大腸癌の診断又は検出のための組成物及び方法
【課題】大腸癌の診断に有用な組成物および大腸癌の検出方法を提供する。
【解決手段】被験者由来の生体試料中の配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片のいずれか１つまたは複数を測定することを含む、大腸癌を検出する方法、ならびに、大腸癌を診断または検出するための組成物。
【解決手段】被験者由来の生体試料中の配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片のいずれか１つまたは複数を測定することを含む、大腸癌を検出する方法、ならびに、大腸癌を診断または検出するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌の診断又は検出に有用な組成物に関する。
【０００２】
本発明はまた、該組成物を使用した大腸癌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
大腸は、全長が約１．６メートルの管であり、盲腸からはじまり上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸、直腸で構成される。大腸は消化吸収された残りの腸内容物をため、そこから水分を吸収しながら大便にする、重要な消化器系器官である。また多量の腸内の細菌を排泄することによって防御する役割を持つ。
【０００４】
大腸癌は大きく分けて、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌があり、大部分が腺癌で大腸ポリープ（ｐｏｌｙｐ）より発生する。有茎のポリープはキノコの様な形状に増殖し、通常は良性腫瘍であるが、そのうちの一部が腺癌に進行する。また現在は、ポリープ由来でない平坦な病変や陥凹性病変から進行大腸癌になることがあることも明らかになっている。
【０００５】
日本人においてはＳ状結腸と直腸が大腸癌のできやすい部位である。食生活の欧米化に応じて増加する傾向にあり、日本における２００４年の器官別死亡数では、結腸と直腸を合わせた場合、肺、胃についで３位である。年齢別にみた大腸癌（結腸・直腸・肛門癌）の罹患率は、５０歳代付近から増加し始め、加齢につれて高くなる。大腸癌の罹患率、死亡率はともに男性のほうが女性の約２倍と高い傾向にあり、結腸癌より直腸癌において男女差が大きい傾向がある。大腸癌の危険因子としては遺伝学的要因も知られているが、一般的には喫煙、肥満、飲酒などを挙げることができる。
【０００６】
大腸癌の治療としては内視鏡治療、外科手術、化学療法、放射線療法などが、病期、腫瘍の大きさ・深達度、転移の度合などを勘案し施される。治療方針の決定にあたっては大腸癌研究会により作成された「大腸癌治療ガイドライン」が参考にされる。早期大腸癌である場合は内視鏡切除、あるいは外科手術によって完全に切除することが可能であり、再発率も非常に低い。進行大腸癌である場合は肺、肝臓、リンパ節や腹膜などに切除困難な転移がおこり、また切除した部位に局所再発がおこることもある。こうした時期では、手術に加え放射線療法や化学療法（抗癌剤治療）が行われる。
【０００７】
このように、大腸癌は比較的早期で発見された場合、予後は比較的良く、初期癌での治療ではほぼ１００％近くが完治する。しかし、大きな腫瘍や転移のある腫瘍の治療成績は劣り、早期発見の重要性が認識されている。
【０００８】
しかしながら、大腸癌を自覚症状によって早期発見することは難しい。ほとんどの早期大腸癌の段階では無症状であり、癌が進行してからでないとはっきりとした自覚症状が現れないことが多いからである。大腸癌の進行につれて血便、便が細くなる（便柱細少）、残便感、腹痛、下痢と便秘の繰り返しなど排便に関する症状や、貧血、嘔吐などの症状が現れる。最も多いのが血便であるが、痔等と混同される場合も多い。
【０００９】
大腸癌の検査法としては直腸指診、便潜血検査、超音波検査、ＣＴ検査、大腸内視鏡検査、注腸造影検査などがある。大規模な集団検診で行われる代表的な検査法は大便の免疫学的潜血反応である。この段階で精密検査を受ける人をスクリーニングできるが、偽陰性、偽陽性判定も多い。精密検査で大腸癌の確定診断を行う方法には大腸内視鏡検査、注腸造影検査、画像診断などの方法があるが、便を全て排出しなければならない、場合によっては苦痛を伴うなど、患者の肉体的、精神的負担が大きく、事前のスクリーニング段階での偽陰性、偽陽性判定を減らすことが求められている。
【００１０】
そこで、大腸癌をスクリーニング段階で検出するために、便潜血検査に加えて、特異的で感受性が高い血中腫瘍マーカー（ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ）を発見しそれを用いた検査を行うことが強く望まれている。血中マーカーのレベルを計測することにより、比較的安価でハイスループットな検査・診断が可能になると考えられる。これまでに、大腸癌のマーカーとしてＣＥＡ、ＣＡ１９−９などが臨床応用されている。しかしながら、大腸癌を特異的に、早期に発見できる腫瘍マーカーは現時点において存在せず、進行大腸癌であっても約半数が陽性を示すのみである。
【００１１】
また、近年のゲノム解析またはプロテオーム解析の進歩に伴い、様々な新規の腫瘍マーカー候補が発見されている。たとえばＩｎｏｒｇａｎｉｃ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（特許文献１）、ＲＳ１５Ａ（特許文献２）、ＣＢＰ２（特許文献３）、ＡＳＣ（特許文献４）などがある。また組織においてはＡｎｎｅｘｉｎ ＩＶなど１３種（非特許文献１）、Ｍｏｒｔａｌｉｎ（非特許文献２）、Ｃｙｔｏｃｈｏｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｎｚｙｍｅｓ（非特許文献３）、ＨＳＰ７０など５種（非特許文献４）、Ａｄｅｎｏｓｙｌ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎａｓｅなど２３種（非特許文献５）、などのマーカー候補が発見されている。
【００１２】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／１２４３５３
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／１２４３５５
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００５／１２４３５６
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００６／０６６９１７
【非特許文献１】Ａｌｆｏｎｓｏ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００５、第５巻、ｐ．２６０２−２６１１
【非特許文献２】Ｄｕｎｄａｓ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００５、第２０５巻、ｐ．７４−８１
【非特許文献３】Ｌａｎｅ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ、２００４、第４０巻、ｐ．２１２７−２１３４
【非特許文献４】Ｓｔｕｌｉｋ，Ｊ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９９、第２０巻、ｐ．３６３８−３６４６
【非特許文献５】Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００４、第４巻、ｐ．７９３−８１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上記の既存のマーカー、およびマーカー候補は特異性及び／又は感受性に乏しいことや、生体試料からのその効率的な検出方法が確立していないことから一般に臨床上の利用は行われておらず、より特異性及び感受性が高い大腸癌のマーカーが切望されている。
【００１４】
本発明は、大腸癌の診断に有用な組成物、および該組成物を用いた大腸癌の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
マーカー探索の方法としては、大腸癌細胞と非癌細胞における遺伝子発現やタンパク質発現、又は細胞の代謝産物などの量を何らかの手段によって比較する方法や、大腸癌患者と非癌患者の体液中に含まれる遺伝子、タンパク質、代謝産物などの量を測定する方法が挙げられる。
【００１６】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、今回、大腸癌患者と健常人の血漿について、大腸癌患者に特異的に検出されるタンパク質マーカーを見出した。
【００１７】
本発明は、以下の特徴を有する。
（１）被験者由来の生体試料中の配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片のいずれか１つまたは複数を測定することを含む、大腸癌をインビトロで検出する方法。
（２）前記断片が、配列番号１〜１６のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、（１）に記載の方法。
（３）前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の量またはその存在を測定する、（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の量が、対照試料のものと比べて有意に増大しているか、あるいは有意に減少していることを指標にする、（１）〜（３）に記載の方法。
（５）前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の測定が免疫学的方法によるものである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記測定が、前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と結合可能な物質を用いて行われる、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記結合可能な物質が抗体またはその断片である、（６）に記載の方法。
（８）前記抗体が標識されている、（７）に記載の方法。
（９）前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、前記試料中の該ポリペプチド、その変異体またはその断片のうちの１つまたは複数の量または存在を免疫学的に測定し、該ポリペプチド、その変異体またはその断片の量が対照試料のものと比べて増大あるいは減少していることを指標にするか、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片が前記試料または対照試料のいずれか一方にのみ存在していること、を指標にして大腸癌を検出することを含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記試料が血液、血漿、血清または尿である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記試料が大腸由来の組織または細胞である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１３）配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその断片またはそれらの化学修飾誘導体のうちの1つまたは複数を含む、大腸癌の診断または検出のための組成物。
（１４）前記ポリペプチドの断片が、配列番号１〜１６のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、（１３）記載の組成物。
（１５）前記ポリペプチドの断片が、少なくとも７個のアミノ酸からなるエピトープを含む、（１３）または（１４）に記載の組成物。
（１６）キットの形態である、（１３）〜（１５）のいずれかに記載の組成物。
（１７）（１３）〜（１６）のいずれかに記載の組成物の、被験者における大腸癌のインビトロ検出のための使用方法。
【００１８】
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
【００１９】
本明細書において「化学修飾誘導体」は、酵素、蛍光団、放射性同位元素などのラベルによるラベル化誘導体、あるいはアセチル化、グリコシル化、リン酸化、硫酸化などの化学修飾を含む誘導体を意味する。
【００２０】
本明細書において「診断又は検出のための組成物」とは、大腸癌の罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断または検出するために、あるいは大腸癌の予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接的又は間接的に使用しうるものをいう。
【００２１】
本明細書において検出・診断対象となる「生体試料」とは、大腸癌の発生にともない発現量が増加あるいは減少する標的ポリペプチドを含有する、またはその含有が疑われる、生体から採取された試料をいう。
【００２２】
本明細書において「特異的に結合する」とは、抗体またはその断片が、本発明における大腸癌マーカーである標的ポリペプチド、その変異体またはその断片とのみ抗原-抗体複合体を形成し、他のペプチド性またはポリペプチド性物質とは該複合体を実質的に形成しないことを意味する。ここで、「実質的」とは、程度は小さいが非特異的な複合体形成が起こり得ることを意味する。
【００２３】
本明細書において「エピトープ」とは、本発明の標的ポリペプチド、その変異体またはその断片において、抗原性または免疫原性を有する部分アミノ酸領域（抗原決定基）指す。エピトープは通常、少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも７アミノ酸または少なくとも８アミノ酸、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明における大腸癌マーカーは、大腸癌患者の血液などの生体試料中に見出されるが、健常人のそれにはほとんど、または全く見出されないか、あるいは逆に健常人の生体試料にのみ見出され、大腸癌患者のそれにはほとんど、または全く見出されないため、単に該マーカーの存在または量を指標にすることによって、例えば血液を用いて、容易に大腸癌を検出することができるという格別の作用効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に本発明をさらに具体的に説明する。
＜大腸癌マーカー＞
本発明の大腸癌の診断または検出のための組成物を使用して大腸癌をインビトロで検出するための大腸癌マーカーは、配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片である。
【００２６】
本発明の配列番号１〜１６のポリペプチドを、その遺伝子名（ＧｅｎＢａｎｋ登録名）およびタンパク質番号（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ登録番号）、ならびにそれらの特性とともに下記の表１に示す。これらのポリペプチドのうち、配列番号１〜３で表されるポリペプチドは、大腸癌患者血漿中に特異的に検出され、健常者の血漿には検出されないか、または大腸癌患者血漿に比べて検出される量が有意に減少していた。また、配列番号４〜１６で表されるポリペプチドは、健常者血漿中に特異的に検出され、大腸癌患者の血漿には検出されないか、または健常人血漿に比べて検出される量が有意に減少していた。なお、これらのポリペプチドおよび／または遺伝子（ｃＤＮＡ）のアミノ酸配列またはヌクレオチド（もしくは、塩基）配列は、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ等のデータバンクにアクセスすることによって入手可能である。
【００２７】
【表１】
【００２８】
また、本発明における上記ポリペプチドの断片は、該ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基からなり、１個または複数のエピトープを保持する。このような断片は、本発明に関わる抗体またはその断片と免疫特異的に結合することができるものである。上記ポリペプチドが、例えば血液中に存在する場合には、そこに存在するプロテアーゼやペプチダーゼなどの酵素によって切断され断片化されて存在することが想定される。
【００２９】
また、後述の実施例１に示すように、本発明において、配列番号１７〜１９で表されるポリペプチドは、健常者に比べて大腸癌患者の生体試料中に特に高いレベルで検出されていた。また、配列番号２０〜３８で表されるポリペプチドは、逆に大腸癌患者に比べて健常者の生体試料中に特に高いレベルで検出されていた。これらのポリペプチドは、配列番号１、３〜７、９〜１５で表されるポリペプチドの断片であり、従って、これらの配列番号１７〜３８で表されるポリペプチド、およびそれらを内部に持つ断片は大腸癌マーカーとしてより好ましく用いられる。下記表２に、配列番号１７〜３８のポリペプチドを、配列番号１、３〜７、９〜１５で表されるポリペプチドのどの部分に相当するかと共に記す。
【００３０】
また、配列番号２０〜２２のアミノ酸配列、および配列番号３０、３１のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５のアミノ酸配列、および配列番号９のアミノ酸配列のなかで、ほぼあるいは完全に連続的に出現している。したがって、配列番号２０〜２２のアミノ酸配列を連結した配列、すなわち配列番号５の第３２８番目のスレオニンから第３６３番目のアルギニンまでの配列、および、配列番号３０、３１で表されるアミノ酸配列を連結した配列、すなわち配列番号９の第５番目のアラニンから第３０番目のリジンまでの配列、のそれぞれで表されるポリペプチド、およびそれらを内部に持つ断片も大腸癌マーカーとしてより好ましく用いられる。
【００３１】
【表２】
【００３２】
本発明において大腸癌検出のための上記標的ポリペプチドはいずれも、大腸癌患者において、血液などの生体試料中の該ポリペプチドのレベルが、健常人と比べて大腸癌に罹患した被験者において有意にまたは格別に高い、あるいは低いことによって特徴付けられる。
【００３３】
本発明におけるポリペプチドは、例えば当業界で慣用の技術である、固相合成等の化学合成法、またはＤＮＡ組換え技術によって作製することができる。手順や精製の簡易さの点で、ＤＮＡ組換え技術の使用が好ましい。
【００３４】
はじめに本発明におけるポリペプチドの部分配列をコードするポリヌクレオチド配列を、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成する。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社などから市販されている。
【００３５】
得られたポリヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして用いて、周知のｃＤＮＡクローニングによって、具体的には、標的である上記遺伝子が発現される大腸組織などの生体組織から抽出した全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムで処理して得られるポリＡ（＋）ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなどのスクリーニングによって、目的のｃＤＮＡクローンを得る。必要に応じて、ｃＤＮＡクローンをさらにＰＣＲ法によって増幅することもできる。これによって目的の遺伝子に対応するｃＤＮＡを得ることができる。
【００３６】
プローブ又はプライマーは、配列番号１〜１６に示されるポリペプチド配列に基づいて１５〜１００塩基の連続する配列の中から選択し、上記のようにして合成しうる。また、ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．および Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７に記載されている。
【００３７】
次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換又はトランスフェクションされた原核又は真核宿主細胞を培養することによって該細胞又は培養上清から目的のポリペプチドを得ることができる。このとき、目的の成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡの５’末端に、分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をフランキングすることによって細胞外に成熟ポリペプチドを分泌させることができる。
【００３８】
ベクター及び発現系はＮｏｖａｇｅｎ社、宝酒造、第一化学薬品、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから入手可能である。宿主細胞としては、細菌などの原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌）、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシアエ）、昆虫細胞（例えばＳｆ細胞）、哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３など）などを用いることができる。ベクターには、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの他に、調節エレメント、例えばプロモーター（例えばｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、解糖系酵素プロモーターなど）、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよびリボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカー（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子；ＬＥＵ２、ＵＲＡ３などの栄養要求性マーカーなど）などを含むことができる。
【００３９】
また、ポリペプチドの精製を容易にするために、標識ペプチドをポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に結合させた融合ポリペプチドの形態で発現産物生成させることもできる。代表的な標識ペプチドには、６〜１０残基のヒスチジンリピート（Ｈｉｓタグ）、ＦＬＡＧ、ｍｙｃペプチド、ＧＳＴポリペプチド、ＧＦＰポリペプチドなどが挙げられるが、標識ペプチドはこれらに限られるものではない。
【００４０】
標識ペプチドを付けずに本発明に係るポリペプチドを生産した場合には、その物理的または化学的性質を利用して、当業者に周知の手段により該ポリペプチドを精製、単離することができる。その精製法として例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動、硫安分画、塩析、塩溶、限外ろ過、透析などの方法を１つまたは複数組み合わせる方法を挙げることができる。さらにまた、該ポリペプチドにヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、といった標識ペプチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識ペプチドに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。この場合、単離・精製が容易となるような発現ベクターを構築するとよい。特にポリペプチドと標識ペプチドとの融合ポリペプチドの形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺伝子工学的に当該ポリペプチドを調製すれば、単離・精製も容易である。
【００４１】
本発明における上記ポリペプチドには、その変異体も含まれる。「変異体」とは、配列番号１〜１６で表されるアミノ酸配列又はその部分配列において１以上、好ましくは１もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは該アミノ酸配列又はその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体を意味する。このような変異体には、例えば、ヒトと異なる哺乳動物種のホモログ、同種の哺乳動物(例えば人種)間での多型性変異に基づく変異体などの天然変異体が含まれる。
【００４２】
ここで、「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個の整数を指す。
【００４３】
また、「％同一性」は、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質または核酸のホモロジー検索プログラムを用いて、ギャップを導入してまたはギャップを導入しないで、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８；高木利久・金久實編、ゲノムネットのデータベース利用法（第２版）１９９８年、共立出版社）。
【００４４】
＜大腸癌の診断または検出のための組成物＞
本発明は、配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数を含む、大腸癌の診断または検出のための組成物を提供する。
【００４５】
さらに、より好ましくは、本発明における大腸癌の診断または検出のための組成物は、配列番号１〜１６で表されるポリペプチドの断片であり、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体のうちの１つまたは複数を含む組成物である。
【００４６】
大腸癌マーカーであるポリペプチドを認識する抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、該ポリペプチドに特異的に結合し得るものである。本発明で使用しうる抗体は、配列番号１〜１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいはその融合ポリペプチドを１または複数の免疫原として使用して慣用の技術によって作製することができる。免疫原として用いられるこれらのポリペプチド、断片、変異体または融合ポリペプチドは、配列番号１〜１６で表される各ポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、または配列番号１〜１６で表される各ポリペプチド全長からなる。また、より好ましくは、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である。
【００４７】
これらのポリペプチド、断片、変異体または融合ポリペプチドは、抗体形成を引き出すエピトープを含むが、これらエピトープは、直鎖でもよいし、より高次構造（断続的）でもよい。なお、該エピトープは、当該技術分野に知られるあらゆるエピトープ解析法、例えばファージディスプレイ法、リバースイムノジェネティックス法など、によって同定できる。
【００４８】
本発明における抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、などがあげられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明で使用しうる抗体は、いずれのタイプ、クラス、サブクラスも含まれるものとする。そのような抗体には、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などが含まれる。
【００５０】
さらにまた、本発明に係るポリペプチドによってあらゆる態様の抗体が誘導される。該ポリペプチドの全部もしくは一部またはエピトープが単離されていれば、慣用技術を用いてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも作製可能である。方法には例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅ ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０に挙げられた方法がある。
【００５１】
ポリクローナル抗体は、鳥類(例えば、ニワトリなど)、哺乳動物(例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ネズミなど)などの動物に本発明に係るポリペプチドを免疫することによって作製することができる。目的の抗体は、免疫された動物の血液から、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの手法を適宜組み合わせて精製することができる。
【００５２】
モノクローナル抗体は、各ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、慣用技術によってマウスにおいて産生することを含む手法によって得ることができる。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明に係るポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用技術によって回収可能である。
【００５３】
モノクローナルおよびポリクローナル抗体の作製について以下に詳しく説明する。
Ａ．モノクローナル抗体の作製
（１）免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢａｌｂ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜１０回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節細胞が好ましい。
【００５４】
（２）細胞融合
各タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明のポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）などが挙げられる。
【００５５】
次に、上記骨髄腫細胞株と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約１：１〜２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１５００〜４０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる。
【００５６】
（３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２００万個/ウェル程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株またはチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００５７】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ、及びＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。ハイブリドーマは、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、本発明のポリペプチド性癌マーカーと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
【００５８】
（４）抗体の回収
モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１０００万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採取する。
【００５９】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００６０】
Ｂ．ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００６１】
また本発明においては、上記抗体の抗原結合断片も使用しうる。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、ＦａｂおよびＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖなどの断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片および誘導体もまた含まれる。そのような抗体には、例えば合成抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、単鎖抗体などが含まれる。
【００６２】
本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、本発明において、ポリペプチドまたはその（ポリ）ペプチド断片の存在を検出するためのアッセイに使用可能である。アッセイにおける特異的検出を可能にするために、モノクローナル抗体の使用が好ましいが、ポリクローナル抗体であっても、精製ポリペプチドを結合したアフィニティーカラムに抗体を結合させることを含む、いわゆる吸収法によって、特異抗体を得ることができる。
【００６３】
したがって、本発明の組成物は、配列番号１〜１６のポリペプチド、その変異体、またはその断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片を少なくとも１つ含む、好ましくは複数種、より好ましくは全ての種類を含むことができる。さらに、より好ましくは、本発明の組成物は、配列番号１〜１６で表されるポリペプチドの断片であり、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるポリペプチドを含む断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片を少なくとも１つ含む、好ましくは複数種、より好ましくは全ての種類を含むことができる。
【００６４】
好ましくは、本発明の組成物はキットの形態である。このようなキットにおいては、上記の各ポリペプチドに特異的に結合可能な抗体またはその断片を、それぞれ個別に、あるいは適宜混合して混合物として、個別の容器（例えばバイアルなど）に入れて包装することができる。抗体またはその断片は、固相担体に結合されていてもよいしまたは遊離の形態でもよく、固相担体に結合される場合、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ラテックス、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス、磁性体等の材質からなるマルチウエルプレート、ビーズ、試験管、スティック、試験片などの形状の固相担体上に抗体またはその断片を付着または結合させてもよい。
【００６５】
本発明で使用される抗体またはその断片には、必要に応じてラベル、例えば蛍光団、酵素、放射性同位元素などを結合させてもよいし、あるいは二次抗体にこのようなラベルを結合してもよい。
【００６６】
蛍光団には、例えばフレオロレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシルクロリドとその誘導体、ウンベリフェロンなどが含まれる。
【００６７】
酵素には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼなどが含まれる。
【００６８】
放射性同位元素には、例えばヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、リン（３２Ｐ）、イオウ（３５Ｓ）、金属類（例えば６８Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇｅ、５４Ｍｎ、９９Ｍｏ、９９Ｔｃ、１３３Ｘｅなど）、トリチウムなどが含まれる。
【００６９】
その他のラベルには、例えばＮＡＤＨ−、ＦＭＮＨ２−、アクリジニウムエステル、ルミノールなどの発光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリンなどの生物発光物質などが含まれる。
【００７０】
また、必要に応じて、アビジン−ビオチン系またはストレプトアビジン−ビオチン系を利用することも可能であり、この場合、本発明の抗体またはその断片に例えばビオチンを結合することもできる。
【００７１】
本発明のキットは、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのマーカーポリペプチド、使用説明書、等をさらに含むことができる。
【００７２】
＜大腸癌の検出＞
本発明によれば、上記大腸癌マーカーと結合可能な物質を用いて、被験者由来の生体試料中の配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片、好ましくはそのうちの１つまたは複数について、その量または存在を調べることを含む方法によって、大腸癌を検出することができる。本発明の方法によって、被験者の生体試料中に配列番号１〜３で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片が検出されるか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に高いと判定されるとき、あるいは配列番号４〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片が検出されないか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に低いと判定されるときには、被験者は大腸癌に罹患していると診断しうる。
【００７３】
また、より好ましくは、配列番号１〜１６で表されるポリペプチドの断片であり、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片、のいずれか１つまたは複数について、その量または存在を調べることを含む方法によって、大腸癌を検出することができる。本発明の方法によって、被験者の生体試料中に配列番号１７〜１９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片が検出されるか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に高いと判定されるとき、あるいは配列番号２０〜３８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片が検出されないか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に低いと判定されるときには、被験者は大腸癌に罹患していると診断しうる。
【００７４】
本発明の方法では、上記大腸癌マーカーの検出は、単一のマーカーでもよいが、好ましくは複数、例えば２以上、３以上、４以上、５以上から３６、３７または３８以下のマーカーについて行うのがよい。これは、予期せぬ非特異的複合体の検出、言い換えれば誤診、を回避するためである。また、本発明における大腸癌マーカーを、当業者に知られている他の癌の診断マーカーと組合せて利用してもよい。
【００７５】
本発明の組成物は、大腸癌の診断、判定又は検出、すなわち罹患の有無や罹患の程度の診断、のために有用である。大腸癌の診断においては、正常組織（または細胞）、非癌組織（または細胞）、正常体液などの対照との比較を行い、被験者の生体試料中の上記大腸癌マーカーの存在または量を検出し、その存在または量の差が有意であれば、被験者について大腸癌の罹患が疑われる。
【００７６】
本発明方法で用いられる検体試料としては、例えば大腸組織、その周辺組織、大腸細胞、あるいは体液、例えば血液、血清、血漿、大腸液、尿などである。被験者の生体組織は、バイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって得ることができる。
【００７７】
本発明において、被験者とは、ヒトを含む哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００７８】
上記大腸癌マーカーと結合可能な物質は、例えば上記抗体またはその断片、アプタマー、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ社商標）、それぞれの大腸癌マーカーの受容体、それぞれの大腸癌マーカーの特異的作用阻害物質、それぞれの大腸癌マーカーの特的作用活性化物質などを含み、好ましくは抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体である。
【００７９】
本発明の実施形態において、測定は、慣用の酵素又は蛍光団で必要により標識した抗体又は断片と、組織切片又はホモゲナイズした組織または体液とを接触させる工程、抗原−抗体複合体を定性的に又は定量的に測定する工程を含むことができる。検出は、例えば免疫電顕により標的ポリペプチドの存在とレベルを測定する方法、酵素抗体法(例えばＥＬＩＳＡ)、蛍光抗体法、放射性免疫測定法、均一法、不均一法、固相法、サンドイッチ法などの慣用法によって標的ポリペプチドの存在またはレベルを測定する方法などによって行うことができる。さらにまた、本発明においては、本発明の抗体と、試料中の標的ポリペプチドとの反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、または標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の検出方法については、感度の点で、後者の間接的検出を利用することが好ましい。
【００８０】
上記の大腸癌マーカーの種類に応じて、被験者から得られた体液または大腸癌組織もしくは細胞、好ましくは血液、において、標的ポリペプチドが存在あるいは消失している場合、あるいは対照と比較して標的ポリペプチドのレベルが有意に増大または減少している場合、大腸癌であると決定する。ここで、「有意に」とは、統計学的有意差があることを意味する。
【００８１】
免疫学的方法に代わる測定方法として、質量分析法を用いる方法が含まれる。この方法は、具体的には実施例に記載される手法で行うことができる。すなわち、生物試料、例えば血清または血漿をフィルターでろ過して夾雑物を除き、緩衝液（例えばｐＨ約８）で希釈して約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したのち、分子量５万以上のタンパク質を除去可能な中空糸フィルター（下記参考例（１））または遠心型平膜フィルターを通して分子量分画し、画分をプロテアーゼ（例えばトリプシン）で処理してペプチド化し、これを質量分析計（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、またはエレクトロスプレーイオン化法を利用したタイプ）に掛けて、目的のポリペプチド由来の特定ピークの質量／荷電数と強度に基づいて、大腸癌摘出手術前の患者と健常人の間における試料中のポリペプチドの存在量の差異を測定することができる。
【実施例】
【００８２】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、この実施例によって制限されないものとする。
＜参考例＞
（１）中空糸フィルターの作製
分画分子量約５万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸を１００本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管に固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュール（モジュールＡ）は血清または血漿中の高分子量タンパク質の除去に用いられ、その直径は約７ｍｍ、長さは約１７ｃｍである。同様に低分子量タンパク質の濃縮に用いられるミニモジュール（モジュールＢ）を分画分子量約３千の孔径の膜を用いて作成した。ミニモジュールは片端に中空糸内腔に連結する入口があり、反対側の端は出口となる。中空糸入口と出口はシリコンチューブによる閉鎖循環系流路であり、この流路内を液体がペリスタポンプに駆動されて循環する。また、中空糸外套のガラス管には、中空糸から漏出してきた液体を排出するポートを備え、１つモジュールセットが構成される。流路途中にＴ字のコネクターによって、モジュールを連結し、モジュールＡ３本と、モジュールＢ１本をタンデムに連結してひとつの中空糸フィルターとした。この中空糸フィルターを蒸留水にて洗浄し、ＰＢＳ（０．１５ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）水溶液を充填した。分画原料の血清または血漿は該中空糸フィルターの流路入口から注入され、分画・濃縮後に流路出口から排出される。該中空糸フィルターに注入された血清または血漿は、モジュールＡ毎に分子量約5万で分子篩いがかかり、分子量５万よりも低分子の成分はモジュールＢで濃縮され、調製されるようになっている。
【００８３】
＜実施例１＞
（１）健常人および大腸癌患者血漿のタンパク質同定
５０〜７０歳代の摘出手術前の大腸癌患者１９名、および同年代の健常人８名からＥＤＴＡ血漿を得て、それぞれの血漿について測定を行った。血漿をポアサイズ０．２２μｍのフィルターでろ過して夾雑物質を取り除き、タンパク質濃度５０ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。この血漿をさらに２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）１２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、参考例（１）に示した中空糸フィルターによって分子量による分画を行った。分画後の血漿サンプル（全量１．８ｍＬ、最大２５０μｇのタンパク質を含む）をＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ(登録商標)ＰＦ２Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）逆相クロマトグラフィーで７分画に分離し、それぞれのフラクションを凍結乾燥した後、１００μＬの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）に再溶解した。このサンプルについて、総タンパク質の５０分の１量のトリプシンで３７℃、２〜３時間の条件で消化し、ペプチド化を行った。各分画のペプチドをさらにイオン交換カラム（ＫＹＡテクノロジーズ）によって４分画化した。その各々の分画を、逆相カラム（ＫＹＡテクノロジーズ）でさらに分画し、溶出されてきたペプチドについて、オンラインで連結された質量分析計Ｑ−ＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）を用いて、サーベイスキャンモードで測定した。
【００８４】
当該分野においては通常、測定を行う際に標準物質を用いることによって質量／電荷比の補正を行うが、さらに本発明における解析では、さらにそれに加えて、通常血液タンパク質として必ず検出されるアルブミン、α−フィブリノーゲンなどのいくつかのタンパク質を内部標準とし、それらのタンパク質の理論質量の値を用いて、測定データの再補正を行うことで、データのさらなる精密化を図った。そのようにして精密化を行ったデータについて、タンパク質解析ソフトＭＡＳＣＯＴを用いて、データの解析を行った。血液タンパク質を同定する基準として、(i)そのタンパク質に属するペプチドのうち、少なくとも一本以上がＭｏｗｓｅスコア３４以上の高い信頼性をもって検出されていること、(ii)ペプチドのＭＳデータの測定値およびＭＳ／ＭＳデータの測定値と、ペプチドの理論値との誤差が０．０３ダルトン以下であること、という二つの基準を用い、誤ったタンパク質同定を極力排除できる条件での解析を行った。
【００８５】
（２）大腸癌患者の癌摘出手術前血漿において健常人の血漿と比べ検出人数が増加または減少したタンパク質
このデータを健常人と癌患者間で比較し、同定されたタンパク質のうち、３人以上の大腸癌患者で検出され、健常人では全く検出されていないタンパク質を健常人と比べ大腸癌摘出手術前の患者の血漿中でその発現が有意に増強するタンパク質として見いだした。これらのタンパク質は、下記表３に示した配列番号１〜３で表されるポリペプチドである。また、同定されたタンパク質のうち、健常人における検出人数が、大腸癌患者における検出人数よりも３人以上多いタンパク質を健常人と比べ大腸癌摘出手術前の患者の血漿中でその発現が有意に減少するタンパク質として見いだした。これらのタンパク質は、下記表３に示した配列番号４〜１６で表されるポリペプチドである。従って、これらの配列番号１〜１６で表されるポリペプチドは大腸癌マーカーとして大腸癌の検出において有用であることが判明した。
【００８６】
【表３】
【００８７】
（３）大腸癌患者の癌摘出手術前血漿において健常人の血漿と比べＭＳピーク強度が増加または減少したタンパク質
さらに、上記（２）において同定されたタンパク質に属するペプチドについて、その検出時におけるＭＳピーク強度を解析した。このＭＳピーク強度は、厳密には定量的なものではないが、タンパク質の存在量をある程度反映した数値であり、ＭＳピーク強度を用いた定量的な比較解析が可能であることは、当業者において周知である。それぞれのペプチドの検出時におけるＭＳピーク強度を健常人と癌患者間で比較し、検出されたペプチドのうち、大腸癌患者群におけるピーク強度が、健常人のそれと比較して有意に大きいペプチドを、健常人と比べ大腸癌摘出手術前の患者の血漿中でその存在量が有意に増加するペプチドとして見いだした。これらのペプチドは配列番号１７〜１９のいずれかで表されるポリペプチドであり、配列番号１、３、４で表されるポリペプチドのうちの、いずれか一つの断片である。また同様に、検出されたペプチドのうち、大腸癌患者群におけるピーク強度が、健常人のそれと比較して有意に小さいタンパク質を、健常人と比べ大腸癌摘出手術前の患者の血漿中でその存在量が有意に減少するペプチドとして見いだした。これらのペプチドは配列番号２０〜３８で表されるポリペプチドであり、これらのペプチドは配列番号５〜７、９〜１５で表されるポリペプチドのうちの、いずれか一つの断片である。従って、これらの配列番号１７〜３８で表されるポリペプチド、およびそれらを内部に持つ断片は大腸癌マーカーとして大腸癌の検出において有用であることが判明した。これらの配列番号１７〜３８で表されるポリペプチド断片を、それぞれ遺伝子名、配列番号１、３〜７、９〜１５で表される配列のどの部位の断片であるか、ペプチド長、アミノ酸配列（一文字表記）と共に表４に示す。また、配列番号１７〜３８で表されるポリペプチド断片の大腸癌患者および健常人におけるＭＳピーク強度を図１〜７に示す。各配列の大腸癌患者および健常人のＭＳピーク強度上の数字は各個人の番号を示す。
【００８８】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、特異性および感受性に優れた、大腸癌の診断または検出のための組成物を提供することができるため、特に製薬および医薬産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明における配列番号１７〜１９で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図２】本発明における配列番号２０〜２２で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図３】本発明における配列番号２３〜２６で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図４】本発明における配列番号２７〜２９で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図５】本発明における配列番号３０〜３２で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図６】本発明における配列番号３３〜３５で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図７】本発明における配列番号３６〜３８で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌の診断又は検出に有用な組成物に関する。
【０００２】
本発明はまた、該組成物を使用した大腸癌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
大腸は、全長が約１．６メートルの管であり、盲腸からはじまり上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ状結腸、直腸で構成される。大腸は消化吸収された残りの腸内容物をため、そこから水分を吸収しながら大便にする、重要な消化器系器官である。また多量の腸内の細菌を排泄することによって防御する役割を持つ。
【０００４】
大腸癌は大きく分けて、腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌があり、大部分が腺癌で大腸ポリープ（ｐｏｌｙｐ）より発生する。有茎のポリープはキノコの様な形状に増殖し、通常は良性腫瘍であるが、そのうちの一部が腺癌に進行する。また現在は、ポリープ由来でない平坦な病変や陥凹性病変から進行大腸癌になることがあることも明らかになっている。
【０００５】
日本人においてはＳ状結腸と直腸が大腸癌のできやすい部位である。食生活の欧米化に応じて増加する傾向にあり、日本における２００４年の器官別死亡数では、結腸と直腸を合わせた場合、肺、胃についで３位である。年齢別にみた大腸癌（結腸・直腸・肛門癌）の罹患率は、５０歳代付近から増加し始め、加齢につれて高くなる。大腸癌の罹患率、死亡率はともに男性のほうが女性の約２倍と高い傾向にあり、結腸癌より直腸癌において男女差が大きい傾向がある。大腸癌の危険因子としては遺伝学的要因も知られているが、一般的には喫煙、肥満、飲酒などを挙げることができる。
【０００６】
大腸癌の治療としては内視鏡治療、外科手術、化学療法、放射線療法などが、病期、腫瘍の大きさ・深達度、転移の度合などを勘案し施される。治療方針の決定にあたっては大腸癌研究会により作成された「大腸癌治療ガイドライン」が参考にされる。早期大腸癌である場合は内視鏡切除、あるいは外科手術によって完全に切除することが可能であり、再発率も非常に低い。進行大腸癌である場合は肺、肝臓、リンパ節や腹膜などに切除困難な転移がおこり、また切除した部位に局所再発がおこることもある。こうした時期では、手術に加え放射線療法や化学療法（抗癌剤治療）が行われる。
【０００７】
このように、大腸癌は比較的早期で発見された場合、予後は比較的良く、初期癌での治療ではほぼ１００％近くが完治する。しかし、大きな腫瘍や転移のある腫瘍の治療成績は劣り、早期発見の重要性が認識されている。
【０００８】
しかしながら、大腸癌を自覚症状によって早期発見することは難しい。ほとんどの早期大腸癌の段階では無症状であり、癌が進行してからでないとはっきりとした自覚症状が現れないことが多いからである。大腸癌の進行につれて血便、便が細くなる（便柱細少）、残便感、腹痛、下痢と便秘の繰り返しなど排便に関する症状や、貧血、嘔吐などの症状が現れる。最も多いのが血便であるが、痔等と混同される場合も多い。
【０００９】
大腸癌の検査法としては直腸指診、便潜血検査、超音波検査、ＣＴ検査、大腸内視鏡検査、注腸造影検査などがある。大規模な集団検診で行われる代表的な検査法は大便の免疫学的潜血反応である。この段階で精密検査を受ける人をスクリーニングできるが、偽陰性、偽陽性判定も多い。精密検査で大腸癌の確定診断を行う方法には大腸内視鏡検査、注腸造影検査、画像診断などの方法があるが、便を全て排出しなければならない、場合によっては苦痛を伴うなど、患者の肉体的、精神的負担が大きく、事前のスクリーニング段階での偽陰性、偽陽性判定を減らすことが求められている。
【００１０】
そこで、大腸癌をスクリーニング段階で検出するために、便潜血検査に加えて、特異的で感受性が高い血中腫瘍マーカー（ｔｕｍｏｒ ｍａｒｋｅｒ）を発見しそれを用いた検査を行うことが強く望まれている。血中マーカーのレベルを計測することにより、比較的安価でハイスループットな検査・診断が可能になると考えられる。これまでに、大腸癌のマーカーとしてＣＥＡ、ＣＡ１９−９などが臨床応用されている。しかしながら、大腸癌を特異的に、早期に発見できる腫瘍マーカーは現時点において存在せず、進行大腸癌であっても約半数が陽性を示すのみである。
【００１１】
また、近年のゲノム解析またはプロテオーム解析の進歩に伴い、様々な新規の腫瘍マーカー候補が発見されている。たとえばＩｎｏｒｇａｎｉｃ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（特許文献１）、ＲＳ１５Ａ（特許文献２）、ＣＢＰ２（特許文献３）、ＡＳＣ（特許文献４）などがある。また組織においてはＡｎｎｅｘｉｎ ＩＶなど１３種（非特許文献１）、Ｍｏｒｔａｌｉｎ（非特許文献２）、Ｃｙｔｏｃｈｏｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｅｎｚｙｍｅｓ（非特許文献３）、ＨＳＰ７０など５種（非特許文献４）、Ａｄｅｎｏｓｙｌ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎａｓｅなど２３種（非特許文献５）、などのマーカー候補が発見されている。
【００１２】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／１２４３５３
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／１２４３５５
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００５／１２４３５６
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００６／０６６９１７
【非特許文献１】Ａｌｆｏｎｓｏ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００５、第５巻、ｐ．２６０２−２６１１
【非特許文献２】Ｄｕｎｄａｓ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２００５、第２０５巻、ｐ．７４−８１
【非特許文献３】Ｌａｎｅ，Ｃ．Ｓ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ、２００４、第４０巻、ｐ．２１２７−２１３４
【非特許文献４】Ｓｔｕｌｉｋ，Ｊ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、１９９９、第２０巻、ｐ．３６３８−３６４６
【非特許文献５】Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００４、第４巻、ｐ．７９３−８１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、上記の既存のマーカー、およびマーカー候補は特異性及び／又は感受性に乏しいことや、生体試料からのその効率的な検出方法が確立していないことから一般に臨床上の利用は行われておらず、より特異性及び感受性が高い大腸癌のマーカーが切望されている。
【００１４】
本発明は、大腸癌の診断に有用な組成物、および該組成物を用いた大腸癌の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
マーカー探索の方法としては、大腸癌細胞と非癌細胞における遺伝子発現やタンパク質発現、又は細胞の代謝産物などの量を何らかの手段によって比較する方法や、大腸癌患者と非癌患者の体液中に含まれる遺伝子、タンパク質、代謝産物などの量を測定する方法が挙げられる。
【００１６】
上記の課題を解決するために、本発明者らは、今回、大腸癌患者と健常人の血漿について、大腸癌患者に特異的に検出されるタンパク質マーカーを見出した。
【００１７】
本発明は、以下の特徴を有する。
（１）被験者由来の生体試料中の配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片のいずれか１つまたは複数を測定することを含む、大腸癌をインビトロで検出する方法。
（２）前記断片が、配列番号１〜１６のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、（１）に記載の方法。
（３）前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の量またはその存在を測定する、（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の量が、対照試料のものと比べて有意に増大しているか、あるいは有意に減少していることを指標にする、（１）〜（３）に記載の方法。
（５）前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の測定が免疫学的方法によるものである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記測定が、前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と結合可能な物質を用いて行われる、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記結合可能な物質が抗体またはその断片である、（６）に記載の方法。
（８）前記抗体が標識されている、（７）に記載の方法。
（９）前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、前記試料中の該ポリペプチド、その変異体またはその断片のうちの１つまたは複数の量または存在を免疫学的に測定し、該ポリペプチド、その変異体またはその断片の量が対照試料のものと比べて増大あるいは減少していることを指標にするか、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片が前記試料または対照試料のいずれか一方にのみ存在していること、を指標にして大腸癌を検出することを含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記試料が血液、血漿、血清または尿である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記試料が大腸由来の組織または細胞である、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１３）配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその断片またはそれらの化学修飾誘導体のうちの1つまたは複数を含む、大腸癌の診断または検出のための組成物。
（１４）前記ポリペプチドの断片が、配列番号１〜１６のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、（１３）記載の組成物。
（１５）前記ポリペプチドの断片が、少なくとも７個のアミノ酸からなるエピトープを含む、（１３）または（１４）に記載の組成物。
（１６）キットの形態である、（１３）〜（１５）のいずれかに記載の組成物。
（１７）（１３）〜（１６）のいずれかに記載の組成物の、被験者における大腸癌のインビトロ検出のための使用方法。
【００１８】
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
【００１９】
本明細書において「化学修飾誘導体」は、酵素、蛍光団、放射性同位元素などのラベルによるラベル化誘導体、あるいはアセチル化、グリコシル化、リン酸化、硫酸化などの化学修飾を含む誘導体を意味する。
【００２０】
本明細書において「診断又は検出のための組成物」とは、大腸癌の罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断または検出するために、あるいは大腸癌の予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接的又は間接的に使用しうるものをいう。
【００２１】
本明細書において検出・診断対象となる「生体試料」とは、大腸癌の発生にともない発現量が増加あるいは減少する標的ポリペプチドを含有する、またはその含有が疑われる、生体から採取された試料をいう。
【００２２】
本明細書において「特異的に結合する」とは、抗体またはその断片が、本発明における大腸癌マーカーである標的ポリペプチド、その変異体またはその断片とのみ抗原-抗体複合体を形成し、他のペプチド性またはポリペプチド性物質とは該複合体を実質的に形成しないことを意味する。ここで、「実質的」とは、程度は小さいが非特異的な複合体形成が起こり得ることを意味する。
【００２３】
本明細書において「エピトープ」とは、本発明の標的ポリペプチド、その変異体またはその断片において、抗原性または免疫原性を有する部分アミノ酸領域（抗原決定基）指す。エピトープは通常、少なくとも５アミノ酸、好ましくは少なくとも７アミノ酸または少なくとも８アミノ酸、より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明における大腸癌マーカーは、大腸癌患者の血液などの生体試料中に見出されるが、健常人のそれにはほとんど、または全く見出されないか、あるいは逆に健常人の生体試料にのみ見出され、大腸癌患者のそれにはほとんど、または全く見出されないため、単に該マーカーの存在または量を指標にすることによって、例えば血液を用いて、容易に大腸癌を検出することができるという格別の作用効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に本発明をさらに具体的に説明する。
＜大腸癌マーカー＞
本発明の大腸癌の診断または検出のための組成物を使用して大腸癌をインビトロで検出するための大腸癌マーカーは、配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片である。
【００２６】
本発明の配列番号１〜１６のポリペプチドを、その遺伝子名（ＧｅｎＢａｎｋ登録名）およびタンパク質番号（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ登録番号）、ならびにそれらの特性とともに下記の表１に示す。これらのポリペプチドのうち、配列番号１〜３で表されるポリペプチドは、大腸癌患者血漿中に特異的に検出され、健常者の血漿には検出されないか、または大腸癌患者血漿に比べて検出される量が有意に減少していた。また、配列番号４〜１６で表されるポリペプチドは、健常者血漿中に特異的に検出され、大腸癌患者の血漿には検出されないか、または健常人血漿に比べて検出される量が有意に減少していた。なお、これらのポリペプチドおよび／または遺伝子（ｃＤＮＡ）のアミノ酸配列またはヌクレオチド（もしくは、塩基）配列は、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ等のデータバンクにアクセスすることによって入手可能である。
【００２７】
【表１】
【００２８】
また、本発明における上記ポリペプチドの断片は、該ポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基からなり、１個または複数のエピトープを保持する。このような断片は、本発明に関わる抗体またはその断片と免疫特異的に結合することができるものである。上記ポリペプチドが、例えば血液中に存在する場合には、そこに存在するプロテアーゼやペプチダーゼなどの酵素によって切断され断片化されて存在することが想定される。
【００２９】
また、後述の実施例１に示すように、本発明において、配列番号１７〜１９で表されるポリペプチドは、健常者に比べて大腸癌患者の生体試料中に特に高いレベルで検出されていた。また、配列番号２０〜３８で表されるポリペプチドは、逆に大腸癌患者に比べて健常者の生体試料中に特に高いレベルで検出されていた。これらのポリペプチドは、配列番号１、３〜７、９〜１５で表されるポリペプチドの断片であり、従って、これらの配列番号１７〜３８で表されるポリペプチド、およびそれらを内部に持つ断片は大腸癌マーカーとしてより好ましく用いられる。下記表２に、配列番号１７〜３８のポリペプチドを、配列番号１、３〜７、９〜１５で表されるポリペプチドのどの部分に相当するかと共に記す。
【００３０】
また、配列番号２０〜２２のアミノ酸配列、および配列番号３０、３１のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５のアミノ酸配列、および配列番号９のアミノ酸配列のなかで、ほぼあるいは完全に連続的に出現している。したがって、配列番号２０〜２２のアミノ酸配列を連結した配列、すなわち配列番号５の第３２８番目のスレオニンから第３６３番目のアルギニンまでの配列、および、配列番号３０、３１で表されるアミノ酸配列を連結した配列、すなわち配列番号９の第５番目のアラニンから第３０番目のリジンまでの配列、のそれぞれで表されるポリペプチド、およびそれらを内部に持つ断片も大腸癌マーカーとしてより好ましく用いられる。
【００３１】
【表２】
【００３２】
本発明において大腸癌検出のための上記標的ポリペプチドはいずれも、大腸癌患者において、血液などの生体試料中の該ポリペプチドのレベルが、健常人と比べて大腸癌に罹患した被験者において有意にまたは格別に高い、あるいは低いことによって特徴付けられる。
【００３３】
本発明におけるポリペプチドは、例えば当業界で慣用の技術である、固相合成等の化学合成法、またはＤＮＡ組換え技術によって作製することができる。手順や精製の簡易さの点で、ＤＮＡ組換え技術の使用が好ましい。
【００３４】
はじめに本発明におけるポリペプチドの部分配列をコードするポリヌクレオチド配列を、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成する。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社などから市販されている。
【００３５】
得られたポリヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして用いて、周知のｃＤＮＡクローニングによって、具体的には、標的である上記遺伝子が発現される大腸組織などの生体組織から抽出した全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカラムで処理して得られるポリＡ（＋）ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によってｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニング、発現スクリーニング、抗体スクリーニングなどのスクリーニングによって、目的のｃＤＮＡクローンを得る。必要に応じて、ｃＤＮＡクローンをさらにＰＣＲ法によって増幅することもできる。これによって目的の遺伝子に対応するｃＤＮＡを得ることができる。
【００３６】
プローブ又はプライマーは、配列番号１〜１６に示されるポリペプチド配列に基づいて１５〜１００塩基の連続する配列の中から選択し、上記のようにして合成しうる。また、ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．および Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７に記載されている。
【００３７】
次に、上記のようにして得られたｃＤＮＡクローンを発現ベクターに組み込み、該ベクターによって形質転換又はトランスフェクションされた原核又は真核宿主細胞を培養することによって該細胞又は培養上清から目的のポリペプチドを得ることができる。このとき、目的の成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡの５’末端に、分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をフランキングすることによって細胞外に成熟ポリペプチドを分泌させることができる。
【００３８】
ベクター及び発現系はＮｏｖａｇｅｎ社、宝酒造、第一化学薬品、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃｓ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社などから入手可能である。宿主細胞としては、細菌などの原核細胞（例えば大腸菌、枯草菌）、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビシアエ）、昆虫細胞（例えばＳｆ細胞）、哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３など）などを用いることができる。ベクターには、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの他に、調節エレメント、例えばプロモーター（例えばｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＳＶ４０ウイルスプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、解糖系酵素プロモーターなど）、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルおよびリボソーム結合部位、複製開始点、ターミネーター、選択マーカー（例えばアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子；ＬＥＵ２、ＵＲＡ３などの栄養要求性マーカーなど）などを含むことができる。
【００３９】
また、ポリペプチドの精製を容易にするために、標識ペプチドをポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に結合させた融合ポリペプチドの形態で発現産物生成させることもできる。代表的な標識ペプチドには、６〜１０残基のヒスチジンリピート（Ｈｉｓタグ）、ＦＬＡＧ、ｍｙｃペプチド、ＧＳＴポリペプチド、ＧＦＰポリペプチドなどが挙げられるが、標識ペプチドはこれらに限られるものではない。
【００４０】
標識ペプチドを付けずに本発明に係るポリペプチドを生産した場合には、その物理的または化学的性質を利用して、当業者に周知の手段により該ポリペプチドを精製、単離することができる。その精製法として例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動、硫安分画、塩析、塩溶、限外ろ過、透析などの方法を１つまたは複数組み合わせる方法を挙げることができる。さらにまた、該ポリペプチドにヒスチジンリピート、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＧＦＰ、といった標識ペプチドを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれの標識ペプチドに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。この場合、単離・精製が容易となるような発現ベクターを構築するとよい。特にポリペプチドと標識ペプチドとの融合ポリペプチドの形態で発現するように発現ベクターを構築し、遺伝子工学的に当該ポリペプチドを調製すれば、単離・精製も容易である。
【００４１】
本発明における上記ポリペプチドには、その変異体も含まれる。「変異体」とは、配列番号１〜１６で表されるアミノ酸配列又はその部分配列において１以上、好ましくは１もしくは数個、のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは該アミノ酸配列又はその部分配列と約８０％以上、約８５％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体を意味する。このような変異体には、例えば、ヒトと異なる哺乳動物種のホモログ、同種の哺乳動物(例えば人種)間での多型性変異に基づく変異体などの天然変異体が含まれる。
【００４２】
ここで、「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個の整数を指す。
【００４３】
また、「％同一性」は、上記のＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質または核酸のホモロジー検索プログラムを用いて、ギャップを導入してまたはギャップを導入しないで、決定することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第９０巻、ｐ.５８７３-５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ.２４４４-２４４８；高木利久・金久實編、ゲノムネットのデータベース利用法（第２版）１９９８年、共立出版社）。
【００４４】
＜大腸癌の診断または検出のための組成物＞
本発明は、配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する、抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体、のうちの１つまたは複数を含む、大腸癌の診断または検出のための組成物を提供する。
【００４５】
さらに、より好ましくは、本発明における大腸癌の診断または検出のための組成物は、配列番号１〜１６で表されるポリペプチドの断片であり、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体のうちの１つまたは複数を含む組成物である。
【００４６】
大腸癌マーカーであるポリペプチドを認識する抗体は、抗体の抗原結合部位を介して、該ポリペプチドに特異的に結合し得るものである。本発明で使用しうる抗体は、配列番号１〜１６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異体またはその断片、あるいはその融合ポリペプチドを１または複数の免疫原として使用して慣用の技術によって作製することができる。免疫原として用いられるこれらのポリペプチド、断片、変異体または融合ポリペプチドは、配列番号１〜１６で表される各ポリペプチドのアミノ酸配列において、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基からなるポリペプチド断片、または配列番号１〜１６で表される各ポリペプチド全長からなる。また、より好ましくは、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である。
【００４７】
これらのポリペプチド、断片、変異体または融合ポリペプチドは、抗体形成を引き出すエピトープを含むが、これらエピトープは、直鎖でもよいし、より高次構造（断続的）でもよい。なお、該エピトープは、当該技術分野に知られるあらゆるエピトープ解析法、例えばファージディスプレイ法、リバースイムノジェネティックス法など、によって同定できる。
【００４８】
本発明における抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、などがあげられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明で使用しうる抗体は、いずれのタイプ、クラス、サブクラスも含まれるものとする。そのような抗体には、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などが含まれる。
【００５０】
さらにまた、本発明に係るポリペプチドによってあらゆる態様の抗体が誘導される。該ポリペプチドの全部もしくは一部またはエピトープが単離されていれば、慣用技術を用いてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれも作製可能である。方法には例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅ ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０に挙げられた方法がある。
【００５１】
ポリクローナル抗体は、鳥類(例えば、ニワトリなど)、哺乳動物(例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ネズミなど)などの動物に本発明に係るポリペプチドを免疫することによって作製することができる。目的の抗体は、免疫された動物の血液から、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの手法を適宜組み合わせて精製することができる。
【００５２】
モノクローナル抗体は、各ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、慣用技術によってマウスにおいて産生することを含む手法によって得ることができる。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明に係るポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用技術によって回収可能である。
【００５３】
モノクローナルおよびポリクローナル抗体の作製について以下に詳しく説明する。
Ａ．モノクローナル抗体の作製
（１）免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして得られた免疫原を、哺乳動物、例えばラット、マウス（例えば近交系マウスのＢａｌｂ／ｃ）、ウサギなどに投与する。免疫原の１回の投与量は、免疫動物の種類、投与経路などにより適宜決定されるものであるが、動物１匹当たり約５０〜２００μｇとされる。免疫は主として皮下、腹腔内に免疫原を注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、初回免疫後、数日から数週間間隔で、好ましくは１〜４週間間隔で、２〜１０回、好ましくは３〜４回追加免疫を行う。初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法などにより繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したときは、免疫原を静脈内または腹腔内に注射し、最終免疫とする。そして、最終免疫の日から２〜５日後、好ましくは３日後に、抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞または局所リンパ節細胞が好ましい。
【００５４】
（２）細胞融合
各タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、慣用的技術によって産生し、そして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を本発明のポリペプチドで免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を採取し、該脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして該酵素に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。抗体産生細胞と融合させる骨髄腫細胞株としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。また株化細胞は、免疫動物と同種系の動物に由来するものが好ましい。骨髄腫細胞株の具体例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）などが挙げられる。
【００５５】
次に、上記骨髄腫細胞株と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを約１：１〜２０：１の割合で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１５００〜４０００ダルトンのポリエチレングリコール等を約１０〜８０％の濃度で使用することができる。また場合によっては、融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシドなどの補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることもできる。
【００５６】
（３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に２００万個/ウェル程度まき、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。培養温度は、２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株またはチミジンキナーゼ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞と骨髄腫細胞株のハイブリドーマのみを選択的に培養し、増殖させることができる。その結果、選択培地で培養開始後、約１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００５７】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採取し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ、及びＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）等によって行うことができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。ハイブリドーマは、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ等の基本培地中での培養において安定であり、本発明のポリペプチド性癌マーカーと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生、分泌するものである。
【００５８】
（４）抗体の回収
モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。すなわち樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法または腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で２〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１０００万個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水または血清を採取する。
【００５９】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより、精製された本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
【００６０】
Ｂ．ポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体を作製する場合は、前記と同様に動物を免疫し、最終の免疫日から６〜６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００６１】
また本発明においては、上記抗体の抗原結合断片も使用しうる。慣用的技術によって産生可能な抗原結合断片の例には、ＦａｂおよびＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖなどの断片が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生可能な抗体断片および誘導体もまた含まれる。そのような抗体には、例えば合成抗体、組換え抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、単鎖抗体などが含まれる。
【００６２】
本発明の抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれにおいても、本発明において、ポリペプチドまたはその（ポリ）ペプチド断片の存在を検出するためのアッセイに使用可能である。アッセイにおける特異的検出を可能にするために、モノクローナル抗体の使用が好ましいが、ポリクローナル抗体であっても、精製ポリペプチドを結合したアフィニティーカラムに抗体を結合させることを含む、いわゆる吸収法によって、特異抗体を得ることができる。
【００６３】
したがって、本発明の組成物は、配列番号１〜１６のポリペプチド、その変異体、またはその断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片を少なくとも１つ含む、好ましくは複数種、より好ましくは全ての種類を含むことができる。さらに、より好ましくは、本発明の組成物は、配列番号１〜１６で表されるポリペプチドの断片であり、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるポリペプチドを含む断片と特異的に結合可能な抗体またはその断片を少なくとも１つ含む、好ましくは複数種、より好ましくは全ての種類を含むことができる。
【００６４】
好ましくは、本発明の組成物はキットの形態である。このようなキットにおいては、上記の各ポリペプチドに特異的に結合可能な抗体またはその断片を、それぞれ個別に、あるいは適宜混合して混合物として、個別の容器（例えばバイアルなど）に入れて包装することができる。抗体またはその断片は、固相担体に結合されていてもよいしまたは遊離の形態でもよく、固相担体に結合される場合、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ラテックス、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス、磁性体等の材質からなるマルチウエルプレート、ビーズ、試験管、スティック、試験片などの形状の固相担体上に抗体またはその断片を付着または結合させてもよい。
【００６５】
本発明で使用される抗体またはその断片には、必要に応じてラベル、例えば蛍光団、酵素、放射性同位元素などを結合させてもよいし、あるいは二次抗体にこのようなラベルを結合してもよい。
【００６６】
蛍光団には、例えばフレオロレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシルクロリドとその誘導体、ウンベリフェロンなどが含まれる。
【００６７】
酵素には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素、アミラーゼなどが含まれる。
【００６８】
放射性同位元素には、例えばヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、リン（３２Ｐ）、イオウ（３５Ｓ）、金属類（例えば６８Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇｅ、５４Ｍｎ、９９Ｍｏ、９９Ｔｃ、１３３Ｘｅなど）、トリチウムなどが含まれる。
【００６９】
その他のラベルには、例えばＮＡＤＨ−、ＦＭＮＨ２−、アクリジニウムエステル、ルミノールなどの発光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリンなどの生物発光物質などが含まれる。
【００７０】
また、必要に応じて、アビジン−ビオチン系またはストレプトアビジン−ビオチン系を利用することも可能であり、この場合、本発明の抗体またはその断片に例えばビオチンを結合することもできる。
【００７１】
本発明のキットは、標識二次抗体、担体、洗浄バッファー、試料希釈液、酵素基質、反応停止液、精製された標準物質としてのマーカーポリペプチド、使用説明書、等をさらに含むことができる。
【００７２】
＜大腸癌の検出＞
本発明によれば、上記大腸癌マーカーと結合可能な物質を用いて、被験者由来の生体試料中の配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片、好ましくはそのうちの１つまたは複数について、その量または存在を調べることを含む方法によって、大腸癌を検出することができる。本発明の方法によって、被験者の生体試料中に配列番号１〜３で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片が検出されるか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に高いと判定されるとき、あるいは配列番号４〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片が検出されないか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に低いと判定されるときには、被験者は大腸癌に罹患していると診断しうる。
【００７３】
また、より好ましくは、配列番号１〜１６で表されるポリペプチドの断片であり、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片、のいずれか１つまたは複数について、その量または存在を調べることを含む方法によって、大腸癌を検出することができる。本発明の方法によって、被験者の生体試料中に配列番号１７〜１９で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片が検出されるか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に高いと判定されるとき、あるいは配列番号２０〜３８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片が検出されないか、又は対照と比べてそれらのポリペプチド、その変異体またはその断片の発現量が有意に低いと判定されるときには、被験者は大腸癌に罹患していると診断しうる。
【００７４】
本発明の方法では、上記大腸癌マーカーの検出は、単一のマーカーでもよいが、好ましくは複数、例えば２以上、３以上、４以上、５以上から３６、３７または３８以下のマーカーについて行うのがよい。これは、予期せぬ非特異的複合体の検出、言い換えれば誤診、を回避するためである。また、本発明における大腸癌マーカーを、当業者に知られている他の癌の診断マーカーと組合せて利用してもよい。
【００７５】
本発明の組成物は、大腸癌の診断、判定又は検出、すなわち罹患の有無や罹患の程度の診断、のために有用である。大腸癌の診断においては、正常組織（または細胞）、非癌組織（または細胞）、正常体液などの対照との比較を行い、被験者の生体試料中の上記大腸癌マーカーの存在または量を検出し、その存在または量の差が有意であれば、被験者について大腸癌の罹患が疑われる。
【００７６】
本発明方法で用いられる検体試料としては、例えば大腸組織、その周辺組織、大腸細胞、あるいは体液、例えば血液、血清、血漿、大腸液、尿などである。被験者の生体組織は、バイオプシーなどで採取するか、もしくは手術によって得ることができる。
【００７７】
本発明において、被験者とは、ヒトを含む哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００７８】
上記大腸癌マーカーと結合可能な物質は、例えば上記抗体またはその断片、アプタマー、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ社商標）、それぞれの大腸癌マーカーの受容体、それぞれの大腸癌マーカーの特異的作用阻害物質、それぞれの大腸癌マーカーの特的作用活性化物質などを含み、好ましくは抗体もしくはその断片、またはそれらの化学修飾誘導体である。
【００７９】
本発明の実施形態において、測定は、慣用の酵素又は蛍光団で必要により標識した抗体又は断片と、組織切片又はホモゲナイズした組織または体液とを接触させる工程、抗原−抗体複合体を定性的に又は定量的に測定する工程を含むことができる。検出は、例えば免疫電顕により標的ポリペプチドの存在とレベルを測定する方法、酵素抗体法(例えばＥＬＩＳＡ)、蛍光抗体法、放射性免疫測定法、均一法、不均一法、固相法、サンドイッチ法などの慣用法によって標的ポリペプチドの存在またはレベルを測定する方法などによって行うことができる。さらにまた、本発明においては、本発明の抗体と、試料中の標的ポリペプチドとの反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、または標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の検出方法については、感度の点で、後者の間接的検出を利用することが好ましい。
【００８０】
上記の大腸癌マーカーの種類に応じて、被験者から得られた体液または大腸癌組織もしくは細胞、好ましくは血液、において、標的ポリペプチドが存在あるいは消失している場合、あるいは対照と比較して標的ポリペプチドのレベルが有意に増大または減少している場合、大腸癌であると決定する。ここで、「有意に」とは、統計学的有意差があることを意味する。
【００８１】
免疫学的方法に代わる測定方法として、質量分析法を用いる方法が含まれる。この方法は、具体的には実施例に記載される手法で行うことができる。すなわち、生物試料、例えば血清または血漿をフィルターでろ過して夾雑物を除き、緩衝液（例えばｐＨ約８）で希釈して約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整したのち、分子量５万以上のタンパク質を除去可能な中空糸フィルター（下記参考例（１））または遠心型平膜フィルターを通して分子量分画し、画分をプロテアーゼ（例えばトリプシン）で処理してペプチド化し、これを質量分析計（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、またはエレクトロスプレーイオン化法を利用したタイプ）に掛けて、目的のポリペプチド由来の特定ピークの質量／荷電数と強度に基づいて、大腸癌摘出手術前の患者と健常人の間における試料中のポリペプチドの存在量の差異を測定することができる。
【実施例】
【００８２】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、この実施例によって制限されないものとする。
＜参考例＞
（１）中空糸フィルターの作製
分画分子量約５万の孔径を膜表面に有するポリスルホン中空糸を１００本束ね、中空糸中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管に固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュール（モジュールＡ）は血清または血漿中の高分子量タンパク質の除去に用いられ、その直径は約７ｍｍ、長さは約１７ｃｍである。同様に低分子量タンパク質の濃縮に用いられるミニモジュール（モジュールＢ）を分画分子量約３千の孔径の膜を用いて作成した。ミニモジュールは片端に中空糸内腔に連結する入口があり、反対側の端は出口となる。中空糸入口と出口はシリコンチューブによる閉鎖循環系流路であり、この流路内を液体がペリスタポンプに駆動されて循環する。また、中空糸外套のガラス管には、中空糸から漏出してきた液体を排出するポートを備え、１つモジュールセットが構成される。流路途中にＴ字のコネクターによって、モジュールを連結し、モジュールＡ３本と、モジュールＢ１本をタンデムに連結してひとつの中空糸フィルターとした。この中空糸フィルターを蒸留水にて洗浄し、ＰＢＳ（０．１５ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）水溶液を充填した。分画原料の血清または血漿は該中空糸フィルターの流路入口から注入され、分画・濃縮後に流路出口から排出される。該中空糸フィルターに注入された血清または血漿は、モジュールＡ毎に分子量約5万で分子篩いがかかり、分子量５万よりも低分子の成分はモジュールＢで濃縮され、調製されるようになっている。
【００８３】
＜実施例１＞
（１）健常人および大腸癌患者血漿のタンパク質同定
５０〜７０歳代の摘出手術前の大腸癌患者１９名、および同年代の健常人８名からＥＤＴＡ血漿を得て、それぞれの血漿について測定を行った。血漿をポアサイズ０．２２μｍのフィルターでろ過して夾雑物質を取り除き、タンパク質濃度５０ｍｇ／ｍＬとなるように調整した。この血漿をさらに２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）１２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、参考例（１）に示した中空糸フィルターによって分子量による分画を行った。分画後の血漿サンプル（全量１．８ｍＬ、最大２５０μｇのタンパク質を含む）をＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ(登録商標)ＰＦ２Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）逆相クロマトグラフィーで７分画に分離し、それぞれのフラクションを凍結乾燥した後、１００μＬの２５ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液（ｐＨ８．０）に再溶解した。このサンプルについて、総タンパク質の５０分の１量のトリプシンで３７℃、２〜３時間の条件で消化し、ペプチド化を行った。各分画のペプチドをさらにイオン交換カラム（ＫＹＡテクノロジーズ）によって４分画化した。その各々の分画を、逆相カラム（ＫＹＡテクノロジーズ）でさらに分画し、溶出されてきたペプチドについて、オンラインで連結された質量分析計Ｑ−ＴＯＦ Ｕｌｔｉｍａ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）を用いて、サーベイスキャンモードで測定した。
【００８４】
当該分野においては通常、測定を行う際に標準物質を用いることによって質量／電荷比の補正を行うが、さらに本発明における解析では、さらにそれに加えて、通常血液タンパク質として必ず検出されるアルブミン、α−フィブリノーゲンなどのいくつかのタンパク質を内部標準とし、それらのタンパク質の理論質量の値を用いて、測定データの再補正を行うことで、データのさらなる精密化を図った。そのようにして精密化を行ったデータについて、タンパク質解析ソフトＭＡＳＣＯＴを用いて、データの解析を行った。血液タンパク質を同定する基準として、(i)そのタンパク質に属するペプチドのうち、少なくとも一本以上がＭｏｗｓｅスコア３４以上の高い信頼性をもって検出されていること、(ii)ペプチドのＭＳデータの測定値およびＭＳ／ＭＳデータの測定値と、ペプチドの理論値との誤差が０．０３ダルトン以下であること、という二つの基準を用い、誤ったタンパク質同定を極力排除できる条件での解析を行った。
【００８５】
（２）大腸癌患者の癌摘出手術前血漿において健常人の血漿と比べ検出人数が増加または減少したタンパク質
このデータを健常人と癌患者間で比較し、同定されたタンパク質のうち、３人以上の大腸癌患者で検出され、健常人では全く検出されていないタンパク質を健常人と比べ大腸癌摘出手術前の患者の血漿中でその発現が有意に増強するタンパク質として見いだした。これらのタンパク質は、下記表３に示した配列番号１〜３で表されるポリペプチドである。また、同定されたタンパク質のうち、健常人における検出人数が、大腸癌患者における検出人数よりも３人以上多いタンパク質を健常人と比べ大腸癌摘出手術前の患者の血漿中でその発現が有意に減少するタンパク質として見いだした。これらのタンパク質は、下記表３に示した配列番号４〜１６で表されるポリペプチドである。従って、これらの配列番号１〜１６で表されるポリペプチドは大腸癌マーカーとして大腸癌の検出において有用であることが判明した。
【００８６】
【表３】
【００８７】
（３）大腸癌患者の癌摘出手術前血漿において健常人の血漿と比べＭＳピーク強度が増加または減少したタンパク質
さらに、上記（２）において同定されたタンパク質に属するペプチドについて、その検出時におけるＭＳピーク強度を解析した。このＭＳピーク強度は、厳密には定量的なものではないが、タンパク質の存在量をある程度反映した数値であり、ＭＳピーク強度を用いた定量的な比較解析が可能であることは、当業者において周知である。それぞれのペプチドの検出時におけるＭＳピーク強度を健常人と癌患者間で比較し、検出されたペプチドのうち、大腸癌患者群におけるピーク強度が、健常人のそれと比較して有意に大きいペプチドを、健常人と比べ大腸癌摘出手術前の患者の血漿中でその存在量が有意に増加するペプチドとして見いだした。これらのペプチドは配列番号１７〜１９のいずれかで表されるポリペプチドであり、配列番号１、３、４で表されるポリペプチドのうちの、いずれか一つの断片である。また同様に、検出されたペプチドのうち、大腸癌患者群におけるピーク強度が、健常人のそれと比較して有意に小さいタンパク質を、健常人と比べ大腸癌摘出手術前の患者の血漿中でその存在量が有意に減少するペプチドとして見いだした。これらのペプチドは配列番号２０〜３８で表されるポリペプチドであり、これらのペプチドは配列番号５〜７、９〜１５で表されるポリペプチドのうちの、いずれか一つの断片である。従って、これらの配列番号１７〜３８で表されるポリペプチド、およびそれらを内部に持つ断片は大腸癌マーカーとして大腸癌の検出において有用であることが判明した。これらの配列番号１７〜３８で表されるポリペプチド断片を、それぞれ遺伝子名、配列番号１、３〜７、９〜１５で表される配列のどの部位の断片であるか、ペプチド長、アミノ酸配列（一文字表記）と共に表４に示す。また、配列番号１７〜３８で表されるポリペプチド断片の大腸癌患者および健常人におけるＭＳピーク強度を図１〜７に示す。各配列の大腸癌患者および健常人のＭＳピーク強度上の数字は各個人の番号を示す。
【００８８】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、特異性および感受性に優れた、大腸癌の診断または検出のための組成物を提供することができるため、特に製薬および医薬産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】本発明における配列番号１７〜１９で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図２】本発明における配列番号２０〜２２で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図３】本発明における配列番号２３〜２６で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図４】本発明における配列番号２７〜２９で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図５】本発明における配列番号３０〜３２で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図６】本発明における配列番号３３〜３５で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【図７】本発明における配列番号３６〜３８で表されるポリペプチドのＭＳピーク強度を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の生体試料中の配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片のいずれか１つまたは複数を測定することを含む、大腸癌をインビトロで検出する方法。
【請求項２】
前記断片が、配列番号１〜１６のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の量またはその存在を測定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の量が、対照試料のものと比べて有意に増大しているか、あるいは有意に減少していることを指標にする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の測定が免疫学的方法によるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定が、前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と結合可能な物質を用いて行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記結合可能な物質が抗体またはその断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が標識されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、前記試料中の該ポリペプチド、その変異体またはその断片のうちの１つまたは複数の量または存在を免疫学的に測定し、該ポリペプチド、その変異体またはその断片の量が対照試料のものと比べて増大あるいは減少していることを指標にするか、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片が前記試料または対照試料のいずれか一方にのみ存在していること、を指標にして大腸癌を検出することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が血液、血漿、血清または尿である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が大腸由来の組織または細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその断片またはそれらの化学修飾誘導体のうちの１つまたは複数を含む、大腸癌の診断または検出のための組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドの断片が、配列番号１〜１６のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドの断片が、少なくとも７個のアミノ酸からなるエピトープを含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
キットの形態である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物の、被験者における大腸癌のインビトロ検出のための使用方法。
【請求項１】
被験者由来の生体試料中の配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片のいずれか１つまたは複数を測定することを含む、大腸癌をインビトロで検出する方法。
【請求項２】
前記断片が、配列番号１〜１６のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の量またはその存在を測定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の量が、対照試料のものと比べて有意に増大しているか、あるいは有意に減少していることを指標にする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチド、その変異体またはその断片の測定が免疫学的方法によるものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定が、前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と結合可能な物質を用いて行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記結合可能な物質が抗体またはその断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が標識されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチド、その変異体またはその断片と特異的に結合する抗体またはその断片を用いて、前記試料中の該ポリペプチド、その変異体またはその断片のうちの１つまたは複数の量または存在を免疫学的に測定し、該ポリペプチド、その変異体またはその断片の量が対照試料のものと比べて増大あるいは減少していることを指標にするか、あるいは該ポリペプチド、その変異体またはその断片が前記試料または対照試料のいずれか一方にのみ存在していること、を指標にして大腸癌を検出することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が血液、血漿、血清または尿である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が大腸由来の組織または細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号１〜１６で表されるポリペプチド、その変異体またはその断片の少なくとも１つと特異的に結合する、抗体もしくはその断片またはそれらの化学修飾誘導体のうちの１つまたは複数を含む、大腸癌の診断または検出のための組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドの断片が、配列番号１〜１６のいずれかで表されるポリペプチドのアミノ酸配列において、それぞれ配列番号１７〜３８のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドの断片が、少なくとも７個のアミノ酸からなるエピトープを含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
キットの形態である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物の、被験者における大腸癌のインビトロ検出のための使用方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−１６８６８６（Ｐ２００９−１６８６８６Ａ）
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８４２４（Ｐ２００８−８４２４）
【出願日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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