大腸癌抑制遺伝子関連蛋白質
【課題】大腸癌抑制遺伝子ＡＰＣに関与する新規物質を見いだし、ＡＰＣの制御を可能にし、大腸癌を制御すること。
【解決手段】ＡＰＣ遺伝子産物、特に該遺伝子産物のアルマジロリピート（Ａｒｍ）部位との結合能をもつ新規蛋白質Ｍ１、すなわち配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び該ポリペプチドの一部を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むベクター、該ベクターを有する形質転換体、当該ポリペプチドに対する抗体、当該ポリペプチドの製造法、上記のものを利用したＭ１の機能および発現の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニング方法、該方法で同定された化合物を提供し、更にこれらを利用し、大腸腫瘍に用いる医薬組成物・診断手段を提供する。
【解決手段】ＡＰＣ遺伝子産物、特に該遺伝子産物のアルマジロリピート（Ａｒｍ）部位との結合能をもつ新規蛋白質Ｍ１、すなわち配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び該ポリペプチドの一部を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むベクター、該ベクターを有する形質転換体、当該ポリペプチドに対する抗体、当該ポリペプチドの製造法、上記のものを利用したＭ１の機能および発現の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニング方法、該方法で同定された化合物を提供し、更にこれらを利用し、大腸腫瘍に用いる医薬組成物・診断手段を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌に関与する癌抑制遺伝子（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ：ＡＰＣ）がコードするポリペプチドに対する結合能、特にＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合能を有する新規な蛋白質（以下、Ｍ１と呼称する）およびポリペプチドに関するものである。さらに詳しくは、新規蛋白質Ｍ１のアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を使ったペプチドまたはポリペプチドの製造方法、該ペプチドまたはポリペプチドに対する抗体、これらを利用した化合物のスクリーニング方法、該スクリーニングされた化合物、該ポリペプチド若しくは該ポリヌクレオチドに作用する活性阻害化合物または活性賦活化合物、これらに関係する医薬組成物、およびこれらに関係する疾病診断手段に関係する。
【背景技術】
【０００２】
癌抑制遺伝子ＡＰＣは、家族性腺腫性ポリポーシス（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ：ＦＡＰ）の原因遺伝子として単離され、散発性の大腸癌の７０〜８０％では、該ＡＰＣの異常が報告されている。ＡＰＣ遺伝子産物は、２，８４３個のアミノ酸からなる３００ｋＤａの巨大な蛋白質である（Ｃｅｌｌ，８７：１５９−１７０，１９９６）。ＡＰＣ遺伝子産物は、種々の蛋白質との相互作用が知られており、その１つにβ−カテニンがある。β−カテニンは、カドヘリンの細胞質側ドメインに結合して細胞接着に役割を果たすと同時に、発生過程や腫瘍形成において重要な役割を担うＷｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル伝達経路の重要な構成要素の１つとしても機能している（Ｃｅｌｌ，８６：３９１−３９９，１９９６）（Ｎａｔｕｒｅ，３８２：６３８−６４２，１９９６）。β−カテニンは、一種の癌遺伝子産物で、ＡＰＣ遺伝子産物は、β−カテニンの機能を抑制することにより癌抑制機能を発揮していると考えられている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７８４−１７８７，１９９７）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７８７−１７９０，１９９７）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７９０−１７９２，１９９７）。その他、ＡＰＣ遺伝子産物は、ＧＳＫ−３ｂ、Ａｘｉｎもしくはコンダクチン／Ａｘｉｌとの相互作用が知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：５９６−５９９，１９９８）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：５７３−５８１，１９９８）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１０８２３−１０８２６，１９９８）（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，６：３９５−４０３，１９９８）。また、ＡＰＣ遺伝子産物は、ＥＢ１とｈＤＬＧとの、そのＣ末端を介した相互作用も報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：１０２０−１０２３，１９９６）。さらに、ＡＰＣ遺伝子産物には、蛋白質間の相互作用の役割を担うアルマジロリピートドメインが存在することも知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、上記のように多様な物質との相互作用を担う大腸癌の癌抑制遺伝子であるＡＰＣ遺伝子に関与する新規物質を見いだすことであり、該新規物質を癌の制御を目的とする手段として使用することである。より具体的には、本発明の課題はＡＰＣ遺伝子産物との結合能、特にＡＰＣ遺伝子産物由来のアルマジロリピートドメインとの結合能、をもつ新規な物質（Ｍ１）を提供することであり、それに伴い有用性ある新規物質（Ｍ１）由来のポリペプチドを提供することである。また本発明の別の課題は、Ｍ１由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、遺伝子工学手法による、Ｍ１由来のポリペプチドの製造法を提供することである。さらに本発明の別の課題は、Ｍ１由来のポリペプチドに対する抗体を提供することである。その他の本発明の課題は、上記のものを利用してＭ１の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニングをおこなうことであり、スクリーニングされた化合物を提供することであり、またこれらを利用した大腸腫瘍に用いる医薬組成物・診断手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
課題解決のため、本発明者は、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメイン（以下、ａｒｍと呼称することもある）に結合する新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡを２ハイブリッドスクリーニング法を用いて同定し、その塩基配列および該新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を決定し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は下記の群より選ばれるポリペプチド；（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、（２）前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（３）前記（１）のポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有しかつ大腸癌の癌抑制遺伝子（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ：ＡＰＣ）の遺伝子産物のアルマジロリピート部位をコードするポリペプチドに対する結合能を有するポリペプチド、および（４）前記（１）から（３）のポリペプチドのアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、かつＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合能を有するポリペプチド；配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸配列を有し、かつＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合能を有するポリペプチド；本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖；本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド；本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖の塩基配列のうち少なくとも１５個の連続した塩基配列で示されるポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドの転写によって発現されるポリペプチドがＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合能を有する、ポリヌクレオチド；本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；本発明の組換えベクターで形質転換された形質転換体；本発明の形質転換体を培養する工程を含む、本発明のポリペプチドの製造方法；本発明のポリペプチドのＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合性を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であって、本発明のポリペプチド、本発明の抗体のうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法；本発明のポリヌクレオチドと相互作用して該ポリヌクレオチドの発現を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であって、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の形質転換体、本発明の抗体のうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法；本発明のポリペプチドのＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子：Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ）活性を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であって、本発明のポリペプチド、本発明の抗体のうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法；本発明のスクリーニング方法でスクリーニングされる化合物；本発明のポリペプチドのＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合性を阻害もしくは増強する化合物；本発明のポリヌクレオチドと相互作用して該ポリヌクレオチドの発現を阻害もしくは増強する化合物；本発明のポリペプチドのＧＥＦ活性を阻害もしくは増強する化合物；本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の形質転換体、本発明の抗体、または本発明の化合物のうち少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする大腸腫瘍の治療に用いる医薬組成物；本発明のポリペプチドの発現または活性に関連した疾病の診断手段であって、試料中の（ａ）該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、および／または（ｂ）該ポリペプチド、をマーカーとして分析することを含む診断手段、を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
以上説明したように本発明のＭ１は、新規蛋白質であり、そのＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位との結合性が特徴的で、ＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子：Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ）活性を有する。この特性を利用した新規医薬組成物、診療手段の提供は、ＡＰＣ遺伝子産物関連の臨床・基礎の医用領域において大きな有用性を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１−Ａ】新規蛋白質Ｍ１のアミノ酸配列の特徴および相同ドメインの配列比較を説明する図である。（Ａ）ヒトＭ１の推定アミノ酸配列。ＳＨ３ドメインは太字、ＤＨドメインは囲み太字、ＰＨドメインは太字かつ下線で表示する。
【図１−Ｂ】（Ｂ）Ｍ１と、Ｄｂｌファミリーのサブファミリーメンバー；ＫＩＡＡ０４２４、Ｄｂｌ、Ｔｉａｍ−１、Ｖａｖ、ｐ１１５−ＲｈｏＧＥＦ、ＣＤＣ２４およびＳｏｓ１との比較。ＤＨドメインの相同性はＭ１のＤＨドメインとほかのタンパクのＤＨドメインとの対応比較における同一性／相同性の割合として計算した。
【図１−Ｃ】（Ｃ）ＤＨドメインのアミノ酸配列表。Ｍ１、ＫＩＡＡ０４２４、Ｄｂｌ、Ｔｉａｍ−１、Ｖａｖ、ｐ１１５−ＲｈｏＧＥＦ、ＣＤＣ２４およびＳｏｓ１のＤＨドメインを並列し、さらに最適化した。同一アミノ酸は白抜き文字で示す。（Ｄ）ＰＨドメインのアミノ酸配列表。Ｍ１と他のＧＥＦ蛋白質および基準となるヒトプレクストリン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）に存在するＰＨドメインを並列した。同一アミノ酸は白抜き文字で示す。
【図２】新規蛋白質Ｍ１の発現を、ラット胎児脳、およびＭ１ｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞で確認した図面である。図中、レーン１、２はラット胎児脳、レーン３〜９は形質転換したＣＯＳ−７細胞でのＭ１発現を示し、形質転換のためのベクターとして、レーン３と４はＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、レーン５はコントロールベクター、レーン６と８はＨＡ−タグで標識したＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、レーン７と９はＨＡ−タグを組み込んだコントロールベクターを使用した。また、レーン１、３、５は、予め抗Ｍ１抗体を対応する抗原であるＭ１ペプチドで吸収して（ｐｅｐ．＋）用いた結果である。
【図３】新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物とのｉｎ ｖｉｖｏでの結合をラット胎児脳溶解物について解析した結果を示す図面である。図中、レーン１および２はラット胎児脳の溶解物を抗Ｍ１抗体で、レーン３および４は抗ＡＰＣ抗体で、レーン５および６は抗β−カテニン抗体で免疫沈降した結果、レーン１、３、５は、予め各抗体を対応する抗原で吸収して（ｐｅｐ．＋）用いた結果である。
【図４】新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物との結合部位を説明する図である。＋はＡＰＣ遺伝子産物との結合活性陽性、−は陰性を表す。＊はＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロ配列をベイトとした２ハイブリッドスクリーニングで得られたクローンを示す。
【図５】新規蛋白質Ｍ１とＲｈｏファミリー低分子量Ｇ蛋白質との結合を示す図面である。
【図６−Ａ】新規蛋白質Ｍ１の低分子量Ｇ蛋白質からのＧＤＰ解離に対する促進作用を示す図であり、低分子量Ｇ蛋白質Ｒａｃ１に対する作用を示す。
【図６−Ｂ】新規蛋白質Ｍ１の低分子量Ｇ蛋白質からのＧＤＰ解離に対する促進作用を示す図であり、低分子量Ｇ蛋白質ＲｈｏＡに対する作用を示す。
【図７−Ａ】新規蛋白質Ｍ１の低分子量Ｇ蛋白質へのＧＴＰ結合に対する促進作用を示す図であり、低分子量Ｇ蛋白質Ｒａｃ１に対する作用を示す。
【図７−Ｂ】新規蛋白質Ｍ１の低分子量Ｇ蛋白質へのＧＴＰ結合に対する促進作用を示す図であり、低分子量Ｇ蛋白質ＲｈｏＡに対する作用を示す。
【図８】新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ活性が、ＡＰＣ−アルマジロドメインの添加により増強されることを示す図である。
【図９】新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物とが、それらを発現した上皮細胞株中の細胞の辺縁の同一部位に存在することを示す図面である。図中、ａ、ｂはＨＡ−タグで標識したＭ１蛋白質を発現させた同一細胞、ｃ、ｄはＨＡ−タグで標識したＭ１蛋白質とＭｙｃ−タグで標識したＡＰＣ−ａｒｍとを両方発現させた同一細胞、ｅはＨＡ−タグで標識したＭ１△ＮＢ（アミノ酸１２７−６１９）を発現させた細胞、ｆはＭｙｃ−タグで標識したＡＰＣ−ａｒｍを発現させた細胞である。また、ａ、ｂは抗ＨＡ抗体と抗ＡＰＣ抗体で二重染色し、ｃ、ｄは抗ＨＡ抗体と抗Ｍｙｃ抗体で二重染色し、ｅは抗ＨＡ抗体で、ｆは抗Ｍｙｃ抗体で処理したものである。ｂ中の矢印頭は、ＡＰＣ蛋白質のクラスターの存在を示しており、また、ａ〜ｄ中の矢印は、Ｍ１とＡＰＣの存在を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（新規Ｍ１）
本発明において提供される新規蛋白質Ｍ１をコードするポリヌクレオチドは、ヒトの胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインを使い、２ハイブリッドスクリーニング法により、新規なアミノ酸配列を有する物質として、そのｃＤＮＡが取得されたものである。本発明の新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡは、６１９個のアミノ酸からなる蛋白質をコードし、既知のＤｂｌファミリー（低分子量Ｇ蛋白質Ｒｈｏファミリーに作用するＧＤＰ解離促進蛋白質の１つである）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：２１６−２２２，１９９６）に類似のドメイン構造を有していた。遺伝子データベース（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を検索したところ、本発明の新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡは、Ｄｂｌファミリーの１つである既知物質ＫＩＡＡ０４２４と約７３％の相同性を有することが判明した。ＫＩＡＡ０４２４は、本発明の新規蛋白質Ｍ１とは、該Ｍ１のＮ末端領域を欠如する点に最も大きな差異を有する。両者は、Ｄｂｌ相同（ＤＨ）ドメイン、プレックストリン（Ｐｒｅｃｋｓｔｒｉｎ）相同（ＰＨ）ドメイン、Ｓｒｃ相同３（ＳＨ３）ドメインを担持する点において同一である。また、マウスを用いた新規蛋白質Ｍ１の組織分布研究において、該Ｍ１のｍＲＮＡが脳に高レベルで発現しており、他の臓器でも低レベルで発現していることを確認した。
【０００９】
新規蛋白質Ｍ１のペプチド断片（配列表、配列番号１のアミノ酸７３〜１２６）を使用して作製した抗体は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として得た新規蛋白質Ｍ１に対し強い反応性を示した。また、該作製した抗体を用い、脳に存在する新規物質Ｍ１が、約８５ｋＤａの蛋白質であることを抗原抗体反応を利用した測定系で確認した。
【００１０】
また、新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物との直接的な相互作用を確認するための実験において、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として得たＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメイン（ＡＰＣ−ａｒｍ）は、ＧＳＴ融合Ｍ１断片（ＧＳＴ−Ｍ１−Ｍ）と相互作用したが、ＧＳＴ単独とは反応せず、同様に、Ｍ１−Ｍは、ＧＳＴ−ＡＰＣ−ａｒｍとは反応したが、ＧＳＴ融合β−カテニンのアルマジロリピートドメイン又はＧＳＴ単独とは反応しないことを確認した。すなわち、新規蛋白質Ｍ１はＡＰＣ遺伝子産物と、該ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインを介して結合していると推定される。また、ラット胎児脳の溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を抗ＡＰＣ抗体で免疫沈降し、ついで抗Ｍ１抗体でイムノブロットすることにより、ＡＰＣ遺伝子産物と本発明のＭ１が共沈殿することが判明した。この反応において、抗Ｍ１抗体を、抗原性を保持するＭ１断片で前処理すると、Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物の共沈殿が阻害された。すなわち、Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物とは生体内で結合していると考えられる。また、Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物の結合部位を２ハイブリッド法を用いて確認したところ、少なくともＭ１のアミノ酸７３〜１２６で示される領域に結合部位が存在することが推定された。このことは、Ｍ１のＳＨ３ドメインの上流域に、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合部位が存在することを意味する。ＫＩＡＡ０４２４は、このような領域をもたないので、ＡＰＣ遺伝子産物との反応性がない。
【００１１】
さらに、新規蛋白質Ｍ１はその作用として、Ｒｈｏファミリーの１つであるＲａｃに特異的なＧＥＦ活性をもつことを確認した。つまり、新規蛋白質Ｍ１は、Ｒａｃに結合しＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進してＲａｃを活性化し、Ｒａｃの関与する細胞情報伝達の下流に位置するＮＦκＢ、ｃ−ｊｕｎ、ＳＲＥ等に作用する。また、Ｒａｃの生理機能である、細胞のラメリポディア（葉状仮足）や細胞膜のラッフリングを誘導する可能性もあり、細胞接着への関与が推定される。
【００１２】
ＡＰＣ遺伝子産物の細胞内局在については、細胞が大腸絨突起先端へクリプトから移動する際に、移動する細胞の微小管先端部位に集積していることが報告されている（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３４：１６５−１７９，１９９６）が、本発明の新規蛋白Ｍ１も同様の部位に集積していることを見出した。このことから、本発明の新規蛋白質Ｍ１が、大腸絨突起における細胞移動制御の鍵を握っている可能性がある。
【００１３】
（ポリペプチド）
本発明の新規蛋白質Ｍ１は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである。さらに本発明のポリペプチドは、この配列表の配列番号１に示すポリペプチドの部分配列を有するポリペプチドから選択される。その選択されるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すポリペプチドと、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％をこえる相同性を有する。この相同性をもつポリペプチドの選択は、例えばＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして行うことができる。
【００１４】
アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、推定されるポリヌクレオチドの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等を使用することができる。
【００１５】
本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの、部分配列を有するポリペプチドから選択されるアミノ酸配列を試薬・標準物質・免疫原として利用できる。その最小単位としては、少なくとも約５個以上、好ましくは少なくとも約８〜１０個以上、さらに好ましくは少なくとも約１１〜１５個以上のアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、免疫学的にスクリーニングしうるポリペプチドを本発明の対象とする。
【００１６】
さらに、このように特定されたポリペプチドをもとにして、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標とすることにより、１ないし数個のアミノ酸の欠失・置換・付加などの変異あるいは誘発変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも提供することができる。欠失・置換・付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９：６６６，１９８３）を利用することが出来る。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、それら自体で、新規蛋白質Ｍ１の機能を調節するための医薬組成物に使用できる。また、本発明のポリペプチドは、新規蛋白質Ｍ１の機能を調節しうる化合物、例えば、阻害剤、拮抗剤、賦活剤等を得るためのスクリーニングや、新規蛋白質Ｍ１に対する抗体の取得に用いることができる。さらに、本発明のポリペプチドは、試薬・標準品としても使用可能である。
【００１８】
（ポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号２のポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対する相補鎖、これらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドのうち少なくとも１５個の連続した塩基配列を有しかつコードするペプチドがＡＰＣ遺伝子産物のａｒｍドメインとの結合能を有するポリヌクレオチド、を意味する。ポリヌクレオチドとしてＤＮＡを代表例にとると、「ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」は、例えば前述のＭｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で ６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号２のポリヌクレオチドの情報から選択される相同鎖および相補鎖を意味し、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する少なくとも約１５〜２０個以上の配列からなるポリヌクレオチド配列及び該相補鎖を意味する。この有用なポリヌクレオチド配列の決定は、公知の蛋白質発現系、例えば無細胞蛋白質発現系を利用して簡易に発現蛋白質の確認を行い、その生理活性特にＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして選別することにより行うことができる。無細胞蛋白質発現系としては、例えば胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる（Ｎａｔｕｒｅ、１７９、１６０〜１６１、１９５７）。
【００２０】
これらのポリヌクレオチドは、いずれも本発明の新規蛋白質Ｍ１および本発明のポリペプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、これらをコードする遺伝子等の核酸、またはｍＲＮＡ検出のためのプローブもしくはプライマーとして、あるいは遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴマーとして使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドをアンチセンスとして使用する場合、他の既知蛋白質、例えばＤｂｌファミリーの１つであるＫＩＡＡ０４２４等、とのコンセンサス配列領域以外の新規蛋白質Ｍ１に固有な領域のヌクレオチド配列を用いることにより、Ｍ１の発現が特異的に阻害される。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、核酸に関する試薬・標準品としても利用できる。
【００２１】
（形質転換体）
上記のような無細胞蛋白質発現系以外にも、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によって、本発明からなる新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを提供可能である。本発明の具体例においては、ＣＯＳ−７細胞を利用したが、無論これに限定されるものではない。
【００２２】
形質転換は、自体公知の手段を応用することができ、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換を行う。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法があげられるが、簡便には核外遺伝子を用いた自律複製系を利用する。ベクターは、宿主の種類により選択され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。構成要素は宿主が原核細胞か真核細胞かによって選択し、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等を自体公知の方法によって組合せて使用する。
【００２３】
形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養することにより、本発明のポリペプチドの製造に用いることができる。培養は、発現産生される新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドの生理活性、特にＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして行ってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチによって行う。
【００２４】
（新規蛋白質Ｍ１およびその由来物の回収）
培地からの新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドの回収は、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を組合せるか、溶解度差にもとづく硫安、アルコール等の分画手段によっても精製回収できる。より好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列に対する抗体を作成し、ポリクローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。
【００２５】
（抗体）
抗体は、本発明の新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドの抗原決定基を選別し、作成する。抗原決定基は、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸で構成される。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号１と相同である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位であればよく、露出部位が不連続部位であれば、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であることも有効である。実施例では、アミノ酸配列の７３位〜１２６位の断片を免疫原として利用した。抗体は、免疫学的に新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを認識する限り特に限定されない。この認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定する。
【００２６】
抗体を産生するためには、本発明の新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に結合して、動物に対して体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行う。担体は、自身が宿主に対して有害作用をおこさなければ特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫する動物としては、マウス、ラット、兎、やぎ、馬等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得する。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法である。実施例においては、ＧＳＴ−Ｍ１を結合させたアフィニティークロマトグラフィーにより、抗Ｍ１抗体を精製した。
【００２７】
モノクロ−ナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞を回収し、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入することによって行われる。
【００２８】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、直接本発明からなる新規蛋白質Ｍ１と結合し、その活性を制御可能であり、ＡＰＣ遺伝子産物と新規蛋白質Ｍ１との相互作用系の制御を容易に行うことができる。そのため、ＡＰＣ遺伝子産物と新規蛋白質Ｍ１が関連する疾患の治療・予防のために有用である。
【００２９】
（スクリーニング）
かくして調製された新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、並びに新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数手段を組合せることによって、新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドとＡＰＣ遺伝子産物との結合性、新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ活性等の機能、または新規蛋白質Ｍ１の発現に対する阻害剤もしくは賦活剤のスクリーニングに有効な手段を提供する。すなわち、本発明のポリペプチド、本発明の抗体の少なくともいずれか１つを用いることで、本発明のポリペプチドとＡＰＣ遺伝子産物との結合性を阻害もしくは増強する化合物を得るためのスクリーニング方法が、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の形質転換体、本発明の抗体の少なくともいずれか１つを用いることで本発明のポリヌクレオチドと相互作用し該ポリヌクレオチドの発現を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法が、本発明のポリペプチド、本発明の抗体の少なくともいずれか１つを用いることで本発明のポリペプチドのＧＥＦ活性等の機能を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法が提供可能である。例えば、ポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質発現系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品スクリーニングシステムにおいて利用可能である。
【００３０】
（化合物、医薬組成物）
上記のスクリーニング方法で得られた化合物は、新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドとＡＰＣ遺伝子産物との相互作用、または新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ活性等の機能を調節する阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物として利用可能である。また、遺伝子レベルでの新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドの発現に対する阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物としても利用可能である。上記の阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物としては、蛋白質、ポリペプチド、抗原性を有さないポリペプチド、低分子化合物等が挙げられ、好ましくは低分子化合物である。
【００３１】
かくして選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、大腸腫瘍の治療に用いる医薬組成物として調製可能である。また、本発明からなる新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター並びに、新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それら自体が、新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物との相互作用に対する阻害・拮抗・賦活等の機能を有する、大腸腫瘍の治療に用いる医薬手段として使用できる。ここで、大腸腫瘍とは、良性腫瘍ならびに悪性腫瘍を含み、具体的には、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）および大腸癌が挙げられる。なお、製剤化にあたっては、自体公知のポリペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、抗体等、各対象に応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００３２】
本発明からなる新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター並びに、新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、本発明のポリペプチドの発現またはその活性が関連する疾患、例えば、本発明の新規蛋白質Ｍ１の発現またはＡＰＣ遺伝子産物との相互作用に関連した疾患等の診断手段として使用することができる。特に、大腸腫瘍の診断マーカーおよび／または試薬等の診断手段として有用である。診断は、新規蛋白質Ｍ１をコードしている核酸配列との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸配列の存在量を決定すること、および／または新規蛋白質Ｍ１について生体内分布を決定すること、および／または新規蛋白質Ｍ１の試料中での存在量を決定することによって行う。詳しくは、新規蛋白質Ｍ１を診断マーカーとして検定する。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、ＰＣＲ反応系等を利用すればよい。なお、ここで言う手段とは、目的達成のために使用する方法および／または媒体を意味する。すなわち、例えば、診断手段には、診断するための方法、診断に用いる試薬キットなどが含まれる。
【実施例１】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
（ｃＤＮＡのクローニング ）
ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメイン（以下、ＡＰＣ−ａｒｍと略称することもある）に対する結合能を有する蛋白質を得ることを目的として、２ハイブリッドスクリーニング（ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｓ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を行った。すなわち、ベイト（ｂａｉｔ）として、ヒトＡＰＣ遺伝子産物アルマジロリピートドメイン（アミノ酸残基４４６−８８０）を融合させたＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含有するプラスミドＧＢＴ９−ＡＰＣを用い、ヒト胎児脳（ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｂｒａｉｎ）ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を対象としてスクリーニングした。該ｃＤＮＡライブラリーとベイトとを、レポーター遺伝子としてｈｉｓ３とｌａｃＺとを導入した酵母にトランスフェクションし、β−ｇａｌアッセイおよびＨＩＳ栄養要求性を指標として、陽性クローンを検出した。
【００３４】
形質転換体１．１×１０７個から、１つの陽性クローンを得た。この得られたクローンから、該クローンで発現されているＡＰＣ−ａｒｍに結合するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンスにより決定したところ、新規な配列であった。得られたｃＤＮＡ断片の下流領域の配列は’Ｍａｒａｔｈｏｎ’−ｒｅａｄｙ ヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて３’ＲＡＣＥシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により取得した。プライマーは５’−ＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧ−３’を用いた。また上記で得られたｃＤＮＡ断片の配列の一部（配列表、配列番号２の塩基番号９７−２６９）をプローブとして、ヒトゲノムライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）について、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ；ＤＩＧ）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。その結果、配列表、配列番号２の塩基番号１−８１を含む２つのオーバーラップするクローンを得、目的とするＡＰＣ−ａｒｍに結合する蛋白質の完全長ｃＤＮＡの配列を決定した。
【００３５】
（アミノ酸配列）
上記方法で得られた、配列表の配列番号２に示すｃＤＮＡは新規な塩基配列を有していた。該ｃＤＮＡをもとに、その塩基配列の翻訳によって、新規蛋白質Ｍ１の推定アミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１に示すアミノ酸残基６１９の配列が得られた（図１Ａ）。
【００３６】
（既存蛋白質との相同性）
該新規蛋白質Ｍ１の推定アミノ酸配列を用いて、既存のｄａｔａｂａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ）に対してＢＬＡＳＴ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いた相同性検索を行ったところＤｂｌファミリーのサブファミリーメンバーの１つであるＫＩＡＡ０４２４と７３％の相同性を認めた（図２Ｂ、Ｃ）。両者は、Ｄｂｌ相同（Ｄｂｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ；ＤＨ）ドメイン、プレックストリン相同（Ｐｒｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ；ＰＨ）ドメイン、Ｓｒｃ相同３（ＳＨ３）ドメインを保持する点において同一であるが、ＫＩＡＡ０４２４には、新規蛋白質Ｍ１のＮ末端領域は存在しないことが判明した。この結果、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有する本発明の蛋白質Ｍ１は新規蛋白質であることが確認された。
【００３７】
（発現組織の確認）
次に配列表の配列番号１の推定アミノ酸配列で示される新規蛋白質Ｍ１の、ヒト組織における発現を、ノザンブロット解析により確認した。多種のヒト組織から得たｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをブロットしたフィルターをＣｌｏｎｔｅｃｈ社より入手し、ＤＩＧ標識したＭ１のｃＤＮＡプローブ、５’−ＧＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧ−３’および５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＡＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧ−３’でハイブリダイゼーションした。その結果、脳に高レベルで発現していることを確認した。また、ｔｉｓｓｕｅ ｂｌｏｔｓによる解析では、脳以外に、睾丸でも存在を確認した。さらに、腎由来の細胞でも発現を確認した。
【００３８】
（抗体の産生）
Ｍ１に対する抗体は、ＮＺＷウサギをＭ１のアミノ酸７３−１２６を含むペプチドを用いて公知の方法で免疫し調製した。ＡＰＣに対する抗体は、ＮＺＷウサギをＡＰＣ遺伝子産物（以下ＡＰＣと略称することもある）のアミノ酸１１２２−１７２９を含むペプチドを用いて公知の方法で免疫して調製した。ＡＰＣのＮ末端領域に対するマウスモノクローナル抗体は公知の方法で調製した（Ｍｉｙａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．１９９５）。抗体は、それぞれ免疫に用いた抗原を結合させたアフィニティーカラムを使用してアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製した。精製したウサギポリクローナル抗Ｍ１抗体とＧＳＴ融合Ｍ１（ＧＳＴ−Ｍ１）との結合反応性を調べたところ、得られた抗体は、ＧＳＴ−Ｍ１に強い反応性を示した。
【００３９】
（Ｍ１の発現）
本発明の新規蛋白質Ｍ１を発現させるために、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位にＭ１のｃＤＮＡを組み込み、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。新規蛋白質Ｍ１の発現確認のため、Ｍ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、コントロールベクター、ＨＡ−タグで標識したＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、ＨＡ−タグを組み込んだベクターを、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。培養した各形質転換体の溶解物、およびＭ１の存在が確認されているラット胎児脳の溶解物について、上記の様に取得した抗Ｍ１抗体、および抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、次いで抗Ｍ１抗体および抗ＨＡ抗体を用いてイムノブロットを行った。Ｍ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター（レーン３）、ＨＡ−タグで標識したＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター（レーン６、８）で形質転換したＣＯＳ−７細胞およびラット胎児脳（レーン１）では明らかに新規蛋白質の発現が認められ、その分子量は約８５ｋＤａであることが判明した（図２）。また、用いた抗Ｍ１抗体を抗原で事前処理しておく（図２中、ｐｅｐ．±で表示）と、新規蛋白質は検出されなかった。すなわち、抗Ｍ１抗体で認識される新規蛋白質Ｍ１が発現されたことが確認された。
【００４０】
（Ｍ１とＡＰＣとのｉｎ ｖｉｖｏにおける結合の解析）
ラット胎児脳溶解物について、上記で作製した新規蛋白質Ｍ１、およびＡＰＣに対するウサギポリクローナル抗体、ならびにβ−カテニンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各沈降物を分離後、各抗体を用いてイムノブロットを行った（図３）。レーン１および２はラット胎児脳の溶解物を抗Ｍ１抗体で、レーン３および４は抗ＡＰＣ抗体で、レーン５および６は抗β−カテニン抗体で免疫沈降した結果を、レーン１、３、５は、予め各抗体を対応する抗原で吸収して用いた結果（図３中、ｐｅｐ．±で表示）を示す。抗Ｍ１抗体で免疫沈降したＭ１が抗ＡＰＣ抗体もしくは抗β−カテニン抗体で検出され、抗ＡＰＣ抗体で免疫沈降したＡＰＣ遺伝子産物が抗Ｍ１抗体で検出され、抗β−カテニン抗体で免疫沈降したβ−カテニンが抗Ｍ１抗体で検出されることから、新規蛋白質Ｍ１はｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＡＰＣおよびβ−カテニンと結合していることが明らかとなった。
【００４１】
（Ｍ１とＡＰＣの相互作用部位の解析）
新規蛋白質Ｍ１の、ＡＰＣ結合ドメインの解析を行うため、Ｍ１の様々な欠失変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）を公知の方法で作製し、ＡＰＣとの結合領域を酵母（ｙｅａｓｔ）を用いた２ハイブリッドシステムにより調べた。具体的には、Ｍ１の欠失変異体を、下記の特異的なプライマーを用いＰＣＲを行って、ｐＧＡＤ４２４にクローニングし、ＧＡＬ４活性化ドメインとの融合体を作成した。
５’−ＡＴＴＴＡＴＴＧＴＡＧＴＴＴＡＣＣＡＡＧＧＡＣ−３’
５’−ＴＧＣＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＡＣ−３’
５’−ＧＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＧ−３’
５’−ＣＣＴＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧ−３’
５’−ＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＧＣＣＴＣＣＧＣ−３’
５’−ＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＣＣＣＧＣＧ−３’
５’−ＧＡＴＧＴＴＣＣＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＡＣＧ−３’
５’−ＡＴＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＣ−３’
ついで、該ＧＡＬ４活性化ドメインとの融合体を２ハイブリッドシステムにおいてＨＩＳ３ ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙとβ−ｇａｌ リポーター活性を用いて、その相互作用を試験した。その結果、図４に示すように、ＳＨ３の上流の領域にＡＰＣ結合部位が存在することが判明した。
【００４２】
（Ｍ１とＲｈｏファミリー低分子量Ｇ蛋白質との結合解析）
新規蛋白質Ｍ１は、Ｄｂｌファミリーのサブファミリーの１つであるＫＩＡＡ０４２４と高い相同性を有する。Ｄｂｌファミリーは低分子量Ｇ蛋白質の１つであるＲｈｏファミリーに作用するＧＤＰ解離促進蛋白質である。新規蛋白質Ｍ１と、ＫＩＡＡ０４２４との相同性に着目し、新規蛋白質Ｍ１の機能解析のため、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇ蛋白質（ｓｍａｌｌ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、ＣＤＣ４２）との結合を調べた。ニッケルビーズに吸着させた新規蛋白質Ｍ１をＲｈｏＡ、Ｒａｃ１およびＧＳＴ−ＣＤＣ４２と、０．１％ＮＰ−４０を含むＥ１Ａ緩衝液〔５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＦ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭＤＴＴ，５０μｇ／ｍＬ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ），１μｇ／ｍｌ ロイペプチン，１μｇ／ｍｌアプロチニン〕中で４℃にて１時間混合し、共沈殿物をイムノブロッティングで検出した。図５に示すように、陽性コントロールとして使用したＤｂｌは用いた全てのＲｈｏファミリー低分子量Ｇ蛋白質と結合するが、新規蛋白質Ｍ１はＲｈｏＡおよびＲａｃ１とは結合したが、ＣＤＣ４２とは結合しなかった。
【００４３】
（Ｍ１のＧＥＦ活性）
次に、新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ活性について検討した。低分子量Ｇ蛋白質からのＧＤＰ解離を調べるために使用する［３Ｈ］ＧＤＰ結合型の低分子量Ｇ蛋白質を、２ｐｍｏｌの各低分子量Ｇ蛋白質を０．２μＭ［３Ｈ］ＧＤＰと３０℃で２０分間、導入用緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ジチオスレイトール）中でインキュベートすることにより得た。低分子量Ｇ蛋白質からの［３Ｈ］ＧＤＰの解離を防ぐため、３７５ｍＭ ＭｇＣｌ２を終濃度が１８ｍＭとなるように加え、直ちに、該混合液を氷冷した。［３Ｈ］ＧＤＰの解離は、反応溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ジチオスレイトール）に２５０倍過剰の非標識ＧＤＰ、ＧＴＰおよびＭ１を加えることにより２５℃で行った（図６Ａ、Ｂ）。次に、低分子量Ｇ蛋白質へのＧＴＰの結合を調べるために使用するＧＤＰ結合型の低分子量Ｇ蛋白質を、２ｐｍｏｌの各低分子量Ｇ蛋白質を０．２μＭ非標識ＧＤＰと３０℃で２０分間、導入用緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中でインキュベートし、３７５ｍＭ ＭｇＣｌ２を終濃度が１８ｍＭとなるように加えることにより得た。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの、ＧＤＰ結合型低分子量Ｇ蛋白質への結合は、１０μＭの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳおよびＭ１を反応溶液に加えることにより、２５℃で実施した（図７Ａ、Ｂ）。解離試験、結合試験の両方において、反応は１ｍｌの氷冷した停止用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ ＮａＣｌ）を加えて、停止した。希釈した混合溶液をニトロセルロースろ紙で濾過し、フィルターを数回、停止用緩衝液で洗浄した。ろ紙上に捕捉された放射活性をカウントした。タンパク質濃度はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準蛋白質として用いて測定した。
【００４４】
図６に示すように、新規蛋白質Ｍ１は、結合しうる低分子量Ｇ蛋白質であるＲａｃ１に作用して、Ｒａｃ１からのＧＤＰ解離を促進したが（図６Ａ）、ＲｈｏＡには結合しないのでＲｈｏＡからのＧＤＰ解離には作用しなかった（図６Ｂ）。また、図７に示すように、新規蛋白質Ｍ１は、Ｒａｃ１へのＧＴＰ結合を促進した（図７Ａ）が、ＲｈｏＡへのＧＴＰ結合には影響しなかった（図７Ｂ）。すなわち、本発明の新規蛋白質Ｍ１は、低分子量Ｇ蛋白質に作用し、ＧＥＦ活性を有する。
【００４５】
（Ｍ１のＧＥＦ活性に対するＡＰＣの作用）
さらに、様々な濃度のＭ１について、ＡＰＣ−ａｒｍの存在下または非存在下で、２０ｎＭの［３Ｈ］ＧＤＰを結合させた結合型のＲａｃ１からの［３Ｈ］ＧＤＰ解離促進能を３０℃で１５分間インキュベーションして測定した。ＡＰＣ−ａｒｍはＭ１より過剰量、モル比で５倍となるように加えた。図８に示すように、Ｍ１のＧＤＰ解離促進能は、ＡＰＣ−ａｒｍの添加により、増強された。すなわち、Ｍ１は、ＡＰＣと結合することにより、ＧＤＰ解離促進能が増強されることが示唆された。
【００４６】
（Ｍ１の細胞内局在）
次に、本発明の新規蛋白質Ｍ１の細胞内局在について検討した。まず、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）上皮細胞株を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で培養した。全長のＭ１およびＭ１△ＮＢ（アミノ酸１２７−６１９）ｃＤＮＡはＣＭＶプロモーターを有する哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）中にサブクローン化した。プラスミドＤＮＡ、ｐＭＫＩＴＮｅｏ−Ｍｙｃタグで標識したＡＰＣ−ａｒｍは、ＡＰＣ（アミノ酸４４６−８８０）の部分配列をコードしているＤＮＡ断片をＳＲαプロモーターを有するｐＭＫＩＴＮｅｏに挿入することにより構築した。発現プラスミドは、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、使用者マニュアルにしたがって、ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。
【００４７】
ＭＤＣＫ細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）中で３．７％ホルムアルデヒドを用いて４℃で１時間、固定した。固定した細胞は室温で１０分間、０．２％トリトンＸ−１００を含むトリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；ＴＢＳ）で処理し、ＴＢＳで３回洗浄した。細胞を透過化した（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）後、１％ＢＳＡ、３％ＦＢＳ、０．２％トリトンＸ−１００を含むＴＢＳ中で一次抗体と室温で１時間、インキュベートした。一次抗体を除去し、細胞をＴＢＳで３回洗浄した。結合した一次抗体は、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはローダミンを結合したヤギ二次抗体（Ｃａｐｐｅｌ社）を用いて、検出した。染色したサンプルは、カールツアイスＬＳＭ５１０レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ Ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）下で、観察した。
【００４８】
結果は、図９に示す。図９中、ａ、ｂはＨＡ−タグで標識したＭ１蛋白質を発現させた同一細胞、ｃ、ｄはＨＡ−タグで標識したＭ１蛋白質とＭｙｃ−タグで標識したＡＰＣ−ａｒｍとを両方発現させた同一細胞、ｅはＨＡ−タグで標識したＭ１△ＮＢ（アミノ酸１２７−６１９）を発現させた細胞、ｆはＭｙｃ−タグで標識したＡＰＣ−ａｒｍを発現させた細胞である。また、ａ、ｂは抗ＨＡ抗体と抗ＡＰＣ抗体で二重染色し、ｃ、ｄは抗ＨＡ抗体と抗Ｍｙｃ抗体で二重染色し、ｅは抗ＨＡ抗体で、ｆは抗Ｍｙｃ抗体で処理した。ｂ中の矢印頭で示すように、ＡＰＣ蛋白質のクラスターが伸長している膜中に存在しており、また、ａ〜ｄ中の矢印で示すように、Ｍ１とＡＰＣが上皮細胞中で細胞の辺縁の同一部位に共存していることが判明した。
【００４９】
（Ｍ１発現細胞株の形態解析）
さらに、Ｍ１△ＮＢを安定に発現するＭＤＣＫ細胞株を樹立し、Ｍ１が細胞の形態、骨格に与える影響を調べたところ、Ｍ１△ＮＢ発現細胞株５クローンはいずれも密に接着せずばらばらに増殖する傾向が見られた。新規蛋白質Ｍ１の細胞接着への関与が推定された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌に関与する癌抑制遺伝子（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ：ＡＰＣ）がコードするポリペプチドに対する結合能、特にＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合能を有する新規な蛋白質（以下、Ｍ１と呼称する）およびポリペプチドに関するものである。さらに詳しくは、新規蛋白質Ｍ１のアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を使ったペプチドまたはポリペプチドの製造方法、該ペプチドまたはポリペプチドに対する抗体、これらを利用した化合物のスクリーニング方法、該スクリーニングされた化合物、該ポリペプチド若しくは該ポリヌクレオチドに作用する活性阻害化合物または活性賦活化合物、これらに関係する医薬組成物、およびこれらに関係する疾病診断手段に関係する。
【背景技術】
【０００２】
癌抑制遺伝子ＡＰＣは、家族性腺腫性ポリポーシス（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ：ＦＡＰ）の原因遺伝子として単離され、散発性の大腸癌の７０〜８０％では、該ＡＰＣの異常が報告されている。ＡＰＣ遺伝子産物は、２，８４３個のアミノ酸からなる３００ｋＤａの巨大な蛋白質である（Ｃｅｌｌ，８７：１５９−１７０，１９９６）。ＡＰＣ遺伝子産物は、種々の蛋白質との相互作用が知られており、その１つにβ−カテニンがある。β−カテニンは、カドヘリンの細胞質側ドメインに結合して細胞接着に役割を果たすと同時に、発生過程や腫瘍形成において重要な役割を担うＷｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル伝達経路の重要な構成要素の１つとしても機能している（Ｃｅｌｌ，８６：３９１−３９９，１９９６）（Ｎａｔｕｒｅ，３８２：６３８−６４２，１９９６）。β−カテニンは、一種の癌遺伝子産物で、ＡＰＣ遺伝子産物は、β−カテニンの機能を抑制することにより癌抑制機能を発揮していると考えられている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７８４−１７８７，１９９７）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７８７−１７９０，１９９７）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１７９０−１７９２，１９９７）。その他、ＡＰＣ遺伝子産物は、ＧＳＫ−３ｂ、Ａｘｉｎもしくはコンダクチン／Ａｘｉｌとの相互作用が知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：５９６−５９９，１９９８）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：５７３−５８１，１９９８）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：１０８２３−１０８２６，１９９８）（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ，６：３９５−４０３，１９９８）。また、ＡＰＣ遺伝子産物は、ＥＢ１とｈＤＬＧとの、そのＣ末端を介した相互作用も報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２：１０２０−１０２３，１９９６）。さらに、ＡＰＣ遺伝子産物には、蛋白質間の相互作用の役割を担うアルマジロリピートドメインが存在することも知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、上記のように多様な物質との相互作用を担う大腸癌の癌抑制遺伝子であるＡＰＣ遺伝子に関与する新規物質を見いだすことであり、該新規物質を癌の制御を目的とする手段として使用することである。より具体的には、本発明の課題はＡＰＣ遺伝子産物との結合能、特にＡＰＣ遺伝子産物由来のアルマジロリピートドメインとの結合能、をもつ新規な物質（Ｍ１）を提供することであり、それに伴い有用性ある新規物質（Ｍ１）由来のポリペプチドを提供することである。また本発明の別の課題は、Ｍ１由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供し、遺伝子工学手法による、Ｍ１由来のポリペプチドの製造法を提供することである。さらに本発明の別の課題は、Ｍ１由来のポリペプチドに対する抗体を提供することである。その他の本発明の課題は、上記のものを利用してＭ１の有する作用の阻害剤・拮抗剤・賦活剤のスクリーニングをおこなうことであり、スクリーニングされた化合物を提供することであり、またこれらを利用した大腸腫瘍に用いる医薬組成物・診断手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
課題解決のため、本発明者は、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメイン（以下、ａｒｍと呼称することもある）に結合する新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡを２ハイブリッドスクリーニング法を用いて同定し、その塩基配列および該新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列を決定し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち、本発明は下記の群より選ばれるポリペプチド；（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、（２）前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（３）前記（１）のポリペプチドと少なくとも約７０％のアミノ酸配列上の相同性を有しかつ大腸癌の癌抑制遺伝子（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ：ＡＰＣ）の遺伝子産物のアルマジロリピート部位をコードするポリペプチドに対する結合能を有するポリペプチド、および（４）前記（１）から（３）のポリペプチドのアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有し、かつＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合能を有するポリペプチド；配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸配列を有し、かつＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合能を有するポリペプチド；本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖；本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド；本発明のポリヌクレオチドまたはその相補鎖の塩基配列のうち少なくとも１５個の連続した塩基配列で示されるポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドの転写によって発現されるポリペプチドがＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合能を有する、ポリヌクレオチド；本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター；本発明の組換えベクターで形質転換された形質転換体；本発明の形質転換体を培養する工程を含む、本発明のポリペプチドの製造方法；本発明のポリペプチドのＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合性を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であって、本発明のポリペプチド、本発明の抗体のうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法；本発明のポリヌクレオチドと相互作用して該ポリヌクレオチドの発現を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であって、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の形質転換体、本発明の抗体のうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法；本発明のポリペプチドのＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子：Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ）活性を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法であって、本発明のポリペプチド、本発明の抗体のうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とするスクリーニング方法；本発明のスクリーニング方法でスクリーニングされる化合物；本発明のポリペプチドのＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位に対する結合性を阻害もしくは増強する化合物；本発明のポリヌクレオチドと相互作用して該ポリヌクレオチドの発現を阻害もしくは増強する化合物；本発明のポリペプチドのＧＥＦ活性を阻害もしくは増強する化合物；本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の形質転換体、本発明の抗体、または本発明の化合物のうち少なくともいずれか１つを含有することを特徴とする大腸腫瘍の治療に用いる医薬組成物；本発明のポリペプチドの発現または活性に関連した疾病の診断手段であって、試料中の（ａ）該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、および／または（ｂ）該ポリペプチド、をマーカーとして分析することを含む診断手段、を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
以上説明したように本発明のＭ１は、新規蛋白質であり、そのＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピート部位との結合性が特徴的で、ＧＥＦ（グアニンヌクレオチド交換因子：Ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｆａｃｔｏｒ）活性を有する。この特性を利用した新規医薬組成物、診療手段の提供は、ＡＰＣ遺伝子産物関連の臨床・基礎の医用領域において大きな有用性を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１−Ａ】新規蛋白質Ｍ１のアミノ酸配列の特徴および相同ドメインの配列比較を説明する図である。（Ａ）ヒトＭ１の推定アミノ酸配列。ＳＨ３ドメインは太字、ＤＨドメインは囲み太字、ＰＨドメインは太字かつ下線で表示する。
【図１−Ｂ】（Ｂ）Ｍ１と、Ｄｂｌファミリーのサブファミリーメンバー；ＫＩＡＡ０４２４、Ｄｂｌ、Ｔｉａｍ−１、Ｖａｖ、ｐ１１５−ＲｈｏＧＥＦ、ＣＤＣ２４およびＳｏｓ１との比較。ＤＨドメインの相同性はＭ１のＤＨドメインとほかのタンパクのＤＨドメインとの対応比較における同一性／相同性の割合として計算した。
【図１−Ｃ】（Ｃ）ＤＨドメインのアミノ酸配列表。Ｍ１、ＫＩＡＡ０４２４、Ｄｂｌ、Ｔｉａｍ−１、Ｖａｖ、ｐ１１５−ＲｈｏＧＥＦ、ＣＤＣ２４およびＳｏｓ１のＤＨドメインを並列し、さらに最適化した。同一アミノ酸は白抜き文字で示す。（Ｄ）ＰＨドメインのアミノ酸配列表。Ｍ１と他のＧＥＦ蛋白質および基準となるヒトプレクストリン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）に存在するＰＨドメインを並列した。同一アミノ酸は白抜き文字で示す。
【図２】新規蛋白質Ｍ１の発現を、ラット胎児脳、およびＭ１ｃＤＮＡを組み込んだ発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞で確認した図面である。図中、レーン１、２はラット胎児脳、レーン３〜９は形質転換したＣＯＳ−７細胞でのＭ１発現を示し、形質転換のためのベクターとして、レーン３と４はＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、レーン５はコントロールベクター、レーン６と８はＨＡ−タグで標識したＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、レーン７と９はＨＡ−タグを組み込んだコントロールベクターを使用した。また、レーン１、３、５は、予め抗Ｍ１抗体を対応する抗原であるＭ１ペプチドで吸収して（ｐｅｐ．＋）用いた結果である。
【図３】新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物とのｉｎ ｖｉｖｏでの結合をラット胎児脳溶解物について解析した結果を示す図面である。図中、レーン１および２はラット胎児脳の溶解物を抗Ｍ１抗体で、レーン３および４は抗ＡＰＣ抗体で、レーン５および６は抗β−カテニン抗体で免疫沈降した結果、レーン１、３、５は、予め各抗体を対応する抗原で吸収して（ｐｅｐ．＋）用いた結果である。
【図４】新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物との結合部位を説明する図である。＋はＡＰＣ遺伝子産物との結合活性陽性、−は陰性を表す。＊はＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロ配列をベイトとした２ハイブリッドスクリーニングで得られたクローンを示す。
【図５】新規蛋白質Ｍ１とＲｈｏファミリー低分子量Ｇ蛋白質との結合を示す図面である。
【図６−Ａ】新規蛋白質Ｍ１の低分子量Ｇ蛋白質からのＧＤＰ解離に対する促進作用を示す図であり、低分子量Ｇ蛋白質Ｒａｃ１に対する作用を示す。
【図６−Ｂ】新規蛋白質Ｍ１の低分子量Ｇ蛋白質からのＧＤＰ解離に対する促進作用を示す図であり、低分子量Ｇ蛋白質ＲｈｏＡに対する作用を示す。
【図７−Ａ】新規蛋白質Ｍ１の低分子量Ｇ蛋白質へのＧＴＰ結合に対する促進作用を示す図であり、低分子量Ｇ蛋白質Ｒａｃ１に対する作用を示す。
【図７−Ｂ】新規蛋白質Ｍ１の低分子量Ｇ蛋白質へのＧＴＰ結合に対する促進作用を示す図であり、低分子量Ｇ蛋白質ＲｈｏＡに対する作用を示す。
【図８】新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ活性が、ＡＰＣ−アルマジロドメインの添加により増強されることを示す図である。
【図９】新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物とが、それらを発現した上皮細胞株中の細胞の辺縁の同一部位に存在することを示す図面である。図中、ａ、ｂはＨＡ−タグで標識したＭ１蛋白質を発現させた同一細胞、ｃ、ｄはＨＡ−タグで標識したＭ１蛋白質とＭｙｃ−タグで標識したＡＰＣ−ａｒｍとを両方発現させた同一細胞、ｅはＨＡ−タグで標識したＭ１△ＮＢ（アミノ酸１２７−６１９）を発現させた細胞、ｆはＭｙｃ−タグで標識したＡＰＣ−ａｒｍを発現させた細胞である。また、ａ、ｂは抗ＨＡ抗体と抗ＡＰＣ抗体で二重染色し、ｃ、ｄは抗ＨＡ抗体と抗Ｍｙｃ抗体で二重染色し、ｅは抗ＨＡ抗体で、ｆは抗Ｍｙｃ抗体で処理したものである。ｂ中の矢印頭は、ＡＰＣ蛋白質のクラスターの存在を示しており、また、ａ〜ｄ中の矢印は、Ｍ１とＡＰＣの存在を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（新規Ｍ１）
本発明において提供される新規蛋白質Ｍ１をコードするポリヌクレオチドは、ヒトの胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインを使い、２ハイブリッドスクリーニング法により、新規なアミノ酸配列を有する物質として、そのｃＤＮＡが取得されたものである。本発明の新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡは、６１９個のアミノ酸からなる蛋白質をコードし、既知のＤｂｌファミリー（低分子量Ｇ蛋白質Ｒｈｏファミリーに作用するＧＤＰ解離促進蛋白質の１つである）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：２１６−２２２，１９９６）に類似のドメイン構造を有していた。遺伝子データベース（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を検索したところ、本発明の新規蛋白質Ｍ１のｃＤＮＡは、Ｄｂｌファミリーの１つである既知物質ＫＩＡＡ０４２４と約７３％の相同性を有することが判明した。ＫＩＡＡ０４２４は、本発明の新規蛋白質Ｍ１とは、該Ｍ１のＮ末端領域を欠如する点に最も大きな差異を有する。両者は、Ｄｂｌ相同（ＤＨ）ドメイン、プレックストリン（Ｐｒｅｃｋｓｔｒｉｎ）相同（ＰＨ）ドメイン、Ｓｒｃ相同３（ＳＨ３）ドメインを担持する点において同一である。また、マウスを用いた新規蛋白質Ｍ１の組織分布研究において、該Ｍ１のｍＲＮＡが脳に高レベルで発現しており、他の臓器でも低レベルで発現していることを確認した。
【０００９】
新規蛋白質Ｍ１のペプチド断片（配列表、配列番号１のアミノ酸７３〜１２６）を使用して作製した抗体は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として得た新規蛋白質Ｍ１に対し強い反応性を示した。また、該作製した抗体を用い、脳に存在する新規物質Ｍ１が、約８５ｋＤａの蛋白質であることを抗原抗体反応を利用した測定系で確認した。
【００１０】
また、新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物との直接的な相互作用を確認するための実験において、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として得たＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメイン（ＡＰＣ−ａｒｍ）は、ＧＳＴ融合Ｍ１断片（ＧＳＴ−Ｍ１−Ｍ）と相互作用したが、ＧＳＴ単独とは反応せず、同様に、Ｍ１−Ｍは、ＧＳＴ−ＡＰＣ−ａｒｍとは反応したが、ＧＳＴ融合β−カテニンのアルマジロリピートドメイン又はＧＳＴ単独とは反応しないことを確認した。すなわち、新規蛋白質Ｍ１はＡＰＣ遺伝子産物と、該ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインを介して結合していると推定される。また、ラット胎児脳の溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を抗ＡＰＣ抗体で免疫沈降し、ついで抗Ｍ１抗体でイムノブロットすることにより、ＡＰＣ遺伝子産物と本発明のＭ１が共沈殿することが判明した。この反応において、抗Ｍ１抗体を、抗原性を保持するＭ１断片で前処理すると、Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物の共沈殿が阻害された。すなわち、Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物とは生体内で結合していると考えられる。また、Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物の結合部位を２ハイブリッド法を用いて確認したところ、少なくともＭ１のアミノ酸７３〜１２６で示される領域に結合部位が存在することが推定された。このことは、Ｍ１のＳＨ３ドメインの上流域に、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合部位が存在することを意味する。ＫＩＡＡ０４２４は、このような領域をもたないので、ＡＰＣ遺伝子産物との反応性がない。
【００１１】
さらに、新規蛋白質Ｍ１はその作用として、Ｒｈｏファミリーの１つであるＲａｃに特異的なＧＥＦ活性をもつことを確認した。つまり、新規蛋白質Ｍ１は、Ｒａｃに結合しＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進してＲａｃを活性化し、Ｒａｃの関与する細胞情報伝達の下流に位置するＮＦκＢ、ｃ−ｊｕｎ、ＳＲＥ等に作用する。また、Ｒａｃの生理機能である、細胞のラメリポディア（葉状仮足）や細胞膜のラッフリングを誘導する可能性もあり、細胞接着への関与が推定される。
【００１２】
ＡＰＣ遺伝子産物の細胞内局在については、細胞が大腸絨突起先端へクリプトから移動する際に、移動する細胞の微小管先端部位に集積していることが報告されている（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１３４：１６５−１７９，１９９６）が、本発明の新規蛋白Ｍ１も同様の部位に集積していることを見出した。このことから、本発明の新規蛋白質Ｍ１が、大腸絨突起における細胞移動制御の鍵を握っている可能性がある。
【００１３】
（ポリペプチド）
本発明の新規蛋白質Ｍ１は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである。さらに本発明のポリペプチドは、この配列表の配列番号１に示すポリペプチドの部分配列を有するポリペプチドから選択される。その選択されるポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すポリペプチドと、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％をこえる相同性を有する。この相同性をもつポリペプチドの選択は、例えばＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして行うことができる。
【００１４】
アミノ酸配列の相同性を決定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、推定されるポリヌクレオチドの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等を使用することができる。
【００１５】
本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの、部分配列を有するポリペプチドから選択されるアミノ酸配列を試薬・標準物質・免疫原として利用できる。その最小単位としては、少なくとも約５個以上、好ましくは少なくとも約８〜１０個以上、さらに好ましくは少なくとも約１１〜１５個以上のアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、免疫学的にスクリーニングしうるポリペプチドを本発明の対象とする。
【００１６】
さらに、このように特定されたポリペプチドをもとにして、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標とすることにより、１ないし数個のアミノ酸の欠失・置換・付加などの変異あるいは誘発変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも提供することができる。欠失・置換・付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１９：６６６，１９８３）を利用することが出来る。さらに、これら利用できるペプチドは、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、それら自体で、新規蛋白質Ｍ１の機能を調節するための医薬組成物に使用できる。また、本発明のポリペプチドは、新規蛋白質Ｍ１の機能を調節しうる化合物、例えば、阻害剤、拮抗剤、賦活剤等を得るためのスクリーニングや、新規蛋白質Ｍ１に対する抗体の取得に用いることができる。さらに、本発明のポリペプチドは、試薬・標準品としても使用可能である。
【００１８】
（ポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号２のポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対する相補鎖、これらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドのうち少なくとも１５個の連続した塩基配列を有しかつコードするペプチドがＡＰＣ遺伝子産物のａｒｍドメインとの結合能を有するポリヌクレオチド、を意味する。ポリヌクレオチドとしてＤＮＡを代表例にとると、「ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」は、例えば前述のＭｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で ６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズのシグナルが観察されることを表す。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする、配列表の配列番号２のポリヌクレオチドの情報から選択される相同鎖および相補鎖を意味し、指定されたヌクレオチド配列の領域に対応する少なくとも約１５〜２０個以上の配列からなるポリヌクレオチド配列及び該相補鎖を意味する。この有用なポリヌクレオチド配列の決定は、公知の蛋白質発現系、例えば無細胞蛋白質発現系を利用して簡易に発現蛋白質の確認を行い、その生理活性特にＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして選別することにより行うことができる。無細胞蛋白質発現系としては、例えば胚芽、家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用できる（Ｎａｔｕｒｅ、１７９、１６０〜１６１、１９５７）。
【００２０】
これらのポリヌクレオチドは、いずれも本発明の新規蛋白質Ｍ１および本発明のポリペプチドの製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、これらをコードする遺伝子等の核酸、またはｍＲＮＡ検出のためのプローブもしくはプライマーとして、あるいは遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴマーとして使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドをアンチセンスとして使用する場合、他の既知蛋白質、例えばＤｂｌファミリーの１つであるＫＩＡＡ０４２４等、とのコンセンサス配列領域以外の新規蛋白質Ｍ１に固有な領域のヌクレオチド配列を用いることにより、Ｍ１の発現が特異的に阻害される。さらに、本発明のポリヌクレオチドは、核酸に関する試薬・標準品としても利用できる。
【００２１】
（形質転換体）
上記のような無細胞蛋白質発現系以外にも、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術によって、本発明からなる新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを提供可能である。本発明の具体例においては、ＣＯＳ−７細胞を利用したが、無論これに限定されるものではない。
【００２２】
形質転換は、自体公知の手段を応用することができ、例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイルス等を利用して宿主の形質転換を行う。より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色体内へのインテグレート法があげられるが、簡便には核外遺伝子を用いた自律複製系を利用する。ベクターは、宿主の種類により選択され、発現目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。構成要素は宿主が原核細胞か真核細胞かによって選択し、プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等を自体公知の方法によって組合せて使用する。
【００２３】
形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培養条件に最適な条件を選択して培養することにより、本発明のポリペプチドの製造に用いることができる。培養は、発現産生される新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドの生理活性、特にＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして行ってもよいが、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチによって行う。
【００２４】
（新規蛋白質Ｍ１およびその由来物の回収）
培地からの新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドの回収は、ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメインとの結合性を指標にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を組合せるか、溶解度差にもとづく硫安、アルコール等の分画手段によっても精製回収できる。より好ましくは、アミノ酸配列の情報に基づき、該アミノ酸配列に対する抗体を作成し、ポリクローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体によって、特異的に吸着回収する方法を用いる。
【００２５】
（抗体）
抗体は、本発明の新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドの抗原決定基を選別し、作成する。抗原決定基は、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸で構成される。このアミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号１と相同である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位であればよく、露出部位が不連続部位であれば、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であることも有効である。実施例では、アミノ酸配列の７３位〜１２６位の断片を免疫原として利用した。抗体は、免疫学的に新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを認識する限り特に限定されない。この認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定する。
【００２６】
抗体を産生するためには、本発明の新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に結合して、動物に対して体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行う。担体は、自身が宿主に対して有害作用をおこさなければ特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫する動物としては、マウス、ラット、兎、やぎ、馬等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得する。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法である。実施例においては、ＧＳＴ−Ｍ１を結合させたアフィニティークロマトグラフィーにより、抗Ｍ１抗体を精製した。
【００２７】
モノクロ−ナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞を回収し、自体公知の永久増殖性細胞への形質転換手段を導入することによって行われる。
【００２８】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、直接本発明からなる新規蛋白質Ｍ１と結合し、その活性を制御可能であり、ＡＰＣ遺伝子産物と新規蛋白質Ｍ１との相互作用系の制御を容易に行うことができる。そのため、ＡＰＣ遺伝子産物と新規蛋白質Ｍ１が関連する疾患の治療・予防のために有用である。
【００２９】
（スクリーニング）
かくして調製された新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づき形質転換させた細胞、並びに新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独または複数手段を組合せることによって、新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドとＡＰＣ遺伝子産物との結合性、新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ活性等の機能、または新規蛋白質Ｍ１の発現に対する阻害剤もしくは賦活剤のスクリーニングに有効な手段を提供する。すなわち、本発明のポリペプチド、本発明の抗体の少なくともいずれか１つを用いることで、本発明のポリペプチドとＡＰＣ遺伝子産物との結合性を阻害もしくは増強する化合物を得るためのスクリーニング方法が、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の形質転換体、本発明の抗体の少なくともいずれか１つを用いることで本発明のポリヌクレオチドと相互作用し該ポリヌクレオチドの発現を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法が、本発明のポリペプチド、本発明の抗体の少なくともいずれか１つを用いることで本発明のポリペプチドのＧＥＦ活性等の機能を阻害もしくは増強する化合物のスクリーニング方法が提供可能である。例えば、ポリペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質発現系を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を利用した抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品スクリーニングシステムにおいて利用可能である。
【００３０】
（化合物、医薬組成物）
上記のスクリーニング方法で得られた化合物は、新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドとＡＰＣ遺伝子産物との相互作用、または新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ活性等の機能を調節する阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物として利用可能である。また、遺伝子レベルでの新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドの発現に対する阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物としても利用可能である。上記の阻害剤、拮抗剤、賦活剤等の候補化合物としては、蛋白質、ポリペプチド、抗原性を有さないポリペプチド、低分子化合物等が挙げられ、好ましくは低分子化合物である。
【００３１】
かくして選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することによって、大腸腫瘍の治療に用いる医薬組成物として調製可能である。また、本発明からなる新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター並びに、新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それら自体が、新規蛋白質Ｍ１とＡＰＣ遺伝子産物との相互作用に対する阻害・拮抗・賦活等の機能を有する、大腸腫瘍の治療に用いる医薬手段として使用できる。ここで、大腸腫瘍とは、良性腫瘍ならびに悪性腫瘍を含み、具体的には、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）および大腸癌が挙げられる。なお、製剤化にあたっては、自体公知のポリペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、抗体等、各対象に応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００３２】
本発明からなる新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの塩基配列を含むベクター並びに、新規蛋白質Ｍ１およびその由来物からなるポリペプチドを免疫学的に認識する抗体は、本発明のポリペプチドの発現またはその活性が関連する疾患、例えば、本発明の新規蛋白質Ｍ１の発現またはＡＰＣ遺伝子産物との相互作用に関連した疾患等の診断手段として使用することができる。特に、大腸腫瘍の診断マーカーおよび／または試薬等の診断手段として有用である。診断は、新規蛋白質Ｍ１をコードしている核酸配列との相互作用・反応性を利用して、相応する核酸配列の存在量を決定すること、および／または新規蛋白質Ｍ１について生体内分布を決定すること、および／または新規蛋白質Ｍ１の試料中での存在量を決定することによって行う。詳しくは、新規蛋白質Ｍ１を診断マーカーとして検定する。その測定法は、自体公知の抗原抗体反応系、酵素反応系、ＰＣＲ反応系等を利用すればよい。なお、ここで言う手段とは、目的達成のために使用する方法および／または媒体を意味する。すなわち、例えば、診断手段には、診断するための方法、診断に用いる試薬キットなどが含まれる。
【実施例１】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
（ｃＤＮＡのクローニング ）
ＡＰＣ遺伝子産物のアルマジロリピートドメイン（以下、ＡＰＣ−ａｒｍと略称することもある）に対する結合能を有する蛋白質を得ることを目的として、２ハイブリッドスクリーニング（ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ ｓｃｒｅｅｎｓ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲＴＭ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を行った。すなわち、ベイト（ｂａｉｔ）として、ヒトＡＰＣ遺伝子産物アルマジロリピートドメイン（アミノ酸残基４４６−８８０）を融合させたＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含有するプラスミドＧＢＴ９−ＡＰＣを用い、ヒト胎児脳（ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ｂｒａｉｎ）ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を対象としてスクリーニングした。該ｃＤＮＡライブラリーとベイトとを、レポーター遺伝子としてｈｉｓ３とｌａｃＺとを導入した酵母にトランスフェクションし、β−ｇａｌアッセイおよびＨＩＳ栄養要求性を指標として、陽性クローンを検出した。
【００３４】
形質転換体１．１×１０７個から、１つの陽性クローンを得た。この得られたクローンから、該クローンで発現されているＡＰＣ−ａｒｍに結合するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンスにより決定したところ、新規な配列であった。得られたｃＤＮＡ断片の下流領域の配列は’Ｍａｒａｔｈｏｎ’−ｒｅａｄｙ ヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて３’ＲＡＣＥシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により取得した。プライマーは５’−ＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＡＧＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧ−３’を用いた。また上記で得られたｃＤＮＡ断片の配列の一部（配列表、配列番号２の塩基番号９７−２６９）をプローブとして、ヒトゲノムライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）について、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ；ＤＩＧ）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。その結果、配列表、配列番号２の塩基番号１−８１を含む２つのオーバーラップするクローンを得、目的とするＡＰＣ−ａｒｍに結合する蛋白質の完全長ｃＤＮＡの配列を決定した。
【００３５】
（アミノ酸配列）
上記方法で得られた、配列表の配列番号２に示すｃＤＮＡは新規な塩基配列を有していた。該ｃＤＮＡをもとに、その塩基配列の翻訳によって、新規蛋白質Ｍ１の推定アミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１に示すアミノ酸残基６１９の配列が得られた（図１Ａ）。
【００３６】
（既存蛋白質との相同性）
該新規蛋白質Ｍ１の推定アミノ酸配列を用いて、既存のｄａｔａｂａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ）に対してＢＬＡＳＴ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いた相同性検索を行ったところＤｂｌファミリーのサブファミリーメンバーの１つであるＫＩＡＡ０４２４と７３％の相同性を認めた（図２Ｂ、Ｃ）。両者は、Ｄｂｌ相同（Ｄｂｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ；ＤＨ）ドメイン、プレックストリン相同（Ｐｒｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ；ＰＨ）ドメイン、Ｓｒｃ相同３（ＳＨ３）ドメインを保持する点において同一であるが、ＫＩＡＡ０４２４には、新規蛋白質Ｍ１のＮ末端領域は存在しないことが判明した。この結果、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有する本発明の蛋白質Ｍ１は新規蛋白質であることが確認された。
【００３７】
（発現組織の確認）
次に配列表の配列番号１の推定アミノ酸配列で示される新規蛋白質Ｍ１の、ヒト組織における発現を、ノザンブロット解析により確認した。多種のヒト組織から得たｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをブロットしたフィルターをＣｌｏｎｔｅｃｈ社より入手し、ＤＩＧ標識したＭ１のｃＤＮＡプローブ、５’−ＧＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧ−３’および５’−ＴＧＴＡＧＴＴＴＡＣＣＡＡＧＧＡＣＣＧ−３’でハイブリダイゼーションした。その結果、脳に高レベルで発現していることを確認した。また、ｔｉｓｓｕｅ ｂｌｏｔｓによる解析では、脳以外に、睾丸でも存在を確認した。さらに、腎由来の細胞でも発現を確認した。
【００３８】
（抗体の産生）
Ｍ１に対する抗体は、ＮＺＷウサギをＭ１のアミノ酸７３−１２６を含むペプチドを用いて公知の方法で免疫し調製した。ＡＰＣに対する抗体は、ＮＺＷウサギをＡＰＣ遺伝子産物（以下ＡＰＣと略称することもある）のアミノ酸１１２２−１７２９を含むペプチドを用いて公知の方法で免疫して調製した。ＡＰＣのＮ末端領域に対するマウスモノクローナル抗体は公知の方法で調製した（Ｍｉｙａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．１９９５）。抗体は、それぞれ免疫に用いた抗原を結合させたアフィニティーカラムを使用してアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製した。精製したウサギポリクローナル抗Ｍ１抗体とＧＳＴ融合Ｍ１（ＧＳＴ−Ｍ１）との結合反応性を調べたところ、得られた抗体は、ＧＳＴ−Ｍ１に強い反応性を示した。
【００３９】
（Ｍ１の発現）
本発明の新規蛋白質Ｍ１を発現させるために、発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位にＭ１のｃＤＮＡを組み込み、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。新規蛋白質Ｍ１の発現確認のため、Ｍ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、コントロールベクター、ＨＡ−タグで標識したＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター、ＨＡ−タグを組み込んだベクターを、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。培養した各形質転換体の溶解物、およびＭ１の存在が確認されているラット胎児脳の溶解物について、上記の様に取得した抗Ｍ１抗体、および抗ＨＡ抗体を用いて免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、次いで抗Ｍ１抗体および抗ＨＡ抗体を用いてイムノブロットを行った。Ｍ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター（レーン３）、ＨＡ−タグで標識したＭ１ｃＤＮＡを組み込んだベクター（レーン６、８）で形質転換したＣＯＳ−７細胞およびラット胎児脳（レーン１）では明らかに新規蛋白質の発現が認められ、その分子量は約８５ｋＤａであることが判明した（図２）。また、用いた抗Ｍ１抗体を抗原で事前処理しておく（図２中、ｐｅｐ．±で表示）と、新規蛋白質は検出されなかった。すなわち、抗Ｍ１抗体で認識される新規蛋白質Ｍ１が発現されたことが確認された。
【００４０】
（Ｍ１とＡＰＣとのｉｎ ｖｉｖｏにおける結合の解析）
ラット胎児脳溶解物について、上記で作製した新規蛋白質Ｍ１、およびＡＰＣに対するウサギポリクローナル抗体、ならびにβ−カテニンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより各沈降物を分離後、各抗体を用いてイムノブロットを行った（図３）。レーン１および２はラット胎児脳の溶解物を抗Ｍ１抗体で、レーン３および４は抗ＡＰＣ抗体で、レーン５および６は抗β−カテニン抗体で免疫沈降した結果を、レーン１、３、５は、予め各抗体を対応する抗原で吸収して用いた結果（図３中、ｐｅｐ．±で表示）を示す。抗Ｍ１抗体で免疫沈降したＭ１が抗ＡＰＣ抗体もしくは抗β−カテニン抗体で検出され、抗ＡＰＣ抗体で免疫沈降したＡＰＣ遺伝子産物が抗Ｍ１抗体で検出され、抗β−カテニン抗体で免疫沈降したβ−カテニンが抗Ｍ１抗体で検出されることから、新規蛋白質Ｍ１はｉｎ ｖｉｖｏにおいてもＡＰＣおよびβ−カテニンと結合していることが明らかとなった。
【００４１】
（Ｍ１とＡＰＣの相互作用部位の解析）
新規蛋白質Ｍ１の、ＡＰＣ結合ドメインの解析を行うため、Ｍ１の様々な欠失変異体（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）を公知の方法で作製し、ＡＰＣとの結合領域を酵母（ｙｅａｓｔ）を用いた２ハイブリッドシステムにより調べた。具体的には、Ｍ１の欠失変異体を、下記の特異的なプライマーを用いＰＣＲを行って、ｐＧＡＤ４２４にクローニングし、ＧＡＬ４活性化ドメインとの融合体を作成した。
５’−ＡＴＴＴＡＴＴＧＴＡＧＴＴＴＡＣＣＡＡＧＧＡＣ−３’
５’−ＴＧＣＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＡＣ−３’
５’−ＧＡＣＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＧＣＴＧＡＴＧ−３’
５’−ＣＣＴＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧ−３’
５’−ＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＣＧＣＣＴＣＣＧＣ−３’
５’−ＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＣＧＡＧＣＣＣＧＣＧ−３’
５’−ＧＡＴＧＴＴＣＣＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴＡＣＧ−３’
５’−ＡＴＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＣ−３’
ついで、該ＧＡＬ４活性化ドメインとの融合体を２ハイブリッドシステムにおいてＨＩＳ３ ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙとβ−ｇａｌ リポーター活性を用いて、その相互作用を試験した。その結果、図４に示すように、ＳＨ３の上流の領域にＡＰＣ結合部位が存在することが判明した。
【００４２】
（Ｍ１とＲｈｏファミリー低分子量Ｇ蛋白質との結合解析）
新規蛋白質Ｍ１は、Ｄｂｌファミリーのサブファミリーの１つであるＫＩＡＡ０４２４と高い相同性を有する。Ｄｂｌファミリーは低分子量Ｇ蛋白質の１つであるＲｈｏファミリーに作用するＧＤＰ解離促進蛋白質である。新規蛋白質Ｍ１と、ＫＩＡＡ０４２４との相同性に着目し、新規蛋白質Ｍ１の機能解析のため、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇ蛋白質（ｓｍａｌｌ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、ＣＤＣ４２）との結合を調べた。ニッケルビーズに吸着させた新規蛋白質Ｍ１をＲｈｏＡ、Ｒａｃ１およびＧＳＴ−ＣＤＣ４２と、０．１％ＮＰ−４０を含むＥ１Ａ緩衝液〔５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ ＮａＦ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭＤＴＴ，５０μｇ／ｍＬ ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ），１μｇ／ｍｌ ロイペプチン，１μｇ／ｍｌアプロチニン〕中で４℃にて１時間混合し、共沈殿物をイムノブロッティングで検出した。図５に示すように、陽性コントロールとして使用したＤｂｌは用いた全てのＲｈｏファミリー低分子量Ｇ蛋白質と結合するが、新規蛋白質Ｍ１はＲｈｏＡおよびＲａｃ１とは結合したが、ＣＤＣ４２とは結合しなかった。
【００４３】
（Ｍ１のＧＥＦ活性）
次に、新規蛋白質Ｍ１のＧＥＦ活性について検討した。低分子量Ｇ蛋白質からのＧＤＰ解離を調べるために使用する［３Ｈ］ＧＤＰ結合型の低分子量Ｇ蛋白質を、２ｐｍｏｌの各低分子量Ｇ蛋白質を０．２μＭ［３Ｈ］ＧＤＰと３０℃で２０分間、導入用緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ジチオスレイトール）中でインキュベートすることにより得た。低分子量Ｇ蛋白質からの［３Ｈ］ＧＤＰの解離を防ぐため、３７５ｍＭ ＭｇＣｌ２を終濃度が１８ｍＭとなるように加え、直ちに、該混合液を氷冷した。［３Ｈ］ＧＤＰの解離は、反応溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、３．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ジチオスレイトール）に２５０倍過剰の非標識ＧＤＰ、ＧＴＰおよびＭ１を加えることにより２５℃で行った（図６Ａ、Ｂ）。次に、低分子量Ｇ蛋白質へのＧＴＰの結合を調べるために使用するＧＤＰ結合型の低分子量Ｇ蛋白質を、２ｐｍｏｌの各低分子量Ｇ蛋白質を０．２μＭ非標識ＧＤＰと３０℃で２０分間、導入用緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中でインキュベートし、３７５ｍＭ ＭｇＣｌ２を終濃度が１８ｍＭとなるように加えることにより得た。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの、ＧＤＰ結合型低分子量Ｇ蛋白質への結合は、１０μＭの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳおよびＭ１を反応溶液に加えることにより、２５℃で実施した（図７Ａ、Ｂ）。解離試験、結合試験の両方において、反応は１ｍｌの氷冷した停止用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１００ｍＭ ＮａＣｌ）を加えて、停止した。希釈した混合溶液をニトロセルロースろ紙で濾過し、フィルターを数回、停止用緩衝液で洗浄した。ろ紙上に捕捉された放射活性をカウントした。タンパク質濃度はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準蛋白質として用いて測定した。
【００４４】
図６に示すように、新規蛋白質Ｍ１は、結合しうる低分子量Ｇ蛋白質であるＲａｃ１に作用して、Ｒａｃ１からのＧＤＰ解離を促進したが（図６Ａ）、ＲｈｏＡには結合しないのでＲｈｏＡからのＧＤＰ解離には作用しなかった（図６Ｂ）。また、図７に示すように、新規蛋白質Ｍ１は、Ｒａｃ１へのＧＴＰ結合を促進した（図７Ａ）が、ＲｈｏＡへのＧＴＰ結合には影響しなかった（図７Ｂ）。すなわち、本発明の新規蛋白質Ｍ１は、低分子量Ｇ蛋白質に作用し、ＧＥＦ活性を有する。
【００４５】
（Ｍ１のＧＥＦ活性に対するＡＰＣの作用）
さらに、様々な濃度のＭ１について、ＡＰＣ−ａｒｍの存在下または非存在下で、２０ｎＭの［３Ｈ］ＧＤＰを結合させた結合型のＲａｃ１からの［３Ｈ］ＧＤＰ解離促進能を３０℃で１５分間インキュベーションして測定した。ＡＰＣ−ａｒｍはＭ１より過剰量、モル比で５倍となるように加えた。図８に示すように、Ｍ１のＧＤＰ解離促進能は、ＡＰＣ−ａｒｍの添加により、増強された。すなわち、Ｍ１は、ＡＰＣと結合することにより、ＧＤＰ解離促進能が増強されることが示唆された。
【００４６】
（Ｍ１の細胞内局在）
次に、本発明の新規蛋白質Ｍ１の細胞内局在について検討した。まず、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）上皮細胞株を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で培養した。全長のＭ１およびＭ１△ＮＢ（アミノ酸１２７−６１９）ｃＤＮＡはＣＭＶプロモーターを有する哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）中にサブクローン化した。プラスミドＤＮＡ、ｐＭＫＩＴＮｅｏ−Ｍｙｃタグで標識したＡＰＣ−ａｒｍは、ＡＰＣ（アミノ酸４４６−８８０）の部分配列をコードしているＤＮＡ断片をＳＲαプロモーターを有するｐＭＫＩＴＮｅｏに挿入することにより構築した。発現プラスミドは、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、使用者マニュアルにしたがって、ＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。
【００４７】
ＭＤＣＫ細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）中で３．７％ホルムアルデヒドを用いて４℃で１時間、固定した。固定した細胞は室温で１０分間、０．２％トリトンＸ−１００を含むトリス緩衝生理食塩水（Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ；ＴＢＳ）で処理し、ＴＢＳで３回洗浄した。細胞を透過化した（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）後、１％ＢＳＡ、３％ＦＢＳ、０．２％トリトンＸ−１００を含むＴＢＳ中で一次抗体と室温で１時間、インキュベートした。一次抗体を除去し、細胞をＴＢＳで３回洗浄した。結合した一次抗体は、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはローダミンを結合したヤギ二次抗体（Ｃａｐｐｅｌ社）を用いて、検出した。染色したサンプルは、カールツアイスＬＳＭ５１０レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ Ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）下で、観察した。
【００４８】
結果は、図９に示す。図９中、ａ、ｂはＨＡ−タグで標識したＭ１蛋白質を発現させた同一細胞、ｃ、ｄはＨＡ−タグで標識したＭ１蛋白質とＭｙｃ−タグで標識したＡＰＣ−ａｒｍとを両方発現させた同一細胞、ｅはＨＡ−タグで標識したＭ１△ＮＢ（アミノ酸１２７−６１９）を発現させた細胞、ｆはＭｙｃ−タグで標識したＡＰＣ−ａｒｍを発現させた細胞である。また、ａ、ｂは抗ＨＡ抗体と抗ＡＰＣ抗体で二重染色し、ｃ、ｄは抗ＨＡ抗体と抗Ｍｙｃ抗体で二重染色し、ｅは抗ＨＡ抗体で、ｆは抗Ｍｙｃ抗体で処理した。ｂ中の矢印頭で示すように、ＡＰＣ蛋白質のクラスターが伸長している膜中に存在しており、また、ａ〜ｄ中の矢印で示すように、Ｍ１とＡＰＣが上皮細胞中で細胞の辺縁の同一部位に共存していることが判明した。
【００４９】
（Ｍ１発現細胞株の形態解析）
さらに、Ｍ１△ＮＢを安定に発現するＭＤＣＫ細胞株を樹立し、Ｍ１が細胞の形態、骨格に与える影響を調べたところ、Ｍ１△ＮＢ発現細胞株５クローンはいずれも密に接着せずばらばらに増殖する傾向が見られた。新規蛋白質Ｍ１の細胞接着への関与が推定された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の群より選ばれるポリペプチド；
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、
および
（２）前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の変異あるいは誘発変異を有し、大腸癌の癌抑制遺伝子ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ）の遺伝子産物に対する結合能を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記の群より選ばれるポリペプチド；
（１）大腸癌の癌抑制遺伝子ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ）の遺伝子産物に対する結合能を有し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、
および
（２）前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の変異あるいは誘発変異を有し、大腸癌の癌抑制遺伝子ＡＰＣの遺伝子産物に対する結合能を有するポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項４】
請求項３記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または２に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項１】
下記の群より選ばれるポリペプチド；
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、
および
（２）前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の変異あるいは誘発変異を有し、大腸癌の癌抑制遺伝子ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ）の遺伝子産物に対する結合能を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記の群より選ばれるポリペプチド；
（１）大腸癌の癌抑制遺伝子ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ Ｃｏｌｉ）の遺伝子産物に対する結合能を有し、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、
および
（２）前記（１）のポリペプチドのアミノ酸配列において１ないし数個のアミノ酸の変異あるいは誘発変異を有し、大腸癌の癌抑制遺伝子ＡＰＣの遺伝子産物に対する結合能を有するポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
【請求項４】
請求項３記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または２に記載のポリペプチドの製造方法。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−Ａ】
【図６−Ｂ】
【図７−Ａ】
【図７−Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−Ａ】
【図６−Ｂ】
【図７−Ａ】
【図７−Ｂ】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−２８４９１３（Ｐ２００９−２８４９１３Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０８７７１（Ｐ２００９−２０８７７１）
【出願日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【分割の表示】特願平１１−２３４８０９の分割
【原出願日】平成１１年８月２０日（１９９９．８．２０）
【出願人】（３０７０１０１６６）第一三共株式会社 (196)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【分割の表示】特願平１１−２３４８０９の分割
【原出願日】平成１１年８月２０日（１９９９．８．２０）
【出願人】（３０７０１０１６６）第一三共株式会社 (196)
【Ｆターム（参考）】
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