卵母細胞の成熟のためのＩＬ−６−型サイトカインの使用
哺乳動物の卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟に対するいくつかのＩＬ−６型サイトカインの使用について説明する。ｉｎ ｖｉｖｏでの受精プロトコル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ａ．卵巣
哺乳動物の卵巣は、生殖細胞からの成熟卵母細胞の産生、並びに二次性徴の発達及び妊娠の正常な完了を可能にするホルモンの産生に関与している。卵巣は、外側皮質及び内側の脈管髄質（ｖａｓｃｕｌａｒ ｍｅｄｕｌｌａ）に大きく分けられる。卵巣の間質は、発達の様々な段階において卵胞を含む皮質と髄質領域の両方におよぶ。
【０００３】
成熟卵胞は、いくつかの特徴ある細胞型を有する高度に複雑なユニットであり、卵胞液に浸された１つの卵母細胞が存在する流動体で満たされた腔「胞（ａｎｔｒｕｍ）」を囲む体細胞のいくつかの層から成る。卵胞は、卵母細胞の成長と成熟に必要な栄養及び調節シグナルを提供する。
【０００４】
成人の卵巣に存在する卵母細胞は、性腺外部位から性腺隆起に移動して胎児育成期に初期の卵巣を形成する一定数の始原生殖細胞（ＰＧＣ）から発達する。発達中の卵巣内でいったん確立されると、増殖性ＰＧＣは卵原細胞へと分化し始める。卵原細胞は、卵巣中の全ての卵母細胞を生み出す幹細胞である。卵原細胞の集団は、卵原細胞が減数分裂前期に入り卵母細胞になるまで、所定の種特異的な数の有糸分裂周期を経る。減数分裂は前期の複糸期で停止し、そして思春期において卵胞形成が始まるまでその段階にとどまる。減数分裂の停止した一次卵母細胞は、原始卵胞内に含まれている。
【０００５】
ｂ．原始卵胞
原始卵胞は、哺乳動物の卵巣の基本的な発達ユニットである。原始卵胞の数は若年期の間に決定され、それらのほとんどは休止状態にとどまっている。原始卵胞の貯蔵は再生可能でなく、成人の全ての生殖可能寿命を供給する。女性の生殖可能年齢の前及びその間、多くのこれらの原始卵胞は休止状態を離れ、成長を開始する（最初の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ））。卵胞は、ほとんどが閉鎖を経る胞段階へと発達する；しかし、これらの卵胞のいくつかは救助され、排卵前期へ到達する（周期的な動員）。休止している原始卵胞のプールが使い果たされた時に、正常な生殖可能年齢が終結する。
【０００６】
ｃ．卵胞形成
卵胞形成は、排卵卵胞の発達、及び女性の生殖可能年齢における定期的な１又は複数の成熟卵母細胞の放出に関連するプロセスである。卵胞形成は、長い沈静期の後に再開し、卵胞の様々な成分による、逐次的な細胞内変化及び分子的変化を伴う。出生以後の生活において、卵胞は成長、成熟及び排卵若しくは退行（ｒｅｇｒｅｓｓ）し続ける。卵胞は、最初の貯蔵が使い果たされるまで、継続的に動員される。
【０００７】
原始卵胞は活性化され一次卵胞になる。原始卵胞及び一次卵胞と卵母細胞の大きさは顕著に違わないが、一次卵胞の段階で重要な変化が起きている。放線冠は卵母細胞とギャップ結合を発達させ、透明帯が２つの細胞型の間に形成し始める。卵胞が前胞（ｐｒｅａｎｔｒａｌ）段階に達するまで、透明帯は完全には卵母細胞の周りを覆わないだろう。一次卵胞の卵胞細胞が集中的な有糸分裂を経る時に、二次卵胞が出現し始める。二次卵胞は、基底膜の外側に確認される莢膜細胞と共に、顆粒膜細胞の少なくとも２つの層を含み、卵胞は優れた毛細血管網を含む。三次卵胞及び胞状（ａｎｔｒａｌ）卵胞は、胞（ａｎｔｒｕｍ）として知られている空洞の存在により特徴付けられており、卵胞液で満たされている。最初の胞状卵胞は、卵母細胞と顆粒膜細胞との間の栄養及び調節シグナルを移行させることを可能とする、ギャップ結合の広範囲な血管網を有している。胞状卵胞は、それらが排卵前の大きさになるまで発達する。胞状卵胞の中では、卵丘細胞が卵母細胞を覆う。ｉｎ ｖｉｖｏでは、卵母細胞の受精に備えた排卵の終点におけるＬＨ上昇の後に、卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）の拡張が誘導される。
【０００８】
ｄ．卵母細胞の成熟
卵母細胞の成熟は、排卵性ＬＨ上昇に応答して卵母細胞が複糸期から中期第ＩＩ期（核の成熟）へと進行する複雑な現象である。いったん中期第ＩＩ期に到達すると、卵母細胞は受精が起こるまで停滞し、そして卵母細胞は減数分裂を完了し、前核を形成する。卵母細胞の成熟は、受精及び早期胚発生（細胞質の成熟）の援助のために細胞を準備する細胞質レベルの変化も伴う。卵母細胞成熟の最後の段階は、さらなる発達に必要な機能特性の獲得に対して重要である。
【０００９】
ｅ．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精
ヒト卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精（ＩＶＦ）は、女性及び男性の様々な形態の不妊症を克服するのに用いられる広く実用化された医療技術であり、それにより不妊夫婦に対する研究及び処置の膨大な新たな領域が切り開かれている。ＩＶＦの成功にも関わらず、現在のＩＶＦ処置を利用しても５組の夫婦のうち約１組は妊娠を成功させることができないため、不妊処置の改善方法が強く求められている。
【００１０】
ＩＶＦが最初に行われたとき、１つの成熟した未受精卵母細胞が、排卵の直前に卵巣から取り除かれた。成熟卵母細胞は実験室の培養皿（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で受精され、得られた胚は女性の子宮に戻された。しかし、もしより多くの卵母細胞が受精に利用できれば、子宮への移植に利用可能なより多くの胚を得ることができ、そしてこれにより妊娠率が顕著に増加するということが見出された。従って、現在の臨床診療は、およそ２０個の卵母細胞の成熟を誘導するために患者へのホルモン注射を伴う。
【００１１】
標準的なＩＶＦ処置は、女性患者の長期間（例えば、３０日）のホルモン刺激を伴う。この処置は、患者自身の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）を抑制するために、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト又はアンタゴニストを投与することにより開始される。この処置は、多数の排卵前卵胞の発達を確実にするために、外因性ゴナドトロピン（例えば、ＦＳＨ及び／又はＬＨ）の注射へと続く。排卵の直前に、多数のｉｎ ｖｉｖｏで成熟した卵母細胞を卵巣から取り除く。単離された成熟卵母細胞は、その後ｉｎ ｖｉｔｒｏで受精され、そして４〜８細胞期に発達した胚を子宮に移植する前に、典型的に３〜６日間の間培養される。
【００１２】
現在の約２５％〜３５％の全体的な妊娠率を向上させることを目的として、ＩＶＦ処置を最適化及び単純化するために持続的な努力がなされてきた。妊娠率が低いため、妊娠率を上昇させるために２〜５個の胚を移植するのが一般的である。
【００１３】
同時に、多くの卵母細胞の成熟を誘導するためのホルモン注射投与が、排卵誘発（ＣＯＨ）として知られている。ＣＯＨの利点は、受精のための多くのより成熟した卵母細胞が利用可能であるということであり、これは妊娠の機会を増加させる。しかし、ＣＯＨを経た女性は、毎日の子宮超音波検査及び血液ホルモン測定により入念に観察されなければならない。なぜなら、過剰の卵巣刺激は卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）を引き起こす可能性があり、これは重篤な状態であり致命的状態になる可能性がある。ＣＯＨは多くの女性に対して効果的ではなく、一部は多嚢胞性卵巣疾患を伴う。
【００１４】
ｆ．卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟
未成熟卵母細胞が卵母細胞から取り除かれ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させることができれば、ＣＯＨに関連した副作用は避けられる。哺乳動物の卵母細胞は卵胞から取り除かれると自発的成熟を経る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた卵母細胞と同じ核成熟率、受精率及び分裂率を有するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞は、顕著に低い胚盤胞率及び発達能力を有する。
【００１５】
各月経周期の初期に、成熟を経る準備のため及び発生能力（例えば、受精する能力及び健康な胎児に発生する能力）のある状態へ向けて、いくつかの卵母細胞は成長し始める。その周期のおよそ５日目〜７日目までに、１つの卵母細胞が支配的になり成長し続け、一方他の卵母細胞は退化するよう誘導される。いったん１つの卵母細胞が支配的になると、排卵の時点で成熟する前のおよそ一週間の間、それは成長し、代謝性変化を経る。この成長期を経ない卵母細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させ、受精させることができるが、発生能力のある可能性は低い。従って、最も多い数の未成熟卵母細胞を得るための最適な時期は、任意の卵母細胞が退化し始める前のその周期の初期である。しかし、月経周期の初期に取り除きｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞は、発生能力のある可能性が低い。
【００１６】
胞状卵胞内の多くの事象は、卵母細胞の成熟及び発生能力の獲得に影響を与え、以下を含む：（ｉ）卵胞の体細胞（特に、卵丘細胞）と卵母細胞の間の相互作用；（ｉｉ）卵胞液の組成；及び（ｉｉｉ）卵胞環境の温度及び血管分布。これらの因子の多くは、卵胞の大きさ及び卵母細胞の成長とともに変化する。対照的に、ＩＶＭのための培養条件は、卵胞環境にほとんど影響を与えない体細胞に基づいており、そして／或いは、複雑な組成物又は事実上不確定な高分子サプリメントとしての添加物を有する。グルコース、ピルビン酸塩、酸素及びアミノ酸などの典型的にＩＶＭ培地に含まれる代謝物は、卵母細胞の成熟及び能力に特異な影響を与えることが示されてきた。これらの因子の取り扱い及びｉｎ ｖｉｖｏにおける環境に関して得られた知識の適用は、改善されたｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵母細胞の成熟及び全体的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚の産生をもたらすことができる。
【００１７】
ｇ．ＩＬ−６−型サイトカイン
ＩＬ（インターロイキン）−６−型のサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＬＩＦ（白血病阻害因子）、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＣＴ−１（カルジオトロフィン−１）及びＣＬＣ（カルジオトロフィン様サイトカイン）を含む）は、分化、生存、アポトーシス及び増殖に関与する標的遺伝子を活性化する。ＩＬ−６−型サイトカインは、一般的なシグナル伝達レセプター鎖ｇｐ１３０（糖タンパク質 １３０）を含む原形質膜レセプター複合体に結合する。シグナル伝達は、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ）チロシンキナーゼファミリーメンバーの活性化を伴い、ＳＴＡＴ（転写のシグナルトランスデューサ及びアクチベータ）ファミリーの転写因子の活性化を導く。ＩＬ−６−型サイトカインのための別の主なシグナル経路は、ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）カスケードである。
【００１８】
ＩＬ−６−型サイトカインの認識に関与するレセプターは、非シグナル伝達α−レセプター及びシグナル伝達レセプターに細分化することができる。非シグナル伝達α−レセプターとしては、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−１１Ｒα、及びＣＮＴＦＲα（ここでＲはレセプターを指す）が挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達レセプターとしては、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、及びＯＳＭＲが挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達レセプターはＪＡＫと会合し、サイトカインの刺激に応答してチロシンがリン酸化される。ＩＬ−６−型サイトカインのそれぞれは、全ての場合においてｇｐ１３０の少なくとも１つの分子を伴うレセプター動員の、あるプロファイルにより特徴付けられる。
【００１９】
ＩＬ−６、ＩＬ−１１及びＣＮＴＦは、最初にそれらの各α−レセプターサブユニットに特異的に結合する。ここで、サイトカイン及びα−レセプターの複合体だけが、効率的にシグナル伝達レセプターサブユニットを動員する。ＩＬ−６及びＩＬ−１１はｇｐ１３０ホモダイマーによりシグナルを伝達する。ほとんどの他のＩＬ−６型サイトカインは、ｇｐ１３０とＬＩＦＲ（ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１及びＣＬＣ）又はｇｐ１３０とＯＳＭＲ（ＯＳＭ）のいずれかのヘテロダイマーによりシグナルを伝達する。ＯＳＭは２つの異なるレセプター複合体を動員することができる：ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０及びＯＳＭＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマーの両方。ＬＩＦ及びＯＳＭは、追加のα−レセプターサブユニットを必要としないで、直接的にそれらのシグナル伝達レセプターサブユニットに関与する。
【００２０】
１） ＬＩＦ
ＬＩＦは多くの細胞型（胚幹細胞、始原生殖細胞、ニューロン、含脂肪細胞、肝細胞、及び骨芽細胞を含む）において様々な生物学的効果を引き出す。ＬＩＦは、様々な内分泌細胞型（子宮−胎盤ユニット、骨代謝、副腎、卵巣、及び睾丸）に影響を及ぼす。生物活性における多様性は、ＬＩＦの様々な同義物に反映され、それらは幹細胞刺激因子ＩＩＩ（ＨＳＦ ＩＩＩ；Ｂａｕｍａｎｎ及びＷｏｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１１６３，１９８９）；コリン作用性神経分化因子（ＣＮＤＦ；Ｙａｍａｍｏｒｉ他， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１４１２，１９９０）；メラノーマ由来リポタンパク質リパーゼ阻害因子（ＭＬＰＬＩ；Ｍｏｒｉ他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６０：１０８５，１９８９）；ＤＡ細胞のためのヒトインターロイキン（ＨＩＬＤＡ；Ｍｏｒｅａｕ他，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６９０，１９８８）；分化因子（Ｄ−因子；Ｔｏｍｉｄａ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０９７８，１９８４）；分化阻害因子（ＤＩＦ；Ａｂｅ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８９４１，１９８９）；分化阻害活性（ＤＩＡ；Ｓｍｉｔｈ及びＨｏｏｐｅｒ，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１，１９８７）；及び分化遅延因子（ＤＲＦ；Ｋｏｏｐｍａｎ及びＣｏｔｔｏｎ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１５４：２３３，１９８４）を含む。
【００２１】
ＬＩＦは様々な成人及び胚の系の調節において中心的な役割を果たしている。生殖系においては、ＬＩＦは初期の妊娠において重要なサイトカインである。事実、雌性のＬＩＦノックアウトマウスは、胚の着床のプロセスに欠陥があるため不妊である。ＬＩＦはヒト卵胞液中に存在し、そのレベルは胞状卵胞の発達段階に従って調節される。卵胞液中のＬＩＦレベルは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に対しても反応する。未成熟卵胞からではなく成熟卵胞からの培養顆粒膜細胞は、βｈＣＧ（β−ヒトＣＧ）による処理後ＬＩＦ産生の増加を示し、これはＬＩＦが排卵及び最終的な卵母細胞の発達に関与している可能性を示唆している。さらに、ＬＩＦがラットにおいて原始卵胞から一次卵胞への移行を促進することが示された。
【００２２】
ＬＩＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚幹（ＥＣ）細胞及び胚生殖（ＥＧ）細胞の培養において重要な因子でもある。ＥＧ細胞又はＥＳ細胞は、線維芽細胞の支持細胞層において培養した場合、いくつかの細胞により又はＬＩＦの外からの添加により条件培地中で培養した場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞の表現型を保つ。支持細胞の不在下において、条件培地又は外からのＬＩＦ、ＥＳ又はＥＧ細胞は様々な細胞型へと自発的に分化する。
【００２３】
２） ＣＴ−１
ＣＴ−１は心筋細胞の肥大を引き起こし、様々な他の細胞型において多面的な効果を有する。Ｐｅｎｎｉｃａ他（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５ Ｍａｙ ５；２７０（１８）：１０９１５−２２）は、ＣＴ−１がマウスの胚幹細胞の分化を阻害したことを開示する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的アッセイは、ＬＩＦが活性であるアッセイにおいてＣＴ−１が活性であり、逆もまた同じであることを示した。これらのデータは、ＣＴ−１が多種多様の造血活性、ニューロン活性、及び発生活性を有し、そしてＣＴ−１がＬＩＦレセプター及びｇｐ１３０シグナル伝達サブユニットにより作動できることを示した。Ｐｅｎｎｉｃａ他は、ＣＴ−１が多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＬＩＦの効果を模倣するはずであると予測する。
【００２４】
国際公開第９７／３０１４６号は、哺乳動物に胚を導入する前にＣＴ−１を含む培地中で胚を培養することにより、哺乳動物において妊娠の維持を強化する方法を開示いる。国際公開第９７／３０１４６号は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精、胚分割及び核移植などの胚の生存率が低い卵母細胞／胚における初期の操作手順に対して、ＣＴ−１を含む培地が適しているかもしれないことを示唆している。
【００２５】
３） ＯＳＭ
オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）は、Ｔ細胞及びマクロファージの活性化周期の後期に産生される多面的サイトカインであり、その活性化周期はそれに寄与する多くの活性と共に広範囲に特徴付けられている。ＯＳＭは、ヒトメラノーマ細胞株の成長又は発達を阻害する能力に基づいて、ホルボールエステルで処理した組織急性リンパ腫細胞株Ｕ９３７の調節された培地から初めて単離された。
【００２６】
ＯＳＭは３つの細胞表面レセプターに結合する。ＯＳＭはｇｐ１３０ポリペプチドに結合し、ＩＬ−６のシグナル伝達サブユニット（低い親和性を有する）としても知られている。２つ目は、中親和性相互作用であり、ＯＳＭ及びＬＩＦは、低親和性のＬＩＦレセプター及びｇｐ１３０から構成されるレセプターへの結合に対して競合する。この中親和性レセプター複合体は、シグナル伝達及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的効果の発揮が可能である。このレセプター複合体は２つのサイトカインにより共有されるが、相互作用の親和性及び各サイトカインにより送達される生物学的シグナルは異なる。ＯＳＭにより認識される３つ目のレセプターは、他のサイトカインと結合することが知られていない高親和性レセプターである。この高親和性ＯＳＭレセプターは、ｇｐ１３０並びに高親和性及び機能的リガンド−レセプター結合に必要な親和性を変換するサブユニットから構成される。
【００２７】
４） ＩＬ−６
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、線維芽細胞及び内皮細胞などの様々な細胞により産生される多機能性サイトカインである。ＩＬ−６は、造血前駆細胞の増殖及び／又は分化に関連するいくつかの活性を示す。これらの活性は、ＩＬ−６単独の作用、又はＩＬ−３及びＩＬ−４などの他のサイトカインとの組み合わせにおいてもたらされる。ＩＬ−６のいくつかの具体的な生物学的効果としては、Ｂ細胞の最終分化、Ｔ細胞の増殖及び分化、急性期反応の調節、上皮細胞の成長調節、巨核球の分化、並びに血小板産生が挙げられる。これらの活性及び効果に従って、ＩＬ−６に対する標的細胞としては、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄腫細胞、巨核球、単球、初期の幹細胞及び肝細胞が挙げられる。
【００２８】
ＩＬ−６は多機能性サイトカインであるが、それが発揮する様々な生物学的効果は、細胞上の２つの異なるレセプターサブユニットとＩＬ−６との段階的な相互作用により開始されると信じられている。ＩＬ−６は最初に８０ｋＤａのレセプターサブユニットとの複合体を形成する。この複合体は非リガンドサブユニットと結合する。この非リガンドサブユニットはｇｐ１３０と呼ばれる膜糖タンパク質である。ＩＬ−６−８０ｋＤａレセプター複合体のｇｐ１３０との結合は、シグナル伝達をもたらす。
【００２９】
５） ｓＩＬ−６Ｒα
２つの機能的に異なる鎖を含んで成るＩＬ−６に対するレセプター系：リガンド結合鎖（ＩＬ−６Ｒ）及びシグナル伝達以外の非リガンド結合鎖（ｇｐ１３０）。ｇｐ１３０鎖はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体と会合し、高親和性ＩＬ−６結合部位及びシグナル伝達の形成をもたらす。インターロイキン−６レセプター（ｓＩＬ−６Ｒ）の細胞外の可溶形態は、膜に固定されたｇｐ１３０を通してＩＬ−６シグナルを仲介することが示された。
【００３０】
６） ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαキメラ
ｓＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６（ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαキメラ）の複合体は、ＩＬ−６Ｒ−ネガティブ及びＩＬ−６Ｒ−ポジティブ細胞の両方において発現したｇｐ１３０と会合することができる。この会合は、ｇｐ１３０のホモ二量体化及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路の活性化を誘導し、それにより細胞応答を導く。
【発明の開示】
【００３１】
発明の概要
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵母細胞の成熟の方法に関し、ＩＬ−６−型サイトカインを含んだ生理学的に許容される培地において未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る。卵母細胞は、初期の胞状又は胞状卵胞の段階に存在することができる。ＩＬ−６−型サイトカインは、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマー、ＯＳＭＲ−ｇｐ１３０へテロダイマー、及びｇｐ１３０ホモダイマーを含むレセプターと結合することができるが、そのレセプターはこれらに限定されない。ＩＬ−６−型サイトカインは、ＩＬ−１１Ｒα及びＣＮＴＦＲαを含むレセプターと結合することができないが、そのレセプターはこれらに限定されない。ＩＬ−６−型サイトカインは、ＬＩＦ、ＣＴ−１、ＯＳＭ、ＩＬ−６又はＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαであることができる。本発明の実施において使用される培地は、さらにＦＳＨ、ｈＣＧ、又はそれらの組み合わせを含んで成ることができる。或いは、培地はＦＳＨ、ｈＣＧ、又はそれらの組み合わせを含まないことができる。
【００３２】
本発明はまた、ＩＬ−６−型サイトカインを含んだ生理学的に許容される培地において未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される、成熟卵母細胞にも関する。
【００３３】
本発明はまた、成熟卵母細胞と共に精子をインキュベートすることを含んで成るｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精の方法にも関する。ここで、この成熟卵母細胞は、ＩＬ−６−型サイトカインを含んだ生理学的に許容される培地において未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される。
【００３４】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟卵母細胞と共に精子をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される胚にも関する。ここで、この成熟卵母細胞は、ＩＬ−６−型サイトカインを含んだ生理学的に許容される培地において未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される。
【００３５】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟卵母細胞と共に精子をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される胚を移植することを含んで成る不妊症を処置する方法にも関する。ここで、この成熟卵母細胞は、ＩＬ−６−型サイトカインを含んだ生理学的に許容される培地において未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される。
【００３６】
発明の詳細な説明
上記のように、卵形成のプロセスは、胚の構成のための資源の大きく且つ複雑な資質を含む卵母細胞の構成に関する、極めて複雑なプロセスである。
【００３７】
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟
本発明は、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟のためのいくつかのＩＬ−６−型サイトカインの使用に関する。
【００３８】
ａ．卵母細胞
卵母細胞が発達の段階である間に、本発明の実施において使用する未成熟卵母細胞は雌性から取り出される。発達の段階としては、初期の胞状卵胞及び胞状卵胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
未成熟卵母細胞は、外部ホルモン治療を経ていない雌性から取り出すことができる。或いは、未成熟卵母細胞は、外部ホルモン治療を経た雌性から取り出すことができる。雌性にホルモンを注射することができ、そのホルモンとしてはＧｎＲＨ、ＦＳＨ、ＬＨ又はｈＣＧが挙げられるが、これらに限定されない。ホルモンは組み合わせて投与することができ、又は任意の順序で逐次的に投与することができる。
【００４０】
未成熟卵母細胞は、超音波検査及び吸引を含む方法により雌性から取り出すことができるが、方法はこれらに限定されない。未成熟卵母細胞は、単離後低温保存することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟の後に温めることができる。
【００４１】
ｂ．成熟
単離し未成熟卵母細胞を、いくつかのＩＬ−６−型サイトカインを含む培地中でインキュベートする。培地は、任意の生理学的に許容される培地であることができる。生理学的に許容される培地としては、ＴＣＭ１９９、ａＭＥＭ及びＨａｍ'ｓ Ｆ１０が挙げられるが、これらに限定されない。培地は、さらに他の因子を含むことができる。他の因子としては、ＦＳＨ、ｈＣＧ、エストラジオール、システアミン、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、及びオートログア（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｒ）の加熱不活性化血清又は卵胞液が挙げられるが、これらに限定されない。培地は、ＦＳＨ、ｈＣＧ、エストラジオール、システアミン、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、及びオートログア（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｒ）の加熱不活性化血清又は卵胞液又はそれらの組み合わせとともに、ＩＬ−６−型サイトカインを含むことができる。培地は、いくつかのＩＬ−６−型サイトカインを含むこともでき、そしてＦＳＨ及び／又はｈＣＧを欠くこともできる。
【００４２】
未成熟卵母細胞を、培地中において、約３７℃〜約３９℃を含む（これに限定されない）温度で、約６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６又は７２時間を含む（これらに限定されない）時間の間インキュベートする。成熟が起こって、卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）、卵丘拡張（ｃｕｍｕｌｕｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、分裂中期ＩＩプレート（ｐｌａｔｅ）形成（ＭＩＩ）、極体放出の顕微鏡での目視検査を含む（これらに限定されない）方法によって明らかとなるまで、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精及び胚産生により機能的に試験されて成熟が起こるまで、卵母細胞をインキュベートする。
【００４３】
ｃ．胚産生
標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精方法を用いて、成熟卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで精子とともにインキュベートし、哺乳動物の胚を産生することができる（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｇａｒｄｎｅｒ他編，２００１年 Ｍａｒｔｉｎ Ｌｄｕｎｅｔｚ Ｌｔｄ，ロンドン）を参照されたい）。胚を、予定日まで胚をはらませておくことのできる雌性の子宮に移植することができる。
【００４４】
２．ＩＬ−６サイトカイン
本発明の実施において使用されるＩＬ−６−型サイトカインとしては、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマー、ＯＳＭＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマー、及びｇｐ１３０ホモダイマーに結合するサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施に使用されるＩＬ−６−型サイトカインとしては、ＩＬ−１１Ｒα、及びＣＮＴＦＲαに結合しないサイトカインも挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
ＩＬ−６−型サイトカインは、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤと呼ばれる４つの長いａ−へリックスを含んで成るヘリックス束サイトカインのサブファミリーである。このＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、上−上−下−下のトポロジーに導く方法で配置されている。全てのヘリクスが直線であるＩＬ−６そして恐らくＩＬ−１１とも対照的に（ｉｎ ｃｏｎｔｒａｃｔ ｗｉｔｈ）、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＮＴＦのＡヘリックスはねじれている。直線のサイトカインはｇｐ１３０ホモダイマーによってシグナル伝達をすることができるのに対して、ねじれたサイトカインはＬＩＦＲ−ｇｐ１３０又はＯＳＭＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマーによってシグナル伝達をすることができる。本発明の実施において使用されるＩＬ−６−型サイトカインとしては、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ−１及びＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａキメラ、並びにＩＬ−６−型サイトカインの生物活性を保持するそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、変異形及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書中で用いられているように、「アナログ」という用語は、ＩＬ−６−型サイトカインとの関係で用いられる場合、１又は複数の非標準的アミノ酸又は他の慣用的な一連のアミノ酸の構造変異形を含む、ペプチド又はポリペプチド意味する。
【００４７】
本明細書中で用いられているように、「誘導体」という用語は、ＩＬ−６−型サイトカインとの関係で用いられる場合、一次構造以外が異なるペプチド又はポリペプチドを意味する（アミノ酸及びアミノ酸アナログ）。例として、誘導体は、翻訳後修飾の１つの形態であるグリコシル化により異なり得る。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、異種系での発現によりグリコシル化パターンを示し得る。少なくとも１つの生物活性が保持されていれば、これらのペプチド又はポリペプチドは本発明の誘導体である。他の誘導体としては、共有結合的に修飾されたＮ−末端若しくはＣ−末端を有する融合ペプチド又は融合ポリペプチド、ＰＥＧ化ペプチド又はポリペプチド、脂質部分と会合したペプチド又はポリペプチド、アルキル化ペプチド又はポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基を介して他のペプチド、ポリペプチド若しくは化学物質と結合したペプチド又はポリペプチド、及び当業界で理解されるだろう付加的修飾体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書中で用いられているように、「フラグメント」という用語は、ＩＬ−６−型サイトカインとの関係で用いられる場合、約８〜約５０アミノ酸長のペプチドを意味する。フラグメントは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０アミノ酸長であることができる。
【００４９】
本明細書中で用いられているように、「ホモログ」という用語は、ＩＬ−６−型サイトカインとの関係で用いられる場合、共通の進化論的原種(ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｃｅｓｔｏｒ)を共有するペプチド又はポリペプチドを意味する。
【００５０】
本明細書中で用いられているように、「変異形」という用語は、ＩＬ−６−型サイトカインとの関係で用いられる場合、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なる（しかし、少なくとも１つの生物活性を保持する）ペプチド又はポリペプチドを意味する。本発明の目的に対しては、「生物活性」としては、特異的抗体により結合される能力が挙げられるが、これに限定されない。
【００５１】
アミノ酸の保存的置換、すなわちアミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸と置換することは、当業界では典型的に小さな変化を伴うものとして認識されている。当業界で理解されているように、アミノ酸のハイドロパシックインデックスを考慮することにより、これらの小さな変化は部分的に同一視され得る。Ｋｙｔｅ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシックインデックスは、その疎水性及び電荷の考慮に基づいている。当業界では、類似のハイドロパシックインデックスのアミノ酸は置換することができ、タンパク質の機能をなお維持できることが知られている。１つの側面において、∀２のハイドロパシックインデックスを有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質が生じるであろう置換を明らかにするのに利用することもできる。ペプチド中のアミノ酸の親水性を考慮することにより、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の計算が可能である。局所的平均親水性は、抗原性及び免疫原性と関連すると報告されている有用な尺度である。米国特許第４,５５４,１０１号が本明細書中で引用文献として組み込まれている。当業界で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、例えば免疫原性などの生物活性を保持するペプチドを生じさせることができる。１つの実施態様において、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて置換を行う。アミノ酸の疎水性指数及び親水性値は両者とも、アミノ酸の特定の側鎖により影響される。その観察と一致して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、アミノ酸、特にアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存することが理解される。その類似性は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、及び他の特性により明らかにされる。
【００５２】
さらに、コンピューターアルゴリズムは、水性溶媒が接近できそうなアミノ酸配列ドメインの予測を補助するのに利用できる。これらのドメインは、しばしばペプチドの外側に向かって配置されることが当業界において知られており、それにより抗原決定基を含む結合決定基に寄与し得る。
【００５３】
本発明は多数の側面を有しており、以下の非制限的な実施例により明らかにされる。
【実施例】
【００５４】
実施例１
卵丘−卵母細胞複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張におけるＬＩＦの効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるマウスＣＯＣの卵丘拡張を誘導するＬＩＦの能力について試験した。７〜８週齢のＣＤ−１雌性マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、ＰＭＳＧ（５ ＩＵ／雌性、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で刺激した。これらの雌性を、進行性の低酸素症により４８時間後に屠殺した。動物の腹部を消毒し、そしてまた髪によるサンプルの汚染を減少させるために、アルコール（７０％）をその部分に適用した。腹腔を曝露させるために、腹部の切開を行った。卵管と連結している卵巣を子宮角及び内臓の脂肪組織から切り離した。１０個の卵巣を、３ｍｌのＬ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ）と１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、３７℃で保存した。
【００５５】
各チューブの中身をその後６０×１５ｍｍのペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）に移した。サーモプレート加熱ステージを用いて、立体顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＳＭ２−８００）の下で、ハサミ又は２７ゲージの注射針を用いて、卵巣から脂肪パッド（ｆａｔｔｙ ｐａｄ）及び卵管を取り除いた。次に、取り除いた卵巣を２〜３ｍｌの新たな培地（Ｌ１５＋１０％ＦＣＳ）で満たした新たなペトリ皿の中に置いた。
【００５６】
針を用いた各卵巣の機械的な破裂により、ＣＯＣを回収し、新たな培地（Ｌ１５＋１０％ＦＣＳ）で満たした新たな３５×１０ｍｍのペトリ皿に置いた。低倍率（２０〜３０×）の立体顕微鏡を用いて、細胞質が均質であることを基に、卵丘が無傷の卵母細胞を選択した。ミネラルオイルを含まない９０μｌの培地（１０％ＦＣＳ及びＰｅｎＳｔｒｅｐ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を含む、αＭＥＭ［Ｇｉｂｃｏ］）を含んだ９６−ウエルプレートの各ウエルに、２つのＣＯＣをマウスガラスピペット（ｍｏｕｔｈ ｇｌａｓｓ ｐｉｐｅｔ）により移した。９６−ウエルプレートへのＣＯＣの添加の前に、プレート中の培地を、５％のＣＯ2を含む加湿インキュベーター中において３７℃で１時間の間予め平衡化した。各ウエルへのＣＯＣの添加後に、体積が１０μｌの異なるロットのＬＩＦを添加し、各ウエルの最終体積を１００μｌとした。各９６−ウエルプレートは、αＭＥＭ及びＦＣＳを含む４つのウエルの「ネガティブコントロール」と、αＭＥＭ、ＦＣＳ及び５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を含む４つのウエルの「ポジティブコントロール」を含んでいた。アッセイごとに、２つのプレート（複製）を走らせた（ｒｕｎ）。５％のＣＯ2を含む加湿インキュベーター中において３７℃で１８時間、そのプレートをインキュベートした。
【００５７】
次に、Ｎｉｋｏｎ製の倒立顕微鏡を用いて各ＣＯＣの目視検査を行い、卵丘細胞による粘液状細胞外マトリクスの形成を同定した。粘液状細胞外マトリクスは、卵丘拡張の指標である。卵丘拡張の割合は、各処理群において用いた総ＣＯＣに対する拡張したＣＯＣの数として規定した。任意のロットのＬＩＦが５０％超のＣＯＣ拡張を誘導した場合に、それをポジティブとみなし、そして、再確認のアッセイにおいて全ての形態のＬＩＦについて再試験をした。次に、確認されたポジティブロットのＬＩＦを、用量応答試験において評価した。説明されているように用量応答試験を行ったが、ウエルごとに４〜５個のＣＯＣを有する３つのウエルを各濃度のＬＩＦに対して割り当てた。
【００５８】
異なった形態及びロットのＬＩＦに対する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟の比率を表１に示す。試験したほとんどのＬＩＦの形態及びロットは卵丘拡張を誘導した（２０〜１００％の拡張）。試験した濃度でＡＳ９００２２７−１だけが卵丘拡張を誘導しなかった。
【表１】
【００５９】
ＩＶＭ 一次スクリーン（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｃｒｅｅｎ）におけるポッジティブの再確認として、２つのＬＩＦ製剤（ＡＳ９００２３０−１及びＡＳ９００２２７−４）を、２つの商業的形態のＬＩＦ（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ及びＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に対して評価した。再確認ＩＶＭアッセイの結果を表２に示す。
【表２】
【００６０】
ＩＶＭ一次スクリーン及び再確認ＩＶＭアッセイにおけるポジティブな結果に基づいて、ＡＳ９００２３０−７（図１）、ＡＳ９００２３０−１（図２）、ＡＳ９００２２７−１（図３）及びＡｎｔｉｇｅｎｉｘからのＬＩＦ（図４）に対して、用量応答解析を行った。ＡＳ９００２２７−１はＩＶＭ一次スクリーニングにおいて唯一卵丘拡張を誘導できなかったＬＩＦであったが、用量応答様式における用量応答試験においては卵丘拡張を誘導することができた。ＡＳ９００２２７−１による一次スクリーンにおいて５０％拡張におよばなかったのは、希釈に関連する問題に原因があったのかもしれない。
【００６１】
実施例２
卵丘−卵母細胞複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟におけるＣＴ−１及びＯＳＭの効果
ＣＯＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張を誘導するＣＴ−１及びＯＳＭの能力を、実施例１に記載の様式でアッセイした。表３に示すように、マウスＣＴ−１（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ＃２５０−２５、ロット０２１２０３）及びヒトＯＳＭ ＡＳ９０１１６５−１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ＃４９６２６０、ロットＢ３０８６６）は、１μｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌで１００％の卵丘拡張を誘導した。マウスＣＴ−１及びヒトＯＳＭに対するポジティブな結果に基づいて、様々な濃度でＩＶＭアッセイを繰り返し、ヒトＣＴ−１（ＡＳ９００９１５−１）（図５）及びＯＳＭ（ＡＳ９０１１６５−１；図６）の用量応答を判断した。
【表３】
【００６２】
実施例３
ヒトＣＴ−１及びマウスＣＴ−１の比較
マウスＣＴ−１とヒトＣＴ−１の用量応答を比較するために、別のＩＶＭアッセイを行った。表４の結果は、ヒトＣＴ−１及びマウスＣＴ−１が両方ともＣＯＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張を誘導することを示す。
【表４】
【００６３】
実施例４
卵丘−卵母細胞複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟におけるＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒαの効果
実施例１〜３において示すｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＣの卵丘拡張を誘導するＬＩＦ、ＣＴ−１及びＯＳＭの能力に基づいて、ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒαについても試験した。表５の結果は、ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒαがｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張も誘導することを示す。
【表５】
【００６４】
上記の結果に基づいて、追加のＩＶＭアッセイを行い、異なる形態のＩＬ−６の用量応答を判断した（表６）。図７〜８は、比較的高い量のＩＬ−６で緩やかな卵丘拡張が生じることを示している。図９〜１０は、異なる形態のｓＩＬ−６Ｒαに対する用量応答を示している。
【表６】
【００６５】
実施例５
卵丘−卵母細胞複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟におけるＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαの効果
実施例４に示すＣＯＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張を個々に誘導するＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒαの能力に基づいて、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαキメラのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張を誘導する能力を試験した。表７は、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６ＲαキメラがＣＯＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張を誘導できたことを示している。図１１のＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαキメラの用量応答は、このキメラがｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張の誘導において、ＩＬ−６又はｓＩＬ−６Ｒαよりも有力であることを示唆している。さらに、このＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαによる誘導は、より変わりにくい。
【表７】
【００６６】
実施例６
ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞の質におけるＬＩＦの効果
実施例１〜５で示すように、ＩＬ−６−型サイトカインは卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟を誘導し、用量に依存する様式で卵丘拡張を刺激する。次に、受精率、胚盤胞率及び出産率を測定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞の質におけるＩＬ−６−型サイトカインの効果を試験した。
【００６７】
実施例１に記載のように、７〜８週齢のＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊ雌性マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ研究所）からマウスＣＯＣを単離した。上記のように、回収したＣＯＣを、１.５ＩＵ／ｍｌのｒｈＣＧ（組み換えヒト絨毛性ゴナドトロピン）を含有するＩＶＭにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた。異なった日に異なったバッチの卵母細胞を用いて、実験を反復して行った。０.２ＩＵのｒＦＳＨ（組み換えヒト卵胞刺激ホルモン）を含む又は含まない、１０００、１又は０.１ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ アメリカ、ＨＣ８８８３２）の存在下で、卵母細胞を成熟させた。ネガティブコントロール群（ＬＩＦ及びＦＳＨを含まないＩＶＭ培地）及びポジティブコントロール群（ｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた卵母細胞＝排卵された卵母細胞）が含まれた。ＰＭＳＧをマウスに投与し、続いて４８時間後に５ＩＵのｈＣＧ（ｉｐ）を投与することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞を調製した。ｈＣＧで刺激した１８時間後に（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精の日）、その雌性を屠殺し、卵巣及び卵管を取り除いた。機械的な破裂により、拡張したＣＯＣを得た。
【００６８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで成熟させたＣＯＣをｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）培地（３％のＢＳＡ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ［Ｓｉｇｍａ]を添加したＫＳＯＭ）中で洗い、次にミネラルオイルの下の５０μｌのマイクロドロップ中に置いた。次に、２×１０6／ｍｌの濃度で精子を添加した。成体雄性マウスから精巣上体精子懸濁液を調製し、ＩＶＦ培地中で２時間プリインキュベートして受精能獲得を確実にした。精子と卵母細胞を４〜５時間インキュベートし、その後ＣＯＣを取り除き、洗い、卵丘細胞をとって裸にし、ミネラルオイルの下でｉｎ ｖｉｔｒｏ胚培養（ＩＶＣ）培地（０.５％のＦｒａｃｔｉｏｎ Ｖ結晶性ＢＳＡ[Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ]を添加したＫＳＯＭ）の３０μｌのマイクロドロップ中に置き、３７℃の加湿させた５％Ｏ2、５％ＣＯ2及び９０％Ｎ2のインキュベーター中に置いた。
【００６９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精の比率を、２細胞胚の割合に基づいて１日目に測定した。図１２に示すように、ＦＳＨ−ＩＶＭ群と比較して、（１０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ＋ＦＳＨ）−ＩＶＭ群及びｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた群において受精率が顕著に増加した。同様の受精率の増加が、２０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ＋ＦＳＨで見られた（図１３）。ネガティブコントロール（ＦＳＨを含まないＩＶＭ培地）と比較して、ＬＩＦ（１０００又は１ｎｇ／ｍｌ）単独でも、受精率が顕著に増加した（図１２）。
【００７０】
胚盤胞の割合に基づいて４日目に胚発生の比率を測定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精率の結果と同様に、ＦＳＨ−ＩＶＭ群と比較して、（１０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ＋ＦＳＨ）−ＩＶＭ群及びｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた群は胚盤胞率の顕著な増加を示した（図１４）。同様の胚盤胞率の増加が、２０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ＋ＦＳＨで見られた（図１５）。さらに、ネガティブコントロール（ＦＳＨを含まないＩＶＭ培地）と比較して、ＬＩＦ（１０００又は１ｎｇ／ｍｌ）単独でも、胚盤胞率が顕著に増加した（図１４）。
【００７１】
２細胞胚ごとの胚盤胞の総数を決定することによっても、胚発生の比率を測定した。図１６で示されるように、ＬＩＦ及びＦＳＨの存在下で成熟させた卵母細胞を有する全ての群に対して並びにｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた群において、およそ８０％の２細胞胚が胚盤胞へと発達した。ＬＩＦだけを用いて成熟させた卵母細胞を用いた群は、同様の結果であった。ネガティブコントロール（−ＦＳＨ）では胚盤胞は存在しなかった。その比率は、ＦＳＨ及び０.１ｎｇ／ｍｌのＬＩＦを用いた群に対して非常に変わりやすかった。
【００７２】
８〜１２週齢のＣＤ１ ２．５日偽妊娠雌性（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の子宮角へ４日目の胚を外科的に移植することにより、異なる実験群に対する出産率を測定した。ＦＳＨ及び１０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦを含む培地中においてｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞から産生した胚は、コントロール群（ＦＳＨ単独）よりも高い出産率（０.０５＜ｐ＜０.０７）を有し、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた群と同じであった（ｐ＞０.０５）（図１７）。同様の出産率の増加が、２０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ＋ＦＳＨで見られた（図１８）。さらに、妊娠率はＦＳＨ＋１０００ｎｇ／ｍｌＬＩＦで若干高かった（図１７）。
【００７３】
受精率、胚盤胞率及び出産率の増加は、標準的マウスＩＶＭ培地へのＬＩＦの添加が卵母細胞の質を増大させることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、卵丘拡張における ＡＳ９００２３０−７ ＬＩＦの用量応答効果を表す；
【図２】図２は、卵丘拡張におけるＡＳ９００２３０−１ ＬＩＦの用量応答効果を表す；
【図３】図３は、卵丘拡張におけるＡ９００２２７−１ ＬＩＦの用量応答効果を表す；
【図４】図４は、卵丘拡張におけるＬＩＦの用量応答効果を表す；
【図５】図５は、卵丘拡張におけるＡＳ９００９１５−１ ＣＴ−１の用量応答効果を表す；
【図６】図６は、卵丘拡張におけるＡＳ９０１ａ６５−１オンコスタチンの用量応答効果を表す；
【図７】図７は、卵丘拡張におけるＡＳ９０１１６７−１ヒトＩＬ−６の用量応答効果を表す；
【図８】図８は、卵丘拡張におけるＡＳ９０００３８−７ヒトＩＬ−６の用量応答効果を表す；
【図９】図９は、卵丘拡張におけるｓＩＬ−６Ｒαの用量応答効果を表す；
【図１０】図１０は、卵丘拡張におけるＡＳ９００４１９ ＩＬ−６Ｒα（１−３３９）−６Ｈｉｓの用量応答効果を表す；及び
【図１１】図１１は、卵丘拡張におけるＡＳ９０１１６６ ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαキメラの用量応答効果を表す。
【図１２】図１２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精した卵母細胞の比率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１３】図１３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精した卵母細胞の比率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１４】図１４は、胚盤胞形成の総比率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１５】図１５は、胚盤胞形成の総比率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１６】図１６は、２細胞胚からの胚盤胞形成の比率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１７】図１７は、出産率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１８】図１８は、出産率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ａ．卵巣
哺乳動物の卵巣は、生殖細胞からの成熟卵母細胞の産生、並びに二次性徴の発達及び妊娠の正常な完了を可能にするホルモンの産生に関与している。卵巣は、外側皮質及び内側の脈管髄質（ｖａｓｃｕｌａｒ ｍｅｄｕｌｌａ）に大きく分けられる。卵巣の間質は、発達の様々な段階において卵胞を含む皮質と髄質領域の両方におよぶ。
【０００３】
成熟卵胞は、いくつかの特徴ある細胞型を有する高度に複雑なユニットであり、卵胞液に浸された１つの卵母細胞が存在する流動体で満たされた腔「胞（ａｎｔｒｕｍ）」を囲む体細胞のいくつかの層から成る。卵胞は、卵母細胞の成長と成熟に必要な栄養及び調節シグナルを提供する。
【０００４】
成人の卵巣に存在する卵母細胞は、性腺外部位から性腺隆起に移動して胎児育成期に初期の卵巣を形成する一定数の始原生殖細胞（ＰＧＣ）から発達する。発達中の卵巣内でいったん確立されると、増殖性ＰＧＣは卵原細胞へと分化し始める。卵原細胞は、卵巣中の全ての卵母細胞を生み出す幹細胞である。卵原細胞の集団は、卵原細胞が減数分裂前期に入り卵母細胞になるまで、所定の種特異的な数の有糸分裂周期を経る。減数分裂は前期の複糸期で停止し、そして思春期において卵胞形成が始まるまでその段階にとどまる。減数分裂の停止した一次卵母細胞は、原始卵胞内に含まれている。
【０００５】
ｂ．原始卵胞
原始卵胞は、哺乳動物の卵巣の基本的な発達ユニットである。原始卵胞の数は若年期の間に決定され、それらのほとんどは休止状態にとどまっている。原始卵胞の貯蔵は再生可能でなく、成人の全ての生殖可能寿命を供給する。女性の生殖可能年齢の前及びその間、多くのこれらの原始卵胞は休止状態を離れ、成長を開始する（最初の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ））。卵胞は、ほとんどが閉鎖を経る胞段階へと発達する；しかし、これらの卵胞のいくつかは救助され、排卵前期へ到達する（周期的な動員）。休止している原始卵胞のプールが使い果たされた時に、正常な生殖可能年齢が終結する。
【０００６】
ｃ．卵胞形成
卵胞形成は、排卵卵胞の発達、及び女性の生殖可能年齢における定期的な１又は複数の成熟卵母細胞の放出に関連するプロセスである。卵胞形成は、長い沈静期の後に再開し、卵胞の様々な成分による、逐次的な細胞内変化及び分子的変化を伴う。出生以後の生活において、卵胞は成長、成熟及び排卵若しくは退行（ｒｅｇｒｅｓｓ）し続ける。卵胞は、最初の貯蔵が使い果たされるまで、継続的に動員される。
【０００７】
原始卵胞は活性化され一次卵胞になる。原始卵胞及び一次卵胞と卵母細胞の大きさは顕著に違わないが、一次卵胞の段階で重要な変化が起きている。放線冠は卵母細胞とギャップ結合を発達させ、透明帯が２つの細胞型の間に形成し始める。卵胞が前胞（ｐｒｅａｎｔｒａｌ）段階に達するまで、透明帯は完全には卵母細胞の周りを覆わないだろう。一次卵胞の卵胞細胞が集中的な有糸分裂を経る時に、二次卵胞が出現し始める。二次卵胞は、基底膜の外側に確認される莢膜細胞と共に、顆粒膜細胞の少なくとも２つの層を含み、卵胞は優れた毛細血管網を含む。三次卵胞及び胞状（ａｎｔｒａｌ）卵胞は、胞（ａｎｔｒｕｍ）として知られている空洞の存在により特徴付けられており、卵胞液で満たされている。最初の胞状卵胞は、卵母細胞と顆粒膜細胞との間の栄養及び調節シグナルを移行させることを可能とする、ギャップ結合の広範囲な血管網を有している。胞状卵胞は、それらが排卵前の大きさになるまで発達する。胞状卵胞の中では、卵丘細胞が卵母細胞を覆う。ｉｎ ｖｉｖｏでは、卵母細胞の受精に備えた排卵の終点におけるＬＨ上昇の後に、卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）の拡張が誘導される。
【０００８】
ｄ．卵母細胞の成熟
卵母細胞の成熟は、排卵性ＬＨ上昇に応答して卵母細胞が複糸期から中期第ＩＩ期（核の成熟）へと進行する複雑な現象である。いったん中期第ＩＩ期に到達すると、卵母細胞は受精が起こるまで停滞し、そして卵母細胞は減数分裂を完了し、前核を形成する。卵母細胞の成熟は、受精及び早期胚発生（細胞質の成熟）の援助のために細胞を準備する細胞質レベルの変化も伴う。卵母細胞成熟の最後の段階は、さらなる発達に必要な機能特性の獲得に対して重要である。
【０００９】
ｅ．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精
ヒト卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精（ＩＶＦ）は、女性及び男性の様々な形態の不妊症を克服するのに用いられる広く実用化された医療技術であり、それにより不妊夫婦に対する研究及び処置の膨大な新たな領域が切り開かれている。ＩＶＦの成功にも関わらず、現在のＩＶＦ処置を利用しても５組の夫婦のうち約１組は妊娠を成功させることができないため、不妊処置の改善方法が強く求められている。
【００１０】
ＩＶＦが最初に行われたとき、１つの成熟した未受精卵母細胞が、排卵の直前に卵巣から取り除かれた。成熟卵母細胞は実験室の培養皿（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で受精され、得られた胚は女性の子宮に戻された。しかし、もしより多くの卵母細胞が受精に利用できれば、子宮への移植に利用可能なより多くの胚を得ることができ、そしてこれにより妊娠率が顕著に増加するということが見出された。従って、現在の臨床診療は、およそ２０個の卵母細胞の成熟を誘導するために患者へのホルモン注射を伴う。
【００１１】
標準的なＩＶＦ処置は、女性患者の長期間（例えば、３０日）のホルモン刺激を伴う。この処置は、患者自身の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）を抑制するために、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト又はアンタゴニストを投与することにより開始される。この処置は、多数の排卵前卵胞の発達を確実にするために、外因性ゴナドトロピン（例えば、ＦＳＨ及び／又はＬＨ）の注射へと続く。排卵の直前に、多数のｉｎ ｖｉｖｏで成熟した卵母細胞を卵巣から取り除く。単離された成熟卵母細胞は、その後ｉｎ ｖｉｔｒｏで受精され、そして４〜８細胞期に発達した胚を子宮に移植する前に、典型的に３〜６日間の間培養される。
【００１２】
現在の約２５％〜３５％の全体的な妊娠率を向上させることを目的として、ＩＶＦ処置を最適化及び単純化するために持続的な努力がなされてきた。妊娠率が低いため、妊娠率を上昇させるために２〜５個の胚を移植するのが一般的である。
【００１３】
同時に、多くの卵母細胞の成熟を誘導するためのホルモン注射投与が、排卵誘発（ＣＯＨ）として知られている。ＣＯＨの利点は、受精のための多くのより成熟した卵母細胞が利用可能であるということであり、これは妊娠の機会を増加させる。しかし、ＣＯＨを経た女性は、毎日の子宮超音波検査及び血液ホルモン測定により入念に観察されなければならない。なぜなら、過剰の卵巣刺激は卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）を引き起こす可能性があり、これは重篤な状態であり致命的状態になる可能性がある。ＣＯＨは多くの女性に対して効果的ではなく、一部は多嚢胞性卵巣疾患を伴う。
【００１４】
ｆ．卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟
未成熟卵母細胞が卵母細胞から取り除かれ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させることができれば、ＣＯＨに関連した副作用は避けられる。哺乳動物の卵母細胞は卵胞から取り除かれると自発的成熟を経る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた卵母細胞と同じ核成熟率、受精率及び分裂率を有するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞は、顕著に低い胚盤胞率及び発達能力を有する。
【００１５】
各月経周期の初期に、成熟を経る準備のため及び発生能力（例えば、受精する能力及び健康な胎児に発生する能力）のある状態へ向けて、いくつかの卵母細胞は成長し始める。その周期のおよそ５日目〜７日目までに、１つの卵母細胞が支配的になり成長し続け、一方他の卵母細胞は退化するよう誘導される。いったん１つの卵母細胞が支配的になると、排卵の時点で成熟する前のおよそ一週間の間、それは成長し、代謝性変化を経る。この成長期を経ない卵母細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させ、受精させることができるが、発生能力のある可能性は低い。従って、最も多い数の未成熟卵母細胞を得るための最適な時期は、任意の卵母細胞が退化し始める前のその周期の初期である。しかし、月経周期の初期に取り除きｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞は、発生能力のある可能性が低い。
【００１６】
胞状卵胞内の多くの事象は、卵母細胞の成熟及び発生能力の獲得に影響を与え、以下を含む：（ｉ）卵胞の体細胞（特に、卵丘細胞）と卵母細胞の間の相互作用；（ｉｉ）卵胞液の組成；及び（ｉｉｉ）卵胞環境の温度及び血管分布。これらの因子の多くは、卵胞の大きさ及び卵母細胞の成長とともに変化する。対照的に、ＩＶＭのための培養条件は、卵胞環境にほとんど影響を与えない体細胞に基づいており、そして／或いは、複雑な組成物又は事実上不確定な高分子サプリメントとしての添加物を有する。グルコース、ピルビン酸塩、酸素及びアミノ酸などの典型的にＩＶＭ培地に含まれる代謝物は、卵母細胞の成熟及び能力に特異な影響を与えることが示されてきた。これらの因子の取り扱い及びｉｎ ｖｉｖｏにおける環境に関して得られた知識の適用は、改善されたｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵母細胞の成熟及び全体的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚の産生をもたらすことができる。
【００１７】
ｇ．ＩＬ−６−型サイトカイン
ＩＬ（インターロイキン）−６−型のサイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＬＩＦ（白血病阻害因子）、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＣＴ−１（カルジオトロフィン−１）及びＣＬＣ（カルジオトロフィン様サイトカイン）を含む）は、分化、生存、アポトーシス及び増殖に関与する標的遺伝子を活性化する。ＩＬ−６−型サイトカインは、一般的なシグナル伝達レセプター鎖ｇｐ１３０（糖タンパク質 １３０）を含む原形質膜レセプター複合体に結合する。シグナル伝達は、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ）チロシンキナーゼファミリーメンバーの活性化を伴い、ＳＴＡＴ（転写のシグナルトランスデューサ及びアクチベータ）ファミリーの転写因子の活性化を導く。ＩＬ−６−型サイトカインのための別の主なシグナル経路は、ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）カスケードである。
【００１８】
ＩＬ−６−型サイトカインの認識に関与するレセプターは、非シグナル伝達α−レセプター及びシグナル伝達レセプターに細分化することができる。非シグナル伝達α−レセプターとしては、ＩＬ−６Ｒα、ＩＬ−１１Ｒα、及びＣＮＴＦＲα（ここでＲはレセプターを指す）が挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達レセプターとしては、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、及びＯＳＭＲが挙げられるが、これらに限定されない。シグナル伝達レセプターはＪＡＫと会合し、サイトカインの刺激に応答してチロシンがリン酸化される。ＩＬ−６−型サイトカインのそれぞれは、全ての場合においてｇｐ１３０の少なくとも１つの分子を伴うレセプター動員の、あるプロファイルにより特徴付けられる。
【００１９】
ＩＬ−６、ＩＬ−１１及びＣＮＴＦは、最初にそれらの各α−レセプターサブユニットに特異的に結合する。ここで、サイトカイン及びα−レセプターの複合体だけが、効率的にシグナル伝達レセプターサブユニットを動員する。ＩＬ−６及びＩＬ−１１はｇｐ１３０ホモダイマーによりシグナルを伝達する。ほとんどの他のＩＬ−６型サイトカインは、ｇｐ１３０とＬＩＦＲ（ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１及びＣＬＣ）又はｇｐ１３０とＯＳＭＲ（ＯＳＭ）のいずれかのヘテロダイマーによりシグナルを伝達する。ＯＳＭは２つの異なるレセプター複合体を動員することができる：ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０及びＯＳＭＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマーの両方。ＬＩＦ及びＯＳＭは、追加のα−レセプターサブユニットを必要としないで、直接的にそれらのシグナル伝達レセプターサブユニットに関与する。
【００２０】
１） ＬＩＦ
ＬＩＦは多くの細胞型（胚幹細胞、始原生殖細胞、ニューロン、含脂肪細胞、肝細胞、及び骨芽細胞を含む）において様々な生物学的効果を引き出す。ＬＩＦは、様々な内分泌細胞型（子宮−胎盤ユニット、骨代謝、副腎、卵巣、及び睾丸）に影響を及ぼす。生物活性における多様性は、ＬＩＦの様々な同義物に反映され、それらは幹細胞刺激因子ＩＩＩ（ＨＳＦ ＩＩＩ；Ｂａｕｍａｎｎ及びＷｏｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１１６３，１９８９）；コリン作用性神経分化因子（ＣＮＤＦ；Ｙａｍａｍｏｒｉ他， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１４１２，１９９０）；メラノーマ由来リポタンパク質リパーゼ阻害因子（ＭＬＰＬＩ；Ｍｏｒｉ他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６０：１０８５，１９８９）；ＤＡ細胞のためのヒトインターロイキン（ＨＩＬＤＡ；Ｍｏｒｅａｕ他，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６９０，１９８８）；分化因子（Ｄ−因子；Ｔｏｍｉｄａ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０９７８，１９８４）；分化阻害因子（ＤＩＦ；Ａｂｅ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８９４１，１９８９）；分化阻害活性（ＤＩＡ；Ｓｍｉｔｈ及びＨｏｏｐｅｒ，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．１２１：１，１９８７）；及び分化遅延因子（ＤＲＦ；Ｋｏｏｐｍａｎ及びＣｏｔｔｏｎ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１５４：２３３，１９８４）を含む。
【００２１】
ＬＩＦは様々な成人及び胚の系の調節において中心的な役割を果たしている。生殖系においては、ＬＩＦは初期の妊娠において重要なサイトカインである。事実、雌性のＬＩＦノックアウトマウスは、胚の着床のプロセスに欠陥があるため不妊である。ＬＩＦはヒト卵胞液中に存在し、そのレベルは胞状卵胞の発達段階に従って調節される。卵胞液中のＬＩＦレベルは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に対しても反応する。未成熟卵胞からではなく成熟卵胞からの培養顆粒膜細胞は、βｈＣＧ（β−ヒトＣＧ）による処理後ＬＩＦ産生の増加を示し、これはＬＩＦが排卵及び最終的な卵母細胞の発達に関与している可能性を示唆している。さらに、ＬＩＦがラットにおいて原始卵胞から一次卵胞への移行を促進することが示された。
【００２２】
ＬＩＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚幹（ＥＣ）細胞及び胚生殖（ＥＧ）細胞の培養において重要な因子でもある。ＥＧ細胞又はＥＳ細胞は、線維芽細胞の支持細胞層において培養した場合、いくつかの細胞により又はＬＩＦの外からの添加により条件培地中で培養した場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞の表現型を保つ。支持細胞の不在下において、条件培地又は外からのＬＩＦ、ＥＳ又はＥＧ細胞は様々な細胞型へと自発的に分化する。
【００２３】
２） ＣＴ−１
ＣＴ−１は心筋細胞の肥大を引き起こし、様々な他の細胞型において多面的な効果を有する。Ｐｅｎｎｉｃａ他（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５ Ｍａｙ ５；２７０（１８）：１０９１５−２２）は、ＣＴ−１がマウスの胚幹細胞の分化を阻害したことを開示する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的アッセイは、ＬＩＦが活性であるアッセイにおいてＣＴ−１が活性であり、逆もまた同じであることを示した。これらのデータは、ＣＴ−１が多種多様の造血活性、ニューロン活性、及び発生活性を有し、そしてＣＴ−１がＬＩＦレセプター及びｇｐ１３０シグナル伝達サブユニットにより作動できることを示した。Ｐｅｎｎｉｃａ他は、ＣＴ−１が多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＬＩＦの効果を模倣するはずであると予測する。
【００２４】
国際公開第９７／３０１４６号は、哺乳動物に胚を導入する前にＣＴ−１を含む培地中で胚を培養することにより、哺乳動物において妊娠の維持を強化する方法を開示いる。国際公開第９７／３０１４６号は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精、胚分割及び核移植などの胚の生存率が低い卵母細胞／胚における初期の操作手順に対して、ＣＴ−１を含む培地が適しているかもしれないことを示唆している。
【００２５】
３） ＯＳＭ
オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）は、Ｔ細胞及びマクロファージの活性化周期の後期に産生される多面的サイトカインであり、その活性化周期はそれに寄与する多くの活性と共に広範囲に特徴付けられている。ＯＳＭは、ヒトメラノーマ細胞株の成長又は発達を阻害する能力に基づいて、ホルボールエステルで処理した組織急性リンパ腫細胞株Ｕ９３７の調節された培地から初めて単離された。
【００２６】
ＯＳＭは３つの細胞表面レセプターに結合する。ＯＳＭはｇｐ１３０ポリペプチドに結合し、ＩＬ−６のシグナル伝達サブユニット（低い親和性を有する）としても知られている。２つ目は、中親和性相互作用であり、ＯＳＭ及びＬＩＦは、低親和性のＬＩＦレセプター及びｇｐ１３０から構成されるレセプターへの結合に対して競合する。この中親和性レセプター複合体は、シグナル伝達及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物学的効果の発揮が可能である。このレセプター複合体は２つのサイトカインにより共有されるが、相互作用の親和性及び各サイトカインにより送達される生物学的シグナルは異なる。ＯＳＭにより認識される３つ目のレセプターは、他のサイトカインと結合することが知られていない高親和性レセプターである。この高親和性ＯＳＭレセプターは、ｇｐ１３０並びに高親和性及び機能的リガンド−レセプター結合に必要な親和性を変換するサブユニットから構成される。
【００２７】
４） ＩＬ−６
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、線維芽細胞及び内皮細胞などの様々な細胞により産生される多機能性サイトカインである。ＩＬ−６は、造血前駆細胞の増殖及び／又は分化に関連するいくつかの活性を示す。これらの活性は、ＩＬ−６単独の作用、又はＩＬ−３及びＩＬ−４などの他のサイトカインとの組み合わせにおいてもたらされる。ＩＬ−６のいくつかの具体的な生物学的効果としては、Ｂ細胞の最終分化、Ｔ細胞の増殖及び分化、急性期反応の調節、上皮細胞の成長調節、巨核球の分化、並びに血小板産生が挙げられる。これらの活性及び効果に従って、ＩＬ−６に対する標的細胞としては、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄腫細胞、巨核球、単球、初期の幹細胞及び肝細胞が挙げられる。
【００２８】
ＩＬ−６は多機能性サイトカインであるが、それが発揮する様々な生物学的効果は、細胞上の２つの異なるレセプターサブユニットとＩＬ−６との段階的な相互作用により開始されると信じられている。ＩＬ−６は最初に８０ｋＤａのレセプターサブユニットとの複合体を形成する。この複合体は非リガンドサブユニットと結合する。この非リガンドサブユニットはｇｐ１３０と呼ばれる膜糖タンパク質である。ＩＬ−６−８０ｋＤａレセプター複合体のｇｐ１３０との結合は、シグナル伝達をもたらす。
【００２９】
５） ｓＩＬ−６Ｒα
２つの機能的に異なる鎖を含んで成るＩＬ−６に対するレセプター系：リガンド結合鎖（ＩＬ−６Ｒ）及びシグナル伝達以外の非リガンド結合鎖（ｇｐ１３０）。ｇｐ１３０鎖はＩＬ−６Ｒ／ＩＬ−６複合体と会合し、高親和性ＩＬ−６結合部位及びシグナル伝達の形成をもたらす。インターロイキン−６レセプター（ｓＩＬ−６Ｒ）の細胞外の可溶形態は、膜に固定されたｇｐ１３０を通してＩＬ−６シグナルを仲介することが示された。
【００３０】
６） ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαキメラ
ｓＩＬ−６Ｒ及びＩＬ−６（ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαキメラ）の複合体は、ＩＬ−６Ｒ−ネガティブ及びＩＬ−６Ｒ−ポジティブ細胞の両方において発現したｇｐ１３０と会合することができる。この会合は、ｇｐ１３０のホモ二量体化及びＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路の活性化を誘導し、それにより細胞応答を導く。
【発明の開示】
【００３１】
発明の概要
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵母細胞の成熟の方法に関し、ＩＬ−６−型サイトカインを含んだ生理学的に許容される培地において未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る。卵母細胞は、初期の胞状又は胞状卵胞の段階に存在することができる。ＩＬ−６−型サイトカインは、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマー、ＯＳＭＲ−ｇｐ１３０へテロダイマー、及びｇｐ１３０ホモダイマーを含むレセプターと結合することができるが、そのレセプターはこれらに限定されない。ＩＬ−６−型サイトカインは、ＩＬ−１１Ｒα及びＣＮＴＦＲαを含むレセプターと結合することができないが、そのレセプターはこれらに限定されない。ＩＬ−６−型サイトカインは、ＬＩＦ、ＣＴ−１、ＯＳＭ、ＩＬ−６又はＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαであることができる。本発明の実施において使用される培地は、さらにＦＳＨ、ｈＣＧ、又はそれらの組み合わせを含んで成ることができる。或いは、培地はＦＳＨ、ｈＣＧ、又はそれらの組み合わせを含まないことができる。
【００３２】
本発明はまた、ＩＬ−６−型サイトカインを含んだ生理学的に許容される培地において未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される、成熟卵母細胞にも関する。
【００３３】
本発明はまた、成熟卵母細胞と共に精子をインキュベートすることを含んで成るｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精の方法にも関する。ここで、この成熟卵母細胞は、ＩＬ−６−型サイトカインを含んだ生理学的に許容される培地において未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される。
【００３４】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟卵母細胞と共に精子をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される胚にも関する。ここで、この成熟卵母細胞は、ＩＬ−６−型サイトカインを含んだ生理学的に許容される培地において未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される。
【００３５】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟卵母細胞と共に精子をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される胚を移植することを含んで成る不妊症を処置する方法にも関する。ここで、この成熟卵母細胞は、ＩＬ−６−型サイトカインを含んだ生理学的に許容される培地において未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る方法により産生される。
【００３６】
発明の詳細な説明
上記のように、卵形成のプロセスは、胚の構成のための資源の大きく且つ複雑な資質を含む卵母細胞の構成に関する、極めて複雑なプロセスである。
【００３７】
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟
本発明は、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟のためのいくつかのＩＬ−６−型サイトカインの使用に関する。
【００３８】
ａ．卵母細胞
卵母細胞が発達の段階である間に、本発明の実施において使用する未成熟卵母細胞は雌性から取り出される。発達の段階としては、初期の胞状卵胞及び胞状卵胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
未成熟卵母細胞は、外部ホルモン治療を経ていない雌性から取り出すことができる。或いは、未成熟卵母細胞は、外部ホルモン治療を経た雌性から取り出すことができる。雌性にホルモンを注射することができ、そのホルモンとしてはＧｎＲＨ、ＦＳＨ、ＬＨ又はｈＣＧが挙げられるが、これらに限定されない。ホルモンは組み合わせて投与することができ、又は任意の順序で逐次的に投与することができる。
【００４０】
未成熟卵母細胞は、超音波検査及び吸引を含む方法により雌性から取り出すことができるが、方法はこれらに限定されない。未成熟卵母細胞は、単離後低温保存することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟の後に温めることができる。
【００４１】
ｂ．成熟
単離し未成熟卵母細胞を、いくつかのＩＬ−６−型サイトカインを含む培地中でインキュベートする。培地は、任意の生理学的に許容される培地であることができる。生理学的に許容される培地としては、ＴＣＭ１９９、ａＭＥＭ及びＨａｍ'ｓ Ｆ１０が挙げられるが、これらに限定されない。培地は、さらに他の因子を含むことができる。他の因子としては、ＦＳＨ、ｈＣＧ、エストラジオール、システアミン、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、及びオートログア（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｒ）の加熱不活性化血清又は卵胞液が挙げられるが、これらに限定されない。培地は、ＦＳＨ、ｈＣＧ、エストラジオール、システアミン、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、及びオートログア（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｒ）の加熱不活性化血清又は卵胞液又はそれらの組み合わせとともに、ＩＬ−６−型サイトカインを含むことができる。培地は、いくつかのＩＬ−６−型サイトカインを含むこともでき、そしてＦＳＨ及び／又はｈＣＧを欠くこともできる。
【００４２】
未成熟卵母細胞を、培地中において、約３７℃〜約３９℃を含む（これに限定されない）温度で、約６、１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６又は７２時間を含む（これらに限定されない）時間の間インキュベートする。成熟が起こって、卵核胞崩壊（ＧＶＢＤ）、卵丘拡張（ｃｕｍｕｌｕｓ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、分裂中期ＩＩプレート（ｐｌａｔｅ）形成（ＭＩＩ）、極体放出の顕微鏡での目視検査を含む（これらに限定されない）方法によって明らかとなるまで、又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精及び胚産生により機能的に試験されて成熟が起こるまで、卵母細胞をインキュベートする。
【００４３】
ｃ．胚産生
標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精方法を用いて、成熟卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで精子とともにインキュベートし、哺乳動物の胚を産生することができる（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｇａｒｄｎｅｒ他編，２００１年 Ｍａｒｔｉｎ Ｌｄｕｎｅｔｚ Ｌｔｄ，ロンドン）を参照されたい）。胚を、予定日まで胚をはらませておくことのできる雌性の子宮に移植することができる。
【００４４】
２．ＩＬ−６サイトカイン
本発明の実施において使用されるＩＬ−６−型サイトカインとしては、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマー、ＯＳＭＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマー、及びｇｐ１３０ホモダイマーに結合するサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施に使用されるＩＬ−６−型サイトカインとしては、ＩＬ−１１Ｒα、及びＣＮＴＦＲαに結合しないサイトカインも挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
ＩＬ−６−型サイトカインは、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤと呼ばれる４つの長いａ−へリックスを含んで成るヘリックス束サイトカインのサブファミリーである。このＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、上−上−下−下のトポロジーに導く方法で配置されている。全てのヘリクスが直線であるＩＬ−６そして恐らくＩＬ−１１とも対照的に（ｉｎ ｃｏｎｔｒａｃｔ ｗｉｔｈ）、ＬＩＦ、ＯＳＭ及びＣＮＴＦのＡヘリックスはねじれている。直線のサイトカインはｇｐ１３０ホモダイマーによってシグナル伝達をすることができるのに対して、ねじれたサイトカインはＬＩＦＲ−ｇｐ１３０又はＯＳＭＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマーによってシグナル伝達をすることができる。本発明の実施において使用されるＩＬ−６−型サイトカインとしては、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＴ−１及びＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒａキメラ、並びにＩＬ−６−型サイトカインの生物活性を保持するそれらのフラグメント、アナログ、ホモログ、変異形及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書中で用いられているように、「アナログ」という用語は、ＩＬ−６−型サイトカインとの関係で用いられる場合、１又は複数の非標準的アミノ酸又は他の慣用的な一連のアミノ酸の構造変異形を含む、ペプチド又はポリペプチド意味する。
【００４７】
本明細書中で用いられているように、「誘導体」という用語は、ＩＬ−６−型サイトカインとの関係で用いられる場合、一次構造以外が異なるペプチド又はポリペプチドを意味する（アミノ酸及びアミノ酸アナログ）。例として、誘導体は、翻訳後修飾の１つの形態であるグリコシル化により異なり得る。例えば、ペプチド又はポリペプチドは、異種系での発現によりグリコシル化パターンを示し得る。少なくとも１つの生物活性が保持されていれば、これらのペプチド又はポリペプチドは本発明の誘導体である。他の誘導体としては、共有結合的に修飾されたＮ−末端若しくはＣ−末端を有する融合ペプチド又は融合ポリペプチド、ＰＥＧ化ペプチド又はポリペプチド、脂質部分と会合したペプチド又はポリペプチド、アルキル化ペプチド又はポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基を介して他のペプチド、ポリペプチド若しくは化学物質と結合したペプチド又はポリペプチド、及び当業界で理解されるだろう付加的修飾体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書中で用いられているように、「フラグメント」という用語は、ＩＬ−６−型サイトカインとの関係で用いられる場合、約８〜約５０アミノ酸長のペプチドを意味する。フラグメントは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０アミノ酸長であることができる。
【００４９】
本明細書中で用いられているように、「ホモログ」という用語は、ＩＬ−６−型サイトカインとの関係で用いられる場合、共通の進化論的原種(ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｃｅｓｔｏｒ)を共有するペプチド又はポリペプチドを意味する。
【００５０】
本明細書中で用いられているように、「変異形」という用語は、ＩＬ−６−型サイトカインとの関係で用いられる場合、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なる（しかし、少なくとも１つの生物活性を保持する）ペプチド又はポリペプチドを意味する。本発明の目的に対しては、「生物活性」としては、特異的抗体により結合される能力が挙げられるが、これに限定されない。
【００５１】
アミノ酸の保存的置換、すなわちアミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸と置換することは、当業界では典型的に小さな変化を伴うものとして認識されている。当業界で理解されているように、アミノ酸のハイドロパシックインデックスを考慮することにより、これらの小さな変化は部分的に同一視され得る。Ｋｙｔｅ他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシックインデックスは、その疎水性及び電荷の考慮に基づいている。当業界では、類似のハイドロパシックインデックスのアミノ酸は置換することができ、タンパク質の機能をなお維持できることが知られている。１つの側面において、∀２のハイドロパシックインデックスを有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質が生じるであろう置換を明らかにするのに利用することもできる。ペプチド中のアミノ酸の親水性を考慮することにより、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の計算が可能である。局所的平均親水性は、抗原性及び免疫原性と関連すると報告されている有用な尺度である。米国特許第４,５５４,１０１号が本明細書中で引用文献として組み込まれている。当業界で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、例えば免疫原性などの生物活性を保持するペプチドを生じさせることができる。１つの実施態様において、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて置換を行う。アミノ酸の疎水性指数及び親水性値は両者とも、アミノ酸の特定の側鎖により影響される。その観察と一致して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、アミノ酸、特にアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存することが理解される。その類似性は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、及び他の特性により明らかにされる。
【００５２】
さらに、コンピューターアルゴリズムは、水性溶媒が接近できそうなアミノ酸配列ドメインの予測を補助するのに利用できる。これらのドメインは、しばしばペプチドの外側に向かって配置されることが当業界において知られており、それにより抗原決定基を含む結合決定基に寄与し得る。
【００５３】
本発明は多数の側面を有しており、以下の非制限的な実施例により明らかにされる。
【実施例】
【００５４】
実施例１
卵丘−卵母細胞複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張におけるＬＩＦの効果
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるマウスＣＯＣの卵丘拡張を誘導するＬＩＦの能力について試験した。７〜８週齢のＣＤ−１雌性マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を、ＰＭＳＧ（５ ＩＵ／雌性、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で刺激した。これらの雌性を、進行性の低酸素症により４８時間後に屠殺した。動物の腹部を消毒し、そしてまた髪によるサンプルの汚染を減少させるために、アルコール（７０％）をその部分に適用した。腹腔を曝露させるために、腹部の切開を行った。卵管と連結している卵巣を子宮角及び内臓の脂肪組織から切り離した。１０個の卵巣を、３ｍｌのＬ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ）と１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、３７℃で保存した。
【００５５】
各チューブの中身をその後６０×１５ｍｍのペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）に移した。サーモプレート加熱ステージを用いて、立体顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＳＭ２−８００）の下で、ハサミ又は２７ゲージの注射針を用いて、卵巣から脂肪パッド（ｆａｔｔｙ ｐａｄ）及び卵管を取り除いた。次に、取り除いた卵巣を２〜３ｍｌの新たな培地（Ｌ１５＋１０％ＦＣＳ）で満たした新たなペトリ皿の中に置いた。
【００５６】
針を用いた各卵巣の機械的な破裂により、ＣＯＣを回収し、新たな培地（Ｌ１５＋１０％ＦＣＳ）で満たした新たな３５×１０ｍｍのペトリ皿に置いた。低倍率（２０〜３０×）の立体顕微鏡を用いて、細胞質が均質であることを基に、卵丘が無傷の卵母細胞を選択した。ミネラルオイルを含まない９０μｌの培地（１０％ＦＣＳ及びＰｅｎＳｔｒｅｐ−Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］を含む、αＭＥＭ［Ｇｉｂｃｏ］）を含んだ９６−ウエルプレートの各ウエルに、２つのＣＯＣをマウスガラスピペット（ｍｏｕｔｈ ｇｌａｓｓ ｐｉｐｅｔ）により移した。９６−ウエルプレートへのＣＯＣの添加の前に、プレート中の培地を、５％のＣＯ2を含む加湿インキュベーター中において３７℃で１時間の間予め平衡化した。各ウエルへのＣＯＣの添加後に、体積が１０μｌの異なるロットのＬＩＦを添加し、各ウエルの最終体積を１００μｌとした。各９６−ウエルプレートは、αＭＥＭ及びＦＣＳを含む４つのウエルの「ネガティブコントロール」と、αＭＥＭ、ＦＣＳ及び５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を含む４つのウエルの「ポジティブコントロール」を含んでいた。アッセイごとに、２つのプレート（複製）を走らせた（ｒｕｎ）。５％のＣＯ2を含む加湿インキュベーター中において３７℃で１８時間、そのプレートをインキュベートした。
【００５７】
次に、Ｎｉｋｏｎ製の倒立顕微鏡を用いて各ＣＯＣの目視検査を行い、卵丘細胞による粘液状細胞外マトリクスの形成を同定した。粘液状細胞外マトリクスは、卵丘拡張の指標である。卵丘拡張の割合は、各処理群において用いた総ＣＯＣに対する拡張したＣＯＣの数として規定した。任意のロットのＬＩＦが５０％超のＣＯＣ拡張を誘導した場合に、それをポジティブとみなし、そして、再確認のアッセイにおいて全ての形態のＬＩＦについて再試験をした。次に、確認されたポジティブロットのＬＩＦを、用量応答試験において評価した。説明されているように用量応答試験を行ったが、ウエルごとに４〜５個のＣＯＣを有する３つのウエルを各濃度のＬＩＦに対して割り当てた。
【００５８】
異なった形態及びロットのＬＩＦに対する、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟の比率を表１に示す。試験したほとんどのＬＩＦの形態及びロットは卵丘拡張を誘導した（２０〜１００％の拡張）。試験した濃度でＡＳ９００２２７−１だけが卵丘拡張を誘導しなかった。
【表１】
【００５９】
ＩＶＭ 一次スクリーン（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｃｒｅｅｎ）におけるポッジティブの再確認として、２つのＬＩＦ製剤（ＡＳ９００２３０−１及びＡＳ９００２２７−４）を、２つの商業的形態のＬＩＦ（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ及びＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に対して評価した。再確認ＩＶＭアッセイの結果を表２に示す。
【表２】
【００６０】
ＩＶＭ一次スクリーン及び再確認ＩＶＭアッセイにおけるポジティブな結果に基づいて、ＡＳ９００２３０−７（図１）、ＡＳ９００２３０−１（図２）、ＡＳ９００２２７−１（図３）及びＡｎｔｉｇｅｎｉｘからのＬＩＦ（図４）に対して、用量応答解析を行った。ＡＳ９００２２７−１はＩＶＭ一次スクリーニングにおいて唯一卵丘拡張を誘導できなかったＬＩＦであったが、用量応答様式における用量応答試験においては卵丘拡張を誘導することができた。ＡＳ９００２２７−１による一次スクリーンにおいて５０％拡張におよばなかったのは、希釈に関連する問題に原因があったのかもしれない。
【００６１】
実施例２
卵丘−卵母細胞複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟におけるＣＴ−１及びＯＳＭの効果
ＣＯＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張を誘導するＣＴ−１及びＯＳＭの能力を、実施例１に記載の様式でアッセイした。表３に示すように、マウスＣＴ−１（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ＃２５０−２５、ロット０２１２０３）及びヒトＯＳＭ ＡＳ９０１１６５−１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ＃４９６２６０、ロットＢ３０８６６）は、１μｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌで１００％の卵丘拡張を誘導した。マウスＣＴ−１及びヒトＯＳＭに対するポジティブな結果に基づいて、様々な濃度でＩＶＭアッセイを繰り返し、ヒトＣＴ−１（ＡＳ９００９１５−１）（図５）及びＯＳＭ（ＡＳ９０１１６５−１；図６）の用量応答を判断した。
【表３】
【００６２】
実施例３
ヒトＣＴ−１及びマウスＣＴ−１の比較
マウスＣＴ−１とヒトＣＴ−１の用量応答を比較するために、別のＩＶＭアッセイを行った。表４の結果は、ヒトＣＴ−１及びマウスＣＴ−１が両方ともＣＯＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張を誘導することを示す。
【表４】
【００６３】
実施例４
卵丘−卵母細胞複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟におけるＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒαの効果
実施例１〜３において示すｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＯＣの卵丘拡張を誘導するＬＩＦ、ＣＴ−１及びＯＳＭの能力に基づいて、ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒαについても試験した。表５の結果は、ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒαがｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張も誘導することを示す。
【表５】
【００６４】
上記の結果に基づいて、追加のＩＶＭアッセイを行い、異なる形態のＩＬ−６の用量応答を判断した（表６）。図７〜８は、比較的高い量のＩＬ−６で緩やかな卵丘拡張が生じることを示している。図９〜１０は、異なる形態のｓＩＬ−６Ｒαに対する用量応答を示している。
【表６】
【００６５】
実施例５
卵丘−卵母細胞複合体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟におけるＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαの効果
実施例４に示すＣＯＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張を個々に誘導するＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒαの能力に基づいて、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαキメラのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張を誘導する能力を試験した。表７は、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６ＲαキメラがＣＯＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張を誘導できたことを示している。図１１のＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαキメラの用量応答は、このキメラがｉｎ ｖｉｔｒｏでの卵丘拡張の誘導において、ＩＬ−６又はｓＩＬ−６Ｒαよりも有力であることを示唆している。さらに、このＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαによる誘導は、より変わりにくい。
【表７】
【００６６】
実施例６
ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞の質におけるＬＩＦの効果
実施例１〜５で示すように、ＩＬ−６−型サイトカインは卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟を誘導し、用量に依存する様式で卵丘拡張を刺激する。次に、受精率、胚盤胞率及び出産率を測定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞の質におけるＩＬ−６−型サイトカインの効果を試験した。
【００６７】
実施例１に記載のように、７〜８週齢のＢ６ＣＢＡＦ１／Ｊ雌性マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ研究所）からマウスＣＯＣを単離した。上記のように、回収したＣＯＣを、１.５ＩＵ／ｍｌのｒｈＣＧ（組み換えヒト絨毛性ゴナドトロピン）を含有するＩＶＭにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた。異なった日に異なったバッチの卵母細胞を用いて、実験を反復して行った。０.２ＩＵのｒＦＳＨ（組み換えヒト卵胞刺激ホルモン）を含む又は含まない、１０００、１又は０.１ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ アメリカ、ＨＣ８８８３２）の存在下で、卵母細胞を成熟させた。ネガティブコントロール群（ＬＩＦ及びＦＳＨを含まないＩＶＭ培地）及びポジティブコントロール群（ｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた卵母細胞＝排卵された卵母細胞）が含まれた。ＰＭＳＧをマウスに投与し、続いて４８時間後に５ＩＵのｈＣＧ（ｉｐ）を投与することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞を調製した。ｈＣＧで刺激した１８時間後に（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精の日）、その雌性を屠殺し、卵巣及び卵管を取り除いた。機械的な破裂により、拡張したＣＯＣを得た。
【００６８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで成熟させたＣＯＣをｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）培地（３％のＢＳＡ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ［Ｓｉｇｍａ]を添加したＫＳＯＭ）中で洗い、次にミネラルオイルの下の５０μｌのマイクロドロップ中に置いた。次に、２×１０6／ｍｌの濃度で精子を添加した。成体雄性マウスから精巣上体精子懸濁液を調製し、ＩＶＦ培地中で２時間プリインキュベートして受精能獲得を確実にした。精子と卵母細胞を４〜５時間インキュベートし、その後ＣＯＣを取り除き、洗い、卵丘細胞をとって裸にし、ミネラルオイルの下でｉｎ ｖｉｔｒｏ胚培養（ＩＶＣ）培地（０.５％のＦｒａｃｔｉｏｎ Ｖ結晶性ＢＳＡ[Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ]を添加したＫＳＯＭ）の３０μｌのマイクロドロップ中に置き、３７℃の加湿させた５％Ｏ2、５％ＣＯ2及び９０％Ｎ2のインキュベーター中に置いた。
【００６９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精の比率を、２細胞胚の割合に基づいて１日目に測定した。図１２に示すように、ＦＳＨ−ＩＶＭ群と比較して、（１０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ＋ＦＳＨ）−ＩＶＭ群及びｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた群において受精率が顕著に増加した。同様の受精率の増加が、２０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ＋ＦＳＨで見られた（図１３）。ネガティブコントロール（ＦＳＨを含まないＩＶＭ培地）と比較して、ＬＩＦ（１０００又は１ｎｇ／ｍｌ）単独でも、受精率が顕著に増加した（図１２）。
【００７０】
胚盤胞の割合に基づいて４日目に胚発生の比率を測定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精率の結果と同様に、ＦＳＨ−ＩＶＭ群と比較して、（１０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ＋ＦＳＨ）−ＩＶＭ群及びｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた群は胚盤胞率の顕著な増加を示した（図１４）。同様の胚盤胞率の増加が、２０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ＋ＦＳＨで見られた（図１５）。さらに、ネガティブコントロール（ＦＳＨを含まないＩＶＭ培地）と比較して、ＬＩＦ（１０００又は１ｎｇ／ｍｌ）単独でも、胚盤胞率が顕著に増加した（図１４）。
【００７１】
２細胞胚ごとの胚盤胞の総数を決定することによっても、胚発生の比率を測定した。図１６で示されるように、ＬＩＦ及びＦＳＨの存在下で成熟させた卵母細胞を有する全ての群に対して並びにｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた群において、およそ８０％の２細胞胚が胚盤胞へと発達した。ＬＩＦだけを用いて成熟させた卵母細胞を用いた群は、同様の結果であった。ネガティブコントロール（−ＦＳＨ）では胚盤胞は存在しなかった。その比率は、ＦＳＨ及び０.１ｎｇ／ｍｌのＬＩＦを用いた群に対して非常に変わりやすかった。
【００７２】
８〜１２週齢のＣＤ１ ２．５日偽妊娠雌性（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の子宮角へ４日目の胚を外科的に移植することにより、異なる実験群に対する出産率を測定した。ＦＳＨ及び１０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦを含む培地中においてｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟させた卵母細胞から産生した胚は、コントロール群（ＦＳＨ単独）よりも高い出産率（０.０５＜ｐ＜０.０７）を有し、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟させた群と同じであった（ｐ＞０.０５）（図１７）。同様の出産率の増加が、２０００ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ＋ＦＳＨで見られた（図１８）。さらに、妊娠率はＦＳＨ＋１０００ｎｇ／ｍｌＬＩＦで若干高かった（図１７）。
【００７３】
受精率、胚盤胞率及び出産率の増加は、標準的マウスＩＶＭ培地へのＬＩＦの添加が卵母細胞の質を増大させることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、卵丘拡張における ＡＳ９００２３０−７ ＬＩＦの用量応答効果を表す；
【図２】図２は、卵丘拡張におけるＡＳ９００２３０−１ ＬＩＦの用量応答効果を表す；
【図３】図３は、卵丘拡張におけるＡ９００２２７−１ ＬＩＦの用量応答効果を表す；
【図４】図４は、卵丘拡張におけるＬＩＦの用量応答効果を表す；
【図５】図５は、卵丘拡張におけるＡＳ９００９１５−１ ＣＴ−１の用量応答効果を表す；
【図６】図６は、卵丘拡張におけるＡＳ９０１ａ６５−１オンコスタチンの用量応答効果を表す；
【図７】図７は、卵丘拡張におけるＡＳ９０１１６７−１ヒトＩＬ−６の用量応答効果を表す；
【図８】図８は、卵丘拡張におけるＡＳ９０００３８−７ヒトＩＬ−６の用量応答効果を表す；
【図９】図９は、卵丘拡張におけるｓＩＬ−６Ｒαの用量応答効果を表す；
【図１０】図１０は、卵丘拡張におけるＡＳ９００４１９ ＩＬ−６Ｒα（１−３３９）−６Ｈｉｓの用量応答効果を表す；及び
【図１１】図１１は、卵丘拡張におけるＡＳ９０１１６６ ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαキメラの用量応答効果を表す。
【図１２】図１２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精した卵母細胞の比率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１３】図１３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精した卵母細胞の比率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１４】図１４は、胚盤胞形成の総比率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１５】図１５は、胚盤胞形成の総比率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１６】図１６は、２細胞胚からの胚盤胞形成の比率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１７】図１７は、出産率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【図１８】図１８は、出産率におけるＬＩＦの効果について実証する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−６−型サイトカインを含む生理学的に許容される培地中で未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟のための方法。
【請求項２】
前記卵母細胞が初期の胞状又は胞状卵胞の段階にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＬ−６型サイトカインが、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマー、ＯＳＭＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマー、及びｇｐ１３０ホモダイマーから成る群から選択されるレセプターに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＬ−６型サイトカインが、ＩＬ−１１Ｒα及びＣＮＴＦＲαから成る群から選択されるレセプターに結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−６型サイトカインがＬＩＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＬ−６型サイトカインがＣＴ−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＬ−６型サイトカインがＩＬ−６である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−６型サイトカインがｓＩＬ−６Ｒαである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＬ−６型サイトカインがＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地がＦＳＨ、ｈＣＧ、又はそれらの組み合わせをさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地がＦＳＨ、ｈＣＧ、又はそれらの組み合わせを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載の方法により産生された成熟卵母細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法により産生された成熟卵母細胞と精子をインキュベートすることを含んで成る、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により産生された胚。
【請求項１５】
請求項１４に記載の胚を雌性の子宮に移植することを含んで成る、不妊症を処置する方法。
【請求項１】
ＩＬ−６−型サイトカインを含む生理学的に許容される培地中で未成熟卵母細胞をインキュベートすることを含んで成る、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟のための方法。
【請求項２】
前記卵母細胞が初期の胞状又は胞状卵胞の段階にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＬ−６型サイトカインが、ＬＩＦＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマー、ＯＳＭＲ−ｇｐ１３０ヘテロダイマー、及びｇｐ１３０ホモダイマーから成る群から選択されるレセプターに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＬ−６型サイトカインが、ＩＬ−１１Ｒα及びＣＮＴＦＲαから成る群から選択されるレセプターに結合しない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−６型サイトカインがＬＩＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＬ−６型サイトカインがＣＴ−１である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＬ−６型サイトカインがＩＬ−６である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−６型サイトカインがｓＩＬ−６Ｒαである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＬ−６型サイトカインがＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒαである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地がＦＳＨ、ｈＣＧ、又はそれらの組み合わせをさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地がＦＳＨ、ｈＣＧ、又はそれらの組み合わせを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載の方法により産生された成熟卵母細胞。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法により産生された成熟卵母細胞と精子をインキュベートすることを含んで成る、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により産生された胚。
【請求項１５】
請求項１４に記載の胚を雌性の子宮に移植することを含んで成る、不妊症を処置する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００７−５３５３０３（Ｐ２００７−５３５３０３Ａ）
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４１４７０（Ｐ２００６−５４１４７０）
【出願日】平成１６年１１月２６日（２００４．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３９７５７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５４４４９
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５９９１７７３９６）アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ (70)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月６日（２００７．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２６日（２００４．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３９７５７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５４４４９
【国際公開日】平成１７年６月１６日（２００５．６．１６）
【出願人】（５９９１７７３９６）アプライド リサーチ システムズ エーアールエス ホールディング ナームロゼ フェンノートシャップ (70)
【Ｆターム（参考）】
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