哺乳動物のベータ・ディフェンシンを用いた、関節リウマチの治療
本発明は、哺乳動物のベータ・ディフェンシンを用いた、関節リウマチの治療に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、配列表をコンピューターで読み取り可能な形式で含む。当該コンピュータで読み取り可能な形式は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は、ヒト・ベータ・ディフェンシンの投与による、関節リウマチの予防及び治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
多くの他の成分の中で、先天性免疫の重要な構成成分は、その各々が、かなりの選択性を示すが、共同で速やかに広範囲の細菌、ウィルス、及び真菌を死滅させることができる、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）である。ＡＭＰの生物学的重要性は、天然においてそれらが偏在することによって強調され、そしてそれらは恐らく、全ての多細胞生物によって産生される。ヒトにおいて、重要なＡＭＰはディフェンシンである。ヒトのディフェンシンは、それらの３つの分子内システイン・ジスルフィド結合の形態に基づいて、α−及びβ−ディフェンシンへと分類され得る、小さいカチオン性ペプチドである。α−ディフェンシンは、好中性顆粒から最初に単離されたもの（ＨＮＰ１〜４）、及び小腸の陰窩中のパネート細胞によって発現されるもの（ＨＤ５及びＨＤ６）へとさらに細かく分類され得る。β−ディフェンシンは主に、皮膚、気管、消化管、泌尿生殖器系、腎臓、膵臓、及び乳腺を含む、種々の組織及び器官における上皮細胞によって産生される。β−ディフェンシン・ファミリーの最も特徴付けされたメンバーは、ｈＢＤ１〜３である。しかし、種々のバイオインフォマティクス・ツールを用いて、推定上のβ−ディフェンシン相同体をコードする約４０個のオープン・リーディング・フレームが、ヒトゲノム中でアノテートされた。ヒト・ディフェンシンの幾つかは、恒常的に産生されるが、他のものは、炎症性サイトカイン、又は外因性の微生物産生物によって誘導される。
【０００４】
ヒトのディフェンシン、及びそれらの直接的な抗微生物活性はまた、広い範囲の免疫調節性／代替性特性を有することが次第に明らかとなってきた。これらは、種々のケモカイン及びサイトカインの誘導、走化性及びアポトーシス活性、プロスタグランジンの誘導、ヒスタミン及びロイコトリエンの放出、補体の阻害、トール様受容体のシグナル伝達を通じた樹状細胞成熟の刺激、並びに好中球による病原体の一掃の刺激を含む。さらに、ヒトのディフェンシンはまた、創傷治癒、上皮及び繊維芽細胞の増殖、血管形成、並びに脈管形成において役割を果たす。
【０００５】
ヒトのディフェンシンが、多くの感染性及び炎症性疾患において重要な役割を果たすことに関する証拠が増大している。ヒトのディフェンシンの過剰発現は通常、恐らく微生物成分又は内因性の炎症性サイトカインによる局所的誘導のために、炎症を起こした及び／又は感染した皮膚において観察される。乾癬において、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３は過剰に存在し、そして尋常性座瘡又は表在性毛嚢炎の患者の損傷性上皮において、ｈＢＤ２の上方制御が観察された。他方で、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３の下方制御は、アトピー性皮膚炎に関連する。
【０００６】
関節リウマチは、多くの組織及び器官に影響を及ぼし得るが、主に関節を攻撃して、関節軟骨の破壊、及び関節の強直へと通常進行する炎症性滑膜炎を引き起こす、慢性全身性炎症性疾患である。関節リウマチはまた、肺、心膜、胸膜及び強膜に広汎性炎症を、並びに皮下組織において最も一般的である結節性病変を引き起こし得る。関節リウマチの原因は知られていないが、自己免疫が、その慢性化及び進行に重要な役割を果たす。
【０００７】
発明の詳細な説明
定義
ディフェンシン：本明細書における用語「ディフェンシン」は、抗微生物性ペプチドのディフェンシン類に属するものとして当業者によって認識されるポリペプチドのことである。ポリペプチドが本発明のディフェンシンであるか否か決定するために、無料で利用可能なＨＭＭＥＲソフトウェア・パッケージを使用することによって、アミノ酸配列が、ＰＦＡＭデータベースの隠れマルコフモデル・プロファイル（ＨＭＭプロファイル）と比較され得る。
【０００８】
ＰＦＡＭディフェンシン・ファミリーは、例えばディフェンシン１、又は「哺乳動物のディフェンシン」（受入番号ＰＦ００３２３）、及びディフェンシン・２、又はディフェンシン・ベータ、又は「ベータ・ディフェンシン」（受入番号ＰＦ００７１１）を含む。
【０００９】
本発明のディフェンシンは、ベータ・ディフェンシン類に属する。ベータ・ディフェンシン由来のディフェンシンは、共通の構造的特徴、例えばシステインのパターンを有する。
【００１０】
本発明のディフェンシンの例は、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（ｈＢＤ１；配列番号１を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２；配列番号２を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（ｈＢＤ３；配列番号３を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４（ｈＢＤ２；配列番号４を参照）、及びマウス・ベータディフェンシン３（ｍＢＤ３；配列番号６を参照）を含む。
【００１１】
同一性：２つのアミノ酸配列間の関連性、又は２つのヌクレオチド配列の関連性を、パラメーター「同一性」で記載する。
【００１２】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２７６−２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定される。使用される任意のパラメーターは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」のアウトプットは、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）
【００１３】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，２０００，同上；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，同上）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性」のアウトプットは、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップ総数）
【００１４】
単離されたポリペプチド：本明細書において使用される用語「単離されたバリアント」又は「単離されたポリペプチド」は、源から単離される、バリアント又はポリペプチドのことである。一の態様において、当該バリアント又はポリペプチドは、当該ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定される通り、少なくとも１％純粋、好ましくは少なくとも５％純粋、より好ましくは少なくとも１０％純粋、より好ましくは少なくとも２０％純粋、より好ましくは少なくとも４０％純粋、より好ましくは少なくとも６０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも８０％純粋、そして最も好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００１５】
実質的に純粋なポリペプチド：本明細書において、用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、天然又は組み換えに関連する他のポリペプチド材料を、最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、より好ましくは最大６重量％、より好ましくは最大５重量％、より好ましくは最大４重量％、より好ましくは最大３重量％、さらにより好ましくは最大２重量％、最も好ましくは最大１重量％、そしてより最も好ましくは最大０．５重量％含むポリペプチド調製物を示す。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、当該調製物中に存在する総ポリペプチド材料が少なくとも９２重量％純粋、好ましくは少なくとも９４重量％純粋、より好ましくは少なくとも９５重量％純粋、より好ましくは少なくとも９６重量％純粋、より好ましくは少なくとも９７重量％純粋、より好ましくは少なくとも９８重量％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％純粋、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純粋、そしてさらに最も好ましくは１００重量％純粋であることが好ましい。本発明のポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態で存在する。これは例えば、周知の組み換え法により、又は古典的な精製法により、当該ポリペプチドを精製することによって達成され得る。
【００１６】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン
本発明は、関節リウマチの治療における、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシンの医薬用途に関する。当該治療は、処置された組織におけるＴＮＦ−アルファ活性の減少に好ましくは関連する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び／又は配列番号６のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び／又は配列番号４のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。より好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（配列番号１）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（配列番号３）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４（配列番号４）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４のバリアント（配列番号５）、及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシン３（配列番号６）から成る。さらにより好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（配列番号１）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（配列番号３）、及び／又はヒト・ベータ・ディフェンシン４（配列番号４）から成る。
【００１８】
別の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）から成る。
【００１９】
さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン、及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシン、並びに機能的に等価なそのバリアントから成る。好ましくは、哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、ヒト・ベータ・ディフェンシン４、及びマウス・ベータ・ディフェンシン３、並びに機能的に等価なそのバリアントから成る。より好ましくは、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、及び機能的に等価なそのバリアントから成る。
【００２０】
本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、好ましい実施形態の化合物とも呼ばれる。
【００２１】
本発明に関して、哺乳動物の（例えばヒトの）・ベータ・ディフェンシンの「機能的に等価なバリアント」は、関節リウマチにおいて、親の哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンとほぼ同じ効果を示す、修飾された哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンである。好ましくは、それはまた、ＴＮＦ−アルファ活性において、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンとほぼ同一の効果を示す。
【００２２】
本発明に従って、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンの機能的に等価なバリアントは、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンアミノ酸配列と比較して、１〜５個のアミノ酸修飾、好ましくは１〜４個のアミノ酸修飾、より好ましくは１〜３個のアミノ酸修飾、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸修飾、及び特に１個のアミノ酸修飾を含み得る。
【００２３】
本明細書において、用語「修飾」は、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンの任意の化学修飾を意味する。１又は２以上の修飾は、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入、並びに１又は２以上のアミノ酸側鎖の交換；又は当該アミノ酸配列において類似の特性を有する非天然のアミノ酸の使用であり得る。特に、１又は２以上の修飾は、アミド化、例えばＣ末端のアミド化であり得る。
【００２４】
好ましくは、アミノ酸の修飾は小さい性質のものであり、そしてそれは、ポリペプチドのフォールディング及び／又は活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸置換又は挿入；単一の欠失；小規模なアミノ末端又はカルボキシル末端の伸長；約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド；又は正味電荷を変更することによって精製を容易にする小規模な伸長、或いは別の機能のもの、例えばポリ−ヒスチジンタグ、抗原性エピトープ、又は結合ドメインである。
【００２５】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族性アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、及びメチオニン）の群の内で存在する。特異的な活性を通常変更しないアミノ酸置換は、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。最も一般的に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００２６】
２０個の標準的アミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びアルファ−メチルセリン）は、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードをコードしないアミノ酸、及び非天然アミノ酸は、アミノ酸残基と置換され得る。「非天然アミノ酸」は、タンパク質合成後に修飾され、及び／又は１又は２以上の側鎖において標準的アミノ酸のものとは異なる化学構造を有する。非天然のアミノ酸は、化学的に合成され得、そして好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、並びに３，３−ジメチルプロリンを含む。
【００２７】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンにおける必須のアミノ酸は、当技術分野で既知の手順、例えば部位特異的変異誘発、又はアラニン走査変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）に従って同定され得る。後者の技術において、単一のアラニンの変異は分子内における全ての残基に導入され、そして生じた変異分子は、生物学的活性（すなわち、関節リウマチに対する活性）を試験され、当該分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８も参照のこと。必須のアミノ酸の同一性は、哺乳動物（例えばヒト）のベータ・ディフェンシンに関連するポリペプチドとの同一性の分析からも推測され得る。
【００２８】
単一の又は複数のアミノ酸の置換が、既知の方法の変異誘発、組み換え及び／又はシャッフリングを用いてなされ得、及び試験され得、その後、関連性スクリーニング手順、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号に開示されたものが行われ得る。使用され得る他の方法は、エラー・プローンＰＣＲ、ファージ・ディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域特異的突然変異誘発（ｒｅｇｉｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）を含む。
【００２９】
本発明のポリペプチドのＮ末端の伸長は好適には、１〜５０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、特に３〜１５個のアミノ酸から成り得る。一の実施形態において、Ｎ末端ペプチドの伸長は、Ａｒｇ（Ｒ）を含まない。別の実施形態において、Ｎ末端の伸長は、以下にさらに定義されるｋｅｘ２又はｋｅｘ２様切断部位を含む。好ましい実施形態において、Ｎ末端伸長は、少なくとも２つのＧｌｕ（Ｅ）及び／又はＡｓｐ（Ｄ）アミノ酸残基を含むペプチドであって、例えばＮ末端伸長は以下の配列の一つを含む：ＥＡＥ、ＥＥ、ＤＥ及びＤＤ。
【００３０】
方法、及び用途
ヒト・ベータ・ディフェンシン２は、４１日間コラーゲンで誘導された関節リウマチマウスモデルにおいて、疾患パラメーターの深刻度を著しく減少させ；したがって、関節リウマチ治療のための医薬として、強力な活性を示すことが判明した。
【００３１】
本発明はしたがって、関節リウマチの治療方法を提供し、当該治療は、有効量の哺乳動物のベータ・ディフェンシンを、好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシンを、より好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシン２を、例えば医薬組成物の形態で、当該治療を必要とする対象へ投与することを含む。医薬の製造のための、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシン、より好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシン２がまた、提供され、及び、関節リウマチの治療のための医薬の製造のための、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシン、より好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシン２の使用がまた、提供される。治療は、存在する疾患又は障害の治療、及び疾患又は障害の予防（防止）を含む。
【００３２】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、経腸（例えば口腔、経口、経鼻、直腸）、非経口（例えば静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、若しくは筋肉内）、又は局所（例えば、皮膚上、鼻腔内、若しくは気管内）を含む、任意の従来の経路による投与のために製剤化された組成物で、治療において使用され得る。他の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、持続放出インプラントの一部として投与され得る。
【００３３】
さらに他の実施形態において、好ましい実施形態の組成物は、凍結乾燥物としての安定性を提供する好適な賦形剤を用いて、凍結乾燥物として製剤化され得、その後に再水和される。
【００３４】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンを含む医薬組成物は、従来法に従って、例えば混合、整粒、被覆、溶解、又は凍結乾燥工程によって製剤化され得る。
【００３５】
好ましい実施形態の医薬組成物は、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、並びに医薬として許容される担体、及び／又は希釈剤を含む。
【００３６】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは好ましくは、関節リウマチにおける治療のために有効である量で、好ましくは患者において許容される毒性で、医薬組成物において使用される。かかる治療のために好適な投与量は当然、例えば、使用される本発明の化合物の化学的性質及び薬物動態データ、個々の宿主、投与様式、並びに処置される健康状態の性質及び深刻度によって変化し得る。しかし一般的に、大型哺乳動物、例えばヒトにおける満足な結果のために、望ましい一日用量は、好ましくは約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、及び最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、例えば、１日に１回、２回、３回、又は４回の分割量で投与される。好ましい実施形態の化合物は、大型哺乳動物、例えばヒトへ、従来使用されているものと同様の投与様式で、同様の投与量で投与され得る。
【００３７】
特定の実施形態において、好ましい実施形態の医薬組成物は、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシンを、投与経路に依存して、単位剤形につき、約０．５ｍｇ以下〜約１５００ｍｇ以上の量で含み得、そしてそれは、好ましくは約０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９ｍｇ〜約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｍｇで、及びより好ましくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５ｍｇ〜約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｍｇで含み得る。しかし、特定の実施形態において、上記のものより低い又は高い投与量が好ましいものであり得る。好適な濃度及び投与量は、当業者によって容易に決定され得る。
【００３８】
医薬として許容される担体及び／又は希釈剤は、当業者に既知である。液体溶液として製剤化された組成物に関して、許容される担体及び／又は希釈剤は、生理食塩水及び滅菌水を含み、並びに場合により抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び他の一般的な添加剤を含み得る。当該組成物はまた、丸剤、カプセル、顆粒、タブレット（被覆された、又は被覆されていない）、（注射可能）溶液、固溶体、懸濁液、分散液、固体分散体（例えばアンプル、バイアル、クリーム、ゲル、ペースト、吸入製剤、粉末、フォーム、チンキ剤、リップスティック、ドロップ、スプレー、又は坐剤の形態）として、製剤化され得る。当該製剤は、（哺乳動物のベータ・ディフェンシン、及び他の追加の活性成分に加えて、）担体、賦形剤、砕解剤、フロー・コンディショナー（ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）、糖類及び甘味剤、香料、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節用の塩、緩衝剤、希釈剤、分散剤及び界面活性剤、結合剤、滑剤、並びに／又は当技術分野で既知の他の医薬用賦形剤を含み得る。当業者はさらに、好適な方法で、及び慣例に従って、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９０に記載された方法で、哺乳動物のベータ・ディフェンシンをさらに製剤化し得る。
【００３９】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、単剤で、又は１、２若しくは３以上の他の医薬化合物若しくは薬剤物質を用いた併用療法で、及び／又は１若しくは２以上の医薬として許容される賦形剤と共に使用され得る。
【００４０】
イン・ビトロにおける合成
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、当技術分野で既知の従来法を用いて、イン・ビトロにおける合成によって製造され得る。種々の市販の合成装置が利用可能であり、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｃ．などの自動合成機がある。合成機を用いることによって、天然に存在するアミノ酸は、非天然のアミノ酸、特にＤ−異性体（又はＤ体）、例えばＤ−アラニン、及びＤ−イソロイシン、側鎖が異なる長さ又は官能基を有するジアステレオマーなどと置換され得る。特定の配列及び製造方法は、簡便性、経済性、必要とされる純度などによって決定され得る。
【００４１】
結合のために好都合な官能基、例えば、アミドのための、又は置換アミン形成、例えば還元的アミノ化のためのアミノ基、チオエーテル又はジスルフィド形成のためのチオール基、アミド形成のためのカルボキシル基などを含む種々のペプチド又はタンパク質に、化学結合が提供され得る。
【００４２】
必要に応じて、種々の基が、合成中又は発現中にペプチドへと導入され得、そしてそれらは、他の分子又は表面への結合を可能とする。したがって、システインは、チオエーテルを製造するために使用され得、ヒスチジンは、金属イオン錯体と結合するために使用され得、カルボキシル基はアミド又はエステルを形成するために使用され得、アミノ基はアミドなどを形成するために使用され得る。
【００４３】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンはまた、組み換え合成の従来法に従って、単離され且つ精製され得る。溶解物は、発現宿主から調製され得、そして当該溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティー・クロマトグラフィー、又は他の精製技術を用いて精製され得る。
【００４４】
本発明は、本発明の範囲を限定するものであるとして解釈されるべきではない、以下の実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００４５】
実施例１
コラーゲンで誘導された関節リウマチモデルにおける、ヒト・ベータ・ディフェンシンの評価
ｈＢＤ２の免疫調節効果に関する試験を通じて、ｈＢＤ２が、抗炎症性における大きな潜在力を有することが予想外にも観察された。
【００４６】
本明細書において、我々は、ｈＢＤ２が、コラーゲンで誘導された関節リウマチマウスモデルの治療に大きな効果があることを示した。
【００４７】
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）
ｈＢＤ２を組み換えで産生した。ｈＢＤ２をコードする合成ＤＮＡ断片（ＤＮＡ２．０）を、ｐＥＴ−３２（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローン化した。生じたプラスミドは、Ｎ末端チオレドキシン部位、その後にｈｉｓ−タグ、エンテロキナーゼ切断部位、及び最後にｈＢＤ２ペプチドを含む、翻訳用融合ペプチドをコードした。発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１へと形質転換した。
【００４８】
この株の一晩培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ−グリセロールで１００倍に希釈し、そして３７℃にて約８のＯＤ６００となるように増殖させ、そして０．５ｍＭのＩＰＴＧで３時間誘導し、その後細胞を遠心分離で採取した。ｈｉｓ−タグされたｔｒｘ−ｈＢＤ２融合ペプチドを、標準的手順を用いて、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）上で精製した。ｈｉｓ−タグ精製された融合ペプチドをその後、エンテロキナーゼ緩衝液（５０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１ｍＭ ＣａＣｌ2）中にて一晩透析し、そしてエンテロキナーゼで切断して成熟ｈＢＤ２を放出した。ｈＢＤ２ペプチドを、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ ｍａｔｒｉｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。ｈＢＤ２の正確な分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて確認した。
【００４９】
ｍＢＤ３（実施例５参照）の産生を、同一の手順を用いて行った。
【００５０】
ｈＢＤ２の適切なフォールディング及びジスルフィド架橋形態をその後、ＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲ分光法と連動したトリプシン消化を用いて確認した。
【００５１】
エンドトキシンを分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって低ｐＨにて除去し、そしてエンドトキシンの含有量をＬＡＬアッセイ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＫＴＡ２）によって決定し、そして当該レベルは、当該アッセイの検出限界（０．０５ＥＵ／ｍｇ）未満であることが分かった。エンドトキシンアッセイの検出限界未満のレベルが、ＰＢＭＣを刺激することができないことを確定するために、非常に強力なリポ多糖（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）を用いた刺激の滴定曲線を行った。非常に低レベルのこのＬＰＳ（０．０６ｎｇ／ｍｌ）は、検出可能なサイトカイン産生へとＰＢＭＣを刺激することができた。
【００５２】
以下の試験の目的は、関節リウマチにおける、ヒト・ベータ・ディフェンシン２の抗炎症活性を決定することであった。
【００５３】
試験系
種／系統：マウス／ＤＢＡ／１
源：Ｈａｒｌａｎ、ＵＫ
性別：雄
動物数：ｎ＝５０
年齢：ヤング・アダルト、試験開始時６〜８週齢
体重：本試験で使用される動物の健康状態を、到着時に調べた。良好な健康状態である動物のみを実験条件に順化させ、そして本試験に使用した。
順化：少なくとも７日間
収容：順化及び以下の投与の間、動物をアクセス制限されたげっ歯類施設に収容し、そして床が硬く、寝具材料として木屑を満たしたポリプロピレンのケージ（４５ｃｍ×２５ｃｍ×１３ｃｍ）中で、最大で１０匹のグループで維持した。ケージを１週間に１回変更した。
食餌及び水：動物は、市販のげっ歯類用食餌を適宜提供され、そして、ステンレス鋼のシッパー・チューブ（ｓｉｐｐｅｒ ｔｕｂｅ）を備えたポリプロピレンの容器経由で各々のケージに供給される飲料水へのアクセスは自由であった。水容器を少なくとも３週間に１回変更した。水を、１週間に３回変更した。
環境：温度２０〜２４℃、相対湿度（ＲＨ）３０〜７０％、１２時間／１２時間の明／暗サイクル、及び１時間当たり１０〜３０回の換気を試験室内で維持するように、自動制御される環境条件を設定した。温度及びＲＨを手動測定及び制御コンピューターの両方によって毎日観測した。光のサイクルを制御コンピューターによって観測した。
識別：動物の耳に、固有の動物識別番号を付与した。この番号はまた、各々のケージの前面で視認可能なケージ・カードにも記載された。ケージカードは、試験番号も含んだ。
ランダム化：動物を実験グループにランダムに振り分けた。
終了：試験終了時、生存する動物にＯ2／ＣＯ2を吸入させ、その後放血することにより安楽死させた。
正当化：マウスが本実験動物モデルのために選択された種であることを示すために、マウスを選択した。ＤＢＡ／１系統マウスはコラーゲンで誘導された関節炎（ＣＩＡ）に対して高い感受性を有する。
【００５４】
材料
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）；上記参照
デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｄ１７５６）
ウシＩＩ型コラーゲン（ＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｃａｔ．ｎｏ．８０４００１３１４）
完全フロインドアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）（ＣＦＡ）（ＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃａｔ．ｎｏ．５０１００９７０３）
ＰＢＳ（ＰＡＡ，ｃａｔ ｎｏ．Ｈ１５−００２）
【００５５】
試験グループの構成
【００５６】
【表１】
【００５７】
関節炎の誘導
全ての動物は、試験０日目時点（試験開始時）で、イソフルレンによる浅麻酔下で、プラスチック製シリンジを用いて、０．１ｍｌのＩＩ型コラーゲン／ＣＦＡエマルション（マウス１匹当たり２００μｇのコラーゲン）を、尾に皮内注射された。注射位置は、尾の基部から約１ｃｍ尾側であった。２１日目に、コラーゲン及びＰＢＳのＩＰ注射によって、動物にコラーゲン（２００μｇ／マウス）を投与した。
【００５８】
治療
試験１４日目に治療を開始し、そして１日１回を継続した。全生存マウスは、試験４２日目に終了された。
【００５９】
投与経路：
（ｉ）ｈＢＤ２：静脈内
（ｉｉ）デキサメタゾン：腹腔内
（ｉｉｉ）ビヒクル・コントロール：静脈内
【００６０】
投与量及び体積投与量（表１も参照）：
（ｉ）ｈＢＤ２：５ｍＬ／ｋｇで、１０、１又は０．１ｍｇ／ｋｇ
（ｉｉ）デキサメタゾン：５ｍＬ／ｋｇで、１ｍｇ／ｋｇ
（ｉｉｉ）ビヒクル・コントロール：５ｍＬ／ｋｇで、０ｍｇ／ｋｇ
【００６１】
鎮痛：鎮痛剤は本試験の間使用されなかった。
【００６２】
観察及び検査
関節炎反応
試験０、１４、２１日目において、その後試験終了までに週に５回、末梢関節における炎症性応答の兆候に関して、マウスを検査した。関節炎反応は、以下に示される重症度の昇順における０〜４スケールに従って、各々の足に関して報告された：
【００６３】
【表２】
【００６４】
臨床兆候
０、１４、２１日目において、及びその後試験終了まで週に５回、注意深く臨床試験が行われ、そして記録された。観察は、皮膚、毛、眼、粘膜の変化、分泌物及び排出物の発生（例えば下痢）、並びに自律神経活動（例えば流涙、唾液分泌、立毛、瞳孔の大きさ、呼吸器の異常パターン）における変化を含んだ。歩き方、姿勢の変化、及びハンドリングに対する応答、並びに奇矯な行動の存在、震え、けいれん、睡眠、及び昏睡が同様に記録された。
【００６５】
１４日目より前に、全ての異常行動について、マウスは毎日監視された。
【００６６】
体重
０、１４、２１日目における関節炎誘導の前に、及びその後試験終了までに週に５回の関節炎誘導の前に、速やかに動物の個々の体重の決定を行った。
【００６７】
実験的関節炎の測定
ダイヤルカリパス（Ｋｒｏｅｐｌｉｎ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、試験０、１４、２１日目、及びその後試験終了までの週に５回、各々の動物の両方の後足（左及び右、足蹠の直下、及び踵骨の上）の厚さにおける相対的変化をｍｍで測定した。
【００６８】
試験の終了
全てのマウスは、試験４２日目で終了された。
【００６９】
試料回収
試験終了時に、Ｏ2／ＣＯ2吸入の後、最終的な血液試料を残存する全ての試験動物から得た。各々の試料から血清を調製し、−２０℃で保管した。さらに、左前足及び後足を回収し、ホルマリン中で保管し、そして右前足及び後足を回収し、可能な関節ＲＮＡ分析のために瞬間凍結した。
【００７０】
人道的エンドポイント
瀕死状態と認められた動物、並びに重度の疼痛及び重度の苦痛の兆候の持続を示した動物を人道的に安楽死させた。さらに、初期体重決定から２０％超の体重減少を示した動物を人道的に安楽死させた。全関節炎スコアが１２超であるマウスも、人道的理由により処分した。Ｏ2／ＣＯ2吸入させ、その後放血することによって、全ての動物を安楽死させた。足試料及び最終的な血液試料を全ての試験動物から得た。
【００７１】
統計的分析
評価は主に、関節炎スコア及び足の厚さの測定の平均値に基づいた。必要に応じて、好適な統計方法によるデータの分析が、治療効果の有意性を決定するために適用された。ＡＮＯＶＡ、その後のＴｕｋｅｙ事後分析（Ｗｉｎｓｔａｔ ２００５．１ Ｅｘｃｅｌ用）を、治療群間の統計的差異を評価するために用いた。
【００７２】
内務省の規制に従って、１２又はそれ以上の全臨床スコアを有するマウスを、関節炎の重症性のために処分した。終了時におけるこれらのマウスの臨床スコアは、高スコアのマウスの除去によって当該データが人工的に歪曲されないように、当該試験の残余に関する分析に持ち越された。
【００７３】
動物のケア及び使用の陳述
本試験は、科学的方法における動物の使用に関する、英国内務省の規制に従って行われた。
【００７４】
結果
表２．コラーゲンで誘導された雄ＤＢＡ／１関節炎マウスにおいて、４２日の観察期間中で決定された平均臨床関節炎スコア。*ｐ＜０．０５、ビヒクル群からの有意差
【００７５】
【表３】
【００７６】
結論
関節炎反応は、試験１４日目からの全グループにおいて確認された。ビヒクルで処置されたマウスにおける平均の全関節炎スコア（表２）は、試験４１日目において８．５±０．７２で最大であった。１０ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２で処置されたマウス（グループＣ）における平均関節炎スコアは、２３日目から試験終了時まで、ビヒクル処置されたマウスに比べて低かったが、４１日目でのみ有意であった。
【００７７】
１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２で処置されたマウス（グループＤ）における平均全関節炎スコアは、試験４１日目において５．２±１．１で最大であり、そして２１日目から試験終了時まで、ビヒクル処置群に比べて一貫して低かったが、４０日目でのみ有意であった。０．１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２で処置されたマウス（グループＥ）における処置は、ビヒクル処置群と比較して、平均全関節炎スコアを有意に低下させなかった。このグループにおける平均スコアは、試験４０日目において９．０±０．７７で最大であった。デキサメタゾン処置群（グループＢ）におけるマウスは、試験２６日目から試験終了時まで、ビヒクル処置群に比べて有意に低い関節炎スコアを示した。
【００７８】
関節炎の重症性のために本試験において早期に処分されたマウスの除去がデータを人工的に歪曲しなかったことを保証するために、かかるマウスからの関節炎スコアが試験終了まで、当該分析中に持ち越された。
【００７９】
実施例２
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）の抗炎症活性
ヒトＰＢＭＣ培養中において、ｈＢＤ２を用いた処置が、ＬＰＳ、ＬＴＡ又はペプチドグリカン刺激された培養のサイトカイン・プロファイルにおいて大きな影響を有することが観察された。ｈＢＤ２が炎症性サイトカイン、並びに、ケモカインＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０及びＩＬ−８を誘導することができることは以前に観察されている（Ｎｉｙｏｎｓａｂａ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｂｏｎｉｏｔｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００６）。
【００８０】
本明細書において我々は、ｈＢＤ２が２つの炎症性サイトカイン、ＴＮＦ及びＩＬ−１βに対する下方制御潜在力を有することを；そしてｈＢＤ２がまた、リポポリ多糖（ＬＰＳ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、又はペプチドグリカン（ＰＧＮ）を用いた炎症性刺激の誘導時において、ＩＬ−１０を誘導することを示した。ＩＬ−１０は、潜在的な抗炎症性サイトカインであり、したがって、ｈＢＤ２のもたらす効果は抗炎症性である。これは、ヒトＰＢＭＣ、単球細胞株、及び樹状細胞株（ｄｅｎｄｒｉｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）において観察された。
【００８１】
ｈＢＤ２は、実施例１に記載された通りに調製された。
【００８２】
ＰＢＭＣの単離及び刺激
（デンマークの関連倫理委員会から認定されている）健常者から末梢血を採取した。ヘパリン添加血液をＲＰＭＩで１／１（ｖ／ｖ）で希釈し、そして２時間以内のＦｉｃｏｌｌ密度遠心にかけた。血漿を個々のドナーの上清から回収し、そしてそれが培養培地（自家培養培地）中２％で使用されるまで、氷上で保存した。単離されたＰＢＭＣを自家培養培地中で再度懸濁し、そして９６ウェル培養プレートに、１ウェルあたり２５５．０００個の細胞で、全体で２００μｌとなるようにまいた。１００、１０、又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２を、それ単体で、或いは、０．６ｎｇ／ｍｌ若しくは２０ｎｇ／ｍｌ（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）のＬＰＳ、１．２５μｇ／ｍｌのリポタイコ酸（ＬＴＡ）（Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来，Ｓｉｇｍａ Ｌ３２６５）、又は４０μｇ／ｍｌのペプチドグリカン（ＰＧＮ）（Ｓ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）由来，Ｓｉｇｍａ ７７１４０）と共に用いて、同一ドナー由来のＰＢＭＣを刺激した。刺激のために使用される濃度は、実験初期に３人の異なるドナーにおいて最適化され、ＬＰＳに関しては、２つの異なる濃度が使用されて、調節可能なサイトカインレベル上にあることを確実なものとした。幾つかの実験において、デキサメサゾン及びインドメタシンを、単剤で、及び炎症性サイトカインの下方制御のコントロールとしてのＬＰＳ又はＬＴＡを共に用いてＰＢＭＣを処置した。３７℃で２４時間のインキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインの測定まで−８０℃で貯蔵した。全ての実験において生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＤＡＬＬ１１００）によって測定し、そして幾つかの場合においてはＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって製造業者の使用説明に従って測定し、そして幾つかの実験において、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによって細胞数をカウントすることによって判断した。
【００８３】
ＭＵＴＺ−３の培養及び刺激
ヒト骨髄性白血病由来の細胞株ＭＵＴＺ−３（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ａ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｍ４５２６）中で維持し、２０％［ｖ／ｖ］ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ Ｆ６１７８）、及び４０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２１５−ＧＭ−０５０）を追加した。これらの前駆細胞は以下に示す単球細胞株中に存在し、そしてこれらの単球を、１００、１０又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２を、単剤で、又はＬＰＳ若しくはＬＴＡと共に用いて刺激した。
【００８４】
樹状細胞の分化
樹状細胞株を生じさせるために、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｒｈｌＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ヒト骨髄性白血病細胞株ＭＵＴＺ−３（１×１０5細胞／ｍｌ）を、７日間かけて分化させて未熟ＤＣとした。２〜３日毎に培地を交換した。分化された細胞株を、ＬＰＳ又はＬＴＡのいずれかを用いて、ｈＢＤ２の存在下で及び不在下でさらに刺激して、樹状細胞におけるｈＢＤ２の効果を調べた。
【００８５】
サイトカインの測定
上清中におけるサイトカイン産生を、ＦＡＣＳアレイ・フローサイトメーター上で、ヒト炎症サイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、製造業者の使用説明（ＢＤ）に従って測定した。以下のサイトカインを測定した：ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６。幾つかの実験において、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのＥＬＩＳＡキット（ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β）によって、製造業者の使用説明に従って、サイトカインを測定した。
【００８６】
データ分析
代表的結果が示されるように、全ての実験を少なくとも２回行った。得られたデータを、平均±標準偏差（ＳＤ）として表現した。表の説明文に記載されたように、変数が処置（ｈＢＤ２、デキサメサゾンなど）及び刺激（ＬＰＳ、ＬＴＡ、ペプチドグリカンなど）である２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、その後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことによって統計的有意性を決定した。差は、ｐ＜０．０５で有意であると見なされた。
【００８７】
結果
ＬＰＳ及びＬＴＡで、処理された及び無処理のヒトＰＢＭＣで、ｈＢＤ２の効果を試験した（表３、４及び５）。ｈＢＤ２を用いた処理により、全３つの試験された濃度に関して、刺激された培養においてＴＮＦの有意な下方制御がなされ（表３）、当該下方制御は、０．６ｎｇ／ｍｌのＬＰＳに関して、及びＬＴＡに関して用量依存的であった。ＩＬ−１βに関して、主に最高用量で下方制御が観察された（表４）。興味深いことに、ＩＬ−１０は有意に且つ用量依存的に上方制御された（表５）。炎症性サイトカインの下方制御、及び抗炎症性サイトカインの誘導は、ｈＢＤ２の非常に強い抗炎症潜在力を示す。ｈＢＤ２の抗炎症効果が細胞毒性効果によるものであることを排除するために、生存率を２つの異なるアッセイで測定した。ｈＢＤ２は、細胞において細胞毒性を有さず、観察される効果は、細胞増殖をもたらす、ＬＰＳ又はＬＴＡの刺激による刺激効果であることが、表６及び７において見られる。したがって、ｈＢＤ２は、これらの細胞において細胞毒性効果を有さない。
【００８８】
表８、９及び１０において、別のドナーからの上清は、フローサイトメトリーによるサイトメトリック・ビーズ・アッセイの代わりに、ＥＬＩＳＡによって、サイトカインに関して分析され、同一のことが観察されたが、アッセイの感度がより低く、そして検出限界が非常により高いため、当該効果が有意なものではなかった。
【００８９】
さらに別のＴｏｌｌ様受容体リガンドを試験するために、ペプチドグリカンで刺激されたＰＢＭＣにおけるｈＢＤ２の効果が調べられた（表１１及び１２）。同一のことが観察された：ＴＮＦは用量依存的に下方制御され、そしてＩＬ−１０は用量依存的に誘導された。
【００９０】
ＴＮＦの下方制御のポジティブ・コントロールとして、２つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインドメタシンを、アッセイにおいて試験した。当該化合物が毒性ではなく、且つ培地への溶解性のために達成可能な濃度であるように、濃度は選択された。ＬＴＡを用いた刺激後にのみ、インドメタシンはＴＮＦを阻害したが（表１３）、デキサメタゾンは、ＴＮＦ産生を効果的に下方制御し、同一のことがＩＬ−１βに関して観察された（表１５）。インドメタシンは、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害剤であり、軽度〜中等度の痛みを治療するために使用される非ステロイド系抗炎症剤であり、関節炎症状を緩和するために有用であり、並びにデキサメタゾンは炎症性疾患の治療において第一に使用される合成グルココルチコイドであり、そしてそれは、非常に低用量で、炎症性サイトカインに対して非常に強力な下方制御効果を有し（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９８）、そしてそれを我々は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βに関しても観察した。ｈＢＤ２は、２つの抗炎症性化合物と同じくらい、またはそれらよりも効果的であった。
【００９１】
表１６及び１７において、単球細胞株、及び樹状細胞においてＴＮＦを下方制御する、ｈＢＤ２の効果が示され、同じことがＰＢＭＣに関して観察された。ＩＬ−１０はまた、ｈＢＤ２且つＬＰＳ、又はｈＢＤ２且つＬＴＡで刺激された樹状細胞に関して誘導された（結果は示さず）。
【００９２】
ＬＰＳ又はＬＴＡへのｈＢＤ２の結合がＴＮＦ及びＩＬ−１βの下方制御を引き起こすことを排除するために、合成リガンド（Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ２−ＴＬＲ１リガンド），ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｔｌｒｔ−ｐｍｓ）を用いたＰＭＢＣの刺激に対するｈＢＤ２の効果を試験した。このリガンドを用いた刺激後においても、ｈＢＤ２は下方制御することができ、このことは、ＬＰＳ又はＬＴＡの中和が、観察される効果に関与しないことを示している（結果は示さず）。さらに、ＴＮＦ−α及びＩＬ−αを含有するサイトカイン・カクテル、並びにｈＢＤ２を用いた樹状細胞の刺激は、サイトカイン・カクテル単体を用いた刺激と比較して、ＩＬ−１β、及びＩＬ−８、及びＩＬ−６の下方制御効果を有した。ＴＮＦ−αを用いた刺激のために、ＴＮＦに対する効果を明白に分析することができなかった（結果を示さず）。
【００９３】
表３．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロール（太字）と比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【００９４】
【表４】
【００９５】
表４．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【００９６】
【表５】
【００９７】
表５．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１，**ｐ＜０．０１，*ｐ＜０．５、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【００９８】
【表６】
【００９９】
表６．ＭＴＳアッセイによって測定された、刺激の２４時間後におけるＰＢＭＣ生存率。横列中、異なる下付き文字を有する値は有意差があり、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことで検定された。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
表７．Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅによって測定されたＰＢＭＣ生存率、５人の異なるドナーからの、５つの実験からの、１つの代表的実験。横列中異なる上付き文字を有する値、及び縦列中異なる上付き文字を有する値は有意差があり、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことで検定された。
【０１０２】
【表８】
【０１０３】
表８．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＴＮＦ−アルファ分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０１ｎｇ／ｍｌ、*ｐ＜０．０５、各々のコントロールと比較；**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較。
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
表９．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＩＬ−１０分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０３ｎｇ／ｍｌ。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
表１０．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＩＬ−１β分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０１６ｎｇ／ｍｌ、**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較。
【０１０８】
【表１１】
【０１０９】
表１１．ＰＧＮを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１１０】
【表１２】
【０１１１】
表１２．ＰＧＮを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１１２】
【表１３】
【０１１３】
表１３．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又はＴＮＦ阻害のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に減少した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１１４】
【表１４】
【０１１５】
表１４．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又は抗炎症効果のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に増加した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１１６】
【表１５】
【０１１７】
表１５．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又は抗炎症効果のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に減少した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１１８】
【表１６】
【０１１９】
表１６．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト単球細胞株（ＭＵＴＺ−３）の上清におけるＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*各々のコントロールと比較してｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１２０】
【表１７】
【０１２１】
表１７．（成熟ＤＣを生じさせるために）ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、未成熟樹状細胞の上清におけるＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*各々のコントロールと比較して有意に減少、ｐ＜０．０５、***各々のコントロールと比較して有意に減少、ｐ＜０．０１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１２２】
【表１８】
【０１２３】
実施例３
ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントの抗炎症活性
基本的に実施例２に記載された通りに実施例３を行った。下の表に示した通り、化合物ｒｈＢＤ２は組み換えｈＢＤ２であり、そしてそれは実施例２において使用されたｈＢＤ２と同一である。
【０１２４】
下の表に示した通り、化合物ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントは、化学合成を用いて調製され、そしてＰｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．から得た。
【０１２５】
組み換えｈＢＤ２（ｒｈＢＤ２）のアミノ酸配列は、化学合成により調製されたｈＢＤ２のアミノ酸配列と同一である。
【０１２６】
下の表で示されたｈＢＤ４バリアントは、ｈＢＤ４のアミノ酸３〜３９から成り、そして当該アミノ酸の配列は配列番号５に示した通りである。
【０１２７】
各々の表において、全ての試料は同一のドナーで試験された。ＳＤは標準偏差を意味する。
【０１２８】
結果
表１８．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１２９】
【表１９】
【０１３０】
表１９．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１３１】
【表２０】
【０１３２】
表２０．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１３３】
【表２１】
【０１３４】
ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントの効果を、ＬＰＳで処置された及び処置されていないヒトＰＢＭＣで試験した（表１８、１９及び２０）。比較のために、ｒｈＢＤ２を各々の設定に含めた。
【０１３５】
全てのディフェンシンに関して、ＴＮＦは下方制御された。ＩＬ−１β分泌の減少は、ＴＮＦと同等であったが、ＴＮＦほど顕著ではなかった。ｈＢＤ２及びｈＢＤ４バリアントに関して、ＩＬ−１０の分泌は、有意に且つ用量依存的に上昇した。
【０１３６】
ｈＢＤ３は１０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍｌで試験され、並びにｈＢＤ４バリアントは４０μｇ／ｍｌで試験された；しかし、これらの濃度においていずれの分子も毒性であったために、毒性効果と抗炎症性効果とを区別することができなかった。
【０１３７】
ＴＮＦの下方制御のポジティブ・コントロールとして、２つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインフリキシマブが当該設定中に含まれた。
【０１３８】
結論
全ての試験されたヒト・ベータ・ディフェンシンは、抗炎症潜在力を示した。
【０１３９】
実施例４
ヒトの単球由来樹状細胞及びヒトＰＢＭＣの、ＩＬ−２３の減少
実施例４は、ヒトＰＢＭＣに関して基本的に実施例２で記載された通りに行われた；しかし、読み出しはＴＮＦ、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１０の代わりにＩＬ−２３であった。さらに、ヒトの単球由来樹状細胞におけるｒｈＢＤ２の効果が同様に調べられた。
【０１４０】
単球由来樹状細胞（ＤＣ）の生成
ＤＣは、Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．によって初めに記載された改良手順に従って調製された。簡潔に述べると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）グラジエントをかけた遠心分離によって、健常なドナーの軟膜から精製された。製造業者の使用指示に従った、マグネティックビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による、ＣＤ１４＋細胞の正の選択によって、単球をＰＢＭＣから単離した。ＣＤ１４＋単球を、ＲＰＭＩ／２％ヒトＡＢ血清、組換え型ヒト顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）中で６日間、６ウェルプレート中で培養し、２日後、及び５日後に培地／サイトカインを再補充した。培養６日後、未熟ＤＣを９６ウェルプレート中で１×１０6細胞／ｍｌの濃度で再度培養し、そしてさらに２４時間、カクテル、及び／又はｈＢＤ２で、処置されなかったか、又は処置された。ｈＢＤ２を４つの濃度で、４通りで試験した。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含む炎症性カクテルを用いて、ｈＢＤ２は、炎症性フェノタイプへのｈＤＣ成熟を抑制するその能力を分析された。デキサメタゾンを加え、２０時間後に当該カクテルを、臨床的抗炎症活性を有することが証明されている化合物のためのポジティブ・コントロールとして加えた。ｈＢＤ２とのインキュベーションを行い、４時間後にカクテルを加えた。
【０１４１】
サイトカインＥＬＩＳＡ
細胞培養上清を回収し、−８０℃で保存した。製造業者の手順（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って、市販の抗体及びスタンダードを用いた標準的サンドイッチＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２３の量を測定した。
【０１４２】
ＭＴＴアッセイ
ビヒクル、カクテル、又はｈＢＤ２を用いた処置によって任意の細胞が大幅に影響を受けるか否かを評価するために、４８時間後の細胞の生存の測定において、ＭＴＴ系細胞増殖決定キットを使用し、製造業者の手順（Ｓｉｇｍａ）に従って行った。
【０１４３】
統計学的分析
全ての実験は少なくとも２回行われ、代表的な結果を示す。示されたデータは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表現された。表の説明文に記載されたように、変数が処置（ｈＢＤ２、デキサメタゾンなど）及び刺激（ＬＰＳ、ＬＴＡ、ペプチドグリカンなど）である、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことによって、統計的有意性を決定した。差はｐ＜０．０５で有意であると考えられた。
【０１４４】
結果
表２１．培地（未刺激）、又はＬＰＳ及びＩＦＮ−γのいずれかで刺激され、培地（未処置）、ｈＢＤ２、又はデキサメタゾンのいずれかで処置された、ヒトＣＤ１４+単球由来樹状細胞の上清中のＩＬ−２３（ｐｇ／ｍｌ）、平均（ＳＥＭ）、Ｎ＝４、３人の内１人の代表的ドナー。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。ｎｄ：検出されず（検出限界未満）。
【０１４５】
【表２２】
【０１４６】
表２２．培地（コントロール）、０．６ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、２０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、又は５μｇ／ｍｌ ＬＴＡのいずれかで刺激され、ｈＢＤ２、デキサメタゾン、又はインフリキシマブで処置された、ヒトＰＢＭＣの上清中のＩＬ−２３（ｐｇ／ｍｌ）、平均（ＳＥＭ）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１４７】
【表２３】
【０１４８】
表２１に示された通り、ｈＢＤ２は、有意に且つ用量依存的に、ヒトＣＤ１４+単球由来樹状細胞からのＩＬ−２３分泌を抑制した。
【０１４９】
ヒトＰＢＭＣに関して、ＩＬ−２３分泌はまた、有意に抑制された（表２２）。これらの細胞において、逆の用量依存性が存在し、そしてそれは、より低用量のｈＢＤ２を試験したとき、鐘形の用量−反応阻害曲線であることが分かった（データを示さず）。
【０１５０】
これは、ＩＬ−２３分泌の抑制によって、ｈＢＤ２が慢性自己免疫状態の抑制効果を有し、したがってＩＬ−２３が、炎症性応答において重要な役割を果たすことを示している。Ｔｈ１７細胞は、それらの生存及び増殖に関して、ＩＬ−２３に依存しており、そしてＴｈ１７細胞は、幾つかの自己免疫疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、及び多発性硬化症の病因であることが示されている。
【０１５１】
実施例５
マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）を用いた、ＰＢＭＣからのＴＮＦ分泌の減少
実施例５は基本的に、ヒトＰＢＭＣに関して、実施例２に記載された通りに行われた。実施例１においてｈＢＤ２の産生のために使用された手順と同一のものを使用して、マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）を調製した。ｍＢＤ３のアミノ酸配列は配列番号６に示される。マウスＰＢＭＣを、以下に記載した通りに調製した。
【０１５２】
マウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離及び刺激
マウス末梢血単核細胞を、１０匹のＮＭＲＩマウスの血液から単離した。要約すれば、ヘパリン添加血液をＲＰＭＩで１／１（ｖ／ｖ）で希釈し、そして２時間以内でＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離にかけた。血漿を上清から回収し、そして廃棄された。単離されたＰＢＭＣを培養培地（ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，４２４０１）ｗ／１％ペニシリン及びストレプトマイシン並びに１％ Ｌ−グルタミン）中で再度懸濁し、そして９６ウェル培養プレートに、１ウェルあたり１５５．５００個の細胞で、全体で２００μｌとなるようにまいた。１００、１０、又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２又はｍＢＤ３（マウス・ベータ・ディフェンシン３）を；それ単体で、又は、２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）と共に用いて、同一のドナーからのＰＢＭＣを刺激した。ＬＰＳ刺激をした及びしていない培地へ、デキサメサゾンを３．５ｎｇ／ｍｌ加えた。３７℃で２４時間インキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインの測定まで−８０℃で貯蔵した。
【０１５３】
ＦＡＣＳアレイ・フローサイトメーターにおける製造業者の使用説明に従って、マウス炎症サイトメトリック・ビーズアレイ（ＣＢＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、上清におけるサイトカインの産生を測定した。
【０１５４】
上清を回収後、生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＤＡＬＬ１１００）によって測定した。
【０１５５】
結果
表２３．ＬＰＳを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料を同一のドナーで試験された。２人のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（Ｎ＝２）。
【０１５６】
【表２４】
【０１５７】
表２４．ＬＰＳを用いた、ｍＢＤ３を用いた及び用いない処置後における、マウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。２匹のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（Ｎ＝２）。
【０１５８】
【表２５】
【０１５９】
表２３に示された通り、マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）は、ヒトＰＢＭＣからのＴＮＦの分泌を、ｈＢＤ２及びデキサメタゾンと同程度まで下方制御した。ｍＤＢ３はまた、マウスＰＢＭＣからのＴＮＦの分泌を下方制御した（表２４）。
【０１６０】
したがってこの設定において、ｍＢＤ３は、すぐれた抗炎症活性を示した。
【０１６１】
【表２６】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、配列表をコンピューターで読み取り可能な形式で含む。当該コンピュータで読み取り可能な形式は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は、ヒト・ベータ・ディフェンシンの投与による、関節リウマチの予防及び治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
多くの他の成分の中で、先天性免疫の重要な構成成分は、その各々が、かなりの選択性を示すが、共同で速やかに広範囲の細菌、ウィルス、及び真菌を死滅させることができる、抗微生物ペプチド（ＡＭＰ）である。ＡＭＰの生物学的重要性は、天然においてそれらが偏在することによって強調され、そしてそれらは恐らく、全ての多細胞生物によって産生される。ヒトにおいて、重要なＡＭＰはディフェンシンである。ヒトのディフェンシンは、それらの３つの分子内システイン・ジスルフィド結合の形態に基づいて、α−及びβ−ディフェンシンへと分類され得る、小さいカチオン性ペプチドである。α−ディフェンシンは、好中性顆粒から最初に単離されたもの（ＨＮＰ１〜４）、及び小腸の陰窩中のパネート細胞によって発現されるもの（ＨＤ５及びＨＤ６）へとさらに細かく分類され得る。β−ディフェンシンは主に、皮膚、気管、消化管、泌尿生殖器系、腎臓、膵臓、及び乳腺を含む、種々の組織及び器官における上皮細胞によって産生される。β−ディフェンシン・ファミリーの最も特徴付けされたメンバーは、ｈＢＤ１〜３である。しかし、種々のバイオインフォマティクス・ツールを用いて、推定上のβ−ディフェンシン相同体をコードする約４０個のオープン・リーディング・フレームが、ヒトゲノム中でアノテートされた。ヒト・ディフェンシンの幾つかは、恒常的に産生されるが、他のものは、炎症性サイトカイン、又は外因性の微生物産生物によって誘導される。
【０００４】
ヒトのディフェンシン、及びそれらの直接的な抗微生物活性はまた、広い範囲の免疫調節性／代替性特性を有することが次第に明らかとなってきた。これらは、種々のケモカイン及びサイトカインの誘導、走化性及びアポトーシス活性、プロスタグランジンの誘導、ヒスタミン及びロイコトリエンの放出、補体の阻害、トール様受容体のシグナル伝達を通じた樹状細胞成熟の刺激、並びに好中球による病原体の一掃の刺激を含む。さらに、ヒトのディフェンシンはまた、創傷治癒、上皮及び繊維芽細胞の増殖、血管形成、並びに脈管形成において役割を果たす。
【０００５】
ヒトのディフェンシンが、多くの感染性及び炎症性疾患において重要な役割を果たすことに関する証拠が増大している。ヒトのディフェンシンの過剰発現は通常、恐らく微生物成分又は内因性の炎症性サイトカインによる局所的誘導のために、炎症を起こした及び／又は感染した皮膚において観察される。乾癬において、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３は過剰に存在し、そして尋常性座瘡又は表在性毛嚢炎の患者の損傷性上皮において、ｈＢＤ２の上方制御が観察された。他方で、ｈＢＤ２及びｈＢＤ３の下方制御は、アトピー性皮膚炎に関連する。
【０００６】
関節リウマチは、多くの組織及び器官に影響を及ぼし得るが、主に関節を攻撃して、関節軟骨の破壊、及び関節の強直へと通常進行する炎症性滑膜炎を引き起こす、慢性全身性炎症性疾患である。関節リウマチはまた、肺、心膜、胸膜及び強膜に広汎性炎症を、並びに皮下組織において最も一般的である結節性病変を引き起こし得る。関節リウマチの原因は知られていないが、自己免疫が、その慢性化及び進行に重要な役割を果たす。
【０００７】
発明の詳細な説明
定義
ディフェンシン：本明細書における用語「ディフェンシン」は、抗微生物性ペプチドのディフェンシン類に属するものとして当業者によって認識されるポリペプチドのことである。ポリペプチドが本発明のディフェンシンであるか否か決定するために、無料で利用可能なＨＭＭＥＲソフトウェア・パッケージを使用することによって、アミノ酸配列が、ＰＦＡＭデータベースの隠れマルコフモデル・プロファイル（ＨＭＭプロファイル）と比較され得る。
【０００８】
ＰＦＡＭディフェンシン・ファミリーは、例えばディフェンシン１、又は「哺乳動物のディフェンシン」（受入番号ＰＦ００３２３）、及びディフェンシン・２、又はディフェンシン・ベータ、又は「ベータ・ディフェンシン」（受入番号ＰＦ００７１１）を含む。
【０００９】
本発明のディフェンシンは、ベータ・ディフェンシン類に属する。ベータ・ディフェンシン由来のディフェンシンは、共通の構造的特徴、例えばシステインのパターンを有する。
【００１０】
本発明のディフェンシンの例は、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（ｈＢＤ１；配列番号１を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２；配列番号２を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（ｈＢＤ３；配列番号３を参照）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４（ｈＢＤ２；配列番号４を参照）、及びマウス・ベータディフェンシン３（ｍＢＤ３；配列番号６を参照）を含む。
【００１１】
同一性：２つのアミノ酸配列間の関連性、又は２つのヌクレオチド配列の関連性を、パラメーター「同一性」で記載する。
【００１２】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２７６−２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定される。使用される任意のパラメーターは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」のアウトプットは、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）
【００１３】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ，２０００，同上；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，同上）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性」のアウトプットは、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップ総数）
【００１４】
単離されたポリペプチド：本明細書において使用される用語「単離されたバリアント」又は「単離されたポリペプチド」は、源から単離される、バリアント又はポリペプチドのことである。一の態様において、当該バリアント又はポリペプチドは、当該ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定される通り、少なくとも１％純粋、好ましくは少なくとも５％純粋、より好ましくは少なくとも１０％純粋、より好ましくは少なくとも２０％純粋、より好ましくは少なくとも４０％純粋、より好ましくは少なくとも６０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも８０％純粋、そして最も好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００１５】
実質的に純粋なポリペプチド：本明細書において、用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、天然又は組み換えに関連する他のポリペプチド材料を、最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、より好ましくは最大６重量％、より好ましくは最大５重量％、より好ましくは最大４重量％、より好ましくは最大３重量％、さらにより好ましくは最大２重量％、最も好ましくは最大１重量％、そしてより最も好ましくは最大０．５重量％含むポリペプチド調製物を示す。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、当該調製物中に存在する総ポリペプチド材料が少なくとも９２重量％純粋、好ましくは少なくとも９４重量％純粋、より好ましくは少なくとも９５重量％純粋、より好ましくは少なくとも９６重量％純粋、より好ましくは少なくとも９７重量％純粋、より好ましくは少なくとも９８重量％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％純粋、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純粋、そしてさらに最も好ましくは１００重量％純粋であることが好ましい。本発明のポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態で存在する。これは例えば、周知の組み換え法により、又は古典的な精製法により、当該ポリペプチドを精製することによって達成され得る。
【００１６】
哺乳動物のベータ・ディフェンシン
本発明は、関節リウマチの治療における、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシン及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシンの医薬用途に関する。当該治療は、処置された組織におけるＴＮＦ−アルファ活性の減少に好ましくは関連する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び／又は配列番号６のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び／又は配列番号４のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。より好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（配列番号１）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（配列番号３）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４（配列番号４）、ヒト・ベータ・ディフェンシン４のバリアント（配列番号５）、及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシン３（配列番号６）から成る。さらにより好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１（配列番号１）、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）、ヒト・ベータ・ディフェンシン３（配列番号３）、及び／又はヒト・ベータ・ディフェンシン４（配列番号４）から成る。
【００１８】
別の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の同一性度を有する。好ましい実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン２（配列番号２）から成る。
【００１９】
さらに別の実施形態において、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン、及び／又はマウス・ベータ・ディフェンシン、並びに機能的に等価なそのバリアントから成る。好ましくは、哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、ヒト・ベータ・ディフェンシン４、及びマウス・ベータ・ディフェンシン３、並びに機能的に等価なそのバリアントから成る。より好ましくは、本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、及び機能的に等価なそのバリアントから成る。
【００２０】
本発明の哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、好ましい実施形態の化合物とも呼ばれる。
【００２１】
本発明に関して、哺乳動物の（例えばヒトの）・ベータ・ディフェンシンの「機能的に等価なバリアント」は、関節リウマチにおいて、親の哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンとほぼ同じ効果を示す、修飾された哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンである。好ましくは、それはまた、ＴＮＦ−アルファ活性において、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンとほぼ同一の効果を示す。
【００２２】
本発明に従って、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンの機能的に等価なバリアントは、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンアミノ酸配列と比較して、１〜５個のアミノ酸修飾、好ましくは１〜４個のアミノ酸修飾、より好ましくは１〜３個のアミノ酸修飾、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸修飾、及び特に１個のアミノ酸修飾を含み得る。
【００２３】
本明細書において、用語「修飾」は、哺乳動物の（例えばヒトの）ベータ・ディフェンシンの任意の化学修飾を意味する。１又は２以上の修飾は、１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入、並びに１又は２以上のアミノ酸側鎖の交換；又は当該アミノ酸配列において類似の特性を有する非天然のアミノ酸の使用であり得る。特に、１又は２以上の修飾は、アミド化、例えばＣ末端のアミド化であり得る。
【００２４】
好ましくは、アミノ酸の修飾は小さい性質のものであり、そしてそれは、ポリペプチドのフォールディング及び／又は活性に大きな影響を与えない保存的アミノ酸置換又は挿入；単一の欠失；小規模なアミノ末端又はカルボキシル末端の伸長；約２０〜２５残基までの小さいリンカーペプチド；又は正味電荷を変更することによって精製を容易にする小規模な伸長、或いは別の機能のもの、例えばポリ−ヒスチジンタグ、抗原性エピトープ、又は結合ドメインである。
【００２５】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族性アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、及びメチオニン）の群の内で存在する。特異的な活性を通常変更しないアミノ酸置換は、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。最も一般的に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００２６】
２０個の標準的アミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びアルファ−メチルセリン）は、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。限定された数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードをコードしないアミノ酸、及び非天然アミノ酸は、アミノ酸残基と置換され得る。「非天然アミノ酸」は、タンパク質合成後に修飾され、及び／又は１又は２以上の側鎖において標準的アミノ酸のものとは異なる化学構造を有する。非天然のアミノ酸は、化学的に合成され得、そして好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、並びに３，３−ジメチルプロリンを含む。
【００２７】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンにおける必須のアミノ酸は、当技術分野で既知の手順、例えば部位特異的変異誘発、又はアラニン走査変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）に従って同定され得る。後者の技術において、単一のアラニンの変異は分子内における全ての残基に導入され、そして生じた変異分子は、生物学的活性（すなわち、関節リウマチに対する活性）を試験され、当該分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８も参照のこと。必須のアミノ酸の同一性は、哺乳動物（例えばヒト）のベータ・ディフェンシンに関連するポリペプチドとの同一性の分析からも推測され得る。
【００２８】
単一の又は複数のアミノ酸の置換が、既知の方法の変異誘発、組み換え及び／又はシャッフリングを用いてなされ得、及び試験され得、その後、関連性スクリーニング手順、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号に開示されたものが行われ得る。使用され得る他の方法は、エラー・プローンＰＣＲ、ファージ・ディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域特異的突然変異誘発（ｒｅｇｉｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４６：１４５；Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ ７：１２７）を含む。
【００２９】
本発明のポリペプチドのＮ末端の伸長は好適には、１〜５０個のアミノ酸、好ましくは２〜２０個のアミノ酸、特に３〜１５個のアミノ酸から成り得る。一の実施形態において、Ｎ末端ペプチドの伸長は、Ａｒｇ（Ｒ）を含まない。別の実施形態において、Ｎ末端の伸長は、以下にさらに定義されるｋｅｘ２又はｋｅｘ２様切断部位を含む。好ましい実施形態において、Ｎ末端伸長は、少なくとも２つのＧｌｕ（Ｅ）及び／又はＡｓｐ（Ｄ）アミノ酸残基を含むペプチドであって、例えばＮ末端伸長は以下の配列の一つを含む：ＥＡＥ、ＥＥ、ＤＥ及びＤＤ。
【００３０】
方法、及び用途
ヒト・ベータ・ディフェンシン２は、４１日間コラーゲンで誘導された関節リウマチマウスモデルにおいて、疾患パラメーターの深刻度を著しく減少させ；したがって、関節リウマチ治療のための医薬として、強力な活性を示すことが判明した。
【００３１】
本発明はしたがって、関節リウマチの治療方法を提供し、当該治療は、有効量の哺乳動物のベータ・ディフェンシンを、好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシンを、より好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシン２を、例えば医薬組成物の形態で、当該治療を必要とする対象へ投与することを含む。医薬の製造のための、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシン、より好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシン２がまた、提供され、及び、関節リウマチの治療のための医薬の製造のための、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシン、より好ましくはヒト・ベータ・ディフェンシン２の使用がまた、提供される。治療は、存在する疾患又は障害の治療、及び疾患又は障害の予防（防止）を含む。
【００３２】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、経腸（例えば口腔、経口、経鼻、直腸）、非経口（例えば静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、若しくは筋肉内）、又は局所（例えば、皮膚上、鼻腔内、若しくは気管内）を含む、任意の従来の経路による投与のために製剤化された組成物で、治療において使用され得る。他の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、持続放出インプラントの一部として投与され得る。
【００３３】
さらに他の実施形態において、好ましい実施形態の組成物は、凍結乾燥物としての安定性を提供する好適な賦形剤を用いて、凍結乾燥物として製剤化され得、その後に再水和される。
【００３４】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンを含む医薬組成物は、従来法に従って、例えば混合、整粒、被覆、溶解、又は凍結乾燥工程によって製剤化され得る。
【００３５】
好ましい実施形態の医薬組成物は、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、並びに医薬として許容される担体、及び／又は希釈剤を含む。
【００３６】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは好ましくは、関節リウマチにおける治療のために有効である量で、好ましくは患者において許容される毒性で、医薬組成物において使用される。かかる治療のために好適な投与量は当然、例えば、使用される本発明の化合物の化学的性質及び薬物動態データ、個々の宿主、投与様式、並びに処置される健康状態の性質及び深刻度によって変化し得る。しかし一般的に、大型哺乳動物、例えばヒトにおける満足な結果のために、望ましい一日用量は、好ましくは約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、及び最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、例えば、１日に１回、２回、３回、又は４回の分割量で投与される。好ましい実施形態の化合物は、大型哺乳動物、例えばヒトへ、従来使用されているものと同様の投与様式で、同様の投与量で投与され得る。
【００３７】
特定の実施形態において、好ましい実施形態の医薬組成物は、哺乳動物のベータ・ディフェンシン、例えばヒト・ベータ・ディフェンシンを、投与経路に依存して、単位剤形につき、約０．５ｍｇ以下〜約１５００ｍｇ以上の量で含み得、そしてそれは、好ましくは約０．５、０．６、０．７、０．８、又は０．９ｍｇ〜約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｍｇで、及びより好ましくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、又は２５ｍｇ〜約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｍｇで含み得る。しかし、特定の実施形態において、上記のものより低い又は高い投与量が好ましいものであり得る。好適な濃度及び投与量は、当業者によって容易に決定され得る。
【００３８】
医薬として許容される担体及び／又は希釈剤は、当業者に既知である。液体溶液として製剤化された組成物に関して、許容される担体及び／又は希釈剤は、生理食塩水及び滅菌水を含み、並びに場合により抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び他の一般的な添加剤を含み得る。当該組成物はまた、丸剤、カプセル、顆粒、タブレット（被覆された、又は被覆されていない）、（注射可能）溶液、固溶体、懸濁液、分散液、固体分散体（例えばアンプル、バイアル、クリーム、ゲル、ペースト、吸入製剤、粉末、フォーム、チンキ剤、リップスティック、ドロップ、スプレー、又は坐剤の形態）として、製剤化され得る。当該製剤は、（哺乳動物のベータ・ディフェンシン、及び他の追加の活性成分に加えて、）担体、賦形剤、砕解剤、フロー・コンディショナー（ｆｌｏｗ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ）、糖類及び甘味剤、香料、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調節用の塩、緩衝剤、希釈剤、分散剤及び界面活性剤、結合剤、滑剤、並びに／又は当技術分野で既知の他の医薬用賦形剤を含み得る。当業者はさらに、好適な方法で、及び慣例に従って、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９０に記載された方法で、哺乳動物のベータ・ディフェンシンをさらに製剤化し得る。
【００３９】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、単剤で、又は１、２若しくは３以上の他の医薬化合物若しくは薬剤物質を用いた併用療法で、及び／又は１若しくは２以上の医薬として許容される賦形剤と共に使用され得る。
【００４０】
イン・ビトロにおける合成
哺乳動物のベータ・ディフェンシンは、当技術分野で既知の従来法を用いて、イン・ビトロにおける合成によって製造され得る。種々の市販の合成装置が利用可能であり、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｃ．などの自動合成機がある。合成機を用いることによって、天然に存在するアミノ酸は、非天然のアミノ酸、特にＤ−異性体（又はＤ体）、例えばＤ−アラニン、及びＤ−イソロイシン、側鎖が異なる長さ又は官能基を有するジアステレオマーなどと置換され得る。特定の配列及び製造方法は、簡便性、経済性、必要とされる純度などによって決定され得る。
【００４１】
結合のために好都合な官能基、例えば、アミドのための、又は置換アミン形成、例えば還元的アミノ化のためのアミノ基、チオエーテル又はジスルフィド形成のためのチオール基、アミド形成のためのカルボキシル基などを含む種々のペプチド又はタンパク質に、化学結合が提供され得る。
【００４２】
必要に応じて、種々の基が、合成中又は発現中にペプチドへと導入され得、そしてそれらは、他の分子又は表面への結合を可能とする。したがって、システインは、チオエーテルを製造するために使用され得、ヒスチジンは、金属イオン錯体と結合するために使用され得、カルボキシル基はアミド又はエステルを形成するために使用され得、アミノ基はアミドなどを形成するために使用され得る。
【００４３】
哺乳動物のベータ・ディフェンシンはまた、組み換え合成の従来法に従って、単離され且つ精製され得る。溶解物は、発現宿主から調製され得、そして当該溶解物は、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティー・クロマトグラフィー、又は他の精製技術を用いて精製され得る。
【００４４】
本発明は、本発明の範囲を限定するものであるとして解釈されるべきではない、以下の実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【００４５】
実施例１
コラーゲンで誘導された関節リウマチモデルにおける、ヒト・ベータ・ディフェンシンの評価
ｈＢＤ２の免疫調節効果に関する試験を通じて、ｈＢＤ２が、抗炎症性における大きな潜在力を有することが予想外にも観察された。
【００４６】
本明細書において、我々は、ｈＢＤ２が、コラーゲンで誘導された関節リウマチマウスモデルの治療に大きな効果があることを示した。
【００４７】
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）
ｈＢＤ２を組み換えで産生した。ｈＢＤ２をコードする合成ＤＮＡ断片（ＤＮＡ２．０）を、ｐＥＴ−３２（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローン化した。生じたプラスミドは、Ｎ末端チオレドキシン部位、その後にｈｉｓ−タグ、エンテロキナーゼ切断部位、及び最後にｈＢＤ２ペプチドを含む、翻訳用融合ペプチドをコードした。発現プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１へと形質転換した。
【００４８】
この株の一晩培養物を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ−グリセロールで１００倍に希釈し、そして３７℃にて約８のＯＤ６００となるように増殖させ、そして０．５ｍＭのＩＰＴＧで３時間誘導し、その後細胞を遠心分離で採取した。ｈｉｓ−タグされたｔｒｘ−ｈＢＤ２融合ペプチドを、標準的手順を用いて、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）上で精製した。ｈｉｓ−タグ精製された融合ペプチドをその後、エンテロキナーゼ緩衝液（５０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，１ｍＭ ＣａＣｌ2）中にて一晩透析し、そしてエンテロキナーゼで切断して成熟ｈＢＤ２を放出した。ｈＢＤ２ペプチドを、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ ｍａｔｒｉｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。ｈＢＤ２の正確な分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて確認した。
【００４９】
ｍＢＤ３（実施例５参照）の産生を、同一の手順を用いて行った。
【００５０】
ｈＢＤ２の適切なフォールディング及びジスルフィド架橋形態をその後、ＬＣ−ＭＳ及びＮＭＲ分光法と連動したトリプシン消化を用いて確認した。
【００５１】
エンドトキシンを分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって低ｐＨにて除去し、そしてエンドトキシンの含有量をＬＡＬアッセイ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＫＴＡ２）によって決定し、そして当該レベルは、当該アッセイの検出限界（０．０５ＥＵ／ｍｇ）未満であることが分かった。エンドトキシンアッセイの検出限界未満のレベルが、ＰＢＭＣを刺激することができないことを確定するために、非常に強力なリポ多糖（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）を用いた刺激の滴定曲線を行った。非常に低レベルのこのＬＰＳ（０．０６ｎｇ／ｍｌ）は、検出可能なサイトカイン産生へとＰＢＭＣを刺激することができた。
【００５２】
以下の試験の目的は、関節リウマチにおける、ヒト・ベータ・ディフェンシン２の抗炎症活性を決定することであった。
【００５３】
試験系
種／系統：マウス／ＤＢＡ／１
源：Ｈａｒｌａｎ、ＵＫ
性別：雄
動物数：ｎ＝５０
年齢：ヤング・アダルト、試験開始時６〜８週齢
体重：本試験で使用される動物の健康状態を、到着時に調べた。良好な健康状態である動物のみを実験条件に順化させ、そして本試験に使用した。
順化：少なくとも７日間
収容：順化及び以下の投与の間、動物をアクセス制限されたげっ歯類施設に収容し、そして床が硬く、寝具材料として木屑を満たしたポリプロピレンのケージ（４５ｃｍ×２５ｃｍ×１３ｃｍ）中で、最大で１０匹のグループで維持した。ケージを１週間に１回変更した。
食餌及び水：動物は、市販のげっ歯類用食餌を適宜提供され、そして、ステンレス鋼のシッパー・チューブ（ｓｉｐｐｅｒ ｔｕｂｅ）を備えたポリプロピレンの容器経由で各々のケージに供給される飲料水へのアクセスは自由であった。水容器を少なくとも３週間に１回変更した。水を、１週間に３回変更した。
環境：温度２０〜２４℃、相対湿度（ＲＨ）３０〜７０％、１２時間／１２時間の明／暗サイクル、及び１時間当たり１０〜３０回の換気を試験室内で維持するように、自動制御される環境条件を設定した。温度及びＲＨを手動測定及び制御コンピューターの両方によって毎日観測した。光のサイクルを制御コンピューターによって観測した。
識別：動物の耳に、固有の動物識別番号を付与した。この番号はまた、各々のケージの前面で視認可能なケージ・カードにも記載された。ケージカードは、試験番号も含んだ。
ランダム化：動物を実験グループにランダムに振り分けた。
終了：試験終了時、生存する動物にＯ2／ＣＯ2を吸入させ、その後放血することにより安楽死させた。
正当化：マウスが本実験動物モデルのために選択された種であることを示すために、マウスを選択した。ＤＢＡ／１系統マウスはコラーゲンで誘導された関節炎（ＣＩＡ）に対して高い感受性を有する。
【００５４】
材料
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）；上記参照
デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．ｎｏ．Ｄ１７５６）
ウシＩＩ型コラーゲン（ＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｃａｔ．ｎｏ．８０４００１３１４）
完全フロインドアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）（ＣＦＡ）（ＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃａｔ．ｎｏ．５０１００９７０３）
ＰＢＳ（ＰＡＡ，ｃａｔ ｎｏ．Ｈ１５−００２）
【００５５】
試験グループの構成
【００５６】
【表１】
【００５７】
関節炎の誘導
全ての動物は、試験０日目時点（試験開始時）で、イソフルレンによる浅麻酔下で、プラスチック製シリンジを用いて、０．１ｍｌのＩＩ型コラーゲン／ＣＦＡエマルション（マウス１匹当たり２００μｇのコラーゲン）を、尾に皮内注射された。注射位置は、尾の基部から約１ｃｍ尾側であった。２１日目に、コラーゲン及びＰＢＳのＩＰ注射によって、動物にコラーゲン（２００μｇ／マウス）を投与した。
【００５８】
治療
試験１４日目に治療を開始し、そして１日１回を継続した。全生存マウスは、試験４２日目に終了された。
【００５９】
投与経路：
（ｉ）ｈＢＤ２：静脈内
（ｉｉ）デキサメタゾン：腹腔内
（ｉｉｉ）ビヒクル・コントロール：静脈内
【００６０】
投与量及び体積投与量（表１も参照）：
（ｉ）ｈＢＤ２：５ｍＬ／ｋｇで、１０、１又は０．１ｍｇ／ｋｇ
（ｉｉ）デキサメタゾン：５ｍＬ／ｋｇで、１ｍｇ／ｋｇ
（ｉｉｉ）ビヒクル・コントロール：５ｍＬ／ｋｇで、０ｍｇ／ｋｇ
【００６１】
鎮痛：鎮痛剤は本試験の間使用されなかった。
【００６２】
観察及び検査
関節炎反応
試験０、１４、２１日目において、その後試験終了までに週に５回、末梢関節における炎症性応答の兆候に関して、マウスを検査した。関節炎反応は、以下に示される重症度の昇順における０〜４スケールに従って、各々の足に関して報告された：
【００６３】
【表２】
【００６４】
臨床兆候
０、１４、２１日目において、及びその後試験終了まで週に５回、注意深く臨床試験が行われ、そして記録された。観察は、皮膚、毛、眼、粘膜の変化、分泌物及び排出物の発生（例えば下痢）、並びに自律神経活動（例えば流涙、唾液分泌、立毛、瞳孔の大きさ、呼吸器の異常パターン）における変化を含んだ。歩き方、姿勢の変化、及びハンドリングに対する応答、並びに奇矯な行動の存在、震え、けいれん、睡眠、及び昏睡が同様に記録された。
【００６５】
１４日目より前に、全ての異常行動について、マウスは毎日監視された。
【００６６】
体重
０、１４、２１日目における関節炎誘導の前に、及びその後試験終了までに週に５回の関節炎誘導の前に、速やかに動物の個々の体重の決定を行った。
【００６７】
実験的関節炎の測定
ダイヤルカリパス（Ｋｒｏｅｐｌｉｎ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、試験０、１４、２１日目、及びその後試験終了までの週に５回、各々の動物の両方の後足（左及び右、足蹠の直下、及び踵骨の上）の厚さにおける相対的変化をｍｍで測定した。
【００６８】
試験の終了
全てのマウスは、試験４２日目で終了された。
【００６９】
試料回収
試験終了時に、Ｏ2／ＣＯ2吸入の後、最終的な血液試料を残存する全ての試験動物から得た。各々の試料から血清を調製し、−２０℃で保管した。さらに、左前足及び後足を回収し、ホルマリン中で保管し、そして右前足及び後足を回収し、可能な関節ＲＮＡ分析のために瞬間凍結した。
【００７０】
人道的エンドポイント
瀕死状態と認められた動物、並びに重度の疼痛及び重度の苦痛の兆候の持続を示した動物を人道的に安楽死させた。さらに、初期体重決定から２０％超の体重減少を示した動物を人道的に安楽死させた。全関節炎スコアが１２超であるマウスも、人道的理由により処分した。Ｏ2／ＣＯ2吸入させ、その後放血することによって、全ての動物を安楽死させた。足試料及び最終的な血液試料を全ての試験動物から得た。
【００７１】
統計的分析
評価は主に、関節炎スコア及び足の厚さの測定の平均値に基づいた。必要に応じて、好適な統計方法によるデータの分析が、治療効果の有意性を決定するために適用された。ＡＮＯＶＡ、その後のＴｕｋｅｙ事後分析（Ｗｉｎｓｔａｔ ２００５．１ Ｅｘｃｅｌ用）を、治療群間の統計的差異を評価するために用いた。
【００７２】
内務省の規制に従って、１２又はそれ以上の全臨床スコアを有するマウスを、関節炎の重症性のために処分した。終了時におけるこれらのマウスの臨床スコアは、高スコアのマウスの除去によって当該データが人工的に歪曲されないように、当該試験の残余に関する分析に持ち越された。
【００７３】
動物のケア及び使用の陳述
本試験は、科学的方法における動物の使用に関する、英国内務省の規制に従って行われた。
【００７４】
結果
表２．コラーゲンで誘導された雄ＤＢＡ／１関節炎マウスにおいて、４２日の観察期間中で決定された平均臨床関節炎スコア。*ｐ＜０．０５、ビヒクル群からの有意差
【００７５】
【表３】
【００７６】
結論
関節炎反応は、試験１４日目からの全グループにおいて確認された。ビヒクルで処置されたマウスにおける平均の全関節炎スコア（表２）は、試験４１日目において８．５±０．７２で最大であった。１０ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２で処置されたマウス（グループＣ）における平均関節炎スコアは、２３日目から試験終了時まで、ビヒクル処置されたマウスに比べて低かったが、４１日目でのみ有意であった。
【００７７】
１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２で処置されたマウス（グループＤ）における平均全関節炎スコアは、試験４１日目において５．２±１．１で最大であり、そして２１日目から試験終了時まで、ビヒクル処置群に比べて一貫して低かったが、４０日目でのみ有意であった。０．１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２で処置されたマウス（グループＥ）における処置は、ビヒクル処置群と比較して、平均全関節炎スコアを有意に低下させなかった。このグループにおける平均スコアは、試験４０日目において９．０±０．７７で最大であった。デキサメタゾン処置群（グループＢ）におけるマウスは、試験２６日目から試験終了時まで、ビヒクル処置群に比べて有意に低い関節炎スコアを示した。
【００７８】
関節炎の重症性のために本試験において早期に処分されたマウスの除去がデータを人工的に歪曲しなかったことを保証するために、かかるマウスからの関節炎スコアが試験終了まで、当該分析中に持ち越された。
【００７９】
実施例２
ヒト・ベータ・ディフェンシン２（ｈＢＤ２）の抗炎症活性
ヒトＰＢＭＣ培養中において、ｈＢＤ２を用いた処置が、ＬＰＳ、ＬＴＡ又はペプチドグリカン刺激された培養のサイトカイン・プロファイルにおいて大きな影響を有することが観察された。ｈＢＤ２が炎症性サイトカイン、並びに、ケモカインＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＰ−１０及びＩＬ−８を誘導することができることは以前に観察されている（Ｎｉｙｏｎｓａｂａ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｂｏｎｉｏｔｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２００６）。
【００８０】
本明細書において我々は、ｈＢＤ２が２つの炎症性サイトカイン、ＴＮＦ及びＩＬ−１βに対する下方制御潜在力を有することを；そしてｈＢＤ２がまた、リポポリ多糖（ＬＰＳ）、リポタイコ酸（ＬＴＡ）、又はペプチドグリカン（ＰＧＮ）を用いた炎症性刺激の誘導時において、ＩＬ−１０を誘導することを示した。ＩＬ−１０は、潜在的な抗炎症性サイトカインであり、したがって、ｈＢＤ２のもたらす効果は抗炎症性である。これは、ヒトＰＢＭＣ、単球細胞株、及び樹状細胞株（ｄｅｎｄｒｉｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）において観察された。
【００８１】
ｈＢＤ２は、実施例１に記載された通りに調製された。
【００８２】
ＰＢＭＣの単離及び刺激
（デンマークの関連倫理委員会から認定されている）健常者から末梢血を採取した。ヘパリン添加血液をＲＰＭＩで１／１（ｖ／ｖ）で希釈し、そして２時間以内のＦｉｃｏｌｌ密度遠心にかけた。血漿を個々のドナーの上清から回収し、そしてそれが培養培地（自家培養培地）中２％で使用されるまで、氷上で保存した。単離されたＰＢＭＣを自家培養培地中で再度懸濁し、そして９６ウェル培養プレートに、１ウェルあたり２５５．０００個の細胞で、全体で２００μｌとなるようにまいた。１００、１０、又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２を、それ単体で、或いは、０．６ｎｇ／ｍｌ若しくは２０ｎｇ／ｍｌ（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）のＬＰＳ、１．２５μｇ／ｍｌのリポタイコ酸（ＬＴＡ）（Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来，Ｓｉｇｍａ Ｌ３２６５）、又は４０μｇ／ｍｌのペプチドグリカン（ＰＧＮ）（Ｓ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）由来，Ｓｉｇｍａ ７７１４０）と共に用いて、同一ドナー由来のＰＢＭＣを刺激した。刺激のために使用される濃度は、実験初期に３人の異なるドナーにおいて最適化され、ＬＰＳに関しては、２つの異なる濃度が使用されて、調節可能なサイトカインレベル上にあることを確実なものとした。幾つかの実験において、デキサメサゾン及びインドメタシンを、単剤で、及び炎症性サイトカインの下方制御のコントロールとしてのＬＰＳ又はＬＴＡを共に用いてＰＢＭＣを処置した。３７℃で２４時間のインキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインの測定まで−８０℃で貯蔵した。全ての実験において生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＤＡＬＬ１１００）によって測定し、そして幾つかの場合においてはＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって製造業者の使用説明に従って測定し、そして幾つかの実験において、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒによって細胞数をカウントすることによって判断した。
【００８３】
ＭＵＴＺ−３の培養及び刺激
ヒト骨髄性白血病由来の細胞株ＭＵＴＺ−３（ＤＳＭＺ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ａ−ＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ Ｍ４５２６）中で維持し、２０％［ｖ／ｖ］ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ Ｆ６１７８）、及び４０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２１５−ＧＭ−０５０）を追加した。これらの前駆細胞は以下に示す単球細胞株中に存在し、そしてこれらの単球を、１００、１０又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２を、単剤で、又はＬＰＳ若しくはＬＴＡと共に用いて刺激した。
【００８４】
樹状細胞の分化
樹状細胞株を生じさせるために、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びｒｈｌＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ヒト骨髄性白血病細胞株ＭＵＴＺ−３（１×１０5細胞／ｍｌ）を、７日間かけて分化させて未熟ＤＣとした。２〜３日毎に培地を交換した。分化された細胞株を、ＬＰＳ又はＬＴＡのいずれかを用いて、ｈＢＤ２の存在下で及び不在下でさらに刺激して、樹状細胞におけるｈＢＤ２の効果を調べた。
【００８５】
サイトカインの測定
上清中におけるサイトカイン産生を、ＦＡＣＳアレイ・フローサイトメーター上で、ヒト炎症サイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、製造業者の使用説明（ＢＤ）に従って測定した。以下のサイトカインを測定した：ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＴＮＦ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６。幾つかの実験において、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓのＥＬＩＳＡキット（ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β）によって、製造業者の使用説明に従って、サイトカインを測定した。
【００８６】
データ分析
代表的結果が示されるように、全ての実験を少なくとも２回行った。得られたデータを、平均±標準偏差（ＳＤ）として表現した。表の説明文に記載されたように、変数が処置（ｈＢＤ２、デキサメサゾンなど）及び刺激（ＬＰＳ、ＬＴＡ、ペプチドグリカンなど）である２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、その後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことによって統計的有意性を決定した。差は、ｐ＜０．０５で有意であると見なされた。
【００８７】
結果
ＬＰＳ及びＬＴＡで、処理された及び無処理のヒトＰＢＭＣで、ｈＢＤ２の効果を試験した（表３、４及び５）。ｈＢＤ２を用いた処理により、全３つの試験された濃度に関して、刺激された培養においてＴＮＦの有意な下方制御がなされ（表３）、当該下方制御は、０．６ｎｇ／ｍｌのＬＰＳに関して、及びＬＴＡに関して用量依存的であった。ＩＬ−１βに関して、主に最高用量で下方制御が観察された（表４）。興味深いことに、ＩＬ−１０は有意に且つ用量依存的に上方制御された（表５）。炎症性サイトカインの下方制御、及び抗炎症性サイトカインの誘導は、ｈＢＤ２の非常に強い抗炎症潜在力を示す。ｈＢＤ２の抗炎症効果が細胞毒性効果によるものであることを排除するために、生存率を２つの異なるアッセイで測定した。ｈＢＤ２は、細胞において細胞毒性を有さず、観察される効果は、細胞増殖をもたらす、ＬＰＳ又はＬＴＡの刺激による刺激効果であることが、表６及び７において見られる。したがって、ｈＢＤ２は、これらの細胞において細胞毒性効果を有さない。
【００８８】
表８、９及び１０において、別のドナーからの上清は、フローサイトメトリーによるサイトメトリック・ビーズ・アッセイの代わりに、ＥＬＩＳＡによって、サイトカインに関して分析され、同一のことが観察されたが、アッセイの感度がより低く、そして検出限界が非常により高いため、当該効果が有意なものではなかった。
【００８９】
さらに別のＴｏｌｌ様受容体リガンドを試験するために、ペプチドグリカンで刺激されたＰＢＭＣにおけるｈＢＤ２の効果が調べられた（表１１及び１２）。同一のことが観察された：ＴＮＦは用量依存的に下方制御され、そしてＩＬ−１０は用量依存的に誘導された。
【００９０】
ＴＮＦの下方制御のポジティブ・コントロールとして、２つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインドメタシンを、アッセイにおいて試験した。当該化合物が毒性ではなく、且つ培地への溶解性のために達成可能な濃度であるように、濃度は選択された。ＬＴＡを用いた刺激後にのみ、インドメタシンはＴＮＦを阻害したが（表１３）、デキサメタゾンは、ＴＮＦ産生を効果的に下方制御し、同一のことがＩＬ−１βに関して観察された（表１５）。インドメタシンは、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害剤であり、軽度〜中等度の痛みを治療するために使用される非ステロイド系抗炎症剤であり、関節炎症状を緩和するために有用であり、並びにデキサメタゾンは炎症性疾患の治療において第一に使用される合成グルココルチコイドであり、そしてそれは、非常に低用量で、炎症性サイトカインに対して非常に強力な下方制御効果を有し（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．１９９８）、そしてそれを我々は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βに関しても観察した。ｈＢＤ２は、２つの抗炎症性化合物と同じくらい、またはそれらよりも効果的であった。
【００９１】
表１６及び１７において、単球細胞株、及び樹状細胞においてＴＮＦを下方制御する、ｈＢＤ２の効果が示され、同じことがＰＢＭＣに関して観察された。ＩＬ−１０はまた、ｈＢＤ２且つＬＰＳ、又はｈＢＤ２且つＬＴＡで刺激された樹状細胞に関して誘導された（結果は示さず）。
【００９２】
ＬＰＳ又はＬＴＡへのｈＢＤ２の結合がＴＮＦ及びＩＬ−１βの下方制御を引き起こすことを排除するために、合成リガンド（Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ２−ＴＬＲ１リガンド），ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｔｌｒｔ−ｐｍｓ）を用いたＰＭＢＣの刺激に対するｈＢＤ２の効果を試験した。このリガンドを用いた刺激後においても、ｈＢＤ２は下方制御することができ、このことは、ＬＰＳ又はＬＴＡの中和が、観察される効果に関与しないことを示している（結果は示さず）。さらに、ＴＮＦ−α及びＩＬ−αを含有するサイトカイン・カクテル、並びにｈＢＤ２を用いた樹状細胞の刺激は、サイトカイン・カクテル単体を用いた刺激と比較して、ＩＬ−１β、及びＩＬ−８、及びＩＬ−６の下方制御効果を有した。ＴＮＦ−αを用いた刺激のために、ＴＮＦに対する効果を明白に分析することができなかった（結果を示さず）。
【００９３】
表３．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロール（太字）と比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【００９４】
【表４】
【００９５】
表４．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【００９６】
【表５】
【００９７】
表５．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。５人のドナーからの代表的実験。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１，**ｐ＜０．０１，*ｐ＜０．５、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【００９８】
【表６】
【００９９】
表６．ＭＴＳアッセイによって測定された、刺激の２４時間後におけるＰＢＭＣ生存率。横列中、異なる下付き文字を有する値は有意差があり、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことで検定された。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
表７．Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅによって測定されたＰＢＭＣ生存率、５人の異なるドナーからの、５つの実験からの、１つの代表的実験。横列中異なる上付き文字を有する値、及び縦列中異なる上付き文字を有する値は有意差があり、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことで検定された。
【０１０２】
【表８】
【０１０３】
表８．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＴＮＦ−アルファ分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０１ｎｇ／ｍｌ、*ｐ＜０．０５、各々のコントロールと比較；**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較。
【０１０４】
【表９】
【０１０５】
表９．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＩＬ−１０分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０３ｎｇ／ｍｌ。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
表１０．ｈＢＤ２、ＬＴＡ、ＬＰＳ又はそれらの組み合わせを用いた刺激後における、ＰＢＭＣからのＩＬ−１β分泌。ＴＮＦ−アルファはＥＬＩＳＡによって測定された。ｎｄ：検出不能、アッセイにおける検出限界０．０１６ｎｇ／ｍｌ、**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較。
【０１０８】
【表１１】
【０１０９】
表１１．ＰＧＮを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１１０】
【表１２】
【０１１１】
表１２．ＰＧＮを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１１２】
【表１３】
【０１１３】
表１３．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又はＴＮＦ阻害のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に減少した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１１４】
【表１４】
【０１１５】
表１４．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又は抗炎症効果のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に増加した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１１６】
【表１５】
【０１１７】
表１５．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２又は抗炎症効果のための２つの異なるコントロール（デキサメタゾン及びインドメタシン）を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生；全ての試料は同一のドナーで試験された。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。下線の引かれた値は各々のコントロール（太字）と比較して有意に減少した。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１１８】
【表１６】
【０１１９】
表１６．ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト単球細胞株（ＭＵＴＺ−３）の上清におけるＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*各々のコントロールと比較してｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、各々のコントロールと比較、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１２０】
【表１７】
【０１２１】
表１７．（成熟ＤＣを生じさせるために）ＬＰＳ又はＬＴＡを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、未成熟樹状細胞の上清におけるＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*各々のコントロールと比較して有意に減少、ｐ＜０．０５、***各々のコントロールと比較して有意に減少、ｐ＜０．０１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析された（各々のデータ・セットに関してＮ＝約２００）。
【０１２２】
【表１８】
【０１２３】
実施例３
ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントの抗炎症活性
基本的に実施例２に記載された通りに実施例３を行った。下の表に示した通り、化合物ｒｈＢＤ２は組み換えｈＢＤ２であり、そしてそれは実施例２において使用されたｈＢＤ２と同一である。
【０１２４】
下の表に示した通り、化合物ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントは、化学合成を用いて調製され、そしてＰｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．から得た。
【０１２５】
組み換えｈＢＤ２（ｒｈＢＤ２）のアミノ酸配列は、化学合成により調製されたｈＢＤ２のアミノ酸配列と同一である。
【０１２６】
下の表で示されたｈＢＤ４バリアントは、ｈＢＤ４のアミノ酸３〜３９から成り、そして当該アミノ酸の配列は配列番号５に示した通りである。
【０１２７】
各々の表において、全ての試料は同一のドナーで試験された。ＳＤは標準偏差を意味する。
【０１２８】
結果
表１８．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１２９】
【表１９】
【０１３０】
表１９．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１０産生。ＩＬ−１０はＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１３１】
【表２０】
【０１３２】
表２０．ＬＰＳを用いた、ヒト・ベータ・ディフェンシン、デキサメタゾン、又はインフリキシマブを用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＩＬ−１β産生。ＩＬ−１βはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１３３】
【表２１】
【０１３４】
ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３、及びｈＢＤ４バリアントの効果を、ＬＰＳで処置された及び処置されていないヒトＰＢＭＣで試験した（表１８、１９及び２０）。比較のために、ｒｈＢＤ２を各々の設定に含めた。
【０１３５】
全てのディフェンシンに関して、ＴＮＦは下方制御された。ＩＬ−１β分泌の減少は、ＴＮＦと同等であったが、ＴＮＦほど顕著ではなかった。ｈＢＤ２及びｈＢＤ４バリアントに関して、ＩＬ−１０の分泌は、有意に且つ用量依存的に上昇した。
【０１３６】
ｈＢＤ３は１０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍｌで試験され、並びにｈＢＤ４バリアントは４０μｇ／ｍｌで試験された；しかし、これらの濃度においていずれの分子も毒性であったために、毒性効果と抗炎症性効果とを区別することができなかった。
【０１３７】
ＴＮＦの下方制御のポジティブ・コントロールとして、２つの抗炎症性化合物、デキサメタゾン及びインフリキシマブが当該設定中に含まれた。
【０１３８】
結論
全ての試験されたヒト・ベータ・ディフェンシンは、抗炎症潜在力を示した。
【０１３９】
実施例４
ヒトの単球由来樹状細胞及びヒトＰＢＭＣの、ＩＬ−２３の減少
実施例４は、ヒトＰＢＭＣに関して基本的に実施例２で記載された通りに行われた；しかし、読み出しはＴＮＦ、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１０の代わりにＩＬ−２３であった。さらに、ヒトの単球由来樹状細胞におけるｒｈＢＤ２の効果が同様に調べられた。
【０１４０】
単球由来樹状細胞（ＤＣ）の生成
ＤＣは、Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．によって初めに記載された改良手順に従って調製された。簡潔に述べると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ（ＧＥ−ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）グラジエントをかけた遠心分離によって、健常なドナーの軟膜から精製された。製造業者の使用指示に従った、マグネティックビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による、ＣＤ１４＋細胞の正の選択によって、単球をＰＢＭＣから単離した。ＣＤ１４＋単球を、ＲＰＭＩ／２％ヒトＡＢ血清、組換え型ヒト顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）中で６日間、６ウェルプレート中で培養し、２日後、及び５日後に培地／サイトカインを再補充した。培養６日後、未熟ＤＣを９６ウェルプレート中で１×１０6細胞／ｍｌの濃度で再度培養し、そしてさらに２４時間、カクテル、及び／又はｈＢＤ２で、処置されなかったか、又は処置された。ｈＢＤ２を４つの濃度で、４通りで試験した。ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含む炎症性カクテルを用いて、ｈＢＤ２は、炎症性フェノタイプへのｈＤＣ成熟を抑制するその能力を分析された。デキサメタゾンを加え、２０時間後に当該カクテルを、臨床的抗炎症活性を有することが証明されている化合物のためのポジティブ・コントロールとして加えた。ｈＢＤ２とのインキュベーションを行い、４時間後にカクテルを加えた。
【０１４１】
サイトカインＥＬＩＳＡ
細胞培養上清を回収し、−８０℃で保存した。製造業者の手順（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って、市販の抗体及びスタンダードを用いた標準的サンドイッチＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２３の量を測定した。
【０１４２】
ＭＴＴアッセイ
ビヒクル、カクテル、又はｈＢＤ２を用いた処置によって任意の細胞が大幅に影響を受けるか否かを評価するために、４８時間後の細胞の生存の測定において、ＭＴＴ系細胞増殖決定キットを使用し、製造業者の手順（Ｓｉｇｍａ）に従って行った。
【０１４３】
統計学的分析
全ての実験は少なくとも２回行われ、代表的な結果を示す。示されたデータは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表現された。表の説明文に記載されたように、変数が処置（ｈＢＤ２、デキサメタゾンなど）及び刺激（ＬＰＳ、ＬＴＡ、ペプチドグリカンなど）である、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを行い、その後Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定を行うことによって、統計的有意性を決定した。差はｐ＜０．０５で有意であると考えられた。
【０１４４】
結果
表２１．培地（未刺激）、又はＬＰＳ及びＩＦＮ−γのいずれかで刺激され、培地（未処置）、ｈＢＤ２、又はデキサメタゾンのいずれかで処置された、ヒトＣＤ１４+単球由来樹状細胞の上清中のＩＬ−２３（ｐｇ／ｍｌ）、平均（ＳＥＭ）、Ｎ＝４、３人の内１人の代表的ドナー。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって未処置細胞と比較。ｎｄ：検出されず（検出限界未満）。
【０１４５】
【表２２】
【０１４６】
表２２．培地（コントロール）、０．６ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、２０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、又は５μｇ／ｍｌ ＬＴＡのいずれかで刺激され、ｈＢＤ２、デキサメタゾン、又はインフリキシマブで処置された、ヒトＰＢＭＣの上清中のＩＬ−２３（ｐｇ／ｍｌ）、平均（ＳＥＭ）。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析、Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較事後検定によって未処置細胞と比較。
【０１４７】
【表２３】
【０１４８】
表２１に示された通り、ｈＢＤ２は、有意に且つ用量依存的に、ヒトＣＤ１４+単球由来樹状細胞からのＩＬ−２３分泌を抑制した。
【０１４９】
ヒトＰＢＭＣに関して、ＩＬ−２３分泌はまた、有意に抑制された（表２２）。これらの細胞において、逆の用量依存性が存在し、そしてそれは、より低用量のｈＢＤ２を試験したとき、鐘形の用量−反応阻害曲線であることが分かった（データを示さず）。
【０１５０】
これは、ＩＬ−２３分泌の抑制によって、ｈＢＤ２が慢性自己免疫状態の抑制効果を有し、したがってＩＬ−２３が、炎症性応答において重要な役割を果たすことを示している。Ｔｈ１７細胞は、それらの生存及び増殖に関して、ＩＬ−２３に依存しており、そしてＴｈ１７細胞は、幾つかの自己免疫疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、及び多発性硬化症の病因であることが示されている。
【０１５１】
実施例５
マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）を用いた、ＰＢＭＣからのＴＮＦ分泌の減少
実施例５は基本的に、ヒトＰＢＭＣに関して、実施例２に記載された通りに行われた。実施例１においてｈＢＤ２の産生のために使用された手順と同一のものを使用して、マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）を調製した。ｍＢＤ３のアミノ酸配列は配列番号６に示される。マウスＰＢＭＣを、以下に記載した通りに調製した。
【０１５２】
マウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離及び刺激
マウス末梢血単核細胞を、１０匹のＮＭＲＩマウスの血液から単離した。要約すれば、ヘパリン添加血液をＲＰＭＩで１／１（ｖ／ｖ）で希釈し、そして２時間以内でＦｉｃｏｌｌ密度遠心分離にかけた。血漿を上清から回収し、そして廃棄された。単離されたＰＢＭＣを培養培地（ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ，４２４０１）ｗ／１％ペニシリン及びストレプトマイシン並びに１％ Ｌ−グルタミン）中で再度懸濁し、そして９６ウェル培養プレートに、１ウェルあたり１５５．５００個の細胞で、全体で２００μｌとなるようにまいた。１００、１０、又は１μｇ／ｍｌのｈＢＤ２又はｍＢＤ３（マウス・ベータ・ディフェンシン３）を；それ単体で、又は、２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｏ１１１：Ｂ４，Ｓｉｇｍａ Ｌ４３９１）と共に用いて、同一のドナーからのＰＢＭＣを刺激した。ＬＰＳ刺激をした及びしていない培地へ、デキサメサゾンを３．５ｎｇ／ｍｌ加えた。３７℃で２４時間インキュベーション後に上清を回収し、そしてサイトカインの測定まで−８０℃で貯蔵した。
【０１５３】
ＦＡＣＳアレイ・フローサイトメーターにおける製造業者の使用説明に従って、マウス炎症サイトメトリック・ビーズアレイ（ＣＢＡ）を用いたフローサイトメトリーによって、上清におけるサイトカインの産生を測定した。
【０１５４】
上清を回収後、生存率をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，ＤＡＬＬ１１００）によって測定した。
【０１５５】
結果
表２３．ＬＰＳを用いた、ｈＢＤ２を用いた及び用いない処置後における、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。全ての試料を同一のドナーで試験された。２人のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（Ｎ＝２）。
【０１５６】
【表２４】
【０１５７】
表２４．ＬＰＳを用いた、ｍＢＤ３を用いた及び用いない処置後における、マウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＴＮＦ産生。２匹のドナーからの代表的実験。ＴＮＦはＦＡＣＳアレイ上でのサイトメトリック・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）によって測定された。***ｐ＜０．００１、各々のコントロールと比較。２−ｗａｙ ＡＮＯＶＡによって分析（Ｎ＝２）。
【０１５８】
【表２５】
【０１５９】
表２３に示された通り、マウス・ベータ・ディフェンシン３（ｍＢＤ３）は、ヒトＰＢＭＣからのＴＮＦの分泌を、ｈＢＤ２及びデキサメタゾンと同程度まで下方制御した。ｍＤＢ３はまた、マウスＰＢＭＣからのＴＮＦの分泌を下方制御した（表２４）。
【０１６０】
したがってこの設定において、ｍＢＤ３は、すぐれた抗炎症活性を示した。
【０１６１】
【表２６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチの治療のための医薬の製造における、哺乳動物のベータ・ディフェンシンの使用。
【請求項２】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、非経口で、好ましくは皮下又は静脈内投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日当たり約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、又はヒト・ベータ・ディフェンシン４である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
治療を必要とする対象へ、有効量の哺乳動物のベータ・ディフェンシンを投与することを含む、関節リウマチの治療方法。
【請求項１０】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、非経口で、好ましくは皮下又は静脈内投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシン又はその機能的に等価なバリアントが、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、又はヒト・ベータ・ディフェンシン４である、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
関節リウマチの治療のための医薬の製造における、哺乳動物のベータ・ディフェンシンの使用。
【請求項２】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、非経口で、好ましくは皮下又は静脈内投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日当たり約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、又はヒト・ベータ・ディフェンシン４である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
治療を必要とする対象へ、有効量の哺乳動物のベータ・ディフェンシンを投与することを含む、関節リウマチの治療方法。
【請求項１０】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、非経口で、好ましくは皮下又は静脈内投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシン又はその機能的に等価なバリアントが、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物のベータ・ディフェンシンが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒト・ベータ・ディフェンシンが、ヒト・ベータ・ディフェンシン１、ヒト・ベータ・ディフェンシン２、ヒト・ベータ・ディフェンシン３、又はヒト・ベータ・ディフェンシン４である、請求項９に記載の方法。
【公表番号】特表２０１１−５２８３３４（Ｐ２０１１−５２８３３４Ａ）
【公表日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１７９５６（Ｐ２０１１−５１７９５６）
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５９２５５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００７１６８
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５１００６２３９８）ノボザイムス アデニウム バイオテック アクティーゼルスカブ (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５９２５５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００７１６８
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５１００６２３９８）ノボザイムス アデニウム バイオテック アクティーゼルスカブ (8)
【Ｆターム（参考）】
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