容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置
【課題】 培養系を開放することなく、また細胞密度に拘わらず、培養容器内の細胞数を計測することを可能とする。
【解決手段】 密封された容器内の液体中の計数対象物の数を計測する方法であって、容器の少なくとも一部の厚みを調整し、調整した範囲の少なくとも一部を測定対象範囲として、当該測定対象範囲における計数対象物の数を計測する容器内の計数対象物の計数方法。
【解決手段】 密封された容器内の液体中の計数対象物の数を計測する方法であって、容器の少なくとも一部の厚みを調整し、調整した範囲の少なくとも一部を測定対象範囲として、当該測定対象範囲における計数対象物の数を計測する容器内の計数対象物の計数方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、容器内の計数対象物の計数方法に関し、特に密封された培養容器内における培養液中の細胞数を数えるための容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような細胞培養においては、細胞の増殖に併せて、培養液における細胞の密度を適正な範囲に維持することが必要である。
【０００３】
すなわち、培養液における細胞密度が大きすぎると各細胞に十分な酸素や栄養を供給することができなくなり、細胞増殖効率が低下する。また、培養液における細胞密度が小さすぎても十分な増殖効率が得られない。
そこで、細胞培養においては、培養中に細胞密度を把握するため、適宜培養容器内における培養液中の細胞数を計測する必要があった。
【０００４】
例えば、特許文献１には、細胞の増殖に併せて培養液における細胞密度を適正に維持することができる細胞培養装置が開示されている。
このような細胞培養装置を用いて細胞数の計測を行う場合、従来は培養容器内につながるチューブから培養細胞が含まれる培養液を採集し、所定の緩衝液を加えて培養液における細胞を測定に適する密度に調整した後、計数盤へ注入し、人や機械によってその数を読み取って、細胞密度を算出するということが行われていた。
【０００５】
また、特許文献２には、撮影手段を備えた培養装置が開示されている。この培養装置によれば、細胞画像を定期的に取得し、保存することが可能になっている。
【０００６】
【特許文献１】国際公開２００８／１３６３７１号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００７／０５２７１８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の細胞培養装置を用いて培養液中の細胞を計数する方法では、培養容器内から培養液を採集する必要があり、培養系が開放されるため、雑菌などが混入するコンタミネーションのリスクがあった。
【０００８】
また、特許文献２に記載の培養装置では、細胞画像を取得することはできるが、その画像にもとづき細胞数を正確に計測し、細胞密度を得ることは困難であった。
すなわち、特許文献２に記載の撮影手段により培養容器内の細胞を撮影する場合、細胞画像の細胞数を計測して、これを当該撮影手段の視野内における培養液の容積で除算することで、細胞密度を算出することはできる。
しかし、このように細胞容器内の細胞を直接観察する場合、図１７に示すように、細胞の密度が大きく細胞が重なり合うときは、細胞数を正確に計測することができない。また、細胞の密度が小さすぎるときは、全体の密度予測が難しく、算出される細胞密度の精度が低くなってしまうという問題があった。
【０００９】
このように撮影手段を用いて培養容器内の細胞を直接計測する場合、従来の計数盤を用いて実測する場合に比較すると、計数盤の厚さが０．１ｍｍであるのに対して培養容器の厚さは１〜２ｃｍ程度であり、その厚さが１００〜２００倍となっている。
このため、撮影手段から見える細胞数は、同じ体積密度でも計数盤を用いて実測する場合の１００〜２００倍となってしまう。したがって、培養容器内の細胞は互いに重なり合う場合が多く、培養容器内の細胞を直接観測して細胞数を計測することは、困難であった。
【００１０】
そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、培養容器の厚みを調整して、撮影手段から見える細胞数を計測可能な数にした後に、培養容器内の細胞数を直接観測により計測することで、実測値に近い細胞密度を得ることに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、培養系を開放することなく、かつ増殖した細胞の密度に拘わらず、培養環境下のあらゆる密度範囲で細胞数を計測することが可能な容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の容器内の計数対象物の計数方法は、密封された容器内の液体中の計数対象物の数を計測する方法であって、容器の少なくとも一部の厚みを調整し、調整した範囲の少なくとも一部を測定対象範囲として当該測定対象範囲における計数対象物の数を計測する方法としてある。
また、本発明の容器内の計数対象物の計数方法は、容器の液体を攪拌し、液体中の計数対象物を均等化した後に、容器の少なくとも一部の厚みを調整する方法としてある。
【００１２】
また、本発明の計数用装置は、密封された容器内の液体中の計数対象物の数を計測するための計数用装置であって、容器を積載する積載台と、容器における測定対象範囲を含む少なくとも一部を所定の厚みに調整する調整部材とを備えた構成としてある。
また、本発明の計数用装置に、さらに調整部材により容器の厚みを調整する前に、容器内の液体を攪拌する攪拌部材を備えた構成とすることもできる。
【００１３】
また、本発明の計数用装置に、さらに容器内の計数対象物を撮影する撮影手段と、撮影された画像内の計数対象物の数を計測する計数手段と、計数手段による計測の結果、計数対象物の数が所定の範囲内に無い場合、画像内の計数対象物の数が、所定の範囲内になるように、調整部材を駆動して、容器の少なくとも一部を所定の厚みに調整させる駆動装置とを備えた構成とすることもできる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、培養系を開放することなく、また増殖した細胞の密度に拘わらず、細胞数を計測することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の容器内の計数対象物の計数方法の原理を示す図である。
【図２】本発明の第一実施形態の計数用装置の構成を示す図である。
【図３】本発明の第一実施形態の計数用装置による容器の厚み調整方法（厚みを減らす場合）を示す図である。
【図４】本発明の第一実施形態の計数用装置による容器の厚み調整方法（厚みを増やす場合）を示す図である。
【図５】本発明の第二実施形態の計数用装置の構成を示す図である。
【図６】本発明の第二実施形態の計数用装置における駆動装置（攪拌部材用）の構成を示す図である。
【図７】本発明の第三実施形態の計数用装置の基本位置を示す図である。
【図８】本発明の第三実施形態の計数用装置の攪拌状態を示す図である。
【図９】本発明の第三実施形態の計数用装置の厚さ調整及び沈殿待ち状態（厚さを減少させる場合）を示す図である。
【図１０】本発明の第三実施形態の計数用装置の顕微鏡観察状態を示す図である。
【図１１】本発明の第三実施形態の計数用装置の厚さ調整及び沈殿待ち状態（厚さを増加させる場合）を示す図である。
【図１２】本発明の実施例及び比較例で使用した培養容器を示す図である。
【図１３】本発明の実施例１及び比較例１における細胞の画像を示す図である。
【図１４】本発明の実施例１及び比較例１の結果を示す図である。
【図１５】本発明の実施例２〜５における細胞の画像を示す図である。
【図１６】本発明の実施例２〜５の結果を示す図である。
【図１７】従来の容器内の計数対象物の計数方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
まず、本発明の容器内の計数対象物の計数方法の原理について、図１を参照して説明する。
同図は、顕微鏡を用いて培養容器内の細胞を直接観察し、その数を計測する様子を示したものであり、図１（Ａ）は、従来のように、容器の厚さを調節することなく、観測する場合を示している。なお、培養液としてその比重が細胞の比重よりも小さいものを使用することで、細胞を容器の底に沈め、顕微鏡観察に適したものとすることができる。また反対に比重の大きい培養液を使用して細胞を容器の上部に集めて観察するようにしても良い。
【００１７】
図１（Ａ）の場合、容器内の細胞数が増加するにつれ、懸濁して静置させたときに、次第に重なり合いが生じてくる。したがって、この方法では細胞を大量に培養する場合に、細胞数を正確に計測することができない。
【００１８】
そこで、本発明では、細胞数が多すぎて正確に計測することができない場合には、図１（Ｂ）に示すように、容器の厚みを減少させることで、観測範囲（測定対象範囲）における細胞数を減少させ、計測に適した細胞数に調整する。
これによって、培養容器により細胞を大量に培養する場合でも、培養容器内の細胞を直接観察することで、培養系を開放することなく、細胞数を計測することが可能となっている。
また、培養容器内の細胞数が少なく、培養容器全体の密度予測が難しい場合にも、容器の厚みを増大させることで、観測範囲内における細胞数を増加させ、計測に適した細胞数に調整することができる。
【００１９】
［第一実施形態］
次に、本発明の第一実施形態の容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置について、図２を参照して説明する。同図は、本実施形態の計数用装置の構成を示す図である。
本実施形態の計数用装置１は、同図に示すように、厚さ調整部材２、容器積載台３、撮影手段４、駆動装置（調節部材用）５、駆動装置（撮影手段用）６、及び照明７を備えており、容器積載台３上に培養容器８を配置して、培養容器８内の培養細胞数を計測する。
【００２０】
厚さ調整部材２は、容器積載台３上の培養容器８を調節する。同図の例では、厚さ調整部材２は培養容器８を押圧するための平面部分を有する押圧板からなり、軟包材からなる培養容器８の一部を上から押圧することで、その厚さを減少させることが可能となっている。
【００２１】
また、厚さ調整部材２における少なくとも培養容器８の測定対象範囲の上方部分は透明な材料からなり、当該部分を照明７により上方から照らし、顕微鏡及びＣＣＤカメラからなる撮影手段４により下方から観察するようになっている。
なお、厚さ調整部材２は、図２に示すような平面部分により培養容器８を押圧する押圧板に限定されるものではなく、ローラや引張部材を用いて構成することもできる。
【００２２】
例えばローラにより培養容器８を上下の両方から又は一方から押圧しつつ移動させて、培養容器８の水平面積を減少させることで、培養容器８の厚みを増加させることができる。また、引張部材を用いて培養容器８を水平方向に引き伸ばすことで、培養容器８の厚みを減少させることもできる。
【００２３】
容器積載台３は、培養容器８を載置させるための平面の台であり、厚さ調整部材２とともに、計数用の積載装置を構成する。
この容器積載台３における測定対象範囲の下方部分は、ガラス板などの透明な部材により構成され、撮影手段４により下方から培養容器８を観測できるようになっている。
【００２４】
駆動装置（調節部材用）５は、図２に示すように、ボールスクリューネジにより、厚さ調整部材２を上下に移動させるものである。これにより容器積載台３上の培養容器８に厚さ調整部材２を押しつけて、培養容器８の厚さを調節可能にしている。
この駆動装置（調節部材用）５には、例えばロッド型電動シリンダ（垂直方向動作用アクチュエータ）を用いることができ、これによって、培養容器８の厚さを０．１ミリ単位できめ細かく調整することが可能である。
【００２５】
また、駆動装置（撮影手段用）６は、図２に示すように、ボールスクリューネジにより、撮影手段４を容器積載台３に対して水平方向に移動するものである。この駆動装置（撮影手段用）６によって、培養容器８内における細胞の撮影時以外は、撮影手段４を容器積載台３の外側に配置し、撮影時に撮影手段４を培養容器８の測定対象範囲の下に移動させることができる。
なお、駆動装置（調節部材用）５や駆動装置（撮影手段用）６を、電動アクチュエータの他、空気圧や油圧、電磁力を利用したアクチュエータを用いて構成したり、あるいはモータやカムを用いて構成したりすることもできる。
【００２６】
照明７は、厚さ調整部材２を介して培養容器８における測定対象範囲を照らし、撮影手段４による細胞の撮影に必要な明るさを提供する。
培養容器８は、軟包材を材料として、袋状（バック型）に形成した容器である。このように、培養容器８の材料として軟包材を用いることで、培養容器８に可撓性・柔軟性を付与することができる。軟包材としては、例えば、特開２００２−２５５２７７号公報（軟包材フィルムシートを用いた食品包装体及び食品の取り出し方法）や、特開２００４−３２３０７７号公報（加圧抽出形の袋状容器）に記載されているものなどを用いることができる。
【００２７】
また、培養容器８は、細胞培養に必要なガス透過性を有しており、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。このような条件を満たす培養容器の材料としては、例えばポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーンゴム等を挙げることができる。
【００２８】
次に、本実施形態の計数用装置による培養容器８の厚さ調整の例について、図３及び図４を参照して説明する。図３は容器の厚みを減らす場合を示すものであり、図４は容器の厚みを増やす場合を示すものである。
【００２９】
培養容器８の厚みを減らす場合、容器の厚み調整は、図２に示すものの他、例えば、図３の（ａ）に示すように、厚さ調整部材２を培養容器８の下方から押圧することにより行うことができる。なお、図示していないが、このとき培養容器８の上面の位置をガラス板などにより固定することが好ましい。
【００３０】
また、培養容器８が水平に伸ばせる材料からなる場合には、図３の（ｂ）に示すように、培養容器８の全面を覆い得る厚さ調整部材２を用いて培養容器８を押圧し、培養容器８の厚さを減少させることもできる。また、図３の（ｃ）に示すように、厚さ調整部材２により培養容器８を引き伸ばして、その厚さを減少させることもできる。この場合、培養容器８の縁の一端を固定するとともに、水平方向反対側の縁を引張部材からなる厚さ調整部材２により引っ張る構成にしたり、あるいは２つの厚さ調整部材２を使用して、培養容器８の水平方向両端を引っ張ることで、培養容器８を引き伸ばす構成にすることもできる。このような柔軟な培養容器８の材料としては、例えばシリコーンゴムなどを用いることができる。
【００３１】
一方、培養容器８の厚みを増やす場合は、例えば、図４の（ｄ）に示すように、培養容器８の上面の一部を厚さ調整部材２により押圧して、培養容器８における押圧した部分以外の厚みを増加させるようにすることができる。
また、図４の（ｅ）に示すように、厚さ調整部材２としてローラなどを使用し、これを移動させて培養容器８を押圧することで、培養容器８の水平面積を減少させ、培養容器８の厚みを増加させることもできる。
【００３２】
次に、本実施形態の容器内の計数対象物の計数方法について、図２を参照してより詳細に説明する。
まず、培養容器８内の細胞数を計測する工程に先だって、培養容器８内の培養液を攪拌することが好ましい。なお、培養液の攪拌手段については、第二実施形態において、詳細に説明する。
【００３３】
次に、駆動装置（撮影手段用）６を用いて、撮影手段４を培養容器８の測定対象範囲の下に移動させる。
次に、駆動装置（調節部材用）５を用いて、厚さ調整部材２を降下させ、培養容器８の厚さを所定の厚さに調整する。
このとき、所定の厚さは、細胞の種類、培養容器のサイズ、測定対象範囲の面積、及び培養期間などにより種々の値を取り得る。
【００３４】
次に、照明７により測定対象範囲を照らして、撮影手段４により撮影する。そして、撮影した画像上の細胞を計数する。このとき、撮影手段４から計数手段に撮影した画像を送信させ、この計数手段により自動的に細胞数を計測することができる。このような計数手段としては、公知の細胞計数分析装置や細胞数計測装置等を用いることができる。
【００３５】
ここで、本実施形態では、培養液として比重が培養細胞よりも小さいものを使用することで、培養細胞を培養容器８の底に沈殿させ、撮影手段の焦点を沈殿した細胞に合わせることでこれらを撮影することができる。しかしなら、細胞密度が大きく、測定対象範囲における細胞が重なり合う場合は、細胞数を正しく計数することができない。
そこで、本実施形態の容器内の計数対象物の計数方法では、このように測定対象範囲における細胞が重なり合う場合は、厚さ調整部材２を移動させて培養容器８の厚さを減少し、計測対象の細胞数を減らすことで、細胞を計測可能にしている。
【００３６】
なお、測定対象範囲おいて重なり合うことなく観測できる最大細胞数は、おおよそ測定対象範囲の面積を培養細胞の平均水平面積で除算した数未満と考えることができる。そこで、細胞を計数した結果、細胞数が当該最大細胞数以上に算出されている場合は、培養容器８の厚さをさらに減少させて、再度計数を行うことが好ましい。また、細胞を測定対象範囲に密に並べた場合の数をより正確に推定し、その推定値を最大細胞数として用いるなど、その他の値を培養容器８の厚さ調整を行うか否かの判断に用いることもできる。
【００３７】
また、細胞を計数した結果、細胞数が一定値未満の場合は、得られる細胞密度の精度が低くなるため、培養容器８の厚さを増加させた後に、再度計数を行うことが好ましい。このような培養容器８の厚さを増加させる計測用装置については、第三実施形態において詳細に説明する。
【００３８】
このようにして測定対象範囲内における細胞数が計測されると、この細胞数を測定対象範囲の容積で除算することで、細胞密度を算出することができる。さらに、得られた細胞密度を培養容器８の容積に乗算することで、培養容器８全体の細胞数を算出することができる。
このような細胞密度及び培養容器８全体の細胞数も、計数手段により自動的に算出させることができる。
【００３９】
このように、本実施形態によれば、培養容器８内の細胞数が多く、培養容器８をそのまま直接観測した場合には、細胞数を正確に計測できない場合でも、培養容器の厚さを減少することで、細胞数を計測することができ、培養容器８内の細胞密度を算出することが可能となっている。
【００４０】
［第二実施形態］
次に、本発明の第二実施形態の容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置について、図５及び図６を参照して説明する。図５は、本実施形態の計数用装置の構成を示す図であり、図６は、本実施形態の計数用装置における駆動装置（攪拌部材用）の構成を示す図である。
本実施形態の計数用装置は、第一実施形態の計数用装置の構成に加えて、さらに攪拌部材を備えている。本実施形態では、この攪拌部材を用いて培養容器８内の培養液を攪拌することにより、細胞を観測しやすいように分散できるようになっている。その他の点は、第一実施形態と同様のものとすることができる。
【００４１】
攪拌部材９は、培養容器８を押圧して移動することにより、培養容器８内における培養液を攪拌し、培養液中の培養細胞を分散させるものである。この攪拌部材９としては、例えば図５に示すようにローラを使用することができる。
同図の例では、攪拌部材９により培養容器８を所定の押圧量で押圧しつつ、この攪拌部材９を容器積載台３と平行に所定の速度及び所定のサイクルで繰り返し移動させることで、培養液を攪拌する構成となっている。
【００４２】
支持台１０は、図５に示すように、容器積載台３の両側に一箇所ずつ上方に向かって立設した、攪拌部材９の両端を回転自在に支持する軸受部と、これら軸受部を連結する連結部によって形成されている。
また、この支持台１０は、図６に示すように、連結部下に取り付けたロッド型電動シリンダ１２（垂直方向動作用アクチュエータ）によって上下に移動させることができ、支持台１０に取り付けられた攪拌部材９による培養容器８に対する押圧量を０．１ミリ単位できめ細かく調整することが可能となっている。
【００４３】
また、ロッド型電動シリンダ１２は、スライダ型電動シリンダ１６（水平方向動作用アクチュエータ）上の移動台１１に取り付けられており、容器積載台３に対して水平方向に移動する。また、移動台１１の水平方向への移動速度をコントロールすることによって、支持台１０に取り付けられた攪拌部材９の移動速度を調整する。
なお、撹拌部材の動作制御には、ロッド型電動シリンダ１２やスライダ型電動シリンダ１６のような電動アクチュエータにかえて、空気圧や油圧、電磁力を利用したアクチュエータを使用したり、モータやカムを用いた構成にしたりすることもできる。
【００４４】
本実施形態の容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置によれば、培養容器８内の細胞数を計測するに先だって、攪拌部材９を培養容器８に所定の押圧量で押圧した状態で、攪拌部材９を水平方向に一定時間往復運動を行わせることができる。
これによって、培養容器８内の培養液を攪拌することができ、培養容器８内における培養細胞を計数し易いように分散させることが可能となる。
【００４５】
［第三実施形態］
次に、本発明の第三実施形態の容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置について、図７〜図１１を参照して説明する。これらの図はそれぞれ、本実施形態の容器内の計数対象物の計数方法における計数用装置の基本位置（図７）、攪拌状態（図８）、厚さ調整及び沈殿待ち状態（計数する細胞を減らしたい場合 図９）、顕微鏡観察状態（図１０）、厚さ調整及び沈殿待ち状態（計数する細胞を増やしたい場合 図１１）を示す模式図である。
【００４６】
本実施形態の計数用装置は、第二実施形態の計数用装置の構成に加えて、さらに培養容器８の厚さを増加させるための厚さ調整部材を備えている。その他の点は、第二実施形態と同様のものとすることができる。
以下、本実施形態の容器内の計数対象物の計数方法における計数用装置の動作手順について、培養容器８の厚さを増加させる動作及び減少させる動作を含めて説明する。
【００４７】
（１）基本位置
まず、図７を参照して、本実施形態の計数用装置の構成要素の基本位置について説明する。
同図において、容器積載台３には顕微鏡観察用の観測孔が設けられ、この観測孔の上部に容器積載台３の上面の一部を構成するガラス板がはめ込まれている。
【００４８】
培養容器８は容器積載台３上に配置され、この容器積載台３の観測孔の上方に厚さ調整部材２−１（押圧板）が配置されている。この厚さ調整部材２−１を下方に移動させ、培養容器８を押圧して、その厚さを減少させるようになっている。
また、培養容器８の縁の一端には厚さ調整部材２−２（ローラ）が配置され、これを移動させることで、培養容器８の水平面積を減少させ、厚さを増加させることが可能になっている。
【００４９】
さらに、培養容器８の上方には攪拌部材９（ローラ）が配置され、この攪拌部材９を下方に移動させて培養容器８を押圧した状態で、水平方向に移動させることで、培養容器８内の培養液を攪拌することが可能になっている。
また、基本位置では、細胞を撮影するための撮影装置４を構成する顕微鏡レンズ４−１とＣＣＤカメラ４−２、及び照明７は、容器積載台３の外側に配置されている。
【００５０】
（２）攪拌状態
次に、図８を参照して、容器内の計数対象物の数の計数を行うに先だち、培養容器８内の培養液を攪拌する手順について説明する。
まず、図７の基本位置から攪拌部材９を下方に移動させて、培養容器８を所定の押圧量で押圧する。次に、この攪拌部材９を容器積載台３と平行に、所定の速度及び所定のサイクルで繰り返し移動させる。
これにより、培養容器８内の培養液を攪拌し、培養液中の細胞を均等化することが可能となる。
【００５１】
（３）厚さ調整及び沈殿待ち状態（厚さを減少させる場合）
次に、図９を参照して、培養容器８の厚さを減少させ、計数する細胞を減らす手順について説明する。
まず、攪拌部材９を上方に移動させて図７の基本位置に戻し、厚さ調整部材２−１を下方に移動させて、培養容器の厚さを減少させる。このとき、厚さ調整部材２−１により、容器積載台３の観測孔上の領域を含む培養容器８の一部を押圧し、培養容器８の測定対象範囲の厚さを所定のサイズに調整する。このとき、培養環境下において、培養容器８の厚さが小さいほど、計数する細胞を減らすことができる。
培養容器８の厚さを減少させた後、培養容器８内の細胞が沈殿するまで静置させる。
【００５２】
（４）顕微鏡観察状態
次に、図１０を参照して、細胞計数を行う手順について説明する。
培養容器８の厚さを減少させた状態で、培養容器８内の細胞が沈殿した後、図１０に示すように、顕微鏡４−１とＣＣＤカメラ４−２とからなる撮影手段４、及び照明７を図７の基本位置から水平方向に移動させ、撮影手段４を観測孔の真下に、照明７を観測孔の上方に配置させる。そして、ＣＣＤカメラ４−２により培養容器８内に沈殿している細胞を撮影する。
【００５３】
このようにして得られた画像を図示しない計数装置に入力して、この計数装置により画像内における細胞数を測定し、得られた細胞数を、測定対象範囲（ＣＣＤカメラ４−２により観測された培養容器８における領域）の容積で除算することで、培養容器８内の細胞密度を算出することができる。
これにより、培養容器８内の細胞が増殖して、そのままの厚さで沈殿させると、重なり合いが生じて正確に計数できない場合でも、培養容器８の厚さを調整することで計数可能にすることができ、培養容器８内の細胞密度を、培養系を開放することなく、算出することが可能となる。
【００５４】
（５）厚さ調整及び沈殿待ち状態（厚さを増加させる場合）
一方、培養の初期段階などにおいては、細胞数が少ないため、計数はできるものの、得られる細胞密度の精度が低くなる場合がある。
このため、観測される細胞数が少ない場合は、図１１に示すように、培養容器８の厚さを増加させ、測定対象範囲における細胞数を増やしてから、（４）で説明した顕微鏡観察を行う。
【００５５】
すなわち、（２）の攪拌後、攪拌部材９を上方に移動させて図７の基本位置に戻し、ローラからなる厚さ調整部材２−２を測定対象範囲方向に移動させて培養容器８を押圧し、培養容器８の厚さを増加させる。このとき、培養容器８における測定対象範囲の厚さを一定にするために、厚さ調整部材２−１を測定対象範囲上に培養容器８の上面に接触させる位置に移動する。そして、培養容器８内の細胞が沈殿するまで静置させる。
【００５６】
これによって、測定対象範囲内の細胞数を増加させることができ、培養容器８内の細胞数が少ない場合に、より正確に細胞密度を算出することが可能になる。
培養容器８内の細胞数が少ない場合の具体的な細胞数は、細胞の種類や測定対象範囲の面積等にもとづき適宜決定されるが、例えば０又は１０未満などの数にすることができる。
【００５７】
なお、上述した（１）〜（５）の手順に従って、培養容器８の厚さを調節した後に、測定対象範囲内の細胞に重なり合いが見られるか、又は、細胞が見られないか若しくはほとんど見られない場合は、再度（１）〜（５）の手順に従って、培養容器８の厚さを調節し、細胞数の計数が行われる。
【００５８】
このように、本実施形態によれば、培養容器８内の細胞数が少なく、培養容器８をそのまま直接観測すると、正確な細胞密度が得られない可能性がある場合、培養容器の厚さを増加させることで、培養容器８内の細胞密度をより正確に算出することが可能となっている。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明の容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置により、培養容器８の厚さを調節して細胞数を計測した実施例、及び培養容器８の厚さを調節することなく細胞数を計測した比較例について説明する。
【００６０】
（実施例１）
培養容器８として、ＬＤＰＥ（直鎖状低密度ポリエチレン）製、フィルム厚０．１５ｍｍのバッグを使用した。培養容器８は、図１２に示すように、仕切り部材（ゴムローラ）で仕切ることにより、培養を行う領域である培養部の長辺を２５０ｍｍ、短辺を２１０ｍｍとし、当該培養部に培養液６４０ｍｌを入れて使用した。なお、このときの培養容器８を平置きした際の容器厚みは、容器上面が完全な水平面にならないが、およそ１６ｍｍであった。観察範囲（測定対象範囲）の水平面のサイズは一辺０．５ｍｍの正方形である。
【００６１】
培養液として細胞科学研究所のＡｌｙＳ５０５Ｎ−０培地を使用するとともに、培養細胞としてヒト白血病Ｔリンパ種のＪｕｒｋａｔＥ６．１株を細胞培養用ディッシュで必要量増殖させたものを使用した。
攪拌部材９として直径１２ｍｍのローラを使用し、押圧量１３ｍｍ、速度５０ｍｍ／ｓ、往復回数１０回の攪拌条件により攪拌を行った。
【００６２】
攪拌直後に、幅５０ｍｍ、厚さ３ｍｍ、長さは培養容器８の長辺より大きいアクリル板からなる厚さ調整部材を降下して、バッグの厚さを３．１ｍｍに調整した。そして、１２分間静置させた後、観測範囲を撮影して、細胞数の計数を行った。また、この細胞数と観測範囲の容積にもとづき細胞密度を算出した。撮影した写真を図１３に、観測範囲内細胞数、細胞密度、実測密度、及び実測値比を図１４に示す。
なお、実測密度は、従来の方法により計数盤を用いて、バッグから回収した培養液中の細胞数を計測し、これを観測範囲の容積で除算して得た。
【００６３】
（比較例１）
実施例１と同一の培養容器８及び培養液を用いて、同一の攪拌条件で攪拌を行った。
次に、バッグの厚さを調節することなく、６０分間静置させた後、観測範囲を撮影した。バッグの上面は押圧を行っていないため波打っており、バッグの厚みはおよそ１６ｍｍであった。
この場合、細胞に重なり合いが見られ、細胞数の計数を行うことはできず、密度の算出も行うことができなかった。その結果を図１３，図１４に示す。
【００６４】
（実施例２）
実施例１とは細胞密度の異なる培養液を用いるとともに、細胞数の計測にあたり、バッグの厚さを１１．０ｍｍとし、その後の静置時間を４５分間にした点以外は、実施例１と同様にして、実験を行った。培養液と培養細胞の種類は、実施例１と同じであるが、本実施例では実施例１に比較して培養細胞数が少ないものを使用した。その結果を図１５及び図１６に示す。
【００６５】
（実施例３）
細胞数の計測にあたり、バッグの厚さを７．０ｍｍとし、その後の静置時間を３０分間にした点以外は、実施例２と同様にして、実験を行った。その結果を図１５及び図１６に示す。
【００６６】
（実施例４）
細胞数の計測にあたり、バッグの厚さを４．０ｍｍとし、その後の静置時間を１２分間にした点以外は、実施例２と同様にして、実験を行った。その結果を図１５及び図１６に示す。
【００６７】
（実施例５）
細胞数の計測にあたり、バッグの厚さを３．１ｍｍとし、その後の静置時間を１２分間にした点以外は、実施例２と同様にして、実験を行った。その結果を図１５及び図１６に示す。
【００６８】
図１３及び図１４に示す通り、バッグの厚さを調整しなかった比較例１では、細胞が重なり合っており、正確に計数することができなかった。なお、計数不可能とは、実際に計算できない場合の他、計数結果が所定値（観測範囲内で視認可能な最大細胞数）以上の場合とすることができる。
これに対して、実施例１では、バッグの厚さを減少させることで、細胞数を計測することができ、培養容器８内における細胞密度を算出することが可能であった。
【００６９】
また、図１５及び図１６に示す通り、実施例２〜５では、バッグの厚さを減少させるに従って、計測された細胞数が少なくなっていることがわかる。また、算出された細胞の密度は、いずれも実測密度と比較して大きく異なるものではなかった。
よって、細胞数が多く、その計数ができない場合、細胞密度が大きい程、バッグの厚さをより大きく減少させることで、細胞を計測可能にできることがわかった。
これらの実験結果から、本発明の計数用装置を用いた容器内の計数対象物の計数方法によれば、培養系を開放することなく、また細胞密度に拘わらず、培養容器内の細胞数を計測でき、細胞密度を算出できることが明らかとなった。
【００７０】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記実施形態及び実施例では、培養細胞を計測対象としているが、これに限定されるものではなく、例えばプランクトンなどその他の有機体、又は無機物を計測対象とすることも可能である。培養容器内の「液体」には、培養液などの液体の他、半流動体も含まれる。また、培養容器８内の培養液として、培養細胞の比重よりも大きいものを使用することで、培養細胞を培養容器８内の上部に位置させることができ、これを計数するようにしても良い。また、上記実施形態及び実施例において細胞を計数するのみならず、細胞の生育状態等を観察することもできる。さらに、攪拌部材９を円柱状ではなく、断面を星形などの種々の形状に構成して様々な振とう効果が得られるようにするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、細胞培養容器を用いて、細胞を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【００７２】
１ 計数用装置
２ 厚さ調整部材
２−１ 厚さ調整部材（厚さ減少用）
２−２ 厚さ調整部材（厚さ増加用）
３ 容器積載台
４ 撮影手段
４−１ 顕微鏡
４−２ ＣＣＤカメラ
５ 駆動装置（調節部材用）
６ 駆動装置（撮影手段用）
７ 照明
８ 培養容器
９ 攪拌部材
１０ 支持台
１１ 移動台
１２ ロッド型電動シリンダ（垂直方向動作用アクチュエータ）
１３ ボールネジ
１４ ガイド棒
１５ 基台
１６ スライダ型電動シリンダ（水平方向動作用アクチュエータ）
１７ ガラス板
【技術分野】
【０００１】
本発明は、容器内の計数対象物の計数方法に関し、特に密封された培養容器内における培養液中の細胞数を数えるための容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような細胞培養においては、細胞の増殖に併せて、培養液における細胞の密度を適正な範囲に維持することが必要である。
【０００３】
すなわち、培養液における細胞密度が大きすぎると各細胞に十分な酸素や栄養を供給することができなくなり、細胞増殖効率が低下する。また、培養液における細胞密度が小さすぎても十分な増殖効率が得られない。
そこで、細胞培養においては、培養中に細胞密度を把握するため、適宜培養容器内における培養液中の細胞数を計測する必要があった。
【０００４】
例えば、特許文献１には、細胞の増殖に併せて培養液における細胞密度を適正に維持することができる細胞培養装置が開示されている。
このような細胞培養装置を用いて細胞数の計測を行う場合、従来は培養容器内につながるチューブから培養細胞が含まれる培養液を採集し、所定の緩衝液を加えて培養液における細胞を測定に適する密度に調整した後、計数盤へ注入し、人や機械によってその数を読み取って、細胞密度を算出するということが行われていた。
【０００５】
また、特許文献２には、撮影手段を備えた培養装置が開示されている。この培養装置によれば、細胞画像を定期的に取得し、保存することが可能になっている。
【０００６】
【特許文献１】国際公開２００８／１３６３７１号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００７／０５２７１８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の細胞培養装置を用いて培養液中の細胞を計数する方法では、培養容器内から培養液を採集する必要があり、培養系が開放されるため、雑菌などが混入するコンタミネーションのリスクがあった。
【０００８】
また、特許文献２に記載の培養装置では、細胞画像を取得することはできるが、その画像にもとづき細胞数を正確に計測し、細胞密度を得ることは困難であった。
すなわち、特許文献２に記載の撮影手段により培養容器内の細胞を撮影する場合、細胞画像の細胞数を計測して、これを当該撮影手段の視野内における培養液の容積で除算することで、細胞密度を算出することはできる。
しかし、このように細胞容器内の細胞を直接観察する場合、図１７に示すように、細胞の密度が大きく細胞が重なり合うときは、細胞数を正確に計測することができない。また、細胞の密度が小さすぎるときは、全体の密度予測が難しく、算出される細胞密度の精度が低くなってしまうという問題があった。
【０００９】
このように撮影手段を用いて培養容器内の細胞を直接計測する場合、従来の計数盤を用いて実測する場合に比較すると、計数盤の厚さが０．１ｍｍであるのに対して培養容器の厚さは１〜２ｃｍ程度であり、その厚さが１００〜２００倍となっている。
このため、撮影手段から見える細胞数は、同じ体積密度でも計数盤を用いて実測する場合の１００〜２００倍となってしまう。したがって、培養容器内の細胞は互いに重なり合う場合が多く、培養容器内の細胞を直接観測して細胞数を計測することは、困難であった。
【００１０】
そこで、本発明者らは鋭意研究した結果、培養容器の厚みを調整して、撮影手段から見える細胞数を計測可能な数にした後に、培養容器内の細胞数を直接観測により計測することで、実測値に近い細胞密度を得ることに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、培養系を開放することなく、かつ増殖した細胞の密度に拘わらず、培養環境下のあらゆる密度範囲で細胞数を計測することが可能な容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の容器内の計数対象物の計数方法は、密封された容器内の液体中の計数対象物の数を計測する方法であって、容器の少なくとも一部の厚みを調整し、調整した範囲の少なくとも一部を測定対象範囲として当該測定対象範囲における計数対象物の数を計測する方法としてある。
また、本発明の容器内の計数対象物の計数方法は、容器の液体を攪拌し、液体中の計数対象物を均等化した後に、容器の少なくとも一部の厚みを調整する方法としてある。
【００１２】
また、本発明の計数用装置は、密封された容器内の液体中の計数対象物の数を計測するための計数用装置であって、容器を積載する積載台と、容器における測定対象範囲を含む少なくとも一部を所定の厚みに調整する調整部材とを備えた構成としてある。
また、本発明の計数用装置に、さらに調整部材により容器の厚みを調整する前に、容器内の液体を攪拌する攪拌部材を備えた構成とすることもできる。
【００１３】
また、本発明の計数用装置に、さらに容器内の計数対象物を撮影する撮影手段と、撮影された画像内の計数対象物の数を計測する計数手段と、計数手段による計測の結果、計数対象物の数が所定の範囲内に無い場合、画像内の計数対象物の数が、所定の範囲内になるように、調整部材を駆動して、容器の少なくとも一部を所定の厚みに調整させる駆動装置とを備えた構成とすることもできる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、培養系を開放することなく、また増殖した細胞の密度に拘わらず、細胞数を計測することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の容器内の計数対象物の計数方法の原理を示す図である。
【図２】本発明の第一実施形態の計数用装置の構成を示す図である。
【図３】本発明の第一実施形態の計数用装置による容器の厚み調整方法（厚みを減らす場合）を示す図である。
【図４】本発明の第一実施形態の計数用装置による容器の厚み調整方法（厚みを増やす場合）を示す図である。
【図５】本発明の第二実施形態の計数用装置の構成を示す図である。
【図６】本発明の第二実施形態の計数用装置における駆動装置（攪拌部材用）の構成を示す図である。
【図７】本発明の第三実施形態の計数用装置の基本位置を示す図である。
【図８】本発明の第三実施形態の計数用装置の攪拌状態を示す図である。
【図９】本発明の第三実施形態の計数用装置の厚さ調整及び沈殿待ち状態（厚さを減少させる場合）を示す図である。
【図１０】本発明の第三実施形態の計数用装置の顕微鏡観察状態を示す図である。
【図１１】本発明の第三実施形態の計数用装置の厚さ調整及び沈殿待ち状態（厚さを増加させる場合）を示す図である。
【図１２】本発明の実施例及び比較例で使用した培養容器を示す図である。
【図１３】本発明の実施例１及び比較例１における細胞の画像を示す図である。
【図１４】本発明の実施例１及び比較例１の結果を示す図である。
【図１５】本発明の実施例２〜５における細胞の画像を示す図である。
【図１６】本発明の実施例２〜５の結果を示す図である。
【図１７】従来の容器内の計数対象物の計数方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について具体的に説明する。
まず、本発明の容器内の計数対象物の計数方法の原理について、図１を参照して説明する。
同図は、顕微鏡を用いて培養容器内の細胞を直接観察し、その数を計測する様子を示したものであり、図１（Ａ）は、従来のように、容器の厚さを調節することなく、観測する場合を示している。なお、培養液としてその比重が細胞の比重よりも小さいものを使用することで、細胞を容器の底に沈め、顕微鏡観察に適したものとすることができる。また反対に比重の大きい培養液を使用して細胞を容器の上部に集めて観察するようにしても良い。
【００１７】
図１（Ａ）の場合、容器内の細胞数が増加するにつれ、懸濁して静置させたときに、次第に重なり合いが生じてくる。したがって、この方法では細胞を大量に培養する場合に、細胞数を正確に計測することができない。
【００１８】
そこで、本発明では、細胞数が多すぎて正確に計測することができない場合には、図１（Ｂ）に示すように、容器の厚みを減少させることで、観測範囲（測定対象範囲）における細胞数を減少させ、計測に適した細胞数に調整する。
これによって、培養容器により細胞を大量に培養する場合でも、培養容器内の細胞を直接観察することで、培養系を開放することなく、細胞数を計測することが可能となっている。
また、培養容器内の細胞数が少なく、培養容器全体の密度予測が難しい場合にも、容器の厚みを増大させることで、観測範囲内における細胞数を増加させ、計測に適した細胞数に調整することができる。
【００１９】
［第一実施形態］
次に、本発明の第一実施形態の容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置について、図２を参照して説明する。同図は、本実施形態の計数用装置の構成を示す図である。
本実施形態の計数用装置１は、同図に示すように、厚さ調整部材２、容器積載台３、撮影手段４、駆動装置（調節部材用）５、駆動装置（撮影手段用）６、及び照明７を備えており、容器積載台３上に培養容器８を配置して、培養容器８内の培養細胞数を計測する。
【００２０】
厚さ調整部材２は、容器積載台３上の培養容器８を調節する。同図の例では、厚さ調整部材２は培養容器８を押圧するための平面部分を有する押圧板からなり、軟包材からなる培養容器８の一部を上から押圧することで、その厚さを減少させることが可能となっている。
【００２１】
また、厚さ調整部材２における少なくとも培養容器８の測定対象範囲の上方部分は透明な材料からなり、当該部分を照明７により上方から照らし、顕微鏡及びＣＣＤカメラからなる撮影手段４により下方から観察するようになっている。
なお、厚さ調整部材２は、図２に示すような平面部分により培養容器８を押圧する押圧板に限定されるものではなく、ローラや引張部材を用いて構成することもできる。
【００２２】
例えばローラにより培養容器８を上下の両方から又は一方から押圧しつつ移動させて、培養容器８の水平面積を減少させることで、培養容器８の厚みを増加させることができる。また、引張部材を用いて培養容器８を水平方向に引き伸ばすことで、培養容器８の厚みを減少させることもできる。
【００２３】
容器積載台３は、培養容器８を載置させるための平面の台であり、厚さ調整部材２とともに、計数用の積載装置を構成する。
この容器積載台３における測定対象範囲の下方部分は、ガラス板などの透明な部材により構成され、撮影手段４により下方から培養容器８を観測できるようになっている。
【００２４】
駆動装置（調節部材用）５は、図２に示すように、ボールスクリューネジにより、厚さ調整部材２を上下に移動させるものである。これにより容器積載台３上の培養容器８に厚さ調整部材２を押しつけて、培養容器８の厚さを調節可能にしている。
この駆動装置（調節部材用）５には、例えばロッド型電動シリンダ（垂直方向動作用アクチュエータ）を用いることができ、これによって、培養容器８の厚さを０．１ミリ単位できめ細かく調整することが可能である。
【００２５】
また、駆動装置（撮影手段用）６は、図２に示すように、ボールスクリューネジにより、撮影手段４を容器積載台３に対して水平方向に移動するものである。この駆動装置（撮影手段用）６によって、培養容器８内における細胞の撮影時以外は、撮影手段４を容器積載台３の外側に配置し、撮影時に撮影手段４を培養容器８の測定対象範囲の下に移動させることができる。
なお、駆動装置（調節部材用）５や駆動装置（撮影手段用）６を、電動アクチュエータの他、空気圧や油圧、電磁力を利用したアクチュエータを用いて構成したり、あるいはモータやカムを用いて構成したりすることもできる。
【００２６】
照明７は、厚さ調整部材２を介して培養容器８における測定対象範囲を照らし、撮影手段４による細胞の撮影に必要な明るさを提供する。
培養容器８は、軟包材を材料として、袋状（バック型）に形成した容器である。このように、培養容器８の材料として軟包材を用いることで、培養容器８に可撓性・柔軟性を付与することができる。軟包材としては、例えば、特開２００２−２５５２７７号公報（軟包材フィルムシートを用いた食品包装体及び食品の取り出し方法）や、特開２００４−３２３０７７号公報（加圧抽出形の袋状容器）に記載されているものなどを用いることができる。
【００２７】
また、培養容器８は、細胞培養に必要なガス透過性を有しており、内容物を確認できるように、一部又は全部が透明性を有している。このような条件を満たす培養容器の材料としては、例えばポリオレフィン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーンゴム等を挙げることができる。
【００２８】
次に、本実施形態の計数用装置による培養容器８の厚さ調整の例について、図３及び図４を参照して説明する。図３は容器の厚みを減らす場合を示すものであり、図４は容器の厚みを増やす場合を示すものである。
【００２９】
培養容器８の厚みを減らす場合、容器の厚み調整は、図２に示すものの他、例えば、図３の（ａ）に示すように、厚さ調整部材２を培養容器８の下方から押圧することにより行うことができる。なお、図示していないが、このとき培養容器８の上面の位置をガラス板などにより固定することが好ましい。
【００３０】
また、培養容器８が水平に伸ばせる材料からなる場合には、図３の（ｂ）に示すように、培養容器８の全面を覆い得る厚さ調整部材２を用いて培養容器８を押圧し、培養容器８の厚さを減少させることもできる。また、図３の（ｃ）に示すように、厚さ調整部材２により培養容器８を引き伸ばして、その厚さを減少させることもできる。この場合、培養容器８の縁の一端を固定するとともに、水平方向反対側の縁を引張部材からなる厚さ調整部材２により引っ張る構成にしたり、あるいは２つの厚さ調整部材２を使用して、培養容器８の水平方向両端を引っ張ることで、培養容器８を引き伸ばす構成にすることもできる。このような柔軟な培養容器８の材料としては、例えばシリコーンゴムなどを用いることができる。
【００３１】
一方、培養容器８の厚みを増やす場合は、例えば、図４の（ｄ）に示すように、培養容器８の上面の一部を厚さ調整部材２により押圧して、培養容器８における押圧した部分以外の厚みを増加させるようにすることができる。
また、図４の（ｅ）に示すように、厚さ調整部材２としてローラなどを使用し、これを移動させて培養容器８を押圧することで、培養容器８の水平面積を減少させ、培養容器８の厚みを増加させることもできる。
【００３２】
次に、本実施形態の容器内の計数対象物の計数方法について、図２を参照してより詳細に説明する。
まず、培養容器８内の細胞数を計測する工程に先だって、培養容器８内の培養液を攪拌することが好ましい。なお、培養液の攪拌手段については、第二実施形態において、詳細に説明する。
【００３３】
次に、駆動装置（撮影手段用）６を用いて、撮影手段４を培養容器８の測定対象範囲の下に移動させる。
次に、駆動装置（調節部材用）５を用いて、厚さ調整部材２を降下させ、培養容器８の厚さを所定の厚さに調整する。
このとき、所定の厚さは、細胞の種類、培養容器のサイズ、測定対象範囲の面積、及び培養期間などにより種々の値を取り得る。
【００３４】
次に、照明７により測定対象範囲を照らして、撮影手段４により撮影する。そして、撮影した画像上の細胞を計数する。このとき、撮影手段４から計数手段に撮影した画像を送信させ、この計数手段により自動的に細胞数を計測することができる。このような計数手段としては、公知の細胞計数分析装置や細胞数計測装置等を用いることができる。
【００３５】
ここで、本実施形態では、培養液として比重が培養細胞よりも小さいものを使用することで、培養細胞を培養容器８の底に沈殿させ、撮影手段の焦点を沈殿した細胞に合わせることでこれらを撮影することができる。しかしなら、細胞密度が大きく、測定対象範囲における細胞が重なり合う場合は、細胞数を正しく計数することができない。
そこで、本実施形態の容器内の計数対象物の計数方法では、このように測定対象範囲における細胞が重なり合う場合は、厚さ調整部材２を移動させて培養容器８の厚さを減少し、計測対象の細胞数を減らすことで、細胞を計測可能にしている。
【００３６】
なお、測定対象範囲おいて重なり合うことなく観測できる最大細胞数は、おおよそ測定対象範囲の面積を培養細胞の平均水平面積で除算した数未満と考えることができる。そこで、細胞を計数した結果、細胞数が当該最大細胞数以上に算出されている場合は、培養容器８の厚さをさらに減少させて、再度計数を行うことが好ましい。また、細胞を測定対象範囲に密に並べた場合の数をより正確に推定し、その推定値を最大細胞数として用いるなど、その他の値を培養容器８の厚さ調整を行うか否かの判断に用いることもできる。
【００３７】
また、細胞を計数した結果、細胞数が一定値未満の場合は、得られる細胞密度の精度が低くなるため、培養容器８の厚さを増加させた後に、再度計数を行うことが好ましい。このような培養容器８の厚さを増加させる計測用装置については、第三実施形態において詳細に説明する。
【００３８】
このようにして測定対象範囲内における細胞数が計測されると、この細胞数を測定対象範囲の容積で除算することで、細胞密度を算出することができる。さらに、得られた細胞密度を培養容器８の容積に乗算することで、培養容器８全体の細胞数を算出することができる。
このような細胞密度及び培養容器８全体の細胞数も、計数手段により自動的に算出させることができる。
【００３９】
このように、本実施形態によれば、培養容器８内の細胞数が多く、培養容器８をそのまま直接観測した場合には、細胞数を正確に計測できない場合でも、培養容器の厚さを減少することで、細胞数を計測することができ、培養容器８内の細胞密度を算出することが可能となっている。
【００４０】
［第二実施形態］
次に、本発明の第二実施形態の容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置について、図５及び図６を参照して説明する。図５は、本実施形態の計数用装置の構成を示す図であり、図６は、本実施形態の計数用装置における駆動装置（攪拌部材用）の構成を示す図である。
本実施形態の計数用装置は、第一実施形態の計数用装置の構成に加えて、さらに攪拌部材を備えている。本実施形態では、この攪拌部材を用いて培養容器８内の培養液を攪拌することにより、細胞を観測しやすいように分散できるようになっている。その他の点は、第一実施形態と同様のものとすることができる。
【００４１】
攪拌部材９は、培養容器８を押圧して移動することにより、培養容器８内における培養液を攪拌し、培養液中の培養細胞を分散させるものである。この攪拌部材９としては、例えば図５に示すようにローラを使用することができる。
同図の例では、攪拌部材９により培養容器８を所定の押圧量で押圧しつつ、この攪拌部材９を容器積載台３と平行に所定の速度及び所定のサイクルで繰り返し移動させることで、培養液を攪拌する構成となっている。
【００４２】
支持台１０は、図５に示すように、容器積載台３の両側に一箇所ずつ上方に向かって立設した、攪拌部材９の両端を回転自在に支持する軸受部と、これら軸受部を連結する連結部によって形成されている。
また、この支持台１０は、図６に示すように、連結部下に取り付けたロッド型電動シリンダ１２（垂直方向動作用アクチュエータ）によって上下に移動させることができ、支持台１０に取り付けられた攪拌部材９による培養容器８に対する押圧量を０．１ミリ単位できめ細かく調整することが可能となっている。
【００４３】
また、ロッド型電動シリンダ１２は、スライダ型電動シリンダ１６（水平方向動作用アクチュエータ）上の移動台１１に取り付けられており、容器積載台３に対して水平方向に移動する。また、移動台１１の水平方向への移動速度をコントロールすることによって、支持台１０に取り付けられた攪拌部材９の移動速度を調整する。
なお、撹拌部材の動作制御には、ロッド型電動シリンダ１２やスライダ型電動シリンダ１６のような電動アクチュエータにかえて、空気圧や油圧、電磁力を利用したアクチュエータを使用したり、モータやカムを用いた構成にしたりすることもできる。
【００４４】
本実施形態の容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置によれば、培養容器８内の細胞数を計測するに先だって、攪拌部材９を培養容器８に所定の押圧量で押圧した状態で、攪拌部材９を水平方向に一定時間往復運動を行わせることができる。
これによって、培養容器８内の培養液を攪拌することができ、培養容器８内における培養細胞を計数し易いように分散させることが可能となる。
【００４５】
［第三実施形態］
次に、本発明の第三実施形態の容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置について、図７〜図１１を参照して説明する。これらの図はそれぞれ、本実施形態の容器内の計数対象物の計数方法における計数用装置の基本位置（図７）、攪拌状態（図８）、厚さ調整及び沈殿待ち状態（計数する細胞を減らしたい場合 図９）、顕微鏡観察状態（図１０）、厚さ調整及び沈殿待ち状態（計数する細胞を増やしたい場合 図１１）を示す模式図である。
【００４６】
本実施形態の計数用装置は、第二実施形態の計数用装置の構成に加えて、さらに培養容器８の厚さを増加させるための厚さ調整部材を備えている。その他の点は、第二実施形態と同様のものとすることができる。
以下、本実施形態の容器内の計数対象物の計数方法における計数用装置の動作手順について、培養容器８の厚さを増加させる動作及び減少させる動作を含めて説明する。
【００４７】
（１）基本位置
まず、図７を参照して、本実施形態の計数用装置の構成要素の基本位置について説明する。
同図において、容器積載台３には顕微鏡観察用の観測孔が設けられ、この観測孔の上部に容器積載台３の上面の一部を構成するガラス板がはめ込まれている。
【００４８】
培養容器８は容器積載台３上に配置され、この容器積載台３の観測孔の上方に厚さ調整部材２−１（押圧板）が配置されている。この厚さ調整部材２−１を下方に移動させ、培養容器８を押圧して、その厚さを減少させるようになっている。
また、培養容器８の縁の一端には厚さ調整部材２−２（ローラ）が配置され、これを移動させることで、培養容器８の水平面積を減少させ、厚さを増加させることが可能になっている。
【００４９】
さらに、培養容器８の上方には攪拌部材９（ローラ）が配置され、この攪拌部材９を下方に移動させて培養容器８を押圧した状態で、水平方向に移動させることで、培養容器８内の培養液を攪拌することが可能になっている。
また、基本位置では、細胞を撮影するための撮影装置４を構成する顕微鏡レンズ４−１とＣＣＤカメラ４−２、及び照明７は、容器積載台３の外側に配置されている。
【００５０】
（２）攪拌状態
次に、図８を参照して、容器内の計数対象物の数の計数を行うに先だち、培養容器８内の培養液を攪拌する手順について説明する。
まず、図７の基本位置から攪拌部材９を下方に移動させて、培養容器８を所定の押圧量で押圧する。次に、この攪拌部材９を容器積載台３と平行に、所定の速度及び所定のサイクルで繰り返し移動させる。
これにより、培養容器８内の培養液を攪拌し、培養液中の細胞を均等化することが可能となる。
【００５１】
（３）厚さ調整及び沈殿待ち状態（厚さを減少させる場合）
次に、図９を参照して、培養容器８の厚さを減少させ、計数する細胞を減らす手順について説明する。
まず、攪拌部材９を上方に移動させて図７の基本位置に戻し、厚さ調整部材２−１を下方に移動させて、培養容器の厚さを減少させる。このとき、厚さ調整部材２−１により、容器積載台３の観測孔上の領域を含む培養容器８の一部を押圧し、培養容器８の測定対象範囲の厚さを所定のサイズに調整する。このとき、培養環境下において、培養容器８の厚さが小さいほど、計数する細胞を減らすことができる。
培養容器８の厚さを減少させた後、培養容器８内の細胞が沈殿するまで静置させる。
【００５２】
（４）顕微鏡観察状態
次に、図１０を参照して、細胞計数を行う手順について説明する。
培養容器８の厚さを減少させた状態で、培養容器８内の細胞が沈殿した後、図１０に示すように、顕微鏡４−１とＣＣＤカメラ４−２とからなる撮影手段４、及び照明７を図７の基本位置から水平方向に移動させ、撮影手段４を観測孔の真下に、照明７を観測孔の上方に配置させる。そして、ＣＣＤカメラ４−２により培養容器８内に沈殿している細胞を撮影する。
【００５３】
このようにして得られた画像を図示しない計数装置に入力して、この計数装置により画像内における細胞数を測定し、得られた細胞数を、測定対象範囲（ＣＣＤカメラ４−２により観測された培養容器８における領域）の容積で除算することで、培養容器８内の細胞密度を算出することができる。
これにより、培養容器８内の細胞が増殖して、そのままの厚さで沈殿させると、重なり合いが生じて正確に計数できない場合でも、培養容器８の厚さを調整することで計数可能にすることができ、培養容器８内の細胞密度を、培養系を開放することなく、算出することが可能となる。
【００５４】
（５）厚さ調整及び沈殿待ち状態（厚さを増加させる場合）
一方、培養の初期段階などにおいては、細胞数が少ないため、計数はできるものの、得られる細胞密度の精度が低くなる場合がある。
このため、観測される細胞数が少ない場合は、図１１に示すように、培養容器８の厚さを増加させ、測定対象範囲における細胞数を増やしてから、（４）で説明した顕微鏡観察を行う。
【００５５】
すなわち、（２）の攪拌後、攪拌部材９を上方に移動させて図７の基本位置に戻し、ローラからなる厚さ調整部材２−２を測定対象範囲方向に移動させて培養容器８を押圧し、培養容器８の厚さを増加させる。このとき、培養容器８における測定対象範囲の厚さを一定にするために、厚さ調整部材２−１を測定対象範囲上に培養容器８の上面に接触させる位置に移動する。そして、培養容器８内の細胞が沈殿するまで静置させる。
【００５６】
これによって、測定対象範囲内の細胞数を増加させることができ、培養容器８内の細胞数が少ない場合に、より正確に細胞密度を算出することが可能になる。
培養容器８内の細胞数が少ない場合の具体的な細胞数は、細胞の種類や測定対象範囲の面積等にもとづき適宜決定されるが、例えば０又は１０未満などの数にすることができる。
【００５７】
なお、上述した（１）〜（５）の手順に従って、培養容器８の厚さを調節した後に、測定対象範囲内の細胞に重なり合いが見られるか、又は、細胞が見られないか若しくはほとんど見られない場合は、再度（１）〜（５）の手順に従って、培養容器８の厚さを調節し、細胞数の計数が行われる。
【００５８】
このように、本実施形態によれば、培養容器８内の細胞数が少なく、培養容器８をそのまま直接観測すると、正確な細胞密度が得られない可能性がある場合、培養容器の厚さを増加させることで、培養容器８内の細胞密度をより正確に算出することが可能となっている。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明の容器内の計数対象物の計数方法、及び計数用装置により、培養容器８の厚さを調節して細胞数を計測した実施例、及び培養容器８の厚さを調節することなく細胞数を計測した比較例について説明する。
【００６０】
（実施例１）
培養容器８として、ＬＤＰＥ（直鎖状低密度ポリエチレン）製、フィルム厚０．１５ｍｍのバッグを使用した。培養容器８は、図１２に示すように、仕切り部材（ゴムローラ）で仕切ることにより、培養を行う領域である培養部の長辺を２５０ｍｍ、短辺を２１０ｍｍとし、当該培養部に培養液６４０ｍｌを入れて使用した。なお、このときの培養容器８を平置きした際の容器厚みは、容器上面が完全な水平面にならないが、およそ１６ｍｍであった。観察範囲（測定対象範囲）の水平面のサイズは一辺０．５ｍｍの正方形である。
【００６１】
培養液として細胞科学研究所のＡｌｙＳ５０５Ｎ−０培地を使用するとともに、培養細胞としてヒト白血病Ｔリンパ種のＪｕｒｋａｔＥ６．１株を細胞培養用ディッシュで必要量増殖させたものを使用した。
攪拌部材９として直径１２ｍｍのローラを使用し、押圧量１３ｍｍ、速度５０ｍｍ／ｓ、往復回数１０回の攪拌条件により攪拌を行った。
【００６２】
攪拌直後に、幅５０ｍｍ、厚さ３ｍｍ、長さは培養容器８の長辺より大きいアクリル板からなる厚さ調整部材を降下して、バッグの厚さを３．１ｍｍに調整した。そして、１２分間静置させた後、観測範囲を撮影して、細胞数の計数を行った。また、この細胞数と観測範囲の容積にもとづき細胞密度を算出した。撮影した写真を図１３に、観測範囲内細胞数、細胞密度、実測密度、及び実測値比を図１４に示す。
なお、実測密度は、従来の方法により計数盤を用いて、バッグから回収した培養液中の細胞数を計測し、これを観測範囲の容積で除算して得た。
【００６３】
（比較例１）
実施例１と同一の培養容器８及び培養液を用いて、同一の攪拌条件で攪拌を行った。
次に、バッグの厚さを調節することなく、６０分間静置させた後、観測範囲を撮影した。バッグの上面は押圧を行っていないため波打っており、バッグの厚みはおよそ１６ｍｍであった。
この場合、細胞に重なり合いが見られ、細胞数の計数を行うことはできず、密度の算出も行うことができなかった。その結果を図１３，図１４に示す。
【００６４】
（実施例２）
実施例１とは細胞密度の異なる培養液を用いるとともに、細胞数の計測にあたり、バッグの厚さを１１．０ｍｍとし、その後の静置時間を４５分間にした点以外は、実施例１と同様にして、実験を行った。培養液と培養細胞の種類は、実施例１と同じであるが、本実施例では実施例１に比較して培養細胞数が少ないものを使用した。その結果を図１５及び図１６に示す。
【００６５】
（実施例３）
細胞数の計測にあたり、バッグの厚さを７．０ｍｍとし、その後の静置時間を３０分間にした点以外は、実施例２と同様にして、実験を行った。その結果を図１５及び図１６に示す。
【００６６】
（実施例４）
細胞数の計測にあたり、バッグの厚さを４．０ｍｍとし、その後の静置時間を１２分間にした点以外は、実施例２と同様にして、実験を行った。その結果を図１５及び図１６に示す。
【００６７】
（実施例５）
細胞数の計測にあたり、バッグの厚さを３．１ｍｍとし、その後の静置時間を１２分間にした点以外は、実施例２と同様にして、実験を行った。その結果を図１５及び図１６に示す。
【００６８】
図１３及び図１４に示す通り、バッグの厚さを調整しなかった比較例１では、細胞が重なり合っており、正確に計数することができなかった。なお、計数不可能とは、実際に計算できない場合の他、計数結果が所定値（観測範囲内で視認可能な最大細胞数）以上の場合とすることができる。
これに対して、実施例１では、バッグの厚さを減少させることで、細胞数を計測することができ、培養容器８内における細胞密度を算出することが可能であった。
【００６９】
また、図１５及び図１６に示す通り、実施例２〜５では、バッグの厚さを減少させるに従って、計測された細胞数が少なくなっていることがわかる。また、算出された細胞の密度は、いずれも実測密度と比較して大きく異なるものではなかった。
よって、細胞数が多く、その計数ができない場合、細胞密度が大きい程、バッグの厚さをより大きく減少させることで、細胞を計測可能にできることがわかった。
これらの実験結果から、本発明の計数用装置を用いた容器内の計数対象物の計数方法によれば、培養系を開放することなく、また細胞密度に拘わらず、培養容器内の細胞数を計測でき、細胞密度を算出できることが明らかとなった。
【００７０】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、上記実施形態及び実施例では、培養細胞を計測対象としているが、これに限定されるものではなく、例えばプランクトンなどその他の有機体、又は無機物を計測対象とすることも可能である。培養容器内の「液体」には、培養液などの液体の他、半流動体も含まれる。また、培養容器８内の培養液として、培養細胞の比重よりも大きいものを使用することで、培養細胞を培養容器８内の上部に位置させることができ、これを計数するようにしても良い。また、上記実施形態及び実施例において細胞を計数するのみならず、細胞の生育状態等を観察することもできる。さらに、攪拌部材９を円柱状ではなく、断面を星形などの種々の形状に構成して様々な振とう効果が得られるようにするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明は、細胞培養容器を用いて、細胞を大量培養する場合に好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【００７２】
１ 計数用装置
２ 厚さ調整部材
２−１ 厚さ調整部材（厚さ減少用）
２−２ 厚さ調整部材（厚さ増加用）
３ 容器積載台
４ 撮影手段
４−１ 顕微鏡
４−２ ＣＣＤカメラ
５ 駆動装置（調節部材用）
６ 駆動装置（撮影手段用）
７ 照明
８ 培養容器
９ 攪拌部材
１０ 支持台
１１ 移動台
１２ ロッド型電動シリンダ（垂直方向動作用アクチュエータ）
１３ ボールネジ
１４ ガイド棒
１５ 基台
１６ スライダ型電動シリンダ（水平方向動作用アクチュエータ）
１７ ガラス板
【特許請求の範囲】
【請求項１】
密封された容器内の液体中の計数対象物の数を計測する方法であって、前記容器の少なくとも一部の厚みを調整し、調整した範囲の少なくとも一部を測定対象範囲として、当該測定対象範囲における計数対象物の数を計測する
ことを特徴とする容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項２】
前記容器内の液体を攪拌し、前記液体中の前記計数対象物を均等化した後に、前記容器の少なくとも一部の厚みを調整する
ことを特徴とする請求項１記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項３】
計測された前記計数対象物の数を用いて、前記液体中の計数対象物の密度を算出し、及び／又は、前記液体全体における計数対象物の数を算出する
ことを特徴とする請求項１又は２記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項４】
前記計数対象物の数の計測が、前記測定対象範囲を撮影した画像中の前記計数対象物の数を計測することにより行われる
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項５】
前記測定対象範囲における前記計数対象物の数が所定値以上である場合、前記容器の少なくとも一部の厚みを減少させた後、前記計数対象物の数を計測する
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項６】
厚み調整部材を用いて、前記容器を押圧し、又は、前記容器を引き伸ばし、前記容器の少なくとも一部の厚みを減少させる
ことを特徴とする請求項５記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項７】
前記測定対象範囲における前記計数対象物の数が所定値未満である場合、前記容器の少なくとも一部の厚みを増加させた後、前記計数対象物の数を計測する
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項８】
厚み調整部材を用いて、前記容器を押圧し、前記容器の少なくとも一部の厚みを増加させる
ことを特徴とする請求項７記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項９】
前記容器が培養容器であり、前記計数対象物が細胞である請求項１〜８のいずれかに記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項１０】
密封された容器内の液体中の計数対象物の数を計測するための計数用装置であって、
前記容器を積載する積載台と、前記容器における測定対象範囲を含む少なくとも一部を所定の厚みに調整する調整部材とを備えたことを特徴とする計数用装置。
【請求項１１】
前記調整部材により前記容器の厚みを調整する前に、前記容器内の液体を攪拌する攪拌部材を備えたことを特徴とする請求項１０記載の計数用装置。
【請求項１２】
前記容器内の前記計数対象物を撮影する撮影手段と、撮影された画像内の前記計数対象物の数を計測する計数手段と、前記計数手段による計測の結果、前記計数対象物の数が所定の範囲内に無い場合、前記画像内の計数対象物の数が、所定の範囲内になるように、前記調整部材を駆動して、前記容器の少なくとも一部を所定の厚みに調整させる駆動装置とを備えたことを特徴とする請求項１０又は１１記載の計数用装置。
【請求項１】
密封された容器内の液体中の計数対象物の数を計測する方法であって、前記容器の少なくとも一部の厚みを調整し、調整した範囲の少なくとも一部を測定対象範囲として、当該測定対象範囲における計数対象物の数を計測する
ことを特徴とする容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項２】
前記容器内の液体を攪拌し、前記液体中の前記計数対象物を均等化した後に、前記容器の少なくとも一部の厚みを調整する
ことを特徴とする請求項１記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項３】
計測された前記計数対象物の数を用いて、前記液体中の計数対象物の密度を算出し、及び／又は、前記液体全体における計数対象物の数を算出する
ことを特徴とする請求項１又は２記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項４】
前記計数対象物の数の計測が、前記測定対象範囲を撮影した画像中の前記計数対象物の数を計測することにより行われる
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項５】
前記測定対象範囲における前記計数対象物の数が所定値以上である場合、前記容器の少なくとも一部の厚みを減少させた後、前記計数対象物の数を計測する
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項６】
厚み調整部材を用いて、前記容器を押圧し、又は、前記容器を引き伸ばし、前記容器の少なくとも一部の厚みを減少させる
ことを特徴とする請求項５記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項７】
前記測定対象範囲における前記計数対象物の数が所定値未満である場合、前記容器の少なくとも一部の厚みを増加させた後、前記計数対象物の数を計測する
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項８】
厚み調整部材を用いて、前記容器を押圧し、前記容器の少なくとも一部の厚みを増加させる
ことを特徴とする請求項７記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項９】
前記容器が培養容器であり、前記計数対象物が細胞である請求項１〜８のいずれかに記載の容器内の計数対象物の計数方法。
【請求項１０】
密封された容器内の液体中の計数対象物の数を計測するための計数用装置であって、
前記容器を積載する積載台と、前記容器における測定対象範囲を含む少なくとも一部を所定の厚みに調整する調整部材とを備えたことを特徴とする計数用装置。
【請求項１１】
前記調整部材により前記容器の厚みを調整する前に、前記容器内の液体を攪拌する攪拌部材を備えたことを特徴とする請求項１０記載の計数用装置。
【請求項１２】
前記容器内の前記計数対象物を撮影する撮影手段と、撮影された画像内の前記計数対象物の数を計測する計数手段と、前記計数手段による計測の結果、前記計数対象物の数が所定の範囲内に無い場合、前記画像内の計数対象物の数が、所定の範囲内になるように、前記調整部材を駆動して、前記容器の少なくとも一部を所定の厚みに調整させる駆動装置とを備えたことを特徴とする請求項１０又は１１記載の計数用装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１４】
【図１６】
【図１７】
【図１３】
【図１５】
【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図１２】
【図１４】
【図１６】
【図１７】
【図１３】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−８７４９８（Ｐ２０１１−８７４９８Ａ）
【公開日】平成２３年５月６日（２０１１．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４２８２６（Ｐ２００９−２４２８２６）
【出願日】平成２１年１０月２１日（２００９．１０．２１）
【出願人】（０００００３７６８）東洋製罐株式会社 (1,150)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月６日（２０１１．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２１日（２００９．１０．２１）
【出願人】（０００００３７６８）東洋製罐株式会社 (1,150)
【Ｆターム（参考）】
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