単離された成人糸球体由来多能性間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）、それらを製造する方法および腎臓の再生医療におけるそれらの使用
本発明は、マーカープロファイルＣＤ１３３−、ＣＤ１４６＋、ＣＤ３４−およびＣＤ１０５＋により特徴付けられる、単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）に関する。脱嚢糸球体から本発明のｈＧＬ−ＭＳＣを製造する方法、ならびに腎臓の再生処理における、特に腎臓糸球体障害または疾患の処置のための、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣの使用も記載されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、成人腎臓の脱嚢(decapsulated)糸球体由来であり、種々の細胞型、特に糸球体細胞型に分化する能力を示し、同時に優れた自己再生およびコロニー形成能力により特徴付けられる、多能性ヒト間葉系幹細胞に関する。さらに、本発明は、本発明の多能性ヒト間葉系幹細胞を製造する方法および再生医療における、特に腎障害および疾患の治療処置におけるこのような幹細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
幹細胞移植は、損傷または負傷組織および臓器の修復および再生の可能性を有することが知られている。結果として、ヒトおよび動物両方の起源由来の新規な多能性幹細胞を同定および単離するために、ならびに臨床適用における、とりわけ再生医療における幹細胞の有効性を研究するために、集中的な研究が最近実施されている。
【０００３】
例えば、Oliverらは、ＢｒｄＵ保持に基づいて、成体齧歯動物腎乳頭におけるゆっくりな周期の幹細胞を同定した［３］。同じアプローチを使用して、Maeshimaらは、成体ラットの尿細管においてＢｒｄＵ標識細胞を同定し、後腎臓に移植されたときに、このような幹細胞が近位尿細管、集合管細胞または繊維芽細胞を産生する可能性を示した［４］。Kitamuraらは、ラット成体腎臓におけるネフロンのＳ３セグメント由来の腎臓前駆細胞の独特な集団を確立し、特性化した［３７］。これらの細胞は、自己再生能力を有し、腎臓胚マーカー、例えば、Ｐａｘ２、Ｗｔｎ４およびＷｔｎ１を発現することが示された。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を押し出す能力に基づいて、多能性の可能性を有するいわゆる「サイドポピュレーション」がマウス胚および成体腎臓において同定された［３８］。最近、Guptaらは、成体ラット腎臓において、胚性幹細胞マーカー、例えば、Ｏｃｔ−４およびＰａｘ−２を発現する多能性腎臓前駆細胞の腎臓常在集団の存在を証明した［５］。しかしながら、それらの動物起源を考慮すると、これらの多能性腎臓幹細胞は、ヒト組織または臓器の再生に関する臨床適用において使用することができない。
【０００４】
ヒト胚性腎臓由来の多能性ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋幹細胞集団の同定は、［３９］に記載されている。しかしながら、これらの胚性幹細胞は、特に胚性幹細胞系およびヒト胚からのそれらの製造と関連する倫理的な問題を考慮すると、再生医療における使用のためにヒト幹細胞を提供する問題に対する最適な解決手段を示さない。
【０００５】
成人腎臓において、本発明者らは、ＣＤ１３３＋前駆細胞／幹細胞の常在集団を以前に記載した［１］。ＣＤ１３３＋細胞は、近位尿細管および糸球体付近の間質または尿細管内において珍しい細胞として見出され、それらは、インビトロおよびインビボ両方において、腎臓上皮および内皮分化を起こすことが示された。最近、Sagrinatiらは、成体腎臓のボーマン嚢由来の多能性ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋細胞集団を単離して特性化した［２］。しかしながら、ヒト腎臓において同定されたＣＤ１３３＋前駆細胞／幹細胞は、乏しい自己再生能力により特徴付けられる。さらに、このような幹細胞は、腎糸球体において見出される種々の細胞型、すなわち足細胞、内皮細胞およびメサンギウム細胞に分化する能力を有することが示されていない。
【０００６】
Schwabら, Human Reproduction (Oxford), vol. 22, no. 11, November 2007, pages 2903-2911は、ＭＳＣの古典的分化能力、すなわち脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および筋系譜細胞への分化を示す子宮内膜のＣＤ１４６＋ ＰＤＧＦ−Ｒβ＋ ＣＤ３４＋ 間葉系幹細胞を記載している。この文献は、さらなる分化能力について記載していない。しかしながら、これらの細胞の子宮内膜起源は、糸球体細胞型、例えば、足細胞、メサンギウム細胞および内皮細胞を生じる能力とは反対の傾向を強く示す。
【０００７】
ＷＯ２００８／０４５４９８は、脂肪細胞および骨芽細胞に分化することができるＣＤ３４＋ ＣＤ１３３− ＣＤ１０５− 腎臓由来細胞集団を記載している。しかしながら、糸球体細胞型への分化は記載されていない。
【０００８】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、間葉系起源の異なる細胞系に分化する能力により特徴付けられる［７］。間葉系幹細胞の主な貯蔵庫は骨髄（ＢＭ）である［８］。しかしながら、マウスモデルにおいて得られた最近のデータによって、ＭＳＣコンパートメントがより広範に分布していることが立証されている。事実、ＭＳＣは、血管壁と関連してすべてのマウス成体組織（脾臓、筋肉、腎臓、肺、肝臓、脳、胸腺）において実質的に検出されている［６］。ヒトにおいて、ＭＳＣは、循環血液ならびにいくつかの組織、例えば、滑膜、脂肪組織、骨梁、歯髄、真皮および肺から単離されている［９−１６］。しかしながら、ヒト糸球体におけるＭＳＣの存在は、今までに研究されていない。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
前記に照らして、腎臓の再生医療において、特にヒト腎臓障害および／または疾患、さらに特に腎臓糸球体障害および／または疾患の治療処置のための医薬として、首尾よく適用できるように、腎糸球体において見られる種々の細胞型に分化することができ、自己再生することができる成人腎臓由来の間葉系幹細胞の必要性が存在する。
【００１０】
これらのおよび他の目的は、成人腎臓の脱嚢糸球体において、本発明者らにより同定され単離された、単離された多能性ヒト間葉系幹細胞により達成される。
【００１１】
したがって、本発明の第１の局面は、ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）、ＣＤ３４（陰性）およびＣＤ１０５（陽性）であることで特徴付けられる、単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）である。
【００１２】
単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）は、有利には、糸球体細胞型、すなわち足細胞、メサンギウム細胞および内皮細胞に分化することができる。
【００１３】
本発明の好ましい態様において、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＣＤ２４（陽性）およびＰａｘ−２（陽性）であることでさらに特徴付けられる。
【００１４】
本発明のさらに好ましい態様において、ｈＧＬ−ＭＳＣは、α−ＳＭＡ（陰性）およびＯｃｔ−４（陰性）であることでさらに特徴付けられる。
【００１５】
本発明の他の局面は、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣを製造する方法であって、以下の工程：
−特定の成長因子の非存在下で生理学的ｐＨで緩衝された血清含有動物細胞培養培地を含む拡大培養培地中で成人腎臓由来の脱嚢糸球体を培養し、それにより、培養された脱嚢糸球体から増殖した細胞の混合集団を得て（該細胞の混合集団は、紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞およびＣＤ１３３（陽性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞の両方を含む）；そして
−混合集団から紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞を単離する（該紡錘状細胞ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）は、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣを表す）
を含む方法である。
【００１６】
好ましい態様において、拡大培養培地は、６.８から７.４の範囲内、より好ましくは７.２から７.４の範囲内のｐＨで緩衝されている。生理学的範囲内のｐＨを維持することができるあらゆる緩衝剤、例えば、Ｈｅｐｅｓ、ＰＢＳなどが使用され得る。
【００１７】
他の好ましい態様において、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣを表す紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞は、少なくとも第３継代の細胞培養物または後代継代、例えば、第４継代、第５継代、第６継代などの細胞培養物から単離される。この態様は、紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞が、上記培養条件下で第３継代の細胞培養後に生存することが見出された混合集団中の唯一の細胞型であるという事実に基づく。
【００１８】
本発明の態様において、紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞は、細胞選別法、例えば、ＦＡＣＳにより混合集団から単離される。あるいは、それらは、それらの紡錘状形態に基づいて単離することができる。
【００１９】
本発明のｈＧＬ−ＭＳＣは、優れた自己再生およびコロニー形成能力により、ならびに限定はしないが内皮細胞、メサンギウム細胞および足細胞を含む多くの糸球体細胞型に分化する能力により有利に特徴付けられる。これらの特性は、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣを特に腎臓再生における使用のために適するものにする。
【００２０】
したがって、本発明のさらなる局面は、腎障害または疾患、特に腎糸球体障害または疾患の治療処置のための医薬としての本発明の単離されたヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）の使用である。
【００２１】
本発明のさらなる局面は、本発明の単離されたヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤および／またはビヒクルを含む医薬組成物である。本発明のヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）を含む医薬組成物は、腎障害または疾患、特に腎糸球体障害または疾患の処置のために特に適当である。
【００２２】
図面の説明
本発明のさらなる利点および特性は、以下の詳細な説明と図面から明白である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、糸球体から増殖した細胞の形態および増殖速度を示す。コラゲナーゼＩ処理により２４時間（Ａ）、７日（Ｂ）、２週（Ｃ）および３週（Ｄ）培養後にボーマン嚢が除去された、成人糸球体の典型的な顕微鏡写真（拡大×２００）。Ｅ）５つの異なる調製物（Ｒ１３６、Ｒ１４０、Ｒ１４１、Ｒ１４７およびＲ１４８と称される）の増殖曲線を示す。
【００２４】
【図２】図２は、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣの特性化に関する。Ａ）典型的なＦＡＣＳ分析は、ｈＧＬ−ＭＳＣが、ＭＳＣの表面マーカー特性（ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６）に対して陽性、ＣＤ１３３および特異的造血マーカー（ＣＤ４５およびＣＤ３４）に対して陰性ならびに内皮マーカー（ＣＤ３１）に対して陰性であることを示す。点線は同形コントロールである。Ｂ）ビメンチン、ネスチン、ＮａｎｏｇおよびＭｕｓａｓｈｉに対する抗体で染色した、ｈＧＬ−ＭＳＣの典型的な免疫蛍光顕微鏡写真（拡大×６００）。発達したｈＧＬ−ＭＳＣ系の全てが、同じ表現型を示した。
【００２５】
【図３】図３は、ｈＧＬ−ＭＳＣの免疫調節性およびそれらのコロニー形成率を示す。Ａ）ｈＧＬ−ＭＳＣが、クラスＩＩ抗原および接着分子ＣＤ１５４ならびに共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０（暗線）に対して陰性であることを示す、典型的なＦＡＣＳ分析。点線は同形コントロールである。Ｂ）本発明の骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）またはヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）の添加は、ＰＨＡ−誘導ＰＢＭＣ増殖を阻害する。ＰＢＭＣ（５×１０４／ｍｌ）を、５×１０３／ｍｌのＢＭ−ＭＳＣまたはｈＧＬ−ＭＳＣ含有または非含有で２.５μｇ／ｍのＰＨＡの存在下で４８時間培養した。データは、トリプリケートにおいて４つの別々の実験の平均±ＳＤとして示す。＊ｐ＜０.０５（スチューデントｔ検定）。Ｃ）コロニー形成率は、それぞれの培養継代において得られたクローンのパーセント（％）として示す。
【００２６】
【図４】図４は、Ａ）糸球体（矢印）におけるＣＤ１４６およびＣＤ２４の共発現、Ｂ）ボーマン嚢の壁細胞（矢印）内および近位尿細管の上皮細胞（＊）におけるＣＤ１３３の発現、ならびに（Ｃ）糸球体ＣＤ１４６（陽性）およびＣＤ２４（陽性）細胞（矢印）におけるＣＤ１３３発現の非存在を示す、典型的な共焦点顕微鏡写真である。実物の６３０×拡大。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明者らにより実施された研究は、間葉系幹細胞が成人脱嚢腎臓糸球体に存在するか否か、このような幹細胞が常在集団を示すか否かを研究することを目的とした。さらに、本発明者らは、糸球体由来ＭＳＣの、特に糸球体細胞型、例えば、足細胞、内皮細胞およびメサンギウム細胞に関しての分化能を評価した。
【００２８】
明細書の実験の部に詳細に記載されているとおり、本発明の間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）は、外科的に取り出されたヒト腎臓由来の皮質の正常部分から得られた。皮質を解離し、段階的な一連のメッシュに通過させた後、糸球体懸濁液を回収し、洗浄し、機械的および酵素的処理によりボーマン嚢を除去した。脱嚢糸球体（図１Ａ）を、非分化条件下で、すなわち幹細胞分化を指示することができる特定の成長因子の非存在下で、血清含有緩衝拡大培地中で培養した。
【００２９】
７日以内に、付着細胞の糸球体増殖が観察された（図１Ｂ）。コンフルエンスは、細胞単層がトリプシン−ＥＤＴＡ処理により分離される１２−１４日目までに達成された。糸球体残存物を低速遠心分離により除去し、細胞を同じ拡大培地中で拡大させた。最初の培養期間中、細胞培養中で形態的不均一性であったが（図１Ｃ）、約３週（すなわち約第４継代）後、培養物は紡錘状細胞で単形性となった（図１Ｄ）。図１Ｅは、５つの異なる細胞調製物の増殖曲線を示す。増殖速度は、５つの初期継代中ゆっくりであったが、細胞がもはや増殖できない第２０継代（培養約１００日）まで連続継代培養で増加した。継代間の間隔は、第４継代まで約３から７日間で変化し、それ以降、約７日間に固定した。
【００３０】
脱嚢糸球体から増殖した紡錘状細胞は、本発明のヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）である。したがって、これらの幹細胞は、それらの形態学的特性に基づいて、細胞培養物から、好ましくは少なくとも第３継代の細胞培養物または後代継代、例えば、第４継代、第５継代、第６継代の細胞培養物から単離することができる。
【００３１】
さらに、本発明者らは、脱嚢糸球体から増殖した細胞が、初期細胞継代（１−３）で、フローサイトメトリーにより検出されるとき、３１±１１％のＣＤ１３３（陽性）および７４±２６％のＣＤ１３３（陰性）細胞（ｎ＝１５調製物）を含む混合集団であったことを観察した。両方の細胞集団がＣＤ１４６を発現する。
【００３２】
したがって、別の形態学的方法として、本発明のヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）は、細胞選別法、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により単離することができる。好ましくは、ＣＤ１３３（陽性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞およびＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞は、第２、第３または第４継代からＦＡＣＳにより選別されるが、それらは、また、あらゆる細胞継代から、次継代(subpassaging)前であっても単離することができる。
【００３３】
ＦＡＣＳ選別集団を特性化し、クローニングした。
【００３４】
ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋細胞は、マーカーＣＤ３１およびｖＷＦを共発現することが見出され、それにより内皮表現型を示した。該ＣＤ１３３＋集団は、ネスチン（データは示していない）もＭＳＣマーカー、例えば、ビメンチン、ＣＤ７３、ＣＤ２９またはＣＤ１６６（データは示していない）も共発現しなかった。ＣＤ１３３＋細胞集団が消化された脱嚢糸球体の細胞懸濁液から免疫−磁気的に選別されたとき、同じ表現型が観察された（データは示していない）。拡大培地の存在下で第４継代後に、腎臓糸球体から増殖した細胞を特性化したとき、ＣＤ１３３＋細胞は、もはや検出することができなかった。
【００３５】
選別されたＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を含むＭＳＣの表面マーカー特性に対して陽性であり［２５］、ＣＤ１３３および特異的造血マーカー（ＣＤ４５およびＣＤ３４）ならびに内皮マーカー（ＣＤ３１）に対して陰性であった（図２Ａ）。免疫蛍光により、これらの細胞は、ＭＳＣ−特異的マーカー・ビメンチンならびに神経および肝臓常在幹細胞マーカー・ネスチン［２６、２７、２８］を発現し、これにより、細胞質線維状パターンを示した（図２Ｂ）。該細胞集団は、上皮性マーカー・サイトケラチンおよびＥ−カドヘリンを発現しなかった。分化した糸球体細胞により通常発現される他のマーカー、例えば、αＳＭＡ（これはメサンギウム細胞により対照的に発現される）もネフリン（これは足細胞により対照的に発現される）も発現しなかった（データは示していない）。これらの特性は、汚染糸球体細胞の非存在を示す。
【００３６】
マーカーＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４およびＭｕｓａｓｈｉの発現も評価した。これらの分子は、胚および成体幹細胞の自己再生および多分化能に関与することが知られている転写因子である［２９−３３］。本発明の幹細胞集団は、核・細胞質においてＮａｎｏｇおよびＭｕｓａｓｈｉの両方の発現を示したが（図２Ｂ）、Ｏｃｔ−４を発現しなかった（示されていない）。
【００３７】
ＢＭ−ＭＳＣに関して記載されているとおり［３４］、ｈＧＬ−ＭＳＣも、ＭＨＣクラスＩ抗原を構成的に発現することを示したが（図２Ａ）、それらは、クラスＩＩ抗原および接着分子ＣＤ１５４ならびに共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０に対して陰性であった（図３Ａ）。加えて、ＰＨＡ誘導性ＰＢＭＣ増殖を阻害することが知られているＢＭ−ＭＳＣと同様に、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＰＨＡ誘導性ＰＢＭＣ増殖の顕著な減少を誘導した（図３Ｂ）。しかしながら、ＢＭ−ＭＳＣと反対に、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＣＤ２４（陽性）およびＰａｘ−２（陽性）であった。さらに、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣが、マウス腎臓から単離された腎臓幹細胞と反対に、α−ＳＭＡおよびＯｃｔ−４の両方に対して陰性であることを見出した。
【００３８】
糸球体から得られたｈＧＬ−ＭＳＣ集団の自己再生能力を証明するために、本発明者らは、選別されたＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋およびＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞において、コロニー形成アッセイを行った。単一細胞懸濁液を９６−ウェルプレートに播種し、拡大培地における第３継代培養物の糸球体からの増殖物を選別した。ＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞のコロニー形成率は２５.３±５.１％であったが、ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋細胞はコロニー形成しなかった（図３Ｃ）。ＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞の初代クローンから産生された単一細胞懸濁液の播種は２代クローンを提供し、２代クローンから産生された単一細胞の播種は３代クローンの産生をもたらした（図３Ｃ）。これらのデータは、糸球体ＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞がコロニー形成し、インビトロで自己再生能力を示したが、ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋細胞はこれらの培養条件下でクローンを産生することができなかったことを示す。ＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋クローンをフローサイトメトリーおよび免疫組織化学により分析し、非クローン集団由来のｈＧＬ−ＭＳＣと同じ間葉系表現型が示された（データは示していない）。拡大培地の存在下で第４継代後に、糸球体から増殖した非選別細胞を特性化したとき、それら全てが間葉系表現型を示し、これにより、使用された培養条件がｈＧＬ−ＭＳＣの拡大に選択的であったことを示す。
【００３９】
本発明者らは、また、本発明のＧＬ−ＭＳＣが糸球体内に局在するＢＭ−由来ＭＳＣ集団よりはむしろ、常在腎臓集団であるか否かを試験する目的の実験を行った。この目的のために、常在およびＢＭ−由来幹細胞により異なって発現されるマーカーの存在を、最初に試験した。ｈＧＬ−ＭＳＣはＣＤ２４を発現したが、ＣＤ２４は、対照的にＢＭ−由来ＭＳＣにおいては陰性であり、腎臓常在幹細胞のマーカーと考えられる［２、３５］。ｈＧＬ−ＭＳＣの腎臓起源も、臓器−特異的胚性Ｐａｘ−２タンパク質および遺伝子の発現により示唆された。Ｐａｘ−２は、ＢＭ−ＭＳＣにより発現されなかった。Ｐａｘ−２は、後腎間充織の幹細胞［３６］ならびに成体ラットおよびヒト腎臓から単離された幹細胞［１、５］により発現される転写因子である。さらに、本発明者らは、女性レシピエントに移植された男性ドナー由来の移植腎臓の糸球体からｈＧＬ−ＭＳＣを単離した。移植された腎臓由来のｈＧＬ−ＭＳＣは、正常腎臓由来のｈＧＬ−ＭＳＣと同じ表現型を示した（データは示していない）。レシピエントの骨髄または移植された腎臓のどちら由来のｈＧＬ−ＭＳＣかを評価するために、ｈＧＬ−ＭＳＣにおけるＹ染色体の存在を第２および第６継代で分析した。第２継代（４７８個の核；２３個の中期）および第６継代（４３６個の核；２５個の中期）で、全体で９１４個の核および４８個の中期を分析した。デュアルカラーＸ（緑色）／Ｙ（赤色）動原体プローブのハイブリダイゼーションパターンのＦＩＳＨ分析は、９０％の核が男性赤色／緑色パターンを有し、１０％の核が１つの緑色スポットだけを有したことを示した。１つの緑色スポットを有する核は、培養中に頻繁に起こる、Ｙ染色体を失った男性核由来であろう。女性核は観察されなかった（２つの緑色スポット）。ｈＧＬ−ＭＳＣの全４８個の中期において検出された核型は、男性であった。ＦＩＳＨ対比染色に使用されるＤＡＰＩで観察された中期染色体は、正常のように見えた。これらのデータは、ｈＧＬ−ＭＳＣがレシピエントの骨髄に由来しなかったことを示唆する。むしろ、それらは、ドナー腎臓の糸球体における常在集団を示す。
【００４０】
間葉系幹細胞の最も顕著な特性の１つは、その多様な間葉系系統に分化する能力であるため、本発明者らは、特定の結合組織細胞に分化する本発明のｈＧＬ−ＭＳＣの能力を評価した。第２または第３継代で選別されたＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋集団は、規定の培養条件下で脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞系統に分化することができないことを示した（データは示していない）。対照的に、１５人の患者（第４−１０継代）から得られた元のＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋ ｈＧＬ−ＭＳＣ系および後に得られた４つのクローンの両方は、多分化能を有することを示した。
【００４１】
ｈＧＬ−ＭＳＣは、カルシウム沈着のＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ染色により示される場合、骨形成培地中で、１４日後に骨細胞分化を効率的に起こした。
【００４２】
脂肪細胞−培地において２１日間培養したとき、ｈＧＬ−ＭＳＣは、脂質滴を含む細胞を生じた。未分化コントロールにおいて、鉱化または脂質滴の証拠が観察されなかった。
【００４３】
ｈＧＬ−ＭＳＣの軟骨細胞への分化を、軟骨細胞−選択培地［７］を使用して観察した。分化ペレットを、軟骨細胞の分化に特有であるサフラニンＯおよびアルシアンブルー［７］での染色処理で２８日目に回収した。
【００４４】
全体を考慮すると、これらの結果は、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣの多分化能を示す。ほぼ同様の結果が、最初に単離された１５個のｈＧＬ−ＭＳＣ系および元の細胞系から後に得られた４つのクローンで得られたという事実も価値がある。
【００４５】
適当な培養条件下で、特定の糸球体細胞集団、例えば、内皮細胞、足細胞およびメサンギウム細胞に分化するｈＧＬ−ＭＳＣの能力も、評価した。内皮分化を得るために、ｈＧＬ−ＭＳＣを、ＶＥＧＦの存在下でＥＢＭ中で３週間培養した。フローサイトメトリー分析は、特異的内皮マーカー、例えば、ＣＤ１０５、ＫＤＲ、ＣＤ３４およびＣＤ３１の発現を示した。加えて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で培養したとき、内皮分化したｈＧＬ−ＭＳＣおよび非−未分化細胞は、特徴的な毛細血管様組織を形成した（データは示していない）。ＰＤＧＦｂｂおよびＴＧＦβ１の存在下で、ｈＧＬ−ＭＳＣは、メサンギウム様表現型を獲得した。具体的には、それらは、α−ＳＭＡおよびアンジオテンシン２受容体１（ＡＴ１）の発現を獲得した。２０μＭ／ＬのＡＴＲＡの存在下で３週間培養したとき、ｈＧＬ−ＭＳＣは、足細胞により発現される特異的上皮性マーカー、例えば、サイトケラチン、ポドシン、ネフリンおよびシナプトポジンの発現を獲得した。ネフリン発現をリアルタイムＰＣＲにより確認し、ネフリン転写産物が、足細胞への分化後にｈＧＬ−ＭＳＣに存在したが、分化を防止する拡大培地中で維持されたｈＧＬ−ＭＳＣに存在しなかったことが示された。３つのクローン細胞系の試験は、同様の結果であった。
【００４６】
全ての実験条件において、一般的に成熟細胞により発現されるＣＤ９０およびＣＤ１４６を維持したメサンギウムおよび内皮分化細胞を除いて（データは示していない）、分化細胞は、幹細胞性関連マーカー、例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｍｕｓａｓｈｉ、ビメンチン、ネスチン、ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ７３を失った。全てのｈＧＬ−ＭＳＣ細胞系およびクローンは、同じ分化能力を示した。同じ培養条件下でＢＭ由来ＭＳＣは、内皮細胞および筋肉様細胞に分化することができたが、足細胞様細胞に分化することはできなかった（データは示していない）。
【００４７】
要するに、本発明者らは、ボーマン嚢に結合している幹細胞の存在を回避するために、予め脱嚢されたヒト糸球体内の幹細胞の存在を試験した。初代継代の脱嚢糸球体から増殖した細胞は、２つの異なる集団、ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋集団およびＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋集団からなることが見出された。ＣＤ１３３＋細胞は、内皮マーカーを共発現するため、恐らく内皮関連細胞集団を示す。さらに、第３継代後に、ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋細胞は生存しなかった。加えて、ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋集団を選別したとき、それは自己再生することができず、コロニー形成しなかった。
【００４８】
対照的に、脱嚢ヒト糸球体から単離されクローニングされたＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋集団は、長期培養で産生することができる間葉系幹細胞の多能性集団であることが見出された。興味深いことに、それらは、細胞培養第４継代後に生存することができる糸球体から増殖した細胞のみであった。これらの細胞をｈＧＬ−ＭＳＣと称した。ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＢＭ−由来ＭＳＣおよび他の成体組織由来のＭＳＣ［９−１６、２６−２８］と以下の特性を共有していた。ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ビメンチンおよびネスチンの発現、ＣＤ３４およびＣＤ４５の欠失、中胚葉分化（骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞）するための能力。加えて、ｈＧＬ−ＭＳＣは、細胞維持に関与するＮａｎｏｇおよびＭｕｓａｓｈｉ胚マーカーを発現した。ＢＭ−由来ＭＳＣと同様に、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＰＢＭＣのＰＨＡ−誘導性増殖を阻害することができた。同様の免疫調節効果が、成体マウス由来の非尿細管Ｓｃａ−１＋ｌｉｎ−多能性幹／前駆細胞［４０］ならびに心臓、脾臓および腎周囲脂肪由来のヒトＭＳＣ［４１］に対して示された。
【００４９】
成体臓器内のＭＳＣの起源について議論する。本研究において、本発明者らは、単離されたｈＧＬ−ＭＳＣが常在腎臓幹細胞の表現型特性を有することを見出した。事実、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣとは対照的に、腎臓常在前駆細胞のマーカー［２、３５］として考えられているＣＤ２４、ならびにＰａｘ−２胚臓器特異的転写因子［１、５、３６］を発現した。Ｐａｘ−２の発現は、腎臓常在幹細胞集団のマーカーであることが以前に示されている［１、５、３６］。さらに、腎臓同種移植におけるドナー性同一性のｈＧＬ−ＭＳＣの存在は、成人糸球体内に局所的に存在するＭＳＣ集団の存在に関する証拠を提供した。この結果は、肺移植試験由来のヒト肺において提供される組織常在ＭＳＣに関する以前の証拠と一致する［１６］。
【００５０】
ｈＧＬ−ＭＳＣの腎臓関与は、内皮細胞ならびに特定の糸球体系統、例えば、足細胞およびメサンギウム様細胞に適当な培養条件下で分化する能力により示される。実際に、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＡＴＲＡおよびＩＶ型コラーゲンの存在下で培養したとき、足細胞のスリット膜に対して特異的なマーカー、例えば、ネフリン、シナプトポジンおよびポドシンを発現する上皮細胞に分化することができた。これは、ＢＭ−ＭＳＣと対照的である。
【００５１】
ｈＧＬ−ＭＳＣの糸球体メサンギウム細胞への分化は、ＢＭ由来の多能性成体前駆細胞において平滑筋細胞分化を誘導することが報告されている［２０］、ＴＧＦベータ１およびＰＤＧＦ−ｂｂの組合せの存在下で細胞を培養することにより得られた。さらに、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣと同様に［２３−２５］、ＰＨＡ−刺激ＰＢＭＣの増殖を阻害したので、免疫調節特性を示した。ｈＧＬ−ＭＳＣの免疫調節活性は、炎症性糸球体疾患と関連する。
【００５２】
要するに、本研究の結果は、成人脱嚢糸球体における、異なる糸球体特異的細胞型の代謝回転に寄与する可能性のある間葉系表現型を発現する常在多能性幹細胞集団の存在を証明する。
【００５３】
成人腎臓糸球体からの本発明のヒト糸球体間葉系幹細胞の単離およびそれらの特性は、以下の実験の部により詳細に記載されているが、これは説明のみの目的のために提供し、特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【００５４】
実験の部
材料および方法
ヒト糸球体および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および培養
糸球体由来のヒト間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）を、外科的に取り出された腎臓（１５個の異なる調製物）由来の皮質の正常部分から得た。皮質を解離し、段階的な一連のメッシュ（６０および１２０メッシュ）に通過させた後、糸球体懸濁液を回収し、Ｈａｎｓ平衡塩溶液（GIBCO, Grand Island, NY）で洗浄し、１０ｍｌピペットを使用する数回の吸引／排出により機械的に、およびコラゲナーゼＩ（Sigma, St. Louis, MO）での２分間消化により酵素的にボーマン嚢を除去した。脱嚢糸球体を、フィブロネクチン被覆Ｔ２５フラスコ（Falcon, BD Bioscience, Two Oak Park, Bedford, MA）に移した。
【００５５】
いくつかの培養培地を比較した。１×ＩＴＳ（Sigma）およびＨｅｐｅｓ（遊離酸、１０ｍＭ）（Sigma）の存在下で１０％のＦＣＳ（Euroclone, Wetherby, UK）を有するＲＰＭＩ（Sigma）（拡大培地）がｈＧＬ−ＭＳＣの最大増幅を引き起こしたので、後の実験において使用した。
【００５６】
ヒトＭＳＣをＢＭから単離し、以前に記載されているとおりに培養した［７］。
【００５７】
成長速度論
培養速度論を描く増殖曲線は、以前に記載されているとおりに作成した［６］。２５ｃｍ２に相当する初代ｈＧｌ−ＭＳＣ培養により占有される増殖面積を、簡素化のため１と見なした。第２継代を行なったとき、継代１の分割比（１：３）にその値を乗じ、このことは、継代１の最後に累積増殖面積が３（すなわち、初代培養により占有される増殖面積の３倍）であったことを意味した。第２継代の最後に、継代２での分割比（１：３）に、継代１の累積増殖面積で乗じた（３×３＝９）。この手順をそれぞれの継代に対して繰り返し、細胞数に正比例する理論的増殖曲線を提供した。増殖を、５つの異なる糸球体調製物において評価した。
【００５８】
糸球体由来間葉系幹細胞の特性化
細胞蛍光分析を、［１］に記載されているとおりに行い、以下の抗体、全てのフィコエリトリン（ＰＥ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合を使用した。抗−ＣＤ１０５、−ＣＤ２９、−ＣＤ３１、−ＣＤ１４６、−ＣＤ４４、−ＣＤ２４、−ＣＤ９０（Dakocytomation, Copenhagen, Denmark）、−ＣＤ７３、−ＣＤ３４、−ＣＤ４５、−ＣＤ８０、−ＣＤ８６、−ＣＤ１６６、ＨＬＡ−Ｉ（Becton Dickinson Biosciences Pharmingen, San Jose, CA）、−ＣＤ１３３（Miltenyi Biotec, Auburn）、ＫＤＲ（R&D Systems, Abington, U.K.）、−ＨＬＡ−ＩＩ（Chemicon International Temecula, CA）、−ＣＤ４０（Immunotech, Beckman Coulter）、−ＣＤ１５４（Serotec, Raleigh, NC USA）モノクローナル抗体。マウスＩｇＧ同形コントロールは、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎから入手した。全てのインキュベーションを、０.１％のウシ血清アルブミンおよび０.１％のアジ化ナトリウムを含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で４℃で行った。それぞれのサンプルにおいて、１０，０００個の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーター（BD Biosciences Pharmingen）で分析した。ゲーティングを陰性コントロールに基づいて構築し、補正コントロールを行われる全ての分析に含んだ。集団パーセントおよび数を、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（BD Biosciences Pharmingen）を使用して、それぞれの実験からゲーティングされた集団に関して得た。
【００５９】
間接免疫蛍光を、２％のスクロースを含む４％のパラホルムアルデヒドで固定し、必要によりＨｅｐｅｓ−Ｔｒｉｔｏｎ×１００バッファー（Sigma）で透過処理した、チャンバースライド（Nalgen Nunc International, Rochester, NY, USA）で培養し、未分化または分化ｈＧＬ−ＭＳＣで行った。以下のモノクローナル抗体を使用した。抗−ビメンチン（Sigma）、抗−サイトケラチン（Biomeda, Foster City CA）、抗−Ｅ−カドヘリン（Dakocytomation）、アルファ−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）（Dakocytomation）、抗−シナプトポジン（Progen Biotechnik, Heidelberg）。抗−フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）（Dakocytomation）、抗−ネスチン（Chemicon International）、抗−Ｐａｘ−２（Covance, Princeton, NJ）、抗−Ｎａｎｏｇ、抗−Ｏｃｔ−４、抗−Ｍｕｓａｓｈｉ（AbCam, Cambridge, Science Park Cambridge UK）、抗−ポドシン、抗−アンジオテンシンＩＩ受容体１（ＡＴ１）（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）ウサギポリクローナル抗体およびブタポリクローナル抗−ネフリン（Progen Biotechnik）を使用した。一次抗体の排除または非免疫ウサギ、ラットもしくはマウスＩｇＧでの置換を、適宜、コントロールとして使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ 抗−ウサギまたは抗−ブタＩｇＧおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ 抗−マウスＩｇＧ（Molecular Probes, Leiden, The Netherlands）を二次Ａｂとして使用した。共焦点顕微鏡分析を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５ Ｐａｓｃａｌモデル共焦点顕微鏡（Carl Zeiss International, Germany）を使用して行った。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ 色素（Sigma）を核染色のために加えた。
【００６０】
マーカー発現プロフィールの要約
以下の表１は、本発明のヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）のマーカー発現プロフィールの要約を提供する。
表１
【表１】
【００６１】
Ｆｉｓｈ試験
ｈＧＬ−ＭＳＣを、女性レシピエントに移植された男性ドナー由来の移植腎臓の糸球体から単離した。４５歳の女性患者に男性移植片を移植した。該移植片は、巣状糸球体硬化症の生検診断で、治療に抵抗性の重度腎炎症候群の再発のため、９つのマウント後に移植された。
【００６２】
サブコンフルエンス（７０％）の培養物を、最終濃度０.０１μｇ／ｍｌのＶｅｌｂｅで一晩インキュベーション（１６−１８時間）した。細胞をペレット化し、ペレットを低張溶液（０.２ｇのＫＣｌ＋０.２ｇのクエン酸Ｎａ／１００ｍｌ）に再懸濁した。３７℃で２０分インキュベーション後、細胞を３：１のメタノール−酢酸で固定し、１８時間、−２０℃で保存した。中期染色体を清潔なスライドガラスに約５０μｌの懸濁液を滴下することにより調製し、空気乾燥させた後、顕微鏡法を使用して視覚化した。
【００６３】
ＦＩＳＨ試験を、市販のＸ（緑色）およびＹ（赤色）染色体動原体プローブならびにＹ古典的サテライトＩＩＩヘテロクロマチンプローブ（Aquarius Cytocell, Cambridge, UK）を使用して行った。プローブを、製造業者の指示にしたがって、調製し変性させた。調製されたプローブを、カバースリップ下に変性させた中期および核（７０℃で７０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ中で１.４５分）を含むスライド上に加えた。ハイブリダイゼーションを一晩３７℃で行った。次に、スライドを７２℃で２分間０.４×ＳＳＣで１回洗浄し、次に、室温で５−１０分間４×ＳＳＣ＋Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma）で２回目の洗浄をした。染色体および核をＤＡＰＩで対比染色し、抗フェード溶液中に置いた。サンプルを、直接顕微鏡視覚化（Ｎｉｋｏｎ落射蛍光顕微鏡）で男性（ＸＹ）／女性（ＸＸ）核および中期の同定のために分析した。デジタル画像をCytovision Cytogenetics Image Analysis Systemを使用して得た。
【００６４】
免疫磁気分離、細胞選別および細胞クローニング
細胞を、新鮮な脱嚢糸球体または第２もしくは３継代の細胞培養物から免疫磁気分離した。解離し、段階的な一連のメッシュに通過させた後、脱嚢糸球体の懸濁液をコラゲナーゼＩ（Sigma）で８分間消化し、ＣＤ１３３＋細胞を、ＭＡＣＳシステム（Miltenyi Biotech）を使用して、磁気細胞選別により単離した。
【００６５】
拡大培地における第２または第３継代培養物で糸球体から培養した集団由来のＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋およびＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞を、細胞選別（ＭｏＦｌｏＴＭ、Dakocytomation）により分離し、両方の集団を特性化し、培養し、細胞選別による９６−ウェルプレートにおける単一細胞懸濁液の播種によりクローニングした。得られたクローンの数、形態および速度論を分析し、それらのいくつかをサブクローニングおよび分化アッセイのために選択した。
【００６６】
インビトロ分化
ｈＧＬ−ＭＳＣの脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞分化能力は、以前に記載されているとおりに測定した［７］。
【００６７】
簡潔には、ｈＧＬ−ＭＳＣを、脂肪生成培地（Lonza, Basel Switzerland）で３週間培養した。分化を評価するために、細胞を、２０分間室温で４％のパラホルムアルデヒドで固定し、２０分間室温でメタノール（Sigma）中の０.５％のＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Sigma）で染色した。
【００６８】
骨細胞分化を、骨形成培地（Lonza）中でｈＧＬ−ＭＳＣを培養することにより評価した。培地を、３週間にわたって１週間に２回交換した。分化を評価するために、細胞を、２０分間４％のパラホルムアルデヒドで固定し、２０分間室温でＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ、ｐＨ４.１（Lonza）で染色した。
【００６９】
軟骨細胞分化に関して、２.５×１０５個のｈＧＬ−ＭＳＣを、１５ｍｌの円錐形ポリプロピレンチューブ（Falcon BD Bioscience）中で１５０ｇで５分間遠心分離し、ＤＭＥＭで２回洗浄した。ペレットを、１０ｎｇ／ｍｌの形質転換成長因子β３（Lonza）を補った軟骨形成培地（Lonza）で培養した。培地を、２８日間にわたって３日ごとに交換した。ペレットを一晩で４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋切片を、グリコサミノグリカンに対して０.１％のサフラニンＯ（Sigma）を使用して、硫酸化プロテオグリカンに対して１％のアルシアンブルーで染色した。
【００７０】
内皮細胞分化を、以前に記載されているとおりに、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ、Sigma）を有する内皮細胞用基本培地（ＥＢＭ）（Lonza）の存在下でｈＧＬ−ＭＳＣを３週間培養することにより得た［１７］。
【００７１】
足細胞分化を、オール・トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、Sigma、２０μｍｏｌ／Ｌ）を含有する拡大培地中でｈＧＬ−ＭＳＣを３週間培養することにより得た［１８］。分化を、ＩＶ型コラーゲン（Sigma）で被覆したチャンバースライドで行った［１９］。
【００７２】
メサンギウム分化を、１０％のＦＣＳ、ＴＧＦ−ベータ１（２.５ｎｇ／ｍｌ、Sigma）［２０］およびＰＤＧＦｂｂ（５ｎｇ／ｍｌ Sigma）［２１］の存在下で、ＤＭＥＭ高濃度グルコース中でｈＧＬ−ＭＳＣを６日間培養することにより得た。分化を、フィブロネクチンで被覆したチャンバースライドで行った。
【００７３】
リアルタイムＰＣＲ
定量的逆転写ＰＣＲを、以前に記載されているとおりに行った［２２］。一本鎖ｃＤＮＡを、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems, Foster City, CA 94404, USA）を使用して、全ＲＮＡから生産した。簡潔には、１または２μｇのｍＲＮＡ、２μｌのＲＴバッファー、０.８μｌのｄＮＴＰ混合物、２μｌのＲＴランダムプライマー、１μｌのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素および４.２μｌのヌクレアーゼ非含有水を、それぞれのｃＤＮＡ合成のために使用した。逆転写後、ｃＤＮＡを−２０℃で保存した。リアルタイムＰＣＲによる相対的量子化を、４８ウェルＳｔｅｐＯｎｅＴＭリアルタイムシステム（Applied Biosystems）を使用して、リアルタイムにおけるＰＣＲ産物のＳＹＢＲ−緑色検出を使用して行った。リアルタイムＰＣＲを行うために、以下の配列−特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、全てMWG-Biotech AG, Ebersberg, Germanyから購入した。（ｉ）［２２］に記載されているヒトネフリンフォワードおよびリバースプライマー、（ｉｉ）［１］に記載されているヒトＰＡＸ２フォワードおよびリバースプライマー、および（ｉｉｉ）［１］に記載されているヒトβ−アクチンフォワードおよびリバースプライマー。Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。熱サイクル条件は以下のとおりである、９５℃１０分のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＬＤの活性化、次に、９５℃１５秒および６０℃（ネフリン、ｐａｘ２およびβ−アクチンに対して）１分の増幅を４５サイクル。増幅の対数期を検出するために、蛍光レベル（産物の定量化）をそれぞれのサイクルで測定した。蛍光が域値に達したサイクルを記録し、トリプリケート間で平均し、β−アクチンに関する域値の平均サイクルに標準化した。コントロールに対する発現の倍数変化を、全てのサンプルに対して計算した。
【００７４】
同種異系末梢血単核細胞−ＭＳＣ共培養
［２３、２４］に記載されているとおり、修飾され混合された細胞培養物において、健常ボランティア由来の末梢血単核細胞（ＢＰＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Sigma）で分画し、キラー細胞として使用し、同種異系ＭＳＣを刺激細胞として使用した。簡潔には、ｈＧＬ−ＭＳＣを、１００μｌの完全培地において５×１０３細胞／ｍｌで９６−ウェルプレート上にトリプリケートにおいて播種し、１から２時間でプラスチックに付着させた。ＰＢＭＣを５×１０４細胞／ｍｌで再懸濁し、最終濃度２.５μｇ／ｍｌで、マイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、Sigma）の存在または非存在下で、Ｇｌ−ＭＳＣ含有または非含有のウェル（１００μｌの容量）に加えた。Ｇｌ−ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０であった。ＢＭ由来のヒトＭＳＣを、コントロールとして使用した。培養を１６−４８時間維持し、培養期間後、リンパ球増殖を評価した。
【００７５】
細胞増殖を、製造業者の指示にしたがって酵素免疫吸着アッセイキット（Chemicon International）を使用して、細胞ＤＮＡへの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みとして検出されるＤＮＡ合成により試験した。データは、［２３］に記載されているとおりに計算される刺激指数（ＳＩ）値として示す。該実験は、記載されているそれぞれの時点に対して少なくとも３回行った。
【００７６】
統計分析
データは、３回以上の実験由来の平均±標準偏差として示した。統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定により評価した。
【００７７】
インビボ局在試験
本発明者らは、また、本発明の幹細胞集団のヒト腎臓におけるインビボ局在を明らかにするために実験を行った。結果は図４に示されている。糸球体においてＣＤ２４（陽性）を共発現する、ＣＤ１４６（陽性）およびＣＤ１３３（陰性）細胞の存在を、免疫蛍光により試験した。図４に示されるとおり、ＣＤ２４（陽性）を共発現するＣＤ１４６（陽性）細胞を、糸球体（平均２.２２±０.２／糸球体 ｎ＝６０）において検出することができ、これらの細胞はＣＤ１３３陰性であった。さらに、ＣＤ１４６は、内皮細胞により糸球体係蹄内で発現した。ＣＤ１３３（陽性）細胞は、主にボーマン嚢において観察された。
【００７８】
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【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、成人腎臓の脱嚢(decapsulated)糸球体由来であり、種々の細胞型、特に糸球体細胞型に分化する能力を示し、同時に優れた自己再生およびコロニー形成能力により特徴付けられる、多能性ヒト間葉系幹細胞に関する。さらに、本発明は、本発明の多能性ヒト間葉系幹細胞を製造する方法および再生医療における、特に腎障害および疾患の治療処置におけるこのような幹細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
幹細胞移植は、損傷または負傷組織および臓器の修復および再生の可能性を有することが知られている。結果として、ヒトおよび動物両方の起源由来の新規な多能性幹細胞を同定および単離するために、ならびに臨床適用における、とりわけ再生医療における幹細胞の有効性を研究するために、集中的な研究が最近実施されている。
【０００３】
例えば、Oliverらは、ＢｒｄＵ保持に基づいて、成体齧歯動物腎乳頭におけるゆっくりな周期の幹細胞を同定した［３］。同じアプローチを使用して、Maeshimaらは、成体ラットの尿細管においてＢｒｄＵ標識細胞を同定し、後腎臓に移植されたときに、このような幹細胞が近位尿細管、集合管細胞または繊維芽細胞を産生する可能性を示した［４］。Kitamuraらは、ラット成体腎臓におけるネフロンのＳ３セグメント由来の腎臓前駆細胞の独特な集団を確立し、特性化した［３７］。これらの細胞は、自己再生能力を有し、腎臓胚マーカー、例えば、Ｐａｘ２、Ｗｔｎ４およびＷｔｎ１を発現することが示された。Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を押し出す能力に基づいて、多能性の可能性を有するいわゆる「サイドポピュレーション」がマウス胚および成体腎臓において同定された［３８］。最近、Guptaらは、成体ラット腎臓において、胚性幹細胞マーカー、例えば、Ｏｃｔ−４およびＰａｘ−２を発現する多能性腎臓前駆細胞の腎臓常在集団の存在を証明した［５］。しかしながら、それらの動物起源を考慮すると、これらの多能性腎臓幹細胞は、ヒト組織または臓器の再生に関する臨床適用において使用することができない。
【０００４】
ヒト胚性腎臓由来の多能性ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋幹細胞集団の同定は、［３９］に記載されている。しかしながら、これらの胚性幹細胞は、特に胚性幹細胞系およびヒト胚からのそれらの製造と関連する倫理的な問題を考慮すると、再生医療における使用のためにヒト幹細胞を提供する問題に対する最適な解決手段を示さない。
【０００５】
成人腎臓において、本発明者らは、ＣＤ１３３＋前駆細胞／幹細胞の常在集団を以前に記載した［１］。ＣＤ１３３＋細胞は、近位尿細管および糸球体付近の間質または尿細管内において珍しい細胞として見出され、それらは、インビトロおよびインビボ両方において、腎臓上皮および内皮分化を起こすことが示された。最近、Sagrinatiらは、成体腎臓のボーマン嚢由来の多能性ＣＤ１３３＋ＣＤ２４＋細胞集団を単離して特性化した［２］。しかしながら、ヒト腎臓において同定されたＣＤ１３３＋前駆細胞／幹細胞は、乏しい自己再生能力により特徴付けられる。さらに、このような幹細胞は、腎糸球体において見出される種々の細胞型、すなわち足細胞、内皮細胞およびメサンギウム細胞に分化する能力を有することが示されていない。
【０００６】
Schwabら, Human Reproduction (Oxford), vol. 22, no. 11, November 2007, pages 2903-2911は、ＭＳＣの古典的分化能力、すなわち脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞および筋系譜細胞への分化を示す子宮内膜のＣＤ１４６＋ ＰＤＧＦ−Ｒβ＋ ＣＤ３４＋ 間葉系幹細胞を記載している。この文献は、さらなる分化能力について記載していない。しかしながら、これらの細胞の子宮内膜起源は、糸球体細胞型、例えば、足細胞、メサンギウム細胞および内皮細胞を生じる能力とは反対の傾向を強く示す。
【０００７】
ＷＯ２００８／０４５４９８は、脂肪細胞および骨芽細胞に分化することができるＣＤ３４＋ ＣＤ１３３− ＣＤ１０５− 腎臓由来細胞集団を記載している。しかしながら、糸球体細胞型への分化は記載されていない。
【０００８】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、間葉系起源の異なる細胞系に分化する能力により特徴付けられる［７］。間葉系幹細胞の主な貯蔵庫は骨髄（ＢＭ）である［８］。しかしながら、マウスモデルにおいて得られた最近のデータによって、ＭＳＣコンパートメントがより広範に分布していることが立証されている。事実、ＭＳＣは、血管壁と関連してすべてのマウス成体組織（脾臓、筋肉、腎臓、肺、肝臓、脳、胸腺）において実質的に検出されている［６］。ヒトにおいて、ＭＳＣは、循環血液ならびにいくつかの組織、例えば、滑膜、脂肪組織、骨梁、歯髄、真皮および肺から単離されている［９−１６］。しかしながら、ヒト糸球体におけるＭＳＣの存在は、今までに研究されていない。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
前記に照らして、腎臓の再生医療において、特にヒト腎臓障害および／または疾患、さらに特に腎臓糸球体障害および／または疾患の治療処置のための医薬として、首尾よく適用できるように、腎糸球体において見られる種々の細胞型に分化することができ、自己再生することができる成人腎臓由来の間葉系幹細胞の必要性が存在する。
【００１０】
これらのおよび他の目的は、成人腎臓の脱嚢糸球体において、本発明者らにより同定され単離された、単離された多能性ヒト間葉系幹細胞により達成される。
【００１１】
したがって、本発明の第１の局面は、ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）、ＣＤ３４（陰性）およびＣＤ１０５（陽性）であることで特徴付けられる、単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）である。
【００１２】
単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）は、有利には、糸球体細胞型、すなわち足細胞、メサンギウム細胞および内皮細胞に分化することができる。
【００１３】
本発明の好ましい態様において、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＣＤ２４（陽性）およびＰａｘ−２（陽性）であることでさらに特徴付けられる。
【００１４】
本発明のさらに好ましい態様において、ｈＧＬ−ＭＳＣは、α−ＳＭＡ（陰性）およびＯｃｔ−４（陰性）であることでさらに特徴付けられる。
【００１５】
本発明の他の局面は、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣを製造する方法であって、以下の工程：
−特定の成長因子の非存在下で生理学的ｐＨで緩衝された血清含有動物細胞培養培地を含む拡大培養培地中で成人腎臓由来の脱嚢糸球体を培養し、それにより、培養された脱嚢糸球体から増殖した細胞の混合集団を得て（該細胞の混合集団は、紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞およびＣＤ１３３（陽性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞の両方を含む）；そして
−混合集団から紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞を単離する（該紡錘状細胞ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）は、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣを表す）
を含む方法である。
【００１６】
好ましい態様において、拡大培養培地は、６.８から７.４の範囲内、より好ましくは７.２から７.４の範囲内のｐＨで緩衝されている。生理学的範囲内のｐＨを維持することができるあらゆる緩衝剤、例えば、Ｈｅｐｅｓ、ＰＢＳなどが使用され得る。
【００１７】
他の好ましい態様において、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣを表す紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞は、少なくとも第３継代の細胞培養物または後代継代、例えば、第４継代、第５継代、第６継代などの細胞培養物から単離される。この態様は、紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞が、上記培養条件下で第３継代の細胞培養後に生存することが見出された混合集団中の唯一の細胞型であるという事実に基づく。
【００１８】
本発明の態様において、紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞は、細胞選別法、例えば、ＦＡＣＳにより混合集団から単離される。あるいは、それらは、それらの紡錘状形態に基づいて単離することができる。
【００１９】
本発明のｈＧＬ−ＭＳＣは、優れた自己再生およびコロニー形成能力により、ならびに限定はしないが内皮細胞、メサンギウム細胞および足細胞を含む多くの糸球体細胞型に分化する能力により有利に特徴付けられる。これらの特性は、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣを特に腎臓再生における使用のために適するものにする。
【００２０】
したがって、本発明のさらなる局面は、腎障害または疾患、特に腎糸球体障害または疾患の治療処置のための医薬としての本発明の単離されたヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）の使用である。
【００２１】
本発明のさらなる局面は、本発明の単離されたヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤および／またはビヒクルを含む医薬組成物である。本発明のヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）を含む医薬組成物は、腎障害または疾患、特に腎糸球体障害または疾患の処置のために特に適当である。
【００２２】
図面の説明
本発明のさらなる利点および特性は、以下の詳細な説明と図面から明白である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、糸球体から増殖した細胞の形態および増殖速度を示す。コラゲナーゼＩ処理により２４時間（Ａ）、７日（Ｂ）、２週（Ｃ）および３週（Ｄ）培養後にボーマン嚢が除去された、成人糸球体の典型的な顕微鏡写真（拡大×２００）。Ｅ）５つの異なる調製物（Ｒ１３６、Ｒ１４０、Ｒ１４１、Ｒ１４７およびＲ１４８と称される）の増殖曲線を示す。
【００２４】
【図２】図２は、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣの特性化に関する。Ａ）典型的なＦＡＣＳ分析は、ｈＧＬ−ＭＳＣが、ＭＳＣの表面マーカー特性（ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６）に対して陽性、ＣＤ１３３および特異的造血マーカー（ＣＤ４５およびＣＤ３４）に対して陰性ならびに内皮マーカー（ＣＤ３１）に対して陰性であることを示す。点線は同形コントロールである。Ｂ）ビメンチン、ネスチン、ＮａｎｏｇおよびＭｕｓａｓｈｉに対する抗体で染色した、ｈＧＬ−ＭＳＣの典型的な免疫蛍光顕微鏡写真（拡大×６００）。発達したｈＧＬ−ＭＳＣ系の全てが、同じ表現型を示した。
【００２５】
【図３】図３は、ｈＧＬ−ＭＳＣの免疫調節性およびそれらのコロニー形成率を示す。Ａ）ｈＧＬ−ＭＳＣが、クラスＩＩ抗原および接着分子ＣＤ１５４ならびに共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０（暗線）に対して陰性であることを示す、典型的なＦＡＣＳ分析。点線は同形コントロールである。Ｂ）本発明の骨髄間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）またはヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）の添加は、ＰＨＡ−誘導ＰＢＭＣ増殖を阻害する。ＰＢＭＣ（５×１０４／ｍｌ）を、５×１０３／ｍｌのＢＭ−ＭＳＣまたはｈＧＬ−ＭＳＣ含有または非含有で２.５μｇ／ｍのＰＨＡの存在下で４８時間培養した。データは、トリプリケートにおいて４つの別々の実験の平均±ＳＤとして示す。＊ｐ＜０.０５（スチューデントｔ検定）。Ｃ）コロニー形成率は、それぞれの培養継代において得られたクローンのパーセント（％）として示す。
【００２６】
【図４】図４は、Ａ）糸球体（矢印）におけるＣＤ１４６およびＣＤ２４の共発現、Ｂ）ボーマン嚢の壁細胞（矢印）内および近位尿細管の上皮細胞（＊）におけるＣＤ１３３の発現、ならびに（Ｃ）糸球体ＣＤ１４６（陽性）およびＣＤ２４（陽性）細胞（矢印）におけるＣＤ１３３発現の非存在を示す、典型的な共焦点顕微鏡写真である。実物の６３０×拡大。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明者らにより実施された研究は、間葉系幹細胞が成人脱嚢腎臓糸球体に存在するか否か、このような幹細胞が常在集団を示すか否かを研究することを目的とした。さらに、本発明者らは、糸球体由来ＭＳＣの、特に糸球体細胞型、例えば、足細胞、内皮細胞およびメサンギウム細胞に関しての分化能を評価した。
【００２８】
明細書の実験の部に詳細に記載されているとおり、本発明の間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）は、外科的に取り出されたヒト腎臓由来の皮質の正常部分から得られた。皮質を解離し、段階的な一連のメッシュに通過させた後、糸球体懸濁液を回収し、洗浄し、機械的および酵素的処理によりボーマン嚢を除去した。脱嚢糸球体（図１Ａ）を、非分化条件下で、すなわち幹細胞分化を指示することができる特定の成長因子の非存在下で、血清含有緩衝拡大培地中で培養した。
【００２９】
７日以内に、付着細胞の糸球体増殖が観察された（図１Ｂ）。コンフルエンスは、細胞単層がトリプシン−ＥＤＴＡ処理により分離される１２−１４日目までに達成された。糸球体残存物を低速遠心分離により除去し、細胞を同じ拡大培地中で拡大させた。最初の培養期間中、細胞培養中で形態的不均一性であったが（図１Ｃ）、約３週（すなわち約第４継代）後、培養物は紡錘状細胞で単形性となった（図１Ｄ）。図１Ｅは、５つの異なる細胞調製物の増殖曲線を示す。増殖速度は、５つの初期継代中ゆっくりであったが、細胞がもはや増殖できない第２０継代（培養約１００日）まで連続継代培養で増加した。継代間の間隔は、第４継代まで約３から７日間で変化し、それ以降、約７日間に固定した。
【００３０】
脱嚢糸球体から増殖した紡錘状細胞は、本発明のヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）である。したがって、これらの幹細胞は、それらの形態学的特性に基づいて、細胞培養物から、好ましくは少なくとも第３継代の細胞培養物または後代継代、例えば、第４継代、第５継代、第６継代の細胞培養物から単離することができる。
【００３１】
さらに、本発明者らは、脱嚢糸球体から増殖した細胞が、初期細胞継代（１−３）で、フローサイトメトリーにより検出されるとき、３１±１１％のＣＤ１３３（陽性）および７４±２６％のＣＤ１３３（陰性）細胞（ｎ＝１５調製物）を含む混合集団であったことを観察した。両方の細胞集団がＣＤ１４６を発現する。
【００３２】
したがって、別の形態学的方法として、本発明のヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）は、細胞選別法、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により単離することができる。好ましくは、ＣＤ１３３（陽性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞およびＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞は、第２、第３または第４継代からＦＡＣＳにより選別されるが、それらは、また、あらゆる細胞継代から、次継代(subpassaging)前であっても単離することができる。
【００３３】
ＦＡＣＳ選別集団を特性化し、クローニングした。
【００３４】
ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋細胞は、マーカーＣＤ３１およびｖＷＦを共発現することが見出され、それにより内皮表現型を示した。該ＣＤ１３３＋集団は、ネスチン（データは示していない）もＭＳＣマーカー、例えば、ビメンチン、ＣＤ７３、ＣＤ２９またはＣＤ１６６（データは示していない）も共発現しなかった。ＣＤ１３３＋細胞集団が消化された脱嚢糸球体の細胞懸濁液から免疫−磁気的に選別されたとき、同じ表現型が観察された（データは示していない）。拡大培地の存在下で第４継代後に、腎臓糸球体から増殖した細胞を特性化したとき、ＣＤ１３３＋細胞は、もはや検出することができなかった。
【００３５】
選別されたＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を含むＭＳＣの表面マーカー特性に対して陽性であり［２５］、ＣＤ１３３および特異的造血マーカー（ＣＤ４５およびＣＤ３４）ならびに内皮マーカー（ＣＤ３１）に対して陰性であった（図２Ａ）。免疫蛍光により、これらの細胞は、ＭＳＣ−特異的マーカー・ビメンチンならびに神経および肝臓常在幹細胞マーカー・ネスチン［２６、２７、２８］を発現し、これにより、細胞質線維状パターンを示した（図２Ｂ）。該細胞集団は、上皮性マーカー・サイトケラチンおよびＥ−カドヘリンを発現しなかった。分化した糸球体細胞により通常発現される他のマーカー、例えば、αＳＭＡ（これはメサンギウム細胞により対照的に発現される）もネフリン（これは足細胞により対照的に発現される）も発現しなかった（データは示していない）。これらの特性は、汚染糸球体細胞の非存在を示す。
【００３６】
マーカーＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４およびＭｕｓａｓｈｉの発現も評価した。これらの分子は、胚および成体幹細胞の自己再生および多分化能に関与することが知られている転写因子である［２９−３３］。本発明の幹細胞集団は、核・細胞質においてＮａｎｏｇおよびＭｕｓａｓｈｉの両方の発現を示したが（図２Ｂ）、Ｏｃｔ−４を発現しなかった（示されていない）。
【００３７】
ＢＭ−ＭＳＣに関して記載されているとおり［３４］、ｈＧＬ−ＭＳＣも、ＭＨＣクラスＩ抗原を構成的に発現することを示したが（図２Ａ）、それらは、クラスＩＩ抗原および接着分子ＣＤ１５４ならびに共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０に対して陰性であった（図３Ａ）。加えて、ＰＨＡ誘導性ＰＢＭＣ増殖を阻害することが知られているＢＭ−ＭＳＣと同様に、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＰＨＡ誘導性ＰＢＭＣ増殖の顕著な減少を誘導した（図３Ｂ）。しかしながら、ＢＭ−ＭＳＣと反対に、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＣＤ２４（陽性）およびＰａｘ−２（陽性）であった。さらに、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣが、マウス腎臓から単離された腎臓幹細胞と反対に、α−ＳＭＡおよびＯｃｔ−４の両方に対して陰性であることを見出した。
【００３８】
糸球体から得られたｈＧＬ−ＭＳＣ集団の自己再生能力を証明するために、本発明者らは、選別されたＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋およびＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞において、コロニー形成アッセイを行った。単一細胞懸濁液を９６−ウェルプレートに播種し、拡大培地における第３継代培養物の糸球体からの増殖物を選別した。ＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞のコロニー形成率は２５.３±５.１％であったが、ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋細胞はコロニー形成しなかった（図３Ｃ）。ＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞の初代クローンから産生された単一細胞懸濁液の播種は２代クローンを提供し、２代クローンから産生された単一細胞の播種は３代クローンの産生をもたらした（図３Ｃ）。これらのデータは、糸球体ＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞がコロニー形成し、インビトロで自己再生能力を示したが、ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋細胞はこれらの培養条件下でクローンを産生することができなかったことを示す。ＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋クローンをフローサイトメトリーおよび免疫組織化学により分析し、非クローン集団由来のｈＧＬ−ＭＳＣと同じ間葉系表現型が示された（データは示していない）。拡大培地の存在下で第４継代後に、糸球体から増殖した非選別細胞を特性化したとき、それら全てが間葉系表現型を示し、これにより、使用された培養条件がｈＧＬ−ＭＳＣの拡大に選択的であったことを示す。
【００３９】
本発明者らは、また、本発明のＧＬ−ＭＳＣが糸球体内に局在するＢＭ−由来ＭＳＣ集団よりはむしろ、常在腎臓集団であるか否かを試験する目的の実験を行った。この目的のために、常在およびＢＭ−由来幹細胞により異なって発現されるマーカーの存在を、最初に試験した。ｈＧＬ−ＭＳＣはＣＤ２４を発現したが、ＣＤ２４は、対照的にＢＭ−由来ＭＳＣにおいては陰性であり、腎臓常在幹細胞のマーカーと考えられる［２、３５］。ｈＧＬ−ＭＳＣの腎臓起源も、臓器−特異的胚性Ｐａｘ−２タンパク質および遺伝子の発現により示唆された。Ｐａｘ−２は、ＢＭ−ＭＳＣにより発現されなかった。Ｐａｘ−２は、後腎間充織の幹細胞［３６］ならびに成体ラットおよびヒト腎臓から単離された幹細胞［１、５］により発現される転写因子である。さらに、本発明者らは、女性レシピエントに移植された男性ドナー由来の移植腎臓の糸球体からｈＧＬ−ＭＳＣを単離した。移植された腎臓由来のｈＧＬ−ＭＳＣは、正常腎臓由来のｈＧＬ−ＭＳＣと同じ表現型を示した（データは示していない）。レシピエントの骨髄または移植された腎臓のどちら由来のｈＧＬ−ＭＳＣかを評価するために、ｈＧＬ−ＭＳＣにおけるＹ染色体の存在を第２および第６継代で分析した。第２継代（４７８個の核；２３個の中期）および第６継代（４３６個の核；２５個の中期）で、全体で９１４個の核および４８個の中期を分析した。デュアルカラーＸ（緑色）／Ｙ（赤色）動原体プローブのハイブリダイゼーションパターンのＦＩＳＨ分析は、９０％の核が男性赤色／緑色パターンを有し、１０％の核が１つの緑色スポットだけを有したことを示した。１つの緑色スポットを有する核は、培養中に頻繁に起こる、Ｙ染色体を失った男性核由来であろう。女性核は観察されなかった（２つの緑色スポット）。ｈＧＬ−ＭＳＣの全４８個の中期において検出された核型は、男性であった。ＦＩＳＨ対比染色に使用されるＤＡＰＩで観察された中期染色体は、正常のように見えた。これらのデータは、ｈＧＬ−ＭＳＣがレシピエントの骨髄に由来しなかったことを示唆する。むしろ、それらは、ドナー腎臓の糸球体における常在集団を示す。
【００４０】
間葉系幹細胞の最も顕著な特性の１つは、その多様な間葉系系統に分化する能力であるため、本発明者らは、特定の結合組織細胞に分化する本発明のｈＧＬ−ＭＳＣの能力を評価した。第２または第３継代で選別されたＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋集団は、規定の培養条件下で脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞系統に分化することができないことを示した（データは示していない）。対照的に、１５人の患者（第４−１０継代）から得られた元のＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋ ｈＧＬ−ＭＳＣ系および後に得られた４つのクローンの両方は、多分化能を有することを示した。
【００４１】
ｈＧＬ−ＭＳＣは、カルシウム沈着のＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ染色により示される場合、骨形成培地中で、１４日後に骨細胞分化を効率的に起こした。
【００４２】
脂肪細胞−培地において２１日間培養したとき、ｈＧＬ−ＭＳＣは、脂質滴を含む細胞を生じた。未分化コントロールにおいて、鉱化または脂質滴の証拠が観察されなかった。
【００４３】
ｈＧＬ−ＭＳＣの軟骨細胞への分化を、軟骨細胞−選択培地［７］を使用して観察した。分化ペレットを、軟骨細胞の分化に特有であるサフラニンＯおよびアルシアンブルー［７］での染色処理で２８日目に回収した。
【００４４】
全体を考慮すると、これらの結果は、本発明のｈＧＬ−ＭＳＣの多分化能を示す。ほぼ同様の結果が、最初に単離された１５個のｈＧＬ−ＭＳＣ系および元の細胞系から後に得られた４つのクローンで得られたという事実も価値がある。
【００４５】
適当な培養条件下で、特定の糸球体細胞集団、例えば、内皮細胞、足細胞およびメサンギウム細胞に分化するｈＧＬ−ＭＳＣの能力も、評価した。内皮分化を得るために、ｈＧＬ−ＭＳＣを、ＶＥＧＦの存在下でＥＢＭ中で３週間培養した。フローサイトメトリー分析は、特異的内皮マーカー、例えば、ＣＤ１０５、ＫＤＲ、ＣＤ３４およびＣＤ３１の発現を示した。加えて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中で培養したとき、内皮分化したｈＧＬ−ＭＳＣおよび非−未分化細胞は、特徴的な毛細血管様組織を形成した（データは示していない）。ＰＤＧＦｂｂおよびＴＧＦβ１の存在下で、ｈＧＬ−ＭＳＣは、メサンギウム様表現型を獲得した。具体的には、それらは、α−ＳＭＡおよびアンジオテンシン２受容体１（ＡＴ１）の発現を獲得した。２０μＭ／ＬのＡＴＲＡの存在下で３週間培養したとき、ｈＧＬ−ＭＳＣは、足細胞により発現される特異的上皮性マーカー、例えば、サイトケラチン、ポドシン、ネフリンおよびシナプトポジンの発現を獲得した。ネフリン発現をリアルタイムＰＣＲにより確認し、ネフリン転写産物が、足細胞への分化後にｈＧＬ−ＭＳＣに存在したが、分化を防止する拡大培地中で維持されたｈＧＬ−ＭＳＣに存在しなかったことが示された。３つのクローン細胞系の試験は、同様の結果であった。
【００４６】
全ての実験条件において、一般的に成熟細胞により発現されるＣＤ９０およびＣＤ１４６を維持したメサンギウムおよび内皮分化細胞を除いて（データは示していない）、分化細胞は、幹細胞性関連マーカー、例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｍｕｓａｓｈｉ、ビメンチン、ネスチン、ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ＣＤ７３を失った。全てのｈＧＬ−ＭＳＣ細胞系およびクローンは、同じ分化能力を示した。同じ培養条件下でＢＭ由来ＭＳＣは、内皮細胞および筋肉様細胞に分化することができたが、足細胞様細胞に分化することはできなかった（データは示していない）。
【００４７】
要するに、本発明者らは、ボーマン嚢に結合している幹細胞の存在を回避するために、予め脱嚢されたヒト糸球体内の幹細胞の存在を試験した。初代継代の脱嚢糸球体から増殖した細胞は、２つの異なる集団、ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋集団およびＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋集団からなることが見出された。ＣＤ１３３＋細胞は、内皮マーカーを共発現するため、恐らく内皮関連細胞集団を示す。さらに、第３継代後に、ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋細胞は生存しなかった。加えて、ＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋集団を選別したとき、それは自己再生することができず、コロニー形成しなかった。
【００４８】
対照的に、脱嚢ヒト糸球体から単離されクローニングされたＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋集団は、長期培養で産生することができる間葉系幹細胞の多能性集団であることが見出された。興味深いことに、それらは、細胞培養第４継代後に生存することができる糸球体から増殖した細胞のみであった。これらの細胞をｈＧＬ−ＭＳＣと称した。ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＢＭ−由来ＭＳＣおよび他の成体組織由来のＭＳＣ［９−１６、２６−２８］と以下の特性を共有していた。ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ビメンチンおよびネスチンの発現、ＣＤ３４およびＣＤ４５の欠失、中胚葉分化（骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞）するための能力。加えて、ｈＧＬ−ＭＳＣは、細胞維持に関与するＮａｎｏｇおよびＭｕｓａｓｈｉ胚マーカーを発現した。ＢＭ−由来ＭＳＣと同様に、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＰＢＭＣのＰＨＡ−誘導性増殖を阻害することができた。同様の免疫調節効果が、成体マウス由来の非尿細管Ｓｃａ−１＋ｌｉｎ−多能性幹／前駆細胞［４０］ならびに心臓、脾臓および腎周囲脂肪由来のヒトＭＳＣ［４１］に対して示された。
【００４９】
成体臓器内のＭＳＣの起源について議論する。本研究において、本発明者らは、単離されたｈＧＬ−ＭＳＣが常在腎臓幹細胞の表現型特性を有することを見出した。事実、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣとは対照的に、腎臓常在前駆細胞のマーカー［２、３５］として考えられているＣＤ２４、ならびにＰａｘ−２胚臓器特異的転写因子［１、５、３６］を発現した。Ｐａｘ−２の発現は、腎臓常在幹細胞集団のマーカーであることが以前に示されている［１、５、３６］。さらに、腎臓同種移植におけるドナー性同一性のｈＧＬ−ＭＳＣの存在は、成人糸球体内に局所的に存在するＭＳＣ集団の存在に関する証拠を提供した。この結果は、肺移植試験由来のヒト肺において提供される組織常在ＭＳＣに関する以前の証拠と一致する［１６］。
【００５０】
ｈＧＬ−ＭＳＣの腎臓関与は、内皮細胞ならびに特定の糸球体系統、例えば、足細胞およびメサンギウム様細胞に適当な培養条件下で分化する能力により示される。実際に、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＡＴＲＡおよびＩＶ型コラーゲンの存在下で培養したとき、足細胞のスリット膜に対して特異的なマーカー、例えば、ネフリン、シナプトポジンおよびポドシンを発現する上皮細胞に分化することができた。これは、ＢＭ−ＭＳＣと対照的である。
【００５１】
ｈＧＬ−ＭＳＣの糸球体メサンギウム細胞への分化は、ＢＭ由来の多能性成体前駆細胞において平滑筋細胞分化を誘導することが報告されている［２０］、ＴＧＦベータ１およびＰＤＧＦ−ｂｂの組合せの存在下で細胞を培養することにより得られた。さらに、ｈＧＬ−ＭＳＣは、ＢＭ−ＭＳＣと同様に［２３−２５］、ＰＨＡ−刺激ＰＢＭＣの増殖を阻害したので、免疫調節特性を示した。ｈＧＬ−ＭＳＣの免疫調節活性は、炎症性糸球体疾患と関連する。
【００５２】
要するに、本研究の結果は、成人脱嚢糸球体における、異なる糸球体特異的細胞型の代謝回転に寄与する可能性のある間葉系表現型を発現する常在多能性幹細胞集団の存在を証明する。
【００５３】
成人腎臓糸球体からの本発明のヒト糸球体間葉系幹細胞の単離およびそれらの特性は、以下の実験の部により詳細に記載されているが、これは説明のみの目的のために提供し、特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【００５４】
実験の部
材料および方法
ヒト糸球体および骨髄由来の間葉系幹細胞の単離および培養
糸球体由来のヒト間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）を、外科的に取り出された腎臓（１５個の異なる調製物）由来の皮質の正常部分から得た。皮質を解離し、段階的な一連のメッシュ（６０および１２０メッシュ）に通過させた後、糸球体懸濁液を回収し、Ｈａｎｓ平衡塩溶液（GIBCO, Grand Island, NY）で洗浄し、１０ｍｌピペットを使用する数回の吸引／排出により機械的に、およびコラゲナーゼＩ（Sigma, St. Louis, MO）での２分間消化により酵素的にボーマン嚢を除去した。脱嚢糸球体を、フィブロネクチン被覆Ｔ２５フラスコ（Falcon, BD Bioscience, Two Oak Park, Bedford, MA）に移した。
【００５５】
いくつかの培養培地を比較した。１×ＩＴＳ（Sigma）およびＨｅｐｅｓ（遊離酸、１０ｍＭ）（Sigma）の存在下で１０％のＦＣＳ（Euroclone, Wetherby, UK）を有するＲＰＭＩ（Sigma）（拡大培地）がｈＧＬ−ＭＳＣの最大増幅を引き起こしたので、後の実験において使用した。
【００５６】
ヒトＭＳＣをＢＭから単離し、以前に記載されているとおりに培養した［７］。
【００５７】
成長速度論
培養速度論を描く増殖曲線は、以前に記載されているとおりに作成した［６］。２５ｃｍ２に相当する初代ｈＧｌ−ＭＳＣ培養により占有される増殖面積を、簡素化のため１と見なした。第２継代を行なったとき、継代１の分割比（１：３）にその値を乗じ、このことは、継代１の最後に累積増殖面積が３（すなわち、初代培養により占有される増殖面積の３倍）であったことを意味した。第２継代の最後に、継代２での分割比（１：３）に、継代１の累積増殖面積で乗じた（３×３＝９）。この手順をそれぞれの継代に対して繰り返し、細胞数に正比例する理論的増殖曲線を提供した。増殖を、５つの異なる糸球体調製物において評価した。
【００５８】
糸球体由来間葉系幹細胞の特性化
細胞蛍光分析を、［１］に記載されているとおりに行い、以下の抗体、全てのフィコエリトリン（ＰＥ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合を使用した。抗−ＣＤ１０５、−ＣＤ２９、−ＣＤ３１、−ＣＤ１４６、−ＣＤ４４、−ＣＤ２４、−ＣＤ９０（Dakocytomation, Copenhagen, Denmark）、−ＣＤ７３、−ＣＤ３４、−ＣＤ４５、−ＣＤ８０、−ＣＤ８６、−ＣＤ１６６、ＨＬＡ−Ｉ（Becton Dickinson Biosciences Pharmingen, San Jose, CA）、−ＣＤ１３３（Miltenyi Biotec, Auburn）、ＫＤＲ（R&D Systems, Abington, U.K.）、−ＨＬＡ−ＩＩ（Chemicon International Temecula, CA）、−ＣＤ４０（Immunotech, Beckman Coulter）、−ＣＤ１５４（Serotec, Raleigh, NC USA）モノクローナル抗体。マウスＩｇＧ同形コントロールは、Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎから入手した。全てのインキュベーションを、０.１％のウシ血清アルブミンおよび０.１％のアジ化ナトリウムを含む１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で４℃で行った。それぞれのサンプルにおいて、１０，０００個の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーター（BD Biosciences Pharmingen）で分析した。ゲーティングを陰性コントロールに基づいて構築し、補正コントロールを行われる全ての分析に含んだ。集団パーセントおよび数を、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（BD Biosciences Pharmingen）を使用して、それぞれの実験からゲーティングされた集団に関して得た。
【００５９】
間接免疫蛍光を、２％のスクロースを含む４％のパラホルムアルデヒドで固定し、必要によりＨｅｐｅｓ−Ｔｒｉｔｏｎ×１００バッファー（Sigma）で透過処理した、チャンバースライド（Nalgen Nunc International, Rochester, NY, USA）で培養し、未分化または分化ｈＧＬ−ＭＳＣで行った。以下のモノクローナル抗体を使用した。抗−ビメンチン（Sigma）、抗−サイトケラチン（Biomeda, Foster City CA）、抗−Ｅ−カドヘリン（Dakocytomation）、アルファ−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）（Dakocytomation）、抗−シナプトポジン（Progen Biotechnik, Heidelberg）。抗−フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）（Dakocytomation）、抗−ネスチン（Chemicon International）、抗−Ｐａｘ−２（Covance, Princeton, NJ）、抗−Ｎａｎｏｇ、抗−Ｏｃｔ−４、抗−Ｍｕｓａｓｈｉ（AbCam, Cambridge, Science Park Cambridge UK）、抗−ポドシン、抗−アンジオテンシンＩＩ受容体１（ＡＴ１）（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）ウサギポリクローナル抗体およびブタポリクローナル抗−ネフリン（Progen Biotechnik）を使用した。一次抗体の排除または非免疫ウサギ、ラットもしくはマウスＩｇＧでの置換を、適宜、コントロールとして使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ 抗−ウサギまたは抗−ブタＩｇＧおよびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ 抗−マウスＩｇＧ（Molecular Probes, Leiden, The Netherlands）を二次Ａｂとして使用した。共焦点顕微鏡分析を、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５ Ｐａｓｃａｌモデル共焦点顕微鏡（Carl Zeiss International, Germany）を使用して行った。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ 色素（Sigma）を核染色のために加えた。
【００６０】
マーカー発現プロフィールの要約
以下の表１は、本発明のヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）のマーカー発現プロフィールの要約を提供する。
表１
【表１】
【００６１】
Ｆｉｓｈ試験
ｈＧＬ−ＭＳＣを、女性レシピエントに移植された男性ドナー由来の移植腎臓の糸球体から単離した。４５歳の女性患者に男性移植片を移植した。該移植片は、巣状糸球体硬化症の生検診断で、治療に抵抗性の重度腎炎症候群の再発のため、９つのマウント後に移植された。
【００６２】
サブコンフルエンス（７０％）の培養物を、最終濃度０.０１μｇ／ｍｌのＶｅｌｂｅで一晩インキュベーション（１６−１８時間）した。細胞をペレット化し、ペレットを低張溶液（０.２ｇのＫＣｌ＋０.２ｇのクエン酸Ｎａ／１００ｍｌ）に再懸濁した。３７℃で２０分インキュベーション後、細胞を３：１のメタノール−酢酸で固定し、１８時間、−２０℃で保存した。中期染色体を清潔なスライドガラスに約５０μｌの懸濁液を滴下することにより調製し、空気乾燥させた後、顕微鏡法を使用して視覚化した。
【００６３】
ＦＩＳＨ試験を、市販のＸ（緑色）およびＹ（赤色）染色体動原体プローブならびにＹ古典的サテライトＩＩＩヘテロクロマチンプローブ（Aquarius Cytocell, Cambridge, UK）を使用して行った。プローブを、製造業者の指示にしたがって、調製し変性させた。調製されたプローブを、カバースリップ下に変性させた中期および核（７０℃で７０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ中で１.４５分）を含むスライド上に加えた。ハイブリダイゼーションを一晩３７℃で行った。次に、スライドを７２℃で２分間０.４×ＳＳＣで１回洗浄し、次に、室温で５−１０分間４×ＳＳＣ＋Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma）で２回目の洗浄をした。染色体および核をＤＡＰＩで対比染色し、抗フェード溶液中に置いた。サンプルを、直接顕微鏡視覚化（Ｎｉｋｏｎ落射蛍光顕微鏡）で男性（ＸＹ）／女性（ＸＸ）核および中期の同定のために分析した。デジタル画像をCytovision Cytogenetics Image Analysis Systemを使用して得た。
【００６４】
免疫磁気分離、細胞選別および細胞クローニング
細胞を、新鮮な脱嚢糸球体または第２もしくは３継代の細胞培養物から免疫磁気分離した。解離し、段階的な一連のメッシュに通過させた後、脱嚢糸球体の懸濁液をコラゲナーゼＩ（Sigma）で８分間消化し、ＣＤ１３３＋細胞を、ＭＡＣＳシステム（Miltenyi Biotech）を使用して、磁気細胞選別により単離した。
【００６５】
拡大培地における第２または第３継代培養物で糸球体から培養した集団由来のＣＤ１３３＋ＣＤ１４６＋およびＣＤ１３３−ＣＤ１４６＋細胞を、細胞選別（ＭｏＦｌｏＴＭ、Dakocytomation）により分離し、両方の集団を特性化し、培養し、細胞選別による９６−ウェルプレートにおける単一細胞懸濁液の播種によりクローニングした。得られたクローンの数、形態および速度論を分析し、それらのいくつかをサブクローニングおよび分化アッセイのために選択した。
【００６６】
インビトロ分化
ｈＧＬ−ＭＳＣの脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞分化能力は、以前に記載されているとおりに測定した［７］。
【００６７】
簡潔には、ｈＧＬ−ＭＳＣを、脂肪生成培地（Lonza, Basel Switzerland）で３週間培養した。分化を評価するために、細胞を、２０分間室温で４％のパラホルムアルデヒドで固定し、２０分間室温でメタノール（Sigma）中の０.５％のＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（Sigma）で染色した。
【００６８】
骨細胞分化を、骨形成培地（Lonza）中でｈＧＬ−ＭＳＣを培養することにより評価した。培地を、３週間にわたって１週間に２回交換した。分化を評価するために、細胞を、２０分間４％のパラホルムアルデヒドで固定し、２０分間室温でＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ、ｐＨ４.１（Lonza）で染色した。
【００６９】
軟骨細胞分化に関して、２.５×１０５個のｈＧＬ−ＭＳＣを、１５ｍｌの円錐形ポリプロピレンチューブ（Falcon BD Bioscience）中で１５０ｇで５分間遠心分離し、ＤＭＥＭで２回洗浄した。ペレットを、１０ｎｇ／ｍｌの形質転換成長因子β３（Lonza）を補った軟骨形成培地（Lonza）で培養した。培地を、２８日間にわたって３日ごとに交換した。ペレットを一晩で４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋切片を、グリコサミノグリカンに対して０.１％のサフラニンＯ（Sigma）を使用して、硫酸化プロテオグリカンに対して１％のアルシアンブルーで染色した。
【００７０】
内皮細胞分化を、以前に記載されているとおりに、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ、Sigma）を有する内皮細胞用基本培地（ＥＢＭ）（Lonza）の存在下でｈＧＬ−ＭＳＣを３週間培養することにより得た［１７］。
【００７１】
足細胞分化を、オール・トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、Sigma、２０μｍｏｌ／Ｌ）を含有する拡大培地中でｈＧＬ−ＭＳＣを３週間培養することにより得た［１８］。分化を、ＩＶ型コラーゲン（Sigma）で被覆したチャンバースライドで行った［１９］。
【００７２】
メサンギウム分化を、１０％のＦＣＳ、ＴＧＦ−ベータ１（２.５ｎｇ／ｍｌ、Sigma）［２０］およびＰＤＧＦｂｂ（５ｎｇ／ｍｌ Sigma）［２１］の存在下で、ＤＭＥＭ高濃度グルコース中でｈＧＬ−ＭＳＣを６日間培養することにより得た。分化を、フィブロネクチンで被覆したチャンバースライドで行った。
【００７３】
リアルタイムＰＣＲ
定量的逆転写ＰＣＲを、以前に記載されているとおりに行った［２２］。一本鎖ｃＤＮＡを、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Applied Biosystems, Foster City, CA 94404, USA）を使用して、全ＲＮＡから生産した。簡潔には、１または２μｇのｍＲＮＡ、２μｌのＲＴバッファー、０.８μｌのｄＮＴＰ混合物、２μｌのＲＴランダムプライマー、１μｌのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素および４.２μｌのヌクレアーゼ非含有水を、それぞれのｃＤＮＡ合成のために使用した。逆転写後、ｃＤＮＡを−２０℃で保存した。リアルタイムＰＣＲによる相対的量子化を、４８ウェルＳｔｅｐＯｎｅＴＭリアルタイムシステム（Applied Biosystems）を使用して、リアルタイムにおけるＰＣＲ産物のＳＹＢＲ−緑色検出を使用して行った。リアルタイムＰＣＲを行うために、以下の配列−特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、全てMWG-Biotech AG, Ebersberg, Germanyから購入した。（ｉ）［２２］に記載されているヒトネフリンフォワードおよびリバースプライマー、（ｉｉ）［１］に記載されているヒトＰＡＸ２フォワードおよびリバースプライマー、および（ｉｉｉ）［１］に記載されているヒトβ−アクチンフォワードおよびリバースプライマー。Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。熱サイクル条件は以下のとおりである、９５℃１０分のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＬＤの活性化、次に、９５℃１５秒および６０℃（ネフリン、ｐａｘ２およびβ−アクチンに対して）１分の増幅を４５サイクル。増幅の対数期を検出するために、蛍光レベル（産物の定量化）をそれぞれのサイクルで測定した。蛍光が域値に達したサイクルを記録し、トリプリケート間で平均し、β−アクチンに関する域値の平均サイクルに標準化した。コントロールに対する発現の倍数変化を、全てのサンプルに対して計算した。
【００７４】
同種異系末梢血単核細胞−ＭＳＣ共培養
［２３、２４］に記載されているとおり、修飾され混合された細胞培養物において、健常ボランティア由来の末梢血単核細胞（ＢＰＭＣ）を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Sigma）で分画し、キラー細胞として使用し、同種異系ＭＳＣを刺激細胞として使用した。簡潔には、ｈＧＬ−ＭＳＣを、１００μｌの完全培地において５×１０３細胞／ｍｌで９６−ウェルプレート上にトリプリケートにおいて播種し、１から２時間でプラスチックに付着させた。ＰＢＭＣを５×１０４細胞／ｍｌで再懸濁し、最終濃度２.５μｇ／ｍｌで、マイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、Sigma）の存在または非存在下で、Ｇｌ−ＭＳＣ含有または非含有のウェル（１００μｌの容量）に加えた。Ｇｌ−ＭＳＣ対ＰＢＭＣ比は１：１０であった。ＢＭ由来のヒトＭＳＣを、コントロールとして使用した。培養を１６−４８時間維持し、培養期間後、リンパ球増殖を評価した。
【００７５】
細胞増殖を、製造業者の指示にしたがって酵素免疫吸着アッセイキット（Chemicon International）を使用して、細胞ＤＮＡへの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みとして検出されるＤＮＡ合成により試験した。データは、［２３］に記載されているとおりに計算される刺激指数（ＳＩ）値として示す。該実験は、記載されているそれぞれの時点に対して少なくとも３回行った。
【００７６】
統計分析
データは、３回以上の実験由来の平均±標準偏差として示した。統計的有意性を、両側スチューデントｔ検定により評価した。
【００７７】
インビボ局在試験
本発明者らは、また、本発明の幹細胞集団のヒト腎臓におけるインビボ局在を明らかにするために実験を行った。結果は図４に示されている。糸球体においてＣＤ２４（陽性）を共発現する、ＣＤ１４６（陽性）およびＣＤ１３３（陰性）細胞の存在を、免疫蛍光により試験した。図４に示されるとおり、ＣＤ２４（陽性）を共発現するＣＤ１４６（陽性）細胞を、糸球体（平均２.２２±０.２／糸球体 ｎ＝６０）において検出することができ、これらの細胞はＣＤ１３３陰性であった。さらに、ＣＤ１４６は、内皮細胞により糸球体係蹄内で発現した。ＣＤ１３３（陽性）細胞は、主にボーマン嚢において観察された。
【００７８】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーカーＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）、ＣＤ３４（陰性）およびＣＤ１０５（陽性）により特徴付けられ、少なくとも以下の細胞型、足細胞、内皮細胞およびメサンギウム細胞に分化する能力によりさらに特徴付けられる、単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項２】
さらに骨細胞(osteogenic)、脂肪細胞(adipogenic)および軟骨細胞分化することができる、請求項１に記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項３】
マーカーＣＤ２４およびＰａｘ−２に対して陽性である、請求項１または２に記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項４】
マーカーα−ＳＭＡおよびＯｃｔ−４に対して陰性である、請求項１から３のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項５】
マーカーＣＤ４５に対して陰性である、請求項１から４のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項６】
マーカーＣＤ３１に対して陰性である、請求項１から５のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項７】
ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される間葉系幹細胞の表面マーカー特性に対して陽性である、請求項１から６のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項８】
マーカーＮａｎｏｇおよびＭｕｓａｓｈｉに対して陽性である、請求項１から７のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項９】
ビメンチンおよびネスチンに対して陽性であり、サイトケラチンに対して陰性である、請求項１から８のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１０】
ＭＨＣクラスＩ抗原を構成的に発現し、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に対して陰性である、請求項１から９のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１１】
共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０に対して陰性である、請求項１０に記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）を製造する方法であって、
特定の成長因子の非存在下で生理学的ｐＨで緩衝された血清含有動物細胞培養培地を含む拡大培養培地中で成人腎臓由来の脱嚢(decapsulated)糸球体を培養し、それにより、培養された脱嚢糸球体から増殖した細胞の混合集団を得て、ここに、該細胞の混合集団は、紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞およびＣＤ１３３（陽性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞の両方を含む工程、および
混合集団から紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞を単離し、ここに、該紡錘状細胞ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）は、所望の成人腎臓由来のヒト多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）を表す工程
を含む方法。
【請求項１３】
紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞が少なくとも第３継代の細胞培養物から単離される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞がそれらの紡錘状形態に基づいて単離される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞が細胞選別法により単離される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
医薬としての請求項１から１１のいずれかに記載の単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１７】
再生医療のための医薬としての請求項１６に記載の単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１８】
腎障害または疾患の治療処置のための医薬としての請求項１７に記載の単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１９】
腎糸球体障害または疾患の治療処置のための医薬としての請求項１８に記載の単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項２０】
請求項１から１１のいずれかに記載の単離されたヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤および／またはビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項１】
マーカーＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）、ＣＤ３４（陰性）およびＣＤ１０５（陽性）により特徴付けられ、少なくとも以下の細胞型、足細胞、内皮細胞およびメサンギウム細胞に分化する能力によりさらに特徴付けられる、単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項２】
さらに骨細胞(osteogenic)、脂肪細胞(adipogenic)および軟骨細胞分化することができる、請求項１に記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項３】
マーカーＣＤ２４およびＰａｘ−２に対して陽性である、請求項１または２に記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項４】
マーカーα−ＳＭＡおよびＯｃｔ−４に対して陰性である、請求項１から３のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項５】
マーカーＣＤ４５に対して陰性である、請求項１から４のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項６】
マーカーＣＤ３１に対して陰性である、請求項１から５のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項７】
ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１６６またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される間葉系幹細胞の表面マーカー特性に対して陽性である、請求項１から６のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項８】
マーカーＮａｎｏｇおよびＭｕｓａｓｈｉに対して陽性である、請求項１から７のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項９】
ビメンチンおよびネスチンに対して陽性であり、サイトケラチンに対して陰性である、請求項１から８のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１０】
ＭＨＣクラスＩ抗原を構成的に発現し、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に対して陰性である、請求項１から９のいずれかに記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１１】
共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０に対して陰性である、請求項１０に記載の成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）を製造する方法であって、
特定の成長因子の非存在下で生理学的ｐＨで緩衝された血清含有動物細胞培養培地を含む拡大培養培地中で成人腎臓由来の脱嚢(decapsulated)糸球体を培養し、それにより、培養された脱嚢糸球体から増殖した細胞の混合集団を得て、ここに、該細胞の混合集団は、紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞およびＣＤ１３３（陽性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞の両方を含む工程、および
混合集団から紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞を単離し、ここに、該紡錘状細胞ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）は、所望の成人腎臓由来のヒト多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）を表す工程
を含む方法。
【請求項１３】
紡錘状ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞が少なくとも第３継代の細胞培養物から単離される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞がそれらの紡錘状形態に基づいて単離される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ１３３（陰性）、ＣＤ１４６（陽性）細胞が細胞選別法により単離される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１６】
医薬としての請求項１から１１のいずれかに記載の単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１７】
再生医療のための医薬としての請求項１６に記載の単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１８】
腎障害または疾患の治療処置のための医薬としての請求項１７に記載の単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項１９】
腎糸球体障害または疾患の治療処置のための医薬としての請求項１８に記載の単離された成人腎臓由来の多能性糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）。
【請求項２０】
請求項１から１１のいずれかに記載の単離されたヒト糸球体間葉系幹細胞（ｈＧＬ−ＭＳＣ）ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤および／またはビヒクルを含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５０７３０４（Ｐ２０１２−５０７３０４Ａ）
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３５０９０（Ｐ２０１１−５３５０９０）
【出願日】平成２１年１１月２日（２００９．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６４４６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５２１９２
【国際公開日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【出願人】（５９７０７５９０４）フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (55)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２日（２００９．１１．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６４４６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０５２１９２
【国際公開日】平成２２年５月１４日（２０１０．５．１４）
【出願人】（５９７０７５９０４）フレゼニウス メディカル ケア ドイッチェランド ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (55)
【Ｆターム（参考）】
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