化学物質の並行微量分析法
【課題】マイクロチップを用いて生体内酵素反応等への環境汚染化学物質等の影響をスクリーニングする。
【解決手段】シリコン基板１０の表裏両面にμｍオーダーの等価な流路４０を形成し、その途中の反応部にＩＴＯ膜に構成した発熱手段を設ける。また、それぞれの流路４０に独立に接続させた独立化学物質供給口５０と、それぞれの流路４０に分岐して接続させた共通化学物質供給口６０を設ける。独立化学物質供給口５０からは例えば反応阻害剤を、共通化学物質強供給口６０からは酵素とそれに合わせた基質とを供給し、流路４０内で反応させることにより、複数の反応阻害剤のスクリーニングを行う。
【解決手段】シリコン基板１０の表裏両面にμｍオーダーの等価な流路４０を形成し、その途中の反応部にＩＴＯ膜に構成した発熱手段を設ける。また、それぞれの流路４０に独立に接続させた独立化学物質供給口５０と、それぞれの流路４０に分岐して接続させた共通化学物質供給口６０を設ける。独立化学物質供給口５０からは例えば反応阻害剤を、共通化学物質強供給口６０からは酵素とそれに合わせた基質とを供給し、流路４０内で反応させることにより、複数の反応阻害剤のスクリーニングを行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチップを用いた化学物質の分析法に関し、特に、種々の環境汚染物質の生体内酵素反応に及ぼす影響等をスクリーニングするのに有効に適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
以下に説明する技術は、本発明を完成するに際し、本発明者によって検討されたものであり、その概要は次のとおりである。
【０００３】
近年、基板上に幅１ｍｍ以下のμｍオーダーの流路を形成し、かかる流路に化学物質を流すことで、マクロスケールで行う場合とは異なり、微量試料で、多種類の反応を、同時並行で、短時間で効率的に行う技術が提案されている。
【０００４】
かかる技術の中には、化学物質を通す流路が形成された基板を複数枚積層し、各層の流路を連絡することで、３次元的に流路の拡大を行う技術も提案されている。非特許文献１には、複数枚の積層構成とすることで、流路内で生成する化学反応物質の収量拡大も容易に行えることが示されている。さらに、非特許文献２には、化学物質を流路に流す際の送液口に関しての記載も見られる。
【０００５】
かかるマイクロチップを用いた反応でも当然に温度制御が求められ、従来の一般的な温度制御は、恒温槽内にマイクロチップごと所要時間放置して、マイクロチップ自体の温度が恒温槽内の温度と平衡して設定温度になるのを待つ方法であった。しかし、かかる手法では、反応温度を制御するのに時間と手間がかかり、反応状況に応じて温度を適宜に変更してその状況確認をするという温度制御は実質的に不可能に近かった。
【０００６】
温度制御に関しては、特許文献１に、ＩＴＯ膜をパターニングして加熱手段を形成し、さらに、別途蛇行線状にＩＴＯ膜をパターニングして温度センサとして構成する技術も提案されている。
【非特許文献１】Y.Kikutani、「Pile-up glass microreactor」Lab Chip、2002、2、p193-196
【非特許文献２】Y.Kikutani、T.Hotiuchi、K.Uchiyama、H.Hisamoto、M.Tokeshi、T.kitamori、「Glass Microchip with Three-Dimensional Micrchannel Network for 2×2 Parallel Synthesis」、Lab on a Chip、2002、2、p188-192
【特許文献１】特開平２００２−８５９６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
生物工学研究の重要な分野の一つに糖鎖機能の解明がある。糖鎖は、細胞間の認識や相互作用において、情報伝達時の暗号として機能していると言われている。糖鎖や糖鎖関連酵素と関係した病気の発生メカニズムを明らかにすることは、その治療法につながると期待されており、今後の糖鎖研究における大きな課題である。
【０００８】
一方、環境化学物質が引き起こす疾病等の人体への影響は未だ十分には解明されていない。どのような化学物質が生体内の酵素反応等にどのように関与し、どのような悪影響を及ぼすかを解明することは極めて重要である。かかる解明にはスクリーニング作業が不可欠となる。
【０００９】
しかし、これまでのスクリーニング方法では、多くの試薬を使用し、長時間と多額の費用とを要していた。特に、多くの試薬を使用することについては、環境化学物質による人体への再環境汚染を引き起こすことにもつながる。そのため、可能な限り微量な試薬を用いてスクリーニングする手法が試みられてはいるが、未だ有効な手法が開発されていないのが現状である。
【００１０】
そこで、本発明者は、近年その活用が注目を集めているマイクロチップを使用することで、使用する試薬量を必要最小限度に抑制することができるものと考えた。さらに、かかるマイクロチップを用いれば、試験終了後の廃液処理量も格段に少なく抑えることができ、その分、環境負荷の低減にも通じる筈である。
【００１１】
しかし、かかるマイクロチップは極めて微小であるため、その加工精度をあげるのが難しい。例えば、一個、一個が等価な製造加工がし難く、ややもすれば試験の再現性にも影響を与える場合も想定される。
【００１２】
マイクロチップを用いた化学分析では、その試料の調製も何回かに分けて希釈すること等が必要となる。特にその定量分析に至っては、器壁についた滴も極めて重大な影響を及ぼすこととなる。
【００１３】
そこで、同一試薬を用いて、複数の分析が行えれば、器具、装置等の個体差が発生せずに好ましい。例えば、マイクロチップに、複数の等価な流路を形成して、使用する試薬を極力同一濃度のものを用いる等して、できるだけ試験対象を同一の条件下で分析することができれば、互いの比較もできてより好ましい。
【００１４】
しかし、マイクロチップにおける複数の流路の等価性については、その技術的課題が多く、未だ十分に達成されていないのが現状である。複数の流路を用いて、同一条件下での定量的な分析をするについては、並行分析が十分に行えないのが現状である。
【００１５】
また、マイクロチップにおいては、流路の等価性の他に、前記の如く試薬等の送液における精度も問題となる。極めて微量な送液量であり、また複数回にわたって希釈しているため、少しの液漏れでも重大な影響を及ぼし、試験にとっては致命的なものとなる。
【００１６】
本発明の目的は、マイクロチップを用いた並行分析において、複数の流路の分析環境の等価性を向上させることにある。
【００１７】
本発明の目的は、マイクロチップを用いて生体内酵素反応等への環境汚染化学物質等の影響をスクリーニングする分析等に必要な技術を提供することにある。
【００１８】
本発明の前記ならびにその他の目的と新規な特徴は、本明細書の記述および添付図面から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本願において開示される発明のうち、代表的なものの概要を簡単に説明すれば、次のとおりである。
【００２０】
本発明はマイクロチップを用いた化学物質の並行微量分析法であって、前記マイクロチップは、厚さ方向に貫通して表裏両面を連絡するμｍオーダーの複数の流路を有し、前記複数の流路は、それぞれ前記複数の流路への少なくとも当初供給量の９７％以上の回収率を有する等価流路に形成され、前記複数の流路は、前記複数の流路のそれぞれに独立して接続された独立反応物質供給口を有し、前記複数の流路は、前記複数の流路のそれぞれに分岐して接続された共通反応物質供給口を有し、前記独立反応物質供給口から供給した反応物質と、前記共通反応物質供給口から供給した反応物質とを、前記複数の流路内のそれぞれで反応させ、反応後の反応生成物を回収して前記複数の流路内のそれぞれにおける反応状況を分析手段により分析することを特徴とする。
【００２１】
かかる構成において、前記複数の流路のそれぞれの回収率が９７％以上である場合の前記当初供給量は、１５０μｌ以上、３１０μｌ以下であることを特徴とする。以上の構成において、前記複数の流路は、１００μｍオーダーに対して１％以内の加工精度で形成されていることを特徴とする。以上いずれかの構成において、前記共通反応物質供給口からは、互いに反応する反応物質を供給し、前記独立反応物質供給口からは、前記反応を阻害するかもしれない反応阻害可能性物質を供給することを特徴とする化学物質の並行微量分析法。かかる構成において、前記反応阻害可能性物質は、環境汚染物質であることを特徴とする。
【００２２】
上記化学物質の並行微量分析法においては、前記共通反応物質供給口から供給する反応物質は、酵素と、前記酵素に反応する基質であることを特徴とする。前記酵素とは、糖鎖分解酵素であり、前記基質とは、前記糖鎖分解酵素により分離される原子団を有する多糖であることを特徴とする。前記糖鎖分解酵素とは、キチナーゼであり、前記多糖とは、構造多糖であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本願において開示される発明のうち、代表的なものによって得られる効果を簡単に説明すれば以下のとおりである。
【００２４】
本発明により、生体内酵素反応等への環境汚染物質の阻害作用等の影響を、極少量の試薬を使用して、短時間に、良好な精度で並行分析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。尚、実施の形態を説明するための全図において、同一の部材には原則として同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する場合がある。
【００２６】
本発明は、複数の流路が形成されたマイクロチップを用いて、複数の化学種のスクリーニングが行えるようにした化学物質の並行微量分析技術である。かかる並行微量分析では、複数の流路の等価性、および各流路への試薬等の送液等価性等に特に配慮した。
【００２７】
マイクロチップに形成された流路は、幅、深さが共にμｍのオーダーである。例えば、幅が４００μｍ、深さが１００μｍである。反応を行わせるマイクロチップ内の複数の流路は、それぞれ等価に形成されている。流路自体の等価性は、例えば、１００μｍオーダーの流路幅の加工に対して、加工精度１％以内に抑えられている。
【００２８】
また、複数の流路への同一物質の当初供給量１５０μｌ以上、３１０μｌ以下に対して、それぞれの流路での回収率が９７％以上で、各流路に対して等量送液されるものである。かかるマイクロチップを用いたスクリーニングでは、使用する試薬等の化学物質の量は、例えば、μｌオーダーに抑えることができる。
【００２９】
このように、本発明では、試薬使用量をμｌに抑えた状態で、送液量１５０μｌ以上、３１０μｌ以下に対して回収率が９７％以上である等価流路を使用して、複数の環境汚染物質の生体内酵素反応に対する阻害状況等のスクリーニングを、短時間で、効率的に、安価な費用で行うことができるものである。
【００３０】
図１に示すように、マイクロチップ１００は、シリコン基板１０の両面に、ガラス板２０、３０が陽極接合により貼り合わされている。ガラス板２０、３０としては、例えば、パイレックス（登録商標）等が使用できる。
【００３１】
シリコン基板１０の両面には、図２（ａ）、（ｂ）に示すように、化学物質を流すことができる流路４０が溝状に形成されている。流路４０は、例えば、シリコン基板１０の両面にそれぞれ４本形成され、各々が図２（ａ）、（ｂ）に示すように、蛇行して設けられている。また、流路４０の一部は、流路４０内に供給された化学物質が互いに反応する反応部を形成している。図では、かかる反応部を、枠状に囲って示した。
【００３２】
シリコン基板１０の表面１０ａ側には、裏面１０ｂの４本の流路４０に独立してつながるように独立化学物質供給口５０（５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄ）が設けられている。独立化学物質供給口５０は、シリコン基板１０の厚さ方向に貫通して裏面１０ｂ側に抜け、裏面１０ｂ側に設けた４本の流路４０にそれぞれ独立してつながっている。独立化学物質供給口５０（５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄ）は、このように複数に構成されているので、４本の流路４０にそれぞれ別の化学物質を並行して供給することができるようになっている。
【００３３】
また、シリコン基板１０の表面１０ａ側には、裏面１０ｂの４本の流路４０に、分岐してそれぞれつながる共通化学物質供給口６０（６０ａ、６０ｂ）が設けられている。共通化学物質供給口６０は、矢印に示すように表面１０ａ側で二手に分かれ、二手に分かれたそれぞれがシリコン基板１０の厚さ方向に貫通して裏面１０ｂ側に至り、さらに裏面１０ｂ側でさらに二手に分かれて４本の流路４０にそれぞれつながっている。
【００３４】
このように分岐して複数の各流路に接続できるように共通化学物質供給口６０を備えることにより、同一濃度の同一の化学物質を、各流路に送ることができるようになり、各流路で行われる並行分析での精度の確保が図れることとなる。
【００３５】
かかる構成の共通化学物質供給口６０は、図２（ａ）、（ｂ）に示すように、２個の共通化学物質供給口６０ａ、６０ｂに構成され、共通化学物質供給口６０ａ、６０ｂから、それぞれ異なる互いに反応する化学物質を別々に供給できるようになっている。
【００３６】
また、上記独立化学物質供給口５０、共通化学物質供給口６０に形成された供給口４１は、図３に示すように、シリコン基板１０の表面側を覆うガラス板２０に設けた貫通路４２を通して、ガラス板２０の表面側に固定したガラス管４３に繋げられている。かかるガラス管４３の固定は、ガラス板２０の表面に接着剤等で固着され、送液口４４として使用できるようになっている。
【００３７】
これまではマイクロチップを固定する治具に、マイクロチップの供給口に符合する位置にネジ孔を形成し、そのネジ孔にテフロン（登録商標）ネジを螺合させ、このテフロン（登録商標）ネジに設けた口を送液口として使用していた。かかる構成では、往々にして、送液に際してネジ孔等から液漏れが発生することがあった。
【００３８】
テフロン（登録商標）ネジを締めつけすぎるとマイクロチップが壊れてしまうため、加減した締めつけが必要となるが、しかし、かかる場合に締めつけが弱いと、ネジ孔の隙間から液漏れが発生するのである。
【００３９】
さらには、複数の流路に対応してテフロン（登録商標）ネジが複数ある場合には、個々の締めつけ具合が異なると、締めつけ方の違いにより溶液等の各流路内での流れ易さに差が出て、結果として各流路での送液量が異なることともなった。
【００４０】
しかし、前記の如く、独立化学物質供給口５０、共通化学物質供給口６０の所謂供給口４１の形成位置に、供給口４１の口径に合わせたガラス管４３を、送液チューブとして固着することにより、液漏れや送液量の違いの原因となるテフロン（登録商標）ネジを設ける必要がなくなり、それにまつわるネジの締めつけ状態等に配慮せずに、送液時の等価性の確保ができるようになった。
【００４１】
かかる構成の独立化学物質供給口５０、共通化学物質供給口６０が接続された４本の流路４０は、表面１０ａ側から裏面１０ｂに至り、裏面１０ｂ側を蛇行し、その後シリコン基板１０の厚さ方向に貫通して表面１０ａ側に上り、さらに蛇行して排出口７０（７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０ｄ）に至るように構成されている。
【００４２】
かかる流路４０の路端末側に設けられた排出口７０（７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０）は、供給口４１の形成の場合と同様に、図示はしないが、ガラス板２０に設けた貫通孔を通して、ガラス板２０の表面に接着剤等で固定したガラス管に接続され、反応生成物等の定量的な回収が図れるように構成されている。
【００４３】
かかる構成の流路４０は、次のようにしてシリコン基板１０の表裏両面に形成される。すなわち、図４に示すように、シリコン基板１０の表面に所定層厚で酸化膜１０１を熱酸化により形成する。形成した酸化膜１０１上に、感光性物質のフォトレジスト１０２を所定層厚で塗布する。フォトレジスト１０２に、流路パターンが形成されたマスクを用いて、所定波長の光で露光し、露光後現像して、流路形成パターンをフォトレジスト１０２上に形成する。
【００４４】
流路形成パターンが形成されたフォトレジスト１０２をさらにマスクとして用い、酸化膜１０１をエッチングすることで、シリコン基板１０への流路形成用マスクを形成する。かかる流路形成用マスクを用いて、ＩＣＰマルチビーム加工装置で、プラズマガスのＳＦ６を照射し、シリコン基板１０をドライエッチングすることで、流路４０に相当する溝を形成する。その後、流路４０の形成に際して使用したマスク、すなわち酸化膜１０１、フォトレジスト１０２を除去する。
【００４５】
このようにしてＩＣＰマルチビーム加工装置を用いることで、プラズマガスとしてＳＦ６を照射して形成した流路４０は、これまでのものに比べて均一に形成することができた。すなわち、複数の流路４０は、それぞれ等価に形成されるのである。
【００４６】
流路形成用の基板としてはシリコン基板１０を選択し、かかるシリコン基板１０にＩＣＰ加工で流路４０を形成するようにしたので、高精度で、アスペクト比の高い各々の等価な流路４０を形成することができる。すなわち、ガラス基板にＩＣＰ加工を適用する場合よりも、あるいはシリコン基板１０に薬液でウエットエッチングする場合よりも、より等価な流路４０を形成することができる。
【００４７】
例えば、流路幅１００μｍに対して、加工精度１％以内での形成が可能であった。そのため各流路間の加工精度によるバラツキを小さくして、並行分析に求められる複数の等価な流路４０を形成することができるようになった。
【００４８】
かかる構成の流路４０を形成したシリコン基板１０の表面１０ａ、裏面１０ｂには、パイレックス（登録商標）等のガラス板２０、３０が貼り合わされている。貼り合わせに際しては、陽極接合等が適用され、流路４０が形成されてシリコン基板１０の接着面がわずかでも確実に貼り合わせがなされている。このようにして、表面１０ａ、裏面１０ｂに形成された流路４０の上方側をガラス板２０で、流路４０の下面側をガラス板３０で、それぞれ塞ぎ液漏れしない流路４０が形成されている。
【００４９】
図４に示す場合は、簡単に、表面１０ａにガラス板２０を陽極接合する様子を示した。かかる陽極接合には、例えば、温度を４００℃、印加電圧を５００Ｖとした。
【００５０】
さらに、裏面１０ｂに形成された流路４０の蛇行開始部分から以降は、独立化学物質供給口５０、共通化学物質供給口６０からそれぞれ供給された化学物質が混合されて反応する反応部に形成されている。但し、反応部は、流路４０の一部を構成し、あくまで流路４０の延長状態として存在し、特別にその構成が他の流路４０部分と異なる訳ではない。単に、その主な役割として分けられているに過ぎない。
【００５１】
かかる流路４０に合わせて、流路４０を覆うガラス板２０、３０部分には、図示はしないが、加熱制御ができるように発熱手段が設けられている。かかる発熱手段としては、例えば、ガラス板２０、３０の表面側に、ＩＴＯ（Indium Tin Oxide）膜が設けられている。ＩＴＯ膜には、図示はしないが、電極用金属がそれぞれ成膜され、電極用金属の間に白金が成膜されている。
【００５２】
電極用金属にはそれぞれリード線が接続され、リード線、電極を介してＩＴＯ膜に電流を流すと、ＩＴＯ膜が発熱するようになっている。このように流路４０に対応して、ガラス板２０、３０に成膜されたＩＴＯ膜が発熱することにより、流路４０の反応部は所定温度に温められることとなる。
【００５３】
ＩＴＯ膜の発熱状態は、電極、白金とから構成される温度センサでリアルタイムに把握され、例えば、発熱状態が所定温度より高くなると電流の流れを制御して発熱状態を抑える等して、発熱状態の制御が行えるようになっている。
【００５４】
かかる構成のマイクロチップ１００について、形成された複数の流路４０の等価性を評価した。先ず、図５（ａ）に示すように、独立化学物質供給口５０、共通化学物質供給口６０にそれぞれ送液口４４を介して水のみを供給し、図５（ｂ）に示すようにその回収率を比較して、各流路４０の等価性を評価した。
【００５５】
すなわち、４個の独立化学物質供給口５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄからは水を０．２５μｌ／ｍｉｎ供給し、共通化学物質供給口６０ａからは水を１μｌ／ｍｉｎ供給し、共通化学物質供給口６０ｂからは水を２μｌ／ｍｉｎ供給した。各流路４０での回収量は、図５（ｂ）に示すようになった。理論上は、各流路４０には１μｌ／ｍｉｎの水が流されて１００％の回収がなされる筈であるが、実際には図５（ｂ）に示すように、９７％以上、１０５％以下の回収率であった。しかし、かかる回収率は、測定誤差の精度の範囲内であり、十分に各流路４０は等価に形成されていることが確認された。
【００５６】
さらに、図６（ａ）に示すように、独立化学物質供給口５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄから、シリンジポンプでそれぞれ流量０．５μｌ／ｍｉｎで、０．１５ｍｇ／ｍｌ濃度の酵素（キチナーゼ）を供給した。併せて、流量２μｌ／ｍｉｎで上記と同様の濃度の酵素を共通化学物質供給口６０ａから供給し、共通化学物質供給口６０ｂからは基質のパラ−ニトロフェニル トリ−Ｎ−アセチル−β−キトトリオサイド（p-nitrophenyl tri-N-acetyl-β-chitotrioside）の０．５ｍＭ濃度のものを流量４μｌ／ｍｉｎで供給して、各流路４０の等価性を検証した。反応停止液としてＮａ２ＣＯ３水溶液を３００μｌ予め入れたエッペンに、反応液を流量２μｌ／ｍｉｎで回収した。各流路への送液量は、３００μｌとした。
【００５７】
このように、回収した反応生成物であるパラ−ニトロフェノール（ｐ−nitrophenol）の吸光度を、波長４０５ｎｍで調べた。その結果は、図６（ｂ）に示すように、４本の流路に対応する排出口７０（７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０ｄ）でエッペンに回収されたｐ−nitrophenolの吸光度は、ほぼ同じであった。
【００５８】
また、本構成の流路４０にそれぞれ１５０μｌ〜３１０μｌの範囲で、流量２μｌ／ｍｉｎで上記と同様に反応物質を供給したときに、それぞれの流路４０を経て排出口７０（７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０ｄ）でエッペンに回収された回収量は、図７に示すように、９７％以上の回収率であり、それぞれの反応流路がかかる範囲内で等価であることが確認された。
【００５９】
以上のように構成された４本の流路４０は等価に形成され、且つ、共通化学物質供給口６０から供給された化学物質は、等量ずつ４本の流路４０に供給されることが分かった。各流路に対応したエッペンでの回収量も９７％以上の回収率となり、各流路４０内では反応物質がほぼ等量流れていることが確認できた。
【００６０】
また、図８（ａ）に示すように、各独立化学物質供給口５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄからは水を０．２５μｌ／ｍｉｎ供給し、共通化学物質供給口６０ａからは上記酵素を１μｌ／ｍｉｎ（濃度０．６ｍｇ／ｍｌ）供給し、共通化学物質供給口６０ｂからは上記基質を２μｌ／ｍｉｎ（濃度０．４ｍＭ）供給した。各流路４０での吸光度は、図８（ｂ）に示すように、ほぼ同じになった。かかる結果からも、各流路の等価性が確認された。
【００６１】
さらに、図９（ａ）に示すように、独立化学物質供給口５０ａから酵素反応阻害剤としてアロサミジンを０．２５μｌ／ｍｉｎ（濃度０．１ｍＭ）、独立化学物質供給口５０ｂ、５０ｃ、５０ｄからは水を０．２５μｌ／ｍｉｎ供給し、共通化学物質供給口６０ａからは前記酵素を１μｌ／ｍｉｎ（濃度０．６ｍｇ／ｍｌ）供給し、共通化学物質供給口６０ｂからは前記基質を２μｌ／ｍｉｎ（濃度０．４ｍＭ）供給した。
【００６２】
各流路４０での吸光度は、図９（ｂ）に示すようになった。すなわち、アロサミジンが反応に関与した流路では、吸光度が他の場合より大きく低下している。しかし、他の３流路では、ほぼ同程度の高い吸光度を示している。それぞれが独立した流路構成であることが検証された。
【００６３】
上記実験では、流路４０に設けた分岐点で、試薬が逆流する場合がないかを検証したものであるが、アロサミジンの酵素阻害剤がもし分岐点で逆流していたら、複数の流路で酵素反応が阻害され、図９（ｂ）に示すものとは異なる結果が得られた筈である。かかる結果から、前記の如く４本の流路４０はそれぞれ独立しており、分岐点での逆流が起きないものであることが確認された。
【００６４】
かかる等価の流路４０は、例えば、シリコン基板１０に、幅４００μｍ以内、深さ１００μｍ以内で、ＩＣＰ加工により形成する場合に可能であった。その他の例えばエッチング等では、等価な流路は形成されず、４本のそれぞれの等価性は、本発明の場合よりも劣っていた。
【００６５】
このように等価な複数の流路を用いて化学物質のスクリーニングを行うことができる。図１０、１１に、その一例を示した。例えば、図１０に示すように、独立化学物質供給口５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄからは、それぞれ目的とする化学反応の阻害となるかもしれない阻害可能性化学物質を、阻害剤Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄとして供給する。共通化学物質供給口６０ａからは酵素を、共通化学物質供給口６０ｂからは酵素と反応する基質を、それぞれ供給する。
【００６６】
このようにして、４本の独立した等価な流路４０を用いることで、独立化学物質供給口５０から供給した４種の化学物質の酵素反応阻害性に応じて、反応生成物ができる筈である。その反応生成物を分析することで、４種の阻害剤の影響を知ることができる。尚、反応部では、前記ＩＴＯ膜を用いて、３７℃に温度制御した。
【００６７】
図１０に示すように、排出口７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０ｄからは、それぞれ阻害剤Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが関与した酵素と基質との反応生成物が回収されることとなる。例えば、酵素としてキチナーゼを供給し、基質として多糖にp-nitrophenyl基が結合したものを供給することで、阻害剤Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが関与した場合のキチナーゼによるｐ−nitrophenolの遊離状況が異なる。
【００６８】
かかるｐ−nitrophenolを、Ｎａ２Ｃｏ３アルカリ溶液で発色させ、発色度合いでその遊離量を分光光度計等で分析すれば、簡単に、且つ精度高く、速やかに、試薬量を例えばμｌ単位に抑えて、複数の試料の分析が行える。
【００６９】
図１１には、上記のように、酵素として生体内の構造多糖に働くキチナーゼを使用し、基質として多糖にp-nitrophenyl基を接合したものを使用して、独立化学物質供給口からは例えば環境汚染物質を供給して、キチナーゼの酵素活性の度合いを分析し、環境汚染物質のキチナーゼ活性に及ぼす影響、すなわち阻害性を調べることができる。分析では、阻害性について、化学物質の種類、濃度等を調べることができる。
【００７０】
また、独立化学物質供給口からは、同一の化学物質を、それぞれ濃度を４種変えて供給し、共通化学物質供給口からは同様に酵素、基質を入れて、阻害剤（阻害材）の働く濃度範囲を決定するのに使用することもできる。
【００７１】
あるいは、２種の阻害可能性のある物質を２種の濃度で入れて、その影響を調べることもできる。
【００７２】
以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。
【００７３】
また、上記説明では、本発明に係る分析を、キチナーゼの生体内での環境物質の影響に関する場合を例に挙げて説明したが、本発明の適用はかかるキチナーゼ以外の酵素の反応、あるいは生体内の酵素反応に限定されるものではなく精緻な温度制御が必要とされる反応にも使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、生体内の酵素反応等に関係する化学物質の並行微量分析等の化学分析の分野で有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明に係るマイクロチップの斜視図である。
【図２】（ａ）は積層チップを構成するシリコン基板の表面側の流路形成パターンを示す平面図であり、（ｂ）はその裏面側の状況を示す平面図である。
【図３】送液口の形成部を部分的に示した断面図である。
【図４】シリコン基板への流路形成の手順を模式的に示す説明図である。
【図５】（ａ）は流路の等価性の評価における独立化学物質供給口、共通化学物質供給口への供給状況を模式的に示した説明図であり、（ｂ）は各流路での回収状況を示した説明図である。
【図６】（ａ）は流路の等価性の評価における独立化学物質供給口、共通化学物質供給口への供給状況を模式的に示した説明図であり、（ｂ）は各流路での吸光度の状況を示した説明図である。
【図７】図６（ａ）に示す構成の実験における各流路での回収量を示した説明図である。
【図８】（ａ）は流路の等価性の評価における独立化学物質供給口、共通化学物質供給口への供給状況を模式的に示した説明図であり、（ｂ）は各流路での吸光度の状況を示した説明図である。
【図９】（ａ）は流路の等価性の評価における独立化学物質供給口、共通化学物質供給口への供給状況を模式的に示した説明図であり、（ｂ）は各流路での吸光度の状況を示した説明図である。
【図１０】阻害剤と、酵素と、基質とを使用した並行微量分析の概要を示す説明図である。
【図１１】キチナーゼの酵素機能を模式的に示す説明図である。
【符号の説明】
【００７６】
１０ シリコン基板
１０ａ 表面
１０ｂ 裏面
２０ ガラス板
３０ ガラス板
４０ 流路
４１ 供給口
４２ 貫通路
４３ ガラス管
４４ 送液口
５０ 独立化学物質供給口
５０ａ 独立化学物質供給口
５０ｂ 独立化学物質供給口
５０ｃ 独立化学物質供給口
５０ｄ 独立化学物質供給口
６０ 共通化学物質供給口
６０ａ 共通化学物質供給口
６０ｂ 共通化学物質供給口
７０ 排出口
７０ａ 排出口
７０ｂ 排出口
７０ｃ 排出口
７０ｄ 排出口
１００ マイクロチップ
１０１ 酸化膜
１０２ フォトレジスト
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチップを用いた化学物質の分析法に関し、特に、種々の環境汚染物質の生体内酵素反応に及ぼす影響等をスクリーニングするのに有効に適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
以下に説明する技術は、本発明を完成するに際し、本発明者によって検討されたものであり、その概要は次のとおりである。
【０００３】
近年、基板上に幅１ｍｍ以下のμｍオーダーの流路を形成し、かかる流路に化学物質を流すことで、マクロスケールで行う場合とは異なり、微量試料で、多種類の反応を、同時並行で、短時間で効率的に行う技術が提案されている。
【０００４】
かかる技術の中には、化学物質を通す流路が形成された基板を複数枚積層し、各層の流路を連絡することで、３次元的に流路の拡大を行う技術も提案されている。非特許文献１には、複数枚の積層構成とすることで、流路内で生成する化学反応物質の収量拡大も容易に行えることが示されている。さらに、非特許文献２には、化学物質を流路に流す際の送液口に関しての記載も見られる。
【０００５】
かかるマイクロチップを用いた反応でも当然に温度制御が求められ、従来の一般的な温度制御は、恒温槽内にマイクロチップごと所要時間放置して、マイクロチップ自体の温度が恒温槽内の温度と平衡して設定温度になるのを待つ方法であった。しかし、かかる手法では、反応温度を制御するのに時間と手間がかかり、反応状況に応じて温度を適宜に変更してその状況確認をするという温度制御は実質的に不可能に近かった。
【０００６】
温度制御に関しては、特許文献１に、ＩＴＯ膜をパターニングして加熱手段を形成し、さらに、別途蛇行線状にＩＴＯ膜をパターニングして温度センサとして構成する技術も提案されている。
【非特許文献１】Y.Kikutani、「Pile-up glass microreactor」Lab Chip、2002、2、p193-196
【非特許文献２】Y.Kikutani、T.Hotiuchi、K.Uchiyama、H.Hisamoto、M.Tokeshi、T.kitamori、「Glass Microchip with Three-Dimensional Micrchannel Network for 2×2 Parallel Synthesis」、Lab on a Chip、2002、2、p188-192
【特許文献１】特開平２００２−８５９６１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
生物工学研究の重要な分野の一つに糖鎖機能の解明がある。糖鎖は、細胞間の認識や相互作用において、情報伝達時の暗号として機能していると言われている。糖鎖や糖鎖関連酵素と関係した病気の発生メカニズムを明らかにすることは、その治療法につながると期待されており、今後の糖鎖研究における大きな課題である。
【０００８】
一方、環境化学物質が引き起こす疾病等の人体への影響は未だ十分には解明されていない。どのような化学物質が生体内の酵素反応等にどのように関与し、どのような悪影響を及ぼすかを解明することは極めて重要である。かかる解明にはスクリーニング作業が不可欠となる。
【０００９】
しかし、これまでのスクリーニング方法では、多くの試薬を使用し、長時間と多額の費用とを要していた。特に、多くの試薬を使用することについては、環境化学物質による人体への再環境汚染を引き起こすことにもつながる。そのため、可能な限り微量な試薬を用いてスクリーニングする手法が試みられてはいるが、未だ有効な手法が開発されていないのが現状である。
【００１０】
そこで、本発明者は、近年その活用が注目を集めているマイクロチップを使用することで、使用する試薬量を必要最小限度に抑制することができるものと考えた。さらに、かかるマイクロチップを用いれば、試験終了後の廃液処理量も格段に少なく抑えることができ、その分、環境負荷の低減にも通じる筈である。
【００１１】
しかし、かかるマイクロチップは極めて微小であるため、その加工精度をあげるのが難しい。例えば、一個、一個が等価な製造加工がし難く、ややもすれば試験の再現性にも影響を与える場合も想定される。
【００１２】
マイクロチップを用いた化学分析では、その試料の調製も何回かに分けて希釈すること等が必要となる。特にその定量分析に至っては、器壁についた滴も極めて重大な影響を及ぼすこととなる。
【００１３】
そこで、同一試薬を用いて、複数の分析が行えれば、器具、装置等の個体差が発生せずに好ましい。例えば、マイクロチップに、複数の等価な流路を形成して、使用する試薬を極力同一濃度のものを用いる等して、できるだけ試験対象を同一の条件下で分析することができれば、互いの比較もできてより好ましい。
【００１４】
しかし、マイクロチップにおける複数の流路の等価性については、その技術的課題が多く、未だ十分に達成されていないのが現状である。複数の流路を用いて、同一条件下での定量的な分析をするについては、並行分析が十分に行えないのが現状である。
【００１５】
また、マイクロチップにおいては、流路の等価性の他に、前記の如く試薬等の送液における精度も問題となる。極めて微量な送液量であり、また複数回にわたって希釈しているため、少しの液漏れでも重大な影響を及ぼし、試験にとっては致命的なものとなる。
【００１６】
本発明の目的は、マイクロチップを用いた並行分析において、複数の流路の分析環境の等価性を向上させることにある。
【００１７】
本発明の目的は、マイクロチップを用いて生体内酵素反応等への環境汚染化学物質等の影響をスクリーニングする分析等に必要な技術を提供することにある。
【００１８】
本発明の前記ならびにその他の目的と新規な特徴は、本明細書の記述および添付図面から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本願において開示される発明のうち、代表的なものの概要を簡単に説明すれば、次のとおりである。
【００２０】
本発明はマイクロチップを用いた化学物質の並行微量分析法であって、前記マイクロチップは、厚さ方向に貫通して表裏両面を連絡するμｍオーダーの複数の流路を有し、前記複数の流路は、それぞれ前記複数の流路への少なくとも当初供給量の９７％以上の回収率を有する等価流路に形成され、前記複数の流路は、前記複数の流路のそれぞれに独立して接続された独立反応物質供給口を有し、前記複数の流路は、前記複数の流路のそれぞれに分岐して接続された共通反応物質供給口を有し、前記独立反応物質供給口から供給した反応物質と、前記共通反応物質供給口から供給した反応物質とを、前記複数の流路内のそれぞれで反応させ、反応後の反応生成物を回収して前記複数の流路内のそれぞれにおける反応状況を分析手段により分析することを特徴とする。
【００２１】
かかる構成において、前記複数の流路のそれぞれの回収率が９７％以上である場合の前記当初供給量は、１５０μｌ以上、３１０μｌ以下であることを特徴とする。以上の構成において、前記複数の流路は、１００μｍオーダーに対して１％以内の加工精度で形成されていることを特徴とする。以上いずれかの構成において、前記共通反応物質供給口からは、互いに反応する反応物質を供給し、前記独立反応物質供給口からは、前記反応を阻害するかもしれない反応阻害可能性物質を供給することを特徴とする化学物質の並行微量分析法。かかる構成において、前記反応阻害可能性物質は、環境汚染物質であることを特徴とする。
【００２２】
上記化学物質の並行微量分析法においては、前記共通反応物質供給口から供給する反応物質は、酵素と、前記酵素に反応する基質であることを特徴とする。前記酵素とは、糖鎖分解酵素であり、前記基質とは、前記糖鎖分解酵素により分離される原子団を有する多糖であることを特徴とする。前記糖鎖分解酵素とは、キチナーゼであり、前記多糖とは、構造多糖であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２３】
本願において開示される発明のうち、代表的なものによって得られる効果を簡単に説明すれば以下のとおりである。
【００２４】
本発明により、生体内酵素反応等への環境汚染物質の阻害作用等の影響を、極少量の試薬を使用して、短時間に、良好な精度で並行分析することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。尚、実施の形態を説明するための全図において、同一の部材には原則として同一の符号を付し、その繰り返しの説明は省略する場合がある。
【００２６】
本発明は、複数の流路が形成されたマイクロチップを用いて、複数の化学種のスクリーニングが行えるようにした化学物質の並行微量分析技術である。かかる並行微量分析では、複数の流路の等価性、および各流路への試薬等の送液等価性等に特に配慮した。
【００２７】
マイクロチップに形成された流路は、幅、深さが共にμｍのオーダーである。例えば、幅が４００μｍ、深さが１００μｍである。反応を行わせるマイクロチップ内の複数の流路は、それぞれ等価に形成されている。流路自体の等価性は、例えば、１００μｍオーダーの流路幅の加工に対して、加工精度１％以内に抑えられている。
【００２８】
また、複数の流路への同一物質の当初供給量１５０μｌ以上、３１０μｌ以下に対して、それぞれの流路での回収率が９７％以上で、各流路に対して等量送液されるものである。かかるマイクロチップを用いたスクリーニングでは、使用する試薬等の化学物質の量は、例えば、μｌオーダーに抑えることができる。
【００２９】
このように、本発明では、試薬使用量をμｌに抑えた状態で、送液量１５０μｌ以上、３１０μｌ以下に対して回収率が９７％以上である等価流路を使用して、複数の環境汚染物質の生体内酵素反応に対する阻害状況等のスクリーニングを、短時間で、効率的に、安価な費用で行うことができるものである。
【００３０】
図１に示すように、マイクロチップ１００は、シリコン基板１０の両面に、ガラス板２０、３０が陽極接合により貼り合わされている。ガラス板２０、３０としては、例えば、パイレックス（登録商標）等が使用できる。
【００３１】
シリコン基板１０の両面には、図２（ａ）、（ｂ）に示すように、化学物質を流すことができる流路４０が溝状に形成されている。流路４０は、例えば、シリコン基板１０の両面にそれぞれ４本形成され、各々が図２（ａ）、（ｂ）に示すように、蛇行して設けられている。また、流路４０の一部は、流路４０内に供給された化学物質が互いに反応する反応部を形成している。図では、かかる反応部を、枠状に囲って示した。
【００３２】
シリコン基板１０の表面１０ａ側には、裏面１０ｂの４本の流路４０に独立してつながるように独立化学物質供給口５０（５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄ）が設けられている。独立化学物質供給口５０は、シリコン基板１０の厚さ方向に貫通して裏面１０ｂ側に抜け、裏面１０ｂ側に設けた４本の流路４０にそれぞれ独立してつながっている。独立化学物質供給口５０（５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄ）は、このように複数に構成されているので、４本の流路４０にそれぞれ別の化学物質を並行して供給することができるようになっている。
【００３３】
また、シリコン基板１０の表面１０ａ側には、裏面１０ｂの４本の流路４０に、分岐してそれぞれつながる共通化学物質供給口６０（６０ａ、６０ｂ）が設けられている。共通化学物質供給口６０は、矢印に示すように表面１０ａ側で二手に分かれ、二手に分かれたそれぞれがシリコン基板１０の厚さ方向に貫通して裏面１０ｂ側に至り、さらに裏面１０ｂ側でさらに二手に分かれて４本の流路４０にそれぞれつながっている。
【００３４】
このように分岐して複数の各流路に接続できるように共通化学物質供給口６０を備えることにより、同一濃度の同一の化学物質を、各流路に送ることができるようになり、各流路で行われる並行分析での精度の確保が図れることとなる。
【００３５】
かかる構成の共通化学物質供給口６０は、図２（ａ）、（ｂ）に示すように、２個の共通化学物質供給口６０ａ、６０ｂに構成され、共通化学物質供給口６０ａ、６０ｂから、それぞれ異なる互いに反応する化学物質を別々に供給できるようになっている。
【００３６】
また、上記独立化学物質供給口５０、共通化学物質供給口６０に形成された供給口４１は、図３に示すように、シリコン基板１０の表面側を覆うガラス板２０に設けた貫通路４２を通して、ガラス板２０の表面側に固定したガラス管４３に繋げられている。かかるガラス管４３の固定は、ガラス板２０の表面に接着剤等で固着され、送液口４４として使用できるようになっている。
【００３７】
これまではマイクロチップを固定する治具に、マイクロチップの供給口に符合する位置にネジ孔を形成し、そのネジ孔にテフロン（登録商標）ネジを螺合させ、このテフロン（登録商標）ネジに設けた口を送液口として使用していた。かかる構成では、往々にして、送液に際してネジ孔等から液漏れが発生することがあった。
【００３８】
テフロン（登録商標）ネジを締めつけすぎるとマイクロチップが壊れてしまうため、加減した締めつけが必要となるが、しかし、かかる場合に締めつけが弱いと、ネジ孔の隙間から液漏れが発生するのである。
【００３９】
さらには、複数の流路に対応してテフロン（登録商標）ネジが複数ある場合には、個々の締めつけ具合が異なると、締めつけ方の違いにより溶液等の各流路内での流れ易さに差が出て、結果として各流路での送液量が異なることともなった。
【００４０】
しかし、前記の如く、独立化学物質供給口５０、共通化学物質供給口６０の所謂供給口４１の形成位置に、供給口４１の口径に合わせたガラス管４３を、送液チューブとして固着することにより、液漏れや送液量の違いの原因となるテフロン（登録商標）ネジを設ける必要がなくなり、それにまつわるネジの締めつけ状態等に配慮せずに、送液時の等価性の確保ができるようになった。
【００４１】
かかる構成の独立化学物質供給口５０、共通化学物質供給口６０が接続された４本の流路４０は、表面１０ａ側から裏面１０ｂに至り、裏面１０ｂ側を蛇行し、その後シリコン基板１０の厚さ方向に貫通して表面１０ａ側に上り、さらに蛇行して排出口７０（７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０ｄ）に至るように構成されている。
【００４２】
かかる流路４０の路端末側に設けられた排出口７０（７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０）は、供給口４１の形成の場合と同様に、図示はしないが、ガラス板２０に設けた貫通孔を通して、ガラス板２０の表面に接着剤等で固定したガラス管に接続され、反応生成物等の定量的な回収が図れるように構成されている。
【００４３】
かかる構成の流路４０は、次のようにしてシリコン基板１０の表裏両面に形成される。すなわち、図４に示すように、シリコン基板１０の表面に所定層厚で酸化膜１０１を熱酸化により形成する。形成した酸化膜１０１上に、感光性物質のフォトレジスト１０２を所定層厚で塗布する。フォトレジスト１０２に、流路パターンが形成されたマスクを用いて、所定波長の光で露光し、露光後現像して、流路形成パターンをフォトレジスト１０２上に形成する。
【００４４】
流路形成パターンが形成されたフォトレジスト１０２をさらにマスクとして用い、酸化膜１０１をエッチングすることで、シリコン基板１０への流路形成用マスクを形成する。かかる流路形成用マスクを用いて、ＩＣＰマルチビーム加工装置で、プラズマガスのＳＦ６を照射し、シリコン基板１０をドライエッチングすることで、流路４０に相当する溝を形成する。その後、流路４０の形成に際して使用したマスク、すなわち酸化膜１０１、フォトレジスト１０２を除去する。
【００４５】
このようにしてＩＣＰマルチビーム加工装置を用いることで、プラズマガスとしてＳＦ６を照射して形成した流路４０は、これまでのものに比べて均一に形成することができた。すなわち、複数の流路４０は、それぞれ等価に形成されるのである。
【００４６】
流路形成用の基板としてはシリコン基板１０を選択し、かかるシリコン基板１０にＩＣＰ加工で流路４０を形成するようにしたので、高精度で、アスペクト比の高い各々の等価な流路４０を形成することができる。すなわち、ガラス基板にＩＣＰ加工を適用する場合よりも、あるいはシリコン基板１０に薬液でウエットエッチングする場合よりも、より等価な流路４０を形成することができる。
【００４７】
例えば、流路幅１００μｍに対して、加工精度１％以内での形成が可能であった。そのため各流路間の加工精度によるバラツキを小さくして、並行分析に求められる複数の等価な流路４０を形成することができるようになった。
【００４８】
かかる構成の流路４０を形成したシリコン基板１０の表面１０ａ、裏面１０ｂには、パイレックス（登録商標）等のガラス板２０、３０が貼り合わされている。貼り合わせに際しては、陽極接合等が適用され、流路４０が形成されてシリコン基板１０の接着面がわずかでも確実に貼り合わせがなされている。このようにして、表面１０ａ、裏面１０ｂに形成された流路４０の上方側をガラス板２０で、流路４０の下面側をガラス板３０で、それぞれ塞ぎ液漏れしない流路４０が形成されている。
【００４９】
図４に示す場合は、簡単に、表面１０ａにガラス板２０を陽極接合する様子を示した。かかる陽極接合には、例えば、温度を４００℃、印加電圧を５００Ｖとした。
【００５０】
さらに、裏面１０ｂに形成された流路４０の蛇行開始部分から以降は、独立化学物質供給口５０、共通化学物質供給口６０からそれぞれ供給された化学物質が混合されて反応する反応部に形成されている。但し、反応部は、流路４０の一部を構成し、あくまで流路４０の延長状態として存在し、特別にその構成が他の流路４０部分と異なる訳ではない。単に、その主な役割として分けられているに過ぎない。
【００５１】
かかる流路４０に合わせて、流路４０を覆うガラス板２０、３０部分には、図示はしないが、加熱制御ができるように発熱手段が設けられている。かかる発熱手段としては、例えば、ガラス板２０、３０の表面側に、ＩＴＯ（Indium Tin Oxide）膜が設けられている。ＩＴＯ膜には、図示はしないが、電極用金属がそれぞれ成膜され、電極用金属の間に白金が成膜されている。
【００５２】
電極用金属にはそれぞれリード線が接続され、リード線、電極を介してＩＴＯ膜に電流を流すと、ＩＴＯ膜が発熱するようになっている。このように流路４０に対応して、ガラス板２０、３０に成膜されたＩＴＯ膜が発熱することにより、流路４０の反応部は所定温度に温められることとなる。
【００５３】
ＩＴＯ膜の発熱状態は、電極、白金とから構成される温度センサでリアルタイムに把握され、例えば、発熱状態が所定温度より高くなると電流の流れを制御して発熱状態を抑える等して、発熱状態の制御が行えるようになっている。
【００５４】
かかる構成のマイクロチップ１００について、形成された複数の流路４０の等価性を評価した。先ず、図５（ａ）に示すように、独立化学物質供給口５０、共通化学物質供給口６０にそれぞれ送液口４４を介して水のみを供給し、図５（ｂ）に示すようにその回収率を比較して、各流路４０の等価性を評価した。
【００５５】
すなわち、４個の独立化学物質供給口５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄからは水を０．２５μｌ／ｍｉｎ供給し、共通化学物質供給口６０ａからは水を１μｌ／ｍｉｎ供給し、共通化学物質供給口６０ｂからは水を２μｌ／ｍｉｎ供給した。各流路４０での回収量は、図５（ｂ）に示すようになった。理論上は、各流路４０には１μｌ／ｍｉｎの水が流されて１００％の回収がなされる筈であるが、実際には図５（ｂ）に示すように、９７％以上、１０５％以下の回収率であった。しかし、かかる回収率は、測定誤差の精度の範囲内であり、十分に各流路４０は等価に形成されていることが確認された。
【００５６】
さらに、図６（ａ）に示すように、独立化学物質供給口５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄから、シリンジポンプでそれぞれ流量０．５μｌ／ｍｉｎで、０．１５ｍｇ／ｍｌ濃度の酵素（キチナーゼ）を供給した。併せて、流量２μｌ／ｍｉｎで上記と同様の濃度の酵素を共通化学物質供給口６０ａから供給し、共通化学物質供給口６０ｂからは基質のパラ−ニトロフェニル トリ−Ｎ−アセチル−β−キトトリオサイド（p-nitrophenyl tri-N-acetyl-β-chitotrioside）の０．５ｍＭ濃度のものを流量４μｌ／ｍｉｎで供給して、各流路４０の等価性を検証した。反応停止液としてＮａ２ＣＯ３水溶液を３００μｌ予め入れたエッペンに、反応液を流量２μｌ／ｍｉｎで回収した。各流路への送液量は、３００μｌとした。
【００５７】
このように、回収した反応生成物であるパラ−ニトロフェノール（ｐ−nitrophenol）の吸光度を、波長４０５ｎｍで調べた。その結果は、図６（ｂ）に示すように、４本の流路に対応する排出口７０（７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０ｄ）でエッペンに回収されたｐ−nitrophenolの吸光度は、ほぼ同じであった。
【００５８】
また、本構成の流路４０にそれぞれ１５０μｌ〜３１０μｌの範囲で、流量２μｌ／ｍｉｎで上記と同様に反応物質を供給したときに、それぞれの流路４０を経て排出口７０（７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０ｄ）でエッペンに回収された回収量は、図７に示すように、９７％以上の回収率であり、それぞれの反応流路がかかる範囲内で等価であることが確認された。
【００５９】
以上のように構成された４本の流路４０は等価に形成され、且つ、共通化学物質供給口６０から供給された化学物質は、等量ずつ４本の流路４０に供給されることが分かった。各流路に対応したエッペンでの回収量も９７％以上の回収率となり、各流路４０内では反応物質がほぼ等量流れていることが確認できた。
【００６０】
また、図８（ａ）に示すように、各独立化学物質供給口５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄからは水を０．２５μｌ／ｍｉｎ供給し、共通化学物質供給口６０ａからは上記酵素を１μｌ／ｍｉｎ（濃度０．６ｍｇ／ｍｌ）供給し、共通化学物質供給口６０ｂからは上記基質を２μｌ／ｍｉｎ（濃度０．４ｍＭ）供給した。各流路４０での吸光度は、図８（ｂ）に示すように、ほぼ同じになった。かかる結果からも、各流路の等価性が確認された。
【００６１】
さらに、図９（ａ）に示すように、独立化学物質供給口５０ａから酵素反応阻害剤としてアロサミジンを０．２５μｌ／ｍｉｎ（濃度０．１ｍＭ）、独立化学物質供給口５０ｂ、５０ｃ、５０ｄからは水を０．２５μｌ／ｍｉｎ供給し、共通化学物質供給口６０ａからは前記酵素を１μｌ／ｍｉｎ（濃度０．６ｍｇ／ｍｌ）供給し、共通化学物質供給口６０ｂからは前記基質を２μｌ／ｍｉｎ（濃度０．４ｍＭ）供給した。
【００６２】
各流路４０での吸光度は、図９（ｂ）に示すようになった。すなわち、アロサミジンが反応に関与した流路では、吸光度が他の場合より大きく低下している。しかし、他の３流路では、ほぼ同程度の高い吸光度を示している。それぞれが独立した流路構成であることが検証された。
【００６３】
上記実験では、流路４０に設けた分岐点で、試薬が逆流する場合がないかを検証したものであるが、アロサミジンの酵素阻害剤がもし分岐点で逆流していたら、複数の流路で酵素反応が阻害され、図９（ｂ）に示すものとは異なる結果が得られた筈である。かかる結果から、前記の如く４本の流路４０はそれぞれ独立しており、分岐点での逆流が起きないものであることが確認された。
【００６４】
かかる等価の流路４０は、例えば、シリコン基板１０に、幅４００μｍ以内、深さ１００μｍ以内で、ＩＣＰ加工により形成する場合に可能であった。その他の例えばエッチング等では、等価な流路は形成されず、４本のそれぞれの等価性は、本発明の場合よりも劣っていた。
【００６５】
このように等価な複数の流路を用いて化学物質のスクリーニングを行うことができる。図１０、１１に、その一例を示した。例えば、図１０に示すように、独立化学物質供給口５０ａ、５０ｂ、５０ｃ、５０ｄからは、それぞれ目的とする化学反応の阻害となるかもしれない阻害可能性化学物質を、阻害剤Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄとして供給する。共通化学物質供給口６０ａからは酵素を、共通化学物質供給口６０ｂからは酵素と反応する基質を、それぞれ供給する。
【００６６】
このようにして、４本の独立した等価な流路４０を用いることで、独立化学物質供給口５０から供給した４種の化学物質の酵素反応阻害性に応じて、反応生成物ができる筈である。その反応生成物を分析することで、４種の阻害剤の影響を知ることができる。尚、反応部では、前記ＩＴＯ膜を用いて、３７℃に温度制御した。
【００６７】
図１０に示すように、排出口７０ａ、７０ｂ、７０ｃ、７０ｄからは、それぞれ阻害剤Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが関与した酵素と基質との反応生成物が回収されることとなる。例えば、酵素としてキチナーゼを供給し、基質として多糖にp-nitrophenyl基が結合したものを供給することで、阻害剤Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが関与した場合のキチナーゼによるｐ−nitrophenolの遊離状況が異なる。
【００６８】
かかるｐ−nitrophenolを、Ｎａ２Ｃｏ３アルカリ溶液で発色させ、発色度合いでその遊離量を分光光度計等で分析すれば、簡単に、且つ精度高く、速やかに、試薬量を例えばμｌ単位に抑えて、複数の試料の分析が行える。
【００６９】
図１１には、上記のように、酵素として生体内の構造多糖に働くキチナーゼを使用し、基質として多糖にp-nitrophenyl基を接合したものを使用して、独立化学物質供給口からは例えば環境汚染物質を供給して、キチナーゼの酵素活性の度合いを分析し、環境汚染物質のキチナーゼ活性に及ぼす影響、すなわち阻害性を調べることができる。分析では、阻害性について、化学物質の種類、濃度等を調べることができる。
【００７０】
また、独立化学物質供給口からは、同一の化学物質を、それぞれ濃度を４種変えて供給し、共通化学物質供給口からは同様に酵素、基質を入れて、阻害剤（阻害材）の働く濃度範囲を決定するのに使用することもできる。
【００７１】
あるいは、２種の阻害可能性のある物質を２種の濃度で入れて、その影響を調べることもできる。
【００７２】
以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は前記実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で種々変更可能であることはいうまでもない。
【００７３】
また、上記説明では、本発明に係る分析を、キチナーゼの生体内での環境物質の影響に関する場合を例に挙げて説明したが、本発明の適用はかかるキチナーゼ以外の酵素の反応、あるいは生体内の酵素反応に限定されるものではなく精緻な温度制御が必要とされる反応にも使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、生体内の酵素反応等に関係する化学物質の並行微量分析等の化学分析の分野で有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明に係るマイクロチップの斜視図である。
【図２】（ａ）は積層チップを構成するシリコン基板の表面側の流路形成パターンを示す平面図であり、（ｂ）はその裏面側の状況を示す平面図である。
【図３】送液口の形成部を部分的に示した断面図である。
【図４】シリコン基板への流路形成の手順を模式的に示す説明図である。
【図５】（ａ）は流路の等価性の評価における独立化学物質供給口、共通化学物質供給口への供給状況を模式的に示した説明図であり、（ｂ）は各流路での回収状況を示した説明図である。
【図６】（ａ）は流路の等価性の評価における独立化学物質供給口、共通化学物質供給口への供給状況を模式的に示した説明図であり、（ｂ）は各流路での吸光度の状況を示した説明図である。
【図７】図６（ａ）に示す構成の実験における各流路での回収量を示した説明図である。
【図８】（ａ）は流路の等価性の評価における独立化学物質供給口、共通化学物質供給口への供給状況を模式的に示した説明図であり、（ｂ）は各流路での吸光度の状況を示した説明図である。
【図９】（ａ）は流路の等価性の評価における独立化学物質供給口、共通化学物質供給口への供給状況を模式的に示した説明図であり、（ｂ）は各流路での吸光度の状況を示した説明図である。
【図１０】阻害剤と、酵素と、基質とを使用した並行微量分析の概要を示す説明図である。
【図１１】キチナーゼの酵素機能を模式的に示す説明図である。
【符号の説明】
【００７６】
１０ シリコン基板
１０ａ 表面
１０ｂ 裏面
２０ ガラス板
３０ ガラス板
４０ 流路
４１ 供給口
４２ 貫通路
４３ ガラス管
４４ 送液口
５０ 独立化学物質供給口
５０ａ 独立化学物質供給口
５０ｂ 独立化学物質供給口
５０ｃ 独立化学物質供給口
５０ｄ 独立化学物質供給口
６０ 共通化学物質供給口
６０ａ 共通化学物質供給口
６０ｂ 共通化学物質供給口
７０ 排出口
７０ａ 排出口
７０ｂ 排出口
７０ｃ 排出口
７０ｄ 排出口
１００ マイクロチップ
１０１ 酸化膜
１０２ フォトレジスト
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチップを用いた化学物質の並行微量分析法であって、
前記マイクロチップは、厚さ方向に貫通して表裏両面を連絡するμｍオーダーの複数の流路を有し、
前記複数の流路は、それぞれ前記複数の流路への少なくとも当初供給量の９７％以上の回収率を有する等価流路に形成され、
前記複数の流路は、前記複数の流路のそれぞれに独立して接続された独立反応物質供給口を有し、
前記複数の流路は、前記複数の流路のそれぞれに分岐して接続された共通反応物質供給口を有し、
前記独立反応物質供給口から供給した反応物質と、前記共通反応物質供給口から供給した反応物質とを、前記複数の流路内のそれぞれで反応させ、反応後の反応生成物を回収して前記複数の流路内のそれぞれにおける反応状況を分析手段により分析することを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項２】
請求項１に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記複数の流路のそれぞれの回収率が９７％以上である場合の前記当初供給量は、１５０μｌ以上、３１０μｌ以下であることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記複数の流路は、１００μｍオーダーに対して１％以内の加工精度で形成されていることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記共通反応物質供給口からは、互いに反応する反応物質を供給し、
前記独立反応物質供給口からは、前記反応を阻害するかもしれない反応阻害可能性物質を供給することを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項５】
請求項４に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記反応阻害可能性物質は、環境汚染物質であることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記共通反応物質供給口から供給する反応物質は、酵素と、前記酵素に反応する基質であることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項７】
請求項６に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記酵素とは、糖鎖分解酵素であり、
前記基質とは、前記糖鎖分解酵素により分離される原子団を有する多糖であることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項８】
請求項７に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記糖鎖分解酵素とは、キチナーゼであり、
前記多糖とは、構造多糖であることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項１】
マイクロチップを用いた化学物質の並行微量分析法であって、
前記マイクロチップは、厚さ方向に貫通して表裏両面を連絡するμｍオーダーの複数の流路を有し、
前記複数の流路は、それぞれ前記複数の流路への少なくとも当初供給量の９７％以上の回収率を有する等価流路に形成され、
前記複数の流路は、前記複数の流路のそれぞれに独立して接続された独立反応物質供給口を有し、
前記複数の流路は、前記複数の流路のそれぞれに分岐して接続された共通反応物質供給口を有し、
前記独立反応物質供給口から供給した反応物質と、前記共通反応物質供給口から供給した反応物質とを、前記複数の流路内のそれぞれで反応させ、反応後の反応生成物を回収して前記複数の流路内のそれぞれにおける反応状況を分析手段により分析することを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項２】
請求項１に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記複数の流路のそれぞれの回収率が９７％以上である場合の前記当初供給量は、１５０μｌ以上、３１０μｌ以下であることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記複数の流路は、１００μｍオーダーに対して１％以内の加工精度で形成されていることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記共通反応物質供給口からは、互いに反応する反応物質を供給し、
前記独立反応物質供給口からは、前記反応を阻害するかもしれない反応阻害可能性物質を供給することを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項５】
請求項４に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記反応阻害可能性物質は、環境汚染物質であることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項６】
請求項４または５に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記共通反応物質供給口から供給する反応物質は、酵素と、前記酵素に反応する基質であることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項７】
請求項６に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記酵素とは、糖鎖分解酵素であり、
前記基質とは、前記糖鎖分解酵素により分離される原子団を有する多糖であることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【請求項８】
請求項７に記載の化学物質の並行微量分析法において、
前記糖鎖分解酵素とは、キチナーゼであり、
前記多糖とは、構造多糖であることを特徴とする化学物質の並行微量分析法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００７−２２２０７２（Ｐ２００７−２２２０７２Ａ）
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−４６７５３（Ｐ２００６−４６７５３）
【出願日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年９月１４日 社団法人日本分析化学会主催の「日本分析化学会第５４年会」において文書をもって発表
【出願人】（３０５０２７４０１）公立大学法人首都大学東京 (385)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年９月１４日 社団法人日本分析化学会主催の「日本分析化学会第５４年会」において文書をもって発表
【出願人】（３０５０２７４０１）公立大学法人首都大学東京 (385)
【Ｆターム（参考）】
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