多価抗体
Ｎ末端から順に、ＶＨ１と呼称する可変ドメイン、ＣＨ１領域、及びＶＨ２と呼称するさらなる可変ドメインを含む重鎖と、Ｎ末端から順に、ＶＬ１と呼称する可変ドメイン、ＣＬドメイン及びＶＬ２と呼称する可変ドメインを含む軽鎖とを含む多価抗体融合タンパク質であって、前記重鎖及び軽鎖が、ＶＨ１及びＶＬ１の第１可変ドメイン対により形成される第１結合部位と、ＶＨ２及びＶＬ２の第２可変ドメイン対により形成される第２結合部位とを提供するように整列され、結合部位を形成する可変ドメイン対の間にジスルフィド結合が存在し、前記融合タンパク質が、ＰＥＧポリマーにコンジュゲートされている融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、２つの抗原結合部位を有する抗体であって、例えば各部位の周辺の立体障害が最小限であることにより、単数又は複数の標的抗原に対する親和性がフォーマットにより有害に影響されない抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多価抗体は既知である。しかし、基本的な概念は数年前に開示されたものの、この技術を活用することに関連して実際上の困難性が存在し、よって、これは、開発中の薬学的な生物学的製品の調製のために広く採用されていない。
【０００３】
自然でない／天然でない抗体フォーマットは発現させることが困難であり得、このことは、商品の経費を支持できないレベルまで著しく押し上げることがある。これらのフォーマットは、標準的な抗体又は断片と比較して免疫原性を増加するか若しくはｉｎ ｖｉｖｏ安定性を低減することがあり、且つ／或いは望ましくない薬物動態を有することがある。
【０００４】
特に、均質な生成物を調製することに関連する問題点は、自然でないフォーマットについての懸念である。例えば、単量体成分を組み合わせる順列が１より多いならば、混合物を得ることができる。よって、所望の／標的の物体を満足のいく純度レベルで単離するために精巧な精製方法が要求されることがある。
【０００５】
このことは、いくつかの方法により対処されており、例えば二重特異性ダイアボディの生成における短いリンカーの使用は、適当な二量体形成を助けると言われた。しかし、可変ドメインの配向が、フォーマットの発現及び活性結合部位の形成に影響し得ることがデータにより示されている。
【０００６】
所望の配置又は配向での組み立てを強要するためのあるアプローチは、「ノブ−イン−ホール」法とよばれ、ここでは、例えばいくつかの抗体ではバリン１３７を大きい残基であるフェニルアラニンに交換し、ロイシン４５をトリプトファンで置き換えることにより、大きい「ノブ」がＶＨドメインに導入される。例えばＶＬドメインに、いくつかの抗体ではフェニルアラニン９８をメチオニンに且つトリプトファン８７をアラニンに変異させることにより、相補的な穴が導入できる。しかし、いくつかの構築物について、抗原結合活性の低減が観察された。
【０００７】
本発明では、ＣＬを軽鎖中に、そしてＣＨ１を重鎖中にもたらすことにより、鎖の正しい配向を確実にする。
【０００８】
よって、
Ｎ末端から順に、ＶＨ１と呼称する可変ドメイン、ＣＨ１領域、及びＶＨ２と呼称するさらなる可変ドメインを含む重鎖と、
Ｎ末端から順に、ＶＬ１と呼称する可変ドメイン、ＣＬドメイン、及びＶＬ２と呼称する可変ドメインを含む軽鎖と
を含む組換え融合タンパク質であって、
前記重鎖及び軽鎖が、ＶＨ１及びＶＬ１の第１可変ドメイン対により形成される第１結合部位と、ＶＨ２及びＶＬ２の第２可変ドメイン対により形成される第２結合部位とを提供するように整列され、
結合部位を形成する可変ドメイン対の間、例えばＶＨ１とＶＬ１及び／又はＶＨ２とＶＬ２との間にジスルフィド結合が存在し、
前記融合タンパク質が、ＰＥＧポリマーにコンジュゲートされている組換え融合タンパク質が提供される。
【０００９】
本明細書で提供する組換え融合タンパク質は、完全抗体のものと同様の半減期も有利に有し、よって、治療における使用のために適切である見込みがある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本開示による様々な融合タンパク質フォーマットを示す。
【図２Ａ】様々な既知の抗体断片フォーマットを示す。
【図２Ｂ】本願で請求する発明による二量体フォーマットについてのある可能性のある配置を示す。
【図３】抗体４Ｄ５についての軽鎖アミノ酸配列を示す。
【図４】抗体４Ｄ５についての重鎖アミノ酸配列を示す。
【図５】太字で示す表面Ｃｙｓ変異の位置とともにＡ２６Ｆａｂ−（３ｘＧ４Ｓ）−ｄｓＦｖ６４５を示す。
【図６】Ａ２６Ｆａｂ−（３ｘＧ４Ｓ）−ｄｓＦｖ６４５、Ｓ１８２及びＳ１６３のＰＥＧ化変異体の非還元ゲルを示す。
【００１１】
重鎖は、本明細書で採用する場合、ＣＨ１ドメインを含む鎖である。
【００１２】
全般的に、重鎖は、Ｆｃ断片、すなわちＣＨ２及び／又はＣＨ３断片を含まない。
【００１３】
一実施形態では、重鎖は、１つのＣＨ１ドメインだけを含む。
【００１４】
ＶＨ１及びＶＨ２は、本明細書で採用する場合、本発明による抗体の重鎖中に可変領域があるという事実に言及することを意図する。これは、それ自体、そのような可変領域の起源を示すものではない。
【００１５】
ＶＬ１及びＶＬ２は、本明細書で採用する場合、本発明による抗体の軽鎖中に可変領域があるという事実に言及することを意図する。これは、それ自体、そのような可変領域の起源を示すものではない。
【００１６】
軽鎖は、本明細書で採用する場合、ＣＬドメインを含む。一実施形態では、軽鎖は、１つのＣＬドメインだけを含む。
【００１７】
軽鎖中の定常領域断片としてのＣＬ、及び重鎖中の定常領域断片としてのＣＨ１の本明細書における配置は、不適当な二量体形成を最小限にすると考えられる。
【００１８】
一実施形態では、本開示による融合タンパク質は、例えば可変ドメインとのリンカーとしてのヒンジを含む。
【００１９】
ヒンジは、全長抗体で見出されるものに対応する位置でＣＨ１のＣ末端に付着させることができ、ＣＨ１とＶＨ２との間の連結を形成できる。この実施形態では、リンカーが軽鎖上にも備えられ、よってＶＬ２が、重鎖中でＶＨ２と対形成するように適切に配置される。軽鎖中で採用されるリンカーは、重鎖中で採用されるヒンジリンカーと同一、類似又は完全に異なっていてよい。
【００２０】
代わりの実施形態では、軽鎖は、例えばＣＬドメインのＣ末端に付着し、ＣＬドメインをＶＬ２に連結するヒンジを含む。この実施形態では、ＶＬ２及びＶＨ２ドメインが適切に対形成して活性部位を形成できることを確実にするためにリンカーが重鎖中に要求されることがある。重鎖中のリンカーは、軽鎖中で採用されるリンカーと同一、類似又は完全に異なることができる。
【００２１】
適切なヒンジの例を、以下に示す。
【００２２】
可変ドメインが、標的抗原と適切／適格に結合する予め定義された対を形成するように、各鎖にもたらされる。
【００２３】
一実施形態では、可変ドメイン対は、１００ｎｍ以下、例えば５０ｎｍ以下、特に１ｎｍ以下の、標的抗原に対する親和性を有する。
【００２４】
適切な可変ドメイン対は、例えば宿主での抗体の産生とその後のＢ細胞のスクリーニングを含む任意の可能な手段により同定してよい。代わりに、適切な対は、ファージディスプレイにより同定してよい。
【００２５】
ファージディスプレイ方法は、当該技術において既知であり、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２、４１〜５０；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４、１７７〜１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４、９５２〜９５８；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１９９７ １８７、９〜１８；及びＢｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７、１９１〜２８０；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；及びＷＯ９５／２０４０１；並びにＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３；及び５，９６９，１０８に開示されるものを含む。
【００２６】
トランスジェニックマウス又はその他の哺乳動物を含むその他の生物を用いて、ヒト化抗体を産生してよい。
【００２７】
一実施形態では、可変ドメイン対（又は各可変ドメイン対）は、同族の対である。
【００２８】
同族の対は、本明細書で採用する場合、可変ドメインの自然な対、すなわち単一の抗体又は抗体発現細胞から単離されたものに言及することを意図する。
【００２９】
一例では、同族の対は、協同して抗原と結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対であり、すなわちこれらは、相補的ＶＨ／ＶＬ対である。
【００３０】
典型的に、同族の対は、同じ抗体に由来するＶＨ／ＶＬ対である。一例では、同族の対は、Ｆａｂファージディスプレイライブラリーのような「対のライブラリー」からの対として単離された可変ドメインの対である。
【００３１】
一例では、ＶＨ／ＶＬ対は、単一特異性である。
【００３２】
第１及び第２結合部位は相対的（互いに相対的）な用語であり、互いを区別するために結合部位に与えられた呼称表示である。一方の結合部位を「第１」と表示するならば、他方は「第２」と表示される。
【００３３】
第１同族対及び第２対も、対を呼称上区別するための相対的な表示である。本明細書で「第１対」と表示されるある対は、分子中の位置について定義するものではない。
【００３４】
可変ドメインは、最適化及び／又はヒト化されていることがある。同族の対に由来する最適化／ヒト化可変ドメインは、最適化／ヒト化の後でもまだ同族の対とみなされる。
【００３５】
ＣＬは、本明細書で採用する場合、軽鎖中の定常領域部分のことをいい、これは、自然に存在する軽鎖定常領域であってよい。
【００３６】
各可変ドメインは、関係する鎖中の定常ドメインと直接又はリンカーを介してつなぎ合わせることができる。
【００３７】
「直接連結された」は、本明細書で採用する場合、遮られない連続アミノ酸配列、すなわちペプチド結合により直接連結された、例えば可変ドメインの配列又は逆に定常領域断片に直接連結され、リンカーによりつなぎ合わされていないものに言及することを意図する。アミノ酸配列中に「自然でないペプチドリンカー」を挿入することは、配列を中断するので、「自然でないペプチドリンカー」を含有する配列は、本明細書の意味の範囲内で、関係する部分に直接融合されるとはみなされない。自然なペプチドリンカーの付加も、それが可変ドメイン又は定常領域断片（例えばＣＬドメイン又はＣＨ１ドメイン）のような１又は複数の関係する成分の配列の一部を形成するとみなすことができないならば、アミノ酸配列を遮るとみなされる。
【００３８】
ＶＨ１は、全般的に、ＣＨ１と直接つなぎ合わされる。
【００３９】
ＶＬ１は、全般的に、ＣＬと直接つなぎ合わされる。
【００４０】
一実施形態では、ＶＨ１ ＣＨ１及びＶＬ１ ＣＬは一緒に、Ｆａｂ又はＦａｂ’を形成する。
【００４１】
一実施形態では、ＶＨ２中（例えばそのＮ末端）のアミノ酸は、ペプチド結合によりＣＨ１のアミノ酸（例えばＣＨ１のＣ末端に）に直接連結される。
【００４２】
一実施形態では、ＶＨ２中（例えばそのＮ末端）のアミノ酸は、リンカーによりＣＨ１（例えばＣＨ１のＣ末端に）に間接的に連結される。
【００４３】
一実施形態では、ＶＬ２中（例えばそのＮ末端）のアミノ酸は、ペプチド結合によりＣＬのアミノ酸（例えばＣＬのＣ末端に）に直接連結される。
【００４４】
一実施形態では、ＶＬ２中（例えばそのＮ末端）のアミノ酸は、リンカーによりＣＬ（例えばＣＬのＣ末端に）に間接的に連結される。
【００４５】
一実施形態では、重鎖中のＶＨ１は、重鎖からの可変ドメインである。すなわち、これは、抗体の自然の重鎖若しくはその関係する断片に由来するか、又はファージディスプレイのような代替の供給源に由来し、重鎖に由来する可変ドメインの特徴を有する。
【００４６】
一実施形態では、重鎖中のＶＨ１は、軽鎖からの可変ドメインである。すなわち、これは、抗体の自然の軽鎖若しくはその関係する断片に由来するか、又はファージディスプレイのような代替の供給源に由来し、軽鎖に由来する可変ドメインの特徴を有する。
【００４７】
一実施形態では、重鎖中のＶＨ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００４８】
一実施形態では、重鎖中のＶＨ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００４９】
一実施形態では、軽鎖中のＶＬ１は、重鎖からの可変ドメインである。
【００５０】
一実施形態では、軽鎖中のＶＬ１は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００５１】
一実施形態では、軽鎖中のＶＬ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００５２】
一実施形態では、軽鎖中のＶＬ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００５３】
一実施形態では、ＶＨ１は、軽鎖からの可変ドメインであり、ＶＨ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００５４】
一実施形態では、ＶＨ１は、重鎖からの可変ドメインであり、ＶＨ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００５５】
一実施形態では、ＶＨ１は、軽鎖からの可変ドメインであり、ＶＨ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００５６】
一実施形態では、ＶＨ１は、重鎖からの可変ドメインであり、ＶＨ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００５７】
一実施形態では、ＶＬ１は、軽鎖からの可変ドメインであり、ＶＬ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００５８】
一実施形態では、ＶＬ１は、重鎖からの可変ドメインであり、ＶＬ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００５９】
一実施形態では、ＶＬ１は、軽鎖からの可変ドメインであり、ＶＬ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００６０】
一実施形態では、ＶＬ１は、重鎖からの可変ドメインであり、ＶＬ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００６１】
一実施形態では、第１可変ドメイン対は、第２可変ドメイン対と同じエピトープと結合する。
【００６２】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、標的抗原と強く結合する。
【００６３】
一実施形態では、第１可変ドメイン対は、第２可変ドメイン対と同じ抗原と結合し、例えば、第１可変ドメイン対及び第２可変ドメイン対は、同じ抗原上の異なるエピトープと結合する。
【００６４】
よって、一実施形態では、本開示による融合タンパク質は、単一特異性である。単一特異性は、本明細書で採用する場合、全ての結合部位が同じ標的抗原と結合することに言及することを意図する。
【００６５】
本実施形態の一態様では、全ての結合部位は、前記抗原の同じエピトープ（単数又は複数）と結合する。
【００６６】
代わりの実施形態では、少なくとも２つの結合部位は、標的抗原上の異なるエピトープと結合する。
【００６７】
一実施形態では、第１可変ドメイン対は、第２可変ドメイン対とは異なる／別個の抗原と結合する。
【００６８】
よって、一実施形態では、本開示による融合タンパク質は、二重特異性であり、例えば２つの結合部位は、異なる又は別個の抗原と特異的に結合する。
【００６９】
特異的に結合するとは、本明細書で採用する場合、標的抗原（すなわちそれらが特異的である抗原）に対する親和性が高く、それらが特異的でない抗原と低い親和性又はかなりより低い親和性で結合する（又は全く結合しない）抗体に言及することを意図する。親和性を測定する方法は、当業者に知られており、ＢＩＡｃｏｒｅのようなアッセイを含む。
【００７０】
一実施形態では、同族の対のような少なくとも１つの可変ドメイン対の可変ドメインは、ジスルフィド結合により連結される。
【００７１】
一実施形態では、例えば第１同族対において第１結合部位を形成する可変ドメイン間にジスルフィド結合が存在する。
【００７２】
一実施形態では、例えば第２同族対において第２結合部位を形成する可変ドメイン間にジスルフィド結合が存在する。
【００７３】
一実施形態では、例えばＶＬ２とＶＨ２との間のジスルフィド結合の非存在下で、ＶＬ１とＶＨ１との間にジスルフィド結合が存在する。
【００７４】
一実施形態では、例えばＶＬ１とＶＬ２との間のジスルフィド結合の非存在下で、ＶＬ２とＶＨ２との間にジスルフィド結合が存在する。
【００７５】
一実施形態では、第１結合部位を形成する可変ドメイン間のジスルフィド結合と、第２結合部位を形成する可変ドメイン間にさらなるジスルフィド結合とが存在する。
【００７６】
一実施形態では、ジスルフィド結合は、間である（文脈がそうでないと示さない限り、以下のリストにおいてＫａｂａｔ番号付けを採用する）。Ｋａｂａｔ番号付けに言及する場合いつでも、関係する参考文献は、Ｋａｂａｔら、１９８７、免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡである：
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ６、７８１〜７８８ Ｚｈｕら（１９９７）を参照されたい；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００、例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３ ５４５１〜５４５９ Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４）；又はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９巻２８号１８３２７〜１８３３１頁Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４）；又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０巻１２号１４５３〜１４５９頁Ｒａｊａｇｏｐａｌら（１９９７）を参照されたい；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５、例えばＪ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８、８２５〜８３１ Ｌｕｏら（１９９５）を参照されたい；
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６、７８１〜７８８ Ｚｈｕら（１９９７）を参照されたい；
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１、例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ３７７ １３５〜１３９ Ｙｏｕｎｇら（１９９５）を参照されたい；
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０、例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９ １３６２〜１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（１９９０）を参照されたい；
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ６、７８１〜７８８ Ｚｈｕら（１９９７）を参照されたい；
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３、例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０巻７５３８〜７５４２頁Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３）；又はＰｒｏｔｅｉｎｓ１９、３５〜４７ Ｊｕｎｇら（１９９４）を参照されたい、或いは
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７、例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ３７７ １３５〜１３９ Ｙｏｕｎｇら（１９９５）を参照されたい。
【００７７】
上で列挙するアミノ酸対は、ジスルフィド結合が形成できるようにシステインで置き換えることができる位置にある。システインは、これらの位置に、既知の技術により工学的に作製できる。
【００７８】
したがって、一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ１００ｂとＶＬ４９、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０１とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００７９】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中であってＣＤＲの外側の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８０】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中であってＣＤＲの外側の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８１】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、ＶＨのシステイン残基は４４位であり、ＶＬのシステイン残基は１００位である。
【００８２】
典型的に、システイン対は、ＶＨ及びＶＬ中のこれらの位置に工学的に作製され、したがって、一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中の２つの工学的に作製されたシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、工学的に作製されたシステイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ１００ｂとＶＬ４９、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０１とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８３】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中であってＣＤＲの外側の２つの工学的に作製されたシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、工学的に作製されたシステイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８４】
一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中であってＣＤＲの外側の２つの工学的に作製されたシステイン残基間のジスルフィド結合により連結され、工学的に作製されたシステイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８５】
一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、２つの工学的に作製されたシステイン残基間のジスルフィド結合により連結され、ＶＨの工学的に作製されたシステイン残基は４４位であり、ＶＬの工学的に作製されたシステイン残基は１００位である。
【００８６】
一実施形態では、ＶＨ１は、ＣＨ１に直接融合され、ＶＬ１は、ＣＬに直接融合され、ＶＨ２とＶＬ２との間にジスルフィド結合が存在する。
【００８７】
一実施形態では、１又は複数の結合部位の可変領域間の１又は複数のジスルフィド結合は、安定化の効果を有し、例えば、発現を助け、且つ／又は不適当な二量体形成を最小限にする。
【００８８】
一実施形態では、第１同族対中の可変ドメイン間及び／又は第２同族の対中の可変ドメイン間にジスルフィド結合が存在し、ＣＨ１及びＣＬのような定常領域断片間にジスルフィド結合が存在する。
【００８９】
本明細書で提供するフォーマットのいずれも、定常ドメイン間のジスルフィド結合あり又はなしで提供してよい。
【００９０】
ＣＬドメインは、カッパ又はラムダのいずれかに由来する。一実施形態では、ＣＬは、ｃカッパである。
【００９１】
一実施形態では、ＣＨ１とＣＬとの間に「自然の」ジスルフィド結合が存在する。「鎖間」システインを形成する結合のための自然の位置は、ヒトｃカッパ及びｃラムダ中の２１４である（Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）第４版１９８７）。
【００９２】
ＣＨ１中のシステイン又は「鎖間システイン」で形成される結合の厳密な位置は、実際に採用する特定のドメインに依存する。よって、例えば、ヒトガンマ−１におけるジスルフィド結合を形成する鎖間システインの自然の位置は、２３３位にある（Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）第４版１９８７）。ガンマ２、３、４、ＩｇＭ及びＩｇＤのようなその他のヒトアイソタイプについての結合形成システインの位置は知られており、例えば１２７である。
【００９３】
様々な鎖間ジスルフィド結合及びその欠如を図２Ａに示す。
【００９４】
一実施形態では、本開示による融合タンパク質は、ジスルフィド結合を、自然に存在するＣＨ１及びＣＬ中のものと対応する等価な位置に有する。
【００９５】
一実施形態では、ＣＨ１又はＣＬを含む定常領域は、自然に存在しない位置にあるジスルフィド結合を有する。これは、要求される位置にてアミノ酸鎖中にシステイン（単数又は複数）を導入することにより、分子中に工学的に作製できる。この自然でないジスルフィド結合は、ＣＨ１とＣＬとの間に存在する自然のジスルフィド結合に加えて又はその代わりにある。
【００９６】
一実施形態では、ＣＨ１とＣＬとの間の自然のジスルフィド結合は存在しない。一実施形態では、ＣＨ１とＣＬとの間の全ての鎖間ジスルフィド結合は存在しない。
【００９７】
一実施形態では、各定常領域断片は、少なくとも１つの可変ドメインと融合される。
【００９８】
一実施形態では、各定常領域断片も、ペプチド、例えば表１及び／又は２中の配列のような人工の／自然に存在しないリンカーを介して、可変ドメイン、例えばそれが融合される可変ドメインに対して非同族の対であるものに連結される。
【００９９】
一実施形態では、例えば重鎖中の定常領域断片は、ＣＨ１ドメインを含む。一実施形態では、定常領域断片は、ＣＨ１ドメインからなる。
【０１００】
ＣＨ１は、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）又はＩｇＭドメイン及びそれらのアイソタイプに由来してよい。
【０１０１】
一実施形態では、軽鎖は、ＣＬドメインを含む。一実施形態では、軽鎖中の定常領域は、ＣＬドメインからなる。
【０１０２】
一実施形態では、Ｎ末端から、重鎖は次のように配置される：可変ドメインＶＨ１（第１同族対の一部）、ＣＨ１、可変ドメインＶＨ２（第２同族対の一部）。この配置では、ＣＨ１は、例えば、第１同族対からの可変ドメインＶＬ１に融合され、ペプチドを介して第２同族対の可変ドメインに連結され得る。
【０１０３】
一実施形態では、Ｎ末端から、軽鎖は次のように配置される：ＶＬ１（第１同族対の一部）、ＣＬ、ＶＬ２（第２同族対の一部）、例えばＣＬは、第１同族対のＶＬ１に融合され、ペプチドを介して第２同族対のＶＬ２に連結され得る。
【０１０４】
適切なペプチドリンカーの例を以下に、例えば表１に示す。
【表１−１】
【表１−２】
【０１０５】
（Ｓ）は、配列３〜７において場合によって存在する。本開示で採用されるリンカーは、表１に示すリンカーを含んでよい。
【０１０６】
本開示による融合タンパク質で用いるための剛直性リンカーの例は、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号４２）、ＰＰＰＰ（配列番号４３）及びＰＰＰを含む。
【０１０７】
一実施形態では、ペプチドリンカーは、アルブミン結合性ペプチドを含む。
【０１０８】
アルブミン結合性ペプチドの例は、ＷＯ２００７／１０６１２０に示され、以下のものを含む：
【表２】
【０１０９】
一実施形態では、リンカーは、エフェクター機能を有する。
【０１１０】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質は二量体形成して、本明細書で（Ｆａｂ’Ｆｖ）２と言及する分子をもたらす。二量体形成は、例えば、本開示による２つの融合タンパク質のそれぞれ（すなわちＦａｂ−ｄｓＦｖ）上にある２つの溶媒露出「標的」システイン間のジスルフィド結合形成、又は２つのＦａｂ−Ｆｖのそれぞれにある「標的」システイン、リシン、糖部分若しくは非自然アミノ酸の化学架橋によることがある。
【０１１１】
Ｆａｂ−Ｆｖ間ジスルフィド結合形成（分子間結合形成）の形成が所望される場合、Ｆａｂ−Ｆｖ内の１つのリンカーだけが単数又は複数のシステインを含有する。すなわち、ＣＬとＶＬ２との間のリンカーが１又は複数のシステインを含有する場合、ＣＨ１とＶＨ２との間のリンカーは、通常、システインを欠く。
【０１１２】
ＣＨ１とＶＨ２との間のリンカーが１又は複数のシステインを含有する場合、ＣＬとＶＬ２との間のリンカーは、通常、システインを欠く。
【０１１３】
リンカーは、１から８の間のシステインを含有してよく、１〜８システインを含有する任意のペプチド配列で構成されてよい。
【０１１４】
適切なペプチド配列を表１、２及び３に示し、これらも、要求に応じて、１〜８システインを含有するように工学的に改変してよい。
【０１１５】
ヒンジを、二量体形成を促進するためにリンカーとして採用してよい。なぜなら、これらは、元来フレキシブルであり、効率的で安定なジスルフィド形成を促進するのに十分な２次構造を含有するからである。特に、任意のクラス又はアイソタイプの自然のヒンジ又は改変ヒンジは、それらが１から８の間のシステイン残基を含有する場合に、用いてよい。
【０１１６】
ＣＬとＶＬ２との間の自然の又は改変ヒンジリンカー配列が１又は複数のシステインを含有する場合、ＣＨ１とＶＨ２との間のリンカーは、通常、システインを欠く。
【０１１７】
ＣＨ１とＶＨ２との間のヒンジリンカーが１又は複数のシステインを含有する場合、ＣＬとＶＬ２との間のリンカーは、通常、システインを欠く。
【０１１８】
代わりに、Ｆａｂ−Ｆｖ間二量体形成は、ＶＬ１、ＶＨ１、ｃカッパ、ｃラムダ、ＣＨ１、ＶＬ２又はＶＨ２の任意の溶媒露出又は表面露出領域上に「標的」残基を工学的に作製することにより促進できる。同様に、「標的」残基は、軽鎖又は重鎖ポリペプチドのいずれかのＣ末端にて、例えばＶＬ２又はＶＨ２の後に工学的に作製してよい。これらの標的残基は、好ましくは、ＶＬ２若しくはＶＨ２の最後の残基の直後又はポリペプチドのリンカー、ヒンジ若しくはスペーサ領域内のシステイン残基である。
【０１１９】
「標的」残基が化学架橋リンカーにより連結される場合、長さ、組成、活性又はヘテロ機能性は、抗原への近づきやすさ、機能的結合力、血清半減期、精製特性又は貯蔵及び処方特性を微調整するために変動してよい。化学架橋リンカーは、部分的にポリエチレングリコールで構成されてよいか、又は第３特異性を加えるための追加の反応性基若しくは活性剤を含有してよい。
【０１２０】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ポリマー、例えばＰＥＧを用いて、第１融合タンパク質中の１つの鎖がポリペプチド、例えば抗体又は断片にコンジュゲートしてヘテロ二量体を形成するように二量体形成する。
【０１２１】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ポリマーを用いて、本開示による第２融合タンパク質と二量体形成して、ヘテロ二量体又はホモ二量体を形成する。
【０１２２】
図２Ｂは、本開示の２つのタンパク質を含むＰＥＧで連結された二量体フォーマットの例を示す。ＰＥＧリンカーは、第１融合タンパク質のＣＨ１と第２融合タンパク質のＣＨ１との間を連結する。しかし、適切な特性を有するヒンジ領域を導入して、ＰＥＧリンカー分子をそれにコンジュゲートしてよい。代わりに、ＣＬドメインを採用して、ＰＥＧをそれにコンジュゲートしてよい。
【０１２３】
１又は複数の可変ドメイン対間のジスルフィド結合の位置は、本明細書で記載される任意の位置であり得る。
【０１２４】
フォーマットは、定常領域間のジスルフィド結合あり又はなしで提供してもよく、その例は上でより詳細に議論される。
【０１２５】
ヒンジは、自然のヒンジ又は改変ヒンジであってよい。改変ヒンジは、表３のように採用してよい。
【０１２６】
いくつかの改変ヒンジ領域は、例えばＵＳ５，６７７，４２５、ＵＳ６６４２３５６、ＷＯ９９１５５４９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ９８２５９７１及びＷＯ２００５００３１７１に既に記載されており、これらは、本明細書に参照により組み込まれている。ヒンジの具体例は、表３に示すものを含む。
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、例えばＸＸはＡＡを表すことがある。
【０１２７】
一実施形態では、本開示による融合タンパク質は、ヒンジを含まない。
【０１２８】
本発明者らは、最終構築物中に同族の対として可変ドメインを提供することにより、関係する対により形成される結合部位の抗原結合特性が最適化され、維持されると考える。
【０１２９】
同族の対中のジスルフィドブリッジは、フォーマットの安定化を助けることにおいて有利であると考えられる。
【０１３０】
１若しくは複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を、本発明により提供される抗体可変ドメインに、抗体が標的抗原と結合し、その活性を中和する能力を著しく変更することなく作製できることが認識される。任意のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失の影響は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えばＢＩＡｃｏｒｅアッセイを用いることにより、当業者により容易に試験できる。
【０１３１】
一実施形態では、軽鎖と重鎖との間の鎖間ジスルフィド結合は存在せず、通常結合を形成しないシステインの１つ又は２つ（鎖間システイン）をポリマーにコンジュゲートする。１つの鎖間システインを、遺伝子工学技術を採用して選択的にコンジュゲートして、対応する鎖間システインを、セリンのような代替アミノ酸で置き換えることができる。
【０１３２】
両方の鎖間システインを、ポリマーに、適切に強い還元剤を採用することによりコンジュゲートしてよい。鎖間システインの様々な配置又はその欠如を図２Ａに示す。
【０１３３】
カッパ又はラムダドメインは、適切なポリマーとの化学的コンジュゲーションにより改変してよい。
【０１３４】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質中のヒトｃカッパは、Ｃ末端に：
【化１】
から選択される配列を含む。
【０１３５】
例えばすぐ上に記載するようなｃカッパのＣ末端における１又は複数のシステインを用いて、それにＰＥＧポリマーをコンジュゲートしてよい。
【０１３６】
コンジュゲーションのためのｃカッパ中の適切な位置は、以下のものを含む：
１．上部ｃカッパ、これは、本開示による融合タンパク質中のＶＬ１及びＶＬ２からほぼ等距離にあり、例えばＧｌｕ１４３、Ｇｌｎ１９９及び／又はＶａｌ１１０（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）、
２．中部ｃカッパ、これは、有効な抗原結合のために要求されると考えられる全ての可動性でフレキシブルなモチーフから離れており、例えばＬｙｓ１４５及び／又はＧｌｎ１４７（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）並びに／或いは
３．下部ｃカッパ、例えばＬｙｓ１９０、Ａｓｎ２１０、Ａｒｇ２１１及び／又はＧｌｕ２１３（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）。
【０１３７】
これらのアミノ酸は、既知の技術を採用して、要求に応じて例えばシステインで置き換えてよい。
【０１３８】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列：
【化２】
を、例えばｃカッパ中に、特にアミノ酸配列中の１０８位〜２１４位（Ｋａｂａｔ番号付け）に含む。
【０１３９】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質中のヒトＣＨ１は、Ｃ末端に、
ＫＳＣ、
ＫＳＳ及び
ＫＣＳ
から選択される配列を含む。
【０１４０】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列：
【化３】
を含む。太字で示すアミノ酸Ｓ１２０は、ＣＨ１の遺伝子／エキソン定義の一部ではないが、構造上の「肘」の一部と考えられる。
【０１４１】
下線で示す配列は、ＣＨ１の遺伝子／エキソン定義の一部ではないが、例えばＣＨ１中、特にアミノ酸配列の１２１位〜２１８位（Ｋａｂａｔ番号付け）における上部ヒンジの一部である。
【０１４２】
コンジュゲーションのためのＣＨ１中の適切な位置は、以下のものを含む：
１．上部ＣＨ１、これは、本発明による融合タンパク質中のＶＨ１及びＶＨ２からほぼ等距離にあり、例えばＡｓｎ２１１（２１６）及び／又はＴｈｒ１２３（Ｋａｂａｔ番号付けによりＡｓｎ２１６及び／又はＴｈｒ１１６）、
２．中部ＣＨ１、これは、有効な抗原結合のために要求されると考えられる全ての可動性でフレキシブルなモチーフから離れており、例えばＳｅｒ１６３及び／又はＳｅｒ１２７（Ｋａｂａｔ番号付けによりＳｅｒ１６３及び／又はＳｅｒ１２０）並びに／或いは
３．下部ＣＨ１、例えばＬｙｓ１３６、Ｓｅｒ１３７及び／又はＳｅｒ２２２（Ｋａｂａｔ番号付けによりＬｙｓ１２９、Ｓｅｒ１３０、Ｓｅｒ２３２）。
【０１４３】
これらのアミノ酸は、既知の技術を採用して、要求に応じて例えばシステインで置き換えてよい。よって、一実施形態では、本発明による工学的に作製されたシステインは、所定のアミノ酸の位置での自然に存在する残基がシステイン残基で置き換えられていることをいう。
【０１４４】
工学的に作製されたシステインの導入は、当該技術において既知の任意の方法を用いて行うことができる。これらの方法は、それらに限定されないが、ＰＣＲ伸長オーバーラップ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又はカセット突然変異誘発を含む（全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、１９８９；Ａｕｓｂｅｌら、分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＆Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９３を参照されたい）。部位特異的突然変異誘発キットは商業的に入手可能であり、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キットである（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら、１９８５、Ｇｅｎｅ、３４：３１５〜３２３に基づいて行うことができる。代わりに、変異体は、アニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅による完全遺伝子合成と、オーバーラップオリゴヌクレオチドのクローニングとにより作製できる。
【０１４５】
一実施形態では、融合タンパク質は、ポリマーのコンジュゲーションのためにＣＨ１及び／又はＣＬ領域中にシステインを有さない。
【０１４６】
一実施形態では、ＶＨ１はＣＨ１に融合され、それらを接続するアミノ酸配列は、本明細書において肘という。一実施形態では、前記肘は、それにコンジュゲートされた、例えばＶＨ１とＶＨ２との間の等距離の位置にコンジュゲートされた、例えばＴｈｒ１２３（Ｋａｂａｔ番号付けによりＴｈｒ１１６）及び／又はＳ１１９（Ｋａｂａｔ番号付けによりＳｅｒ１１２）及び／又はＳ１２２（Ｋａｂａｔ番号付けによりＳｅｒ１１５）残基にコンジュゲートされた１又は複数の、例えば１つのＰＥＧポリマーを有する。ジスルフィド結合は、例えば単数又は複数のシステインを、分子中の適切な位置に工学的に作製して、それにＰＥＧポリマーをコンジュゲートするための基質をもたらすことによりもたらされる。
【０１４７】
一実施形態では、ＶＬ１はＣＬに融合され、それらを接続するアミノ酸配列は、本明細書において肘という。一実施形態では、前記肘は、それらにコンジュゲートされた、例えばＶＬ１とＶＬ２との間の等距離の位置にコンジュゲートされた、例えばＬｙｓ１０７、Ａｒｇ１０８及び／又はＴｈｒ１０９（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）残基にコンジュゲートされた１又は複数の、例えば１つのＰＥＧポリマーを有する。上で論じたように、システインは、コンジュゲーションのために要求に応じてもたらすことができる。
【０１４８】
一実施形態では、ＰＥＧは、凝集傾向の領域と空間的に近い残基とコンジュゲートされる。有利には、このような領域と近いＰＥＧ化は、対象の領域を、分子間相互作用から、治療用の投与のために適切な溶液での濃度にて実質的に遮蔽し得る。軽鎖中では、コンジュゲーションは、例えばＴｈｒ１０９若しくはＧｌｎ１９９（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）にて又はその付近にあって、例えばＶａｌＡｌａ−ＡｌａＬｙｓスポットを打ち消し、且つ／或いはＬｙｓ１４９又はＡｓｎ１５２（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）で、例えば単一のＬｅｕスポットを打ち消してよい。重鎖中では、コンジュゲーションは、例えばＧｌｎ１７８（Ｋａｂａｔ番号付けによりＧｌｎ１７９）若しくはＳｅｒ１８０（Ｋａｂａｔ番号付けによりＳｅｒ１８２）若しくはＧｌｙ１８１（Ｋａｂａｔ番号付けによりＧｌｙ１８３）にて又はその付近にあって、ＶａｌＬｙｓ−Ｔｙｒスポットに対処してよい。
【０１４９】
一実施形態では、ＰＥＧ分子は、溶媒露出、反応性及び／又は表面曝露／露出アミノ酸、例えばシステインに付着される。
【０１５０】
表面曝露システイン（遊離システイン）は、本明細書で採用する場合、融合タンパク質が「自然の」折り畳まれた立体構造にある場合に、それにＰＥＧ分子のようなエフェクター分子をコンジュゲートするために露出しているシステインに言及することを意図する。表面システインは、抗体又は断片の親水性部分で見出されるものである。このタイプの遊離システインをどのように工学的に作製するかの例は、ＵＳ７，５２１，５４１にも示される。
【０１５１】
システインで置き換えることができる４Ｄ５の軽鎖（図３に示す配列）中の適切なアミノ酸は、以下のものを含む：
セリン（Ｓ）：７、９、１０、１２、１４、２６、５６、６０、６３、６７、７６、７７、１１４、１２１、１２７、１５６、１５９、１６８、１７１、２０２、２０３、
トレオニン（Ｔ）：５、２０、２２、３１、６９、７２、７４、１２９、１９７、２０６、
グリシン（Ｇ）：１６、４１、５７、６８、１２８、１４３、１５７、２００、２１２
アスパラギン酸（Ｄ）：１７、２８、７０、１２２、１５１、１６７、１７０
アルギニン（Ｒ）：１８、２４、６１、２１１、
グルタミン（Ｑ）：２７、７９、１４７、１６０、１９５、１９９
アスパラギン（Ｎ）：３０、１５２、１５８、２１０、
アラニン（Ａ）：３４、１５３、
リシン（Ｋ）：３９、４２、１２６、１４５、１４９、１６９、
グルタミン酸（Ｅ）：５５、８１、１２３、１６１、２１３。
【０１５２】
上で採用する番号は、ＰＤＢ結晶構造配列ファイル１ＦＶＥで示すような抗体１次配列番号付けである。これらの番号は、Ｋａｂａｔ番号付けにも対応する。この開示は、本発明の融合タンパク質に含まれるその他の抗体又は断片中の対応するアミノ酸（Ｋａｂａｔ番号付けを採用する）の置き換えにも拡張される。
【０１５３】
よって、一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化４】
からなる群から選択される。
【０１５４】
一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化５】
からなる群から選択される。
【０１５５】
その他の適切な残基は、ＷＯ２００６／０３４４８８及びＷＯ２００８／０３８０２４を含む文献に記載されている。したがって、一実施形態では、システインを、融合タンパク質軽鎖中に、例えば：
Ｖ１５をＣで置き換えて、
Ａ４３をＣで置き換えて、
Ｖ１１０をＣで置き換えて、
Ｓ１１４をＣで置き換えて、
Ｓ１２１をＣで置き換えて、
Ｓ１２７をＣで置き換えて、
Ａ１４４をＣで置き換えて、
Ａ１５３をＣで置き換えて、
Ｎ１５８をＣで置き換えて、
Ｓ１６８をＣで置き換えて、
Ｖ２０５をＣで置き換えて、
Ｓ１７１をＣで置き換えて、
Ｓ１５６をＣで置き換えて、
Ｓ２０２をＣで置き換えて、且つ／又は
Ｓ２０３をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１５６】
上記の番号付けは、図３に示す軽鎖配列を参照するが、本明細書の開示は、その他の軽鎖における対応するＫａｂａｔ位置にも拡張される。
【０１５７】
一実施形態では、システインを、融合タンパク質軽鎖中に、例えば：
Ｓ１７１をＣで置き換えて、
Ｓ１５６をＣで置き換えて、
Ｓ２０２をＣで置き換えて、且つ／又は
Ｓ２０３をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１５８】
一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化６】
からなる群から選択される。
【０１５９】
一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化７】
からなる群から選択される。
【０１６０】
一実施形態では、システインを、融合タンパク質軽鎖定常領域、ＣＬ中に、例えば：
Ｔ１０９をＣで置き換えて、
Ｅ１４３をＣで置き換えて、
Ｋ１４５をＣで置き換えて、
Ｋ１４９をＣで置き換えて、且つ／又は
Ｎ２１０をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１６１】
一実施形態では、システインを、融合タンパク質軽鎖可変領域中に、例えば：
配列番号４４のＳ７７をＣで置き換えて、且つ／又は
配列番号４４のＫ１０７をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１６２】
一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｓ７７、Ｋ１０７、Ｔ１０９、Ｅ１４３、Ｋ１４５、Ｋ１４９及びＮ２１０からなる群から選択される。
【０１６３】
本明細書において上で特定された全ての残基はＩｇＧ１に由来するが、本明細書における開示は、抗体のその他のクラス及びアイソタイプからのその他の軽鎖中の対応するＫａｂａｔ位置までも拡張される。
【０１６４】
したがって、一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化８】
からなる群から選択される。
【０１６５】
一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化９】
からなる群から選択される。
【０１６６】
したがって、一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして７７位、１０７位、１０９位、１４３位、１４５位、１４９位及び２１０位からなる群から選択される。
【０１６７】
システインで置き換えることができる４Ｄ５の重鎖（図４に示す配列）中の適切なアミノ酸は、以下のものを含む：
セリン（Ｓ）：７、１７、２１、６３、７１、８６、１１９、１２０、１２２、１２７、１３４、１３５、１３７、１３９、１６０、１６３、１６８、１７９、１８０、１９３、１９４、１９５、２１０、２２２
トレオニン（Ｔ）：５８、６９、１２３、１３８、１６７、１９８、２００、
グリシン（Ｇ）：８、９、１０、１５、１６、２６、６６、１００、１０１、１０３、１４０、１４１、１６４、１６９、１８１、１９７、
アスパラギン酸（Ｄ）：６２、７３、１０２、２１５、
アルギニン（Ｒ）：５９、６７、８７、
グルタミン（Ｑ）：３、１３、１１２、１５５、１９９、２１９、
アスパラギン（Ｎ）：８４、２１１、
アラニン（Ａ）：８８、１２１、１６５
リシン（Ｋ）：４３、６５、１２４、１３６、２０８、２１３、２１７、
グルタミン酸（Ｅ）：８９。
【０１６８】
上で採用する番号は、ＰＤＢ結晶構造配列ファイル１ＦＶＥで示すような抗体１次配列番号付けである。この開示は、本発明の融合タンパク質に含まれるその他の抗体又は断片中の対応するアミノ酸（Ｋａｂａｔ番号付けを採用する）の置き換えにも拡張される。
【０１６９】
重鎖中の位置についての等価なＫａｂａｔ配列番号付けは、以下のとおりである：
セリン（Ｓ）：７、１７、２１、６２、７０、８２ｂ、１１２、１１３、１１５、１２０、１２７、１２８、１３０、１３４、１５６、１６３、１６８、１８０、１８２、１９５、１９６、１９７、２１５、２３２
トレオニン（Ｔ）：５７、６８、１１６、１３３、１６７、２００、２０５、
グリシン（Ｇ）：８、９、１０、１５、１６、２６、６５、９６、９７、９９、１３５、１３６、１６４、１６９、１８３、１９９、
アスパラギン酸（Ｄ）：６１、７２、９８、２２０、
アルギニン（Ｒ）：５８、６６、８６、
グルタミン（Ｑ）：３、１３、１０５、２０３
アスパラギン（Ｎ）：８２ａ、２１６、
アラニン（Ａ）：８４、１１４、１６５
リシン（Ｋ）：４３、６４、１１７、１２９、２１３、２１８、２２２、
グルタミン酸（Ｅ）：８５。
【０１７０】
したがって、一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化１０】
からなる群から選択される。
【０１７１】
一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化１１】
からなる群から選択される。
【０１７２】
その他の適切な残基は、ＷＯ２００６／０３４４８８及びＷＯ２００８／０３８０２４を含む文献に記載されている。したがって、一実施形態では、システインを、融合タンパク質重鎖中に、例えば：
Ａ４０をＣで置き換えて、
Ｌ８６をＣで置き換えて、
Ａ８８をＣで置き換えて、
Ｓ１１９をＣで置き換えて、
Ｓ１２０をＣで置き換えて、
Ａ１２１をＣで置き換えて、
Ｓ１２２をＣで置き換えて、
Ａ１７５をＣで置き換えて、
Ｖ１７６をＣで置き換えて、且つ／又は
Ｓ１７９をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１７３】
上記の番号付けは、図４に示す重鎖配列を参照するが、本明細書の開示は、その他の重鎖における対応するＫａｂａｔ位置にも拡張される。
【０１７４】
Ｋａｂａｔ番号付けによる等価な位置は、次のとおりである：
Ａ４０をＣで置き換え、
Ｌ８２ｃをＣで置き換え、
Ａ８４をＣで置き換え、
Ｓ１１２をＣで置き換え、
Ｓ１１３をＣで置き換え、
Ａ１１４をＣで置き換え、
Ｓ１１５をＣで置き換え、
Ａ１７６をＣで置き換え、
Ｖ１７７をＣで置き換え、且つ／又は
Ｓ１８０をＣで置き換える。
【０１７５】
したがって、一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化１２】
からなる群から選択される。
【０１７６】
一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化１３】
からなる群から選択される。
【０１７７】
一実施形態では、システインを、融合タンパク質重鎖定常領域ＣＨ１中に、例えば：
Ｔ１１６をＣで置き換えて、
Ｓ１６３をＣで置き換えて、
Ｓ１８２をＣで置き換えて、且つ／又は
Ｎ２１６をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１７８】
一実施形態では、システインを、融合タンパク質重鎖可変ドメイン、ＶＨ中に、例えば：
配列番号２２７のＳ８２ｂをＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１７９】
一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｓ８２ｂ、Ｔ１１６、Ｓ１６３、Ｓ１８２及びＮ２１６からなる群から選択される。
【０１８０】
本明細書において上で特定された全ての残基はＩｇＧ１に由来するが、本明細書における開示は、抗体のその他のクラス及びアイソタイプからのその他の重鎖中の対応するＫａｂａｔ位置にも拡張される。
【０１８１】
したがって、一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化１４】
の位置からなる群から選択される。
【０１８２】
一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化１５】
の位置からなる群から選択される。
【０１８３】
一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして８２ｂ、１１６、１６３、１８２及び２１６の位置からなる群から選択される。
【０１８４】
一実施形態では、本発明の組換え融合タンパク質は、重鎖中の１６３位及び／又は１８２位にて工学的に作製されたシステインを通じてＰＥＧ化される。
【０１８５】
一実施形態では、融合タンパク質は、ＰＥＧ分子が付着されているか又はＰＥＧ分子を付着できる遊離システインを含む。一実施形態では、融合タンパク質又はその一部は：
【化１６】
から選択される１又は複数の配列を含む。
【０１８６】
一実施形態では、遊離システインを含み、以下：
【化１７】
の１又は複数から選択される配列を場合によって含むシステインが工学的に作製された融合タンパク質を提供する。
【０１８７】
一実施形態では、配列：
【化１８】
を含む軽鎖が提供される。
【０１８８】
凡例
下線 表面露出側鎖
二重下線 システインに置き換えるのに適切な残基
太字 コンジュゲーション用に特に実際的に対象となる領域（ＣＤＲ及び外側／フレキシブルループから離れている）
斜体 実際上あり得ない対象の領域（ＣＤＲ残基に近いか又はその中）
淡い影付き 埋め込まれている／露出されていない領域
濃い影付き 「凝集傾向」を有するＣＨ１残基。
【０１８９】
一実施形態では、配列：
【化１９】
を含む重鎖が提供される。
【０１９０】
一実施形態では、ＰＥＧポリマーを、ＣＤＲから適切に離れ、肘領域に近い／隣接しているがその中にはコードされていない下部軽鎖可変ドメイン、例えばＶＬ１及び／又はＶＬ２中の位置、例えばＳｅｒ１２、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｎ７９又はＧｌｕ８１にコンジュゲートして、物体の結合がどのような様式でも少なくならず又は有害に影響されないようにする。これらの軽鎖残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けを用いて同じである。
【０１９１】
一実施形態では、ＰＥＧポリマーを、ＣＤＲから適切に離れ、肘領域に近い／隣接しているがその中にはコードされていない下部重鎖可変ドメイン、例えばＶＨ１及び／又はＶＨ２中の位置、例えばＧｌｎ１３（Ｋａｂａｔ番号付けによりＧｌｎ１３）又はＧｌｕ８９（Ｋａｂａｔ番号付けによりＧｌｕ８５）にコンジュゲートして、物体の結合がどのような様式でも少なくならず又は有害に影響されないようにする。
【０１９２】
一実施形態では、重鎖は、配列番号２２５及び／又は２２７に示す配列を含む。
【０１９３】
一実施形態では、軽鎖は、配列番号２２８及び／又は４４に示す配列を含む。
【０１９４】
本明細書における全ての実施形態は、物体とのＰＥＧポリマーのコンジュゲーションが、本開示の融合タンパク質の結合／親和性を少なくせず又はそれに有害に影響しないようなものである。
【０１９５】
適切なポリマーは、ポリ（エチレングリコール）又は特にメトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａまでの範囲の分子量を有するもののようなポリアルキレンポリマーを含む。その他の適切なポリマー、例えばデンプン、複合グリコフォーム、例えばＮ−ＧｌｕｃＮａｃ及びその他のもの、例えば調査されたポリマーは、アミノ酸に基づくもの、例えばポリ−ＧＧＧＧＳ、ポリグルタミン酸及びポリアスパラギン酸（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２００７；Ｊｕｌｔａｎｉら、１９９７；Ｚｕｎｉｎｏら、１９８２）；炭水化物に基づくもの、例えば酸化デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デンプン及びポリシアル酸（Ｆａｇｎａｎｉら、１９９０；Ｂａｕｄｙｓら、１９９８；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、２０００）；並びに完全合成ポリマー、例えばポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリオキシエチル化グリセロール、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリレート、蝶ネクタイ型デンドリマー及びＰＥＧ（Ｋａｎｅｄａら、２００４；Ｃａｌｉｃｅｔｉら、１９９９；Ｓｏｕｃｅｋら、２００２）を含む。
【０１９６】
ポリマーのサイズは、所望により変動してよいが、全般的に、５００Ｄａから８００００Ｄａまで、例えば５０００から５００００Ｄａまで、例えば２００００から４００００Ｄａまでの平均分子量の範囲内である。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図する使用、例えば腫瘍のようなあるいくつかの組織に局在化する能力又は循環半減期を拡張する能力に基づいて選択してよい（概説について、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５を参照されたい）。よって、例えば、生成物が循環を離れて組織に侵入することを意図する場合、例えば腫瘍の治療において用いるために、小さい分子量のポリマー、例えば５０００Ｄａ付近の分子量を有するものを用いることが有利であり得る。生成物が循環中に残ることを意図する用途について、より高い分子量のポリマー、例えば２００００Ｄａから４００００Ｄａまでの範囲の分子量を有するものを用いることが有利であり得る。
【０１９７】
ＰＥＧ分子は、抗体断片中にある任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を通じて付着してよい。このようなアミノ酸は、抗体断片中に自然に存在するか、又は組換えＤＮＡ法を用いて断片中に工学的に作製してよい（例えばＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１を参照されたい）。一例では、本発明の抗体分子は、改変が、その重鎖のＣ末端の端への、エフェクター分子の付着を可能にする１又は複数のアミノ酸の付加である、改変Ｆａｂ断片である。適切には、追加のアミノ酸は、１又は複数のシステイン残基を含有する改変ヒンジ領域を形成し、これに対してエフェクター分子が付着できる。２以上のＰＥＧ分子を付着させるために、複数の部位を用いることができる。
【０１９８】
一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、１つ又は２つのＰＥＧ分子でＰＥＧ化されている。
【０１９９】
一実施形態では、ＰＥＧ分子は、軽鎖中のシステイン１７１と連結されており、例えば本明細書に参照により組み込まれているＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい。
【０２００】
１つにおいて、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、溶媒露出又は表面露出システインを通じてＰＥＧ化されている。
【０２０１】
適切には、ＰＥＧ分子は、融合タンパク質中の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通じて共有的に連結されている。融合タンパク質に付着している各ポリマー分子は、タンパク質中にあるシステイン残基の硫黄原子に共有的に連結され得る。共有結合は、一般的に、ジスルフィド結合、又は特に硫黄−炭素結合である。付着点としてチオール基を用いる場合、適切に活性化されたＰＥＧ分子、例えばマレイミドのようなチオール選択的誘導体及びシステイン誘導体を用い得る。活性化されたＰＥＧ分子は、上記のようなポリマー−融合タンパク質含有分子の調製において出発物質として用いてよい。活性化されたＰＥＧ分子は、α−ハロカルボン酸若しくはエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドのようなチオール反応性基を含有する任意のポリマーであってよい。このような出発物質は、商業的に得ることができる（例えばＮｅｋｔａｒ、ＵＳＡ；Ｎｉｐｐｏｎ Ｏｉｌｓ ａｎｄ Ｆａｔｓ（ＮＯＦ）、Ｊａｐａｎ；Ｄｒ Ｒｅｄｄｙ、ＵＫ；ＪｅｎＫｅｍ、Ｃｈｉｎａ；Ｐａｎ Ａｓｉａ Ｂｉｏ、Ｃｈｉｎａ；ＳｕｎＢｉｏ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ；Ｂｉｏｖｅｃｔｒａ、ＵＳＡから）か、又は商業的に入手可能な出発物質から従来の化学的手順を用いて調製できる。具体的なＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン及び２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えばＮｉｐｐｏｎ Ｏｉｌｓ ａｎｄ Ｆａｔｓ（ＮＯＦ）、Ｊａｐａｎ；Ｄｒ Ｒｅｄｄｙ、ＵＫ；ＪｅｎＫｅｍ、Ｃｈｉｎａ；Ｐａｎ Ａｓｉａ Ｂｉｏ、Ｃｈｉｎａ；ＳｕｎＢｉｏ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙから）を含む。
【０２０２】
ＰＥＧ分子のようなエフェクター分子は、融合タンパク質に、アルデヒド糖を通じて、又はより一般的には抗体断片中にある任意の利用可能なアミノ酸側鎖若しくは末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を通じることを含むいくつかの異なる方法により付着できる。エフェクター分子の付着の部位は、ランダム又は部位特異的のいずれでもあり得る。
【０２０３】
ランダム付着は、リシンのようなアミノ酸を通じて頻繁に達成され、このことにより、ＰＥＧ分子のようなエフェクター分子が、リシンの位置に依存して抗体断片全体を通していくつかの部位で付着されることになる。このことはいくつかの場合において成功しているが、付着されるＰＥＧ分子のようなエフェクター分子の厳密な場所及び数は制御できず、このことは、例えば付着されるものが少なすぎるならば活性の喪失及び／又は例えばそれらが抗原結合部位に干渉するならば親和性の喪失（Ｃｈａｐｍａｎ ２００２ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５）を導き得る。結果として、ＰＥＧ分子のようなエフェクター分子の制御された部位特異的付着が、通常、選択される方法である。
【０２０４】
ＰＥＧ分子のようなエフェクター分子の部位特異的付着は、システイン残基への付着により最も一般的に達成される。なぜなら、このような残基は、抗体断片中で比較的非凡であるからである。抗体ヒンジは、部位特異的付着のために好ましい領域である。なぜなら、これらは、システイン残基を含有し、抗原結合に関与しやすい融合タンパク質の他の領域から離れているからである。適切なヒンジは、断片中に自然に存在するか、又は組換えＤＮＡ技術を用いて創出できるかのいずれかである（例えばＵＳ５，６７７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１；Ｌｅｏｎｇら、２００１ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６、１０６〜１１９；Ｃｈａｐｍａｎら、１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７、７８０〜７８３を参照されたい）。代わりに又はさらに、部位特異的システインを抗体断片中に工学的に作製して、例えばエフェクター分子付着のための表面曝露システイン（単数又は複数）を創出してもよい（ＵＳ５，２１９，９９６）。
【０２０５】
一実施形態では、本発明による融合タンパク質は、ヒンジを、ヒンジにほぼ対応する長さの、ＣＬとＶＬ２スペーサとの間のリンカーとして含む。
【０２０６】
自然の及び工学的に作製されたシステインをＰＥＧ分子のようなエフェクター分子の部位特異的付着のために用いる技術は、記載されている（ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０及びＷＯ２００５００３１７１を参照されたい）。これらの断片の全てにおいて、重鎖定常領域と軽鎖定常領域（ＣＨ１とＣＬ）との間の自然の鎖間ジスルフィド結合は、鎖間システインがエフェクター分子の付着の部位として用いられているからか、又は鎖間システインが、エフェクター分子がこれらのシステインに付着することを回避するために別のアミノ酸に置き換えられているからかのいずれかにより、存在しない。これらの断片は、エフェクター分子の付着の部位として用いるための工学的に作製されたシステインも含み得る。一例では、これらの工学的に作製されたシステインは、抗体断片出発物質の重鎖定常領域と軽鎖定常領域との間のジスルフィド連結を形成する工学的に作製されたシステインの対である。上記のジスルフィド結合は、しかし、エフェクター分子がこれらのシステインに一旦付着すると、喪失される。
【０２０７】
一実施形態では、抗体断片の重鎖及び軽鎖が天然鎖間ジスルフィド結合でない工学的に作製された鎖間ジスルフィド結合により連結された融合タンパク質ＰＥＧ分子コンジュゲートが提供される。この工学的に作製された鎖間ジスルフィド結合は、強い還元剤を用いる場合であっても、エフェクター分子の付着中は保持される。軽鎖：重鎖界面では、システインの対がうまく工学的に作製されて、還元剤及びエフェクター分子がほぼ近づくことができないように十分に埋め込まれたジスルフィド結合が導入される部位も提供される。「埋め込まれたジスルフィド」の例は、ＷＯ２００７０１０２３１に示される。
【０２０８】
これらの断片の具体的な利点は、工学的に作製された鎖間システイン間のジスルフィド結合が、エフェクター分子の付着中にインタクトのままであることにある。
【０２０９】
よって、本発明による一実施形態では、１又は複数のエフェクター分子が付着した融合タンパク質であって、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）定常領域間の自然の鎖間ジスルフィド結合が存在せず、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）定常領域が、一方が軽鎖（ＣＬ）定常領域中で他方が重鎖定常（ＣＨ１）領域中の工学的に作製されたシステインの対の間の鎖間ジスルフィド結合により連結されていることを特徴とする融合タンパク質が提供される。
【０２１０】
一実施形態では、ＰＥＧは、表面露出システインにコンジュゲートされる。
【０２１１】
用語「自然の鎖間ジスルフィド結合」は、本明細書で用いる場合、自然に存在する生殖系列抗体遺伝子においてコードされる重鎖及び軽鎖定常領域中のシステイン間に存在する鎖間ジスルフィド結合のことをいう。特に、自然の鎖間システインは、自然に存在する抗体中で互いにジスルフィド連結されている軽鎖の定常領域（ＣＬ）中のシステインと重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）中のシステインである。このようなシステインの例は、Ｋａｂａｔら、１９８７、免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡにより定義されるように、ヒトＩｇＧ１の軽鎖の２１４位及び重鎖の２３３位、ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖の１２７位、並びにヒトＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂの重鎖の１２８位で典型的に見出すことができる。これらのシステインの厳密な位置は、欠失、挿入及び／又は置換のような任意の改変が抗体断片に対して作製されているならば、自然に存在する抗体のものから変動し得ることが認識される。
【０２１２】
よって、１又は複数の実施形態では、自然の鎖間ジスルフィド結合は、存在しない。自然の鎖間ジスルフィド結合は、存在しないことがある。なぜなら、１又は複数のエフェクター分子がそれに付着されるからである。
【０２１３】
別の実施形態では、自然の鎖間ジスルフィド結合は、本発明の抗体断片中に存在しない。なぜなら、鎖間システインは、セリンのような別のアミノ酸で置き換えられているからである。
【０２１４】
本発明の抗体断片では、重鎖及び軽鎖定常領域は、軽鎖及び／又は重鎖中の工学的に作製されたシステイン間の鎖間ジスルフィド結合により連結される。
【０２１５】
本発明の融合タンパク質は、高い結合親和性、特にピコモル濃度を適切に有する。親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅを含む当該技術において既知の任意の適切な方法を用いて測定できる。一実施形態では、本発明の抗体分子は、約１００ｐＭ又はそれより良い結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、約５０ｐＭ又はそれより良い結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、約４０ｐＭ又はそれより良い結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、約３０ｐＭ又はそれより良い結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、完全にヒト又はヒト化されており、約１００ｐＭ又はそれより良い結合親和性を有する。
【０２１６】
所望により、本発明の融合タンパク質は、１又は複数のさらなるエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートされてよい。エフェクター分子が、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体に付着できる単一部分を形成するように連結された２以上のそのような分子を含んでよいことが認識される。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが所望される場合、これは、抗体断片がエフェクター分子に直接若しくはカップリング剤を介して連結される、標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順により調製できる。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当該技術において公知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、制御された薬物送達（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７、６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９〜５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３、６７〜１２３を参照されたい）。具体的な化学的手順は、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１に記載されるものを含む。代わりに、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されるような組換えＤＮＡ手順を用いて達成してよい。
【０２１７】
用語エフェクター分子は、本明細書で用いる場合、例えば、抗悪性腫瘍薬剤、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体若しくは抗体断片、合成の若しくは自然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの断片、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレートされた金属、ナノ粒子並びにＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法により検出できる単数又は複数の蛍光化合物のようなレポーター基を含む。
【０２１８】
エフェクター分子の例は、細胞毒又は細胞にとって不利益な（例えば死滅させる）任意の薬剤を含む細胞傷害性薬剤を含んでよい。例は、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそれらの類似体及び同族体を含む。
【０２１９】
エフェクター分子は、それらに限定されないが、代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリチアマイシン又はデュオカルマイシン）、並びに有糸分裂阻害薬剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）を含む。
【０２２０】
その他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８のようなキレート化された放射性核種；又はそれらに限定されないがアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンのような薬物を含み得る。
【０２２１】
その他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチド及び酵素を含む、対象の酵素は、それらに限定されないが、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼを含む。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドは、それらに限定されないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素若しくはジフテリア毒素のような毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子若しくは組織プラスミノゲンアクチベータのようなタンパク質、血栓性薬剤若しくは抗血管新生薬剤、例えばアンジオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくはその他の成長因子及び免疫グロブリンのような生物学的応答調節剤を含む。
【０２２２】
その他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能物質を含んでよい。検出可能物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影法で用いるため）及び非放射活性常磁性金属イオンを含む。診断薬として用いるために抗体にコンジュゲートできる金属イオンについて、全般的に、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリントランスフェラーゼを含み、適切な補欠分子族は、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンを含み、適切な蛍光物質は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリスリンを含み、適切な発光物質は、ルミノールを含み、適切な生物発光物質は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含み、適切な放射活性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃを含む。
【０２２３】
別の例では、エフェクター分子は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加し、且つ／又は抗体の免疫原性を低減し、且つ／又は免疫系までの上皮性関門を横切る抗体の送達を増進させることができる。このタイプの適切なエフェクター分子の例は、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質又はＷＯ０５／１１７９８４に記載されるもののようなアルブミン結合性化合物を含む。
【０２２４】
エフェクター分子がポリマーである場合、これは、全般的に、合成の又は自然に存在するポリマー、例えば場合によって置換されてよい直鎖状若しくは分岐鎖状のポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー、或いは分岐鎖状若しくは非分岐鎖状の多糖、例えばホモ又はヘテロ多糖であってよい。
【０２２５】
上記の合成ポリマー上に存在し得る具体的な場合によって存在する置換基は、１又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基を含む。
【０２２６】
合成ポリマーの具体例は、場合によって置換されてよい直鎖状若しくは分岐鎖状のポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はそれらの誘導体、特にメトキシポリ（エチレングリコール）のような場合によって置換されてよいポリ（エチレングリコール）又はそれらの誘導体を含む。
【０２２７】
具体的な自然に存在するポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体を含む。
【０２２８】
「誘導体」は、本明細書で用いる場合、反応性誘導体、例えばマレイミドのようなチオール選択的反応性基などを含むことを意図する。反応性基は、直接、又はリンカーセグメントを通じてポリマーと連結してよい。このような基の残基が、融合タンパク質とポリマーとの間の連結基として生成物の一部分を形成するいくつかの場合があることが認識される。
【０２２９】
本発明は、本明細書で記載する抗体、又はそれらの重鎖若しくは軽鎖のそれらの断片をコードする単離ＤＮＡも提供する。
【０２３０】
さらなる態様では、前記ＤＮＡを含むベクターが提供される。
【０２３１】
ベクターを構築し得る全般的な方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者に公知である。この点に関して、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより出版されるＭａｎｉａｔｉｓマニュアル（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ）が参照される。
【０２３２】
さらなる態様では、上記のベクター及び／又はＤＮＡを含む宿主細胞が提供される。
【０２３３】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の融合タンパク質分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために用いてよい。細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びその他の微生物の系を用いてよいか、又は真核、例えば哺乳類の宿主細胞発現系も用いてよい。適切な哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞を含む。
【０２３４】
本発明は、本発明による融合タンパク質分子を生成するためのプロセスであって、本発明のベクター（及び／又はＤＮＡ）を含有する宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現を導くために適切な条件下で培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む方法も提供する。
【０２３５】
重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物の生成のために、細胞系に、２つのベクター、すなわち軽鎖ポリペプチドをコードする第１ベクターと、重鎖ポリペプチドをコードする第２ベクターとを用いてトランスフェクトしてよい。代わりに、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターを用いてよい。
【０２３６】
本開示による融合タンパク質分子は、宿主細胞から良好なレベルで発現される。よって、融合タンパク質分子の特性は最適化され、商業的に処理することができる。
【０２３７】
本発明の融合タンパク質分子は、病的状態の治療及び／又は予防において有用である。
【０２３８】
よって、その治療有効量を投与することによる、治療で使用するための融合タンパク質分子が提供される。一実施形態では、融合タンパク質分子は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤として投与される。
【０２３９】
よって、本発明は、本発明の融合タンパク質分子を、１若しくは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物或いは診断用組成物も提供する。したがって、医薬品の製造のための本発明の融合タンパク質分子の使用が提供される。組成物は、薬学的に許容される担体を通常含む滅菌医薬組成物の一部として通常供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントを追加で含み得る。
【０２４０】
本発明は、本発明の融合タンパク質分子を、１若しくは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に加えて混合することを含む、医薬組成物又は診断用組成物を調製するプロセスも提供する。
【０２４１】
融合タンパク質分子は、医薬組成物若しくは診断用組成物における単独の活性成分であってよいか、或いはその他の抗体成分、例えば抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ若しくは抗ＬＰＳ抗体又はキサンチンのような非抗体成分を含むその他の活性成分を伴ってよい。その他の適切な活性成分は、寛容を誘導できる抗体、例えば抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４抗体を含む。
【０２４２】
さらなる実施形態では、本開示による融合タンパク質分子又は組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤、例えばコルチコステロイド（例えばフルチカゾンプロピオン酸エステル）及び／或いはベータ−２−アゴニスト（例えばサルブタモール、サルメテロール若しくはホルモテロール）又は細胞成長及び増殖の阻害剤（例えばラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキセート）又は代わりにＣＤ２８及び／若しくはＣＤ４０阻害剤と組み合わせて採用される。一実施形態では、阻害剤は、小分子である。別の実施形態では、阻害剤は、標的に特異的な抗体である。
【０２４３】
医薬組成物は、治療有効量の本発明の抗体を適切に含む。用語「治療有効量」は、本明細書で用いる場合、標的の疾患若しくは状態を治療、緩和又は予防するため、或いは検出可能な治療又は予防的効果を示すために必要な治療薬剤の量のことをいう。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類における動物モデルのいずれかにおいて初期に見積もることができる。動物モデルは、適当な投与濃度範囲及び投与経路を決定するために用いることもできる。このような情報は、次いで、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定するために用いることができる。
【０２４４】
ヒト対象についての精密な治療有効量は、疾患の状態の重症度、対象の全身健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食餌、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ（単数又は複数）、反応感受性並びに治療に対する耐性／応答に依存する。この量は、日常的な実験により決定でき、臨床医の判断の範囲内である。全般的に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。医薬組成物は、用量あたりの予め決定された量の本発明の活性薬剤を含有する単位剤形で簡便にもたらすことができる。
【０２４５】
組成物は、患者に個別に投与してよいか、又はその他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組み合わせて（例えば同時、逐次的又は別々に）投与してよい。
【０２４６】
本発明の融合タンパク質分子を投与する用量は、治療される状態の性質、存在する炎症の程度及び抗体分子が予防的に又は現存する状態を治療するためのいずれに用いられるかに依存する。
【０２４７】
投与の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続期間に依存する。抗体分子が短い半減期（例えば２〜１０時間）を有するならば、１日あたり１又は複数の用量を与えることが必要なことがある。代わりに、抗体分子が長い半減期（例えば２〜１５日）を有するならば、１日あたり１回、１週間あたり１回又は１若しくは２カ月毎に１回さえの投与量を与えることだけが必要なことがある。
【０２４８】
薬学的に許容される担体は、それ自体が、組成物を受容する個体にとって有害な抗体の生成を誘導しないものであるべきであり、且つ毒性でないべきである。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子のような大きく緩慢に代謝される巨大分子であってよい。
【０２４９】
薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩のような鉱酸塩又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩のような有機酸の塩を用いることができる。
【０２５０】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、食塩水、グリセロール及びエタノールのような液体を追加で含有してよい。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝物質のような補助物質が、このような組成物に存在してよい。このような担体により、医薬組成物が、患者による摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー及び懸濁剤に処方されることが可能になる。
【０２５１】
投与のための適切な形は、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は持続注入による非経口投与のために適切な形を含む。生成物が注射又は注入用である場合、これは、油性若しくは水性媒体中の懸濁物、溶液又はエマルジョンの形をとることができ、懸濁剤、防腐剤、安定化剤及び／又は分散剤のような処方用剤を含有できる。代わりに、抗体分子は、適当な滅菌液体での使用前の再構成のための乾燥形であってよい。
【０２５２】
一旦処方されると、本発明の組成物は、対象に直接投与できる。治療される対照は、動物であり得る。しかし、１又は複数の実施形態では、組成物は、ヒト対象への投与のために適合される。
【０２５３】
適切には、本開示による製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値に類似せず、例えば製剤のｐＨが７であるならば、８〜９又はそれより高いｐＩが適当であり得る。理論に拘束されることを望まないが、このことが、安定性が改善された最終製剤を最終的に提供し得る、例えば抗体又は断片が溶解されたままになると考えられる。
【０２５４】
本発明の医薬組成物は、それらに限定されないが、経口、静脈内、筋内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経真皮、経皮（例えばＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む任意の数の経路により投与してよい。ハイポスプレーを用いて、本発明の医薬組成物を投与してもよい。典型的に、治療用組成物は、液体の溶液又は懸濁物のいずれかとして注射剤として調製してよい。注射前に液体媒体に溶解又は懸濁するために適切な固体の形も調製してよい。
【０２５５】
組成物の直接送達は、全般的に、注射により、皮下、腹腔内、静脈内若しくは筋内で達成されるか、又は組織の間質空間内に送達される。組成物は、病変に投与することもできる。投与量処理は、単回用量計画又は複数回用量計画であってよい。
【０２５６】
組成物中の活性成分は、融合タンパク質分子であることが認識される。それ自体で、これは、消化管内の分解に対して感受性である。よって、消化管を用いる経路により組成物を投与するならば、組成物は、抗体を分解から保護するが、抗体が消化管から一旦吸収されると抗体を放出する因子を含有する必要がある。
【０２５７】
薬学的に許容される担体についての詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの製薬科学（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。
【０２５８】
一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
【０２５９】
適切な吸入用調製物は、吸入用粉剤、噴射用ガス又は噴射用ガスを含まない吸入用溶液を含有する定量エアロソルを含む。活性物質を含有する本開示による吸入用粉剤は、上記の活性物質のみからなるか、又は上記の活性物質と生理的に許容される賦形剤との混合物からなることができる。
【０２６０】
これらの吸入用粉剤は、単糖（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えばデキストラン）、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いの混合物を含み得る。単糖及び二糖が適切に用いられ、それのみではないが特にそれらの水和物の形のラクトース又はグルコースの使用。
【０２６１】
肺における沈着のための粒子には、１０ミクロン未満、例えば１〜９ミクロン、例えば０．１から５μｍまで、特に１から５μｍまでの粒子サイズが要求される。活性成分（例えば抗体又は断片）の粒子サイズは、第一に重要である。
【０２６２】
吸入用エアロソルを調製するために用いることができる噴射用ガスは、当該技術において知られている。適切な噴射用ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンのような炭化水素、並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン若しくはシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体のようなハロ炭化水素から選択される。上記の噴射用ガスは、そのまま又はそれらの混合物として用いてよい。
【０２６３】
特に適切な噴射用ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにそれらの混合物が特に適切である。
【０２６４】
噴射用ガス含有吸入用エアロソルは、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、滑沢剤及びｐＨを調製するための手段のようなその他の成分も含有してよい。これらの全ての成分は、当該技術において知られている。
【０２６５】
本発明による噴射用ガス含有吸入用エアロソルは、５重量％までの活性物質を含有してよい。本発明によるエアロソルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【０２６６】
代わりに、肺への局所投与も、例えばネブライザー、例えば圧縮機に接続されたネブライザー（例えばＰａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．により製造されるＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮機に接続されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）ネブライザー）のようなデバイスを採用する液体の溶液又は懸濁物製剤の投与によることができる。
【０２６７】
本発明の融合タンパク質分子は、溶剤に分散して、例えば溶液又は懸濁物の形で送達できる。これは、適当な生理的溶液、例えば食塩水又はその他の薬理学的に許容される溶剤又は緩衝溶液に懸濁できる。当該技術において既知の緩衝溶液は、０．０５ｍｇから０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇから９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇから０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇから０．３０ｍｇの無水クエン酸塩、及び０．４５ｍｇから０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを水１ｍｌあたりに含有して、約４．０から５．０のｐＨを達成することができる。懸濁物は、例えば凍結乾燥抗体を採用できる。
【０２６８】
治療用の懸濁物又は溶液の製剤は、１又は複数の賦形剤も含有できる。賦形剤は、当該技術において公知であり、緩衝液（例えばクエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液及び重炭酸塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む。溶液又は懸濁物は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェアにカプセル化できる。製剤は、全般的に、滅菌製造プロセスを採用する実質的な滅菌形で提供される。
【０２６９】
これは、製剤に用いるための緩衝された溶剤／溶液のろ過、滅菌緩衝溶剤溶液中への抗体の無菌懸濁、及び当業者が熟知している方法による滅菌貯蔵容器への製剤の分配による製造及び滅菌処理を含み得る。
【０２７０】
本開示による噴霧化用製剤は、例えばホイルエンベロープに包装された単回用量単位（例えば密閉プラスチック容器又はバイアル）として提供してよい。各バイアルは、例えば２ｍｌの容量の溶剤／溶液の緩衝液中に単位用量を含有する。
【０２７１】
本開示の融合タンパク質分子は、噴霧化による送達のために適切であると考えられる。
【０２７２】
本明細書の文脈における含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味することを意図する。
【０２７３】
技術的に適当である場合、本発明の実施形態は組み合わせることができる。
【０２７４】
実施形態は、あるいくつかの特徴／要素を含むと本明細書において記載される。本開示は、前記特徴／要素からなる又は実質的にそれらからなる別々の実施形態にも拡張される。
【０２７５】
本発明は、以下の実施例により例示によってのみさらに記載され、これらは、添付の図面に言及する。添付の図面において、以下のとおりである。
図１は、本開示による様々な融合タンパク質フォーマットを示す。
図２Ａは、様々な既知の抗体断片フォーマットを示す。
図２Ｂは、本願で請求する発明による二量体フォーマットについてのある可能性のある配置を示す。
図３は、抗体４Ｄ５についての軽鎖アミノ酸配列を示す。
図４は、抗体４Ｄ５についての重鎖アミノ酸配列を示す。
図５は、太字で示す表面Ｃｙｓ変異の位置とともにＡ２６Ｆａｂ−（３ｘＧ４Ｓ）−ｄｓＦｖ６４５を示す。
図６は、Ａ２６Ｆａｂ−（３ｘＧ４Ｓ）−ｄｓＦｖ６４５、Ｓ１８２及びＳ１６３のＰＥＧ化変異体の非還元ゲルを示す。
【実施例】
【０２７６】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖ
Ｆａｂ−ｄｓＦｖフォーマットでの抗体融合体を、ＷＯ２０１０／０３５０１２に記載されるようにして作製した。Ｆａｂ−ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０９６４１８に記載され、図５に示すＡ２６として知られるＯＸ−４０抗体からの可変領域（配列番号２２５及び２２８）と、ＷＯ２０１０／０３５０１２及び図５に記載される６４５として知られる抗ヒト血清アルブミン抗体の可変領域配列、配列番号２２７及び４４とを含んだ。フォーマットは、Ａ２６Ｆａｂ−ｄｓ６４５Ｆｖであった。
【０２７７】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖ Ａ２６−６４５中の特定の残基は、システイン残基の導入のためにＰＥＧ化のための点として選択した。選択された変異は、重鎖及び軽鎖の両方の中であり、Ｆａｂ及びＦｖの両方の中であった。効果をタンパク質生成、折り畳み、親和性及び安定性の対するものに限定するために、ＣＤＲ及びいずれのその他の構造的に重要なモチーフから離れた残基を選択するように注意した。
【０２７８】
選択した残基を、図５及び表４に示す。特定の残基に番号をつけ、図５において太字で強調する。
【表４】
【０２７９】
変異５及び１３は、鎖間ジスルフィド結合に寄与する２つのシステイン残基のうち１つがセリンに変異され、他方がＰＥＧ化部位のために残されている対照として作製した。
【０２８０】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖの突然変異誘発
Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けした表４における各位置でのＦａｂ−ｄｓＦｖ Ａ２６−６４５の部位特異的突然変異誘発は、以下のようにして行った。Ｆａｂ−ｄｓＦｖ Ａ２６−６４５をコードするベクターを、標準的な「オーバーラップＰＣＲ法」を用いる部位特異的突然変異誘発に供した。簡単に述べると、２つの変異原性オリゴヌクレオチドを、２つのフランキングオリゴヌクレオチドとともに用いて、２回の別々のＰＣＲ反応において２つの変異ＰＣＲ生成物を作製した。各反応からの小容量（典型的に約１ｕｌ）のオーバーラップＰＣＲ粗生成物を、同じ２つのフランキングオリゴヌクレオチドを用いる３回目のアセンブリＰＣＲにおいて鋳型として用いた。このことにより、全長変異ＤＮＡ配列が作製され、これを発現プラスミドに制限／ライゲーションによりクローニングした後に、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２８１】
哺乳類細胞における発現のためのＦａｂ−ｄｓＦｖ融合プラスミドの構築
各Ｆａｂ−ｄｓＦｖ重鎖変異体を、哺乳類発現ベクターに、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下でクローニングした。これらを、哺乳類細胞における発現のために（以下を参照されたい）、対応するＦａｂ−ｄｓＦｖ軽鎖を含有する類似のベクターと対形成させた。
【０２８２】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖの哺乳類発現
ＨＥＫ２９３細胞に、重鎖及び軽鎖のプラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を製造者の使用説明に従って用いてトランスフェクトした。簡単に述べると、２μｇの重鎖プラスミド＋２μｇの軽鎖プラスミドを、１０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋３４０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地とＲＴにて２０分間インキュベートした。混合物を、次いで、懸濁された５×１０６のＨＥＫ２９３細胞に加え、３７℃にて振とうしながら４日間インキュベートした。
【０２８３】
プロテインＧ精製
哺乳類発現懸濁物を遠心分離により清澄化し、上清を２ｍＬまで、１０ｋＤａ分子量カットオフ遠心分離濃縮器を用いて濃縮した。濃縮された上清を、１６０００×ｇにて１０分間遠心分離して、いずれの沈殿物も除去し、次いで１．８ｍＬを、１ｍｌのＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１ｍｌ／分にて装填した。カラムを２０ｍＭリン酸塩、４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４で洗浄し、結合した物質を０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７で溶出した。溶出ピーク（２．５ｍＬ）を回収し、ｐＨを約ｐＨ７に、１００μＬの２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．５を用いて調整した。ｐＨを調整した溶出物をＰＢＳ中に、１０ｋＤａ分子量カットオフ遠心分離濃縮器を用いてダイアフィルトレーションし、約５００μＬに濃縮した。
【０２８４】
Ｔｈｒ１０９Ｃｙｓ及びＡｓｎ２１６Ｃｙｓ以外の全てのＦａｂ−ｄｓＦｖは、適度に良好に発現された。これらの両方の発現が乏しい変異体のＤＮＡ配列を確認した。配列に問題はなかったが、これらはともに収率が非常に低く、軽鎖についてのＴｈｒ１０９Ｃｙｓも重鎖についてのＡｓｎ２１１Ｃｙｓもさらに分析しなかった。
【０２８５】
Ｂｉａｃｏｒｅ
Ｆａｂ−ｄｓＦｖ構築物の相互作用についての結合親和性及び動態パラメータを、ＣＭ５センサチップ及びＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）実行緩衝液を用いるＢｉａｃｏｒｅ３０００で行う表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。Ｆａｂ−ｄｓＦｖ試料を、センサチップ表面に、ヒトＦ（ａｂ’）２特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９７）又は内部で作製した抗ヒトＣＨ１モノクローナル抗体のいずれかを用いて捕捉した。捕捉抗体の共有的固定化を、標準的なアミンカップリング化学により達成した。
【０２８６】
各アッセイサイクルは、まず、１分間の注入を用いてＦａｂ−ｄｓＦｖを捕捉した後の、抗原の３分間の注入からなる会合段階からなり、その後、解離を２０分間監視した。各サイクルの後に、捕捉表面を、４０ｍＭ ＨＣｌを２×１分間、その後５ｍＭ ＮａＯＨを３０秒間注入することにより再生した。用いた流速は、捕捉について１０μｌ／分、会合及び解離段階について３０μｌ／分並びに再生について１０μｌ／分であった。
【０２８７】
動態アッセイのために、抗原の力価決定を行い、ブランクのフローセルを参照の減算のために用い、緩衝液ブランク注入を含めて、装置ノイズ及びドリフトを減算した。
【０２８８】
得られたセンサグラムを、標準的な１：１結合モデルにＢｉａｃｏｒｅ ３０００評価ソフトウェアを用いて同時グローバルフィッティングすることにより、動態パラメータを決定した。
【表５】
【０２８９】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖ−Ｃｙｓの還元及びＰＥＧ化
ＣＨ１上のＳ１８２Ｃ又はＳ１６３ＣにてシステインＰＥＧ化部位が導入された、０．１Ｍリン酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６中のプロテインＧにより精製したＦａｂ−ｄｓＦｖを、０．１Ｍリン酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６中の１００ｍＭβ−メルカプトエチルアミン（βＭＥＡ）を１ｍＭの最終濃度まで加えることにより還元した。還元反応を周囲温度にて１時間インキュベートした後に、０．１Ｍリン酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６の定組成勾配中で運転するＳｅｐｈａｃｒｙｌ−２００ １０／３０カラム上でのＳＥ−ＨＰＬＣにより分画した。ほとんどの単量体Ｆａｂ−ｄｓＦｖを含有する５００μｌの画分を同定して２つに分けた。一方の半分には、０．１Ｍリン酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６中の５μｌの１５０ｍｇ／ｍｌ ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−２００ＭＡ ＰＥＧ（ＮＯＦ）を加えたが、これは、２０ｋＤａマレイミド活性ＰＥＧである。他方の半分には、０．１Ｍリン酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６中の５μｌの１００ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を加えた。全ての試料を、周囲温度にて１晩インキュベートした。試料を、非還元４〜２０％アクリルアミドＴｒｉｓ／グリシンゲルで分析した。ゲルを、Ｏｗｌ銀染色キットを製造者の使用説明に従って用いて銀染色した。図６を参照されたい。
【０２９０】
図６
Ａ＝Ｓ１８２Ｃ ＣＨ１＋ＰＥＧ
Ｂ＝Ｓ１６３Ｃ ＣＨ１＋ＰＥＧ
Ｃ＝Ｓ１８２Ｃ ＣＨ１＋ＮＥＭ
【０２９１】
図６のレーンＣは、還元が、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ内の内部及び間のジスルフィド結合を破壊しないことを証明する。存在する唯一のバンドは、還元及びＮＥＭキャッピングを受けていない標準物質と比較した場合に、正しくジスルフィド結合されたＦａｂ−ｄｓＦｖと同じ位置で移動する（データは示さず）。レーンＡ及びＢでは、２つのバンドがあり、より低いものは、正しくジスルフィド結合されたＦａｂ−ｄｓＦｖに相当し、より高いものは、ＰＥＧ化された正しくジスルフィド結合されたＦａｂ−ｄｓＦｖである。ゲル上でのシフトは、１つの２０ｋ ＰＥＧの付加を示す。用いたマレイミド化学により、このデータは、ＣＨ１上のＳ１８２Ｃ及びＳ１６３Ｃの導入されたシステインＰＥＧ部位でのＦａｂ−ｄｓＦｖの部位特異的ＰＥＧ化を証明する。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、２つの抗原結合部位を有する抗体であって、例えば各部位の周辺の立体障害が最小限であることにより、単数又は複数の標的抗原に対する親和性がフォーマットにより有害に影響されない抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多価抗体は既知である。しかし、基本的な概念は数年前に開示されたものの、この技術を活用することに関連して実際上の困難性が存在し、よって、これは、開発中の薬学的な生物学的製品の調製のために広く採用されていない。
【０００３】
自然でない／天然でない抗体フォーマットは発現させることが困難であり得、このことは、商品の経費を支持できないレベルまで著しく押し上げることがある。これらのフォーマットは、標準的な抗体又は断片と比較して免疫原性を増加するか若しくはｉｎ ｖｉｖｏ安定性を低減することがあり、且つ／或いは望ましくない薬物動態を有することがある。
【０００４】
特に、均質な生成物を調製することに関連する問題点は、自然でないフォーマットについての懸念である。例えば、単量体成分を組み合わせる順列が１より多いならば、混合物を得ることができる。よって、所望の／標的の物体を満足のいく純度レベルで単離するために精巧な精製方法が要求されることがある。
【０００５】
このことは、いくつかの方法により対処されており、例えば二重特異性ダイアボディの生成における短いリンカーの使用は、適当な二量体形成を助けると言われた。しかし、可変ドメインの配向が、フォーマットの発現及び活性結合部位の形成に影響し得ることがデータにより示されている。
【０００６】
所望の配置又は配向での組み立てを強要するためのあるアプローチは、「ノブ−イン−ホール」法とよばれ、ここでは、例えばいくつかの抗体ではバリン１３７を大きい残基であるフェニルアラニンに交換し、ロイシン４５をトリプトファンで置き換えることにより、大きい「ノブ」がＶＨドメインに導入される。例えばＶＬドメインに、いくつかの抗体ではフェニルアラニン９８をメチオニンに且つトリプトファン８７をアラニンに変異させることにより、相補的な穴が導入できる。しかし、いくつかの構築物について、抗原結合活性の低減が観察された。
【０００７】
本発明では、ＣＬを軽鎖中に、そしてＣＨ１を重鎖中にもたらすことにより、鎖の正しい配向を確実にする。
【０００８】
よって、
Ｎ末端から順に、ＶＨ１と呼称する可変ドメイン、ＣＨ１領域、及びＶＨ２と呼称するさらなる可変ドメインを含む重鎖と、
Ｎ末端から順に、ＶＬ１と呼称する可変ドメイン、ＣＬドメイン、及びＶＬ２と呼称する可変ドメインを含む軽鎖と
を含む組換え融合タンパク質であって、
前記重鎖及び軽鎖が、ＶＨ１及びＶＬ１の第１可変ドメイン対により形成される第１結合部位と、ＶＨ２及びＶＬ２の第２可変ドメイン対により形成される第２結合部位とを提供するように整列され、
結合部位を形成する可変ドメイン対の間、例えばＶＨ１とＶＬ１及び／又はＶＨ２とＶＬ２との間にジスルフィド結合が存在し、
前記融合タンパク質が、ＰＥＧポリマーにコンジュゲートされている組換え融合タンパク質が提供される。
【０００９】
本明細書で提供する組換え融合タンパク質は、完全抗体のものと同様の半減期も有利に有し、よって、治療における使用のために適切である見込みがある。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本開示による様々な融合タンパク質フォーマットを示す。
【図２Ａ】様々な既知の抗体断片フォーマットを示す。
【図２Ｂ】本願で請求する発明による二量体フォーマットについてのある可能性のある配置を示す。
【図３】抗体４Ｄ５についての軽鎖アミノ酸配列を示す。
【図４】抗体４Ｄ５についての重鎖アミノ酸配列を示す。
【図５】太字で示す表面Ｃｙｓ変異の位置とともにＡ２６Ｆａｂ−（３ｘＧ４Ｓ）−ｄｓＦｖ６４５を示す。
【図６】Ａ２６Ｆａｂ−（３ｘＧ４Ｓ）−ｄｓＦｖ６４５、Ｓ１８２及びＳ１６３のＰＥＧ化変異体の非還元ゲルを示す。
【００１１】
重鎖は、本明細書で採用する場合、ＣＨ１ドメインを含む鎖である。
【００１２】
全般的に、重鎖は、Ｆｃ断片、すなわちＣＨ２及び／又はＣＨ３断片を含まない。
【００１３】
一実施形態では、重鎖は、１つのＣＨ１ドメインだけを含む。
【００１４】
ＶＨ１及びＶＨ２は、本明細書で採用する場合、本発明による抗体の重鎖中に可変領域があるという事実に言及することを意図する。これは、それ自体、そのような可変領域の起源を示すものではない。
【００１５】
ＶＬ１及びＶＬ２は、本明細書で採用する場合、本発明による抗体の軽鎖中に可変領域があるという事実に言及することを意図する。これは、それ自体、そのような可変領域の起源を示すものではない。
【００１６】
軽鎖は、本明細書で採用する場合、ＣＬドメインを含む。一実施形態では、軽鎖は、１つのＣＬドメインだけを含む。
【００１７】
軽鎖中の定常領域断片としてのＣＬ、及び重鎖中の定常領域断片としてのＣＨ１の本明細書における配置は、不適当な二量体形成を最小限にすると考えられる。
【００１８】
一実施形態では、本開示による融合タンパク質は、例えば可変ドメインとのリンカーとしてのヒンジを含む。
【００１９】
ヒンジは、全長抗体で見出されるものに対応する位置でＣＨ１のＣ末端に付着させることができ、ＣＨ１とＶＨ２との間の連結を形成できる。この実施形態では、リンカーが軽鎖上にも備えられ、よってＶＬ２が、重鎖中でＶＨ２と対形成するように適切に配置される。軽鎖中で採用されるリンカーは、重鎖中で採用されるヒンジリンカーと同一、類似又は完全に異なっていてよい。
【００２０】
代わりの実施形態では、軽鎖は、例えばＣＬドメインのＣ末端に付着し、ＣＬドメインをＶＬ２に連結するヒンジを含む。この実施形態では、ＶＬ２及びＶＨ２ドメインが適切に対形成して活性部位を形成できることを確実にするためにリンカーが重鎖中に要求されることがある。重鎖中のリンカーは、軽鎖中で採用されるリンカーと同一、類似又は完全に異なることができる。
【００２１】
適切なヒンジの例を、以下に示す。
【００２２】
可変ドメインが、標的抗原と適切／適格に結合する予め定義された対を形成するように、各鎖にもたらされる。
【００２３】
一実施形態では、可変ドメイン対は、１００ｎｍ以下、例えば５０ｎｍ以下、特に１ｎｍ以下の、標的抗原に対する親和性を有する。
【００２４】
適切な可変ドメイン対は、例えば宿主での抗体の産生とその後のＢ細胞のスクリーニングを含む任意の可能な手段により同定してよい。代わりに、適切な対は、ファージディスプレイにより同定してよい。
【００２５】
ファージディスプレイ方法は、当該技術において既知であり、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２、４１〜５０；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４、１７７〜１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４、９５２〜９５８；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１９９７ １８７、９〜１８；及びＢｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７、１９１〜２８０；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；及びＷＯ９５／２０４０１；並びにＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３；及び５，９６９，１０８に開示されるものを含む。
【００２６】
トランスジェニックマウス又はその他の哺乳動物を含むその他の生物を用いて、ヒト化抗体を産生してよい。
【００２７】
一実施形態では、可変ドメイン対（又は各可変ドメイン対）は、同族の対である。
【００２８】
同族の対は、本明細書で採用する場合、可変ドメインの自然な対、すなわち単一の抗体又は抗体発現細胞から単離されたものに言及することを意図する。
【００２９】
一例では、同族の対は、協同して抗原と結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対であり、すなわちこれらは、相補的ＶＨ／ＶＬ対である。
【００３０】
典型的に、同族の対は、同じ抗体に由来するＶＨ／ＶＬ対である。一例では、同族の対は、Ｆａｂファージディスプレイライブラリーのような「対のライブラリー」からの対として単離された可変ドメインの対である。
【００３１】
一例では、ＶＨ／ＶＬ対は、単一特異性である。
【００３２】
第１及び第２結合部位は相対的（互いに相対的）な用語であり、互いを区別するために結合部位に与えられた呼称表示である。一方の結合部位を「第１」と表示するならば、他方は「第２」と表示される。
【００３３】
第１同族対及び第２対も、対を呼称上区別するための相対的な表示である。本明細書で「第１対」と表示されるある対は、分子中の位置について定義するものではない。
【００３４】
可変ドメインは、最適化及び／又はヒト化されていることがある。同族の対に由来する最適化／ヒト化可変ドメインは、最適化／ヒト化の後でもまだ同族の対とみなされる。
【００３５】
ＣＬは、本明細書で採用する場合、軽鎖中の定常領域部分のことをいい、これは、自然に存在する軽鎖定常領域であってよい。
【００３６】
各可変ドメインは、関係する鎖中の定常ドメインと直接又はリンカーを介してつなぎ合わせることができる。
【００３７】
「直接連結された」は、本明細書で採用する場合、遮られない連続アミノ酸配列、すなわちペプチド結合により直接連結された、例えば可変ドメインの配列又は逆に定常領域断片に直接連結され、リンカーによりつなぎ合わされていないものに言及することを意図する。アミノ酸配列中に「自然でないペプチドリンカー」を挿入することは、配列を中断するので、「自然でないペプチドリンカー」を含有する配列は、本明細書の意味の範囲内で、関係する部分に直接融合されるとはみなされない。自然なペプチドリンカーの付加も、それが可変ドメイン又は定常領域断片（例えばＣＬドメイン又はＣＨ１ドメイン）のような１又は複数の関係する成分の配列の一部を形成するとみなすことができないならば、アミノ酸配列を遮るとみなされる。
【００３８】
ＶＨ１は、全般的に、ＣＨ１と直接つなぎ合わされる。
【００３９】
ＶＬ１は、全般的に、ＣＬと直接つなぎ合わされる。
【００４０】
一実施形態では、ＶＨ１ ＣＨ１及びＶＬ１ ＣＬは一緒に、Ｆａｂ又はＦａｂ’を形成する。
【００４１】
一実施形態では、ＶＨ２中（例えばそのＮ末端）のアミノ酸は、ペプチド結合によりＣＨ１のアミノ酸（例えばＣＨ１のＣ末端に）に直接連結される。
【００４２】
一実施形態では、ＶＨ２中（例えばそのＮ末端）のアミノ酸は、リンカーによりＣＨ１（例えばＣＨ１のＣ末端に）に間接的に連結される。
【００４３】
一実施形態では、ＶＬ２中（例えばそのＮ末端）のアミノ酸は、ペプチド結合によりＣＬのアミノ酸（例えばＣＬのＣ末端に）に直接連結される。
【００４４】
一実施形態では、ＶＬ２中（例えばそのＮ末端）のアミノ酸は、リンカーによりＣＬ（例えばＣＬのＣ末端に）に間接的に連結される。
【００４５】
一実施形態では、重鎖中のＶＨ１は、重鎖からの可変ドメインである。すなわち、これは、抗体の自然の重鎖若しくはその関係する断片に由来するか、又はファージディスプレイのような代替の供給源に由来し、重鎖に由来する可変ドメインの特徴を有する。
【００４６】
一実施形態では、重鎖中のＶＨ１は、軽鎖からの可変ドメインである。すなわち、これは、抗体の自然の軽鎖若しくはその関係する断片に由来するか、又はファージディスプレイのような代替の供給源に由来し、軽鎖に由来する可変ドメインの特徴を有する。
【００４７】
一実施形態では、重鎖中のＶＨ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００４８】
一実施形態では、重鎖中のＶＨ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００４９】
一実施形態では、軽鎖中のＶＬ１は、重鎖からの可変ドメインである。
【００５０】
一実施形態では、軽鎖中のＶＬ１は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００５１】
一実施形態では、軽鎖中のＶＬ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００５２】
一実施形態では、軽鎖中のＶＬ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００５３】
一実施形態では、ＶＨ１は、軽鎖からの可変ドメインであり、ＶＨ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００５４】
一実施形態では、ＶＨ１は、重鎖からの可変ドメインであり、ＶＨ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００５５】
一実施形態では、ＶＨ１は、軽鎖からの可変ドメインであり、ＶＨ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００５６】
一実施形態では、ＶＨ１は、重鎖からの可変ドメインであり、ＶＨ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００５７】
一実施形態では、ＶＬ１は、軽鎖からの可変ドメインであり、ＶＬ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００５８】
一実施形態では、ＶＬ１は、重鎖からの可変ドメインであり、ＶＬ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００５９】
一実施形態では、ＶＬ１は、軽鎖からの可変ドメインであり、ＶＬ２は、重鎖からの可変ドメインである。
【００６０】
一実施形態では、ＶＬ１は、重鎖からの可変ドメインであり、ＶＬ２は、軽鎖からの可変ドメインである。
【００６１】
一実施形態では、第１可変ドメイン対は、第２可変ドメイン対と同じエピトープと結合する。
【００６２】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、標的抗原と強く結合する。
【００６３】
一実施形態では、第１可変ドメイン対は、第２可変ドメイン対と同じ抗原と結合し、例えば、第１可変ドメイン対及び第２可変ドメイン対は、同じ抗原上の異なるエピトープと結合する。
【００６４】
よって、一実施形態では、本開示による融合タンパク質は、単一特異性である。単一特異性は、本明細書で採用する場合、全ての結合部位が同じ標的抗原と結合することに言及することを意図する。
【００６５】
本実施形態の一態様では、全ての結合部位は、前記抗原の同じエピトープ（単数又は複数）と結合する。
【００６６】
代わりの実施形態では、少なくとも２つの結合部位は、標的抗原上の異なるエピトープと結合する。
【００６７】
一実施形態では、第１可変ドメイン対は、第２可変ドメイン対とは異なる／別個の抗原と結合する。
【００６８】
よって、一実施形態では、本開示による融合タンパク質は、二重特異性であり、例えば２つの結合部位は、異なる又は別個の抗原と特異的に結合する。
【００６９】
特異的に結合するとは、本明細書で採用する場合、標的抗原（すなわちそれらが特異的である抗原）に対する親和性が高く、それらが特異的でない抗原と低い親和性又はかなりより低い親和性で結合する（又は全く結合しない）抗体に言及することを意図する。親和性を測定する方法は、当業者に知られており、ＢＩＡｃｏｒｅのようなアッセイを含む。
【００７０】
一実施形態では、同族の対のような少なくとも１つの可変ドメイン対の可変ドメインは、ジスルフィド結合により連結される。
【００７１】
一実施形態では、例えば第１同族対において第１結合部位を形成する可変ドメイン間にジスルフィド結合が存在する。
【００７２】
一実施形態では、例えば第２同族対において第２結合部位を形成する可変ドメイン間にジスルフィド結合が存在する。
【００７３】
一実施形態では、例えばＶＬ２とＶＨ２との間のジスルフィド結合の非存在下で、ＶＬ１とＶＨ１との間にジスルフィド結合が存在する。
【００７４】
一実施形態では、例えばＶＬ１とＶＬ２との間のジスルフィド結合の非存在下で、ＶＬ２とＶＨ２との間にジスルフィド結合が存在する。
【００７５】
一実施形態では、第１結合部位を形成する可変ドメイン間のジスルフィド結合と、第２結合部位を形成する可変ドメイン間にさらなるジスルフィド結合とが存在する。
【００７６】
一実施形態では、ジスルフィド結合は、間である（文脈がそうでないと示さない限り、以下のリストにおいてＫａｂａｔ番号付けを採用する）。Ｋａｂａｔ番号付けに言及する場合いつでも、関係する参考文献は、Ｋａｂａｔら、１９８７、免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡである：
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ６、７８１〜７８８ Ｚｈｕら（１９９７）を参照されたい；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００、例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３ ５４５１〜５４５９ Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４）；又はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９巻２８号１８３２７〜１８３３１頁Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４）；又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０巻１２号１４５３〜１４５９頁Ｒａｊａｇｏｐａｌら（１９９７）を参照されたい；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５、例えばＪ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８、８２５〜８３１ Ｌｕｏら（１９９５）を参照されたい；
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６、７８１〜７８８ Ｚｈｕら（１９９７）を参照されたい；
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１、例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ３７７ １３５〜１３９ Ｙｏｕｎｇら（１９９５）を参照されたい；
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０、例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２９ １３６２〜１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（１９９０）を参照されたい；
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６、例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ６、７８１〜７８８ Ｚｈｕら（１９９７）を参照されたい；
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３、例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０巻７５３８〜７５４２頁Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３）；又はＰｒｏｔｅｉｎｓ１９、３５〜４７ Ｊｕｎｇら（１９９４）を参照されたい、或いは
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７、例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ３７７ １３５〜１３９ Ｙｏｕｎｇら（１９９５）を参照されたい。
【００７７】
上で列挙するアミノ酸対は、ジスルフィド結合が形成できるようにシステインで置き換えることができる位置にある。システインは、これらの位置に、既知の技術により工学的に作製できる。
【００７８】
したがって、一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ１００ｂとＶＬ４９、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０１とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００７９】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中であってＣＤＲの外側の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８０】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中であってＣＤＲの外側の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８１】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、ＶＨのシステイン残基は４４位であり、ＶＬのシステイン残基は１００位である。
【００８２】
典型的に、システイン対は、ＶＨ及びＶＬ中のこれらの位置に工学的に作製され、したがって、一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中の２つの工学的に作製されたシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、工学的に作製されたシステイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ１００ｂとＶＬ４９、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０１とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８３】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中であってＣＤＲの外側の２つの工学的に作製されたシステイン残基間のジスルフィド結合により連結でき、工学的に作製されたシステイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８４】
一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、一方がＶＨ中で他方がＶＬ中であってＣＤＲの外側の２つの工学的に作製されたシステイン残基間のジスルフィド結合により連結され、工学的に作製されたシステイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８５】
一実施形態では、可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、２つの工学的に作製されたシステイン残基間のジスルフィド結合により連結され、ＶＨの工学的に作製されたシステイン残基は４４位であり、ＶＬの工学的に作製されたシステイン残基は１００位である。
【００８６】
一実施形態では、ＶＨ１は、ＣＨ１に直接融合され、ＶＬ１は、ＣＬに直接融合され、ＶＨ２とＶＬ２との間にジスルフィド結合が存在する。
【００８７】
一実施形態では、１又は複数の結合部位の可変領域間の１又は複数のジスルフィド結合は、安定化の効果を有し、例えば、発現を助け、且つ／又は不適当な二量体形成を最小限にする。
【００８８】
一実施形態では、第１同族対中の可変ドメイン間及び／又は第２同族の対中の可変ドメイン間にジスルフィド結合が存在し、ＣＨ１及びＣＬのような定常領域断片間にジスルフィド結合が存在する。
【００８９】
本明細書で提供するフォーマットのいずれも、定常ドメイン間のジスルフィド結合あり又はなしで提供してよい。
【００９０】
ＣＬドメインは、カッパ又はラムダのいずれかに由来する。一実施形態では、ＣＬは、ｃカッパである。
【００９１】
一実施形態では、ＣＨ１とＣＬとの間に「自然の」ジスルフィド結合が存在する。「鎖間」システインを形成する結合のための自然の位置は、ヒトｃカッパ及びｃラムダ中の２１４である（Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）第４版１９８７）。
【００９２】
ＣＨ１中のシステイン又は「鎖間システイン」で形成される結合の厳密な位置は、実際に採用する特定のドメインに依存する。よって、例えば、ヒトガンマ−１におけるジスルフィド結合を形成する鎖間システインの自然の位置は、２３３位にある（Ｋａｂａｔ番号付け（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）第４版１９８７）。ガンマ２、３、４、ＩｇＭ及びＩｇＤのようなその他のヒトアイソタイプについての結合形成システインの位置は知られており、例えば１２７である。
【００９３】
様々な鎖間ジスルフィド結合及びその欠如を図２Ａに示す。
【００９４】
一実施形態では、本開示による融合タンパク質は、ジスルフィド結合を、自然に存在するＣＨ１及びＣＬ中のものと対応する等価な位置に有する。
【００９５】
一実施形態では、ＣＨ１又はＣＬを含む定常領域は、自然に存在しない位置にあるジスルフィド結合を有する。これは、要求される位置にてアミノ酸鎖中にシステイン（単数又は複数）を導入することにより、分子中に工学的に作製できる。この自然でないジスルフィド結合は、ＣＨ１とＣＬとの間に存在する自然のジスルフィド結合に加えて又はその代わりにある。
【００９６】
一実施形態では、ＣＨ１とＣＬとの間の自然のジスルフィド結合は存在しない。一実施形態では、ＣＨ１とＣＬとの間の全ての鎖間ジスルフィド結合は存在しない。
【００９７】
一実施形態では、各定常領域断片は、少なくとも１つの可変ドメインと融合される。
【００９８】
一実施形態では、各定常領域断片も、ペプチド、例えば表１及び／又は２中の配列のような人工の／自然に存在しないリンカーを介して、可変ドメイン、例えばそれが融合される可変ドメインに対して非同族の対であるものに連結される。
【００９９】
一実施形態では、例えば重鎖中の定常領域断片は、ＣＨ１ドメインを含む。一実施形態では、定常領域断片は、ＣＨ１ドメインからなる。
【０１００】
ＣＨ１は、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）又はＩｇＭドメイン及びそれらのアイソタイプに由来してよい。
【０１０１】
一実施形態では、軽鎖は、ＣＬドメインを含む。一実施形態では、軽鎖中の定常領域は、ＣＬドメインからなる。
【０１０２】
一実施形態では、Ｎ末端から、重鎖は次のように配置される：可変ドメインＶＨ１（第１同族対の一部）、ＣＨ１、可変ドメインＶＨ２（第２同族対の一部）。この配置では、ＣＨ１は、例えば、第１同族対からの可変ドメインＶＬ１に融合され、ペプチドを介して第２同族対の可変ドメインに連結され得る。
【０１０３】
一実施形態では、Ｎ末端から、軽鎖は次のように配置される：ＶＬ１（第１同族対の一部）、ＣＬ、ＶＬ２（第２同族対の一部）、例えばＣＬは、第１同族対のＶＬ１に融合され、ペプチドを介して第２同族対のＶＬ２に連結され得る。
【０１０４】
適切なペプチドリンカーの例を以下に、例えば表１に示す。
【表１−１】
【表１−２】
【０１０５】
（Ｓ）は、配列３〜７において場合によって存在する。本開示で採用されるリンカーは、表１に示すリンカーを含んでよい。
【０１０６】
本開示による融合タンパク質で用いるための剛直性リンカーの例は、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号４２）、ＰＰＰＰ（配列番号４３）及びＰＰＰを含む。
【０１０７】
一実施形態では、ペプチドリンカーは、アルブミン結合性ペプチドを含む。
【０１０８】
アルブミン結合性ペプチドの例は、ＷＯ２００７／１０６１２０に示され、以下のものを含む：
【表２】
【０１０９】
一実施形態では、リンカーは、エフェクター機能を有する。
【０１１０】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質は二量体形成して、本明細書で（Ｆａｂ’Ｆｖ）２と言及する分子をもたらす。二量体形成は、例えば、本開示による２つの融合タンパク質のそれぞれ（すなわちＦａｂ−ｄｓＦｖ）上にある２つの溶媒露出「標的」システイン間のジスルフィド結合形成、又は２つのＦａｂ−Ｆｖのそれぞれにある「標的」システイン、リシン、糖部分若しくは非自然アミノ酸の化学架橋によることがある。
【０１１１】
Ｆａｂ−Ｆｖ間ジスルフィド結合形成（分子間結合形成）の形成が所望される場合、Ｆａｂ−Ｆｖ内の１つのリンカーだけが単数又は複数のシステインを含有する。すなわち、ＣＬとＶＬ２との間のリンカーが１又は複数のシステインを含有する場合、ＣＨ１とＶＨ２との間のリンカーは、通常、システインを欠く。
【０１１２】
ＣＨ１とＶＨ２との間のリンカーが１又は複数のシステインを含有する場合、ＣＬとＶＬ２との間のリンカーは、通常、システインを欠く。
【０１１３】
リンカーは、１から８の間のシステインを含有してよく、１〜８システインを含有する任意のペプチド配列で構成されてよい。
【０１１４】
適切なペプチド配列を表１、２及び３に示し、これらも、要求に応じて、１〜８システインを含有するように工学的に改変してよい。
【０１１５】
ヒンジを、二量体形成を促進するためにリンカーとして採用してよい。なぜなら、これらは、元来フレキシブルであり、効率的で安定なジスルフィド形成を促進するのに十分な２次構造を含有するからである。特に、任意のクラス又はアイソタイプの自然のヒンジ又は改変ヒンジは、それらが１から８の間のシステイン残基を含有する場合に、用いてよい。
【０１１６】
ＣＬとＶＬ２との間の自然の又は改変ヒンジリンカー配列が１又は複数のシステインを含有する場合、ＣＨ１とＶＨ２との間のリンカーは、通常、システインを欠く。
【０１１７】
ＣＨ１とＶＨ２との間のヒンジリンカーが１又は複数のシステインを含有する場合、ＣＬとＶＬ２との間のリンカーは、通常、システインを欠く。
【０１１８】
代わりに、Ｆａｂ−Ｆｖ間二量体形成は、ＶＬ１、ＶＨ１、ｃカッパ、ｃラムダ、ＣＨ１、ＶＬ２又はＶＨ２の任意の溶媒露出又は表面露出領域上に「標的」残基を工学的に作製することにより促進できる。同様に、「標的」残基は、軽鎖又は重鎖ポリペプチドのいずれかのＣ末端にて、例えばＶＬ２又はＶＨ２の後に工学的に作製してよい。これらの標的残基は、好ましくは、ＶＬ２若しくはＶＨ２の最後の残基の直後又はポリペプチドのリンカー、ヒンジ若しくはスペーサ領域内のシステイン残基である。
【０１１９】
「標的」残基が化学架橋リンカーにより連結される場合、長さ、組成、活性又はヘテロ機能性は、抗原への近づきやすさ、機能的結合力、血清半減期、精製特性又は貯蔵及び処方特性を微調整するために変動してよい。化学架橋リンカーは、部分的にポリエチレングリコールで構成されてよいか、又は第３特異性を加えるための追加の反応性基若しくは活性剤を含有してよい。
【０１２０】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ポリマー、例えばＰＥＧを用いて、第１融合タンパク質中の１つの鎖がポリペプチド、例えば抗体又は断片にコンジュゲートしてヘテロ二量体を形成するように二量体形成する。
【０１２１】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ポリマーを用いて、本開示による第２融合タンパク質と二量体形成して、ヘテロ二量体又はホモ二量体を形成する。
【０１２２】
図２Ｂは、本開示の２つのタンパク質を含むＰＥＧで連結された二量体フォーマットの例を示す。ＰＥＧリンカーは、第１融合タンパク質のＣＨ１と第２融合タンパク質のＣＨ１との間を連結する。しかし、適切な特性を有するヒンジ領域を導入して、ＰＥＧリンカー分子をそれにコンジュゲートしてよい。代わりに、ＣＬドメインを採用して、ＰＥＧをそれにコンジュゲートしてよい。
【０１２３】
１又は複数の可変ドメイン対間のジスルフィド結合の位置は、本明細書で記載される任意の位置であり得る。
【０１２４】
フォーマットは、定常領域間のジスルフィド結合あり又はなしで提供してもよく、その例は上でより詳細に議論される。
【０１２５】
ヒンジは、自然のヒンジ又は改変ヒンジであってよい。改変ヒンジは、表３のように採用してよい。
【０１２６】
いくつかの改変ヒンジ領域は、例えばＵＳ５，６７７，４２５、ＵＳ６６４２３５６、ＷＯ９９１５５４９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０、ＷＯ９８２５９７１及びＷＯ２００５００３１７１に既に記載されており、これらは、本明細書に参照により組み込まれている。ヒンジの具体例は、表３に示すものを含む。
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表し、例えばＸＸはＡＡを表すことがある。
【０１２７】
一実施形態では、本開示による融合タンパク質は、ヒンジを含まない。
【０１２８】
本発明者らは、最終構築物中に同族の対として可変ドメインを提供することにより、関係する対により形成される結合部位の抗原結合特性が最適化され、維持されると考える。
【０１２９】
同族の対中のジスルフィドブリッジは、フォーマットの安定化を助けることにおいて有利であると考えられる。
【０１３０】
１若しくは複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を、本発明により提供される抗体可変ドメインに、抗体が標的抗原と結合し、その活性を中和する能力を著しく変更することなく作製できることが認識される。任意のアミノ酸置換、付加及び／又は欠失の影響は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えばＢＩＡｃｏｒｅアッセイを用いることにより、当業者により容易に試験できる。
【０１３１】
一実施形態では、軽鎖と重鎖との間の鎖間ジスルフィド結合は存在せず、通常結合を形成しないシステインの１つ又は２つ（鎖間システイン）をポリマーにコンジュゲートする。１つの鎖間システインを、遺伝子工学技術を採用して選択的にコンジュゲートして、対応する鎖間システインを、セリンのような代替アミノ酸で置き換えることができる。
【０１３２】
両方の鎖間システインを、ポリマーに、適切に強い還元剤を採用することによりコンジュゲートしてよい。鎖間システインの様々な配置又はその欠如を図２Ａに示す。
【０１３３】
カッパ又はラムダドメインは、適切なポリマーとの化学的コンジュゲーションにより改変してよい。
【０１３４】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質中のヒトｃカッパは、Ｃ末端に：
【化１】
から選択される配列を含む。
【０１３５】
例えばすぐ上に記載するようなｃカッパのＣ末端における１又は複数のシステインを用いて、それにＰＥＧポリマーをコンジュゲートしてよい。
【０１３６】
コンジュゲーションのためのｃカッパ中の適切な位置は、以下のものを含む：
１．上部ｃカッパ、これは、本開示による融合タンパク質中のＶＬ１及びＶＬ２からほぼ等距離にあり、例えばＧｌｕ１４３、Ｇｌｎ１９９及び／又はＶａｌ１１０（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）、
２．中部ｃカッパ、これは、有効な抗原結合のために要求されると考えられる全ての可動性でフレキシブルなモチーフから離れており、例えばＬｙｓ１４５及び／又はＧｌｎ１４７（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）並びに／或いは
３．下部ｃカッパ、例えばＬｙｓ１９０、Ａｓｎ２１０、Ａｒｇ２１１及び／又はＧｌｕ２１３（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）。
【０１３７】
これらのアミノ酸は、既知の技術を採用して、要求に応じて例えばシステインで置き換えてよい。
【０１３８】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列：
【化２】
を、例えばｃカッパ中に、特にアミノ酸配列中の１０８位〜２１４位（Ｋａｂａｔ番号付け）に含む。
【０１３９】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質中のヒトＣＨ１は、Ｃ末端に、
ＫＳＣ、
ＫＳＳ及び
ＫＣＳ
から選択される配列を含む。
【０１４０】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列：
【化３】
を含む。太字で示すアミノ酸Ｓ１２０は、ＣＨ１の遺伝子／エキソン定義の一部ではないが、構造上の「肘」の一部と考えられる。
【０１４１】
下線で示す配列は、ＣＨ１の遺伝子／エキソン定義の一部ではないが、例えばＣＨ１中、特にアミノ酸配列の１２１位〜２１８位（Ｋａｂａｔ番号付け）における上部ヒンジの一部である。
【０１４２】
コンジュゲーションのためのＣＨ１中の適切な位置は、以下のものを含む：
１．上部ＣＨ１、これは、本発明による融合タンパク質中のＶＨ１及びＶＨ２からほぼ等距離にあり、例えばＡｓｎ２１１（２１６）及び／又はＴｈｒ１２３（Ｋａｂａｔ番号付けによりＡｓｎ２１６及び／又はＴｈｒ１１６）、
２．中部ＣＨ１、これは、有効な抗原結合のために要求されると考えられる全ての可動性でフレキシブルなモチーフから離れており、例えばＳｅｒ１６３及び／又はＳｅｒ１２７（Ｋａｂａｔ番号付けによりＳｅｒ１６３及び／又はＳｅｒ１２０）並びに／或いは
３．下部ＣＨ１、例えばＬｙｓ１３６、Ｓｅｒ１３７及び／又はＳｅｒ２２２（Ｋａｂａｔ番号付けによりＬｙｓ１２９、Ｓｅｒ１３０、Ｓｅｒ２３２）。
【０１４３】
これらのアミノ酸は、既知の技術を採用して、要求に応じて例えばシステインで置き換えてよい。よって、一実施形態では、本発明による工学的に作製されたシステインは、所定のアミノ酸の位置での自然に存在する残基がシステイン残基で置き換えられていることをいう。
【０１４４】
工学的に作製されたシステインの導入は、当該技術において既知の任意の方法を用いて行うことができる。これらの方法は、それらに限定されないが、ＰＣＲ伸長オーバーラップ突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又はカセット突然変異誘発を含む（全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、１９８９；Ａｕｓｂｅｌら、分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＆Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９３を参照されたい）。部位特異的突然変異誘発キットは商業的に入手可能であり、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キットである（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）。カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら、１９８５、Ｇｅｎｅ、３４：３１５〜３２３に基づいて行うことができる。代わりに、変異体は、アニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅による完全遺伝子合成と、オーバーラップオリゴヌクレオチドのクローニングとにより作製できる。
【０１４５】
一実施形態では、融合タンパク質は、ポリマーのコンジュゲーションのためにＣＨ１及び／又はＣＬ領域中にシステインを有さない。
【０１４６】
一実施形態では、ＶＨ１はＣＨ１に融合され、それらを接続するアミノ酸配列は、本明細書において肘という。一実施形態では、前記肘は、それにコンジュゲートされた、例えばＶＨ１とＶＨ２との間の等距離の位置にコンジュゲートされた、例えばＴｈｒ１２３（Ｋａｂａｔ番号付けによりＴｈｒ１１６）及び／又はＳ１１９（Ｋａｂａｔ番号付けによりＳｅｒ１１２）及び／又はＳ１２２（Ｋａｂａｔ番号付けによりＳｅｒ１１５）残基にコンジュゲートされた１又は複数の、例えば１つのＰＥＧポリマーを有する。ジスルフィド結合は、例えば単数又は複数のシステインを、分子中の適切な位置に工学的に作製して、それにＰＥＧポリマーをコンジュゲートするための基質をもたらすことによりもたらされる。
【０１４７】
一実施形態では、ＶＬ１はＣＬに融合され、それらを接続するアミノ酸配列は、本明細書において肘という。一実施形態では、前記肘は、それらにコンジュゲートされた、例えばＶＬ１とＶＬ２との間の等距離の位置にコンジュゲートされた、例えばＬｙｓ１０７、Ａｒｇ１０８及び／又はＴｈｒ１０９（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）残基にコンジュゲートされた１又は複数の、例えば１つのＰＥＧポリマーを有する。上で論じたように、システインは、コンジュゲーションのために要求に応じてもたらすことができる。
【０１４８】
一実施形態では、ＰＥＧは、凝集傾向の領域と空間的に近い残基とコンジュゲートされる。有利には、このような領域と近いＰＥＧ化は、対象の領域を、分子間相互作用から、治療用の投与のために適切な溶液での濃度にて実質的に遮蔽し得る。軽鎖中では、コンジュゲーションは、例えばＴｈｒ１０９若しくはＧｌｎ１９９（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）にて又はその付近にあって、例えばＶａｌＡｌａ−ＡｌａＬｙｓスポットを打ち消し、且つ／或いはＬｙｓ１４９又はＡｓｎ１５２（直鎖状及びＫａｂａｔ番号付け）で、例えば単一のＬｅｕスポットを打ち消してよい。重鎖中では、コンジュゲーションは、例えばＧｌｎ１７８（Ｋａｂａｔ番号付けによりＧｌｎ１７９）若しくはＳｅｒ１８０（Ｋａｂａｔ番号付けによりＳｅｒ１８２）若しくはＧｌｙ１８１（Ｋａｂａｔ番号付けによりＧｌｙ１８３）にて又はその付近にあって、ＶａｌＬｙｓ−Ｔｙｒスポットに対処してよい。
【０１４９】
一実施形態では、ＰＥＧ分子は、溶媒露出、反応性及び／又は表面曝露／露出アミノ酸、例えばシステインに付着される。
【０１５０】
表面曝露システイン（遊離システイン）は、本明細書で採用する場合、融合タンパク質が「自然の」折り畳まれた立体構造にある場合に、それにＰＥＧ分子のようなエフェクター分子をコンジュゲートするために露出しているシステインに言及することを意図する。表面システインは、抗体又は断片の親水性部分で見出されるものである。このタイプの遊離システインをどのように工学的に作製するかの例は、ＵＳ７，５２１，５４１にも示される。
【０１５１】
システインで置き換えることができる４Ｄ５の軽鎖（図３に示す配列）中の適切なアミノ酸は、以下のものを含む：
セリン（Ｓ）：７、９、１０、１２、１４、２６、５６、６０、６３、６７、７６、７７、１１４、１２１、１２７、１５６、１５９、１６８、１７１、２０２、２０３、
トレオニン（Ｔ）：５、２０、２２、３１、６９、７２、７４、１２９、１９７、２０６、
グリシン（Ｇ）：１６、４１、５７、６８、１２８、１４３、１５７、２００、２１２
アスパラギン酸（Ｄ）：１７、２８、７０、１２２、１５１、１６７、１７０
アルギニン（Ｒ）：１８、２４、６１、２１１、
グルタミン（Ｑ）：２７、７９、１４７、１６０、１９５、１９９
アスパラギン（Ｎ）：３０、１５２、１５８、２１０、
アラニン（Ａ）：３４、１５３、
リシン（Ｋ）：３９、４２、１２６、１４５、１４９、１６９、
グルタミン酸（Ｅ）：５５、８１、１２３、１６１、２１３。
【０１５２】
上で採用する番号は、ＰＤＢ結晶構造配列ファイル１ＦＶＥで示すような抗体１次配列番号付けである。これらの番号は、Ｋａｂａｔ番号付けにも対応する。この開示は、本発明の融合タンパク質に含まれるその他の抗体又は断片中の対応するアミノ酸（Ｋａｂａｔ番号付けを採用する）の置き換えにも拡張される。
【０１５３】
よって、一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化４】
からなる群から選択される。
【０１５４】
一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化５】
からなる群から選択される。
【０１５５】
その他の適切な残基は、ＷＯ２００６／０３４４８８及びＷＯ２００８／０３８０２４を含む文献に記載されている。したがって、一実施形態では、システインを、融合タンパク質軽鎖中に、例えば：
Ｖ１５をＣで置き換えて、
Ａ４３をＣで置き換えて、
Ｖ１１０をＣで置き換えて、
Ｓ１１４をＣで置き換えて、
Ｓ１２１をＣで置き換えて、
Ｓ１２７をＣで置き換えて、
Ａ１４４をＣで置き換えて、
Ａ１５３をＣで置き換えて、
Ｎ１５８をＣで置き換えて、
Ｓ１６８をＣで置き換えて、
Ｖ２０５をＣで置き換えて、
Ｓ１７１をＣで置き換えて、
Ｓ１５６をＣで置き換えて、
Ｓ２０２をＣで置き換えて、且つ／又は
Ｓ２０３をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１５６】
上記の番号付けは、図３に示す軽鎖配列を参照するが、本明細書の開示は、その他の軽鎖における対応するＫａｂａｔ位置にも拡張される。
【０１５７】
一実施形態では、システインを、融合タンパク質軽鎖中に、例えば：
Ｓ１７１をＣで置き換えて、
Ｓ１５６をＣで置き換えて、
Ｓ２０２をＣで置き換えて、且つ／又は
Ｓ２０３をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１５８】
一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化６】
からなる群から選択される。
【０１５９】
一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化７】
からなる群から選択される。
【０１６０】
一実施形態では、システインを、融合タンパク質軽鎖定常領域、ＣＬ中に、例えば：
Ｔ１０９をＣで置き換えて、
Ｅ１４３をＣで置き換えて、
Ｋ１４５をＣで置き換えて、
Ｋ１４９をＣで置き換えて、且つ／又は
Ｎ２１０をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１６１】
一実施形態では、システインを、融合タンパク質軽鎖可変領域中に、例えば：
配列番号４４のＳ７７をＣで置き換えて、且つ／又は
配列番号４４のＫ１０７をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１６２】
一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｓ７７、Ｋ１０７、Ｔ１０９、Ｅ１４３、Ｋ１４５、Ｋ１４９及びＮ２１０からなる群から選択される。
【０１６３】
本明細書において上で特定された全ての残基はＩｇＧ１に由来するが、本明細書における開示は、抗体のその他のクラス及びアイソタイプからのその他の軽鎖中の対応するＫａｂａｔ位置までも拡張される。
【０１６４】
したがって、一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化８】
からなる群から選択される。
【０１６５】
一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化９】
からなる群から選択される。
【０１６６】
したがって、一実施形態では、抗体融合タンパク質軽鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして７７位、１０７位、１０９位、１４３位、１４５位、１４９位及び２１０位からなる群から選択される。
【０１６７】
システインで置き換えることができる４Ｄ５の重鎖（図４に示す配列）中の適切なアミノ酸は、以下のものを含む：
セリン（Ｓ）：７、１７、２１、６３、７１、８６、１１９、１２０、１２２、１２７、１３４、１３５、１３７、１３９、１６０、１６３、１６８、１７９、１８０、１９３、１９４、１９５、２１０、２２２
トレオニン（Ｔ）：５８、６９、１２３、１３８、１６７、１９８、２００、
グリシン（Ｇ）：８、９、１０、１５、１６、２６、６６、１００、１０１、１０３、１４０、１４１、１６４、１６９、１８１、１９７、
アスパラギン酸（Ｄ）：６２、７３、１０２、２１５、
アルギニン（Ｒ）：５９、６７、８７、
グルタミン（Ｑ）：３、１３、１１２、１５５、１９９、２１９、
アスパラギン（Ｎ）：８４、２１１、
アラニン（Ａ）：８８、１２１、１６５
リシン（Ｋ）：４３、６５、１２４、１３６、２０８、２１３、２１７、
グルタミン酸（Ｅ）：８９。
【０１６８】
上で採用する番号は、ＰＤＢ結晶構造配列ファイル１ＦＶＥで示すような抗体１次配列番号付けである。この開示は、本発明の融合タンパク質に含まれるその他の抗体又は断片中の対応するアミノ酸（Ｋａｂａｔ番号付けを採用する）の置き換えにも拡張される。
【０１６９】
重鎖中の位置についての等価なＫａｂａｔ配列番号付けは、以下のとおりである：
セリン（Ｓ）：７、１７、２１、６２、７０、８２ｂ、１１２、１１３、１１５、１２０、１２７、１２８、１３０、１３４、１５６、１６３、１６８、１８０、１８２、１９５、１９６、１９７、２１５、２３２
トレオニン（Ｔ）：５７、６８、１１６、１３３、１６７、２００、２０５、
グリシン（Ｇ）：８、９、１０、１５、１６、２６、６５、９６、９７、９９、１３５、１３６、１６４、１６９、１８３、１９９、
アスパラギン酸（Ｄ）：６１、７２、９８、２２０、
アルギニン（Ｒ）：５８、６６、８６、
グルタミン（Ｑ）：３、１３、１０５、２０３
アスパラギン（Ｎ）：８２ａ、２１６、
アラニン（Ａ）：８４、１１４、１６５
リシン（Ｋ）：４３、６４、１１７、１２９、２１３、２１８、２２２、
グルタミン酸（Ｅ）：８５。
【０１７０】
したがって、一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化１０】
からなる群から選択される。
【０１７１】
一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化１１】
からなる群から選択される。
【０１７２】
その他の適切な残基は、ＷＯ２００６／０３４４８８及びＷＯ２００８／０３８０２４を含む文献に記載されている。したがって、一実施形態では、システインを、融合タンパク質重鎖中に、例えば：
Ａ４０をＣで置き換えて、
Ｌ８６をＣで置き換えて、
Ａ８８をＣで置き換えて、
Ｓ１１９をＣで置き換えて、
Ｓ１２０をＣで置き換えて、
Ａ１２１をＣで置き換えて、
Ｓ１２２をＣで置き換えて、
Ａ１７５をＣで置き換えて、
Ｖ１７６をＣで置き換えて、且つ／又は
Ｓ１７９をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１７３】
上記の番号付けは、図４に示す重鎖配列を参照するが、本明細書の開示は、その他の重鎖における対応するＫａｂａｔ位置にも拡張される。
【０１７４】
Ｋａｂａｔ番号付けによる等価な位置は、次のとおりである：
Ａ４０をＣで置き換え、
Ｌ８２ｃをＣで置き換え、
Ａ８４をＣで置き換え、
Ｓ１１２をＣで置き換え、
Ｓ１１３をＣで置き換え、
Ａ１１４をＣで置き換え、
Ｓ１１５をＣで置き換え、
Ａ１７６をＣで置き換え、
Ｖ１７７をＣで置き換え、且つ／又は
Ｓ１８０をＣで置き換える。
【０１７５】
したがって、一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化１２】
からなる群から選択される。
【０１７６】
一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、
【化１３】
からなる群から選択される。
【０１７７】
一実施形態では、システインを、融合タンパク質重鎖定常領域ＣＨ１中に、例えば：
Ｔ１１６をＣで置き換えて、
Ｓ１６３をＣで置き換えて、
Ｓ１８２をＣで置き換えて、且つ／又は
Ｎ２１６をＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１７８】
一実施形態では、システインを、融合タンパク質重鎖可変ドメイン、ＶＨ中に、例えば：
配列番号２２７のＳ８２ｂをＣで置き換えて
工学的に作製する。
【０１７９】
一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｓ８２ｂ、Ｔ１１６、Ｓ１６３、Ｓ１８２及びＮ２１６からなる群から選択される。
【０１８０】
本明細書において上で特定された全ての残基はＩｇＧ１に由来するが、本明細書における開示は、抗体のその他のクラス及びアイソタイプからのその他の重鎖中の対応するＫａｂａｔ位置にも拡張される。
【０１８１】
したがって、一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化１４】
の位置からなる群から選択される。
【０１８２】
一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化１５】
の位置からなる群から選択される。
【０１８３】
一実施形態では、抗体融合タンパク質重鎖は、工学的に作製されたシステインを含み、前記工学的に作製されたシステインの位置は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして８２ｂ、１１６、１６３、１８２及び２１６の位置からなる群から選択される。
【０１８４】
一実施形態では、本発明の組換え融合タンパク質は、重鎖中の１６３位及び／又は１８２位にて工学的に作製されたシステインを通じてＰＥＧ化される。
【０１８５】
一実施形態では、融合タンパク質は、ＰＥＧ分子が付着されているか又はＰＥＧ分子を付着できる遊離システインを含む。一実施形態では、融合タンパク質又はその一部は：
【化１６】
から選択される１又は複数の配列を含む。
【０１８６】
一実施形態では、遊離システインを含み、以下：
【化１７】
の１又は複数から選択される配列を場合によって含むシステインが工学的に作製された融合タンパク質を提供する。
【０１８７】
一実施形態では、配列：
【化１８】
を含む軽鎖が提供される。
【０１８８】
凡例
下線 表面露出側鎖
二重下線 システインに置き換えるのに適切な残基
太字 コンジュゲーション用に特に実際的に対象となる領域（ＣＤＲ及び外側／フレキシブルループから離れている）
斜体 実際上あり得ない対象の領域（ＣＤＲ残基に近いか又はその中）
淡い影付き 埋め込まれている／露出されていない領域
濃い影付き 「凝集傾向」を有するＣＨ１残基。
【０１８９】
一実施形態では、配列：
【化１９】
を含む重鎖が提供される。
【０１９０】
一実施形態では、ＰＥＧポリマーを、ＣＤＲから適切に離れ、肘領域に近い／隣接しているがその中にはコードされていない下部軽鎖可変ドメイン、例えばＶＬ１及び／又はＶＬ２中の位置、例えばＳｅｒ１２、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｎ７９又はＧｌｕ８１にコンジュゲートして、物体の結合がどのような様式でも少なくならず又は有害に影響されないようにする。これらの軽鎖残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けを用いて同じである。
【０１９１】
一実施形態では、ＰＥＧポリマーを、ＣＤＲから適切に離れ、肘領域に近い／隣接しているがその中にはコードされていない下部重鎖可変ドメイン、例えばＶＨ１及び／又はＶＨ２中の位置、例えばＧｌｎ１３（Ｋａｂａｔ番号付けによりＧｌｎ１３）又はＧｌｕ８９（Ｋａｂａｔ番号付けによりＧｌｕ８５）にコンジュゲートして、物体の結合がどのような様式でも少なくならず又は有害に影響されないようにする。
【０１９２】
一実施形態では、重鎖は、配列番号２２５及び／又は２２７に示す配列を含む。
【０１９３】
一実施形態では、軽鎖は、配列番号２２８及び／又は４４に示す配列を含む。
【０１９４】
本明細書における全ての実施形態は、物体とのＰＥＧポリマーのコンジュゲーションが、本開示の融合タンパク質の結合／親和性を少なくせず又はそれに有害に影響しないようなものである。
【０１９５】
適切なポリマーは、ポリ（エチレングリコール）又は特にメトキシポリ（エチレングリコール）若しくはその誘導体、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａまでの範囲の分子量を有するもののようなポリアルキレンポリマーを含む。その他の適切なポリマー、例えばデンプン、複合グリコフォーム、例えばＮ−ＧｌｕｃＮａｃ及びその他のもの、例えば調査されたポリマーは、アミノ酸に基づくもの、例えばポリ−ＧＧＧＧＳ、ポリグルタミン酸及びポリアスパラギン酸（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙら、２００７；Ｊｕｌｔａｎｉら、１９９７；Ｚｕｎｉｎｏら、１９８２）；炭水化物に基づくもの、例えば酸化デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デンプン及びポリシアル酸（Ｆａｇｎａｎｉら、１９９０；Ｂａｕｄｙｓら、１９９８；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓら、２０００）；並びに完全合成ポリマー、例えばポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリオキシエチル化グリセロール、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリレート、蝶ネクタイ型デンドリマー及びＰＥＧ（Ｋａｎｅｄａら、２００４；Ｃａｌｉｃｅｔｉら、１９９９；Ｓｏｕｃｅｋら、２００２）を含む。
【０１９６】
ポリマーのサイズは、所望により変動してよいが、全般的に、５００Ｄａから８００００Ｄａまで、例えば５０００から５００００Ｄａまで、例えば２００００から４００００Ｄａまでの平均分子量の範囲内である。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図する使用、例えば腫瘍のようなあるいくつかの組織に局在化する能力又は循環半減期を拡張する能力に基づいて選択してよい（概説について、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５を参照されたい）。よって、例えば、生成物が循環を離れて組織に侵入することを意図する場合、例えば腫瘍の治療において用いるために、小さい分子量のポリマー、例えば５０００Ｄａ付近の分子量を有するものを用いることが有利であり得る。生成物が循環中に残ることを意図する用途について、より高い分子量のポリマー、例えば２００００Ｄａから４００００Ｄａまでの範囲の分子量を有するものを用いることが有利であり得る。
【０１９７】
ＰＥＧ分子は、抗体断片中にある任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を通じて付着してよい。このようなアミノ酸は、抗体断片中に自然に存在するか、又は組換えＤＮＡ法を用いて断片中に工学的に作製してよい（例えばＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１を参照されたい）。一例では、本発明の抗体分子は、改変が、その重鎖のＣ末端の端への、エフェクター分子の付着を可能にする１又は複数のアミノ酸の付加である、改変Ｆａｂ断片である。適切には、追加のアミノ酸は、１又は複数のシステイン残基を含有する改変ヒンジ領域を形成し、これに対してエフェクター分子が付着できる。２以上のＰＥＧ分子を付着させるために、複数の部位を用いることができる。
【０１９８】
一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、１つ又は２つのＰＥＧ分子でＰＥＧ化されている。
【０１９９】
一実施形態では、ＰＥＧ分子は、軽鎖中のシステイン１７１と連結されており、例えば本明細書に参照により組み込まれているＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい。
【０２００】
１つにおいて、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、溶媒露出又は表面露出システインを通じてＰＥＧ化されている。
【０２０１】
適切には、ＰＥＧ分子は、融合タンパク質中の少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通じて共有的に連結されている。融合タンパク質に付着している各ポリマー分子は、タンパク質中にあるシステイン残基の硫黄原子に共有的に連結され得る。共有結合は、一般的に、ジスルフィド結合、又は特に硫黄−炭素結合である。付着点としてチオール基を用いる場合、適切に活性化されたＰＥＧ分子、例えばマレイミドのようなチオール選択的誘導体及びシステイン誘導体を用い得る。活性化されたＰＥＧ分子は、上記のようなポリマー−融合タンパク質含有分子の調製において出発物質として用いてよい。活性化されたＰＥＧ分子は、α−ハロカルボン酸若しくはエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドのようなチオール反応性基を含有する任意のポリマーであってよい。このような出発物質は、商業的に得ることができる（例えばＮｅｋｔａｒ、ＵＳＡ；Ｎｉｐｐｏｎ Ｏｉｌｓ ａｎｄ Ｆａｔｓ（ＮＯＦ）、Ｊａｐａｎ；Ｄｒ Ｒｅｄｄｙ、ＵＫ；ＪｅｎＫｅｍ、Ｃｈｉｎａ；Ｐａｎ Ａｓｉａ Ｂｉｏ、Ｃｈｉｎａ；ＳｕｎＢｉｏ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ；Ｂｉｏｖｅｃｔｒａ、ＵＳＡから）か、又は商業的に入手可能な出発物質から従来の化学的手順を用いて調製できる。具体的なＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン及び２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えばＮｉｐｐｏｎ Ｏｉｌｓ ａｎｄ Ｆａｔｓ（ＮＯＦ）、Ｊａｐａｎ；Ｄｒ Ｒｅｄｄｙ、ＵＫ；ＪｅｎＫｅｍ、Ｃｈｉｎａ；Ｐａｎ Ａｓｉａ Ｂｉｏ、Ｃｈｉｎａ；ＳｕｎＢｉｏ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙから）を含む。
【０２０２】
ＰＥＧ分子のようなエフェクター分子は、融合タンパク質に、アルデヒド糖を通じて、又はより一般的には抗体断片中にある任意の利用可能なアミノ酸側鎖若しくは末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を通じることを含むいくつかの異なる方法により付着できる。エフェクター分子の付着の部位は、ランダム又は部位特異的のいずれでもあり得る。
【０２０３】
ランダム付着は、リシンのようなアミノ酸を通じて頻繁に達成され、このことにより、ＰＥＧ分子のようなエフェクター分子が、リシンの位置に依存して抗体断片全体を通していくつかの部位で付着されることになる。このことはいくつかの場合において成功しているが、付着されるＰＥＧ分子のようなエフェクター分子の厳密な場所及び数は制御できず、このことは、例えば付着されるものが少なすぎるならば活性の喪失及び／又は例えばそれらが抗原結合部位に干渉するならば親和性の喪失（Ｃｈａｐｍａｎ ２００２ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５）を導き得る。結果として、ＰＥＧ分子のようなエフェクター分子の制御された部位特異的付着が、通常、選択される方法である。
【０２０４】
ＰＥＧ分子のようなエフェクター分子の部位特異的付着は、システイン残基への付着により最も一般的に達成される。なぜなら、このような残基は、抗体断片中で比較的非凡であるからである。抗体ヒンジは、部位特異的付着のために好ましい領域である。なぜなら、これらは、システイン残基を含有し、抗原結合に関与しやすい融合タンパク質の他の領域から離れているからである。適切なヒンジは、断片中に自然に存在するか、又は組換えＤＮＡ技術を用いて創出できるかのいずれかである（例えばＵＳ５，６７７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１；Ｌｅｏｎｇら、２００１ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１６、１０６〜１１９；Ｃｈａｐｍａｎら、１９９９ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７、７８０〜７８３を参照されたい）。代わりに又はさらに、部位特異的システインを抗体断片中に工学的に作製して、例えばエフェクター分子付着のための表面曝露システイン（単数又は複数）を創出してもよい（ＵＳ５，２１９，９９６）。
【０２０５】
一実施形態では、本発明による融合タンパク質は、ヒンジを、ヒンジにほぼ対応する長さの、ＣＬとＶＬ２スペーサとの間のリンカーとして含む。
【０２０６】
自然の及び工学的に作製されたシステインをＰＥＧ分子のようなエフェクター分子の部位特異的付着のために用いる技術は、記載されている（ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０及びＷＯ２００５００３１７１を参照されたい）。これらの断片の全てにおいて、重鎖定常領域と軽鎖定常領域（ＣＨ１とＣＬ）との間の自然の鎖間ジスルフィド結合は、鎖間システインがエフェクター分子の付着の部位として用いられているからか、又は鎖間システインが、エフェクター分子がこれらのシステインに付着することを回避するために別のアミノ酸に置き換えられているからかのいずれかにより、存在しない。これらの断片は、エフェクター分子の付着の部位として用いるための工学的に作製されたシステインも含み得る。一例では、これらの工学的に作製されたシステインは、抗体断片出発物質の重鎖定常領域と軽鎖定常領域との間のジスルフィド連結を形成する工学的に作製されたシステインの対である。上記のジスルフィド結合は、しかし、エフェクター分子がこれらのシステインに一旦付着すると、喪失される。
【０２０７】
一実施形態では、抗体断片の重鎖及び軽鎖が天然鎖間ジスルフィド結合でない工学的に作製された鎖間ジスルフィド結合により連結された融合タンパク質ＰＥＧ分子コンジュゲートが提供される。この工学的に作製された鎖間ジスルフィド結合は、強い還元剤を用いる場合であっても、エフェクター分子の付着中は保持される。軽鎖：重鎖界面では、システインの対がうまく工学的に作製されて、還元剤及びエフェクター分子がほぼ近づくことができないように十分に埋め込まれたジスルフィド結合が導入される部位も提供される。「埋め込まれたジスルフィド」の例は、ＷＯ２００７０１０２３１に示される。
【０２０８】
これらの断片の具体的な利点は、工学的に作製された鎖間システイン間のジスルフィド結合が、エフェクター分子の付着中にインタクトのままであることにある。
【０２０９】
よって、本発明による一実施形態では、１又は複数のエフェクター分子が付着した融合タンパク質であって、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）定常領域間の自然の鎖間ジスルフィド結合が存在せず、重鎖（ＣＨ１）及び軽鎖（ＣＬ）定常領域が、一方が軽鎖（ＣＬ）定常領域中で他方が重鎖定常（ＣＨ１）領域中の工学的に作製されたシステインの対の間の鎖間ジスルフィド結合により連結されていることを特徴とする融合タンパク質が提供される。
【０２１０】
一実施形態では、ＰＥＧは、表面露出システインにコンジュゲートされる。
【０２１１】
用語「自然の鎖間ジスルフィド結合」は、本明細書で用いる場合、自然に存在する生殖系列抗体遺伝子においてコードされる重鎖及び軽鎖定常領域中のシステイン間に存在する鎖間ジスルフィド結合のことをいう。特に、自然の鎖間システインは、自然に存在する抗体中で互いにジスルフィド連結されている軽鎖の定常領域（ＣＬ）中のシステインと重鎖の第１定常領域（ＣＨ１）中のシステインである。このようなシステインの例は、Ｋａｂａｔら、１９８７、免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡにより定義されるように、ヒトＩｇＧ１の軽鎖の２１４位及び重鎖の２３３位、ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の重鎖の１２７位、並びにヒトＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂの重鎖の１２８位で典型的に見出すことができる。これらのシステインの厳密な位置は、欠失、挿入及び／又は置換のような任意の改変が抗体断片に対して作製されているならば、自然に存在する抗体のものから変動し得ることが認識される。
【０２１２】
よって、１又は複数の実施形態では、自然の鎖間ジスルフィド結合は、存在しない。自然の鎖間ジスルフィド結合は、存在しないことがある。なぜなら、１又は複数のエフェクター分子がそれに付着されるからである。
【０２１３】
別の実施形態では、自然の鎖間ジスルフィド結合は、本発明の抗体断片中に存在しない。なぜなら、鎖間システインは、セリンのような別のアミノ酸で置き換えられているからである。
【０２１４】
本発明の抗体断片では、重鎖及び軽鎖定常領域は、軽鎖及び／又は重鎖中の工学的に作製されたシステイン間の鎖間ジスルフィド結合により連結される。
【０２１５】
本発明の融合タンパク質は、高い結合親和性、特にピコモル濃度を適切に有する。親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅを含む当該技術において既知の任意の適切な方法を用いて測定できる。一実施形態では、本発明の抗体分子は、約１００ｐＭ又はそれより良い結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、約５０ｐＭ又はそれより良い結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、約４０ｐＭ又はそれより良い結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、約３０ｐＭ又はそれより良い結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、完全にヒト又はヒト化されており、約１００ｐＭ又はそれより良い結合親和性を有する。
【０２１６】
所望により、本発明の融合タンパク質は、１又は複数のさらなるエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートされてよい。エフェクター分子が、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体に付着できる単一部分を形成するように連結された２以上のそのような分子を含んでよいことが認識される。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが所望される場合、これは、抗体断片がエフェクター分子に直接若しくはカップリング剤を介して連結される、標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順により調製できる。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当該技術において公知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、制御された薬物送達（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７、６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９〜５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３、６７〜１２３を参照されたい）。具体的な化学的手順は、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１に記載されるものを含む。代わりに、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されるような組換えＤＮＡ手順を用いて達成してよい。
【０２１７】
用語エフェクター分子は、本明細書で用いる場合、例えば、抗悪性腫瘍薬剤、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体若しくは抗体断片、合成の若しくは自然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの断片、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレートされた金属、ナノ粒子並びにＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法により検出できる単数又は複数の蛍光化合物のようなレポーター基を含む。
【０２１８】
エフェクター分子の例は、細胞毒又は細胞にとって不利益な（例えば死滅させる）任意の薬剤を含む細胞傷害性薬剤を含んでよい。例は、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそれらの類似体及び同族体を含む。
【０２１９】
エフェクター分子は、それらに限定されないが、代謝拮抗剤（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリチアマイシン又はデュオカルマイシン）、並びに有糸分裂阻害薬剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）を含む。
【０２２０】
その他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８のようなキレート化された放射性核種；又はそれらに限定されないがアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンのような薬物を含み得る。
【０２２１】
その他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチド及び酵素を含む、対象の酵素は、それらに限定されないが、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼを含む。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドは、それらに限定されないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素若しくはジフテリア毒素のような毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子若しくは組織プラスミノゲンアクチベータのようなタンパク質、血栓性薬剤若しくは抗血管新生薬剤、例えばアンジオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくはその他の成長因子及び免疫グロブリンのような生物学的応答調節剤を含む。
【０２２２】
その他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能物質を含んでよい。検出可能物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影法で用いるため）及び非放射活性常磁性金属イオンを含む。診断薬として用いるために抗体にコンジュゲートできる金属イオンについて、全般的に、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリントランスフェラーゼを含み、適切な補欠分子族は、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンを含み、適切な蛍光物質は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリスリンを含み、適切な発光物質は、ルミノールを含み、適切な生物発光物質は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含み、適切な放射活性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃを含む。
【０２２３】
別の例では、エフェクター分子は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加し、且つ／又は抗体の免疫原性を低減し、且つ／又は免疫系までの上皮性関門を横切る抗体の送達を増進させることができる。このタイプの適切なエフェクター分子の例は、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質又はＷＯ０５／１１７９８４に記載されるもののようなアルブミン結合性化合物を含む。
【０２２４】
エフェクター分子がポリマーである場合、これは、全般的に、合成の又は自然に存在するポリマー、例えば場合によって置換されてよい直鎖状若しくは分岐鎖状のポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー、或いは分岐鎖状若しくは非分岐鎖状の多糖、例えばホモ又はヘテロ多糖であってよい。
【０２２５】
上記の合成ポリマー上に存在し得る具体的な場合によって存在する置換基は、１又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基を含む。
【０２２６】
合成ポリマーの具体例は、場合によって置換されてよい直鎖状若しくは分岐鎖状のポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はそれらの誘導体、特にメトキシポリ（エチレングリコール）のような場合によって置換されてよいポリ（エチレングリコール）又はそれらの誘導体を含む。
【０２２７】
具体的な自然に存在するポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体を含む。
【０２２８】
「誘導体」は、本明細書で用いる場合、反応性誘導体、例えばマレイミドのようなチオール選択的反応性基などを含むことを意図する。反応性基は、直接、又はリンカーセグメントを通じてポリマーと連結してよい。このような基の残基が、融合タンパク質とポリマーとの間の連結基として生成物の一部分を形成するいくつかの場合があることが認識される。
【０２２９】
本発明は、本明細書で記載する抗体、又はそれらの重鎖若しくは軽鎖のそれらの断片をコードする単離ＤＮＡも提供する。
【０２３０】
さらなる態様では、前記ＤＮＡを含むベクターが提供される。
【０２３１】
ベクターを構築し得る全般的な方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者に公知である。この点に関して、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより出版されるＭａｎｉａｔｉｓマニュアル（Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ）が参照される。
【０２３２】
さらなる態様では、上記のベクター及び／又はＤＮＡを含む宿主細胞が提供される。
【０２３３】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の融合タンパク質分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために用いてよい。細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びその他の微生物の系を用いてよいか、又は真核、例えば哺乳類の宿主細胞発現系も用いてよい。適切な哺乳類宿主細胞は、ＣＨＯ、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞を含む。
【０２３４】
本発明は、本発明による融合タンパク質分子を生成するためのプロセスであって、本発明のベクター（及び／又はＤＮＡ）を含有する宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからのタンパク質の発現を導くために適切な条件下で培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む方法も提供する。
【０２３５】
重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物の生成のために、細胞系に、２つのベクター、すなわち軽鎖ポリペプチドをコードする第１ベクターと、重鎖ポリペプチドをコードする第２ベクターとを用いてトランスフェクトしてよい。代わりに、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターを用いてよい。
【０２３６】
本開示による融合タンパク質分子は、宿主細胞から良好なレベルで発現される。よって、融合タンパク質分子の特性は最適化され、商業的に処理することができる。
【０２３７】
本発明の融合タンパク質分子は、病的状態の治療及び／又は予防において有用である。
【０２３８】
よって、その治療有効量を投与することによる、治療で使用するための融合タンパク質分子が提供される。一実施形態では、融合タンパク質分子は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤として投与される。
【０２３９】
よって、本発明は、本発明の融合タンパク質分子を、１若しくは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて含む医薬組成物或いは診断用組成物も提供する。したがって、医薬品の製造のための本発明の融合タンパク質分子の使用が提供される。組成物は、薬学的に許容される担体を通常含む滅菌医薬組成物の一部として通常供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントを追加で含み得る。
【０２４０】
本発明は、本発明の融合タンパク質分子を、１若しくは複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に加えて混合することを含む、医薬組成物又は診断用組成物を調製するプロセスも提供する。
【０２４１】
融合タンパク質分子は、医薬組成物若しくは診断用組成物における単独の活性成分であってよいか、或いはその他の抗体成分、例えば抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ若しくは抗ＬＰＳ抗体又はキサンチンのような非抗体成分を含むその他の活性成分を伴ってよい。その他の適切な活性成分は、寛容を誘導できる抗体、例えば抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４抗体を含む。
【０２４２】
さらなる実施形態では、本開示による融合タンパク質分子又は組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤、例えばコルチコステロイド（例えばフルチカゾンプロピオン酸エステル）及び／或いはベータ−２−アゴニスト（例えばサルブタモール、サルメテロール若しくはホルモテロール）又は細胞成長及び増殖の阻害剤（例えばラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキセート）又は代わりにＣＤ２８及び／若しくはＣＤ４０阻害剤と組み合わせて採用される。一実施形態では、阻害剤は、小分子である。別の実施形態では、阻害剤は、標的に特異的な抗体である。
【０２４３】
医薬組成物は、治療有効量の本発明の抗体を適切に含む。用語「治療有効量」は、本明細書で用いる場合、標的の疾患若しくは状態を治療、緩和又は予防するため、或いは検出可能な治療又は予防的効果を示すために必要な治療薬剤の量のことをいう。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類における動物モデルのいずれかにおいて初期に見積もることができる。動物モデルは、適当な投与濃度範囲及び投与経路を決定するために用いることもできる。このような情報は、次いで、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定するために用いることができる。
【０２４４】
ヒト対象についての精密な治療有効量は、疾患の状態の重症度、対象の全身健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食餌、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ（単数又は複数）、反応感受性並びに治療に対する耐性／応答に依存する。この量は、日常的な実験により決定でき、臨床医の判断の範囲内である。全般的に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。医薬組成物は、用量あたりの予め決定された量の本発明の活性薬剤を含有する単位剤形で簡便にもたらすことができる。
【０２４５】
組成物は、患者に個別に投与してよいか、又はその他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組み合わせて（例えば同時、逐次的又は別々に）投与してよい。
【０２４６】
本発明の融合タンパク質分子を投与する用量は、治療される状態の性質、存在する炎症の程度及び抗体分子が予防的に又は現存する状態を治療するためのいずれに用いられるかに依存する。
【０２４７】
投与の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続期間に依存する。抗体分子が短い半減期（例えば２〜１０時間）を有するならば、１日あたり１又は複数の用量を与えることが必要なことがある。代わりに、抗体分子が長い半減期（例えば２〜１５日）を有するならば、１日あたり１回、１週間あたり１回又は１若しくは２カ月毎に１回さえの投与量を与えることだけが必要なことがある。
【０２４８】
薬学的に許容される担体は、それ自体が、組成物を受容する個体にとって有害な抗体の生成を誘導しないものであるべきであり、且つ毒性でないべきである。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子のような大きく緩慢に代謝される巨大分子であってよい。
【０２４９】
薬学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩のような鉱酸塩又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩のような有機酸の塩を用いることができる。
【０２５０】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、食塩水、グリセロール及びエタノールのような液体を追加で含有してよい。さらに、湿潤剤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝物質のような補助物質が、このような組成物に存在してよい。このような担体により、医薬組成物が、患者による摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー及び懸濁剤に処方されることが可能になる。
【０２５１】
投与のための適切な形は、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は持続注入による非経口投与のために適切な形を含む。生成物が注射又は注入用である場合、これは、油性若しくは水性媒体中の懸濁物、溶液又はエマルジョンの形をとることができ、懸濁剤、防腐剤、安定化剤及び／又は分散剤のような処方用剤を含有できる。代わりに、抗体分子は、適当な滅菌液体での使用前の再構成のための乾燥形であってよい。
【０２５２】
一旦処方されると、本発明の組成物は、対象に直接投与できる。治療される対照は、動物であり得る。しかし、１又は複数の実施形態では、組成物は、ヒト対象への投与のために適合される。
【０２５３】
適切には、本開示による製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値に類似せず、例えば製剤のｐＨが７であるならば、８〜９又はそれより高いｐＩが適当であり得る。理論に拘束されることを望まないが、このことが、安定性が改善された最終製剤を最終的に提供し得る、例えば抗体又は断片が溶解されたままになると考えられる。
【０２５４】
本発明の医薬組成物は、それらに限定されないが、経口、静脈内、筋内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経真皮、経皮（例えばＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む任意の数の経路により投与してよい。ハイポスプレーを用いて、本発明の医薬組成物を投与してもよい。典型的に、治療用組成物は、液体の溶液又は懸濁物のいずれかとして注射剤として調製してよい。注射前に液体媒体に溶解又は懸濁するために適切な固体の形も調製してよい。
【０２５５】
組成物の直接送達は、全般的に、注射により、皮下、腹腔内、静脈内若しくは筋内で達成されるか、又は組織の間質空間内に送達される。組成物は、病変に投与することもできる。投与量処理は、単回用量計画又は複数回用量計画であってよい。
【０２５６】
組成物中の活性成分は、融合タンパク質分子であることが認識される。それ自体で、これは、消化管内の分解に対して感受性である。よって、消化管を用いる経路により組成物を投与するならば、組成物は、抗体を分解から保護するが、抗体が消化管から一旦吸収されると抗体を放出する因子を含有する必要がある。
【０２５７】
薬学的に許容される担体についての詳細な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの製薬科学（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。
【０２５８】
一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
【０２５９】
適切な吸入用調製物は、吸入用粉剤、噴射用ガス又は噴射用ガスを含まない吸入用溶液を含有する定量エアロソルを含む。活性物質を含有する本開示による吸入用粉剤は、上記の活性物質のみからなるか、又は上記の活性物質と生理的に許容される賦形剤との混合物からなることができる。
【０２６０】
これらの吸入用粉剤は、単糖（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えばデキストラン）、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いの混合物を含み得る。単糖及び二糖が適切に用いられ、それのみではないが特にそれらの水和物の形のラクトース又はグルコースの使用。
【０２６１】
肺における沈着のための粒子には、１０ミクロン未満、例えば１〜９ミクロン、例えば０．１から５μｍまで、特に１から５μｍまでの粒子サイズが要求される。活性成分（例えば抗体又は断片）の粒子サイズは、第一に重要である。
【０２６２】
吸入用エアロソルを調製するために用いることができる噴射用ガスは、当該技術において知られている。適切な噴射用ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンのような炭化水素、並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン若しくはシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体のようなハロ炭化水素から選択される。上記の噴射用ガスは、そのまま又はそれらの混合物として用いてよい。
【０２６３】
特に適切な噴射用ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにそれらの混合物が特に適切である。
【０２６４】
噴射用ガス含有吸入用エアロソルは、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、滑沢剤及びｐＨを調製するための手段のようなその他の成分も含有してよい。これらの全ての成分は、当該技術において知られている。
【０２６５】
本発明による噴射用ガス含有吸入用エアロソルは、５重量％までの活性物質を含有してよい。本発明によるエアロソルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【０２６６】
代わりに、肺への局所投与も、例えばネブライザー、例えば圧縮機に接続されたネブライザー（例えばＰａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．により製造されるＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮機に接続されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）ネブライザー）のようなデバイスを採用する液体の溶液又は懸濁物製剤の投与によることができる。
【０２６７】
本発明の融合タンパク質分子は、溶剤に分散して、例えば溶液又は懸濁物の形で送達できる。これは、適当な生理的溶液、例えば食塩水又はその他の薬理学的に許容される溶剤又は緩衝溶液に懸濁できる。当該技術において既知の緩衝溶液は、０．０５ｍｇから０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇから９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇから０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇから０．３０ｍｇの無水クエン酸塩、及び０．４５ｍｇから０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを水１ｍｌあたりに含有して、約４．０から５．０のｐＨを達成することができる。懸濁物は、例えば凍結乾燥抗体を採用できる。
【０２６８】
治療用の懸濁物又は溶液の製剤は、１又は複数の賦形剤も含有できる。賦形剤は、当該技術において公知であり、緩衝液（例えばクエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液及び重炭酸塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む。溶液又は懸濁物は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェアにカプセル化できる。製剤は、全般的に、滅菌製造プロセスを採用する実質的な滅菌形で提供される。
【０２６９】
これは、製剤に用いるための緩衝された溶剤／溶液のろ過、滅菌緩衝溶剤溶液中への抗体の無菌懸濁、及び当業者が熟知している方法による滅菌貯蔵容器への製剤の分配による製造及び滅菌処理を含み得る。
【０２７０】
本開示による噴霧化用製剤は、例えばホイルエンベロープに包装された単回用量単位（例えば密閉プラスチック容器又はバイアル）として提供してよい。各バイアルは、例えば２ｍｌの容量の溶剤／溶液の緩衝液中に単位用量を含有する。
【０２７１】
本開示の融合タンパク質分子は、噴霧化による送達のために適切であると考えられる。
【０２７２】
本明細書の文脈における含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味することを意図する。
【０２７３】
技術的に適当である場合、本発明の実施形態は組み合わせることができる。
【０２７４】
実施形態は、あるいくつかの特徴／要素を含むと本明細書において記載される。本開示は、前記特徴／要素からなる又は実質的にそれらからなる別々の実施形態にも拡張される。
【０２７５】
本発明は、以下の実施例により例示によってのみさらに記載され、これらは、添付の図面に言及する。添付の図面において、以下のとおりである。
図１は、本開示による様々な融合タンパク質フォーマットを示す。
図２Ａは、様々な既知の抗体断片フォーマットを示す。
図２Ｂは、本願で請求する発明による二量体フォーマットについてのある可能性のある配置を示す。
図３は、抗体４Ｄ５についての軽鎖アミノ酸配列を示す。
図４は、抗体４Ｄ５についての重鎖アミノ酸配列を示す。
図５は、太字で示す表面Ｃｙｓ変異の位置とともにＡ２６Ｆａｂ−（３ｘＧ４Ｓ）−ｄｓＦｖ６４５を示す。
図６は、Ａ２６Ｆａｂ−（３ｘＧ４Ｓ）−ｄｓＦｖ６４５、Ｓ１８２及びＳ１６３のＰＥＧ化変異体の非還元ゲルを示す。
【実施例】
【０２７６】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖ
Ｆａｂ−ｄｓＦｖフォーマットでの抗体融合体を、ＷＯ２０１０／０３５０１２に記載されるようにして作製した。Ｆａｂ−ｄｓＦｖは、ＷＯ２０１０／０９６４１８に記載され、図５に示すＡ２６として知られるＯＸ−４０抗体からの可変領域（配列番号２２５及び２２８）と、ＷＯ２０１０／０３５０１２及び図５に記載される６４５として知られる抗ヒト血清アルブミン抗体の可変領域配列、配列番号２２７及び４４とを含んだ。フォーマットは、Ａ２６Ｆａｂ−ｄｓ６４５Ｆｖであった。
【０２７７】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖ Ａ２６−６４５中の特定の残基は、システイン残基の導入のためにＰＥＧ化のための点として選択した。選択された変異は、重鎖及び軽鎖の両方の中であり、Ｆａｂ及びＦｖの両方の中であった。効果をタンパク質生成、折り畳み、親和性及び安定性の対するものに限定するために、ＣＤＲ及びいずれのその他の構造的に重要なモチーフから離れた残基を選択するように注意した。
【０２７８】
選択した残基を、図５及び表４に示す。特定の残基に番号をつけ、図５において太字で強調する。
【表４】
【０２７９】
変異５及び１３は、鎖間ジスルフィド結合に寄与する２つのシステイン残基のうち１つがセリンに変異され、他方がＰＥＧ化部位のために残されている対照として作製した。
【０２８０】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖの突然変異誘発
Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けした表４における各位置でのＦａｂ−ｄｓＦｖ Ａ２６−６４５の部位特異的突然変異誘発は、以下のようにして行った。Ｆａｂ−ｄｓＦｖ Ａ２６−６４５をコードするベクターを、標準的な「オーバーラップＰＣＲ法」を用いる部位特異的突然変異誘発に供した。簡単に述べると、２つの変異原性オリゴヌクレオチドを、２つのフランキングオリゴヌクレオチドとともに用いて、２回の別々のＰＣＲ反応において２つの変異ＰＣＲ生成物を作製した。各反応からの小容量（典型的に約１ｕｌ）のオーバーラップＰＣＲ粗生成物を、同じ２つのフランキングオリゴヌクレオチドを用いる３回目のアセンブリＰＣＲにおいて鋳型として用いた。このことにより、全長変異ＤＮＡ配列が作製され、これを発現プラスミドに制限／ライゲーションによりクローニングした後に、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２８１】
哺乳類細胞における発現のためのＦａｂ−ｄｓＦｖ融合プラスミドの構築
各Ｆａｂ−ｄｓＦｖ重鎖変異体を、哺乳類発現ベクターに、ＨＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター及びＳＶ４０ＥポリＡ配列の制御下でクローニングした。これらを、哺乳類細胞における発現のために（以下を参照されたい）、対応するＦａｂ−ｄｓＦｖ軽鎖を含有する類似のベクターと対形成させた。
【０２８２】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖの哺乳類発現
ＨＥＫ２９３細胞に、重鎖及び軽鎖のプラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を製造者の使用説明に従って用いてトランスフェクトした。簡単に述べると、２μｇの重鎖プラスミド＋２μｇの軽鎖プラスミドを、１０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ＋３４０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ培地とＲＴにて２０分間インキュベートした。混合物を、次いで、懸濁された５×１０６のＨＥＫ２９３細胞に加え、３７℃にて振とうしながら４日間インキュベートした。
【０２８３】
プロテインＧ精製
哺乳類発現懸濁物を遠心分離により清澄化し、上清を２ｍＬまで、１０ｋＤａ分子量カットオフ遠心分離濃縮器を用いて濃縮した。濃縮された上清を、１６０００×ｇにて１０分間遠心分離して、いずれの沈殿物も除去し、次いで１．８ｍＬを、１ｍｌのＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１ｍｌ／分にて装填した。カラムを２０ｍＭリン酸塩、４０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４で洗浄し、結合した物質を０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７で溶出した。溶出ピーク（２．５ｍＬ）を回収し、ｐＨを約ｐＨ７に、１００μＬの２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．５を用いて調整した。ｐＨを調整した溶出物をＰＢＳ中に、１０ｋＤａ分子量カットオフ遠心分離濃縮器を用いてダイアフィルトレーションし、約５００μＬに濃縮した。
【０２８４】
Ｔｈｒ１０９Ｃｙｓ及びＡｓｎ２１６Ｃｙｓ以外の全てのＦａｂ−ｄｓＦｖは、適度に良好に発現された。これらの両方の発現が乏しい変異体のＤＮＡ配列を確認した。配列に問題はなかったが、これらはともに収率が非常に低く、軽鎖についてのＴｈｒ１０９Ｃｙｓも重鎖についてのＡｓｎ２１１Ｃｙｓもさらに分析しなかった。
【０２８５】
Ｂｉａｃｏｒｅ
Ｆａｂ−ｄｓＦｖ構築物の相互作用についての結合親和性及び動態パラメータを、ＣＭ５センサチップ及びＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０）実行緩衝液を用いるＢｉａｃｏｒｅ３０００で行う表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。Ｆａｂ−ｄｓＦｖ試料を、センサチップ表面に、ヒトＦ（ａｂ’）２特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９７）又は内部で作製した抗ヒトＣＨ１モノクローナル抗体のいずれかを用いて捕捉した。捕捉抗体の共有的固定化を、標準的なアミンカップリング化学により達成した。
【０２８６】
各アッセイサイクルは、まず、１分間の注入を用いてＦａｂ−ｄｓＦｖを捕捉した後の、抗原の３分間の注入からなる会合段階からなり、その後、解離を２０分間監視した。各サイクルの後に、捕捉表面を、４０ｍＭ ＨＣｌを２×１分間、その後５ｍＭ ＮａＯＨを３０秒間注入することにより再生した。用いた流速は、捕捉について１０μｌ／分、会合及び解離段階について３０μｌ／分並びに再生について１０μｌ／分であった。
【０２８７】
動態アッセイのために、抗原の力価決定を行い、ブランクのフローセルを参照の減算のために用い、緩衝液ブランク注入を含めて、装置ノイズ及びドリフトを減算した。
【０２８８】
得られたセンサグラムを、標準的な１：１結合モデルにＢｉａｃｏｒｅ ３０００評価ソフトウェアを用いて同時グローバルフィッティングすることにより、動態パラメータを決定した。
【表５】
【０２８９】
Ｆａｂ−ｄｓＦｖ−Ｃｙｓの還元及びＰＥＧ化
ＣＨ１上のＳ１８２Ｃ又はＳ１６３ＣにてシステインＰＥＧ化部位が導入された、０．１Ｍリン酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６中のプロテインＧにより精製したＦａｂ−ｄｓＦｖを、０．１Ｍリン酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６中の１００ｍＭβ−メルカプトエチルアミン（βＭＥＡ）を１ｍＭの最終濃度まで加えることにより還元した。還元反応を周囲温度にて１時間インキュベートした後に、０．１Ｍリン酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６の定組成勾配中で運転するＳｅｐｈａｃｒｙｌ−２００ １０／３０カラム上でのＳＥ−ＨＰＬＣにより分画した。ほとんどの単量体Ｆａｂ−ｄｓＦｖを含有する５００μｌの画分を同定して２つに分けた。一方の半分には、０．１Ｍリン酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６中の５μｌの１５０ｍｇ／ｍｌ ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−２００ＭＡ ＰＥＧ（ＮＯＦ）を加えたが、これは、２０ｋＤａマレイミド活性ＰＥＧである。他方の半分には、０．１Ｍリン酸塩、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ６中の５μｌの１００ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を加えた。全ての試料を、周囲温度にて１晩インキュベートした。試料を、非還元４〜２０％アクリルアミドＴｒｉｓ／グリシンゲルで分析した。ゲルを、Ｏｗｌ銀染色キットを製造者の使用説明に従って用いて銀染色した。図６を参照されたい。
【０２９０】
図６
Ａ＝Ｓ１８２Ｃ ＣＨ１＋ＰＥＧ
Ｂ＝Ｓ１６３Ｃ ＣＨ１＋ＰＥＧ
Ｃ＝Ｓ１８２Ｃ ＣＨ１＋ＮＥＭ
【０２９１】
図６のレーンＣは、還元が、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ内の内部及び間のジスルフィド結合を破壊しないことを証明する。存在する唯一のバンドは、還元及びＮＥＭキャッピングを受けていない標準物質と比較した場合に、正しくジスルフィド結合されたＦａｂ−ｄｓＦｖと同じ位置で移動する（データは示さず）。レーンＡ及びＢでは、２つのバンドがあり、より低いものは、正しくジスルフィド結合されたＦａｂ−ｄｓＦｖに相当し、より高いものは、ＰＥＧ化された正しくジスルフィド結合されたＦａｂ−ｄｓＦｖである。ゲル上でのシフトは、１つの２０ｋ ＰＥＧの付加を示す。用いたマレイミド化学により、このデータは、ＣＨ１上のＳ１８２Ｃ及びＳ１６３Ｃの導入されたシステインＰＥＧ部位でのＦａｂ−ｄｓＦｖの部位特異的ＰＥＧ化を証明する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端から順に、ＶＨ１と呼称する可変ドメイン、ＣＨ１領域、及びＶＨ２と呼称するさらなる可変ドメインを含む重鎖と、
Ｎ末端から順に、ＶＬ１と呼称する可変ドメイン、ＣＬドメイン、及びＶＬ２と呼称する可変ドメインを含む軽鎖と
を含む組換え融合タンパク質であって、
前記重鎖及び軽鎖が、ＶＨ１及びＶＬ１の第１可変ドメイン対により形成される第１結合部位と、ＶＨ２及びＶＬ２の第２可変ドメイン対により形成される第２結合部位とを提供するように整列され、
結合部位を形成する可変ドメイン対の間にジスルフィド結合が存在し、
前記融合タンパク質が、ＰＥＧポリマーにコンジュゲートされている、
上記組換え融合タンパク質。
【請求項２】
ＶＨ１及びＶＬ１の第１可変ドメイン対の間並びに／又はＶＨ２及びＶＬ２の第２可変ドメイン対の間にジスルフィド結合が存在する、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３】
ＶＨ２及びＶＬ２の第２可変ドメイン対の間にジスルフィド結合が存在する、請求項１又は請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４】
ＶＨ２のアミノ酸が、ＣＨ１のアミノ酸に、ペプチド結合により直接連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５】
ＶＨ２が、ＣＨ１に、リンカーにより間接的に連結されている、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６】
ＶＬ２が、ＣＬのアミノ酸に、ペプチド結合により直接連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
ＶＬ２が、ＣＬに、リンカーにより間接的に連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
リンカーが、配列番号２２６に示す配列を有する、請求項５又は請求項７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
溶媒露出システインを通じてＰＥＧ化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０】
ＣＨ１及び／又はＣＬの鎖間システインを通じてＰＥＧ化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１】
軽鎖中に工学的に作製されたシステインを通じてＰＥＧ化され、前記工学的に作製されたシステインの位置が、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化１】
の位置からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２】
軽鎖中に工学的に作製されたシステインを通じてＰＥＧ化され、前記工学的に作製されたシステインの位置が、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして、７７位、１０７位、１０９位、１４３位、１４５位、１４９位及び２１０位からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３】
重鎖中に工学的に作製されたシステインを通じてＰＥＧ化され、前記工学的に作製されたシステインの位置が、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化２】
の位置からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４】
重鎖中に工学的に作製されたシステインを通じてＰＥＧ化され、前記工学的に作製されたシステインの位置が、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして、８２ｂ、１１６、１６３、１８２及び２１６の位置からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１５】
１つ又は２つのＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６】
ＰＥＧ分子が、５０００から８００００Ｄａの範囲にある、請求項１５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７】
重鎖中のＶＨ１が、重鎖からの可変ドメイン又は軽鎖からの可変ドメインである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８】
重鎖中のＶＨ２が、重鎖からの可変ドメイン又は軽鎖からの可変ドメインである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９】
軽鎖中のＶＬ１が、軽鎖又は重鎖からの可変ドメインである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０】
軽鎖中のＶＬ２が、軽鎖又は重鎖からの可変ドメインである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２１】
ＶＨ２が、重鎖からの可変ドメインであり、ＶＬ２が、軽鎖からの可変ドメインである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２２】
一方がＶＨ２中で他方がＶＬ２中の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により、第２可変ドメイン対が連結され、２つのシステイン残基の位置が、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ１００ｂとＶＬ４９、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０１とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２３】
ＶＨ２のシステインが４４位にあり、ＶＬ２のシステインが１００位にある、請求項２１又は請求項２３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２４】
２つの可変ドメイン対が、それぞれ同族の対である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２５】
２つの可変ドメイン対が、それぞれ、協同して抗原と結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２６】
ＣＨ１及びＣＬドメインが、ＩｇＧ１に由来する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２７】
二量体形成している、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２８】
溶媒露出システインを介して二量体形成している、請求項２７のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２９】
ジスルフィド結合を介して直接二量体形成している、請求項２７又は２８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３０】
化学的リンカーを介して二量体形成している、請求項２７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３１】
ＰＥＧリンカーを介して二量体形成している、請求項３０に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３２】
ペプチドリンカーを介して二量体形成している、請求項２７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３３】
二重特異性又は単一特異性である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１】
Ｎ末端から順に、ＶＨ１と呼称する可変ドメイン、ＣＨ１領域、及びＶＨ２と呼称するさらなる可変ドメインを含む重鎖と、
Ｎ末端から順に、ＶＬ１と呼称する可変ドメイン、ＣＬドメイン、及びＶＬ２と呼称する可変ドメインを含む軽鎖と
を含む組換え融合タンパク質であって、
前記重鎖及び軽鎖が、ＶＨ１及びＶＬ１の第１可変ドメイン対により形成される第１結合部位と、ＶＨ２及びＶＬ２の第２可変ドメイン対により形成される第２結合部位とを提供するように整列され、
結合部位を形成する可変ドメイン対の間にジスルフィド結合が存在し、
前記融合タンパク質が、ＰＥＧポリマーにコンジュゲートされている、
上記組換え融合タンパク質。
【請求項２】
ＶＨ１及びＶＬ１の第１可変ドメイン対の間並びに／又はＶＨ２及びＶＬ２の第２可変ドメイン対の間にジスルフィド結合が存在する、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３】
ＶＨ２及びＶＬ２の第２可変ドメイン対の間にジスルフィド結合が存在する、請求項１又は請求項２に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項４】
ＶＨ２のアミノ酸が、ＣＨ１のアミノ酸に、ペプチド結合により直接連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項５】
ＶＨ２が、ＣＨ１に、リンカーにより間接的に連結されている、請求項１に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項６】
ＶＬ２が、ＣＬのアミノ酸に、ペプチド結合により直接連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項７】
ＶＬ２が、ＣＬに、リンカーにより間接的に連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項８】
リンカーが、配列番号２２６に示す配列を有する、請求項５又は請求項７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項９】
溶媒露出システインを通じてＰＥＧ化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１０】
ＣＨ１及び／又はＣＬの鎖間システインを通じてＰＥＧ化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１１】
軽鎖中に工学的に作製されたシステインを通じてＰＥＧ化され、前記工学的に作製されたシステインの位置が、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化１】
の位置からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１２】
軽鎖中に工学的に作製されたシステインを通じてＰＥＧ化され、前記工学的に作製されたシステインの位置が、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして、７７位、１０７位、１０９位、１４３位、１４５位、１４９位及び２１０位からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１３】
重鎖中に工学的に作製されたシステインを通じてＰＥＧ化され、前記工学的に作製されたシステインの位置が、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして
【化２】
の位置からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１４】
重鎖中に工学的に作製されたシステインを通じてＰＥＧ化され、前記工学的に作製されたシステインの位置が、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けして、８２ｂ、１１６、１６３、１８２及び２１６の位置からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１５】
１つ又は２つのＰＥＧ分子によりＰＥＧ化されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１６】
ＰＥＧ分子が、５０００から８００００Ｄａの範囲にある、請求項１５に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１７】
重鎖中のＶＨ１が、重鎖からの可変ドメイン又は軽鎖からの可変ドメインである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１８】
重鎖中のＶＨ２が、重鎖からの可変ドメイン又は軽鎖からの可変ドメインである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項１９】
軽鎖中のＶＬ１が、軽鎖又は重鎖からの可変ドメインである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２０】
軽鎖中のＶＬ２が、軽鎖又は重鎖からの可変ドメインである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２１】
ＶＨ２が、重鎖からの可変ドメインであり、ＶＬ２が、軽鎖からの可変ドメインである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２２】
一方がＶＨ２中で他方がＶＬ２中の２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により、第２可変ドメイン対が連結され、２つのシステイン残基の位置が、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ１００ｂとＶＬ４９、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０１とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２３】
ＶＨ２のシステインが４４位にあり、ＶＬ２のシステインが１００位にある、請求項２１又は請求項２３に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２４】
２つの可変ドメイン対が、それぞれ同族の対である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２５】
２つの可変ドメイン対が、それぞれ、協同して抗原と結合する相補的ＶＨ／ＶＬ対である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２６】
ＣＨ１及びＣＬドメインが、ＩｇＧ１に由来する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２７】
二量体形成している、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２８】
溶媒露出システインを介して二量体形成している、請求項２７のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項２９】
ジスルフィド結合を介して直接二量体形成している、請求項２７又は２８に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３０】
化学的リンカーを介して二量体形成している、請求項２７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３１】
ＰＥＧリンカーを介して二量体形成している、請求項３０に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３２】
ペプチドリンカーを介して二量体形成している、請求項２７に記載の組換え融合タンパク質。
【請求項３３】
二重特異性又は単一特異性である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組換え融合タンパク質。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１３−５１０８９７（Ｐ２０１３−５１０８９７Ａ）
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３９４０６（Ｐ２０１２−５３９４０６）
【出願日】平成２２年１１月１７日（２０１０．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００２１２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６１４９２
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月１７日（２０１０．１１．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００２１２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６１４９２
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５０７０７３９１８）ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム (70)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]