塩を用いた蛋白のフロキュレーション
例えば組換え蛋白を単離するための分離方法を開示する。この方法は、蛋白を有する培地中で第１陽イオンおよび第１陰イオンを有する固体を形成させること、ならびにその蛋白からその固体を分離することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年９月１５日に出願された米国仮出願第６０／７１７８３８号の利益を主張するものであり、その全体を出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
本発明は、分離方法、例えば１つまたは複数の可溶性不純物、細胞、細胞片、または不溶性不純物などの不純物を含む液体から精製された生成物を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオテクノロジー産業の中で、商業規模で蛋白を精製することは、治療目的および診断目的の組換え蛋白の開発への重要な課題である。収量、純度、および処理量に関する問題に製造部門は取り組んでいる。組換え蛋白の技術が出現したことで、関心対象の蛋白は、その蛋白をコードしている遺伝子を発現するように操作された培養真核宿主細胞系を使用して産生させることができる。しかし、宿主細胞の培養プロセスの結果として生じうるものは、所望の蛋白と、蛋白変異体などのその蛋白自体に由来するか、または宿主細胞の蛋白、ＤＮＡ、および細胞片などの宿主細胞に由来するかのいずれかの不純物との混合物である。医薬用途への所望の組換え蛋白の使用は、これらの不純物から十分なレベルの蛋白を確実に回収できることを条件とすることがある。組換え技法は、自然界に見出されない蛋白、例えば新規な突然変異蛋白、融合蛋白、または培地への蛋白分泌を指令する異種シグナル配列を有する蛋白を産生させることもできる。組換え蛋白は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０骨髄腫細胞、およびピキア・パストリス酵母細胞を含めた多くの真核細胞型に発現させることができる。
【０００４】
典型的には、組換え蛋白を産生させるために、発現させる蛋白をコードしている遺伝子を、所望の細胞型にその遺伝子の転写および翻訳を指令するための適切な配列と共に含む組換えＤＮＡベクターが作製される。ベクターは、例えば薬物耐性遺伝子である選択マーカーもしくは逆選択マーカーなどの配列、および／または蛋白発現配列の安定した保持を促進するように設計された配列を含むこともある。哺乳動物細胞については、プラスミドベクターおよびウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターを使用することができる。
【０００５】
ベクターの作製に続いて、次にベクターを細胞に導入する。ベクターは、標準的な方法、例えばリポフェクション、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、またはバイオリスティックス（遺伝子銃）を使用して裸のＤＮＡとしてトランスフェクトすることができる。ウイルスベクターは、ウイルス粒子を用いた感染により導入することができる。次に、ベクターを含有する細胞を求めて細胞をスクリーニングまたは選択する。
【０００６】
ベクターを含有し、組換え蛋白を発現する細胞は液体培地中または固体支持体上で生育させることができ、蛋白はその細胞培養物から単離することができる。哺乳動物細胞の密度は、１０６細胞／ｍＬから２×１０７細胞／ｍＬ以上の範囲である。大部分の蛋白は分泌される。分泌された蛋白の濃度は、４ｍｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの範囲になりうる。しかし、蛋白が細胞内で産生される場合は、細胞を破壊して蛋白を放出させるが、蛋白が分泌される場合は、細胞および細胞片を除去した後で生育培地または支持体から蛋白を単離することができる。次に、単離した蛋白は精製することができる。
【０００７】
細胞および細胞片を除去するために使用される従来の生物薬剤学的蛋白精製方法には、遠心分離、精密濾過、およびデプスフィルターがある。珪藻土などの濾過助剤は、これらの工程の能率を高めるために使用することができるが、濾過助剤は常に有効とは限らず、関心対象の産物に有意に結合することがある。濾過助剤の使用は、大規模な生物薬剤的作業の一部としては厄介でありうる固体または均質懸濁液の添加もまた必要とすることがある。
【０００８】
高分子凝集剤は、哺乳動物細胞培養のプロセス流れを清澄化することを助けるために使用することができるが、高分子凝集剤には限界がある可能性がある。例えば、加工助剤として典型的には使用される硫酸プロタミン製剤は、関心対象の蛋白の不活性化または沈殿析出による産物の損失に関する懸念のせいで適用が限定されている（Ｓｃｏｐｅｓ、１９８７）。医学用途のために販売されているような高品質試薬は高価なことがある。場合によっては、非常に低レベルまでの除去には、患者に予期しない作用がないことを保証するための確認が欠かせないことがある。例えば、キトサンは詳細に明らかにされた試薬ではなく、清澄化の適用に日常的に使用するには、その一貫した能率に関して懸念がある。ＤＥＡＥデキストランなどの多荷電ポリマー、廃水処理に使われることの多いアクリルアミド系ポリマー（ＮＡＬＣＯ Ｗａｔｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第８章）、およびポリエチレンアミン（ＰＥＩ）は、清澄化の適用での使用が考えられてきた。後者の２種類のポリマーに関して、アクリルアミド試薬は有毒試薬の混入の可能性があり、ポリエチレンアミンは高度に有効な清澄化試薬であるが、多くの場合、発癌物質の疑いのある様々な量のエチレンイミンモノマーが混入している（Ｓｃａｗｅｎら）。さらに、ＰＥＩを含めたこれらのポリマーの多くは、多数のクロマトグラフィー樹脂にほぼ非可逆的に結合することによって、下流の加工処理の選択肢が限られる傾向がある。これらのポリマーに関連する規制の問題および原料再利用の問題が、主として学術研究への応用を制限してきた。
【０００９】
ミョウバンおよび鉄塩などの非ポリマー系凝集剤は、廃水処理産業で利用されてきた（ＮＡＬＣＯ Ｗａｔｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）。これらの物質は蛋白産物に結合することがあり、また化学反応を触媒して安全性または有効性に影響しうる蛋白の修飾を招くおそれがあることから、これらの物質は蛋白産物の加工処理に有用ではないと考えられよう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は分離方法に関する。この分離方法は、１つまたは複数の可溶性不純物、不溶性不純物、細胞、または細胞片などの不純物を含有する液体から組換え蛋白などの蛋白を単離するために使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本発明は、不純物の除去を助ける沈殿を形成することができる１つまたは複数（例えば２つ以上）の可溶性溶液を液体に添加することを含む分離方法を特徴とする。この沈殿は不純物の方に強く結合し、標的産物にはあまり強く結合しない。この溶液には、例えば一緒に混合したときに、例えば粒子、コロイド物質、細胞片、または細胞と相互作用することができ、不溶性の沈殿を形成する可溶性陽イオン、例えば金属イオンおよび／または可溶性陰イオンが含まれうる。結果として生じた沈殿は、精密濾過、デプス濾過、または遠心分離などの固液分離技法を使用して清澄化または除去することができる。処理された液体は、同様に加工処理された未処理の液体に比べて低い不純物レベルを有しうる。
【００１２】
不純物は、液体中に懸濁状態で見出される要素に関係することがある。いくつかの実施形態では、不純物にはコロイド物質、粒子状物質、細胞、膜断片などの細胞片、および典型的な加工条件で不溶性のその他の大きな細胞複合体が含まれる。不純物は、典型的な加工条件で可溶性のままである細胞構成要素を意味することもある。ＤＮＡ、宿主細胞蛋白、およびリン脂質は、清澄化のときに溶液状態で存在する細胞構成要素の例である。さらに、不活性アイソフォームまたは凝集した種などの可溶性の産物関連不純物も存在することがある。
【００１３】
不純物のレベルは、様々な方法により評価することができる。液体中の破片の量の尺度を与える一方法は、濁度の比濁（ｎｅｐｈａｌｏｍｅｔｒｉｃ）測定である。あるいは、破片のレベルは、既知の容量の液体を加工するために必要なメンブランフィルターの面積を測定することにより評価することができる。特異的な不純物は、液体に可溶性で、評価に特異的生化学試験を必要とすることもある。ＤＮＡレベルは、市販の色素であるＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号Ｐ−７５８１）を使用することなどにより、蛍光測定に基づく方法を使用して測定することができる。代わりの取り組みには、スロットブロット技法などのハイブリダイゼーション法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）がある。宿主細胞の蛋白レベルは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法、逆相クロマトグラフィー法、または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）法により評価することができる。リン脂質は、薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーにより分析することができる。
【００１４】
生じた沈殿は、懸濁状態の不純物および可能性不純物の両方と相互作用することがあり、この相互作用は、精製した液体中のこれらの不純物のレベルを減少させることがある。結果として、この分離方法は、費用節減および／または時間節約、ならびに例えば組換え蛋白の産生のために哺乳動物細胞培養物を使用する工業プロセスのための産物の品質向上をもたらすことができる。
【００１５】
別の態様では、本発明は、その後のクロマトグラフィー工程の能率、例えばプロテインＡクロマトグラフィー工程の能率を高めることを特徴とする。プロテインＡクロマトグラフィーは、典型的にはスタフィロコッカス・アウレウスのプロテインＡが固定化された樹脂に無細胞馴化培地を直接適用することにより行われる。この樹脂は、続いて中性ｐＨ（ｐＨ約６〜８）の水溶液で洗浄し、結合した蛋白は、多くの場合、酸性緩衝液で溶出させる。それに続く加工処理の前に、溶出液のプールは中性ｐＨに調整する。プロテインＡの溶出液のプールは、特に高密度細胞培養物を負荷に使用した場合に、中和時に沈殿することが多い。本発明によると、プロテインＡ工程による宿主細胞蛋白の除去は、未処理液体に比べて負荷物を金属および陰イオンで処理した場合の方が大きい。複数の実施形態では、負荷する液体を陽イオンおよび陰イオンで処理しておいた場合に、中和時のプロテインＡのピークの沈殿析出が少なくなることが多く、加工処理の向上となっている。
【００１６】
別の態様では、本発明は２つの可溶性薬剤の選択を特徴とし、これらの薬剤は、混合すると固体を形成し、その固体は、適切な条件で高い産物回収率を伴って加工処理液の純度を向上することができる。これらの薬剤には、カルシウム、マンガン、マグネシウム、アルミニウム、コバルト、ニッケル、炭酸塩、フッ化物、亜硫酸塩、リン酸塩、ケイ酸塩、およびアルギン酸塩がありうるが、それに限定されるわけではない。これらの化合物は、金属への好ましいリガンドである多価金属イオンと、一価陰イオンまたはその代わりに多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔまたはｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）陰イオンとの組合せに相当する。これらの陽イオンおよび陰イオンの塩は、やや溶けにくい複合体を潜在的に形成するために適した条件で混合したとき、清澄化の応用に有用性を有することがある。
【００１７】
別の態様では、本発明は、蛋白を含む培地中で第１陽イオンおよび第１陰イオンを有する固体を形成させること、ならびにその蛋白からその固体を分離することを含む方法を特徴とする。
【００１８】
別の態様では、本発明は、蛋白を有する培地に第１陽イオンおよび第１陰イオンを導入すること、その第１陽イオンおよび第１陰イオンを有する固体を沈殿させること、ならびにその蛋白からその固体を分離することを含む方法を特徴とする。
【００１９】
本明細書に記載する方法は、培地、例えば液体培地（例えば混濁した懸濁物）から１つまたは複数の不純物の濾過を容易にするために使用することができる。例えば、これらの方法は、従来の濾過方法を使用した不純物の除去を困難または不都合にしている、１つまたは複数の混濁起因物質を有する培地に使用することができる。したがって別の態様では、本発明は、（ｉ）標的成分（例えば精製すべき成分）と、沈殿または凝集した宿主細胞蛋白、脂質、細胞片、全細胞、沈殿したＤＮＡ、またはプロテインＡのピークを中和したときに形成する沈殿などの１つまたは複数の混濁起因物質とを含む培地（例えば液体培地）中で第１陽イオンおよび第１陰イオンを含む固体を形成させること、ならびに（ｉｉ）例えば濾過によりその溶液からその固体および混濁起因物質を分離することを含む方法を特徴とする。複数の実施形態では、混濁起因物質は、コロイド物質、砂、土などの環境起源由来の粒子状物質、研磨したステンレス鋼微粉、または消泡剤もしくは尿素などの沈殿した賦形剤などの非細胞起源とすることができる。培地（例えば混濁した懸濁物）は、濁度計により測定したときに５ＮＴＵ超、または１００ＮＴＵ超、または５００ＮＴＵ超などの比較的高い濁度を有することがある。いくつかの実施形態では、この固体の存在は培地の濾過性能を増大させることができる。いくつかの実施形態では、処理した培地（例えば工程（ｉ）および（ｉｉ）を行った後の培地）の濁度は、未処理培地よりも小さいことがある。いくつかの実施形態では、標的成分は蛋白（例えば可溶性蛋白、例えば抗体）とすることができる。この方法は、濾過後に溶液から標的成分を回収することをさらに含むことができる。
【００２０】
複数の実施形態は、以下の特徴を１つまたは複数含むことができる。
【００２１】
第１陽イオンは、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオン、アルミニウムイオン、スカンジウムイオン、ランタンイオン、ケイ素イオン、チタンイオン、ジルコニウムイオン、トリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、銅イオン、クロムイオン、鉄イオン、ニッケル、亜鉛イオン、またはバナジウムイオンとすることができる。第１陽イオンはカルシウムイオンとすることができる。
【００２２】
第１陰イオンは、リン酸イオン、炭酸イオン、クロム酸イオン、タングステン酸イオン、水酸化物イオン、ハロゲン化物イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、亜硫酸イオン、モリブデン酸イオン、硝酸イオン、フッ化物イオン、ケイ酸イオン、およびアルギン酸イオンとすることができる。第１陰イオンはリン酸イオンとすることができる。
【００２３】
第１陽イオンはカルシウムイオンとすることができ、第１陰イオンはリン酸イオンとすることができる。
【００２４】
この固体は、約１０−４Ｍ２を超えない溶解度積定数を有することがある。
【００２５】
この方法は、約４ｍＭから約２００ｍＭの第１陽イオンまたは第１陰イオンを培地に導入することをさらに含むことができる。
【００２６】
第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積は、約１０−５Ｍ２、１０−４Ｍ２、または２．７×１０−２Ｍ２を超えることがある。
【００２７】
培地中の第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度は異なることがある。
【００２８】
培地中の第１陽イオンの濃度および第１陰イオン濃度は実質的に同じでありうる。
【００２９】
この方法は、培地のｐＨを変化させることをさらに含むことができる。
【００３０】
培地のｐＨは、約５から約９に維持されることがある。
【００３１】
この方法は、培地中の蛋白の少なくとも約５０％の分離をもたらすことがある。この方法は、培地中の蛋白の少なくとも約７０％の分離をもたらすことがある。
【００３２】
この方法は、清澄化された培地の清澄化された濁度を、その培地と同一で、その固体を有さない第２の清澄化された培地に比べて少なくとも約３０％だけ減少させることをさらに含むことができる。この方法は、清澄化された培地の濁度を、その培地と同一で、その固体を有さない第２の清澄化された培地に比べて少なくとも約５０％だけ減少させることをさらに含むことができる。
【００３３】
培地は細胞を含むことができる。培地は哺乳動物細胞をさらに含むことができる。培地は真核細胞をさらに含むことができる。
【００３４】
この方法は、培地を遠心分離すること、精密濾過膜を通してその培地を濾過すること、またはデプスフィルターを通してその培地を濾過することをさらに含むことができる。
【００３５】
固体は、第２陽イオン種または第２陰イオンをさらに含むことができる。
【００３６】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、第１培地と同一で、固体の形成を有さない第２培地を同様に溶出させたピークよりも低い濁度を有する溶出ピークをもたらすことができる。
【００３７】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、その培地と同一で、固体の形成を有さない第２培地の溶出ピークよりも低い可溶性不純物レベルを有する溶出ピークをもたらすことができる。
【００３８】
第１陽イオンおよび第１陰イオンは連続して導入することができる。
【００３９】
第１陽イオンおよび第１陰イオンは同時に導入することができる。
【００４０】
この方法は、異なる濃度の第１陽イオンおよび第１陰イオンを培地に導入すること、または同一濃度の第１陽イオンおよび第１陰イオンを培地に導入することを含むことができる。
【００４１】
この方法は、培地の温度を調整することをさらに含むことができる。
【００４２】
この蛋白は分泌蛋白とすることができる。その蛋白は、抗体、抗体の抗原結合断片、可溶性受容体、受容体融合体、サイトカイン、成長因子、酵素、または凝固因子とすることができる。
【００４３】
その蛋白が抗体またはその断片である実施形態では、その蛋白は少なくとも１つ、典型的には２つの完全長重鎖、および／または少なくとも１つ、典型的には２つの軽鎖を含むことができる。あるいは、その抗体またはその断片は、抗原結合断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ断片）のみを含むことができる。その抗体またはその断片は、モノクローナル抗体または単一特異性抗体とすることができる。その抗体またはその断片は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで作製された抗体のこともある。なお他の実施形態では、その抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、その抗体は例えばκまたはλから選択される軽鎖を有する。一実施形態では、その抗体の性質を改変するために（例えばＦｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能のうち１つまたは複数を増加または減少させるために）、定常領域が改変、例えば突然変異されている。典型的には、その抗体またはその断片は、前もって決定された抗原、例として例えば神経変性障害、代謝障害、炎症障害、自己免疫障害、および／または悪性障害などの障害に関連する抗原に特異的に結合する。本発明の方法により分離することのできる抗体の例には、Ａβペプチド、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、５Ｔ４、および増殖分化因子８（ＧＤＦ−８）に対する抗体があるが、それに限定されるわけではない。
【００４４】
他の態様、特徴、および利点は、その好ましい実施の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
図１に関して、組換え蛋白などの標的蛋白を分離するための方法３０を示す。方法３０は、その蛋白および（細胞片、細胞、ＤＮＡ、宿主細胞蛋白、および不活性アイソフォームまたは凝集した種などの産物関連不純物を含みうるが、それに限定されるわけではない）不純物を含有する液体に可溶性塩（カルシウム含有塩およびリン酸含有塩など）を添加することを含む（工程３２）。これらの塩溶液は、これらの塩溶液を混合したときの液体におけるｐＨ変化を最小にするため、またはｐＨを最適化するための緩衝化剤を有することがある。接触（例えば混合）したときに、これらの可溶性塩は反応を開始し、培地中で沈降しうる不溶性沈殿（固体リン酸カルシウムなど）を形成することが多い。図１に示すように、続いて培地を所定のｐＨに滴定調節し、必要に応じて温度を調整し（工程３４）、沈殿析出を高めてもよい。沈降途中の沈殿は、細胞および破片、ならびに潜在的にその他の不純物も沈降させるが、標的蛋白は本質的にその液体に引き続き可溶性である。沈殿析出を促進し、清澄化を最適化する一方で高レベルの標的蛋白の回収を維持するために、この液体懸濁液を目標時間適切な条件でインキュベートする（工程３６）。続いて、標的蛋白を含有する液体から沈殿を分離する（工程３８）。この作業は、重力沈降、遠心分離、または濾過を含めた様々な方法で行うことができ、濾過の選択肢には、タンジェンシャルフロー濾過、デプス濾過、荷電媒質を通した濾過、珪藻土が媒質の構成要素であるパッド濾過がある。培地に添加する陽イオンおよび陰イオンの量は、沈殿析出または破片の重力沈降に十分ではないおそれがあるが、それでも濾過助剤として作用することにより濾過を促進することができる。固液分離は、一連の前記選択項目による加工処理すること、典型的には滅菌等級とみなすことができる小さい公称孔径（０．４５、０．２、または０．１μＭなど）に級別されるフィルターを通した液体の通過で最高点に達することを含みうる。本明細書に記載するフロキュレーション方法により清澄化された液体は、一次清澄化の一環として、または遠心分離などの初回固液分離工程後のいずれかで濾過面積が小さくて済むことがある。さらに、パッド後および滅菌等級のフィルター後の濁度は、フロキュレーションしていない対照に比べて有意に低下することがある。
【００４６】
典型的には、その後の精製は、一連のクロマトグラフィー工程により進めることができるが、結晶化および沈殿析出などの他の精製方法を考えることもできる。記載した方法を使用した清澄化の後に、抗体についてはプロテインＡカラムであることが多い第１クロマトグラフィー工程の能率が高まることがある。宿主細胞蛋白を含めた宿主細胞由来不純物の全体的な除去は、フロキュレーション処理を行わないときよりも大きくなりうる。多くの場合で、中和されたプロテインＡの溶出液プールのピークもまた、未処理対照に比べて少ない沈殿析出を有する。この沈殿析出レベルの減少は、より小さいフィルター面積を必要とすることもあり、必要な加工処理時間が短縮することもある。沈殿析出レベルの減少は、望まれない不純物が除去されたことも示している。
【００４７】
理論に縛られることを望まないが、不溶性沈殿は、細胞、細胞片、およびその他のプロセス流れの不純物に選択的に結合するが、蛋白とは有意に相互作用しないことにより、蛋白の分離を高めると考えられる。仮説を立てられた不純物除去プロセスの非限定的な例を下の式（１）に示す：
【００４８】
【化１】
【００４９】
式（１）を参照すると、Ｍ＋は可溶性［すなわち「（ｓ）」］陽イオンであり、Ａ−は、Ｍ＋と相互作用して不溶性の塩または複合体を形成することができる可溶性陰イオンであり、影付きの丸および黒丸は、それぞれ可溶性不純物または不溶性不純物を表し、１は陽イオン−陰イオン塩または複合体と、それに結合した不純物とを含む不溶性沈殿であり（１は本明細書において「最終複合体もしくは塩」または「第１陽イオンおよび第１陰イオンを有する固体」と呼ばれることもある）、下向きの矢印は１が沈殿析出した形態であることを示す。例えばリン酸カルシウムは、ＤＮＡ、宿主細胞蛋白、および細胞片とイオン的および／またはキレート化により相互作用することができるが、標的蛋白と有意には相互作用しない。この選択性によって、その蛋白は上清中に残り、続いて培地および馴化培地のその他の構成要素から容易に分離される。
【００５０】
図１をさらに参照すると、分離方法３０は、第１可溶性塩および第２可溶性塩を培地に導入すること（工程３２）を含む。この培地は、例えば組換え蛋白が形成した馴化水溶液とすることができる。第１可溶性塩は第１陽イオンを含み、第２可溶性塩は第１陰イオンを含む。接触させると、第１陽イオンおよび第１陰イオンは培地中で相互作用することができ、不溶性沈殿の形成を開始することがある。ｐＨまたは温度の液体環境を任意の時間に調整して、沈殿析出条件を最適化することができ（例えば工程３４）、溶液を目標時間インキュベートし、系を完全に平衡状態にさせる（工程３６）。
【００５１】
一般に、関心対象の産物を有する液体中に比較的不溶性の塩または複合体を形成することができる任意の陽イオン（例えば第１陽イオン）／陰イオン（例えば第１陰イオン）の組合せを選択することができる。複数の実施形態では、そのような塩または複合体は、関心対象の産物を有する液体に匹敵する溶液に溶けない、やや溶けにくい、ほとんど溶けない、極めて溶けにくい、または溶けにくいと分かることがある。陽イオン／陰イオンの組合せの例には、選択された陽イオン（例えば第１陽イオン、例えば下記式２のＭ＋）および選択された陰イオン（例えば第１陰イオン、例えば下記式２のＡ−）が、水に比較的不溶性の塩または複合体（例えば下記式２のＭＡ）を形成することができる組合せが含まれる：
【００５２】
【化２】
【００５３】
式中、「（ｓ）」および下向きの矢印は、式（１）に関して定義した通りである。多くの場合、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘまたはｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙまたはその他の類似の参考文献に記載されている水への溶解度の特徴付けは、潜在的能率の適切な指標となる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、選択した陽イオンおよび選択した陰イオンは、水において約１×１０−４Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２（例えば約１×１０−５Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２、約１×１０−６Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２、約１×１０−４Ｍ２から約１×１０−４０Ｍ２）の溶解度積定数（Ｋｓｐ）を有する塩または複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、例示的な陽イオンおよび陰イオンは、第１陽イオンおよび第１陰イオンの溶解度積定数（Ｋｓｐ）（［陽イオン］×［陰イオン］）が例えば約１０−４Ｍ２未満、好ましくは約１０−５Ｍ２または１０−６Ｍ２を下回ると同定することができる。１０−４Ｍ２未満のＫｓｐ値を有する物質はこの方法に利用することができる。それは、その陽イオンおよび陰イオンを混合したときに、これらの物質がそれぞれ最大で１０ｍＭの最終溶液を生じることができ、１０ｍＭを超えたその陽イオンまたは陰イオンの添加は、沈殿およびその後のフロキュレーションを生じることができるからである。上に挙げたよりも高いＫｓｐ値を有する物質を使用することもできるが、固体を形成させるために過剰量の陽イオンおよび陰イオンが必要になるおそれがある。
【００５５】
陽イオン（例えば第１陽イオン）は、アルカリ土類金属、遷移金属、または典型元素でありうる。これらの元素は、硬い酸、境界域の酸（ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ ａｃｉｄ）、または軟らかい酸に分類されることがある。第１陽イオンの例にはカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ２＋）、アルミニウムイオン（Ａｌ３＋）、銅イオン（Ｃｕ（Ｉ）またはＣｕ（ＩＩ））、スカンジウムイオン（Ｓｃ＋３）、ランタンイオン（Ｌａ＋３）、ケイ素イオン（Ｓｉ４＋）、チタンイオン（Ｔｉ（ＩＩＩ）またはＴｉ（ＩＶ））、トリウムイオン、ジルコニウムイオン、マンガンイオン（Ｍｎ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩＩ））、コバルトイオン（Ｃｏ（ＩＩ）またはＣｏ（ＩＩＩ））、クロムイオン（Ｃｒ（ＩＩ）またはＣｒ（ＩＩＩ））、鉄イオン（Ｆｅ（ＩＩ）またはＦｅ（ＩＩＩ））、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）、およびバナジウムイオン（Ｖ（ＩＩＩ）、Ｖ（ＩＶ）、またはＶ（Ｖ））がある。これらは硬い酸および境界域の酸に相当する。第１陰イオンは原子種または分子種とすることができる。いくつかの実施形態では、第１陽イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、またはＮｉ２＋とすることができる。ある実施形態では、第１陽イオンはＣａ２＋とすることができる。
【００５６】
第１陰イオンの例には、使用する金属イオンへの好ましいリガンドである陰イオンがある。硬い酸および境界域の酸について、陰イオンにはフッ化物イオン、リン酸イオン、炭酸イオン、ケイ酸イオン、クロム酸イオン、タングステン酸イオン、水酸化物イオン、亜硫酸イオン、硝酸イオン、モリブデン酸イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、およびクエン酸イオン、ならびにある程度は硫酸イオンおよび過塩素酸イオンが含まれることがある（Ａｑｕａｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗ．ＳｔｕｍｍおよびＪＳ Ｍｏｒｇａｎ編、Ｊ Ｗｉｌｅｙ、（１９８１）、３４３頁；ならびにＲ．Ｇ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第８５巻、３５３３頁（１９６３）参照）。いくつかの実施形態では、第１陰イオンはリン酸イオン、亜硫酸イオン、炭酸イオン、フッ化物イオン、モリブデン酸イオン、またはケイ酸イオンとすることができる。ある実施形態では、第１陰イオンはリン酸イオンとすることができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、第１陽イオンはＣａ２＋とすることができ、第１陰イオンは、リン酸イオン、亜硫酸イオン、炭酸イオン、フッ化物イオン、モリブデン酸イオン、またはケイ酸イオンとすることができる。ある実施形態では、第１陽イオンはＣａ２＋とすることができ、第１陰イオンはリン酸イオンとすることができる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、第１陽イオンは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、またはＮｉ２＋とすることができ、第１陰イオンはリン酸イオン、炭酸イオン、またはフッ化物イオンとすることができる。
【００５９】
第１陽イオンおよび第１陰イオンそれぞれについての初濃度（すなわち（沈殿析出の開始前に）培地に導入される第１陽イオンおよび第１陰イオンの濃度）は、最終複合体の溶解度に応じて約２ミリモル濃度から約２００ミリモル濃度の範囲（例えば約３ミリモル濃度から約２００ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約２００ミリモル濃度、約５ミリモル濃度から約２００ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約１００ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約５０ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約４０ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約３０ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約１０ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度から約８０ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度から約４０ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度から約３０ミリモル濃度、約２０ミリモル濃度から約８０ミリモル濃度、約２０ミリモル濃度から約４０ミリモル濃度、例えば約４ミリモル濃度、約６ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度、約１３．３ミリモル濃度、約１６ミリモル濃度、約２０ミリモル濃度、約２４ミリモル濃度、約３０ミリモル濃度、約３３．３ミリモル濃度、約４０ミリモル濃度、約５０ミリモル濃度、または約８０ミリモル濃度）とすることができる。ある実施形態では、（沈殿析出の開始前に）培地に導入される第１陽イオンの濃度は、約６ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度、約２０ミリモル濃度、約２４ミリモル濃度、約３０ミリモル濃度、約４０ミリモル濃度、約５０ミリモル濃度、または約８０ミリモル濃度とすることができる。ある実施形態では、（沈殿析出の開始前に）培地に導入される第１陰イオンの濃度は、４ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度、約１３．３ミリモル濃度、約１６ミリモル濃度、約２０ミリモル濃度、約２４ミリモル濃度、約３０ミリモル濃度、約４０ミリモル濃度、約５０ミリモル濃度、または約８０ミリモル濃度とすることができる。例えば、（沈殿の開始前に）培地に導入される第１陽イオンの濃度は約３０ミリモル濃度とすることができ、（沈殿の開始前に）培地に導入される第１陰イオンの濃度は約２０ミリモル濃度とすることができる。別の例として、（沈殿の開始前に）培地に導入される第１陽イオンの濃度は約２４ミリモル濃度とすることができ、（沈殿の開始前に）培地に導入される第１陰イオンの濃度は約１６ミリモル濃度とすることができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、第１陽イオンおよび第１陰イオンの上記初濃度の積は、約４×１０−６Ｍ２から約４×１０−２Ｍ２、（例えば約１．６×１０−５Ｍ２から約４×１０−２Ｍ２、約２．５×１０−５Ｍ２から約４×１０−２Ｍ２、約１．６×１０−５Ｍ２から約６．４×１０−３Ｍ２、または約２．５×１０−５Ｍ２から約６．４×１０−３Ｍ２）とすることができる。いくつかの実施形態では、第１陽イオンおよび第１陰イオンの上記初濃度の積は、約１×１０−５Ｍ２超、約２×１０−５Ｍ２超、約１×１０−４Ｍ２超、約２×１０−４Ｍ２超、約１０×１０−４Ｍ２超、または約２．７×１０−２Ｍ２とすることができる。いくつかの実施形態では、これらの濃度は、不純物と一緒になった不溶性塩の有意な沈殿析出を招くことがある。高すぎる濃度は、総液体容量の約１０％を超える固体容量を招くことがある。５００ｍＭを超える陽イオンまたは陰イオンの濃度は、低い溶解度定数を有すると大きな固体容量を与えることがある。大きな固体容量から標準的な固液分離技法を用いて十分な産物を回収することは困難なおそれがある。沈殿の例には、リン酸カルシウム、亜硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、フッ化カルシウム、ケイ酸カルシウム、モリブデン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、フッ化マグネシウム、リン酸マンガン、炭酸マンガン、リン酸コバルト、リン酸ニッケル、および炭酸ニッケルがある。
【００６１】
いくつかの実施形態では、液体培地中の最終的な塩または複合体（例えば式（１）の１、すなわち陽イオン−陰イオンの塩または複合体と、それに結合している不純物とを含む不溶性沈殿）のＫｓｐは、約１×１０−４Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２（例えば約１×１０−５Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２、約１×１０−６Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２、約１×１０−４Ｍ２から約１×１０−４０Ｍ２）とすることができる。いくつかの実施形態では、液体培地中の最終的な塩または複合体のＫｓｐは、例えば約１０−４Ｍ２未満、好ましくは約１０−５Ｍ２または１０−６Ｍ２未満とすることができる。例えば、表１でカルシウム４０ｍＭおよびリン酸２０ｍＭを有する抗ＩＬ１３＃２試料では、遠心分離後（すなわち沈殿析出後）の上清は、カルシウム８．１９ｍＭおよびリン酸１．０４ｍＭを含有した。この可溶性カルシウムおよびリン酸のレベルは８．５×１０−６Ｍ２のＫｓｐに対応する。表１でカルシウム８０ｍＭおよびリン酸２０ｍＭを有する抗ＡＢ＃１試料では、遠心分離後の上清はカルシウム２２．２ｍＭおよびリン酸０．４ｍＭを含有した。この可溶性カルシウムおよびリン酸のレベルは８．４×１０−６Ｍ２のＫｓｐに対応する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、液体培地中の最終的な塩または複合体（例えば式（１）の１）のＫｓｐは、水における陽イオン−陰イオンの塩または複合体自体（すなわち不純物が結合していないもの、例えば式（２）の２）のＫｓｐとは異なる（例えばそのＫｓｐよりも大きい）ことがある。例えば、式（１）および（２）を参照すると、液体中の例えば１（例えばＭＡ＝リン酸カルシウム）のＫｓｐは、水におけるリン酸カルシウム自体（例えばＭＡ＝リン酸カルシウムである式（２）の２）のＫｓｐとは異なる（例えばそのＫｓｐよりも大きい）ことがある。
【００６３】
沈殿を形成するその他の実施を行うことができる。例えば、第１陽イオンおよび第１陰イオンは、実質的に同時または連続的に培地に導入することができる。第１陽イオンがカルシウムイオンであり、第１陰イオンが亜硫酸イオンである実施では、カルシウムを導入する前に培地に亜硫酸塩を導入することで、不純物の沈殿析出を高めることができる（実施例２）。第１陽イオンおよび第１陰イオンの濃度は、実質的に同じこともあり、異なる（陽イオンに富むまたは陰イオンに富む）こともある。例えば一方のイオンの濃度は、もう一方のイオンの濃度の約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、または約５倍の大きさとすることができる。いくつかの実施では、１つを超える陽イオンおよび／または１つを超える陰イオンが培地に導入される。陽イオンの総濃度は、約５ミリモル濃度から約２００ミリモル濃度の範囲とすることができ、陰イオンの総濃度も同様でありうる。ポリマー性溶液を使用する場合、ポリマーの分子量に基づくとｍＭ単位の濃度は実質的に低いおそれがあり、その代わりに濃度はモノマーの分子量に依存することがある。その他の実施では、１つまたは複数の陽イオンのみ、または１つまたは複数の陰イオンのみが培地に導入される。例えば、蛋白を有する培地が沈殿を形成することができる陰イオンまたは陽イオンをすでに含む場合、それぞれ適切な陽イオンまたは陰イオンを添加して沈殿を形成させることができる。あるいは、イオンを添加して、すでに培地中にあるイオンと反応させ、第１沈殿を形成させることができ、そしてさらなる陽イオン／陰イオンの組合せを培地に添加して他の沈殿を形成させることができる。
【００６４】
図１に示すように、この方法は、所望により適切なｐＨに培地を滴定調節することおよび／または温度を調整すること（工程３４）を含むことができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、培地のｐＨを所定のｐＨに調整して沈殿を増大させることができる（工程３４）。培地のｐＨは、例えば塩基（例えばＮａＯＨ）またはリン酸もしくは塩酸などの酸を用いて滴定調節することによって増加または減少させることができる。所定のｐＨは、例えば培地中の陽イオンおよび陰イオン、培地中のその他の物質、ならびに／または培地の組成の関数とすることができる。所定のｐＨは、約５から約９、例えば約６．５から約９の範囲とすることができる。
【００６６】
その他の実施形態では、培地のｐＨは調整されない。
【００６７】
いくつかの実施形態では、培地を加熱または冷却して能率を最適化することがある（工程３４）。ｐＨを調整することと同様に、培地を加熱またはインキュベートする温度および時間は、例えば培地中の陽イオンおよび陰イオン、培地中のその他の物質、ならびに／または培地の組成の関数とすることができる。
【００６８】
培地は室温でインキュベートすることができ、または例えば約３７℃に加熱することができる。インキュベーション時間または加熱時間（工程３６）は、約１時間から約１２時間までの範囲とすることができる。培地をインキュベートまたは加熱する間に、培地は（例えば物質の剪断を低下させるために低速で）混合することができ、または培地は最初の時間混合し、そして沈殿が沈降できるように混合せずに静置させ、それにより蛋白を有する上清を容易に分離させることができる。
【００６９】
その他の実施形態では、沈殿が良好な分離を十分にもたらすならば、培地は加熱しない。
【００７０】
次に、上清からの沈殿の分離を助けるために培地を遠心分離し（工程３８）、それにより上清の濁度は低下する。デプス濾過または精密濾過などのその他の固体除去方法が可能である。下記の実施例に例示するように、フロキュレーションを起こしていない未処理対照溶液に比べて少なくとも約３０％だけ培地の濁度が低下することがある。いくつかの実施では、培地の濁度は少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％以上だけ低下する。本明細書に使用するように、濁度は標準的な手順に従って比濁計（ＨＡＣＨ（ラブランド、コロラド州）により製造されたものなど）を使用して測定する。
【００７１】
遠心分離などによる一次清澄化後に、濾過を用いたさらなる破片除去が行われることがある（工程３８）。下記実施例に例示するように、本明細書に記載する分離方法は、少なくとも約５０％（少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％など）の蛋白回収率で高い収率をもたらすことができる。本明細書に使用するように、回収率は、処理前プール中の標的蛋白の質量に対する処理後のプール中の質量として計算される。産物の質量は、標的蛋白の濃度と容量との積であり、ここで濃度は、高速液体クロマトグラフィーアッセイなどの様々な方法により決定することができる。抗体である標的蛋白について、濃度は、多くの場合プロテインＡに基づく分析方法を使用して決定することができる。生物薬剤用細胞培養、精製、または蛋白の特徴付けの方法の分野の技術者は、適切なアッセイ法を識別することができる。
【００７２】
続いて蛋白は、従来法に従って精製することができる。
【００７３】
蛋白またはポリペプチド
本発明は、液体からの蛋白、例えば可溶性蛋白または分泌蛋白の分離に関する。本明細書に使用する用語「蛋白」は、ユニットとして機能することができる１つまたは複数のポリペプチドを表す。本明細書に使用する「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に結合した連続するアミノ酸鎖を表す。用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸鎖を表すために使用されるが、当業者ならば、この用語が長鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒に結合した２つのアミノ酸を備える最小の鎖を表しうることを理解するであろう。単一のポリペプチドがユニットとして機能できるならば、用語「ポリペプチド」および「蛋白」は相互交換可能に使用することができる。
【００７４】
ある実施形態では、蛋白は組換え産生される。本明細書に使用する用語「組換え発現された蛋白」および「組換え蛋白」は、ヒトの手によってポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞から発現したポリペプチドを表す。ある実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。ある実施形態では、この操作は１つまたは複数の遺伝子修飾を含んでもよい。例えば、発現させるポリペプチドをコードしている１つまたは複数の異種遺伝子の導入により、宿主細胞を遺伝子修飾してもよい。組換え発現された異種ポリペプチドは、宿主細胞で通常発現されるポリペプチドに同一または類似とすることができる。組換え発現された異種ポリペプチドは、宿主細胞にとって外来、例えば宿主細胞で通常発現されるポリペプチドとは異種のこともある。ある実施形態では、組換え発現された異種ポリペプチドはキメラである。例えば、ポリペプチドの一部は、宿主細胞に通常発現されるポリペプチドと同一または類似するアミノ酸配列を有するが、他の部分がその宿主細胞にとって外来のアミノ酸配列を有することがある。さらに、またはあるいは、ポリペプチドは、共に宿主細胞に通常発現される２つ以上の異なるポリペプチド由来のアミノ酸配列を有することがある。さらにポリペプチドは、共に宿主細胞にとって外来の２つ以上のポリペプチド由来のアミノ酸配列を有することがある。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１つまたは複数の内因性遺伝子の活性化またはアップレギュレーションにより遺伝子修飾されている。
【００７５】
本発明により望ましくは分離することができる任意の蛋白は、多くの場合、関心対象の、または有用な、生物活性または化学活性に基づいて選択されるものである。例えば、本発明は、数ある中で任意の医薬的または商業的に関連する抗体、受容体、サイトカイン、成長因子、酵素、凝固因子、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤を分離するために採用することができる。本発明により分離することができる蛋白の以下のリストは、事実上単なる例示であり、限定する列挙であることを意図しない。当業者は、本発明により任意の蛋白を発現させることができることを了解しているものであり、必要に基づいて産生される特定の蛋白を選択することができるものである。
【００７６】
抗体および結合断片
免疫グロブリンとしても公知である抗体は、典型的にはそれぞれ約２５ｋＤａの２つの軽（Ｌ）鎖と、それぞれ約５０ｋＤａの２つの重（Ｈ）鎖とから構成される四量体グリコシル化蛋白である。λおよびκと名付けられた２種類の軽鎖を抗体に見出すことができる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、５つの主クラス、すなわちＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭに割り当てることができ、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。各軽鎖は、１つのＮ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および１つの定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）を含む。各重鎖は、１つのＮ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３つまたは４つのＣドメイン（ＣＨ）、および１つのヒンジ領域を含む。最もＶＨに近いＣＨドメインはＣＨ１と呼ぶ。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と呼ばれる４領域の比較的保存された配列からなり、これらの領域は、３領域の超可変配列（相補性決定領域（ＣＤＲ））の足場を形成している。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を有する。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれるが、軽鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれる。ＣＤＲ３は、典型的には抗体結合部位内の分子多様性の最大の原因である。例えばＨ３は、わずか２つのアミノ酸残基のこともあり、２６個を超えるアミノ酸のこともある。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元立体配置は、当技術分野で十分に公知である。抗体構造の総説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗら編、１９８８を参照されたい。当業者は、各サブユニット構造、例えばＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、ＦＲ構造が、活性な断片、例えばＶＨ、ＶＬ、もしくはＣＤＲサブユニットのうち抗原に結合する部分、すなわち抗原結合断片を備えること、または例えばＣＨサブユニットのうち例えばＦｃ受容体および／または補体に結合し、かつ／もしくは活性化する部分を備えることを認識しているものである。ＣＤＲは、典型的にはＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）、Ｋａｂａｔら編に記載されているＫａｂａｔのＣＤＲを表す。抗原結合部位を特徴付けるための別の基準は、Ｃｈｏｔｈｉａに記載されている超可変ループを参照することである。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：４６２８〜４６３８を参照されたい。なお別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアに使用されるＡｂＭの規定である。一般に例えばＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ハイデルベルク）の中のＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓを参照されたい。ＫａｂａｔのＣＤＲに関して記載された実施形態は、代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａの超可変ループまたはＡｂＭで規定されたループに関する同様に記載された関係を使用して実施することができる。
【００７７】
本明細書に使用される用語「抗体」は、少なくとも１つ、典型的には２つのＶＨドメインもしくはその部分、および／または少なくとも１つ、典型的には２つのＶＬドメインもしくはその部分を備える蛋白を含む。一実施形態では、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖の４量体であり、ここで、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は例えばジスルフィド結合により相互に結合している。抗体またはその部分は、齧歯類、霊長類（例えばヒトおよび非ヒト霊長類）、ラクダ科の動物（例えばラクダまたはラマ）を非限定的に含めた任意の起源から得ることができ、組換え産生、例えばキメラ化、ヒト化することができ、かつ／または本明細書にさらに詳細に記載するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで作製することができる。
【００７８】
抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわちＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる１価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわちヒンジ領域でジスルフィド結合により結合している２つのＦａｂ断片を備える２価断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片、（ｖｉ）ラクダまたはラクダ化可変ドメイン、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ならびに（ｖｉｉｉ）二重特異性抗体がある。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ、およびＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、これらのドメインを蛋白一本鎖として作ることができる合成リンカーにより、組換え法を用いて、これらのドメインを連結することができ、その蛋白一本鎖では、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対を形成して１価分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えばＢｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９〜８３を参照されたい）。このような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合断片」という用語に包含されることが意図される。これらの断片は、当業者に公知の従来技法を使用して得られ、これらの断片は、無傷抗体と同様に機能について評価される。
【００７９】
抗原結合断片は、所望により例えば安定性、エフェクター細胞の機能、または補体結合のうち１つまたは複数を高める部分を含むことができる。例えば、抗原結合断片は、ＰＥＧ化部分、アルブミン、または重鎖もしくは／または軽鎖の定常領域（もしくはその部分）を含むことができる。
【００８０】
「二重特異性」抗体または「二機能」抗体以外では、抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であることが了解されている。「二重特異性」抗体もしくは「二機能抗体」、またはその抗原結合断片は、２つの異なる抗原結合部位を有する人工ハイブリッド抗体またはその断片である。二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合、Ｆａｂ’断片同士の結合、または組換えを含めた様々な方法により産生することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８、１５４７〜１５５３（１９９２）を参照されたい。
【００８１】
抗体またはその抗原結合断片を得るために、当業者に公知の数多くの方法が利用できる。例えば、モノクローナル抗体は、公知の方法によるハイブリドーマの作製により産生させることができる。次に、この方法で形成したハイブリドーマは、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））分析などの標準法を用いてスクリーニングし、特定抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つまたは複数のハイブリドーマを同定する。任意の形態の特定の抗原は、免疫原として、例えば組換え抗原、天然形態、任意の変異体、またはその断片、およびその抗原性ペプチドとして使用することができる。
【００８２】
抗体を作る方法の一例は、蛋白発現ライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えばＬａｄｎｅｒら、米国特許第５２２３４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１３１５〜１３１７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；およびＷＯ９０／０２８０９に記載されている。
【００８３】
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、特定抗原は、非ヒト動物、例えば齧歯動物、例えばマウス、ハムスター、またはラットを免疫するために使用することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を有して、マウス抗体産生を欠損したマウス系統を操作して創出することができる。ハイブリドーマ技法を使用して、所望の特異性を有する、遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体を産生させ、選択してもよい。例えばＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７：１３〜２１、ＵＳ２００３−００７０１８５、１９９６年１０月３１日に公表されたＷＯ９６／３４０９６、および１９９６年４月２９日に提出されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８を参照されたい。
【００８４】
別の実施形態では、モノクローナル抗体を非ヒト動物から得て、次に当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法を使用して修飾抗体、例えばヒト化抗体、脱免疫化抗体、キメラ抗体を産生してもよい。キメラ抗体を製造するための様々なアプローチが記載されている。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１、１９８５；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２、１９８５；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４８１６５６７号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４８１６３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開ＥＰ１７１４９６；欧州特許公開０１７３４９４；英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂを参照されたい。ヒト化抗体は、例えばヒト重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現するが、内因性のマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現することができないトランスジェニックマウスを使用して産生させることもできる。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体を調製するために使用することができる例示的なＣＤＲグラフト化方法を記載している（米国特許第５２２５５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全てを非ヒトＣＤＲの少なくとも部分と交換することができ、またはＣＤＲの一部だけを非ヒトＣＤＲと交換することができる。所定の抗原にヒト化抗体を結合させるために、必要な数のＣＤＲを交換することだけが必要である。
【００８５】
ヒト化抗体またはその断片は、抗原の結合に直接は関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメイン由来の等価の配列に交換することにより作製することができる。ヒト化抗体またはその断片を作製するための方法の例は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４；およびＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ５８５９２０５；およびＵＳ６４０７２１３に示されている。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つ由来の免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全てまたは一部をコードしている核酸配列を単離、操作、および発現させることを含む。そのような核酸は、上記の所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから、およびその他の起源から得ることができる。次に、ヒト化抗体分子をコードしている組換えＤＮＡは、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
【００８６】
ある実施形態では、ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列の置換、生殖細胞系列置換、および／または復帰突然変異の導入により最適化される。そのような改変された免疫グロブリン分子は、当技術分野で公知の任意のいくつかの技法により作ることができ（例えばＴｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：７３０８〜７３１２、１９８３；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２７９、１９８３；Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２：３〜１６、１９８２）、またはＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３またはＥＰ０２３９４００の教示に従って作ることもできる）。
【００８７】
抗体またはその断片は、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に開示された方法により、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失、すなわち「脱免疫化」により修飾することもできる。簡潔には、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて、抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを分析することができる。これらのペプチドは（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に規定されるように）潜在的Ｔ細胞エピトープに相当する。潜在的Ｔ細胞エピトープを検出するために、「ペプチドスレディング（ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」という名のコンピュータモデリングの取り組みを適用することができ、さらに、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載されているようにＶＨ配列およびＶＬ配列に存在するモチーフについて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは１８個の主要ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのうち任意のものに結合し、したがって、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成している。検出された潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは１アミノ酸置換によって除去することができる。典型的には、保存的置換が行われる。全ての場合ではなく多くの場合に、ヒト生殖細胞系列抗体配列中のある位置に共通のアミノ酸を使用することができる。ヒト生殖細胞系列配列は、例えばＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、第１６（５）巻：２３７〜２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：４６２８〜４６３８に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリーは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の総合ディレクトリー（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ケンブリッジ、英国）による編集）を提供している。これらの配列は、例えばフレームワーク領域およびＣＤＲについてのヒト配列の起源として使用することができる。ＵＳ６３０００６４に記載されているようにヒトのコンセンサスフレームワーク領域もまた使用することができる。
【００８８】
ある実施形態では、抗体は、改変された免疫グロブリン定常領域またはＦｃ領域を有することがある。例えば、本明細書における教示により産生された抗体は、補体受容体および／またはＦｃ受容体などのエフェクター分子に強くまたはより高い特異性で結合することがあり、このことは、エフェクター細胞活性、溶解、補体介在性活性、抗体の除去、および抗体の半減期などのいくつかの抗体の免疫機能を制御することができる。抗体のＦｃ領域に結合する典型的なＦｃ受容体（例えばＩｇＧ抗体）には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎサブクラスという受容体が、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングされた形態を含めて含まれるが、それに限定されるわけではない。Ｆｃ受容体は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ９：４５７〜９２、１９９１；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２５〜３４、１９９４；ならびにｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１、１９９５）に総説されている。
【００８９】
本発明の方法により分離することができる抗体の非限定的な例には、Ａβ、ＩＬ−１３、ＩＬ−２２、ＧＤＦ８、および５Ｔ４に対する抗体があるが、それに限定されるわけではない。これらの抗体のそれぞれは、本明細書下記および添付の実施例にさらに詳細に記載されている。
【００９０】
抗Ａβ抗体
添付の実施例に記載したように、抗ＡＢ抗体は本発明の方法により分離することができる。用語「ＡＢ抗体」、「Ａβ抗体」、「抗Ａβ抗体」、および「抗Ａβ」は本明細書において相互交換可能に使用され、ＡＰＰ、Ａβ蛋白、またはその両方の１つまたは複数のエピトープまたは抗原決定基に結合する抗体を表す。エピトープまたは抗原決定基の例は、ヒトアミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）に見出すことができるが、好ましくはＡＰＰのＡβペプチドに見出される。ＡＰＰの複数のアイソフォーム、例えばＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０が存在する。ＡＰＰの中のアミノ酸は、ＡＰＰ７７０アイソフォームの配列に従って番号が割り付けられる（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｐ０５０６７号を参照のこと）。Ａβ（本明細書においてβアミロイドペプチドおよびＡベータとも呼ばれる）ペプチドは、ＡＰＰの３９〜４３アミノ酸の約４ｋＤａの内部断片である（Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３）。例えばＡβ４０は、ＡＰＰの残基６７２〜７１１からなり、Ａβ４２はＡＰＰの残基６７２〜７１３からなる。異なるセクレターゼ酵素によるＡＰＰのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ蛋白分解プロセシングの結果として、Ａβは「短鎖型」の長さ４０アミノ酸および長さ４２〜４３アミノ酸の「長鎖型」の両方で見出される。エピトープまたは抗原決定基は、ＡβペプチドのＮ末端内に位置することがあり、それらは、Ａβのアミノ酸１〜１０、好ましくはＡβ４２の残基１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、２〜７、３〜６、もしくは３〜７の残基、またはＡβの残基２〜４、５、６、７、もしくは８、Ａβの残基３〜５、６、７、８、もしくは９、またはＡβ４２の残基４〜７、８、９、もしくは１０の中の残基を含む。「中心部（ｃｅｎｔｒａｌ）」エピトープまたは抗原決定基は、Ａβペプチドの中心部または中央部に位置し、Ａβのアミノ酸１６〜２４、１６〜２３、１６〜２２、１６〜２１、１９〜２１、１９〜２２、１９〜２３、または１９〜２４の中の残基を含む。「Ｃ末端」エピトープまたは抗原決定基は、ＡβペプチドのＣ末端の中に位置し、Ａβのアミノ酸３３〜４０、３３〜４１、または３３〜４２の中の残基を含む。
【００９１】
様々な実施形態では、Ａβ抗体は末端特異的である。本明細書に使用する用語「末端特異的」は、ＡβペプチドのＮ末端残基またはＣ末端残基に特異的に結合するが、同じ残基を備える長鎖Ａβ種の中またはＡＰＰの中に存在すると同残基を認識しない抗体を表す。
【００９２】
様々な実施形態では、Ａβ抗体は「Ｃ末端特異的」である。本明細書に使用する用語「Ｃ末端特異的」は、Ａβペプチドの遊離Ｃ末端を特異的に認識する抗体を意味する。Ｃ末端特異的Ａβ抗体の例には、残基４０で終止するＡβペプチドを認識するが、残基４１、４２、および／または４３で終止するＡβペプチドを認識しない抗体；残基４２で終止するＡβペプチドを認識するが、残基４０、４１、および／または４３で終止するＡβペプチドを認識しない抗体などが含まれる。
【００９３】
一実施形態では、抗体は３Ｄ６抗体もしくはその変異体、または１０Ｄ５抗体もしくはその変異体とすることができ、これら抗体の両方が米国特許公開番号２００３／０１６５４９６Ａ１、米国特許公開番号２００４／００８７７７７Ａ１、国際特許公開ＷＯ０２／４６２３７Ａ３に記載されている。３Ｄ６および１０Ｄ５の記載は、例えば国際特許公開ＷＯ０２／０８８３０６Ａ２および国際特許公開ＷＯ０２／０８８３０７Ａ２にも見出すことができる。３Ｄ６は、ヒトβアミロイドペプチドに位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基１〜５に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。比較すると、１０Ｄ５は、ヒトβアミロイドペプチドに位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基３〜６に特異的に結合するｍＡｂである。別の実施形態では、抗体は、米国特許公開番号２００４００８２７６２Ａ１および国際特許公開ＷＯ０３／０７７８５８Ａ２に記載されているような１２Ｂ４抗体またはその変異体であってもよい。１２Ｂ４は、ヒトβアミロイドペプチドに位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基３〜７に特異的に結合するｍＡｂである。なお別の実施形態では、抗体は、米国特許出願第１０／８５８８５５号および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／１７５１４に記載されている１２Ａ１１抗体またはその変異体であってもよい。１２Ａ１１は、ヒトβアミロイドペプチドに位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基３〜７に特異的に結合するｍＡｂである。なお別の実施形態では、抗体は、米国特許出願第１０／７８９２７３号および国際特許出願ＷＯ０１／６２８０１Ａ２に記載されている２６６抗体とすることができる。本発明に使用するために、ヒトβアミロイドペプチドに位置するＣ末端エピトープに特異的に結合するように設計された抗体には、米国特許第５７８６１６０号に記載されている３６９．２Ｂがあるが、それに限定されるわけではない。
【００９４】
例示的な実施形態では、抗体はＡβペプチドに選択的に結合するヒト化抗Ａβペプチド３Ｄ６抗体である。さらに具体的には、このヒト化抗Ａβペプチド３Ｄ６抗体は、（例えばアルツハイマー病を患う患者での）脳の斑沈着に見出されるヒトβアミロイド１〜４０ペプチドまたは１〜４２ペプチドに位置するＮＨ２末端エピトープに特異的に結合するように設計されている。
【００９５】
抗ＡＢ抗体を使用して、アミロイド病、特にアルツハイマー病を治療することができる。用語「アミロイド病」には、不溶性アミロイド線維の形成または沈着に関連する（か、またはそれによって引き起こされる）任意の疾患が含まれる。アミロイド病の例には、全身性アミロイドーシス、アルツハイマー病、成人発症型糖尿病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、およびプリオン関連伝染性海綿状脳症（ヒトにおけるクールーまたはクロイツフェルト−ヤコブ病、ならびにそれぞれヒツジおよびウシにおけるスクレーピーおよびＢＳＥ）があるが、それに限定されるわけではない。沈着する線維のポリペプチド構成要素の性質によって、種々のアミロイド病が規定または特徴付けされている。例えば、アルツハイマー病を有する対象または患者においてβアミロイド蛋白（例えば野生型、変異型、または短縮型βアミロイド蛋白）は、特徴的なアミロイド沈着のポリペプチド構成要素である。したがって、アルツハイマー病は、例えば対象または患者の脳における「Ａβの沈着を特徴とする疾患」または「Ａβの沈着と関連する疾患」の一例である。用語「βアミロイド蛋白」、「βアミロイドペプチド」、「βアミロイド」、「Ａβ」、および「Ａβペプチド」は、本明細書において相互交換可能に使用される。
【００９６】
抗５Ｔ４抗体
５Ｔ４抗原は以前に特徴付けられた（例えばＷＯ８９／０７９４７参照）。ヒト５Ｔ４の完全核酸配列は公知である（Ｍｙｅｒｓら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ１６９：９３１９〜２４およびＧｅｎＢａｎｋ（受託番号第Ｚ２９０８３号））。その他の種由来の５Ｔ４抗原、例えばマウス５Ｔ４（ＷＯ００／２９４２８）、イヌ５Ｔ４（ＷＯ０１／３６４８６）、またはネコ５Ｔ４（ＵＳ０５／０１００９５８）の配列も公知である。
【００９７】
ヒト５Ｔ４は、癌腫で広く発現するが、正常な成体組織では高度に限定された発現パターンを有する約７２ｋＤａの糖蛋白である。この蛋白は結腸直腸および胃の癌における転移と強く相関していると考えられる。５Ｔ４抗原の発現は、乳癌および卵巣癌においても高頻度で見出される（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１０：４７９〜８４；Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６９：８９９〜９０２；Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら（１９９２）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６６：８６７〜９）。５Ｔ４は、メカニズムに関与している可能性がある、腫瘍進行および転移能についてのマーカーとして提案された（Ｃａｒｓｂｅｒｇら（１９９６）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ６８：８４〜９２）。５Ｔ４は、免疫療法剤としての使用もまた提案された（ＷＯ００／２９４２８参照）。５Ｔ４の抗原ペプチドは例えばＵＳ０５／０１００９５８に開示されており、その内容は参照により組み込まれている。
【００９８】
いくつかの係属中の出願、例えば米国出願公開番号２００３／００１８００４および番号２００５／００３２２１６は、一般に抗５Ｔ４モノクローナル抗体をコードしている核酸、そのベクターおよび宿主細胞に関する。一般にヒト化抗５Ｔ４ Ｈ８モノクローナル抗体およびそのカリケアマイシンコンジュゲート、ならびにこれらのカリケアマイシンコンジュゲートを使用した治療方法に関する仮特許出願が提出されている（米国出願公開番号２００６／００８８５２２）。これらの出願の全ての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００９９】
抗ＩＬ１３抗体
本発明の方法により分離することができる抗体の別の例は、抗ＩＬ−１３抗体である。インターロイキン１３（ＩＬ−１３）は、Ｔリンパ球およびマスト細胞により分泌される、以前に特徴付けられたサイトカインである（ＭｃＫｅｎｚｉｅら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：３７３５〜３９；Ｂｏｓｔら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８７：６６３〜４１）。用語「ＩＬ−１３」は、インターロイキン１３を表し、ＩＬ−１３のプロセシングされていない完全長前駆体型および翻訳後開裂の結果として生じる成熟型を含む。この用語は、修飾（例えば組換え修飾）された配列を含めて、成熟ＩＬ−１３に関連する少なくともいくつかの生物学的活性を維持する、ＩＬ−１３の任意の断片および変異体も表す。用語「ＩＬ−１３」は、ヒトＩＬ−１３およびその他の脊椎動物の種が含まれる。いくつかの係属中の出願、例えば米国出願公開番号２００６／００６３２２８Ａおよび番号２００６／００７３１４８がヒトおよびサルのＩＬ−１３、ＩＬ−１３ペプチドに対する抗体、それを産生するベクターおよび宿主細胞を開示している。これらの全公報の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１００】
ＩＬ−１３はＩＬ−４といくつかの生物学的活性を共有する。例えば、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれかは、Ｂ細胞においてＩｇＥのアイソタイプスイッチを引き起こすことができる（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５７９２〜５８００）。さらに、喘息患者では細胞表面ＣＤ２３および血清ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）のレベル増加が報告された（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇｕｅｒｅｒｒｏら（１９９４）Ａｌｌｅｒｇｙ４９：５８７〜９２；ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら（１９９９）Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｐｒｏｃ．２０：１１９〜２５）。しかも、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれかはＢ細胞および単球上のＭＨＣクラスＩＩおよび低親和性ＩｇＥ受容体（ＣＤ２３）の発現をアップレギュレーションすることができ、その結果として、抗原提示の増強およびマクロファージ機能の調節が生じる（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、上記）。これらの観察は、ＩＬ−１３が気道好酸球増加症および気道過敏症（ＡＨＲ）の発生に重要なプレーヤーとなりうることを示唆している（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、上記；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：２２５８〜６１）。したがって、ＩＬ−１３の阻害は、呼吸器障害（例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、気道炎症を伴うその他の状態、好酸球増加症、線維症、および過剰粘液産生（例えば嚢胞性線維症および肺線維症）、アトピー性障害（例えばアトピー性皮膚炎、蕁麻疹、湿疹、アレルギー性鼻炎）、皮膚（アトピー性皮膚炎）、消化器（例えば潰瘍性大腸炎および／またはクローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、肝臓（例えば肝硬変、肝細胞癌）の炎症状態および／または自己免疫状態、強皮症、白血病、膠芽腫、およびリンパ腫（例えばホジキンリンパ腫）などの腫瘍または癌（例えば軟部組織腫瘍または固形腫瘍）、ウイルス感染（例えばＨＴＬＶ−１による）、他の器官の線維症、例えば肝臓の線維症（例えばＢおよび／またはＣ型肝炎ウイルスにより起こる線維症）を非限定的に含めたいくつかの炎症状態および／またはアレルギー状態の病態の改善に有用である可能性がある。
【０１０１】
抗ＩＬ２２抗体
本発明の方法により分離することができる別の抗体の例は抗ＩＬ−２２抗体である。インターロイキン２２（ＩＬ−２２）は、ＩＬ−１０と配列相同性を示す、以前に特徴付けられたクラスＩＩサイトカインである。Ｔ細胞におけるその発現は、ＩＬ−９またはＣｏｎＡによりアップレギュレーションされる（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌ．ら（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９７（１８）：１０１４４〜９）。ＬＰＳ投与に応答してＩＬ−２２ ｍＲＮＡの発現がｉｎ ｖｉｖｏで誘導されること、およびＩＬ−２２が急性期応答を示すパラメーターを調節すること（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌ．ら（２０００）上記；Ｐｉｔｔｍａｎ Ｄ．ら（２００１）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２：１７２）、ならびにマウスのコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて抗ＩＬ−２２中和抗体を使用することによるＩＬ−２２活性の低下が炎症症状を改善することが研究から示された。したがって、例えば自己免疫障害（例えば関節リウマチなどの関節炎性障害）、呼吸器障害（例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、例えば皮膚（例えば乾癬）、心血管系（例えばアテローム性動脈硬化症）、神経系（例えばアルツハイマー病）、腎臓（例えば腎炎）、肝臓（例えば肝炎）、および膵臓（例えば膵炎）の炎症状態の治療のために、ＩＬ−２２アンタゴニスト、例えば抗ＩＬ−２２中和抗体およびその断片を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫抑制を誘導することができる。
【０１０２】
用語「ＩＬ−２２」は、ＩＬ−２２のプロセシングされていない完全長前駆体型および翻訳後開裂の結果として生じた成熟型を含めたインターロイキン２２を表す。この用語は、修飾された配列を含めて、成熟ＩＬ−２２に関連する少なくともいくつかの生物学的活性を維持するＩＬ−２２の任意の断片および変異体も表す。用語「ＩＬ−２２」は、ヒトＩＬ−２２およびその他の脊椎動物の種が含まれる。ヒトおよび齧歯動物ＩＬ−２２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびにＩＬ−２２に対する抗体は、例えば米国出願公開番号２００５−００４２２２０および番号２００５−０１５８７６０、ならびに米国特許第６９３９５４５号に開示されている。これらの公報全ての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１０３】
抗ＧＤＦ８抗体
本発明の方法により分離することができるなお別の例示的な抗体は、抗ＧＤＦ８抗体である。ミオスタチンとしても知られている成長分化因子８（ＧＤＦ−８）は分泌蛋白であり、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの構造的に関係する成長因子のメンバーであり、これら成長因子の全てが生理学的に重要な成長調節特性および形態形成特性を有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、８：１３３〜１４６；Ｈｏｏｄｌｅｓｓら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２８：２３５〜２７２）。ＴＧＦ−βと同様に、ヒトＧＤＦ−８は３７５アミノ酸長の前駆蛋白として合成される。前駆ＧＤＦ−８蛋白はホモ二量体を形成する。プロセシングのときにアミノ末端プロペプチドがＡｒｇ−２６６で開裂する。「潜在型結合ペプチド」（ＬＡＰ）として知られている開裂したプロペプチドは、このホモ二量体に非共有結合したままであることによって、この複合体を不活性化することができる（Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６４０７〜６４１５；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７６４６〜７６５４；Ｂｒｏｗｎら（１９９０）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３：３５〜４３；およびＴｈｉｅｓら（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、１８：２５１〜２５９）。成熟ＧＤＦ−８とプロペプチドとの複合体は、一般に「小型潜在型複合体（ｓｍａｌｌ ｌａｔｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘ）」と呼ばれる（Ｇｅｎｔｒｙら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：６８５１〜６８５７；Ｄｅｒｙｎｃｋら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３１６：７０１〜７０５；およびＭａｓｓａｇｕｅ（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２：５９７〜６４１）。その他の蛋白もまた成熟ＧＤＦ−８と結合してその生物学的活性を阻害することが知られている。そのような阻害蛋白にはフォリスタチンおよびフォリスタチン関連蛋白がある（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２０８：２２２〜２３２）。
【０１０４】
用語「ＧＤＦ−８」は成長分化因子８を表し、必要に応じて、ＧＤＦ−８に構造または機能的に関係する因子、例えばＢＭＰ−１１およびＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するその他の因子を表す。この用語は、ＧＤＦ−８のプロセシングされていない完全長前駆体型、ならびに翻訳後開裂の結果として生じた成熟型およびプロペプチド型を表す。この用語は、修飾された配列を含めて、成熟ＧＤＦ−８に関連する少なくともいくつかの生物学的活性を維持するＧＤＦ−８の任意の断片および変異体も表す。ヒトＧＤＦ−８および（マウス、ヒヒ、ウシ、ニワトリを含む）多数のその他の哺乳動物種のアミノ酸配列は、例えばＵＳ２００４−０１４２３８２、ＵＳ２００２−０１５７１２５、およびＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２４５７〜１２４６１に開示されており、この全ての内容は、その全体がこれによって参照により組み込まれている）。ＧＤＦ−８に対する中和抗体の例は、例えばＵＳ２００４−０１４２３８２に開示されており、この例を使用して、筋肉組織または骨密度の増加が望ましい状態を治療または予防することができる。疾患および障害の例には、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）、筋萎縮性側索硬化症、筋萎縮症、臓器萎縮症、虚弱、トンネル症候群、鬱血性閉塞性肺疾患、筋肉減少症、悪液質、およびその他の筋消耗症候群などの筋肉および神経筋障害、脂肪組織障害（例えば肥満）、２型糖尿病、耐糖能障害、代謝性症候群（例えばシンドロームＸ）、熱傷などの外傷または窒素不均衡により誘導されるインスリン抵抗性、ならびに骨変性疾患（例えば骨関節炎および骨粗しょう症）が含まれる。
【０１０５】
可溶性受容体および受容体融合体
いくつかの実施形態では、本発明の方法により分離される蛋白は、可溶性受容体またはその断片とすることができる。可溶性受容体の例には、可溶性腫瘍壊死因子α受容体およびβ受容体などの受容体（ＴＮＦＲ−１（１９９１年３月２０日に公表されたＥＰ４１７５６３）、ＴＮＦＲ−２（１９９１年３月２０日に公表されたＥＰ４１７０１４）、ならびにＮａｉｓｍｉｔｈおよびＳｐｒａｎｇ、Ｊ Ｉｎｆｌａｍｍ．４７（１〜２）：１〜７、１９９５〜９６に総説されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）の細胞外ドメインが含まれる。その他の実施形態では、可溶性受容体には、例えばＵＳ２００３−０１０８５４９（この内容もまた参照により組み込まれている）に記載されているようなインターロイキン２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）の細胞外ドメインが含まれる。
【０１０６】
その他の実施形態では、本発明の方法は、可溶性受容体融合体を分離するために使用される。融合蛋白は、ターゲティング部分、例えば可溶性受容体断片またはリガンドと、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）を含めた様々なアイソタイプの免疫グロブリン鎖、Ｆｃ断片、重鎖定常領域とを含むことができる。例えば融合蛋白は、受容体の細胞外ドメインと、例えばそれが融合したヒト免疫グロブリン（例えばヒトＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４、またはその突然変異型）のＦｃ鎖とを含むことができる。一実施形態では、ヒトＦｃ配列は１つまたは複数のアミノ酸で突然変異しており、例えば残基２５４および２５７で野生型配列から突然変異して、Ｆｃ受容体の結合が低下している。融合蛋白は、さらに、第１部分を第２部分、例えば免疫グロブリン断片に結合させるリンカー配列を含むことができる。例えば融合蛋白は、ペプチドリンカー、例えば長さ約４から２０アミノ酸、さらに好ましくは５から１０アミノ酸のペプチドリンカーを含むことがあり、このペプチドリンカーは長さ８アミノ酸である。例えば、融合蛋白には、式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙ（式中、ｙは１、２、３、４、５、６、７、または８である）を有するペプチドリンカーを含むことができる。その他の実施形態では、さらなるアミノ酸配列を融合蛋白のＮ末端またはＣ末端に付加して、発現、立体柔軟性、検出および／または単離もしくは精製を促進することができる。
【０１０７】
ある実施形態では、可溶性受容体融合体は可溶性ＴＮＦＲ−Ｉｇ（例えばＴＮＦ受容体、例えばｐ５５もしくはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体の可溶性断片、またはその誘導体）、例えば７５ｋｄのＴＮＦＲ−ＩｇＧ（例えばヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合した７５ｋＤのＴＮＦ受容体）を含む。
【０１０８】
本発明のキメラ蛋白または融合蛋白は、標準的な組換えＤＮＡ技法により産生させることができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードしているＤＮＡ断片は、従来技法に従って、例えば連結のための平滑末端または付着末端、適切な末端を用意するための制限酵素消化、必要に応じた付着末端の平滑化、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を用いることによりフレーム内で一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含めた従来技法により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子断片の間で相補的突出を生じるアンカープライマーを用いて行うことができ、これらの遺伝子断片を続いてアニーリングし、再増幅させてキメラ遺伝子配列を作製することができる（例えばＡｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２参照）。さらに、融合部分をコードしている多数の発現ベクターが市販されている（例えば免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５５１６９６４号、第５２２５５３８号、第５４２８１３０号、第５５１４５８２号、第５７１４１４７号、および第５４５５１６５号に記載されている。
【０１０９】
成長因子およびサイトカイン
医薬品および／または市販薬剤として有効であることが示され、本発明の教示により望ましくは産生することができる別のクラスのポリペプチドには、成長因子およびサイトカインなどのその他のシグナル伝達分子がある。
【０１１０】
成長因子は、典型的には細胞により分泌され、他の細胞上の受容体に結合し、それを活性化し、受容体細胞の代謝変化または発生変化を開始する糖蛋白である。哺乳動物成長因子および他のシグナル伝達分子の非限定的な例には、サイトカイン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含めたＴＧＦ−βなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合蛋白、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９などのＣＤ蛋白、エリスロポイエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成蛋白（ＢＭＰ）、インターフェロンα、β、およびγなどのインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＴＬ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−１３（例えばＩＬ−１１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよびβ、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、濾胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォンウィルブランド因子などの凝固因子、プロテインＣなどの抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ヒトマクロファージ炎症性蛋白（ＭＩＰ−１−α）、ミュラー管抑制物質、レラクシンＡ鎖、レラクシンＢ鎖、プロレラクシン、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、４、５、もしくは６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）などの神経栄養因子、またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子がある。当業者は、本発明の方法および組成物により発現させることができるその他の成長因子またはシグナル伝達分子を認識しているものである。
【０１１１】
成長因子またはその他のシグナル伝達分子のグリコシル化パターンの特異的改変は、その治療的性質に劇的な効果を有することが示された。一例として、慢性貧血を患う患者の通常の治療方法は、患者による赤血球の産生を促進するために、組換えヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥＰＯ）の頻回注射を患者に行うことである。ｒＨｕＥＰＯのアナログであるダルベポエチンアルファ（Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標））は、通常のｒＨｕＥＰＯよりも長い持続時間をもつように開発された。ダルベポエチンアルファとｒＨｕＥＰＯとの主な違いは、２つの余剰のシアル酸含有Ｎ結合オリゴ糖鎖の存在である。ダルベポエチンアルファの産生は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ糖工学を使用して実現された（全体が参照により本明細書に組み込まれているＥｌｌｉｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２１（４）：４１４〜２１、２００３参照）。Ｅｌｌｉｏｔｔらは、ｒＨｕＥＰＯポリペプチド主鎖に余剰のグリコシル化部位を組み込むためにｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を使用し、その結果としてダルベポエチンアルファアナログの発現をもたらした。余剰のオリゴ糖鎖は、ＥＰＯ受容体結合部位の遠位に位置し、受容体の結合を妨害しないようである。しかし、ダルベポエチンアルファの半減期はｒＨｕＥＰＯの最大３倍の長さであり、その結果としてずっと有効な治療剤となる。
【０１１２】
凝固因子
凝固因子は、医薬品および／または市販薬剤として有効なことが示された。血友病Ｂは患者の血液が凝固できない障害である。したがって、出血を来すどのような小さな創傷も潜在的に致命的な事象である。例えば、第ＩＸ凝固因子（第ＩＸ因子または「ＦＩＸ」）は、その欠損が血友病Ｂを生じる１本鎖糖蛋白である。ＦＩＸは１本鎖チモーゲンとして合成され、これは、活性化ペプチドの放出により２本鎖セリンプロテアーゼ（第ＩＸａ因子）に活性化されることができる。第ＩＸａ因子の触媒ドメインは重鎖に位置する（全体が参照により本明細書に組み込まれているＣｈａｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：４、１９９７参照）。ＦＩＸは、Ｎ結合およびＯ結合糖鎖の両方を含む複数のグリコシル化部位を有する。セリン６１でのある特定のＯ結合構造（Ｓｉａ−α２，３−Ｇａｌ−β１，４−ＧｌｃＮＡｃ−β１，３−Ｆｕｃ−α１−Ｏ−Ｓｅｒ）は、かつてＦＩＸに独特であると考えられていたが、それ以来、哺乳動物およびドロソフィラにＮｏｔｃｈ蛋白を含む少数のその他の分子に見出された（Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５（１３）、２０００）。細胞培養したチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞により産生されたＦＩＸは、セリン６１オリゴ糖鎖に幾分変動を示す。これらの異なる糖形態およびその他の潜在的糖形態は、ヒトもしくは動物に投与された場合に異なる凝固誘導能を有するおそれがあり、かつ／または血中で異なる安定性を有して有効性の低い凝固を生じるおそれがある。
【０１１３】
臨床的には血友病Ｂと区別が付かない血友病Ａは、１本鎖として合成され、次に２本鎖活性型にプロセシングされる別の糖蛋白であるヒト第ＶＩＩＩ凝固因子の異常により起こる。本発明は、第ＶＩＩＩ凝固因子の凝固活性を調節するために、第ＶＩＩＩ凝固因子のグリコシル化パターンを制御または改変するためにも採用することができる。本発明により産生させることができるその他の凝固因子には、組織因子およびフォンウィルブランド因子がある。
【０１１４】
酵素
医薬品および／または市販薬剤として有効なことが示され、本発明の教示により望ましくは産生することができる別のクラスのポリペプチドには、酵素がある。酵素は、グリコシル化パターンが酵素活性に影響する糖蛋白とすることができる。したがって、本発明は、細胞培養で酵素を産生させるためにも使用することができ、ここで、産生された酵素は、より広範囲であるか、さもなければより望ましいグリコシル化パターンを有する。
【０１１５】
１つに過ぎない非限定的な例として、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＲ）の欠損はゴーシェ病として知られる状態を生じ、この疾患はある細胞のライソソームへのグルコセレブロシダーゼ蓄積によって起こる。ゴーシェ病の対象は、脾腫大、肝腫大、骨格障害、血小板減少症、および貧血を含めた一連の症状を示す。ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＨａｙｅｓは、アミノ酸一次配列に１置換を有する組換えＧＣＲ（ｒＧＣＲ）が、天然ＧＣＲに比べてグリコシル化パターンの改変、具体的にはフコース残基およびＮ−アセチルグルコサミン残基の増加を示すことを示した（米国特許第５５４９８９２号）。
【０１１６】
ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＨａｙｅｓは、このｒＧＣＲが天然ｒＧＣＲに比べて薬物動態的性質の向上を示すことも実証した。例えば、天然ＧＣＲの約２倍のｒＧＣＲは肝クッパー細胞を標的とした。これら２つの蛋白のアミノ酸一次配列は１残基が異なるが、ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＨａｙｅｓは、ｒＧＣＲのグリコシル化パターン改変がクッパー細胞への標的付けにも影響すると仮定した。当業者は、酵素的、薬物動態的、および／または薬力学的性質の改変を示す結果、グリコシル化パターンに改変を生じる酵素のその他の公知の例を認識しているものである。
【０１１７】
蛋白の産生
本発明の方法により分離される蛋白は、当技術分野で十分に公知の技法を使用して組換え産生させることができる。この蛋白をコードしているヌクレオチド配列は、典型的には所望の量の修飾抗体を産生させるために使用することができる宿主細胞に導入するために、発現ベクターに挿入され、今度はポリペプチドを与える。用語「ベクター」は、多くの場合核酸、例えば遺伝子を含み、さらに核酸の複製、転写、安定性、および／または宿主細胞からの蛋白の発現もしくは分泌に必要な最小エレメントを含む核酸構築物を含む。そのような構築物は、染色体外エレメントとして存在してもよく、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【０１１８】
用語「発現ベクター」は、所望の蛋白産物の高レベル発現のために核酸構築物が最適化されている特異的な種類のベクターを含む。発現ベクターは、多くの場合、特異的な種類の細胞での高レベル転写のために最適化され、かつ／または特異的誘導剤の使用に基づいて発現が構成性であるように最適化された、プロモーターおよびエンハンサーエレメントなどの転写調節因子を有する。発現ベクターは、さらに蛋白の適正で、かつ／または高い翻訳を与える配列を有する。当業者に公知なように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。用語「発現カセット」は、遺伝子を有し、その遺伝子に加えて、宿主細胞におけるその遺伝子の適正で、かつ／または高い発現をさせるエレメントを有する核酸構築物を含む。抗体を産生させるために、軽鎖および重鎖をコードしている核酸を発現ベクターに挿入することができる。そのような配列は、同一の核酸分子（例えば同一の発現ベクター）に存在してもよく、代わりに別々の核酸分子（例えば別々の発現ベクター）から発現させてもよい。
【０１１９】
用語「作動可能に連結した」は、構成要素が意図した方法で機能可能な（例えば機能的に連結した）関係にある並置が含まれる。例として、関心対象のポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター／エンハンサーは、前記ポリヌクレオチドに連結する結果、プロモーター／エンハンサーにより指令される発現を活性化する状態で、関心対象のポリヌクレオチドの発現が実現される。
【０１２０】
発現ベクターは、典型的にはエピソームまたは宿主染色体ＤＮＡに内在する部分のいずれかとして宿主生物において複製することができる。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、またはネオマイシン耐性）を有する（例えばＩｔａｋｕｒａら、米国特許第４７０４３６２号参照）。免疫グロブリンＤＮＡカセット配列、挿入配列、および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞でのベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有することがある。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば米国特許第４３９９２１６号、第４６３４６６５号、および第５１７９０１７号（全てＡｘｅｌらによる）参照）。例えば、典型的には選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ヒグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いてｄｈｆｒ−宿主細胞に使用するためのもの）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）がある。
【０１２１】
ベクターが適切な宿主細胞に組み込まれたならば、その宿主細胞は、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに所望の抗体の収集および精製に適した条件で維持される。細胞培養と、蛋白またはポリペプチドの発現とに感受性の任意の宿主細胞は、本発明により利用することができる。ある実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。本発明により使用することができる哺乳動物細胞の非限定的な例には、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ第８５１１０５０３号）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ（ライデン、オランダ））、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児腎臓系（２９３または懸濁培養での成長用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１、１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）、ヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８、１９８２）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）がある。
【０１２２】
さらに、本発明によりポリペプチドまたは蛋白を発現する任意の数の市販および非市販のハイブリドーマ細胞系を利用することができる。当業者は、ハイブリドーマ細胞系が異なる栄養要求性を有することがあり、かつ／または最適の成長およびポリペプチドもしくは蛋白の発現のために異なる培養条件を必要とすることがあると認識しているものであり、必要に応じて条件を変更することができるものである。
【０１２３】
これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。例えばＣｏら、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９を参照されたい。哺乳動物宿主細胞の発現用の好ましい調節配列には、ＦＦ−１ａプロモーターおよびＢＧＨポリＡ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞での高レベルの蛋白発現を指令するウイルスエレメントが含まれる。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えばＳｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５１６８０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４５１０２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４９６８６１５号を参照されたい。例示的な実施形態では、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子は、（例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなどのＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来する）エンハンサー／プロモーター調節エレメントに作動可能に連結させ、遺伝子の高レベル転写を推進する。本発明の例示的な実施形態では、この構築物は、真核宿主細胞に本発明のポリペプチドを相対的に高レベル発現する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。適合性のＩＲＥＳ配列は米国特許第６１９３９８０号に開示されており、この特許もまた本明細書に組み込まれている。
【０１２４】
あるいは、コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムに導入し、続いてトランスジェニック動物の乳汁に発現させるために導入遺伝子に組み込むことができる（例えばＤｅｂｏｅｒら、ＵＳ５７４１９５７、Ｒｏｓｅｎ、ＵＳ５３０４４８９、およびＭｅａｄｅら、ＵＳ５８４９９９２参照）。適切な導入遺伝子には、カゼインまたはβラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子に由来するプロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結した軽鎖および／または重鎖についてのコード配列が含まれる。
【０１２５】
原核宿主細胞もまた、本発明の抗体の産生に適することがある。イー・コリは、本発明のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ配列）をクローニングするために特に有用な一原核宿主である。使用に適するその他の微生物宿主には、バシルス・サチルスなどの桿菌属、エシェリキア、サルモネラ、およびセラチアなどの腸内細菌科、ならびに種々のシュードモナス種がある。これらの原核宿主では、発現ベクターを作ることもでき、発現ベクターは典型的には宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば複製起点）を有するものである。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系などの任意の数の様々な十分に公知のプロモーターが存在するものである。プロモーターは、所望によりオペレーター配列を用いて典型的には発現を制御するものであり、転写および翻訳を開始し、完了するためにリボソーム結合部位配列などを有するものである。
【０１２６】
原核生物における蛋白の発現は、ほとんどの場合融合蛋白または非融合蛋白のいずれかの発現を指令している構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いてイー・コリで行われる。融合ベクターは、それにコードされている抗体に、多くの場合組換え抗体の定常領域にいくつかのアミノ酸を付加するが、その抗体の特異性または抗原認識には影響しない。融合ペプチドのアミノ酸の付加は、例えばマーカー（例えばｍｙｃまたはｆｌａｇなどのエピトープタグ）として抗体にさらなる機能を付加することができる。
【０１２７】
酵母などのその他の微生物もまた発現に有用である。サッカロミセスは、所望通りに発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終結配列などを有する適切なベクターを伴う、好ましい酵母宿主である。典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよびその他の糖分解酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけアルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームＣ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素由来のプロモーターが含まれる。
【０１２８】
関心対象のポリヌクレオチド配列を有するベクター（例えば重鎖および軽鎖をコードしている配列ならびに発現制御配列）は、十分に公知の方法により宿主細胞に導入することができ、その方法は細胞性宿主の種類に応じて異なる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、通常原核細胞に利用されるが、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスティックス、またはウイルスに基づくトランスフェクションはその他の細胞性宿主に使用することができる。（一般に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９）を参照されたい）。哺乳動物細胞を形質転換するために使用される他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションの使用がある（一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照）。トランスジェニック動物の産生のために、受精した卵母細胞に導入遺伝子をマイクロインジェクションすることもでき、胚性幹細胞のゲノムに組み込み、除核した卵母細胞にその細胞の核を導入することもできる。
【０１２９】
重鎖および軽鎖を別々の発現ベクターにクローニングするとき、これらのベクターを同時トランスフェクションし、無傷の免疫グロブリンの発現および集合を得る。いったん発現すると、本発明の抗体全体、その二量体、個別の軽鎖および重鎖、またはその他の免疫グロブリン形態は、本明細書に記載するように分離し、かつ／または硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含めた当技術分野で公知の手順によりさらに精製することができる（一般にＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９８２）参照）。医薬用途には少なくとも均質性が約９０から９５％の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８から９９％以上の均質性が最も好ましい。
【０１３０】
以下の実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。
【０１３１】
実施例１
様々な陽イオンおよび陰イオンを用いたフロキュレーション：様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（表１に示す）は、無血清培地で培養した組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生させた。１２５ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに細胞含有馴化培地約５０ｍＬを分注した（１０００ｍＬフラスコに４００ｍＬ入れた抗ＧＤＦ８＃２を有する３０／２０リン酸カルシウムの例および２０００ｍＬフラスコに１０００ｍＬ入れた抗ＩＬ１３＃１を有する３０／２０リン酸カルシウムの例を除く）。ｐＨを制御するためにＨＥＰＥＳを４０ｍＭまで添加した。最終目標濃度（表１参照）に達するように、この溶液に金属陽イオンの濃縮溶液を添加し、静かに混合した。陰イオン濃縮溶液をこの混合物（表１参照）に添加して、最終陰イオン濃度を実現し、静かに混合した。（下記表１で星印（＊）で示した一部の実施例では、陰イオンを最初に添加し、次に陽イオンを添加した）。ｐＨは、目標となるｐＨ範囲までＮａＯＨの添加により増加させるか、またはＨＣｌの添加により減少させた。多くの例では、ｐＨは調整する必要がなかった。この混合物は、陰性対照と共に振盪器上で１８〜２５℃で１から４時間インキュベートさせた。インキュベーションの後で、この混合物を５０ｍＬ遠沈管に注いだ。各混合物を３４０ｇで１０分間遠心分離した。清澄化された上清を分注し、比濁計（ＨＡＣＨ（ラブランド、コロラド州））を使用して濁度を測定した。結果として得られた濁度は、未処理対照の結果からの減少率として表１に報告する。抗体濃度は、抗体に一般的なプロテインＡ ＨＰＬＣ法により測定した。未処理対照に比べた回収率を表１に報告する。
【０１３２】
表１：陽イオンであるカルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト（ＩＩ）、およびニッケルについてのフロキュレーションの結果。陰イオンを陽イオンの前に添加した星印（＊）を付けた場合を除き、全ての処理は陰イオンの前に陽イオンを添加して行った。
【０１３３】
【表１】
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
【表４】
【０１３７】
【表５】
【０１３８】
一部試料の上清中のカルシウムおよびリン酸の残留レベルを測定した。残留カルシウムは、ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤＩＣＡ−５００）を使用して測定した。残留リン酸は、ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＯＭＧ−２５Ｈ）を使用して測定した。表１でカルシウム４０ｍＭおよびリン酸２０ｍＭを有する抗ＩＬ１３＃２試料では、遠心分離後の上清はカルシウム８．１９ｍＭおよびリン酸１．０４ｍＭを含有した。このレベルの可溶性カルシウムおよびリン酸は８．５×１０−６Ｍ２のＫｓｐに換算することができる。表１でカルシウム８０ｍＭおよびリン酸２０ｍＭを有する抗ＡＢ＃１試料では、遠心分離後の上清は、カルシウム２２．２ｍＭおよびリン酸０．４ｍＭを含有した。このレベルの可溶性カルシウムおよびリン酸は、８．４×１０−６Ｍ２のＫｓｐに換算される。
【０１３９】
実施例２
陰イオン／陽イオンの添加順序の効果：ｍＡｂである抗ＧＤＦ８＃１は、無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた。約５０ｍＬの細胞含有馴化培地を３本の１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコＡ、Ｂ、およびＣに分注した。試料Ａは未処理のまま放置し、陰性対照とした。試料ＢおよびＣのｐＨを制御するためにＨＥＰＥＳを４０ｍＭまで添加した。濃度５０ｍＭまで５Ｍ塩化カルシウムを試料Ｂに添加し、静かに混合後、０．５Ｍ亜硫酸ナトリウムを濃度３３．３ｍＭまで添加した。試料Ｃについては添加順序を逆にした。０．５Ｍ亜硫酸ナトリウムを濃度３３．３ｍＭまで添加し、静かに混合後、５Ｍ塩化カルシウムを濃度５０ｍＭまで添加した。３つの混合物は全て７．４から７．６のｐＨを有した。これらの混合物を振盪器上で１８〜２５℃で１時間インキュベートさせた。インキュベーション後に、これらの混合物を５０ｍＬ遠沈管に注いだ。各混合物を３４０ｇで１０分間遠心分離した。清澄化された上清を取り出し、プロテインＡ ＨＰＬＣにより抗体濃度について、比濁計を用いて濁度についてアッセイした。
【０１４０】
試料ＢおよびＣは、共に未処理試料に比べて９４％の抗体回収率を有した。最初に陽イオンを添加した試料Ｂは未処理試料に比べて沈殿が形成したことを示す濁度の増加を示したが、この沈殿は遠心分離により容易に除去するには小さすぎた。最初に陰イオンを添加した試料Ｃは、未処理試料に比べて濁度の４６％の減少を示し、これは、形成した沈殿が遠心分離により容易に沈殿するのに十分な大きさであったことを示している。濁度の減少は、若干量の細胞片および／またはコロイド物質が沈殿により結合され、ペレット中に除去されたことも示している。
【０１４１】
実施例３
沈殿剤としてカルシウムおよびリン酸を使用したパイロットスケール実験ならびに下流の清澄化工程およびクロマトグラフィー工程に及ぼす効果：ｍＡｂである抗ＡＢ＃１は、５００Ｌバイオリアクター中の無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた。収集時に、培養液を室温（１８〜２５℃）にした。培養液３５０Ｌを未処理のまま放置し、陰性対照とした。培養液１５０Ｌを２００Ｌカルボイに移し、オーバーヘッドミキサーでゆっくりと混合した。ｐＨを制御するために緩衝液を４０ｍＭまで添加した。次に、２Ｍリン酸カリウムを濃度２０ｍＭまで添加した。次に、５Ｍ塩化カルシウムを濃度３０ｍＭまで添加した。この混合物のｐＨは７．３であった。フロキュレーションした培養液を混合しながら１６０分間インキュベートした。インキュベーションの終わりにこの混合物のｐＨは７．０であった。
【０１４２】
フロキュレーションした培養液および未処理培養液の両方は、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＢＴＰＸ２０５分離板型遠心分離器により流速４．４Ｌ／ｍｉｎおよびボウル速度７６３０ＲＰＭ（８０００ｇ）で加工処理した。未処理試料についての１１７ＮＴＵに比べて、フロキュレーションした試料の定常状態遠心分離物の濁度は１４ＮＴＵであり、濁度の８８％の減少であった。フロキュレーションした遠心分離物での抗体力価の回収率は未処理遠心分離物の９６％であった。フロキュレーションした遠心分離物中の宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）のレベルは、５３３３４１ｐｐｍから３４８０８７ｐｐｍに、未処理遠心分離物に比べて３５％減少した。
【０１４３】
フロキュレーションした遠心分離物および未処理遠心分離物の両方にフィルター１平方メートル当たり遠心分離物２５０Ｌの性能までＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａ１ＨＣパッドフィルターを通過させて加工処理した。未処理試料は、２４Ｌ／ｍ２で４ＮＴＵから１２１Ｌ／ｍ２で２６ＮＴＵまで、２５４Ｌ／ｍ２で３７ＮＴＵまでと、着実に増加する濁度の流出を示した。未処理試料についての最終的なパッド濾液プールの濁度は２１ＮＴＵであった。フロキュレーションした試料は、２１Ｌ／ｍ２で２ＮＴＵから１５０Ｌ／ｍ２で６ＮＴＵまで、２５４Ｌ／ｍ２で７ＮＴＵまでと、パッドを通過した濁度にわずかな増加だけを示した。フロキュレーションした試料についての最終的なパッド濾液プールの濁度は５ＮＴＵで、未処理試料に比べて濁度の７６％の減少であった。
【０１４４】
パッド濾過および０．２μｍポリッシングフィルターを通過させたさらなる濾過の後に、試料はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡアフィニティーカラムを使用したクロマトグラフィーにかけた。抗体をプロテインＡカラムから溶出させた場合、ピークプールは多くの場合混濁しており、ピークを中和したときに濁度は典型的には増加する。未処理ピークのプールは１０ＮＴＵの濁度を有し、中和すると２２ＮＴＵまで増加した。フロキュレーションしたピークのプールは３ＮＴＵの濁度を有し、中和すると未処理ピークよりも６３％低い８ＮＴＵまで増加した。
【０１４５】
実施例４
カルシウムおよびリン酸を用いたフロキュレーションは、清澄化した馴化培地およびプロテインＡのピークの両方で濁度減少を生じる。細胞関連不純物および産物関連不純物の両方の有意な減少も実現した。
【０１４６】
ｍＡｂである抗５Ｔ４は、無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた。培地約３Ｌを未処理のままで放置し、陰性対照とした。別に培養液３Ｌを４Ｌ容器に入れた。ｐＨを制御するために緩衝液を４０ｍＭまで添加し、１８〜２４℃で静かに混合した。次に、２Ｍリン酸カリウムを濃度２０ｍＭまで添加し、この溶液を静かに混合した。次に、５Ｍ塩化カルシウムを濃度３０ｍＭまで添加し、この溶液を静かに混合した。この混合物のｐＨは７．２であった。フロキュレーションした培養液を３個の２Ｌエルレンマイヤーフラスコに移し、混合しながら２時間インキュベートした。インキュベーションの終わりにこの混合物のｐＨは７．０であった。
【０１４７】
フロキュレーションした培養液および未処理の培養液の両方の試料５０ｍＬを３４０ｇで１０分間遠心分離した。清澄化した上清を取り出し、プロテインＡ ＨＰＬＣにより抗体濃度について、そして比濁計を使用して濁度についてアッセイした。産物関連物質の総回収率は未処理試料に比べて７８％であった。未処理試料の濁度は２９ＮＴＵであった。フロキュレーションした試料の濁度は２ＮＴＵであり、未処理試料に比べて濁度の９３％の減少であった。
【０１４８】
フロキュレーションした試料および未処理試料の両方は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａ１ＨＣパッドフィルターを通過させて加工処理した。パッド濾過および０．２μｍポリッシングフィルターを通過させたさらなる濾過の後に、試料はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡアフィニティーカラムを使用したクロマトグラフィーにかけた。高濃度でのプロテインＡカラムからの抗体溶出液として、産物ピークの頂点での物質は沈殿することが多く、混濁した溶液を生じた。分光光度計で吸光度６００ｎｍにより測定したとき、未処理試料のピーク頂点での沈殿析出レベルは１．８５ＡＵであった。分光光度計で吸光度６００ｎｍにより測定したとき、フロキュレーションした試料のピーク頂点での沈殿折出レベルは０．０３ＡＵであり、未処理試料に比べて濁度の９８％の減少であった。
【０１４９】
抗体をプロテインＡカラムから溶出させると、ピークのプールは時折混濁している。中和すると、物質が沈殿して溶液から沈降するときの濁度は、ｐＨ５．５からｐＨ６．０の間で典型的には有意に増加する。この沈殿の一部はｐＨが７を超えると再び可溶性になる傾向がある。抗体濃度８．１ｍｇ／ｍＬの未処理ピークのプールは、溶出時に濁度８．５ＮＴＵを有し、ｐＨ５．５から６．０では８３９ＮＴＵに増加し、ｐＨ７．０では５３ＮＴＵに減少した。０．２μｍ滅菌等級のフィルターを通過させて濾過すると、濁度は４０ＮＴＵに減少しただけであった。
【０１５０】
フロキュレーションした産物のプールは小容量でカラムから溶出し、その結果さらに濃縮されていた。抗体濃度１５．１ｍｇ／ｍＬのフロキュレーションしたピークのプールは、溶出時に濁度５．６ＮＴＵを有し、ｐＨ５．５から６．０では３１ＮＴＵに増加し、これは、対照から濁度の９６％の減少であった。濁度は、１５．１ｍｇ／ｍＬのときｐＨ７．０で４６ＮＴＵにやや増加した。０．２μｍの滅菌等級のフィルターを通過させて濾過すると、濁度は８．１ＮＴＵに減少し、これは、対照から８０％の減少であった。
【０１５１】
中和したプロテインＡのピークを未処理対照と一致するように濃度８．１ｍｇ／ｍＬに希釈すると、濾過していないフロキュレーションした試料の濁度は４６ＮＴＵから２５ＮＴＵに減少し、これは、未処理試料に比べて５３％の減少であった。０．２μｍ滅菌等級のフィルターを通過させて濾過すると、濁度は４．１ＮＴＵに減少し、これは、未処理試料に比べて濁度の９０％の減少であった。
【０１５２】
プロテインＡのピークのプールに存在する高分子量（ＨＭＷ）凝集体のレベルは、サイズ排除ＨＰＬＣにより測定した。未処理試料中の凝集体のレベルは９．５１％であった。フロキュレーションした試料中の凝集体のレベルは１．０５％であり、これは、未処理試料に比べて凝集体の８９％の減少であった。凝集体の減少を考慮すると、培養液中の産物回収率７８％は所望のモノマーの回収率８５％に換算される。
【０１５３】
ＣＨＯ細胞により分泌される望ましくない不純物である宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡを使用したプロセスのうち種々の工程で測定した。ＨＣＰレベルは、抗体１ｍｇ当たりのＨＣＰのｎｇに等しい百万分率（ｐｐｍ）として報告する。未処理培養液中のＨＣＰレベルは２．５３Ｅ６ｐｐｍであった。フロキュレーションした馴化培地中のＨＣＰレベルは３．８３Ｅ５ｐｐｍで、これは、未処理培養液から８４％の減少であった。未処理培養液およびフロキュレーションした培養液の両方が、パッドフィルターを通過すると、それぞれ１．０２Ｅ６および１．６２Ｅ５まで、ＨＣＰが約６０％減少した。プロテインＡカラムを通過して精製すると、未処理試料中のＨＣＰレベルは１．０３Ｅ５ｐｐｍまで９０％だけ減少した。フロキュレーションした試料中のＨＣＰレベルは、３．８３Ｅ２ｐｐｍまで９８％だけ減少した。全体的に見て、未処理精製手順についてＨＣＰの１．４ｌｏｇの除去があった。フロキュレーションした精製手順は、ＨＣＰの３．８ｌｏｇの除去を実現し、未処理精製手順に比べてＨＣＰの２５０倍の減少を生じた。
【０１５４】
いくつかの実施を記載したが、本発明はそれに限定されるわけではない。
【０１５５】
一例としていくつかの実施では、本明細書に記載するフロキュレーション方法は、細胞の不在下、例えば細胞を除去した後で行うことができる。その培地は無細胞不溶性物質を有することがある（下記実施例５参照）。
【０１５６】
実施例５
混濁した蛋白含有溶液の濾過を助けるために固体沈殿を形成させるためのカルシウムおよびリン酸の使用：ｍＡｂである抗ＧＤＦ８＃１を無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた。細胞はＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＢＴＰＸ２０５分離板型遠心分離器により除去し、結果として生じた遠心分離物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａ１ＨＣパッドフィルターを通過させて加工処理した。パッド濾過および０．２μｍポリッシングフィルターを通過させたさらなる濾過の後に、試料はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡアフィニティーカラムを使用してクロマトグラフィーにかけた。低ｐＨ緩衝液を使用して抗体をプロテインＡカラムから溶出させると、ピークのプールは時折混濁している。中和すると濁度は典型的には有意に増加する。
【０１５７】
この実施例では、プロテインＡのピークは４℃で７日間濾過せずに保ち、次に室温に加温した。ピークの濁度は１９２ＮＴＵであった。ピークを２つの８００ｍＬ試料に分け、一方の試料を未処理のまま放置した。２つ目の試料に４ｍＭリン酸カリウムおよび６ｍＭ塩化カルシウムを添加した。次に、処理した試料は２Ｌエルレンマイヤーフラスコ中で１８〜２５℃で１時間振盪した。振盪した後、処理した試料の濁度は４６０ＮＴＵであった。
【０１５８】
次に、未処理試料および処理した試料の両方は、１７．７ｃｍ２Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ０．５／０．２μｍポリエーテルスルホンカプセルフィルターを通過させて濾過した。各フィルターを通過することができた溶液の量に基づいて最大フィルター性能を計算した。最大フィルター性能は、フィルターが詰まって溶液がそれ以上通過できなくなるまで、フィルター１ｍ２を通過することができる溶液のリットル数である。未処理試料は、約３０Ｌ／ｍ２の最大フィルター性能に達することができたが、処理した試料は約１５００Ｌ／ｍ２の最大フィルター性能に達し、これは、フィルター性能の５０倍の増加であった。未処理試料および処理した試料両方のフィルター後の濁度は９ＮＴＵであり、これは、処理がさらなる粒子状物質の除去をそれ以上生じたとは思われないが、実際に濾過助剤として働き、フィルターが詰まるまで大容量の溶液にフィルターを通過させたことを示していた。
【０１５９】
実施例６
混濁した蛋白含有溶液中の粒子状物質の除去を助けるために固体沈殿を形成させるためのカルシウムおよびリン酸の使用に及ぼす規模および混合方法の効果：図２および３に「ｍＡｂ Ｂ」と示す抗ＡＢ＃２ｍＡｂは、パイロットスケールバイオリアクター中の無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた（細胞培養液１６０〜５００Ｌ）。細胞含有馴化培地約１２５Ｌ、１．５Ｌ、または５０ｍＬを２００Ｌカルボイ、２Ｌビーカー、または１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコにそれぞれ分注した。ｐＨを制御するためにＨＥＰＥＳを４０ｍＭまで添加した。２００Ｌカルボイおよび２Ｌビーカーを撹拌羽根で混合した。１２５ｍＬエルレンマイヤーは振盪器により混合した。リン酸カリウムの濃縮溶液を各混合物に添加し、最終溶液で最終濃度２０ｍＭを実現した。塩化カルシウム濃縮溶液を各溶液に添加して、最終目標濃度３０ｍＭを実現し、混合した。最終ｐＨは７．０から７．５であった。この固体および培地は室温（２０〜２３℃）の混合条件で１時間を超えてインキュベートした。未処理試料の一定分量５０ｍＬならびに処理した試料１２５Ｌ、１．５Ｌ、および５０ｍＬを３４０×ｇで１０分間遠心分離した。上清の濁度および抗体濃度を測定した。
【０１６０】
規模および混合方法が濁度に及ぼす効果を図２に示す。規模および混合方法（撹拌羽根または振盪器）には依存せずに、全てのフロキュレーションの例で濁度は対照よりも９０％超減少する。さらに、処理した全ての試料で抗体回収率は未処理試料の１００％であった。したがって、これらの大きく異なる条件について、本発明のフロキュレーションは規模または混合方法に依存するとは思われない。
【０１６１】
ＣＨＯ細胞により分泌される不必要な不純物である宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して未処理上清および処理した１２５Ｌ試料で測定した。ＨＣＰレベルは、抗体１ｍｇ当たりのＨＣＰのｎｇに等しい百万分率（ｐｐｍ）として報告する。処理した１２５Ｌ試料は、未処理試料に比べてＨＣＰが５０％減少した。
【０１６２】
実施例７
混濁した蛋白含有溶液中の粒子状物質の除去を助けるために固体沈殿を形成させるためのカルシウムおよびリン酸の使用に及ぼす混合速度の効果：図３に「ｍＡｂ Ｂ」と示す抗ＡＢ＃２ｍＡｂは、パイロットスケールバイオリアクター中の無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた（細胞培養液１６０〜５００Ｌ）。細胞含有馴化培地約１２５Ｌを２つの２００Ｌカルボイに入れた。ｐＨを制御するためにＨＥＰＥＳを４０ｍＭまで添加した。混合は撹拌羽根で行い、一方はチップ速度０．９ｍ／ｓで、もう一方は２．５ｍ／ｓで運転した。リン酸カリウムの濃縮溶液をこの混合物に添加し、最終溶液で最終濃度２０ｍＭを実現した。塩化カルシウム濃縮溶液をこの溶液に添加して、３０ｍＭの最終目標濃度を実現し、混合した。最終ｐＨは７．０から７．５であった。この固体および培地は室温（２０〜２３℃）の混合条件でインキュベートし、試料を様々な時点で採取した。各試料上清の濁度は、３４０×ｇで１０分間遠心分離後に測定した。撹拌羽根のチップ速度が濁度に及ぼす効果を図３に示す。濁度は、１時間後に検討したフロキュレーションの例の全てで、チップ速度には依存せずに対照から９０％超減少する。チップ速度が速いと、１５分の時点で濁度の減少が速いと思われた。しかし、この差は有意ではない。したがって、１時間のインキュベーション後に検討した速度についての本発明のフロキュレーションは、チップ速度に依存するとは思われない。
【０１６３】
ＣＨＯ細胞により産生された不必要な不純物である宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して未処理上清および処理した０．９ｍ／ｓ試料で測定した。ＨＣＰレベルは、抗体１ｍｇ当たりのＨＣＰのｎｇに等しい百万分率（ｐｐｍ）として報告する。処理した試料は、未処理試料に比べてＨＣＰが４７％減少した。
【０１６４】
実施例８
大規模フロキュレーション：
沈殿剤としてカルシウムおよびリン酸を使用したパイロット実験および下流の清澄化工程およびクロマトグラフィー工程に及ぼす効果：ｍＡｂである抗ＩＬ−１３＃１（図４および５にｍＡｂ Ｅと示す）は、１９０Ｌバイオリアクター中の無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により５つの異なるバッチで産生させた。バイオリアクターを培養時間１２〜１４日で運転し、細胞は８×１０６〜１１×１０６生細胞／ｍＬの生存度を有し、６６〜８８％が生存していた。採集時に、培養液を室温（１８〜２５℃）にした。（最初の４つのバッチについては）培養液１５０Ｌは２００Ｌカルボイに移すか、（最後のバッチについては）バイオリアクターの中に放置し、オーバーヘッドミキサーでゆっくりと混合した。ｐＨを制御するためにＨＥＰＥＳ緩衝液を４０ｍＭまで添加した。次に、２Ｍリン酸カリウムを濃度２０ｍＭまで添加した。次に、５Ｍ塩化カルシウムを濃度３０ｍＭになるように添加した。この混合物のｐＨは７から７．５であった。フロキュレーションした培養液は、混合しながら２から３時間インキュベートした。
【０１６５】
フロキュレーションした培養液は、４から５Ｌ／ｍｉｎの流速および７６３０ＲＰＭ（８０００ｇ）のボウル速度でＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＢＴＰＸ２０５分離板型遠心分離器により加工処理した。図４に、得られた遠心分離上清の濁度を、（３４０ｇで１０分間の未処理対照の遠心分離から得られた）フロキュレーションしていない試料の上清と比較する。全ての場合で、フロキュレーションは濁度を８５％超減少させる。フロキュレーションした上清中の抗体力価の回収率は、インキュベーション時間の関数として図５に示すが、全ての場合で７５％超である。試料５０ｍＬをバッチ４０３および４０５から採取し、１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中でさらなる時間インキュベートした。７時間後にバッチ４０３は未処理試料の６０％の力価を有し、バッチ４０５は未処理試料の８０％の力価を有した。
【０１６６】
ＣＨＯ細胞により分泌された不必要な不純物である宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して未処理上清および処理した遠心分離上清で測定した。ＨＣＰレベルは、抗体１ｍｇ当たりのＨＣＰのｎｇに等しい百万分率（ｐｐｍ）として報告する。５つのバッチから処理した試料は、未処理試料に比べて４９％〜６９％のＨＣＰの減少を示した。
【０１６７】
最初の３つのバッチは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａ１ＨＣパッドフィルターを通過させて、１平方メートルおよび１時間当たり１２０リットルの流束でフィルター１平方メートル当たり遠心分離上清２７０Ｌの性能まで加工処理し、圧力の増加も増加も伴わなかった。
【０１６８】
濁度により測定したとき、パッド濾過後の試料は一般に数日間安定なままであった。
【０１６９】
最後の２つのバッチは、パッドを通過させずに直接０．２μｍフィルターにかけた。０．２μｍフィルターの前にパッドフィルターを使用せずに、それぞれ７３０および１６０Ｌ／ｍ２のフィルター性能を実現した。これらのフィルター性能は、フロキュレーションしていない物質でのフィルター性能よりも濾過性の有意な向上を示している。室温（１８〜２４℃）で０．２μｍで濾過した遠心分離上清（パッドなし）を保存すると、カルシウムおよびリン酸の沈殿継続が原因で、濁度は数時間以内に増加し始める。２４〜４８時間後に、沈殿は沈降し、容器の底にリン酸カルシウムの結晶層を形成する。結果として生じた清澄化した蛋白含有溶液は、沈殿の沈降前および後の両方で優れた濾過性を有する。沈殿への抗体の損失はない。
【０１７０】
最終バッチについてのフロキュレーションは、パイロットバイオリアクターで直接行った。リアクターは標準的な定置洗浄（ＣＩＰ）手順（水すすぎに続いて６０〜８０℃の０．１Ｎ ＮａＯＨによる洗浄）を使用して効果的に洗浄した。
【０１７１】
全ての５つのバッチは、プロテインＡカラム、陰イオン交換工程、ウイルス停留フィルター、および最終的な限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）によりパイロットスケールで加工処理したが、作業に問題はなかった。中和したプロテインＡのピークは、全て＜２０ＮＴＵの濁度を有し、高度に濾過性であった。サイズ排除ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により測定した高分子量凝集物および低分子量切断物（ｃｌｉｐ）のレベルなどの産物の品質、ならびに陽イオン交換ＨＰＬＣにより測定した酸性種および塩基性種のレベルは、この抗体を用いて予め行ったフロキュレーションなしのパイロット実験（ｃａｍｐａｉｇｎ）に匹敵した。
【０１７２】
実施例９
沈殿剤としてのカルシウムおよびリン酸の使用ならびに下流のプロテインＡクロマトグラフィー工程およびその後の濾過に及ぼす効果：３つのｍＡｂ、すなわち抗ＡＢ＃２、抗ＧＤＦ８＃１、および抗ＩＬ２２は、無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた。それぞれについて培養液を半分に分け、最初の試料を未処理のままとした。２番目の試料（処理した試料）にＨＥＰＥＳを４０ｍＭのレベルまで、リン酸カリウムを２０ｍＭのレベルまで、そして塩化カルシウムを３０ｍＭのレベルまで添加した。試料由来の全ての細胞は遠心分離により除去し、結果として得られた上清はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａ１ＨＣパッドフィルターを通過させて加工処理した。パッド濾過および０．２μｍポリッシングフィルターを通過させたさらなる濾過の後で、試料はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡアフィニティーカラムを使用してクロマトグラフィーにかけた。低ｐＨ緩衝液を使用して抗体をプロテインＡカラムから溶出させると、ピークのプールは時折混濁する。中和すると、濁度は典型的には有意に増加する。
【０１７３】
未処理試料および処理した試料の中和されたピークの濁度を下記表２に示す。３つの処理試料は全て未処理試料に比べて中和されたピークの濁度に有意な減少を示した。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
次に、未処理で中和した抗ＩＬ２２のピークおよび処理して中和した抗ＩＬ２２のピークは、２．８ｃｍ２Ｐａｌｌ Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｓｕｐｏｒ０．８／０．２μｍポリエーテルスルホン製シリンジフィルターを通過させて濾過した。各フィルターを通過することができた溶液の量に基づいて、最大フィルター性能を計算した。最大フィルター性能は、フィルターが詰まって溶液がそれ以上通過できなくなるまでフィルター１ｍ２を通過することができる溶液のリットル数である。未処理試料は、約１０〜３０Ｌ／ｍ２の最大フィルター性能を実現することができた。１７０Ｌ／ｍ２の処理した試料は、流れを減少させずにフィルターを通過し、この段階では処理した試料は残存しなかった。処理した試料は、最大フィルター性能を正確に計算するには速すぎる速度でフィルターを通過した。しかし、１７０Ｌ／ｍ２の目標まで流出の減少はなく、最大性能は１７０Ｌ／ｍ２よりも有意に大きいと考えることができる。
【０１７６】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１７７】
その他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に属する。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】分離方法の実施形態のフローチャートを示す図である。
【図２】規模および混合方法がフロキュレーションに及ぼす効果を示す図である。
【図３】混合速度がフロキュレーションに及ぼす効果を示す図である。
【図４】５回のパイロットスケールのフロキュレーション実験の図的要約である。
【図５】図４に要約した５回のパイロットスケールの各フロキュレーション実験についての経時的な抗体回収率（％）の変化を示す図的要約である。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００５年９月１５日に出願された米国仮出願第６０／７１７８３８号の利益を主張するものであり、その全体を出典明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
本発明は、分離方法、例えば１つまたは複数の可溶性不純物、細胞、細胞片、または不溶性不純物などの不純物を含む液体から精製された生成物を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオテクノロジー産業の中で、商業規模で蛋白を精製することは、治療目的および診断目的の組換え蛋白の開発への重要な課題である。収量、純度、および処理量に関する問題に製造部門は取り組んでいる。組換え蛋白の技術が出現したことで、関心対象の蛋白は、その蛋白をコードしている遺伝子を発現するように操作された培養真核宿主細胞系を使用して産生させることができる。しかし、宿主細胞の培養プロセスの結果として生じうるものは、所望の蛋白と、蛋白変異体などのその蛋白自体に由来するか、または宿主細胞の蛋白、ＤＮＡ、および細胞片などの宿主細胞に由来するかのいずれかの不純物との混合物である。医薬用途への所望の組換え蛋白の使用は、これらの不純物から十分なレベルの蛋白を確実に回収できることを条件とすることがある。組換え技法は、自然界に見出されない蛋白、例えば新規な突然変異蛋白、融合蛋白、または培地への蛋白分泌を指令する異種シグナル配列を有する蛋白を産生させることもできる。組換え蛋白は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＮＳ０骨髄腫細胞、およびピキア・パストリス酵母細胞を含めた多くの真核細胞型に発現させることができる。
【０００４】
典型的には、組換え蛋白を産生させるために、発現させる蛋白をコードしている遺伝子を、所望の細胞型にその遺伝子の転写および翻訳を指令するための適切な配列と共に含む組換えＤＮＡベクターが作製される。ベクターは、例えば薬物耐性遺伝子である選択マーカーもしくは逆選択マーカーなどの配列、および／または蛋白発現配列の安定した保持を促進するように設計された配列を含むこともある。哺乳動物細胞については、プラスミドベクターおよびウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターを使用することができる。
【０００５】
ベクターの作製に続いて、次にベクターを細胞に導入する。ベクターは、標準的な方法、例えばリポフェクション、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、またはバイオリスティックス（遺伝子銃）を使用して裸のＤＮＡとしてトランスフェクトすることができる。ウイルスベクターは、ウイルス粒子を用いた感染により導入することができる。次に、ベクターを含有する細胞を求めて細胞をスクリーニングまたは選択する。
【０００６】
ベクターを含有し、組換え蛋白を発現する細胞は液体培地中または固体支持体上で生育させることができ、蛋白はその細胞培養物から単離することができる。哺乳動物細胞の密度は、１０６細胞／ｍＬから２×１０７細胞／ｍＬ以上の範囲である。大部分の蛋白は分泌される。分泌された蛋白の濃度は、４ｍｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌの範囲になりうる。しかし、蛋白が細胞内で産生される場合は、細胞を破壊して蛋白を放出させるが、蛋白が分泌される場合は、細胞および細胞片を除去した後で生育培地または支持体から蛋白を単離することができる。次に、単離した蛋白は精製することができる。
【０００７】
細胞および細胞片を除去するために使用される従来の生物薬剤学的蛋白精製方法には、遠心分離、精密濾過、およびデプスフィルターがある。珪藻土などの濾過助剤は、これらの工程の能率を高めるために使用することができるが、濾過助剤は常に有効とは限らず、関心対象の産物に有意に結合することがある。濾過助剤の使用は、大規模な生物薬剤的作業の一部としては厄介でありうる固体または均質懸濁液の添加もまた必要とすることがある。
【０００８】
高分子凝集剤は、哺乳動物細胞培養のプロセス流れを清澄化することを助けるために使用することができるが、高分子凝集剤には限界がある可能性がある。例えば、加工助剤として典型的には使用される硫酸プロタミン製剤は、関心対象の蛋白の不活性化または沈殿析出による産物の損失に関する懸念のせいで適用が限定されている（Ｓｃｏｐｅｓ、１９８７）。医学用途のために販売されているような高品質試薬は高価なことがある。場合によっては、非常に低レベルまでの除去には、患者に予期しない作用がないことを保証するための確認が欠かせないことがある。例えば、キトサンは詳細に明らかにされた試薬ではなく、清澄化の適用に日常的に使用するには、その一貫した能率に関して懸念がある。ＤＥＡＥデキストランなどの多荷電ポリマー、廃水処理に使われることの多いアクリルアミド系ポリマー（ＮＡＬＣＯ Ｗａｔｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第８章）、およびポリエチレンアミン（ＰＥＩ）は、清澄化の適用での使用が考えられてきた。後者の２種類のポリマーに関して、アクリルアミド試薬は有毒試薬の混入の可能性があり、ポリエチレンアミンは高度に有効な清澄化試薬であるが、多くの場合、発癌物質の疑いのある様々な量のエチレンイミンモノマーが混入している（Ｓｃａｗｅｎら）。さらに、ＰＥＩを含めたこれらのポリマーの多くは、多数のクロマトグラフィー樹脂にほぼ非可逆的に結合することによって、下流の加工処理の選択肢が限られる傾向がある。これらのポリマーに関連する規制の問題および原料再利用の問題が、主として学術研究への応用を制限してきた。
【０００９】
ミョウバンおよび鉄塩などの非ポリマー系凝集剤は、廃水処理産業で利用されてきた（ＮＡＬＣＯ Ｗａｔｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）。これらの物質は蛋白産物に結合することがあり、また化学反応を触媒して安全性または有効性に影響しうる蛋白の修飾を招くおそれがあることから、これらの物質は蛋白産物の加工処理に有用ではないと考えられよう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は分離方法に関する。この分離方法は、１つまたは複数の可溶性不純物、不溶性不純物、細胞、または細胞片などの不純物を含有する液体から組換え蛋白などの蛋白を単離するために使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、本発明は、不純物の除去を助ける沈殿を形成することができる１つまたは複数（例えば２つ以上）の可溶性溶液を液体に添加することを含む分離方法を特徴とする。この沈殿は不純物の方に強く結合し、標的産物にはあまり強く結合しない。この溶液には、例えば一緒に混合したときに、例えば粒子、コロイド物質、細胞片、または細胞と相互作用することができ、不溶性の沈殿を形成する可溶性陽イオン、例えば金属イオンおよび／または可溶性陰イオンが含まれうる。結果として生じた沈殿は、精密濾過、デプス濾過、または遠心分離などの固液分離技法を使用して清澄化または除去することができる。処理された液体は、同様に加工処理された未処理の液体に比べて低い不純物レベルを有しうる。
【００１２】
不純物は、液体中に懸濁状態で見出される要素に関係することがある。いくつかの実施形態では、不純物にはコロイド物質、粒子状物質、細胞、膜断片などの細胞片、および典型的な加工条件で不溶性のその他の大きな細胞複合体が含まれる。不純物は、典型的な加工条件で可溶性のままである細胞構成要素を意味することもある。ＤＮＡ、宿主細胞蛋白、およびリン脂質は、清澄化のときに溶液状態で存在する細胞構成要素の例である。さらに、不活性アイソフォームまたは凝集した種などの可溶性の産物関連不純物も存在することがある。
【００１３】
不純物のレベルは、様々な方法により評価することができる。液体中の破片の量の尺度を与える一方法は、濁度の比濁（ｎｅｐｈａｌｏｍｅｔｒｉｃ）測定である。あるいは、破片のレベルは、既知の容量の液体を加工するために必要なメンブランフィルターの面積を測定することにより評価することができる。特異的な不純物は、液体に可溶性で、評価に特異的生化学試験を必要とすることもある。ＤＮＡレベルは、市販の色素であるＰｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号Ｐ−７５８１）を使用することなどにより、蛍光測定に基づく方法を使用して測定することができる。代わりの取り組みには、スロットブロット技法などのハイブリダイゼーション法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）がある。宿主細胞の蛋白レベルは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法、逆相クロマトグラフィー法、または酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）法により評価することができる。リン脂質は、薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーにより分析することができる。
【００１４】
生じた沈殿は、懸濁状態の不純物および可能性不純物の両方と相互作用することがあり、この相互作用は、精製した液体中のこれらの不純物のレベルを減少させることがある。結果として、この分離方法は、費用節減および／または時間節約、ならびに例えば組換え蛋白の産生のために哺乳動物細胞培養物を使用する工業プロセスのための産物の品質向上をもたらすことができる。
【００１５】
別の態様では、本発明は、その後のクロマトグラフィー工程の能率、例えばプロテインＡクロマトグラフィー工程の能率を高めることを特徴とする。プロテインＡクロマトグラフィーは、典型的にはスタフィロコッカス・アウレウスのプロテインＡが固定化された樹脂に無細胞馴化培地を直接適用することにより行われる。この樹脂は、続いて中性ｐＨ（ｐＨ約６〜８）の水溶液で洗浄し、結合した蛋白は、多くの場合、酸性緩衝液で溶出させる。それに続く加工処理の前に、溶出液のプールは中性ｐＨに調整する。プロテインＡの溶出液のプールは、特に高密度細胞培養物を負荷に使用した場合に、中和時に沈殿することが多い。本発明によると、プロテインＡ工程による宿主細胞蛋白の除去は、未処理液体に比べて負荷物を金属および陰イオンで処理した場合の方が大きい。複数の実施形態では、負荷する液体を陽イオンおよび陰イオンで処理しておいた場合に、中和時のプロテインＡのピークの沈殿析出が少なくなることが多く、加工処理の向上となっている。
【００１６】
別の態様では、本発明は２つの可溶性薬剤の選択を特徴とし、これらの薬剤は、混合すると固体を形成し、その固体は、適切な条件で高い産物回収率を伴って加工処理液の純度を向上することができる。これらの薬剤には、カルシウム、マンガン、マグネシウム、アルミニウム、コバルト、ニッケル、炭酸塩、フッ化物、亜硫酸塩、リン酸塩、ケイ酸塩、およびアルギン酸塩がありうるが、それに限定されるわけではない。これらの化合物は、金属への好ましいリガンドである多価金属イオンと、一価陰イオンまたはその代わりに多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔまたはｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）陰イオンとの組合せに相当する。これらの陽イオンおよび陰イオンの塩は、やや溶けにくい複合体を潜在的に形成するために適した条件で混合したとき、清澄化の応用に有用性を有することがある。
【００１７】
別の態様では、本発明は、蛋白を含む培地中で第１陽イオンおよび第１陰イオンを有する固体を形成させること、ならびにその蛋白からその固体を分離することを含む方法を特徴とする。
【００１８】
別の態様では、本発明は、蛋白を有する培地に第１陽イオンおよび第１陰イオンを導入すること、その第１陽イオンおよび第１陰イオンを有する固体を沈殿させること、ならびにその蛋白からその固体を分離することを含む方法を特徴とする。
【００１９】
本明細書に記載する方法は、培地、例えば液体培地（例えば混濁した懸濁物）から１つまたは複数の不純物の濾過を容易にするために使用することができる。例えば、これらの方法は、従来の濾過方法を使用した不純物の除去を困難または不都合にしている、１つまたは複数の混濁起因物質を有する培地に使用することができる。したがって別の態様では、本発明は、（ｉ）標的成分（例えば精製すべき成分）と、沈殿または凝集した宿主細胞蛋白、脂質、細胞片、全細胞、沈殿したＤＮＡ、またはプロテインＡのピークを中和したときに形成する沈殿などの１つまたは複数の混濁起因物質とを含む培地（例えば液体培地）中で第１陽イオンおよび第１陰イオンを含む固体を形成させること、ならびに（ｉｉ）例えば濾過によりその溶液からその固体および混濁起因物質を分離することを含む方法を特徴とする。複数の実施形態では、混濁起因物質は、コロイド物質、砂、土などの環境起源由来の粒子状物質、研磨したステンレス鋼微粉、または消泡剤もしくは尿素などの沈殿した賦形剤などの非細胞起源とすることができる。培地（例えば混濁した懸濁物）は、濁度計により測定したときに５ＮＴＵ超、または１００ＮＴＵ超、または５００ＮＴＵ超などの比較的高い濁度を有することがある。いくつかの実施形態では、この固体の存在は培地の濾過性能を増大させることができる。いくつかの実施形態では、処理した培地（例えば工程（ｉ）および（ｉｉ）を行った後の培地）の濁度は、未処理培地よりも小さいことがある。いくつかの実施形態では、標的成分は蛋白（例えば可溶性蛋白、例えば抗体）とすることができる。この方法は、濾過後に溶液から標的成分を回収することをさらに含むことができる。
【００２０】
複数の実施形態は、以下の特徴を１つまたは複数含むことができる。
【００２１】
第１陽イオンは、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ストロンチウムイオン、アルミニウムイオン、スカンジウムイオン、ランタンイオン、ケイ素イオン、チタンイオン、ジルコニウムイオン、トリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオン、銅イオン、クロムイオン、鉄イオン、ニッケル、亜鉛イオン、またはバナジウムイオンとすることができる。第１陽イオンはカルシウムイオンとすることができる。
【００２２】
第１陰イオンは、リン酸イオン、炭酸イオン、クロム酸イオン、タングステン酸イオン、水酸化物イオン、ハロゲン化物イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、亜硫酸イオン、モリブデン酸イオン、硝酸イオン、フッ化物イオン、ケイ酸イオン、およびアルギン酸イオンとすることができる。第１陰イオンはリン酸イオンとすることができる。
【００２３】
第１陽イオンはカルシウムイオンとすることができ、第１陰イオンはリン酸イオンとすることができる。
【００２４】
この固体は、約１０−４Ｍ２を超えない溶解度積定数を有することがある。
【００２５】
この方法は、約４ｍＭから約２００ｍＭの第１陽イオンまたは第１陰イオンを培地に導入することをさらに含むことができる。
【００２６】
第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積は、約１０−５Ｍ２、１０−４Ｍ２、または２．７×１０−２Ｍ２を超えることがある。
【００２７】
培地中の第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度は異なることがある。
【００２８】
培地中の第１陽イオンの濃度および第１陰イオン濃度は実質的に同じでありうる。
【００２９】
この方法は、培地のｐＨを変化させることをさらに含むことができる。
【００３０】
培地のｐＨは、約５から約９に維持されることがある。
【００３１】
この方法は、培地中の蛋白の少なくとも約５０％の分離をもたらすことがある。この方法は、培地中の蛋白の少なくとも約７０％の分離をもたらすことがある。
【００３２】
この方法は、清澄化された培地の清澄化された濁度を、その培地と同一で、その固体を有さない第２の清澄化された培地に比べて少なくとも約３０％だけ減少させることをさらに含むことができる。この方法は、清澄化された培地の濁度を、その培地と同一で、その固体を有さない第２の清澄化された培地に比べて少なくとも約５０％だけ減少させることをさらに含むことができる。
【００３３】
培地は細胞を含むことができる。培地は哺乳動物細胞をさらに含むことができる。培地は真核細胞をさらに含むことができる。
【００３４】
この方法は、培地を遠心分離すること、精密濾過膜を通してその培地を濾過すること、またはデプスフィルターを通してその培地を濾過することをさらに含むことができる。
【００３５】
固体は、第２陽イオン種または第２陰イオンをさらに含むことができる。
【００３６】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、第１培地と同一で、固体の形成を有さない第２培地を同様に溶出させたピークよりも低い濁度を有する溶出ピークをもたらすことができる。
【００３７】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、その培地と同一で、固体の形成を有さない第２培地の溶出ピークよりも低い可溶性不純物レベルを有する溶出ピークをもたらすことができる。
【００３８】
第１陽イオンおよび第１陰イオンは連続して導入することができる。
【００３９】
第１陽イオンおよび第１陰イオンは同時に導入することができる。
【００４０】
この方法は、異なる濃度の第１陽イオンおよび第１陰イオンを培地に導入すること、または同一濃度の第１陽イオンおよび第１陰イオンを培地に導入することを含むことができる。
【００４１】
この方法は、培地の温度を調整することをさらに含むことができる。
【００４２】
この蛋白は分泌蛋白とすることができる。その蛋白は、抗体、抗体の抗原結合断片、可溶性受容体、受容体融合体、サイトカイン、成長因子、酵素、または凝固因子とすることができる。
【００４３】
その蛋白が抗体またはその断片である実施形態では、その蛋白は少なくとも１つ、典型的には２つの完全長重鎖、および／または少なくとも１つ、典型的には２つの軽鎖を含むことができる。あるいは、その抗体またはその断片は、抗原結合断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ断片）のみを含むことができる。その抗体またはその断片は、モノクローナル抗体または単一特異性抗体とすることができる。その抗体またはその断片は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで作製された抗体のこともある。なお他の実施形態では、その抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、その抗体は例えばκまたはλから選択される軽鎖を有する。一実施形態では、その抗体の性質を改変するために（例えばＦｃ受容体の結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、または補体機能のうち１つまたは複数を増加または減少させるために）、定常領域が改変、例えば突然変異されている。典型的には、その抗体またはその断片は、前もって決定された抗原、例として例えば神経変性障害、代謝障害、炎症障害、自己免疫障害、および／または悪性障害などの障害に関連する抗原に特異的に結合する。本発明の方法により分離することのできる抗体の例には、Ａβペプチド、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、５Ｔ４、および増殖分化因子８（ＧＤＦ−８）に対する抗体があるが、それに限定されるわけではない。
【００４４】
他の態様、特徴、および利点は、その好ましい実施の説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
図１に関して、組換え蛋白などの標的蛋白を分離するための方法３０を示す。方法３０は、その蛋白および（細胞片、細胞、ＤＮＡ、宿主細胞蛋白、および不活性アイソフォームまたは凝集した種などの産物関連不純物を含みうるが、それに限定されるわけではない）不純物を含有する液体に可溶性塩（カルシウム含有塩およびリン酸含有塩など）を添加することを含む（工程３２）。これらの塩溶液は、これらの塩溶液を混合したときの液体におけるｐＨ変化を最小にするため、またはｐＨを最適化するための緩衝化剤を有することがある。接触（例えば混合）したときに、これらの可溶性塩は反応を開始し、培地中で沈降しうる不溶性沈殿（固体リン酸カルシウムなど）を形成することが多い。図１に示すように、続いて培地を所定のｐＨに滴定調節し、必要に応じて温度を調整し（工程３４）、沈殿析出を高めてもよい。沈降途中の沈殿は、細胞および破片、ならびに潜在的にその他の不純物も沈降させるが、標的蛋白は本質的にその液体に引き続き可溶性である。沈殿析出を促進し、清澄化を最適化する一方で高レベルの標的蛋白の回収を維持するために、この液体懸濁液を目標時間適切な条件でインキュベートする（工程３６）。続いて、標的蛋白を含有する液体から沈殿を分離する（工程３８）。この作業は、重力沈降、遠心分離、または濾過を含めた様々な方法で行うことができ、濾過の選択肢には、タンジェンシャルフロー濾過、デプス濾過、荷電媒質を通した濾過、珪藻土が媒質の構成要素であるパッド濾過がある。培地に添加する陽イオンおよび陰イオンの量は、沈殿析出または破片の重力沈降に十分ではないおそれがあるが、それでも濾過助剤として作用することにより濾過を促進することができる。固液分離は、一連の前記選択項目による加工処理すること、典型的には滅菌等級とみなすことができる小さい公称孔径（０．４５、０．２、または０．１μＭなど）に級別されるフィルターを通した液体の通過で最高点に達することを含みうる。本明細書に記載するフロキュレーション方法により清澄化された液体は、一次清澄化の一環として、または遠心分離などの初回固液分離工程後のいずれかで濾過面積が小さくて済むことがある。さらに、パッド後および滅菌等級のフィルター後の濁度は、フロキュレーションしていない対照に比べて有意に低下することがある。
【００４６】
典型的には、その後の精製は、一連のクロマトグラフィー工程により進めることができるが、結晶化および沈殿析出などの他の精製方法を考えることもできる。記載した方法を使用した清澄化の後に、抗体についてはプロテインＡカラムであることが多い第１クロマトグラフィー工程の能率が高まることがある。宿主細胞蛋白を含めた宿主細胞由来不純物の全体的な除去は、フロキュレーション処理を行わないときよりも大きくなりうる。多くの場合で、中和されたプロテインＡの溶出液プールのピークもまた、未処理対照に比べて少ない沈殿析出を有する。この沈殿析出レベルの減少は、より小さいフィルター面積を必要とすることもあり、必要な加工処理時間が短縮することもある。沈殿析出レベルの減少は、望まれない不純物が除去されたことも示している。
【００４７】
理論に縛られることを望まないが、不溶性沈殿は、細胞、細胞片、およびその他のプロセス流れの不純物に選択的に結合するが、蛋白とは有意に相互作用しないことにより、蛋白の分離を高めると考えられる。仮説を立てられた不純物除去プロセスの非限定的な例を下の式（１）に示す：
【００４８】
【化１】
【００４９】
式（１）を参照すると、Ｍ＋は可溶性［すなわち「（ｓ）」］陽イオンであり、Ａ−は、Ｍ＋と相互作用して不溶性の塩または複合体を形成することができる可溶性陰イオンであり、影付きの丸および黒丸は、それぞれ可溶性不純物または不溶性不純物を表し、１は陽イオン−陰イオン塩または複合体と、それに結合した不純物とを含む不溶性沈殿であり（１は本明細書において「最終複合体もしくは塩」または「第１陽イオンおよび第１陰イオンを有する固体」と呼ばれることもある）、下向きの矢印は１が沈殿析出した形態であることを示す。例えばリン酸カルシウムは、ＤＮＡ、宿主細胞蛋白、および細胞片とイオン的および／またはキレート化により相互作用することができるが、標的蛋白と有意には相互作用しない。この選択性によって、その蛋白は上清中に残り、続いて培地および馴化培地のその他の構成要素から容易に分離される。
【００５０】
図１をさらに参照すると、分離方法３０は、第１可溶性塩および第２可溶性塩を培地に導入すること（工程３２）を含む。この培地は、例えば組換え蛋白が形成した馴化水溶液とすることができる。第１可溶性塩は第１陽イオンを含み、第２可溶性塩は第１陰イオンを含む。接触させると、第１陽イオンおよび第１陰イオンは培地中で相互作用することができ、不溶性沈殿の形成を開始することがある。ｐＨまたは温度の液体環境を任意の時間に調整して、沈殿析出条件を最適化することができ（例えば工程３４）、溶液を目標時間インキュベートし、系を完全に平衡状態にさせる（工程３６）。
【００５１】
一般に、関心対象の産物を有する液体中に比較的不溶性の塩または複合体を形成することができる任意の陽イオン（例えば第１陽イオン）／陰イオン（例えば第１陰イオン）の組合せを選択することができる。複数の実施形態では、そのような塩または複合体は、関心対象の産物を有する液体に匹敵する溶液に溶けない、やや溶けにくい、ほとんど溶けない、極めて溶けにくい、または溶けにくいと分かることがある。陽イオン／陰イオンの組合せの例には、選択された陽イオン（例えば第１陽イオン、例えば下記式２のＭ＋）および選択された陰イオン（例えば第１陰イオン、例えば下記式２のＡ−）が、水に比較的不溶性の塩または複合体（例えば下記式２のＭＡ）を形成することができる組合せが含まれる：
【００５２】
【化２】
【００５３】
式中、「（ｓ）」および下向きの矢印は、式（１）に関して定義した通りである。多くの場合、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘまたはｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙまたはその他の類似の参考文献に記載されている水への溶解度の特徴付けは、潜在的能率の適切な指標となる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、選択した陽イオンおよび選択した陰イオンは、水において約１×１０−４Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２（例えば約１×１０−５Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２、約１×１０−６Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２、約１×１０−４Ｍ２から約１×１０−４０Ｍ２）の溶解度積定数（Ｋｓｐ）を有する塩または複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、例示的な陽イオンおよび陰イオンは、第１陽イオンおよび第１陰イオンの溶解度積定数（Ｋｓｐ）（［陽イオン］×［陰イオン］）が例えば約１０−４Ｍ２未満、好ましくは約１０−５Ｍ２または１０−６Ｍ２を下回ると同定することができる。１０−４Ｍ２未満のＫｓｐ値を有する物質はこの方法に利用することができる。それは、その陽イオンおよび陰イオンを混合したときに、これらの物質がそれぞれ最大で１０ｍＭの最終溶液を生じることができ、１０ｍＭを超えたその陽イオンまたは陰イオンの添加は、沈殿およびその後のフロキュレーションを生じることができるからである。上に挙げたよりも高いＫｓｐ値を有する物質を使用することもできるが、固体を形成させるために過剰量の陽イオンおよび陰イオンが必要になるおそれがある。
【００５５】
陽イオン（例えば第１陽イオン）は、アルカリ土類金属、遷移金属、または典型元素でありうる。これらの元素は、硬い酸、境界域の酸（ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ ａｃｉｄ）、または軟らかい酸に分類されることがある。第１陽イオンの例にはカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ２＋）、アルミニウムイオン（Ａｌ３＋）、銅イオン（Ｃｕ（Ｉ）またはＣｕ（ＩＩ））、スカンジウムイオン（Ｓｃ＋３）、ランタンイオン（Ｌａ＋３）、ケイ素イオン（Ｓｉ４＋）、チタンイオン（Ｔｉ（ＩＩＩ）またはＴｉ（ＩＶ））、トリウムイオン、ジルコニウムイオン、マンガンイオン（Ｍｎ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩＩ））、コバルトイオン（Ｃｏ（ＩＩ）またはＣｏ（ＩＩＩ））、クロムイオン（Ｃｒ（ＩＩ）またはＣｒ（ＩＩＩ））、鉄イオン（Ｆｅ（ＩＩ）またはＦｅ（ＩＩＩ））、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）、およびバナジウムイオン（Ｖ（ＩＩＩ）、Ｖ（ＩＶ）、またはＶ（Ｖ））がある。これらは硬い酸および境界域の酸に相当する。第１陰イオンは原子種または分子種とすることができる。いくつかの実施形態では、第１陽イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、またはＮｉ２＋とすることができる。ある実施形態では、第１陽イオンはＣａ２＋とすることができる。
【００５６】
第１陰イオンの例には、使用する金属イオンへの好ましいリガンドである陰イオンがある。硬い酸および境界域の酸について、陰イオンにはフッ化物イオン、リン酸イオン、炭酸イオン、ケイ酸イオン、クロム酸イオン、タングステン酸イオン、水酸化物イオン、亜硫酸イオン、硝酸イオン、モリブデン酸イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、およびクエン酸イオン、ならびにある程度は硫酸イオンおよび過塩素酸イオンが含まれることがある（Ａｑｕａｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗ．ＳｔｕｍｍおよびＪＳ Ｍｏｒｇａｎ編、Ｊ Ｗｉｌｅｙ、（１９８１）、３４３頁；ならびにＲ．Ｇ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第８５巻、３５３３頁（１９６３）参照）。いくつかの実施形態では、第１陰イオンはリン酸イオン、亜硫酸イオン、炭酸イオン、フッ化物イオン、モリブデン酸イオン、またはケイ酸イオンとすることができる。ある実施形態では、第１陰イオンはリン酸イオンとすることができる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、第１陽イオンはＣａ２＋とすることができ、第１陰イオンは、リン酸イオン、亜硫酸イオン、炭酸イオン、フッ化物イオン、モリブデン酸イオン、またはケイ酸イオンとすることができる。ある実施形態では、第１陽イオンはＣａ２＋とすることができ、第１陰イオンはリン酸イオンとすることができる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、第１陽イオンは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、またはＮｉ２＋とすることができ、第１陰イオンはリン酸イオン、炭酸イオン、またはフッ化物イオンとすることができる。
【００５９】
第１陽イオンおよび第１陰イオンそれぞれについての初濃度（すなわち（沈殿析出の開始前に）培地に導入される第１陽イオンおよび第１陰イオンの濃度）は、最終複合体の溶解度に応じて約２ミリモル濃度から約２００ミリモル濃度の範囲（例えば約３ミリモル濃度から約２００ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約２００ミリモル濃度、約５ミリモル濃度から約２００ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約１００ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約５０ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約４０ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約３０ミリモル濃度、約４ミリモル濃度から約１０ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度から約８０ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度から約４０ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度から約３０ミリモル濃度、約２０ミリモル濃度から約８０ミリモル濃度、約２０ミリモル濃度から約４０ミリモル濃度、例えば約４ミリモル濃度、約６ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度、約１３．３ミリモル濃度、約１６ミリモル濃度、約２０ミリモル濃度、約２４ミリモル濃度、約３０ミリモル濃度、約３３．３ミリモル濃度、約４０ミリモル濃度、約５０ミリモル濃度、または約８０ミリモル濃度）とすることができる。ある実施形態では、（沈殿析出の開始前に）培地に導入される第１陽イオンの濃度は、約６ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度、約２０ミリモル濃度、約２４ミリモル濃度、約３０ミリモル濃度、約４０ミリモル濃度、約５０ミリモル濃度、または約８０ミリモル濃度とすることができる。ある実施形態では、（沈殿析出の開始前に）培地に導入される第１陰イオンの濃度は、４ミリモル濃度、約１０ミリモル濃度、約１３．３ミリモル濃度、約１６ミリモル濃度、約２０ミリモル濃度、約２４ミリモル濃度、約３０ミリモル濃度、約４０ミリモル濃度、約５０ミリモル濃度、または約８０ミリモル濃度とすることができる。例えば、（沈殿の開始前に）培地に導入される第１陽イオンの濃度は約３０ミリモル濃度とすることができ、（沈殿の開始前に）培地に導入される第１陰イオンの濃度は約２０ミリモル濃度とすることができる。別の例として、（沈殿の開始前に）培地に導入される第１陽イオンの濃度は約２４ミリモル濃度とすることができ、（沈殿の開始前に）培地に導入される第１陰イオンの濃度は約１６ミリモル濃度とすることができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、第１陽イオンおよび第１陰イオンの上記初濃度の積は、約４×１０−６Ｍ２から約４×１０−２Ｍ２、（例えば約１．６×１０−５Ｍ２から約４×１０−２Ｍ２、約２．５×１０−５Ｍ２から約４×１０−２Ｍ２、約１．６×１０−５Ｍ２から約６．４×１０−３Ｍ２、または約２．５×１０−５Ｍ２から約６．４×１０−３Ｍ２）とすることができる。いくつかの実施形態では、第１陽イオンおよび第１陰イオンの上記初濃度の積は、約１×１０−５Ｍ２超、約２×１０−５Ｍ２超、約１×１０−４Ｍ２超、約２×１０−４Ｍ２超、約１０×１０−４Ｍ２超、または約２．７×１０−２Ｍ２とすることができる。いくつかの実施形態では、これらの濃度は、不純物と一緒になった不溶性塩の有意な沈殿析出を招くことがある。高すぎる濃度は、総液体容量の約１０％を超える固体容量を招くことがある。５００ｍＭを超える陽イオンまたは陰イオンの濃度は、低い溶解度定数を有すると大きな固体容量を与えることがある。大きな固体容量から標準的な固液分離技法を用いて十分な産物を回収することは困難なおそれがある。沈殿の例には、リン酸カルシウム、亜硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、フッ化カルシウム、ケイ酸カルシウム、モリブデン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、フッ化マグネシウム、リン酸マンガン、炭酸マンガン、リン酸コバルト、リン酸ニッケル、および炭酸ニッケルがある。
【００６１】
いくつかの実施形態では、液体培地中の最終的な塩または複合体（例えば式（１）の１、すなわち陽イオン−陰イオンの塩または複合体と、それに結合している不純物とを含む不溶性沈殿）のＫｓｐは、約１×１０−４Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２（例えば約１×１０−５Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２、約１×１０−６Ｍ２から約１×１０−５０Ｍ２、約１×１０−４Ｍ２から約１×１０−４０Ｍ２）とすることができる。いくつかの実施形態では、液体培地中の最終的な塩または複合体のＫｓｐは、例えば約１０−４Ｍ２未満、好ましくは約１０−５Ｍ２または１０−６Ｍ２未満とすることができる。例えば、表１でカルシウム４０ｍＭおよびリン酸２０ｍＭを有する抗ＩＬ１３＃２試料では、遠心分離後（すなわち沈殿析出後）の上清は、カルシウム８．１９ｍＭおよびリン酸１．０４ｍＭを含有した。この可溶性カルシウムおよびリン酸のレベルは８．５×１０−６Ｍ２のＫｓｐに対応する。表１でカルシウム８０ｍＭおよびリン酸２０ｍＭを有する抗ＡＢ＃１試料では、遠心分離後の上清はカルシウム２２．２ｍＭおよびリン酸０．４ｍＭを含有した。この可溶性カルシウムおよびリン酸のレベルは８．４×１０−６Ｍ２のＫｓｐに対応する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、液体培地中の最終的な塩または複合体（例えば式（１）の１）のＫｓｐは、水における陽イオン−陰イオンの塩または複合体自体（すなわち不純物が結合していないもの、例えば式（２）の２）のＫｓｐとは異なる（例えばそのＫｓｐよりも大きい）ことがある。例えば、式（１）および（２）を参照すると、液体中の例えば１（例えばＭＡ＝リン酸カルシウム）のＫｓｐは、水におけるリン酸カルシウム自体（例えばＭＡ＝リン酸カルシウムである式（２）の２）のＫｓｐとは異なる（例えばそのＫｓｐよりも大きい）ことがある。
【００６３】
沈殿を形成するその他の実施を行うことができる。例えば、第１陽イオンおよび第１陰イオンは、実質的に同時または連続的に培地に導入することができる。第１陽イオンがカルシウムイオンであり、第１陰イオンが亜硫酸イオンである実施では、カルシウムを導入する前に培地に亜硫酸塩を導入することで、不純物の沈殿析出を高めることができる（実施例２）。第１陽イオンおよび第１陰イオンの濃度は、実質的に同じこともあり、異なる（陽イオンに富むまたは陰イオンに富む）こともある。例えば一方のイオンの濃度は、もう一方のイオンの濃度の約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、または約５倍の大きさとすることができる。いくつかの実施では、１つを超える陽イオンおよび／または１つを超える陰イオンが培地に導入される。陽イオンの総濃度は、約５ミリモル濃度から約２００ミリモル濃度の範囲とすることができ、陰イオンの総濃度も同様でありうる。ポリマー性溶液を使用する場合、ポリマーの分子量に基づくとｍＭ単位の濃度は実質的に低いおそれがあり、その代わりに濃度はモノマーの分子量に依存することがある。その他の実施では、１つまたは複数の陽イオンのみ、または１つまたは複数の陰イオンのみが培地に導入される。例えば、蛋白を有する培地が沈殿を形成することができる陰イオンまたは陽イオンをすでに含む場合、それぞれ適切な陽イオンまたは陰イオンを添加して沈殿を形成させることができる。あるいは、イオンを添加して、すでに培地中にあるイオンと反応させ、第１沈殿を形成させることができ、そしてさらなる陽イオン／陰イオンの組合せを培地に添加して他の沈殿を形成させることができる。
【００６４】
図１に示すように、この方法は、所望により適切なｐＨに培地を滴定調節することおよび／または温度を調整すること（工程３４）を含むことができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、培地のｐＨを所定のｐＨに調整して沈殿を増大させることができる（工程３４）。培地のｐＨは、例えば塩基（例えばＮａＯＨ）またはリン酸もしくは塩酸などの酸を用いて滴定調節することによって増加または減少させることができる。所定のｐＨは、例えば培地中の陽イオンおよび陰イオン、培地中のその他の物質、ならびに／または培地の組成の関数とすることができる。所定のｐＨは、約５から約９、例えば約６．５から約９の範囲とすることができる。
【００６６】
その他の実施形態では、培地のｐＨは調整されない。
【００６７】
いくつかの実施形態では、培地を加熱または冷却して能率を最適化することがある（工程３４）。ｐＨを調整することと同様に、培地を加熱またはインキュベートする温度および時間は、例えば培地中の陽イオンおよび陰イオン、培地中のその他の物質、ならびに／または培地の組成の関数とすることができる。
【００６８】
培地は室温でインキュベートすることができ、または例えば約３７℃に加熱することができる。インキュベーション時間または加熱時間（工程３６）は、約１時間から約１２時間までの範囲とすることができる。培地をインキュベートまたは加熱する間に、培地は（例えば物質の剪断を低下させるために低速で）混合することができ、または培地は最初の時間混合し、そして沈殿が沈降できるように混合せずに静置させ、それにより蛋白を有する上清を容易に分離させることができる。
【００６９】
その他の実施形態では、沈殿が良好な分離を十分にもたらすならば、培地は加熱しない。
【００７０】
次に、上清からの沈殿の分離を助けるために培地を遠心分離し（工程３８）、それにより上清の濁度は低下する。デプス濾過または精密濾過などのその他の固体除去方法が可能である。下記の実施例に例示するように、フロキュレーションを起こしていない未処理対照溶液に比べて少なくとも約３０％だけ培地の濁度が低下することがある。いくつかの実施では、培地の濁度は少なくとも約５０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％以上だけ低下する。本明細書に使用するように、濁度は標準的な手順に従って比濁計（ＨＡＣＨ（ラブランド、コロラド州）により製造されたものなど）を使用して測定する。
【００７１】
遠心分離などによる一次清澄化後に、濾過を用いたさらなる破片除去が行われることがある（工程３８）。下記実施例に例示するように、本明細書に記載する分離方法は、少なくとも約５０％（少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％など）の蛋白回収率で高い収率をもたらすことができる。本明細書に使用するように、回収率は、処理前プール中の標的蛋白の質量に対する処理後のプール中の質量として計算される。産物の質量は、標的蛋白の濃度と容量との積であり、ここで濃度は、高速液体クロマトグラフィーアッセイなどの様々な方法により決定することができる。抗体である標的蛋白について、濃度は、多くの場合プロテインＡに基づく分析方法を使用して決定することができる。生物薬剤用細胞培養、精製、または蛋白の特徴付けの方法の分野の技術者は、適切なアッセイ法を識別することができる。
【００７２】
続いて蛋白は、従来法に従って精製することができる。
【００７３】
蛋白またはポリペプチド
本発明は、液体からの蛋白、例えば可溶性蛋白または分泌蛋白の分離に関する。本明細書に使用する用語「蛋白」は、ユニットとして機能することができる１つまたは複数のポリペプチドを表す。本明細書に使用する「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して一緒に結合した連続するアミノ酸鎖を表す。用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸鎖を表すために使用されるが、当業者ならば、この用語が長鎖に限定されず、ペプチド結合を介して一緒に結合した２つのアミノ酸を備える最小の鎖を表しうることを理解するであろう。単一のポリペプチドがユニットとして機能できるならば、用語「ポリペプチド」および「蛋白」は相互交換可能に使用することができる。
【００７４】
ある実施形態では、蛋白は組換え産生される。本明細書に使用する用語「組換え発現された蛋白」および「組換え蛋白」は、ヒトの手によってポリペプチドを発現するように操作された宿主細胞から発現したポリペプチドを表す。ある実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。ある実施形態では、この操作は１つまたは複数の遺伝子修飾を含んでもよい。例えば、発現させるポリペプチドをコードしている１つまたは複数の異種遺伝子の導入により、宿主細胞を遺伝子修飾してもよい。組換え発現された異種ポリペプチドは、宿主細胞で通常発現されるポリペプチドに同一または類似とすることができる。組換え発現された異種ポリペプチドは、宿主細胞にとって外来、例えば宿主細胞で通常発現されるポリペプチドとは異種のこともある。ある実施形態では、組換え発現された異種ポリペプチドはキメラである。例えば、ポリペプチドの一部は、宿主細胞に通常発現されるポリペプチドと同一または類似するアミノ酸配列を有するが、他の部分がその宿主細胞にとって外来のアミノ酸配列を有することがある。さらに、またはあるいは、ポリペプチドは、共に宿主細胞に通常発現される２つ以上の異なるポリペプチド由来のアミノ酸配列を有することがある。さらにポリペプチドは、共に宿主細胞にとって外来の２つ以上のポリペプチド由来のアミノ酸配列を有することがある。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１つまたは複数の内因性遺伝子の活性化またはアップレギュレーションにより遺伝子修飾されている。
【００７５】
本発明により望ましくは分離することができる任意の蛋白は、多くの場合、関心対象の、または有用な、生物活性または化学活性に基づいて選択されるものである。例えば、本発明は、数ある中で任意の医薬的または商業的に関連する抗体、受容体、サイトカイン、成長因子、酵素、凝固因子、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤を分離するために採用することができる。本発明により分離することができる蛋白の以下のリストは、事実上単なる例示であり、限定する列挙であることを意図しない。当業者は、本発明により任意の蛋白を発現させることができることを了解しているものであり、必要に基づいて産生される特定の蛋白を選択することができるものである。
【００７６】
抗体および結合断片
免疫グロブリンとしても公知である抗体は、典型的にはそれぞれ約２５ｋＤａの２つの軽（Ｌ）鎖と、それぞれ約５０ｋＤａの２つの重（Ｈ）鎖とから構成される四量体グリコシル化蛋白である。λおよびκと名付けられた２種類の軽鎖を抗体に見出すことができる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、５つの主クラス、すなわちＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＭに割り当てることができ、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けることができる。各軽鎖は、１つのＮ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および１つの定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）を含む。各重鎖は、１つのＮ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３つまたは４つのＣドメイン（ＣＨ）、および１つのヒンジ領域を含む。最もＶＨに近いＣＨドメインはＣＨ１と呼ぶ。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）と呼ばれる４領域の比較的保存された配列からなり、これらの領域は、３領域の超可変配列（相補性決定領域（ＣＤＲ））の足場を形成している。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を有する。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。したがって、重鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれるが、軽鎖上のＣＤＲ構成要素は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と呼ばれる。ＣＤＲ３は、典型的には抗体結合部位内の分子多様性の最大の原因である。例えばＨ３は、わずか２つのアミノ酸残基のこともあり、２６個を超えるアミノ酸のこともある。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元立体配置は、当技術分野で十分に公知である。抗体構造の総説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｌｏｗら編、１９８８を参照されたい。当業者は、各サブユニット構造、例えばＣＨ、ＶＨ、ＣＬ、ＶＬ、ＣＤＲ、ＦＲ構造が、活性な断片、例えばＶＨ、ＶＬ、もしくはＣＤＲサブユニットのうち抗原に結合する部分、すなわち抗原結合断片を備えること、または例えばＣＨサブユニットのうち例えばＦｃ受容体および／または補体に結合し、かつ／もしくは活性化する部分を備えることを認識しているものである。ＣＤＲは、典型的にはＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）、Ｋａｂａｔら編に記載されているＫａｂａｔのＣＤＲを表す。抗原結合部位を特徴付けるための別の基準は、Ｃｈｏｔｈｉａに記載されている超可変ループを参照することである。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：４６２８〜４６３８を参照されたい。なお別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアに使用されるＡｂＭの規定である。一般に例えばＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ハイデルベルク）の中のＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓを参照されたい。ＫａｂａｔのＣＤＲに関して記載された実施形態は、代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａの超可変ループまたはＡｂＭで規定されたループに関する同様に記載された関係を使用して実施することができる。
【００７７】
本明細書に使用される用語「抗体」は、少なくとも１つ、典型的には２つのＶＨドメインもしくはその部分、および／または少なくとも１つ、典型的には２つのＶＬドメインもしくはその部分を備える蛋白を含む。一実施形態では、抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖の４量体であり、ここで、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は例えばジスルフィド結合により相互に結合している。抗体またはその部分は、齧歯類、霊長類（例えばヒトおよび非ヒト霊長類）、ラクダ科の動物（例えばラクダまたはラマ）を非限定的に含めた任意の起源から得ることができ、組換え産生、例えばキメラ化、ヒト化することができ、かつ／または本明細書にさらに詳細に記載するようにｉｎ ｖｉｔｒｏで作製することができる。
【００７８】
抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわちＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる１価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわちヒンジ領域でジスルフィド結合により結合している２つのＦａｂ断片を備える２価断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片、（ｖｉ）ラクダまたはラクダ化可変ドメイン、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ならびに（ｖｉｉｉ）二重特異性抗体がある。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ、およびＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、これらのドメインを蛋白一本鎖として作ることができる合成リンカーにより、組換え法を用いて、これらのドメインを連結することができ、その蛋白一本鎖では、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対を形成して１価分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えばＢｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３〜２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９〜８３を参照されたい）。このような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合断片」という用語に包含されることが意図される。これらの断片は、当業者に公知の従来技法を使用して得られ、これらの断片は、無傷抗体と同様に機能について評価される。
【００７９】
抗原結合断片は、所望により例えば安定性、エフェクター細胞の機能、または補体結合のうち１つまたは複数を高める部分を含むことができる。例えば、抗原結合断片は、ＰＥＧ化部分、アルブミン、または重鎖もしくは／または軽鎖の定常領域（もしくはその部分）を含むことができる。
【００８０】
「二重特異性」抗体または「二機能」抗体以外では、抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であることが了解されている。「二重特異性」抗体もしくは「二機能抗体」、またはその抗原結合断片は、２つの異なる抗原結合部位を有する人工ハイブリッド抗体またはその断片である。二重特異性抗体またはその抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合、Ｆａｂ’断片同士の結合、または組換えを含めた様々な方法により産生することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８、１５４７〜１５５３（１９９２）を参照されたい。
【００８１】
抗体またはその抗原結合断片を得るために、当業者に公知の数多くの方法が利用できる。例えば、モノクローナル抗体は、公知の方法によるハイブリドーマの作製により産生させることができる。次に、この方法で形成したハイブリドーマは、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））分析などの標準法を用いてスクリーニングし、特定抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つまたは複数のハイブリドーマを同定する。任意の形態の特定の抗原は、免疫原として、例えば組換え抗原、天然形態、任意の変異体、またはその断片、およびその抗原性ペプチドとして使用することができる。
【００８２】
抗体を作る方法の一例は、蛋白発現ライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーまたはリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含む。ファージディスプレイは、例えばＬａｄｎｅｒら、米国特許第５２２３４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１３１５〜１３１７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；およびＷＯ９０／０２８０９に記載されている。
【００８３】
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、特定抗原は、非ヒト動物、例えば齧歯動物、例えばマウス、ハムスター、またはラットを免疫するために使用することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を有して、マウス抗体産生を欠損したマウス系統を操作して創出することができる。ハイブリドーマ技法を使用して、所望の特異性を有する、遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体を産生させ、選択してもよい。例えばＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７：１３〜２１、ＵＳ２００３−００７０１８５、１９９６年１０月３１日に公表されたＷＯ９６／３４０９６、および１９９６年４月２９日に提出されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８を参照されたい。
【００８４】
別の実施形態では、モノクローナル抗体を非ヒト動物から得て、次に当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法を使用して修飾抗体、例えばヒト化抗体、脱免疫化抗体、キメラ抗体を産生してもよい。キメラ抗体を製造するための様々なアプローチが記載されている。例えばＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１、１９８５；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２、１９８５；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４８１６５６７号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４８１６３９７号；Ｔａｎａｇｕｃｈｉら、欧州特許公開ＥＰ１７１４９６；欧州特許公開０１７３４９４；英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂを参照されたい。ヒト化抗体は、例えばヒト重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現するが、内因性のマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現することができないトランスジェニックマウスを使用して産生させることもできる。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体を調製するために使用することができる例示的なＣＤＲグラフト化方法を記載している（米国特許第５２２５５３９号）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全てを非ヒトＣＤＲの少なくとも部分と交換することができ、またはＣＤＲの一部だけを非ヒトＣＤＲと交換することができる。所定の抗原にヒト化抗体を結合させるために、必要な数のＣＤＲを交換することだけが必要である。
【００８５】
ヒト化抗体またはその断片は、抗原の結合に直接は関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメイン由来の等価の配列に交換することにより作製することができる。ヒト化抗体またはその断片を作製するための方法の例は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４；およびＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ５８５９２０５；およびＵＳ６４０７２１３に示されている。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つ由来の免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全てまたは一部をコードしている核酸配列を単離、操作、および発現させることを含む。そのような核酸は、上記の所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから、およびその他の起源から得ることができる。次に、ヒト化抗体分子をコードしている組換えＤＮＡは、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
【００８６】
ある実施形態では、ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列の置換、生殖細胞系列置換、および／または復帰突然変異の導入により最適化される。そのような改変された免疫グロブリン分子は、当技術分野で公知の任意のいくつかの技法により作ることができ（例えばＴｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：７３０８〜７３１２、１９８３；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２７９、１９８３；Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２：３〜１６、１９８２）、またはＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３またはＥＰ０２３９４００の教示に従って作ることもできる）。
【００８７】
抗体またはその断片は、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に開示された方法により、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失、すなわち「脱免疫化」により修飾することもできる。簡潔には、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて、抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを分析することができる。これらのペプチドは（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に規定されるように）潜在的Ｔ細胞エピトープに相当する。潜在的Ｔ細胞エピトープを検出するために、「ペプチドスレディング（ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」という名のコンピュータモデリングの取り組みを適用することができ、さらに、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載されているようにＶＨ配列およびＶＬ配列に存在するモチーフについて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは１８個の主要ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲアロタイプのうち任意のものに結合し、したがって、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成している。検出された潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメイン中の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは１アミノ酸置換によって除去することができる。典型的には、保存的置換が行われる。全ての場合ではなく多くの場合に、ヒト生殖細胞系列抗体配列中のある位置に共通のアミノ酸を使用することができる。ヒト生殖細胞系列配列は、例えばＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、第１６（５）巻：２３７〜２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ら、（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：４６２８〜４６３８に開示されている。Ｖ ＢＡＳＥディレクトリーは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の総合ディレクトリー（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ケンブリッジ、英国）による編集）を提供している。これらの配列は、例えばフレームワーク領域およびＣＤＲについてのヒト配列の起源として使用することができる。ＵＳ６３０００６４に記載されているようにヒトのコンセンサスフレームワーク領域もまた使用することができる。
【００８８】
ある実施形態では、抗体は、改変された免疫グロブリン定常領域またはＦｃ領域を有することがある。例えば、本明細書における教示により産生された抗体は、補体受容体および／またはＦｃ受容体などのエフェクター分子に強くまたはより高い特異性で結合することがあり、このことは、エフェクター細胞活性、溶解、補体介在性活性、抗体の除去、および抗体の半減期などのいくつかの抗体の免疫機能を制御することができる。抗体のＦｃ領域に結合する典型的なＦｃ受容体（例えばＩｇＧ抗体）には、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎサブクラスという受容体が、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングされた形態を含めて含まれるが、それに限定されるわけではない。Ｆｃ受容体は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ９：４５７〜９２、１９９１；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２５〜３４、１９９４；ならびにｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１、１９９５）に総説されている。
【００８９】
本発明の方法により分離することができる抗体の非限定的な例には、Ａβ、ＩＬ−１３、ＩＬ−２２、ＧＤＦ８、および５Ｔ４に対する抗体があるが、それに限定されるわけではない。これらの抗体のそれぞれは、本明細書下記および添付の実施例にさらに詳細に記載されている。
【００９０】
抗Ａβ抗体
添付の実施例に記載したように、抗ＡＢ抗体は本発明の方法により分離することができる。用語「ＡＢ抗体」、「Ａβ抗体」、「抗Ａβ抗体」、および「抗Ａβ」は本明細書において相互交換可能に使用され、ＡＰＰ、Ａβ蛋白、またはその両方の１つまたは複数のエピトープまたは抗原決定基に結合する抗体を表す。エピトープまたは抗原決定基の例は、ヒトアミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）に見出すことができるが、好ましくはＡＰＰのＡβペプチドに見出される。ＡＰＰの複数のアイソフォーム、例えばＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０が存在する。ＡＰＰの中のアミノ酸は、ＡＰＰ７７０アイソフォームの配列に従って番号が割り付けられる（例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｐ０５０６７号を参照のこと）。Ａβ（本明細書においてβアミロイドペプチドおよびＡベータとも呼ばれる）ペプチドは、ＡＰＰの３９〜４３アミノ酸の約４ｋＤａの内部断片である（Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３）。例えばＡβ４０は、ＡＰＰの残基６７２〜７１１からなり、Ａβ４２はＡＰＰの残基６７２〜７１３からなる。異なるセクレターゼ酵素によるＡＰＰのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ蛋白分解プロセシングの結果として、Ａβは「短鎖型」の長さ４０アミノ酸および長さ４２〜４３アミノ酸の「長鎖型」の両方で見出される。エピトープまたは抗原決定基は、ＡβペプチドのＮ末端内に位置することがあり、それらは、Ａβのアミノ酸１〜１０、好ましくはＡβ４２の残基１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、２〜７、３〜６、もしくは３〜７の残基、またはＡβの残基２〜４、５、６、７、もしくは８、Ａβの残基３〜５、６、７、８、もしくは９、またはＡβ４２の残基４〜７、８、９、もしくは１０の中の残基を含む。「中心部（ｃｅｎｔｒａｌ）」エピトープまたは抗原決定基は、Ａβペプチドの中心部または中央部に位置し、Ａβのアミノ酸１６〜２４、１６〜２３、１６〜２２、１６〜２１、１９〜２１、１９〜２２、１９〜２３、または１９〜２４の中の残基を含む。「Ｃ末端」エピトープまたは抗原決定基は、ＡβペプチドのＣ末端の中に位置し、Ａβのアミノ酸３３〜４０、３３〜４１、または３３〜４２の中の残基を含む。
【００９１】
様々な実施形態では、Ａβ抗体は末端特異的である。本明細書に使用する用語「末端特異的」は、ＡβペプチドのＮ末端残基またはＣ末端残基に特異的に結合するが、同じ残基を備える長鎖Ａβ種の中またはＡＰＰの中に存在すると同残基を認識しない抗体を表す。
【００９２】
様々な実施形態では、Ａβ抗体は「Ｃ末端特異的」である。本明細書に使用する用語「Ｃ末端特異的」は、Ａβペプチドの遊離Ｃ末端を特異的に認識する抗体を意味する。Ｃ末端特異的Ａβ抗体の例には、残基４０で終止するＡβペプチドを認識するが、残基４１、４２、および／または４３で終止するＡβペプチドを認識しない抗体；残基４２で終止するＡβペプチドを認識するが、残基４０、４１、および／または４３で終止するＡβペプチドを認識しない抗体などが含まれる。
【００９３】
一実施形態では、抗体は３Ｄ６抗体もしくはその変異体、または１０Ｄ５抗体もしくはその変異体とすることができ、これら抗体の両方が米国特許公開番号２００３／０１６５４９６Ａ１、米国特許公開番号２００４／００８７７７７Ａ１、国際特許公開ＷＯ０２／４６２３７Ａ３に記載されている。３Ｄ６および１０Ｄ５の記載は、例えば国際特許公開ＷＯ０２／０８８３０６Ａ２および国際特許公開ＷＯ０２／０８８３０７Ａ２にも見出すことができる。３Ｄ６は、ヒトβアミロイドペプチドに位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基１〜５に特異的に結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。比較すると、１０Ｄ５は、ヒトβアミロイドペプチドに位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基３〜６に特異的に結合するｍＡｂである。別の実施形態では、抗体は、米国特許公開番号２００４００８２７６２Ａ１および国際特許公開ＷＯ０３／０７７８５８Ａ２に記載されているような１２Ｂ４抗体またはその変異体であってもよい。１２Ｂ４は、ヒトβアミロイドペプチドに位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基３〜７に特異的に結合するｍＡｂである。なお別の実施形態では、抗体は、米国特許出願第１０／８５８８５５号および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／１７５１４に記載されている１２Ａ１１抗体またはその変異体であってもよい。１２Ａ１１は、ヒトβアミロイドペプチドに位置するＮ末端エピトープ、具体的には残基３〜７に特異的に結合するｍＡｂである。なお別の実施形態では、抗体は、米国特許出願第１０／７８９２７３号および国際特許出願ＷＯ０１／６２８０１Ａ２に記載されている２６６抗体とすることができる。本発明に使用するために、ヒトβアミロイドペプチドに位置するＣ末端エピトープに特異的に結合するように設計された抗体には、米国特許第５７８６１６０号に記載されている３６９．２Ｂがあるが、それに限定されるわけではない。
【００９４】
例示的な実施形態では、抗体はＡβペプチドに選択的に結合するヒト化抗Ａβペプチド３Ｄ６抗体である。さらに具体的には、このヒト化抗Ａβペプチド３Ｄ６抗体は、（例えばアルツハイマー病を患う患者での）脳の斑沈着に見出されるヒトβアミロイド１〜４０ペプチドまたは１〜４２ペプチドに位置するＮＨ２末端エピトープに特異的に結合するように設計されている。
【００９５】
抗ＡＢ抗体を使用して、アミロイド病、特にアルツハイマー病を治療することができる。用語「アミロイド病」には、不溶性アミロイド線維の形成または沈着に関連する（か、またはそれによって引き起こされる）任意の疾患が含まれる。アミロイド病の例には、全身性アミロイドーシス、アルツハイマー病、成人発症型糖尿病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、およびプリオン関連伝染性海綿状脳症（ヒトにおけるクールーまたはクロイツフェルト−ヤコブ病、ならびにそれぞれヒツジおよびウシにおけるスクレーピーおよびＢＳＥ）があるが、それに限定されるわけではない。沈着する線維のポリペプチド構成要素の性質によって、種々のアミロイド病が規定または特徴付けされている。例えば、アルツハイマー病を有する対象または患者においてβアミロイド蛋白（例えば野生型、変異型、または短縮型βアミロイド蛋白）は、特徴的なアミロイド沈着のポリペプチド構成要素である。したがって、アルツハイマー病は、例えば対象または患者の脳における「Ａβの沈着を特徴とする疾患」または「Ａβの沈着と関連する疾患」の一例である。用語「βアミロイド蛋白」、「βアミロイドペプチド」、「βアミロイド」、「Ａβ」、および「Ａβペプチド」は、本明細書において相互交換可能に使用される。
【００９６】
抗５Ｔ４抗体
５Ｔ４抗原は以前に特徴付けられた（例えばＷＯ８９／０７９４７参照）。ヒト５Ｔ４の完全核酸配列は公知である（Ｍｙｅｒｓら（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ１６９：９３１９〜２４およびＧｅｎＢａｎｋ（受託番号第Ｚ２９０８３号））。その他の種由来の５Ｔ４抗原、例えばマウス５Ｔ４（ＷＯ００／２９４２８）、イヌ５Ｔ４（ＷＯ０１／３６４８６）、またはネコ５Ｔ４（ＵＳ０５／０１００９５８）の配列も公知である。
【００９７】
ヒト５Ｔ４は、癌腫で広く発現するが、正常な成体組織では高度に限定された発現パターンを有する約７２ｋＤａの糖蛋白である。この蛋白は結腸直腸および胃の癌における転移と強く相関していると考えられる。５Ｔ４抗原の発現は、乳癌および卵巣癌においても高頻度で見出される（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１０：４７９〜８４；Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６９：８９９〜９０２；Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら（１９９２）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６６：８６７〜９）。５Ｔ４は、メカニズムに関与している可能性がある、腫瘍進行および転移能についてのマーカーとして提案された（Ｃａｒｓｂｅｒｇら（１９９６）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ６８：８４〜９２）。５Ｔ４は、免疫療法剤としての使用もまた提案された（ＷＯ００／２９４２８参照）。５Ｔ４の抗原ペプチドは例えばＵＳ０５／０１００９５８に開示されており、その内容は参照により組み込まれている。
【００９８】
いくつかの係属中の出願、例えば米国出願公開番号２００３／００１８００４および番号２００５／００３２２１６は、一般に抗５Ｔ４モノクローナル抗体をコードしている核酸、そのベクターおよび宿主細胞に関する。一般にヒト化抗５Ｔ４ Ｈ８モノクローナル抗体およびそのカリケアマイシンコンジュゲート、ならびにこれらのカリケアマイシンコンジュゲートを使用した治療方法に関する仮特許出願が提出されている（米国出願公開番号２００６／００８８５２２）。これらの出願の全ての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００９９】
抗ＩＬ１３抗体
本発明の方法により分離することができる抗体の別の例は、抗ＩＬ−１３抗体である。インターロイキン１３（ＩＬ−１３）は、Ｔリンパ球およびマスト細胞により分泌される、以前に特徴付けられたサイトカインである（ＭｃＫｅｎｚｉｅら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：３７３５〜３９；Ｂｏｓｔら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８７：６６３〜４１）。用語「ＩＬ−１３」は、インターロイキン１３を表し、ＩＬ−１３のプロセシングされていない完全長前駆体型および翻訳後開裂の結果として生じる成熟型を含む。この用語は、修飾（例えば組換え修飾）された配列を含めて、成熟ＩＬ−１３に関連する少なくともいくつかの生物学的活性を維持する、ＩＬ−１３の任意の断片および変異体も表す。用語「ＩＬ−１３」は、ヒトＩＬ−１３およびその他の脊椎動物の種が含まれる。いくつかの係属中の出願、例えば米国出願公開番号２００６／００６３２２８Ａおよび番号２００６／００７３１４８がヒトおよびサルのＩＬ−１３、ＩＬ−１３ペプチドに対する抗体、それを産生するベクターおよび宿主細胞を開示している。これらの全公報の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１００】
ＩＬ−１３はＩＬ−４といくつかの生物学的活性を共有する。例えば、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれかは、Ｂ細胞においてＩｇＥのアイソタイプスイッチを引き起こすことができる（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５７９２〜５８００）。さらに、喘息患者では細胞表面ＣＤ２３および血清ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）のレベル増加が報告された（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇｕｅｒｅｒｒｏら（１９９４）Ａｌｌｅｒｇｙ４９：５８７〜９２；ＤｉＬｏｒｅｎｚｏら（１９９９）Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｐｒｏｃ．２０：１１９〜２５）。しかも、ＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれかはＢ細胞および単球上のＭＨＣクラスＩＩおよび低親和性ＩｇＥ受容体（ＣＤ２３）の発現をアップレギュレーションすることができ、その結果として、抗原提示の増強およびマクロファージ機能の調節が生じる（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、上記）。これらの観察は、ＩＬ−１３が気道好酸球増加症および気道過敏症（ＡＨＲ）の発生に重要なプレーヤーとなりうることを示唆している（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、上記；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：２２５８〜６１）。したがって、ＩＬ−１３の阻害は、呼吸器障害（例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、気道炎症を伴うその他の状態、好酸球増加症、線維症、および過剰粘液産生（例えば嚢胞性線維症および肺線維症）、アトピー性障害（例えばアトピー性皮膚炎、蕁麻疹、湿疹、アレルギー性鼻炎）、皮膚（アトピー性皮膚炎）、消化器（例えば潰瘍性大腸炎および／またはクローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、肝臓（例えば肝硬変、肝細胞癌）の炎症状態および／または自己免疫状態、強皮症、白血病、膠芽腫、およびリンパ腫（例えばホジキンリンパ腫）などの腫瘍または癌（例えば軟部組織腫瘍または固形腫瘍）、ウイルス感染（例えばＨＴＬＶ−１による）、他の器官の線維症、例えば肝臓の線維症（例えばＢおよび／またはＣ型肝炎ウイルスにより起こる線維症）を非限定的に含めたいくつかの炎症状態および／またはアレルギー状態の病態の改善に有用である可能性がある。
【０１０１】
抗ＩＬ２２抗体
本発明の方法により分離することができる別の抗体の例は抗ＩＬ−２２抗体である。インターロイキン２２（ＩＬ−２２）は、ＩＬ−１０と配列相同性を示す、以前に特徴付けられたクラスＩＩサイトカインである。Ｔ細胞におけるその発現は、ＩＬ−９またはＣｏｎＡによりアップレギュレーションされる（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌ．ら（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９７（１８）：１０１４４〜９）。ＬＰＳ投与に応答してＩＬ−２２ ｍＲＮＡの発現がｉｎ ｖｉｖｏで誘導されること、およびＩＬ−２２が急性期応答を示すパラメーターを調節すること（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌ．ら（２０００）上記；Ｐｉｔｔｍａｎ Ｄ．ら（２００１）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２：１７２）、ならびにマウスのコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて抗ＩＬ−２２中和抗体を使用することによるＩＬ−２２活性の低下が炎症症状を改善することが研究から示された。したがって、例えば自己免疫障害（例えば関節リウマチなどの関節炎性障害）、呼吸器障害（例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））、例えば皮膚（例えば乾癬）、心血管系（例えばアテローム性動脈硬化症）、神経系（例えばアルツハイマー病）、腎臓（例えば腎炎）、肝臓（例えば肝炎）、および膵臓（例えば膵炎）の炎症状態の治療のために、ＩＬ−２２アンタゴニスト、例えば抗ＩＬ−２２中和抗体およびその断片を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫抑制を誘導することができる。
【０１０２】
用語「ＩＬ−２２」は、ＩＬ−２２のプロセシングされていない完全長前駆体型および翻訳後開裂の結果として生じた成熟型を含めたインターロイキン２２を表す。この用語は、修飾された配列を含めて、成熟ＩＬ−２２に関連する少なくともいくつかの生物学的活性を維持するＩＬ−２２の任意の断片および変異体も表す。用語「ＩＬ−２２」は、ヒトＩＬ−２２およびその他の脊椎動物の種が含まれる。ヒトおよび齧歯動物ＩＬ−２２のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、ならびにＩＬ−２２に対する抗体は、例えば米国出願公開番号２００５−００４２２２０および番号２００５−０１５８７６０、ならびに米国特許第６９３９５４５号に開示されている。これらの公報全ての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１０３】
抗ＧＤＦ８抗体
本発明の方法により分離することができるなお別の例示的な抗体は、抗ＧＤＦ８抗体である。ミオスタチンとしても知られている成長分化因子８（ＧＤＦ−８）は分泌蛋白であり、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの構造的に関係する成長因子のメンバーであり、これら成長因子の全てが生理学的に重要な成長調節特性および形態形成特性を有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、８：１３３〜１４６；Ｈｏｏｄｌｅｓｓら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２８：２３５〜２７２）。ＴＧＦ−βと同様に、ヒトＧＤＦ−８は３７５アミノ酸長の前駆蛋白として合成される。前駆ＧＤＦ−８蛋白はホモ二量体を形成する。プロセシングのときにアミノ末端プロペプチドがＡｒｇ−２６６で開裂する。「潜在型結合ペプチド」（ＬＡＰ）として知られている開裂したプロペプチドは、このホモ二量体に非共有結合したままであることによって、この複合体を不活性化することができる（Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６４０７〜６４１５；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７６４６〜７６５４；Ｂｒｏｗｎら（１９９０）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３：３５〜４３；およびＴｈｉｅｓら（２００１）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、１８：２５１〜２５９）。成熟ＧＤＦ−８とプロペプチドとの複合体は、一般に「小型潜在型複合体（ｓｍａｌｌ ｌａｔｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘ）」と呼ばれる（Ｇｅｎｔｒｙら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９：６８５１〜６８５７；Ｄｅｒｙｎｃｋら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ、３１６：７０１〜７０５；およびＭａｓｓａｇｕｅ（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２：５９７〜６４１）。その他の蛋白もまた成熟ＧＤＦ−８と結合してその生物学的活性を阻害することが知られている。そのような阻害蛋白にはフォリスタチンおよびフォリスタチン関連蛋白がある（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２０８：２２２〜２３２）。
【０１０４】
用語「ＧＤＦ−８」は成長分化因子８を表し、必要に応じて、ＧＤＦ−８に構造または機能的に関係する因子、例えばＢＭＰ−１１およびＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するその他の因子を表す。この用語は、ＧＤＦ−８のプロセシングされていない完全長前駆体型、ならびに翻訳後開裂の結果として生じた成熟型およびプロペプチド型を表す。この用語は、修飾された配列を含めて、成熟ＧＤＦ−８に関連する少なくともいくつかの生物学的活性を維持するＧＤＦ−８の任意の断片および変異体も表す。ヒトＧＤＦ−８および（マウス、ヒヒ、ウシ、ニワトリを含む）多数のその他の哺乳動物種のアミノ酸配列は、例えばＵＳ２００４−０１４２３８２、ＵＳ２００２−０１５７１２５、およびＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：１２４５７〜１２４６１に開示されており、この全ての内容は、その全体がこれによって参照により組み込まれている）。ＧＤＦ−８に対する中和抗体の例は、例えばＵＳ２００４−０１４２３８２に開示されており、この例を使用して、筋肉組織または骨密度の増加が望ましい状態を治療または予防することができる。疾患および障害の例には、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む）、筋萎縮性側索硬化症、筋萎縮症、臓器萎縮症、虚弱、トンネル症候群、鬱血性閉塞性肺疾患、筋肉減少症、悪液質、およびその他の筋消耗症候群などの筋肉および神経筋障害、脂肪組織障害（例えば肥満）、２型糖尿病、耐糖能障害、代謝性症候群（例えばシンドロームＸ）、熱傷などの外傷または窒素不均衡により誘導されるインスリン抵抗性、ならびに骨変性疾患（例えば骨関節炎および骨粗しょう症）が含まれる。
【０１０５】
可溶性受容体および受容体融合体
いくつかの実施形態では、本発明の方法により分離される蛋白は、可溶性受容体またはその断片とすることができる。可溶性受容体の例には、可溶性腫瘍壊死因子α受容体およびβ受容体などの受容体（ＴＮＦＲ−１（１９９１年３月２０日に公表されたＥＰ４１７５６３）、ＴＮＦＲ−２（１９９１年３月２０日に公表されたＥＰ４１７０１４）、ならびにＮａｉｓｍｉｔｈおよびＳｐｒａｎｇ、Ｊ Ｉｎｆｌａｍｍ．４７（１〜２）：１〜７、１９９５〜９６に総説されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている）の細胞外ドメインが含まれる。その他の実施形態では、可溶性受容体には、例えばＵＳ２００３−０１０８５４９（この内容もまた参照により組み込まれている）に記載されているようなインターロイキン２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）の細胞外ドメインが含まれる。
【０１０６】
その他の実施形態では、本発明の方法は、可溶性受容体融合体を分離するために使用される。融合蛋白は、ターゲティング部分、例えば可溶性受容体断片またはリガンドと、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）を含めた様々なアイソタイプの免疫グロブリン鎖、Ｆｃ断片、重鎖定常領域とを含むことができる。例えば融合蛋白は、受容体の細胞外ドメインと、例えばそれが融合したヒト免疫グロブリン（例えばヒトＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４、またはその突然変異型）のＦｃ鎖とを含むことができる。一実施形態では、ヒトＦｃ配列は１つまたは複数のアミノ酸で突然変異しており、例えば残基２５４および２５７で野生型配列から突然変異して、Ｆｃ受容体の結合が低下している。融合蛋白は、さらに、第１部分を第２部分、例えば免疫グロブリン断片に結合させるリンカー配列を含むことができる。例えば融合蛋白は、ペプチドリンカー、例えば長さ約４から２０アミノ酸、さらに好ましくは５から１０アミノ酸のペプチドリンカーを含むことがあり、このペプチドリンカーは長さ８アミノ酸である。例えば、融合蛋白には、式（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｙ（式中、ｙは１、２、３、４、５、６、７、または８である）を有するペプチドリンカーを含むことができる。その他の実施形態では、さらなるアミノ酸配列を融合蛋白のＮ末端またはＣ末端に付加して、発現、立体柔軟性、検出および／または単離もしくは精製を促進することができる。
【０１０７】
ある実施形態では、可溶性受容体融合体は可溶性ＴＮＦＲ−Ｉｇ（例えばＴＮＦ受容体、例えばｐ５５もしくはｐ７５ヒトＴＮＦ受容体の可溶性断片、またはその誘導体）、例えば７５ｋｄのＴＮＦＲ−ＩｇＧ（例えばヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合した７５ｋＤのＴＮＦ受容体）を含む。
【０１０８】
本発明のキメラ蛋白または融合蛋白は、標準的な組換えＤＮＡ技法により産生させることができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードしているＤＮＡ断片は、従来技法に従って、例えば連結のための平滑末端または付着末端、適切な末端を用意するための制限酵素消化、必要に応じた付着末端の平滑化、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を用いることによりフレーム内で一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含めた従来技法により合成することができる。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子断片の間で相補的突出を生じるアンカープライマーを用いて行うことができ、これらの遺伝子断片を続いてアニーリングし、再増幅させてキメラ遺伝子配列を作製することができる（例えばＡｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２参照）。さらに、融合部分をコードしている多数の発現ベクターが市販されている（例えば免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５５１６９６４号、第５２２５５３８号、第５４２８１３０号、第５５１４５８２号、第５７１４１４７号、および第５４５５１６５号に記載されている。
【０１０９】
成長因子およびサイトカイン
医薬品および／または市販薬剤として有効であることが示され、本発明の教示により望ましくは産生することができる別のクラスのポリペプチドには、成長因子およびサイトカインなどのその他のシグナル伝達分子がある。
【０１１０】
成長因子は、典型的には細胞により分泌され、他の細胞上の受容体に結合し、それを活性化し、受容体細胞の代謝変化または発生変化を開始する糖蛋白である。哺乳動物成長因子および他のシグナル伝達分子の非限定的な例には、サイトカイン、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含めたＴＧＦ−βなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合蛋白、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９などのＣＤ蛋白、エリスロポイエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成蛋白（ＢＭＰ）、インターフェロンα、β、およびγなどのインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＴＬ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−１３（例えばＩＬ−１１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよびβ、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、濾胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォンウィルブランド因子などの凝固因子、プロテインＣなどの抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、ヒトマクロファージ炎症性蛋白（ＭＩＰ−１−α）、ミュラー管抑制物質、レラクシンＡ鎖、レラクシンＢ鎖、プロレラクシン、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、４、５、もしくは６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）などの神経栄養因子、またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子がある。当業者は、本発明の方法および組成物により発現させることができるその他の成長因子またはシグナル伝達分子を認識しているものである。
【０１１１】
成長因子またはその他のシグナル伝達分子のグリコシル化パターンの特異的改変は、その治療的性質に劇的な効果を有することが示された。一例として、慢性貧血を患う患者の通常の治療方法は、患者による赤血球の産生を促進するために、組換えヒトエリスロポイエチン（ｒＨｕＥＰＯ）の頻回注射を患者に行うことである。ｒＨｕＥＰＯのアナログであるダルベポエチンアルファ（Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標））は、通常のｒＨｕＥＰＯよりも長い持続時間をもつように開発された。ダルベポエチンアルファとｒＨｕＥＰＯとの主な違いは、２つの余剰のシアル酸含有Ｎ結合オリゴ糖鎖の存在である。ダルベポエチンアルファの産生は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ糖工学を使用して実現された（全体が参照により本明細書に組み込まれているＥｌｌｉｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２１（４）：４１４〜２１、２００３参照）。Ｅｌｌｉｏｔｔらは、ｒＨｕＥＰＯポリペプチド主鎖に余剰のグリコシル化部位を組み込むためにｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発を使用し、その結果としてダルベポエチンアルファアナログの発現をもたらした。余剰のオリゴ糖鎖は、ＥＰＯ受容体結合部位の遠位に位置し、受容体の結合を妨害しないようである。しかし、ダルベポエチンアルファの半減期はｒＨｕＥＰＯの最大３倍の長さであり、その結果としてずっと有効な治療剤となる。
【０１１２】
凝固因子
凝固因子は、医薬品および／または市販薬剤として有効なことが示された。血友病Ｂは患者の血液が凝固できない障害である。したがって、出血を来すどのような小さな創傷も潜在的に致命的な事象である。例えば、第ＩＸ凝固因子（第ＩＸ因子または「ＦＩＸ」）は、その欠損が血友病Ｂを生じる１本鎖糖蛋白である。ＦＩＸは１本鎖チモーゲンとして合成され、これは、活性化ペプチドの放出により２本鎖セリンプロテアーゼ（第ＩＸａ因子）に活性化されることができる。第ＩＸａ因子の触媒ドメインは重鎖に位置する（全体が参照により本明細書に組み込まれているＣｈａｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：４、１９９７参照）。ＦＩＸは、Ｎ結合およびＯ結合糖鎖の両方を含む複数のグリコシル化部位を有する。セリン６１でのある特定のＯ結合構造（Ｓｉａ−α２，３−Ｇａｌ−β１，４−ＧｌｃＮＡｃ−β１，３−Ｆｕｃ−α１−Ｏ−Ｓｅｒ）は、かつてＦＩＸに独特であると考えられていたが、それ以来、哺乳動物およびドロソフィラにＮｏｔｃｈ蛋白を含む少数のその他の分子に見出された（Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５（１３）、２０００）。細胞培養したチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞により産生されたＦＩＸは、セリン６１オリゴ糖鎖に幾分変動を示す。これらの異なる糖形態およびその他の潜在的糖形態は、ヒトもしくは動物に投与された場合に異なる凝固誘導能を有するおそれがあり、かつ／または血中で異なる安定性を有して有効性の低い凝固を生じるおそれがある。
【０１１３】
臨床的には血友病Ｂと区別が付かない血友病Ａは、１本鎖として合成され、次に２本鎖活性型にプロセシングされる別の糖蛋白であるヒト第ＶＩＩＩ凝固因子の異常により起こる。本発明は、第ＶＩＩＩ凝固因子の凝固活性を調節するために、第ＶＩＩＩ凝固因子のグリコシル化パターンを制御または改変するためにも採用することができる。本発明により産生させることができるその他の凝固因子には、組織因子およびフォンウィルブランド因子がある。
【０１１４】
酵素
医薬品および／または市販薬剤として有効なことが示され、本発明の教示により望ましくは産生することができる別のクラスのポリペプチドには、酵素がある。酵素は、グリコシル化パターンが酵素活性に影響する糖蛋白とすることができる。したがって、本発明は、細胞培養で酵素を産生させるためにも使用することができ、ここで、産生された酵素は、より広範囲であるか、さもなければより望ましいグリコシル化パターンを有する。
【０１１５】
１つに過ぎない非限定的な例として、グルコセレブロシダーゼ（ＧＣＲ）の欠損はゴーシェ病として知られる状態を生じ、この疾患はある細胞のライソソームへのグルコセレブロシダーゼ蓄積によって起こる。ゴーシェ病の対象は、脾腫大、肝腫大、骨格障害、血小板減少症、および貧血を含めた一連の症状を示す。ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＨａｙｅｓは、アミノ酸一次配列に１置換を有する組換えＧＣＲ（ｒＧＣＲ）が、天然ＧＣＲに比べてグリコシル化パターンの改変、具体的にはフコース残基およびＮ−アセチルグルコサミン残基の増加を示すことを示した（米国特許第５５４９８９２号）。
【０１１６】
ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＨａｙｅｓは、このｒＧＣＲが天然ｒＧＣＲに比べて薬物動態的性質の向上を示すことも実証した。例えば、天然ＧＣＲの約２倍のｒＧＣＲは肝クッパー細胞を標的とした。これら２つの蛋白のアミノ酸一次配列は１残基が異なるが、ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＨａｙｅｓは、ｒＧＣＲのグリコシル化パターン改変がクッパー細胞への標的付けにも影響すると仮定した。当業者は、酵素的、薬物動態的、および／または薬力学的性質の改変を示す結果、グリコシル化パターンに改変を生じる酵素のその他の公知の例を認識しているものである。
【０１１７】
蛋白の産生
本発明の方法により分離される蛋白は、当技術分野で十分に公知の技法を使用して組換え産生させることができる。この蛋白をコードしているヌクレオチド配列は、典型的には所望の量の修飾抗体を産生させるために使用することができる宿主細胞に導入するために、発現ベクターに挿入され、今度はポリペプチドを与える。用語「ベクター」は、多くの場合核酸、例えば遺伝子を含み、さらに核酸の複製、転写、安定性、および／または宿主細胞からの蛋白の発現もしくは分泌に必要な最小エレメントを含む核酸構築物を含む。そのような構築物は、染色体外エレメントとして存在してもよく、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【０１１８】
用語「発現ベクター」は、所望の蛋白産物の高レベル発現のために核酸構築物が最適化されている特異的な種類のベクターを含む。発現ベクターは、多くの場合、特異的な種類の細胞での高レベル転写のために最適化され、かつ／または特異的誘導剤の使用に基づいて発現が構成性であるように最適化された、プロモーターおよびエンハンサーエレメントなどの転写調節因子を有する。発現ベクターは、さらに蛋白の適正で、かつ／または高い翻訳を与える配列を有する。当業者に公知なように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。用語「発現カセット」は、遺伝子を有し、その遺伝子に加えて、宿主細胞におけるその遺伝子の適正で、かつ／または高い発現をさせるエレメントを有する核酸構築物を含む。抗体を産生させるために、軽鎖および重鎖をコードしている核酸を発現ベクターに挿入することができる。そのような配列は、同一の核酸分子（例えば同一の発現ベクター）に存在してもよく、代わりに別々の核酸分子（例えば別々の発現ベクター）から発現させてもよい。
【０１１９】
用語「作動可能に連結した」は、構成要素が意図した方法で機能可能な（例えば機能的に連結した）関係にある並置が含まれる。例として、関心対象のポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーター／エンハンサーは、前記ポリヌクレオチドに連結する結果、プロモーター／エンハンサーにより指令される発現を活性化する状態で、関心対象のポリヌクレオチドの発現が実現される。
【０１２０】
発現ベクターは、典型的にはエピソームまたは宿主染色体ＤＮＡに内在する部分のいずれかとして宿主生物において複製することができる。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、またはネオマイシン耐性）を有する（例えばＩｔａｋｕｒａら、米国特許第４７０４３６２号参照）。免疫グロブリンＤＮＡカセット配列、挿入配列、および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞でのベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有することがある。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば米国特許第４３９９２１６号、第４６３４６６５号、および第５１７９０１７号（全てＡｘｅｌらによる）参照）。例えば、典型的には選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ヒグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いてｄｈｆｒ−宿主細胞に使用するためのもの）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）がある。
【０１２１】
ベクターが適切な宿主細胞に組み込まれたならば、その宿主細胞は、ヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに所望の抗体の収集および精製に適した条件で維持される。細胞培養と、蛋白またはポリペプチドの発現とに感受性の任意の宿主細胞は、本発明により利用することができる。ある実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。本発明により使用することができる哺乳動物細胞の非限定的な例には、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ第８５１１０５０３号）、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ（ライデン、オランダ））、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児腎臓系（２９３または懸濁培養での成長用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９、１９７７）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６、１９８０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３：２４３〜２５１、１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）、ヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８、１９８２）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、およびヒト肝細胞癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）がある。
【０１２２】
さらに、本発明によりポリペプチドまたは蛋白を発現する任意の数の市販および非市販のハイブリドーマ細胞系を利用することができる。当業者は、ハイブリドーマ細胞系が異なる栄養要求性を有することがあり、かつ／または最適の成長およびポリペプチドもしくは蛋白の発現のために異なる培養条件を必要とすることがあると認識しているものであり、必要に応じて条件を変更することができるものである。
【０１２３】
これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列などの必要なプロセシング情報部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。例えばＣｏら、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９を参照されたい。哺乳動物宿主細胞の発現用の好ましい調節配列には、ＦＦ−１ａプロモーターおよびＢＧＨポリＡ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞での高レベルの蛋白発現を指令するウイルスエレメントが含まれる。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えばＳｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５１６８０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４５１０２４５号、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４９６８６１５号を参照されたい。例示的な実施形態では、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子は、（例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなどのＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなどに由来する）エンハンサー／プロモーター調節エレメントに作動可能に連結させ、遺伝子の高レベル転写を推進する。本発明の例示的な実施形態では、この構築物は、真核宿主細胞に本発明のポリペプチドを相対的に高レベル発現する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。適合性のＩＲＥＳ配列は米国特許第６１９３９８０号に開示されており、この特許もまた本明細書に組み込まれている。
【０１２４】
あるいは、コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムに導入し、続いてトランスジェニック動物の乳汁に発現させるために導入遺伝子に組み込むことができる（例えばＤｅｂｏｅｒら、ＵＳ５７４１９５７、Ｒｏｓｅｎ、ＵＳ５３０４４８９、およびＭｅａｄｅら、ＵＳ５８４９９９２参照）。適切な導入遺伝子には、カゼインまたはβラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子に由来するプロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結した軽鎖および／または重鎖についてのコード配列が含まれる。
【０１２５】
原核宿主細胞もまた、本発明の抗体の産生に適することがある。イー・コリは、本発明のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ配列）をクローニングするために特に有用な一原核宿主である。使用に適するその他の微生物宿主には、バシルス・サチルスなどの桿菌属、エシェリキア、サルモネラ、およびセラチアなどの腸内細菌科、ならびに種々のシュードモナス種がある。これらの原核宿主では、発現ベクターを作ることもでき、発現ベクターは典型的には宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば複製起点）を有するものである。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系などの任意の数の様々な十分に公知のプロモーターが存在するものである。プロモーターは、所望によりオペレーター配列を用いて典型的には発現を制御するものであり、転写および翻訳を開始し、完了するためにリボソーム結合部位配列などを有するものである。
【０１２６】
原核生物における蛋白の発現は、ほとんどの場合融合蛋白または非融合蛋白のいずれかの発現を指令している構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いてイー・コリで行われる。融合ベクターは、それにコードされている抗体に、多くの場合組換え抗体の定常領域にいくつかのアミノ酸を付加するが、その抗体の特異性または抗原認識には影響しない。融合ペプチドのアミノ酸の付加は、例えばマーカー（例えばｍｙｃまたはｆｌａｇなどのエピトープタグ）として抗体にさらなる機能を付加することができる。
【０１２７】
酵母などのその他の微生物もまた発現に有用である。サッカロミセスは、所望通りに発現制御配列（例えばプロモーター）、複製起点、終結配列などを有する適切なベクターを伴う、好ましい酵母宿主である。典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよびその他の糖分解酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけアルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームＣ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素由来のプロモーターが含まれる。
【０１２８】
関心対象のポリヌクレオチド配列を有するベクター（例えば重鎖および軽鎖をコードしている配列ならびに発現制御配列）は、十分に公知の方法により宿主細胞に導入することができ、その方法は細胞性宿主の種類に応じて異なる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、通常原核細胞に利用されるが、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェクション、バイオリスティックス、またはウイルスに基づくトランスフェクションはその他の細胞性宿主に使用することができる。（一般に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９）を参照されたい）。哺乳動物細胞を形質転換するために使用される他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクションの使用がある（一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照）。トランスジェニック動物の産生のために、受精した卵母細胞に導入遺伝子をマイクロインジェクションすることもでき、胚性幹細胞のゲノムに組み込み、除核した卵母細胞にその細胞の核を導入することもできる。
【０１２９】
重鎖および軽鎖を別々の発現ベクターにクローニングするとき、これらのベクターを同時トランスフェクションし、無傷の免疫グロブリンの発現および集合を得る。いったん発現すると、本発明の抗体全体、その二量体、個別の軽鎖および重鎖、またはその他の免疫グロブリン形態は、本明細書に記載するように分離し、かつ／または硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含めた当技術分野で公知の手順によりさらに精製することができる（一般にＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９８２）参照）。医薬用途には少なくとも均質性が約９０から９５％の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８から９９％以上の均質性が最も好ましい。
【０１３０】
以下の実施例は例示であり、本発明を限定するものではない。
【０１３１】
実施例１
様々な陽イオンおよび陰イオンを用いたフロキュレーション：様々なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（表１に示す）は、無血清培地で培養した組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生させた。１２５ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに細胞含有馴化培地約５０ｍＬを分注した（１０００ｍＬフラスコに４００ｍＬ入れた抗ＧＤＦ８＃２を有する３０／２０リン酸カルシウムの例および２０００ｍＬフラスコに１０００ｍＬ入れた抗ＩＬ１３＃１を有する３０／２０リン酸カルシウムの例を除く）。ｐＨを制御するためにＨＥＰＥＳを４０ｍＭまで添加した。最終目標濃度（表１参照）に達するように、この溶液に金属陽イオンの濃縮溶液を添加し、静かに混合した。陰イオン濃縮溶液をこの混合物（表１参照）に添加して、最終陰イオン濃度を実現し、静かに混合した。（下記表１で星印（＊）で示した一部の実施例では、陰イオンを最初に添加し、次に陽イオンを添加した）。ｐＨは、目標となるｐＨ範囲までＮａＯＨの添加により増加させるか、またはＨＣｌの添加により減少させた。多くの例では、ｐＨは調整する必要がなかった。この混合物は、陰性対照と共に振盪器上で１８〜２５℃で１から４時間インキュベートさせた。インキュベーションの後で、この混合物を５０ｍＬ遠沈管に注いだ。各混合物を３４０ｇで１０分間遠心分離した。清澄化された上清を分注し、比濁計（ＨＡＣＨ（ラブランド、コロラド州））を使用して濁度を測定した。結果として得られた濁度は、未処理対照の結果からの減少率として表１に報告する。抗体濃度は、抗体に一般的なプロテインＡ ＨＰＬＣ法により測定した。未処理対照に比べた回収率を表１に報告する。
【０１３２】
表１：陽イオンであるカルシウム、マグネシウム、マンガン、コバルト（ＩＩ）、およびニッケルについてのフロキュレーションの結果。陰イオンを陽イオンの前に添加した星印（＊）を付けた場合を除き、全ての処理は陰イオンの前に陽イオンを添加して行った。
【０１３３】
【表１】
【０１３４】
【表２】
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
【表４】
【０１３７】
【表５】
【０１３８】
一部試料の上清中のカルシウムおよびリン酸の残留レベルを測定した。残留カルシウムは、ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（商標）Ｃａｌｃｉｕｍ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＤＩＣＡ−５００）を使用して測定した。残留リン酸は、ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍａｌａｃｈｉｔｅ Ｇｒｅｅｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＰＯＭＧ−２５Ｈ）を使用して測定した。表１でカルシウム４０ｍＭおよびリン酸２０ｍＭを有する抗ＩＬ１３＃２試料では、遠心分離後の上清はカルシウム８．１９ｍＭおよびリン酸１．０４ｍＭを含有した。このレベルの可溶性カルシウムおよびリン酸は８．５×１０−６Ｍ２のＫｓｐに換算することができる。表１でカルシウム８０ｍＭおよびリン酸２０ｍＭを有する抗ＡＢ＃１試料では、遠心分離後の上清は、カルシウム２２．２ｍＭおよびリン酸０．４ｍＭを含有した。このレベルの可溶性カルシウムおよびリン酸は、８．４×１０−６Ｍ２のＫｓｐに換算される。
【０１３９】
実施例２
陰イオン／陽イオンの添加順序の効果：ｍＡｂである抗ＧＤＦ８＃１は、無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた。約５０ｍＬの細胞含有馴化培地を３本の１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコＡ、Ｂ、およびＣに分注した。試料Ａは未処理のまま放置し、陰性対照とした。試料ＢおよびＣのｐＨを制御するためにＨＥＰＥＳを４０ｍＭまで添加した。濃度５０ｍＭまで５Ｍ塩化カルシウムを試料Ｂに添加し、静かに混合後、０．５Ｍ亜硫酸ナトリウムを濃度３３．３ｍＭまで添加した。試料Ｃについては添加順序を逆にした。０．５Ｍ亜硫酸ナトリウムを濃度３３．３ｍＭまで添加し、静かに混合後、５Ｍ塩化カルシウムを濃度５０ｍＭまで添加した。３つの混合物は全て７．４から７．６のｐＨを有した。これらの混合物を振盪器上で１８〜２５℃で１時間インキュベートさせた。インキュベーション後に、これらの混合物を５０ｍＬ遠沈管に注いだ。各混合物を３４０ｇで１０分間遠心分離した。清澄化された上清を取り出し、プロテインＡ ＨＰＬＣにより抗体濃度について、比濁計を用いて濁度についてアッセイした。
【０１４０】
試料ＢおよびＣは、共に未処理試料に比べて９４％の抗体回収率を有した。最初に陽イオンを添加した試料Ｂは未処理試料に比べて沈殿が形成したことを示す濁度の増加を示したが、この沈殿は遠心分離により容易に除去するには小さすぎた。最初に陰イオンを添加した試料Ｃは、未処理試料に比べて濁度の４６％の減少を示し、これは、形成した沈殿が遠心分離により容易に沈殿するのに十分な大きさであったことを示している。濁度の減少は、若干量の細胞片および／またはコロイド物質が沈殿により結合され、ペレット中に除去されたことも示している。
【０１４１】
実施例３
沈殿剤としてカルシウムおよびリン酸を使用したパイロットスケール実験ならびに下流の清澄化工程およびクロマトグラフィー工程に及ぼす効果：ｍＡｂである抗ＡＢ＃１は、５００Ｌバイオリアクター中の無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた。収集時に、培養液を室温（１８〜２５℃）にした。培養液３５０Ｌを未処理のまま放置し、陰性対照とした。培養液１５０Ｌを２００Ｌカルボイに移し、オーバーヘッドミキサーでゆっくりと混合した。ｐＨを制御するために緩衝液を４０ｍＭまで添加した。次に、２Ｍリン酸カリウムを濃度２０ｍＭまで添加した。次に、５Ｍ塩化カルシウムを濃度３０ｍＭまで添加した。この混合物のｐＨは７．３であった。フロキュレーションした培養液を混合しながら１６０分間インキュベートした。インキュベーションの終わりにこの混合物のｐＨは７．０であった。
【０１４２】
フロキュレーションした培養液および未処理培養液の両方は、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ ＢＴＰＸ２０５分離板型遠心分離器により流速４．４Ｌ／ｍｉｎおよびボウル速度７６３０ＲＰＭ（８０００ｇ）で加工処理した。未処理試料についての１１７ＮＴＵに比べて、フロキュレーションした試料の定常状態遠心分離物の濁度は１４ＮＴＵであり、濁度の８８％の減少であった。フロキュレーションした遠心分離物での抗体力価の回収率は未処理遠心分離物の９６％であった。フロキュレーションした遠心分離物中の宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）のレベルは、５３３３４１ｐｐｍから３４８０８７ｐｐｍに、未処理遠心分離物に比べて３５％減少した。
【０１４３】
フロキュレーションした遠心分離物および未処理遠心分離物の両方にフィルター１平方メートル当たり遠心分離物２５０Ｌの性能までＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａ１ＨＣパッドフィルターを通過させて加工処理した。未処理試料は、２４Ｌ／ｍ２で４ＮＴＵから１２１Ｌ／ｍ２で２６ＮＴＵまで、２５４Ｌ／ｍ２で３７ＮＴＵまでと、着実に増加する濁度の流出を示した。未処理試料についての最終的なパッド濾液プールの濁度は２１ＮＴＵであった。フロキュレーションした試料は、２１Ｌ／ｍ２で２ＮＴＵから１５０Ｌ／ｍ２で６ＮＴＵまで、２５４Ｌ／ｍ２で７ＮＴＵまでと、パッドを通過した濁度にわずかな増加だけを示した。フロキュレーションした試料についての最終的なパッド濾液プールの濁度は５ＮＴＵで、未処理試料に比べて濁度の７６％の減少であった。
【０１４４】
パッド濾過および０．２μｍポリッシングフィルターを通過させたさらなる濾過の後に、試料はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡアフィニティーカラムを使用したクロマトグラフィーにかけた。抗体をプロテインＡカラムから溶出させた場合、ピークプールは多くの場合混濁しており、ピークを中和したときに濁度は典型的には増加する。未処理ピークのプールは１０ＮＴＵの濁度を有し、中和すると２２ＮＴＵまで増加した。フロキュレーションしたピークのプールは３ＮＴＵの濁度を有し、中和すると未処理ピークよりも６３％低い８ＮＴＵまで増加した。
【０１４５】
実施例４
カルシウムおよびリン酸を用いたフロキュレーションは、清澄化した馴化培地およびプロテインＡのピークの両方で濁度減少を生じる。細胞関連不純物および産物関連不純物の両方の有意な減少も実現した。
【０１４６】
ｍＡｂである抗５Ｔ４は、無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた。培地約３Ｌを未処理のままで放置し、陰性対照とした。別に培養液３Ｌを４Ｌ容器に入れた。ｐＨを制御するために緩衝液を４０ｍＭまで添加し、１８〜２４℃で静かに混合した。次に、２Ｍリン酸カリウムを濃度２０ｍＭまで添加し、この溶液を静かに混合した。次に、５Ｍ塩化カルシウムを濃度３０ｍＭまで添加し、この溶液を静かに混合した。この混合物のｐＨは７．２であった。フロキュレーションした培養液を３個の２Ｌエルレンマイヤーフラスコに移し、混合しながら２時間インキュベートした。インキュベーションの終わりにこの混合物のｐＨは７．０であった。
【０１４７】
フロキュレーションした培養液および未処理の培養液の両方の試料５０ｍＬを３４０ｇで１０分間遠心分離した。清澄化した上清を取り出し、プロテインＡ ＨＰＬＣにより抗体濃度について、そして比濁計を使用して濁度についてアッセイした。産物関連物質の総回収率は未処理試料に比べて７８％であった。未処理試料の濁度は２９ＮＴＵであった。フロキュレーションした試料の濁度は２ＮＴＵであり、未処理試料に比べて濁度の９３％の減少であった。
【０１４８】
フロキュレーションした試料および未処理試料の両方は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａ１ＨＣパッドフィルターを通過させて加工処理した。パッド濾過および０．２μｍポリッシングフィルターを通過させたさらなる濾過の後に、試料はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡアフィニティーカラムを使用したクロマトグラフィーにかけた。高濃度でのプロテインＡカラムからの抗体溶出液として、産物ピークの頂点での物質は沈殿することが多く、混濁した溶液を生じた。分光光度計で吸光度６００ｎｍにより測定したとき、未処理試料のピーク頂点での沈殿析出レベルは１．８５ＡＵであった。分光光度計で吸光度６００ｎｍにより測定したとき、フロキュレーションした試料のピーク頂点での沈殿折出レベルは０．０３ＡＵであり、未処理試料に比べて濁度の９８％の減少であった。
【０１４９】
抗体をプロテインＡカラムから溶出させると、ピークのプールは時折混濁している。中和すると、物質が沈殿して溶液から沈降するときの濁度は、ｐＨ５．５からｐＨ６．０の間で典型的には有意に増加する。この沈殿の一部はｐＨが７を超えると再び可溶性になる傾向がある。抗体濃度８．１ｍｇ／ｍＬの未処理ピークのプールは、溶出時に濁度８．５ＮＴＵを有し、ｐＨ５．５から６．０では８３９ＮＴＵに増加し、ｐＨ７．０では５３ＮＴＵに減少した。０．２μｍ滅菌等級のフィルターを通過させて濾過すると、濁度は４０ＮＴＵに減少しただけであった。
【０１５０】
フロキュレーションした産物のプールは小容量でカラムから溶出し、その結果さらに濃縮されていた。抗体濃度１５．１ｍｇ／ｍＬのフロキュレーションしたピークのプールは、溶出時に濁度５．６ＮＴＵを有し、ｐＨ５．５から６．０では３１ＮＴＵに増加し、これは、対照から濁度の９６％の減少であった。濁度は、１５．１ｍｇ／ｍＬのときｐＨ７．０で４６ＮＴＵにやや増加した。０．２μｍの滅菌等級のフィルターを通過させて濾過すると、濁度は８．１ＮＴＵに減少し、これは、対照から８０％の減少であった。
【０１５１】
中和したプロテインＡのピークを未処理対照と一致するように濃度８．１ｍｇ／ｍＬに希釈すると、濾過していないフロキュレーションした試料の濁度は４６ＮＴＵから２５ＮＴＵに減少し、これは、未処理試料に比べて５３％の減少であった。０．２μｍ滅菌等級のフィルターを通過させて濾過すると、濁度は４．１ＮＴＵに減少し、これは、未処理試料に比べて濁度の９０％の減少であった。
【０１５２】
プロテインＡのピークのプールに存在する高分子量（ＨＭＷ）凝集体のレベルは、サイズ排除ＨＰＬＣにより測定した。未処理試料中の凝集体のレベルは９．５１％であった。フロキュレーションした試料中の凝集体のレベルは１．０５％であり、これは、未処理試料に比べて凝集体の８９％の減少であった。凝集体の減少を考慮すると、培養液中の産物回収率７８％は所望のモノマーの回収率８５％に換算される。
【０１５３】
ＣＨＯ細胞により分泌される望ましくない不純物である宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡを使用したプロセスのうち種々の工程で測定した。ＨＣＰレベルは、抗体１ｍｇ当たりのＨＣＰのｎｇに等しい百万分率（ｐｐｍ）として報告する。未処理培養液中のＨＣＰレベルは２．５３Ｅ６ｐｐｍであった。フロキュレーションした馴化培地中のＨＣＰレベルは３．８３Ｅ５ｐｐｍで、これは、未処理培養液から８４％の減少であった。未処理培養液およびフロキュレーションした培養液の両方が、パッドフィルターを通過すると、それぞれ１．０２Ｅ６および１．６２Ｅ５まで、ＨＣＰが約６０％減少した。プロテインＡカラムを通過して精製すると、未処理試料中のＨＣＰレベルは１．０３Ｅ５ｐｐｍまで９０％だけ減少した。フロキュレーションした試料中のＨＣＰレベルは、３．８３Ｅ２ｐｐｍまで９８％だけ減少した。全体的に見て、未処理精製手順についてＨＣＰの１．４ｌｏｇの除去があった。フロキュレーションした精製手順は、ＨＣＰの３．８ｌｏｇの除去を実現し、未処理精製手順に比べてＨＣＰの２５０倍の減少を生じた。
【０１５４】
いくつかの実施を記載したが、本発明はそれに限定されるわけではない。
【０１５５】
一例としていくつかの実施では、本明細書に記載するフロキュレーション方法は、細胞の不在下、例えば細胞を除去した後で行うことができる。その培地は無細胞不溶性物質を有することがある（下記実施例５参照）。
【０１５６】
実施例５
混濁した蛋白含有溶液の濾過を助けるために固体沈殿を形成させるためのカルシウムおよびリン酸の使用：ｍＡｂである抗ＧＤＦ８＃１を無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた。細胞はＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＢＴＰＸ２０５分離板型遠心分離器により除去し、結果として生じた遠心分離物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａ１ＨＣパッドフィルターを通過させて加工処理した。パッド濾過および０．２μｍポリッシングフィルターを通過させたさらなる濾過の後に、試料はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡアフィニティーカラムを使用してクロマトグラフィーにかけた。低ｐＨ緩衝液を使用して抗体をプロテインＡカラムから溶出させると、ピークのプールは時折混濁している。中和すると濁度は典型的には有意に増加する。
【０１５７】
この実施例では、プロテインＡのピークは４℃で７日間濾過せずに保ち、次に室温に加温した。ピークの濁度は１９２ＮＴＵであった。ピークを２つの８００ｍＬ試料に分け、一方の試料を未処理のまま放置した。２つ目の試料に４ｍＭリン酸カリウムおよび６ｍＭ塩化カルシウムを添加した。次に、処理した試料は２Ｌエルレンマイヤーフラスコ中で１８〜２５℃で１時間振盪した。振盪した後、処理した試料の濁度は４６０ＮＴＵであった。
【０１５８】
次に、未処理試料および処理した試料の両方は、１７．７ｃｍ２Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ０．５／０．２μｍポリエーテルスルホンカプセルフィルターを通過させて濾過した。各フィルターを通過することができた溶液の量に基づいて最大フィルター性能を計算した。最大フィルター性能は、フィルターが詰まって溶液がそれ以上通過できなくなるまで、フィルター１ｍ２を通過することができる溶液のリットル数である。未処理試料は、約３０Ｌ／ｍ２の最大フィルター性能に達することができたが、処理した試料は約１５００Ｌ／ｍ２の最大フィルター性能に達し、これは、フィルター性能の５０倍の増加であった。未処理試料および処理した試料両方のフィルター後の濁度は９ＮＴＵであり、これは、処理がさらなる粒子状物質の除去をそれ以上生じたとは思われないが、実際に濾過助剤として働き、フィルターが詰まるまで大容量の溶液にフィルターを通過させたことを示していた。
【０１５９】
実施例６
混濁した蛋白含有溶液中の粒子状物質の除去を助けるために固体沈殿を形成させるためのカルシウムおよびリン酸の使用に及ぼす規模および混合方法の効果：図２および３に「ｍＡｂ Ｂ」と示す抗ＡＢ＃２ｍＡｂは、パイロットスケールバイオリアクター中の無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた（細胞培養液１６０〜５００Ｌ）。細胞含有馴化培地約１２５Ｌ、１．５Ｌ、または５０ｍＬを２００Ｌカルボイ、２Ｌビーカー、または１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコにそれぞれ分注した。ｐＨを制御するためにＨＥＰＥＳを４０ｍＭまで添加した。２００Ｌカルボイおよび２Ｌビーカーを撹拌羽根で混合した。１２５ｍＬエルレンマイヤーは振盪器により混合した。リン酸カリウムの濃縮溶液を各混合物に添加し、最終溶液で最終濃度２０ｍＭを実現した。塩化カルシウム濃縮溶液を各溶液に添加して、最終目標濃度３０ｍＭを実現し、混合した。最終ｐＨは７．０から７．５であった。この固体および培地は室温（２０〜２３℃）の混合条件で１時間を超えてインキュベートした。未処理試料の一定分量５０ｍＬならびに処理した試料１２５Ｌ、１．５Ｌ、および５０ｍＬを３４０×ｇで１０分間遠心分離した。上清の濁度および抗体濃度を測定した。
【０１６０】
規模および混合方法が濁度に及ぼす効果を図２に示す。規模および混合方法（撹拌羽根または振盪器）には依存せずに、全てのフロキュレーションの例で濁度は対照よりも９０％超減少する。さらに、処理した全ての試料で抗体回収率は未処理試料の１００％であった。したがって、これらの大きく異なる条件について、本発明のフロキュレーションは規模または混合方法に依存するとは思われない。
【０１６１】
ＣＨＯ細胞により分泌される不必要な不純物である宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して未処理上清および処理した１２５Ｌ試料で測定した。ＨＣＰレベルは、抗体１ｍｇ当たりのＨＣＰのｎｇに等しい百万分率（ｐｐｍ）として報告する。処理した１２５Ｌ試料は、未処理試料に比べてＨＣＰが５０％減少した。
【０１６２】
実施例７
混濁した蛋白含有溶液中の粒子状物質の除去を助けるために固体沈殿を形成させるためのカルシウムおよびリン酸の使用に及ぼす混合速度の効果：図３に「ｍＡｂ Ｂ」と示す抗ＡＢ＃２ｍＡｂは、パイロットスケールバイオリアクター中の無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた（細胞培養液１６０〜５００Ｌ）。細胞含有馴化培地約１２５Ｌを２つの２００Ｌカルボイに入れた。ｐＨを制御するためにＨＥＰＥＳを４０ｍＭまで添加した。混合は撹拌羽根で行い、一方はチップ速度０．９ｍ／ｓで、もう一方は２．５ｍ／ｓで運転した。リン酸カリウムの濃縮溶液をこの混合物に添加し、最終溶液で最終濃度２０ｍＭを実現した。塩化カルシウム濃縮溶液をこの溶液に添加して、３０ｍＭの最終目標濃度を実現し、混合した。最終ｐＨは７．０から７．５であった。この固体および培地は室温（２０〜２３℃）の混合条件でインキュベートし、試料を様々な時点で採取した。各試料上清の濁度は、３４０×ｇで１０分間遠心分離後に測定した。撹拌羽根のチップ速度が濁度に及ぼす効果を図３に示す。濁度は、１時間後に検討したフロキュレーションの例の全てで、チップ速度には依存せずに対照から９０％超減少する。チップ速度が速いと、１５分の時点で濁度の減少が速いと思われた。しかし、この差は有意ではない。したがって、１時間のインキュベーション後に検討した速度についての本発明のフロキュレーションは、チップ速度に依存するとは思われない。
【０１６３】
ＣＨＯ細胞により産生された不必要な不純物である宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して未処理上清および処理した０．９ｍ／ｓ試料で測定した。ＨＣＰレベルは、抗体１ｍｇ当たりのＨＣＰのｎｇに等しい百万分率（ｐｐｍ）として報告する。処理した試料は、未処理試料に比べてＨＣＰが４７％減少した。
【０１６４】
実施例８
大規模フロキュレーション：
沈殿剤としてカルシウムおよびリン酸を使用したパイロット実験および下流の清澄化工程およびクロマトグラフィー工程に及ぼす効果：ｍＡｂである抗ＩＬ−１３＃１（図４および５にｍＡｂ Ｅと示す）は、１９０Ｌバイオリアクター中の無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により５つの異なるバッチで産生させた。バイオリアクターを培養時間１２〜１４日で運転し、細胞は８×１０６〜１１×１０６生細胞／ｍＬの生存度を有し、６６〜８８％が生存していた。採集時に、培養液を室温（１８〜２５℃）にした。（最初の４つのバッチについては）培養液１５０Ｌは２００Ｌカルボイに移すか、（最後のバッチについては）バイオリアクターの中に放置し、オーバーヘッドミキサーでゆっくりと混合した。ｐＨを制御するためにＨＥＰＥＳ緩衝液を４０ｍＭまで添加した。次に、２Ｍリン酸カリウムを濃度２０ｍＭまで添加した。次に、５Ｍ塩化カルシウムを濃度３０ｍＭになるように添加した。この混合物のｐＨは７から７．５であった。フロキュレーションした培養液は、混合しながら２から３時間インキュベートした。
【０１６５】
フロキュレーションした培養液は、４から５Ｌ／ｍｉｎの流速および７６３０ＲＰＭ（８０００ｇ）のボウル速度でＡｌｆａ Ｌａｖａｌ ＢＴＰＸ２０５分離板型遠心分離器により加工処理した。図４に、得られた遠心分離上清の濁度を、（３４０ｇで１０分間の未処理対照の遠心分離から得られた）フロキュレーションしていない試料の上清と比較する。全ての場合で、フロキュレーションは濁度を８５％超減少させる。フロキュレーションした上清中の抗体力価の回収率は、インキュベーション時間の関数として図５に示すが、全ての場合で７５％超である。試料５０ｍＬをバッチ４０３および４０５から採取し、１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中でさらなる時間インキュベートした。７時間後にバッチ４０３は未処理試料の６０％の力価を有し、バッチ４０５は未処理試料の８０％の力価を有した。
【０１６６】
ＣＨＯ細胞により分泌された不必要な不純物である宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡを使用して未処理上清および処理した遠心分離上清で測定した。ＨＣＰレベルは、抗体１ｍｇ当たりのＨＣＰのｎｇに等しい百万分率（ｐｐｍ）として報告する。５つのバッチから処理した試料は、未処理試料に比べて４９％〜６９％のＨＣＰの減少を示した。
【０１６７】
最初の３つのバッチは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａ１ＨＣパッドフィルターを通過させて、１平方メートルおよび１時間当たり１２０リットルの流束でフィルター１平方メートル当たり遠心分離上清２７０Ｌの性能まで加工処理し、圧力の増加も増加も伴わなかった。
【０１６８】
濁度により測定したとき、パッド濾過後の試料は一般に数日間安定なままであった。
【０１６９】
最後の２つのバッチは、パッドを通過させずに直接０．２μｍフィルターにかけた。０．２μｍフィルターの前にパッドフィルターを使用せずに、それぞれ７３０および１６０Ｌ／ｍ２のフィルター性能を実現した。これらのフィルター性能は、フロキュレーションしていない物質でのフィルター性能よりも濾過性の有意な向上を示している。室温（１８〜２４℃）で０．２μｍで濾過した遠心分離上清（パッドなし）を保存すると、カルシウムおよびリン酸の沈殿継続が原因で、濁度は数時間以内に増加し始める。２４〜４８時間後に、沈殿は沈降し、容器の底にリン酸カルシウムの結晶層を形成する。結果として生じた清澄化した蛋白含有溶液は、沈殿の沈降前および後の両方で優れた濾過性を有する。沈殿への抗体の損失はない。
【０１７０】
最終バッチについてのフロキュレーションは、パイロットバイオリアクターで直接行った。リアクターは標準的な定置洗浄（ＣＩＰ）手順（水すすぎに続いて６０〜８０℃の０．１Ｎ ＮａＯＨによる洗浄）を使用して効果的に洗浄した。
【０１７１】
全ての５つのバッチは、プロテインＡカラム、陰イオン交換工程、ウイルス停留フィルター、および最終的な限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）によりパイロットスケールで加工処理したが、作業に問題はなかった。中和したプロテインＡのピークは、全て＜２０ＮＴＵの濁度を有し、高度に濾過性であった。サイズ排除ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により測定した高分子量凝集物および低分子量切断物（ｃｌｉｐ）のレベルなどの産物の品質、ならびに陽イオン交換ＨＰＬＣにより測定した酸性種および塩基性種のレベルは、この抗体を用いて予め行ったフロキュレーションなしのパイロット実験（ｃａｍｐａｉｇｎ）に匹敵した。
【０１７２】
実施例９
沈殿剤としてのカルシウムおよびリン酸の使用ならびに下流のプロテインＡクロマトグラフィー工程およびその後の濾過に及ぼす効果：３つのｍＡｂ、すなわち抗ＡＢ＃２、抗ＧＤＦ８＃１、および抗ＩＬ２２は、無血清培地で培養した組換えＣＨＯ細胞により産生させた。それぞれについて培養液を半分に分け、最初の試料を未処理のままとした。２番目の試料（処理した試料）にＨＥＰＥＳを４０ｍＭのレベルまで、リン酸カリウムを２０ｍＭのレベルまで、そして塩化カルシウムを３０ｍＭのレベルまで添加した。試料由来の全ての細胞は遠心分離により除去し、結果として得られた上清はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａ１ＨＣパッドフィルターを通過させて加工処理した。パッド濾過および０．２μｍポリッシングフィルターを通過させたさらなる濾過の後で、試料はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡアフィニティーカラムを使用してクロマトグラフィーにかけた。低ｐＨ緩衝液を使用して抗体をプロテインＡカラムから溶出させると、ピークのプールは時折混濁する。中和すると、濁度は典型的には有意に増加する。
【０１７３】
未処理試料および処理した試料の中和されたピークの濁度を下記表２に示す。３つの処理試料は全て未処理試料に比べて中和されたピークの濁度に有意な減少を示した。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
次に、未処理で中和した抗ＩＬ２２のピークおよび処理して中和した抗ＩＬ２２のピークは、２．８ｃｍ２Ｐａｌｌ Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｓｕｐｏｒ０．８／０．２μｍポリエーテルスルホン製シリンジフィルターを通過させて濾過した。各フィルターを通過することができた溶液の量に基づいて、最大フィルター性能を計算した。最大フィルター性能は、フィルターが詰まって溶液がそれ以上通過できなくなるまでフィルター１ｍ２を通過することができる溶液のリットル数である。未処理試料は、約１０〜３０Ｌ／ｍ２の最大フィルター性能を実現することができた。１７０Ｌ／ｍ２の処理した試料は、流れを減少させずにフィルターを通過し、この段階では処理した試料は残存しなかった。処理した試料は、最大フィルター性能を正確に計算するには速すぎる速度でフィルターを通過した。しかし、１７０Ｌ／ｍ２の目標まで流出の減少はなく、最大性能は１７０Ｌ／ｍ２よりも有意に大きいと考えることができる。
【０１７６】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１７７】
その他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に属する。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】分離方法の実施形態のフローチャートを示す図である。
【図２】規模および混合方法がフロキュレーションに及ぼす効果を示す図である。
【図３】混合速度がフロキュレーションに及ぼす効果を示す図である。
【図４】５回のパイロットスケールのフロキュレーション実験の図的要約である。
【図５】図４に要約した５回のパイロットスケールの各フロキュレーション実験についての経時的な抗体回収率（％）の変化を示す図的要約である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白を含む培地中で第１陽イオンおよび第１陰イオンを含む固体を形成させ；および
該蛋白から該固体を分離することを含む、方法。
【請求項２】
第１陽イオンが、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、アルミニウム、スカンジウム、ランタン、ケイ素、チタン、ジルコニウム、トリウム、マンガン、コバルト、銅、クロム、鉄、ニッケル、亜鉛およびバナジウムからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１陽イオンがカルシウムである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第１陰イオンが、リン酸イオン、炭酸イオン、クロム酸イオン、タングステン酸イオン、水酸化物イオン、ハロゲン化物イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、亜硫酸イオン、モリブデン酸イオン、硝酸イオン、フッ化物イオン、ケイ酸イオン、およびアルギン酸イオンからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第１陰イオンがリン酸イオンである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第１陽イオンがカルシウムであり、第１陰イオンがリン酸イオンである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
固体の溶解度積定数が約１０−４Ｍ２にすぎない、請求項１記載の方法。
【請求項８】
約４ｍＭから約２００ｍＭの第１陽イオンまたは第１陰イオンを培地に導入することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
固体形成前の第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約１０−５Ｍ２よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
固体形成前の第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約１０−４Ｍ２よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
固体形成前の第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約２．７ｘ１０−２Ｍ２よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
培地中の第１陽イオンと第１陰イオンの濃度が異なる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
培地中の第１陽イオンと第１陰イオンの濃度が実質的に同じである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
培地のｐＨを変化させることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
培地のｐＨが約５と約９の間に維持される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
培地中の蛋白の少なくとも約５０％が分離される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
培地中の蛋白の少なくとも約７０％が分離される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
清澄化された培地の濁度を、該培地と同一で、固体を含まない第２の清澄化された培地と比べて少なくとも約３０％だけ減少させることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
清澄化された培地の濁度を、該培地と同一で、固体を含まない第２の清澄化された培地と比べて少なくとも約５０％だけ減少させることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
培地が哺乳動物細胞をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
培地が真核細胞をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
培地を遠心分離に付すこと、精密濾過膜を通してその培地を濾過すること、またはデプスフィルターを通してその培地を濾過することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
固体が第２陽イオン種または第２陰イオンをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、第１培地と同一で、固体形成を有さない第２培地を同様に溶出させたピークよりも低い濁度を有する溶出ピークを得る、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、該培地と同一で、固体形成を有さない第２培地の溶出ピークよりも低い可溶性不純物レベルを有する溶出ピークを得る、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
第１陽イオンおよび第１陰イオンを蛋白を含む培地に導入し；
該第１陽イオンおよび第１陰イオンを含む固体を沈殿させ；および
該固体を該蛋白より分離することを含む、方法。
【請求項２７】
第１陽イオンおよび第１陰イオンが連続的に導入される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
第１陽イオンおよび第１陰イオンが同時に導入される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
第１陽イオンが、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、アルミニウム、スカンジウム、ランタン、ケイ素、チタン、ジルコニウム、トリウム、マンガン、コバルト、銅、クロム、鉄、ニッケル、亜鉛およびバナジウムからなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
第１陰イオンが、リン酸イオン、炭酸イオン、クロム酸イオン、タングステン酸イオン、水酸化物イオン、ハロゲン化物イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、亜硫酸イオン、モリブデン酸イオン、硝酸イオン、フッ化物イオン、ケイ酸イオン、およびアルギン酸イオンからなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
固体の溶解度積定数が約１０−４Ｍ２にすぎない、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
約４ｍＭから約２００ｍＭの第１陽イオンまたは第１陰イオンを培地に導入することをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約１０−５Ｍ２よりも大きい、請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約１０−４Ｍ２よりも大きい、請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約２．７ｘ１０−２Ｍ２よりも大きい、請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
異なる濃度の第１陽イオンと第１陰イオンを培地に導入することを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３７】
同じ濃度の第１陽イオンと第１陰イオンを培地に導入することを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３８】
培地のｐＨを変化させることをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３９】
培地のｐＨが約５と約９の間に維持される、請求項２６記載の方法。
【請求項４０】
培地の温度を調整することをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４１】
培地中の蛋白の少なくとも約５０％が分離される、請求項２６記載の方法。
【請求項４２】
培地中の蛋白の少なくとも約７０％が分離される、請求項２６記載の方法。
【請求項４３】
清澄化された培地の濁度を、該培地と同一で、固体を含まない第２の清澄化された培地と比べて少なくとも約３０％だけ減少させることをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４４】
清澄化された培地の濁度を、該培地と同一で、固体を含まない第２の清澄化された培地と比べて少なくとも約５０％だけ減少させることをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４５】
培地が哺乳動物細胞をさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４６】
培地が真核細胞をさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４７】
培地を遠心分離に付すことをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４８】
固体が第２陽イオンまたは第２陰イオンをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４９】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、第１培地と同一で、固体形成を有さない第２培地を同様に溶出させたピークよりも低い濁度を有する溶出ピークを得る、請求項２６記載の方法。
【請求項５０】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、該培地と同一で、固体形成を有さない第２培地の溶出ピークよりも低い可溶性不純物レベルを有する溶出ピークを得る、請求項２６記載の方法。
【請求項５１】
蛋白が分泌蛋白である、請求項１記載の方法。
【請求項５２】
蛋白が、抗体、抗体の抗原結合断片、可溶性受容体、受容体融合体、サイトカイン、成長因子、酵素および凝固因子からなる群より選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
蛋白が抗体またはその抗体の抗原結合断片である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
抗体またはその抗体の抗原結合断片がＡβペプチド、インターロイキン−１３、インターロイキン−２２、５Ｔ４または成長分化因子−８と結合する、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
蛋白が分泌蛋白である、請求項２６記載の方法。
【請求項５６】
蛋白が、抗体、抗体の抗原結合断片、可溶性受容体、受容体融合体、サイトカイン、成長因子、酵素および凝固因子からなる群より選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
蛋白が抗体またはその抗体の抗原結合断片である、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
抗体またはその抗体の抗原結合断片がＡβペプチド、インターロイキン−１３、インターロイキン−２２、５Ｔ４または成長分化因子−８と結合する、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
（ｉ）標的成分と、混濁起因物質とを含む培地中で第１陽イオンおよび第１陰イオンを含む固体を形成させること；および（ｉｉ）濾過によりその溶液からその固体および混濁起因物質を分離することを含む、方法
【請求項６０】
標的成分が蛋白である、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
蛋白が可溶性蛋白である、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
第１陽イオンがカルシウムである、請求項２６記載の方法。
【請求項６３】
第１陰イオンがリン酸イオンである、請求項２６記載の方法。
【請求項６４】
第１陽イオンがカルシウムで、第１陰イオンがリン酸イオンである、請求項２６記載の方法。
【請求項６５】
培地の温度を調整することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１】
蛋白を含む培地中で第１陽イオンおよび第１陰イオンを含む固体を形成させ；および
該蛋白から該固体を分離することを含む、方法。
【請求項２】
第１陽イオンが、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、アルミニウム、スカンジウム、ランタン、ケイ素、チタン、ジルコニウム、トリウム、マンガン、コバルト、銅、クロム、鉄、ニッケル、亜鉛およびバナジウムからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１陽イオンがカルシウムである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
第１陰イオンが、リン酸イオン、炭酸イオン、クロム酸イオン、タングステン酸イオン、水酸化物イオン、ハロゲン化物イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、亜硫酸イオン、モリブデン酸イオン、硝酸イオン、フッ化物イオン、ケイ酸イオン、およびアルギン酸イオンからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第１陰イオンがリン酸イオンである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第１陽イオンがカルシウムであり、第１陰イオンがリン酸イオンである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
固体の溶解度積定数が約１０−４Ｍ２にすぎない、請求項１記載の方法。
【請求項８】
約４ｍＭから約２００ｍＭの第１陽イオンまたは第１陰イオンを培地に導入することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
固体形成前の第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約１０−５Ｍ２よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
固体形成前の第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約１０−４Ｍ２よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
固体形成前の第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約２．７ｘ１０−２Ｍ２よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
培地中の第１陽イオンと第１陰イオンの濃度が異なる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
培地中の第１陽イオンと第１陰イオンの濃度が実質的に同じである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
培地のｐＨを変化させることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
培地のｐＨが約５と約９の間に維持される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
培地中の蛋白の少なくとも約５０％が分離される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
培地中の蛋白の少なくとも約７０％が分離される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
清澄化された培地の濁度を、該培地と同一で、固体を含まない第２の清澄化された培地と比べて少なくとも約３０％だけ減少させることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
清澄化された培地の濁度を、該培地と同一で、固体を含まない第２の清澄化された培地と比べて少なくとも約５０％だけ減少させることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
培地が哺乳動物細胞をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
培地が真核細胞をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
培地を遠心分離に付すこと、精密濾過膜を通してその培地を濾過すること、またはデプスフィルターを通してその培地を濾過することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
固体が第２陽イオン種または第２陰イオンをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、第１培地と同一で、固体形成を有さない第２培地を同様に溶出させたピークよりも低い濁度を有する溶出ピークを得る、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、該培地と同一で、固体形成を有さない第２培地の溶出ピークよりも低い可溶性不純物レベルを有する溶出ピークを得る、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
第１陽イオンおよび第１陰イオンを蛋白を含む培地に導入し；
該第１陽イオンおよび第１陰イオンを含む固体を沈殿させ；および
該固体を該蛋白より分離することを含む、方法。
【請求項２７】
第１陽イオンおよび第１陰イオンが連続的に導入される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
第１陽イオンおよび第１陰イオンが同時に導入される、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
第１陽イオンが、カルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、アルミニウム、スカンジウム、ランタン、ケイ素、チタン、ジルコニウム、トリウム、マンガン、コバルト、銅、クロム、鉄、ニッケル、亜鉛およびバナジウムからなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
第１陰イオンが、リン酸イオン、炭酸イオン、クロム酸イオン、タングステン酸イオン、水酸化物イオン、ハロゲン化物イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、亜硫酸イオン、モリブデン酸イオン、硝酸イオン、フッ化物イオン、ケイ酸イオン、およびアルギン酸イオンからなる群より選択される、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
固体の溶解度積定数が約１０−４Ｍ２にすぎない、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
約４ｍＭから約２００ｍＭの第１陽イオンまたは第１陰イオンを培地に導入することをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約１０−５Ｍ２よりも大きい、請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約１０−４Ｍ２よりも大きい、請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
第１陽イオンの濃度および第１陰イオンの濃度の積が約２．７ｘ１０−２Ｍ２よりも大きい、請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
異なる濃度の第１陽イオンと第１陰イオンを培地に導入することを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３７】
同じ濃度の第１陽イオンと第１陰イオンを培地に導入することを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３８】
培地のｐＨを変化させることをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３９】
培地のｐＨが約５と約９の間に維持される、請求項２６記載の方法。
【請求項４０】
培地の温度を調整することをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４１】
培地中の蛋白の少なくとも約５０％が分離される、請求項２６記載の方法。
【請求項４２】
培地中の蛋白の少なくとも約７０％が分離される、請求項２６記載の方法。
【請求項４３】
清澄化された培地の濁度を、該培地と同一で、固体を含まない第２の清澄化された培地と比べて少なくとも約３０％だけ減少させることをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４４】
清澄化された培地の濁度を、該培地と同一で、固体を含まない第２の清澄化された培地と比べて少なくとも約５０％だけ減少させることをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４５】
培地が哺乳動物細胞をさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４６】
培地が真核細胞をさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４７】
培地を遠心分離に付すことをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４８】
固体が第２陽イオンまたは第２陰イオンをさらに含む、請求項２６記載の方法。
【請求項４９】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、第１培地と同一で、固体形成を有さない第２培地を同様に溶出させたピークよりも低い濁度を有する溶出ピークを得る、請求項２６記載の方法。
【請求項５０】
固体を形成させて分離した後で、蛋白を含む培地をプロテインＡカラムに適用して溶出させ、該培地と同一で、固体形成を有さない第２培地の溶出ピークよりも低い可溶性不純物レベルを有する溶出ピークを得る、請求項２６記載の方法。
【請求項５１】
蛋白が分泌蛋白である、請求項１記載の方法。
【請求項５２】
蛋白が、抗体、抗体の抗原結合断片、可溶性受容体、受容体融合体、サイトカイン、成長因子、酵素および凝固因子からなる群より選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
蛋白が抗体またはその抗体の抗原結合断片である、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
抗体またはその抗体の抗原結合断片がＡβペプチド、インターロイキン−１３、インターロイキン−２２、５Ｔ４または成長分化因子−８と結合する、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
蛋白が分泌蛋白である、請求項２６記載の方法。
【請求項５６】
蛋白が、抗体、抗体の抗原結合断片、可溶性受容体、受容体融合体、サイトカイン、成長因子、酵素および凝固因子からなる群より選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
蛋白が抗体またはその抗体の抗原結合断片である、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
抗体またはその抗体の抗原結合断片がＡβペプチド、インターロイキン−１３、インターロイキン−２２、５Ｔ４または成長分化因子−８と結合する、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
（ｉ）標的成分と、混濁起因物質とを含む培地中で第１陽イオンおよび第１陰イオンを含む固体を形成させること；および（ｉｉ）濾過によりその溶液からその固体および混濁起因物質を分離することを含む、方法
【請求項６０】
標的成分が蛋白である、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
蛋白が可溶性蛋白である、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
第１陽イオンがカルシウムである、請求項２６記載の方法。
【請求項６３】
第１陰イオンがリン酸イオンである、請求項２６記載の方法。
【請求項６４】
第１陽イオンがカルシウムで、第１陰イオンがリン酸イオンである、請求項２６記載の方法。
【請求項６５】
培地の温度を調整することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００９−５０８４８６（Ｐ２００９−５０８４８６Ａ）
【公表日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３１１９４（Ｐ２００８−５３１１９４）
【出願日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３５０２５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３５２８３
【国際公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３５０２５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３５２８３
【国際公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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