明の動物細胞培養用培地で培養する動物細胞の種類は特に限定されない。具体的には、抗体、酵素（ウロキナーゼ等）、ホルモン（インシュリン等）、サイトカイン（インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、成長因子等）、その他の生理活性蛋白質・ペプチドなどの有用物質を産生する動物細胞が挙げられ、かかる動物細胞としては、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、腎細胞等の非形質転換細胞や、コードする遺伝子や有用物質の生合成に関与する遺伝子を導入した形質転換細胞が例示される。形質転換細胞の例としては、マウスミエローマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの抗体産生細胞などが挙げられる。これらの動物細胞を培養して有用物質を効率的に製造することができる。また、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などを培養し、効率的に増殖させることにより、これらを再生医療の分野にも利用することができる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
【００２３】
実施例で用いた測定方法について以下にまとめる。
【００２４】
（蛋白質含量）
１０５℃、１２時間乾燥した大豆蛋白質画分の重量に対して、ケルダール法により測定した蛋白質量の重量を、乾燥物中の蛋白質含量として重量％で表した。なお、窒素換算係数は６．２５とした。
【００２５】
（β―コングリシニン含量）
β−コングリシニンはＥＬＩＳＡ法により定量を行った。サンプル０．１ｇを精秤し、５０ｍｌ栓付三角フラスコ中に入れ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）２．５ｍｌ及び８Ｍ Ｕｒｅａ−ＤＴＴ緩衝液７．５ｍｌを添加した。１００℃で１時間抽出した。抽出後シスチンを含む０．４Ｍ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ９．０）で再会合させた後、１００ｍｌに定容し、ろ過液をＥＬＩＳＡ用サンプルとした。ＥＬＩＳＡ用９６ウェルＥＩＡマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ（株）製）にサンプル及び検量線用β−コングリシニン（不二製油（株）製）をそれぞれ４℃で１日間保存することで固定化し、ブロッキング液（大日本住友製薬（株）製）を２００μｌ加え３７℃で２時間インキュベートしブロッキングした。ブロッキング後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３回洗浄した。次に、１次抗体として０．５μｇ／ｍｌの抗β−コングリシニンウサギポリクロナール抗体（タカラバイオ（株）製）を１００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で３回洗浄した。その後、２次抗体として０．１μｇ／ｍｌのペルオキダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ（株）製）を１００μｌ添加し３７℃で１時間インキュベートした。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で３回洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ Ｍｉｃｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ（株）製）を１００μｌ加え５分間発色させた。１Ｎ硫酸を１００μｌ加え発色反応を停止後、波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。測定後、検量線用β−コングリシニンの吸光度を用いて検量線を作成し、サンプルのβ−コングリシニン含量を算出し、ケルダール法で算出した全蛋白質に対する比率を求めた。
【００２６】
（ジペプチド・トリペプチド含量）
大豆蛋白質画分の加水分解物の分子量分布を、以下のゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ法により測定した。ペプチド用ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣシステムを組み、分子量マーカーとなる既知のペプチドをチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を求めた。なお、分子量マーカーは、オクタペプチドとして［β−Ａｓｐ］−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩのβ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（分子量１０４６）、ヘキサペプチドとしてＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＶのＶａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（分子量７７５）、ペンタペプチドとしてＬｅｕ−ＥｎｋｅｐｈａｌｉｎのＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（分子量５５５）、トリペプチドとしてＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（分子量４０５）、遊離アミノ酸としてＰｒｏ（分子量１１５）を用いた。加水分解物（１％）を１０，０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離した上清を、ゲル濾過用溶媒で２倍に希釈し、その５μlをＨＰＬＣにアプライした。加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める分子量５００以下のペプチド画分の割合（％）を、全体の吸光度のチャート面積に対する、分子量５００以下の範囲（時間範囲）の面積の割合によって求めた（使用カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ７．５／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、溶媒：１％ＳＤＳ／１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、カラム温度２５℃、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２２０ｎｍ）。
次に、アミノ酸分析により大豆蛋白質画分の加水分解物中の遊離アミノ酸含量の測定を行った。加水分解物（４ｍｇ／ｍｌ）を等量の３％スルホサリチル酸に加え、室温で１５分間振とうした。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上澄みを０．４５μｍフィルターでろ過し、アミノ酸分析器（日本電子製 ＪＬＣ５００Ｖ）にて、遊離アミノ酸を測定した。蛋白質中の遊離アミノ酸含量はケルダール法にて得られた蛋白質含量に対する割合として算出した。
以上より得られた、「分子量５００以下のペプチド画分の割合」から「遊離アミノ酸含量」を差し引いた値を、加水分解物中の「ジペプチド・トリペプチド含量」とした。
【００２７】
（イソフラボン含量）
大豆イソフラボンとして１〜１０ｍｇに相当する量の試料を定量し、７０％エタノールにて１００ｍｌに定容した。そして０．４５μｍＰＶＤＦフィルターにて濾過したものを試験溶液とした。標準品は１２種類、すなわちダイジン、ゲニスチン、グリシチン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、マロニルダイジン、マロニルゲニスチン、マロニルグリシチン、アセチルダイジン、アセチルゲネスチン、アセチルグリシチン（和光純薬工業株式会社）を用いた。ＨＰＬＣの条件については非特許文献３に記載の条件に準拠した。定量にはダイゼイン標準品を用い、各換算値を用いて算出した。
【００２８】
（製造例１）各種大豆蛋白質画分の調製
非特許文献１に記載の方法に準じて以下の通り、β―コングリシニン濃縮物、グリシニン濃縮物及びＬＰ濃縮物の各大豆蛋白質画分を調製した。
（１）低変性脱脂大豆に加熱処理を施してＮＳＩ（水溶性窒素指数、ＡＯＣＳ公式分析法ＢＡ−１１−６５ ＮＳＩによる）を低下させた脱脂大豆（ＮＳＩ７０％）の温水抽出スラリーを遠心分離機にてオカラ画分を除き脱脂豆乳とした。
（２）次に脱脂豆乳のｐＨを５．８に調整して遠心分離機にて沈殿カード画分を回収した。この画分が１１Ｓグロブリンである「グリシニン」の濃縮物である。
（３）次に、残りの上清のｐＨを５．０に調整し、５５℃で１０分間放置後、次いでｐＨ５．５に調整後、遠心分離機にて沈殿カード画分を回収した。この画分が、脂質親和性蛋白質である「ＬＰ」の濃縮物」である。
（４）次に、残りの上清のｐＨを４．５に調整し、遠心分離機にて沈殿カードを回収した。この画分が７Ｓグロブリンである「β−コングリシニン」の濃縮物である。
（５）得られた各画分を中和して、加熱殺菌した。
【００２９】
（製造例２）分離大豆蛋白の調製
別途、低変性脱脂大豆から以下のように分離大豆蛋白質を調製した。
（１）低変性脱脂大豆の温水抽出スラリーを遠心分離機にてオカラ画分を除き脱脂豆乳とした。
（２）得られた脱脂豆乳のｐＨを４．５に調整して等電点沈殿し、遠心分離機にて酸沈殿カードを得て中和した。
（３）得られた各画分を中和して、加熱殺菌した。
【００３０】
（製造例３） 加水分解物の調製
製造例１及び２で得られたβ−コングリシニン濃縮物、グリシニン濃縮物、ＬＰ濃縮物及び分離大豆蛋白質から特許文献６を参考にして、以下のようにプロテアーゼによる加水分解物を調製した。３％大豆蛋白質溶液に対して、サモアーゼ（起源；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、金属プロテアーゼ、大和化成）を蛋白質当たり２％加え、ｐＨ９．０、５８℃で６０分間作用させた。次にビオプラーゼ（起源；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．，セリンプロテアーゼ、ナガセケムテック）を蛋白質当たり１％加え、ｐＨ７．５、５８℃で６０分間作用させた。次にスミチュームＦＰ（起源；Ａｓｐｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．，金属プロテアーゼ、新日本化学工業）を蛋白質当たり１％加え、ｐＨ７．５、５８℃で６０分間作用させた。以上の処理の後、９０℃、２０分間で反応を停止した後、以下の実施例１及び２に用いる試料とした。
【００３１】
製造例１、２で得られた各種大豆蛋白質画分及び分離大豆蛋白質の蛋白質含量と、製造例３で得られたそれらの加水分解物中の各種物質の含有量を測定し、以下の表１にまとめた。
【００３２】
【表１】
【００３３】
（実施例１）ウシ血清含有培地における各蛋白質加水分解物の効果
製造例３で得られた各蛋白質加水分解物の動物細胞、特に抗体産生細胞への増殖促進効果及び抗体産生促進効果を確認するために、以下の方法に従いマウス抗体産生ハイブリドーマの培養実験を行なった。
【００３４】
細胞は抗体産生ハイブリドーマ細胞（株式会社フロンティア研究所製）を使用し、基本培地としてＲＰＭＩ−１６９０（和光純薬社製）を用い、これに終濃度１０％となるようにウシ血清（ＦＢＳ）を添加し、コントロール用培地とした。一方、大豆蛋白質加水分解物を評価する際には、基本培地ＲＰＭＩ−１６９０にＦＢＳを５％添加し、大豆蛋白質加水分解物を０．２５％添加しサンプル評価用培地とした。
【００３５】
培養は、抗体産生細胞を３７℃にて解凍後、１５ｍＬの遠心管に移し、１０ｍＬ洗浄培地（ＲＰＭＩ−１６９０：ＦＢＳ非含有）を加え攪拌した。攪拌後、遠心分離（４℃，８００ｇ，１０分間）を行い、洗浄した。洗浄後、５ｍＬの培地を細胞に加え細胞浮遊液を調製した。調製後の細胞浮遊液を３−７日間前培養（３７±０．５℃，ＣＯ２濃度５％）した。前培養後、細胞浮遊液を回収し、遠心洗浄（８００ｇ、１０分間）の後、得られた細胞ペレットに、大豆蛋白質加水分解物を含有する培地を添加し懸濁後、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞浮遊液を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ、各３ｗｅｌｌに添加し、３日間培養（３７±０．５℃，ＣＯ２濃度５％）した。
【００３６】
３日間培養後、培養上清を回収し、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の操作手順に従って、抗体産生量の測定、細胞数の計測を行ない、３ｗｅｌｌ間の平均値及び標準偏差を求めた。
【００３７】
結果を図１及び図２にまとめた。図１は、ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図であり、図２は、ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
【００３８】
図１及び図２から明らかなように、他の大豆蛋白質加水分解物を添加した場合と比較して、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物のみが抗体産生ハイブリドーマの細胞数及び抗体産生能を増加させていることが認められた。グリシニン濃縮物の加水分解物及びＬＰ濃縮物の加水分解物では細胞数及び抗体産生能の増加が認められなかったことは、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物中に細胞増殖及び抗体産生能を促す因子が含まれている可能性を示唆している。さらに、ＦＢＳを１０％添加しているコントロールと比較しても高くなっていることから、ウシ血清中に含まれている細胞増殖因子及び抗体産生能向上因子よりも強い効果を持っていると考えられた。
【００３９】
なお、イソフラボンは抗酸化作用を有するため、細胞保護作用が期待される。しかしながら、表１から分かるように、β−コングリシニン濃縮物のイソフラボン含量が一番低く、したがって、細胞数の増加及び抗体産生能の増加はイソフラボンの作用とは無関係であり、このような効果はβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物に由来すると考えられる。
【００４０】
（実施例２） 無血清培地における各蛋白質加水分解物の効果
実施例１の結果より、ウシ血清含有培地において、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物に抗体産生ハイブリドーマの増殖促進効果及び抗体産生促進効果が認められたことから、市販の無血清培地２種類にβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物又は分離大豆蛋白質加水分解物を加え、同様の効果が得られるか検証した。
【００４１】
実施例１と同じ細胞を使用し、無血清培地としてＣｏｓｍｅｄｉｕｍｕ００５（コスモバイオ社製）、ＨｙｂｒｉｄｏｍａＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をそれぞれ基本培地として使用した。一方、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物及び分離大豆蛋白質加水分解物を評価する際には、各無血清培地に、各加水分解物を０．５％添加しサンプル評価用培地とした。また、ＲＰＭＩ−１６９０に終濃度１０％となるようにウシ血清（ＦＢＳ）を添加したものをコントロール用培地とした。
【００４２】
培養及び評価は実施例１に記載の方法と同じ方法で行なった。
【００４３】
結果を図３及び４にまとめた。図３は、無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図である。図４は、無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
【００４４】
図３及び４から明らかなように、分離大豆蛋白質加水分解物と比較して、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物は抗体産生ハイブリドーマの細胞数及び抗体産生能を向上させていることが確認された。効果の強度は、使用する無血清培地の種類に依存するが、少なくとも細胞数に関しては、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加した無血清培地では該加水分解物を添加しない場合と比較して増加する傾向が見られた。更に、無血清培地Ｃｏｓｍｅｄｉｕｍ００５にβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加した場合にはウシ血清含有培地と比較しても高い細胞増殖能と抗体産生能を示すことが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞培養用培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞、特に哺乳動物細胞を培養する際に、細胞を効率的に増殖させることは重要である。例えば、抗体、酵素、ホルモンなどの有用物質を産生する細胞であれば、細胞の増殖率を高めることで、有用物質を効率よく製造することが可能である。あるいは、皮膚細胞、軟骨細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞といった細胞の増殖率を高めることで、効率のよい再生医療が行われることが期待できる。
【０００３】
細胞増殖率を高めることを目的として、培地にウシ血清やウシ血清から分離した蛋白質成分を添加することがよく行われている。しかしながら近年では、血清中に混入する不要物、例えば、ウシ由来の抗体、ウイルス、病原性プリオンなどが混入することは好ましくなく、無血清培地の開発が進められている。そして、特許文献１では、大豆蛋白質加水分解物及び酵母抽出物を無血清培地に添加して、細胞増殖率を高めることが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００２−５２００１４号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１２９６４７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００２／０２８１９８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９８／４４８０７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００９／０３５８５２号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００６／１３４７５２号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍ．Ｓａｍｏｔｏら，Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０２巻，３１７−３２２頁，２００７年
【非特許文献２】Ｓ．Ｋｕｄｏｕら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５５巻，２２２７?２２３３頁、１９９１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血清培地又は無血清培地に添加することで、動物細胞の増殖率を高めることができる因子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、大豆β−コングリシニン濃縮物の加水分解物を血清培地又は無血清培地に添加した培地で動物細胞を培養すると、細胞増殖率を高めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
（１）β−コングリシニン濃縮物の加水分解物を含む動物細胞培養用培地。
（２）無血清培地である、上記（１）に記載の培地。
（３）β−コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる動物細胞増殖促進剤。
（４）β−コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる抗体産生促進剤。
（５）上記（１）又は（２）に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
（６）上記（１）又は（２）に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の増殖を促進する方法。
（７）動物細胞培養用培地にβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加する、上記（１）又は（２）に記載の培地の製造方法。
（８）上記（１）又は（２）に記載の培地中で動物細胞を培養し、動物細胞から産生される有用物質を培地から単離する、有用物質の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、動物細胞の増殖率を高めることができ、その結果、有用物質を効率よく製造することができ、また、再生医療の効率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図である。
【図２】ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
【図３】無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図である。
【図４】無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１２】
（大豆蛋白質）
一般の大豆に含まれる蛋白質は、超遠心分析による沈降係数から、２Ｓ、７Ｓ、１１Ｓ及び１５Ｓの各種グロブリンが含まれている。このうち、７Ｓグロブリンと１１Ｓグロブリンは主要な酸沈殿生の構成蛋白質成分である。本発明におけるβ−コングリシニンは７Ｓグロブリンに相当するものであり、β−コングリシニン濃縮物は蛋白質中のβ−コングリシニンの割合が高められたものをいう。一方、グリシニンは１１Ｓグロブリンに相当するものである。さらに、大豆蛋白質中には上記グロブリン以外にも酸沈殿性大豆蛋白質群が存在し、これらはレシチンや糖脂質などの極性脂質を多く随伴するために、包括的に、脂質親和性蛋白質（ＬＰ）と呼ばれている（特許文献２参照）。
【００１３】
（β−コングリシニンの濃縮）
本発明の動物細胞培養用培地に添加される窒素源としては、通常の大豆粉末や分離大豆蛋白質から調製された加水分解物ではなく、動物細胞用培地が優れた細胞増殖促進活性を発揮するために、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物が必須である。該濃縮物中のβ−コングリシニン含量は、粗蛋白質に対して４０重量％以上含まれていることが好ましく、５０重量％以上含まれていることがより好ましい。大豆からβ−コングリシニン濃縮物を調製する方法は公知であり、大きく類別して一般的な組成の大豆から蛋白質を抽出又は濃縮したものからβ−コングリシニンを分画する方法と、予め育種や遺伝子組換技術によりβ−コングリシニンを濃縮させた大豆から蛋白質を抽出又は濃縮する方法がある。例えば、前者の例としては非特許文献１、特許文献２及び特許文献３などに記載の方法が挙げられる。また後者の例としては特許文献４や特許文献５などに記載の方法が挙げられる。これらの調製方法によれば、β−コングリシニン濃縮物におけるβ−コングリシニンの含量を、粗蛋白質に対して６０重量％以上あるいは８０重量％以上とすることが可能である。
【００１４】
（β−コングリシニン濃縮物の加水分解）
本発明に係るβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物は、上記β−コングリシニン濃縮物をプロテアーゼ処理することによって得られるペプチド混合物である。β−コングリシニン濃縮物の加水分解物は分解度がより高いことが好ましく、特に加水分解物中におけるペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及びトリペプチドの割合が高いことが好ましい。具体的には、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及びトリペプチドの割合が６０重量％以上であることが好ましく、６４重量％以上であることがより好ましい。なお本願では、ジペプチド及びトリペプチドを、分子量５００以下の画分から遊離アミノ酸を除いた画分と規定した。したがって、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及びトリペプチドの割合は、ペプチド用ゲルろ過クロマトグラフィーにより加水分解物中の分子量５００以下のペプチド画分の割合を測定した後、アミノ酸分析により測定した加水分解物中の遊離アミノ酸含量を差し引くことにより算出することが可能である。蛋白質中の遊離アミノ酸含量は１０重量％以下であることが好ましく、５重量％以下であることがより好ましい。さらに、ペプチド体はより低分子であることが望ましいことから、加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める分子量５００以上の画分の割合は４０重量％以下であることが好ましく、３５重量％以下であることがより好ましい。
【００１５】
加水分解物を得るために使用するプロテアーゼは、動物起源、植物起源又は微生物起源を問わず、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」、「酸性プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼ、好ましくは「金属プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から適宜選択することができる。特に２種類以上、あるいは３種類以上の異なった分類に属する酵素を、順次若しくは同時に作用させる分解方法がジペプチドやトリペプチド等の比較的分子量の低いペプチドの割合を増加させることができ好ましい。
【００１６】
このプロテアーゼの分類は、酵素科学の分野において通常行なわれている活性中心のアミノ酸の種類による分類方法である。各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはＢａｃｉｌｌｕｓ中性プロテアーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ中性プロテアーゼ、サモアーゼ等、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ酸性プロテアーゼ、スミチュームＡＰ等、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン、パパイン等、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン、キモトリプシン、ズブチリシン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓアルカリプロテアーゼ、アルカラーゼ、ビオプラーゼ等が挙げられる。これら以外の酵素でも作用ｐＨや阻害剤との反応性により、その分類を確認することができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なるため、「切れ残り」を減らし、効率よく酵素分解物を得ることができる。また、異なった起源の（起源生物）の酵素を併用することで、更に効率よく酵素分解物を製造することができる。同分類でも起源が異なれば、基質である蛋白質への作用部位も異なり、結果としてジペプチドやトリペプチドの割合を増やすことができる。これらプロテアーゼはエキソ活性が少ないことが好ましい。
【００１７】
プロテアーゼ処理の反応ｐＨや反応温度は、用いるプロテアーゼの特性に合わせて設定すれば良く、通常、反応ｐＨは至適ｐＨ付近で行ない、反応温度は至適温度付近で行なえば良い。概ね反応温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃である。反応後は酵素を失活させるのに十分な温度（６０〜１７０℃程度）まで加熱し、残存酵素活性を失活させる。
【００１８】
プロテアーゼ処理後の反応液は、そのまま又は濃縮して用いることもできるが、通常、殺菌し、噴霧乾燥、凍結乾燥等して乾燥粉末の状態で利用する。殺菌は、加熱殺菌が好ましく、加熱温度は１１０〜１７０℃が好ましく、１３０〜１７０℃が更に好ましい。加熱時間は３〜２０秒間が好ましい。また、反応液を任意のｐＨに調整してもよく、またｐＨ調整時に発生する沈殿物や懸濁物を遠心分離や濾過等により除去してもよい。更に活性炭や吸着樹脂により精製してもよい。
【００１９】
（動物細胞培養用培地への利用）
このようにして得られたβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物を動物細胞培養用培地に添加することで、本発明の動物細胞培養用培地を製造することができる。β−コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加する基本培地は、血清含有培地であってもよく無血清培地であってもよく、基本培地の種類は特に限定されず市販されている培地を使用することができる。好ましい基本培地は培養する動物細胞の種類によって異なり、当業者が適宜選択することができる。β−コングリシニン濃縮物の加水分解物の添加量は、培養する動物細胞の種類によって異なるが、望ましくは動物細胞培養用培地当たり、乾燥させた加水分解物として０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜２重量％の濃度にて高い効果を得ることができる。
【００２０】
（動物細胞の増殖促進効果及び有用物質の産生促進効果）
本発明の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養すると、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物により動物細胞の細胞増殖が促進される。これにより、増殖が促進される動物細胞がヒトの生体に有用な物質を産生する種類のものである場合は、動物細胞による該有用物質の産生も促進されうる。例えば、培養する動物細胞が抗体産生細胞の場合は、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物の作用により抗体産生が促進される。したがって、本発明の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養して有用物質を産生させ、これを培地から常法により単離することにより、有用物質を効率的に製造することができる。動物細胞から産生される各種有用物質としては抗体の他、酵素やホルモン等が挙げられる。
【００２１】
本発明の動物細胞培養用培地で培養する動物細胞の種類は特に限定されない。具体的には、抗体、酵素（ウロキナーゼ等）、ホルモン（インシュリン等）、サイトカイン（インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、成長因子等）、その他の生理活性蛋白質・ペプチドなどの有用物質を産生する動物細胞が挙げられ、かかる動物細胞としては、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、腎細胞等の非形質転換細胞や、コードする遺伝子や有用物質の生合成に関与する遺伝子を導入した形質転換細胞が例示される。形質転換細胞の例としては、マウスミエローマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの抗体産生細胞などが挙げられる。これらの動物細胞を培養して有用物質を効率的に製造することができる。また、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などを培養し、効率的に増殖させることにより、これらを再生医療の分野にも利用することができる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明する。
【００２３】
実施例で用いた測定方法について以下にまとめる。
【００２４】
（蛋白質含量）
１０５℃、１２時間乾燥した大豆蛋白質画分の重量に対して、ケルダール法により測定した蛋白質量の重量を、乾燥物中の蛋白質含量として重量％で表した。なお、窒素換算係数は６．２５とした。
【００２５】
（β―コングリシニン含量）
β−コングリシニンはＥＬＩＳＡ法により定量を行った。サンプル０．１ｇを精秤し、５０ｍｌ栓付三角フラスコ中に入れ、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）２．５ｍｌ及び８Ｍ Ｕｒｅａ−ＤＴＴ緩衝液７．５ｍｌを添加した。１００℃で１時間抽出した。抽出後シスチンを含む０．４Ｍ ＮａＣｌ溶液（ｐＨ９．０）で再会合させた後、１００ｍｌに定容し、ろ過液をＥＬＩＳＡ用サンプルとした。ＥＬＩＳＡ用９６ウェルＥＩＡマイクロプレート（ＩＷＡＫＩ（株）製）にサンプル及び検量線用β−コングリシニン（不二製油（株）製）をそれぞれ４℃で１日間保存することで固定化し、ブロッキング液（大日本住友製薬（株）製）を２００μｌ加え３７℃で２時間インキュベートしブロッキングした。ブロッキング後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で３回洗浄した。次に、１次抗体として０．５μｇ／ｍｌの抗β−コングリシニンウサギポリクロナール抗体（タカラバイオ（株）製）を１００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で３回洗浄した。その後、２次抗体として０．１μｇ／ｍｌのペルオキダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ（株）製）を１００μｌ添加し３７℃で１時間インキュベートした。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で３回洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ Ｍｉｃｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ（株）製）を１００μｌ加え５分間発色させた。１Ｎ硫酸を１００μｌ加え発色反応を停止後、波長４５０ｎｍで吸光度を測定した。測定後、検量線用β−コングリシニンの吸光度を用いて検量線を作成し、サンプルのβ−コングリシニン含量を算出し、ケルダール法で算出した全蛋白質に対する比率を求めた。
【００２６】
（ジペプチド・トリペプチド含量）
大豆蛋白質画分の加水分解物の分子量分布を、以下のゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ法により測定した。ペプチド用ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣシステムを組み、分子量マーカーとなる既知のペプチドをチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を求めた。なお、分子量マーカーは、オクタペプチドとして［β−Ａｓｐ］−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩのβ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（分子量１０４６）、ヘキサペプチドとしてＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＶのＶａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（分子量７７５）、ペンタペプチドとしてＬｅｕ−ＥｎｋｅｐｈａｌｉｎのＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（分子量５５５）、トリペプチドとしてＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（分子量４０５）、遊離アミノ酸としてＰｒｏ（分子量１１５）を用いた。加水分解物（１％）を１０，０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離した上清を、ゲル濾過用溶媒で２倍に希釈し、その５μlをＨＰＬＣにアプライした。加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める分子量５００以下のペプチド画分の割合（％）を、全体の吸光度のチャート面積に対する、分子量５００以下の範囲（時間範囲）の面積の割合によって求めた（使用カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ７．５／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、溶媒：１％ＳＤＳ／１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、カラム温度２５℃、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２２０ｎｍ）。
次に、アミノ酸分析により大豆蛋白質画分の加水分解物中の遊離アミノ酸含量の測定を行った。加水分解物（４ｍｇ／ｍｌ）を等量の３％スルホサリチル酸に加え、室温で１５分間振とうした。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上澄みを０．４５μｍフィルターでろ過し、アミノ酸分析器（日本電子製 ＪＬＣ５００Ｖ）にて、遊離アミノ酸を測定した。蛋白質中の遊離アミノ酸含量はケルダール法にて得られた蛋白質含量に対する割合として算出した。
以上より得られた、「分子量５００以下のペプチド画分の割合」から「遊離アミノ酸含量」を差し引いた値を、加水分解物中の「ジペプチド・トリペプチド含量」とした。
【００２７】
（イソフラボン含量）
大豆イソフラボンとして１〜１０ｍｇに相当する量の試料を定量し、７０％エタノールにて１００ｍｌに定容した。そして０．４５μｍＰＶＤＦフィルターにて濾過したものを試験溶液とした。標準品は１２種類、すなわちダイジン、ゲニスチン、グリシチン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、マロニルダイジン、マロニルゲニスチン、マロニルグリシチン、アセチルダイジン、アセチルゲネスチン、アセチルグリシチン（和光純薬工業株式会社）を用いた。ＨＰＬＣの条件については非特許文献３に記載の条件に準拠した。定量にはダイゼイン標準品を用い、各換算値を用いて算出した。
【００２８】
（製造例１）各種大豆蛋白質画分の調製
非特許文献１に記載の方法に準じて以下の通り、β―コングリシニン濃縮物、グリシニン濃縮物及びＬＰ濃縮物の各大豆蛋白質画分を調製した。
（１）低変性脱脂大豆に加熱処理を施してＮＳＩ（水溶性窒素指数、ＡＯＣＳ公式分析法ＢＡ−１１−６５ ＮＳＩによる）を低下させた脱脂大豆（ＮＳＩ７０％）の温水抽出スラリーを遠心分離機にてオカラ画分を除き脱脂豆乳とした。
（２）次に脱脂豆乳のｐＨを５．８に調整して遠心分離機にて沈殿カード画分を回収した。この画分が１１Ｓグロブリンである「グリシニン」の濃縮物である。
（３）次に、残りの上清のｐＨを５．０に調整し、５５℃で１０分間放置後、次いでｐＨ５．５に調整後、遠心分離機にて沈殿カード画分を回収した。この画分が、脂質親和性蛋白質である「ＬＰ」の濃縮物」である。
（４）次に、残りの上清のｐＨを４．５に調整し、遠心分離機にて沈殿カードを回収した。この画分が７Ｓグロブリンである「β−コングリシニン」の濃縮物である。
（５）得られた各画分を中和して、加熱殺菌した。
【００２９】
（製造例２）分離大豆蛋白の調製
別途、低変性脱脂大豆から以下のように分離大豆蛋白質を調製した。
（１）低変性脱脂大豆の温水抽出スラリーを遠心分離機にてオカラ画分を除き脱脂豆乳とした。
（２）得られた脱脂豆乳のｐＨを４．５に調整して等電点沈殿し、遠心分離機にて酸沈殿カードを得て中和した。
（３）得られた各画分を中和して、加熱殺菌した。
【００３０】
（製造例３） 加水分解物の調製
製造例１及び２で得られたβ−コングリシニン濃縮物、グリシニン濃縮物、ＬＰ濃縮物及び分離大豆蛋白質から特許文献６を参考にして、以下のようにプロテアーゼによる加水分解物を調製した。３％大豆蛋白質溶液に対して、サモアーゼ（起源；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、金属プロテアーゼ、大和化成）を蛋白質当たり２％加え、ｐＨ９．０、５８℃で６０分間作用させた。次にビオプラーゼ（起源；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．，セリンプロテアーゼ、ナガセケムテック）を蛋白質当たり１％加え、ｐＨ７．５、５８℃で６０分間作用させた。次にスミチュームＦＰ（起源；Ａｓｐｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．，金属プロテアーゼ、新日本化学工業）を蛋白質当たり１％加え、ｐＨ７．５、５８℃で６０分間作用させた。以上の処理の後、９０℃、２０分間で反応を停止した後、以下の実施例１及び２に用いる試料とした。
【００３１】
製造例１、２で得られた各種大豆蛋白質画分及び分離大豆蛋白質の蛋白質含量と、製造例３で得られたそれらの加水分解物中の各種物質の含有量を測定し、以下の表１にまとめた。
【００３２】
【表１】
【００３３】
（実施例１）ウシ血清含有培地における各蛋白質加水分解物の効果
製造例３で得られた各蛋白質加水分解物の動物細胞、特に抗体産生細胞への増殖促進効果及び抗体産生促進効果を確認するために、以下の方法に従いマウス抗体産生ハイブリドーマの培養実験を行なった。
【００３４】
細胞は抗体産生ハイブリドーマ細胞（株式会社フロンティア研究所製）を使用し、基本培地としてＲＰＭＩ−１６９０（和光純薬社製）を用い、これに終濃度１０％となるようにウシ血清（ＦＢＳ）を添加し、コントロール用培地とした。一方、大豆蛋白質加水分解物を評価する際には、基本培地ＲＰＭＩ−１６９０にＦＢＳを５％添加し、大豆蛋白質加水分解物を０．２５％添加しサンプル評価用培地とした。
【００３５】
培養は、抗体産生細胞を３７℃にて解凍後、１５ｍＬの遠心管に移し、１０ｍＬ洗浄培地（ＲＰＭＩ−１６９０：ＦＢＳ非含有）を加え攪拌した。攪拌後、遠心分離（４℃，８００ｇ，１０分間）を行い、洗浄した。洗浄後、５ｍＬの培地を細胞に加え細胞浮遊液を調製した。調製後の細胞浮遊液を３−７日間前培養（３７±０．５℃，ＣＯ２濃度５％）した。前培養後、細胞浮遊液を回収し、遠心洗浄（８００ｇ、１０分間）の後、得られた細胞ペレットに、大豆蛋白質加水分解物を含有する培地を添加し懸濁後、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した細胞浮遊液を０．５ｍＬ／ｗｅｌｌ、各３ｗｅｌｌに添加し、３日間培養（３７±０．５℃，ＣＯ２濃度５％）した。
【００３６】
３日間培養後、培養上清を回収し、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）の操作手順に従って、抗体産生量の測定、細胞数の計測を行ない、３ｗｅｌｌ間の平均値及び標準偏差を求めた。
【００３７】
結果を図１及び図２にまとめた。図１は、ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図であり、図２は、ウシ血清含有培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
【００３８】
図１及び図２から明らかなように、他の大豆蛋白質加水分解物を添加した場合と比較して、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物のみが抗体産生ハイブリドーマの細胞数及び抗体産生能を増加させていることが認められた。グリシニン濃縮物の加水分解物及びＬＰ濃縮物の加水分解物では細胞数及び抗体産生能の増加が認められなかったことは、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物中に細胞増殖及び抗体産生能を促す因子が含まれている可能性を示唆している。さらに、ＦＢＳを１０％添加しているコントロールと比較しても高くなっていることから、ウシ血清中に含まれている細胞増殖因子及び抗体産生能向上因子よりも強い効果を持っていると考えられた。
【００３９】
なお、イソフラボンは抗酸化作用を有するため、細胞保護作用が期待される。しかしながら、表１から分かるように、β−コングリシニン濃縮物のイソフラボン含量が一番低く、したがって、細胞数の増加及び抗体産生能の増加はイソフラボンの作用とは無関係であり、このような効果はβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物に由来すると考えられる。
【００４０】
（実施例２） 無血清培地における各蛋白質加水分解物の効果
実施例１の結果より、ウシ血清含有培地において、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物に抗体産生ハイブリドーマの増殖促進効果及び抗体産生促進効果が認められたことから、市販の無血清培地２種類にβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物又は分離大豆蛋白質加水分解物を加え、同様の効果が得られるか検証した。
【００４１】
実施例１と同じ細胞を使用し、無血清培地としてＣｏｓｍｅｄｉｕｍｕ００５（コスモバイオ社製）、ＨｙｂｒｉｄｏｍａＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をそれぞれ基本培地として使用した。一方、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物及び分離大豆蛋白質加水分解物を評価する際には、各無血清培地に、各加水分解物を０．５％添加しサンプル評価用培地とした。また、ＲＰＭＩ−１６９０に終濃度１０％となるようにウシ血清（ＦＢＳ）を添加したものをコントロール用培地とした。
【００４２】
培養及び評価は実施例１に記載の方法と同じ方法で行なった。
【００４３】
結果を図３及び４にまとめた。図３は、無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が細胞増殖に及ぼす効果を表す図である。図４は、無血清培地における大豆蛋白質加水分解物が抗体産生量に及ぼす効果を表す図である。
【００４４】
図３及び４から明らかなように、分離大豆蛋白質加水分解物と比較して、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物は抗体産生ハイブリドーマの細胞数及び抗体産生能を向上させていることが確認された。効果の強度は、使用する無血清培地の種類に依存するが、少なくとも細胞数に関しては、β−コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加した無血清培地では該加水分解物を添加しない場合と比較して増加する傾向が見られた。更に、無血清培地Ｃｏｓｍｅｄｉｕｍ００５にβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加した場合にはウシ血清含有培地と比較しても高い細胞増殖能と抗体産生能を示すことが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−コングリシニン濃縮物の加水分解物を含む動物細胞培養用培地。
【請求項２】
無血清培地である、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
β−コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる動物細胞増殖促進剤。
【請求項４】
β−コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる抗体産生促進剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の増殖を促進する方法。
【請求項７】
動物細胞培養用培地にβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加する、請求項１又は２に記載の培地の製造方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の培地中で動物細胞を培養し、動物細胞から産生される有用物質を培地から単離する、有用物質の製造方法。
【請求項１】
β−コングリシニン濃縮物の加水分解物を含む動物細胞培養用培地。
【請求項２】
無血清培地である、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
β−コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる動物細胞増殖促進剤。
【請求項４】
β−コングリシニン濃縮物の加水分解物からなる抗体産生促進剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の増殖を促進する方法。
【請求項７】
動物細胞培養用培地にβ−コングリシニン濃縮物の加水分解物を添加する、請求項１又は２に記載の培地の製造方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の培地中で動物細胞を培養し、動物細胞から産生される有用物質を培地から単離する、有用物質の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１８２７３６（Ｐ２０１１−１８２７３６Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３０８９（Ｐ２０１０−５３０８９）
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【出願人】（０００２３６７６８）不二製油株式会社 (386)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【出願人】（０００２３６７６８）不二製油株式会社 (386)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]