対象の微生物汚染を評価するための分析機器および方法
【課題】各種サンプルのｔ閾値対ＴＶＣの２点較正曲線を使用してｔ０の生存好気性菌数を確認するための機器および方法を提供する。
【解決手段】較正曲線上の一方の点は、ｘ切片値（すなわち、サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中の試験の開始時（ｔ０）における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値）である。もう一方の点は、ｔ０でのより小さい既知生存好気性菌数を有するサンプルから実験的に確認される。
【解決手段】較正曲線上の一方の点は、ｘ切片値（すなわち、サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中の試験の開始時（ｔ０）における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値）である。もう一方の点は、ｔ０でのより小さい既知生存好気性菌数を有するサンプルから実験的に確認される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年４月２１日に出願された米国仮出願番号第６１／４７７，６９５号の利益を主張している。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中の好気性菌の総生存数（ＴＶＣ）は、サンプル中の酸素の枯渇を、ｔ閾値対ＴＶＣの先に確立した較正曲線に基づいて、閾値に達するまで経時的にモニタリングすることによって決定できる。例えば、Ｆ．Ｃ．Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ ａｎｄ Ｄ． Ｂ． Ｐａｐｋｏｖｓｋｙ， Ｒａｐｉｄ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ａｅｒｏｂｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ｏｘｙｇｎ Ｒｅｓｐｉｒｏｍｅｔｒｙ， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第７２巻、第２号、２００６年２月、１２７９〜１２８７頁を参照のこと。
【０００３】
ｔ閾値対ＴＶＣの較正曲線は、既知の異なる出発ＴＶＣを含有するいくつかのサンプルのｔ閾値を実験的に決定することと、結果を片対数目盛にプロットすることと、回帰直線の一次方程式を確立することとによって確立する。
【０００４】
このようなシステムは比較的迅速で、容易で、正確であるが、各種サンプル（例えば、各ＳＫＵまたは各種スワブまたはスワブサンプリングプロトコール）のｔ閾値対ＴＶＣの較正曲線の確立に関わる時間および費用のために、このシステムが商業的な使用には、特に、絶え間なく変わる製品ラインを有する、および／または数ダースもしくは数千でさえの種々のＳＫＵを有する企業には適さないものとなっている。
【０００５】
したがって、各種サンプルのｔ閾値対ＴＶＣの正確な較正曲線を迅速かつ安価に得るシステムおよび方法に対する大きな必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者は、驚くべきことに、各種サンプルのｔ閾値対ＴＶＣの正確な較正曲線を、一方の点がｘ切片値（すなわち、サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中の試験の開始時（ｔ０）における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値）であり、もう一方の点が、ｔ０でのより小さい既知生存好気性菌数、好ましくは、ｘ切片でのｔ０より数桁小さいｔ０での生存好気性菌数を有するサンプルから実験的に確認される、２点だけから確立できることを発見した。
【０００７】
本発明の第１の態様は、（ａ）時間ｔ０で出発して対象から採取したサンプルを培養する段階と、（ｂ）培養サンプルのＯ２濃度を、検出されるＯ２濃度が閾値より下に低下するまで定期的に確認する段階と、（ｃ）ｔ０からＯ２濃度が閾値より下に低下した時点までに測定される期間ｔ閾値を確立する段階と、（ｄ）次に示す一次方程式を使用して、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付ける段階とを含む、対象の微生物汚染を評価する方法である。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ （式１）
ここで、
ｘ＝ｔ０における、サンプルの単位重量、容積またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）であり、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【０００８】
サンプルは、酸素感受性フォトルミネッセンス色素の存在下で、酸素感受性色素の蛍光を測定することによって培養サンプルのＯ２濃度を確認しながら、密閉されたチャンバー中で培養することが好ましい。
【０００９】
本発明の第２の態様は、Ｏ２センサと、センサと電気的に連通しているマイクロプロセッサとを含む分析機器であり、ここで、機器は、（ｉ）対象から採取された培養サンプルのＯ２濃度を定期的に確認し、（ｉｉ）サンプルの培養が開始された時間ｔ０から、サンプルの確認されたＯ２濃度が最初に閾値より下に落ちる時点までの期間ｔ閾値を決定し、（ｉｉｉ）次に示す一次方程式を使用して、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付け、（ｉｖ）ｘの関連付けられた値を周辺装置に送信するのに有効である。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ （式１）
ここで、
ｘ＝ｔ０における、サンプルの単位重量、容積、またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）であり、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【００１０】
Ｏ２センサは、発光寿命を有する酸素感受性フォトルミネッセンス色素と、酸素感受性色素の蛍光を測定することによって色素と流体連結している環境中のＯ２濃度を決定するのに有効な読み取り装置とを含むことが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に従って調製された例示的較正曲線を示す図である。
【図２】本発明に従った例示的Ｏ２センサおよび培養サンプルから読み取り値を取るマイクロプロセッサを示す図であり、ここで、サンプルは、評価される対象から剥離された液化試料である。
【図３】本発明に従った例示的な培養サンプルを示す図であり、ここで、サンプルは、評価される対象の表面から採取したスワブサンプリングである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
構成
本発明は、対象（図示せず）から採取された培養サンプル５０中の酸素濃度の変化をモニタリングすることと、容易に較正可能な一次方程式を使用して観察された変化を、培養前のサンプル５０中の生存好気性菌数と関連付けることとによって、対象（図示せず）の微生物汚染を評価するための機器および方法を対象とする。
【００１３】
微生物汚染について評価される対象（図示せず）は本質的に制限がなく、食肉加工およびパッケージング施設において使用される設備、食品調理用調理台、医療機器、果実、野菜および食肉などの固体ならびに乳製品、給水塔内に保持される水、生体サンプル、下水処理システムによって処理された下水、河川および小川を流れる水などの液体などに至る。
【００１４】
当業者ならば、具体的であるが、排他的ではなく、鶏胸肉などの固体対象（図示せず）から試料を剥離すること、食品調理領域において使用される衛生的にされたステンレス鋼調理台などの硬表面から採取したスワブサンプリング、下水処理施設から採取されたアリコートなどを含めて、注目する種々の対象（図示せず）から適したサンプル５０を得、調製することができる。
【００１５】
各サンプル５０を、開放上端２１、閉鎖下端２２および保持チャンバー２９内のプローブ３０を有する容器２０の保持チャンバー２９内に入れる。容器２０は、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００２９４０２号明細書に開示されるものなどの、深さ対外周の高アスペクト比を有するバイアルまたはキュベットであることが好ましい。好ましい容器２０は、バイアルまたはキュベット２０であるので、開示内容のバランスは、バイアル２０のような容器２０を言及するものとするが、それによって制限されるものではない。
【００１６】
本明細書に記載される好ましい方法および機器は、酸素（Ｏ２）によるフォトルミネッセンスの消光に基づいて、サンプル５０中の酸素（Ｏ２）の微生物による消費をモニタリングする。発光とは、蛍光およびリン光の両方を包含する。紫外領域または可視領域における電磁放射が使用されて、分子が高い電子エネルギーレベルに励起される。励起された分子は、いくつかの方法のうち１種によってその過剰なエネルギーを失う。これらの方法の１種として、蛍光がある。蛍光とは、第一励起一重項状態から一重項基底状態への電子の放射遷移を指す（Ｓ１からＳ０）。蛍光の寿命は比較的短く、およそ１０−９〜１０−７秒である。しかし、最低励起一重項状態から三重項状態への項間交差が起こることが多く、これが、２つの状態のポテンシャルエネルギー曲線の交差の原因である。そのように生じた三重項状態は、リン光として知られる放射過程によって基底状態に戻り得る。リン光とは、最低励起三重項状態から一重項基底状態への電子の放射緩和である（Ｔ１からＳ０）。リン光につながる遷移は、スピン多重度の変化を含むので、確率が低く、したがって、１０−４〜１０秒の比較的長い寿命を有する。蛍光およびリン光寿命は、フォトルミネッセンス分子を消光できる分析物の分圧（ＰＡ）の変化に関連する規定される様式で変化するとわかっている。したがって、フォトルミネッセンス材料と流体連結しているＰＡは、フォトルミネッセンス寿命を測定することによって決定できる。
【００１７】
好ましい実施形態では、プローブ３０は光学的に活性であり、バイアル２０の保持チャンバー２９内に入れられたサンプル５０中の酸素分圧ＰＯ２の変化を経験するよう構成され、配置された酸素分圧感受性材料である。酸素感受性材料は、好ましくは、酸素透過性ポリマーマトリックス内に埋め込まれたフォトルミネッセンス色素である。あるいは、酸素感受性フォトルミネッセンス色素を、サンプル５０および／または任意の添加される増殖培地４０中に溶解してもよい。
【００１８】
酸素感受性フォトルミネッセンス色素は、周知の酸素感受性フォトルミネッセンス色素のいずれから選択してもよい。当業者ならば、プローブの意図される使用に基づいて適した色素を選択できる。適した酸素感受性フォトルミネッセンス色素の包括的でないリストとして、具体的であるが、排他的ではなく、ルテニウム（ＩＩ）−ビピリジルおよびルテニウム（ＩＩ）−ジフェニルフェナントロリン複合体、白金（ＩＩ）−オクタエチルポルフィン−ケトンなどのポルフィリン−ケトン、白金（ＩＩ）−テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ポルフィンなどの白金（ＩＩ）−ポルフィリン、パラジウム（ＩＩ）−テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ポルフィンなどのパラジウム（ＩＩ）−ポルフィリン、テトラベンゾポルフィリンのリン光金属錯体、クロリン、アザポルフィリンおよびイリジウム（ＩＩＩ）またはオスミウム（ＩＩ）の長期減衰発光複合体が挙げられる。
【００１９】
通常、疎水性酸素感受性フォトルミネッセンス色素を、適した酸素透過性かつ疎水性の担体マトリックスとともに配合する。やはり、当業者ならば、プローブ３０の意図される使用および選択された色素に基づいて、適した酸素透過性疎水性担体マトリックスを選択できる。酸素透過性疎水性担体マトリックスとして使用するための適したポリマーの包括的でないリストとして、具体的であるが、排他的ではなく、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリ塩化ビニルおよびいくつかの共重合体が挙げられる。
【００２０】
プローブ３０が、分析物によるフォトルミネッセンスの消光に基づく場合には、バイアル２０またはプローブ３０でコーティングされたバイアル２０の少なくともその部分は、励起および発光波長の放射が、プローブ３０に送信され、プローブ３０から受け取られるのを、最小にしか干渉せずに可能にしなくてはならない。
【００２１】
分析物によるフォトルミネッセンスの消光に基づいてプローブ３０を調べるための機器１０は、周知であり、ニュージャージー州フランクリンレイクのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｎおよびミネソタ州ミネアポリスのＭｏｃｏｎ，Ｉｎｃ．をはじめとする種々の供給源から市販されている。このような機器１０は、通常、マイクロプロセッサ１６、コンピュータメモリ（図示せず）、マウス（図示せず）および／またはキーボード（図示せず）などの入力装置、ディスプレイ１５およびプリンター（図示せず）を含むか、またはそれらと連通するよう装備される。
【００２２】
プローブ３０を含有するバイアル２０の製造
プローブ３０を含有するバイアル２０は、（Ａ）酢酸エチルなどの有機溶媒（図示せず）中にフォトルミネッセンス酸素感受性色素と、酸素透過性ポリマーとを含有するコーティングカクテル（図示せず）を調製することと、（Ｂ）シリンジ（図示せず）を使用することなどによって、保持チャンバー２９の底２２にカクテルを置くことと、（Ｃ）カクテル（図示せず）を乾燥させ、それによって、固体状態コーティングが、バイアル２０の底２２で保持チャンバー２９内に形成され、それによって、バイアル２０内にプローブ３０を形成することによって従来的に製造できる。
【００２３】
一般に、有機溶媒中のポリマーの濃度は、１：２０から１：１０，０００ｗ／ｗ、好ましくは、１：５０〜１：５，０００ｗ／ｗの範囲の色素対ポリマーの割合で、０．１〜２０重量％の範囲になくてはならない。
【００２４】
使用
対象の微生物汚染は、（ａ）対象から採取したサンプル５０を得ることおよびプローブ３０を備えた容器２０の保持チャンバー２９中に置くことと、（ｂ）場合により、サンプル５０を規定の期間、消化することと、（ｃ）置かれたサンプル５０内に含有される微生物の増殖を支持するために必要かつ適当な場合には、場合により、増殖培地４０を保持チャンバー２９中に置くことと、（ｄ）時間ｔ０で出発して、サンプル５０を培養することと、（ｅ）プローブ３０で検出されるＯ２濃度が閾値より下に低下するまで、培養サンプル５０のＯ２濃度を定期的に確認することと、（ｆ）ｔ０から、Ｏ２濃度が閾値よりも下に低下した時点までに測定される期間ｔ閾値を確立することと、（ｇ）次に示す一次方程式を使用して、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付けることとによって評価できる。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ （式１）
ここで、
ｘ＝ｔ０における、サンプルの単位重量、容積または、サンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）
ここで、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【００２５】
サンプルは、酸素感受性フォトルミネッセンス色素の存在下で、Ｏ２センサと、センサと電気的に連通しているマイクロプロセッサとを含む分析機器１０を用いて、酸素感受性色素の蛍光を測定することによって培養サンプルのＯ２濃度を確認しながら、密閉されたチャンバー中で培養することが好ましい。
【００２６】
Ｏ２濃度閾値は、（ｉ）Ｏ２の大気中濃度の低下％として、（ｉｉ）ｔ０での容器２０中のプローブ３０と流体連結しているＯ２の濃度に対する、容器２０中のプローブ３０と流体連結しているＯ２の濃度の低下％として、または（ｉｉｉ）容器２０の保持チャンバー２９内のＯ２の濃度の絶対値として確立してもよい。選択肢（ｉ）または選択肢（ｉｉ）のいずれかが使用される場合には、好ましい低下％は、２５％から７５％の間の低下である。選択肢（ｉｉｉ）が使用される場合には、５％から１６％の間の絶対値が好ましい。
【００２７】
サンプル５０が消化される場合には、ｔ０は、サンプル５０をｔｓｔｏｍａｃｈの規定の期間、消化した後に確立しなくてはならない。この規定の期間は、サンプル５０内の細菌の誘導増殖期内に起こるように設定することが好ましく、６０分未満の期間が通常許容され、５分未満の期間が望ましいことが多い。
【００２８】
保持チャンバー２９内の酸素濃度は、実質的に任意の所望のスケジュールで調べることができるが、２時間を超える間隔をおいての読み取りは、ｔ０でのＴＶＣの最終確認値において過度の不正確性の影響を受ける結果をもたらす傾向があり、一方で、３０分未満しか間隔をおかない読み取りは、実質的にさらなる時間および努力を必要とするが、ｔ０でのＴＶＣの最終確認値の正確性において中程度の改善しか伴わない。
【００２９】
励起されたプローブ３０によって放出される放射は、強度および／または寿命（減衰の速度、位相変動または異方性）の観点から測定でき、寿命の測定は、一般に、色素が酸素によって消光されてしまう程度の測定によって酸素濃度を確立しようとする場合に、より正確な、信頼性のある測定技術として好ましい。
【００３０】
一次方程式およびその較正
密閉されたサンプル５０が規定量または％の酸素を消費するのに必要な時間からサンプル５０中の好気性菌の総生存数（ＴＶＣ）を調べるために、図１に表されるものなどのｔ閾値対ＴＶＣの先に確立された較正曲線を使用することが必要である。
【００３１】
伝統的に、ｔ閾値対ＴＶＣのこのような較正曲線は、既知の種々の出発ＴＶＣを含有する同一サンプル種（例えば、地下水、乳、鶏胸肉、挽肉のハンバーグ、挽いた卵殻、壊れていない卵の外側から採取したスワブサンプル、衛生的にされたステンレス鋼食品加工作業面から採取したスワブサンプルなど）のいくつかのサンプル５０のｔ閾値を実験によって求めることと、半対数目盛に結果をプロットすることと、回帰直線の一次方程式を確立することとによって確立する。
【００３２】
本発明者は、驚くべきことに、各種サンプルのｔ閾値対ＴＶＣの正確な較正曲線は、一方の点がｘ切片値（すなわち、サンプル５０を培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル５０中の試験の開始時（ｔ０）における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値）であり、もう一方の点が、ｔ０でのより小さい既知生存好気性菌数、好ましくは、ｘ切片でのｔ０より数桁小さいｔ０での生存好気性菌数を有するサンプル５０から実験的に確認される、２点だけから確立できることを発見した。使用される対数は、自然対数であることが好ましい。
【００３３】
ひとたび、サンプル種のｔ閾値対ＴＶＣの較正曲線を確立すると、培養前のそのサンプル種のサンプル５０中の生存好気性菌数を、次に示す一次方程式を使用して、ｔ０からＯ２濃度が閾値より下に低下した時点までに測定されるｔ閾値の実験的に得られる値から確認できる。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ （式１）
ここで、
ｘ＝ｔ０における、サンプルの単位重量、容積、またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）
ここで、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【００３４】
ｘ切片値は、実験的に確立することが好ましいが、推定してもよい。推定する場合には、多くの場合、６から１０の間の、最も多くは、７から９の間の推定値が、許容される結果をもたらすとわかった。
【００３５】
実施例
実施例１（予測）
剥離されたサンプル
プローブ３０において酸素感受性色素の蛍光を測定することによってプローブ３０と流体連結しているサンプル５０中のＯ２濃度を決定できる検査装置１０に、特定の種類のサンプル５０の１種のサンプル５０からｙ（ｔ閾値）を実験的に得ると、方程式１をｘ（ｔ０における、サンプルの単位重量、容積またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数）について解くことができる、種々の特定の種類のサンプルのｍ（傾き）およびｂ（ｙ切片）の値を提供する。
【００３６】
検査装置１０がｍおよびｂの値を有するサンプル５０の種類に合致する、保存料を含有する加工食品のサンプル５０を、毎正時３０分に加工ラインから採取して、パッケージングの直前に生存細菌数（ＴＶＣ、ＡＰＣまたはＣＦＵ）を確認する。各サンプル５０を加工ラインから試験室へ運び、所定の期間消化し、既知容積または重量のサンプル５０を、フォトルミネッセンス酵素感受性プローブ３０を含有するバーコードをつけたバイアル２０中に置く。
【００３７】
検査装置１０を用いてプローブ３０を検査することによって、サンプル５０を含有する各バイアル２０中のプローブ３０から最初の読み取り値をとる。サンプル５０の種類、最初の読み取り値の結果および最初の読み取り値をとる時刻を記録し、調べられるバイアル２０のバーコードと関連付ける。最初の検査を完了すると、各バイアル２０のその後の検査のスケジュールを定め、バイアル２０を培養チャンバー（図示せず）中に入れる。
【００３８】
各バイアル２０を、定めた検査スケジュールで続いて検査する。各バイアル２０の各検査の結果および最初の検査からの経過時間を記録する。
【００３９】
各バイアル２０を、プローブ３０からの読み取り値が閾値に到達するまで検査し、その時点で、検査装置１０は、試験が完了したことを示し、試験されたサンプル５０の種類のｍおよびｂについて先に提供された値およびｙについて実験的に確認された値を使用して生存細菌数（ｘ）を決定し、ｘについて予め決められた閾値に基づいてサンプル５０が許容されるまたは許容されない生存細菌数を含有していたかどうかについての表示をオペレーターに提供する。要求に応じて、オペレーターは、生存細菌数の実値を検査装置１０から得ることができる。
【００４０】
実施例２（予測）
スワブされたサンプル
プローブ３０において酸素感受性色素の蛍光を測定することによってプローブ３０と流体連結しているサンプル５０中のＯ２濃度を決定できる検査装置１０に、特定の種類のサンプル５０の１種のサンプル５０からｙ（ｔ閾値）を実験的に得ると、方程式１をｘ（ｔ０における、サンプルの単位重量、容積またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数）について解くことができる、種々の特定の種類のサンプルのｍ（傾き）およびｂ（ｙ切片）の値を提供する。
【００４１】
検査装置１０がｍおよびｂの値を有するサンプル５０の種類に合致する、食品加工プラント中の作業面の既知面積をスワブすることによって得られるサンプル５０を、作業面が清掃され、衛生的にされる時間毎に採取し、生存細菌数（ＴＶＣ、ＡＰＣまたはＣＦＵ）を確認し、それによって、清掃および衛生化過程の有効性を検証する。スワブ５１のサンプル含有部分を、フォトルミネッセンス酸素感受性プローブ３０を含有するバーコードをつけたバイアル２０中に直ちに置き、適した増殖培地４０を加える。
【００４２】
検査装置１０を用いてプローブ３０を検査することによって、サンプル５０を含有する各バイアル２０中のプローブ３０から最初の読み取り値をとる。サンプル５０の種類、最初の読み取り値の結果および最初の読み取り値をとる時刻を記録し、調べられるバイアル２０のバーコードと関連付ける。最初の検査を完了すると、各バイアル２０のその後の検査のスケジュールを定め、バイアル２０を培養チャンバー（図示せず）中に入れる。
【００４３】
各バイアル２０を、定めた検査スケジュールで続いて検査する。各バイアル２０の各検査の結果および最初の検査からの経過時間を記録する。
【００４４】
各バイアル２０を、プローブ３０からの読み取り値が閾値に到達するまで検査し、その時点で、検査装置１０は、試験が完了したことを示し、試験されたサンプル５０の種類のｍおよびｂについて先に提供された値およびｙについて実験的に確認された値を使用して生存細菌数（ｘ）を決定し、ｘについて予め決められた閾値に基づいてサンプル５０が許容されるまたは許容されない生存細菌数を含有していたかどうかについての表示をオペレーターに提供する。要求に応じて、オペレーターは、生存細菌数の実値を検査装置１０から得ることができる。
【符号の説明】
【００４５】
用語
１０ 検査装置
１５ 検査装置のディスプレイ構成要素
１６ マイクロプロセッサ
２０ 容器、バイアルまたはキュベット
２１ 容器、バイアルまたはキュベットの開放上端
２２ 容器、バイアルまたはキュベットの密閉下端
２９ 容器、バイアルまたはキュベットの保持チャンバー
３０ プローブ
４０ 増殖培地
５０ サンプル
５１ サンプルを含有するスワブ
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年４月２１日に出願された米国仮出願番号第６１／４７７，６９５号の利益を主張している。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中の好気性菌の総生存数（ＴＶＣ）は、サンプル中の酸素の枯渇を、ｔ閾値対ＴＶＣの先に確立した較正曲線に基づいて、閾値に達するまで経時的にモニタリングすることによって決定できる。例えば、Ｆ．Ｃ．Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ ａｎｄ Ｄ． Ｂ． Ｐａｐｋｏｖｓｋｙ， Ｒａｐｉｄ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ａｅｒｏｂｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ｏｘｙｇｎ Ｒｅｓｐｉｒｏｍｅｔｒｙ， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第７２巻、第２号、２００６年２月、１２７９〜１２８７頁を参照のこと。
【０００３】
ｔ閾値対ＴＶＣの較正曲線は、既知の異なる出発ＴＶＣを含有するいくつかのサンプルのｔ閾値を実験的に決定することと、結果を片対数目盛にプロットすることと、回帰直線の一次方程式を確立することとによって確立する。
【０００４】
このようなシステムは比較的迅速で、容易で、正確であるが、各種サンプル（例えば、各ＳＫＵまたは各種スワブまたはスワブサンプリングプロトコール）のｔ閾値対ＴＶＣの較正曲線の確立に関わる時間および費用のために、このシステムが商業的な使用には、特に、絶え間なく変わる製品ラインを有する、および／または数ダースもしくは数千でさえの種々のＳＫＵを有する企業には適さないものとなっている。
【０００５】
したがって、各種サンプルのｔ閾値対ＴＶＣの正確な較正曲線を迅速かつ安価に得るシステムおよび方法に対する大きな必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者は、驚くべきことに、各種サンプルのｔ閾値対ＴＶＣの正確な較正曲線を、一方の点がｘ切片値（すなわち、サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中の試験の開始時（ｔ０）における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値）であり、もう一方の点が、ｔ０でのより小さい既知生存好気性菌数、好ましくは、ｘ切片でのｔ０より数桁小さいｔ０での生存好気性菌数を有するサンプルから実験的に確認される、２点だけから確立できることを発見した。
【０００７】
本発明の第１の態様は、（ａ）時間ｔ０で出発して対象から採取したサンプルを培養する段階と、（ｂ）培養サンプルのＯ２濃度を、検出されるＯ２濃度が閾値より下に低下するまで定期的に確認する段階と、（ｃ）ｔ０からＯ２濃度が閾値より下に低下した時点までに測定される期間ｔ閾値を確立する段階と、（ｄ）次に示す一次方程式を使用して、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付ける段階とを含む、対象の微生物汚染を評価する方法である。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ （式１）
ここで、
ｘ＝ｔ０における、サンプルの単位重量、容積またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）であり、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【０００８】
サンプルは、酸素感受性フォトルミネッセンス色素の存在下で、酸素感受性色素の蛍光を測定することによって培養サンプルのＯ２濃度を確認しながら、密閉されたチャンバー中で培養することが好ましい。
【０００９】
本発明の第２の態様は、Ｏ２センサと、センサと電気的に連通しているマイクロプロセッサとを含む分析機器であり、ここで、機器は、（ｉ）対象から採取された培養サンプルのＯ２濃度を定期的に確認し、（ｉｉ）サンプルの培養が開始された時間ｔ０から、サンプルの確認されたＯ２濃度が最初に閾値より下に落ちる時点までの期間ｔ閾値を決定し、（ｉｉｉ）次に示す一次方程式を使用して、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付け、（ｉｖ）ｘの関連付けられた値を周辺装置に送信するのに有効である。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ （式１）
ここで、
ｘ＝ｔ０における、サンプルの単位重量、容積、またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）であり、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【００１０】
Ｏ２センサは、発光寿命を有する酸素感受性フォトルミネッセンス色素と、酸素感受性色素の蛍光を測定することによって色素と流体連結している環境中のＯ２濃度を決定するのに有効な読み取り装置とを含むことが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に従って調製された例示的較正曲線を示す図である。
【図２】本発明に従った例示的Ｏ２センサおよび培養サンプルから読み取り値を取るマイクロプロセッサを示す図であり、ここで、サンプルは、評価される対象から剥離された液化試料である。
【図３】本発明に従った例示的な培養サンプルを示す図であり、ここで、サンプルは、評価される対象の表面から採取したスワブサンプリングである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
構成
本発明は、対象（図示せず）から採取された培養サンプル５０中の酸素濃度の変化をモニタリングすることと、容易に較正可能な一次方程式を使用して観察された変化を、培養前のサンプル５０中の生存好気性菌数と関連付けることとによって、対象（図示せず）の微生物汚染を評価するための機器および方法を対象とする。
【００１３】
微生物汚染について評価される対象（図示せず）は本質的に制限がなく、食肉加工およびパッケージング施設において使用される設備、食品調理用調理台、医療機器、果実、野菜および食肉などの固体ならびに乳製品、給水塔内に保持される水、生体サンプル、下水処理システムによって処理された下水、河川および小川を流れる水などの液体などに至る。
【００１４】
当業者ならば、具体的であるが、排他的ではなく、鶏胸肉などの固体対象（図示せず）から試料を剥離すること、食品調理領域において使用される衛生的にされたステンレス鋼調理台などの硬表面から採取したスワブサンプリング、下水処理施設から採取されたアリコートなどを含めて、注目する種々の対象（図示せず）から適したサンプル５０を得、調製することができる。
【００１５】
各サンプル５０を、開放上端２１、閉鎖下端２２および保持チャンバー２９内のプローブ３０を有する容器２０の保持チャンバー２９内に入れる。容器２０は、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００２９４０２号明細書に開示されるものなどの、深さ対外周の高アスペクト比を有するバイアルまたはキュベットであることが好ましい。好ましい容器２０は、バイアルまたはキュベット２０であるので、開示内容のバランスは、バイアル２０のような容器２０を言及するものとするが、それによって制限されるものではない。
【００１６】
本明細書に記載される好ましい方法および機器は、酸素（Ｏ２）によるフォトルミネッセンスの消光に基づいて、サンプル５０中の酸素（Ｏ２）の微生物による消費をモニタリングする。発光とは、蛍光およびリン光の両方を包含する。紫外領域または可視領域における電磁放射が使用されて、分子が高い電子エネルギーレベルに励起される。励起された分子は、いくつかの方法のうち１種によってその過剰なエネルギーを失う。これらの方法の１種として、蛍光がある。蛍光とは、第一励起一重項状態から一重項基底状態への電子の放射遷移を指す（Ｓ１からＳ０）。蛍光の寿命は比較的短く、およそ１０−９〜１０−７秒である。しかし、最低励起一重項状態から三重項状態への項間交差が起こることが多く、これが、２つの状態のポテンシャルエネルギー曲線の交差の原因である。そのように生じた三重項状態は、リン光として知られる放射過程によって基底状態に戻り得る。リン光とは、最低励起三重項状態から一重項基底状態への電子の放射緩和である（Ｔ１からＳ０）。リン光につながる遷移は、スピン多重度の変化を含むので、確率が低く、したがって、１０−４〜１０秒の比較的長い寿命を有する。蛍光およびリン光寿命は、フォトルミネッセンス分子を消光できる分析物の分圧（ＰＡ）の変化に関連する規定される様式で変化するとわかっている。したがって、フォトルミネッセンス材料と流体連結しているＰＡは、フォトルミネッセンス寿命を測定することによって決定できる。
【００１７】
好ましい実施形態では、プローブ３０は光学的に活性であり、バイアル２０の保持チャンバー２９内に入れられたサンプル５０中の酸素分圧ＰＯ２の変化を経験するよう構成され、配置された酸素分圧感受性材料である。酸素感受性材料は、好ましくは、酸素透過性ポリマーマトリックス内に埋め込まれたフォトルミネッセンス色素である。あるいは、酸素感受性フォトルミネッセンス色素を、サンプル５０および／または任意の添加される増殖培地４０中に溶解してもよい。
【００１８】
酸素感受性フォトルミネッセンス色素は、周知の酸素感受性フォトルミネッセンス色素のいずれから選択してもよい。当業者ならば、プローブの意図される使用に基づいて適した色素を選択できる。適した酸素感受性フォトルミネッセンス色素の包括的でないリストとして、具体的であるが、排他的ではなく、ルテニウム（ＩＩ）−ビピリジルおよびルテニウム（ＩＩ）−ジフェニルフェナントロリン複合体、白金（ＩＩ）−オクタエチルポルフィン−ケトンなどのポルフィリン−ケトン、白金（ＩＩ）−テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ポルフィンなどの白金（ＩＩ）−ポルフィリン、パラジウム（ＩＩ）−テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ポルフィンなどのパラジウム（ＩＩ）−ポルフィリン、テトラベンゾポルフィリンのリン光金属錯体、クロリン、アザポルフィリンおよびイリジウム（ＩＩＩ）またはオスミウム（ＩＩ）の長期減衰発光複合体が挙げられる。
【００１９】
通常、疎水性酸素感受性フォトルミネッセンス色素を、適した酸素透過性かつ疎水性の担体マトリックスとともに配合する。やはり、当業者ならば、プローブ３０の意図される使用および選択された色素に基づいて、適した酸素透過性疎水性担体マトリックスを選択できる。酸素透過性疎水性担体マトリックスとして使用するための適したポリマーの包括的でないリストとして、具体的であるが、排他的ではなく、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリ塩化ビニルおよびいくつかの共重合体が挙げられる。
【００２０】
プローブ３０が、分析物によるフォトルミネッセンスの消光に基づく場合には、バイアル２０またはプローブ３０でコーティングされたバイアル２０の少なくともその部分は、励起および発光波長の放射が、プローブ３０に送信され、プローブ３０から受け取られるのを、最小にしか干渉せずに可能にしなくてはならない。
【００２１】
分析物によるフォトルミネッセンスの消光に基づいてプローブ３０を調べるための機器１０は、周知であり、ニュージャージー州フランクリンレイクのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎｎおよびミネソタ州ミネアポリスのＭｏｃｏｎ，Ｉｎｃ．をはじめとする種々の供給源から市販されている。このような機器１０は、通常、マイクロプロセッサ１６、コンピュータメモリ（図示せず）、マウス（図示せず）および／またはキーボード（図示せず）などの入力装置、ディスプレイ１５およびプリンター（図示せず）を含むか、またはそれらと連通するよう装備される。
【００２２】
プローブ３０を含有するバイアル２０の製造
プローブ３０を含有するバイアル２０は、（Ａ）酢酸エチルなどの有機溶媒（図示せず）中にフォトルミネッセンス酸素感受性色素と、酸素透過性ポリマーとを含有するコーティングカクテル（図示せず）を調製することと、（Ｂ）シリンジ（図示せず）を使用することなどによって、保持チャンバー２９の底２２にカクテルを置くことと、（Ｃ）カクテル（図示せず）を乾燥させ、それによって、固体状態コーティングが、バイアル２０の底２２で保持チャンバー２９内に形成され、それによって、バイアル２０内にプローブ３０を形成することによって従来的に製造できる。
【００２３】
一般に、有機溶媒中のポリマーの濃度は、１：２０から１：１０，０００ｗ／ｗ、好ましくは、１：５０〜１：５，０００ｗ／ｗの範囲の色素対ポリマーの割合で、０．１〜２０重量％の範囲になくてはならない。
【００２４】
使用
対象の微生物汚染は、（ａ）対象から採取したサンプル５０を得ることおよびプローブ３０を備えた容器２０の保持チャンバー２９中に置くことと、（ｂ）場合により、サンプル５０を規定の期間、消化することと、（ｃ）置かれたサンプル５０内に含有される微生物の増殖を支持するために必要かつ適当な場合には、場合により、増殖培地４０を保持チャンバー２９中に置くことと、（ｄ）時間ｔ０で出発して、サンプル５０を培養することと、（ｅ）プローブ３０で検出されるＯ２濃度が閾値より下に低下するまで、培養サンプル５０のＯ２濃度を定期的に確認することと、（ｆ）ｔ０から、Ｏ２濃度が閾値よりも下に低下した時点までに測定される期間ｔ閾値を確立することと、（ｇ）次に示す一次方程式を使用して、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付けることとによって評価できる。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ （式１）
ここで、
ｘ＝ｔ０における、サンプルの単位重量、容積または、サンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）
ここで、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【００２５】
サンプルは、酸素感受性フォトルミネッセンス色素の存在下で、Ｏ２センサと、センサと電気的に連通しているマイクロプロセッサとを含む分析機器１０を用いて、酸素感受性色素の蛍光を測定することによって培養サンプルのＯ２濃度を確認しながら、密閉されたチャンバー中で培養することが好ましい。
【００２６】
Ｏ２濃度閾値は、（ｉ）Ｏ２の大気中濃度の低下％として、（ｉｉ）ｔ０での容器２０中のプローブ３０と流体連結しているＯ２の濃度に対する、容器２０中のプローブ３０と流体連結しているＯ２の濃度の低下％として、または（ｉｉｉ）容器２０の保持チャンバー２９内のＯ２の濃度の絶対値として確立してもよい。選択肢（ｉ）または選択肢（ｉｉ）のいずれかが使用される場合には、好ましい低下％は、２５％から７５％の間の低下である。選択肢（ｉｉｉ）が使用される場合には、５％から１６％の間の絶対値が好ましい。
【００２７】
サンプル５０が消化される場合には、ｔ０は、サンプル５０をｔｓｔｏｍａｃｈの規定の期間、消化した後に確立しなくてはならない。この規定の期間は、サンプル５０内の細菌の誘導増殖期内に起こるように設定することが好ましく、６０分未満の期間が通常許容され、５分未満の期間が望ましいことが多い。
【００２８】
保持チャンバー２９内の酸素濃度は、実質的に任意の所望のスケジュールで調べることができるが、２時間を超える間隔をおいての読み取りは、ｔ０でのＴＶＣの最終確認値において過度の不正確性の影響を受ける結果をもたらす傾向があり、一方で、３０分未満しか間隔をおかない読み取りは、実質的にさらなる時間および努力を必要とするが、ｔ０でのＴＶＣの最終確認値の正確性において中程度の改善しか伴わない。
【００２９】
励起されたプローブ３０によって放出される放射は、強度および／または寿命（減衰の速度、位相変動または異方性）の観点から測定でき、寿命の測定は、一般に、色素が酸素によって消光されてしまう程度の測定によって酸素濃度を確立しようとする場合に、より正確な、信頼性のある測定技術として好ましい。
【００３０】
一次方程式およびその較正
密閉されたサンプル５０が規定量または％の酸素を消費するのに必要な時間からサンプル５０中の好気性菌の総生存数（ＴＶＣ）を調べるために、図１に表されるものなどのｔ閾値対ＴＶＣの先に確立された較正曲線を使用することが必要である。
【００３１】
伝統的に、ｔ閾値対ＴＶＣのこのような較正曲線は、既知の種々の出発ＴＶＣを含有する同一サンプル種（例えば、地下水、乳、鶏胸肉、挽肉のハンバーグ、挽いた卵殻、壊れていない卵の外側から採取したスワブサンプル、衛生的にされたステンレス鋼食品加工作業面から採取したスワブサンプルなど）のいくつかのサンプル５０のｔ閾値を実験によって求めることと、半対数目盛に結果をプロットすることと、回帰直線の一次方程式を確立することとによって確立する。
【００３２】
本発明者は、驚くべきことに、各種サンプルのｔ閾値対ＴＶＣの正確な較正曲線は、一方の点がｘ切片値（すなわち、サンプル５０を培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル５０中の試験の開始時（ｔ０）における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値）であり、もう一方の点が、ｔ０でのより小さい既知生存好気性菌数、好ましくは、ｘ切片でのｔ０より数桁小さいｔ０での生存好気性菌数を有するサンプル５０から実験的に確認される、２点だけから確立できることを発見した。使用される対数は、自然対数であることが好ましい。
【００３３】
ひとたび、サンプル種のｔ閾値対ＴＶＣの較正曲線を確立すると、培養前のそのサンプル種のサンプル５０中の生存好気性菌数を、次に示す一次方程式を使用して、ｔ０からＯ２濃度が閾値より下に低下した時点までに測定されるｔ閾値の実験的に得られる値から確認できる。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ （式１）
ここで、
ｘ＝ｔ０における、サンプルの単位重量、容積、またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）
ここで、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【００３４】
ｘ切片値は、実験的に確立することが好ましいが、推定してもよい。推定する場合には、多くの場合、６から１０の間の、最も多くは、７から９の間の推定値が、許容される結果をもたらすとわかった。
【００３５】
実施例
実施例１（予測）
剥離されたサンプル
プローブ３０において酸素感受性色素の蛍光を測定することによってプローブ３０と流体連結しているサンプル５０中のＯ２濃度を決定できる検査装置１０に、特定の種類のサンプル５０の１種のサンプル５０からｙ（ｔ閾値）を実験的に得ると、方程式１をｘ（ｔ０における、サンプルの単位重量、容積またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数）について解くことができる、種々の特定の種類のサンプルのｍ（傾き）およびｂ（ｙ切片）の値を提供する。
【００３６】
検査装置１０がｍおよびｂの値を有するサンプル５０の種類に合致する、保存料を含有する加工食品のサンプル５０を、毎正時３０分に加工ラインから採取して、パッケージングの直前に生存細菌数（ＴＶＣ、ＡＰＣまたはＣＦＵ）を確認する。各サンプル５０を加工ラインから試験室へ運び、所定の期間消化し、既知容積または重量のサンプル５０を、フォトルミネッセンス酵素感受性プローブ３０を含有するバーコードをつけたバイアル２０中に置く。
【００３７】
検査装置１０を用いてプローブ３０を検査することによって、サンプル５０を含有する各バイアル２０中のプローブ３０から最初の読み取り値をとる。サンプル５０の種類、最初の読み取り値の結果および最初の読み取り値をとる時刻を記録し、調べられるバイアル２０のバーコードと関連付ける。最初の検査を完了すると、各バイアル２０のその後の検査のスケジュールを定め、バイアル２０を培養チャンバー（図示せず）中に入れる。
【００３８】
各バイアル２０を、定めた検査スケジュールで続いて検査する。各バイアル２０の各検査の結果および最初の検査からの経過時間を記録する。
【００３９】
各バイアル２０を、プローブ３０からの読み取り値が閾値に到達するまで検査し、その時点で、検査装置１０は、試験が完了したことを示し、試験されたサンプル５０の種類のｍおよびｂについて先に提供された値およびｙについて実験的に確認された値を使用して生存細菌数（ｘ）を決定し、ｘについて予め決められた閾値に基づいてサンプル５０が許容されるまたは許容されない生存細菌数を含有していたかどうかについての表示をオペレーターに提供する。要求に応じて、オペレーターは、生存細菌数の実値を検査装置１０から得ることができる。
【００４０】
実施例２（予測）
スワブされたサンプル
プローブ３０において酸素感受性色素の蛍光を測定することによってプローブ３０と流体連結しているサンプル５０中のＯ２濃度を決定できる検査装置１０に、特定の種類のサンプル５０の１種のサンプル５０からｙ（ｔ閾値）を実験的に得ると、方程式１をｘ（ｔ０における、サンプルの単位重量、容積またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数）について解くことができる、種々の特定の種類のサンプルのｍ（傾き）およびｂ（ｙ切片）の値を提供する。
【００４１】
検査装置１０がｍおよびｂの値を有するサンプル５０の種類に合致する、食品加工プラント中の作業面の既知面積をスワブすることによって得られるサンプル５０を、作業面が清掃され、衛生的にされる時間毎に採取し、生存細菌数（ＴＶＣ、ＡＰＣまたはＣＦＵ）を確認し、それによって、清掃および衛生化過程の有効性を検証する。スワブ５１のサンプル含有部分を、フォトルミネッセンス酸素感受性プローブ３０を含有するバーコードをつけたバイアル２０中に直ちに置き、適した増殖培地４０を加える。
【００４２】
検査装置１０を用いてプローブ３０を検査することによって、サンプル５０を含有する各バイアル２０中のプローブ３０から最初の読み取り値をとる。サンプル５０の種類、最初の読み取り値の結果および最初の読み取り値をとる時刻を記録し、調べられるバイアル２０のバーコードと関連付ける。最初の検査を完了すると、各バイアル２０のその後の検査のスケジュールを定め、バイアル２０を培養チャンバー（図示せず）中に入れる。
【００４３】
各バイアル２０を、定めた検査スケジュールで続いて検査する。各バイアル２０の各検査の結果および最初の検査からの経過時間を記録する。
【００４４】
各バイアル２０を、プローブ３０からの読み取り値が閾値に到達するまで検査し、その時点で、検査装置１０は、試験が完了したことを示し、試験されたサンプル５０の種類のｍおよびｂについて先に提供された値およびｙについて実験的に確認された値を使用して生存細菌数（ｘ）を決定し、ｘについて予め決められた閾値に基づいてサンプル５０が許容されるまたは許容されない生存細菌数を含有していたかどうかについての表示をオペレーターに提供する。要求に応じて、オペレーターは、生存細菌数の実値を検査装置１０から得ることができる。
【符号の説明】
【００４５】
用語
１０ 検査装置
１５ 検査装置のディスプレイ構成要素
１６ マイクロプロセッサ
２０ 容器、バイアルまたはキュベット
２１ 容器、バイアルまたはキュベットの開放上端
２２ 容器、バイアルまたはキュベットの密閉下端
２９ 容器、バイアルまたはキュベットの保持チャンバー
３０ プローブ
４０ 増殖培地
５０ サンプル
５１ サンプルを含有するスワブ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の微生物汚染を評価する方法であって、
（ａ）時間ｔ０で出発して、対象から採取したサンプルを培養する段階と、
（ｂ）培養サンプルのＯ２濃度を、検出されるＯ２濃度が閾値より下に低下するまで定期的に確認する段階と、
（ｃ）ｔ０からＯ２濃度が閾値より下に低下した時点までに測定される期間ｔ閾値を確立する段階と、
（ｄ）下記の一次方程式[式１]を使用して、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付ける段階と、
を有する方法。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ・・・ [式１]
ここで、
ｘ＝ｔ０における、サンプルの単位重量、容積またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）であり、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【請求項２】
対数が自然対数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、対象から剥離された試料であり、ｘ＝ｔ０におけるサンプルの単位重量または容積あたりの生存好気性菌数の対数である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、対象の表面から採取されたスワブサンプリングであり、ｘ＝ｔ０におけるサンプルを得るためにスワブされた対象の単位面積たりの生存好気性菌数の対数である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
表面の衛生化を検証する目的で、スワブサンプリングを、表面を衛生的にした後に採取する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象が食料品であり、ｔ０が、サンプルを時間ｔｓｔｏｍａｃｈの規定の期間消化した後に生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ｔｓｔｏｍａｃｈが、細菌の誘導期増殖内に完了する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培養サンプルのＯ２濃度を、少なくとも毎時１回確認する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｏ２濃度閾値が、ｔ０におけるＯ２濃度の２５％から７５％の間の低下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付けることが、一次方程式をｘについて解くことによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付けることが、ルックアップテーブルの使用によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ｘ切片が実験値である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ｘ切片が、６から１０の間の推定値である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルを、酸素感受性フォトルミネッセンス色素の存在下で密閉チャンバー中で培養し、培養サンプルのＯ２濃度を酸素感受性色素の蛍光を測定することによって確認する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
酸素感受性色素の発光寿命が、培養サンプルのＯ２濃度の変化に応じて変化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
酸素感受性フォトルミネッセンス色素が、サンプルと物理的に接触する酸素透過性疎水性ポリマーマトリックス内に埋め込まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
酸素感受性フォトルミネッセンス色素を、サンプル中に溶解する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
Ｏ２センサと、センサと電気的に連通しているマイクロプロセッサとを含む分析機器であって、
（i）対象から採取された培養サンプルのＯ２濃度を定期的に確認し、
（ii）サンプルの培養が開始された時間ｔ０から、サンプルの確認されたＯ２濃度が最初に閾値より下に落ちた時点までの期間ｔ閾値を決定し、
（iii）下記の一次方程式[式１]を使用して、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付け、
（iv）ｘの関連付けられた値を周辺装置に送信する、
のに有効である機器。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ・・・ [式１]
ここで、
ｘ＝ｔ０におけるサンプルの単位重量、容積またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたり生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）であり、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【請求項１９】
対数が自然対数である、請求項１８に記載の機器。
【請求項２０】
培養サンプルのＯ２濃度を、少なくとも２時間に１回確認するようプログラムされている、請求項１８に記載の機器。
【請求項２１】
ｔ０のＯ２濃度からの２５％から７５％の間の低下のＯ２濃度閾値を用いてプログラムされている、請求項１８に記載の機器。
【請求項２２】
一次方程式をｘについて解くことによって、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付ける、請求項１８に記載の機器。
【請求項２３】
ルックアップテーブルを使用することによって、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付ける、請求項１８に記載の機器。
【請求項２４】
少なくともユーザーインターフェースをさらに含み、ｘ切片が、人によって入力される実験値である、請求項１８に記載の機器。
【請求項２５】
少なくともユーザーインターフェースをさらに含み、ｘ切片が、人によって入力される６から１０の間の推定値である、請求項１８に記載の機器。
【請求項２６】
センサが、発光寿命を有する酸素感受性フォトルミネッセンス色素と、酸素感受性色素の蛍光を測定することによって色素と流体連結している環境中のＯ２濃度を決定するのに有効な読み取り装置とを含む、請求項１８に記載の機器。
【請求項２７】
酸素感受性色素の発光寿命が、培養サンプルのＯ２濃度の変化に応じて変化する、請求項２６に記載の機器。
【請求項２８】
酸素感受性フォトルミネッセンス色素が、対象から採取したサンプルと物理的に接触させて配置することができる酸素透過性疎水性ポリマーマトリックス内に埋め込まれている、請求項２７に記載の機器。
【請求項１】
対象の微生物汚染を評価する方法であって、
（ａ）時間ｔ０で出発して、対象から採取したサンプルを培養する段階と、
（ｂ）培養サンプルのＯ２濃度を、検出されるＯ２濃度が閾値より下に低下するまで定期的に確認する段階と、
（ｃ）ｔ０からＯ２濃度が閾値より下に低下した時点までに測定される期間ｔ閾値を確立する段階と、
（ｄ）下記の一次方程式[式１]を使用して、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付ける段階と、
を有する方法。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ・・・ [式１]
ここで、
ｘ＝ｔ０における、サンプルの単位重量、容積またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたりの生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）であり、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【請求項２】
対数が自然対数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、対象から剥離された試料であり、ｘ＝ｔ０におけるサンプルの単位重量または容積あたりの生存好気性菌数の対数である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、対象の表面から採取されたスワブサンプリングであり、ｘ＝ｔ０におけるサンプルを得るためにスワブされた対象の単位面積たりの生存好気性菌数の対数である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
表面の衛生化を検証する目的で、スワブサンプリングを、表面を衛生的にした後に採取する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
対象が食料品であり、ｔ０が、サンプルを時間ｔｓｔｏｍａｃｈの規定の期間消化した後に生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ｔｓｔｏｍａｃｈが、細菌の誘導期増殖内に完了する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培養サンプルのＯ２濃度を、少なくとも毎時１回確認する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｏ２濃度閾値が、ｔ０におけるＯ２濃度の２５％から７５％の間の低下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付けることが、一次方程式をｘについて解くことによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付けることが、ルックアップテーブルの使用によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ｘ切片が実験値である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ｘ切片が、６から１０の間の推定値である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルを、酸素感受性フォトルミネッセンス色素の存在下で密閉チャンバー中で培養し、培養サンプルのＯ２濃度を酸素感受性色素の蛍光を測定することによって確認する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
酸素感受性色素の発光寿命が、培養サンプルのＯ２濃度の変化に応じて変化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
酸素感受性フォトルミネッセンス色素が、サンプルと物理的に接触する酸素透過性疎水性ポリマーマトリックス内に埋め込まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
酸素感受性フォトルミネッセンス色素を、サンプル中に溶解する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
Ｏ２センサと、センサと電気的に連通しているマイクロプロセッサとを含む分析機器であって、
（i）対象から採取された培養サンプルのＯ２濃度を定期的に確認し、
（ii）サンプルの培養が開始された時間ｔ０から、サンプルの確認されたＯ２濃度が最初に閾値より下に落ちた時点までの期間ｔ閾値を決定し、
（iii）下記の一次方程式[式１]を使用して、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付け、
（iv）ｘの関連付けられた値を周辺装置に送信する、
のに有効である機器。
ｙ＝ｍｘ＋ｂ・・・ [式１]
ここで、
ｘ＝ｔ０におけるサンプルの単位重量、容積またはサンプルを得るためにスワブされた面積あたり生存好気性菌数の対数、
ｙ＝ｔ閾値、
ｘ切片＝（−ｂ／ｍ）＝サンプルを培養の開始時に実質的に即時にｔ閾値に達するようにさせるのに有効な、サンプル中のｔ０における最小生存好気性菌数の対数の推定値または実験値、
ｍ（傾き）＝（ｙ２−ｙ１）／（ｘ２−ｘ１）であり、
ｘ１およびｙ１は、既知ｘを有する対象から採取されたサンプルのｔ閾値を確立することによって実験的に確認されるものであり、
ｘ２およびｙ２は、ｘ切片でのｘおよびｙの値（−ｂ／ｍ，０）である。
【請求項１９】
対数が自然対数である、請求項１８に記載の機器。
【請求項２０】
培養サンプルのＯ２濃度を、少なくとも２時間に１回確認するようプログラムされている、請求項１８に記載の機器。
【請求項２１】
ｔ０のＯ２濃度からの２５％から７５％の間の低下のＯ２濃度閾値を用いてプログラムされている、請求項１８に記載の機器。
【請求項２２】
一次方程式をｘについて解くことによって、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付ける、請求項１８に記載の機器。
【請求項２３】
ルックアップテーブルを使用することによって、ｔ閾値を、培養前のサンプル中の生存好気性菌数と関連付ける、請求項１８に記載の機器。
【請求項２４】
少なくともユーザーインターフェースをさらに含み、ｘ切片が、人によって入力される実験値である、請求項１８に記載の機器。
【請求項２５】
少なくともユーザーインターフェースをさらに含み、ｘ切片が、人によって入力される６から１０の間の推定値である、請求項１８に記載の機器。
【請求項２６】
センサが、発光寿命を有する酸素感受性フォトルミネッセンス色素と、酸素感受性色素の蛍光を測定することによって色素と流体連結している環境中のＯ２濃度を決定するのに有効な読み取り装置とを含む、請求項１８に記載の機器。
【請求項２７】
酸素感受性色素の発光寿命が、培養サンプルのＯ２濃度の変化に応じて変化する、請求項２６に記載の機器。
【請求項２８】
酸素感受性フォトルミネッセンス色素が、対象から採取したサンプルと物理的に接触させて配置することができる酸素透過性疎水性ポリマーマトリックス内に埋め込まれている、請求項２７に記載の機器。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−２２５９３２（Ｐ２０１２−２２５９３２Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１１０００５（Ｐ２０１２−１１０００５）
【出願日】平成２４年４月２０日（２０１２．４．２０）
【出願人】（５９２０１４１８２）モコン・インコーポレーテッド (16)
【公開日】平成２４年１１月１５日（２０１２．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１１０００５（Ｐ２０１２−１１０００５）
【出願日】平成２４年４月２０日（２０１２．４．２０）
【出願人】（５９２０１４１８２）モコン・インコーポレーテッド (16)
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