増加した量のグルコサミノグリカンを合成する植物
本発明は、増加量のグルコサミノグリカンを合成する植物細胞及び植物、ならびに、そのような植物を調製するための方法、ならびに、また、これらの植物細胞又は植物を用いてグルコサミノグリカンを調製するための方法に関する。ここで、本発明の植物細胞又は遺伝子改変植物は、野生型の植物細胞又は野生型の植物と比較し、グルコサミノグリカン合成酵素活性及び加えて増加したグルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性及び増加したＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有する。本発明は、さらに、増加したグルコサミノグリカン合成を有する植物細胞を含む組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増加した量のグルコサミノグリカンを合成する植物細胞及び植物、ならびに、そのような植物を調製するための方法、ならびに、また、これらの植物細胞又は植物を用いてグルコサミノグリカンを調製するための方法に関する。ここで、本発明の植物細胞又は遺伝子改変植物は、野生型の植物細胞又は野生型の植物と比較し、グルコサミノグリカン合成酵素活性及び加えて増加したグルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性及び増加したＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有する。本発明は、さらに、増加したグルコサミノグリカン合成を有する植物細胞を含む組成物に関する。
【０００２】
プロテオグリカン、糖タンパク質のクラスは、とりわけ、軟骨の必須成分であり、コアタンパク質に付着し、繰り返し二糖単位で構成されるグルコサミノグリカンを有する。それらの部分のための繰り返し二糖単位は、特徴的な炭水化物結合配列を介して、コアタンパク質に共有結合的に付着する。二糖単位の組成に応じて、区別が、とりわけ、グルコサミノグリカンへパラン／ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、及びコンドロイチン／デルマタン硫酸の間でなされ、その二糖単位は各々、グルコサミン又はグルコサミン誘導体である分子を含む。ヒアルロナンは、さらなるグルコサミノグリカンであり、やはり、その二糖単位の成分の１つとしてグルコサミン（Ｎ−アセチル−グルコサミン）の誘導体を有するが、しかし、本来は、タンパク質に付着していない。ヒアルロナンを除き、言及したグルコサミノグリカンは自然で硫酸化ポリマーである。これらの物質において、硫酸基を二糖単位の種々の原子又は置換基に導入し、言及した物質が均一なポリマーではないが、しかし、各一般用語の下でまとめられるポリマーのグループであるようになっている。問題になっているポリマー基の個々の分子は、硫酸化の程度及び硫酸基を有するモノマーの位置の両方において異なりうる。
【０００３】
ヒアルロナンは、自然発生的な非分岐、直鎖ムコ多糖類（グルコサミノグリカン）であり、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の交互分子で構築される。ヒアルロナンの基本的な構成要素は、二糖グルクロン酸−ベータ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミンからなる。ヒアルロナンにおいて、これらの繰り返し単位は、互いに、ベータ−１，４結合を介して付着する。薬学において、ヒアルロン酸という用語が頻繁に使用される。ヒアルロナンは、大半の場合において、遊離酸としてではなくポリアニオンとして存在するため、以下に、ヒアルロナンという用語が好ましく使用されるが、しかし、各々の用語は両方の分子形態を包含すると理解すべきである。
【０００４】
ヒアルロナンは、異常な物理的、化学的特性、例えば、高分子電解質の特性、粘弾性特性、水を結合する高い能力、ゲル形成の特性を有し、それらは、ヒアルロナンのさらなる特性に加えて、Lapcik et al.（1998, Chemical Reviews 98(8), 2663−2684）による総説文献に記載される。ヒアルロナンは、脊椎動物の細胞外結合組織及び体液の成分である。ヒトでは、ヒアルロン酸は、全ての体細胞、特に間葉細胞の細胞膜により合成され、身体において一様に存在し、結合組織、細胞外マトリクス、臍帯、滑液、軟骨組織、皮膚、及び眼の硝子体において特に高濃度である（Bernhard Gebauer, 1998, Inaugural-Dissertation, Virchow-Klinikum Medizinische Fakultat Charite der Humboldt Universitat zu Berlin; Fraser et al., 1997, Journal of Internal Medicine 242, 27-33）。最近、ヒアルロナンは、非脊椎動物の生物体（軟体動物）でも見出された（Volpi and Maccari, 2003, Biochimie 85, 619-625）。さらに、一部のヒト病原性グラム陽性細菌（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）グループＡ及びＣ）及びグラム陰性細菌（パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ））は、これらの細菌を、それらの宿主の免疫系による攻撃に対して防御するエキソ多糖類としてヒアルロナンを合成する。なぜなら、ヒアルロナンは非免疫原性物質であるからである。クロレラ属の単細胞緑藻類に感染するウイルスは、その一部がゾウリムシ種において内部共生体として存在し、単細胞緑藻類に、ウイルスによる感染後にヒアルロナンを合成する能力を与える（Graves et al., 1999, Virology 257, 15-23）。しかし、ヒアルロナンを合成する能力は、問題になっている藻類を特徴付ける特色ではない。藻類がヒアルロナンを合成する能力は、ウイルスでの感染により媒介され、そのゲノムはヒアルロナン合成酵素をコードする配列を有する（DeAngelis, 1997, Science 278, 1800-1803）。
【０００５】
ヒアルロナン合成の触媒作用は、単一の膜組込み酵素又は膜結合酵素である、ヒアルロナン合成酵素による影響を受ける。合成されたヒアルロナン分子の細胞質膜を越えた細胞周辺の培地中への転移の機構は、まだ完全には解明されていない。より初期の仮説では、細胞膜を越えた輸送は、ヒアルロナン合成酵素自体の影響を受けることが想定された。しかし、より最近の結果では、ヒアルロナン分子の細胞質膜を越えた輸送が、この作用に関与する輸送タンパク質を介したエネルギー依存的輸送により起こることが示されている。このように、能動輸送タンパク質の合成が阻害されたストレプトコッカス株が突然変異により生成された。これらの株は、対応する野生型細菌株よりも少ないヒアルロナンを合成した（Ouskova et al., 2004, Glycobiology 14(10), 931-938）。ヒト繊維芽細胞において、公知の輸送タンパク質を特異的に阻害する薬剤を用いて、産生されるヒアルロナンの量及びヒアルロナン合成酵素の活性の両方を低下させることが可能である（Prehm and Schumacher, 2004, Biochemical Pharmacology 68, 1401-1410）。仮にある場合、ヒアルロナンを輸送できる輸送タンパク質がどのくらいの量で植物中に存在するかは公知ではない。
【０００６】
ヒアルロナンの異常な特性によって、種々の分野、例えば、薬学、化粧品産業における適用のため、食品及び飼料の産生において、技術的適用（例えば、潤滑剤）などにおいて豊富な可能性を提供する。ヒアルロナンが現在使用されている最も重要な適用は、医薬及び化粧品の分野である（例えば、Lapcik et al., 1998, Chemical Reviews 98(8), 2663-2684, Goa and Benfield, 1994, Drugs 47(3), 536-566を参照のこと）。医学分野において、ヒアルロナン含有産物は、現在、関節症の関節内処置のため、及び、眼の手術のために使用される眼薬中で使用される。ヒアルロナンは、また、競走馬での関節障害の処置のために使用される。また、ヒアルロナンは一部の鼻科薬の成分であり、例えば、点眼薬及び鼻薬の形態で、乾燥した粘膜を湿らせるために役立つ。注射用のヒアルロナン含有溶液を、鎮痛剤及び抗リウマチ剤として使用する。ヒアルロナン又は誘導体化ヒアルロナンを含むパッチを創傷治癒に用いる。皮膚科薬として、ヒアルロナン含有ゲルインプラントを、形成外科において皮膚変形を矯正するために使用する。薬学的用途のために、高分子量を有するヒアルロナンの使用が好まれる。化粧品医学において、ヒアルロナン調製物は最も適した皮膚充填物質の１つである。ヒアルロナンを注射することにより、限られた時間期間にわたり、しわを伸ばし、唇の容積を増加することが可能である。化粧品産物中で、特に皮膚クリーム及びローション中で、ヒアルロナンは、その高い水結合能力を理由に、保湿剤として頻繁に使用される。
【０００７】
さらに、ヒアルロナン含有調製物は、いわゆる栄養補給食品（食品添加物）として販売され、関節症の予防及び軽減のために動物（例えば、イヌ、ウマ）でも使用できる。
【０００８】
商業目的のために使用されるヒアルロナンは、現在、動物組織（ケイトウ）から単離される、又は、細菌培養物を使用して発酵性に調製される。ＵＳ ４，１４１，９７３には、ケイトウから、又は、代わりに臍帯からヒアルロナンを単離するための方法が記載されている。ヒアルロナンに加えて、動物組織（例えば、ケイトウ、臍帯）は、また、ヒアルロナンに関連するさらなるムコ多糖類、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラタン硫酸、及びヘパリンを含む。さらに、動物生物体は、ヒアルロナンに特異的に結合し、生物体における最も異なる機能、例えば、肝臓でのヒアルロナンの分解、細胞移動のためのリード構造としてのヒアルロナンの機能、エンドサイトーシスの調節、ヒアルロナンの細胞表面への固定、又はヒアルロナンネットワークの形成に必要とされるタンパク質（ヒアルアドヘリン）を含む（Turley, 1991, Adv Drug Delivery Rev 7, 257 ff.; Laurent and Fraser, 1992, FASEB J. 6, 183 ff.; Stamenkovic and Aruffo, 1993, Methods Enzymol. 245, 195 ff; Knudson and Knudson, 1993, FASEB 7, 1233 ff.）。
【０００９】
ヒアルロナンの細菌産生のために使用されるストレプトコッカス株は、もっぱら、ヒトに病原性を持つ細菌である。培養中でも、これらの細菌は（発熱性）外毒素及び溶血素（ストレプトリジン、特にアルファ−及びベータ−溶血素）を産生し（Kilian, M.: Streptococcus and Enterococcus. In: Medical Microbiology. Greenwood, D.; Slack, RCA; Peutherer, J. F. (Eds.). Chapter 16. Churchill Livingstone, Edinburgh, UK: pp.174-188, 2002, ISBN 0443070776）、それらは培地中に放出される。これによって、ストレプトコッカス株を用いて調製されたヒアルロナンの精製及び単離がより困難になる。特に、薬学的用途では、調製物中での外毒素及び溶血素の存在が問題である。
ＵＳ ４，８０１，５３９には、突然変異細菌株（ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ））の発酵によるヒアルロナンの調製が記載されている。使用される突然変異細菌株は、ベータ−溶血素をもはや合成しない。達成される収量は、培養物１リットル当たり３．６gのヒアルロナンであった。
ＥＰ ０６９４６１６には、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）又はストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）を培養するための方法が記載されており、ここで、用いられる培養条件下で、ストレプトリジンは合成されず、しかし、増加量のヒアルロナンが合成される。達成される収量は、培養物１リットル当たり３．５gのヒアルロナンであった。
培養中に、ストレプトコッカス株は培地中に酵素ヒアルロニダーゼを放出し、その結果として、この産生系でも、分子量が精製中に低下する。ヒアルロニダーゼ陰性ストレプトコッカス株の使用又は培養中にヒアルロニダーゼの産生が阻害されるヒアルロナンの産生のための方法が、ＵＳ ４，７８２，０４６に記載されている。達成される収量は、培養物１リットル当たり２．５gのヒアルロナンまでであり、達成される最高平均分子量は３．８×１０６Daであり、分子量分布は２．４×１０６〜４．０×１０６であった。
ＵＳ ２００３０１７５９０２及びＷＯ ０３ ０５４１６３には、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）からのヒアルロナン合成酵素の異種発現を用いたヒアルロナンの調製が記載されている。十分量のヒアルロナンの産生を達成するために、ヒアルロナン合成酵素の異種発現に加えて、バチルス細胞中でのＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼの同時発現も必要とされる。ＵＳ ２００３０１７５９０２及びＷＯ ０３ ０５４１６３には、バチルス・スブチリスを用いた産生において得られる絶対量のヒアルロナンについて述べられていない。達成される最高平均分子量は約４．２×１０６である。しかし、この平均分子量は組換えバチルス株についてだけ達成され、ここでストレプトコッカス・エクイシミリスからのヒアルロナン合成酵素遺伝子をコードする遺伝子及びバチルス・スブチリスからのＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ａｍｙＱプロモーターの制御下で、バチルス・スブチリスのゲノム中に組込まれ、ここで、同時に、バチルス・スブチリスの内因性ｃｘｐＹ遺伝子（チトクロムＰ４５０オキシダーゼをコードする）が不活化された。Chien and Lee（2007, Biotechnol. Prog. Online publication, ASAP Article 10.1021/bp070036w, S8756-7938(07)00036-7）は、種々の組換えバチルス・スブチリス株について記載している。１つの株は、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列及びＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列で形質転換されており、最大１．１４g/lのヒアルロナンを合成した。先ほど言及した核酸配列に加えて、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロビンをコードする核酸配列で形質転換した株は、１．８g/lのヒアルロナンを合成した。
【００１０】
ＷＯ ０６ ０３２５３８には、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子で形質転換されたトランスジェニック植物について記載されている。問題になっている植物中でのヒアルロナンの合成は、明確に実証された。
【００１１】
ＷＯ ０５ ０１２５２９には、クロレラ感染ウイルスからのヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を使用して形質転換されたトランスジェニックタバコ植物の産生が記載されている。ＷＯ ０５ ０１２５２９において、一方では、クロレラ・ウイルス株ＣＶＨ１、そして、他方では、タバコ植物を形質転換するためのクロレラ・ウイルス株ＣＶＫＡ１のヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列が使用された。ヒアルロナンの合成は、クロレラ・ウイルス株ＣＶＫＡ１から単離されたヒアルロナン合成酵素をコードする核酸で形質転換された植物についてだけ実証できた。クロレラ・ウイルス株ＣＶＨ１から単離されたヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列で形質転換されたタバコ植物について、対応するトランスジェニック植物においてヒアルロナン合成を検出することは可能ではなかった。ＷＯ ０５ ０１２５２９におけるヒアルロナン産生トランスジェニックタバコ植物だけにより合成されたヒアルロナンの量が、測定された容積１ml当たり約４．２μgのヒアルロナンであると述べられており、問題になっている実験を行うための説明を考慮に入れると、植物材料の新鮮重量１グラム当たりで産生される最大１２μgのヒアルロナンの量にほぼ相当する。
【００１２】
ＷＯ ２００７ ０３９３１４には、ヒアルロナン合成酵素の活性、及び、加えて、増加したグルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）活性を有するトランスジェニック植物が記載されている。これらの植物は、ヒアルロナン合成酵素の活性だけを有する植物と比較し、増加量のヒアルロナンを合成する。これらのタバコ植物により合成される最高量のヒアルロナンは、測定のために使用される植物材料の新鮮重量１グラム当たり約０．０３%である（ＷＯ ２００７ ０３９３１６における図５を参照のこと）。
【００１３】
ＷＯ ２００７ ０３９３１６には、ヒアルロナン合成酵素の活性、ならびに、加えて、野生型植物と比較し、増加したグルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）活性、及び、増加したＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼ（ＵＤＰ−Ｇｌｃ−ＤＨ）活性を有するトランスジェニック植物が記載されている。これらの植物は、ヒアルロナン合成酵素の活性及び同時にＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の活性を有する植物と比較し、増加量のヒアルロナンを合成する。これらのタバコ植物により合成される最高量のヒアルロナンは、測定のために使用される植物材料の新鮮重量１グラム当たり約０．２%である（ＷＯ ２００７ ０３９３１６における図６を参照のこと）。
【００１４】
さらに、ＷＯ ２００７ ０３９３１６には、植物細胞において発現されて、植物細胞においてヒアルロナンの合成量をさらに増加できるタンパク質のリストが含まれている。ＷＯ ２００７ ０３９３１６において提示されるタンパク質は、種々の生物において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成に関与する酵素の無作為なリストである。ＷＯ ２００７ ０３９３１６に列挙されるタンパク質は種々の酵素機能を有する。ＷＯ ２００７ ０３９３１６は、列挙される酵素が、トランスジェニック植物において発現された場合に、実際にヒアルロナン含量を増加させうるか否か、及び、それがいずれの酵素であるのかの示唆を与えていない。
【００１５】
コンドロイチン／デルマタン（［ベータ−１，４）］−［グルクロン酸−ベータ−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン］ｎ）の二糖鎖の合成は、コンドロイチン合成酵素により触媒され、ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、即ち、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）のエピマーから開始される（Kitagawa et al., 2001, J Biol Chem 276(42), 38721-38726）。エピメラーゼにより、コンドロイチンのグルクロン酸分子をイズロン酸に変換できる。グルクロン酸分子の１０%超がイズロン酸として存在する場合、ポリマーをデルマタンと呼ぶ。コンドロイチン又はデルマタンの二糖鎖の種々の位置での硫酸基の導入は、次に、他の酵素により触媒され、コンドロイチン／デルマタン硫酸の形成をもたらす。ここで、硫酸化の程度は分子ごとに異なりうる。
【００１６】
しばらくの間、コンドロイチン硫酸は、変形性関節症の処置のための潜在的な活性化合物として検討されてきた（Clegg et al., 2006, The New England Journal of Medicine 354(8), 795-808）。
【００１７】
ヘパリン／ヘパラン（ヘパロサン）（［アルファ−１，４］−［グルクロン酸−ベータ−１，４−グルコサミン］n又は［アルファ−１，４］−［イズロン酸−アルファ−１，４−グルコサミン］n）の二糖鎖の合成は、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素により触媒され、ＵＤＰ−ＧｌｃＡ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから開始される（DeAngelis and White, 2004, J. Bacteriology 186(24), 8529-8532）。ヘパロサンのグルクロン酸分子をエピメラーゼによりイズロン酸に変換できる。ヘパロサンの二糖鎖の種々の位置での硫酸基の導入は、次に、他の酵素により触媒され、ヘパリン又はヘパラン硫酸の形成をもたらす。ヘパリン硫酸は、ヘパラン硫酸よりも大幅に高い硫酸基による置換を有する。ヘパリン硫酸は約９０%のイズロン酸分子を有するが、ヘパラン硫酸において、グルクロン酸分子が優勢である（Gallagher et al., 1992, Int. J. Biochem 24, 553-560）。コンドロイチン／デルマタン硫酸の場合のように、ヘパリン／ヘパラン硫酸の場合においても、硫酸化の程度は分子ごとに異なりうる。
ヘパリン硫酸を、とりわけ、抗凝固剤として、例えば、血栓症の予防及び処置のために使用する。
【００１８】
現在、コンドロイチン／デルマタン硫酸及びヘパリン／ヘパラン硫酸は、動物組織からの単離により調製される。コンドロイチン硫酸は主にウシ軟骨又はサメ軟骨から単離され、ヘパリン／ヘパラン硫酸はブタ腸又はウシ肺から単離される。コンドロイチン／デルマタン硫酸及びヘパリン／ヘパラン硫酸の二糖鎖は均一な硫酸化パターンを有さないため、均一な特定の産物を得ることは困難である。したがって、産物は常に種々の硫酸化の程度を有する分子の混合物である。既に記載した通り、グルコサミノグリカン、例えば、コンドロイチン硫酸又はヘパリン／ヘパラン硫酸が、現在、動物組織から単離される。所望の物質に加えて、これらの組織は他のグルコサミノグリカンも含む。個々のグルコサミノグリカンの分離は、仮に可能な場合でも、困難で費用がかかる。さらに、病原性微生物による、及び／又は、他の物質、例えば、ＢＳＥ又は鳥インフルエンザ病原体による動物組織の潜在的な汚染は、ヒトにおいて疾患を招きうるが、動物組織から単離されたグルコサミノグリカンを使用した場合に問題を引き起こす。患者において、動物タンパク質により汚染された医薬調製物の使用は、特に、患者が動物タンパク質にアレルギーを持つ場合、身体の不要な免疫学的反応をもたらしうる（ヒアルロナン調製物については、例えば、ＵＳ ４，１４１，９７３を参照のこと）。
また、動物原材料から調製された物質は、例えば、完全菜食主義者などの一部の生活方法において、又は、コーシャー食品の調製において許容できない。
動物組織からのグルコサミノグリカンの単離におけるさらなる問題は、動物組織がグルコサミノグリカン分解酵素も含むため、頻繁にグルコサミノグリカンの分子量が精製中に低下する効果にある。
動物組織から満足できる質及び純度で得ることのできるグルコサミノグリカンの量（収量）は低く（例えば、ケイトウからのヒアルロナン：０．０７９% w/w、ＥＰ ０１４４０１９、ＵＳ ４，７８２，０４６）、それは多量の動物組織が加工されなければならないことを意味する。
細菌株の発酵によるグルコサミノグリカンの産生は高コストと関連する。なぜなら、細菌を、費用がかかる制御培養条件下で密封された無菌容器内で発酵させなければならないからである（例えば、ヒアルロナンについて、ＵＳ ４，８９７，３４９を参照のこと）。さらに、細菌株の発酵により産生できるグルコサミノグリカンの量は、各場合において存在する産生設備により制限される。ここで、発酵槽が、物理法則の結果、過剰に大きな培養容積で構築できないことも考慮に入れなければならない。ここで、外から供給された物質の均質な混合について特に言及してよく（例えば、細菌のための必須栄養源、ｐＨを調節するための試薬、酸素）、効率的な産生に必要な培地は、大きな発酵槽中で、仮にある場合でも、大きな技術的出費を伴ってだけ確実にできる。
【００１９】
植物は、グルコサミノグリカン、例えば、ヒアルロナン、ヘパラン／ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、又はコンドロイチン／デルマタン硫酸を自然で産生しない。自然発生的な植物自体は、それらのゲノム中に、グルコサミノグリカンの合成を触媒するタンパク質をコードする任意の核酸を有さないが、多数の植物炭水化物が記載され、特性付けされてきたが、今までに、非感染自然植物細胞において言及したグルコサミノグリカンのいずれも検出することが可能ではない（Graves et al., 1999, Virology 257, 15-23）。
【００２０】
ＷＯ ９８ ３５０４７（ＵＳ ６，４４４，８７８）には、植物細胞におけるＧｌｃＮＡｃの合成のための代謝経路が記載されており、そこでは、グルコサミンが、複数の連続的な酵素触媒反応工程を経て、代謝産物ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチル−グルコサミン６−リン酸、及びＮ−アセチル−グルコサミン１−リン酸の形成を伴い、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換される。高濃度で、グルコサミン６−リン酸は植物細胞に有毒である（ＷＯ ９８ ３５０４７）。
植物について記載される代わりの代謝経路は、フルクトース６−リン酸及びグルタミンの反応を含み、グルコサミン６−リン酸を与え、それは続いて多数の連続的な酵素触媒反応工程を経て、代謝産物グルコサミン１−リン酸及びＮ−アセチル−グルコサミン１−リン酸の形成を伴い、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換される（Mayer et al., 1968, Plant Physiol. 43, 1097-1107）。
【００２１】
今日まで、植物が増加量のグルコサミノグリカンを合成するために、植物中でのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成のための代謝経路においてどのタンパク質活性を修飾しなければならないかは、依然として明らかではない。
【００２２】
したがって、植物において効率的な量のグルコサミノグリカンを調製するための代わりの手段及び方法を提供することが本発明の目的である。
【００２３】
この目的は、特許請求の範囲において言及する実施態様により達成される。
【００２４】
驚くべきことに、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする核酸分子を含み、及び、加えて、グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子、及び単機能性のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼの活性を含むタンパク質をコードする外来核酸分子を含む遺伝子改変植物細胞又は遺伝子改変植物が、グルコサミノグリカン合成酵素の活性（だけ）を有する植物細胞又は植物よりも有意に高い量のグルコサミノグリカンを産生することが見出されている。
【００２５】
このように、本発明は、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子を含む遺伝子改変植物細胞又は遺伝子改変植物に関し、遺伝子改変植物細胞又は遺伝子改変植物が、加えて、グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子及び単機能性のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を含むことを特徴とする。
【００２６】
細菌株の発酵によるグルコサミノグリカンの産生は高コストと関連する。なぜなら、細菌を、費用がかかる制御培養条件下で密封された無菌容器内で発酵させなければならないからである（例えば、ＵＳ ４，８９７，３４９を参照のこと）。さらに、細菌株の発酵により産生できるグルコサミノグリカンの量は、各場合において存在する産生設備により制限される。例えば、現在市販されているヒアルロナンの高コストは、このグルコサミノグリカンが、その特別な特性（例えば、粘弾性特性、水を結合する高い能力）にもかかわらず、工業的用途には利用可能ではない。
このように、グルコサミノグリカンを産生するための公知の手段と比較し、本発明の植物細胞及び本発明の植物は、それらが、グルコサミノグリカン合成酵素の活性だけを含む植物細胞又は植物と比較し、増加量のグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を合成するという利点を提供する。
【００２７】
ここで、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物の遺伝子改変は、任意の遺伝子改変でよく、植物細胞又は植物中への、グルコサミン合成酵素をコードする外来核酸分子の組込み及びグルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子の組込み及び単機能性のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子の組込みをもたらす。
【００２８】
本発明に関連して、「グルコサミノグリカン合成酵素」という用語は、基質ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルドヘキソサミン（ＵＤＰ−ＡｌｄｏｈｅｘＮＡｃ）からグルコサミノグリカンを合成するタンパク質を意味すると理解すべきである。グルコサミノグリカンの触媒作用は、以下の一般的な反応スキームに従って起こる：
ｎＵＤＰ−ＧｌｃＡ ＋ ｎＵＤＰ−ＡｌｄｏｈｅｘＮＡｃ → ［ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ］ｎ ＋ ２ ｎＵＤＰ
【００２９】
好ましくは、上の反応順序で調製されたＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルドヘキソサミンは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン又はＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミンである。
【００３０】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の植物細胞又は本発明の植物に関し、ここでグルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子は、ヒアルロナン合成酵素又はコンドロイチン合成酵素又はヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする。
【００３１】
本発明に関連して、「ヒアルロナン合成酵素」（ＥＣ ２．４．１．２１２）という用語は、基質ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）及びＵＤＰＮ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からヒアルロナンを合成するタンパク質を意味すると理解すべきである。ヒアルロナンの合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ｎＵＤＰ−ＧｌｃＡ ＋ ｎＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ → ベータ−１，４−［ＧｌｃＡ−ベータ−１，３−ＧｌｃＮＡｃ］ｎ ＋ ２ ｎＵＤＰ
【００３２】
今までに試験されてきたヒアルロナン合成酵素は、２つのグループに分類できる：クラスＩのヒアルロナン合成酵素及びクラスＩＩのヒアルロナン合成酵素（DeAngelis, 1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences 56, 670-682）。脊椎動物からのヒアルロナン合成酵素は、同定されたアイソザイムによりさらに識別される。種々のアイソザイムが、アラブ数字により、それらの同定の順番で呼ばれる（例えば、ｈｓＨＡＳ１、ｈｓＨＡＳ２、ｈｓＨＡＳ３）。
【００３３】
ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子及び対応するタンパク質配列が、とりわけ、以下の生物について記載されている：ウサギ（カイウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ））ｏｃＨａｓ２（ＥＭＢＬ ＡＢ０５５９７８．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｏｃＨａｓ３（ＥＭＢＬ ＡＢ０５５９７９．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；ヒヒ（アヌビスヒヒ（Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｉｓ））ｐａＨａｓ１（ＥＭＢＬ ＡＹ４６３６９５．１）；カエル（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ））ｘｌＨａｓ１（ＥＭＢＬ Ｍ２２２４９．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｘｌＨａｓ２（ＤＧ４２）（ＥＭＢＬ ＡＦ１６８４６５．１）、ｘｌＨａｓ３（ＥＭＢＬ ＡＹ３０２２５２．１）；ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））ｈｓＨＡＳ１（ＥＭＢＬ Ｄ８４４２４．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｈｓＨＡＳ２（ＥＭＢＬ Ｕ５４８０４．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｈｓＨＡＳ３（ＥＭＢＬ ＡＦ２３２７７２．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；マウス（ムス・ムスクスル（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））ｍｍＨａｓ１（ＥＭＢＬ Ｄ８２９６４．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｍｍＨＡＳ２（ＥＭＢＬ Ｕ５２５２４．２， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｍｍＨａｓ３（ＥＭＢＬ Ｕ８６４０８．２， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；ウシ（ボス・タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ））ｂｔＨａｓ２（ＥＭＢＬ ＡＪ００４９５１．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；トリ（ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ））ｇｇＨａｓ２（ＥＭＢＬ ＡＦ１０６９４０．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；ラット（ラッタス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ｒｎＨａｓ １（ＥＭＢＬ ＡＢ０９７５６８．１， Ｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（１８） １８６７９−１８６７８）、ｒｎＨａｓ２（ＥＭＢＬ ＡＦ００８２０１．１）；ｒｎＨａｓ ３（ＮＣＢＩ ＮＭ＿１７２３１９．１， Ｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（１８） １８６７９−１８６７８）、ウマ（エクウス・キャバルス（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ））ｅｃＨＡＳ２（ＥＭＢＬ ＡＹ０５６５８２．１， ＧＩ：２３４２８４８６）、ブタ（サス・スクローファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ））ｓｓｃＨＡＳ２（ＮＣＢＩ ＮＭ＿２１４０５３．１， ＧＩ：４７５２２９２１）、ｓｓｃＨａｓ ３（ＥＭＢＬＡＢ１５９６７５）、ゼブラフィッシュ（ゼブラ・ダニオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ））ｂｒＨａｓ１（ＥＭＢＬ ＡＹ４３７４０７）、ｂｒＨａｓ２（ＥＭＢＬ ＡＦ１９０７４２．１） ｂｒＨａｓ３（ＥＭＢＬ ＡＦ１９０７４３．１）；パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）ｐｍＨａｓ（ＥＭＢＬ ＡＦ０３６００４．２）；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｓｐＨａｓ（ＥＭＢＬ， Ｌ２０８５３．１， Ｌ２１１８７．１， ＵＳ ６，４５５，３０４， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；ストレプトコッカス・エクイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓ）ｓｅＨａｓ（ＥＭＢＬ ＡＦ３４７０２２．１， ＡＹ１７３０７８．１）、ストレプトコッカス・ユベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）ｓｕＨａｓＡ（ＥＭＢＬ ＡＪ２４２９４６．２， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）ｓｅｑＨａｓ（ＥＭＢＬ ＡＦ０２３８７６．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ｓｓＨＡＳ（ＵＳ ２００３０２３５８９３）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）ｓｔＨａｓ（ＡＰ０００９８８．１）、パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ １）ｃｖＨＡＳ（ＥＭＢＬ Ｕ４２５８０．３， ＰＢ４２５８０， ＵＳ ２００３０２３５８９３）。
【００３４】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでグルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする。ヒアルロナン合成酵素をコードする問題になっている外来核酸分子は、好ましくは、ウイルスヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子である。好ましくは、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、藻類に感染するウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードする。
藻類感染ウイルスに関し、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、好ましくは、クロレラ感染ウイルスのヒアルロナン合成酵素、特に好ましくはパラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１のヒアルロナン合成酵素、及び、特に好ましくはＨ１株のパラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードする。
好ましくは、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とし、そのアミノ酸配列は少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号２の下に示すアミノ酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それが配列番号２の下に示すアミノ酸配列を有するヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号１又は配列番号３の下に示す核酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それが配列番号３の下に示す核酸配列を有すること、又は、外来核酸分子の配列が、遺伝コードの縮重のため、配列番号１又は３の下に示す核酸配列とは異なることを特徴とする。
【００３５】
２００４年８月２５日、パラメシウム・ブルサリア・クロレラウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードする合成核酸分子を含むプラスミドＩＣ ３４１−２２２を、番号ＤＳＭ１６６６４の下、ブダペスト条約に従い、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunswick, Germany）に寄託した。配列番号２の下に示すアミノ酸配列は、プラスミドＩＣ ３４１−２２２に組込まれた核酸配列のコード領域に由来しうるが、パラメシウム・ブルサリア・クロレラウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードする。
【００３６】
したがって、本発明は、また、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子が、それが、そのアミノ酸配列がプラスミドＤＳＭ１６６６４中に挿入された核酸配列のコード領域に由来しうるタンパク質をコードすること、又は、それが、そのアミノ酸配列が少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、プラスミドＤＳＭ１６６６４中に挿入された核酸配列のコード領域に由来しうるアミノ酸配列と同一であるタンパク質をコードすることを特徴とする。
本発明は、また、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子が、それがプラスミドＤＳＭ１６６６４中に組込まれたヒアルロナン合成酵素コード核酸配列であること、又は、それが、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、プラスミドＤＳＭ１６６６４中に組込まれた核酸配列と同一であることを特徴とする。
【００３７】
本発明に関連して、「コンドロイチン合成酵素」（ＥＣ ２．４．１．１７５， ＥＣ １．４．１．２２６）という用語は、基質ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）からコンドロイチンを合成する２つのタンパク質からなるタンパク質又はタンパク質複合体を意味すると理解すべきである。コンドロイチンの合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ｎＵＤＰ−ＧｌｃＡ ＋ ｎＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ → ベータ−１，４−［ＧｌｃＡ−ベータ−１，３−ＧａｌＮＡｃ］ｎ ＋ ２ ｎＵＤＰ
【００３８】
一部の生物において、プロテオグリカンに付着したコンドロイチン分子の伸長は、２つの異なるタンパク質からなるコンドロイチン合成酵素の酵素複合体により触媒される。２つのタンパク質の１つ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＥＣ ２．４．１．１７５）は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンモノマーをベータ−１，４−付着を介して加え、第２タンパク質、Ｎ−アセチルガラクトサミニル−プロテオグリカン３−ベータ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２６）は、グルクロン酸モノマーをベータ−１，３−付着を介してコンドロイチン分子に加える。しかし、当業者は二機能性タンパク質にも精通しており、ここで単一のタンパク質がＮ−アセチル−ガラクトサミンモノマー及びグルクロン酸モノマーの両方をコンドロイチン分子に加える。
【００３９】
さらなる好ましい実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでグルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがコンドロイチン合成酵素をコードすることを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様は、本発明の植物細胞又は本発明の植物に関し、ここでコンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンモノマー及びグルクロン酸モノマーの両方をコンドロイチン分子に付着する二機能性コンドロイチン合成酵素をコードする。
【００４０】
本発明に関連して、「二機能性コンドロイチン合成酵素」という用語は、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＥＣ ２．４．１．１７５）の活性及びアセチルガラクトサミニル−プロテオグリカン３−ベータ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２６）の活性が１分子中に存在するタンパク質を意味すると理解すべきである。
【００４１】
単機能性のコンドロイチン合成酵素をコードする核酸分子及びそれに由来するアミノ酸配列が、例えば、細菌から（例えば、大腸菌、ＵＳ ２００３１０９６９３、ＥＰ １２８３２５９を参照のこと）、記載されている。
二機能性コンドロイチン合成酵素をコードする核酸分子及びそれに由来するアミノ酸配列が、例えば、哺乳動物（例えば、ホモ・サピエンス、ＷＯ ０３ ０１２０９９、ＵＳ ２００５０４８６０４、ＵＳ ２００６０５２３３５、ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＣ０４６２４７．１、ＢＣ０２３５３１．２；Kitagawa et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(42), 38721-38726）又はパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｃｏｄａ）（ＵＳ ２００３１０４６０１， ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＦ１９５５１７， DeAngelis and Padgett-McCue, 2000, J. Biol. Chem. 275(31), 24124-24129）から、記載されている。
【００４２】
コンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子は、好ましくは、細菌コンドロイチン合成酵素をコードする、好ましくはパスツレラからのコンドロイチン合成酵素をコードする、特に好ましくはパスツレラ・マルトシダからのコンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子である。
好ましくは、コンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがコンドロイチン合成酵素をコードすることを特徴とし、そのアミノ酸配列は少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号５の下に示すアミノ酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、コンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それが配列番号５の下に示すアミノ酸配列を有するコンドロイチン合成酵素をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、コンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子は、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号４の下に示す核酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、コンドロイチン合成酵素をコードする核酸分子は、それが配列番号４の下に示す核酸配列を有すること、又は、外来核酸分子の配列が、遺伝コードの縮重のため、配列番号４の下に示す核酸配列とは異なることを特徴とする。
【００４３】
本発明に関連して、「ヘパリン／ヘパロサン合成酵素」又は「ヘパロサン合成酵素」（ＥＣ ２．４．１．２２４， ＥＣ ２．４．１．２２５）という用語は、基質ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からヘパリン／ヘパランを合成する２つのタンパク質からなるタンパク質又は酵素複合体を意味すると理解すべきである。ヘパリン／ヘパランの合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ｎＵＤＰ−ＧｌｃＡ ＋ ｎＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ → アルファ−１，４−［ＧｌｃＡ−ベータ−１，４−ＧｌｃＮＡｃ］ｎ ＋ ２ ｎＵＤＰ
【００４４】
ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする核酸分子及びそれに由来するアミノ酸配列が、例えば、細菌から（パスツレラ・マルトシダＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏｓ： ＡＦ４２５５９１， ＡＦ４３９８０４， ＡＹ２９２１９９， ＡＹ２９２２００， ＵＳ ２００３００９９９６７， 大腸菌ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： Ｘ７７６１７．１）又はヒトから（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏｓ： ＢＣ００１１７４．１， ＮＭ＿２０７１２２．１）、記載されている。
【００４５】
一部の生物において、プロテオグリカンに付着したヘパリン／ヘパロサン分子の伸長は、２つの異なるタンパク質からなるヘパリン／ヘパロサン合成酵素の酵素複合体により触媒される。２つのタンパク質の１つ、グルクロノシル−Ｎ−アセチルグルコサミニル−プロテオグリカン４−アルファ−Ｎ−グルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２４）は、Ｎ−アセチル−グルコサミンモノマーをベータ−１，４−付着を介して加え、第２タンパク質、Ｎ−アセチルグルコサミニル−プロテオグリカン４−ベータ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２５）は、グルクロン酸モノマーをベータ−１，３−付着を介してヘパリン／ヘパラン分子に加える。しかし、当業者は二機能性タンパク質にも精通しており、ここで単一のタンパク質はＮ−アセチル−グルコサミンモノマー及びグルクロン酸モノマーの両方をヘパリン／ヘパロサン分子に加える。そのような二機能性ヘパリン／ヘパロサン合成酵素が、例えば、ヒトから（Busse and Kusche-Gullberg, 2003, J. Biol. Chem. 278(42), 41333-41337）又はパスツレラから（DeAngelis and White, 2004, J. Bacteriology 186(24), 8529-8532）、記載されている。ヘパリン／ヘパロサン合成酵素の活性を有する二機能性タンパク質は、ＥＣ番号２．４．１．２２４の下に分類される酵素の活性及びＥＣ番号２．４．１．２２５の下に分類される酵素の活性の両方を有する。
【００４６】
さらなる好ましい実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでグルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードすることを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様は、本発明の植物細胞又は本発明の植物に関し、ここでヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子は、Ｎ−アセチル−グルコサミンモノマー及びグルクロン酸モノマーをヘパリン／ヘパラン分子に付着させる二機能性ヘパリン／ヘパラン合成酵素をコードする。
ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子は、好ましくは細菌ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする、好ましくはパスツレラからのヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする、特に好ましくはパスツレラ・マルトシダからのヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子である。
【００４７】
好ましくは、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードすることを特徴とし、そのアミノ酸配列は少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号７の下に示すアミノ酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それが配列番号７の下に示すアミノ酸配列を有するヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子は、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号６の下に示す核酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする核酸分子は、それが配列番号６の下に示す核酸配列を有すること、又は、外来核酸分子の配列が、遺伝コードの縮重のため、配列番号６の下に示す核酸配列とは異なることを特徴とする。
【００４８】
本発明に関連して、「グルコサミンリン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（アセチル−ＣｏＡ：Ｄ−グルコサミンリン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ又はＧｌｃＮ−Ｐアセチルトランスフェラーゼ）」（ＥＣ ２．３．１．４）という用語は、基質Ｄ−グルコサミンリン酸（ＧｌｃＮ−Ｐ）及びアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンリン酸（ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ）を合成するタンパク質を意味すると理解すべきである。Ｎ−アセチル−グルコサミン６−リン酸の合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ＧｌｃＮ−Ｐ ＋ ＡｃＣｏＡ → ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ ＋ ＣｏＡＳＨ
【００４９】
示した反応方程式において、基質ＧｌｃＮ−Ｐはグルコサミン１−リン酸（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）又はグルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）のいずれかでありうる。
【００５０】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンの合成のための問題になっている代謝経路において、試験された細菌生物と真核生物の間の本質的な違いは、問題になっている代謝経路の異なる中間体をアセチル化反応の基質として使用することである。細菌生物において、ＧｌｃＮ−１−Ｐのアセチル化は、ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１５７）の活性を有するタンパク質により行われるが（Gehring et al., 1996, Biochemistry 35, 579-585）、真核動物又は菌類において、ＧｌｃＮ−６−Ｐのアセチル化は、グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．４）の活性を有するタンパク質により触媒される（Milewski et al., 2006, Yeast 23, 1-14、Wiley InterScience, DOI: 10.1002./yea.1337にオンラインで発表）。したがって、異なる生物において、異なる基質及び異なるタンパク質の両方をＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成のために使用する。
驚くべきことに、先行技術における開示（ＷＯ ２００７ ０２３６８２）とは対照的に、ＧｌｃＮ−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする任意の核酸分子を植物細胞中に導入することにより植物細胞において合成されるグルコサミノグリカンの量を増加させることは可能ではないことが見出されている。むしろ、ＧｌｃＮ−１−Ｐ（例えば、大腸菌からのｇｌｍｕ）をアセチル化するＧｌｃＮ−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子の導入によって植物細胞又は植物により合成されるグルコサミノグリカンの量における増加はもたらされないことが見出されている。したがって、本発明の植物細胞又は本発明の植物のために、外来核酸分子が、ＧｌｃＮ−６−Ｐをアセチル化反応のための基質として使用し、このためＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．４）の活性を有するタンパク質であるＧｌｃＮ−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードすることが必須である。対照的に、ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１５７）の活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、アセチル化反応のためにＧｌｃＮ−１−Ｐを使用し、本発明の植物細胞又は本発明の植物を産生するために適さない。
さらに、グルコサミン６−リン酸ムターゼ（ＧｌｃＮ−６−Ｐムターゼ）をコードする外来核酸分子を有する植物細胞又は植物は、ＧｌｃＮ−６−ＰのＧｌｃＮ−１−Ｐへの異性化を触媒し、有意に高い量のグルコサミノグリカンを合成しないことが見出されている。
【００５１】
本発明に関連して、「グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（アセチル−ＣｏＡ：Ｄ−グルコサミン６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼ）」（ＥＣ ２．３．１．４）という用語は、基質Ｄ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）及びアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）を合成するタンパク質として理解されるように意味する。Ｎ−アセチル−グルコサミン６−リン酸の合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ＧｌｃＮ−６−Ｐ ＋ ＡｃＣｏＡ → ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ ＋ ＣｏＡＳＨ
【００５２】
ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有する機能的形態のタンパク質は、ホモダイマーである。モノマーの三次構造は中央コア領域を有する。このコア領域は、４つのアルファ−ヘリックス及び６番目のベータ鎖（ベータ−６鎖）により囲まれた、５つの逆平行鎖（ベータ鎖１〜５）を有するベータ−シート構造からなる。ホモダイマーの形成中、サブユニットのベータ−６鎖と、それぞれの他のサブユニットの対応するベータ−６鎖との相互作用が存在する。
配列番号９の下に示すアミノ酸配列（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２６．１）は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする。配列番号９の下に示すアミノ酸配列において、アミノ酸７〜１１はベータ−１鎖を形成し、アミノ酸１３〜２６はアルファ−１鎖を形成し、アミノ酸３７〜４７はアルファ−２鎖を形成し、アミノ酸６２〜６９はベータ−２鎖を形成し、アミノ酸７４〜８６はベータ−３鎖を形成し、アミノ酸９２〜１０３はベータ−４鎖を形成し、アミノ酸１１１〜１２５はアルファ−３鎖を形成し、アミノ酸１３０〜１３６はベータ−５鎖を形成し、アミノ酸１３９〜１４６はアルファ−３鎖を形成し、そして、アミノ酸１５４〜１５９はベータ−６鎖を形成する。配列番号９の下に示す配列中のベータ−４鎖に存在するアミノ酸Ｇｌｕ（位置９８）、Ａｓｐ（位置９９）、及びＩｌｅ（位置１００）は、基質ＡｃＣｏＡと相互作用し、それらはそのカルボニル結合を極性化し、そして、それらはＡｃＣｏＡ及びＧｌｃＮ−６−ＰならびにＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼからなるテトラデリック（ｔｅｔｒａｅｄｒｉｃ）反応中間体においてＡｃＣｏＡの酸素原子の負電荷を安定化する。配列番号９の下に示す配列中のアミノ酸Ｔｙｒ（位置１４３）は、切除されるべきＣｏＡ分子のチオレートアニオンを安定化させる。反応の触媒作用中でのこれらの相互作用は、配列番号９の下に示す配列中のアミノ酸Ｌｅｕ（位置１３３）により支持される。反応の触媒作用中に、ＧｌｃＮ−６−Ｐは、ホモダイマーのモノマーの間に形成されるポケットにおいて結合し、ベータ−６鎖のアミノ酸残基がその形成に関与する。反応の触媒作用中に、配列番号９の下に示す配列中のアミノ酸Ａｓｐ（位置１３４）は、ＧｌｃＮ−６−Ｐのアミノ基の求核性を増加させる（Milewski et al., 2006, Wiley InterScience, www.interscience.wiley.com, DOI:10.1002/yea.1337にオンラインで発表）。問題になっている反応の触媒作用に関与するＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質のさらなるアミノ酸が、Peneff et al.（2004, J. Biological Chemistry 276(19), 16328-16334, 図１）に記載されている。
ここで、サッカロマイセス・セレビシエのアミノ酸配列について例示的な方法で、反応の触媒作用に関与するアミノ酸も、他の生物からのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において同定できる。例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２７．１）からのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列においてアミノ酸Ｇｌｕ８８、Ａｓｐ８０、Ｉｌｅ９０、Ａｓｐ１２４、及びＴｙｒ１３３が存在する。
【００５３】
ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子及び対応するタンパク質配列が、とりわけ、以下の生物について記載されている：サッカロマイセス・セレビシエ（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２６．１）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２９．１）、カンジダ・アルビカンス（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２７．１）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＥ６２７５６．１）、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿０７３２５３．４， ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＡ６３４９７．１， ＣＡＡ０４４５３１．１）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＡＬ１３９１６．１）、ゼノパス・トロピカリス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒａｏｐｉｃａｌｉｓ）（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＣＲ７６００２１．２）、ムス・ムスクスル（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＥ３９８８６．１）、ホモ・サピエンス（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＣ０３４８２．１）、オランウータン（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＣＲ８５８９９６．１）、アカントアモエバ・ポリファガ・ミミウイルス（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＡＶ５０５８６．１）。既に記載した通り、反応の触媒反応に関与するアミノ酸残基は、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有する種々の生物に由来するタンパク質において保存されているが、一部の場合において、それらの配列は互いに非常低い同一性を有する。このように、サッカロマイセス・セレビシエ（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２６．１）からのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列は、カンジダ・アルビカンス（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２７．１）からの対応する配列とわずか４４%同一であり、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２９．１）からのものとわずか２５%の同一性を有する（Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ， ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ， ＤＯＩ：１０．１００２／ｙｅａ．１３３７にオンラインで発表）。問題になっているアミノ酸配列の互いの低い同一性にもかかわらず、ＧｌｃＮ−６−Ｐ−アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする全ての上記の配列が、本発明の植物細胞又は本発明の植物の産生に適する。
【００５４】
本発明に従い、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、任意の生物に由来しうる；好ましくは、核酸分子は、菌類、動物又は植物に、特に好ましくは菌類及び特に好ましくはサッカロマイセス・セレビシエに由来する。
好ましくは、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼをコードする外来核酸分子は、それがＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼをコードすることを特徴とし、そのアミノ酸配列は少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号９の下に示すアミノ酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、それが配列番号９の下に示すアミノ酸配列を有するＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号８の下に示す核酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸分子は、それが配列番号８の下に示す核酸配列を有すること、又は、外来核酸分子の配列が、遺伝コードの縮重のため、配列番号８の下に示す核酸配列とは異なることを特徴とする。
【００５５】
本発明に関連して、「ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ（２−アセトアミド−２−デオキシ−ｄ−グルコース１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）（ＥＣ ２．７．７．２３）」という用語は、基質ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）からＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を合成するタンパク質を意味すると理解すべきである。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ＵＴＰ ＋ ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ ⇔ Ｐ−Ｐ ＋ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
【００５６】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する原核生物タンパク質は、一般的に、二機能性タンパク質であり、上に示す反応（ＥＣ ２．７．７．２３）に加えて、グルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．１．１５７）の機能を有する。即ち、それらは、グルコサミン１−リン酸（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）のＮ−アセチル−グルコサミン１−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）へのＮ−アセチル化（ＧｌｃＮ−１−Ｐ ＋ ＡｃＣｏＡ → ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ ＋ ＣｏＡＳＨ）を触媒する（Gehring et al., 1996, Biochemistry 35, 579-585）。対照的に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する真核生物タンパク質は、上に記載した反応（ＵＴＰ ＋ ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ ⇔ Ｐ−Ｐ ＋ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を触媒するだけの単機能性タンパク質である（Mio et al., 1998, J. Biol. Chem. 273 (23), 14392-14397）。
【００５７】
本発明に関連して、「ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する単機能性タンパク質」という用語は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質について上に示す反応（ＵＴＰ ＋ ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ ⇔ Ｐ−Ｐ ＋ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を触媒するタンパク質を意味すると理解すべきである。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する単機能性タンパク質は、ＧｌｃＮ−１−ＰのＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐへのアセチル化を触媒する（追加の）活性を有さない。したがって、ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する単機能性タンパク質は、従って、ＥＣ番号２．７．７．２３の下に分類されるタンパク質であるが、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する二機能性タンパク質は、ＥＣ番号２．７．７．２３の下に分類される酵素の活性及びＥＣ番号２．３．１．１５７の下に分類される酵素の活性の両方を有する。
【００５８】
驚くべきことに、先行技術における開示（例えば、ＷＯ ２００７ ０２３６８２）とは対照的に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性及びＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性（例えば、ｇｌｍＵ ａｕｓ Ｅ． ｃｏｌｉ、ＥＣ ２．７．７．２３及びＥＣ ２．３．１．１５７）を有する二機能性タンパク質をコードする外来核酸分子を有する、本発明の植物細胞又は本発明の植物は、増加量のグルコサミノグリカンを合成しないことが見出されている。したがって、本発明の植物細胞又は本発明の植物のために、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードする外来核酸分子が、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ（ＥＣ ２．７．７．２３）の活性を有する単機能性タンパク質をコードすることが必須である。したがって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードする外来核酸分子は、先ほど言及したＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性に加えて、ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１５７）の追加活性を有するタンパク質をコードする必要なない。このように、それは、好ましくは、真核生物由来の外来核酸分子である。さらに、驚くべきことに、先行技術における開示（例えば、ＷＯ ２００７ ０２３６８２）とは対照的に、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質の発現及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質の発現に加えて、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｐムターゼ、ＥＣ ５．４．２．３）の発現は、植物細胞又は植物においてさらなる増加量のグルコサミノグリカンをもたらさないことが見出されている。
【００５９】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する単機能性タンパク質をコードするアミノ酸配列は、タンパク質の間で高度に保存されているアミノ酸残基を含む。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する真核生物タンパク質をコードするアミノ酸配列は、各々の場合において、タンパク質の間で保存されている３つのドメインを有する。第１ドメインのコンセンサス配列は、ＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸｘｘＴｈｒＡｒｇＬｅｕＧｌｙＸｘｘＸｘｘＸｘｘＰｒｏＬｙｓＧｌｙ（配列番号１１の下に示す配列中のアミノ酸１１１〜１２４）、第２ドメインのそれはＰｒｏ（Ａｓｐ又はＡｓｎ）ＧｌｙＡｓｎ（Ｇｌｙ又はＡｌａ）ＧｌｙＸｘｘＸｘｘＸｘｘＡｌａ（配列番号１１の下に示す配列中のアミノ酸２１９〜２２８）、そして、第３ドメインのそれはＬｙｓＸｘｘＧｌｕＸｘｘＰｈｅＸｘｘＰｈｅＡｓｐＸｘｘＰｈｅ（配列番号１１の下に示す配列中のアミノ酸３７７〜３８６）、ここでＸｘｘは任意のアミノ酸である。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する原核生物タンパク質（例えば、ｇｌｍＵ ａｕｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＥＡＹ４６９４９．１）は、真核生物からの対応するタンパク質の第１ドメインと類似の保存ドメイン（ＧｌｙＸｘｘＧｌｙＴｈｒ（Ａｒｇ又はＳｅｒ）ＸｘｘＸｘｘＸｘｘＸｘｘＰｒｏＬｙｓ）を有する。真核生物タンパク質のドメイン２及び３について、対応するドメインは原核生物タンパク質において見出されない（Mok and Edwards, 2000, J. Biol. Chem. 280(47), 39363-39372）。
【００６０】
配列番号１１の下に示すアミノ酸配列中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１２）、Ｇｌｙ（位置１１４）、Ｔｈｒ（位置１１５）、Ａｒｇ（位置１１６）、Ｐｒｏ（位置１２２）、及びＬｙｓ（位置１２３）は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする一次配列中で保存されている。配列番号１１の下に示すアミノ酸配列中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１２）、Ａｒｇ（位置１１６）、又はＬｙｓ（位置１２３）の交換は、実質的に不活性なタンパク質をもたらす。対照的に、配列番号１１の下に示すアミノ酸配列中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１４）、Ｔｈｒ（位置１１５）、又はＰｒｏ（位置１２２）の交換は、問題になっているタンパク質の活性の低下だけを示す。したがって、配列番号１１の下に示すアミノ酸配列中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１２）、Ａｒｇ（位置１１６）、及びＬｙｓ（位置１２３）は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質において触媒機能を有するアミノ酸である（Mio et al., 1998, J. Biol. Chem. 273(23), 14392-14397）。
【００６１】
ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＡＭ５４７０２．１）からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において、アミノ酸Ｇｌｙ（位置１０８）は、配列番号１１の下に示す配列のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１２）に対応する。ランブル鞭毛虫からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列における、アミノ酸Ａｌａを介した、アミノ酸Ｇｌｙ（位置１０８）の交換も、タンパク質の活性のほぼ完全な低下をもたらす（Mok and Edwards, 2005, J. Biol. Chem. 280(47), 39363-39372）。ホモ・サピエンス（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＡ３１２０２．１）からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列におけるアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１１）（配列番号１１の下に示す配列中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１２）に対応する）の交換も、活性のほぼ完全な低下をもたらす（Wang-Gillam et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(2), 1433-1438）。ホモ・サピエンス（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＡ３１２０２）からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードするタンパク質中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置２２２）及びランブル鞭毛虫（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＡＭ５４７０２．１）から対応するタンパク質の対応するアミノ酸Ｇｌｙ（位置２１０）の交換は、両方の場合において同様に、活性のほぼ完全な低下をもたらし、言及したアミノ酸が、同様に、触媒作用に関与するアミノ酸であることを示す（Mok and Edwards, 2005, J. Biol. Chem. 280(47), 39363-39372）。ホモ・サピエンス（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＡ３１２０２）からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードするタンパク質中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置２２４）の交換は、タンパク質の活性の大幅な、しかし、完全ではない喪失をもたらし、アミノ酸Ｐｒｏ（位置２２２）の交換は活性のわずかな低下だけをもたらす。このことから、配列番号１１の下に示す配列のアミノ酸Ｇｌｙ（位置２２１）及びＧｌｙ（位置２２３）がＵＴＰの認識に関与し、配列番号１１の下に示す配列のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１１）及びＧｌｙ（位置１１２）は、それぞれの一次配列において保存されており、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐの結合に関与すると結論付けた（Wang-Gillam et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(2), 1433-1438）。
【００６２】
上に言及した特性を有するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの単機能性の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子及び対応するタンパク質配列は、とりわけ、以下の生物について記載されている：ランブル鞭毛虫（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＡＭ５４７０２．１）、サッカロマイセス・セレビシエ（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： Ｘ７９３８０．１， ＮＣＢＩ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ： ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ： ＣＡＡ５５７９２７）、カンジダ・アルビカンス（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＸＭ＿７１５４８０．１）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＸＭ＿００１３８５１５１．１）、ムス・ムスクスル（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿１３３８０６．４）、タイリクオオカミ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ）（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＸＭ＿８４４７７４．１）；ボス・タウルス（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿００１０４６４０４．１）、ゼノパス・トロピカリス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（ＮＭ＿００１０１１１４２．１）、アフリカツメガエル（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＣ０７７８３６．１）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿１０２８４５．４）、ゼブラ・ダニオ（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿２１２６２１．１）、ホモ・サピエンス（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿００３１１５．３， ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ．： ＢＡＡ３１２０２．１）。
【００６３】
本発明に従って、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、任意の真核生物に由来しうる；好ましくは、核酸は、真菌、動物又は植物、特に好ましくは真菌、特に好ましくはサッカロマイセス・セレビシエに由来する。
好ましくは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、それがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードすることを特徴とし、そのアミノ酸配列は少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号１１の下に示すアミノ酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、それが配列番号１１の下に示すアミノ酸配列を有するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号１０の下に示す核酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードする核酸分子は、それが配列番号１０の下に示す核酸配列を有すること、又は、外来核酸分子の配列が、遺伝コードの縮重のため、配列番号１０の下に示す核酸配列とは異なることを特徴とする。
【００６４】
本発明に関連して、「外来核酸分子」という用語は、対応する野生型植物細胞において自然発生しない、又は、野生型植物細胞において具体的な空間的配置で自然発生しない、又は、野生型植物細胞のゲノム中の、それが自然発生しない部位に局在化している、のいずれかの分子を意味すると理解すべきである。好ましくは、外来核酸分子は、組換え又は特定の空間的配置が植物細胞において自然発生しない種々のエレメントを含む組換え分子である。
【００６５】
本発明に関連して、「組換え核酸分子」という用語は、組換え核酸分子中に存在するもののような組み合わせにおいて自然に存在しない種々の核酸分子を含む核酸分子を意味すると理解すべきである。このように、組換え核酸分子は、グルコサミノグリカン合成酵素及び／又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及び／又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に加えて、また、言及した核酸分子との組み合わせにおいて自然に存在しない核酸配列を含みうる。グルコサミノグリカン合成酵素及び／又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及び／又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子との組み合わせでの組換え核酸分子に存在する言及した追加の核酸配列は、任意の配列でよい。例えば、それらは、ゲノム植物核酸配列でよい。追加の核酸配列は、好ましくは、調節配列（プロモーター、終結シグナル、エンハンサ―）、特に好ましくは植物組織において活性である調節配列、特に好ましくは植物組織において活性である組織特異的な調節配列である。組換え核酸分子を生成するための方法は、当業者に公知であり、遺伝子操作方法、例えば、ライゲーションによる核酸分子の連結、遺伝子組換え又は核酸分子のデノボ合成などを含む（例えば、Sambrok et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002)，ＩＳＢＮ：０４７１２５０９２９を参照のこと）。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様は、本発明の植物細胞又は本発明の植物に関し、その中において、外来核酸分子が植物細胞又は植物のゲノム中に安定的に組込まれる。
【００６７】
それらのゲノム中に（安定的に）組込まれた外来核酸分子、又は、それらのゲノム中に組込まれた、グルコサミノグリカン合成酵素及び／又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及び／又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする複数の核酸分子を有する遺伝子改変植物細胞及び遺伝子改変植物は、とりわけ、それらが、野生型植物細胞及び野生型植物においてそれぞれ自然発生しない外来核酸分子を含むという事実により、又は、そのような分子が、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物の、野生型植物細胞及び野生型植物においてそれぞれ発生しないゲノム中の部位（即ち、異なるゲノム環境中である）に組込まれる点において、野生型植物細胞及び野生型植物から識別できる。さらに、本発明のそのような遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物は、それらが、適宜、野生型植物細胞又は野生型植物において自然に存在するそのような分子のコピーに加えて、それらのゲノム中に組込まれた少なくとも１コピーの外来核酸分子を含む点で、非遺伝子改変野生型植物細胞及び非遺伝子改変野生型植物からそれぞれ識別できる。本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物中に導入された外来核酸分子が、野生型植物細胞又は野生型植物において既に自然に存在する追加コピーの分子である場合、本発明の遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物が、特に、この追加コピー／これらの追加コピーが、それ／それらが野生型植物細胞及び野生型植物においてそれぞれ存在しないゲノム中の部位に局在化するとの事実により、野生型植物細胞及び野生型植物からそれぞれ識別できる。
核酸分子の植物細胞及び植物のゲノム中への組込みが、遺伝的方法及び／又は分子生物学の方法により実証できる。核酸分子の植物細胞のゲノム又は植物のゲノム中への安定的な組込みは、遺伝された核酸分子を有する子孫において、安定的に組込まれた核酸分子が親世代と同じゲノム環境に存在することを特徴とする。植物細胞のゲノム又は植物のゲノムにおける核酸配列の安定的な組込みの存在は、当業者に公知の方法、とりわけ、ＲＦＬＰ分析（制限断片長多型）のサザンブロット解析（Nam et al., 1989, The Plant Cell 1, 699-705;Leister and Dean, 1993, The Plant Journal 4 (4), 745-750）を用いて、ＰＣＲに基づく方法、例えば、増幅断片の長さの差の分析（増幅断片長多型、ＡＦＬＰ）（Castiglioni et al., 1998, Genetics 149, 2039-2056;Meksem et al., 2001, Molecular Genetics and Genomics 265, 207-214;Meyer et al., 1998, Molecular and General Genetics 259, 150-160）などで、又は、制限エンドヌクレアーゼを使用して切断した増幅断片（増幅切断多型配列、ＣＡＰＳ）を使用して（Konieczny and Ausubel, 1993, The Plant Journal 4, 403-410;Jarvis et al., 1994, Plant Molecular Biology 24, 685-687;Bachem et al., 1996, The Plant Journal 9 (5), 745-753）、実証できる。
【００６８】
本発明に関連して、「野生型植物細胞」という用語は、本発明の遺伝子改変植物細胞の産生のための出発材料として役立った植物細胞を意味すると理解すべきであり、即ち、それらの遺伝情報が、導入され、そして、グルコサミノグリカン合成酵素及び／又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及び／又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の組込みをもたらす遺伝的改変は別として、本発明の遺伝子改変植物細胞のものに対応する。
【００６９】
本発明に関連して、「野生型植物」という用語は、本発明の遺伝子改変植物の産生のための出発材料として役立った植物を意味すると理解すべきであり、即ち、それらの遺伝情報が、導入され、そして、グルコサミノグリカン合成酵素及び／又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及び／又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の組込みをもたらす遺伝的改変は別として、本発明の遺伝子改変植物のものに対応する。
【００７０】
本発明に関連して、「ゲノム」という用語は、植物細胞中に存在する全遺伝物質を意味すると理解すべきである。核に加えて、他の画分（例えば、色素体、ミトコンドリア）も遺伝物質を含むことが当業者に公知である。
【００７１】
核酸分子を植物宿主細胞中に（安定的に）組込むための多数の技術を利用可能である。これらの技術は、形質転換、プロトプラスト融合、注入、ＤＮＡのエレクトロポレーション、微粒子銃アプローチによるＤＮＡの導入、及び、また、さらなる選択肢の手段として、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用したｔ−ＤＮＡでの植物細胞の形質転換を含む（“Transgenic Plants”, Leandro ed., Humana Press 2004, ISBN 1-59259-827-7の総説）。植物細胞のアグロバクテリウム媒介性の形質転換の使用は、徹底的な試験の対象であり、ＥＰ １２０５１６；Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Chapter V;Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46及びAn et al. EMBO J. 4, (1985), 277-287において網羅的に記載されている。ジャガイモの形質転換については、例えば、Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29-33を参照のこと。トマト植物の形質転換については、例えば、ＵＳ ５，５６５，３４７を参照のこと。
【００７２】
アグロバクテリウム形質転換に基づくベクターを使用した単子葉植物の形質転換も記載されている（Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506;Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282;Deng et al, Science in China 33, (1990), 28-34;Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80;May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492;Conner and Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555;Ritchie et al, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265）。単子葉植物を形質転換するための代わりのシステムは、微粒子銃アプローチを使用した形質転換（Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317 325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631）、プロトプラスト形質転換、部分的透過性細胞のエレクトロポレーション、グラスファイバーを使用したＤＮＡの導入である。特に、トウモロコシの形質転換が、文献中に数回記載されている（ＷＯ９５／０６１２８、ＥＰ０５１３８４９、ＥＰ０４６５８７５、ＥＰ０２９２４３５；Fromm et al., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon Kamm et al., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726を参照のこと）。他の草、例えば、サトウキビ（Bower and Birch, 1992, Plant Journal 2(3), 409-416; Bower et al., 1996 Molecular Breeding 2, 239-249; Arencibia et al., 1998, Transgenic Research 7, 213-222）又はアワ（Casas et al., 1993, PNAS 90, 11212-11216；ＵＳ ６，３６９，２９８）のスイッチグラス（Panicum virgatum, Somleva et al., 2002 Crop Science 42: 2080 - 2087; Richards et al., 2001, Plant Cell Reporters 20, 48-54）などの形質転換も記載されている。
他の穀物種での形質転換の成功が、また、例えば、オオムギ（Wan and Lemaux, s.o.; Ritala et al., s.o.; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74）及びコムギ（Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker et al., 1994, Plant Journal 5, 299-307）について記載されている。上の方法の全てが本発明に関して適する。
【００７３】
先行技術と比較し、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物は、それらがグルコサミノグリカン合成酵素の活性だけを有する植物よりも多量のグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を産生するという利点を提供する。これによって、ほとんど費用をかけずにグルコサミノグリカンを産生することが可能になる。なぜなら、より高いグルコサミノグリカン含量を有する植物からのグルコサミノグリカンの単離は、それほど複雑ではなく、より費用効率が高いからである。さらに、先行技術に記載した植物と比較し、より小さな栽培面積が、本発明の遺伝子改変植物を使用してグルコサミノグリカンを産生するために必要とされる。これは、それが現在、その希少性及び高価格のために使用されない工業的用途のためでさえ十分量でグルコサミノグリカンを産生する可能性をもたらす。クロレラ属のウイルス感染植物生物は、比較的多量のグルコサミノグリカン（ヒアルロナン）を産生するためには不適である。グルコサミノグリカン（ヒアルロナン）の産生において、ウイルス感染藻類は、グルコサミノグリカン合成酵素に必要とされる遺伝子がそれらのゲノム中に安定的に組込まれず（Van Etten and Meints, 1999, Annu. Rev. Microbiol. 53, 447-494）、そのため、グルコサミノグリカン（ヒアルロナン）を産生するために、ウイルス感染を繰り返さなければならないという不利点を有する。したがって、持続的に所望の質及び量のグルコサミノグリカン（ヒアルロナン）を合成する個々のクロレラ細胞を単離することは可能ではない。さらに、ウイルス感染したクロレラ藻類において、グルコサミノグリカン（ヒアルロナン）は限られた期間だけ産生され、ウイルスが原因となる溶解の結果として、藻類は感染からわずか約８時間後に死滅する（Van Etten et al., 2002, Arch Virol 147, 1479-1516）。対照的に、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物を、無制限な方法で栄養的又は有性的に繁殖でき、それらがグルコサミノグリカン（ヒアルロナン）を持続的に産生するという利点を提供する。
ＷＯ ０５ ０１２５２９に記載されるトランスジェニック植物は、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を有し、比較的少量のグルコサミノグリカン（ヒアルロナン）を合成する。対照的に、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物が大幅に多量のグルコサミノグリカンを合成するという利点を提供する。
【００７４】
したがって、本発明は、また、グルコサミノグリカンを合成する本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物を提供する。
好ましい実施態様において、本発明の植物細胞又は本発明の植物は、コンドロイチン、ヘパリン／ヘパロサン、及びヒアルロナンからなる群より選択されるグルコサミノグリカンを合成する。
【００７５】
本発明の遺伝子改変植物中の新鮮重量に関して、グルコサミノグリカン含量を測定するために、好ましくは、植物、即ち、根を除く全ての植物部分の上の全粉砕材料を使用する。
グルコサミノグリカンを合成する本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物は、それらにより合成されるグルコサミノグリカンを単離し、その構造を確認することにより同定できる。植物組織は、それが任意のグルコサミノグリカンを含まないという利点を有するため、簡単で速い単離方法を、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物におけるグルコサミノグリカンの存在を実証するために使用できる。植物組織は、それが任意のグルコサミノグリカン分解酵素を含まないという利点を有するため、簡単で速い単離方法を、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物におけるグルコサミノグリカンの存在を実証するために使用できる。この目的のために、水を検証すべき植物組織に加えて、そして、植物組織を次に機械的に粉砕する（例えば、ビード・ミル、ワーリングブレンダー、ジュース抽出器などを用いて）。必要な場合、より多くの水を次に懸濁液に加えてよく、そして、細胞残骸及び不水溶性成分をその後に遠心分離により除去する。遠心分離後に得られた上清中のグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）の存在を、次に、例えば、関連するグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）に特異的に結合するタンパク質を使用して実証できる。
種々のグルコサミノグリカンについての免疫学的試薬（ＥＬＩＳＡ）に基づくそのようなテストキットが、当業者に公知であり、市販されている（例えば、ヘパリンのためのテストキット：Lifespan Technologies, 2401 Foothill Drive, Salt Lake City, UT 84109-1405, Prod. No.: K-2100）。
ヒアルロナンに特異的に結合するタンパク質を用いたヒアルロナンの検出のための方法が、例えば、ＵＳ ５，０１９，４９８に記載されている。ＵＳ ５，０１９，４９８に記載されている方法を行うためのテストキットが市販されている（例えば、Corgenix, Inc.（Colorado, USA）からのヒアルロン酸（ＨＡ）テストキット（Prod. No. 029-001）；一般方法事項４も参照のこと）。
コンドロイチンが、例えば、免疫学的方法を用いて検出できる（Mizuguchi et al., 2003, Nature 423, 443-448）。
遠心分離の上清中でのグルコサミノグリカンの存在は、さらに、他の分析方法、例えば、ＩＲ、ＮＭＲ、又は質量分析などを使用して確認することもできる。
【００７６】
本発明の植物の発生時間にわたり、グルコサミノグリカンが植物組織中に蓄積することが観察されているため、本発明の遺伝子改変植物における新鮮重量に関するグルコサミノグリカンの量は、特に好ましくは、問題になっている植物の回収時又は回収（１又は２）日前に測定する。
【００７７】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、それらが、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを有する遺伝子改変植物細胞と比較し、もしくは、遺伝子改変植物と比較し、又は、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子を有し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸を有さず、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を有さない遺伝子改変植物と比較し、増加量のグルコサミノグリカンを産生することを特徴とする。
【００７８】
好ましくは、本発明の遺伝子改変植物細胞中又は本発明の遺伝子改変植物中の植物材料の新鮮重量に関して産生されるグルコサミノグリカンの量は、グルコサミノグリカン合成酵素の活性（だけ）を有する、対応する遺伝子改変植物細胞と比較し、又は、対応する遺伝子改変植物と比較し、少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．４倍、特に好ましくは少なくとも１．６倍、そして、特に好ましくは少なくとも１．８倍増加する。本発明の遺伝子改変植物細胞中又は本発明の遺伝子改変植物中の植物材料の新鮮重量に関するグルコサミノグリカン含量の増加を測定するために、好ましくは、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物と対応する植物細胞及び植物（グルコサミノグリカン合成酵素活性（だけ）を有する）をそれぞれ比較し、ここで植物細胞又は植物の等価材料（例えば、葉、塊茎）を比較すべきであり、この材料を取った植物細胞又は植物を同じ条件下で栽培しており、そして、ここで同等の齢（発生段階）を有する植物材料のグルコサミノグリカン含量を比較すべきである。例えば、植物の若葉は、異なる植物の古葉と比較すべきではない。同じことを、植物の全地上部分のグルコサミノグリカン含量の測定に適用する。比較すべき植物は、同等の条件下で培養されたはずであり、同じ発生段階を有する。
【００７９】
好ましい実施態様において、本発明は、植物材料の新鮮重量（ＦＷ）１g当たり少なくとも１６０μg、好ましくは少なくとも１８０μg、特に好ましくは少なくとも２００μg、特に好ましくは少なくとも２２５μg、そして、最も好ましくは少なくとも２５０μgのグルコサミノグリカンを合成する本発明の植物細胞又は本発明の植物に関する。
さらなる実施態様において、本発明の植物細胞又は本発明の植物は、植物材料の新鮮重量（ＦＷ）１g当たり最大４５０μg、好ましくは最大４００μg、特に好ましくは最大３００μg、特に好ましくは最大２８０μg、そして、最も好ましくは最大２６０μgのグルコサミノグリカンを合成する。
【００８０】
本発明のさらなる実施態様において、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物はそれぞれ緑色陸生植物の植物細胞又は緑色陸生植物であり、グルコサミノグリカンを合成する。
【００８１】
本発明に関連して、「緑色陸生植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）」という用語は、Strasburger, “Lehrbuch der Botanik”[Textbook of Botany], 34th ed., Spektrum Akad. Verl., 1999, (ISBN 3-8274-0779-6)に定義される通りに理解すべきである。
【００８２】
本発明の好ましい実施態様は、多細胞植物又は多細胞生物である本発明の遺伝子改変植物の本発明の遺伝子改変植物細胞に関する。したがって、この実施態様は、単細胞植物（原生生物）に由来しない、又は、原生生物ではない植物細胞又は植物に関する。
【００８３】
本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物は、原則として、それぞれ任意の植物種、即ち、単子葉植物及び双子葉植物の両方の植物細胞及び植物でよい。それらは、好ましくは、作物植物、即ち、ヒト及び動物に与える目的のため、又は、バイオマスを産生するため、及び／又は、技術的、工業的な目的のための物質を調製するために、ヒトにより栽培される植物である（例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、カサバ、ジャガイモ、トマト、スイッチグラス（パニカム・ヴーガラタム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ））、サゴ、リョクトウ、エンドウ、モロコシ、ニンジン、ナス、ダイコン、アブラナ、ダイズ、ピーナッツ、キュウリ、カボチャ、メロン、ニラ、ニンニク、キャベツ、ホウレンソウ、サツマイモ、アスパラガス、ズッキーニ、レタス、アーティチョーク、スイートコーン、パースニップ、フタナミソウ、キクイモ、バナナ、サトウダイコン、サトウキビ、ビート、ブロッコリー、キャベツ、タマネギ、黄色ビート、タンポポ、ストロベリー、リンゴ、アンズ、プラム、桃、ブドウ、カリフラワー、セロリ、ピーマン、スウェーデンカブ、ルバーブ）。トウモロコシ、サトウキビ、サツマイモ又は糖キビ（ｓｕｇａｒ ｍｉｌｌｅｔ）が特に好ましく、トマト又はジャガイモ植物が非常に特に好ましい。
【００８４】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでタンパク質をコードする外来核酸分子は、外来核酸分子のコドンが、元の生物のそれぞれのタンパク質をコードする核酸分子のコドンと比較して改変されていることを特徴とする。特に好ましくは、外来核酸分子のコドンは改変され、それらは、そのゲノム中にそれらが組込まれた、又は、組込まれるはずである植物細胞又は植物のコドン使用頻度に適応するようにする。
【００８５】
遺伝コードの縮重のため、アミノ酸は１つ又は複数のコドンによりコードされうる。様々な生物において、アミノ酸をコードするコドンを異なる頻度で使用する。コード核酸配列のコドンを、ゲノム中に発現させるべき配列が組込まれるはずである植物細胞又は植物におけるそれらの使用頻度に適応させることは、特に植物細胞又は植物における、増加量の翻訳タンパク質及び／又は問題になっているｍＲＮＡの安定性に寄与しうる。問題になっている植物細胞又は植物におけるコドン使用頻度は、特定のコドンが特定のアミノ酸をコードするために使用される頻度について、問題になっている生物のコード核酸配列を可能な限り多く検証することにより、当業者により決定できる。特定の生物のコドン使用頻度は当業者に公知であり、コンピュータプログラムを使用した簡単で迅速な方法で決定できる。適したコンピュータプログラムは公的にアクセス可能であり、無料で、とりわけ、インターネット（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｃｕａ．ｓｃｈｏｅｄｌ．ｄｅ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｅｎｇ／ｃｕｔａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）で提供される。コード核酸配列のコドンを、ゲノム中に発現させるべき配列が組込まれるはずである植物細胞又は植物におけるそれらの使用頻度に適応させることは、インビトロ突然変異生成により、又は、好ましくは、遺伝子配列のデノボ合成により行うことができる。核酸配列のデノボ合成のための方法は当業者に公知である。デノボ合成は、例えば、最初に個々の核酸オリゴヌクレオチドを合成すること、これらをそれに相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすること、それによりそれらがＤＮＡ二本鎖を形成するようにし、そして次に個々の二本鎖オリゴヌクレオチドを連結すること、それにより所望の核酸配列が得られるようにすることにより行うことができる。コドンが特定の標的生物に使用される頻度の適応を含む、核酸配列のデノボ合成は、このサービスを提供する会社（例えば、Entelechon GmbH, Regensburg, Germany）へ供給することもできる。
【００８６】
本発明に関連して、「同一性」という用語は、少なくとも６０%、特に同一性において、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、特に好ましくは少なくとも９０%、そして、特に好ましくは少なくとも９５%のタンパク質をコードする、核酸分子のコード領域の全長又はアミノ酸配列の全長にわたる配列同一性を意味する。本発明に関連して、「同一性」という用語は、パーセントで表わされる、他のタンパク質／核酸と同一のアミノ酸／ヌクレオチドの数（同一性）を意味すると理解すべきである。好ましくは、ヒアルロナン合成酵素の活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号２の下に与えるアミノ酸配列との比較により決定し、ヒアルロナン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号１又は配列番号３の下に与える核酸配列との比較により決定し、コンドロイチン合成酵素の活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号５の下に示すアミノ酸配列との比較により決定し、又は、コンドロイチン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号４の下に示す核酸配列との比較により決定し、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素の活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号７の下に示すアミノ酸配列との比較により決定し、又は、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号６の下に示す核酸配列との比較により決定し、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号９の下に示すアミノ酸配列との比較により決定し、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号８の下に示す核酸配列との比較により決定し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号１１の下に与えるアミノ酸配列との比較により決定し、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号１０の下に示す核酸配列との比較により決定する（他のタンパク質／核酸とコンピュータプログラムを用いて）。互いに比較すべき配列が異なる長さである場合、同一性は、より短い配列がより長い配列と共有するアミノ酸の数のパーセントでの同一性を決定することにより決定すべきである。好ましくは、同一性は、公知の公的に利用可能なコンピュータプログラムClustalW（Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680）を使用して決定する。ClustalWは、Julie Thompson（Thompson@EMBL-Heidelberg.DE）及びToby Gibson（Gibson@EMBL-Heidelberg.DE）、European Molecular Biology Laboratory（Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany）により公的に利用可能にされている。ClustalWは、また、種々のインターネットページから、とりわけ、ＩＧＢＭＣ（Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, France； ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｐｕｂ／）から、ならびに、ＥＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）及びＥＢＩ（European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK）の全ての類似のインターネットページからダウンロードできる。
好ましくは、バージョン１．８のClustalWコンピュータプログラムを使用し、本発明に関連して記載するタンパク質と他のタンパク質の間の同一性を決定する。ここで、パラメーターを以下の通りに設定しなければならない：ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＴＯＰＤＩＡＧ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＰＡＩＲＧＡＰ＝３、ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰＥＸＴＥＮＤ＝０．０５、ＧＡＰＤＩＳＴ＝８、ＭＡＸＤＩＶ＝４０、ＭＡＴＲＩＸ＝ＧＯＮＮＥＴ、ＥＮＤＧＡＰＳ（ＯＦＦ）、ＮＯＰＧＡＰ、ＮＯＨＧＡＰ。
好ましくは、バージョン１．８のClustalWコンピュータプログラムを使用し、例えば、本発明に関連して記載する核酸分子のヌクレオチド配列と他の核酸分子のヌクレオチド配列の間の同一性を決定する。ここで、パラメーターを以下の通りに設定しなければならない：ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＴＯＰＤＩＡＧＳ＝４、ＰＡＩＲＧＡＰ＝５、ＤＮＡＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ、ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰＥＸＴ＝５、ＭＡＸＤＩＶ＝４０、ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮＳ：非加重。
【００８７】
同一性は、さらに、問題になっている核酸分子又はそれらによりコードされるタンパク質の間の機能的及び／又は構造的な等価性が存在することを意味する。上に記載する分子と相同であり、これらの分子の派生物を表わす核酸分子は、一般的に、同じ生物学的機能を有する改変を表わすこれらの分子のバリエーションである。それらは、自然発生のバリエーション、例えば、他の種からの配列、又は突然変異のいずれかでありうるが、ここでこれらの突然変異は自然の方法で発生したかもしれず、又は、標的突然変異生成により導入された。さらに、バリエーションは合成的に産生された配列でありうる。対立遺伝子変異体は、自然発生する変異体又は合成的に産生された変異体又は組換えＤＮＡ技術により生成された変異体のいずれかでありうる。特別な形態の派生物は、例えば、遺伝コードの縮重による、本発明に関連して記載する核酸分子とは異なる核酸分子である。
【００８８】
異なる核酸分子の派生物によりコードされるタンパク質は、特定の共通する特徴を有する。
これらは、例えば、生物学的活性、基質特異性、分子量、免疫学的反応性、立体構造などでありうる。
【００８９】
本発明は、さらに、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする、及び、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする、及び／又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする、植物細胞又は植物のゲノム中に組込まれた外来核酸分子が、植物細胞において転写を開始する調節エレメント（プロモーター）に連結されていることを特徴とする、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物を提供する。これらは同種又は異種のプロモーターでありうる。プロモーターは、構成的、組織特異的、発生特異的、又は、外部因子（例えば、化学物質の適用後、熱及び／又は冷気、渇水、疾患などの非生物因子の作用による）により調節されうる。ここで、グルコサミノグリカン合成酵素又はＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物のゲノム中に組込まれ、各々の場合において、同じプロモーターに付着できる、又は、異なるプロモーターを個々の配列に付着できる。ここで、２つ又は３つのプロモーターが、任意の組み合わせで存在でき、各々の場合において、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物においてグルコサミノグリカン合成酵素、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする関連核酸分子に付着される。
【００９０】
本発明の好ましい実施態様は、グルコサミノグリカン合成酵素、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子からなる群より選択される、少なくとも１つの外来核酸分子、特に好ましくは少なくとも２つの外来核酸分子、特に好ましくは３つの外来核酸分子が、組織特異的プロモーターに連結される、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関する。好ましい組織特異的プロモーターは、特異的に植物の塊茎、果実もしくは種子細胞、又は葉において転写開始を開始するプロモーターである。
【００９１】
一般的に、植物細胞において活性である各プロモーターは、グルコサミノグリカン合成酵素、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の発現に適する。
ここで、プロモーターは、発現が、構成的である、又は、特定の組織中、植物発生の特定の時点又は外部因子により決定される時間点だけであるように選んでよい。植物に関して、及び、発現される核酸分子に関して、プロモーターは同種又は異種でありうる。
適したプロモーターは、例えば、構成的発現のためのカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ ＲＮＳのプロモーター又はトウモロコシに由来するユビキチンプロモーター（Christensen and Quail, 1996, Transgenic Research 5(3), 213-218）、キビからのカフィリン（ｋａｆｉｒｉｎ）プロモーター（De Rose et al., 1996, Plant Molecular Biology 32 1029-1035; Mishra et al., 2007, Molecular Biology Reports online: 2 February 2007, DOI: 10.1007/s11033-007-9056-8）又はＣｅｓｔｒｕｍ ＹＬＣＶプロモーター（Yellow Leaf Curling Virus; WO 01 73087;Stavolone et al., 2003, Plant Mol.Biol.53, 703-713）、ジャガイモにおける塊茎特異的発現のためのパタチンゲン（ｐａｔａｔｉｎｇｅｎ）プロモーターＢ３３（Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29）、又は、トマトのための果実特異的プロモーター（Montgomery et al., 1993, Plant Cell 5, 1049-1062）、例えば、トマトからのポリガラクツロナーゼプロモーター（Montgomery et al., 1993, Plant Cell 5, 1049-1062）又はトマトからのＥ８プロモーター（Metha et al., 2002, Nature Biotechnol. 20(6), 613-618）又はモモからのＡＣＣオキシダーゼプロモーター（Moon and Callahan, 2004, J. Experimental Botany 55 (402), 1519-1528）又は光合成活性組織においてのみ発現を確実にするプロモーター、例えば、ＳＴ−ＬＳ１プロモーター（Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451）、又は、胚乳特異的発現のために、コムギからのＨＭＷＧプロモーター、トウモロコシからのＵＳＰプロモーター、ファセオリンプロモーター、ゼイン遺伝子のプロモーター（Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93)、グルテリンプロモーター（Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218）又はｓｈｒｕｎｋｅｎ−１プロモーター（Werr et al., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380）である。しかし、外部因子により決定される時間点でだけ活性であるプロモーターを使用することも可能である（例えば、ＷＯ ９３０７２７９を参照のこと）。ここで、特に興味深いのは、簡単な誘導を許すヒートショックタンパク質のプロモーターでありうる。さらに、種子特異的プロモーター、例えば、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）及び他の植物における種子特異的発現を確実にするソラマメからのＵＳＰプロモーターなどを使用することが可能である（Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Baumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467）。
【００９２】
藻類感染ウイルスのゲノム中に存在するプロモーターの使用は、また、植物において核酸配列を発現させるために適する（Mitra et al., 1994, Biochem. Biophys Res Commun 204(1), 187-194; Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol Biol 26(1), 85-93, Van Etten et al., 2002, Arch Virol 147, 1479-1516）。
【００９３】
本発明に関連して、「組織特異的」という用語は、発現（例えば、転写の開始）の、特定の組織への実質的な限定を意味すると理解すべきである。
【００９４】
本発明に関連して、「塊茎、果実、又は種子細胞」という用語は、塊茎、果実、又は種子中に存在する全ての細胞を意味すると理解すべきである。
【００９５】
本発明に関連して、「同種プロモーター」という用語は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物の産生のために使用する植物細胞又は植物に自然に存在する（植物細胞又は植物に関して同種である）プロモーターを意味する、又は、配列が単離された生物における（発現させるべき核酸分子に関して同種である）遺伝子の発現調節を調節するプロモーターを意味すると理解すべきである。
【００９６】
本発明に関連して、「異種プロモーター」という用語は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物の産生のために使用する植物細胞又は植物に自然に存在しない（植物細胞又は植物に関して異種である）プロモーターを意味する、又は、発現させるべき核酸配列が単離された生物において、核酸配列の発現調節のために自然に存在しない（発現させるべき核酸分子に関して異種である）プロモーターを意味すると理解すべきである。
【００９７】
また、ポリＡテールを、核酸分子のｍＲＮＡ転写産物に付加するために役立つ終結配列（ポリアデニル化シグナル）が存在してよい。ポリＡテールは転写産物の安定化に作用すると考えられる。そのようなエレメントは文献（Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29を参照のこと）に記載されており、所望の通りに交換できる。
【００９８】
また、イントロン配列が、プロモーターとコード領域の間に、又は、タンパク質をコードする外来核酸分子に存在することも可能である。そのようなイントロン配列は、植物における発現の安定性及び発現増加をもたらしうる（Callis et al., 1987, Genes Devel. 1, 1183-1200; Luehrsen, and Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier et al., 1997; Plant Journal 12(4), 895-899; Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; XU et al., 2003, Science in China Series C Vol.46 No.6, 561-569）。適したイントロン配列は、例えば、トウモロコシからのｓｈ１遺伝子の第１イントロン、トウモロコシからのポリユビキチン遺伝子の第１イントロン、コメからのＥＰＳＰＳ遺伝子の第１イントロン、又は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのＰＡＴ１遺伝子の第１の２つのイントロンの１つである。
【００９９】
本発明は、また、本発明の遺伝子改変植物細胞を含む植物に関する。そのような植物は、本発明の遺伝子改変植物細胞からの再生により産生してよい。
【０１００】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物の回収可能な植物部分、例えば、果実、貯蔵根及び他の根、花、芽、新芽、葉又は茎、好ましくは種子、果実、又は塊茎、本発明の遺伝子改変植物細胞を含むこれらの回収可能な部分に関する。
【０１０１】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の回収可能な植物部分は、本発明の遺伝子改変植物細胞を含む本発明の遺伝子改変植物の加工可能又は消費可能な部分である。
【０１０２】
本発明に関連して、「加工可能な部分」という用語は、食材又は飼料を調製するために使用される植物部分を意味すると理解すべきであり、それらは工業的方法のための原料源として、薬学的産物の産生のための原料源として、又は、化粧品産物の産生のための原料源として使用される。
【０１０３】
本発明に関連して、「消費可能な部分」という用語は、ヒト用の食物として役立つ、又は、動物飼料として使用される植物部分を意味すると理解すべきである。
【０１０４】
本発明は、また、本発明の遺伝子改変植物細胞を含む本発明の遺伝子改変植物の繁殖物質に関する。
【０１０５】
ここで、「繁殖物質」という用語は、栄養的又は有性的な経路を介して子孫を生成するために適した植物の成分を含む。栄養繁殖に適するのは、例えば、挿し木、カルス培養物、根茎、又は塊茎であるが、しかし、また、例えば、プロトプラスト及び細胞培養である。有性方法を用いて産生される繁殖物質は、例えば、果実、種子、実生などを含む。繁殖物質は、好ましくは、塊茎、果実、又は種子の形態を取る。
【０１０６】
好ましくは、本発明は、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を含む本発明の繁殖物質又は本発明の植物の回収可能部分に関する。特に好ましくは、本発明の繁殖物質又は本発明の植物の回収可能部分は、グルコサミノグリカンを合成する本発明の繁殖物質又は本発明の植物の回収可能部分である。好ましくは、グルコサミノグリカンは、コンドロイチン、ヘパリン／ヘパラン、又はヒアルロナン、特に好ましくはヒアルロナンである。
【０１０７】
本発明に関連して、「ジャガイモ植物」又は「ジャガイモ」という用語は、ナス属の植物種、特にナス属及び特にソラナム・チュベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）の塊茎産生種を意味すると理解すべきである。
【０１０８】
本発明に関連して、「トマト植物」又は「トマト」という用語は、リコペルシコン属、特にリコペルシコン・エスカレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の植物種を意味すると理解すべきである。
【０１０９】
本発明のさらなる利点は、本発明の遺伝子改変植物の回収可能部分、繁殖物質、加工可能部分、又は消費可能部分が、グルコサミン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを含む植物よりも多くのグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を含むことである。したがって、本発明の遺伝子改変植物は、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を単離できる原材料としての使用にだけでなく、予防的又は治療的な特徴（例えば、変形性関節症の予防ため、ＵＳ ６，６０７，７４５）を有する食材／飼料として直接的に、又は、食材／飼料の調製のためにも使用できる。本発明の遺伝子改変植物は、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを有する植物よりも高いグルコサミノグリカン含量を有するため、そのような食材／飼料の産生は、より少量の本発明の遺伝子改変植物の回収可能部分、繁殖物質、加工可能、又は消費可能部分を必要とする。本発明の遺伝子改変植物の消費可能部分が、例えば、直接的にいわゆる「栄養補給食品」として消費される場合、比較的少量の物質を摂取することでさえポジティブな効果を達成することが可能になる。これは、とりわけ、動物飼料の産生において特に有用でありうる。なぜなら、高過ぎる植物成分含量を有する動物飼料は、種々の動物種のための飼料として不適であるからである。
グルコサミノグリカン、特にヒアルロナンの高い水結合能力を理由に、本発明の遺伝子改変植物の回収可能部分、繁殖物質、加工可能部分、又は消費可能部分は、固型化した食材／飼料を産生する際に、より少ない増粘剤を必要とするとの利点を有する。このように、例えば、ゼリーの産生にはより少ない砂糖が必要になり、これは健康に及ぼす追加のポジティブな効果と関連する。粗植物物質の脱水に必要となる食材／飼料の産生において、本発明の遺伝子改変植物の回収可能部分、繁殖物質、加工可能部分、又は消費可能部分を使用する利点は、より少ない水を問題になっている植物材料から除去しなければならない事実において、より低い産生コスト、及び、より穏やかな調製方法（より低い及び／又はより短い加熱）により、問題になっている食材／飼料の栄養価の上昇をもたらすことにある。このように、例えば、トマトケチャップの産生において、所望の稠度を達成するために、ほとんどエネルギーを導入する必要がない。
【０１１０】
本発明は、さらに、以下を含む植物を産生するための方法を提供する
ａ）植物細胞の遺伝的改変、ここで遺伝子改変は以下の工程ｉ〜ｉｉｉを含む
ｉ）グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉ）グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉｉ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼをコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ここで工程ｉ〜ｉｉｉは任意の順番で個々に行うことができ、又は、工程ｉ〜ｉｉｉの任意の組み合わせを同時に行ってよい
ｂ）工程ａ）ｉ及び／又はａ）ｉｉ及び／又はａ）ｉｉｉｉからの植物細胞からの植物の再生；
ｃ）適宜、工程ｂ）の植物を使用したさらなる植物の生成、
ここで、適宜、植物細胞は、工程ｂ）又はｃ）の植物から単離し、そして、方法工程ａ）〜ｃ）を、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子及びグルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を有する植物が生成されるまで繰り返す。
【０１１１】
植物を産生するための本発明の方法の好ましい実施態様は、以下を含む、植物を調製するための方法に関する
ａ）植物細胞の遺伝的改変、ここで遺伝子改変は以下の工程ｉ〜ｉｉｉを任意の順番で含み、又は、以下の工程ｉ〜ｉｉｉの任意の組み合わせを個々に又は同時に行う、
ｉ）グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉ）グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉｉ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ｂ）以下の工程
ｉ）ａ）ｉ
ｉｉ）ａ）ｉｉ
ｉｉｉ）ａ）ｉｉｉ
ｉｖ）ａ）ｉ及びａ）ｉｉ、
ｖ）ａ）ｉ及びａ）ｉｉｉ、
ｖｉ）ａ）ｉｉ及びａ）ｉｉｉ、又は
ｖｉｉ）ａ）ｉ及びａ）ｉｉ及びａ）ｉｉｉ
の遺伝子改変を含む植物細胞からの植物の再生
ｃ）以下の工程
ｉ）ｂ）ｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｉ）ｂ）ｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｉｉ）ｂ）ｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、及び同時に、工程ａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｖ）ｂ）ｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変の導入、
ｖ）ｂ）ｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｖｉ）ｂ）ｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変の導入、及び同時に、工程ａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｖｉｉ）ｂ）ｉｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変の導入、
ｖｉｉｉ）ｂ）ｉｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｘ）ｂ）ｉｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変の導入、及び同時に、工程ａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｘ）ｂ）ｉｖ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｘｉ）ｂ）ｖ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、又は
ｘｉｉ）ｂ）ｖｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変、
の植物の植物細胞中への遺伝子改変の導入及び植物の再生、
ｄ）以下の工程
ｉ）ｃ）ｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｉ）ｃ）ｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｉｉ）ｃ）ｉｖ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｖ）ｃ）ｖ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｖ）ｃ）ｖｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｖｉ）ｃ）ｖｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変の導入、又は
ｖｉｉ）ｃ）ｉｘ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
の植物の植物細胞中への遺伝子改変の導入及び植物の再生
ｅ）適宜、工程ｂ）ｖｉｉ ｃ）ｉｉｉ、ｃ）ｖｉ、ｃ）ｘ、ｃ）ｘｉ、ｃ）ｘｉｉのいずれか、又は、工程ｄ）ｉ〜ｄ）ｖｉｉのいずれかの植物を用いてさらなる植物を生成すること。
【０１１２】
植物を産生するための本発明の方法の工程ａ）の外来核酸分子を導入するために、任意の利用可能な方法を使用できる。植物細胞の形質転換のための種々の方法が既に記載されており、ここで、対応する方法で適用できる。植物を産生するための本発明の方法の工程ａ）の方法工程が同時でないが、連続的に行える場合、同一の又は異なる方法を個々の形質転換工程のために使用してよい。
【０１１３】
植物を産生するための本発明の方法の工程ｂ）、ならびに、適宜、工程ｃ）及びｄ）の植物の再生を、当業者に公知の方法により行うことができる（例えば、Plant Cell Culture Protocols, 1999, edt. by R. D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2に記載）。
【０１１４】
植物を産生するための本発明の方法の（方法に依存した、工程ｃ）又は工程ｅ）の）さらなる植物の生成は、例えば、栄養繁殖により（例えば、挿し木を介して、塊茎、又はカルス栽培及び全植物の再生を介して）又は有性繁殖により起こりうる。ここで、有性繁殖は、好ましくは、制御された方法で行われ、即ち、特定の特性を伴う選択された植物を別のものと交配し、繁殖させる。選択は、好ましくは、さらなる植物（方法に依存して、工程ｃ）又は工程ｅ）に従って生成される）が先行する工程において導入された外来核酸分子を有するように行われる。
【０１１５】
植物を産生するための本発明の方法において、本発明の遺伝子改変植物細胞のための遺伝子改変を、同時に、又は、連続工程において、任意の組み合わせで行うことができる。外来核酸分子がまだ導入されていない野生型植物及び野生型植物細胞の両方を使用することが可能である、又は、既に遺伝子改変されており、１つ又は複数の外来核酸分子が既に導入されている植物細胞又は植物を使用することが可能である。
【０１１６】
植物を産生するための本発明の方法の工程ａ）における、植物細胞又は植物中に外来核酸分子を導入する遺伝子改変において、外来核酸分子は単一の核酸分子又は複数の核酸分子でよい。このように、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、単一の核酸分子上に一緒に存在でき、又は、言及した外来核酸分子の２つが単一の核酸分子上に一緒に存在しうる、及び、第３の外来核酸分子が別の核酸分子上に任意の可能な組み合わせで存在しうる、又は、言及した外来核酸分子の全て３つが個々の別々の核酸分子上に各々存在しうる。
【０１１７】
外来核酸分子又は組換え核酸分子の好ましい特性は、本発明の植物細胞又は本発明の植物に関連して既に上に記載されており、それらは植物を産生するための本発明の工程の実践において対応して適用できる。
【０１１８】
さらなる好ましい実施態様において、植物を産生するための本発明の方法を、本発明の遺伝子改変植物を産生するために使用する。
【０１１９】
本発明は、また、ヒアルロナンを合成する植物を産生するための本発明の方法により入手可能な植物を提供する。
【０１２０】
本発明は、さらに、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を産生するための方法に関し、本発明の遺伝子改変植物細胞から、本発明の遺伝子改変植物から、本発明の繁殖物質から、本発明の回収可能部分から、又は、植物を産生するための本発明の方法により入手可能な植物もしくはこれらの植物の部分からグルコサミノグリカンを抽出する工程を含む。好ましくは、そのような方法は、また、本発明の栽培された遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、本発明の加工可能な植物部分を、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を抽出する前に回収する工程、及び、特に好ましくは、さらに、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物を、回収前に栽培する工程を含む。
【０１２１】
細菌又は動物組織とは対照的に、植物組織はグルコサミノグリカン分解酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ）を有さない。したがって、既に上に記載した通り、植物組織からのグルコサミノグリカンの抽出は、比較的簡単な方法を使用して可能である。必要な場合、上に記載した、グルコサミノグリカンを含む植物細胞又は組織の水性抽出物は、当業者に公知の方法、例えば、エタノールでの繰り返し沈殿などを使用して精製できる。ヒアルロナンを精製するための好ましい方法は、一般方法事項３の下に記載されている。
【０１２２】
グルコサミノグリカンを本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物から抽出するための既に記載した方法は、また、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を、ヒアルロナンを合成する植物を調製するための本発明の繁殖物質から、本発明の回収可能な植物部分から、又は、本発明の方法により入手可能な植物又はこれらの植物の部分から単離するために適する。
【０１２３】
本発明は、また、グルコサミノグリカンを調製するための本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、又は植物を産生するための本発明の方法により入手可能な植物の使用を提供する。
【０１２４】
本発明は、さらに、本発明の遺伝子改変植物細胞を含む組成物に関する。ここで、植物細胞が無傷であるのか、又は、もはや無傷ではないのかは重要ではない。なぜなら、それらは、例えば加工により破壊されているからである。組成物は、好ましくは、食材又は飼料、薬学的産物又は化粧品産物である。
【０１２５】
本発明は、好ましくは、本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能部分、又は、本発明の方法により入手可能な植物の成分を含む、及び、組換え核酸分子を含む組成物を提供し、ここで、組換え核酸分子は、それらがグルコサミノグリカン合成酵素、及び、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するタンパク質、及び、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むことを特徴とする。
【０１２６】
植物細胞又は植物のゲノム中への外来核酸分子の安定的組込みによって、外来核酸分子が、植物細胞又は植物のゲノム中への組込み後、ゲノムの植物核酸配列により隣接される。したがって、好ましい実施態様において、本発明の組成物は、本発明の組成物中に存在する組換え核酸分子がゲノムの植物核酸配列により隣接されることを特徴とする。
ここで、ゲノムの植物核酸配列は、組成物を調製するために使用される植物細胞又は植物のゲノム中に自然に存在する任意の配列でよい。
【０１２７】
本発明の組成物中に存在する組換え核酸分子は、個々の又は異なる組換え核酸分子でありうるが、ここで、グルコサミノグリカン合成酵素（例えば、ヒアルロナン合成酵素）、及び、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、及び、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が、１つの核酸分子中に存在し、又は、言及した核酸分子が別々の核酸分子に存在する。グルコサミノグリカン合成酵素（例えば、ヒアルロナン合成酵素）、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、及び、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が、単一の組換え核酸分子上に一緒に存在しうる、又は、言及した核酸分子の２つが単一の組換え核酸分子上に一緒に存在しうる、そして、第３の核酸分子が別の組換え核酸分子上に任意の可能な組み合わせで存在しうる、又は、言及した全て３つの核酸分子が各場合において個々の別々の組換え核酸分子上に存在しうる。グルコサミノグリカン合成酵素（例えば、ヒアルロナン合成酵素）をコードする、又は、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子がどのように本発明の組成物中に存在するのかに依存して、それらは同一の又は異なるゲノム植物核酸配列により隣接されうる。
【０１２８】
本発明の組成物が組換え核酸分子を含むことは、当業者に公知の方法、例えば、ハイブリダイゼーションに基づく方法を使用し、又は、好ましくは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に基づく方法を使用して実証されうる。
【０１２９】
既に上に言及した通り、本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、又は、本発明の方法により入手可能な植物を、食材／飼料を調製するために使用することが可能である。しかし、工業的用途のための原材料としての使用は、また、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を単離しなくても可能である。このように、例えば、本発明の遺伝子改変植物又は本発明の遺伝子改変植物の部分を、農業栽培下の領域に適用し、土壌の水分結合の増加を達成できる。さらに、本発明の遺伝子改変植物又は本発明の遺伝子改変植物細胞を、乾燥剤を調製するために（例えば、水分感受性品目の輸送時での使用のために）又は液体の吸収剤として（例えば、おむつ中で、又は、こぼれた水性液体を吸収するために）使用できる。そのような用途のために、本発明の遺伝子改変植物の全体、本発明の遺伝子改変植物の部分、又は、本発明の粉砕された（例えば、挽かれた）遺伝子改変植物、又は本発明の遺伝子改変植物部分を、適宜、使用することが可能である。挽かれた植物又は植物部分を使用する用途に適するのは、特に、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を含むが、しかし、低い割合の水だけを含む植物部分である。これらは、好ましくは、穀物植物（トウモロコシ、コメ、コムギ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、サゴ、又はモロコシ）の穀物である。本発明の遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物が、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする１つの外来核酸分子だけを有する植物よりも高いグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）含量を有するため、これらと比較し、本発明の遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物を使用する場合にはほとんど材料を工業的用途のために使用する必要がない。
【０１３０】
本発明は、また、本発明の組成物を調製するための方法を提供し、ここで本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、又は、植物を産生するための本発明の方法により入手可能な植物を使用する。本発明の組成物を調製するための方法は、好ましくは、食材又は飼料を調製するための方法、薬学的産物を調製するための方法、又は、化粧品産物を調製するための方法である。
【０１３１】
食材又は飼料を調製するための方法は、当業者に公知である。本発明の遺伝子改変植物又は本発明の植物部分の工業領域での使用のための方法も当業者に公知であり、とりわけ、本発明の遺伝子改変植物又は本発明の植物部分を粉砕すること、又は、挽くことを含む；しかし、それらにもっぱら限定されない。食材／飼料を調製するため、又は、工業領域での使用のために本発明の材料を使用することに起因する利点のいくつかが、既に上に記載されている。
【０１３２】
組成物を調製するための本発明の方法は、特に好ましくは、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を含む組成物を調製するための方法である。
【０１３３】
本発明の組成物を調製するための方法により入手可能な組成物は、同様に、本発明により提供される。
【０１３４】
本発明は、また、本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、又は、本発明の方法により入手可能な植物の、本発明の組成物を調製するための植物を産生するための使用に関する。好ましくは、本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、又は、本発明の方法により入手可能な植物の、食材又は飼料を調製するため、薬学的産物を調製するため、又は、化粧品産物を調製するための植物を産生するための使用である。
【０１３５】
配列の説明
配列番号１：パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列。
配列番号２：パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素のアミノ酸配列。アミノ酸配列は配列番号１に由来しうる。
配列番号３：パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素をコードする合成核酸配列。示した配列のコドンの合成は、それらが植物細胞でのコドンの使用に適応されるように実施した。示した核酸配列は、配列番号２の下に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
配列番号４：パスツレラ・マルトシダからのコンドロイチン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号５：パスツレラ・マルトシダからのコンドロイチン合成酵素の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号４に由来しうる。
配列番号６：パスツレラ・マルトシダからのヘパロサン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号７：パスツレラ・マルトシダからのヘパロサン合成酵素の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号６に由来しうる。
配列番号８：サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号９：サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号８に由来しうる。
配列番号１０：サッカロマイセス・セレビシエからのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号１１：サッカロマイセス・セレビシエからのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号１０に由来しうる。
配列番号１２：ＹＬＣＶプロモーター、制限酵素部位、アグロバクテリウムからのｏｃｓターミネーターのポリアデニル化シグナル配列、及び、アグロバクテリウムからのｎｏｓターミネーターのポリアデニル化シグナル配列を含む発現カセットの核酸配列。
配列番号１３：ＭＣＳ（「マルチクローニングサイト」）を調製するための合成オリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ＭＣＳ（「マルチクローニングサイト」）を調製するための合成オリゴヌクレオチド。
配列番号１５：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号１６：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号１７：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号１８：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号１９：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号２０：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号２１：大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号２２：大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号２１に由来しうる。
配列番号２３：ＰＣＲプライマーとして使用した合成オリゴヌクレオチド。
配列番号２４：ＰＣＲプライマーとして使用した合成オリゴヌクレオチド。
配列番号２５：大腸菌からのグルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｇｌｍｕ）。
配列番号２６：大腸菌からのグルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号２５に由来しうる。
配列番号２７：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号２８：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号２９：サッカロマイセス・セレビシエからのホスホアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮ−Ｐ）ムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号３０：サッカロマイセス・セレビシエからのホスホアセチルグルコサミンムターゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号３０に由来しうる。
【０１３６】
一般方法
本発明に関連して使用できる方法を以下に記載する。これらの方法は特定の実施態様である；しかし、本発明はこれらの方法に限定されない。本発明を、記載の方法を改変することにより、及び／又は、個々の方法又は方法の部分を代わりの方法又は方法の代わりの部分により交換することにより、同じ方法で行うことができることは、当業者に公知である。
【０１３７】
１．ジャガイモ植物の形質転換
ジャガイモ植物を、アグロバクテリウムを用いて、Rocha-Sosa et al.（EMBO J. 8, (1989), 23-29）に記載の通りに、形質転換した。
２．植物組織からのヒアルロナンの例を使用したグルコサミノグリカンの単離
植物組織においてヒアルロナンの存在を検出し、ヒアルロナン含量を測定するために、植物材料を以下の通りに用意した：２００μlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）を約０．３gの植物材料に加え、混合物を実験用振動ボールミル（MM200, Retsch, Germany）中で粉砕した（３０Ｈｚで３０秒間）。さらに８００μlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）を次に加え、混合物を十分に混合した（例えば、ボルテックスミキサーを使用）。細胞残骸及び不溶性成分を、１６０００ｘgで５分間遠心分離することにより上清から分離した。植物の全地上部分中のヒアルロナンの量を測定するために、植物の全地上部分を培養基質の上約１cm〜３cmで切断し、小片に切り、次に、ワーリングブレンダーを使用して、一般方法事項３の下に記載の通りに粉砕した。ヒアルロナン含量を測定するために、一定分量を、次に、得られた遠心分離上清から除去してよい（一般方法事項３を参照のこと）。
３．ヒアルロナンの例を使用したグルコサミノグリカンの精製
粉砕した植物材料又は植物の全地上部分を、水（約１００mlの水、脱塩、伝導率≧１８ＭΩ、各場合において１００gの植物材料）の添加後、ワーリングブレンダー中で、最高速度で約３０秒間粉砕した。細胞残骸を次に茶こしを使用して除去した。除去した細胞残骸を３００mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）中に再懸濁し、茶こしを使用して再び除去した。得られた２つの懸濁液（１００ml＋３００ml）を合わせ、１３０００ｘgで１５分間遠心分離した。ＮａＣｌを、最終濃度が１%に達するまで、得られた遠心分離上清に加えた。ＮａＣｌが溶液になった後、沈殿を、２倍容積のエタノールの添加、続く十分な混合及び−２０℃で一晩のインキュベーションにより行った。混合物を次に１３０００ｘgで１５分間遠心分離した。この遠心分離後に得られた沈降沈殿物を１００mlのバッファー（５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ， ｐＨ８， １mM ＣａＣｌ２）中に溶解し、プロテイナーゼＫを次に最終濃度１００μg/mlまで加え、溶液を４２℃で２時間インキュベートした。これに９５℃で１０分間のインキュベーションが続いた。さらに１回、ＮａＣｌを、最終濃度が１%に達するまで、この溶液に加えた。ＮａＣｌが溶液になった後、別の沈殿を、２倍容積のエタノールの添加、十分な混合、及び−２０℃で約９６時間のインキュベーションにより行った。これに１３０００ｘgで１５分間の遠心分離が続いた。この遠心分離後に得られた沈降沈殿物を３０mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）中に溶解し、さらに１回、ＮａＣｌを最終濃度１%まで加えた。２倍容積のエタノールの添加、十分な混合、及び−２０℃で一晩のインキュベーションにより、別の沈殿を行った。続く１３０００ｘgで１５分間の遠心分離後に得られた沈殿物を、２０mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）中に溶解した。
さらなる精製を遠心ろ過により行った。この目的のために、各場合において、５mlの溶解した沈殿物をメンブレンフィルター（CentriconAmicon，孔幅１０ ０００ NMWL, Prod. No. UCF8 010 96）に適用し、サンプルを、わずか約３mlの溶液がフィルター上に残るまで、２２００ｘgで遠心分離した。さらに２回、各場合において、３mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）を次にメンブレン上の溶液に加えて、各場合において、同一条件下で、最後にわずか約３ｍｌの溶液がフィルター上に残るまで、再遠心分離した。溶液は、遠心ろ過を取り外した後、依然としてメンブレン上に存在し、メンブレンを約１．５mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）で繰り返し（３〜５回）リンスした。依然としてメンブレン上に存在した全ての溶液及びリンスから得られた溶液を合わせ、ＮａＣｌを最終濃度１%まで加え、ＮａＣｌが溶液になった後、２倍容積のエタノールを加え、サンプルを混合し、沈殿物を−２０℃で一晩の保存により得た。続く１３０００ｘgで１５分間の遠心分離後に得られた沈殿物を４mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）中に溶解し、次に凍結乾燥した（０．３７mbarの圧力下で２４時間、凍結乾燥機器Christ Alpha 1-4、Christ（Osterode, Germany）から）。
４．ヒアルロナンの検出及びヒアルロナン含量の測定
ヒアルロナンを市販テスト（ヒアルロン酸（ＨＡ）テストキット、Corgenix, Inc.（Colorado, USA）から、Prod. No. 029-001）を使用し、製造者の指示（これと共に記載中に参照により組み入れられる）に従って検出した。テスト原理は、ヒアルロナン（ＨＡＢＰ）に特異的に結合するタンパク質の可用性に基づき、ＥＬＩＳＡと同様に行い、ここで呈色反応は検証されたサンプル中のヒアルロナン含量を示す。ヒアルロナン値を、検量線を用いて、テストキットと共に含まれる規定量のヒアルロナンを使用して測定する。したがって、ヒアルロナンの定量的測定のために、測定すべきサンプルを、記載した限度内にある濃度で用いるべきである（例えば、限度を超えている、又は、限度に達していないかに依存し、問題になっているサンプルの希釈又は植物組織からヒアルロナンを抽出するためのより少ない水の使用）。
並列バッチで、測定すべきサンプルの一定分量を最初にヒアルロナン消化にかけ、次に市販テスト（ヒアルロン酸（ＨＡ）テストキット、Corgenix, Inc.（Colorado, USA）から、Prod. No. 029-001）を使用して測定した。ヒアルロニダーゼ消化を、ヒアルロニダーゼバッファー（０．１Mリン酸カリウムバッファー、ｐＨ ５．３；１５０mM ＮａＣｌ）中の４００μlの植物抽出物を使用し、５μg（〜３単位）のヒアルロニダーゼ（hyaluronidase type III、Sigmaから、Prod. No. H 2251）を加え、３７℃で３０分間インキュベートすることにより行った。各場合において、１：１０希釈で、全てのサンプルを次にヒアルロナン含量の測定のために使用した。
５．ＧＦＡＴの活性の測定
ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の活性をRachel et al.（1996, J. Bacteriol. 178 (8), 2320-2327）に記載の通りに測定する。
ＧＦＡＴ−１又はＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質を区別するために、Hu et al.（2004, J. Biol. Chem. 279 (29), 29988-29993）に記載の方法を使用する。
【０１３８】
実施例
１．植物発現ベクターＩＲ ４７−７１の調製
プラスミドｐＢｉｎＡＲは二成分ベクターｐＢｉｎ１９（Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711-8721）の派生物であり、以下の通りに構築する：カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ ＲＮＳのプロモーターのヌクレオチド６９０９〜７４３７を含む５２９bp長のフラグメントを、プラスミドｐＤＨ５１（Pietrzak et al, 1986 Nucleic Acids Res. 14, 5858）からのＥｃｏ ＲＩ／Ｋｐｎ Ｉフラグメントとして単離し、ｐＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏ ＲＩ及びＫｐｎ Ｉ制限酵素部位の間に連結した。この方法で、プラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓを形成した。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＰｖｕ ＩＩを使用し、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡのオクトピン合成酵素（ｏｃｔｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子（遺伝子３）のポリアデニル化シグナル（３’末端）を含む１９２bp長のフラグメント（Gielen et al, 1984, EMBO Journal 3, 835-846）（ヌクレオチド１１ ７４９−１１ ９３９）を、プラスミドｐＡＧＶ４０（Herrera-Estrella et al, 1983 Nature, 303, 209-213）から単離した。Ｓｐｈ ＩリンカーのＰｖｕ ＩＩ制限酵素部位への付加後、フラグメントをｐＵＣ１８−３５ＳのＳｐｈ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素部位の間に連結した。これはプラスミドｐＡ７を与えた。ここで、３５Ｓプロモーター及びＯｃｓターミネーターを含む全ポリリンカーを、Ｅｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを使用して除去し、適切に切断されたベクターｐＢｉｎ１９中に連結した。これは植物発現ベクターｐＢｉｎＡＲを与えた（Hofgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230）。ソラナム・チュベロサムからのパタチン遺伝子Ｂ３３のプロモーター（Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29）を、Ｄｒａ Ｉフラグメント（ヌクレオチド−１５１２ − ＋１４）として、Ｓｓｔ Ｉ切断ベクターｐＵＣ１９（末端をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑化した）中に連結した。これはプラスミドｐＵＣ１９−Ｂ３３を与えた。このプラスミドから、Ｂ３３プロモーターをＥｃｏ ＲＩ及びＳｍａ Ｉを使用して除去し、適した制限ベクターｐＢｉｎＡＲ中に連結した。これは植物発現ベクターｐＢｉｎＢ３３を与えた。
さらなるクローニング工程を容易にするために、ＭＣＳ（マルチクローニングサイト）を延長した。この目的のために、２つの相補的オリゴヌクレオチドを合成し、９５℃で５分間加熱し、徐々に室温まで冷却し、良好なアニーリング及びｐＢｉｎＢ３３のＳａｌ Ｉ及びＫｐｎ Ｉ制限酵素部位中へのクローニングを可能にした。この目的のために使用するオリゴヌクレオチドを配列番号１３及び配列番号１４の下に示す。得られたプラスミドをＩＲ ４７−７１と名付けた。
【０１３９】
２．植物発現ベクターｐＢｉｎＡＲＨｙｇの調製
３５Ｓプロモーター、Ｏｃｓターミネーター、及び全マルチクローニングサイトを含むフラグメントを、ｐＡ７から、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを使用して除去し、同じ制限エンドヌクレアーゼを使用して切断したベクターｐＢＩＢＨｙｇ（Becker, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 203）中にクローニングした。得られたプラスミドをｐＢｉｎＡＲＨｙｇと名付けた。
【０１４０】
３．クローニングベクターＩＣ ３１７−２０４の調製
制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを使用し、ｏｃｓターミネーターを含む核酸フラグメントをプラスミドＩＲ ４７−７１から単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ（Stratageneから、Prod. No. 212207）中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３０６−２０４と名付けた。
制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩを使用し、Ｂ３３プロモーターを含む核酸フラグメントをプラスミドＩＲ ４７−７１から単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ（Stratageneから、Prod. No. 212207）中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３１４−２０４と名付けた。
ＩＣ ３０６−２０４から、ＯＣＳターミネーターを制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したプラスミドＩＣ ３１４−２０４中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３１７−２０４と名付けた。
【０１４１】
４．核酸分子の合成
ａ）パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子の合成
パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１のヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列をMedigenomix GmbH（Munich, Germany）により合成し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ２．１（Prod. No. K2000-01）中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３２３−２１５と名付けた。パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのＨＡＳタンパク質をコードする合成核酸配列を配列番号３の下に示す。パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１から元々単離された対応する核酸配列を配列番号１の下に示す。
ｂ）ＹＬＣＶプロモーター及びＭＣＳ、ｎｏｓターミネーター及びｏｃｓターミネーターを含む核酸配列の合成
ＹＬＣＶプロモーター（Stavolone et al., Plant Molecular Biology 53: 703-713, 2003）ならびに制限酵素部位Ｓａｃ Ｉ及びＳｍａ Ｉを含むＭＣＳ（「マルチクローニングサイト」）、ｎｏｓターミネーター及びｏｃｓターミネーターを含む核酸分子がEntelechon GmbHにより合成され、InvitrogenからのベクターｐＣＲ４Ｔｏｐｏ（Prod. No. K4510-20）中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３８９−３３７と名付けた。合成核酸配列を配列番号１２の下に示す。
【０１４２】
５．核酸分子の単離
ａ）ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列の単離及びクローニング
サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｇｎａ１）をＰＣＲにより単離し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ ２．１（Prod. No. K4510-20）中にクローニングした。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りであった：
１．工程：５分、９４℃
２．工程：４５秒、９４℃
３．工程：４５秒、５９℃
４．工程：４５秒、７２℃
５．工程：１０分、７２℃
６．工程：４℃
工程２〜４を３５回繰り返し、手順を次に工程５で続けた。
５０μlの反応バッチは、バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５０mM ＫＣｌ、及び３mM ＭｇＳＯ４）、各場合での５００nMの増幅プライマー（配列番号１５及び配列番号１６の下に示す）、１０μlのＱ溶液（Qiagen, Prod. No. 206143に含まれる）、各場合での０．２mMのデオキシリボヌクレオチド、０．５μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Prod. No.: 11304-011）、及び鋳型としての２５０ngのゲノム酵母ＤＮＡを含んだ。ＰＣＲを、EppendorfからのMastercycler（Prod. No. 5331 000.010）を使用して行った。
サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸配列を、配列番号８の下に示す。
得られたフラグメントのベクターｐＣＲ ２．１中へのクローニング及び配列の確認後、サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする問題になっている核酸配列を、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉ及びＸｂａ Ｉを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＡ７中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ２９８−２０４と名付けた。
【０１４３】
ｂ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列の単離及びクローニング
サッカロマイセス・セレビシエからのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｑｒｉ）をＰＣＲにより単離し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ ２．１（Prod. No. K2000-01）中にクローニングした。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りであった：
１．工程：５分、９４℃
２．工程：４５秒、９４℃
３．工程：４５秒、５９℃
４．工程：４５秒、７２℃
５．工程：３０分、７２℃
６．工程：４℃
工程２〜４を３５回繰り返し、手順を次に工程５で続けた。
５０μlの反応バッチは、バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５０mM ＫＣｌ、及び３mM ＭｇＳＯ４）、各場合での５００nMの増幅プライマー（配列番号１７及び配列番号１８の下に示す）、１０μlのＱ溶液（Qiagen， Ｐｒｏｄ． Ｎｏ． ２０６１４３に含まれる）、各場合での０．２mMのデオキシリボヌクレオチド、０．５μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Prod. No.: 11304-011）、及び鋳型としての２５０ngのゲノム酵母ＤＮＡ（Invitrogen Prod. No. 40802）を含んだ。ＰＣＲを、EppendorfからのMastercycler（Prod. NR. 5331 000.010）を使用して行った。
サッカロマイセス・セレビシエからのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸配列を、配列番号１０の下に示す。
得られたフラグメントのベクターｐＣＲ ２．１中へのクローニング及び配列の確認後、サッカロマイセス・セレビシエからのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉ及びＸｂａ Ｉを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＡ７中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３０３−２０４と名付けた。
【０１４４】
ｃ）ＧｌｃＮＡｃ−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の単離及びクローニング
サッカロマイセス・セレビシエからのホスホアセチルグルコサミンムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｐｃｍ Ｉ， ＥＣ ５．４．２．３）をＰＣＲにより単離し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ ２．１（Prod. No. K2000-01）中にクローニングした。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りであった：
１．工程：５分、９４℃
２．工程：４５秒、９４℃
３．工程：４５秒、５９℃
４．工程：４５秒、７２℃
５．工程：３０分、７２℃
６．工程：４℃
工程２〜４を３５回繰り返し、手順を次に工程５で続けた。
５０μlの反応バッチは、バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５０mM ＫＣｌ、及び３mM ＭｇＳＯ４）、各場合での５００nMの増幅プライマー（配列番号２７及び配列番号２８の下に示す）、１０μlのＱ溶液（Qiagen, Prod. No. 206143に含まれる）、各場合での０．２mMのデオキシリボヌクレオチド、０．５μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Prod. No.: 11304-011）、及び鋳型としての２５０ngのゲノム酵母ＤＮＡ（Invitrogen Prod. No. 40802）を含んだ。ＰＣＲを、EppendorfからのMastercycler（Prod. No. 5331 000.010）を使用して行った。
得られたフラグメントのベクターｐＣＲ ２．１中へのクローニング及び配列の確認後、サッカロマイセス・セレビシエからのホスホアセチルグルコサミンムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉ及びＸｂａ Ｉを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＡ７中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３０４−２０４と名付けた。
【０１４５】
ｄ）大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の単離及びクローニング
大腸菌からのグルコサミン１−リン酸ムターゼ（ＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼ）の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｇｌｍｍ）をＰＣＲにより単離し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ ２．１（Prod. No. K2000-01）中にクローニングした。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りであった：
１．工程：５分、９４℃
２．工程：４５秒、９４℃
３．工程：４５秒、５９℃
４．工程：４５秒、７２℃
５．工程：３０分、７２℃
６．工程：４℃
工程２〜４を３５回繰り返し、手順を次に工程５で続けた。
５０μlの反応バッチは、バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５０mM ＫＣｌ、及び３mM ＭｇＳＯ４）、各場合での５００nMの増幅プライマー（配列番号１９及び配列番号２０の下に示す）、１０μlのＱ溶液（Qiagen, Prod. No. 206143に含まれる）、各場合での０．２mMのデオキシリボヌクレオチド、０．５μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Prod. No.: 11304-011）、及び鋳型としての２５０ngのゲノム大腸菌ＤＮＡを含んだ。ＰＣＲを、EppendorfからのMastercycler（Prod. No. 5331 000.010）を使用して行った。
大腸菌からのグルコサミン１−リン酸ムターゼタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸配列（ｇｌｍｍ）を、配列番号２１の下に示す。
得られたフラグメントのベクターｐＣＲ ２．１中へのクローニング及び配列の確認後、大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉ及びＸｂａ Ｉを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＡ７中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３００−２０４と名付けた。
【０１４６】
ｅ）大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の単離及びクローニング
大腸菌からのグルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する二機能性タンパク質をコードする核酸配列（ｑｌｍｕ）をＰＣＲにより単離し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ ２．１（Prod. No. K2000-01）中にクローニングした。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りであった：
１．工程：５分、９４℃
２．工程：４５秒、９４℃
３．工程：４５秒、５９℃
４．工程：４５秒、７２℃
５．工程：３０分、７２℃
６．工程：４℃
工程２〜４を３５回繰り返し、手順を次に工程５で続けた。
５０μlの反応バッチは、バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５０mM ＫＣｌ、及び３mM ＭｇＳＯ４）、各場合での５００nMの増幅プライマー（配列番号２３及び配列番号２４の下に示す）、１０μlのＱ溶液（Qiagen, Prod. No. 206143に含まれる）、各場合での０．２mMのデオキシリボヌクレオチド、０．５μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Prod. No.: 11304-011）、及び鋳型としての２５０ngのゲノム大腸菌ＤＮＡを含んだ。ＰＣＲを、EppendorfからのMastercycler（Prod. No. 5331 000.010）を使用して行った。
大腸菌からのグルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸配列（ｇｌｍｕ）を、配列番号２５の下に示す。
得られたフラグメントのベクターｐＣＲ ２．１中へのクローニング及び配列の確認後、大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する二機能性タンパク質をコードする核酸配列（ｇｌｍｕ）を、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉ及びＸｂａ Ｉを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＡ７中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ２９９−２０４と名付けた。
【０１４７】
６．パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素のためのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３４１−２２２の調製
ヒアルロナン合成酵素のコード配列を含む核酸分子を、プラスミドＩＣ ３２３−２１５から、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏ Ｉでの制限酵素消化により単離し、プラスミドＩＲ ４７−７１のＢａｍＨＩ及びＸｈｏ Ｉ制限酵素部位中にクローニングした。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３４１−２２２と名付けた。
【０１４８】
７．サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質のためのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３５１−２２２の調製
開始プラスミドは上に記載の植物発現ベクターｐＵＢＩ ｂａｒ（ＷＯ ９７ ４４４７２）であり、その中のＥｃｏ ＲＩ及びＳｄａ Ｉ制限酵素部位中に、酵母からのｇｎａ遺伝子のコード配列をクローニングした。酵母からのｇｎａ遺伝子のコード配列をＥｃｏ ＲＩ及びＳｄａ Ｉ制限酵素消化によりプラスミドＩＣ ２９８−２０４から単離した。得られたベクターをＩＣ ３５１−２２２と名付けた。
【０１４９】
８．ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質のためのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３９２−３３７の調製
開始プラスミドは上にさらに記載するプラスミドＩＣ ３５１−２２２であり、その中のＥｃｏ ＲＩ制限酵素部位中に、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩを使用してプラスミドＩＣ ３８９−３３７から単離したＹＬＣＶプロモーター及びＮＯＳターミネーター及びＯＣＳターミネーターのカセットをクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３９０−３３７と名付けた。
上に記載したプラスミドＩＣ ３０３−２０４から、ｑｒｉ遺伝子のコード配列をＳａｃ Ｉ及びＥｃｏ ＲＶ制限酵素消化により単離し、ベクターＩＣ ３９０−３３７のＳａｃ Ｉ及びＳｍａ Ｉ制限酵素部位中に連結した。得られたベクターをＩＣ ３９１−３３７と名付けた。
重複性のＯＣＳターミネーターを除去するために、ベクターＩＣ ３９１−３３７をＡａｔ ＩＩで消化し、次に再連結した。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３９２−３３７と名付けた。
【０１５０】
９．大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質ならびにＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有する二機能性タンパク質のためのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３６０−２３７の調製
大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の導入のための開始プラスミドは、上にさらに記載するプラスミドＩＣ ２９９−２０４であり、そのコード配列はＥｃｏ ＲＩ制限酵素消化により単離され、ｐＭＣＳ５ベクター（MoBiTec GmbH, Prod. No.: pMCS5）のＥｃｏ ＲＩ制限酵素部位中にクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３０７−２０４と名付けた。次の工程では、ベクターＩＣ ３０７−２０４をＰｍｅ Ｉ及びＳｍａ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、再連結した。得られたベクターをＩＣ ３１１−２０４と名付けた。ＧＬＭＵの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、次に、プラスミドＩＣ ３１１−２０４からＢａｍ ＨＩ及びＫｐｎＩでの制限酵素消化により単離し、ベクターＩＣ ３１２−２０４の制限酵素部位Ｂａｍ ＨＩ及びＫｐｎ Ｉ中に連結した。得られたベクターをＩＣ ３１５−２０４と名付けた。ベクターＩＣ ３１２−２０４を、３５Ｓプロモーターフラグメント（Ｅｃｏ ＲＩ及びＳａｌ Ｉ制限酵素消化によりプラスミドｐＡ７から単離）、ｏｃｓフラグメント（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａｌ Ｉ制限酵素消化によりＩＣ ３０９−２０４から単離）、及びベクターＩＣ３１０−２０４（Ｅｃｏ ＲＩ制限酵素消化により開環）で構成される３つのフラグメントの同時連結により調製した。プラスミドＩＣ３１０−２０４はｐＵＣ １８ベクターであり、そのＭＣＳの部分はＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｌ １３５ＩＩ制限酵素消化及び続く再連結により除去されている。ＩＣ ３０９−２０４は、ｐＡ７からＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａｌ Ｉを使用してｏｃｓフラグメントを単離し、それをＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａｌ Ｉで消化したｐＢＳ ＫＳベクター中にクローニングすることにより調製した。
プラスミドＩＣ ３１５−２０４から、３５Ｓプロモーター、大腸菌からのグルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｑｌｍｕ）、及びｏｃｓターミネーターをＥｃｏ ＲＩ制限酵素消化により単離し、Ｕｂｉ Ｂａｒベクター（ＷＯ ９７ ４４４７２）のＥｃｏ ＲＩ制限酵素部位中にクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３５９−２３７と名付けた。
ＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の導入のための開始プラスミドは、上にさらに記載するプラスミドＩＣ ２９９−２０４であり、そのコード配列をＳｄａ Ｉ及びＳｍａ Ｉ制限酵素消化により単離し、Ｕｂｉ ｂａｒベクターのＳｄａ Ｉ及びＨｐａ Ｉ制限酵素部位中に連結した。得られたベクターをＩＣ ３５５−２２２と名付けた。
プラスミドＩＣ ３５５−２２２から、ｇｌｍｍ遺伝子のコード配列をＳｐｅ Ｉ及びＤｒａ Ｉ制限酵素消化により単離し、ＩＣ ３５９−２３７プラスミドのＳｐｅ Ｉ及びＰｍｅ Ｉ制限酵素部位中にクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３６０−２３７と名付けた。
【０１５１】
１０．サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質、及びＧｌｃＮＡｃ−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質のためのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３９３−３３７の調製
サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮＡｃ−Ｐムターゼをコードする核酸配列の導入のための開始プラスミドは、上にさらに記載するプラスミドＩＣ ３０４−２０４であり、そのコード配列をＥｃｏ ＲＩ制限酵素消化により単離し、ｐＭＣＳ５ベクター（MoBiTec GmbH, Prod. No.: pMCS5）のＥｃｏ ＲＩ制限酵素部位中にクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３１３−２０４と名付けた。次の工程では、サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮＡｃ−Ｐムターゼをコードする核酸配列を、ベクターＩＣ ３１３−２０４からＰｍｅ Ｉ及びＰａｃ Ｉ制限酵素消化により単離し、Ｐｍｅ Ｉ及びＰａｃ Ｉで消化したベクターＩＣ ３９３−３３７中にクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３９４−３３７と名付けた。
プラスミドＩＣ ３９３−３３７の調製のための開始ベクターは上にさらに記載するプラスミドＩＣ ３９１−３３７であり、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質のための核酸配列を既に含んだ。この目的のために、上にさらに記載するＢ３３プロモーターをＰａｃ Ｉ及びＡｖｒ ＩＩ制限酵素消化により単離し、Ｐａｃ Ｉ及びＡｖｒ ＩＩで消化したベクターＩＣ ３９１−３３７中にクローニングした。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３９３−３３７と名付けた。
【０１５２】
１１．ジャガイモ植物の形質転換
ジャガイモ植物を、一般方法事項１に記載する方法に従って植物発現ベクターＩＣ ３４１−２２２（ソラナム・チュベロサムからのパパチン遺伝子Ｂ３３のプロモーターの制御下にあるパラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素のためのコード核酸配列を含む（Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29)）で形質転換した。
得られたジャガイモ植物を、プラスミドＩＣ ３４１−２２２で形質転換し、３６５ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られた植物を意味する）と名付けた。形質転換後に得られた栽培品種を、３６５ ＥＳ Ｘと名付け、問題になっている植物により合成されるヒアルロナンの量について分析した（ＷＯ ２００６ ０３２５３８も参照のこと）。栽培品種３６５ ＥＳ １３及び３６５ ＥＳ ７４を以下に記載の形質転換にために選んだ。
栽培品種３６５ ＥＳ １３及び３６５ ＥＳ ７４のジャガイモ植物を、植物発現ベクターＩＣ ３９２−３３７又はＩＣ ３６０−２３７又はＩＣ ３９４−３３７で、一般方法事項１に記載する方法に従って形質転換した。
プラスミドＩＣ ３９２−３３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ １３の得られたトランスジェニックジャガイモ植物を、４３７ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
プラスミドＩＣ ３９２−３３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ ７４の得られたトランスジェニックジャガイモ植物を、４３８ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
プラスミドＩＣ ３６０−２３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ １３の得られたトランスジェニックジャガイモ植物を、３９７ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
プラスミドＩＣ ３６０−２３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ ７４の得られたトランスジェニックジャガイモ植物を、３９８ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
プラスミドＩＣ ３９３−３３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ １３の得られたジャガイモ植物を、４４４ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
プラスミドＩＣ ３９３−３３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ ７４の得られたジャガイモ植物を、４４５ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
【０１５３】
１２．ヒアルロナン合成酵素をコードする、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする、及び、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を含むジャガイモ植物の分析
グリーンハウスでは、栽培品種３６５ ＥＳ １３、３６５ ＥＳ ７４、４３７ ＥＳ Ｘ、４３８ ＥＳ Ｘ、３９７ ＥＳ Ｘ、３９８ ＥＳ Ｘ、４４４ ＥＳ Ｘ、及び４４５ ＥＳ Ｘの個々の植物を６cmポット中の土壌で栽培した。植物の全地上部分を７〜９週目の植物から回収し、一般方法事項３に記載する方法に従って加工した。問題になっている植物抽出物中のヒアルロナンの量は、問題になっている植物抽出物の一定分量中に含まれるヒアルロナンを、一般方法事項４に記載する方法に従って、検量線を用いて測定することにより決定した。ヒアルロナン含量の決定のために、遠心分離後に得られた上清を１：１０希釈で使用した。選択した植物について、以下の結果を得た：
【０１５４】
【表１】
表１：栽培品種３６５ ＥＳ １３及び３６５ ＥＳ ７４の独立した選択されたトランスジェニック植物（ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを含む）により産生される、問題になっている植物の全地上部分中でのヒアルロナンの量（μg（ヒアルロナン）/g（新鮮重量））。カラム１は、材料を回収した植物の名称を示す（「ｗｔ Ｄｅｓｉｒｅｅ」は栽培品種Ｄｅｓｉｒｅｅの非形質転換野生型植物を指す）。カラム２は、用いた新鮮重量に基づくヒアルロナンの量を示す。
【０１５５】
【表２】
表２：栽培品種４３７ ＥＳ又は４３８ ＥＳの独立した選択されたトランスジェニック植物により産生される、問題になっている植物の全地上部分中でのヒアルロナンの量（μg（ヒアルロナン）/g（新鮮重量））。カラム１は、材料を回収した植物の名称を示す。カラム２は、用いた新鮮重量に基づくヒアルロナンの量を示す。
示した結果は、ヒアルロナン合成酵素をコードする、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする、及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を同時に含む植物が、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを含む植物よりも大幅に高いヒアルロナン量を合成することを例示する。
【０１５６】
【表３】
表３：栽培品種４９７ ＥＳ又は４９８ ＥＳの独立した選択されたトランスジェニック植物により産生される、問題になっている植物の全地上部分中でのヒアルロナンの量（μg（ヒアルロナン）/g（新鮮重量））。カラム１は、材料を回収した植物の名称を示す。カラム２は、用いた新鮮重量に基づくヒアルロナンの量を示す。
示した結果は、ヒアルロナン合成酵素をコードする、ならびに、ＧｌｃＮ−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質、ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を同時に含む植物が、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを含む植物よりも有意に高いヒアルロナン量を合成しないことを例示する。
【０１５７】
【表４】
表４：栽培品種４４４ ＥＳ又は４４５ ＥＳの独立した選択されたトランスジェニック植物により産生される、問題になっている植物の全地上部分中でのヒアルロナンの量（μg（ヒアルロナン）/g（新鮮重量））。カラム１は、材料を回収した植物の名称を示す。カラム２は、用いた新鮮重量に基づくヒアルロナンの量を示す。
示した結果は、ヒアルロナン合成酵素をコードする、ならびに、ＧｌｃＮ−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質及びＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を同時に含む植物が、ヒアルロナン合成酵素、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子だけを含む植物よりも有意に高いヒアルロナン量を合成しないことを例示する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増加した量のグルコサミノグリカンを合成する植物細胞及び植物、ならびに、そのような植物を調製するための方法、ならびに、また、これらの植物細胞又は植物を用いてグルコサミノグリカンを調製するための方法に関する。ここで、本発明の植物細胞又は遺伝子改変植物は、野生型の植物細胞又は野生型の植物と比較し、グルコサミノグリカン合成酵素活性及び加えて増加したグルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ活性及び増加したＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼ活性を有する。本発明は、さらに、増加したグルコサミノグリカン合成を有する植物細胞を含む組成物に関する。
【０００２】
プロテオグリカン、糖タンパク質のクラスは、とりわけ、軟骨の必須成分であり、コアタンパク質に付着し、繰り返し二糖単位で構成されるグルコサミノグリカンを有する。それらの部分のための繰り返し二糖単位は、特徴的な炭水化物結合配列を介して、コアタンパク質に共有結合的に付着する。二糖単位の組成に応じて、区別が、とりわけ、グルコサミノグリカンへパラン／ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、及びコンドロイチン／デルマタン硫酸の間でなされ、その二糖単位は各々、グルコサミン又はグルコサミン誘導体である分子を含む。ヒアルロナンは、さらなるグルコサミノグリカンであり、やはり、その二糖単位の成分の１つとしてグルコサミン（Ｎ−アセチル−グルコサミン）の誘導体を有するが、しかし、本来は、タンパク質に付着していない。ヒアルロナンを除き、言及したグルコサミノグリカンは自然で硫酸化ポリマーである。これらの物質において、硫酸基を二糖単位の種々の原子又は置換基に導入し、言及した物質が均一なポリマーではないが、しかし、各一般用語の下でまとめられるポリマーのグループであるようになっている。問題になっているポリマー基の個々の分子は、硫酸化の程度及び硫酸基を有するモノマーの位置の両方において異なりうる。
【０００３】
ヒアルロナンは、自然発生的な非分岐、直鎖ムコ多糖類（グルコサミノグリカン）であり、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の交互分子で構築される。ヒアルロナンの基本的な構成要素は、二糖グルクロン酸−ベータ−１，３−Ｎ−アセチル−グルコサミンからなる。ヒアルロナンにおいて、これらの繰り返し単位は、互いに、ベータ−１，４結合を介して付着する。薬学において、ヒアルロン酸という用語が頻繁に使用される。ヒアルロナンは、大半の場合において、遊離酸としてではなくポリアニオンとして存在するため、以下に、ヒアルロナンという用語が好ましく使用されるが、しかし、各々の用語は両方の分子形態を包含すると理解すべきである。
【０００４】
ヒアルロナンは、異常な物理的、化学的特性、例えば、高分子電解質の特性、粘弾性特性、水を結合する高い能力、ゲル形成の特性を有し、それらは、ヒアルロナンのさらなる特性に加えて、Lapcik et al.（1998, Chemical Reviews 98(8), 2663−2684）による総説文献に記載される。ヒアルロナンは、脊椎動物の細胞外結合組織及び体液の成分である。ヒトでは、ヒアルロン酸は、全ての体細胞、特に間葉細胞の細胞膜により合成され、身体において一様に存在し、結合組織、細胞外マトリクス、臍帯、滑液、軟骨組織、皮膚、及び眼の硝子体において特に高濃度である（Bernhard Gebauer, 1998, Inaugural-Dissertation, Virchow-Klinikum Medizinische Fakultat Charite der Humboldt Universitat zu Berlin; Fraser et al., 1997, Journal of Internal Medicine 242, 27-33）。最近、ヒアルロナンは、非脊椎動物の生物体（軟体動物）でも見出された（Volpi and Maccari, 2003, Biochimie 85, 619-625）。さらに、一部のヒト病原性グラム陽性細菌（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）グループＡ及びＣ）及びグラム陰性細菌（パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ））は、これらの細菌を、それらの宿主の免疫系による攻撃に対して防御するエキソ多糖類としてヒアルロナンを合成する。なぜなら、ヒアルロナンは非免疫原性物質であるからである。クロレラ属の単細胞緑藻類に感染するウイルスは、その一部がゾウリムシ種において内部共生体として存在し、単細胞緑藻類に、ウイルスによる感染後にヒアルロナンを合成する能力を与える（Graves et al., 1999, Virology 257, 15-23）。しかし、ヒアルロナンを合成する能力は、問題になっている藻類を特徴付ける特色ではない。藻類がヒアルロナンを合成する能力は、ウイルスでの感染により媒介され、そのゲノムはヒアルロナン合成酵素をコードする配列を有する（DeAngelis, 1997, Science 278, 1800-1803）。
【０００５】
ヒアルロナン合成の触媒作用は、単一の膜組込み酵素又は膜結合酵素である、ヒアルロナン合成酵素による影響を受ける。合成されたヒアルロナン分子の細胞質膜を越えた細胞周辺の培地中への転移の機構は、まだ完全には解明されていない。より初期の仮説では、細胞膜を越えた輸送は、ヒアルロナン合成酵素自体の影響を受けることが想定された。しかし、より最近の結果では、ヒアルロナン分子の細胞質膜を越えた輸送が、この作用に関与する輸送タンパク質を介したエネルギー依存的輸送により起こることが示されている。このように、能動輸送タンパク質の合成が阻害されたストレプトコッカス株が突然変異により生成された。これらの株は、対応する野生型細菌株よりも少ないヒアルロナンを合成した（Ouskova et al., 2004, Glycobiology 14(10), 931-938）。ヒト繊維芽細胞において、公知の輸送タンパク質を特異的に阻害する薬剤を用いて、産生されるヒアルロナンの量及びヒアルロナン合成酵素の活性の両方を低下させることが可能である（Prehm and Schumacher, 2004, Biochemical Pharmacology 68, 1401-1410）。仮にある場合、ヒアルロナンを輸送できる輸送タンパク質がどのくらいの量で植物中に存在するかは公知ではない。
【０００６】
ヒアルロナンの異常な特性によって、種々の分野、例えば、薬学、化粧品産業における適用のため、食品及び飼料の産生において、技術的適用（例えば、潤滑剤）などにおいて豊富な可能性を提供する。ヒアルロナンが現在使用されている最も重要な適用は、医薬及び化粧品の分野である（例えば、Lapcik et al., 1998, Chemical Reviews 98(8), 2663-2684, Goa and Benfield, 1994, Drugs 47(3), 536-566を参照のこと）。医学分野において、ヒアルロナン含有産物は、現在、関節症の関節内処置のため、及び、眼の手術のために使用される眼薬中で使用される。ヒアルロナンは、また、競走馬での関節障害の処置のために使用される。また、ヒアルロナンは一部の鼻科薬の成分であり、例えば、点眼薬及び鼻薬の形態で、乾燥した粘膜を湿らせるために役立つ。注射用のヒアルロナン含有溶液を、鎮痛剤及び抗リウマチ剤として使用する。ヒアルロナン又は誘導体化ヒアルロナンを含むパッチを創傷治癒に用いる。皮膚科薬として、ヒアルロナン含有ゲルインプラントを、形成外科において皮膚変形を矯正するために使用する。薬学的用途のために、高分子量を有するヒアルロナンの使用が好まれる。化粧品医学において、ヒアルロナン調製物は最も適した皮膚充填物質の１つである。ヒアルロナンを注射することにより、限られた時間期間にわたり、しわを伸ばし、唇の容積を増加することが可能である。化粧品産物中で、特に皮膚クリーム及びローション中で、ヒアルロナンは、その高い水結合能力を理由に、保湿剤として頻繁に使用される。
【０００７】
さらに、ヒアルロナン含有調製物は、いわゆる栄養補給食品（食品添加物）として販売され、関節症の予防及び軽減のために動物（例えば、イヌ、ウマ）でも使用できる。
【０００８】
商業目的のために使用されるヒアルロナンは、現在、動物組織（ケイトウ）から単離される、又は、細菌培養物を使用して発酵性に調製される。ＵＳ ４，１４１，９７３には、ケイトウから、又は、代わりに臍帯からヒアルロナンを単離するための方法が記載されている。ヒアルロナンに加えて、動物組織（例えば、ケイトウ、臍帯）は、また、ヒアルロナンに関連するさらなるムコ多糖類、例えば、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラタン硫酸、及びヘパリンを含む。さらに、動物生物体は、ヒアルロナンに特異的に結合し、生物体における最も異なる機能、例えば、肝臓でのヒアルロナンの分解、細胞移動のためのリード構造としてのヒアルロナンの機能、エンドサイトーシスの調節、ヒアルロナンの細胞表面への固定、又はヒアルロナンネットワークの形成に必要とされるタンパク質（ヒアルアドヘリン）を含む（Turley, 1991, Adv Drug Delivery Rev 7, 257 ff.; Laurent and Fraser, 1992, FASEB J. 6, 183 ff.; Stamenkovic and Aruffo, 1993, Methods Enzymol. 245, 195 ff; Knudson and Knudson, 1993, FASEB 7, 1233 ff.）。
【０００９】
ヒアルロナンの細菌産生のために使用されるストレプトコッカス株は、もっぱら、ヒトに病原性を持つ細菌である。培養中でも、これらの細菌は（発熱性）外毒素及び溶血素（ストレプトリジン、特にアルファ−及びベータ−溶血素）を産生し（Kilian, M.: Streptococcus and Enterococcus. In: Medical Microbiology. Greenwood, D.; Slack, RCA; Peutherer, J. F. (Eds.). Chapter 16. Churchill Livingstone, Edinburgh, UK: pp.174-188, 2002, ISBN 0443070776）、それらは培地中に放出される。これによって、ストレプトコッカス株を用いて調製されたヒアルロナンの精製及び単離がより困難になる。特に、薬学的用途では、調製物中での外毒素及び溶血素の存在が問題である。
ＵＳ ４，８０１，５３９には、突然変異細菌株（ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ））の発酵によるヒアルロナンの調製が記載されている。使用される突然変異細菌株は、ベータ−溶血素をもはや合成しない。達成される収量は、培養物１リットル当たり３．６gのヒアルロナンであった。
ＥＰ ０６９４６１６には、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）又はストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）を培養するための方法が記載されており、ここで、用いられる培養条件下で、ストレプトリジンは合成されず、しかし、増加量のヒアルロナンが合成される。達成される収量は、培養物１リットル当たり３．５gのヒアルロナンであった。
培養中に、ストレプトコッカス株は培地中に酵素ヒアルロニダーゼを放出し、その結果として、この産生系でも、分子量が精製中に低下する。ヒアルロニダーゼ陰性ストレプトコッカス株の使用又は培養中にヒアルロニダーゼの産生が阻害されるヒアルロナンの産生のための方法が、ＵＳ ４，７８２，０４６に記載されている。達成される収量は、培養物１リットル当たり２．５gのヒアルロナンまでであり、達成される最高平均分子量は３．８×１０６Daであり、分子量分布は２．４×１０６〜４．０×１０６であった。
ＵＳ ２００３０１７５９０２及びＷＯ ０３ ０５４１６３には、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）からのヒアルロナン合成酵素の異種発現を用いたヒアルロナンの調製が記載されている。十分量のヒアルロナンの産生を達成するために、ヒアルロナン合成酵素の異種発現に加えて、バチルス細胞中でのＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼの同時発現も必要とされる。ＵＳ ２００３０１７５９０２及びＷＯ ０３ ０５４１６３には、バチルス・スブチリスを用いた産生において得られる絶対量のヒアルロナンについて述べられていない。達成される最高平均分子量は約４．２×１０６である。しかし、この平均分子量は組換えバチルス株についてだけ達成され、ここでストレプトコッカス・エクイシミリスからのヒアルロナン合成酵素遺伝子をコードする遺伝子及びバチルス・スブチリスからのＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、ａｍｙＱプロモーターの制御下で、バチルス・スブチリスのゲノム中に組込まれ、ここで、同時に、バチルス・スブチリスの内因性ｃｘｐＹ遺伝子（チトクロムＰ４５０オキシダーゼをコードする）が不活化された。Chien and Lee（2007, Biotechnol. Prog. Online publication, ASAP Article 10.1021/bp070036w, S8756-7938(07)00036-7）は、種々の組換えバチルス・スブチリス株について記載している。１つの株は、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列及びＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列で形質転換されており、最大１．１４g/lのヒアルロナンを合成した。先ほど言及した核酸配列に加えて、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）ヘモグロビンをコードする核酸配列で形質転換した株は、１．８g/lのヒアルロナンを合成した。
【００１０】
ＷＯ ０６ ０３２５３８には、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子で形質転換されたトランスジェニック植物について記載されている。問題になっている植物中でのヒアルロナンの合成は、明確に実証された。
【００１１】
ＷＯ ０５ ０１２５２９には、クロレラ感染ウイルスからのヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を使用して形質転換されたトランスジェニックタバコ植物の産生が記載されている。ＷＯ ０５ ０１２５２９において、一方では、クロレラ・ウイルス株ＣＶＨ１、そして、他方では、タバコ植物を形質転換するためのクロレラ・ウイルス株ＣＶＫＡ１のヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列が使用された。ヒアルロナンの合成は、クロレラ・ウイルス株ＣＶＫＡ１から単離されたヒアルロナン合成酵素をコードする核酸で形質転換された植物についてだけ実証できた。クロレラ・ウイルス株ＣＶＨ１から単離されたヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列で形質転換されたタバコ植物について、対応するトランスジェニック植物においてヒアルロナン合成を検出することは可能ではなかった。ＷＯ ０５ ０１２５２９におけるヒアルロナン産生トランスジェニックタバコ植物だけにより合成されたヒアルロナンの量が、測定された容積１ml当たり約４．２μgのヒアルロナンであると述べられており、問題になっている実験を行うための説明を考慮に入れると、植物材料の新鮮重量１グラム当たりで産生される最大１２μgのヒアルロナンの量にほぼ相当する。
【００１２】
ＷＯ ２００７ ０３９３１４には、ヒアルロナン合成酵素の活性、及び、加えて、増加したグルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）活性を有するトランスジェニック植物が記載されている。これらの植物は、ヒアルロナン合成酵素の活性だけを有する植物と比較し、増加量のヒアルロナンを合成する。これらのタバコ植物により合成される最高量のヒアルロナンは、測定のために使用される植物材料の新鮮重量１グラム当たり約０．０３%である（ＷＯ ２００７ ０３９３１６における図５を参照のこと）。
【００１３】
ＷＯ ２００７ ０３９３１６には、ヒアルロナン合成酵素の活性、ならびに、加えて、野生型植物と比較し、増加したグルタミン：フルクトース６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）活性、及び、増加したＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼ（ＵＤＰ−Ｇｌｃ−ＤＨ）活性を有するトランスジェニック植物が記載されている。これらの植物は、ヒアルロナン合成酵素の活性及び同時にＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の活性を有する植物と比較し、増加量のヒアルロナンを合成する。これらのタバコ植物により合成される最高量のヒアルロナンは、測定のために使用される植物材料の新鮮重量１グラム当たり約０．２%である（ＷＯ ２００７ ０３９３１６における図６を参照のこと）。
【００１４】
さらに、ＷＯ ２００７ ０３９３１６には、植物細胞において発現されて、植物細胞においてヒアルロナンの合成量をさらに増加できるタンパク質のリストが含まれている。ＷＯ ２００７ ０３９３１６において提示されるタンパク質は、種々の生物において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成に関与する酵素の無作為なリストである。ＷＯ ２００７ ０３９３１６に列挙されるタンパク質は種々の酵素機能を有する。ＷＯ ２００７ ０３９３１６は、列挙される酵素が、トランスジェニック植物において発現された場合に、実際にヒアルロナン含量を増加させうるか否か、及び、それがいずれの酵素であるのかの示唆を与えていない。
【００１５】
コンドロイチン／デルマタン（［ベータ−１，４）］−［グルクロン酸−ベータ−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン］ｎ）の二糖鎖の合成は、コンドロイチン合成酵素により触媒され、ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、即ち、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）のエピマーから開始される（Kitagawa et al., 2001, J Biol Chem 276(42), 38721-38726）。エピメラーゼにより、コンドロイチンのグルクロン酸分子をイズロン酸に変換できる。グルクロン酸分子の１０%超がイズロン酸として存在する場合、ポリマーをデルマタンと呼ぶ。コンドロイチン又はデルマタンの二糖鎖の種々の位置での硫酸基の導入は、次に、他の酵素により触媒され、コンドロイチン／デルマタン硫酸の形成をもたらす。ここで、硫酸化の程度は分子ごとに異なりうる。
【００１６】
しばらくの間、コンドロイチン硫酸は、変形性関節症の処置のための潜在的な活性化合物として検討されてきた（Clegg et al., 2006, The New England Journal of Medicine 354(8), 795-808）。
【００１７】
ヘパリン／ヘパラン（ヘパロサン）（［アルファ−１，４］−［グルクロン酸−ベータ−１，４−グルコサミン］n又は［アルファ−１，４］−［イズロン酸−アルファ−１，４−グルコサミン］n）の二糖鎖の合成は、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素により触媒され、ＵＤＰ−ＧｌｃＡ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃから開始される（DeAngelis and White, 2004, J. Bacteriology 186(24), 8529-8532）。ヘパロサンのグルクロン酸分子をエピメラーゼによりイズロン酸に変換できる。ヘパロサンの二糖鎖の種々の位置での硫酸基の導入は、次に、他の酵素により触媒され、ヘパリン又はヘパラン硫酸の形成をもたらす。ヘパリン硫酸は、ヘパラン硫酸よりも大幅に高い硫酸基による置換を有する。ヘパリン硫酸は約９０%のイズロン酸分子を有するが、ヘパラン硫酸において、グルクロン酸分子が優勢である（Gallagher et al., 1992, Int. J. Biochem 24, 553-560）。コンドロイチン／デルマタン硫酸の場合のように、ヘパリン／ヘパラン硫酸の場合においても、硫酸化の程度は分子ごとに異なりうる。
ヘパリン硫酸を、とりわけ、抗凝固剤として、例えば、血栓症の予防及び処置のために使用する。
【００１８】
現在、コンドロイチン／デルマタン硫酸及びヘパリン／ヘパラン硫酸は、動物組織からの単離により調製される。コンドロイチン硫酸は主にウシ軟骨又はサメ軟骨から単離され、ヘパリン／ヘパラン硫酸はブタ腸又はウシ肺から単離される。コンドロイチン／デルマタン硫酸及びヘパリン／ヘパラン硫酸の二糖鎖は均一な硫酸化パターンを有さないため、均一な特定の産物を得ることは困難である。したがって、産物は常に種々の硫酸化の程度を有する分子の混合物である。既に記載した通り、グルコサミノグリカン、例えば、コンドロイチン硫酸又はヘパリン／ヘパラン硫酸が、現在、動物組織から単離される。所望の物質に加えて、これらの組織は他のグルコサミノグリカンも含む。個々のグルコサミノグリカンの分離は、仮に可能な場合でも、困難で費用がかかる。さらに、病原性微生物による、及び／又は、他の物質、例えば、ＢＳＥ又は鳥インフルエンザ病原体による動物組織の潜在的な汚染は、ヒトにおいて疾患を招きうるが、動物組織から単離されたグルコサミノグリカンを使用した場合に問題を引き起こす。患者において、動物タンパク質により汚染された医薬調製物の使用は、特に、患者が動物タンパク質にアレルギーを持つ場合、身体の不要な免疫学的反応をもたらしうる（ヒアルロナン調製物については、例えば、ＵＳ ４，１４１，９７３を参照のこと）。
また、動物原材料から調製された物質は、例えば、完全菜食主義者などの一部の生活方法において、又は、コーシャー食品の調製において許容できない。
動物組織からのグルコサミノグリカンの単離におけるさらなる問題は、動物組織がグルコサミノグリカン分解酵素も含むため、頻繁にグルコサミノグリカンの分子量が精製中に低下する効果にある。
動物組織から満足できる質及び純度で得ることのできるグルコサミノグリカンの量（収量）は低く（例えば、ケイトウからのヒアルロナン：０．０７９% w/w、ＥＰ ０１４４０１９、ＵＳ ４，７８２，０４６）、それは多量の動物組織が加工されなければならないことを意味する。
細菌株の発酵によるグルコサミノグリカンの産生は高コストと関連する。なぜなら、細菌を、費用がかかる制御培養条件下で密封された無菌容器内で発酵させなければならないからである（例えば、ヒアルロナンについて、ＵＳ ４，８９７，３４９を参照のこと）。さらに、細菌株の発酵により産生できるグルコサミノグリカンの量は、各場合において存在する産生設備により制限される。ここで、発酵槽が、物理法則の結果、過剰に大きな培養容積で構築できないことも考慮に入れなければならない。ここで、外から供給された物質の均質な混合について特に言及してよく（例えば、細菌のための必須栄養源、ｐＨを調節するための試薬、酸素）、効率的な産生に必要な培地は、大きな発酵槽中で、仮にある場合でも、大きな技術的出費を伴ってだけ確実にできる。
【００１９】
植物は、グルコサミノグリカン、例えば、ヒアルロナン、ヘパラン／ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、又はコンドロイチン／デルマタン硫酸を自然で産生しない。自然発生的な植物自体は、それらのゲノム中に、グルコサミノグリカンの合成を触媒するタンパク質をコードする任意の核酸を有さないが、多数の植物炭水化物が記載され、特性付けされてきたが、今までに、非感染自然植物細胞において言及したグルコサミノグリカンのいずれも検出することが可能ではない（Graves et al., 1999, Virology 257, 15-23）。
【００２０】
ＷＯ ９８ ３５０４７（ＵＳ ６，４４４，８７８）には、植物細胞におけるＧｌｃＮＡｃの合成のための代謝経路が記載されており、そこでは、グルコサミンが、複数の連続的な酵素触媒反応工程を経て、代謝産物ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチル−グルコサミン６−リン酸、及びＮ−アセチル−グルコサミン１−リン酸の形成を伴い、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換される。高濃度で、グルコサミン６−リン酸は植物細胞に有毒である（ＷＯ ９８ ３５０４７）。
植物について記載される代わりの代謝経路は、フルクトース６−リン酸及びグルタミンの反応を含み、グルコサミン６−リン酸を与え、それは続いて多数の連続的な酵素触媒反応工程を経て、代謝産物グルコサミン１−リン酸及びＮ−アセチル−グルコサミン１−リン酸の形成を伴い、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換される（Mayer et al., 1968, Plant Physiol. 43, 1097-1107）。
【００２１】
今日まで、植物が増加量のグルコサミノグリカンを合成するために、植物中でのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成のための代謝経路においてどのタンパク質活性を修飾しなければならないかは、依然として明らかではない。
【００２２】
したがって、植物において効率的な量のグルコサミノグリカンを調製するための代わりの手段及び方法を提供することが本発明の目的である。
【００２３】
この目的は、特許請求の範囲において言及する実施態様により達成される。
【００２４】
驚くべきことに、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする核酸分子を含み、及び、加えて、グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子、及び単機能性のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼの活性を含むタンパク質をコードする外来核酸分子を含む遺伝子改変植物細胞又は遺伝子改変植物が、グルコサミノグリカン合成酵素の活性（だけ）を有する植物細胞又は植物よりも有意に高い量のグルコサミノグリカンを産生することが見出されている。
【００２５】
このように、本発明は、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子を含む遺伝子改変植物細胞又は遺伝子改変植物に関し、遺伝子改変植物細胞又は遺伝子改変植物が、加えて、グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子及び単機能性のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を含むことを特徴とする。
【００２６】
細菌株の発酵によるグルコサミノグリカンの産生は高コストと関連する。なぜなら、細菌を、費用がかかる制御培養条件下で密封された無菌容器内で発酵させなければならないからである（例えば、ＵＳ ４，８９７，３４９を参照のこと）。さらに、細菌株の発酵により産生できるグルコサミノグリカンの量は、各場合において存在する産生設備により制限される。例えば、現在市販されているヒアルロナンの高コストは、このグルコサミノグリカンが、その特別な特性（例えば、粘弾性特性、水を結合する高い能力）にもかかわらず、工業的用途には利用可能ではない。
このように、グルコサミノグリカンを産生するための公知の手段と比較し、本発明の植物細胞及び本発明の植物は、それらが、グルコサミノグリカン合成酵素の活性だけを含む植物細胞又は植物と比較し、増加量のグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を合成するという利点を提供する。
【００２７】
ここで、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物の遺伝子改変は、任意の遺伝子改変でよく、植物細胞又は植物中への、グルコサミン合成酵素をコードする外来核酸分子の組込み及びグルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子の組込み及び単機能性のＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子の組込みをもたらす。
【００２８】
本発明に関連して、「グルコサミノグリカン合成酵素」という用語は、基質ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルドヘキソサミン（ＵＤＰ−ＡｌｄｏｈｅｘＮＡｃ）からグルコサミノグリカンを合成するタンパク質を意味すると理解すべきである。グルコサミノグリカンの触媒作用は、以下の一般的な反応スキームに従って起こる：
ｎＵＤＰ−ＧｌｃＡ ＋ ｎＵＤＰ−ＡｌｄｏｈｅｘＮＡｃ → ［ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ］ｎ ＋ ２ ｎＵＤＰ
【００２９】
好ましくは、上の反応順序で調製されたＵＤＰ−Ｎ−アセチル−アルドヘキソサミンは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン又はＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミンである。
【００３０】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の植物細胞又は本発明の植物に関し、ここでグルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子は、ヒアルロナン合成酵素又はコンドロイチン合成酵素又はヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする。
【００３１】
本発明に関連して、「ヒアルロナン合成酵素」（ＥＣ ２．４．１．２１２）という用語は、基質ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）及びＵＤＰＮ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からヒアルロナンを合成するタンパク質を意味すると理解すべきである。ヒアルロナンの合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ｎＵＤＰ−ＧｌｃＡ ＋ ｎＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ → ベータ−１，４−［ＧｌｃＡ−ベータ−１，３−ＧｌｃＮＡｃ］ｎ ＋ ２ ｎＵＤＰ
【００３２】
今までに試験されてきたヒアルロナン合成酵素は、２つのグループに分類できる：クラスＩのヒアルロナン合成酵素及びクラスＩＩのヒアルロナン合成酵素（DeAngelis, 1999, CMLS, Cellular and Molecular Life Sciences 56, 670-682）。脊椎動物からのヒアルロナン合成酵素は、同定されたアイソザイムによりさらに識別される。種々のアイソザイムが、アラブ数字により、それらの同定の順番で呼ばれる（例えば、ｈｓＨＡＳ１、ｈｓＨＡＳ２、ｈｓＨＡＳ３）。
【００３３】
ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子及び対応するタンパク質配列が、とりわけ、以下の生物について記載されている：ウサギ（カイウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ））ｏｃＨａｓ２（ＥＭＢＬ ＡＢ０５５９７８．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｏｃＨａｓ３（ＥＭＢＬ ＡＢ０５５９７９．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；ヒヒ（アヌビスヒヒ（Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｉｓ））ｐａＨａｓ１（ＥＭＢＬ ＡＹ４６３６９５．１）；カエル（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ））ｘｌＨａｓ１（ＥＭＢＬ Ｍ２２２４９．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｘｌＨａｓ２（ＤＧ４２）（ＥＭＢＬ ＡＦ１６８４６５．１）、ｘｌＨａｓ３（ＥＭＢＬ ＡＹ３０２２５２．１）；ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））ｈｓＨＡＳ１（ＥＭＢＬ Ｄ８４４２４．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｈｓＨＡＳ２（ＥＭＢＬ Ｕ５４８０４．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｈｓＨＡＳ３（ＥＭＢＬ ＡＦ２３２７７２．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；マウス（ムス・ムスクスル（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））ｍｍＨａｓ１（ＥＭＢＬ Ｄ８２９６４．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｍｍＨＡＳ２（ＥＭＢＬ Ｕ５２５２４．２， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ｍｍＨａｓ３（ＥＭＢＬ Ｕ８６４０８．２， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；ウシ（ボス・タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ））ｂｔＨａｓ２（ＥＭＢＬ ＡＪ００４９５１．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；トリ（ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ））ｇｇＨａｓ２（ＥＭＢＬ ＡＦ１０６９４０．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；ラット（ラッタス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））ｒｎＨａｓ １（ＥＭＢＬ ＡＢ０９７５６８．１， Ｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（１８） １８６７９−１８６７８）、ｒｎＨａｓ２（ＥＭＢＬ ＡＦ００８２０１．１）；ｒｎＨａｓ ３（ＮＣＢＩ ＮＭ＿１７２３１９．１， Ｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９（１８） １８６７９−１８６７８）、ウマ（エクウス・キャバルス（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ））ｅｃＨＡＳ２（ＥＭＢＬ ＡＹ０５６５８２．１， ＧＩ：２３４２８４８６）、ブタ（サス・スクローファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ））ｓｓｃＨＡＳ２（ＮＣＢＩ ＮＭ＿２１４０５３．１， ＧＩ：４７５２２９２１）、ｓｓｃＨａｓ ３（ＥＭＢＬＡＢ１５９６７５）、ゼブラフィッシュ（ゼブラ・ダニオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ））ｂｒＨａｓ１（ＥＭＢＬ ＡＹ４３７４０７）、ｂｒＨａｓ２（ＥＭＢＬ ＡＦ１９０７４２．１） ｂｒＨａｓ３（ＥＭＢＬ ＡＦ１９０７４３．１）；パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）ｐｍＨａｓ（ＥＭＢＬ ＡＦ０３６００４．２）；ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｓｐＨａｓ（ＥＭＢＬ， Ｌ２０８５３．１， Ｌ２１１８７．１， ＵＳ ６，４５５，３０４， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；ストレプトコッカス・エクイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓ）ｓｅＨａｓ（ＥＭＢＬ ＡＦ３４７０２２．１， ＡＹ１７３０７８．１）、ストレプトコッカス・ユベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）ｓｕＨａｓＡ（ＥＭＢＬ ＡＪ２４２９４６．２， ＵＳ ２００３０２３５８９３）、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）ｓｅｑＨａｓ（ＥＭＢＬ ＡＦ０２３８７６．１， ＵＳ ２００３０２３５８９３）；スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ｓｓＨＡＳ（ＵＳ ２００３０２３５８９３）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ）ｓｔＨａｓ（ＡＰ０００９８８．１）、パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｂｕｒｓａｒｉａ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｉｒｕｓ １）ｃｖＨＡＳ（ＥＭＢＬ Ｕ４２５８０．３， ＰＢ４２５８０， ＵＳ ２００３０２３５８９３）。
【００３４】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでグルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする。ヒアルロナン合成酵素をコードする問題になっている外来核酸分子は、好ましくは、ウイルスヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子である。好ましくは、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、藻類に感染するウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードする。
藻類感染ウイルスに関し、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、好ましくは、クロレラ感染ウイルスのヒアルロナン合成酵素、特に好ましくはパラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１のヒアルロナン合成酵素、及び、特に好ましくはＨ１株のパラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードする。
好ましくは、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とし、そのアミノ酸配列は少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号２の下に示すアミノ酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それが配列番号２の下に示すアミノ酸配列を有するヒアルロナン合成酵素をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号１又は配列番号３の下に示す核酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それが配列番号３の下に示す核酸配列を有すること、又は、外来核酸分子の配列が、遺伝コードの縮重のため、配列番号１又は３の下に示す核酸配列とは異なることを特徴とする。
【００３５】
２００４年８月２５日、パラメシウム・ブルサリア・クロレラウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードする合成核酸分子を含むプラスミドＩＣ ３４１−２２２を、番号ＤＳＭ１６６６４の下、ブダペスト条約に従い、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（Mascheroder Weg 1b, 38124 Brunswick, Germany）に寄託した。配列番号２の下に示すアミノ酸配列は、プラスミドＩＣ ３４１−２２２に組込まれた核酸配列のコード領域に由来しうるが、パラメシウム・ブルサリア・クロレラウイルスのヒアルロナン合成酵素をコードする。
【００３６】
したがって、本発明は、また、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子が、それが、そのアミノ酸配列がプラスミドＤＳＭ１６６６４中に挿入された核酸配列のコード領域に由来しうるタンパク質をコードすること、又は、それが、そのアミノ酸配列が少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、プラスミドＤＳＭ１６６６４中に挿入された核酸配列のコード領域に由来しうるアミノ酸配列と同一であるタンパク質をコードすることを特徴とする。
本発明は、また、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子が、それがプラスミドＤＳＭ１６６６４中に組込まれたヒアルロナン合成酵素コード核酸配列であること、又は、それが、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、プラスミドＤＳＭ１６６６４中に組込まれた核酸配列と同一であることを特徴とする。
【００３７】
本発明に関連して、「コンドロイチン合成酵素」（ＥＣ ２．４．１．１７５， ＥＣ １．４．１．２２６）という用語は、基質ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）からコンドロイチンを合成する２つのタンパク質からなるタンパク質又はタンパク質複合体を意味すると理解すべきである。コンドロイチンの合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ｎＵＤＰ−ＧｌｃＡ ＋ ｎＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ → ベータ−１，４−［ＧｌｃＡ−ベータ−１，３−ＧａｌＮＡｃ］ｎ ＋ ２ ｎＵＤＰ
【００３８】
一部の生物において、プロテオグリカンに付着したコンドロイチン分子の伸長は、２つの異なるタンパク質からなるコンドロイチン合成酵素の酵素複合体により触媒される。２つのタンパク質の１つ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＥＣ ２．４．１．１７５）は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンモノマーをベータ−１，４−付着を介して加え、第２タンパク質、Ｎ−アセチルガラクトサミニル−プロテオグリカン３−ベータ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２６）は、グルクロン酸モノマーをベータ−１，３−付着を介してコンドロイチン分子に加える。しかし、当業者は二機能性タンパク質にも精通しており、ここで単一のタンパク質がＮ−アセチル−ガラクトサミンモノマー及びグルクロン酸モノマーの両方をコンドロイチン分子に加える。
【００３９】
さらなる好ましい実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでグルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがコンドロイチン合成酵素をコードすることを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様は、本発明の植物細胞又は本発明の植物に関し、ここでコンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子は、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンモノマー及びグルクロン酸モノマーの両方をコンドロイチン分子に付着する二機能性コンドロイチン合成酵素をコードする。
【００４０】
本発明に関連して、「二機能性コンドロイチン合成酵素」という用語は、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＥＣ ２．４．１．１７５）の活性及びアセチルガラクトサミニル−プロテオグリカン３−ベータ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２６）の活性が１分子中に存在するタンパク質を意味すると理解すべきである。
【００４１】
単機能性のコンドロイチン合成酵素をコードする核酸分子及びそれに由来するアミノ酸配列が、例えば、細菌から（例えば、大腸菌、ＵＳ ２００３１０９６９３、ＥＰ １２８３２５９を参照のこと）、記載されている。
二機能性コンドロイチン合成酵素をコードする核酸分子及びそれに由来するアミノ酸配列が、例えば、哺乳動物（例えば、ホモ・サピエンス、ＷＯ ０３ ０１２０９９、ＵＳ ２００５０４８６０４、ＵＳ ２００６０５２３３５、ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＣ０４６２４７．１、ＢＣ０２３５３１．２；Kitagawa et al., 2001, J. Biol. Chem. 276(42), 38721-38726）又はパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｉｃｏｄａ）（ＵＳ ２００３１０４６０１， ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＦ１９５５１７， DeAngelis and Padgett-McCue, 2000, J. Biol. Chem. 275(31), 24124-24129）から、記載されている。
【００４２】
コンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子は、好ましくは、細菌コンドロイチン合成酵素をコードする、好ましくはパスツレラからのコンドロイチン合成酵素をコードする、特に好ましくはパスツレラ・マルトシダからのコンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子である。
好ましくは、コンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがコンドロイチン合成酵素をコードすることを特徴とし、そのアミノ酸配列は少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号５の下に示すアミノ酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、コンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それが配列番号５の下に示すアミノ酸配列を有するコンドロイチン合成酵素をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、コンドロイチン合成酵素をコードする外来核酸分子は、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号４の下に示す核酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、コンドロイチン合成酵素をコードする核酸分子は、それが配列番号４の下に示す核酸配列を有すること、又は、外来核酸分子の配列が、遺伝コードの縮重のため、配列番号４の下に示す核酸配列とは異なることを特徴とする。
【００４３】
本発明に関連して、「ヘパリン／ヘパロサン合成酵素」又は「ヘパロサン合成酵素」（ＥＣ ２．４．１．２２４， ＥＣ ２．４．１．２２５）という用語は、基質ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰ−ＧｌｃＡ）及びＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からヘパリン／ヘパランを合成する２つのタンパク質からなるタンパク質又は酵素複合体を意味すると理解すべきである。ヘパリン／ヘパランの合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ｎＵＤＰ−ＧｌｃＡ ＋ ｎＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ → アルファ−１，４−［ＧｌｃＡ−ベータ−１，４−ＧｌｃＮＡｃ］ｎ ＋ ２ ｎＵＤＰ
【００４４】
ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする核酸分子及びそれに由来するアミノ酸配列が、例えば、細菌から（パスツレラ・マルトシダＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏｓ： ＡＦ４２５５９１， ＡＦ４３９８０４， ＡＹ２９２１９９， ＡＹ２９２２００， ＵＳ ２００３００９９９６７， 大腸菌ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： Ｘ７７６１７．１）又はヒトから（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏｓ： ＢＣ００１１７４．１， ＮＭ＿２０７１２２．１）、記載されている。
【００４５】
一部の生物において、プロテオグリカンに付着したヘパリン／ヘパロサン分子の伸長は、２つの異なるタンパク質からなるヘパリン／ヘパロサン合成酵素の酵素複合体により触媒される。２つのタンパク質の１つ、グルクロノシル−Ｎ−アセチルグルコサミニル−プロテオグリカン４−アルファ−Ｎ−グルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２４）は、Ｎ−アセチル−グルコサミンモノマーをベータ−１，４−付着を介して加え、第２タンパク質、Ｎ−アセチルグルコサミニル−プロテオグリカン４−ベータ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．２２５）は、グルクロン酸モノマーをベータ−１，３−付着を介してヘパリン／ヘパラン分子に加える。しかし、当業者は二機能性タンパク質にも精通しており、ここで単一のタンパク質はＮ−アセチル−グルコサミンモノマー及びグルクロン酸モノマーの両方をヘパリン／ヘパロサン分子に加える。そのような二機能性ヘパリン／ヘパロサン合成酵素が、例えば、ヒトから（Busse and Kusche-Gullberg, 2003, J. Biol. Chem. 278(42), 41333-41337）又はパスツレラから（DeAngelis and White, 2004, J. Bacteriology 186(24), 8529-8532）、記載されている。ヘパリン／ヘパロサン合成酵素の活性を有する二機能性タンパク質は、ＥＣ番号２．４．１．２２４の下に分類される酵素の活性及びＥＣ番号２．４．１．２２５の下に分類される酵素の活性の両方を有する。
【００４６】
さらなる好ましい実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでグルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードすることを特徴とする。
本発明の好ましい実施態様は、本発明の植物細胞又は本発明の植物に関し、ここでヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子は、Ｎ−アセチル−グルコサミンモノマー及びグルクロン酸モノマーをヘパリン／ヘパラン分子に付着させる二機能性ヘパリン／ヘパラン合成酵素をコードする。
ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子は、好ましくは細菌ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする、好ましくはパスツレラからのヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする、特に好ましくはパスツレラ・マルトシダからのヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子である。
【００４７】
好ましくは、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それがヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードすることを特徴とし、そのアミノ酸配列は少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号７の下に示すアミノ酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子は、それが配列番号７の下に示すアミノ酸配列を有するヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする外来核酸分子は、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号６の下に示す核酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素をコードする核酸分子は、それが配列番号６の下に示す核酸配列を有すること、又は、外来核酸分子の配列が、遺伝コードの縮重のため、配列番号６の下に示す核酸配列とは異なることを特徴とする。
【００４８】
本発明に関連して、「グルコサミンリン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（アセチル−ＣｏＡ：Ｄ−グルコサミンリン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ又はＧｌｃＮ−Ｐアセチルトランスフェラーゼ）」（ＥＣ ２．３．１．４）という用語は、基質Ｄ−グルコサミンリン酸（ＧｌｃＮ−Ｐ）及びアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンリン酸（ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ）を合成するタンパク質を意味すると理解すべきである。Ｎ−アセチル−グルコサミン６−リン酸の合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ＧｌｃＮ−Ｐ ＋ ＡｃＣｏＡ → ＧｌｃＮＡｃ−Ｐ ＋ ＣｏＡＳＨ
【００４９】
示した反応方程式において、基質ＧｌｃＮ−Ｐはグルコサミン１−リン酸（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）又はグルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）のいずれかでありうる。
【００５０】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンの合成のための問題になっている代謝経路において、試験された細菌生物と真核生物の間の本質的な違いは、問題になっている代謝経路の異なる中間体をアセチル化反応の基質として使用することである。細菌生物において、ＧｌｃＮ−１−Ｐのアセチル化は、ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１５７）の活性を有するタンパク質により行われるが（Gehring et al., 1996, Biochemistry 35, 579-585）、真核動物又は菌類において、ＧｌｃＮ−６−Ｐのアセチル化は、グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．４）の活性を有するタンパク質により触媒される（Milewski et al., 2006, Yeast 23, 1-14、Wiley InterScience, DOI: 10.1002./yea.1337にオンラインで発表）。したがって、異なる生物において、異なる基質及び異なるタンパク質の両方をＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成のために使用する。
驚くべきことに、先行技術における開示（ＷＯ ２００７ ０２３６８２）とは対照的に、ＧｌｃＮ−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする任意の核酸分子を植物細胞中に導入することにより植物細胞において合成されるグルコサミノグリカンの量を増加させることは可能ではないことが見出されている。むしろ、ＧｌｃＮ−１−Ｐ（例えば、大腸菌からのｇｌｍｕ）をアセチル化するＧｌｃＮ−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子の導入によって植物細胞又は植物により合成されるグルコサミノグリカンの量における増加はもたらされないことが見出されている。したがって、本発明の植物細胞又は本発明の植物のために、外来核酸分子が、ＧｌｃＮ−６−Ｐをアセチル化反応のための基質として使用し、このためＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．４）の活性を有するタンパク質であるＧｌｃＮ−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードすることが必須である。対照的に、ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１５７）の活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、アセチル化反応のためにＧｌｃＮ−１−Ｐを使用し、本発明の植物細胞又は本発明の植物を産生するために適さない。
さらに、グルコサミン６−リン酸ムターゼ（ＧｌｃＮ−６−Ｐムターゼ）をコードする外来核酸分子を有する植物細胞又は植物は、ＧｌｃＮ−６−ＰのＧｌｃＮ−１−Ｐへの異性化を触媒し、有意に高い量のグルコサミノグリカンを合成しないことが見出されている。
【００５１】
本発明に関連して、「グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（アセチル−ＣｏＡ：Ｄ−グルコサミン６−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼ）」（ＥＣ ２．３．１．４）という用語は、基質Ｄ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）及びアセチル−ＣｏＡ（ＡｃＣｏＡ）からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）を合成するタンパク質として理解されるように意味する。Ｎ−アセチル−グルコサミン６−リン酸の合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ＧｌｃＮ−６−Ｐ ＋ ＡｃＣｏＡ → ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ ＋ ＣｏＡＳＨ
【００５２】
ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有する機能的形態のタンパク質は、ホモダイマーである。モノマーの三次構造は中央コア領域を有する。このコア領域は、４つのアルファ−ヘリックス及び６番目のベータ鎖（ベータ−６鎖）により囲まれた、５つの逆平行鎖（ベータ鎖１〜５）を有するベータ−シート構造からなる。ホモダイマーの形成中、サブユニットのベータ−６鎖と、それぞれの他のサブユニットの対応するベータ−６鎖との相互作用が存在する。
配列番号９の下に示すアミノ酸配列（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２６．１）は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする。配列番号９の下に示すアミノ酸配列において、アミノ酸７〜１１はベータ−１鎖を形成し、アミノ酸１３〜２６はアルファ−１鎖を形成し、アミノ酸３７〜４７はアルファ−２鎖を形成し、アミノ酸６２〜６９はベータ−２鎖を形成し、アミノ酸７４〜８６はベータ−３鎖を形成し、アミノ酸９２〜１０３はベータ−４鎖を形成し、アミノ酸１１１〜１２５はアルファ−３鎖を形成し、アミノ酸１３０〜１３６はベータ−５鎖を形成し、アミノ酸１３９〜１４６はアルファ−３鎖を形成し、そして、アミノ酸１５４〜１５９はベータ−６鎖を形成する。配列番号９の下に示す配列中のベータ−４鎖に存在するアミノ酸Ｇｌｕ（位置９８）、Ａｓｐ（位置９９）、及びＩｌｅ（位置１００）は、基質ＡｃＣｏＡと相互作用し、それらはそのカルボニル結合を極性化し、そして、それらはＡｃＣｏＡ及びＧｌｃＮ−６−ＰならびにＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼからなるテトラデリック（ｔｅｔｒａｅｄｒｉｃ）反応中間体においてＡｃＣｏＡの酸素原子の負電荷を安定化する。配列番号９の下に示す配列中のアミノ酸Ｔｙｒ（位置１４３）は、切除されるべきＣｏＡ分子のチオレートアニオンを安定化させる。反応の触媒作用中でのこれらの相互作用は、配列番号９の下に示す配列中のアミノ酸Ｌｅｕ（位置１３３）により支持される。反応の触媒作用中に、ＧｌｃＮ−６−Ｐは、ホモダイマーのモノマーの間に形成されるポケットにおいて結合し、ベータ−６鎖のアミノ酸残基がその形成に関与する。反応の触媒作用中に、配列番号９の下に示す配列中のアミノ酸Ａｓｐ（位置１３４）は、ＧｌｃＮ−６−Ｐのアミノ基の求核性を増加させる（Milewski et al., 2006, Wiley InterScience, www.interscience.wiley.com, DOI:10.1002/yea.1337にオンラインで発表）。問題になっている反応の触媒作用に関与するＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質のさらなるアミノ酸が、Peneff et al.（2004, J. Biological Chemistry 276(19), 16328-16334, 図１）に記載されている。
ここで、サッカロマイセス・セレビシエのアミノ酸配列について例示的な方法で、反応の触媒作用に関与するアミノ酸も、他の生物からのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において同定できる。例えば、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２７．１）からのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列においてアミノ酸Ｇｌｕ８８、Ａｓｐ８０、Ｉｌｅ９０、Ａｓｐ１２４、及びＴｙｒ１３３が存在する。
【００５３】
ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子及び対応するタンパク質配列が、とりわけ、以下の生物について記載されている：サッカロマイセス・セレビシエ（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２６．１）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２９．１）、カンジダ・アルビカンス（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２７．１）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＥ６２７５６．１）、シノラブディス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿０７３２５３．４， ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＡ６３４９７．１， ＣＡＡ０４４５３１．１）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＡＬ１３９１６．１）、ゼノパス・トロピカリス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒａｏｐｉｃａｌｉｓ）（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＣＲ７６００２１．２）、ムス・ムスクスル（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＥ３９８８６．１）、ホモ・サピエンス（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＣ０３４８２．１）、オランウータン（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ）（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＣＲ８５８９９６．１）、アカントアモエバ・ポリファガ・ミミウイルス（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｐｏｌｙｐｈａｇａ ｍｉｍｉｖｉｒｕｓ）（ＥＭＢＬ ＣＤＳ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＡＶ５０５８６．１）。既に記載した通り、反応の触媒反応に関与するアミノ酸残基は、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有する種々の生物に由来するタンパク質において保存されているが、一部の場合において、それらの配列は互いに非常低い同一性を有する。このように、サッカロマイセス・セレビシエ（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２６．１）からのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列は、カンジダ・アルビカンス（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２７．１）からの対応する配列とわずか４４%同一であり、シゾサッカロミセス・ポンベ（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＢ０１７６２９．１）からのものとわずか２５%の同一性を有する（Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ， ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ， ＤＯＩ：１０．１００２／ｙｅａ．１３３７にオンラインで発表）。問題になっているアミノ酸配列の互いの低い同一性にもかかわらず、ＧｌｃＮ−６−Ｐ−アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする全ての上記の配列が、本発明の植物細胞又は本発明の植物の産生に適する。
【００５４】
本発明に従い、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、任意の生物に由来しうる；好ましくは、核酸分子は、菌類、動物又は植物に、特に好ましくは菌類及び特に好ましくはサッカロマイセス・セレビシエに由来する。
好ましくは、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼをコードする外来核酸分子は、それがＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼをコードすることを特徴とし、そのアミノ酸配列は少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号９の下に示すアミノ酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、それが配列番号９の下に示すアミノ酸配列を有するＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号８の下に示す核酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸分子は、それが配列番号８の下に示す核酸配列を有すること、又は、外来核酸分子の配列が、遺伝コードの縮重のため、配列番号８の下に示す核酸配列とは異なることを特徴とする。
【００５５】
本発明に関連して、「ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ（２−アセトアミド−２−デオキシ−ｄ−グルコース１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ）（ＥＣ ２．７．７．２３）」という用語は、基質ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）からＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を合成するタンパク質を意味すると理解すべきである。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの合成は、以下の反応スキームに従って触媒される：
ＵＴＰ ＋ ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ ⇔ Ｐ−Ｐ ＋ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ
【００５６】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する原核生物タンパク質は、一般的に、二機能性タンパク質であり、上に示す反応（ＥＣ ２．７．７．２３）に加えて、グルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．１．１５７）の機能を有する。即ち、それらは、グルコサミン１−リン酸（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）のＮ−アセチル−グルコサミン１−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）へのＮ−アセチル化（ＧｌｃＮ−１−Ｐ ＋ ＡｃＣｏＡ → ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ ＋ ＣｏＡＳＨ）を触媒する（Gehring et al., 1996, Biochemistry 35, 579-585）。対照的に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する真核生物タンパク質は、上に記載した反応（ＵＴＰ ＋ ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ ⇔ Ｐ−Ｐ ＋ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を触媒するだけの単機能性タンパク質である（Mio et al., 1998, J. Biol. Chem. 273 (23), 14392-14397）。
【００５７】
本発明に関連して、「ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する単機能性タンパク質」という用語は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質について上に示す反応（ＵＴＰ ＋ ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ ⇔ Ｐ−Ｐ ＋ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）を触媒するタンパク質を意味すると理解すべきである。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する単機能性タンパク質は、ＧｌｃＮ−１−ＰのＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐへのアセチル化を触媒する（追加の）活性を有さない。したがって、ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する単機能性タンパク質は、従って、ＥＣ番号２．７．７．２３の下に分類されるタンパク質であるが、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する二機能性タンパク質は、ＥＣ番号２．７．７．２３の下に分類される酵素の活性及びＥＣ番号２．３．１．１５７の下に分類される酵素の活性の両方を有する。
【００５８】
驚くべきことに、先行技術における開示（例えば、ＷＯ ２００７ ０２３６８２）とは対照的に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性及びＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性（例えば、ｇｌｍＵ ａｕｓ Ｅ． ｃｏｌｉ、ＥＣ ２．７．７．２３及びＥＣ ２．３．１．１５７）を有する二機能性タンパク質をコードする外来核酸分子を有する、本発明の植物細胞又は本発明の植物は、増加量のグルコサミノグリカンを合成しないことが見出されている。したがって、本発明の植物細胞又は本発明の植物のために、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードする外来核酸分子が、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ（ＥＣ ２．７．７．２３）の活性を有する単機能性タンパク質をコードすることが必須である。したがって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードする外来核酸分子は、先ほど言及したＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性に加えて、ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．３．１．１５７）の追加活性を有するタンパク質をコードする必要なない。このように、それは、好ましくは、真核生物由来の外来核酸分子である。さらに、驚くべきことに、先行技術における開示（例えば、ＷＯ ２００７ ０２３６８２）とは対照的に、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質の発現及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質の発現に加えて、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｐムターゼ、ＥＣ ５．４．２．３）の発現は、植物細胞又は植物においてさらなる増加量のグルコサミノグリカンをもたらさないことが見出されている。
【００５９】
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する単機能性タンパク質をコードするアミノ酸配列は、タンパク質の間で高度に保存されているアミノ酸残基を含む。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する真核生物タンパク質をコードするアミノ酸配列は、各々の場合において、タンパク質の間で保存されている３つのドメインを有する。第１ドメインのコンセンサス配列は、ＧｌｙＧｌｙＧｌｎＸｘｘＴｈｒＡｒｇＬｅｕＧｌｙＸｘｘＸｘｘＸｘｘＰｒｏＬｙｓＧｌｙ（配列番号１１の下に示す配列中のアミノ酸１１１〜１２４）、第２ドメインのそれはＰｒｏ（Ａｓｐ又はＡｓｎ）ＧｌｙＡｓｎ（Ｇｌｙ又はＡｌａ）ＧｌｙＸｘｘＸｘｘＸｘｘＡｌａ（配列番号１１の下に示す配列中のアミノ酸２１９〜２２８）、そして、第３ドメインのそれはＬｙｓＸｘｘＧｌｕＸｘｘＰｈｅＸｘｘＰｈｅＡｓｐＸｘｘＰｈｅ（配列番号１１の下に示す配列中のアミノ酸３７７〜３８６）、ここでＸｘｘは任意のアミノ酸である。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する原核生物タンパク質（例えば、ｇｌｍＵ ａｕｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＥＡＹ４６９４９．１）は、真核生物からの対応するタンパク質の第１ドメインと類似の保存ドメイン（ＧｌｙＸｘｘＧｌｙＴｈｒ（Ａｒｇ又はＳｅｒ）ＸｘｘＸｘｘＸｘｘＸｘｘＰｒｏＬｙｓ）を有する。真核生物タンパク質のドメイン２及び３について、対応するドメインは原核生物タンパク質において見出されない（Mok and Edwards, 2000, J. Biol. Chem. 280(47), 39363-39372）。
【００６０】
配列番号１１の下に示すアミノ酸配列中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１２）、Ｇｌｙ（位置１１４）、Ｔｈｒ（位置１１５）、Ａｒｇ（位置１１６）、Ｐｒｏ（位置１２２）、及びＬｙｓ（位置１２３）は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする一次配列中で保存されている。配列番号１１の下に示すアミノ酸配列中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１２）、Ａｒｇ（位置１１６）、又はＬｙｓ（位置１２３）の交換は、実質的に不活性なタンパク質をもたらす。対照的に、配列番号１１の下に示すアミノ酸配列中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１４）、Ｔｈｒ（位置１１５）、又はＰｒｏ（位置１２２）の交換は、問題になっているタンパク質の活性の低下だけを示す。したがって、配列番号１１の下に示すアミノ酸配列中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１２）、Ａｒｇ（位置１１６）、及びＬｙｓ（位置１２３）は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質において触媒機能を有するアミノ酸である（Mio et al., 1998, J. Biol. Chem. 273(23), 14392-14397）。
【００６１】
ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＡＭ５４７０２．１）からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列において、アミノ酸Ｇｌｙ（位置１０８）は、配列番号１１の下に示す配列のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１２）に対応する。ランブル鞭毛虫からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列における、アミノ酸Ａｌａを介した、アミノ酸Ｇｌｙ（位置１０８）の交換も、タンパク質の活性のほぼ完全な低下をもたらす（Mok and Edwards, 2005, J. Biol. Chem. 280(47), 39363-39372）。ホモ・サピエンス（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＡ３１２０２．１）からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列におけるアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１１）（配列番号１１の下に示す配列中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１２）に対応する）の交換も、活性のほぼ完全な低下をもたらす（Wang-Gillam et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(2), 1433-1438）。ホモ・サピエンス（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＡ３１２０２）からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードするタンパク質中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置２２２）及びランブル鞭毛虫（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＡＭ５４７０２．１）から対応するタンパク質の対応するアミノ酸Ｇｌｙ（位置２１０）の交換は、両方の場合において同様に、活性のほぼ完全な低下をもたらし、言及したアミノ酸が、同様に、触媒作用に関与するアミノ酸であることを示す（Mok and Edwards, 2005, J. Biol. Chem. 280(47), 39363-39372）。ホモ・サピエンス（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＡＡ３１２０２）からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードするタンパク質中のアミノ酸Ｇｌｙ（位置２２４）の交換は、タンパク質の活性の大幅な、しかし、完全ではない喪失をもたらし、アミノ酸Ｐｒｏ（位置２２２）の交換は活性のわずかな低下だけをもたらす。このことから、配列番号１１の下に示す配列のアミノ酸Ｇｌｙ（位置２２１）及びＧｌｙ（位置２２３）がＵＴＰの認識に関与し、配列番号１１の下に示す配列のアミノ酸Ｇｌｙ（位置１１１）及びＧｌｙ（位置１１２）は、それぞれの一次配列において保存されており、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐの結合に関与すると結論付けた（Wang-Gillam et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(2), 1433-1438）。
【００６２】
上に言及した特性を有するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの単機能性の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子及び対応するタンパク質配列は、とりわけ、以下の生物について記載されている：ランブル鞭毛虫（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： ＡＡＭ５４７０２．１）、サッカロマイセス・セレビシエ（ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ： Ｘ７９３８０．１， ＮＣＢＩ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ： ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ： ＣＡＡ５５７９２７）、カンジダ・アルビカンス（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＸＭ＿７１５４８０．１）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ）（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＸＭ＿００１３８５１５１．１）、ムス・ムスクスル（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿１３３８０６．４）、タイリクオオカミ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ）（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＸＭ＿８４４７７４．１）；ボス・タウルス（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿００１０４６４０４．１）、ゼノパス・トロピカリス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（ＮＭ＿００１０１１１４２．１）、アフリカツメガエル（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＢＣ０７７８３６．１）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿１０２８４５．４）、ゼブラ・ダニオ（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿２１２６２１．１）、ホモ・サピエンス（ＮＣＢＩ ａｃｃ． Ｎｏ： ＮＭ＿００３１１５．３， ＥＭＢＬ ａｃｃ． Ｎｏ．： ＢＡＡ３１２０２．１）。
【００６３】
本発明に従って、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、任意の真核生物に由来しうる；好ましくは、核酸は、真菌、動物又は植物、特に好ましくは真菌、特に好ましくはサッカロマイセス・セレビシエに由来する。
好ましくは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、それがＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードすることを特徴とし、そのアミノ酸配列は少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号１１の下に示すアミノ酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、それが配列番号１１の下に示すアミノ酸配列を有するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする。
さらなる実施態様において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、特に好ましくは少なくとも９５%、及び、特に好ましくは少なくとも９８%、配列番号１０の下に示す核酸配列と同一である。特に好ましい実施態様において、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードする核酸分子は、それが配列番号１０の下に示す核酸配列を有すること、又は、外来核酸分子の配列が、遺伝コードの縮重のため、配列番号１０の下に示す核酸配列とは異なることを特徴とする。
【００６４】
本発明に関連して、「外来核酸分子」という用語は、対応する野生型植物細胞において自然発生しない、又は、野生型植物細胞において具体的な空間的配置で自然発生しない、又は、野生型植物細胞のゲノム中の、それが自然発生しない部位に局在化している、のいずれかの分子を意味すると理解すべきである。好ましくは、外来核酸分子は、組換え又は特定の空間的配置が植物細胞において自然発生しない種々のエレメントを含む組換え分子である。
【００６５】
本発明に関連して、「組換え核酸分子」という用語は、組換え核酸分子中に存在するもののような組み合わせにおいて自然に存在しない種々の核酸分子を含む核酸分子を意味すると理解すべきである。このように、組換え核酸分子は、グルコサミノグリカン合成酵素及び／又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及び／又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に加えて、また、言及した核酸分子との組み合わせにおいて自然に存在しない核酸配列を含みうる。グルコサミノグリカン合成酵素及び／又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及び／又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子との組み合わせでの組換え核酸分子に存在する言及した追加の核酸配列は、任意の配列でよい。例えば、それらは、ゲノム植物核酸配列でよい。追加の核酸配列は、好ましくは、調節配列（プロモーター、終結シグナル、エンハンサ―）、特に好ましくは植物組織において活性である調節配列、特に好ましくは植物組織において活性である組織特異的な調節配列である。組換え核酸分子を生成するための方法は、当業者に公知であり、遺伝子操作方法、例えば、ライゲーションによる核酸分子の連結、遺伝子組換え又は核酸分子のデノボ合成などを含む（例えば、Sambrok et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002)，ＩＳＢＮ：０４７１２５０９２９を参照のこと）。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様は、本発明の植物細胞又は本発明の植物に関し、その中において、外来核酸分子が植物細胞又は植物のゲノム中に安定的に組込まれる。
【００６７】
それらのゲノム中に（安定的に）組込まれた外来核酸分子、又は、それらのゲノム中に組込まれた、グルコサミノグリカン合成酵素及び／又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及び／又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする複数の核酸分子を有する遺伝子改変植物細胞及び遺伝子改変植物は、とりわけ、それらが、野生型植物細胞及び野生型植物においてそれぞれ自然発生しない外来核酸分子を含むという事実により、又は、そのような分子が、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物の、野生型植物細胞及び野生型植物においてそれぞれ発生しないゲノム中の部位（即ち、異なるゲノム環境中である）に組込まれる点において、野生型植物細胞及び野生型植物から識別できる。さらに、本発明のそのような遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物は、それらが、適宜、野生型植物細胞又は野生型植物において自然に存在するそのような分子のコピーに加えて、それらのゲノム中に組込まれた少なくとも１コピーの外来核酸分子を含む点で、非遺伝子改変野生型植物細胞及び非遺伝子改変野生型植物からそれぞれ識別できる。本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物中に導入された外来核酸分子が、野生型植物細胞又は野生型植物において既に自然に存在する追加コピーの分子である場合、本発明の遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物が、特に、この追加コピー／これらの追加コピーが、それ／それらが野生型植物細胞及び野生型植物においてそれぞれ存在しないゲノム中の部位に局在化するとの事実により、野生型植物細胞及び野生型植物からそれぞれ識別できる。
核酸分子の植物細胞及び植物のゲノム中への組込みが、遺伝的方法及び／又は分子生物学の方法により実証できる。核酸分子の植物細胞のゲノム又は植物のゲノム中への安定的な組込みは、遺伝された核酸分子を有する子孫において、安定的に組込まれた核酸分子が親世代と同じゲノム環境に存在することを特徴とする。植物細胞のゲノム又は植物のゲノムにおける核酸配列の安定的な組込みの存在は、当業者に公知の方法、とりわけ、ＲＦＬＰ分析（制限断片長多型）のサザンブロット解析（Nam et al., 1989, The Plant Cell 1, 699-705;Leister and Dean, 1993, The Plant Journal 4 (4), 745-750）を用いて、ＰＣＲに基づく方法、例えば、増幅断片の長さの差の分析（増幅断片長多型、ＡＦＬＰ）（Castiglioni et al., 1998, Genetics 149, 2039-2056;Meksem et al., 2001, Molecular Genetics and Genomics 265, 207-214;Meyer et al., 1998, Molecular and General Genetics 259, 150-160）などで、又は、制限エンドヌクレアーゼを使用して切断した増幅断片（増幅切断多型配列、ＣＡＰＳ）を使用して（Konieczny and Ausubel, 1993, The Plant Journal 4, 403-410;Jarvis et al., 1994, Plant Molecular Biology 24, 685-687;Bachem et al., 1996, The Plant Journal 9 (5), 745-753）、実証できる。
【００６８】
本発明に関連して、「野生型植物細胞」という用語は、本発明の遺伝子改変植物細胞の産生のための出発材料として役立った植物細胞を意味すると理解すべきであり、即ち、それらの遺伝情報が、導入され、そして、グルコサミノグリカン合成酵素及び／又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及び／又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の組込みをもたらす遺伝的改変は別として、本発明の遺伝子改変植物細胞のものに対応する。
【００６９】
本発明に関連して、「野生型植物」という用語は、本発明の遺伝子改変植物の産生のための出発材料として役立った植物を意味すると理解すべきであり、即ち、それらの遺伝情報が、導入され、そして、グルコサミノグリカン合成酵素及び／又はＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及び／又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の組込みをもたらす遺伝的改変は別として、本発明の遺伝子改変植物のものに対応する。
【００７０】
本発明に関連して、「ゲノム」という用語は、植物細胞中に存在する全遺伝物質を意味すると理解すべきである。核に加えて、他の画分（例えば、色素体、ミトコンドリア）も遺伝物質を含むことが当業者に公知である。
【００７１】
核酸分子を植物宿主細胞中に（安定的に）組込むための多数の技術を利用可能である。これらの技術は、形質転換、プロトプラスト融合、注入、ＤＮＡのエレクトロポレーション、微粒子銃アプローチによるＤＮＡの導入、及び、また、さらなる選択肢の手段として、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用したｔ−ＤＮＡでの植物細胞の形質転換を含む（“Transgenic Plants”, Leandro ed., Humana Press 2004, ISBN 1-59259-827-7の総説）。植物細胞のアグロバクテリウム媒介性の形質転換の使用は、徹底的な試験の対象であり、ＥＰ １２０５１６；Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), Chapter V;Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46及びAn et al. EMBO J. 4, (1985), 277-287において網羅的に記載されている。ジャガイモの形質転換については、例えば、Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29-33を参照のこと。トマト植物の形質転換については、例えば、ＵＳ ５，５６５，３４７を参照のこと。
【００７２】
アグロバクテリウム形質転換に基づくベクターを使用した単子葉植物の形質転換も記載されている（Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506;Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282;Deng et al, Science in China 33, (1990), 28-34;Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80;May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492;Conner and Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555;Ritchie et al, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265）。単子葉植物を形質転換するための代わりのシステムは、微粒子銃アプローチを使用した形質転換（Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317 325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631）、プロトプラスト形質転換、部分的透過性細胞のエレクトロポレーション、グラスファイバーを使用したＤＮＡの導入である。特に、トウモロコシの形質転換が、文献中に数回記載されている（ＷＯ９５／０６１２８、ＥＰ０５１３８４９、ＥＰ０４６５８７５、ＥＰ０２９２４３５；Fromm et al., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon Kamm et al., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726を参照のこと）。他の草、例えば、サトウキビ（Bower and Birch, 1992, Plant Journal 2(3), 409-416; Bower et al., 1996 Molecular Breeding 2, 239-249; Arencibia et al., 1998, Transgenic Research 7, 213-222）又はアワ（Casas et al., 1993, PNAS 90, 11212-11216；ＵＳ ６，３６９，２９８）のスイッチグラス（Panicum virgatum, Somleva et al., 2002 Crop Science 42: 2080 - 2087; Richards et al., 2001, Plant Cell Reporters 20, 48-54）などの形質転換も記載されている。
他の穀物種での形質転換の成功が、また、例えば、オオムギ（Wan and Lemaux, s.o.; Ritala et al., s.o.; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74）及びコムギ（Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker et al., 1994, Plant Journal 5, 299-307）について記載されている。上の方法の全てが本発明に関して適する。
【００７３】
先行技術と比較し、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物は、それらがグルコサミノグリカン合成酵素の活性だけを有する植物よりも多量のグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を産生するという利点を提供する。これによって、ほとんど費用をかけずにグルコサミノグリカンを産生することが可能になる。なぜなら、より高いグルコサミノグリカン含量を有する植物からのグルコサミノグリカンの単離は、それほど複雑ではなく、より費用効率が高いからである。さらに、先行技術に記載した植物と比較し、より小さな栽培面積が、本発明の遺伝子改変植物を使用してグルコサミノグリカンを産生するために必要とされる。これは、それが現在、その希少性及び高価格のために使用されない工業的用途のためでさえ十分量でグルコサミノグリカンを産生する可能性をもたらす。クロレラ属のウイルス感染植物生物は、比較的多量のグルコサミノグリカン（ヒアルロナン）を産生するためには不適である。グルコサミノグリカン（ヒアルロナン）の産生において、ウイルス感染藻類は、グルコサミノグリカン合成酵素に必要とされる遺伝子がそれらのゲノム中に安定的に組込まれず（Van Etten and Meints, 1999, Annu. Rev. Microbiol. 53, 447-494）、そのため、グルコサミノグリカン（ヒアルロナン）を産生するために、ウイルス感染を繰り返さなければならないという不利点を有する。したがって、持続的に所望の質及び量のグルコサミノグリカン（ヒアルロナン）を合成する個々のクロレラ細胞を単離することは可能ではない。さらに、ウイルス感染したクロレラ藻類において、グルコサミノグリカン（ヒアルロナン）は限られた期間だけ産生され、ウイルスが原因となる溶解の結果として、藻類は感染からわずか約８時間後に死滅する（Van Etten et al., 2002, Arch Virol 147, 1479-1516）。対照的に、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物を、無制限な方法で栄養的又は有性的に繁殖でき、それらがグルコサミノグリカン（ヒアルロナン）を持続的に産生するという利点を提供する。
ＷＯ ０５ ０１２５２９に記載されるトランスジェニック植物は、ヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子を有し、比較的少量のグルコサミノグリカン（ヒアルロナン）を合成する。対照的に、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物が大幅に多量のグルコサミノグリカンを合成するという利点を提供する。
【００７４】
したがって、本発明は、また、グルコサミノグリカンを合成する本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物を提供する。
好ましい実施態様において、本発明の植物細胞又は本発明の植物は、コンドロイチン、ヘパリン／ヘパロサン、及びヒアルロナンからなる群より選択されるグルコサミノグリカンを合成する。
【００７５】
本発明の遺伝子改変植物中の新鮮重量に関して、グルコサミノグリカン含量を測定するために、好ましくは、植物、即ち、根を除く全ての植物部分の上の全粉砕材料を使用する。
グルコサミノグリカンを合成する本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物は、それらにより合成されるグルコサミノグリカンを単離し、その構造を確認することにより同定できる。植物組織は、それが任意のグルコサミノグリカンを含まないという利点を有するため、簡単で速い単離方法を、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物におけるグルコサミノグリカンの存在を実証するために使用できる。植物組織は、それが任意のグルコサミノグリカン分解酵素を含まないという利点を有するため、簡単で速い単離方法を、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物におけるグルコサミノグリカンの存在を実証するために使用できる。この目的のために、水を検証すべき植物組織に加えて、そして、植物組織を次に機械的に粉砕する（例えば、ビード・ミル、ワーリングブレンダー、ジュース抽出器などを用いて）。必要な場合、より多くの水を次に懸濁液に加えてよく、そして、細胞残骸及び不水溶性成分をその後に遠心分離により除去する。遠心分離後に得られた上清中のグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）の存在を、次に、例えば、関連するグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）に特異的に結合するタンパク質を使用して実証できる。
種々のグルコサミノグリカンについての免疫学的試薬（ＥＬＩＳＡ）に基づくそのようなテストキットが、当業者に公知であり、市販されている（例えば、ヘパリンのためのテストキット：Lifespan Technologies, 2401 Foothill Drive, Salt Lake City, UT 84109-1405, Prod. No.: K-2100）。
ヒアルロナンに特異的に結合するタンパク質を用いたヒアルロナンの検出のための方法が、例えば、ＵＳ ５，０１９，４９８に記載されている。ＵＳ ５，０１９，４９８に記載されている方法を行うためのテストキットが市販されている（例えば、Corgenix, Inc.（Colorado, USA）からのヒアルロン酸（ＨＡ）テストキット（Prod. No. 029-001）；一般方法事項４も参照のこと）。
コンドロイチンが、例えば、免疫学的方法を用いて検出できる（Mizuguchi et al., 2003, Nature 423, 443-448）。
遠心分離の上清中でのグルコサミノグリカンの存在は、さらに、他の分析方法、例えば、ＩＲ、ＮＭＲ、又は質量分析などを使用して確認することもできる。
【００７６】
本発明の植物の発生時間にわたり、グルコサミノグリカンが植物組織中に蓄積することが観察されているため、本発明の遺伝子改変植物における新鮮重量に関するグルコサミノグリカンの量は、特に好ましくは、問題になっている植物の回収時又は回収（１又は２）日前に測定する。
【００７７】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、それらが、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを有する遺伝子改変植物細胞と比較し、もしくは、遺伝子改変植物と比較し、又は、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子を有し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸を有さず、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を有さない遺伝子改変植物と比較し、増加量のグルコサミノグリカンを産生することを特徴とする。
【００７８】
好ましくは、本発明の遺伝子改変植物細胞中又は本発明の遺伝子改変植物中の植物材料の新鮮重量に関して産生されるグルコサミノグリカンの量は、グルコサミノグリカン合成酵素の活性（だけ）を有する、対応する遺伝子改変植物細胞と比較し、又は、対応する遺伝子改変植物と比較し、少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．４倍、特に好ましくは少なくとも１．６倍、そして、特に好ましくは少なくとも１．８倍増加する。本発明の遺伝子改変植物細胞中又は本発明の遺伝子改変植物中の植物材料の新鮮重量に関するグルコサミノグリカン含量の増加を測定するために、好ましくは、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物と対応する植物細胞及び植物（グルコサミノグリカン合成酵素活性（だけ）を有する）をそれぞれ比較し、ここで植物細胞又は植物の等価材料（例えば、葉、塊茎）を比較すべきであり、この材料を取った植物細胞又は植物を同じ条件下で栽培しており、そして、ここで同等の齢（発生段階）を有する植物材料のグルコサミノグリカン含量を比較すべきである。例えば、植物の若葉は、異なる植物の古葉と比較すべきではない。同じことを、植物の全地上部分のグルコサミノグリカン含量の測定に適用する。比較すべき植物は、同等の条件下で培養されたはずであり、同じ発生段階を有する。
【００７９】
好ましい実施態様において、本発明は、植物材料の新鮮重量（ＦＷ）１g当たり少なくとも１６０μg、好ましくは少なくとも１８０μg、特に好ましくは少なくとも２００μg、特に好ましくは少なくとも２２５μg、そして、最も好ましくは少なくとも２５０μgのグルコサミノグリカンを合成する本発明の植物細胞又は本発明の植物に関する。
さらなる実施態様において、本発明の植物細胞又は本発明の植物は、植物材料の新鮮重量（ＦＷ）１g当たり最大４５０μg、好ましくは最大４００μg、特に好ましくは最大３００μg、特に好ましくは最大２８０μg、そして、最も好ましくは最大２６０μgのグルコサミノグリカンを合成する。
【００８０】
本発明のさらなる実施態様において、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物はそれぞれ緑色陸生植物の植物細胞又は緑色陸生植物であり、グルコサミノグリカンを合成する。
【００８１】
本発明に関連して、「緑色陸生植物（Ｅｍｂｒｙｏｐｈｙｔａ）」という用語は、Strasburger, “Lehrbuch der Botanik”[Textbook of Botany], 34th ed., Spektrum Akad. Verl., 1999, (ISBN 3-8274-0779-6)に定義される通りに理解すべきである。
【００８２】
本発明の好ましい実施態様は、多細胞植物又は多細胞生物である本発明の遺伝子改変植物の本発明の遺伝子改変植物細胞に関する。したがって、この実施態様は、単細胞植物（原生生物）に由来しない、又は、原生生物ではない植物細胞又は植物に関する。
【００８３】
本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物は、原則として、それぞれ任意の植物種、即ち、単子葉植物及び双子葉植物の両方の植物細胞及び植物でよい。それらは、好ましくは、作物植物、即ち、ヒト及び動物に与える目的のため、又は、バイオマスを産生するため、及び／又は、技術的、工業的な目的のための物質を調製するために、ヒトにより栽培される植物である（例えば、トウモロコシ、コメ、コムギ、アルファルファ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、カサバ、ジャガイモ、トマト、スイッチグラス（パニカム・ヴーガラタム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ））、サゴ、リョクトウ、エンドウ、モロコシ、ニンジン、ナス、ダイコン、アブラナ、ダイズ、ピーナッツ、キュウリ、カボチャ、メロン、ニラ、ニンニク、キャベツ、ホウレンソウ、サツマイモ、アスパラガス、ズッキーニ、レタス、アーティチョーク、スイートコーン、パースニップ、フタナミソウ、キクイモ、バナナ、サトウダイコン、サトウキビ、ビート、ブロッコリー、キャベツ、タマネギ、黄色ビート、タンポポ、ストロベリー、リンゴ、アンズ、プラム、桃、ブドウ、カリフラワー、セロリ、ピーマン、スウェーデンカブ、ルバーブ）。トウモロコシ、サトウキビ、サツマイモ又は糖キビ（ｓｕｇａｒ ｍｉｌｌｅｔ）が特に好ましく、トマト又はジャガイモ植物が非常に特に好ましい。
【００８４】
好ましい実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関し、ここでタンパク質をコードする外来核酸分子は、外来核酸分子のコドンが、元の生物のそれぞれのタンパク質をコードする核酸分子のコドンと比較して改変されていることを特徴とする。特に好ましくは、外来核酸分子のコドンは改変され、それらは、そのゲノム中にそれらが組込まれた、又は、組込まれるはずである植物細胞又は植物のコドン使用頻度に適応するようにする。
【００８５】
遺伝コードの縮重のため、アミノ酸は１つ又は複数のコドンによりコードされうる。様々な生物において、アミノ酸をコードするコドンを異なる頻度で使用する。コード核酸配列のコドンを、ゲノム中に発現させるべき配列が組込まれるはずである植物細胞又は植物におけるそれらの使用頻度に適応させることは、特に植物細胞又は植物における、増加量の翻訳タンパク質及び／又は問題になっているｍＲＮＡの安定性に寄与しうる。問題になっている植物細胞又は植物におけるコドン使用頻度は、特定のコドンが特定のアミノ酸をコードするために使用される頻度について、問題になっている生物のコード核酸配列を可能な限り多く検証することにより、当業者により決定できる。特定の生物のコドン使用頻度は当業者に公知であり、コンピュータプログラムを使用した簡単で迅速な方法で決定できる。適したコンピュータプログラムは公的にアクセス可能であり、無料で、とりわけ、インターネット（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｇｃｕａ．ｓｃｈｏｅｄｌ．ｄｅ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ．ｃｏｍ／ｅｎｇ／ｃｕｔａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）で提供される。コード核酸配列のコドンを、ゲノム中に発現させるべき配列が組込まれるはずである植物細胞又は植物におけるそれらの使用頻度に適応させることは、インビトロ突然変異生成により、又は、好ましくは、遺伝子配列のデノボ合成により行うことができる。核酸配列のデノボ合成のための方法は当業者に公知である。デノボ合成は、例えば、最初に個々の核酸オリゴヌクレオチドを合成すること、これらをそれに相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすること、それによりそれらがＤＮＡ二本鎖を形成するようにし、そして次に個々の二本鎖オリゴヌクレオチドを連結すること、それにより所望の核酸配列が得られるようにすることにより行うことができる。コドンが特定の標的生物に使用される頻度の適応を含む、核酸配列のデノボ合成は、このサービスを提供する会社（例えば、Entelechon GmbH, Regensburg, Germany）へ供給することもできる。
【００８６】
本発明に関連して、「同一性」という用語は、少なくとも６０%、特に同一性において、少なくとも７０%、好ましくは少なくとも８０%、特に好ましくは少なくとも９０%、そして、特に好ましくは少なくとも９５%のタンパク質をコードする、核酸分子のコード領域の全長又はアミノ酸配列の全長にわたる配列同一性を意味する。本発明に関連して、「同一性」という用語は、パーセントで表わされる、他のタンパク質／核酸と同一のアミノ酸／ヌクレオチドの数（同一性）を意味すると理解すべきである。好ましくは、ヒアルロナン合成酵素の活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号２の下に与えるアミノ酸配列との比較により決定し、ヒアルロナン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号１又は配列番号３の下に与える核酸配列との比較により決定し、コンドロイチン合成酵素の活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号５の下に示すアミノ酸配列との比較により決定し、又は、コンドロイチン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号４の下に示す核酸配列との比較により決定し、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素の活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号７の下に示すアミノ酸配列との比較により決定し、又は、ヘパリン／ヘパロサン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号６の下に示す核酸配列との比較により決定し、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号９の下に示すアミノ酸配列との比較により決定し、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号８の下に示す核酸配列との比較により決定し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質に関する同一性は、配列番号１１の下に与えるアミノ酸配列との比較により決定し、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する同一性は、配列番号１０の下に示す核酸配列との比較により決定する（他のタンパク質／核酸とコンピュータプログラムを用いて）。互いに比較すべき配列が異なる長さである場合、同一性は、より短い配列がより長い配列と共有するアミノ酸の数のパーセントでの同一性を決定することにより決定すべきである。好ましくは、同一性は、公知の公的に利用可能なコンピュータプログラムClustalW（Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680）を使用して決定する。ClustalWは、Julie Thompson（Thompson@EMBL-Heidelberg.DE）及びToby Gibson（Gibson@EMBL-Heidelberg.DE）、European Molecular Biology Laboratory（Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germany）により公的に利用可能にされている。ClustalWは、また、種々のインターネットページから、とりわけ、ＩＧＢＭＣ（Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, France； ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｐｕｂ／）から、ならびに、ＥＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／）及びＥＢＩ（European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK）の全ての類似のインターネットページからダウンロードできる。
好ましくは、バージョン１．８のClustalWコンピュータプログラムを使用し、本発明に関連して記載するタンパク質と他のタンパク質の間の同一性を決定する。ここで、パラメーターを以下の通りに設定しなければならない：ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＴＯＰＤＩＡＧ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝５、ＰＡＩＲＧＡＰ＝３、ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰＥＸＴＥＮＤ＝０．０５、ＧＡＰＤＩＳＴ＝８、ＭＡＸＤＩＶ＝４０、ＭＡＴＲＩＸ＝ＧＯＮＮＥＴ、ＥＮＤＧＡＰＳ（ＯＦＦ）、ＮＯＰＧＡＰ、ＮＯＨＧＡＰ。
好ましくは、バージョン１．８のClustalWコンピュータプログラムを使用し、例えば、本発明に関連して記載する核酸分子のヌクレオチド配列と他の核酸分子のヌクレオチド配列の間の同一性を決定する。ここで、パラメーターを以下の通りに設定しなければならない：ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＴＯＰＤＩＡＧＳ＝４、ＰＡＩＲＧＡＰ＝５、ＤＮＡＭＡＴＲＩＸ：ＩＵＢ、ＧＡＰＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰＥＸＴ＝５、ＭＡＸＤＩＶ＝４０、ＴＲＡＮＳＩＴＩＯＮＳ：非加重。
【００８７】
同一性は、さらに、問題になっている核酸分子又はそれらによりコードされるタンパク質の間の機能的及び／又は構造的な等価性が存在することを意味する。上に記載する分子と相同であり、これらの分子の派生物を表わす核酸分子は、一般的に、同じ生物学的機能を有する改変を表わすこれらの分子のバリエーションである。それらは、自然発生のバリエーション、例えば、他の種からの配列、又は突然変異のいずれかでありうるが、ここでこれらの突然変異は自然の方法で発生したかもしれず、又は、標的突然変異生成により導入された。さらに、バリエーションは合成的に産生された配列でありうる。対立遺伝子変異体は、自然発生する変異体又は合成的に産生された変異体又は組換えＤＮＡ技術により生成された変異体のいずれかでありうる。特別な形態の派生物は、例えば、遺伝コードの縮重による、本発明に関連して記載する核酸分子とは異なる核酸分子である。
【００８８】
異なる核酸分子の派生物によりコードされるタンパク質は、特定の共通する特徴を有する。
これらは、例えば、生物学的活性、基質特異性、分子量、免疫学的反応性、立体構造などでありうる。
【００８９】
本発明は、さらに、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする、及び、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする、及び／又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする、植物細胞又は植物のゲノム中に組込まれた外来核酸分子が、植物細胞において転写を開始する調節エレメント（プロモーター）に連結されていることを特徴とする、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物を提供する。これらは同種又は異種のプロモーターでありうる。プロモーターは、構成的、組織特異的、発生特異的、又は、外部因子（例えば、化学物質の適用後、熱及び／又は冷気、渇水、疾患などの非生物因子の作用による）により調節されうる。ここで、グルコサミノグリカン合成酵素又はＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物のゲノム中に組込まれ、各々の場合において、同じプロモーターに付着できる、又は、異なるプロモーターを個々の配列に付着できる。ここで、２つ又は３つのプロモーターが、任意の組み合わせで存在でき、各々の場合において、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物においてグルコサミノグリカン合成酵素、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする関連核酸分子に付着される。
【００９０】
本発明の好ましい実施態様は、グルコサミノグリカン合成酵素、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子からなる群より選択される、少なくとも１つの外来核酸分子、特に好ましくは少なくとも２つの外来核酸分子、特に好ましくは３つの外来核酸分子が、組織特異的プロモーターに連結される、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物に関する。好ましい組織特異的プロモーターは、特異的に植物の塊茎、果実もしくは種子細胞、又は葉において転写開始を開始するプロモーターである。
【００９１】
一般的に、植物細胞において活性である各プロモーターは、グルコサミノグリカン合成酵素、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の発現に適する。
ここで、プロモーターは、発現が、構成的である、又は、特定の組織中、植物発生の特定の時点又は外部因子により決定される時間点だけであるように選んでよい。植物に関して、及び、発現される核酸分子に関して、プロモーターは同種又は異種でありうる。
適したプロモーターは、例えば、構成的発現のためのカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ ＲＮＳのプロモーター又はトウモロコシに由来するユビキチンプロモーター（Christensen and Quail, 1996, Transgenic Research 5(3), 213-218）、キビからのカフィリン（ｋａｆｉｒｉｎ）プロモーター（De Rose et al., 1996, Plant Molecular Biology 32 1029-1035; Mishra et al., 2007, Molecular Biology Reports online: 2 February 2007, DOI: 10.1007/s11033-007-9056-8）又はＣｅｓｔｒｕｍ ＹＬＣＶプロモーター（Yellow Leaf Curling Virus; WO 01 73087;Stavolone et al., 2003, Plant Mol.Biol.53, 703-713）、ジャガイモにおける塊茎特異的発現のためのパタチンゲン（ｐａｔａｔｉｎｇｅｎ）プロモーターＢ３３（Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29）、又は、トマトのための果実特異的プロモーター（Montgomery et al., 1993, Plant Cell 5, 1049-1062）、例えば、トマトからのポリガラクツロナーゼプロモーター（Montgomery et al., 1993, Plant Cell 5, 1049-1062）又はトマトからのＥ８プロモーター（Metha et al., 2002, Nature Biotechnol. 20(6), 613-618）又はモモからのＡＣＣオキシダーゼプロモーター（Moon and Callahan, 2004, J. Experimental Botany 55 (402), 1519-1528）又は光合成活性組織においてのみ発現を確実にするプロモーター、例えば、ＳＴ−ＬＳ１プロモーター（Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451）、又は、胚乳特異的発現のために、コムギからのＨＭＷＧプロモーター、トウモロコシからのＵＳＰプロモーター、ファセオリンプロモーター、ゼイン遺伝子のプロモーター（Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93)、グルテリンプロモーター（Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218）又はｓｈｒｕｎｋｅｎ−１プロモーター（Werr et al., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380）である。しかし、外部因子により決定される時間点でだけ活性であるプロモーターを使用することも可能である（例えば、ＷＯ ９３０７２７９を参照のこと）。ここで、特に興味深いのは、簡単な誘導を許すヒートショックタンパク質のプロモーターでありうる。さらに、種子特異的プロモーター、例えば、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）及び他の植物における種子特異的発現を確実にするソラマメからのＵＳＰプロモーターなどを使用することが可能である（Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Baumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467）。
【００９２】
藻類感染ウイルスのゲノム中に存在するプロモーターの使用は、また、植物において核酸配列を発現させるために適する（Mitra et al., 1994, Biochem. Biophys Res Commun 204(1), 187-194; Mitra and Higgins, 1994, Plant Mol Biol 26(1), 85-93, Van Etten et al., 2002, Arch Virol 147, 1479-1516）。
【００９３】
本発明に関連して、「組織特異的」という用語は、発現（例えば、転写の開始）の、特定の組織への実質的な限定を意味すると理解すべきである。
【００９４】
本発明に関連して、「塊茎、果実、又は種子細胞」という用語は、塊茎、果実、又は種子中に存在する全ての細胞を意味すると理解すべきである。
【００９５】
本発明に関連して、「同種プロモーター」という用語は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物の産生のために使用する植物細胞又は植物に自然に存在する（植物細胞又は植物に関して同種である）プロモーターを意味する、又は、配列が単離された生物における（発現させるべき核酸分子に関して同種である）遺伝子の発現調節を調節するプロモーターを意味すると理解すべきである。
【００９６】
本発明に関連して、「異種プロモーター」という用語は、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物の産生のために使用する植物細胞又は植物に自然に存在しない（植物細胞又は植物に関して異種である）プロモーターを意味する、又は、発現させるべき核酸配列が単離された生物において、核酸配列の発現調節のために自然に存在しない（発現させるべき核酸分子に関して異種である）プロモーターを意味すると理解すべきである。
【００９７】
また、ポリＡテールを、核酸分子のｍＲＮＡ転写産物に付加するために役立つ終結配列（ポリアデニル化シグナル）が存在してよい。ポリＡテールは転写産物の安定化に作用すると考えられる。そのようなエレメントは文献（Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29を参照のこと）に記載されており、所望の通りに交換できる。
【００９８】
また、イントロン配列が、プロモーターとコード領域の間に、又は、タンパク質をコードする外来核酸分子に存在することも可能である。そのようなイントロン配列は、植物における発現の安定性及び発現増加をもたらしうる（Callis et al., 1987, Genes Devel. 1, 1183-1200; Luehrsen, and Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier et al., 1997; Plant Journal 12(4), 895-899; Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91, 1575-1579; XU et al., 2003, Science in China Series C Vol.46 No.6, 561-569）。適したイントロン配列は、例えば、トウモロコシからのｓｈ１遺伝子の第１イントロン、トウモロコシからのポリユビキチン遺伝子の第１イントロン、コメからのＥＰＳＰＳ遺伝子の第１イントロン、又は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からのＰＡＴ１遺伝子の第１の２つのイントロンの１つである。
【００９９】
本発明は、また、本発明の遺伝子改変植物細胞を含む植物に関する。そのような植物は、本発明の遺伝子改変植物細胞からの再生により産生してよい。
【０１００】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明の遺伝子改変植物の回収可能な植物部分、例えば、果実、貯蔵根及び他の根、花、芽、新芽、葉又は茎、好ましくは種子、果実、又は塊茎、本発明の遺伝子改変植物細胞を含むこれらの回収可能な部分に関する。
【０１０１】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の回収可能な植物部分は、本発明の遺伝子改変植物細胞を含む本発明の遺伝子改変植物の加工可能又は消費可能な部分である。
【０１０２】
本発明に関連して、「加工可能な部分」という用語は、食材又は飼料を調製するために使用される植物部分を意味すると理解すべきであり、それらは工業的方法のための原料源として、薬学的産物の産生のための原料源として、又は、化粧品産物の産生のための原料源として使用される。
【０１０３】
本発明に関連して、「消費可能な部分」という用語は、ヒト用の食物として役立つ、又は、動物飼料として使用される植物部分を意味すると理解すべきである。
【０１０４】
本発明は、また、本発明の遺伝子改変植物細胞を含む本発明の遺伝子改変植物の繁殖物質に関する。
【０１０５】
ここで、「繁殖物質」という用語は、栄養的又は有性的な経路を介して子孫を生成するために適した植物の成分を含む。栄養繁殖に適するのは、例えば、挿し木、カルス培養物、根茎、又は塊茎であるが、しかし、また、例えば、プロトプラスト及び細胞培養である。有性方法を用いて産生される繁殖物質は、例えば、果実、種子、実生などを含む。繁殖物質は、好ましくは、塊茎、果実、又は種子の形態を取る。
【０１０６】
好ましくは、本発明は、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を含む本発明の繁殖物質又は本発明の植物の回収可能部分に関する。特に好ましくは、本発明の繁殖物質又は本発明の植物の回収可能部分は、グルコサミノグリカンを合成する本発明の繁殖物質又は本発明の植物の回収可能部分である。好ましくは、グルコサミノグリカンは、コンドロイチン、ヘパリン／ヘパラン、又はヒアルロナン、特に好ましくはヒアルロナンである。
【０１０７】
本発明に関連して、「ジャガイモ植物」又は「ジャガイモ」という用語は、ナス属の植物種、特にナス属及び特にソラナム・チュベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）の塊茎産生種を意味すると理解すべきである。
【０１０８】
本発明に関連して、「トマト植物」又は「トマト」という用語は、リコペルシコン属、特にリコペルシコン・エスカレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の植物種を意味すると理解すべきである。
【０１０９】
本発明のさらなる利点は、本発明の遺伝子改変植物の回収可能部分、繁殖物質、加工可能部分、又は消費可能部分が、グルコサミン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを含む植物よりも多くのグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を含むことである。したがって、本発明の遺伝子改変植物は、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を単離できる原材料としての使用にだけでなく、予防的又は治療的な特徴（例えば、変形性関節症の予防ため、ＵＳ ６，６０７，７４５）を有する食材／飼料として直接的に、又は、食材／飼料の調製のためにも使用できる。本発明の遺伝子改変植物は、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを有する植物よりも高いグルコサミノグリカン含量を有するため、そのような食材／飼料の産生は、より少量の本発明の遺伝子改変植物の回収可能部分、繁殖物質、加工可能、又は消費可能部分を必要とする。本発明の遺伝子改変植物の消費可能部分が、例えば、直接的にいわゆる「栄養補給食品」として消費される場合、比較的少量の物質を摂取することでさえポジティブな効果を達成することが可能になる。これは、とりわけ、動物飼料の産生において特に有用でありうる。なぜなら、高過ぎる植物成分含量を有する動物飼料は、種々の動物種のための飼料として不適であるからである。
グルコサミノグリカン、特にヒアルロナンの高い水結合能力を理由に、本発明の遺伝子改変植物の回収可能部分、繁殖物質、加工可能部分、又は消費可能部分は、固型化した食材／飼料を産生する際に、より少ない増粘剤を必要とするとの利点を有する。このように、例えば、ゼリーの産生にはより少ない砂糖が必要になり、これは健康に及ぼす追加のポジティブな効果と関連する。粗植物物質の脱水に必要となる食材／飼料の産生において、本発明の遺伝子改変植物の回収可能部分、繁殖物質、加工可能部分、又は消費可能部分を使用する利点は、より少ない水を問題になっている植物材料から除去しなければならない事実において、より低い産生コスト、及び、より穏やかな調製方法（より低い及び／又はより短い加熱）により、問題になっている食材／飼料の栄養価の上昇をもたらすことにある。このように、例えば、トマトケチャップの産生において、所望の稠度を達成するために、ほとんどエネルギーを導入する必要がない。
【０１１０】
本発明は、さらに、以下を含む植物を産生するための方法を提供する
ａ）植物細胞の遺伝的改変、ここで遺伝子改変は以下の工程ｉ〜ｉｉｉを含む
ｉ）グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉ）グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉｉ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼをコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ここで工程ｉ〜ｉｉｉは任意の順番で個々に行うことができ、又は、工程ｉ〜ｉｉｉの任意の組み合わせを同時に行ってよい
ｂ）工程ａ）ｉ及び／又はａ）ｉｉ及び／又はａ）ｉｉｉｉからの植物細胞からの植物の再生；
ｃ）適宜、工程ｂ）の植物を使用したさらなる植物の生成、
ここで、適宜、植物細胞は、工程ｂ）又はｃ）の植物から単離し、そして、方法工程ａ）〜ｃ）を、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子及びグルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を有する植物が生成されるまで繰り返す。
【０１１１】
植物を産生するための本発明の方法の好ましい実施態様は、以下を含む、植物を調製するための方法に関する
ａ）植物細胞の遺伝的改変、ここで遺伝子改変は以下の工程ｉ〜ｉｉｉを任意の順番で含み、又は、以下の工程ｉ〜ｉｉｉの任意の組み合わせを個々に又は同時に行う、
ｉ）グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉ）グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉｉ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼをコードする外来核酸分子の植物細胞中への導入
ｂ）以下の工程
ｉ）ａ）ｉ
ｉｉ）ａ）ｉｉ
ｉｉｉ）ａ）ｉｉｉ
ｉｖ）ａ）ｉ及びａ）ｉｉ、
ｖ）ａ）ｉ及びａ）ｉｉｉ、
ｖｉ）ａ）ｉｉ及びａ）ｉｉｉ、又は
ｖｉｉ）ａ）ｉ及びａ）ｉｉ及びａ）ｉｉｉ
の遺伝子改変を含む植物細胞からの植物の再生
ｃ）以下の工程
ｉ）ｂ）ｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｉ）ｂ）ｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｉｉ）ｂ）ｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、及び同時に、工程ａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｖ）ｂ）ｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変の導入、
ｖ）ｂ）ｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｖｉ）ｂ）ｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変の導入、及び同時に、工程ａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｖｉｉ）ｂ）ｉｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変の導入、
ｖｉｉｉ）ｂ）ｉｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｘ）ｂ）ｉｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変の導入、及び同時に、工程ａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｘ）ｂ）ｉｖ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｘｉ）ｂ）ｖ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、又は
ｘｉｉ）ｂ）ｖｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変、
の植物の植物細胞中への遺伝子改変の導入及び植物の再生、
ｄ）以下の工程
ｉ）ｃ）ｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｉ）ｃ）ｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｉｉ）ｃ）ｉｖ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉｉの遺伝子改変の導入、
ｉｖ）ｃ）ｖ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｖ）ｃ）ｖｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
ｖｉ）ｃ）ｖｉｉ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉの遺伝子改変の導入、又は
ｖｉｉ）ｃ）ｉｘ工程の植物の植物細胞中へのａ）ｉｉの遺伝子改変の導入、
の植物の植物細胞中への遺伝子改変の導入及び植物の再生
ｅ）適宜、工程ｂ）ｖｉｉ ｃ）ｉｉｉ、ｃ）ｖｉ、ｃ）ｘ、ｃ）ｘｉ、ｃ）ｘｉｉのいずれか、又は、工程ｄ）ｉ〜ｄ）ｖｉｉのいずれかの植物を用いてさらなる植物を生成すること。
【０１１２】
植物を産生するための本発明の方法の工程ａ）の外来核酸分子を導入するために、任意の利用可能な方法を使用できる。植物細胞の形質転換のための種々の方法が既に記載されており、ここで、対応する方法で適用できる。植物を産生するための本発明の方法の工程ａ）の方法工程が同時でないが、連続的に行える場合、同一の又は異なる方法を個々の形質転換工程のために使用してよい。
【０１１３】
植物を産生するための本発明の方法の工程ｂ）、ならびに、適宜、工程ｃ）及びｄ）の植物の再生を、当業者に公知の方法により行うことができる（例えば、Plant Cell Culture Protocols, 1999, edt. by R. D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2に記載）。
【０１１４】
植物を産生するための本発明の方法の（方法に依存した、工程ｃ）又は工程ｅ）の）さらなる植物の生成は、例えば、栄養繁殖により（例えば、挿し木を介して、塊茎、又はカルス栽培及び全植物の再生を介して）又は有性繁殖により起こりうる。ここで、有性繁殖は、好ましくは、制御された方法で行われ、即ち、特定の特性を伴う選択された植物を別のものと交配し、繁殖させる。選択は、好ましくは、さらなる植物（方法に依存して、工程ｃ）又は工程ｅ）に従って生成される）が先行する工程において導入された外来核酸分子を有するように行われる。
【０１１５】
植物を産生するための本発明の方法において、本発明の遺伝子改変植物細胞のための遺伝子改変を、同時に、又は、連続工程において、任意の組み合わせで行うことができる。外来核酸分子がまだ導入されていない野生型植物及び野生型植物細胞の両方を使用することが可能である、又は、既に遺伝子改変されており、１つ又は複数の外来核酸分子が既に導入されている植物細胞又は植物を使用することが可能である。
【０１１６】
植物を産生するための本発明の方法の工程ａ）における、植物細胞又は植物中に外来核酸分子を導入する遺伝子改変において、外来核酸分子は単一の核酸分子又は複数の核酸分子でよい。このように、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子は、単一の核酸分子上に一緒に存在でき、又は、言及した外来核酸分子の２つが単一の核酸分子上に一緒に存在しうる、及び、第３の外来核酸分子が別の核酸分子上に任意の可能な組み合わせで存在しうる、又は、言及した外来核酸分子の全て３つが個々の別々の核酸分子上に各々存在しうる。
【０１１７】
外来核酸分子又は組換え核酸分子の好ましい特性は、本発明の植物細胞又は本発明の植物に関連して既に上に記載されており、それらは植物を産生するための本発明の工程の実践において対応して適用できる。
【０１１８】
さらなる好ましい実施態様において、植物を産生するための本発明の方法を、本発明の遺伝子改変植物を産生するために使用する。
【０１１９】
本発明は、また、ヒアルロナンを合成する植物を産生するための本発明の方法により入手可能な植物を提供する。
【０１２０】
本発明は、さらに、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を産生するための方法に関し、本発明の遺伝子改変植物細胞から、本発明の遺伝子改変植物から、本発明の繁殖物質から、本発明の回収可能部分から、又は、植物を産生するための本発明の方法により入手可能な植物もしくはこれらの植物の部分からグルコサミノグリカンを抽出する工程を含む。好ましくは、そのような方法は、また、本発明の栽培された遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、本発明の加工可能な植物部分を、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を抽出する前に回収する工程、及び、特に好ましくは、さらに、本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物を、回収前に栽培する工程を含む。
【０１２１】
細菌又は動物組織とは対照的に、植物組織はグルコサミノグリカン分解酵素（例えば、ヒアルロニダーゼ）を有さない。したがって、既に上に記載した通り、植物組織からのグルコサミノグリカンの抽出は、比較的簡単な方法を使用して可能である。必要な場合、上に記載した、グルコサミノグリカンを含む植物細胞又は組織の水性抽出物は、当業者に公知の方法、例えば、エタノールでの繰り返し沈殿などを使用して精製できる。ヒアルロナンを精製するための好ましい方法は、一般方法事項３の下に記載されている。
【０１２２】
グルコサミノグリカンを本発明の遺伝子改変植物細胞又は本発明の遺伝子改変植物から抽出するための既に記載した方法は、また、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を、ヒアルロナンを合成する植物を調製するための本発明の繁殖物質から、本発明の回収可能な植物部分から、又は、本発明の方法により入手可能な植物又はこれらの植物の部分から単離するために適する。
【０１２３】
本発明は、また、グルコサミノグリカンを調製するための本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、又は植物を産生するための本発明の方法により入手可能な植物の使用を提供する。
【０１２４】
本発明は、さらに、本発明の遺伝子改変植物細胞を含む組成物に関する。ここで、植物細胞が無傷であるのか、又は、もはや無傷ではないのかは重要ではない。なぜなら、それらは、例えば加工により破壊されているからである。組成物は、好ましくは、食材又は飼料、薬学的産物又は化粧品産物である。
【０１２５】
本発明は、好ましくは、本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能部分、又は、本発明の方法により入手可能な植物の成分を含む、及び、組換え核酸分子を含む組成物を提供し、ここで、組換え核酸分子は、それらがグルコサミノグリカン合成酵素、及び、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するタンパク質、及び、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を含むことを特徴とする。
【０１２６】
植物細胞又は植物のゲノム中への外来核酸分子の安定的組込みによって、外来核酸分子が、植物細胞又は植物のゲノム中への組込み後、ゲノムの植物核酸配列により隣接される。したがって、好ましい実施態様において、本発明の組成物は、本発明の組成物中に存在する組換え核酸分子がゲノムの植物核酸配列により隣接されることを特徴とする。
ここで、ゲノムの植物核酸配列は、組成物を調製するために使用される植物細胞又は植物のゲノム中に自然に存在する任意の配列でよい。
【０１２７】
本発明の組成物中に存在する組換え核酸分子は、個々の又は異なる組換え核酸分子でありうるが、ここで、グルコサミノグリカン合成酵素（例えば、ヒアルロナン合成酵素）、及び、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、及び、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が、１つの核酸分子中に存在し、又は、言及した核酸分子が別々の核酸分子に存在する。グルコサミノグリカン合成酵素（例えば、ヒアルロナン合成酵素）、又は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、及び、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子が、単一の組換え核酸分子上に一緒に存在しうる、又は、言及した核酸分子の２つが単一の組換え核酸分子上に一緒に存在しうる、そして、第３の核酸分子が別の組換え核酸分子上に任意の可能な組み合わせで存在しうる、又は、言及した全て３つの核酸分子が各場合において個々の別々の組換え核酸分子上に存在しうる。グルコサミノグリカン合成酵素（例えば、ヒアルロナン合成酵素）をコードする、又は、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする、又は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子がどのように本発明の組成物中に存在するのかに依存して、それらは同一の又は異なるゲノム植物核酸配列により隣接されうる。
【０１２８】
本発明の組成物が組換え核酸分子を含むことは、当業者に公知の方法、例えば、ハイブリダイゼーションに基づく方法を使用し、又は、好ましくは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に基づく方法を使用して実証されうる。
【０１２９】
既に上に言及した通り、本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、又は、本発明の方法により入手可能な植物を、食材／飼料を調製するために使用することが可能である。しかし、工業的用途のための原材料としての使用は、また、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を単離しなくても可能である。このように、例えば、本発明の遺伝子改変植物又は本発明の遺伝子改変植物の部分を、農業栽培下の領域に適用し、土壌の水分結合の増加を達成できる。さらに、本発明の遺伝子改変植物又は本発明の遺伝子改変植物細胞を、乾燥剤を調製するために（例えば、水分感受性品目の輸送時での使用のために）又は液体の吸収剤として（例えば、おむつ中で、又は、こぼれた水性液体を吸収するために）使用できる。そのような用途のために、本発明の遺伝子改変植物の全体、本発明の遺伝子改変植物の部分、又は、本発明の粉砕された（例えば、挽かれた）遺伝子改変植物、又は本発明の遺伝子改変植物部分を、適宜、使用することが可能である。挽かれた植物又は植物部分を使用する用途に適するのは、特に、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を含むが、しかし、低い割合の水だけを含む植物部分である。これらは、好ましくは、穀物植物（トウモロコシ、コメ、コムギ、ライムギ、オートムギ、オオムギ、サゴ、又はモロコシ）の穀物である。本発明の遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物が、グルコサミノグリカン合成酵素をコードする１つの外来核酸分子だけを有する植物よりも高いグルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）含量を有するため、これらと比較し、本発明の遺伝子改変植物細胞及び本発明の遺伝子改変植物を使用する場合にはほとんど材料を工業的用途のために使用する必要がない。
【０１３０】
本発明は、また、本発明の組成物を調製するための方法を提供し、ここで本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、又は、植物を産生するための本発明の方法により入手可能な植物を使用する。本発明の組成物を調製するための方法は、好ましくは、食材又は飼料を調製するための方法、薬学的産物を調製するための方法、又は、化粧品産物を調製するための方法である。
【０１３１】
食材又は飼料を調製するための方法は、当業者に公知である。本発明の遺伝子改変植物又は本発明の植物部分の工業領域での使用のための方法も当業者に公知であり、とりわけ、本発明の遺伝子改変植物又は本発明の植物部分を粉砕すること、又は、挽くことを含む；しかし、それらにもっぱら限定されない。食材／飼料を調製するため、又は、工業領域での使用のために本発明の材料を使用することに起因する利点のいくつかが、既に上に記載されている。
【０１３２】
組成物を調製するための本発明の方法は、特に好ましくは、グルコサミノグリカン（例えば、ヒアルロナン）を含む組成物を調製するための方法である。
【０１３３】
本発明の組成物を調製するための方法により入手可能な組成物は、同様に、本発明により提供される。
【０１３４】
本発明は、また、本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、又は、本発明の方法により入手可能な植物の、本発明の組成物を調製するための植物を産生するための使用に関する。好ましくは、本発明の遺伝子改変植物細胞、本発明の遺伝子改変植物、本発明の繁殖物質、本発明の回収可能な植物部分、又は、本発明の方法により入手可能な植物の、食材又は飼料を調製するため、薬学的産物を調製するため、又は、化粧品産物を調製するための植物を産生するための使用である。
【０１３５】
配列の説明
配列番号１：パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列。
配列番号２：パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素のアミノ酸配列。アミノ酸配列は配列番号１に由来しうる。
配列番号３：パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素をコードする合成核酸配列。示した配列のコドンの合成は、それらが植物細胞でのコドンの使用に適応されるように実施した。示した核酸配列は、配列番号２の下に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
配列番号４：パスツレラ・マルトシダからのコンドロイチン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号５：パスツレラ・マルトシダからのコンドロイチン合成酵素の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号４に由来しうる。
配列番号６：パスツレラ・マルトシダからのヘパロサン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号７：パスツレラ・マルトシダからのヘパロサン合成酵素の活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号６に由来しうる。
配列番号８：サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号９：サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号８に由来しうる。
配列番号１０：サッカロマイセス・セレビシエからのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号１１：サッカロマイセス・セレビシエからのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号１０に由来しうる。
配列番号１２：ＹＬＣＶプロモーター、制限酵素部位、アグロバクテリウムからのｏｃｓターミネーターのポリアデニル化シグナル配列、及び、アグロバクテリウムからのｎｏｓターミネーターのポリアデニル化シグナル配列を含む発現カセットの核酸配列。
配列番号１３：ＭＣＳ（「マルチクローニングサイト」）を調製するための合成オリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ＭＣＳ（「マルチクローニングサイト」）を調製するための合成オリゴヌクレオチド。
配列番号１５：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号１６：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号１７：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号１８：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号１９：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号２０：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号２１：大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号２２：大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号２１に由来しうる。
配列番号２３：ＰＣＲプライマーとして使用した合成オリゴヌクレオチド。
配列番号２４：ＰＣＲプライマーとして使用した合成オリゴヌクレオチド。
配列番号２５：大腸菌からのグルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｇｌｍｕ）。
配列番号２６：大腸菌からのグルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号２５に由来しうる。
配列番号２７：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号２８：ＰＣＲ反応に使用したプライマー。
配列番号２９：サッカロマイセス・セレビシエからのホスホアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮ−Ｐ）ムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列。
配列番号３０：サッカロマイセス・セレビシエからのホスホアセチルグルコサミンムターゼの活性を有するタンパク質のアミノ酸配列。示したアミノ酸配列は配列番号３０に由来しうる。
【０１３６】
一般方法
本発明に関連して使用できる方法を以下に記載する。これらの方法は特定の実施態様である；しかし、本発明はこれらの方法に限定されない。本発明を、記載の方法を改変することにより、及び／又は、個々の方法又は方法の部分を代わりの方法又は方法の代わりの部分により交換することにより、同じ方法で行うことができることは、当業者に公知である。
【０１３７】
１．ジャガイモ植物の形質転換
ジャガイモ植物を、アグロバクテリウムを用いて、Rocha-Sosa et al.（EMBO J. 8, (1989), 23-29）に記載の通りに、形質転換した。
２．植物組織からのヒアルロナンの例を使用したグルコサミノグリカンの単離
植物組織においてヒアルロナンの存在を検出し、ヒアルロナン含量を測定するために、植物材料を以下の通りに用意した：２００μlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）を約０．３gの植物材料に加え、混合物を実験用振動ボールミル（MM200, Retsch, Germany）中で粉砕した（３０Ｈｚで３０秒間）。さらに８００μlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）を次に加え、混合物を十分に混合した（例えば、ボルテックスミキサーを使用）。細胞残骸及び不溶性成分を、１６０００ｘgで５分間遠心分離することにより上清から分離した。植物の全地上部分中のヒアルロナンの量を測定するために、植物の全地上部分を培養基質の上約１cm〜３cmで切断し、小片に切り、次に、ワーリングブレンダーを使用して、一般方法事項３の下に記載の通りに粉砕した。ヒアルロナン含量を測定するために、一定分量を、次に、得られた遠心分離上清から除去してよい（一般方法事項３を参照のこと）。
３．ヒアルロナンの例を使用したグルコサミノグリカンの精製
粉砕した植物材料又は植物の全地上部分を、水（約１００mlの水、脱塩、伝導率≧１８ＭΩ、各場合において１００gの植物材料）の添加後、ワーリングブレンダー中で、最高速度で約３０秒間粉砕した。細胞残骸を次に茶こしを使用して除去した。除去した細胞残骸を３００mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）中に再懸濁し、茶こしを使用して再び除去した。得られた２つの懸濁液（１００ml＋３００ml）を合わせ、１３０００ｘgで１５分間遠心分離した。ＮａＣｌを、最終濃度が１%に達するまで、得られた遠心分離上清に加えた。ＮａＣｌが溶液になった後、沈殿を、２倍容積のエタノールの添加、続く十分な混合及び−２０℃で一晩のインキュベーションにより行った。混合物を次に１３０００ｘgで１５分間遠心分離した。この遠心分離後に得られた沈降沈殿物を１００mlのバッファー（５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ， ｐＨ８， １mM ＣａＣｌ２）中に溶解し、プロテイナーゼＫを次に最終濃度１００μg/mlまで加え、溶液を４２℃で２時間インキュベートした。これに９５℃で１０分間のインキュベーションが続いた。さらに１回、ＮａＣｌを、最終濃度が１%に達するまで、この溶液に加えた。ＮａＣｌが溶液になった後、別の沈殿を、２倍容積のエタノールの添加、十分な混合、及び−２０℃で約９６時間のインキュベーションにより行った。これに１３０００ｘgで１５分間の遠心分離が続いた。この遠心分離後に得られた沈降沈殿物を３０mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）中に溶解し、さらに１回、ＮａＣｌを最終濃度１%まで加えた。２倍容積のエタノールの添加、十分な混合、及び−２０℃で一晩のインキュベーションにより、別の沈殿を行った。続く１３０００ｘgで１５分間の遠心分離後に得られた沈殿物を、２０mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）中に溶解した。
さらなる精製を遠心ろ過により行った。この目的のために、各場合において、５mlの溶解した沈殿物をメンブレンフィルター（CentriconAmicon，孔幅１０ ０００ NMWL, Prod. No. UCF8 010 96）に適用し、サンプルを、わずか約３mlの溶液がフィルター上に残るまで、２２００ｘgで遠心分離した。さらに２回、各場合において、３mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）を次にメンブレン上の溶液に加えて、各場合において、同一条件下で、最後にわずか約３ｍｌの溶液がフィルター上に残るまで、再遠心分離した。溶液は、遠心ろ過を取り外した後、依然としてメンブレン上に存在し、メンブレンを約１．５mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）で繰り返し（３〜５回）リンスした。依然としてメンブレン上に存在した全ての溶液及びリンスから得られた溶液を合わせ、ＮａＣｌを最終濃度１%まで加え、ＮａＣｌが溶液になった後、２倍容積のエタノールを加え、サンプルを混合し、沈殿物を−２０℃で一晩の保存により得た。続く１３０００ｘgで１５分間の遠心分離後に得られた沈殿物を４mlの水（脱塩、伝導率≧１８ＭΩ）中に溶解し、次に凍結乾燥した（０．３７mbarの圧力下で２４時間、凍結乾燥機器Christ Alpha 1-4、Christ（Osterode, Germany）から）。
４．ヒアルロナンの検出及びヒアルロナン含量の測定
ヒアルロナンを市販テスト（ヒアルロン酸（ＨＡ）テストキット、Corgenix, Inc.（Colorado, USA）から、Prod. No. 029-001）を使用し、製造者の指示（これと共に記載中に参照により組み入れられる）に従って検出した。テスト原理は、ヒアルロナン（ＨＡＢＰ）に特異的に結合するタンパク質の可用性に基づき、ＥＬＩＳＡと同様に行い、ここで呈色反応は検証されたサンプル中のヒアルロナン含量を示す。ヒアルロナン値を、検量線を用いて、テストキットと共に含まれる規定量のヒアルロナンを使用して測定する。したがって、ヒアルロナンの定量的測定のために、測定すべきサンプルを、記載した限度内にある濃度で用いるべきである（例えば、限度を超えている、又は、限度に達していないかに依存し、問題になっているサンプルの希釈又は植物組織からヒアルロナンを抽出するためのより少ない水の使用）。
並列バッチで、測定すべきサンプルの一定分量を最初にヒアルロナン消化にかけ、次に市販テスト（ヒアルロン酸（ＨＡ）テストキット、Corgenix, Inc.（Colorado, USA）から、Prod. No. 029-001）を使用して測定した。ヒアルロニダーゼ消化を、ヒアルロニダーゼバッファー（０．１Mリン酸カリウムバッファー、ｐＨ ５．３；１５０mM ＮａＣｌ）中の４００μlの植物抽出物を使用し、５μg（〜３単位）のヒアルロニダーゼ（hyaluronidase type III、Sigmaから、Prod. No. H 2251）を加え、３７℃で３０分間インキュベートすることにより行った。各場合において、１：１０希釈で、全てのサンプルを次にヒアルロナン含量の測定のために使用した。
５．ＧＦＡＴの活性の測定
ＧＦＡＴの活性を有するタンパク質の活性をRachel et al.（1996, J. Bacteriol. 178 (8), 2320-2327）に記載の通りに測定する。
ＧＦＡＴ−１又はＧＦＡＴ−２の活性を有するタンパク質を区別するために、Hu et al.（2004, J. Biol. Chem. 279 (29), 29988-29993）に記載の方法を使用する。
【０１３８】
実施例
１．植物発現ベクターＩＲ ４７−７１の調製
プラスミドｐＢｉｎＡＲは二成分ベクターｐＢｉｎ１９（Bevan, 1984, Nucl Acids Res 12: 8711-8721）の派生物であり、以下の通りに構築する：カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ ＲＮＳのプロモーターのヌクレオチド６９０９〜７４３７を含む５２９bp長のフラグメントを、プラスミドｐＤＨ５１（Pietrzak et al, 1986 Nucleic Acids Res. 14, 5858）からのＥｃｏ ＲＩ／Ｋｐｎ Ｉフラグメントとして単離し、ｐＵＣ１８のポリリンカーのＥｃｏ ＲＩ及びＫｐｎ Ｉ制限酵素部位の間に連結した。この方法で、プラスミドｐＵＣ１８−３５Ｓを形成した。制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＰｖｕ ＩＩを使用し、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨ５のＴ−ＤＮＡのオクトピン合成酵素（ｏｃｔｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子（遺伝子３）のポリアデニル化シグナル（３’末端）を含む１９２bp長のフラグメント（Gielen et al, 1984, EMBO Journal 3, 835-846）（ヌクレオチド１１ ７４９−１１ ９３９）を、プラスミドｐＡＧＶ４０（Herrera-Estrella et al, 1983 Nature, 303, 209-213）から単離した。Ｓｐｈ ＩリンカーのＰｖｕ ＩＩ制限酵素部位への付加後、フラグメントをｐＵＣ１８−３５ＳのＳｐｈ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素部位の間に連結した。これはプラスミドｐＡ７を与えた。ここで、３５Ｓプロモーター及びＯｃｓターミネーターを含む全ポリリンカーを、Ｅｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを使用して除去し、適切に切断されたベクターｐＢｉｎ１９中に連結した。これは植物発現ベクターｐＢｉｎＡＲを与えた（Hofgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230）。ソラナム・チュベロサムからのパタチン遺伝子Ｂ３３のプロモーター（Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29）を、Ｄｒａ Ｉフラグメント（ヌクレオチド−１５１２ − ＋１４）として、Ｓｓｔ Ｉ切断ベクターｐＵＣ１９（末端をＴ４−ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑化した）中に連結した。これはプラスミドｐＵＣ１９−Ｂ３３を与えた。このプラスミドから、Ｂ３３プロモーターをＥｃｏ ＲＩ及びＳｍａ Ｉを使用して除去し、適した制限ベクターｐＢｉｎＡＲ中に連結した。これは植物発現ベクターｐＢｉｎＢ３３を与えた。
さらなるクローニング工程を容易にするために、ＭＣＳ（マルチクローニングサイト）を延長した。この目的のために、２つの相補的オリゴヌクレオチドを合成し、９５℃で５分間加熱し、徐々に室温まで冷却し、良好なアニーリング及びｐＢｉｎＢ３３のＳａｌ Ｉ及びＫｐｎ Ｉ制限酵素部位中へのクローニングを可能にした。この目的のために使用するオリゴヌクレオチドを配列番号１３及び配列番号１４の下に示す。得られたプラスミドをＩＲ ４７−７１と名付けた。
【０１３９】
２．植物発現ベクターｐＢｉｎＡＲＨｙｇの調製
３５Ｓプロモーター、Ｏｃｓターミネーター、及び全マルチクローニングサイトを含むフラグメントを、ｐＡ７から、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを使用して除去し、同じ制限エンドヌクレアーゼを使用して切断したベクターｐＢＩＢＨｙｇ（Becker, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 203）中にクローニングした。得られたプラスミドをｐＢｉｎＡＲＨｙｇと名付けた。
【０１４０】
３．クローニングベクターＩＣ ３１７−２０４の調製
制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ Ｉ及びＨｉｎｄ ＩＩＩを使用し、ｏｃｓターミネーターを含む核酸フラグメントをプラスミドＩＲ ４７−７１から単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ（Stratageneから、Prod. No. 212207）中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３０６−２０４と名付けた。
制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩ及びＥｃｏ ＲＩを使用し、Ｂ３３プロモーターを含む核酸フラグメントをプラスミドＩＲ ４７−７１から単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ（Stratageneから、Prod. No. 212207）中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３１４−２０４と名付けた。
ＩＣ ３０６−２０４から、ＯＣＳターミネーターを制限エンドヌクレアーゼＢａｍ ＨＩを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したプラスミドＩＣ ３１４−２０４中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３１７−２０４と名付けた。
【０１４１】
４．核酸分子の合成
ａ）パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素をコードする核酸分子の合成
パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１のヒアルロナン合成酵素をコードする核酸配列をMedigenomix GmbH（Munich, Germany）により合成し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ２．１（Prod. No. K2000-01）中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３２３−２１５と名付けた。パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのＨＡＳタンパク質をコードする合成核酸配列を配列番号３の下に示す。パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１から元々単離された対応する核酸配列を配列番号１の下に示す。
ｂ）ＹＬＣＶプロモーター及びＭＣＳ、ｎｏｓターミネーター及びｏｃｓターミネーターを含む核酸配列の合成
ＹＬＣＶプロモーター（Stavolone et al., Plant Molecular Biology 53: 703-713, 2003）ならびに制限酵素部位Ｓａｃ Ｉ及びＳｍａ Ｉを含むＭＣＳ（「マルチクローニングサイト」）、ｎｏｓターミネーター及びｏｃｓターミネーターを含む核酸分子がEntelechon GmbHにより合成され、InvitrogenからのベクターｐＣＲ４Ｔｏｐｏ（Prod. No. K4510-20）中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３８９−３３７と名付けた。合成核酸配列を配列番号１２の下に示す。
【０１４２】
５．核酸分子の単離
ａ）ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列の単離及びクローニング
サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｇｎａ１）をＰＣＲにより単離し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ ２．１（Prod. No. K4510-20）中にクローニングした。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りであった：
１．工程：５分、９４℃
２．工程：４５秒、９４℃
３．工程：４５秒、５９℃
４．工程：４５秒、７２℃
５．工程：１０分、７２℃
６．工程：４℃
工程２〜４を３５回繰り返し、手順を次に工程５で続けた。
５０μlの反応バッチは、バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５０mM ＫＣｌ、及び３mM ＭｇＳＯ４）、各場合での５００nMの増幅プライマー（配列番号１５及び配列番号１６の下に示す）、１０μlのＱ溶液（Qiagen, Prod. No. 206143に含まれる）、各場合での０．２mMのデオキシリボヌクレオチド、０．５μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Prod. No.: 11304-011）、及び鋳型としての２５０ngのゲノム酵母ＤＮＡを含んだ。ＰＣＲを、EppendorfからのMastercycler（Prod. No. 5331 000.010）を使用して行った。
サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸配列を、配列番号８の下に示す。
得られたフラグメントのベクターｐＣＲ ２．１中へのクローニング及び配列の確認後、サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする問題になっている核酸配列を、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉ及びＸｂａ Ｉを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＡ７中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ２９８−２０４と名付けた。
【０１４３】
ｂ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質のコード核酸配列の単離及びクローニング
サッカロマイセス・セレビシエからのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｑｒｉ）をＰＣＲにより単離し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ ２．１（Prod. No. K2000-01）中にクローニングした。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りであった：
１．工程：５分、９４℃
２．工程：４５秒、９４℃
３．工程：４５秒、５９℃
４．工程：４５秒、７２℃
５．工程：３０分、７２℃
６．工程：４℃
工程２〜４を３５回繰り返し、手順を次に工程５で続けた。
５０μlの反応バッチは、バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５０mM ＫＣｌ、及び３mM ＭｇＳＯ４）、各場合での５００nMの増幅プライマー（配列番号１７及び配列番号１８の下に示す）、１０μlのＱ溶液（Qiagen， Ｐｒｏｄ． Ｎｏ． ２０６１４３に含まれる）、各場合での０．２mMのデオキシリボヌクレオチド、０．５μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Prod. No.: 11304-011）、及び鋳型としての２５０ngのゲノム酵母ＤＮＡ（Invitrogen Prod. No. 40802）を含んだ。ＰＣＲを、EppendorfからのMastercycler（Prod. NR. 5331 000.010）を使用して行った。
サッカロマイセス・セレビシエからのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸配列を、配列番号１０の下に示す。
得られたフラグメントのベクターｐＣＲ ２．１中へのクローニング及び配列の確認後、サッカロマイセス・セレビシエからのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉ及びＸｂａ Ｉを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＡ７中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３０３−２０４と名付けた。
【０１４４】
ｃ）ＧｌｃＮＡｃ−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の単離及びクローニング
サッカロマイセス・セレビシエからのホスホアセチルグルコサミンムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｐｃｍ Ｉ， ＥＣ ５．４．２．３）をＰＣＲにより単離し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ ２．１（Prod. No. K2000-01）中にクローニングした。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りであった：
１．工程：５分、９４℃
２．工程：４５秒、９４℃
３．工程：４５秒、５９℃
４．工程：４５秒、７２℃
５．工程：３０分、７２℃
６．工程：４℃
工程２〜４を３５回繰り返し、手順を次に工程５で続けた。
５０μlの反応バッチは、バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５０mM ＫＣｌ、及び３mM ＭｇＳＯ４）、各場合での５００nMの増幅プライマー（配列番号２７及び配列番号２８の下に示す）、１０μlのＱ溶液（Qiagen, Prod. No. 206143に含まれる）、各場合での０．２mMのデオキシリボヌクレオチド、０．５μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Prod. No.: 11304-011）、及び鋳型としての２５０ngのゲノム酵母ＤＮＡ（Invitrogen Prod. No. 40802）を含んだ。ＰＣＲを、EppendorfからのMastercycler（Prod. No. 5331 000.010）を使用して行った。
得られたフラグメントのベクターｐＣＲ ２．１中へのクローニング及び配列の確認後、サッカロマイセス・セレビシエからのホスホアセチルグルコサミンムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉ及びＸｂａ Ｉを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＡ７中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３０４−２０４と名付けた。
【０１４５】
ｄ）大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の単離及びクローニング
大腸菌からのグルコサミン１−リン酸ムターゼ（ＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼ）の活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｇｌｍｍ）をＰＣＲにより単離し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ ２．１（Prod. No. K2000-01）中にクローニングした。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りであった：
１．工程：５分、９４℃
２．工程：４５秒、９４℃
３．工程：４５秒、５９℃
４．工程：４５秒、７２℃
５．工程：３０分、７２℃
６．工程：４℃
工程２〜４を３５回繰り返し、手順を次に工程５で続けた。
５０μlの反応バッチは、バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５０mM ＫＣｌ、及び３mM ＭｇＳＯ４）、各場合での５００nMの増幅プライマー（配列番号１９及び配列番号２０の下に示す）、１０μlのＱ溶液（Qiagen, Prod. No. 206143に含まれる）、各場合での０．２mMのデオキシリボヌクレオチド、０．５μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Prod. No.: 11304-011）、及び鋳型としての２５０ngのゲノム大腸菌ＤＮＡを含んだ。ＰＣＲを、EppendorfからのMastercycler（Prod. No. 5331 000.010）を使用して行った。
大腸菌からのグルコサミン１−リン酸ムターゼタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸配列（ｇｌｍｍ）を、配列番号２１の下に示す。
得られたフラグメントのベクターｐＣＲ ２．１中へのクローニング及び配列の確認後、大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉ及びＸｂａ Ｉを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＡ７中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ３００−２０４と名付けた。
【０１４６】
ｅ）大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の単離及びクローニング
大腸菌からのグルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する二機能性タンパク質をコードする核酸配列（ｑｌｍｕ）をＰＣＲにより単離し、InvitrogenからのベクターｐＣＲ ２．１（Prod. No. K2000-01）中にクローニングした。ＰＣＲのための反応条件は以下の通りであった：
１．工程：５分、９４℃
２．工程：４５秒、９４℃
３．工程：４５秒、５９℃
４．工程：４５秒、７２℃
５．工程：３０分、７２℃
６．工程：４℃
工程２〜４を３５回繰り返し、手順を次に工程５で続けた。
５０μlの反応バッチは、バッファー（１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５０mM ＫＣｌ、及び３mM ＭｇＳＯ４）、各場合での５００nMの増幅プライマー（配列番号２３及び配列番号２４の下に示す）、１０μlのＱ溶液（Qiagen, Prod. No. 206143に含まれる）、各場合での０．２mMのデオキシリボヌクレオチド、０．５μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Prod. No.: 11304-011）、及び鋳型としての２５０ngのゲノム大腸菌ＤＮＡを含んだ。ＰＣＲを、EppendorfからのMastercycler（Prod. No. 5331 000.010）を使用して行った。
大腸菌からのグルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする単離された核酸配列（ｇｌｍｕ）を、配列番号２５の下に示す。
得られたフラグメントのベクターｐＣＲ ２．１中へのクローニング及び配列の確認後、大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有する二機能性タンパク質をコードする核酸配列（ｇｌｍｕ）を、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎ Ｉ及びＸｂａ Ｉを使用して単離し、同じ制限エンドヌクレアーゼで切断したベクターｐＡ７中にクローニングした。得られたプラスミドをＩＣ ２９９−２０４と名付けた。
【０１４７】
６．パラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素のためのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３４１−２２２の調製
ヒアルロナン合成酵素のコード配列を含む核酸分子を、プラスミドＩＣ ３２３−２１５から、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏ Ｉでの制限酵素消化により単離し、プラスミドＩＲ ４７−７１のＢａｍＨＩ及びＸｈｏ Ｉ制限酵素部位中にクローニングした。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３４１−２２２と名付けた。
【０１４８】
７．サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質のためのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３５１−２２２の調製
開始プラスミドは上に記載の植物発現ベクターｐＵＢＩ ｂａｒ（ＷＯ ９７ ４４４７２）であり、その中のＥｃｏ ＲＩ及びＳｄａ Ｉ制限酵素部位中に、酵母からのｇｎａ遺伝子のコード配列をクローニングした。酵母からのｇｎａ遺伝子のコード配列をＥｃｏ ＲＩ及びＳｄａ Ｉ制限酵素消化によりプラスミドＩＣ ２９８−２０４から単離した。得られたベクターをＩＣ ３５１−２２２と名付けた。
【０１４９】
８．ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質のためのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３９２−３３７の調製
開始プラスミドは上にさらに記載するプラスミドＩＣ ３５１−２２２であり、その中のＥｃｏ ＲＩ制限酵素部位中に、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩを使用してプラスミドＩＣ ３８９−３３７から単離したＹＬＣＶプロモーター及びＮＯＳターミネーター及びＯＣＳターミネーターのカセットをクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３９０−３３７と名付けた。
上に記載したプラスミドＩＣ ３０３−２０４から、ｑｒｉ遺伝子のコード配列をＳａｃ Ｉ及びＥｃｏ ＲＶ制限酵素消化により単離し、ベクターＩＣ ３９０−３３７のＳａｃ Ｉ及びＳｍａ Ｉ制限酵素部位中に連結した。得られたベクターをＩＣ ３９１−３３７と名付けた。
重複性のＯＣＳターミネーターを除去するために、ベクターＩＣ ３９１−３３７をＡａｔ ＩＩで消化し、次に再連結した。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３９２−３３７と名付けた。
【０１５０】
９．大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質ならびにＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有する二機能性タンパク質のためのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３６０−２３７の調製
大腸菌からのＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の導入のための開始プラスミドは、上にさらに記載するプラスミドＩＣ ２９９−２０４であり、そのコード配列はＥｃｏ ＲＩ制限酵素消化により単離され、ｐＭＣＳ５ベクター（MoBiTec GmbH, Prod. No.: pMCS5）のＥｃｏ ＲＩ制限酵素部位中にクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３０７−２０４と名付けた。次の工程では、ベクターＩＣ ３０７−２０４をＰｍｅ Ｉ及びＳｍａ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、再連結した。得られたベクターをＩＣ ３１１−２０４と名付けた。ＧＬＭＵの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を、次に、プラスミドＩＣ ３１１−２０４からＢａｍ ＨＩ及びＫｐｎＩでの制限酵素消化により単離し、ベクターＩＣ ３１２−２０４の制限酵素部位Ｂａｍ ＨＩ及びＫｐｎ Ｉ中に連結した。得られたベクターをＩＣ ３１５−２０４と名付けた。ベクターＩＣ ３１２−２０４を、３５Ｓプロモーターフラグメント（Ｅｃｏ ＲＩ及びＳａｌ Ｉ制限酵素消化によりプラスミドｐＡ７から単離）、ｏｃｓフラグメント（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａｌ Ｉ制限酵素消化によりＩＣ ３０９−２０４から単離）、及びベクターＩＣ３１０−２０４（Ｅｃｏ ＲＩ制限酵素消化により開環）で構成される３つのフラグメントの同時連結により調製した。プラスミドＩＣ３１０−２０４はｐＵＣ １８ベクターであり、そのＭＣＳの部分はＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＥｃｌ １３５ＩＩ制限酵素消化及び続く再連結により除去されている。ＩＣ ３０９−２０４は、ｐＡ７からＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａｌ Ｉを使用してｏｃｓフラグメントを単離し、それをＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａｌ Ｉで消化したｐＢＳ ＫＳベクター中にクローニングすることにより調製した。
プラスミドＩＣ ３１５−２０４から、３５Ｓプロモーター、大腸菌からのグルコサミン１−リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする核酸配列（ｑｌｍｕ）、及びｏｃｓターミネーターをＥｃｏ ＲＩ制限酵素消化により単離し、Ｕｂｉ Ｂａｒベクター（ＷＯ ９７ ４４４７２）のＥｃｏ ＲＩ制限酵素部位中にクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３５９−２３７と名付けた。
ＧｌｃＮ−１−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸配列の導入のための開始プラスミドは、上にさらに記載するプラスミドＩＣ ２９９−２０４であり、そのコード配列をＳｄａ Ｉ及びＳｍａ Ｉ制限酵素消化により単離し、Ｕｂｉ ｂａｒベクターのＳｄａ Ｉ及びＨｐａ Ｉ制限酵素部位中に連結した。得られたベクターをＩＣ ３５５−２２２と名付けた。
プラスミドＩＣ ３５５−２２２から、ｇｌｍｍ遺伝子のコード配列をＳｐｅ Ｉ及びＤｒａ Ｉ制限酵素消化により単離し、ＩＣ ３５９−２３７プラスミドのＳｐｅ Ｉ及びＰｍｅ Ｉ制限酵素部位中にクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３６０−２３７と名付けた。
【０１５１】
１０．サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質、及びＧｌｃＮＡｃ−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質のためのコード核酸配列を含む植物発現ベクターＩＣ ３９３−３３７の調製
サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮＡｃ−Ｐムターゼをコードする核酸配列の導入のための開始プラスミドは、上にさらに記載するプラスミドＩＣ ３０４−２０４であり、そのコード配列をＥｃｏ ＲＩ制限酵素消化により単離し、ｐＭＣＳ５ベクター（MoBiTec GmbH, Prod. No.: pMCS5）のＥｃｏ ＲＩ制限酵素部位中にクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３１３−２０４と名付けた。次の工程では、サッカロマイセス・セレビシエからのＧｌｃＮＡｃ−Ｐムターゼをコードする核酸配列を、ベクターＩＣ ３１３−２０４からＰｍｅ Ｉ及びＰａｃ Ｉ制限酵素消化により単離し、Ｐｍｅ Ｉ及びＰａｃ Ｉで消化したベクターＩＣ ３９３−３３７中にクローニングした。得られたベクターをＩＣ ３９４−３３７と名付けた。
プラスミドＩＣ ３９３−３３７の調製のための開始ベクターは上にさらに記載するプラスミドＩＣ ３９１−３３７であり、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質のための核酸配列を既に含んだ。この目的のために、上にさらに記載するＢ３３プロモーターをＰａｃ Ｉ及びＡｖｒ ＩＩ制限酵素消化により単離し、Ｐａｃ Ｉ及びＡｖｒ ＩＩで消化したベクターＩＣ ３９１−３３７中にクローニングした。得られた植物発現ベクターをＩＣ ３９３−３３７と名付けた。
【０１５２】
１１．ジャガイモ植物の形質転換
ジャガイモ植物を、一般方法事項１に記載する方法に従って植物発現ベクターＩＣ ３４１−２２２（ソラナム・チュベロサムからのパパチン遺伝子Ｂ３３のプロモーターの制御下にあるパラメシウム・ブルサリア・クロレラ・ウイルス１からのヒアルロナン合成酵素のためのコード核酸配列を含む（Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8, 23-29)）で形質転換した。
得られたジャガイモ植物を、プラスミドＩＣ ３４１−２２２で形質転換し、３６５ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られた植物を意味する）と名付けた。形質転換後に得られた栽培品種を、３６５ ＥＳ Ｘと名付け、問題になっている植物により合成されるヒアルロナンの量について分析した（ＷＯ ２００６ ０３２５３８も参照のこと）。栽培品種３６５ ＥＳ １３及び３６５ ＥＳ ７４を以下に記載の形質転換にために選んだ。
栽培品種３６５ ＥＳ １３及び３６５ ＥＳ ７４のジャガイモ植物を、植物発現ベクターＩＣ ３９２−３３７又はＩＣ ３６０−２３７又はＩＣ ３９４−３３７で、一般方法事項１に記載する方法に従って形質転換した。
プラスミドＩＣ ３９２−３３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ １３の得られたトランスジェニックジャガイモ植物を、４３７ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
プラスミドＩＣ ３９２−３３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ ７４の得られたトランスジェニックジャガイモ植物を、４３８ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
プラスミドＩＣ ３６０−２３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ １３の得られたトランスジェニックジャガイモ植物を、３９７ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
プラスミドＩＣ ３６０−２３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ ７４の得られたトランスジェニックジャガイモ植物を、３９８ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
プラスミドＩＣ ３９３−３３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ １３の得られたジャガイモ植物を、４４４ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
プラスミドＩＣ ３９３−３３７で形質転換された栽培品種３６５ ＥＳ ７４の得られたジャガイモ植物を、４４５ ＥＳ Ｘ（Ｘは形質転換から独立的に得られる植物を意味する）と名付けた。
【０１５３】
１２．ヒアルロナン合成酵素をコードする、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする、及び、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を含むジャガイモ植物の分析
グリーンハウスでは、栽培品種３６５ ＥＳ １３、３６５ ＥＳ ７４、４３７ ＥＳ Ｘ、４３８ ＥＳ Ｘ、３９７ ＥＳ Ｘ、３９８ ＥＳ Ｘ、４４４ ＥＳ Ｘ、及び４４５ ＥＳ Ｘの個々の植物を６cmポット中の土壌で栽培した。植物の全地上部分を７〜９週目の植物から回収し、一般方法事項３に記載する方法に従って加工した。問題になっている植物抽出物中のヒアルロナンの量は、問題になっている植物抽出物の一定分量中に含まれるヒアルロナンを、一般方法事項４に記載する方法に従って、検量線を用いて測定することにより決定した。ヒアルロナン含量の決定のために、遠心分離後に得られた上清を１：１０希釈で使用した。選択した植物について、以下の結果を得た：
【０１５４】
【表１】
表１：栽培品種３６５ ＥＳ １３及び３６５ ＥＳ ７４の独立した選択されたトランスジェニック植物（ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを含む）により産生される、問題になっている植物の全地上部分中でのヒアルロナンの量（μg（ヒアルロナン）/g（新鮮重量））。カラム１は、材料を回収した植物の名称を示す（「ｗｔ Ｄｅｓｉｒｅｅ」は栽培品種Ｄｅｓｉｒｅｅの非形質転換野生型植物を指す）。カラム２は、用いた新鮮重量に基づくヒアルロナンの量を示す。
【０１５５】
【表２】
表２：栽培品種４３７ ＥＳ又は４３８ ＥＳの独立した選択されたトランスジェニック植物により産生される、問題になっている植物の全地上部分中でのヒアルロナンの量（μg（ヒアルロナン）/g（新鮮重量））。カラム１は、材料を回収した植物の名称を示す。カラム２は、用いた新鮮重量に基づくヒアルロナンの量を示す。
示した結果は、ヒアルロナン合成酵素をコードする、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする、及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を同時に含む植物が、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを含む植物よりも大幅に高いヒアルロナン量を合成することを例示する。
【０１５６】
【表３】
表３：栽培品種４９７ ＥＳ又は４９８ ＥＳの独立した選択されたトランスジェニック植物により産生される、問題になっている植物の全地上部分中でのヒアルロナンの量（μg（ヒアルロナン）/g（新鮮重量））。カラム１は、材料を回収した植物の名称を示す。カラム２は、用いた新鮮重量に基づくヒアルロナンの量を示す。
示した結果は、ヒアルロナン合成酵素をコードする、ならびに、ＧｌｃＮ−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質、ＧｌｃＮ−１−Ｐアセチルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの二機能性活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を同時に含む植物が、ヒアルロナン合成酵素をコードする外来核酸分子だけを含む植物よりも有意に高いヒアルロナン量を合成しないことを例示する。
【０１５７】
【表４】
表４：栽培品種４４４ ＥＳ又は４４５ ＥＳの独立した選択されたトランスジェニック植物により産生される、問題になっている植物の全地上部分中でのヒアルロナンの量（μg（ヒアルロナン）/g（新鮮重量））。カラム１は、材料を回収した植物の名称を示す。カラム２は、用いた新鮮重量に基づくヒアルロナンの量を示す。
示した結果は、ヒアルロナン合成酵素をコードする、ならびに、ＧｌｃＮ−Ｐムターゼの活性を有するタンパク質及びＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を同時に含む植物が、ヒアルロナン合成酵素、ＧｌｃＮ−６−Ｐアセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質、及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子だけを含む植物よりも有意に高いヒアルロナン量を合成しないことを例示する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子を含む遺伝子改変植物細胞であって、該植物細胞が、追加で、グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子及び単機能性ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を含む遺伝子改変植物細胞。
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子改変植物細胞を含む植物。
【請求項３】
請求項１記載の遺伝子改変植物細胞を含む、請求項２記載の植物の繁殖物質。
【請求項４】
請求項１記載の遺伝子改変植物細胞を含む、請求項２記載の植物の回収可能な植物部分。
【請求項５】
植物を産生するための方法であって、以下を含む
ａ）植物細胞の遺伝的改変、ここで遺伝子改変は以下の工程ｉ〜ｉｉｉを含む
ｉ）グルコサミノグリカン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉ）グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉｉ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼの単機能性活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の植物細胞中への導入
ｂ）工程ａ）ｉ及び／又はａ）ｉｉ及び／又はａ）ｉｉｉｉからの植物細胞からの植物の再生；
ｃ）適宜、工程ｂ）の植物を使用したさらなる植物の生成、
ここで工程ａ）ｉ〜ａ）ｉｉｉは任意の順番で個々に行うことができ、又は、工程ａ）ｉ〜ａ）ｉｉｉの任意の組み合わせを同時に行ってよく、適宜、工程ａ）ｉ〜ａ）ｉｉｉの失われた外来核酸分子を、工程ｂ）又はｃ）に従って得られた植物の植物細胞中に導入してよい。
【請求項６】
グルコサミノグリカンを産生するための方法であって、請求項１記載の遺伝子改変植物細胞から、請求項２記載の植物から、請求項３記載の繁殖物質から、請求項４記載の回収可能な植物部分から、又は、請求項５記載の方法により入手可能な植物からのグルコサミノグリカンの抽出の工程を含む方法。
【請求項７】
グルコサミノグリカンを製造するための、請求項１記載の遺伝子改変植物細胞、請求項２記載の植物、請求項３記載の繁殖物質、請求項４記載の回収可能な植物部分、又は、請求項５記載の方法により入手可能な植物の使用。
【請求項８】
請求項１記載の遺伝子改変植物細胞を含む、組成物。
【請求項９】
グルコサミノグリカンを含む組成物を調製するための方法であって、請求項１記載の遺伝子改変植物細胞、請求項２記載の植物、請求項３記載の繁殖物質、請求項４記載の回収可能な植物部分、又は請求項５記載の方法により入手可能な植物を使用することを含む方法。
【請求項１０】
請求項８記載の組成物を調製するための、請求項１記載の遺伝子改変植物細胞、請求項２記載の植物、請求項３記載の繁殖物質、請求項４記載の回収可能な植物部分、又は、請求項５記載の方法により入手可能な植物の使用。
【請求項１】
グルコサミノグリカン合成酵素をコードする外来核酸分子を含む遺伝子改変植物細胞であって、該植物細胞が、追加で、グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子及び単機能性ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼの活性を有するタンパク質をコードする外来核酸分子を含む遺伝子改変植物細胞。
【請求項２】
請求項１記載の遺伝子改変植物細胞を含む植物。
【請求項３】
請求項１記載の遺伝子改変植物細胞を含む、請求項２記載の植物の繁殖物質。
【請求項４】
請求項１記載の遺伝子改変植物細胞を含む、請求項２記載の植物の回収可能な植物部分。
【請求項５】
植物を産生するための方法であって、以下を含む
ａ）植物細胞の遺伝的改変、ここで遺伝子改変は以下の工程ｉ〜ｉｉｉを含む
ｉ）グルコサミノグリカン合成酵素の活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉ）グルコサミン６−リン酸アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の植物細胞中への導入
ｉｉｉ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−グルコサミンピロホスホリラーゼの単機能性活性を有するタンパク質をコードする核酸分子の植物細胞中への導入
ｂ）工程ａ）ｉ及び／又はａ）ｉｉ及び／又はａ）ｉｉｉｉからの植物細胞からの植物の再生；
ｃ）適宜、工程ｂ）の植物を使用したさらなる植物の生成、
ここで工程ａ）ｉ〜ａ）ｉｉｉは任意の順番で個々に行うことができ、又は、工程ａ）ｉ〜ａ）ｉｉｉの任意の組み合わせを同時に行ってよく、適宜、工程ａ）ｉ〜ａ）ｉｉｉの失われた外来核酸分子を、工程ｂ）又はｃ）に従って得られた植物の植物細胞中に導入してよい。
【請求項６】
グルコサミノグリカンを産生するための方法であって、請求項１記載の遺伝子改変植物細胞から、請求項２記載の植物から、請求項３記載の繁殖物質から、請求項４記載の回収可能な植物部分から、又は、請求項５記載の方法により入手可能な植物からのグルコサミノグリカンの抽出の工程を含む方法。
【請求項７】
グルコサミノグリカンを製造するための、請求項１記載の遺伝子改変植物細胞、請求項２記載の植物、請求項３記載の繁殖物質、請求項４記載の回収可能な植物部分、又は、請求項５記載の方法により入手可能な植物の使用。
【請求項８】
請求項１記載の遺伝子改変植物細胞を含む、組成物。
【請求項９】
グルコサミノグリカンを含む組成物を調製するための方法であって、請求項１記載の遺伝子改変植物細胞、請求項２記載の植物、請求項３記載の繁殖物質、請求項４記載の回収可能な植物部分、又は請求項５記載の方法により入手可能な植物を使用することを含む方法。
【請求項１０】
請求項８記載の組成物を調製するための、請求項１記載の遺伝子改変植物細胞、請求項２記載の植物、請求項３記載の繁殖物質、請求項４記載の回収可能な植物部分、又は、請求項５記載の方法により入手可能な植物の使用。
【公表番号】特表２０１０−５３８６２６（Ｐ２０１０−５３８６２６Ａ）
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２４４１４（Ｐ２０１０−５２４４１４）
【出願日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００７８３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３３７５２
【国際公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【出願人】（５０７２０３３５３）バイエル・クロップサイエンス・アーゲー (172)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＥＲ ＣＲＯＰＳＣＩＥＮＣＥ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００７８３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０３３７５２
【国際公開日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【出願人】（５０７２０３３５３）バイエル・クロップサイエンス・アーゲー (172)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＥＲ ＣＲＯＰＳＣＩＥＮＣＥ ＡＧ
【Ｆターム（参考）】
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