大腸菌群検出用試験シート
【解決手段】 培養試薬を含有するブイヨン培地に反応基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドを添加した検出液をシート状の基体に含浸させてなることを特徴とする大腸菌群検出用試験シート。
【効果】 本発明によれば、確実に、しかも簡単に食品等の大腸菌群を検出することができる。
【効果】 本発明によれば、確実に、しかも簡単に食品等の大腸菌群を検出することができる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、飲食物の糞便汚染の指標や大腸菌汚染の原因となる大腸菌群を、簡易かつ短時間で確実に検出できる安価な大腸菌群検出用試験シートに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】大腸菌群（Ｃｏｌｉｆｏｒｍ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）は普通温血動物の腸管内の常在菌であることから、これらの細菌が水や食品から検出されれば、その水や食品が直接又は間接的にヒトや動物の糞便に汚染されていることが疑われ、ひいては各種の消化器系伝染病菌や食中毒細菌が存在する可能性もあるので、当然その飲食物は衛生上好ましくないとみなされる。
【０００３】従って、従来から大腸菌群は糞便汚染指標細菌又は単に汚染指標細菌といわれており、飲食物の糞便汚染の指標として、この大腸菌群の検査が一般的に行われている。
【０００４】また最近では、一部の生鮮食品や牛乳、畜肉加工品などの、大腸菌群による汚染が比較的高いものについては、大腸菌群の検査よりも大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））を直接検査したほうが、特異性が高く効率的であるため、大腸菌群に代って大腸菌を検出することが行われるようになっている。
【０００５】このため、大腸菌群を簡便に検出する方法、また大腸菌群より大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を特異的に検出する方法が望まれている。
【０００６】従って、本発明は、簡易かつ短時間で確実に大腸菌群を検出することができる安価な大腸菌群検出具を提供することを第１の目的とする。また、本発明は、このように検出された大腸菌群から大腸菌を確実に検出することができる大腸菌群検出具を提供することを第２の目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本発明は、上記目的を達成するため、培養試薬を含有するブイヨン培地に反応基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドを添加した検出液をシート状の基体に含浸させてなることを特徴とする大腸菌群検出用試験シートを提供するものである。また、本発明は、かかる試験シートにおいて、更に反応基質として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを添加した試験シートを提供する。
【０００８】即ち、本発明の試験シートを用いて大腸菌群の検出を行う場合は、検体を試験シートに付着させ、検体中の菌類を試験シート中に含まれた検出液中で培養する。このとき、検体中に大腸菌群が存在すれば大腸菌群の持つ乳糖分解酵素のβ−ガラクトシダーゼにより、上記５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドを加水分解して青色の発色スポットを形成し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び大腸菌以外の大腸菌群に属する菌、例えば、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属が検出し得る一方、その他の腸内細菌群に属するプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属等は検出されないものである。
【０００９】またこの場合、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドに加えて４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを添加していると、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−Ｄ−グルクロニダーゼ酵素が４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを加水分解して蛍光物質を産出し、例えば３６０ｎｍの紫外線照射により、上記５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドの加水分解による青色のスポットのうち、Ｅ．ｃｏｌｉに基づく青色スポットのみがライトブルーの蛍光を発し、上記Ｅ．ｃｏｌｉ以外の大腸菌群に基づく青色スポットはこのような蛍光を発しないので、Ｅ．ｃｏｌｉとそれ以外の大腸菌群との識別ができる。
【００１０】それ故、本発明の試験シートは、大腸菌群を特異的に検出し得ると共に、大腸菌群の中から大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を特異的に検出することが可能である。しかも、上述したように試験シートに検体を付着させ、培養を行い、紫外線を照射するだけで短時間で簡易に大腸菌の検出を行うことができる上、シート状の基体に検出液を含浸させたものであるから、極く小量の培地、培養試薬及び反応基質で安価に検査を行うことができると共に、検査後は焼却により簡単かつ安全に廃棄することができるものである。
【００１１】以下、本発明につき更に詳しく説明すると、本発明の大腸菌群検出用試験シートは、上述のように培養試薬及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドをブイヨン培地に添加した検出液をシート状の基体に含浸させたものであるが、この場合上記ブイヨン培地としては、従来から菌の培養に一般的に用いられている基本組成のブイヨンを用いることができ、具体的には下記組成のブイヨンを例示することができる。
【００１２】
ペプトン ２０ｇ／Ｌ乳糖 ５ｇ／Ｌ胆汁酸塩 １．５ｇ／Ｌリン酸水素一カリウム ４．０ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム １．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
【００１３】また、このブイヨンに反応基質として添加される５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドは、上述したように、大腸菌群の持つ乳糖分解酵素β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）により加水分解されて青色の発色スポットを形成するものである。その添加量は特に制限されないが、通常上記ブイヨン培地１０００ｍｌ当り０．０１〜０．５ｇ程度、特に０．０３〜０．２ｇ程度とすることができる。
【００１４】一方、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が産生する酵素β−Ｄ−グルクロニダーゼによりそのグルクロニド結合が加水分解され、蛍光物質（４−メチルウンベリフェリル）を生じるもので、この蛍光物質の紫外線照射による蛍光反応から大腸菌を検出するものである。その添加量も、特に制限されるものではないが、通常上記ブイヨン培地１０００ｍｌ当たり、０．０５〜０．１ｇ程度とされる。
【００１５】更に、上記培養試薬は、大腸菌を短時間で効果的に培養するために添加されるものであり、上記反応基質の反応に影響しないものであればよく、大腸菌の培養に通常用いられるものを好適に使用することができる。具体的にはＬ−アスパラギン、カザミノ酸、酵母エキス、ブドウ糖、クエン酸ナトリウム等が挙げられ、これらの中でもＬ−アスパラギン、カザミノ酸及び酵母エキスを組合わせて使用することが好ましい。この培養試薬の添加量は、通常量とすることができ、具体的には上記ブイヨン１０００ｍｌに対して０．５〜３ｇ程度とすることができるが、特に上記Ｌ−アスパラギン、カザミノ酸及び酵母エキスを組合わせて用いる場合にはＬ−アスパラギン１ｇ程度、カザミノ酸０．５ｇ程度、酵母エキス１ｇ程度とすることが好ましい。
【００１６】本発明の試験シートは、上記ブイヨン培地に上記反応基質及び培養試薬を添加した検出液を含浸させたものであるが、この検出液はｐＨ６．５程度とすることが好ましい。また、この検出液には大腸菌群の増殖を阻害しないものであれば、上記以外添加剤を添加してもよく、上記以外の培養試薬や菌選択剤を適宜添加することができる。
【００１７】次に、上記検出液を含浸させるシート状の基体としては、その材質、形状等に特に制限はなく、吸水性を有する紙や布等を用いることができるが、特に濾紙等の吸水性の良好な紙を用いて小短冊状に形成したものが好適に用いられる。具体的には、図１に示すシート状基体が例示される。即ち、図１は本発明試験シートの一例を示すもので、この試験シート１は濾紙等の吸水性の良好な紙を用いて小短冊状に形成したシート状基体２に上記検出液を含浸したものである。この場合、図中３はシート状基体２の一端側に形成された切目線で、この切目線３を境界として一側がつまみ部４、他側が試験部５として構成されており、これにより試験シート１に検体を接種させるに当たり、つまみ部４を指で摘んで持ち上げる等する以外は試験シート１の他の部分、特に試験部５は指が直接触れないため、該試験部５が汚染されることがなく、試験部５に現れる反応は全て検体由来のものと判断することができ、従って検査結果を誤りなく判定できるものである。
【００１８】上記シート状基体２に上記検出液を含浸させる手段については特に制限されないが、シート状基体２を検出液に浸漬し、シート状基体２に検出液をしみこませる方法が好適に採用される。この場合、検出液のシート状基体への含浸量に特に制限はなく、この検出液を含浸させたシート状基体を乾燥することにより本発明の大腸菌群検出用試験シートを得ることができる。
【００１９】本発明の検出用試験シートは、各種飲食物、例えば、生鮮食品（野菜、果実、豆腐等）、畜産加工品（食肉、ハム、チーズ等）、更には、たまり水、水道水、井戸水等に広く使用することができ、飲食物の糞便汚染の指標に限らず、水質調査、公園内の砂場等の汚染、及び飲食店や家庭内の衛生管理など、簡易な公衆衛生検査用試験シートとしても有効に活用できるものである。
【００２０】本発明の大腸菌群検出用試験シートの使用方法は、まず検体を本発明試験シートに付着させる。この場合、被験物が水溶性の場合は、そのままの状態で検体とし、被験物が粘液状又は固体状の場合は、生理食塩水で適宜希釈混合し、これを検体とすることができる。この検体の試験シートへの付着量については、特に制限されないが、通常１ｍｌ程度が好適である。なお、被験物が各種食品等の固形物である場合には試験シートを直接接触させて検体を付着させることも可能である。
【００２１】次に、検体が付着した試験シートを培養に供する。培養条件は温度３６〜４４．５℃が好適であり、特に、３５〜３７℃が一般的な培養条件であり好ましい。培養時間は特に制限されないが一般的には１８〜２４時間程度とされる。具体的な培養方法としては、例えば検体を付着させた試験シートを雑菌及び乾燥を避けるために、シャーレ又はプラスチックフイルム製の透明袋中等に入れ、３５〜３７℃のふ卵器内で２４時間程度保存することにより行うことができる。
【００２２】培養後、試験シートが透明袋等の透明容器にある場合はそのまま、必要によっては試験シートを取り出し、青色スポット数を数え、その程度を判定するものである。なお、この青色スポットは、大腸菌群の持つβ−ガラクトシダーゼが５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを加水分解して、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリン及びβ−Ｄ−ガラクトースを生成し、前者が酸化してブロモクロロインジゴとなる反応に基づくものである。
【００２３】また、試験シートが更に４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを含んでいる場合は、更に試験シートにＵＶランプ等を用いて紫外線を照射し、上記青色スポットのうちでライトブルーの蛍光をあるものを数えることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の存在、程度が判定できるものである。なお、この反応は、大腸菌の酵素β−Ｄ−グルクロニダーゼによって検出液中に含まれた反応基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドのグルクロニド結合が加水分解され、蛍光物質４−メチルウンベリフェリルが遊離することに基づくものである。
【００２４】ここで、スポットの生じた試験シートを保存する場合は冷蔵保存が適しており、冷凍保存では生じたスポットは約１０日で減弱する。
【００２５】本発明の大腸菌群検出用試験シートの保存方法は、試薬の安定性等の面から冷暗所（冷蔵庫など）保存が望ましい。但し、室温保存で７か月経過した後でも、スポットは認められ、室温においてもある程度の期間の保存が可能である。
【００２６】なお、使用済みの試験シートは、大腸菌群が検出されなくとも、他の菌で汚染されているおそれがあるので、感染等の防止の面から焼却により廃棄処分しなければならないが、この場合本発明試験紙シートは、紙や布からなるシート状であるため、容易に焼却廃棄することができ、従来の試験管等を用いた検出キット法に比べ廃棄処分が簡易かつ経済的である。
【００２７】本試験紙は培地中の色素による発色反応によってスポットの形成を見るのではないため、色素や還元剤が含まれないことから、保管中に試験紙が変色することがない。また、試験紙上の発色は酵素反応に基づくもので、反応の呈色は菌量に比例し、少量の菌量でも発色させることができる。更に、紫外線を照射することにより、Ｅ．ｃｏｌｉのみを特異的なライトブルーに蛍光発色させ、他の大腸菌群との鑑別が容易であり、使用方法も極めて簡易である。
【００２８】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００２９】［実施例１］ブイヨン培地１０００ｍｌに対して、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）０．０５ｇ、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）０．０５ｇ，Ｌ−アスパラギン１．０ｇ、カザミノ酸０．５ｇ及び酵母エキス１．０ｇを添加して検出液を調製し、この検出液中に短冊状に裁断した濾紙を浸漬して該濾紙（シート状基体）に上記検出液を含浸させた後、これを乾燥させて大腸菌群検出用試験シートを得た。
【００３０】一方、下記大腸菌、大腸菌群、及び他の菌種の培養菌液を滅菌０．１％ペプトン加生理食塩水を用いて希釈し、生菌数１〜１０個乃至１０3個以上の希釈液を調製した。
大腸菌：エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｉ型大腸菌群：シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄ）
エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）
他の菌類：サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）
プセドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
【００３１】次に、上記菌液中に上記試験シートを浸漬し、３５℃で２４時間培養後、青色スポット数を調べた。また、これにＵＶランプで紫外線（波長３６５ｎｍ）を照射し、ライトブルーの蛍光を発するスポット数を調べた。結果を表１に示す。なお、結果は下記の判定基準により評価したものである。また、接種菌量は公定法に従って算定した。
【００３２】スポット数＋ １〜１０＋＋ １０〜１００＋＋＋ １００以上又は試験紙全体が青色
【００３３】
【表１】
【００３４】表１に示すとおり、Ｅ．ｃｏｌｉ及び大腸菌群は、各希釈液に応じたスポット数の発生が見られたが、他の菌種では全くスポットは見られなかった。また、これに紫外線を照射すると、Ｅ．ｃｏｌｉを接種した試験紙上の青色スポットのみがライトブルーの蛍光を発し、大腸菌群及び他の菌種の試験紙は全く蛍光を発しなかった。
【００３５】［実施例２］Ｅ．ｃｏｌｉと上記した他の菌種との種々の菌量の菌液を調製し、実施例１と同様に実験を行った。その結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】上記の結果より、Ｅ．ｃｏｌｉ菌量１〜１０個の少量菌と他の菌種の１〜１０個の少量菌から１０4以上の大量菌の組み合わせの場合でも、発生青色スポット数はＥ．ｃｏｌｉの菌量に応じたスポット数のみが形成され、また、その逆の混合菌量であっても他の菌種の含有菌量に影響されることなく、Ｅ．ｃｏｌｉの菌量に応じたスポット数が形成された。
【００３８】また、これに紫外線を照射したところ、青色スポットは全て蛍光を発し、他菌種の存在に影響されることなく、Ｅ．ｃｏｌｉのみが発育し、スポットを形成していたことが確認された。
【００３９】［実施例３］上記した大腸菌群と他の菌種との種々の菌量の菌液を調製し、実施例１と同様に実験を行った。その結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】表３の結果より、大腸菌群の発育青色スポットは、他菌種の含有菌量に影響されることなく、大腸菌群の各含有菌量に応じた青色スポットが形成された。またこの青色スポットの生じた試験紙に紫外線で照射したが、すべて蛍光を認めなかった。
【００４２】以上のことから、本試験紙に発生する青色スポットはＥ．ｃｏｌｉ及び大腸菌群のみで、他の菌種には影響されず、更に紫外線を照射することにより、Ｅ．ｃｏｌｉのみが特異的に蛍光発色することが確認された。
【００４３】［実施例４］実施例１の試験シートを用い、井戸水などの水（３０検体）、惣菜類（１３５検体）、豚、牛、鶏、マグロ刺身等の生肉・生魚類（１７検体）、豆腐・生菓子・カット野菜（１０検体）、マナイタ等の調理器具（１５検体）について大腸菌群の有無について検査を行い、ＬＢ−ＢＧＬＢ発酵管法、デソキシコレート寒天培地による結果との対比を行った。なお、対照としたＬＢ−ＢＧＬＢ発酵管法及びデソキシコレート寒天培地による試験法は食品衛生法に従った。また、惣菜類、生肉・生魚類、豆腐・生菓子・カット野菜については試料１０ｇを滅菌１％ペプトン加生理食塩水９０ｍｌとを混合したものについて試験を行い、調理器具については拭き取り試験を行った。結果を表４に示す。この場合、井戸水及び使用水についてＬＢ−ＢＧＬＢ発酵管法で酸及びガス産生の陽性数と本試験紙上の青色スポット形成数を比較し、各種食品類については、デソキシコレート寒天培地上で赤色集落が形成されたものを陽性とし、同様に本試験紙上では青色スポットを形成したものを陽性として、両試験法の一致率を比較した。
【００４４】
【表４】
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、確実に、しかも簡単に食品等の大腸菌群を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に用いる試験紙の一例を示す平面図である。
【符号の説明】
１ 試験紙
２ シート体
３ 切目線
４ つまみ部
５ 試験部
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、飲食物の糞便汚染の指標や大腸菌汚染の原因となる大腸菌群を、簡易かつ短時間で確実に検出できる安価な大腸菌群検出用試験シートに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】大腸菌群（Ｃｏｌｉｆｏｒｍ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）は普通温血動物の腸管内の常在菌であることから、これらの細菌が水や食品から検出されれば、その水や食品が直接又は間接的にヒトや動物の糞便に汚染されていることが疑われ、ひいては各種の消化器系伝染病菌や食中毒細菌が存在する可能性もあるので、当然その飲食物は衛生上好ましくないとみなされる。
【０００３】従って、従来から大腸菌群は糞便汚染指標細菌又は単に汚染指標細菌といわれており、飲食物の糞便汚染の指標として、この大腸菌群の検査が一般的に行われている。
【０００４】また最近では、一部の生鮮食品や牛乳、畜肉加工品などの、大腸菌群による汚染が比較的高いものについては、大腸菌群の検査よりも大腸菌（エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））を直接検査したほうが、特異性が高く効率的であるため、大腸菌群に代って大腸菌を検出することが行われるようになっている。
【０００５】このため、大腸菌群を簡便に検出する方法、また大腸菌群より大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を特異的に検出する方法が望まれている。
【０００６】従って、本発明は、簡易かつ短時間で確実に大腸菌群を検出することができる安価な大腸菌群検出具を提供することを第１の目的とする。また、本発明は、このように検出された大腸菌群から大腸菌を確実に検出することができる大腸菌群検出具を提供することを第２の目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本発明は、上記目的を達成するため、培養試薬を含有するブイヨン培地に反応基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドを添加した検出液をシート状の基体に含浸させてなることを特徴とする大腸菌群検出用試験シートを提供するものである。また、本発明は、かかる試験シートにおいて、更に反応基質として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを添加した試験シートを提供する。
【０００８】即ち、本発明の試験シートを用いて大腸菌群の検出を行う場合は、検体を試験シートに付着させ、検体中の菌類を試験シート中に含まれた検出液中で培養する。このとき、検体中に大腸菌群が存在すれば大腸菌群の持つ乳糖分解酵素のβ−ガラクトシダーゼにより、上記５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドを加水分解して青色の発色スポットを形成し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び大腸菌以外の大腸菌群に属する菌、例えば、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属が検出し得る一方、その他の腸内細菌群に属するプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属等は検出されないものである。
【０００９】またこの場合、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドに加えて４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを添加していると、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−Ｄ−グルクロニダーゼ酵素が４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを加水分解して蛍光物質を産出し、例えば３６０ｎｍの紫外線照射により、上記５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドの加水分解による青色のスポットのうち、Ｅ．ｃｏｌｉに基づく青色スポットのみがライトブルーの蛍光を発し、上記Ｅ．ｃｏｌｉ以外の大腸菌群に基づく青色スポットはこのような蛍光を発しないので、Ｅ．ｃｏｌｉとそれ以外の大腸菌群との識別ができる。
【００１０】それ故、本発明の試験シートは、大腸菌群を特異的に検出し得ると共に、大腸菌群の中から大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を特異的に検出することが可能である。しかも、上述したように試験シートに検体を付着させ、培養を行い、紫外線を照射するだけで短時間で簡易に大腸菌の検出を行うことができる上、シート状の基体に検出液を含浸させたものであるから、極く小量の培地、培養試薬及び反応基質で安価に検査を行うことができると共に、検査後は焼却により簡単かつ安全に廃棄することができるものである。
【００１１】以下、本発明につき更に詳しく説明すると、本発明の大腸菌群検出用試験シートは、上述のように培養試薬及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドをブイヨン培地に添加した検出液をシート状の基体に含浸させたものであるが、この場合上記ブイヨン培地としては、従来から菌の培養に一般的に用いられている基本組成のブイヨンを用いることができ、具体的には下記組成のブイヨンを例示することができる。
【００１２】
ペプトン ２０ｇ／Ｌ乳糖 ５ｇ／Ｌ胆汁酸塩 １．５ｇ／Ｌリン酸水素一カリウム ４．０ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム １．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム ５．０ｇ／Ｌ
【００１３】また、このブイヨンに反応基質として添加される５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドは、上述したように、大腸菌群の持つ乳糖分解酵素β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）により加水分解されて青色の発色スポットを形成するものである。その添加量は特に制限されないが、通常上記ブイヨン培地１０００ｍｌ当り０．０１〜０．５ｇ程度、特に０．０３〜０．２ｇ程度とすることができる。
【００１４】一方、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が産生する酵素β−Ｄ−グルクロニダーゼによりそのグルクロニド結合が加水分解され、蛍光物質（４−メチルウンベリフェリル）を生じるもので、この蛍光物質の紫外線照射による蛍光反応から大腸菌を検出するものである。その添加量も、特に制限されるものではないが、通常上記ブイヨン培地１０００ｍｌ当たり、０．０５〜０．１ｇ程度とされる。
【００１５】更に、上記培養試薬は、大腸菌を短時間で効果的に培養するために添加されるものであり、上記反応基質の反応に影響しないものであればよく、大腸菌の培養に通常用いられるものを好適に使用することができる。具体的にはＬ−アスパラギン、カザミノ酸、酵母エキス、ブドウ糖、クエン酸ナトリウム等が挙げられ、これらの中でもＬ−アスパラギン、カザミノ酸及び酵母エキスを組合わせて使用することが好ましい。この培養試薬の添加量は、通常量とすることができ、具体的には上記ブイヨン１０００ｍｌに対して０．５〜３ｇ程度とすることができるが、特に上記Ｌ−アスパラギン、カザミノ酸及び酵母エキスを組合わせて用いる場合にはＬ−アスパラギン１ｇ程度、カザミノ酸０．５ｇ程度、酵母エキス１ｇ程度とすることが好ましい。
【００１６】本発明の試験シートは、上記ブイヨン培地に上記反応基質及び培養試薬を添加した検出液を含浸させたものであるが、この検出液はｐＨ６．５程度とすることが好ましい。また、この検出液には大腸菌群の増殖を阻害しないものであれば、上記以外添加剤を添加してもよく、上記以外の培養試薬や菌選択剤を適宜添加することができる。
【００１７】次に、上記検出液を含浸させるシート状の基体としては、その材質、形状等に特に制限はなく、吸水性を有する紙や布等を用いることができるが、特に濾紙等の吸水性の良好な紙を用いて小短冊状に形成したものが好適に用いられる。具体的には、図１に示すシート状基体が例示される。即ち、図１は本発明試験シートの一例を示すもので、この試験シート１は濾紙等の吸水性の良好な紙を用いて小短冊状に形成したシート状基体２に上記検出液を含浸したものである。この場合、図中３はシート状基体２の一端側に形成された切目線で、この切目線３を境界として一側がつまみ部４、他側が試験部５として構成されており、これにより試験シート１に検体を接種させるに当たり、つまみ部４を指で摘んで持ち上げる等する以外は試験シート１の他の部分、特に試験部５は指が直接触れないため、該試験部５が汚染されることがなく、試験部５に現れる反応は全て検体由来のものと判断することができ、従って検査結果を誤りなく判定できるものである。
【００１８】上記シート状基体２に上記検出液を含浸させる手段については特に制限されないが、シート状基体２を検出液に浸漬し、シート状基体２に検出液をしみこませる方法が好適に採用される。この場合、検出液のシート状基体への含浸量に特に制限はなく、この検出液を含浸させたシート状基体を乾燥することにより本発明の大腸菌群検出用試験シートを得ることができる。
【００１９】本発明の検出用試験シートは、各種飲食物、例えば、生鮮食品（野菜、果実、豆腐等）、畜産加工品（食肉、ハム、チーズ等）、更には、たまり水、水道水、井戸水等に広く使用することができ、飲食物の糞便汚染の指標に限らず、水質調査、公園内の砂場等の汚染、及び飲食店や家庭内の衛生管理など、簡易な公衆衛生検査用試験シートとしても有効に活用できるものである。
【００２０】本発明の大腸菌群検出用試験シートの使用方法は、まず検体を本発明試験シートに付着させる。この場合、被験物が水溶性の場合は、そのままの状態で検体とし、被験物が粘液状又は固体状の場合は、生理食塩水で適宜希釈混合し、これを検体とすることができる。この検体の試験シートへの付着量については、特に制限されないが、通常１ｍｌ程度が好適である。なお、被験物が各種食品等の固形物である場合には試験シートを直接接触させて検体を付着させることも可能である。
【００２１】次に、検体が付着した試験シートを培養に供する。培養条件は温度３６〜４４．５℃が好適であり、特に、３５〜３７℃が一般的な培養条件であり好ましい。培養時間は特に制限されないが一般的には１８〜２４時間程度とされる。具体的な培養方法としては、例えば検体を付着させた試験シートを雑菌及び乾燥を避けるために、シャーレ又はプラスチックフイルム製の透明袋中等に入れ、３５〜３７℃のふ卵器内で２４時間程度保存することにより行うことができる。
【００２２】培養後、試験シートが透明袋等の透明容器にある場合はそのまま、必要によっては試験シートを取り出し、青色スポット数を数え、その程度を判定するものである。なお、この青色スポットは、大腸菌群の持つβ−ガラクトシダーゼが５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを加水分解して、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリン及びβ−Ｄ−ガラクトースを生成し、前者が酸化してブロモクロロインジゴとなる反応に基づくものである。
【００２３】また、試験シートが更に４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを含んでいる場合は、更に試験シートにＵＶランプ等を用いて紫外線を照射し、上記青色スポットのうちでライトブルーの蛍光をあるものを数えることにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の存在、程度が判定できるものである。なお、この反応は、大腸菌の酵素β−Ｄ−グルクロニダーゼによって検出液中に含まれた反応基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドのグルクロニド結合が加水分解され、蛍光物質４−メチルウンベリフェリルが遊離することに基づくものである。
【００２４】ここで、スポットの生じた試験シートを保存する場合は冷蔵保存が適しており、冷凍保存では生じたスポットは約１０日で減弱する。
【００２５】本発明の大腸菌群検出用試験シートの保存方法は、試薬の安定性等の面から冷暗所（冷蔵庫など）保存が望ましい。但し、室温保存で７か月経過した後でも、スポットは認められ、室温においてもある程度の期間の保存が可能である。
【００２６】なお、使用済みの試験シートは、大腸菌群が検出されなくとも、他の菌で汚染されているおそれがあるので、感染等の防止の面から焼却により廃棄処分しなければならないが、この場合本発明試験紙シートは、紙や布からなるシート状であるため、容易に焼却廃棄することができ、従来の試験管等を用いた検出キット法に比べ廃棄処分が簡易かつ経済的である。
【００２７】本試験紙は培地中の色素による発色反応によってスポットの形成を見るのではないため、色素や還元剤が含まれないことから、保管中に試験紙が変色することがない。また、試験紙上の発色は酵素反応に基づくもので、反応の呈色は菌量に比例し、少量の菌量でも発色させることができる。更に、紫外線を照射することにより、Ｅ．ｃｏｌｉのみを特異的なライトブルーに蛍光発色させ、他の大腸菌群との鑑別が容易であり、使用方法も極めて簡易である。
【００２８】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。
【００２９】［実施例１］ブイヨン培地１０００ｍｌに対して、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）０．０５ｇ、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）０．０５ｇ，Ｌ−アスパラギン１．０ｇ、カザミノ酸０．５ｇ及び酵母エキス１．０ｇを添加して検出液を調製し、この検出液中に短冊状に裁断した濾紙を浸漬して該濾紙（シート状基体）に上記検出液を含浸させた後、これを乾燥させて大腸菌群検出用試験シートを得た。
【００３０】一方、下記大腸菌、大腸菌群、及び他の菌種の培養菌液を滅菌０．１％ペプトン加生理食塩水を用いて希釈し、生菌数１〜１０個乃至１０3個以上の希釈液を調製した。
大腸菌：エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｉ型大腸菌群：シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄ）
エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）
クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）
他の菌類：サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）
プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）
プセドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
【００３１】次に、上記菌液中に上記試験シートを浸漬し、３５℃で２４時間培養後、青色スポット数を調べた。また、これにＵＶランプで紫外線（波長３６５ｎｍ）を照射し、ライトブルーの蛍光を発するスポット数を調べた。結果を表１に示す。なお、結果は下記の判定基準により評価したものである。また、接種菌量は公定法に従って算定した。
【００３２】スポット数＋ １〜１０＋＋ １０〜１００＋＋＋ １００以上又は試験紙全体が青色
【００３３】
【表１】
【００３４】表１に示すとおり、Ｅ．ｃｏｌｉ及び大腸菌群は、各希釈液に応じたスポット数の発生が見られたが、他の菌種では全くスポットは見られなかった。また、これに紫外線を照射すると、Ｅ．ｃｏｌｉを接種した試験紙上の青色スポットのみがライトブルーの蛍光を発し、大腸菌群及び他の菌種の試験紙は全く蛍光を発しなかった。
【００３５】［実施例２］Ｅ．ｃｏｌｉと上記した他の菌種との種々の菌量の菌液を調製し、実施例１と同様に実験を行った。その結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
【００３７】上記の結果より、Ｅ．ｃｏｌｉ菌量１〜１０個の少量菌と他の菌種の１〜１０個の少量菌から１０4以上の大量菌の組み合わせの場合でも、発生青色スポット数はＥ．ｃｏｌｉの菌量に応じたスポット数のみが形成され、また、その逆の混合菌量であっても他の菌種の含有菌量に影響されることなく、Ｅ．ｃｏｌｉの菌量に応じたスポット数が形成された。
【００３８】また、これに紫外線を照射したところ、青色スポットは全て蛍光を発し、他菌種の存在に影響されることなく、Ｅ．ｃｏｌｉのみが発育し、スポットを形成していたことが確認された。
【００３９】［実施例３］上記した大腸菌群と他の菌種との種々の菌量の菌液を調製し、実施例１と同様に実験を行った。その結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】表３の結果より、大腸菌群の発育青色スポットは、他菌種の含有菌量に影響されることなく、大腸菌群の各含有菌量に応じた青色スポットが形成された。またこの青色スポットの生じた試験紙に紫外線で照射したが、すべて蛍光を認めなかった。
【００４２】以上のことから、本試験紙に発生する青色スポットはＥ．ｃｏｌｉ及び大腸菌群のみで、他の菌種には影響されず、更に紫外線を照射することにより、Ｅ．ｃｏｌｉのみが特異的に蛍光発色することが確認された。
【００４３】［実施例４］実施例１の試験シートを用い、井戸水などの水（３０検体）、惣菜類（１３５検体）、豚、牛、鶏、マグロ刺身等の生肉・生魚類（１７検体）、豆腐・生菓子・カット野菜（１０検体）、マナイタ等の調理器具（１５検体）について大腸菌群の有無について検査を行い、ＬＢ−ＢＧＬＢ発酵管法、デソキシコレート寒天培地による結果との対比を行った。なお、対照としたＬＢ−ＢＧＬＢ発酵管法及びデソキシコレート寒天培地による試験法は食品衛生法に従った。また、惣菜類、生肉・生魚類、豆腐・生菓子・カット野菜については試料１０ｇを滅菌１％ペプトン加生理食塩水９０ｍｌとを混合したものについて試験を行い、調理器具については拭き取り試験を行った。結果を表４に示す。この場合、井戸水及び使用水についてＬＢ−ＢＧＬＢ発酵管法で酸及びガス産生の陽性数と本試験紙上の青色スポット形成数を比較し、各種食品類については、デソキシコレート寒天培地上で赤色集落が形成されたものを陽性とし、同様に本試験紙上では青色スポットを形成したものを陽性として、両試験法の一致率を比較した。
【００４４】
【表４】
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、確実に、しかも簡単に食品等の大腸菌群を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に用いる試験紙の一例を示す平面図である。
【符号の説明】
１ 試験紙
２ シート体
３ 切目線
４ つまみ部
５ 試験部
【特許請求の範囲】
【請求項１】 培養試薬を含有するブイヨン培地に反応基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドを添加した検出液をシート状の基体に含浸させてなることを特徴とする大腸菌群検出用試験シート。
【請求項２】 反応基質として更に４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを添加した請求項１記載の試験シート。
【請求項１】 培養試薬を含有するブイヨン培地に反応基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドを添加した検出液をシート状の基体に含浸させてなることを特徴とする大腸菌群検出用試験シート。
【請求項２】 反応基質として更に４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを添加した請求項１記載の試験シート。
【図１】
【公開番号】特開２０００−１００（Ｐ２０００−１００Ａ）
【公開日】平成１２年１月７日（２０００．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１０−１８３３４３
【出願日】平成１０年６月１５日（１９９８．６．１５）
【出願人】（５９５０４６２６３）サン化学株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１２年１月７日（２０００．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１０年６月１５日（１９９８．６．１５）
【出願人】（５９５０４６２６３）サン化学株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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