子宮内膜症関連疾患の治療薬
【課題】子宮内膜症の発症、進行に関与する分子メカニズムに作用する子宮内膜症関連疾患の治療薬を提供する。
【解決手段】細胞内におけるヒスタミン放出因子（HRF）ポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬。
【解決手段】細胞内におけるヒスタミン放出因子（HRF）ポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、子宮内膜症関連疾患の分子メカニズムを利用した当該疾患の治療薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
子宮内膜症は一般的な産婦人科疾患であり、生殖可能年齢にある全女性の10％に影響している（非特許文献1）。子宮内膜症の組織は正所性子宮内膜のように周期的な増殖と崩壊を経て、周期的月経困難症、性交疼痛症、骨盤痛、および月経時血尿の原因になる。さらに不妊症患者の30〜40％がこの疾患を有していることも報告されている（非特許文献2）。一部の患者で子宮内膜細胞が転移し、異所的に増殖する際のメカニズムは未だに不明であるが、炎症性サイトカインの脱調節化が子宮内膜症の進行に寄与している可能性がある（非特許文献3、4）。事実、単球の活性化と腹腔内への移動が、子宮内膜症において最も一貫して報告されている免疫学的異常性の一つとなっている（非特許文献5〜8）。
【０００３】
ダイオキシンは内分泌攪乱物質の一種であり、環境中に遍在している。3,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxisin（TCDD；ダイオキシン）はダイオキシン群の中でも最も毒性が高い物質であり、各種の毒性効果（例えば、免疫毒性、血液毒性、催奇形性、および発ガン性など）を有している（非特許文献9、10）。TCDDおよび関連化合物が誘導する遺伝子発現の変化は、毒素がアリル炭化水素受容体（AhR）に結合した時点で開始され、次にアリル炭化水素受容体核トランスロケーター（ARNT）と二量体を形成して、XRE（異物応答配列）モチーフを含む遺伝子調節要素と相互作用する複合体を形成する（非特許文献11、12）。サルをTCDDに慢性曝露させると、用量依存的に軽度から重度の子宮内膜症が発現したことから（非特許文献13）、ダイオキシンと子宮内膜症の関連性について幾つかの研究が行われた（非特許文献14〜１8）。しかしながらTCDD曝露は子宮内膜症に相関しないと言う結果が最近報告され（非特許文献19、20）、ダイオキシン曝露と子宮内膜症の関連性は不明のままとなっている。
【０００４】
なおこの出願の発明者らは、IgE依存性ヒスタミン放出因子（Histamine Releasing Foctor:HRF）を含むTCDD標的遺伝子を同定している（非特許文献21〜23）。しかしながら、このようなTCDD標的遺伝子産物としてのHRFと子宮内膜症との関係は一切知られていない。
【非特許文献１】Wheeler J.M. J. Reprod Med. 1989, 34(1):41-6
【非特許文献２】：Candiani G.B. et al. Obstct Gynecol. Surv. 1991, 46(6):374-82
【非特許文献３】Garcia-Velasco J.A. and Arici A. Fertil Steril. 1999, 71(6):983-93
【非特許文献４】Barcz et al. Med. Sci. Monit. 2000, 6(5):1042-6
【非特許文献５】Jolicoeur C. et al. Am. J. Pathol. 1998, 152(1):125-33
【非特許文献６】Lebovic D.I. et al. Fertil Steril 2001, 75(1):1-10
【非特許文献７】Hornung D. et al. Am. J. Pathol. 2001, 158(6):1949-54
【非特許文献８】Blumenthal R.D. et al. Am. J. Pathol. 2000, 156(5):1581-8
【非特許文献９】Chapman D.E. and Schiller C.M. Toxicol Appl. Pharmacol. 1985, 78(1):147-57
【非特許文献１０】McGregor D.B. et al. Environ Health Perspect. 1998, 106 Suppl 2:755-60
【非特許文献１１】Sagawa K. and Fujii-Kuriyama T. J. Biochem. (Tokyo) 1997, 122(6):1075-9
【非特許文献１２】Nebert D.W. Crit. Rev. Toxicol. 1989, 20(3):153-74
【非特許文献１３】Rier S.E. et al. Fundam. Appl. Toxicol. 1993, 21(4):433-41
【非特許文献１４】Gibbsons A. Science 1993, 262(5183):1373
【非特許文献１５】Obsteen K.G. and Sierra-Rivera E. Endocrinol. 1997, 15(3):301-8
【非特許文献１６】Bruner-Tran K.L. et al. Gynecol. Obstet. Invest. 1999, 48 Suppl. 1:45-56
【非特許文献１７】Johson K.L. et al. Environ Health Perspect 1997, 105(7):750-5
【非特許文献１８】Yang J.Z. and Foster W.G. Toxicol. Ind. Health 1997, 13(1):15-25
【非特許文献１９】Igarashi T. et al. Endocr. J. 1999, 46(6):765-72
【非特許文献２０】Pauwels A. et al. Hum. Reprod. 2001, 16(10):2050-5
【非特許文献２１】Oikawa K. et al. Cancer Res. 2001, 61(15):5707-9
【非特許文献２２】Oikawa K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 290(3):984-7
【非特許文献２３】Ohbayashi et al. FEBS Lett. 2001, 508(3):341-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
子宮内膜症については、その分子メカニズムに基づいた治療薬は存在していなかった。
【０００６】
この出願は、子宮内膜症の発症、進行に関与する分子メカニズムに作用する子宮内膜症関連疾患の治療薬を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記の課題を解決するものとして、細胞内におけるヒスタミン放出因子（HRF）ポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬を提供する。
【０００８】
すなわち、この出願の発明者らは、子宮内膜組織と子宮内膜症移植片におけるTCDD標的遺伝子（HRF、CYP1A1）の発現を調べた結果、子宮内膜症の進行とHRF発現レベルに高い相関関係を見出してこの出願の発明を完成させた。
【０００９】
なおこの発明において、「子宮内膜症関連疾患」とは、子宮内膜症、および子宮内膜症を原因とする月経困難症、不妊症および子宮腺筋症等を意味する。「診断」とは、被験者が子宮内膜症関連疾患に羅患しているか否かの判定、将来的に子宮内膜症関連疾患に羅患する危険性が存在するか否かの判定、および治療後に子宮内膜症関連疾患を再発する危険性が存在するか否かの判定を意味する。また、診断には、子宮内膜症関連疾患の羅患やその危険性がどの程度であるか測定することも含まれる。
【００１０】
また「HRFポリヌクレオチド」とはHRFタンパク質をコードするポリヌクレオチド［プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ATP、GTP、CTP、UTP；またはdATP、dGTP、dCTP、dTTP）が結合した分子を意味する。具体的には、HRFタンパク質をコードするゲノムDNA、ゲノムDNAから転写されるmRNA、mRNAから合成されるcDNAである。また、2本鎖であっても1本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノムDNAやmRNA、cDNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。また「ポリヌクレオチド」とは、前記のヌクレオチドが100個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは2-99個連結した分子を言う。さらに「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。特にアミノ酸残基2-33個のものを「オリゴペプチド」、34個以上のものを「ポリペプチド」と記載する。
【００１１】
また、配列表に示した塩基配列およびアミノ酸配列については、１以上の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に基づく１以上のアミノ酸残基の付加、欠失および他のアミノ酸への置換をも包含する。
【００１２】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、薬剤の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New York (1993); S. Weissman (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York (1999); J. C. Glorioso et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 306, Academic Press, New York (1999)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】正常子宮内膜組織、子宮内膜症患者に由来する正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片におけるHRFとCYP1A1の発現を調べた結果である。(A)HRF mRNAレベルはノーザンブロット分析により調べた。ブロットの再プローブをヒトβアクチンプローブを用いて行い、トータルRNAレベルを決定した。ノーザンブロットにより調べた試料中のCYP1A1 mRNBAレベルはサザンブロット分析を用いた定量的RT-PCRにより決定した。定量の精度を確認するため、5倍の異なる濃度のcDNA試料（1xおよび5x）をPCRテンプレートとして用い、同様な配置で調べた。βアクチンをmRNA量に対する内部対照として用いた。(B)HRFおよびCYP1A1のmRNAレベルに対する画像表示を同様に示す。mRNAレベルはdensintometry（MOLECULAR IMAGER，Nippon Bio-Rad）を用いてβアクチンシグナルに対して正規化した。試料11−2AはHRFのmRNAレベル、10-2AはCYP1A1のmRNAレベルを示し、任意に10に設定した。複数の試料が一個人由来である場合には、平均値を計算して表示した。エラーバーは複数試料の最大値を表す。12-1、7-1、8-1および6Bは正常な子宮内膜組織であり、アステリスクが印字された1Cは子宮内膜症患者の正所性子宮内膜である。
【図２】子宮内膜症移植片におけるHRF発現を調べた結果である。(A)正常な子宮内膜組織、子宮内膜症患者の正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片におけるHRF発現のノーザンブロット分析の結果である。ブロットはヒトβアクチンプローブを用いて再プローブを行い、トータルRNAレベルを決定した。カラム上のN、EuおよびEnはそれぞれ正常な子宮内膜組織、子宮内膜症患者の正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片を示す。(B)図1Aおよび図2Aにおいて調査した試料について、ノーザンブロット分析により測定したHRF mRNAレベルのグラフ表示である。HRF mRNAレベルはdensintometry（MOLECULAR IMAGER，Nippon Bio-Rad）を用いてβアクチンシグナルに対して正規化した。試料6BのmRNAレベルを任意に１に設定した。複数の試料が一個人由来である場合には、平均値を計算して表示した。エラーバーは複数試料の最大値を表す。
【図３】HRFおよびCD68発現の免疫組織化学的分析の結果である。茶色の染色で陽性部分が可視化されている。逆染色にはヘマトキシリンを用いた。(A)および(B)正常な子宮内膜組織におけるHRFタンパク質の検出（A:増殖フェーズ、B:分泌フェーズ、原図倍率ｘ200）。(C)卵巣の子宮内膜症移植片内部におけるHRFタンパク質の検出（原図倍率ｘ200）。(D)子宮内膜症移植片の形態を示す連続切片のH&E染色（原図倍率ｘ200）。(E)さらに高倍率で(C)と同じ視野のHRFタンパク質を検出したもの（原図倍率ｘ400）。(F)子宮内膜症移植片の連続切片におけるCD68陽性マクロファージの免疫組織化学的局在（原図倍率ｘ400）。
【図４】移植アッセイの結果である。(A)NIH3T3細胞内のHRFタンパク質のウエスタンブロット分析の結果。wt：親のNIH3T3細胞、HRF:HRFを含むレトロウイルスベクターによる感染後に安定してHRFを発現する細胞株（pMSCV-HRF-3T3）、vector:空のベクターを感染させた対照細胞（pMSCV-3T3）。(B)ヌードマウスにおけるHRF過剰発現細胞の示す高い移植効率を示す。縦軸上のマークは次の状態を示す。+++：無数の移植コロニーが観察された状態、++：数十個の移植コロニーが観察された状態、+:数個の移植コロニーが観察された状態、−:移植コロニーは観察されなかった状態。対照細胞またはHRF過剰発現細胞を注射した個々のマウスは、それぞれ白丸または黒丸により示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
この出願の発明は、細胞内HRFポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬る。すなわち、後記実施例にも示したように、HRFポリヌクレオチドを過剰に発現する細胞はin vivoにおいて活発に増殖することから、細胞内HRFポリヌクレオチドの過剰発現が子宮内膜組織の移植や増殖の原因となっていると考えられる。そこでこのHRFポリヌクレオチドの発現を抑制することによって、子宮内膜症関連疾患の治療、または少なくともその進行、悪化を停止もしくは抑制することが可能となる。
【００１５】
細胞内HRFポリヌクレオチドの発現を抑制する分子としては、アンチセンス配列、リボザイム、キメラオリゴ、RNA干渉（RNA interference: RNAi）を生じさせる二本鎖RNA分子等（以下、これらは「発現抑制分子」と記載することがある）を使用することができる。特に、RNAiは外来性RNA分子によって標的遺伝子のmRNAを分解し、標的遺伝子の発現を抑制する手法であり、アンチセンス配列等と比較して、標的遺伝子の発現抑制効果が格段に優れているために、好ましい手段である。使用するRNA分子としては、二本鎖RNA（double-strand RNA: dsRNA）、より好ましくはその短鎖（20−25bp程度）のRNA（small interfering RNA: siRNA）（例えば、Elbashir S.M. et al. Genes Dev. 2001, 15(2):188-200）、ヘアピン構造の短鎖RNA（short hairpin RNA: shRNA）（例えば、Paddison P.J. et al. Genes Dev. 2002, 16(8):948-958）、およびsiRNAとは別の短鎖RNA（small temporally regulated RNA: stRNA）（例えば、Grosshans H. and Slack F.J. J. Cell Biol. 2002, 156(1):17-21）等が好ましい。
【００１６】
以上のとおりの発現抑制分子は、標的遺伝子（HRFポリヌクレオチド）の配列（例えば配列番号１）に基づき設計され、公知の化学合成またはin vitro転写翻訳等の手段で作成することができる。なお、例えばsiRNAの設計に当たっては、以下を留意することが提案されている。(1)調節タンパク質結合部位の多い5’および3’の非翻訳領域（UTR）と開始コドン周辺領域は除外する；(2)開始コドンの50から100ヌクレオチド下流の領域を選択する；(3)選択した領域からAA(N19)TTまたはAA(21)となる領域であって、GC含量が少なくとも30％から70％、好ましくは50％程度の領域を選択する。
【００１７】
作成された発現抑制分子は、適当な溶媒と混合した状態で体内に投与することができるが、その効果をより持続させるためには、発現ベクターの形態で投与することが好ましい。発現ベクターとしては、プラスミドベクターまたはウイルスベクター等を使用することができる。例えば、RNAi用のRNA分子を発現させる場合のプラスミドベクターとしては、市販のpiGENEシリーズ、pSINsi/pBAsiシリーズ等を使用することができる。また、ウイルスベクターとしては、複製欠損性か、条件により複製するか、または複製コンピテントとなるべくさらに加工されたアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスゲノムに由来する複製非コンピテントベクター、例えば米国特許第6,096,718号；6,110,458号；6,113,913号；5,631,236号参照）、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノムに由来するベクター等を使用することができる。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびそれらの組合せを主成分とするものが含まれる（例えば、米国特許第6,117,681号；6,107,478号; 5,658,775号; 5,449,614号；Buchscher（1992）J. Virol. 66:2731-2739; Johann（1992）J. Virol. 66:1635-1640参照）。このようなウイルスベクターは、例えばsiRNA発現用のアデノウイルスベクターの場合、先ず、基本プラスミドベクター（例えばpBAsi）を構築し、この基本ベクターからプロモーター＋siRNAコード配列を切り出し、これをアデノウイルスベクター作成用コスミドに載せ換え、この組換えコスミドを293細胞等にトランスフェクションすることによって作成することができる。
【００１８】
以上のとおりの発現ベクターは、通常の遺伝子治療等の手順に従って、患者の子宮内膜等を含め、あらゆる投与経路によっても体内に投与することができる。また、プラスミドベクターの場合には、Hydrodynamic法（Song E. et al. Nature Medicine 2003, 9(3):347-351）によって静脈内に投与することも好ましい方法である。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
1．材料と方法
1-1．組織試料
RNA調製のために、18例の患者から以下の試料を得た。1)子宮内膜症移植片（n＝21）、2)子宮内膜症患者に由来する正所性子宮内膜組織（掻爬による；n=4）、3）子宮内膜症を持たない患者に由来する正常子宮内膜組織（n=6）。いくつかの試料は一個人の異なる部位から得た。試料は液体窒素中で凍結し、-80℃で貯蔵してRNA調製に備えた。子宮内膜症移植片は卵巣から得た。RNA調製用の正常子宮内膜組織と、正常に増殖および分泌を行う子宮内膜組織をホルマリン固定、パラフィン包埋した試料は、平滑筋腫または子宮脱の患者から取得した。病理標本は組織学的試験により段階づけを行った結果、それらは子宮内膜症の第IIIからIV段階にわたっていた（t-ASRM：revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis［改訂版米国生殖医学学会子宮内膜症分類］、1996）。また、この研究の女性被験者は子宮内膜の過形成や腫瘍形成を示さず、手術前に抗炎症剤やホルモン剤の投与を受けていなかった。手術前に書面の同意を得たが、これは東京医科大学病院の人体調査に関する施設内監査委員会により承認されたプロトコルに従った。
1-2．ノーザンブロット分析
ノーザンブロットは文献（Oikawa K. et al. Cancer Res. 2001, 61(15):5707-9）の記載により実施した。HRFプローブは文献（Oikawa K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 290(3):984-7）の記載に従って調製した。ヒトβアクチンcDNA対照プローブ（CLONTECH Laboratories, Inc.）をスタンダードとした。
1-3．サザンブロット分析を用いたRT-PCR
文献（Kubota M. et al. Am. J. Pathol. 1997, 151(3):735-44）の記載に従い、オリゴヌクレオチドdTプライマーを用いてトータルRNAから第1鎖cDNAを合成した。次に、得られた第1鎖cDNA溶液2μl（1x）および10μl（5x）をテンプレートとして用い、PCRを行った。以下の4種類のプライマーを添加した後、初期変性を95℃で2分間、（95℃で0.5分、65℃で0.5分、72℃で1分）×22サイクルの条件でCYP1A1とβアクチンのcDNA断片のPCR増幅した。
【００２０】
CYP1A1増幅用プライマー：5’-ccacaaccaccaagaactgcttag-3’（SEQ ID: 3）
5’-gaaggggacgaaggaagagtg-3’（SEQ ID: 4）
βアクチン増幅用プライマー：5’-gggaaatcgtgcgtgacgttaag-3’（SEQ ID: 5）
5’-tgtgttggcgtacaggtctttg-3’（SEQ ID: 6）
増幅産物をアガロースゲル上の電気泳動により分画した後、ブロッティングとハイブリダイゼーションを行った。CYP1A1 cDNAプローブは、上述のプライマー対を用いた逆転写PCRにより得た。ヒトβアクチンcDNAプローブ（CLONTECH）を対照として用いた。Rediprime II random trime labeling system（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、これらのcDNAプローブを32Pにより標識した。
1-4．抗体調製と免疫組織化学法
ヒトHRFに由来するオリゴペプチド（GKLEEQRPERVKPFMT：SEQ ID: 2の101-116）に対するペプチド抗体を、ウサギを用いた標準法により行った作製し、HRF-GKLと命名した。免疫組織化学的分析は、脱パラフィン化した切片を抗HRF抗体、HRF-TPY（Oikawa K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 290(3):984-7）およびHRF-GKL（1:100に稀釈）または抗ヒトCD68抗体（1:100に稀釈；Dako社）の混合液の存在下で一夜インキュベートした。抗HRF染色用には、脱パラフィン化した切片を圧力滅菌器を用いて熱誘導性の抗原回復に供した。LSABC（Dako）を用いて検出を行ったが、ここでは3,3’-ジアミノベンチジンを色素体として使用した。ヘマトキシリンを用いて逆染色を行った。
1-5.ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析は文献（Oikawa K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 290(3):984-7）の記載に従って行った。膜のプローブ処理は抗HRF（HRF-GKLまたはHRF-TPY）抗体を用い、1:2000の稀釈比で行った。シグナル検出はECL plus Western blotting detection system（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて行った。
1-6．細胞培養とレトロウイルス感染
NIH3T3細胞はAmerican Type Culture Collection（ATCC）より取得した。細胞は、37℃条件で10% FBSを添加したDMEM（GIBCO BRL, Life Technologies, Inc.）中、5％CO２環境下に維持した。全長ORFを含むマウスHRF cDNAを以下のプライマーを用いてPCR増幅した。
【００２１】
5’-ttggatccatgatcatctaccgggacctg-3’（SEQ ID: 7）
5’-ttgaattcttaacatttctccatctctaa-3’（SEQ ID: 8）
得られたcDNA断片をBamHIおよびEcoRIで消化し、レトロウイルス発現ベクターMSCV-puro（CLONTECH）のBglII-EcoRI部位にクローニングした。組み替えレトロウイルスの調製と感染のプロトコルは文献（Kuroda > et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96(9):5025-30）の記載に従った。感染の24時間後、1μg／mlピューロマイシン（CLONTECH）を用いて2週間にわたり感染細胞を選別した。
1-7．動物と処置
5×10５個の細胞の部分標本を、6週齢のメスBALB/Cヌードマウスの腹腔内に注射して移植アッセイを行った。2週間後に動物を屠殺し、移植片コロニー数を測定した。
2．結果
2-1．子宮内膜症におけるTCDD誘導性遺伝子HRFの発現パターン
ノーザンブロット分析により、子宮内膜症時のHRF発現パターンを決定した。その結果、5例中3例の患者から得た子宮内膜症移植片組織中に高レベルのHRF発現が認められた（図１Aおよび１B）。ヒトのチトクロームp450遺伝子スーパーファミリーの一部（例えばCYP1A1、CYP1A2およびCYP1B1）はジオキシンにより誘導されるため、CYP1A1の誘導はジオキシン依存性の遺伝子発現調節に対する基本的な標的になる。このためジオキシン曝露とHRF発現の関連を調べるために、ここではサザン分析によるRT-PCRを用いてCYP1A1発現を調査した（Trifa Y. et al. J. Biol. Chem. 1998, 273(7):3980-5; Oikawa K. et al. Gene 2000, 261(2):221-8）。その結果、CYP1A1は必ずしも高HRF発現を示す全例において誘導されている訳ではなかった（図１Aおよび１B）。このため、いくつかのケースではHRF発現がTCDDにより誘導されている可能性はあるにも関わらず、子宮内膜症移植片におけるHRFはTCDD曝露とは無関係に誘導されていることが確認された。
2-2．子宮内膜症移植片におけるHRF過剰発現
子宮内膜症を追加発症した患者の子宮内膜症移植片において、HRFが過剰発現していることが確認された。すなわち、7例の子宮内膜症患者について、ノーザンブロット分析を行った（図2A）。正常な子宮内膜組織および子宮内膜症患者の正所性の子宮内膜と比較すると、子宮内膜症移植片においては高度なHRF発現が観察された（図2B）。
2-3．正常子宮内膜と子宮内膜症移植片におけるHRFの免疫組織化学
HRFを発現する子宮内膜細胞のタイプを、抗HRFポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学により決定した。その結果、HRFが子宮内膜腺と正常組織の間質細胞に共に存在することが同定されたが、宮内膜腺は間質細胞より強い発現を示した（図3Aおよび3B）。分泌と増殖フェーズの間における発現パターンの顕著な変化はなかった。さらに、子宮内膜症移植片におけるHRF発現も調査した。その結果、卵巣の子宮内膜症移植片の間質および上皮成分の両方にHRFが存在していた（図3Cと3E）。正常な子宮内膜の間質細胞でのHRF発現は弱いのに対して、卵巣の子宮内膜症移植片では子宮内膜腺と間質細胞はいずれも同様な高レベルのHRF発現を示した。これらのHRFに対する特異的なシグナルは、免疫前血清を対照として用いた場合には観察されなかった（データ示さず）。しかしながら、子宮内膜症移植片におけるHRF誘導のメカニズムは依然として不明である。M-CSFによる活性化段階においてマクロファージがHRFを誘導することを示す報告（Teshima S. et al. J. Immunol. 1998, 161(11):6353-66）と一致するように、子宮内膜症移植片においてはCD68陽性のマクロファージの関与が観察されている（Hornung D. et al. Am. J. Pathol. 2001, 158(6):1949-54）。従って、移植片の連続切片に対するCD68染色を利用して、HRF過剰発現領域内部におけるCD68陽性のマクロファージを同定した（図3F）。ヘマトキシリン-エオジンを用いて染色した対照切片は、子宮内膜症移植片の全体的な形態を示している。これらの結果から、子宮内膜症移植片におけるHRF産生にはマクロファージが寄与しているであろうと考えられる。
2-4．NIH3T3細胞の腹腔内移植に対するHRFの効果
HRF発現増加による生理学的な影響について調査した。子宮内膜症の原因は未だに不明である（Klninckx R.P. et al. Gynecol Obstet Invest. 1999, 47 Suppl 1:3-9, discussion 9-10; van der Linden P.J.Q. Front Biosci. 1997, 2:c48-52）。主要な仮説に従うならば、子宮内膜症の発症は、卵管逆流により腹腔に達した（逆行性月経）子宮内膜組織の移植および増殖による。ここではこの移植に対してHRFが及ぼす影響を調査した。最初に、HRFを過剰発現するNIH3T3細胞の安定形質移入体を作製した。HRF発現用のレトロウイルスベクター（pMSCV-HRF）を感染後に、高度なHRF発現が確認された（図4A）。次にこれらの細胞（pMSCV-HRF-3T3細胞）をヌードマウスの腹腔内に注射した。pMSCV-HRF-3T3細胞は、対照ベクター（pMSC-3T3）を感染させた細胞と比較して高い移植能を有していた（図4B）。これらのデータから、HRFは免疫学的機能不全においてのみならず、子宮内膜症移植片の初期発達にも重要な役割を果たしていることが示唆された。
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、子宮内膜症関連疾患の分子メカニズムを利用した当該疾患の治療薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
子宮内膜症は一般的な産婦人科疾患であり、生殖可能年齢にある全女性の10％に影響している（非特許文献1）。子宮内膜症の組織は正所性子宮内膜のように周期的な増殖と崩壊を経て、周期的月経困難症、性交疼痛症、骨盤痛、および月経時血尿の原因になる。さらに不妊症患者の30〜40％がこの疾患を有していることも報告されている（非特許文献2）。一部の患者で子宮内膜細胞が転移し、異所的に増殖する際のメカニズムは未だに不明であるが、炎症性サイトカインの脱調節化が子宮内膜症の進行に寄与している可能性がある（非特許文献3、4）。事実、単球の活性化と腹腔内への移動が、子宮内膜症において最も一貫して報告されている免疫学的異常性の一つとなっている（非特許文献5〜8）。
【０００３】
ダイオキシンは内分泌攪乱物質の一種であり、環境中に遍在している。3,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxisin（TCDD；ダイオキシン）はダイオキシン群の中でも最も毒性が高い物質であり、各種の毒性効果（例えば、免疫毒性、血液毒性、催奇形性、および発ガン性など）を有している（非特許文献9、10）。TCDDおよび関連化合物が誘導する遺伝子発現の変化は、毒素がアリル炭化水素受容体（AhR）に結合した時点で開始され、次にアリル炭化水素受容体核トランスロケーター（ARNT）と二量体を形成して、XRE（異物応答配列）モチーフを含む遺伝子調節要素と相互作用する複合体を形成する（非特許文献11、12）。サルをTCDDに慢性曝露させると、用量依存的に軽度から重度の子宮内膜症が発現したことから（非特許文献13）、ダイオキシンと子宮内膜症の関連性について幾つかの研究が行われた（非特許文献14〜１8）。しかしながらTCDD曝露は子宮内膜症に相関しないと言う結果が最近報告され（非特許文献19、20）、ダイオキシン曝露と子宮内膜症の関連性は不明のままとなっている。
【０００４】
なおこの出願の発明者らは、IgE依存性ヒスタミン放出因子（Histamine Releasing Foctor:HRF）を含むTCDD標的遺伝子を同定している（非特許文献21〜23）。しかしながら、このようなTCDD標的遺伝子産物としてのHRFと子宮内膜症との関係は一切知られていない。
【非特許文献１】Wheeler J.M. J. Reprod Med. 1989, 34(1):41-6
【非特許文献２】：Candiani G.B. et al. Obstct Gynecol. Surv. 1991, 46(6):374-82
【非特許文献３】Garcia-Velasco J.A. and Arici A. Fertil Steril. 1999, 71(6):983-93
【非特許文献４】Barcz et al. Med. Sci. Monit. 2000, 6(5):1042-6
【非特許文献５】Jolicoeur C. et al. Am. J. Pathol. 1998, 152(1):125-33
【非特許文献６】Lebovic D.I. et al. Fertil Steril 2001, 75(1):1-10
【非特許文献７】Hornung D. et al. Am. J. Pathol. 2001, 158(6):1949-54
【非特許文献８】Blumenthal R.D. et al. Am. J. Pathol. 2000, 156(5):1581-8
【非特許文献９】Chapman D.E. and Schiller C.M. Toxicol Appl. Pharmacol. 1985, 78(1):147-57
【非特許文献１０】McGregor D.B. et al. Environ Health Perspect. 1998, 106 Suppl 2:755-60
【非特許文献１１】Sagawa K. and Fujii-Kuriyama T. J. Biochem. (Tokyo) 1997, 122(6):1075-9
【非特許文献１２】Nebert D.W. Crit. Rev. Toxicol. 1989, 20(3):153-74
【非特許文献１３】Rier S.E. et al. Fundam. Appl. Toxicol. 1993, 21(4):433-41
【非特許文献１４】Gibbsons A. Science 1993, 262(5183):1373
【非特許文献１５】Obsteen K.G. and Sierra-Rivera E. Endocrinol. 1997, 15(3):301-8
【非特許文献１６】Bruner-Tran K.L. et al. Gynecol. Obstet. Invest. 1999, 48 Suppl. 1:45-56
【非特許文献１７】Johson K.L. et al. Environ Health Perspect 1997, 105(7):750-5
【非特許文献１８】Yang J.Z. and Foster W.G. Toxicol. Ind. Health 1997, 13(1):15-25
【非特許文献１９】Igarashi T. et al. Endocr. J. 1999, 46(6):765-72
【非特許文献２０】Pauwels A. et al. Hum. Reprod. 2001, 16(10):2050-5
【非特許文献２１】Oikawa K. et al. Cancer Res. 2001, 61(15):5707-9
【非特許文献２２】Oikawa K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 290(3):984-7
【非特許文献２３】Ohbayashi et al. FEBS Lett. 2001, 508(3):341-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
子宮内膜症については、その分子メカニズムに基づいた治療薬は存在していなかった。
【０００６】
この出願は、子宮内膜症の発症、進行に関与する分子メカニズムに作用する子宮内膜症関連疾患の治療薬を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記の課題を解決するものとして、細胞内におけるヒスタミン放出因子（HRF）ポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬を提供する。
【０００８】
すなわち、この出願の発明者らは、子宮内膜組織と子宮内膜症移植片におけるTCDD標的遺伝子（HRF、CYP1A1）の発現を調べた結果、子宮内膜症の進行とHRF発現レベルに高い相関関係を見出してこの出願の発明を完成させた。
【０００９】
なおこの発明において、「子宮内膜症関連疾患」とは、子宮内膜症、および子宮内膜症を原因とする月経困難症、不妊症および子宮腺筋症等を意味する。「診断」とは、被験者が子宮内膜症関連疾患に羅患しているか否かの判定、将来的に子宮内膜症関連疾患に羅患する危険性が存在するか否かの判定、および治療後に子宮内膜症関連疾患を再発する危険性が存在するか否かの判定を意味する。また、診断には、子宮内膜症関連疾患の羅患やその危険性がどの程度であるか測定することも含まれる。
【００１０】
また「HRFポリヌクレオチド」とはHRFタンパク質をコードするポリヌクレオチド［プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ATP、GTP、CTP、UTP；またはdATP、dGTP、dCTP、dTTP）が結合した分子を意味する。具体的には、HRFタンパク質をコードするゲノムDNA、ゲノムDNAから転写されるmRNA、mRNAから合成されるcDNAである。また、2本鎖であっても1本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノムDNAやmRNA、cDNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。また「ポリヌクレオチド」とは、前記のヌクレオチドが100個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは2-99個連結した分子を言う。さらに「タンパク質」および「ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。特にアミノ酸残基2-33個のものを「オリゴペプチド」、34個以上のものを「ポリペプチド」と記載する。
【００１１】
また、配列表に示した塩基配列およびアミノ酸配列については、１以上の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に基づく１以上のアミノ酸残基の付加、欠失および他のアミノ酸への置換をも包含する。
【００１２】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、薬剤の調製はRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New York (1993); S. Weissman (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York (1999); J. C. Glorioso et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 306, Academic Press, New York (1999)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】正常子宮内膜組織、子宮内膜症患者に由来する正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片におけるHRFとCYP1A1の発現を調べた結果である。(A)HRF mRNAレベルはノーザンブロット分析により調べた。ブロットの再プローブをヒトβアクチンプローブを用いて行い、トータルRNAレベルを決定した。ノーザンブロットにより調べた試料中のCYP1A1 mRNBAレベルはサザンブロット分析を用いた定量的RT-PCRにより決定した。定量の精度を確認するため、5倍の異なる濃度のcDNA試料（1xおよび5x）をPCRテンプレートとして用い、同様な配置で調べた。βアクチンをmRNA量に対する内部対照として用いた。(B)HRFおよびCYP1A1のmRNAレベルに対する画像表示を同様に示す。mRNAレベルはdensintometry（MOLECULAR IMAGER，Nippon Bio-Rad）を用いてβアクチンシグナルに対して正規化した。試料11−2AはHRFのmRNAレベル、10-2AはCYP1A1のmRNAレベルを示し、任意に10に設定した。複数の試料が一個人由来である場合には、平均値を計算して表示した。エラーバーは複数試料の最大値を表す。12-1、7-1、8-1および6Bは正常な子宮内膜組織であり、アステリスクが印字された1Cは子宮内膜症患者の正所性子宮内膜である。
【図２】子宮内膜症移植片におけるHRF発現を調べた結果である。(A)正常な子宮内膜組織、子宮内膜症患者の正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片におけるHRF発現のノーザンブロット分析の結果である。ブロットはヒトβアクチンプローブを用いて再プローブを行い、トータルRNAレベルを決定した。カラム上のN、EuおよびEnはそれぞれ正常な子宮内膜組織、子宮内膜症患者の正所性子宮内膜組織、および子宮内膜症移植片を示す。(B)図1Aおよび図2Aにおいて調査した試料について、ノーザンブロット分析により測定したHRF mRNAレベルのグラフ表示である。HRF mRNAレベルはdensintometry（MOLECULAR IMAGER，Nippon Bio-Rad）を用いてβアクチンシグナルに対して正規化した。試料6BのmRNAレベルを任意に１に設定した。複数の試料が一個人由来である場合には、平均値を計算して表示した。エラーバーは複数試料の最大値を表す。
【図３】HRFおよびCD68発現の免疫組織化学的分析の結果である。茶色の染色で陽性部分が可視化されている。逆染色にはヘマトキシリンを用いた。(A)および(B)正常な子宮内膜組織におけるHRFタンパク質の検出（A:増殖フェーズ、B:分泌フェーズ、原図倍率ｘ200）。(C)卵巣の子宮内膜症移植片内部におけるHRFタンパク質の検出（原図倍率ｘ200）。(D)子宮内膜症移植片の形態を示す連続切片のH&E染色（原図倍率ｘ200）。(E)さらに高倍率で(C)と同じ視野のHRFタンパク質を検出したもの（原図倍率ｘ400）。(F)子宮内膜症移植片の連続切片におけるCD68陽性マクロファージの免疫組織化学的局在（原図倍率ｘ400）。
【図４】移植アッセイの結果である。(A)NIH3T3細胞内のHRFタンパク質のウエスタンブロット分析の結果。wt：親のNIH3T3細胞、HRF:HRFを含むレトロウイルスベクターによる感染後に安定してHRFを発現する細胞株（pMSCV-HRF-3T3）、vector:空のベクターを感染させた対照細胞（pMSCV-3T3）。(B)ヌードマウスにおけるHRF過剰発現細胞の示す高い移植効率を示す。縦軸上のマークは次の状態を示す。+++：無数の移植コロニーが観察された状態、++：数十個の移植コロニーが観察された状態、+:数個の移植コロニーが観察された状態、−:移植コロニーは観察されなかった状態。対照細胞またはHRF過剰発現細胞を注射した個々のマウスは、それぞれ白丸または黒丸により示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
この出願の発明は、細胞内HRFポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬る。すなわち、後記実施例にも示したように、HRFポリヌクレオチドを過剰に発現する細胞はin vivoにおいて活発に増殖することから、細胞内HRFポリヌクレオチドの過剰発現が子宮内膜組織の移植や増殖の原因となっていると考えられる。そこでこのHRFポリヌクレオチドの発現を抑制することによって、子宮内膜症関連疾患の治療、または少なくともその進行、悪化を停止もしくは抑制することが可能となる。
【００１５】
細胞内HRFポリヌクレオチドの発現を抑制する分子としては、アンチセンス配列、リボザイム、キメラオリゴ、RNA干渉（RNA interference: RNAi）を生じさせる二本鎖RNA分子等（以下、これらは「発現抑制分子」と記載することがある）を使用することができる。特に、RNAiは外来性RNA分子によって標的遺伝子のmRNAを分解し、標的遺伝子の発現を抑制する手法であり、アンチセンス配列等と比較して、標的遺伝子の発現抑制効果が格段に優れているために、好ましい手段である。使用するRNA分子としては、二本鎖RNA（double-strand RNA: dsRNA）、より好ましくはその短鎖（20−25bp程度）のRNA（small interfering RNA: siRNA）（例えば、Elbashir S.M. et al. Genes Dev. 2001, 15(2):188-200）、ヘアピン構造の短鎖RNA（short hairpin RNA: shRNA）（例えば、Paddison P.J. et al. Genes Dev. 2002, 16(8):948-958）、およびsiRNAとは別の短鎖RNA（small temporally regulated RNA: stRNA）（例えば、Grosshans H. and Slack F.J. J. Cell Biol. 2002, 156(1):17-21）等が好ましい。
【００１６】
以上のとおりの発現抑制分子は、標的遺伝子（HRFポリヌクレオチド）の配列（例えば配列番号１）に基づき設計され、公知の化学合成またはin vitro転写翻訳等の手段で作成することができる。なお、例えばsiRNAの設計に当たっては、以下を留意することが提案されている。(1)調節タンパク質結合部位の多い5’および3’の非翻訳領域（UTR）と開始コドン周辺領域は除外する；(2)開始コドンの50から100ヌクレオチド下流の領域を選択する；(3)選択した領域からAA(N19)TTまたはAA(21)となる領域であって、GC含量が少なくとも30％から70％、好ましくは50％程度の領域を選択する。
【００１７】
作成された発現抑制分子は、適当な溶媒と混合した状態で体内に投与することができるが、その効果をより持続させるためには、発現ベクターの形態で投与することが好ましい。発現ベクターとしては、プラスミドベクターまたはウイルスベクター等を使用することができる。例えば、RNAi用のRNA分子を発現させる場合のプラスミドベクターとしては、市販のpiGENEシリーズ、pSINsi/pBAsiシリーズ等を使用することができる。また、ウイルスベクターとしては、複製欠損性か、条件により複製するか、または複製コンピテントとなるべくさらに加工されたアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルスゲノムに由来する複製非コンピテントベクター、例えば米国特許第6,096,718号；6,110,458号；6,113,913号；5,631,236号参照）、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノムに由来するベクター等を使用することができる。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、およびそれらの組合せを主成分とするものが含まれる（例えば、米国特許第6,117,681号；6,107,478号; 5,658,775号; 5,449,614号；Buchscher（1992）J. Virol. 66:2731-2739; Johann（1992）J. Virol. 66:1635-1640参照）。このようなウイルスベクターは、例えばsiRNA発現用のアデノウイルスベクターの場合、先ず、基本プラスミドベクター（例えばpBAsi）を構築し、この基本ベクターからプロモーター＋siRNAコード配列を切り出し、これをアデノウイルスベクター作成用コスミドに載せ換え、この組換えコスミドを293細胞等にトランスフェクションすることによって作成することができる。
【００１８】
以上のとおりの発現ベクターは、通常の遺伝子治療等の手順に従って、患者の子宮内膜等を含め、あらゆる投与経路によっても体内に投与することができる。また、プラスミドベクターの場合には、Hydrodynamic法（Song E. et al. Nature Medicine 2003, 9(3):347-351）によって静脈内に投与することも好ましい方法である。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
1．材料と方法
1-1．組織試料
RNA調製のために、18例の患者から以下の試料を得た。1)子宮内膜症移植片（n＝21）、2)子宮内膜症患者に由来する正所性子宮内膜組織（掻爬による；n=4）、3）子宮内膜症を持たない患者に由来する正常子宮内膜組織（n=6）。いくつかの試料は一個人の異なる部位から得た。試料は液体窒素中で凍結し、-80℃で貯蔵してRNA調製に備えた。子宮内膜症移植片は卵巣から得た。RNA調製用の正常子宮内膜組織と、正常に増殖および分泌を行う子宮内膜組織をホルマリン固定、パラフィン包埋した試料は、平滑筋腫または子宮脱の患者から取得した。病理標本は組織学的試験により段階づけを行った結果、それらは子宮内膜症の第IIIからIV段階にわたっていた（t-ASRM：revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis［改訂版米国生殖医学学会子宮内膜症分類］、1996）。また、この研究の女性被験者は子宮内膜の過形成や腫瘍形成を示さず、手術前に抗炎症剤やホルモン剤の投与を受けていなかった。手術前に書面の同意を得たが、これは東京医科大学病院の人体調査に関する施設内監査委員会により承認されたプロトコルに従った。
1-2．ノーザンブロット分析
ノーザンブロットは文献（Oikawa K. et al. Cancer Res. 2001, 61(15):5707-9）の記載により実施した。HRFプローブは文献（Oikawa K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 290(3):984-7）の記載に従って調製した。ヒトβアクチンcDNA対照プローブ（CLONTECH Laboratories, Inc.）をスタンダードとした。
1-3．サザンブロット分析を用いたRT-PCR
文献（Kubota M. et al. Am. J. Pathol. 1997, 151(3):735-44）の記載に従い、オリゴヌクレオチドdTプライマーを用いてトータルRNAから第1鎖cDNAを合成した。次に、得られた第1鎖cDNA溶液2μl（1x）および10μl（5x）をテンプレートとして用い、PCRを行った。以下の4種類のプライマーを添加した後、初期変性を95℃で2分間、（95℃で0.5分、65℃で0.5分、72℃で1分）×22サイクルの条件でCYP1A1とβアクチンのcDNA断片のPCR増幅した。
【００２０】
CYP1A1増幅用プライマー：5’-ccacaaccaccaagaactgcttag-3’（SEQ ID: 3）
5’-gaaggggacgaaggaagagtg-3’（SEQ ID: 4）
βアクチン増幅用プライマー：5’-gggaaatcgtgcgtgacgttaag-3’（SEQ ID: 5）
5’-tgtgttggcgtacaggtctttg-3’（SEQ ID: 6）
増幅産物をアガロースゲル上の電気泳動により分画した後、ブロッティングとハイブリダイゼーションを行った。CYP1A1 cDNAプローブは、上述のプライマー対を用いた逆転写PCRにより得た。ヒトβアクチンcDNAプローブ（CLONTECH）を対照として用いた。Rediprime II random trime labeling system（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、これらのcDNAプローブを32Pにより標識した。
1-4．抗体調製と免疫組織化学法
ヒトHRFに由来するオリゴペプチド（GKLEEQRPERVKPFMT：SEQ ID: 2の101-116）に対するペプチド抗体を、ウサギを用いた標準法により行った作製し、HRF-GKLと命名した。免疫組織化学的分析は、脱パラフィン化した切片を抗HRF抗体、HRF-TPY（Oikawa K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 290(3):984-7）およびHRF-GKL（1:100に稀釈）または抗ヒトCD68抗体（1:100に稀釈；Dako社）の混合液の存在下で一夜インキュベートした。抗HRF染色用には、脱パラフィン化した切片を圧力滅菌器を用いて熱誘導性の抗原回復に供した。LSABC（Dako）を用いて検出を行ったが、ここでは3,3’-ジアミノベンチジンを色素体として使用した。ヘマトキシリンを用いて逆染色を行った。
1-5.ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析は文献（Oikawa K. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 290(3):984-7）の記載に従って行った。膜のプローブ処理は抗HRF（HRF-GKLまたはHRF-TPY）抗体を用い、1:2000の稀釈比で行った。シグナル検出はECL plus Western blotting detection system（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて行った。
1-6．細胞培養とレトロウイルス感染
NIH3T3細胞はAmerican Type Culture Collection（ATCC）より取得した。細胞は、37℃条件で10% FBSを添加したDMEM（GIBCO BRL, Life Technologies, Inc.）中、5％CO２環境下に維持した。全長ORFを含むマウスHRF cDNAを以下のプライマーを用いてPCR増幅した。
【００２１】
5’-ttggatccatgatcatctaccgggacctg-3’（SEQ ID: 7）
5’-ttgaattcttaacatttctccatctctaa-3’（SEQ ID: 8）
得られたcDNA断片をBamHIおよびEcoRIで消化し、レトロウイルス発現ベクターMSCV-puro（CLONTECH）のBglII-EcoRI部位にクローニングした。組み替えレトロウイルスの調製と感染のプロトコルは文献（Kuroda > et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96(9):5025-30）の記載に従った。感染の24時間後、1μg／mlピューロマイシン（CLONTECH）を用いて2週間にわたり感染細胞を選別した。
1-7．動物と処置
5×10５個の細胞の部分標本を、6週齢のメスBALB/Cヌードマウスの腹腔内に注射して移植アッセイを行った。2週間後に動物を屠殺し、移植片コロニー数を測定した。
2．結果
2-1．子宮内膜症におけるTCDD誘導性遺伝子HRFの発現パターン
ノーザンブロット分析により、子宮内膜症時のHRF発現パターンを決定した。その結果、5例中3例の患者から得た子宮内膜症移植片組織中に高レベルのHRF発現が認められた（図１Aおよび１B）。ヒトのチトクロームp450遺伝子スーパーファミリーの一部（例えばCYP1A1、CYP1A2およびCYP1B1）はジオキシンにより誘導されるため、CYP1A1の誘導はジオキシン依存性の遺伝子発現調節に対する基本的な標的になる。このためジオキシン曝露とHRF発現の関連を調べるために、ここではサザン分析によるRT-PCRを用いてCYP1A1発現を調査した（Trifa Y. et al. J. Biol. Chem. 1998, 273(7):3980-5; Oikawa K. et al. Gene 2000, 261(2):221-8）。その結果、CYP1A1は必ずしも高HRF発現を示す全例において誘導されている訳ではなかった（図１Aおよび１B）。このため、いくつかのケースではHRF発現がTCDDにより誘導されている可能性はあるにも関わらず、子宮内膜症移植片におけるHRFはTCDD曝露とは無関係に誘導されていることが確認された。
2-2．子宮内膜症移植片におけるHRF過剰発現
子宮内膜症を追加発症した患者の子宮内膜症移植片において、HRFが過剰発現していることが確認された。すなわち、7例の子宮内膜症患者について、ノーザンブロット分析を行った（図2A）。正常な子宮内膜組織および子宮内膜症患者の正所性の子宮内膜と比較すると、子宮内膜症移植片においては高度なHRF発現が観察された（図2B）。
2-3．正常子宮内膜と子宮内膜症移植片におけるHRFの免疫組織化学
HRFを発現する子宮内膜細胞のタイプを、抗HRFポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学により決定した。その結果、HRFが子宮内膜腺と正常組織の間質細胞に共に存在することが同定されたが、宮内膜腺は間質細胞より強い発現を示した（図3Aおよび3B）。分泌と増殖フェーズの間における発現パターンの顕著な変化はなかった。さらに、子宮内膜症移植片におけるHRF発現も調査した。その結果、卵巣の子宮内膜症移植片の間質および上皮成分の両方にHRFが存在していた（図3Cと3E）。正常な子宮内膜の間質細胞でのHRF発現は弱いのに対して、卵巣の子宮内膜症移植片では子宮内膜腺と間質細胞はいずれも同様な高レベルのHRF発現を示した。これらのHRFに対する特異的なシグナルは、免疫前血清を対照として用いた場合には観察されなかった（データ示さず）。しかしながら、子宮内膜症移植片におけるHRF誘導のメカニズムは依然として不明である。M-CSFによる活性化段階においてマクロファージがHRFを誘導することを示す報告（Teshima S. et al. J. Immunol. 1998, 161(11):6353-66）と一致するように、子宮内膜症移植片においてはCD68陽性のマクロファージの関与が観察されている（Hornung D. et al. Am. J. Pathol. 2001, 158(6):1949-54）。従って、移植片の連続切片に対するCD68染色を利用して、HRF過剰発現領域内部におけるCD68陽性のマクロファージを同定した（図3F）。ヘマトキシリン-エオジンを用いて染色した対照切片は、子宮内膜症移植片の全体的な形態を示している。これらの結果から、子宮内膜症移植片におけるHRF産生にはマクロファージが寄与しているであろうと考えられる。
2-4．NIH3T3細胞の腹腔内移植に対するHRFの効果
HRF発現増加による生理学的な影響について調査した。子宮内膜症の原因は未だに不明である（Klninckx R.P. et al. Gynecol Obstet Invest. 1999, 47 Suppl 1:3-9, discussion 9-10; van der Linden P.J.Q. Front Biosci. 1997, 2:c48-52）。主要な仮説に従うならば、子宮内膜症の発症は、卵管逆流により腹腔に達した（逆行性月経）子宮内膜組織の移植および増殖による。ここではこの移植に対してHRFが及ぼす影響を調査した。最初に、HRFを過剰発現するNIH3T3細胞の安定形質移入体を作製した。HRF発現用のレトロウイルスベクター（pMSCV-HRF）を感染後に、高度なHRF発現が確認された（図4A）。次にこれらの細胞（pMSCV-HRF-3T3細胞）をヌードマウスの腹腔内に注射した。pMSCV-HRF-3T3細胞は、対照ベクター（pMSC-3T3）を感染させた細胞と比較して高い移植能を有していた（図4B）。これらのデータから、HRFは免疫学的機能不全においてのみならず、子宮内膜症移植片の初期発達にも重要な役割を果たしていることが示唆された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内におけるヒスタミン放出因子（HRF）ポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬。
【請求項１】
細胞内におけるヒスタミン放出因子（HRF）ポリヌクレオチドの発現を抑制する分子を含有することを特徴とする子宮内膜症関連疾患の治療薬。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２０９１５８（Ｐ２００９−２０９１５８Ａ）
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４８０６０（Ｐ２００９−１４８０６０）
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【分割の表示】特願２００５−５１１４５４（Ｐ２００５−５１１４５４）の分割
【原出願日】平成１６年１月１３日（２００４．１．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１５年１月１３日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１７日（２００９．９．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２２日（２００９．６．２２）
【分割の表示】特願２００５−５１１４５４（Ｐ２００５−５１１４５４）の分割
【原出願日】平成１６年１月１３日（２００４．１．１３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１５年１月１３日 インターネットアドレス「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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