単鎖タンパク質をそれらの２鎖形態に細胞内変換する方法
本明細書は、外来性プロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質及び二鎖ループ内に位置する外来性プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼを含む発現構築体、そのような発現構築体を含む細胞組成物、及び単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法を開示する。
Notice: Undefined index: DEJ in /mnt/www/gzt_disp.php on line 298
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約３．５時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
ｂ）前記細胞を２２℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
ステップ（ｂ）の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖クロストリジウム毒素及び前記ＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
前記産生されたＴＥＶプロテアーゼが、前記二鎖ループ領域内に位置する前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位で前記単鎖クロストリジウム毒素を切断し、それにより前記単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する方法。
【請求項２】
前記単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項１に記載の細胞内方法：（１）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素結合ドメイン；２）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；３）前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン；４）前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；５）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素結合ドメイン；又は６）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン。
【請求項３】
前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項４】
前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項５】
前記クロストリジウム毒素結合ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン、ＴｅＮＴ結合ドメイン、ＢａＮＴ結合ドメイン、又はＢｕＮＴ結合ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項６】
単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約８時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む前記単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
ｂ）前記細胞を、約１２〜１６℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
ステップ（ｂ）の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖タンパク質及び前記ＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
前記産生されたＴＥＶプロテアーゼが、前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインに位置する前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位で前記単鎖タンパク質を切断し、それにより前記単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項６に記載の細胞内方法：１）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、２）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、３）前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、４）前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、５）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、又は６）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイドの結合ドメイン。
【請求項８】
前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆの酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項９】
前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項１０】
前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ノシセプチン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンケファリン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ＢＡＭ２２結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンドモルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンドルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−へモルフィン結合ドメイン、又は統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−リモルフィン結合ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項１１】
単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約８時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
ｂ）前記細胞を、約１２〜１６℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
ステップ（ｂ）の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖タンパク質及び前記ＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
前記産生されたＴＥＶプロテアーゼが、前記二鎖ループ領域内に位置する前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位で前記単鎖タンパク質を切断し、それにより前記単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
【請求項１２】
前記単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項１１に記載の細胞内方法：（１）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン；２）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；３）前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン；４）前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；５）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン；又は６）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン。
【請求項１３】
前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆの酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、請求項１１に記載の細胞内方法。
【請求項１４】
前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、請求項１１に記載の細胞内方法。
【請求項１５】
前記非クロストリジウム毒素結合ドメインが、オピオイドペプチド結合ドメイン、メラノコルチンペプチド結合ドメイン、ガラニンペプチド結合ドメイン、グラニンペプチド結合ドメイン、タキキニンペプチド結合ドメイン、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメイン、神経ホルモンペプチド結合ドメイン、サイトカインペプチド結合ドメイン、キニンペプチド結合ドメイン、線維芽細胞増殖因子ペプチド結合ドメイン、ニューロトロフィンペプチド結合ドメイン、腫瘍壊死因子ペプチド結合ドメイン、グリア由来神経栄養因子ペプチド結合ドメイン、形質転換増殖因子βペプチド結合ドメイン、骨形態形成タンパク質ペプチド結合ドメイン、増殖及び分化因子ペプチド結合ドメイン、アクチビンペプチド結合ドメイン、血管内皮増殖因子ペプチド結合ドメイン、インスリン増殖因子ペプチド結合ドメイン、上皮細胞増殖因子ペプチド結合ドメイン、グルカゴン様ホルモンペプチド結合ドメイン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド結合ドメイン、成長ホルモン放出ホルモンペプチド結合ドメイン、血管作用性小腸ペプチド結合ドメイン、胃抑制ポリペプチドペプチド結合ドメイン、カルシトニン関連ペプチド内臓腸ペプチド結合ドメイン、又はプロテアーゼ活性化受容体ペプチド結合ドメインである、請求項１１に記載の細胞内方法。
【請求項１】
二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約３．５時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖クロストリジウム毒素をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
ｂ）前記細胞を２２℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
ステップ（ｂ）の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖クロストリジウム毒素及び前記ＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
前記産生されたＴＥＶプロテアーゼが、前記二鎖ループ領域内に位置する前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位で前記単鎖クロストリジウム毒素を切断し、それにより前記単鎖クロストリジウム毒素をその二鎖形態に変換する方法。
【請求項２】
前記単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項１に記載の細胞内方法：（１）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素結合ドメイン；２）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；３）前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン；４）前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；５）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素結合ドメイン；又は６）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン。
【請求項３】
前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項４】
前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項５】
前記クロストリジウム毒素結合ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ結合ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ結合ドメイン、ＴｅＮＴ結合ドメイン、ＢａＮＴ結合ドメイン、又はＢｕＮＴ結合ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項６】
単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約８時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインを含む前記単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
ｂ）前記細胞を、約１２〜１６℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
ステップ（ｂ）の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖タンパク質及び前記ＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
前記産生されたＴＥＶプロテアーゼが、前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインに位置する前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位で前記単鎖タンパク質を切断し、それにより前記単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項６に記載の細胞内方法：１）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、２）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、３）前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、４）前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、５）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、又は６）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイドの結合ドメイン。
【請求項８】
前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆの酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項９】
前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項１０】
前記統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−オピオイド結合ドメインが、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ノシセプチン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ダイノルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンケファリン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−ＢＡＭ２２結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンドモルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−エンドルフィン結合ドメイン、統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−へモルフィン結合ドメイン、又は統合型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位−リモルフィン結合ドメインである、請求項１に記載の細胞内方法。
【請求項１１】
単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する細胞内方法であって、
ａ）二重発現構築体を含む細胞を、３７℃で約８時間増殖させ、前記二重発現構築体が、
ｉ）酵素ドメイン、移行ドメイン、非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域を含む単鎖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び
ｉｉ）ＴＥＶプロテアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含むステップ、
ｂ）前記細胞を、約１２〜１６℃で約１６〜約１８時間増殖させるステップを含み、
ステップ（ｂ）の増殖が、前記二重発現構築体からの前記単鎖タンパク質及び前記ＴＥＶプロテアーゼの発現を誘導し、
前記産生されたＴＥＶプロテアーゼが、前記二鎖ループ領域内に位置する前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位で前記単鎖タンパク質を切断し、それにより前記単鎖タンパク質をその二鎖形態に変換する方法。
【請求項１２】
前記単鎖クロストリジウム毒素が、以下の線形のアミノからカルボキシルの単一ポリペプチド順序を含む、請求項１１に記載の細胞内方法：（１）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、及び前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン；２）前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；３）前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン；４）前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、及び前記クロストリジウム毒素移行ドメイン；５）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン、及び前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン；又は６）前記クロストリジウム毒素移行ドメイン、前記ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む二鎖ループ領域、前記非クロストリジウム毒素結合ドメイン、及び前記クロストリジウム毒素酵素ドメイン。
【請求項１３】
前記クロストリジウム毒素酵素ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆの酵素ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ酵素ドメイン、ＴｅＮＴ酵素ドメイン、ＢａＮＴ酵素ドメイン、又はＢｕＮＴ酵素ドメインである、請求項１１に記載の細胞内方法。
【請求項１４】
前記クロストリジウム毒素移行ドメインが、ＢｏＮＴ／Ａ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｂ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｃ１移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｄ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｅ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｆ移行ドメイン、ＢｏＮＴ／Ｇ移行ドメイン、ＴｅＮＴ移行ドメイン、ＢａＮＴ移行ドメイン、又はＢｕＮＴ移行ドメインである、請求項１１に記載の細胞内方法。
【請求項１５】
前記非クロストリジウム毒素結合ドメインが、オピオイドペプチド結合ドメイン、メラノコルチンペプチド結合ドメイン、ガラニンペプチド結合ドメイン、グラニンペプチド結合ドメイン、タキキニンペプチド結合ドメイン、神経ペプチドＹ関連ペプチド結合ドメイン、神経ホルモンペプチド結合ドメイン、サイトカインペプチド結合ドメイン、キニンペプチド結合ドメイン、線維芽細胞増殖因子ペプチド結合ドメイン、ニューロトロフィンペプチド結合ドメイン、腫瘍壊死因子ペプチド結合ドメイン、グリア由来神経栄養因子ペプチド結合ドメイン、形質転換増殖因子βペプチド結合ドメイン、骨形態形成タンパク質ペプチド結合ドメイン、増殖及び分化因子ペプチド結合ドメイン、アクチビンペプチド結合ドメイン、血管内皮増殖因子ペプチド結合ドメイン、インスリン増殖因子ペプチド結合ドメイン、上皮細胞増殖因子ペプチド結合ドメイン、グルカゴン様ホルモンペプチド結合ドメイン、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド結合ドメイン、成長ホルモン放出ホルモンペプチド結合ドメイン、血管作用性小腸ペプチド結合ドメイン、胃抑制ポリペプチドペプチド結合ドメイン、カルシトニン関連ペプチド内臓腸ペプチド結合ドメイン、又はプロテアーゼ活性化受容体ペプチド結合ドメインである、請求項１１に記載の細胞内方法。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５１７７９７（Ｐ２０１３−５１７７９７Ａ）
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５１２１８（Ｐ２０１２−５５１２１８）
【出願日】平成２３年１月２４日（２０１１．１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２２７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９１３７０
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５９１０１８２６８）アラーガン、インコーポレイテッド (293)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＬＥＲＧＡＮ，ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２０日（２０１３．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２４日（２０１１．１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２２２７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９１３７０
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５９１０１８２６８）アラーガン、インコーポレイテッド (293)
【氏名又は名称原語表記】ＡＬＬＥＲＧＡＮ，ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]