医薬の調製方法、ネーキッド結合要素、組合せ調製物、医薬組成物、中和方法、補体沈着向上方法、癌の治療方法、分析方法および癌治療薬の製造方法
本発明は、腫瘍や白血病の治療において、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２双方に結合する結合要素の使用に関する。この結合要素は、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に結合する抗体であることができ、ＣＤ５５を中和し、癌細胞が補体媒介攻撃による打撃を受けやすくなるようにさせる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的結合要素および治療におけるその使用に関し、特に、ＣＤ５５に結合する特異的結合要素と、補体活性のモジュレーションにおけるその使用と、新生物性疾患(neoplastic disease) 等の疾患の治療とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの補体系は、活性化されたタンパク質、レセプター、正および負のレギュレーターを含む３０種類に上る血清や細胞の成分から構成される高効率な認識・エフェクター機構からなる。すなわち、補体カスケードは、トリガステップ、フィードバックループによる増幅ステップ、そして最終的な膜侵襲、すなわち溶解ステップからなる。
【０００３】
補体系の中心的成分はＣ３である。古典経路または第２経路によるＣ３ｂの生成は、オプソニン化や溶解にとって極めて重要である。
【０００４】
古典経路は、成分Ｃ１がその構成成分であるＣ１ｑを介して抗体に付着し、免疫複合体を形成することにより開始される。しかしながら、第２経路では、抗体に相当する開始因子はない。むしろ、ネイティブＣ３（native C3)のチオエステル基の自然加水分解の結果、持続的な低レベル活性状態にある。この結果、Ｃ３は血漿中あるいは細胞表面上に存在する非特異アクセプター分子と結合することになる。これにより、Ｃ３転移酵素が生成したり、フィードバックループが出現したりする場合もあろう。強力なプロ炎症性能および破壊能のため、流動相(fluid phase) とバイスタンダー組織(bystander tissues) の双方において補体の活性化を抑制するようデザインされた調節システムが存在する。
【０００５】
膜結合性補体調節タンパク質としてはつぎの４種類、すなわち、補体レセプター１（ＣＲ１）、ＣＤ５５、ＣＤ４６およびＣＤ５９が存在する（リスゼウスキ（Liszewski）ら、１９９６、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：２０１〜２８３）。調節はつぎのいずれかによって達成される。
１．活性化されたタンパク質と酵素複合体の自然崩壊（すなわち、半減期が短い）。
２．活性複合体の不安定化および阻害。
３．「活性化された」成分のタンパク質分解切断。
【０００６】
ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９は、表面上皮細胞や腫瘍組織などの多くの組織において広く発現する。対照的に、ＣＲ１の発現は末梢の血液細胞に限定されており、そのため固形腫瘍の保護に直接関与しない。
【０００７】
大部分の腫瘍は上皮細胞を起源とするものであり、表面上皮細胞の大部分が補体調節タンパク質を発現させるのに対し、腫瘍におけるＣＤ５５、ＣＤ４６およびＣＤ５９の発現は様々である。結腸直腸（colorectal）癌や甲状腺癌の多くは、３種類の補体調節タンパク質をいずれも高レベルに発現する（ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１２９〜１４２；リー（Li）ら、２００１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８４：８０〜８６；ソルスタインソン（Thorsteinsson）、１９９８、ＡＰＭＩＳ．１０６：８６９〜８７８；ヤマカワ（Yamakawa）ら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ ７３：２８０８〜２８１７）。
【０００８】
乳房の乳管癌は、表現型に最も多くのバリエーションが見られ、１種類の阻害物質だけを発現している腫瘍もあれば、２〜３種の阻害物質を様々な組合せで発現している腫瘍もある（ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、上掲；ソルスタインソン（Thorsteinsson）、１９９８、上掲）。
【０００９】
腎臓細胞腫は１〜３種類の阻害物質（通常ＣＤ５５とＣＤ５９）の弱〜中程度の発現を示す（ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、上掲）一方、非小細胞（non-small cell）肺腫や卵巣癌、子宮頸癌は、通常ＣＤ５９とＣＤ４６を発現し、ＣＤ５５との免疫反応性は一定ではない（ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、上掲；ブジョージ（Bjorge）ら、１９７７、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４２：１８５〜１９２；シンプソン（Simpson）ら、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：１４５５〜１４６７）。
【００１０】
これまでに各種細胞株において同様の結果が得られている（ブジョージ（Bjorge）ら、１９９６、上掲；ゴーター（Gorter）ら、１９８６、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４ １；ジャール（Jurl）ら、１９９７、Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ．６４：２２２〜２３０；リー（Li）ら、２００１、上掲）。
【００１１】
３種類の補体調節タンパク質は全て血管内皮で発現する。補体が媒介する障害のリスクが増大する可能性のある炎症に関連してこれらタンパク質がどのような具体的な役割を果たしているのかについてはいまだ判明していない。ＣＤ５５は、内皮細胞でプロ炎症性のメディエーターであるＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＦＮ−γによりアップレギュレートされ、またＭＡＣ（膜侵襲複合体）やトロンビンによってもアップレギュレートされるが、ＣＤ４６やＣＤ５９にはこれらの特性は見られない。この結果は、炎症や凝固中、補体から内皮細胞を保護することにおいて、ＣＤ５５が極めて重要であることを示唆している。
【００１２】
さらに、内皮細胞が後退して内皮下細胞外マトリックスが露出すると、第２補体経路が強力に誘導されて炎症を刺激するアナフィラトキシンが放出されることが近年示された。腫瘍は統制の乱れた内皮細胞を有し、血管壁を露出させていることが多いため、腫瘍環境においては補体の活性化が誘導されるであろう。これは、腫瘍細胞が補体調節レセプターを過剰発現する理由の１つである。しかしながら、実際は、腫瘍細胞と内皮細胞のいずれもがＣＤ４６ではなくＣＤ５５を、その細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へ分泌できることが示された（ハインドマーシュ（Hindmarsh）とマークス（Marks）、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１２８〜６１３６）。ハインドマーシュ（Hindmarsh）とマークス（Marks）は内皮細胞ではなく腫瘍に由来するＣＤ５５が機能的に活性であり、Ｃ３ｂの沈着を抑制できることを示した。
【００１３】
しかしながら、マトリックスに沈着したＣＤ５５は炎症性サイトカインによってアップレギュレートされ得ないであろう。より最近になって本発明者らは、ＣＤ５５とＣＤ５９はどちらも腫瘍および内皮細胞によって細胞外マトリックスに沈着でき、後者は強力な血管形成増殖因子（ＶＥＧＦ）（リー（Li）ら、２００１、上掲）により、かなりアップレギュレートされることを示した。さらに、ＶＥＧＦで刺激された内皮細胞により沈着したＣＤ５５は機能的に活性であることが示された。ＶＥＧＦは、現在、サイトカインのうち、ＣＤ５５の細胞表面における発現とＥＣＭへの沈着のいずれをもアップレギュレートすることが分かっている唯一のサイトカインであるという点で特別である。
【００１４】
多くの腫瘍はＶＥＧＦを高レベルに分泌して血管形成を誘導するので、内皮細胞上およびＥＣＭ内におけるＣＤ５５の発現が刺激される。興味深いことに、結腸直腸腫瘍（colorectal tumours）と抗ＣＤ５５モノクローナル抗体の免疫組織化学作用の結果、腫瘍のストロマ（リー（Li）ら、２００１、上掲；シンプソン（Simpson）ら、１９９７、上掲；ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、上掲）および血管（ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、上掲）が濃く染色される。ＥＣＭ内に沈着したＣＤ５５が共有結合し、強酸または強アルカリによって放出されなくなっているのである。
【００１５】
ＣＤ５５は、古典補体経路および第２補体経路双方からのＣ３転移酵素に結合し、Ｃ２ｂとＣ３ｂをそれぞれ動かす。そのため、ＣＤ５５はＣ３ｂの沈着を抑制することができ、下流における膜侵襲複合体の形成を阻害する。
【００１６】
ＣＤ５５は、隣接する４種類のショートコンセンサス（ＳＣＲ）ドメインと細胞表面に近接するトレオニン／セリンに富む領域から構成される細胞外ドメインを有する。
【００１７】
ＣＤ５５は、第１および第２ＳＣＲドメイン間に単一のＮ−グリコシル化部位を有し、トレオニンとセリンに富む領域では非常にＯ−グリコシル化されている。
【００１８】
ＣＤ５５はグリコホスホイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞膜に付着しており、補体に曝されている全細胞、すなわち赤血球、白血球、内皮および上皮細胞によって発現される。
【００１９】
ＣＤ５５は、また、血漿、唾液および尿中にも少量検出された。この可溶性形態(soluble form)の生物学的意義は、機能的に活性であることが示されていないため、依然として明確でない。近年、ＨｅＬａ細胞とＨＵＶＥＣがＣＤ５５を自身の細胞外マトリックスに組み込むこと、およびこの共有結合したＣＤ５５がＣ３ｂの沈着とプロ炎症性アナフィラトキシンＣ３ａの放出を阻害できるということが示された（ハインドマーシュ（Hindmarsh）およびマークス（Marks）、１９９８、上掲）。
【００２０】
補体調節タンパク質の機能を阻害する各種抗体は、腫瘍細胞を原位置で補体の活性化の影響を受けやすくするとともに、腫瘍細胞をモノクローナル抗体仲介補体依存性細胞毒に対しても敏感にさせることもある。
【００２１】
キメラ抗Ｌｅｗｉｓ Ｙモノクローナル抗体（ｃＨ１８Ａ）は、肺腺癌細胞の２種の細胞株に対し、補体仲介細胞溶解を媒介する程度は低かった。しかし、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の機能をブロックする抗体の添加は補体媒介型溶解をかなり向上させる。補体調節タンパク質に対して複数のブロック抗体を用いると、いずれか１種類の抗体の場合よりｃＨ１８Ａ仲介型溶解が向上する（アズマ（Azuma）ら、１９９５、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：２０２〜２０８）。
【００２２】
いくつかの研究グループが二重特異性抗体を作製している。これは、一方の腕が腫瘍細胞表面の抗原を標的とし、他方の腕は補体調節タンパク質の機能的ドメインを標的とするものである。ＨＬＡおよびＣＤ５５のＳＣＲ３を標的とする二重特異性抗体によれば、腎臓腫瘍へのＣ３ｂの沈着を９２％向上させるという結果が得られた。同様に、同一の研究において、腎臓腫瘍抗原およびＣＤ５５のＳＣＲ３を標的とする二重特異性抗体によれば、腎臓腫瘍へのＣ３ｂの沈着を２５〜４００％上昇させるとともに、細胞に補体仲介型溶解を受けやすくさせるという結果が得られた（ブロク（Blok）ら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３４３７〜３４４３）。
【００２３】
最後に、キメラ抗ＣＤ３７モノクローナル抗体を用いて補体古典経路を活性化した場合、リンパ腫の特異的抗原とＣＤ５９の機能的ドメインとを標的とする二重特異性抗体のＦａｂガンマコンストラクトは細胞溶解を３〜５倍上昇させた（ハリス（Harris）ら、１９９７年、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：３６４〜３７１）。
【００２４】
しかしながら、今までの研究によってＣＤ５５のＳＣＲ３を認識する各種モノクローナル抗体が、ＣＤ５５を部分的に中和し、Ｃ３ｂの沈着を向上させるとともに、ＭＡＣ複合体形成を導くことが示されたはいえ、これらの抗体はいずれもＣ３転移酵素によるＳＣＲ３への結合に対して競合しているにすぎず、よって、部分的にＣＤ５５を中和しているだけである。
【００２５】
ＣＤ５５の分子構造から、ＳＣＲ３がＣＤ５５の活性ドメインであり、Ｃ３が結合するための正確な構造を提供するのにＳＣＲ２とＳＣＲ４が必要であることが示された。補体崩壊におけるＳＣＲ１の役割は示されていない。しかしながら、ＳＣＲ２はＣ３が結合するための正確な構造を提供するのに必要であるが、ＣＤ５５のシングルのＳＣＲドメインに対するモノクローナル抗体を用いた研究から、ＳＣＲ１またはＳＣＲ２に結合する抗体ではなく、ＳＣＲ３に結合するモノクローナル抗体が、唯一ＣＤ５５を中和できるということが示された（コイン（Coyne）ら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９、２９０６）。
【００２６】
モノクローナル抗体７９１Ｔ／３６を用いた骨肉種、卵巣腫瘍および結腸直腸腫瘍（colorectal tumours）におけるイメージングの研究（エンブレトン（Embleton）ら、１９８１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：５８２〜５８７）において、１ｃｍ３という小さい病変部の画像化に成功した（ファランズ（Farrands）ら、１９８２、Ｌａｎｃｅｔ ２：３９７〜４００；ファランズ（Farrands）ら、１９８３、Ｊ．ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．６５：６３８〜６４０；アーミテージ（Armitage）ら、１９８５、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：６２３〜６３１）。
【００２７】
さらに、切除した腫瘍のオートラジオグラフィーから、抗体の局在化が、細胞表面と、そしてより強い程度で間質とに見られた（アーミテージ（Armitage）ら、１９８４、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７１：４０７〜４１２）。
【００２８】
これらの研究は、抗ＣＤ５５抗体が正常組織に対する毒性を一切示すことなく、効果的に腫瘍を局部的に食い止めることができることを説明している。特に、内皮細胞または正常組織上においては、放射線標識された抗体の血液細胞に対する結合は検出されず、放射線標識のバックグラウンドレベルのみが測定された。最近、７９１Ｔ／３６によって認識される抗原がＣＤ５５として特定された（スペンドラブ（Spendlove）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２９４４〜２９５３；スペンドラブ（Spendlove）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２２８２〜２２８６）。
【００２９】
ＣＤ５５／ＣＤ４６キメラ構築体を用いた、ＣＤ５５の第１の２種類のＳＣＲドメインに対する７９１Ｔ／３６の結合部位のマップ化が成功し、ペプチドの分析により７９１Ｔ／３６がＣＤ５５のＳＣＲ１〜２に別個の３領域に結合できることが示された。１領域はＳＣＲ１に存在し、他２領域はＳＣＲ２に存在する。
【００３０】
従来から、ナイーブ抗体ファージライブラリーを用いた、崩壊促進因子（ＤＡＦ）を標的とする抗体等の抗体作製方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。この特許文献１は、癌の診断や治療におけるそのような抗体の使用について言及しており、ＤＡＦの過剰発現の評価あるいは肺癌の治療、特に細胞毒性剤と組み合わせた場合の治療における抗体ＬＵ３０の使用が示唆されているが、挙げられている例は推測の域を出ていない。
【００３１】
また、従来から、抗体７９１Ｔ／３６に対して作製された抗イディオタイプ抗体１０５ＡＤ７の製造が知られており（例えば、特許文献２参照）、この特許文献２は、１０５ＡＤ７抗体の潜在的な治療上の使用について推測している。
【００３２】
【特許文献１】国際公開第００／５２０４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／４４１５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
しかしながら、今のところ、抗ＳＣＲ３抗体を除き、治療面において有用な抗ＣＤ５５抗体は示されていない。この分子の他のＳＣＲを標的とする抗体を用いた治療上の研究は免疫コンジュゲート化された分子に限定されてきた（例えば、ＵＳ４９１６２１３（ゾーマ社）、ＵＳ４９２５９２２（ゾーマ社）およびベイヤーズ（Byers）ら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５０４２〜５０４６参照）。例えばベイヤーズ（Byers）らは、リシンのＡ鎖に結合させた７９１Ｔ／３６を用いた研究について記載しており、無胸腺マウスの腫瘍の増殖を強く阻害することが示された。そのため、７９１Ｔ／３６−ＲＴＡを、進行した結腸直腸癌（colorectal cancer）患者の第Ｉ相臨床試験においてスクリーニングした（ベイヤーズ（Byers）ら、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ ４９：６１５３〜６１６０）。しかしながら、用量依存性毒性（dose limiting toxicity）のため、その試験は成功しなかった。
【００３４】
今までの研究においては、ＣＤ５５のＳＣＲ１またはＳＣＲ２を標的とする抗体は、ＣＤ５５に対して中和作用を有しないことが示されていたのに対し、驚くべきことに、本発明者らはこのたび、ＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方を標的とする抗体が、ＣＤ５５を効果的に中和するだけでなく、ＳＣＲ３中和抗体よりも優れたものであることを見い出した。
【００３５】
従って本発明は、その第１のアスペクトにおいて、ＣＤ５５を中和する方法を提供するものであり、該方法は、ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２と特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含む。
【００３６】
ＣＤ５５を中和することによって、容易に補体の沈着を向上させることができる。従って本発明は、その第２のアスペクトにおいて、組織上の補体の沈着を向上させる方法を提供するものであり、該方法は、ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２と特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含む。
【００３７】
本発明の各方法は、生体内外で用いることができる。
【００３８】
前述したように、ＣＤ５５は多くの腫瘍細胞表面に広く存在し、補体の沈着を阻害する働きをする。本発明の方法は、腫瘍細胞上のそのような分子を中和することによって、腫瘍細胞に対する補体媒介型の攻撃を可能とする。従って、本発明は、別の面においては、癌の治療方法を提供するものであり、該方法は必要とする哺乳類動物へのＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２と特異的に結合するネーキッド結合要素の治療有効量の投与を含む。
【００３９】
本発明は、その更なる別の面において、（i）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素または（ii）前記結合要素をコードする核酸の、ＣＤ５５を中和するための医薬の調製における使用を提供するものである。
【００４０】
本発明は、その更なる他の面において、癌治療に使用するための、ＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素を提供するものである。
【００４１】
本発明は、更なるアスペクトにおいて、（i）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素または（ii）前記結合要素をコードする核酸の、癌治療薬の調製における、使用を提供するものである。
【００４２】
さらに本発明は、癌治療のための医薬組成物を提供するが、該組成物はＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素を含む。
【００４３】
特異的結合要素
本明細書において、「結合要素」とは、互いに対して結合特異性を有する一対の分子を構成する要素である。よって、結合要素とは特異的結合要素である。結合対を構成する前記要素は天然由来であるか、全部または一部が合成により生成されたものである。分子対の一方の要素は表面に凸部または凹部等の領域を有し、この領域は、分子対の他方の要素の特定の空間・極性構造と特異的に結合する、すなわち該構造と相補的である。このため、対を構成する各要素は互いに特異的に結合する性質を有する。結合対のタイプとしては、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質が挙げられる。
【００４４】
本発明は抗原−抗体型の反応に関するものであるが、本発明の結合要素および本発明における使用のための結合要素は、ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２の双方に結合可能であればいかなる部分（moiety）とすることができる。
【００４５】
本明細書において使用する用語「ネーキッド」は、本発明の結合要素または本発明における使用のための結合要素は、リシン等、抗癌性を有するいかなる物質にも結合されていない、ということを意味する。
【００４６】
抗体
「抗体」は免疫グロブリンであり、天然に存在するか、一部または全部が合成により生成される。この用語は、また抗体結合ドメインであるか抗体結合ドメインに相当する結合ドメインを有するいかなるポリペプチド、タンパク質またはペプチドをも包含する。これらは、天然源由来のものでもよいし、一部または全部が合成により生成されたものでもよい。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプとそのアイソタイプサブクラス、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ等の抗原結合ドメインを含むフラグメント、およびダイアボディ（diabodies）等が挙げられる。
【００４７】
本発明の結合要素は、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体等の抗体、またはそのフラグメントであることができる。抗体の定常領域はいかなるクラスのものでもよく、例えばヒトのクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体はどのサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に属していてもよい。ＩｇＧ１が好ましい。好ましい実施態様においては、抗体は、ＡＴＣＣに寄託された細胞株（受託番号ＨＢ９１７３）によって産生される７９１Ｔ／３６である。
【００４８】
抗体は多くの方法で修飾することができるが、「抗体」という用語は、必要な特異性を備えた結合ドメインを有するものであれば、いかなる結合要素や物質も包含するものとして解釈すべきである。よって、この用語は抗体のフラグメントや誘導体、抗体と機能的に等価なものおよび同種のものを包含し、例えば天然のものであれ、全部または一部が合成されたものであれ、免疫グロブリン結合ドメインを有するいかなるポリペプチドをも含む。よって、免疫グロブリン結合ドメイン（または等価物）が別のポリペプチドと結合したキメラ分子も含まれる。キメラ抗体のクローニングと発現についてはＥＰ−Ａ−０１２０６９４とＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【００４９】
抗体分子を構成する種々のフラグメントには、抗原に結合する機能を有するものがあることが示されている。そのような結合フラグメントの例としては、（i）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１の各ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ii）ＶＨおよびＣＨ１の各ドメインからなるＦｄフラグメント；（iii）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（iｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（ワード（Ward)，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６（１９８９））；（ｖ）単離したＣＤＲ領域；（ｖi）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち２個の結合されたＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント（ｖii）ＶＨドメインとＶＬドメインとが、これら２ドメインを関係づけて抗原結合部位を形成させることができるペプチドリンカーによって互いに結合している一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（バード（Bird)ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６（１９８８）；ヒューストン（Huston）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３（１９８８））；（ｖiii）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（iｘ）「ダイアボディ」、すなわち遺伝子融合によって形成された多価または多重特異性フラグメント（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．ホーリンガー（Hollinger）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８（１９９３））が挙げられる。
【００５０】
本発明において使用するための抗体またはポリペプチドのフラグメント（例えば７９１Ｔ／３６抗体のフラグメント）は、一般に少なくとも５〜７個の隣接するアミノ酸からなる一続きのアミノ酸残基配列を意味し、これは少なくとも約７〜９個の隣接するアミノ酸からなる場合もあるが、通常は少なくとも約９〜１３個の隣接するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０〜３０以上の隣接するアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約３０〜４０以上の連続するアミノ酸からなる残基である。フラグメントの好ましいグループは、モノクローナル抗体７９１Ｔ／３６抗体のＣＤＲ領域を全部または部分的に含むものである。
【００５１】
そのような抗体やポリペプチドの「誘導体」や７９１Ｔ３６抗体のフラグメントの「誘導体」は、タンパク質のアミノ酸配列を変えること（例えば、タンパク質をコードする核酸を操作するまたはタンパク質そのものに変更を加える）によって改変された抗体やポリペプチドを意味する。天然のアミノ酸配列のそのような誘導体は、１以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失および／または置換を伴うことができるが、これらを伴ったものであってもＣＤ５５中和活性等の抗ＣＤ５５活性を有するペプチドを提供するものが好ましい。そのような誘導体において挿入、付加、欠失および／または置換されるアミノ酸の数は２５以下が好ましく、より好ましくは１５以下、さらに好ましくは１０以下、特に好ましくは４以下、最も好ましくは１または２である。
【００５２】
「抗体」という用語は、「ヒト化された」各種の抗体を含む。ヒト化抗体の作製方法は、本技術分野において公知である。方法については、例えば米国特許第５２２５５３９号（ウィンター（Winter））に記載されている。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体（７９１Ｔ／３６等）の超可変領域とヒト抗体の定常領域とを有する改変された抗体であってもよい。よって、結合要素はヒトの定常領域を含むことができる。
【００５３】
超可変領域以外の可変領域もまた、ヒト抗体の可変領域に由来することができる、および／または７９１Ｔ／３６等のモノクローナル抗体に由来することができる。そのような場合、可変領域全体をマウスモノクローナル抗体７９１Ｔ／３６由来のものとすることができ、この抗体はキメラ化されていると言われる。キメラ化抗体の作製方法は、本技術分野において公知である。そのような方法としては、例えばボス（Boss）（セルテック社）の米国特許およびキャビリー（Cabilly）（ジェネンテック社）の米国特許に記載されたものが挙げられる（それぞれ米国特許第４８１６３９７号および４８１６５６７号を参照）。
【００５４】
モノクローナル抗体やその他各種抗体を用い、組換えＤＮＡ技術の技法を利用すれば、元の抗体の特異性を保持する別の抗体またはキメラ分子を生成することが可能である。この技法では、抗体の、免疫ブロブリン可変領域（あるいは相補性決定領域（ＣＤＲ））をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域（あるいは定常領域にフレームワーク領域をプラスした領域）に導入する（例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８Ａ、ＥＰ−Ａ−２３９４００参照）。抗体を産生するハイブリドーマ等の細胞を遺伝子変異等の変化に付すことができる（この変化は、産生される抗体の結合特異性を変えるものであっても、変えないものであってもよい）。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様においては、結合要素は図１ｂに示す配列のＣＤ５５のＳＣＲ１（アミノ酸８３〜９３）およびＳＣＲ２（アミノ酸１０１〜１１２とアミノ酸１４５〜１５７）に結合するものである。
【００５６】
結合要素は、ＡＴＣＣに寄託された細胞株（受託番号ＨＢ９１７３）によって産生された抗体の各種ＣＤＲの内の１以上あるいは該ＣＤＲのフラグメントを含むことができる。
【００５７】
前述したように、本発明の好ましい実施態様において、結合要素はＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞（受託番号ＨＢ９１７３）によって産生された抗体７９１Ｔ／３６である。本明細書において、「７９１Ｔ／３６」と記載した場合、７９１Ｔ／３６に対してかなりの相同性を有する配列も含まれる。７９１Ｔ／３６の相補性決定領域（ＣＤＲ）と他抗体のＣＤＲとの相同性の程度は、少なくとも６０％であることが好ましく、より好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、最も好ましくは９５％である。
【００５８】
２種類のアミノ酸配列または２種類の核酸の配列における相同率は、最適な比較ができるように配列同士を並べ（例えば、相手側配列と最もよく合うように並べるため、一方の配列にギャップを挿入することができる）、対応する位置のアミノ酸残基やヌクレオチドを比較することによって決定することができる。「最もよく合う並び」とは、２個の配列を並べたときに最も高い相同率が得られる並びをいう。相同率は、比較する配列中の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの個数によって決定される（すなわち、相同率％＝（同一の位置の数／位置の全数）×１００）。
【００５９】
２配列間の相同率の決定は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを用いて達成できる。２配列を比較するための数学的アルゴリズムの一例は、カーリン（Karlin）とアルツシュル（Altschul）のアルゴリズム（１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４〜２２６８）であり、これはさらにカーリン（Karlin）とアルツシュル（Altschul）（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５８７７）に記載のように改変されている。アルツシュル（Altschul）らのＮＢＬＡＳＴとＸＢＬＡＳＴプログラム（１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０）はそのようなアルゴリズムを組み込んだものである。ＢＬＡＳＴのヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を用いて行うことができ、これにより本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴのタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて行うことができ、これにより本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列が得られる。配列にギャップを挿入して比較する場合は、アルツシュル（Altschul）らの文献（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載のようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いれば反復検索により、分子同士の関係が薄くても検出できる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔの各プログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴやＮＢＬＡＳＴ）を使用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照）。
【００６０】
配列比較用の数学的アルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ， ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このアルゴリズムは、ＣＧＣ配列アライメント・ソフトウェアパッケージの一部のＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。当業界における他の公知の配列解析アルゴリズムとしては、Ｔｏｒｅｌｌｉｓ ＆ Ｒｏｂｏｔｔｉ（１９９４）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１０：３−５に記載のＡＤＶＡＮＣＥやＡＤＡＭ、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−８に記載のＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡにおいては、ｋｔｕｐは検索の感度およびスピードを設定する制御オプションである。
【００６１】
高度の配列同一性が存在する場合、アミノ酸配列の相違は比較的少ない。相違は例えば２０未満、１０未満の場合、また、５未満の場合すらあろう。
【００６２】
本発明者らは、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に向けられた抗体、例えば７９１Ｔ／３６抗体やそのフラグメントあるいはその誘導体を癌治療薬として使用することによって、ＣＤ５５を不活化し、腫瘍細胞が補体媒介型の攻撃を受けやすくさせることができることを示した。このことは、癌患者の腫瘍内における抗体の局在化と癌患者の生存率の上昇によって示される（実施例参照）。
【００６３】
したがって、本発明は、さらに、７９１Ｔ／３６のネーキッド「フラグメント」や「誘導体」あるいは「７９１Ｔ／３６」ファミリーの他のポリペプチドであってＣＤ５５エピトープのＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するものを癌治療剤の調製のために使用することを提供する。
【００６４】
結合要素は、単独であるいは１以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。よって本発明は、さらに、癌治療において同時に、別々にまたは順次的に使用するための組合せ調製物としての作用剤、およびＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素を含む製品を提供するものである。作用剤としては各種化学療法剤を挙げることができ、その例としてはドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン、マイトマイシンＣ、オキサリプラチン、ラルチトレキセド、タモキシフェンおよびシスプラチンを挙げることができ、これらは本発明の結合要素と共働的に作用できるものである。他の各種作用剤としては、非ステロイド系の抗炎症薬（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェン、ケトプロフェン）や麻酔剤（モルヒネ等）等の鎮痛薬、または鎮吐剤を挙げることができる。別の実施形態においては、作用剤は別の結合要素であってもよい。よって、好ましい態様においては、結合要素は１以上の他の結合要素と組み合わせて投与することができる。そのような結合要素としては、抗ＣＤ２０抗体（例えばリツキサン（リツキシマブ）；バイオジェン・アイデック社、米国マサチューセッツ州、ケンブリッジ）；抗ＶＥＧＦ抗体（例えばアバスチン（ベバシズマブ）；ジェネンテック社、米国カルフォルニア州、南サンフランシスコ／ロシュ社、スイス国バーゼル）；抗ＣＤ１７１Ａ抗体（例えばパノレックス（エドレコロマブ）；セントコア社；米国ペンシルベニア州、マルバーン)／グラクソスミスクライン社、英国、アックスブリッジ）；抗ＣＥＡ抗イディオタイプｍＡｂ（例えばシーバック（CeaVac）、タイタンファーマスーティカルズ社、米国カルフォルニア州、南サンフランシスコ）；抗ＥＧＦＲ抗体（例えばエルビタックス（セツキシマブ）、イムクローン社、米国ニューヨーク／ブリストル・マイヤーズ・スクイブ社、米国ニューヨーク、メルク社、米国ニュージャージー州、ホワイトハウス・ステーション）；抗ＨＭＦＧ抗イディオタイプｍＡｂ（例えばトリアブ、タイタンファーマスーティカルズ社、米国カルフォルニア州、南サンフランシスコ）、抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡＢＸ−ＥＧＦ、アブジェニクス社、米国カリフォルニア州フリーモント／アムジェン社、カルフォルニア州、サウザンドオークス）および／または抗ＨＥＲ２抗体（例えばハーセプチン、ジェネンテック社、米国カルフォルニア州、南サンフランシスコ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
作用剤(active agent)は結合要素と共働的に作用するのが好ましい。作用剤と共働的に作用し殺腫瘍を向上させる結合要素の能力は、免疫エフェクター機構によるものではなく、むしろＣＤ５５を不活化し補体の沈着や溶解を促進することの直接的な結果によるものである。本発明の結合要素は検出可能な標識を保持することができる。
【００６６】
治療
「治療」とは、ヒトまたは非ヒト動物に利益を提供しうる如何なる治療計画をも含む。治療は、現在見られる症状に関するものであってもよいし、予防的なもの（予防的処置）であってもよい。したがって、「治療」は治癒、軽減、予防等の効果を提供する。
【００６７】
「癌治療」は、癌性増殖に起因する症状の治療を含むとともに、新生物増殖や腫瘍の治療を含む。本発明のシステムによって扱うことができる腫瘍の例としては、例えば骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫；乳癌腫、肺癌腫、膀胱癌腫、甲状腺癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、結腸直腸癌腫、膵臓癌腫、胃癌腫、肝臓癌腫、子宮癌腫、子宮頸癌腫、卵巣癌腫等の癌腫；ホジキンや非ホジキンリンパ腫等のリンパ腫；神経芽細胞腫；メラノーマ；ミエローマ；ウィルムス腫瘍；急性リンパ芽球性白血病等の白血病；グリオーマ；網膜芽細胞腫を挙げることができる。
【００６８】
結合要素は、癌性細胞あるいは組織（腫瘍細胞と非腫瘍細胞を含む）上に存在するＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に結合すると、ＣＤ５５を中和し補体の沈着を促進するとともに補体の媒介するこれら細胞の溶解を向上させることができる。
【００６９】
特に、本発明の組成物および方法は、現在罹患している癌の治療に有用であり、かつ、一度治療や手術を行った癌の再発予防に有用である。
【００７０】
投与
本発明の結合要素は、単独でも投与できるが、医薬組成物として投与するのが好ましく、これは一般に、意図した投与経路に応じて選択される適切な医薬的賦形剤や希釈剤、担体を含むものである。本発明の結合要素は、治療を必要とする患者に適切な経路で投与することができる。正確な投与量は、該要素の正確な性質（全抗体なのか、フラグメントなのか、ダイアボディかなど）や、該要素に付着させる検出可能なラベルの性質をはじめとする、数々の因子によって決定される。
【００７１】
適切な投与経路の例としては、経口、経結腸直腸、経鼻、局所（口内、舌下等）、経膣、非経口（皮下、筋内、経静脈、皮内、髄膜、硬膜外等）投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。静脈投与が好ましい。
【００７２】
カテーテルや他の外科的挿管による送達も考えられるが、注射（静脈注射）が本組成物の治療的投与のための主経路である。粉末形態の場合は、液状形態に戻してから使用することができる。
【００７３】
静脈注射または患部への注射のためには、活性成分は非経口で許容されうる水溶液の形態（パイロジェンフリーで適切なｐＨ、等張性および安定性を有するもの）をとる。当業者にとって、塩化ナトリウム注、リンゲル注、ラクテート化リンゲル注等の等張性媒体を用いて適切な溶液を調製することは十分容易である。必要に応じ、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、および／またはその他の添加剤も使用できる。
【００７４】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末または液状であることができる。錠剤はゼラチンやアジュバント等の固形の担体を含むことができる。液体の医薬組成物は一般に、水、石油、動物性・植物性油、鉱物油や合成油等の液体の担体を含むことができる。また、生理的食塩水溶液、デキストロースまたは他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコール類も使用できる。
【００７５】
本発明の組成物は、また、ミクロスフィアや、リポソーム、その他の微細球状デリバリーシステム、徐放性調製物等を、血流のある組織に配置することによって投与することもできる。徐放性担体の好適な例としては、個別形状体に使用する半透性ポリマーマトリックス、例えば、座薬やマイクロカプセルが挙げられる。移植可能な、あるいはマイクロカプセル形状の徐放性マトリックスとしてはポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号；ヨーロッパ特許出願００５８４８１Ａ）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートからなるコポリマー（シドマン（sidman）ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２（１）：５４７〜５５６、１９８５）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）やエチレンビニルアセテート（ランガー（Langer)ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７、１９８１およびランガー（Langer)、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５、１９８２）が挙げられる。ポリペプチドを含有するリポソームは周知の方法によって調製される（ＤＥ３２１８１２１Ａ；エプスタイン（Epstein）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８２：３６８８〜３６９２、１９８５；ホワン（Hwang）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、７７：４０３０〜４０３４、１９８０；ＥＰ−Ａ−００５２５２２Ａ；Ｅ−Ａ−００３６６７６；ＥＰ−Ａ−００８８０４６；ＥＰ−Ａ−０１４３９４９；ＥＰ−Ａ−０１４２５４１；ＪＰ−Ａ−８３−１１８０８；ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ ４４８５０４５および４５４４５４５）。通常、リポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム）単層構造体であり、脂質含量は約３０モル％コレステロールより高く、その選択された部分(proportion)がポリペプチドの溶出最適速度を達成するよう調節される。
【００７６】
前述した技法およびプロトコール、または本発明に従って用いることができる他の技法およびプロトコールの例は、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"第１６版、オスロ・エー(Oslo, A)編、１９８０に記載されている。
【００７７】
組成物は腫瘍部位あるいは他の所望とする部位に局在化されるような方法で投与することができる、すなわち、腫瘍や他の各種細胞を標的とする方法で送達されることができる。抗体や細胞特異的リガンド等のターゲッティングシステムを利用するターゲッティング治療は、作用剤をある種の細胞により高い特異性で送達するために用いることができる。ターゲッティングはいろいろな理由から好ましい。例えば、薬剤が許容できない程度に毒性を示すものであったり、そうでなくてもあまりにも高用量を必要としたり、あるいはターゲッティング以外では標的の細胞に届かせることができない場合を挙げることができる。
【００７８】
医薬組成物
前述したように、本発明は、癌治療のための医薬組成物にまで拡張され、この組成物はＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に結合するネーキッド結合要素を含むものである。本発明の医薬組成物および本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分のほか、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝剤・安定化剤、あるいはその他当業者に周知の物質を含むことができる。そのような物質は、毒性がないことが必要とされ、かつ活性成分の効能に干渉しないものでなくてはならない。担体やその他の物質の正確な性質がどうあるべきかは、経口や注射（例えば静脈注射）といった投与経路によって決められるであろう。
【００７９】
形状は、液体であってもよいし（例えばｐＨ６．８〜７．６の非リン酸緩衝液を含有する生理的食塩水溶液）、凍結乾燥粉末であってもよい。
【００８０】
投与量
本発明組成物は、好ましくは、「治療有効量」を患者に投与するものであって、これは対象となる患者に効果を示す十分な量である。実際の投与量、投与の割合や経時プロフィル(rate and time-course)は治療対象となるものの性質や重篤度によって決まる。治療の処方（投与量の決定等）は究極的には医師一般や他のメディカルドクターの責任・裁量の範囲内であり、典型的には治療対象の疾病、個々の患者の症状、送達部位、投与方法、その他、医師のよく知る因子群が考慮される。
【００８１】
最適な投与量は、年齢、性別、体重、治療対象となる状態の重篤度、投与される活性成分および投与経路等、数々のパラメータに基づき医療従事者によって決定されることができる。一般的に、ポリペプチドと抗体の血清濃度は、レセプターを飽和させることのできる血清濃度であることが望ましい。約０．１ｎＭを超える濃度が、通常十分な濃度である。例えば、抗体１００ｍｇ／ｍ２の投与量は、約８日間で２０ｎＭ程度の血清濃度を提供する。
【００８２】
大まかなガイドラインによると、抗体の投与は毎週１０〜３００ｍｇ／ｍ２の量とすることができる。これと同等の抗体フラグメントを投与する場合には、ＣＤ５５を飽和できる濃度を超えた血清レベルを維持するため、投与間隔をより短くして使用することが必要とされる。
【００８３】
結合要素の生産
本発明の結合要素および本発明の使用のための結合要素は、その全部または一部分を化学合成により生成することができる。結合要素は十分確立された標準液、または好ましくは固相ペプチド合成法、広く入手可能な一般的記述によって容易に調製できる（Ｊ．Ｍ．スチュワート（Stewart）およびＪ．Ｄ．ヤング（Young）、固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）、第２版、ピアースケミカル社（Pierce Chemical Company）、イリノイ州、ロックフォード（Rockford）（１９８４）；Ｍ．ボダンズスキー（Bodanzsky）およびＡ．ボダンズスキー（Bodanzsky）、ペプチド合成の実践（The Practice of Peptide Synthesis）、ニューヨーク州、スプリンガー バーラグ（Springer Verlag）（１９８４）；および応用バイオシステムズ４３０Ａユーザーズマニュアル（Applied Biosystems 430A Users Manual）、ＡＢＩ社、カルフォルニア州、フォスターシティ（Foster City）等参照）。あるいは溶液中で、液相法により調製したり、固相、液相と溶液化学を組み合わせることによって調製することもできる（例えば、まず各ペプチド部分を完成させ、ついで所望され、かつ適切な場合には、存在する保護基を全て除去後、カルボン酸やスルホン酸、その反応誘導体の反応によって残基Ｘを導入する）。
【００８４】
本発明における使用に適した結合要素を生産する別の便利な方法は、結合要素をコードする核酸を発現させることであり、核酸を発現システムにおいて用いることである。よって、本発明は、さらに、ネーキッド結合要素（すなわち、癌治療のための薬剤の調製において、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合する要素）をコードする単離された核酸を提供するものである。
【００８５】
本発明に従って使用するための核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含することができ、かつその全体または一部が合成物であってもよい。好ましいアスペクトにおいては、本発明に使用する核酸は先に定義した本発明の結合要素をコードするものである。当業者であれば、本発明の結合要素をなお提供できる。そのような核酸に対する置換、欠失および／または付加を決定することができるであろう。
【００８６】
本発明で使用するための結合要素をコードする核酸の配列は、核酸の配列とクローンさえ入手できれば、本明細書に含まれる情報やレファレンスおよび本技術分野に知られた技法（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ「モレキュラー・クローニング；ラボラトリー・マニュアル」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９年およびＡｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学における簡単なプロトコル」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、１９９２年参照)によって、当業者は容易に調製することができる。これら技法の例としては、（i）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した核酸サンプルの増幅（例えば、ゲノム源から）、（ii）化学合成、（iii）ｃＤＮＡ配列の調製、を挙げることができる。抗体の各種フラグメントをコードするＤＮＡは、当業者に知られた何らかの適切な方法（コードしているＤＮＡを準備し、発現させるべきどちらの側であれ、適切な制限酵素認識部位を特定し、ＤＮＡからそのような部分を切り出す等）によって生成し、利用することができる。この部分は、ついで市販されている標準的な発現システムの適切なプロモーターに機能的に結合させることができる。別の組換えアプローチは、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡ中の目的関連部分を増幅させることである。部位特異的変異変異誘発を用いる等により、配列に対して各種の修飾を行うことができ、これにより、修飾されたペプチドを発現させることができる。また、核酸を発現させるために用いた宿主細胞中のコドンの選択順位を確認することもできる。
【００８７】
核酸は、プラスミド、ベクター、転写または発現カセット（前記の核酸を少なくとも一種類含む）といった形態のコンストラクトとして含まれていてもよい。このコンストラクトは、１以上の前記コンストラクトを含むリコンビナント宿主細胞内に含まれていてもよい。発現は、適切な条件で核酸を含有するリコンビナント宿主細胞を培養すれば容易に達成できる。発現させて生産した後、何らかの適切な技法を用いて特異的結合要素を単離および／または精製し、その後適宜使用することができる。
【００８８】
本発明に従って使用するための結合要素コード核酸分子やベクターは、例えば天然の環境から単離および／または精製することにより、実質的に純粋または均一な形態において提供することができる。あるいは、核酸の場合には、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸や遺伝子源がない（あるいは実質的にない）形態として提供できる。
【００８９】
様々な種類の宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングシステムや発現システムは周知である。適切な宿主細胞としては、バクテリア、哺乳類細胞、酵母およびバキュロウィルスの系を挙げることができる。ヘテロ・ポリペプチドの発現のために本技術分野において利用できる哺乳類細胞株としてはチャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビー・ハムスター腎細胞、ＮＳＯマウス・メラノーマ細胞、その他多数のものを挙げることができる。一般的で、好ましい細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉ．である。
【００９０】
Ｅ．ｃｏｌｉ．等の原核細胞における各種抗体および抗体フラグメントの発現は、本技術分野において確立されたものである。これについては、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎによる”Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”９：５４５−５５１（１９９１）が参照される。培養中の真核細胞における発現も、結合要素を生産するための選択肢として当業者は利用することができる。最近のレビュー記事としては、Ｒｅｆｆ、”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．”４：５７３−５７６（１９９３）；Ｔｒｉｌｌら、”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．”６：５５３−５６０（１９９５）が参照される。
【００９１】
あるいは、本発明において使用するための特異的結合要素の生産は、トランスジェニック生物、例えば哺乳動物、鳥、魚、昆虫または植物のトランスジェニック生物において、本技術分野に知られた方法によって行うことができる。そのようなトランスジェニック技法においては、（１以上の）結合要素をコードする核酸を細胞または胚に導入することができる。そのような導入方法としては、直接注入、エレクトロポレーション、核移入技法(nuclear transfer technique)、ベクター（例えば、ウィルスベクター）を利用する方法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。より好ましい一実施態様においては、特異的結合要素は鳥の組織、好ましくは鳥の卵で生産されるものであり、例えば、英国出願第０２２７６４５．９号（２００２年１１月２７日出願）およびこの出願の優先権を主張する国際出願において開示された方法を用いることができる。
【００９２】
適当な調節配列を有する適切なベクターを選択または構築することができる。この調節配列としては、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニレーション配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じて使用できるその他各種配列を挙げることができる。ベクターとしては各種プラスミド、ウィルス性ベクター（例えば、「ファージ」）または必要に応じてファージミドを挙げることができる。詳細については、例えばサムブルック(Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（第２版）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９年）参照。核酸を操作するための多くの知られた技法やプロトコール、例えば核酸コンストラクトの調製、変異の誘発、シークエンシング、ＤＮＡの各種細胞への導入および遺伝子発現、タンパク質解析等については、オースベル(Ausubel)ら編のショート・プロトコル・イン・モレキュラー・バイオロジー（第２版）ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（１９９２年）が参照される。
【００９３】
核酸は、適切なものでありさえすれば如何なる手段によっても宿主細胞に導入することができる。この導入には利用可能な如何なる技法をも用いることができる。真核細胞の場合に適切な技法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション法およびレトロウィルスまたはその他のウィルス（ワクシニアウィルス等、また昆虫細胞の場合にはバキュロウィルス）を用いた形質導入を挙げることができる。細菌細胞の場合に適切な技法としては、塩化カルシウムトランスフォーメーション、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いたトランスフェクションを挙げることができる。
【００９４】
抗生物質耐性遺伝子や感受性遺伝子等のいわゆるマーカー遺伝子を利用して、目的とする核酸を有するクローンを同定でき、これについては本技術分野において周知である。
【００９５】
導入に続き、核酸からの発現を誘導するが、これは例えば、宿主細胞を遺伝子発現に適した条件で培養することで行うことができる。
【００９６】
前記核酸は、宿主細胞のゲノム（染色体等）に導入される。この導入は、標準的な技法に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列の組込みによって促進される。核酸は細胞内のエクストラ染色体ベクター上のものか、さもなければ該細胞に対し同定可能に異種あるいは外来性であることができる。
【００９７】
分析
さらに本発明は、細胞サンプルまたは組織への補体の沈着を向上させるために使用できる、抗体等の更なる薬剤を同定するための分析を提供するものであり、これは任意に癌治療に用いることができる。
【００９８】
より好ましい面において、前記分析はＣＤ５５を阻害できる薬剤を同定するための分析方法を含むものであり、これはつぎの各ステップ：
ａ）候補剤をＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の少なくとも一部に接触せしめ；そして
ｂ）前記の候補剤のＳＣＲ１とＳＣＲ２に対する結合を測定する、
を含む。
【００９９】
さらなる実施態様において、前記分析方法はＣＤ５５を阻害できる薬剤を同定するための方法を含むものであり、これはつぎの各ステップ：
（ａ）ネーキッド結合要素の存在下で候補剤をＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の少なくとも一部に接触せしめ（ここでネーキッド結合要素は、候補剤が存在しないとＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合できるものである）；
（ｂ）候補剤が、ネーキッド結合要素のＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に対する結合を阻害する程度を決定する、
を含む。
【０１００】
前記分析はさらに、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合する候補剤を選択するステップ；および／または候補剤の存在下および非存在下において、細胞サンプルに沈着する補体の量を決定するステップ、を含むこともできる。
【０１０１】
本発明の分析のより好ましい実施態様において、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の部分は、図１ｂに示した配列のアミノ酸８３〜９３、１０１〜１１２および１４５〜１５７を含む。
【０１０２】
本発明は、さらに、スクリーニング方法を提供するものであり、これはＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に対するネーキッド結合要素の結合阻害能を有する候補剤のライブラリーをスクリーニングするステップを含む。
【０１０３】
本発明の分析はいわば篩（スクリーン）であり、これによって多くの候補剤が試験される。したがって、当業者に知られた各種化合物をスクリーニングするための何らかの適切な技法を用いることができる。前記スクリーンはハイスループット・スクリーンである。例えば国際公開第８４／０３５６４号パンフレットは、大量のペプチドを固体の支持体上に合成し薬剤と反応させ洗浄するという方法について記載している。結合したものが検出される技法である。
【０１０４】
本発明は、また、競合的薬剤（competitive drug)のスクリーニング分析という用途も意図しており、この分析は、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に特異的に結合できる７９１Ｔ／３６等の中和抗体が、ＣＤ５５のＳＣＲ１と２に結合する試験化合物と競合するものである。
【０１０５】
本発明のスクリーニング方法によって同定された各剤および癌治療のための医薬の製造におけるその使用もまた、本発明によって意図されたものである。
【０１０６】
本発明の各面における好ましい特徴は、必要な変更を加えれば他の面についても当てはまる。
【０１０７】
以下、本発明を実施例によってさらに説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１０８】
実施例１．ＣＤ５５中和分析
オクチルグルコシドに溶解させた７９１Ｔ細胞から、イムノアフィニティー−マトリックス精製によって精製ＣＤ５５抗原を得た。精製抗原から得られたタンパク質の配列データに基づくプライマーを用いて、ＣＤ５５ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定を行った（スペンドラブ（Spendlove）ら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２２８２）。得られたＤＮＡ配列は、カラス（Caras）らによって同定されＧｅｎｂａｎｋデータベースに収められているもの（受託番号Ｍ３１５１６）と一致した。
【０１０９】
細胞
骨肉腫細胞株７９１Ｔを、熱失活させた１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ(ギブコ、ＢＲＬ、ペイズリーおよびＵＫ)中で増殖させた。
【０１１０】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体７９１Ｔ／３６（ＩｇＧ２ｂ 抗７９１Ｔｇｐ７２；エンブレトン（Embleton）ら、１９８１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：５８２〜５８７）、ＢＲＩＣ２１６（ＩｇＧ１ 抗ＳＣＲ３（ＣＤ５５の）；テイト（Tate）ら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６１，４８９）、ＢＲＩＣ２２０（ＩｇＧ１ 抗ＳＣＲ１（ＣＤ５５の）；テイト（Tate）ら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６１，４８９）、ＢＲＩＣ１１０（ＩｇＧ１ 抗ＳＣＲ２（ＣＤ５５の）；スプリング（Spring）ら、１９８７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６２ ３７７；コイン（Coyne）ら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９ ２９０６）については、従前報告されている。この中のＢＲＩＣ抗体はブラッド・グループ・レファレンス・ラボラトリー(Blood Group Reference laboratory) (英国ロンドン）から購入した。
【０１１１】
方法
ＣＤ５５を過剰発現している７９１Ｔ腫瘍細胞を１０％ＦＣＳ含有培地で洗浄し、１００μＬ当たり１×１０５の細胞密度で再懸濁した。一次抗体を５０μｇ／ｍＬの濃度で、サンプル体積の３倍量（３×１０５細胞／３００μＬ）とともにインキュベートした。一次抗体としては、ポジティブコントロール抗体２１６（抗ＳＣＲ３）、ネガティブコントロール抗体２２０（抗ＳＣＲ１）および試験抗体７９１Ｔ／３６（抗ＳＣＲ１、ＳＣＲ２）を用いた。細胞と抗体を、４℃で１時間インキュベートしてからＰＢＳで洗浄した。サンプルをチューブあたり１００μＬとして３試料に分けた。補体源として合計濃度５％でヒト血清（熱失活なし）を添加した。チューブを数回反転させてから３７℃で２時間インキュベートした（３０分毎に混合した）。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、ポリクローナルウサギ抗ヒトＣ３ｃＦＩＴＣコンジュゲート抗体（１／１００）に終体積１００μＬとなるように添加した。細胞を４℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄し、１％調製細胞２００μＬに再懸濁させた。
【０１１２】
結果
図２は非ブロック抗体２２０存在下で、Ｃ３ｂの７９１Ｔ細胞への沈着が低レベル(modest levels)であったことを示している（ＭＬＦ２００）。ＣＤ５５中和抗体２１６の存在下では、Ｃ３ｂの沈着の向上が観察される（ＭＬＦ３５０）。しかしながら、モノクローナル抗体７９１Ｔ／３６の存在下では、Ｃ３ｂの沈着量がより一層増大した（ＭＬＦ５２０）。このことは、２１６がＳＣＲ３への結合をＣ３転移酵素と競合するのに有効であるが、７９１Ｔ／３６のＳＣＲ１とＳＣＲ２ドメインへの結合はＣＤ５５を機能的に不活化させＣ３ｂの沈着を２５０％増大させたことを示唆している。
【０１１３】
実施例２．腫瘍イメージングのため放射線標識７９１Ｔ／３６で処置された再発結腸直腸癌（colorectal cancer）患者の長期生存
抗体とラベリング
抗体源はハイブリドーマ７９１Ｔ／３６クローン３である（７９１Ｔ／３６、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ）。ハイブリドーマを産生しているマウスの腹水を、ｐＨ７．５、０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸・リン酸バッファー中、プロテインＡ−「セファロース」カラムに適用し、カラムを十分に洗浄した。結合した免疫グロブリンを、ｐＨ６．０、５．０、４．５および３．０で順次溶出させ、次いでこれをリン酸緩衝化生理食塩水によって透析した。ついで、透析液を１，０００，０００ｇで１時間遠心し、０．２２μｍのMillexミリポア・フィルターを用いて濾過し、−７０℃で保存した（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。この調製物は、マウス・イムノグロブリン・タイピング抗血清（マイルズ・ラボラトリーズ、ストーク・ポッジズ、バックス）による免疫核酸試験で、ＩｇＧ２ｂのみを含有しており、またパイロゲン・フリーであることがわかった（ブーツ・ファーマスーティカル社、ノッツ）。
【０１１４】
抗体調製物の各バッチは、試薬「Ｉｏｄｏｇｅｎ」を用いて１３１Ｉで標識した。未結合ヨウ素は、セファデックスＧ２５のゲル濾過によって除去した。標識された調製物は、生理食塩水（血清アルブミン１％含有）で希釈し、Millex濾過によって滅菌した。
【０１１５】
結腸直腸癌（colorectal cancer）を再発した７２名の患者に対し、放射線標識したモノクローナル抗体７９１Ｔ／３６によるイメージングを行った。患者は抗体１０μｇの皮内(id)投与、続いて２００μｇの静脈投与を受けた。２００μｇの抗体と約７０ＭＢｑの１３１Ｉを含有する２ｄＬの調製物を３０分かけて各患者の前腕前部静脈に注入した。
【０１１６】
生存について７年間追跡し、同時期の再発結腸直腸癌患者グループとの比較を行った。７９１Ｔ／３６を受けた患者のうち長期生存者が１２名（１６％）おり、これに対し同時期グループでは７年間生存したのは８９名の患者のうちわずか１名（ｐ＞０．００１）であった。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
この結果は、放射線標識した７９１Ｔ／３６抗体を受けた患者は、非無作為試験(non-randomised trial)において生存率に関し明白な利益を享受していることを示している。腫瘍に到達する放射線標識の投与量は、放射線標識のみで殺腫瘍を引き起こすのに必要なレベルより非常に低い。したがって、前記抗体がＣＤ５５を不活化することによって、残りの腫瘍に対する補体の攻撃が可能となったということが十分考えられる。これら患者は７９１Ｔ／３６抗体の静脈投与を一回受けただけであることを考えると、得られた生存率の向上は劇的である。ヒト化７９１Ｔ／３６抗体を繰返し注射すると、一層明白な治療上の利点が得られるであろう。
【０１１９】
実施例３．ＳＣＲ１とＳＣＲ２に対する新規なモノクローナル抗体の産生
ＣＤ５５抗原を過剰発現している７９１Ｔ細胞（１０６細胞）を６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に２回注射し（各回の間隔を３週間あけて）免疫した。ついで、マウスにヒトＦｃと融合させたＳＣＲ１−２タンパク質を注射して追加免疫し、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。マウスの尾部から採血し、文献記載に従って血清をスクリーニングに付し、ＣＨＯ細胞が発現するＣＤ５５ＳＣＲ１−２／ＣＤ４６ＳＣＲ３−４キメラ分子を認識する能力を有するものを選択した（スペンドラブ（Spendlove）ら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，２９４４）。
【０１２０】
また、ＳＣＲ１−２ＣＤ５５Ｆｃタンパク質とＩＣ、２Ｎおよび２Ｃペプチドを認識する能力についてもスクリーニングした。このペプチドは前に述べたようにＢＳＡに付着させたものである（スペンドラブ（Spendlove）ら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，２９４４）。
【０１２１】
ＣＤ５５ＳＣＲＩおよびＳＣＲ２を認識する抗体を産生しているマウスに対して、ＳＣＲ１−２Ｆｃタンパク質を静脈注射し追加免疫して、５日後に脾臓細胞(splenocytes)を取り出し、ＰＥＧを用いてＮＳＯミエローマ細胞と１０：１の比で融合させる。ＨＡＴ培地を用いてハイブリドーマを選別し、ＳＲＲ１−２Ｆｃタンパク質を認識する抗体の産生についてＥＬＩＳＡを行いスクリーニングする。正しい抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法で３回クローニングし（ウェル当たり１細胞）、クローン性を確実なものとする。モノクローナル抗体を、ＣＨＯ細胞によって発現されているＣＤ５５ＳＣＲ１−２／ＣＤ４６ＳＣＲ３−４キメラ分子を認識する能力について、文献記載に従いスクリーニングする（スペンドラブ（Spendlove）ら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，２９４４）。
【０１２２】
また、ＳＣＲ１−２ＣＤ５５Ｆｃタンパク質とＩＣ、２Ｎおよび２Ｃペプチドを認識する能力についてスクリーニングする。このペプチドは既に文献記載されているようにＢＳＡに付着させたものである（スペンドラブ（Spendlove）ら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，２９４４）。７９１Ｔ／３６と同じ部位を認識するかどうか決定するため、プレートを前記のようにＣＤ５５でコーティングする。
【０１２３】
ついで、新規のモノクローナル抗体とインキュベートし、続いてビオチン化７９１Ｔ／３６とインキュベートする。７９１Ｔ／３６の結合については、アビジンペルオキシダーゼとＡＢＴＳ基質を用いて、プレートリーダーで４０５ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を読み取り定量する。モノクローナル抗体が７９１Ｔ／３６と同一または関連する部位を認識すると、ＣＤ５５抗原に対する７９１Ｔ／３６の結合が阻害されるであろう。
【０１２４】
本明細書中に言及された文書全てを、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。ここに記載した実施形態に対する、本発明の範囲と精神から逸脱せずになされうる様々な変更やバリエーションについては当業者に明らかであろう。
【０１２５】
本発明を、特定の好ましい実施態様と関連させ記述してきたが、請求の範囲に記載の本発明を不当にそのような特定の実施態様に限定してはならないものと理解されるべきである。実際、本発明を実施するためのここに記載した態様に関する当業者に自明な種々の改変は、本発明の範囲内に入るものであると意図されている。
【０１２６】
参考文献
１．リスゼウスキ（Liszewski），Ｍ．Ｋ．、Ｔ．Ｃ．ファリース（Farries）、Ｄ．Ｍ．ルブリン（Lublin）、Ｉ．Ａ．ルーニー（Rooney）およびＪ．Ｐ．アトキンソン（Atkinson）、１９９６、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：２０１〜２８３.
２．ハインドマーシュ（Hindmarsh），Ｅ．Ｊ．およびＲ．Ｍ．マークス（Marks）、１９９８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１０５２〜１０６２．
３．ニーハンス（Niehans），Ｇ．Ａ．、Ｄ．Ｌ．チェルウィッツ（Cherwitz）、Ｎ．Ａ．ステイリー（Staley）、Ｄ．Ｊ．クナップ（Knapp）およびＡ．Ｐ．ダルマッソ（Dalmasso）、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１２９〜１４２.
４．リー（Li），Ｌ．、Ｉ．スペンドラブ（Spendlove）、Ｊ．モーガン（Morgan）およびＬ．Ｇ．デュラン（Durrant）、２００１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８４：８０〜８６.
５．ソルスタインソン（Thorsteinsson），Ｌ．、Ｇ．Ｍ．オダウド（O'Dowd）、Ｐ．Ｍ．ハリントン（Harrington）およびＰ．Ｍ．ジョンソン（Johnson）、１９９８、ＡＰＭＩＳ．１０６：８６９〜８７８.
６．ヤマカワ（Yamakawa），Ｍ．、Ｋ．ヤマダ（Yamada）、Ｔ．ツゲ（Tsuge）、Ｈ．オオルイ（Ohrui）、Ｔ．オガタ（Ogata）、Ｍ．ドバシ（Dobashi）およびＹ．イマイ（Imai）、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ ７３：２８０８〜２８１７.
７．ブジョージ（Bjorge），Ｌ．、Ｔ．Ｓ．ジェンセン（Jensen）およびＲ．マトレ（Matre）、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４２：１８５〜１９２．
８．シンプソン（Simpson），Ｋ．Ｌ．、Ａ．ジョーンズ（Jones）、Ｓ．ノーマン（Norman）およびＣ．Ｈ．ホルメス（Holmes）、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：１４５５〜１４６７.
９．ジャール（Jurl），Ｈ．、Ｆ．ヘルミグ（Helmig）、Ｋ．バルツァー（Baltzer）、Ｈ．カルソッフ（Kalthoff）、Ｄ．ヘンネブランス（HenneBruns）およびＢ．クレマー（Kremer）、１９９７、Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ．６４：２２２〜２３０.
１０．ハインドマーシュ（Hindmarsh），Ｅ．Ｊ．およびＲ．Ｍ．マークス（Marks）、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１２８〜６１３６.
１１．ニーハンス（Niehans），Ｇ．Ａ．、Ｄ．Ｌ．チェルウィッツ（Cherwitz）、Ｎ．Ａ．ステイリー（Staley）、Ｄ．Ｊ．クナップ（Knapp）およびＡ．Ｐ．ダルマッソ（Dalmasso）、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１２９〜１４２.
１２．アズマ（Azuma），Ａ．、Ｙ．ヤマノ（Yamano）、Ａ．ヨシムラ（Yoshimura）、Ｔ．ヒビノ（Hibino）、Ｔ．ニシダ（Nishida）、Ｈ．ヤギタ（Yagita）、Ｋ．オクムラ（Okumura）、Ｔ．セヤ（Seya）、Ｒ．カンナギ（Kannagi）、Ｍ．シブヤ（Shibuya）およびＳ．クドウ（Kudoh）、１９９５、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：２０２〜２０８.
１３．ブロク（Blok），Ｖ．Ｔ．、Ｍ．Ｒ．ダハ（Daha）、Ｏ．ティズマ（Tijsma）、Ｃ．Ｌ．ハリス（Harris）、Ｂ．Ｐ．モーガン（Morgan）、Ｇ．Ｊ．フローレン（Fleuren）およびＡ．ゴーター（Gorter）、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３４３７〜３４４３.
１４．ハリス（Harris），Ｃ．Ｌ．、Ｋ．Ｓ．カン（Kan）、Ｇ．Ｔ．スティーブンソン（Stevenson）およびＢ．Ｐ．モーガン（Morgan）、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：３６４〜３７１.
１５．ファランズ（Farrands），Ｐ．Ａ．、Ａ．Ｃ．パーキンス（Perkins）、Ｍ．Ｖ．ピム（Pimm）、Ｊ．Ｄ．ハーディー（Hardy）、Ｍ．Ｊ．エンブレトン（Embleton）、Ｒ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）およびＪ．Ｄ．ハードキャッスル（Hardcastle）、１９８２、Ｌａｎｃｅｔ ２：３９７〜４００.
１６．ファランズ（Farrands），Ｐ．Ａ．、Ａ．パーキンス（Perkins）、Ｌ．サリー（Sully）、Ｊ．Ｓ．ホプキンス（Hopkins）、Ｍ．Ｖ．ピム（Pimm）、Ｒ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）およびＪ．Ｄ．ハードキャッスル（Hardcastle）、１９８３、Ｊ．ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．６５：６３８〜６４０.
１７．アーミテージ（Armitage），Ｎ．Ｃ．、Ａ．Ｃ．パーキンス（Perkins）、Ｍ．Ｖ．ピム（Pimm）、Ｍ．Ｌ．ワスティー（Wastie）およびＲ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）、１９８５、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：６２３〜６３１.
１８．アーミテージ（Armitage），Ｎ．Ｃ．、Ａ．Ｃ．パーキンス（Perkins）、Ｍ．Ｖ．ピム（Pimm）、Ｐ．Ａ．ファランズ（Farrands）、Ｒ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）およびＪ．Ｄ．ハードキャッスル（Hardcastle）、１９８４、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７１：４０７〜４１２.
１９．ベイヤーズ（Byers），Ｖ．Ｓ．、Ｍ．Ｖ．ピム（Pimm）、Ｐ．Ｊ．スキャンノン（Scannon）、Ｉ．ポールズィック（Pawluczyk）およびＲ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５０４２〜５０４６.
２０．ベイヤーズ（Byers），Ｖ．Ｓ．、Ｒ．ロドビエン（Rodvien）、Ｋ．グラント（Grant）、Ｌ．Ｇ．デュラン（Durrant）、Ｋ．Ｈ．ハドソン（Hudson）、Ｒ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）およびＰ．Ｊ．スキャンノン（Scannon）、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ ４９：６１５３〜６１６０.
２１．スペンドラブ（Spendlove），Ｉ．、Ｌ．リー（Li）、Ｊ．カルミカエル（Carmichael）およびＬ．Ｇ．デュラン（Durrant）、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２２８２〜２２８６.
２２．エンブレトン（Embleton），Ｍ．Ｊ．、Ｂ．ガン（Gunn）、Ｖ．Ｓ．ベイヤーズ（Byers）およびＲ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）、１９８１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：５８２〜５８７.
２３．ラブランド（Loveland），Ｂ．Ｅ．、Ｍ．ランテリ（Lanteri）、Ｐ．キリアコウ（Kyriakou）およびＤ．クリスチャンセン（Christiansen）、１９９８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５：３６９ Ａ１５５.
２４．ランテリ（Lanteri），Ｍ．、Ｄ．クリスチャンセン（Christiansen）、Ｐ．Ｍ．ホガース（Hogarth）、Ｉ．Ｆ．Ｃ．マッケンジー（McKenzie）およびＢ．Ｅ．ラブランド（Loveland）、１９９８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５：３６９ Ａ１５６.
２５．エバンス（Evans），Ｍ．Ｊ．、Ｓ．Ｌ．ハートマン（Hartman）、Ｄ．Ｗ．ウォルフ（Wolff）、Ｓ．Ａ．ロリンズ（Rollins）およびＳ．Ｐ．スクイント（Squinto）、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１２３〜１３８.
２６．カサスノバス（Casasnovas），Ｊ．Ｍ．、Ｍ．ラービー（Larvie）およびＴ．スタール（Stehle）、１９９９、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．１８：２９１１〜２９２２.
２７．フリードマン（Friedman），Ａ．Ｒ．、Ｖ．Ａ．ロバーツ（Roberts）およびＪ．Ａ．タイナー（Tainer）、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔ． Ｆｕｎｃｔ． Ｇｅｎｅｔ．２０：１５〜２４.
２８．スタンフィールド（Stanfield），Ｒ．Ｌ．、Ｍ．タキモト−カミムラ（Takimoto-Kamimura）、Ｊ．Ｍ．リニ（Rini）、Ａ．Ｔ．プロフィー（Profy）およびＩ．Ａ．ウィルソン（Wilson）、１９９３、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １：８３〜９３.
２９．コイン（Coyne）ＫＥ、ホール（Hall）ＳＥ、トンプソン（Thompson）ＥＳ、アース（Arce）ＭＡ、イノシタ（Inoshita）Ｔ、フジタ（Fujita）Ｔ、アンスティー（Anstee）ＤＪ、ロッセ（Rosse）Ｗ、ルブリン（Lublin）ＤＭ（１９９２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９ ２９０６〜２９１３.
３０．スプリング（Spring）ＦＡ、ジャドソン（Judson）ＰＡ、ダニエルズ（Daniels）ＳＦ、パーソンズ（Parsons）ＳＦ、マリンソン（Mallinson）Ｇおよびアンスティー（Anstee）ＤＪ９１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６２ ３７７.
３１．テイト（Tate）ＣＧ、ウチカワ（Uchikawa）Ｍ、タナー（Tanner）ＭＪＡ、ジャドソン（Judson）ＰＡ、パーソンズ（Parsons）ＳＦ、マリンソン（Mallinson）Ｇおよびアンスティー（Anstee）ＤＪ（１９８９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６１，４８９.
３２．ゴーター（Gorter）Ａ、ブロク（Blok）ＶＴ、ハースヌート（Haasnoot）ＷＨＢ、エンシンク（Ensink）ＮＧ、ダハ（Daha）ＭＲ、ローレン（Leuren）ＧＪ（１９９６），Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４ １０３９〜１０４９.
３３．スペンドラブ（Spendlove）Ｉ、リー（Li）Ｌ、ポッター（Potter）Ｖ、クリスチャンセン（Christiansen）Ｄ、ラブランド（Loveland）Ｂおよびデュラン（Durrant）ＬＧ（２０００），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，２９４４.
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１ａ】１０５ＡＤ７ハイブリドーマからの、ＶＫおよびＶＨのｃＤＮＡが翻訳されたＣＤＲ配列を示す。大文字はＣＤＲ領域を示し、小文字は隣接するフレームワークのアミノ酸である。
【図１ｂ】３種類のＣＤＲペプチドとＣＤ５５のアラインメントを示す。アミノ酸の番号付けは、リーダー配列を含む完全長配列からなされたものである。後の分析に用いるＣＤ５５ペプチドをアンダーラインで示した。黒丸（・）アミノ酸が相同であることを示し、物理化学的性質が類似するアミノ酸には（｜）で印をしてある。
【図２】補体Ｃ３ｂの沈着の分析を示す。７９１Ｔ細胞をヒト血清（補体源）とインキュベートした。Ｃ３ｂの沈着は、ウサギ抗Ｃ３ｂＦＩＴＣ標識抗体を用いて、ブロック抗体（２１６）、非ブロック抗体（２２０）または試験抗体７９１Ｔ／３６の存在下で測定した。蛍光はＦＡＣＳｃａｎフロー・サイトメーターで定量し、平均線形蛍光(mean linear fluorescence;ＭＬＦ)で示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的結合要素および治療におけるその使用に関し、特に、ＣＤ５５に結合する特異的結合要素と、補体活性のモジュレーションにおけるその使用と、新生物性疾患(neoplastic disease) 等の疾患の治療とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの補体系は、活性化されたタンパク質、レセプター、正および負のレギュレーターを含む３０種類に上る血清や細胞の成分から構成される高効率な認識・エフェクター機構からなる。すなわち、補体カスケードは、トリガステップ、フィードバックループによる増幅ステップ、そして最終的な膜侵襲、すなわち溶解ステップからなる。
【０００３】
補体系の中心的成分はＣ３である。古典経路または第２経路によるＣ３ｂの生成は、オプソニン化や溶解にとって極めて重要である。
【０００４】
古典経路は、成分Ｃ１がその構成成分であるＣ１ｑを介して抗体に付着し、免疫複合体を形成することにより開始される。しかしながら、第２経路では、抗体に相当する開始因子はない。むしろ、ネイティブＣ３（native C3)のチオエステル基の自然加水分解の結果、持続的な低レベル活性状態にある。この結果、Ｃ３は血漿中あるいは細胞表面上に存在する非特異アクセプター分子と結合することになる。これにより、Ｃ３転移酵素が生成したり、フィードバックループが出現したりする場合もあろう。強力なプロ炎症性能および破壊能のため、流動相(fluid phase) とバイスタンダー組織(bystander tissues) の双方において補体の活性化を抑制するようデザインされた調節システムが存在する。
【０００５】
膜結合性補体調節タンパク質としてはつぎの４種類、すなわち、補体レセプター１（ＣＲ１）、ＣＤ５５、ＣＤ４６およびＣＤ５９が存在する（リスゼウスキ（Liszewski）ら、１９９６、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：２０１〜２８３）。調節はつぎのいずれかによって達成される。
１．活性化されたタンパク質と酵素複合体の自然崩壊（すなわち、半減期が短い）。
２．活性複合体の不安定化および阻害。
３．「活性化された」成分のタンパク質分解切断。
【０００６】
ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９は、表面上皮細胞や腫瘍組織などの多くの組織において広く発現する。対照的に、ＣＲ１の発現は末梢の血液細胞に限定されており、そのため固形腫瘍の保護に直接関与しない。
【０００７】
大部分の腫瘍は上皮細胞を起源とするものであり、表面上皮細胞の大部分が補体調節タンパク質を発現させるのに対し、腫瘍におけるＣＤ５５、ＣＤ４６およびＣＤ５９の発現は様々である。結腸直腸（colorectal）癌や甲状腺癌の多くは、３種類の補体調節タンパク質をいずれも高レベルに発現する（ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１２９〜１４２；リー（Li）ら、２００１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８４：８０〜８６；ソルスタインソン（Thorsteinsson）、１９９８、ＡＰＭＩＳ．１０６：８６９〜８７８；ヤマカワ（Yamakawa）ら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ ７３：２８０８〜２８１７）。
【０００８】
乳房の乳管癌は、表現型に最も多くのバリエーションが見られ、１種類の阻害物質だけを発現している腫瘍もあれば、２〜３種の阻害物質を様々な組合せで発現している腫瘍もある（ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、上掲；ソルスタインソン（Thorsteinsson）、１９９８、上掲）。
【０００９】
腎臓細胞腫は１〜３種類の阻害物質（通常ＣＤ５５とＣＤ５９）の弱〜中程度の発現を示す（ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、上掲）一方、非小細胞（non-small cell）肺腫や卵巣癌、子宮頸癌は、通常ＣＤ５９とＣＤ４６を発現し、ＣＤ５５との免疫反応性は一定ではない（ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、上掲；ブジョージ（Bjorge）ら、１９７７、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４２：１８５〜１９２；シンプソン（Simpson）ら、１９９７、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：１４５５〜１４６７）。
【００１０】
これまでに各種細胞株において同様の結果が得られている（ブジョージ（Bjorge）ら、１９９６、上掲；ゴーター（Gorter）ら、１９８６、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４ １；ジャール（Jurl）ら、１９９７、Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ．６４：２２２〜２３０；リー（Li）ら、２００１、上掲）。
【００１１】
３種類の補体調節タンパク質は全て血管内皮で発現する。補体が媒介する障害のリスクが増大する可能性のある炎症に関連してこれらタンパク質がどのような具体的な役割を果たしているのかについてはいまだ判明していない。ＣＤ５５は、内皮細胞でプロ炎症性のメディエーターであるＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＦＮ−γによりアップレギュレートされ、またＭＡＣ（膜侵襲複合体）やトロンビンによってもアップレギュレートされるが、ＣＤ４６やＣＤ５９にはこれらの特性は見られない。この結果は、炎症や凝固中、補体から内皮細胞を保護することにおいて、ＣＤ５５が極めて重要であることを示唆している。
【００１２】
さらに、内皮細胞が後退して内皮下細胞外マトリックスが露出すると、第２補体経路が強力に誘導されて炎症を刺激するアナフィラトキシンが放出されることが近年示された。腫瘍は統制の乱れた内皮細胞を有し、血管壁を露出させていることが多いため、腫瘍環境においては補体の活性化が誘導されるであろう。これは、腫瘍細胞が補体調節レセプターを過剰発現する理由の１つである。しかしながら、実際は、腫瘍細胞と内皮細胞のいずれもがＣＤ４６ではなくＣＤ５５を、その細胞外マトリックス（ＥＣＭ）へ分泌できることが示された（ハインドマーシュ（Hindmarsh）とマークス（Marks）、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１２８〜６１３６）。ハインドマーシュ（Hindmarsh）とマークス（Marks）は内皮細胞ではなく腫瘍に由来するＣＤ５５が機能的に活性であり、Ｃ３ｂの沈着を抑制できることを示した。
【００１３】
しかしながら、マトリックスに沈着したＣＤ５５は炎症性サイトカインによってアップレギュレートされ得ないであろう。より最近になって本発明者らは、ＣＤ５５とＣＤ５９はどちらも腫瘍および内皮細胞によって細胞外マトリックスに沈着でき、後者は強力な血管形成増殖因子（ＶＥＧＦ）（リー（Li）ら、２００１、上掲）により、かなりアップレギュレートされることを示した。さらに、ＶＥＧＦで刺激された内皮細胞により沈着したＣＤ５５は機能的に活性であることが示された。ＶＥＧＦは、現在、サイトカインのうち、ＣＤ５５の細胞表面における発現とＥＣＭへの沈着のいずれをもアップレギュレートすることが分かっている唯一のサイトカインであるという点で特別である。
【００１４】
多くの腫瘍はＶＥＧＦを高レベルに分泌して血管形成を誘導するので、内皮細胞上およびＥＣＭ内におけるＣＤ５５の発現が刺激される。興味深いことに、結腸直腸腫瘍（colorectal tumours）と抗ＣＤ５５モノクローナル抗体の免疫組織化学作用の結果、腫瘍のストロマ（リー（Li）ら、２００１、上掲；シンプソン（Simpson）ら、１９９７、上掲；ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、上掲）および血管（ニーハンス（Niehans）ら、１９９６、上掲）が濃く染色される。ＥＣＭ内に沈着したＣＤ５５が共有結合し、強酸または強アルカリによって放出されなくなっているのである。
【００１５】
ＣＤ５５は、古典補体経路および第２補体経路双方からのＣ３転移酵素に結合し、Ｃ２ｂとＣ３ｂをそれぞれ動かす。そのため、ＣＤ５５はＣ３ｂの沈着を抑制することができ、下流における膜侵襲複合体の形成を阻害する。
【００１６】
ＣＤ５５は、隣接する４種類のショートコンセンサス（ＳＣＲ）ドメインと細胞表面に近接するトレオニン／セリンに富む領域から構成される細胞外ドメインを有する。
【００１７】
ＣＤ５５は、第１および第２ＳＣＲドメイン間に単一のＮ−グリコシル化部位を有し、トレオニンとセリンに富む領域では非常にＯ−グリコシル化されている。
【００１８】
ＣＤ５５はグリコホスホイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞膜に付着しており、補体に曝されている全細胞、すなわち赤血球、白血球、内皮および上皮細胞によって発現される。
【００１９】
ＣＤ５５は、また、血漿、唾液および尿中にも少量検出された。この可溶性形態(soluble form)の生物学的意義は、機能的に活性であることが示されていないため、依然として明確でない。近年、ＨｅＬａ細胞とＨＵＶＥＣがＣＤ５５を自身の細胞外マトリックスに組み込むこと、およびこの共有結合したＣＤ５５がＣ３ｂの沈着とプロ炎症性アナフィラトキシンＣ３ａの放出を阻害できるということが示された（ハインドマーシュ（Hindmarsh）およびマークス（Marks）、１９９８、上掲）。
【００２０】
補体調節タンパク質の機能を阻害する各種抗体は、腫瘍細胞を原位置で補体の活性化の影響を受けやすくするとともに、腫瘍細胞をモノクローナル抗体仲介補体依存性細胞毒に対しても敏感にさせることもある。
【００２１】
キメラ抗Ｌｅｗｉｓ Ｙモノクローナル抗体（ｃＨ１８Ａ）は、肺腺癌細胞の２種の細胞株に対し、補体仲介細胞溶解を媒介する程度は低かった。しかし、ＣＤ４６、ＣＤ５５およびＣＤ５９の機能をブロックする抗体の添加は補体媒介型溶解をかなり向上させる。補体調節タンパク質に対して複数のブロック抗体を用いると、いずれか１種類の抗体の場合よりｃＨ１８Ａ仲介型溶解が向上する（アズマ（Azuma）ら、１９９５、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：２０２〜２０８）。
【００２２】
いくつかの研究グループが二重特異性抗体を作製している。これは、一方の腕が腫瘍細胞表面の抗原を標的とし、他方の腕は補体調節タンパク質の機能的ドメインを標的とするものである。ＨＬＡおよびＣＤ５５のＳＣＲ３を標的とする二重特異性抗体によれば、腎臓腫瘍へのＣ３ｂの沈着を９２％向上させるという結果が得られた。同様に、同一の研究において、腎臓腫瘍抗原およびＣＤ５５のＳＣＲ３を標的とする二重特異性抗体によれば、腎臓腫瘍へのＣ３ｂの沈着を２５〜４００％上昇させるとともに、細胞に補体仲介型溶解を受けやすくさせるという結果が得られた（ブロク（Blok）ら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３４３７〜３４４３）。
【００２３】
最後に、キメラ抗ＣＤ３７モノクローナル抗体を用いて補体古典経路を活性化した場合、リンパ腫の特異的抗原とＣＤ５９の機能的ドメインとを標的とする二重特異性抗体のＦａｂガンマコンストラクトは細胞溶解を３〜５倍上昇させた（ハリス（Harris）ら、１９９７年、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：３６４〜３７１）。
【００２４】
しかしながら、今までの研究によってＣＤ５５のＳＣＲ３を認識する各種モノクローナル抗体が、ＣＤ５５を部分的に中和し、Ｃ３ｂの沈着を向上させるとともに、ＭＡＣ複合体形成を導くことが示されたはいえ、これらの抗体はいずれもＣ３転移酵素によるＳＣＲ３への結合に対して競合しているにすぎず、よって、部分的にＣＤ５５を中和しているだけである。
【００２５】
ＣＤ５５の分子構造から、ＳＣＲ３がＣＤ５５の活性ドメインであり、Ｃ３が結合するための正確な構造を提供するのにＳＣＲ２とＳＣＲ４が必要であることが示された。補体崩壊におけるＳＣＲ１の役割は示されていない。しかしながら、ＳＣＲ２はＣ３が結合するための正確な構造を提供するのに必要であるが、ＣＤ５５のシングルのＳＣＲドメインに対するモノクローナル抗体を用いた研究から、ＳＣＲ１またはＳＣＲ２に結合する抗体ではなく、ＳＣＲ３に結合するモノクローナル抗体が、唯一ＣＤ５５を中和できるということが示された（コイン（Coyne）ら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９、２９０６）。
【００２６】
モノクローナル抗体７９１Ｔ／３６を用いた骨肉種、卵巣腫瘍および結腸直腸腫瘍（colorectal tumours）におけるイメージングの研究（エンブレトン（Embleton）ら、１９８１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：５８２〜５８７）において、１ｃｍ３という小さい病変部の画像化に成功した（ファランズ（Farrands）ら、１９８２、Ｌａｎｃｅｔ ２：３９７〜４００；ファランズ（Farrands）ら、１９８３、Ｊ．ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．６５：６３８〜６４０；アーミテージ（Armitage）ら、１９８５、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：６２３〜６３１）。
【００２７】
さらに、切除した腫瘍のオートラジオグラフィーから、抗体の局在化が、細胞表面と、そしてより強い程度で間質とに見られた（アーミテージ（Armitage）ら、１９８４、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７１：４０７〜４１２）。
【００２８】
これらの研究は、抗ＣＤ５５抗体が正常組織に対する毒性を一切示すことなく、効果的に腫瘍を局部的に食い止めることができることを説明している。特に、内皮細胞または正常組織上においては、放射線標識された抗体の血液細胞に対する結合は検出されず、放射線標識のバックグラウンドレベルのみが測定された。最近、７９１Ｔ／３６によって認識される抗原がＣＤ５５として特定された（スペンドラブ（Spendlove）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：２９４４〜２９５３；スペンドラブ（Spendlove）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２２８２〜２２８６）。
【００２９】
ＣＤ５５／ＣＤ４６キメラ構築体を用いた、ＣＤ５５の第１の２種類のＳＣＲドメインに対する７９１Ｔ／３６の結合部位のマップ化が成功し、ペプチドの分析により７９１Ｔ／３６がＣＤ５５のＳＣＲ１〜２に別個の３領域に結合できることが示された。１領域はＳＣＲ１に存在し、他２領域はＳＣＲ２に存在する。
【００３０】
従来から、ナイーブ抗体ファージライブラリーを用いた、崩壊促進因子（ＤＡＦ）を標的とする抗体等の抗体作製方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。この特許文献１は、癌の診断や治療におけるそのような抗体の使用について言及しており、ＤＡＦの過剰発現の評価あるいは肺癌の治療、特に細胞毒性剤と組み合わせた場合の治療における抗体ＬＵ３０の使用が示唆されているが、挙げられている例は推測の域を出ていない。
【００３１】
また、従来から、抗体７９１Ｔ／３６に対して作製された抗イディオタイプ抗体１０５ＡＤ７の製造が知られており（例えば、特許文献２参照）、この特許文献２は、１０５ＡＤ７抗体の潜在的な治療上の使用について推測している。
【００３２】
【特許文献１】国際公開第００／５２０４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第００／４４１５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
しかしながら、今のところ、抗ＳＣＲ３抗体を除き、治療面において有用な抗ＣＤ５５抗体は示されていない。この分子の他のＳＣＲを標的とする抗体を用いた治療上の研究は免疫コンジュゲート化された分子に限定されてきた（例えば、ＵＳ４９１６２１３（ゾーマ社）、ＵＳ４９２５９２２（ゾーマ社）およびベイヤーズ（Byers）ら、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５０４２〜５０４６参照）。例えばベイヤーズ（Byers）らは、リシンのＡ鎖に結合させた７９１Ｔ／３６を用いた研究について記載しており、無胸腺マウスの腫瘍の増殖を強く阻害することが示された。そのため、７９１Ｔ／３６−ＲＴＡを、進行した結腸直腸癌（colorectal cancer）患者の第Ｉ相臨床試験においてスクリーニングした（ベイヤーズ（Byers）ら、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ ４９：６１５３〜６１６０）。しかしながら、用量依存性毒性（dose limiting toxicity）のため、その試験は成功しなかった。
【００３４】
今までの研究においては、ＣＤ５５のＳＣＲ１またはＳＣＲ２を標的とする抗体は、ＣＤ５５に対して中和作用を有しないことが示されていたのに対し、驚くべきことに、本発明者らはこのたび、ＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方を標的とする抗体が、ＣＤ５５を効果的に中和するだけでなく、ＳＣＲ３中和抗体よりも優れたものであることを見い出した。
【００３５】
従って本発明は、その第１のアスペクトにおいて、ＣＤ５５を中和する方法を提供するものであり、該方法は、ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２と特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含む。
【００３６】
ＣＤ５５を中和することによって、容易に補体の沈着を向上させることができる。従って本発明は、その第２のアスペクトにおいて、組織上の補体の沈着を向上させる方法を提供するものであり、該方法は、ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２と特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含む。
【００３７】
本発明の各方法は、生体内外で用いることができる。
【００３８】
前述したように、ＣＤ５５は多くの腫瘍細胞表面に広く存在し、補体の沈着を阻害する働きをする。本発明の方法は、腫瘍細胞上のそのような分子を中和することによって、腫瘍細胞に対する補体媒介型の攻撃を可能とする。従って、本発明は、別の面においては、癌の治療方法を提供するものであり、該方法は必要とする哺乳類動物へのＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２と特異的に結合するネーキッド結合要素の治療有効量の投与を含む。
【００３９】
本発明は、その更なる別の面において、（i）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素または（ii）前記結合要素をコードする核酸の、ＣＤ５５を中和するための医薬の調製における使用を提供するものである。
【００４０】
本発明は、その更なる他の面において、癌治療に使用するための、ＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素を提供するものである。
【００４１】
本発明は、更なるアスペクトにおいて、（i）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素または（ii）前記結合要素をコードする核酸の、癌治療薬の調製における、使用を提供するものである。
【００４２】
さらに本発明は、癌治療のための医薬組成物を提供するが、該組成物はＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素を含む。
【００４３】
特異的結合要素
本明細書において、「結合要素」とは、互いに対して結合特異性を有する一対の分子を構成する要素である。よって、結合要素とは特異的結合要素である。結合対を構成する前記要素は天然由来であるか、全部または一部が合成により生成されたものである。分子対の一方の要素は表面に凸部または凹部等の領域を有し、この領域は、分子対の他方の要素の特定の空間・極性構造と特異的に結合する、すなわち該構造と相補的である。このため、対を構成する各要素は互いに特異的に結合する性質を有する。結合対のタイプとしては、抗原−抗体、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド、酵素−基質が挙げられる。
【００４４】
本発明は抗原−抗体型の反応に関するものであるが、本発明の結合要素および本発明における使用のための結合要素は、ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２の双方に結合可能であればいかなる部分（moiety）とすることができる。
【００４５】
本明細書において使用する用語「ネーキッド」は、本発明の結合要素または本発明における使用のための結合要素は、リシン等、抗癌性を有するいかなる物質にも結合されていない、ということを意味する。
【００４６】
抗体
「抗体」は免疫グロブリンであり、天然に存在するか、一部または全部が合成により生成される。この用語は、また抗体結合ドメインであるか抗体結合ドメインに相当する結合ドメインを有するいかなるポリペプチド、タンパク質またはペプチドをも包含する。これらは、天然源由来のものでもよいし、一部または全部が合成により生成されたものでもよい。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプとそのアイソタイプサブクラス、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ等の抗原結合ドメインを含むフラグメント、およびダイアボディ（diabodies）等が挙げられる。
【００４７】
本発明の結合要素は、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体等の抗体、またはそのフラグメントであることができる。抗体の定常領域はいかなるクラスのものでもよく、例えばヒトのクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体はどのサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に属していてもよい。ＩｇＧ１が好ましい。好ましい実施態様においては、抗体は、ＡＴＣＣに寄託された細胞株（受託番号ＨＢ９１７３）によって産生される７９１Ｔ／３６である。
【００４８】
抗体は多くの方法で修飾することができるが、「抗体」という用語は、必要な特異性を備えた結合ドメインを有するものであれば、いかなる結合要素や物質も包含するものとして解釈すべきである。よって、この用語は抗体のフラグメントや誘導体、抗体と機能的に等価なものおよび同種のものを包含し、例えば天然のものであれ、全部または一部が合成されたものであれ、免疫グロブリン結合ドメインを有するいかなるポリペプチドをも含む。よって、免疫グロブリン結合ドメイン（または等価物）が別のポリペプチドと結合したキメラ分子も含まれる。キメラ抗体のクローニングと発現についてはＥＰ−Ａ−０１２０６９４とＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【００４９】
抗体分子を構成する種々のフラグメントには、抗原に結合する機能を有するものがあることが示されている。そのような結合フラグメントの例としては、（i）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１の各ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ii）ＶＨおよびＣＨ１の各ドメインからなるＦｄフラグメント；（iii）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（iｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（ワード（Ward)，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６（１９８９））；（ｖ）単離したＣＤＲ領域；（ｖi）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち２個の結合されたＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント（ｖii）ＶＨドメインとＶＬドメインとが、これら２ドメインを関係づけて抗原結合部位を形成させることができるペプチドリンカーによって互いに結合している一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（バード（Bird)ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６（１９８８）；ヒューストン（Huston）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３（１９８８））；（ｖiii）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（iｘ）「ダイアボディ」、すなわち遺伝子融合によって形成された多価または多重特異性フラグメント（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．ホーリンガー（Hollinger）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８（１９９３））が挙げられる。
【００５０】
本発明において使用するための抗体またはポリペプチドのフラグメント（例えば７９１Ｔ／３６抗体のフラグメント）は、一般に少なくとも５〜７個の隣接するアミノ酸からなる一続きのアミノ酸残基配列を意味し、これは少なくとも約７〜９個の隣接するアミノ酸からなる場合もあるが、通常は少なくとも約９〜１３個の隣接するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０〜３０以上の隣接するアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約３０〜４０以上の連続するアミノ酸からなる残基である。フラグメントの好ましいグループは、モノクローナル抗体７９１Ｔ／３６抗体のＣＤＲ領域を全部または部分的に含むものである。
【００５１】
そのような抗体やポリペプチドの「誘導体」や７９１Ｔ３６抗体のフラグメントの「誘導体」は、タンパク質のアミノ酸配列を変えること（例えば、タンパク質をコードする核酸を操作するまたはタンパク質そのものに変更を加える）によって改変された抗体やポリペプチドを意味する。天然のアミノ酸配列のそのような誘導体は、１以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失および／または置換を伴うことができるが、これらを伴ったものであってもＣＤ５５中和活性等の抗ＣＤ５５活性を有するペプチドを提供するものが好ましい。そのような誘導体において挿入、付加、欠失および／または置換されるアミノ酸の数は２５以下が好ましく、より好ましくは１５以下、さらに好ましくは１０以下、特に好ましくは４以下、最も好ましくは１または２である。
【００５２】
「抗体」という用語は、「ヒト化された」各種の抗体を含む。ヒト化抗体の作製方法は、本技術分野において公知である。方法については、例えば米国特許第５２２５５３９号（ウィンター（Winter））に記載されている。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体（７９１Ｔ／３６等）の超可変領域とヒト抗体の定常領域とを有する改変された抗体であってもよい。よって、結合要素はヒトの定常領域を含むことができる。
【００５３】
超可変領域以外の可変領域もまた、ヒト抗体の可変領域に由来することができる、および／または７９１Ｔ／３６等のモノクローナル抗体に由来することができる。そのような場合、可変領域全体をマウスモノクローナル抗体７９１Ｔ／３６由来のものとすることができ、この抗体はキメラ化されていると言われる。キメラ化抗体の作製方法は、本技術分野において公知である。そのような方法としては、例えばボス（Boss）（セルテック社）の米国特許およびキャビリー（Cabilly）（ジェネンテック社）の米国特許に記載されたものが挙げられる（それぞれ米国特許第４８１６３９７号および４８１６５６７号を参照）。
【００５４】
モノクローナル抗体やその他各種抗体を用い、組換えＤＮＡ技術の技法を利用すれば、元の抗体の特異性を保持する別の抗体またはキメラ分子を生成することが可能である。この技法では、抗体の、免疫ブロブリン可変領域（あるいは相補性決定領域（ＣＤＲ））をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域（あるいは定常領域にフレームワーク領域をプラスした領域）に導入する（例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ２１８８６３８Ａ、ＥＰ−Ａ−２３９４００参照）。抗体を産生するハイブリドーマ等の細胞を遺伝子変異等の変化に付すことができる（この変化は、産生される抗体の結合特異性を変えるものであっても、変えないものであってもよい）。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様においては、結合要素は図１ｂに示す配列のＣＤ５５のＳＣＲ１（アミノ酸８３〜９３）およびＳＣＲ２（アミノ酸１０１〜１１２とアミノ酸１４５〜１５７）に結合するものである。
【００５６】
結合要素は、ＡＴＣＣに寄託された細胞株（受託番号ＨＢ９１７３）によって産生された抗体の各種ＣＤＲの内の１以上あるいは該ＣＤＲのフラグメントを含むことができる。
【００５７】
前述したように、本発明の好ましい実施態様において、結合要素はＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞（受託番号ＨＢ９１７３）によって産生された抗体７９１Ｔ／３６である。本明細書において、「７９１Ｔ／３６」と記載した場合、７９１Ｔ／３６に対してかなりの相同性を有する配列も含まれる。７９１Ｔ／３６の相補性決定領域（ＣＤＲ）と他抗体のＣＤＲとの相同性の程度は、少なくとも６０％であることが好ましく、より好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、最も好ましくは９５％である。
【００５８】
２種類のアミノ酸配列または２種類の核酸の配列における相同率は、最適な比較ができるように配列同士を並べ（例えば、相手側配列と最もよく合うように並べるため、一方の配列にギャップを挿入することができる）、対応する位置のアミノ酸残基やヌクレオチドを比較することによって決定することができる。「最もよく合う並び」とは、２個の配列を並べたときに最も高い相同率が得られる並びをいう。相同率は、比較する配列中の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの個数によって決定される（すなわち、相同率％＝（同一の位置の数／位置の全数）×１００）。
【００５９】
２配列間の相同率の決定は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを用いて達成できる。２配列を比較するための数学的アルゴリズムの一例は、カーリン（Karlin）とアルツシュル（Altschul）のアルゴリズム（１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４〜２２６８）であり、これはさらにカーリン（Karlin）とアルツシュル（Altschul）（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５８７７）に記載のように改変されている。アルツシュル（Altschul）らのＮＢＬＡＳＴとＸＢＬＡＳＴプログラム（１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０）はそのようなアルゴリズムを組み込んだものである。ＢＬＡＳＴのヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）を用いて行うことができ、これにより本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴのタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）を用いて行うことができ、これにより本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列が得られる。配列にギャップを挿入して比較する場合は、アルツシュル（Altschul）らの文献（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２に記載のようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いれば反復検索により、分子同士の関係が薄くても検出できる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔの各プログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴやＮＢＬＡＳＴ）を使用できる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照）。
【００６０】
配列比較用の数学的アルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ ＆ Ｍｉｌｌｅｒ， ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このアルゴリズムは、ＣＧＣ配列アライメント・ソフトウェアパッケージの一部のＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。当業界における他の公知の配列解析アルゴリズムとしては、Ｔｏｒｅｌｌｉｓ ＆ Ｒｏｂｏｔｔｉ（１９９４）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１０：３−５に記載のＡＤＶＡＮＣＥやＡＤＡＭ、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−８に記載のＦＡＳＴＡが挙げられる。ＦＡＳＴＡにおいては、ｋｔｕｐは検索の感度およびスピードを設定する制御オプションである。
【００６１】
高度の配列同一性が存在する場合、アミノ酸配列の相違は比較的少ない。相違は例えば２０未満、１０未満の場合、また、５未満の場合すらあろう。
【００６２】
本発明者らは、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に向けられた抗体、例えば７９１Ｔ／３６抗体やそのフラグメントあるいはその誘導体を癌治療薬として使用することによって、ＣＤ５５を不活化し、腫瘍細胞が補体媒介型の攻撃を受けやすくさせることができることを示した。このことは、癌患者の腫瘍内における抗体の局在化と癌患者の生存率の上昇によって示される（実施例参照）。
【００６３】
したがって、本発明は、さらに、７９１Ｔ／３６のネーキッド「フラグメント」や「誘導体」あるいは「７９１Ｔ／３６」ファミリーの他のポリペプチドであってＣＤ５５エピトープのＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するものを癌治療剤の調製のために使用することを提供する。
【００６４】
結合要素は、単独であるいは１以上の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。よって本発明は、さらに、癌治療において同時に、別々にまたは順次的に使用するための組合せ調製物としての作用剤、およびＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素を含む製品を提供するものである。作用剤としては各種化学療法剤を挙げることができ、その例としてはドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ロイコボリン、イリノテカン、マイトマイシンＣ、オキサリプラチン、ラルチトレキセド、タモキシフェンおよびシスプラチンを挙げることができ、これらは本発明の結合要素と共働的に作用できるものである。他の各種作用剤としては、非ステロイド系の抗炎症薬（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェン、ケトプロフェン）や麻酔剤（モルヒネ等）等の鎮痛薬、または鎮吐剤を挙げることができる。別の実施形態においては、作用剤は別の結合要素であってもよい。よって、好ましい態様においては、結合要素は１以上の他の結合要素と組み合わせて投与することができる。そのような結合要素としては、抗ＣＤ２０抗体（例えばリツキサン（リツキシマブ）；バイオジェン・アイデック社、米国マサチューセッツ州、ケンブリッジ）；抗ＶＥＧＦ抗体（例えばアバスチン（ベバシズマブ）；ジェネンテック社、米国カルフォルニア州、南サンフランシスコ／ロシュ社、スイス国バーゼル）；抗ＣＤ１７１Ａ抗体（例えばパノレックス（エドレコロマブ）；セントコア社；米国ペンシルベニア州、マルバーン)／グラクソスミスクライン社、英国、アックスブリッジ）；抗ＣＥＡ抗イディオタイプｍＡｂ（例えばシーバック（CeaVac）、タイタンファーマスーティカルズ社、米国カルフォルニア州、南サンフランシスコ）；抗ＥＧＦＲ抗体（例えばエルビタックス（セツキシマブ）、イムクローン社、米国ニューヨーク／ブリストル・マイヤーズ・スクイブ社、米国ニューヨーク、メルク社、米国ニュージャージー州、ホワイトハウス・ステーション）；抗ＨＭＦＧ抗イディオタイプｍＡｂ（例えばトリアブ、タイタンファーマスーティカルズ社、米国カルフォルニア州、南サンフランシスコ）、抗ＥＧＦＲ抗体（例えばＡＢＸ−ＥＧＦ、アブジェニクス社、米国カリフォルニア州フリーモント／アムジェン社、カルフォルニア州、サウザンドオークス）および／または抗ＨＥＲ２抗体（例えばハーセプチン、ジェネンテック社、米国カルフォルニア州、南サンフランシスコ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
作用剤(active agent)は結合要素と共働的に作用するのが好ましい。作用剤と共働的に作用し殺腫瘍を向上させる結合要素の能力は、免疫エフェクター機構によるものではなく、むしろＣＤ５５を不活化し補体の沈着や溶解を促進することの直接的な結果によるものである。本発明の結合要素は検出可能な標識を保持することができる。
【００６６】
治療
「治療」とは、ヒトまたは非ヒト動物に利益を提供しうる如何なる治療計画をも含む。治療は、現在見られる症状に関するものであってもよいし、予防的なもの（予防的処置）であってもよい。したがって、「治療」は治癒、軽減、予防等の効果を提供する。
【００６７】
「癌治療」は、癌性増殖に起因する症状の治療を含むとともに、新生物増殖や腫瘍の治療を含む。本発明のシステムによって扱うことができる腫瘍の例としては、例えば骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫；乳癌腫、肺癌腫、膀胱癌腫、甲状腺癌腫、前立腺癌腫、結腸癌腫、結腸直腸癌腫、膵臓癌腫、胃癌腫、肝臓癌腫、子宮癌腫、子宮頸癌腫、卵巣癌腫等の癌腫；ホジキンや非ホジキンリンパ腫等のリンパ腫；神経芽細胞腫；メラノーマ；ミエローマ；ウィルムス腫瘍；急性リンパ芽球性白血病等の白血病；グリオーマ；網膜芽細胞腫を挙げることができる。
【００６８】
結合要素は、癌性細胞あるいは組織（腫瘍細胞と非腫瘍細胞を含む）上に存在するＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に結合すると、ＣＤ５５を中和し補体の沈着を促進するとともに補体の媒介するこれら細胞の溶解を向上させることができる。
【００６９】
特に、本発明の組成物および方法は、現在罹患している癌の治療に有用であり、かつ、一度治療や手術を行った癌の再発予防に有用である。
【００７０】
投与
本発明の結合要素は、単独でも投与できるが、医薬組成物として投与するのが好ましく、これは一般に、意図した投与経路に応じて選択される適切な医薬的賦形剤や希釈剤、担体を含むものである。本発明の結合要素は、治療を必要とする患者に適切な経路で投与することができる。正確な投与量は、該要素の正確な性質（全抗体なのか、フラグメントなのか、ダイアボディかなど）や、該要素に付着させる検出可能なラベルの性質をはじめとする、数々の因子によって決定される。
【００７１】
適切な投与経路の例としては、経口、経結腸直腸、経鼻、局所（口内、舌下等）、経膣、非経口（皮下、筋内、経静脈、皮内、髄膜、硬膜外等）投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。静脈投与が好ましい。
【００７２】
カテーテルや他の外科的挿管による送達も考えられるが、注射（静脈注射）が本組成物の治療的投与のための主経路である。粉末形態の場合は、液状形態に戻してから使用することができる。
【００７３】
静脈注射または患部への注射のためには、活性成分は非経口で許容されうる水溶液の形態（パイロジェンフリーで適切なｐＨ、等張性および安定性を有するもの）をとる。当業者にとって、塩化ナトリウム注、リンゲル注、ラクテート化リンゲル注等の等張性媒体を用いて適切な溶液を調製することは十分容易である。必要に応じ、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、および／またはその他の添加剤も使用できる。
【００７４】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末または液状であることができる。錠剤はゼラチンやアジュバント等の固形の担体を含むことができる。液体の医薬組成物は一般に、水、石油、動物性・植物性油、鉱物油や合成油等の液体の担体を含むことができる。また、生理的食塩水溶液、デキストロースまたは他のサッカライド溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のグリコール類も使用できる。
【００７５】
本発明の組成物は、また、ミクロスフィアや、リポソーム、その他の微細球状デリバリーシステム、徐放性調製物等を、血流のある組織に配置することによって投与することもできる。徐放性担体の好適な例としては、個別形状体に使用する半透性ポリマーマトリックス、例えば、座薬やマイクロカプセルが挙げられる。移植可能な、あるいはマイクロカプセル形状の徐放性マトリックスとしてはポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号；ヨーロッパ特許出願００５８４８１Ａ）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートからなるコポリマー（シドマン（sidman）ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２（１）：５４７〜５５６、１９８５）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）やエチレンビニルアセテート（ランガー（Langer)ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７、１９８１およびランガー（Langer)、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５、１９８２）が挙げられる。ポリペプチドを含有するリポソームは周知の方法によって調製される（ＤＥ３２１８１２１Ａ；エプスタイン（Epstein）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、８２：３６８８〜３６９２、１９８５；ホワン（Hwang）ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、７７：４０３０〜４０３４、１９８０；ＥＰ−Ａ−００５２５２２Ａ；Ｅ−Ａ−００３６６７６；ＥＰ−Ａ−００８８０４６；ＥＰ−Ａ−０１４３９４９；ＥＰ−Ａ−０１４２５４１；ＪＰ−Ａ−８３−１１８０８；ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ ４４８５０４５および４５４４５４５）。通常、リポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム）単層構造体であり、脂質含量は約３０モル％コレステロールより高く、その選択された部分(proportion)がポリペプチドの溶出最適速度を達成するよう調節される。
【００７６】
前述した技法およびプロトコール、または本発明に従って用いることができる他の技法およびプロトコールの例は、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"第１６版、オスロ・エー(Oslo, A)編、１９８０に記載されている。
【００７７】
組成物は腫瘍部位あるいは他の所望とする部位に局在化されるような方法で投与することができる、すなわち、腫瘍や他の各種細胞を標的とする方法で送達されることができる。抗体や細胞特異的リガンド等のターゲッティングシステムを利用するターゲッティング治療は、作用剤をある種の細胞により高い特異性で送達するために用いることができる。ターゲッティングはいろいろな理由から好ましい。例えば、薬剤が許容できない程度に毒性を示すものであったり、そうでなくてもあまりにも高用量を必要としたり、あるいはターゲッティング以外では標的の細胞に届かせることができない場合を挙げることができる。
【００７８】
医薬組成物
前述したように、本発明は、癌治療のための医薬組成物にまで拡張され、この組成物はＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に結合するネーキッド結合要素を含むものである。本発明の医薬組成物および本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分のほか、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝剤・安定化剤、あるいはその他当業者に周知の物質を含むことができる。そのような物質は、毒性がないことが必要とされ、かつ活性成分の効能に干渉しないものでなくてはならない。担体やその他の物質の正確な性質がどうあるべきかは、経口や注射（例えば静脈注射）といった投与経路によって決められるであろう。
【００７９】
形状は、液体であってもよいし（例えばｐＨ６．８〜７．６の非リン酸緩衝液を含有する生理的食塩水溶液）、凍結乾燥粉末であってもよい。
【００８０】
投与量
本発明組成物は、好ましくは、「治療有効量」を患者に投与するものであって、これは対象となる患者に効果を示す十分な量である。実際の投与量、投与の割合や経時プロフィル(rate and time-course)は治療対象となるものの性質や重篤度によって決まる。治療の処方（投与量の決定等）は究極的には医師一般や他のメディカルドクターの責任・裁量の範囲内であり、典型的には治療対象の疾病、個々の患者の症状、送達部位、投与方法、その他、医師のよく知る因子群が考慮される。
【００８１】
最適な投与量は、年齢、性別、体重、治療対象となる状態の重篤度、投与される活性成分および投与経路等、数々のパラメータに基づき医療従事者によって決定されることができる。一般的に、ポリペプチドと抗体の血清濃度は、レセプターを飽和させることのできる血清濃度であることが望ましい。約０．１ｎＭを超える濃度が、通常十分な濃度である。例えば、抗体１００ｍｇ／ｍ２の投与量は、約８日間で２０ｎＭ程度の血清濃度を提供する。
【００８２】
大まかなガイドラインによると、抗体の投与は毎週１０〜３００ｍｇ／ｍ２の量とすることができる。これと同等の抗体フラグメントを投与する場合には、ＣＤ５５を飽和できる濃度を超えた血清レベルを維持するため、投与間隔をより短くして使用することが必要とされる。
【００８３】
結合要素の生産
本発明の結合要素および本発明の使用のための結合要素は、その全部または一部分を化学合成により生成することができる。結合要素は十分確立された標準液、または好ましくは固相ペプチド合成法、広く入手可能な一般的記述によって容易に調製できる（Ｊ．Ｍ．スチュワート（Stewart）およびＪ．Ｄ．ヤング（Young）、固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis）、第２版、ピアースケミカル社（Pierce Chemical Company）、イリノイ州、ロックフォード（Rockford）（１９８４）；Ｍ．ボダンズスキー（Bodanzsky）およびＡ．ボダンズスキー（Bodanzsky）、ペプチド合成の実践（The Practice of Peptide Synthesis）、ニューヨーク州、スプリンガー バーラグ（Springer Verlag）（１９８４）；および応用バイオシステムズ４３０Ａユーザーズマニュアル（Applied Biosystems 430A Users Manual）、ＡＢＩ社、カルフォルニア州、フォスターシティ（Foster City）等参照）。あるいは溶液中で、液相法により調製したり、固相、液相と溶液化学を組み合わせることによって調製することもできる（例えば、まず各ペプチド部分を完成させ、ついで所望され、かつ適切な場合には、存在する保護基を全て除去後、カルボン酸やスルホン酸、その反応誘導体の反応によって残基Ｘを導入する）。
【００８４】
本発明における使用に適した結合要素を生産する別の便利な方法は、結合要素をコードする核酸を発現させることであり、核酸を発現システムにおいて用いることである。よって、本発明は、さらに、ネーキッド結合要素（すなわち、癌治療のための薬剤の調製において、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合する要素）をコードする単離された核酸を提供するものである。
【００８５】
本発明に従って使用するための核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含することができ、かつその全体または一部が合成物であってもよい。好ましいアスペクトにおいては、本発明に使用する核酸は先に定義した本発明の結合要素をコードするものである。当業者であれば、本発明の結合要素をなお提供できる。そのような核酸に対する置換、欠失および／または付加を決定することができるであろう。
【００８６】
本発明で使用するための結合要素をコードする核酸の配列は、核酸の配列とクローンさえ入手できれば、本明細書に含まれる情報やレファレンスおよび本技術分野に知られた技法（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ「モレキュラー・クローニング；ラボラトリー・マニュアル」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、１９８９年およびＡｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学における簡単なプロトコル」ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、１９９２年参照)によって、当業者は容易に調製することができる。これら技法の例としては、（i）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した核酸サンプルの増幅（例えば、ゲノム源から）、（ii）化学合成、（iii）ｃＤＮＡ配列の調製、を挙げることができる。抗体の各種フラグメントをコードするＤＮＡは、当業者に知られた何らかの適切な方法（コードしているＤＮＡを準備し、発現させるべきどちらの側であれ、適切な制限酵素認識部位を特定し、ＤＮＡからそのような部分を切り出す等）によって生成し、利用することができる。この部分は、ついで市販されている標準的な発現システムの適切なプロモーターに機能的に結合させることができる。別の組換えアプローチは、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡ中の目的関連部分を増幅させることである。部位特異的変異変異誘発を用いる等により、配列に対して各種の修飾を行うことができ、これにより、修飾されたペプチドを発現させることができる。また、核酸を発現させるために用いた宿主細胞中のコドンの選択順位を確認することもできる。
【００８７】
核酸は、プラスミド、ベクター、転写または発現カセット（前記の核酸を少なくとも一種類含む）といった形態のコンストラクトとして含まれていてもよい。このコンストラクトは、１以上の前記コンストラクトを含むリコンビナント宿主細胞内に含まれていてもよい。発現は、適切な条件で核酸を含有するリコンビナント宿主細胞を培養すれば容易に達成できる。発現させて生産した後、何らかの適切な技法を用いて特異的結合要素を単離および／または精製し、その後適宜使用することができる。
【００８８】
本発明に従って使用するための結合要素コード核酸分子やベクターは、例えば天然の環境から単離および／または精製することにより、実質的に純粋または均一な形態において提供することができる。あるいは、核酸の場合には、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸や遺伝子源がない（あるいは実質的にない）形態として提供できる。
【００８９】
様々な種類の宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングシステムや発現システムは周知である。適切な宿主細胞としては、バクテリア、哺乳類細胞、酵母およびバキュロウィルスの系を挙げることができる。ヘテロ・ポリペプチドの発現のために本技術分野において利用できる哺乳類細胞株としてはチャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビー・ハムスター腎細胞、ＮＳＯマウス・メラノーマ細胞、その他多数のものを挙げることができる。一般的で、好ましい細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉ．である。
【００９０】
Ｅ．ｃｏｌｉ．等の原核細胞における各種抗体および抗体フラグメントの発現は、本技術分野において確立されたものである。これについては、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎによる”Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”９：５４５−５５１（１９９１）が参照される。培養中の真核細胞における発現も、結合要素を生産するための選択肢として当業者は利用することができる。最近のレビュー記事としては、Ｒｅｆｆ、”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．”４：５７３−５７６（１９９３）；Ｔｒｉｌｌら、”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．”６：５５３−５６０（１９９５）が参照される。
【００９１】
あるいは、本発明において使用するための特異的結合要素の生産は、トランスジェニック生物、例えば哺乳動物、鳥、魚、昆虫または植物のトランスジェニック生物において、本技術分野に知られた方法によって行うことができる。そのようなトランスジェニック技法においては、（１以上の）結合要素をコードする核酸を細胞または胚に導入することができる。そのような導入方法としては、直接注入、エレクトロポレーション、核移入技法(nuclear transfer technique)、ベクター（例えば、ウィルスベクター）を利用する方法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。より好ましい一実施態様においては、特異的結合要素は鳥の組織、好ましくは鳥の卵で生産されるものであり、例えば、英国出願第０２２７６４５．９号（２００２年１１月２７日出願）およびこの出願の優先権を主張する国際出願において開示された方法を用いることができる。
【００９２】
適当な調節配列を有する適切なベクターを選択または構築することができる。この調節配列としては、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニレーション配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じて使用できるその他各種配列を挙げることができる。ベクターとしては各種プラスミド、ウィルス性ベクター（例えば、「ファージ」）または必要に応じてファージミドを挙げることができる。詳細については、例えばサムブルック(Sambrook)ら、モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニュアル（第２版）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（１９８９年）参照。核酸を操作するための多くの知られた技法やプロトコール、例えば核酸コンストラクトの調製、変異の誘発、シークエンシング、ＤＮＡの各種細胞への導入および遺伝子発現、タンパク質解析等については、オースベル(Ausubel)ら編のショート・プロトコル・イン・モレキュラー・バイオロジー（第２版）ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（１９９２年）が参照される。
【００９３】
核酸は、適切なものでありさえすれば如何なる手段によっても宿主細胞に導入することができる。この導入には利用可能な如何なる技法をも用いることができる。真核細胞の場合に適切な技法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション法およびレトロウィルスまたはその他のウィルス（ワクシニアウィルス等、また昆虫細胞の場合にはバキュロウィルス）を用いた形質導入を挙げることができる。細菌細胞の場合に適切な技法としては、塩化カルシウムトランスフォーメーション、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを用いたトランスフェクションを挙げることができる。
【００９４】
抗生物質耐性遺伝子や感受性遺伝子等のいわゆるマーカー遺伝子を利用して、目的とする核酸を有するクローンを同定でき、これについては本技術分野において周知である。
【００９５】
導入に続き、核酸からの発現を誘導するが、これは例えば、宿主細胞を遺伝子発現に適した条件で培養することで行うことができる。
【００９６】
前記核酸は、宿主細胞のゲノム（染色体等）に導入される。この導入は、標準的な技法に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列の組込みによって促進される。核酸は細胞内のエクストラ染色体ベクター上のものか、さもなければ該細胞に対し同定可能に異種あるいは外来性であることができる。
【００９７】
分析
さらに本発明は、細胞サンプルまたは組織への補体の沈着を向上させるために使用できる、抗体等の更なる薬剤を同定するための分析を提供するものであり、これは任意に癌治療に用いることができる。
【００９８】
より好ましい面において、前記分析はＣＤ５５を阻害できる薬剤を同定するための分析方法を含むものであり、これはつぎの各ステップ：
ａ）候補剤をＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の少なくとも一部に接触せしめ；そして
ｂ）前記の候補剤のＳＣＲ１とＳＣＲ２に対する結合を測定する、
を含む。
【００９９】
さらなる実施態様において、前記分析方法はＣＤ５５を阻害できる薬剤を同定するための方法を含むものであり、これはつぎの各ステップ：
（ａ）ネーキッド結合要素の存在下で候補剤をＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の少なくとも一部に接触せしめ（ここでネーキッド結合要素は、候補剤が存在しないとＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合できるものである）；
（ｂ）候補剤が、ネーキッド結合要素のＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に対する結合を阻害する程度を決定する、
を含む。
【０１００】
前記分析はさらに、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合する候補剤を選択するステップ；および／または候補剤の存在下および非存在下において、細胞サンプルに沈着する補体の量を決定するステップ、を含むこともできる。
【０１０１】
本発明の分析のより好ましい実施態様において、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の部分は、図１ｂに示した配列のアミノ酸８３〜９３、１０１〜１１２および１４５〜１５７を含む。
【０１０２】
本発明は、さらに、スクリーニング方法を提供するものであり、これはＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に対するネーキッド結合要素の結合阻害能を有する候補剤のライブラリーをスクリーニングするステップを含む。
【０１０３】
本発明の分析はいわば篩（スクリーン）であり、これによって多くの候補剤が試験される。したがって、当業者に知られた各種化合物をスクリーニングするための何らかの適切な技法を用いることができる。前記スクリーンはハイスループット・スクリーンである。例えば国際公開第８４／０３５６４号パンフレットは、大量のペプチドを固体の支持体上に合成し薬剤と反応させ洗浄するという方法について記載している。結合したものが検出される技法である。
【０１０４】
本発明は、また、競合的薬剤（competitive drug)のスクリーニング分析という用途も意図しており、この分析は、ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２に特異的に結合できる７９１Ｔ／３６等の中和抗体が、ＣＤ５５のＳＣＲ１と２に結合する試験化合物と競合するものである。
【０１０５】
本発明のスクリーニング方法によって同定された各剤および癌治療のための医薬の製造におけるその使用もまた、本発明によって意図されたものである。
【０１０６】
本発明の各面における好ましい特徴は、必要な変更を加えれば他の面についても当てはまる。
【０１０７】
以下、本発明を実施例によってさらに説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１０８】
実施例１．ＣＤ５５中和分析
オクチルグルコシドに溶解させた７９１Ｔ細胞から、イムノアフィニティー−マトリックス精製によって精製ＣＤ５５抗原を得た。精製抗原から得られたタンパク質の配列データに基づくプライマーを用いて、ＣＤ５５ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定を行った（スペンドラブ（Spendlove）ら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２２８２）。得られたＤＮＡ配列は、カラス（Caras）らによって同定されＧｅｎｂａｎｋデータベースに収められているもの（受託番号Ｍ３１５１６）と一致した。
【０１０９】
細胞
骨肉腫細胞株７９１Ｔを、熱失活させた１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ(ギブコ、ＢＲＬ、ペイズリーおよびＵＫ)中で増殖させた。
【０１１０】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体７９１Ｔ／３６（ＩｇＧ２ｂ 抗７９１Ｔｇｐ７２；エンブレトン（Embleton）ら、１９８１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：５８２〜５８７）、ＢＲＩＣ２１６（ＩｇＧ１ 抗ＳＣＲ３（ＣＤ５５の）；テイト（Tate）ら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６１，４８９）、ＢＲＩＣ２２０（ＩｇＧ１ 抗ＳＣＲ１（ＣＤ５５の）；テイト（Tate）ら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６１，４８９）、ＢＲＩＣ１１０（ＩｇＧ１ 抗ＳＣＲ２（ＣＤ５５の）；スプリング（Spring）ら、１９８７、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６２ ３７７；コイン（Coyne）ら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９ ２９０６）については、従前報告されている。この中のＢＲＩＣ抗体はブラッド・グループ・レファレンス・ラボラトリー(Blood Group Reference laboratory) (英国ロンドン）から購入した。
【０１１１】
方法
ＣＤ５５を過剰発現している７９１Ｔ腫瘍細胞を１０％ＦＣＳ含有培地で洗浄し、１００μＬ当たり１×１０５の細胞密度で再懸濁した。一次抗体を５０μｇ／ｍＬの濃度で、サンプル体積の３倍量（３×１０５細胞／３００μＬ）とともにインキュベートした。一次抗体としては、ポジティブコントロール抗体２１６（抗ＳＣＲ３）、ネガティブコントロール抗体２２０（抗ＳＣＲ１）および試験抗体７９１Ｔ／３６（抗ＳＣＲ１、ＳＣＲ２）を用いた。細胞と抗体を、４℃で１時間インキュベートしてからＰＢＳで洗浄した。サンプルをチューブあたり１００μＬとして３試料に分けた。補体源として合計濃度５％でヒト血清（熱失活なし）を添加した。チューブを数回反転させてから３７℃で２時間インキュベートした（３０分毎に混合した）。細胞をＰＢＳで２回洗浄後、ポリクローナルウサギ抗ヒトＣ３ｃＦＩＴＣコンジュゲート抗体（１／１００）に終体積１００μＬとなるように添加した。細胞を４℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄し、１％調製細胞２００μＬに再懸濁させた。
【０１１２】
結果
図２は非ブロック抗体２２０存在下で、Ｃ３ｂの７９１Ｔ細胞への沈着が低レベル(modest levels)であったことを示している（ＭＬＦ２００）。ＣＤ５５中和抗体２１６の存在下では、Ｃ３ｂの沈着の向上が観察される（ＭＬＦ３５０）。しかしながら、モノクローナル抗体７９１Ｔ／３６の存在下では、Ｃ３ｂの沈着量がより一層増大した（ＭＬＦ５２０）。このことは、２１６がＳＣＲ３への結合をＣ３転移酵素と競合するのに有効であるが、７９１Ｔ／３６のＳＣＲ１とＳＣＲ２ドメインへの結合はＣＤ５５を機能的に不活化させＣ３ｂの沈着を２５０％増大させたことを示唆している。
【０１１３】
実施例２．腫瘍イメージングのため放射線標識７９１Ｔ／３６で処置された再発結腸直腸癌（colorectal cancer）患者の長期生存
抗体とラベリング
抗体源はハイブリドーマ７９１Ｔ／３６クローン３である（７９１Ｔ／３６、ＩｇＧ２ｂアイソタイプ）。ハイブリドーマを産生しているマウスの腹水を、ｐＨ７．５、０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸・リン酸バッファー中、プロテインＡ−「セファロース」カラムに適用し、カラムを十分に洗浄した。結合した免疫グロブリンを、ｐＨ６．０、５．０、４．５および３．０で順次溶出させ、次いでこれをリン酸緩衝化生理食塩水によって透析した。ついで、透析液を１，０００，０００ｇで１時間遠心し、０．２２μｍのMillexミリポア・フィルターを用いて濾過し、−７０℃で保存した（タンパク質濃度：１ｍｇ／ｍＬ）。この調製物は、マウス・イムノグロブリン・タイピング抗血清（マイルズ・ラボラトリーズ、ストーク・ポッジズ、バックス）による免疫核酸試験で、ＩｇＧ２ｂのみを含有しており、またパイロゲン・フリーであることがわかった（ブーツ・ファーマスーティカル社、ノッツ）。
【０１１４】
抗体調製物の各バッチは、試薬「Ｉｏｄｏｇｅｎ」を用いて１３１Ｉで標識した。未結合ヨウ素は、セファデックスＧ２５のゲル濾過によって除去した。標識された調製物は、生理食塩水（血清アルブミン１％含有）で希釈し、Millex濾過によって滅菌した。
【０１１５】
結腸直腸癌（colorectal cancer）を再発した７２名の患者に対し、放射線標識したモノクローナル抗体７９１Ｔ／３６によるイメージングを行った。患者は抗体１０μｇの皮内(id)投与、続いて２００μｇの静脈投与を受けた。２００μｇの抗体と約７０ＭＢｑの１３１Ｉを含有する２ｄＬの調製物を３０分かけて各患者の前腕前部静脈に注入した。
【０１１６】
生存について７年間追跡し、同時期の再発結腸直腸癌患者グループとの比較を行った。７９１Ｔ／３６を受けた患者のうち長期生存者が１２名（１６％）おり、これに対し同時期グループでは７年間生存したのは８９名の患者のうちわずか１名（ｐ＞０．００１）であった。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
この結果は、放射線標識した７９１Ｔ／３６抗体を受けた患者は、非無作為試験(non-randomised trial)において生存率に関し明白な利益を享受していることを示している。腫瘍に到達する放射線標識の投与量は、放射線標識のみで殺腫瘍を引き起こすのに必要なレベルより非常に低い。したがって、前記抗体がＣＤ５５を不活化することによって、残りの腫瘍に対する補体の攻撃が可能となったということが十分考えられる。これら患者は７９１Ｔ／３６抗体の静脈投与を一回受けただけであることを考えると、得られた生存率の向上は劇的である。ヒト化７９１Ｔ／３６抗体を繰返し注射すると、一層明白な治療上の利点が得られるであろう。
【０１１９】
実施例３．ＳＣＲ１とＳＣＲ２に対する新規なモノクローナル抗体の産生
ＣＤ５５抗原を過剰発現している７９１Ｔ細胞（１０６細胞）を６〜８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に２回注射し（各回の間隔を３週間あけて）免疫した。ついで、マウスにヒトＦｃと融合させたＳＣＲ１−２タンパク質を注射して追加免疫し、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。マウスの尾部から採血し、文献記載に従って血清をスクリーニングに付し、ＣＨＯ細胞が発現するＣＤ５５ＳＣＲ１−２／ＣＤ４６ＳＣＲ３−４キメラ分子を認識する能力を有するものを選択した（スペンドラブ（Spendlove）ら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，２９４４）。
【０１２０】
また、ＳＣＲ１−２ＣＤ５５Ｆｃタンパク質とＩＣ、２Ｎおよび２Ｃペプチドを認識する能力についてもスクリーニングした。このペプチドは前に述べたようにＢＳＡに付着させたものである（スペンドラブ（Spendlove）ら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，２９４４）。
【０１２１】
ＣＤ５５ＳＣＲＩおよびＳＣＲ２を認識する抗体を産生しているマウスに対して、ＳＣＲ１−２Ｆｃタンパク質を静脈注射し追加免疫して、５日後に脾臓細胞(splenocytes)を取り出し、ＰＥＧを用いてＮＳＯミエローマ細胞と１０：１の比で融合させる。ＨＡＴ培地を用いてハイブリドーマを選別し、ＳＲＲ１−２Ｆｃタンパク質を認識する抗体の産生についてＥＬＩＳＡを行いスクリーニングする。正しい抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法で３回クローニングし（ウェル当たり１細胞）、クローン性を確実なものとする。モノクローナル抗体を、ＣＨＯ細胞によって発現されているＣＤ５５ＳＣＲ１−２／ＣＤ４６ＳＣＲ３−４キメラ分子を認識する能力について、文献記載に従いスクリーニングする（スペンドラブ（Spendlove）ら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，２９４４）。
【０１２２】
また、ＳＣＲ１−２ＣＤ５５Ｆｃタンパク質とＩＣ、２Ｎおよび２Ｃペプチドを認識する能力についてスクリーニングする。このペプチドは既に文献記載されているようにＢＳＡに付着させたものである（スペンドラブ（Spendlove）ら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，２９４４）。７９１Ｔ／３６と同じ部位を認識するかどうか決定するため、プレートを前記のようにＣＤ５５でコーティングする。
【０１２３】
ついで、新規のモノクローナル抗体とインキュベートし、続いてビオチン化７９１Ｔ／３６とインキュベートする。７９１Ｔ／３６の結合については、アビジンペルオキシダーゼとＡＢＴＳ基質を用いて、プレートリーダーで４０５ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を読み取り定量する。モノクローナル抗体が７９１Ｔ／３６と同一または関連する部位を認識すると、ＣＤ５５抗原に対する７９１Ｔ／３６の結合が阻害されるであろう。
【０１２４】
本明細書中に言及された文書全てを、本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。ここに記載した実施形態に対する、本発明の範囲と精神から逸脱せずになされうる様々な変更やバリエーションについては当業者に明らかであろう。
【０１２５】
本発明を、特定の好ましい実施態様と関連させ記述してきたが、請求の範囲に記載の本発明を不当にそのような特定の実施態様に限定してはならないものと理解されるべきである。実際、本発明を実施するためのここに記載した態様に関する当業者に自明な種々の改変は、本発明の範囲内に入るものであると意図されている。
【０１２６】
参考文献
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１０．ハインドマーシュ（Hindmarsh），Ｅ．Ｊ．およびＲ．Ｍ．マークス（Marks）、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：６１２８〜６１３６.
１１．ニーハンス（Niehans），Ｇ．Ａ．、Ｄ．Ｌ．チェルウィッツ（Cherwitz）、Ｎ．Ａ．ステイリー（Staley）、Ｄ．Ｊ．クナップ（Knapp）およびＡ．Ｐ．ダルマッソ（Dalmasso）、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４９：１２９〜１４２.
１２．アズマ（Azuma），Ａ．、Ｙ．ヤマノ（Yamano）、Ａ．ヨシムラ（Yoshimura）、Ｔ．ヒビノ（Hibino）、Ｔ．ニシダ（Nishida）、Ｈ．ヤギタ（Yagita）、Ｋ．オクムラ（Okumura）、Ｔ．セヤ（Seya）、Ｒ．カンナギ（Kannagi）、Ｍ．シブヤ（Shibuya）およびＳ．クドウ（Kudoh）、１９９５、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：２０２〜２０８.
１３．ブロク（Blok），Ｖ．Ｔ．、Ｍ．Ｒ．ダハ（Daha）、Ｏ．ティズマ（Tijsma）、Ｃ．Ｌ．ハリス（Harris）、Ｂ．Ｐ．モーガン（Morgan）、Ｇ．Ｊ．フローレン（Fleuren）およびＡ．ゴーター（Gorter）、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３４３７〜３４４３.
１４．ハリス（Harris），Ｃ．Ｌ．、Ｋ．Ｓ．カン（Kan）、Ｇ．Ｔ．スティーブンソン（Stevenson）およびＢ．Ｐ．モーガン（Morgan）、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：３６４〜３７１.
１５．ファランズ（Farrands），Ｐ．Ａ．、Ａ．Ｃ．パーキンス（Perkins）、Ｍ．Ｖ．ピム（Pimm）、Ｊ．Ｄ．ハーディー（Hardy）、Ｍ．Ｊ．エンブレトン（Embleton）、Ｒ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）およびＪ．Ｄ．ハードキャッスル（Hardcastle）、１９８２、Ｌａｎｃｅｔ ２：３９７〜４００.
１６．ファランズ（Farrands），Ｐ．Ａ．、Ａ．パーキンス（Perkins）、Ｌ．サリー（Sully）、Ｊ．Ｓ．ホプキンス（Hopkins）、Ｍ．Ｖ．ピム（Pimm）、Ｒ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）およびＪ．Ｄ．ハードキャッスル（Hardcastle）、１９８３、Ｊ．ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．６５：６３８〜６４０.
１７．アーミテージ（Armitage），Ｎ．Ｃ．、Ａ．Ｃ．パーキンス（Perkins）、Ｍ．Ｖ．ピム（Pimm）、Ｍ．Ｌ．ワスティー（Wastie）およびＲ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）、１９８５、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．６：６２３〜６３１.
１８．アーミテージ（Armitage），Ｎ．Ｃ．、Ａ．Ｃ．パーキンス（Perkins）、Ｍ．Ｖ．ピム（Pimm）、Ｐ．Ａ．ファランズ（Farrands）、Ｒ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）およびＪ．Ｄ．ハードキャッスル（Hardcastle）、１９８４、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．７１：４０７〜４１２.
１９．ベイヤーズ（Byers），Ｖ．Ｓ．、Ｍ．Ｖ．ピム（Pimm）、Ｐ．Ｊ．スキャンノン（Scannon）、Ｉ．ポールズィック（Pawluczyk）およびＲ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５０４２〜５０４６.
２０．ベイヤーズ（Byers），Ｖ．Ｓ．、Ｒ．ロドビエン（Rodvien）、Ｋ．グラント（Grant）、Ｌ．Ｇ．デュラン（Durrant）、Ｋ．Ｈ．ハドソン（Hudson）、Ｒ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）およびＰ．Ｊ．スキャンノン（Scannon）、１９８９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅｒｃｈ ４９：６１５３〜６１６０.
２１．スペンドラブ（Spendlove），Ｉ．、Ｌ．リー（Li）、Ｊ．カルミカエル（Carmichael）およびＬ．Ｇ．デュラン（Durrant）、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２２８２〜２２８６.
２２．エンブレトン（Embleton），Ｍ．Ｊ．、Ｂ．ガン（Gunn）、Ｖ．Ｓ．ベイヤーズ（Byers）およびＲ．Ｗ．ボールドウィン（Baldwin）、１９８１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４３：５８２〜５８７.
２３．ラブランド（Loveland），Ｂ．Ｅ．、Ｍ．ランテリ（Lanteri）、Ｐ．キリアコウ（Kyriakou）およびＤ．クリスチャンセン（Christiansen）、１９９８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５：３６９ Ａ１５５.
２４．ランテリ（Lanteri），Ｍ．、Ｄ．クリスチャンセン（Christiansen）、Ｐ．Ｍ．ホガース（Hogarth）、Ｉ．Ｆ．Ｃ．マッケンジー（McKenzie）およびＢ．Ｅ．ラブランド（Loveland）、１９９８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３５：３６９ Ａ１５６.
２５．エバンス（Evans），Ｍ．Ｊ．、Ｓ．Ｌ．ハートマン（Hartman）、Ｄ．Ｗ．ウォルフ（Wolff）、Ｓ．Ａ．ロリンズ（Rollins）およびＳ．Ｐ．スクイント（Squinto）、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１２３〜１３８.
２６．カサスノバス（Casasnovas），Ｊ．Ｍ．、Ｍ．ラービー（Larvie）およびＴ．スタール（Stehle）、１９９９、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．１８：２９１１〜２９２２.
２７．フリードマン（Friedman），Ａ．Ｒ．、Ｖ．Ａ．ロバーツ（Roberts）およびＪ．Ａ．タイナー（Tainer）、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔ． Ｆｕｎｃｔ． Ｇｅｎｅｔ．２０：１５〜２４.
２８．スタンフィールド（Stanfield），Ｒ．Ｌ．、Ｍ．タキモト−カミムラ（Takimoto-Kamimura）、Ｊ．Ｍ．リニ（Rini）、Ａ．Ｔ．プロフィー（Profy）およびＩ．Ａ．ウィルソン（Wilson）、１９９３、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １：８３〜９３.
２９．コイン（Coyne）ＫＥ、ホール（Hall）ＳＥ、トンプソン（Thompson）ＥＳ、アース（Arce）ＭＡ、イノシタ（Inoshita）Ｔ、フジタ（Fujita）Ｔ、アンスティー（Anstee）ＤＪ、ロッセ（Rosse）Ｗ、ルブリン（Lublin）ＤＭ（１９９２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９ ２９０６〜２９１３.
３０．スプリング（Spring）ＦＡ、ジャドソン（Judson）ＰＡ、ダニエルズ（Daniels）ＳＦ、パーソンズ（Parsons）ＳＦ、マリンソン（Mallinson）Ｇおよびアンスティー（Anstee）ＤＪ９１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６２ ３７７.
３１．テイト（Tate）ＣＧ、ウチカワ（Uchikawa）Ｍ、タナー（Tanner）ＭＪＡ、ジャドソン（Judson）ＰＡ、パーソンズ（Parsons）ＳＦ、マリンソン（Mallinson）Ｇおよびアンスティー（Anstee）ＤＪ（１９８９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６１，４８９.
３２．ゴーター（Gorter）Ａ、ブロク（Blok）ＶＴ、ハースヌート（Haasnoot）ＷＨＢ、エンシンク（Ensink）ＮＧ、ダハ（Daha）ＭＲ、ローレン（Leuren）ＧＪ（１９９６），Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４ １０３９〜１０４９.
３３．スペンドラブ（Spendlove）Ｉ、リー（Li）Ｌ、ポッター（Potter）Ｖ、クリスチャンセン（Christiansen）Ｄ、ラブランド（Loveland）Ｂおよびデュラン（Durrant）ＬＧ（２０００），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，２９４４.
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１ａ】１０５ＡＤ７ハイブリドーマからの、ＶＫおよびＶＨのｃＤＮＡが翻訳されたＣＤＲ配列を示す。大文字はＣＤＲ領域を示し、小文字は隣接するフレームワークのアミノ酸である。
【図１ｂ】３種類のＣＤＲペプチドとＣＤ５５のアラインメントを示す。アミノ酸の番号付けは、リーダー配列を含む完全長配列からなされたものである。後の分析に用いるＣＤ５５ペプチドをアンダーラインで示した。黒丸（・）アミノ酸が相同であることを示し、物理化学的性質が類似するアミノ酸には（｜）で印をしてある。
【図２】補体Ｃ３ｂの沈着の分析を示す。７９１Ｔ細胞をヒト血清（補体源）とインキュベートした。Ｃ３ｂの沈着は、ウサギ抗Ｃ３ｂＦＩＴＣ標識抗体を用いて、ブロック抗体（２１６）、非ブロック抗体（２２０）または試験抗体７９１Ｔ／３６の存在下で測定した。蛍光はＦＡＣＳｃａｎフロー・サイトメーターで定量し、平均線形蛍光(mean linear fluorescence;ＭＬＦ)で示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ５５を中和するための医薬の調製方法において、（ｉ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、または（ｉｉ）前記結合要素をコードする核酸を使用する医薬の調製方法。
【請求項２】
組織への補体の沈着の向上のための医薬の調製方法において、（ｉ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、または（ｉｉ）前記結合要素をコードする核酸を使用する医薬の調製方法。
【請求項３】
癌治療薬の調製方法において、（ｉ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、または（ｉｉ）前記結合要素をコードする核酸を使用する医薬の調製方法。
【請求項４】
癌が、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、脊椎癌のうちの１つ以上である請求項３に記載の医薬の調製方法。
【請求項５】
前記結合要素が抗体またはそのフラグメントである請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項６】
前記結合要素が、下記化１に示す配列のアミノ酸８３〜９３、下記化２に示す配列のアミノ酸１０１〜１１２、および下記化３に示すアミノ酸１４５〜１５７に結合する請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【化１】
【化２】
【化３】
【請求項７】
前記結合要素は、ＡＴＣＣに寄託された受託番号ＨＢ９１７３の細胞株により産生される抗体のＣＤＲの１つ以上またはその断片を含む請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項８】
前記結合要素は、ＡＴＣＣに寄託された受託番号ＨＢ９１７３のハイブリドーマ細胞により産生される抗体７９１Ｔ／３６である請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項９】
前記結合要素は、少なくとも１つのヒトの定常領域を含む請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項１０】
癌治療に使用するための、ＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素。
【請求項１１】
癌治療において同時に、または別々にあるいは順次使用するための組合せ調製物としての作用剤、およびＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素。
【請求項１２】
前記作用剤が、ドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、イリノテカンまたはシスプラチンである請求項１１に記載の組合せ調製物。
【請求項１３】
前記作用剤が抗体である請求項１１に記載の組合せ調製物。
【請求項１４】
前記作用剤が、抗−ＣＤ２０抗体；抗−ＶＥＧＦ抗体；抗−ＣＤ１７１Ａ抗体；抗−ＣＥＡ抗−イディオタイプｍＡｂ；抗−ＥＧＦＲ抗体；抗−ＨＭＦＧ抗−イディオタイプｍＡｂ；抗−ＥＧＦＲ抗体、ハーセプチン等の抗−ＨＥＲ２抗体である請求項１３に記載の組合せ調製物。
【請求項１５】
前記ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項９のいずれか１項に定義されたものである請求項１０または請求項１１に記載のネーキッド結合要素または請求項１２ないし請求項１４のいずれか１項に記載の組合せ調製物。
【請求項１６】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に特異的に結合するネーキッド結合要素、および医薬として許容される賦形剤、希釈剤または担体を含有する癌治療のための医薬組成物。
【請求項１７】
前記ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項９のいずれか１項に定義されたものである請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含むＣＤ５５の中和方法。
【請求項１９】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含む補体沈着を向上させる方法。
【請求項２０】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に特異的に結合するネーキッド結合要素の治療的有効量を投与することを含む癌の治療方法。
【請求項２１】
前記ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項９のいずれか１項に定義されたものである請求項１６ないし請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ５５を阻害可能な薬剤を特定するための分析方法において、
ａ）候補剤をＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の少なくとも一部に接触せしめることと、
ｂ）前記候補剤のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方への結合を測定することと
を含む分析方法。
【請求項２３】
ＣＤ５５を阻害可能な薬剤を特定するための分析方法において、
（ａ）候補剤の非存在下においてはＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合可能なネーキッド結合要素の存在下において候補剤をＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の少なくとも一部に接触せしめることと、
（ｂ）候補剤が、ネーキッド結合要素のＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２への結合をどの程度阻害したかを測定することと
を含む分析方法。
【請求項２４】
前記結合要素が請求項６ないし請求項９のいずれか１項に定義されたものである請求項２３に記載の分析方法。
【請求項２５】
請求項２２ないし請求項２４のいずれか１項に記載の分析方法において、
さらに、（ｃ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合する候補剤を選択する段階と、および／または（ｄ）候補剤の存在下あるいは非存在下において細胞試料上への補体沈着量を測定する段階とを含む分析方法。
【請求項２６】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の前記一部が、下記化１に示す配列のアミノ酸８３〜９３、下記化２に示す配列のアミノ酸１０１〜１１２および化３に示すアミノ酸１４５〜１５７を含む請求項２２ないし請求項２５のいずれか１項に記載の分析方法。
【化１】
【化２】
【化３】
【請求項２７】
請求項２２ないし請求項２６のいずれか１項に記載の分析方法により特定された薬剤を使用する癌治療薬の製造方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織への補体の沈着の向上のための医薬の調製方法において、（ｉ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、または（ｉｉ）前記ネーキッド結合要素をコードする核酸を使用し、ネーキッド結合要素が、抗腫瘍特性を有する剤と結合していないようにした医薬の調製方法。
【請求項２】
癌治療薬の調製方法において、（ｉ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、または（ｉｉ）前記ネーキッド結合要素をコードする核酸を使用し、ネーキッド結合要素が、抗腫瘍特性を有する剤と結合していないようにした癌治療薬の調製方法。
【請求項３】
癌が、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、脊椎癌のうちの１つ以上である請求項２に記載の癌治療薬の調製方法。
【請求項４】
前記結合要素が、抗体またはそのフラグメントである請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項５】
前記結合要素が、下記化１に示す配列のアミノ酸８３〜９３、下記化２に示す配列のアミノ酸１０１〜１１２、および下記化３に示すアミノ酸１４５〜１５７に結合する請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【化１】
【化２】
【化３】
【請求項６】
前記結合要素は、ＡＴＣＣに寄託された受託番号ＨＢ９１７３の細胞株により産生される抗体の各種ＣＤＲの１つ以上またはそのフラグメントを含む請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項７】
前記結合要素は、ＡＴＣＣに寄託された受託番号ＨＢ９１７３のハイブリドーマ細胞により産生される抗体７９１Ｔ／３６である請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項８】
結合要素は、少なくとも１つのヒトの定常領域を含む請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項９】
癌治療に使用するための、ＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素。
【請求項１０】
癌治療において同時に、または別々にあるいは順次使用するための組合せ調製物としての作用剤、およびＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素であって、前記作用剤が、化学療法剤、鎮痛剤または鎮吐剤であるネーキッド結合要素。
【請求項１１】
前記作用剤が、ドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル、イリノテカンまたはシスプラチンである請求項１０に記載のネーキッド結合要素。
【請求項１２】
前記作用剤が抗体である請求項１０に記載のネーキッド結合要素。
【請求項１３】
前記作用剤が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ１７１Ａ抗体、抗ＣＥＡ抗イディオタイプｍＡｂ、抗ＨＭＦＧ抗イディオタイプｍＡｂ、抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＨＥＲ２抗体である請求項１２に記載のネーキッド結合要素。
【請求項１４】
前記ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項８のいずれか１項に定義されたものである請求項９または請求項１０に記載のネーキッド結合要素または請求項１１ないし請求項１３のいずれか１項に記載の作用剤。
【請求項１５】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、および医薬として許容される賦形剤、希釈剤または担体を含有する癌治療のための医薬組成物。
【請求項１６】
ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項８のいずれか１項に定義されたものである請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２に特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含むＣＤ５５の補体活性阻害作用の中和方法。
【請求項１８】
ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２に特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含む補体沈着を向上させる方法。
【請求項１９】
ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２に特異的に結合するネーキッド結合要素の治療的有効量をこれを必要とする哺乳類動物に投与すること含む癌の治療方法。
【請求項２０】
ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項８のいずれか１項に定義されたものである請求項１７ないし請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
ＣＤ５５を中和するための医薬の調製方法において、（ｉ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、または（ｉｉ）前記結合要素をコードする核酸を使用する医薬の調製方法。
【請求項２】
組織への補体の沈着の向上のための医薬の調製方法において、（ｉ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、または（ｉｉ）前記結合要素をコードする核酸を使用する医薬の調製方法。
【請求項３】
癌治療薬の調製方法において、（ｉ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、または（ｉｉ）前記結合要素をコードする核酸を使用する医薬の調製方法。
【請求項４】
癌が、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、脊椎癌のうちの１つ以上である請求項３に記載の医薬の調製方法。
【請求項５】
前記結合要素が抗体またはそのフラグメントである請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項６】
前記結合要素が、下記化１に示す配列のアミノ酸８３〜９３、下記化２に示す配列のアミノ酸１０１〜１１２、および下記化３に示すアミノ酸１４５〜１５７に結合する請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【化１】
【化２】
【化３】
【請求項７】
前記結合要素は、ＡＴＣＣに寄託された受託番号ＨＢ９１７３の細胞株により産生される抗体のＣＤＲの１つ以上またはその断片を含む請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項８】
前記結合要素は、ＡＴＣＣに寄託された受託番号ＨＢ９１７３のハイブリドーマ細胞により産生される抗体７９１Ｔ／３６である請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項９】
前記結合要素は、少なくとも１つのヒトの定常領域を含む請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項１０】
癌治療に使用するための、ＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素。
【請求項１１】
癌治療において同時に、または別々にあるいは順次使用するための組合せ調製物としての作用剤、およびＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素。
【請求項１２】
前記作用剤が、ドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、イリノテカンまたはシスプラチンである請求項１１に記載の組合せ調製物。
【請求項１３】
前記作用剤が抗体である請求項１１に記載の組合せ調製物。
【請求項１４】
前記作用剤が、抗−ＣＤ２０抗体；抗−ＶＥＧＦ抗体；抗−ＣＤ１７１Ａ抗体；抗−ＣＥＡ抗−イディオタイプｍＡｂ；抗−ＥＧＦＲ抗体；抗−ＨＭＦＧ抗−イディオタイプｍＡｂ；抗−ＥＧＦＲ抗体、ハーセプチン等の抗−ＨＥＲ２抗体である請求項１３に記載の組合せ調製物。
【請求項１５】
前記ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項９のいずれか１項に定義されたものである請求項１０または請求項１１に記載のネーキッド結合要素または請求項１２ないし請求項１４のいずれか１項に記載の組合せ調製物。
【請求項１６】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に特異的に結合するネーキッド結合要素、および医薬として許容される賦形剤、希釈剤または担体を含有する癌治療のための医薬組成物。
【請求項１７】
前記ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項９のいずれか１項に定義されたものである請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含むＣＤ５５の中和方法。
【請求項１９】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含む補体沈着を向上させる方法。
【請求項２０】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に特異的に結合するネーキッド結合要素の治療的有効量を投与することを含む癌の治療方法。
【請求項２１】
前記ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項９のいずれか１項に定義されたものである請求項１６ないし請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ５５を阻害可能な薬剤を特定するための分析方法において、
ａ）候補剤をＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の少なくとも一部に接触せしめることと、
ｂ）前記候補剤のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方への結合を測定することと
を含む分析方法。
【請求項２３】
ＣＤ５５を阻害可能な薬剤を特定するための分析方法において、
（ａ）候補剤の非存在下においてはＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合可能なネーキッド結合要素の存在下において候補剤をＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の少なくとも一部に接触せしめることと、
（ｂ）候補剤が、ネーキッド結合要素のＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２への結合をどの程度阻害したかを測定することと
を含む分析方法。
【請求項２４】
前記結合要素が請求項６ないし請求項９のいずれか１項に定義されたものである請求項２３に記載の分析方法。
【請求項２５】
請求項２２ないし請求項２４のいずれか１項に記載の分析方法において、
さらに、（ｃ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合する候補剤を選択する段階と、および／または（ｄ）候補剤の存在下あるいは非存在下において細胞試料上への補体沈着量を測定する段階とを含む分析方法。
【請求項２６】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の前記一部が、下記化１に示す配列のアミノ酸８３〜９３、下記化２に示す配列のアミノ酸１０１〜１１２および化３に示すアミノ酸１４５〜１５７を含む請求項２２ないし請求項２５のいずれか１項に記載の分析方法。
【化１】
【化２】
【化３】
【請求項２７】
請求項２２ないし請求項２６のいずれか１項に記載の分析方法により特定された薬剤を使用する癌治療薬の製造方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織への補体の沈着の向上のための医薬の調製方法において、（ｉ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、または（ｉｉ）前記ネーキッド結合要素をコードする核酸を使用し、ネーキッド結合要素が、抗腫瘍特性を有する剤と結合していないようにした医薬の調製方法。
【請求項２】
癌治療薬の調製方法において、（ｉ）ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、または（ｉｉ）前記ネーキッド結合要素をコードする核酸を使用し、ネーキッド結合要素が、抗腫瘍特性を有する剤と結合していないようにした癌治療薬の調製方法。
【請求項３】
癌が、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、皮膚癌、脊椎癌のうちの１つ以上である請求項２に記載の癌治療薬の調製方法。
【請求項４】
前記結合要素が、抗体またはそのフラグメントである請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項５】
前記結合要素が、下記化１に示す配列のアミノ酸８３〜９３、下記化２に示す配列のアミノ酸１０１〜１１２、および下記化３に示すアミノ酸１４５〜１５７に結合する請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【化１】
【化２】
【化３】
【請求項６】
前記結合要素は、ＡＴＣＣに寄託された受託番号ＨＢ９１７３の細胞株により産生される抗体の各種ＣＤＲの１つ以上またはそのフラグメントを含む請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項７】
前記結合要素は、ＡＴＣＣに寄託された受託番号ＨＢ９１７３のハイブリドーマ細胞により産生される抗体７９１Ｔ／３６である請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項８】
結合要素は、少なくとも１つのヒトの定常領域を含む請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の医薬の調製方法。
【請求項９】
癌治療に使用するための、ＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素。
【請求項１０】
癌治療において同時に、または別々にあるいは順次使用するための組合せ調製物としての作用剤、およびＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素であって、前記作用剤が、化学療法剤、鎮痛剤または鎮吐剤であるネーキッド結合要素。
【請求項１１】
前記作用剤が、ドキソルビシン、タキソール、５−フルオロウラシル、イリノテカンまたはシスプラチンである請求項１０に記載のネーキッド結合要素。
【請求項１２】
前記作用剤が抗体である請求項１０に記載のネーキッド結合要素。
【請求項１３】
前記作用剤が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ１７１Ａ抗体、抗ＣＥＡ抗イディオタイプｍＡｂ、抗ＨＭＦＧ抗イディオタイプｍＡｂ、抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＨＥＲ２抗体である請求項１２に記載のネーキッド結合要素。
【請求項１４】
前記ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項８のいずれか１項に定義されたものである請求項９または請求項１０に記載のネーキッド結合要素または請求項１１ないし請求項１３のいずれか１項に記載の作用剤。
【請求項１５】
ＣＤ５５のＳＣＲ１とＳＣＲ２の双方に結合するネーキッド結合要素、および医薬として許容される賦形剤、希釈剤または担体を含有する癌治療のための医薬組成物。
【請求項１６】
ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項８のいずれか１項に定義されたものである請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２に特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含むＣＤ５５の補体活性阻害作用の中和方法。
【請求項１８】
ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２に特異的に結合するネーキッド結合要素の投与を含む補体沈着を向上させる方法。
【請求項１９】
ＣＤ５５のＳＣＲ１およびＳＣＲ２に特異的に結合するネーキッド結合要素の治療的有効量をこれを必要とする哺乳類動物に投与すること含む癌の治療方法。
【請求項２０】
ネーキッド結合要素が請求項１ないし請求項８のいずれか１項に定義されたものである請求項１７ないし請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図１ｂ】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５２０７４２（Ｐ２００６−５２０７４２Ａ）
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５４７００（Ｐ２００４−５５４７００）
【出願日】平成１５年１１月２６日（２００３．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００５１６３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８４１３
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５０４２３６６５１）キャンサー リサーチ テクノロジー リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月２６日（２００３．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００５１６３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８４１３
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５０４２３６６５１）キャンサー リサーチ テクノロジー リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＣＥＲ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
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