小胞体ストレス反応を調節するハンセヌラポリモルファの新規遺伝子、およびこれを用いて分泌効果を増加させる方法
本発明は、小胞体ストレス反応（ＵＰＲ）を調節するハンセヌラポリモルファ(Hancenula polymorpha)の新規遺伝子、およびこれを用いて組み換えタンパク質の分泌発現効率を増加させる方法に関し、さらに詳しくは、ハンセヌラポリモルファでＵＰＲメカニズムの核心調節因子であるＨｐＨＡＣ１遺伝子、およびこれによる調節メカニズムを解明し、これを操作および活用して組み換えタンパク質の分泌発現効率を増加させる方法に関する。本発明によれば、ハンセヌラポリモルファ分泌発現システムを用いて、産業用または医薬用として有用な分泌タンパク質を大量生産することにより、低廉な費用で大量のタンパク質を生産することができる。よって、本発明は、産業用および医薬用組み換えタンパク質の生産に適用するとき、患者の経済的負担を省くことにより、人類の保健福祉向上にも寄与することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレス反応（ＵＰＲ）を調節するハンセヌラポリモルファ(H. polymorpha)の新規遺伝子および前記遺伝子を用いて組み換えタンパク質の分泌発現効率を増加させる方法に係り、さらに詳しくは、ハンセヌラポリモルファにおいてＵＰＲメカニズムの核心調節因子であるＨｐＨＡＣ１遺伝子とこれによる調節メカニズムを解明し、これを操作および活用して組み換えタンパク質の分泌発現効率を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母を始めとした全ての真核細胞は、細菌などの原核生物とは異なり、小胞体（ＥＲ）と呼ばれる細胞内小器官を持っているため、外に分泌されるタンパク質または細胞膜タンパク質は、この器官を通して移動する。すなわち、細胞質ではなく外部に出るタンパク質は、リボソーム(ribosome)で翻訳されて直ちに小胞体に転位(translocation)されるが、このような分泌過程中にフォールディングが不完全なタンパク質が小胞体内に蓄積されると、小胞体ストレスが発生する。このように小胞体から分泌ストレスが発生すると、これを認識し、発生した小胞体ストレス（または分泌ストレス）を解消しようとするＵＰＲと呼ばれる対応メカニズムが作動する。このようなＵＰＲメカニズムは、真核単細胞微生物である酵母からヒトなどの高等生物に至る全ての真核細胞から発見される。
【０００３】
酵母のＵＰＲメカニズムに関するゲノム水準における本格的な研究は、２０００年代に伝統酵母としてのサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を対象として始まり(Cell 101, 249, 2000)、このような結果に基づいて調節および作用メカニズムの解明が行われている(Cell 107, 103, 2001; Nature 415, 92, 2002)。
【０００４】
酵母におけるＵＰＲメカニズムは、主にＨＡＣｌと呼ばれる転写調節因子によって調節されるという事実が先に発見されたが、以後、高等生物における研究がさらに盛んに行われることにより、ＨＡＣｌに該当するＸＢＰｌ遺伝子の他にＡＴＦ６、ＰＥＲＫなどの多様な調節因子があるという事実が明らかになった。
真核単細胞微生物である酵母は、高等生物と同一の細胞内小器官を備え、非常に類似のタンパク質分泌メカニズムを保有しているため、人体由来タンパク質を発現するための経済性が高く、操作が容易な組み換え発現宿主として脚光を浴びている。
【０００５】
動物細胞発現システムは、複雑な人体由来の糖タンパク質を発現することに利点があるが、低い生産性、高価の費用および長期間がかかる生産細胞株開発期間などが大きい欠点として作用している。そして、ヒトと類似しているため、むしろウイルスとプリオンの汚染可能性などの危険性を持っており、問題点として作用している。これに対し、酵母は、低廉な費用で容易に所望の組み換えタンパク質を生産することができるため経済性が高く、殆ど人類文明の発生時点から発酵過程に多く使用されてきた安全性が立証された微生物である。現在、大部分の酵母はヒトに安全な微生物(ＧＲＡＳ, Generally Recognized As Safe)として思われている。
【０００６】
酵母の中では、伝統酵母であるサッカロミスセレビシエが長らく生物学の研究対象とされてきて、現在まで多くの組み換えタンパク質の生産宿主として活用されている。ところが、産業的な活用において重要な活性型タンパク質を大量で分泌発現する能力がピキアパストリス(Pichia pastoris)またはハンセヌラポリモルファなどの産業用酵母より足りないため、分泌発現宿主としての主導権を漸次失っている。
【０００７】
メチロトローフ酵母であるハンセヌラポリモルファは、卓越した組み換えタンパク質分泌発現宿主として最近大きい脚光を浴びている。１３．５ｇ／Ｌの驚異的な生産性を示したフィターゼ(phytase)の生産を始めとして、医薬用としてはＢ型肝炎ワクチンの大量生産に成功して大きい注目を浴びている。特に、Ｂ型肝炎ワクチンの場合には、生産宿主としてハンセヌラポリモルファの経済性のおかげで第３世界へ低廉な費用で供給して全世界人類の保健福祉増進にも大きく寄与している。
【０００８】
ハンセヌラポリモルファは、産業用および医薬用組み換えタンパク質の大量生産宿主システムとして既に国際的に認められているため、今後のハンセヌラポリモルファを用いた組み換えタンパク質生産技術の展望は非常に高い。よって、ハンセヌラポリモルファの分泌発現能力をさらに向上させることにより、人体由来医薬用糖タンパク質を含む高付加価値の分泌タンパク質を高品質、高効率で生産する宿主として開発することは、市場と産業界が求めている技術である。
【０００９】
本発明者らは、去る１０余年間、ハンセヌラポリモルファを対象として組み換えタンパク質の分泌発現のための基礎および応用研究を行ってきた。最近では、全体遺伝体水準で調節メカニズムを分析することが可能な全体ゲノムマイクロアレイを自体製作した。これに基づき、ハンセヌラポリモルファの分泌発現を最適化するための細胞再設計技術を完成するための一環として、最も重要な転写調節因子であるＨｐＨＡＣ１遺伝子を同定し、その欠損および過発現菌株を作ってその特性を分析した。ひいては、本発明者らは、これらを対象としてマイクロアレイ実験を行い、分泌ストレスを解消するＵＰＲメカニズムを理解することが可能な基礎を設け、ハンセヌラポリモルファの分泌発現を最適化するための方法を提供することにより、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子の発現を増加させる活性を示すタンパク質を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記タンパク質をコードする核酸を提供することにある。好ましくは、該核酸は、配列番号２に示される核酸配列、又はこの遺伝子に特異的なスプライシング前の、配列番号２の前駆体である配列番号１に示される核酸配列、又は配列番号１の断片を含む。
【００１１】
本発明の別の目的は、配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子の発現を増加させる転写因子活性を示すタンパク質をコードする核酸を含む組み換えベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記組み換えベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、前記組み換えベクターで形質転換されたハンセヌラポリモルファ宿主細胞を提供することにある。
本発明の別の目的は、分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子の発現を増加させる新規の転写因子遺伝子ＨｐＨＡＣ１を破砕または変異させ、小胞体ストレス反応が減少したハンセヌラポリモルファ変異株を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、前記ＨｐＨＡＣ１遺伝子の常時発現を介して、良好な成長を示す生産宿主を開発することにある。
本発明の別の目的は、前記ＨｐＨＡＣ１遺伝子の常時発現または過発現を介して、組み換えタンパク質の分泌発現能力が向上した生産宿主を製作する方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１ＡはハンセヌラポリモルファのＨｐＨＡＣｌ遺伝子の塩基配列を示し、図１Ｂは逆転写重合酵素連鎖反応によって前記遺伝子のスプライシングを確認した実験結果およびその模式図を示す。逆転写重合酵素連鎖反応の産物をアガロースゲル電気泳動によって大きさ別に分析し、スプライシングによって大きさが減少した断片の塩基配列を分析した。これよりＨＡＣ１特異的スプライシング部位を確認し、その部位を下線で表示した（図１Ａ）。前記スプライシングによって変わるスプライシングの前と後の終止コドンは太字でそれぞれ表示した。
【００１５】
【図２】図２ＡはハンセヌラポリモルファＨｐＨＡＣ１タンパク質とサッカロミセスセレビシエのＳｃＨＡＣ１タンパク質とのアミノ酸配列の比較分析結果を示し、図２Ｂは相同性が高い部位を示す模式図である。
【００１６】
【図３】図３Ａおよび図３Ｂはハンセヌラポリモルファから分泌ストレス解消反応としてのＵＰＲを誘導する条件を探索した実験結果である。図３ＡはＨｐＨＡＣ１ ｍＲＮＡのスプライシングを用いて分析した結果であり、図３Ｂは伝統酵母であるサッカロミセスセレビシエで発現が増加すると知られているＵＰＲの伝統ターゲット遺伝子に対応するハンセヌラポリモルファ遺伝子（ＨｐＫＡＲ２、ＨｐＰＤＩ１、ＨｐＥＲＯ１）の発現量の変化様相を分析したものである。前記実験のためには、指数成長期にあるハンセヌラポリモルファ野生型菌株を使用し、最適の濃度で求められた５μｇ／ｍＬのツニカマイシン(tunicamycin)、５ｍＭ ＤＴＴ(Dithiothreitol)およびブレフェルジン(Blefeldin)Ａをそれぞれ３０分、６０分、１２０分間時間別に処理した細胞を回収して使用した。
【００１７】
【図４】図４はハンセヌラポリモルファのＨｐＨＡＣ１遺伝子を破砕するための融合重合酵素連鎖反応と細胞内遺伝子組み換えに関する模式図である。
【００１８】
【図５】図５Ａはハンセヌラポリモルファ野生型とＨｐＨＡＣ１遺伝子が破砕されたＨｐＨＡＣ１Δ変異株の成長特性を分析した図である。液体培養では、前記２つの菌株をＯＤ６００＝０．１として初期培養を開始して２時間間隔でＯＤ６００を測定した。また、指数成長期にある前記２つの菌株の培養液を１０倍ずつ連続して希釈し、２μＬずつ最小固体培地、イノシトール(inositol)を添加した最小固体培地、イノシトールとツニカマイシンを添加した固体培地にそれぞれ点滴した後、２日間培養して成長特性を分析した（図５Ｂ）。
【００１９】
【図６】図６はＨｐＨａｃ１タンパク質過発現細胞株を作るための過程を示す模式図である。スプライシングされたＨｐＨＡＣ１ ＲＮＡを逆転写重合酵素連鎖反応によって増幅し、これを遺伝子組み換え方法を用いてハンセヌラポリモルファ用ベクターにクローニングしてｐＧＡＰ−ＨｐＨＡＣ１ｓベクターを製作した。そして、そのベクターをハンセヌラポリモルファ菌株に形質転換によって導入して過発現菌株を製作した。
【００２０】
【図７】図７Ａおよび図７Ｂはハンセヌラポリモルファ野生型菌株とＨｐＨＡＣ１遺伝子が破砕された変異株（ＨｐＨＡＣ１Δ）を指数成長期（ＯＤ６００＝０．５）でマイクロアレイ実験によって全体的な遺伝子発現様相の差異を分析した図である。図７Ａは全体的なマイクロアレイ実験のデザインを示す模式図、図７Ｂは個別遺伝子の発現差異を比較した散布図である。
【００２１】
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは２種のマイクロアレイ実験によってＨｐＨａｃ１タンパク質が調節するＵＰＲターゲット遺伝子を選別する実験および結果の模式図である。図８Ａは２種のマイクロアレイ実験のデザインを示す模式図、図８Ｂはマイクロアレイ実験によって選別されたＨｐＨＡＣ１が調節するＵＰＲターゲット遺伝子を酵母の分泌発現機能によって分け、その個数を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、組み換えタンパク質の生産宿主として脚光を浴びるハンセヌラポリモルファのタンパク質分泌発現を最適化して生産性を高めるための細胞再設計技術に関する。
全ての真核細胞において、外部に分泌されるタンパク質は、翻訳と同時に、小胞体という細胞内小器官へ移動し、そこでフォールディングと修飾過程が行われる。したがって、過発現プロモータなどを用いて組み換えタンパク質を大量で分泌発現すると、小胞体内のフォールディングと修飾を担当するタンパク質が処理可能な量を超過して入る場合が頻繁に発生する。このような特性タンパク質の過発現などによってフォールディングまたは修飾が不完全なタンパク質が小胞体内に蓄積されると、これは細胞にストレスとして作用し、激しい場合には成長阻害または怪死になることまである。
【００２３】
このようにフォールディングまたは修飾が不完全なタンパク質が小胞体に蓄積されて分泌ストレスが発生すると、これを認識し、ＵＰＲ(unfolded protein response)と呼ばれる対応メカニズムが作動して分泌ストレスを緩和させる。
伝統酵母であるサッカロミセスセレビシエでは、主にＩＲＥ１と呼ばれる膜タンパク質が、フォールディングが不完全なタンパク質を認識して核酸分解活性が活性化されると、唯一の基質として知られている転写因子ＨＡＣ１の前駆体ｍＲＮＡを切断する。このように切断されたＨＣＡ１のｍＲＮＡはｔＲＮＡ接合酵素（リガーゼ）によって接合され、ＨＡＣ１固有の特異的スプライシングが起り、始めてＨａｃ１タンパク質が翻訳されて出ることになる。
【００２４】
本発明者らは、メチロトローフ酵母であるハンセヌラポリモルファゲノム情報に基づいてハンセヌラポリモルファＤＬ−１菌株(Levine and Cooney, Appl. Microbiol., 26, 982-990)でＨｐＨＡＣ１遺伝子を発掘し、前記遺伝子が分泌ストレス発生の際にＨＣＡ１特異的スプライシングメカニズムを持つという事実を解明した。このように解明されたＨｐＨＡＣ１のスプライシングされた活性化ｍＲＮＡの塩基配列が配列番号２に示されており、スプライシングされる前の前駆体塩基配列が配列番号１に示されている。
【００２５】
一つの様態として、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、ＵＰＲ反応経路のターゲット遺伝子の発現を増加させる活性を示すタンパク質を提供する。
通常、ＨＡＣ１遺伝子の前駆体ｍＲＮＡは、２次元的な構造なので、タンパク質をコードする翻訳過程が行われず、Ｉｒｅ１タンパク質によるスプライシング過程が行われる場合にのみタンパク質の翻訳が行われ得る。したがって、ＨｐＨａｃ１タンパク質はスプライシングされた後の塩基配列によって決定され、このように発現されたタンパク質はＵＰＲ経路にある一群の遺伝子の発現を増加させる転写因子活性を有する。本発明によって明らかになった転写因子活性を持つＨｐＨａｃ１タンパク質のアミノ酸配列が配列番号３に示されている。
【００２６】
本発明によれば、ハンセヌラポリモルファのＨｐＨＡＣ１転写因子は、ＨＡＣ１特異的スプライシングによって、配列番号３に示されているアミノ酸配列を持つことが確認された。また、実施例５に記載されたマイクロアレイ実験によって、前記タンパク質はＵＰＲ反応経路にあるターゲット遺伝子の発現を増加させるという事実も解明した。よって、ＵＰＲターゲット遺伝子の発現を増加させる活性を持つ限りは、９０％以上の相同性を有するタンパク質およびその断片も本発明の範囲に含まれる。
【００２７】
本発明で使用された用語「相同性」とは、野生型アミノ酸配列との類似度を示すためのものであって、本発明のＨｐＨａｃ１タンパク質をコードするアミノ酸配列と好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一であり得るアミノ酸配列を含む。このような相同性の比較は、肉眼で購入容易な比較プログラムを用いて行うことができる。市販のコンピュータプログラムは２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することができ、相同性（％）は隣接した配列に対して計算できる。
本発明で使用された用語「ＵＰＲターゲット遺伝子」とは、小胞体で発生した小胞体ストレス反応を解消するために発現が増加する遺伝子を指称し、小胞体内でタンパク質のフォールディングと修飾を助けて分泌効率を増加させる遺伝子を含む。好ましくは、実施例５でマイクロアレイ実験によって明らかになった一群の遺伝子を含む。
【００２８】
別の様態として、本発明は、前記タンパク質をコードする核酸を提供する。
ハンセヌラポリモルファのＨｐＨａｃ１タンパク質をコードする核酸配列は、好ましくは配列番号１または２に示される核酸配列を有する。配列番号１は、非活性型の前駆体ｍＲＮＡであり、分泌ストレスを受けると、スプライシングと呼ばれる切断と接合によって配列番号２のｍＲＮＡに変換される。本発明者らは、実際タンパク質コード配列である配列番号２に示される核酸配列を有するハンセヌラポリモルファのＨｐＨＡＣ１遺伝子をＧｅｎＢａｎｋに寄託番号第ＤＱ６７９９１５号で寄託した。また、前記遺伝子を含む組み換えベクターｐＧＡＰ−ＨｐＨＡＣ１ｓを製作した後、大腸菌(Escherichia coli)ＤＨ５α菌株に形質転換によって導入して２００６年６月１３日にＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、韓国大田市儒城区魚慇洞５２番地所在の韓国生命工学研究院）に寄託番号第ＫＣＴＣ１０９６０ＢＰ号で寄託した。
【００２９】
別の様態として、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、ＵＰＲターゲット遺伝子の発現を増加させる転写因子活性を示すタンパク質をコードする核酸を含む組み換えベクターを提供する。
このような組み換えベクターは、好ましくは配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、ＵＰＲターゲット遺伝子の発現を増加させる転写因子活性を示すタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００３０】
本発明において、用語「ベクター」は、宿主細胞にＤＮＡを導入しようとする通常の全ての手段を意味し、例えばプラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターおよびウイルスベクターなどの通常のベクターを含む。
好ましいベクターは、プロモータ、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサなどの発現調節エレメントの他にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造できる。
【００３１】
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を提供し、好ましくは寄託番号第ＫＣＴＣ第１０９６０ＢＰ号で寄託された、形質転換された宿主細胞を提供する。
また、本発明者らは、前記組み換えベクターをハンセヌラポリモルファにも導入してＨｐＨＡＣ１タンパク質が常時発現される形質転換宿主を製作した。前記宿主は、常時発現されるＨｐＨＡＣ１タンパク質によってＵＰＲターゲット遺伝子の発現量が増加して分泌発現能力が向上するという特徴を持つ。
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換されたハンセヌラポリモルファ宿主細胞を提供する。
【００３２】
本発明者らは、ハンセヌラポリモルファの分泌ストレス解消メカニズムであるＵＰＲ反応を理解するために、ＨｐＨＡＣ１遺伝子が欠損したハンセヌラポリモルファ変異株（Ｈｐｈａｃ１Δ）を製作した。ゲノム上で目的とした遺伝子のみの特異的不活性化は当分野で確立された方法によって行うことができ、その方法は特に制限されない。
【００３３】
本発明において、ＨｐＨＡＣ１遺伝子を特異的に欠損させるためには融合重合酵素連鎖反応と細胞内相同組み換え方法(homologous recombination)が利用できる。ＨｐＨＡＣ１遺伝子の５’−末端の切片と３’−末端の切片との間に選別マーカーを含むベクターでハンセヌラポリモルファを形質転換させることにより、ゲノムとベクター間の組み換えを誘導した。
別の様態として、本発明は、ＨｐＨＡＣ１遺伝子を破砕または変異させることにより、小胞体ストレス反応が減少したハンセヌラポリモルファ変異株を提供する。
【００３４】
本発明によって製造されたＨｐｈａｃ１Δ菌株は、基本複合培地であるＹＰＤで培養したとき、指数成長期の後半から安定期に至るまで野生型菌株に比べて成長が大きく遅延して安定期に遅く到達する成長特性が確認された（図５Ａ）。これは、一般にＨＡＣ１欠損酵母菌株が複合培地では別に発現形質を示さないことに比べれば異例的な現象である。そして、伝統酵母のＨＡＣ１欠損変異株は、イノシトールがないときに成長しないイノシトール成長要求性を示すが、ハンセヌラポリモルファＨｐｈａｃ１Δ菌株は、イノシトール成長要求性がなかった（図５Ｂ）。イノシトールの存在有無を問わずに野生型より遅く成長することを固体培養でも確認することができた。また、糖タンパク質のグリコシル化を阻害させて分泌ストレスを誘発する物質としてのツニカマイシンが固体培地に含まれた場合、野生型に比べてＨｐｈａｃ１Δ菌株の成長が大きく妨害されることを確認することができた。
【００３５】
上述したような本発明に係るＨｐｈａｃ１Δ菌株がブドウ糖を含む複合栄養培地において野生型に比べて指数成長期で成長が遅い特性を示すことは、伝統酵母などでは観察されなかった特性である。よって、ハンセヌラポリモルファではＨｐＨａｃ１タンパク質が正常的な成長および分裂においても重要な遺伝子調節役割を行うことを推論することができる。伝統酵母と同様に、ツニカマイシンまたはＤＴＴ処理などの分泌ストレス条件で野生型に比べてＨｐｈａｃ１Δ菌株の成長がより阻害されることを観察することができた。
【００３６】
本発明者らは、野生型およびＨｐＨＡＣ１破砕菌株を対象として成長の差異が現れる直前の指数成長期でマイクロアレイ実験を行い、遺伝体の発現様相にどんな差異が現れるかを分析した。野性型に比べてＨｐｈａｃ１Δ菌株における発現が減少した遺伝子は、殆ど転写調節因子であるＨｐＨａｃ１タンパク質によって調節される遺伝子と予想され、伝統酵母においてＵＰＲターゲット遺伝子として知られている遺伝子が含まれる。これに対し、野生型に比べてＨｐｈａｃ１Δ菌株における発現が増加した遺伝子には、ＵＰＲターゲット遺伝子以外のストレス反応遺伝子が多く含まれる。すなわち、小胞体ストレス反応を緩和させて分泌発現効率を増加させるＨｐＨＡＣ１遺伝子の欠損の際に、一般な成長環境でも細胞はストレスを受ける。このストレスを解消するために、他のストレス反応遺伝子の発現量が大きく増加するのである。
【００３７】
別の様態として、本発明は、ＨｐＨＡＣ１遺伝子の常時発現によって成長中に発生しうる分泌ストレスが解消されて良好な成長を示す生産宿主を開発する方法を提供する。
本発明では、ハンセヌラポリモルファ野生型菌株と前記Ｈｐｈａｃ１Δ変異株を対象としてマイクロアレイ実験を行い、ＨｐＨａｃ１タンパク質が直接発現を調節するＵＰＲターゲット遺伝子が選別された。このような遺伝子群には、小胞体におけるタンパク質のフォールディングを助けるシャペロン(chaperone)および二硫化結合を助ける遺伝子（ＫＡＲ２、ＥＲＯ１、ＳＣＪ１、ＬＨＳ１、ＰＤＩ１など）が含まれ、糖タンパク質のグリコシル化を助けるタンパク質群が多く含まれる。また、タンパク質の分泌のために必要な小胞体とゴルジ体間の小胞移動に関連した遺伝子（ＳＥＣ６６、ＳＥＣ６１、ＳＥＣ３１、ＳＥＣ４、ＴＰＭ１、ＶＰＳ２９、ＳＥＣ２１、ＳＥＣ２６、ＲＥＴ２）も含まれる。
【００３８】
上述したようなＨｐＨａｃ１タンパク質が発現を増加させる遺伝子群に対する分析結果は、ＨａＨＡＣ１がハンセヌラポリモルファの分泌発現効率を向上させる機能があるという事実を立証することである。特に、分泌能力向上と共に糖タンパク質のグリコシル化能力を向上させることにより、高付加価値の人体由来医薬用糖タンパク質の分泌発現に適した生産宿主の製作に有用であろう。よって、ＨｐＨａｃ１タンパク質の常時発現または過発現によって組み換えタンパク質の分泌発現能力が向上したハンセヌラポリモルファ生産宿主を製作することができる。
【００３９】
本発明によって生産できる組み換えタンパク質は、例えば、ＥＰＯ、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｇ−ＣＳＦなどのサイトカイン；ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ヒトタンパク質Ｃなどの凝集因子；免疫グロブリン、Ｆａｂ、二重特異抗体、単一鎖抗体、ｄｉａｂｏｄｙなどの治療用抗体類、Ｆｃ融合タンパク質；グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−グルコシダーゼなどの酵素治療剤；内皮成長因子；成長ホルモン放出因子；トリパノソーマクルジトランスシアリダーゼ(typanosoma cruzi trans-sialidase)、ＨＩＶ外皮タンパク質(HIV envelope protein)、インフルエンザウイルスＡヘマグルチニン(influenza virus A haemagglutinin)、インフルエンザノイラミニダーゼ(influenza neuraminidase)、牛のエンテロキナーゼ活性因子、牛のヘルペスウイルスタイプ−１糖タンパク質Ｄ(Bovine herpes virus type-1 glycoprotein D)；ヒトアンジオスタチン(human angiostatin)、ヒトＢ７−１、Ｂ７−２およびＢ−７受容体ＣＴＬＡ−４；ヒト組織因子(human tissue factor)；成長因子（例えば、血素板由来成長因子）；ヒトα−アンチトリプシン(human alpha-antitrypsin)；組織プラズミノゲン活性化因子(tissue plasminogen activator)；プラズミノゲン活性化因子抑制因子−１(plasminogen activator inhibitor-1)；ウロキナーゼ(urokinase)；プラズミノゲン；およびトロンビンなどを含む。
【００４０】
本発明によって生産された組み換えタンパク質は、従来の技術で知られている一般な方法によって精製でき、精製された特定タンパク質の特性に応じて精製方法を選択することができる。例えば、沈殿法、免疫吸着法、分画化法または多様なクロマトグラフィー法などの精製方法があり、これに限定されない。
別の様態として、本発明は、ＨｐＨＡＣ１遺伝子の常時発現または過発現によって組み換えタンパク質の分泌発現能力が向上した生産宿主を製作する方法を提供する。
【実施例】
【００４１】
（発明の様態）
（実施例１）
ハンセヌラポリモルファＨｐＨＡＣ１のスプライシング確認
最近完成されたハンセヌラポリモルファに対する遺伝体塩基配列データベース(Ramezani-Red et al., FEMS Yeast Res., 4, 207-5, 2003)から、サッカロミセスセレビシエのＵＰＲ調節転写因子であるＳｃＨＡＣ１遺伝子と最も類似性を示すＯＲＦ(open reading frame)の塩基配列情報を得ることができたが（図１Ａ）、その類似性が１５％程度と非常に低いため、実験によってその予測が合うかを確認する必要があった。前記遺伝子が実際サッカロミセスセレビシエのＳｃＨＡＣ１に対応する遺伝子であるかを確認するために、最も大きい特徴であるＵＰＲ条件でその遺伝子が特異的にスプライシングされるかを逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて確認した。ハンセヌラポリモルファＤＬ−１菌株(Levine and Cooney, Appl. Microbiol., 26, 982-990, (1973))に分泌タンパク質ストレス誘発物質としてのＤＴＴを様々な濃度で処理した後、細胞を回収して液体窒素で急速冷却させ、しかる後に、−７０℃に保管した。
【００４２】
そして、凍らせた細胞を氷でゆっくり溶かした後、ＤＥＰＣ(Diethylpyrocabohydrate)処理した蒸留水で洗浄し、しかる後に、次の方法でＲＮＡを分離精製した。７５０μＬのＴＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．０５％ＳＤＳ）溶液を仕込み、同量の酸性フェノール−クロロホルムを仕込んだ後、６５℃で１０分間加熱し、１０秒間ボルテキシング(vortexing)過程を交互に１時間繰り返し行った。さらに、１分間氷で冷やした後、２０秒間ボルテキシングし、１４，０００ｒｐｍで１５分間常温で遠心分離した。７００μＬの上澄み液のみを注意深く新しいチューブに移し、同量の酸性フェノール−クロロホルムを入れてよく混ぜた後、４℃で１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。さらに６００μＬの上澄み液を注意深く新しいチューブに移した後、同量のクロロホルム−イソアミルアルコールを入れてよく混ぜ、前記条件と同様に遠心分離した。最終的に上澄み液のみを取って２．５倍体積の１００％エタノールと１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウムを入れて１０秒間ボルテキシングし、−７０℃で３０分間（−２０℃で約１６時間）保管した。さらに７０％エタノールで洗浄し、沈殿物を空気中で乾燥させた。乾燥した沈殿物を水に溶かした後、分離したＲＮＡの定量のためにＯＤ２８０およびＯＤ２６０の値を測定し、１．２％アガロースゲル電気泳動によって純度を確認した。前述したように抽出されたＲＮＡ１００μｇを米国Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて、提供された案内書の方法に従って追加精製した。最終的に回収したＲＮＡは、前述と同様に、ＯＤ２８０とＯＤ２６０値およびゲル電気泳動法によって濃度および純度を確認した。
【００４３】
前述した方法で精製したＲＮＡを鋳型として逆転写反応によってｃＤＮＡを合成し、さらにこれを鋳型として一対のプライマー（ＨｐＨＡＣ１−Ｓ−ｆｏｒ、ＨａＨＡＣ１−Ｓ−ｒｅｖ）を用いて重合酵素連鎖反応(Polymerase Chain Reaction;ＰＣＲ)を行った（表１参照）。そして、重合酵素連鎖反応の生産物は、アガロースゲル電気泳動によって分析し、５ｍＭ ＤＴＴを１５分間処理したサンプルから、ＨｐＨＡＣ１遺伝子がスプライシングされて２つのバンドとして現れることを確認することができた（図１Ｂ）。アガロースゲルデータの隣の模式図はＨｐＨＡＣ１が非活性化型（ＨｐＨＡＣ１ｕ）からスプライシングによって活性化型（ＨｐＨＡＣ１ｉ）に変わることを示した。確保された遺伝子断片の塩基配列を分析することにより、ＨｐＨＡＣ１のスプライシング部位を確認することができた。この部位は図１Ａに下線で示した。注目すべき点は、スプライシングによってタンパク質のＣ末端部位のアミノ酸配列が変わって元々の配列とは異なる配列になることである。非活性化型にあった終止コドンも、スプライシングによって切り出され、後部の新しい終止コドンで代替される。
【００４４】
前記実験から得られた結果に基づき、スプライシングされたＨｐＨＡＣ１のアミノ酸配列とＳｃＨＡＣ１のアミノ酸配列間の相同性をＷｅｂで利用可能なソフトウェア（ＧＥＮＥＤＯＣ、http://www.psc.edu/biomed/genedoc）によって分析したところ、８％の同一性(identity)と１５％の類似性(similarity)を示して２種間に低い相同性があることが分かった。ところが、転写調節因子としての重要なＤＮＡ結合部位である塩基モチーフ(basic motif)およびロイシンジッパー(leucine zipper)部分間には６８％の同一性と７７％の類似性を示して非常に高い相同性があることが分かった（図２）。
【００４５】
【表１】
【００４６】
（実施例２）
ハンセヌラポリモルファにおけるＵＰＲ(unfold protein response)誘導条件の探索
ＵＰＲ反応が誘導されたかは、逆転写酵素重合反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてＨｐＨＡＣ１遺伝子のスプライシング有無（図３Ａ）および伝統的なＵＰＲターゲット遺伝子の発現量増加（図３Ｂ）によって確認した。ハンセヌラポリモルファＣＢＳ４７３２に由来したＡ１６菌株を用いてツニカマイシンなどのグリコシル化阻害剤処理、ＤＴＴ(Dithiothreitol)による還元ストレス誘発およびブレフェルジン(Blefeldin)Ａ処理によるタンパク質の小胞体移動妨害などの多様な分泌ストレスを誘発し、どれほどの濃度でＵＰＲ反応が起るかを探索した。
まず、酵母の培養のためには、グルコースを主炭素源として含んでいるＹＰＤ（酵母抽出物１％、バクトペプトン２％、グルコース２％）培地を主に使用した。３ｍＬのＹＰＤ培地に１７０ｒｐｍにて３７℃で１６時間種菌培養した後、５０ｍＬのＹＰＤ培地に６００ｎｍにおけるＯＤ（ＯＤ６００）が０．１となるように接種し、しかる後に、同一の条件で本培養してＯＤ６００が０．３〜０．４となる時点で細胞を回収した。これらの細胞をｐＨ５．４のＹＰＤ培地と多様な濃度のツニカマイシン、ＤＴＴおよびブレフェルジンＡを含むｐＨ５．４のＹＰＤ培地に均等に分注して同一条件で培養し、３０分、１時間、２時間となる時点でそれぞれのＯＤ６００値を測定し、細胞を回収した。そして、これらの細胞からのＲＮＡの抽出、精製および逆転写重合酵素連鎖反応は実施例１と同様の方法を用いて行った。ＨｐＨＡＣ１のスプライシング確認のためには、表１に記述されたプライマーＨｐＨＡＣ１−Ｓ−ｆｏｒとＨａＨＡＣ１−Ｓ−ｒｅｖを使用した。伝統的なＵＰＲターゲット遺伝子の発現量確認実験のためには、表２に記述されたプライマーを用いて重合酵素連鎖反応実験を行った。
【００４７】
様々な濃度別にツニカマイシン、ＤＴＴおよびブレフェルジンＡを処理した試料からＨｐＨＡＣ１のスプライシング有無を確認した結果、５μｇ／ｍＬのツニカマイシン、５ｍＭ ＤＴＴ、５μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡで適当な程度のＨｐＨＡＣ１スプライシングパターンを確認することができた。時間別条件探索では、分泌タンパク質のグリコシル化を阻害するツニカマイシンとタンパク質の小胞体流出を妨害するブレフェルジンＡを処理した試料と、タンパク質の二硫化結合を妨害して分泌ストレスを誘発するＤＴＴを処理した試料とが、互に異なる様相を示した。ツニカマイシンとブレフェルジンＡの場合にはスプライシングパターンが大きく増加するが、ＤＴＴの場合には全般的にスプライシングの度合いが少ないうえ、３０分で最も高いスプライシング様相を示し、時間経過に伴って減少する様相を観察することができた（図３Ａ）。
【００４８】
伝統酵母であるサッカロミセスセレビシエでＵＰＲによって発現量が増加すると知られているターゲット遺伝子ＳｃＫＡＲ２、ＳｃＰＤＩ１およびＳｃＥＲＯ１に対応するハンセヌラポリモルファの遺伝子（ＨｐＫＡＲ２、ＨｐＰＤＩ１、ＨｐＥＲＯ１）に対して半定量逆転写重合酵素連鎖反応実験を行った。そして、比較のための対照区として、ＨｐＡＣＴ１に対しても同一の条件で逆転写重合酵素連鎖反応実験を行った。実験結果、ＨｐＫＡＲ２、ＨｐＥＲＯ１およびＨｐＰＤＩ１はいずれも小胞体ストレス反応によって発現量が増加することを確認することができた。
【００４９】
（実施例３）
ＨｐＨＡＣ１遺伝子欠損および過発現菌株の製作と特性分析
ＨｐＨＡＣ１遺伝子が破砕されたハンセヌラポリモルファ変異株を製作するために、融合重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）と細胞内遺伝子組み換え(in vivo DNA recombination)技術を用いて遺伝子を破砕した(Oldenburg et al., Nucleic Acid Res., 25, 451, 1997)。
【００５０】
一次重合酵素連鎖反応では、表１に記述された４対のプライマーを用いてＬＥＵ２遺伝子（Ｎ末端；ＬｅｕＮ−ｆｏｒ、ＬｅｕＮ−ｒｅｖ、Ｃ末端：ＬｅｕＣ−ｆｏｒ、ＬｅｕＣ−ｒｅｖ）とＨｐＨＡＣ１遺伝子（Ｎ末端；ＨｐＨＡＣ１−Ｎ−ｆｏｒ、ＨｐＨＡＣ１−Ｎ−ｒｅｖ、Ｃ末端；ＨｐＨＡＣ１−Ｃ−ｆｏｒ、ＨｐＨＡＣ１−Ｃ−ｒｅｖ）それぞれのＮ末端とＣ末端を増幅した後、二次融合重合酵素連鎖反応で２対のプライマーを用いてＨｐＨＡＣ１遺伝子のＮ末端とＬＥＵ２遺伝子のＮ末端とを連結（ＨｐＨＡＣ１−Ｎ−ｆｏｒ、ＬｅｕＮ−ｒｅｖし、ＬＥＵ２遺伝子のＣ末端とＨｐＨＡＣ１遺伝子のＣ末端とを連結（ＬｅｕＣ−ｆｏｒ、ＨｐＨＡＣ１−Ｃ−ｒｅｖ）した。確保したそれぞれのＤＮＡ切片を酵母細胞内に導入した後、細胞内遺伝子組み換えによってＨｐＨＡＣ１遺伝子が破砕された形質転換体を選別した（図４）。まず、ＬＥＵ２選別標識によって、ロイシンが欠乏した最小培地で成長する形質転換体を選別した後、重合酵素連鎖反応によって、野性型菌株とは異なるように増幅されたＤＮＡ切片を確認し、ＨｐＨＡＣ１遺伝子が破砕されたハンセヌラポリモルファ変異株であるＨｐｈａｃ１Δ（ｈａｃ１：：ＬＥＵ２）菌株を製作した。
【００５１】
ハンセヌラポリモルファＨｐＨＡＣ１遺伝子が過発現された変異株を製作するために、前記実施例１で確保されたｃＤＮＡを鋳型とし、表１に記述されたプライマーＨｐＨＡＣ１ｓ＿ｆｏｒとＨｐＨＡＣ１ｓ＿ｒｅｖを用いて重合酵素連鎖反応によってＨｐＨＡＣ１遺伝子を増幅した。そして、前記ＨｐＨＡＣ１遺伝子、ＬＥＵ２選別標識遺伝子および多重複製遺伝子（ＨＡＲＳ）が含まれたｐＧＡＰベクターにそれぞれＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を処理した後、これらを接合(ligation)し、大腸菌に導入してクローニングした（図６）。クローニング確認は、重合酵素連鎖反応および塩基配列分析によって行った。スプライシングされたｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡが含まれた組み換えベクターｐＧＡＰ−ＨｐＨＡＣ１ｓを選別した。そして、このように確保された前記ベクターを酵母細胞内に導入し、ＬＥＵ２標識遺伝子を用いて、ロイシンが欠乏した最小培地で成長する形質転換体を選別した。この形質転換体のＤＮＡを抽出し、これを鋳型として重合酵素連鎖反応実験を行い、ＨｐＨＡＣ１遺伝子が導入されて過発現される形質転換体ＤＬ１−Ｈ１ｓ菌株を最終製作した。
【００５２】
（実施例４）
ハンセヌラポリモルファ野性型とＨｐＨＡＣ１欠損菌株の遺伝子発現様相の分析
前記実施例３で言及したように、ＨｐＨＡＣ１欠損菌株は、野性型より成長が遅くてその理由に対する端緒を探すために、代表的な機能遺伝体研究方法であるマイクロアレイ実験方法を使用した。野生型菌株としては、ハンセヌラポリモルファＤＬ１菌株にロイシン遺伝子が入ったＤＬ１Ｌ菌株を使用し、ＨｐＨＡＣ１欠損菌株（Ｈｐｈａｃ１Δ）としては、前記実施例３で製作された菌株を使用した。ブドウ糖を主炭素源として含んでいる複合培地であるＹＰＤで培養し、指数成長期時点で２つの菌株をそれぞれ回収し、それからＲＮＡ分離精製して全体転写体の量の差異をマイクロアレイによって比較分析した（図３）。
【００５３】
実験方法をより詳しく説明すると、次のとおりである：ハンセヌラポリモルファＤＬ１ＬとＨｐｈａｃ１Δ菌株を３ｍＬのＹＰＤ培地に３７℃、１７０ｒｐｍで１６時間種菌培養した。次いで、これを５０ｍＬのＹＰＤ培地にＯＤ６００が０．１となるように菌株を接種した後、同一の条件で本培養し、成長の差異が見える以前の指数成長期であるＯＤ６００が０．５となる時点で細胞を回収した。総ＲＮＡは、前記回収された細胞から実施例１の方法と同様に分離精製した。
【００５４】
マイクロアレイ実験のためのｃＤＮＡの製造、ハイブリダイゼーションおよび蛍光標識などに用いられた全ての試薬と実験は、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ社の３ＤＮＡ（商標）サブマイクロＥＸエクスプレションアレイ検出キットおよび提供された案内書に基づいて行った。簡略に述べると、ｃＤＮＡ合成のためには総ＲＮＡ７０μｇを使用し、キットから提供されたＲＴプライマーを入れて８０℃で１０分間反応させた。氷で冷却の後、ＲＮＡ分解酵素阻害剤であるＳｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（商標）とＲＴバッファ、ｄＮＴＰ混合物と逆転写酵素混合物を添加して４２℃で２時間反応させ、０．５Ｍ ＮａＯＨ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ３．５μＬを添加して反応を中止させた。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性させるために６５℃で２０分間反応させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）によって反応を中和させた。こうして得られたｃＤＮＡ反応物をＱｉａｇｅｎ社のＰＣＲ精製キットを用いて精製濃縮し、ハイブリダイゼーションバッファ、ＬＮＡ ｄＴブロッカーを添加して８０℃で１０分、５０℃で２０分間反応させ、アレイスライドに滴下して４５℃、１８時間暗反応を行った。スライドを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣおよび蒸留水で洗浄し、完全に乾燥させた。次いで、蛍光物質である３ＤＮＡキャプチャ試薬とハイブリダイゼーション緩衝液を混合して８０℃で１０分間、５０℃で２０分間反応させ、この反応物を前記スライドに滴下させて５０℃で６時間暗反応を行った。そして、上述した過程と同一の過程を経てスライドを洗浄し、最終マイクロアレイスライドを得た。
【００５５】
前記マイクロアレイスライドをスキャンアレイ５０００でスキャニングしてアレイイメージを確保した。前記イメージをＡｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ４．０プログラムを用いて、スポット発見(spot finding)、定量(quantification)、バックグラウンド測定(background estimation)の３段階からなるイメージプロセシング過程を経て実験誤差を矯正した。そして、前記プログラムを用いて発現差異を分析した。指数成長期で野生型とＨｐｈａｃ１Δ菌株の転写体発現差異を分析した結果、まだ成長の差異が現れない時点なのに多様な遺伝子が発現量の差異を示した（図７Ｂ）。野生型に比べてＨｐｈａｃ１Δ菌株における発現が減少した遺伝子は、殆ど転写調節因子であるＨｐＨａｃ１タンパク質によって調節されるＵＰＲ関連遺伝子と予想され、伝統酵母であるＵＰＲのターゲット遺伝子として知られている遺伝子が多く含まれた（表２）。より詳しく考察すると、小胞体でタンパク質のフォールディングを助けるシャペロン遺伝子（ＫＡＲ２、ＥＲＯ１、ＳＣＪ１、ＬＨＳ１）、糖タンパク質のグリコシル化に関連した遺伝子（ＯＳＴ１、ＯＳＴ４、ＳＷＰ１、ＷＢＰ１、ＳＴＴ３、ＭＮＮ２、ＭＮＮ９、ＫＴＲ１、ＫＴＲ４、ＰＭＩ４０、ＰＭＴ２、ＰＭＴ５）とタンパク質分泌関連遺伝子（ＥＲＶ４１、ＶＩＰ３６、ＳＥＣ５３、ＹＳＹ６、ＥＭＰ７９）の発現がＨｐＨＡＣ１遺伝子の欠損の際に減少した。
【００５６】
【表２】
【００５７】
野生型に比べてＨｐｈａｃ１菌株における発現が増加した遺伝子を考察すると、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ６０、ＤＤＲ４８、ＳＩＴ１、ＳＴＩ１、ＳＩＳ１、ＨＳＣ８２などのストレス回復に関連したＨＳＰ(heat shock protein)系列、細胞内遺伝物質またはタンパク質損傷を誘導する活性酸素を除去する遺伝子（ＳＫＮ７、ＳＯＤ２、ＨＹＲ１）、タンパク質のフォールディングを助ける一群の遺伝子（ＭＴＬ１、ＭＤＪ１、ＤＮＡＪ、ＣＲＰ６）、フォールディングが不完全なタンパク質を分解する役割を担当する遺伝子（ＰＲＢ１、ＢＵＬ１、ＣＤＣ４８、ＨＵＬ５）および一般なストレス状況で細胞内構造体の保護役割を果たすトレハロース(trehalose)の合成に関連した遺伝子（ＴＰＳ１、ＴＰＳ３）の発現が増加する様相を示した（表３）。この結果は、分泌ストレスを緩和させるための遺伝子の発現を増加させるＨｐＨＡＣ１遺伝子の欠損の際に、一般な成長環境でも分泌ストレスを解消することができないため、ＨｐＨＡＣ１によって調節されない他のストレス緩和遺伝子の発現が増加するものと推論することができる。すなわち、ＨｐＨＡＣ１の欠損により一群の分泌ストレス緩和遺伝子がその機能を行わないため、相対的に別のストレス緩和遺伝子の発現が増加するものと解釈することができる。
【００５８】
【表３】
【００５９】
（実施例５）
ＨｐＨａｃ１タンパク質が調節するＵＰＲターゲット遺伝子の選別
ＨｐＨａｃ１タンパク質が調節するＵＰＲターゲット遺伝子を選別するために、２種のマイクロアレイ実験を行った。まず、野生型菌株を対象として指数成長期まで培養し、２つに分け、一方はツニカマイシンまたはＤＴＴを処理した後で培養し続け、もう一方は対照区として無処理で培養した。３０分、６０分および１２０分でそれぞれ細胞を回収し、実施例４と同様にしてマイクロアレイ実験を行った（図８Ａの左）。第２のマイクロアレイ実験では、野生型菌株とＨｐｈａｃ１Δ菌株をそれぞれ指数成長期まで培養した後、２つの細胞にツニカマイシンまたはＤＴＴを処理してそれぞれ３０分、６０分および１２０分で細胞を回収した後、マイクロアレイ実験を行った（図８Ａの右）。
【００６０】
第１のマイクロアレイ実験では、ツニカマイシンまたはＤＴＴ処理の際に発現が増加する全ての遺伝子を選別し、分泌または類似ストレスに反応する遺伝子群を取ることができた。第２のマイクロアレイ実験は、分泌ストレス条件の下で野生型とＨｐｈａｃ１Δ菌株の遺伝子発現様相の差異を比較分析することにより、ＨｐＨＡＣ１が直接調節するＵＰＲターゲット遺伝子を選別するためのものである。よって、第１のマイクロアレイ実験で選別された全体遺伝子群の中から、第２のマイクロアレイ実験でＨｐＨａｃ１タンパク質依存的に発現が増加する遺伝子群のみを選別し、Ｈｐｈａｃ１破砕により発生しうる間接効果を除去した。また、前記２つの実験において、タンパク質の二硫化結合を妨害するＤＴＴ処理とタンパク質のグリコシル化を阻害するツニカマイシン処理という２種の分泌ストレスをそれぞれ与え、２種の分泌ストレスの下ではいずれも発現量が増加する遺伝子のみを選別することにより、それぞれの処理によって発生しうる副反応を除去した。
【００６１】
前述したように激しい基準を適用し、ＨｐＨａｃ１タンパク質によって調節されるＵＰＲターゲット遺伝子を選別して表４に示した。このように選別された遺伝子には、特定機能の遺伝子群が主に含まれた。特に、小胞体でタンパク質の正常的なフォールディングを助けるシャペロンおよび二硫化結合形成遺伝子（ＫＡＲ２、ＥＲＯ１、ＳＣＪ１、ＬＨＳ１、ＰＤＩ１）と糖タンパク質のグリコシル化に関連した遺伝子（ＡＬＧ５、ＯＰＵ２４、ＯＳＴ１、ＯＳＴ２、ＯＳＴ４、ＳＷＰ１、ＷＢＰ１、ＫＴＲ１、ＯＣＲ５、ＧＰＩ１７、ＭＮＮ４、ＭＮＮ１０、ＫＴＲ４）が多く含まれた（図８Ｂ）。また、小胞体からコルギ体への分泌タンパク質輸送に関連した遺伝子（ＳＥＣ６６、ＳＥＣ６１、ＳＥＣ３１、ＳＥＣ４、ＴＰＭ１、ＶＰＳ２９）とコルジ体から小胞体への小胞逆輸送に関連した遺伝子（ＳＥＣ２１、ＳＥＣ２６、ＲＥＴ２）の発現も著しかった。
【００６２】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明では、ハンセヌラポリモルファ分泌ストレス解消反応の核心調節因子であるＨｐＨＡＣ１遺伝子を同定し、実際ＨｐＨＡＣ１タンパク質をコードしうるＨＡＣ１特異的スプライシングされたｍＲＮＡも同定し、その塩基配列も解明した。また、本発明では、マイクロアレイ実験によってＨｐＨａｃ１タンパク質が直接発現を調節する分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子も解明した。
本発明によれば、ＨｐＨａｃ１タンパク質の常時発現または過発現によってハンセヌラポリモルファの分泌発現能力および成長能力を向上させることが可能な方法を提供することができる。
【００６４】
また、本発明によれば、分泌発現能力と成長能力が向上したハンセヌラポリモルファ生産宿主を開発することができる。このように開発されたハンセヌラポリモルファ分泌発現システムを用いて、産業用または医薬用として有用な分泌タンパク質を大量生産することにより、低廉な費用で大量のタンパク質を生産することが可能な経済性を獲得することができる。よって、本発明は、産業用および医薬用組み換えタンパク質の生産に適用するとき、患者の経済的負担を省くことにより、人類の保健福祉向上にも寄与することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小胞体ストレス反応（ＵＰＲ）を調節するハンセヌラポリモルファ(H. polymorpha)の新規遺伝子および前記遺伝子を用いて組み換えタンパク質の分泌発現効率を増加させる方法に係り、さらに詳しくは、ハンセヌラポリモルファにおいてＵＰＲメカニズムの核心調節因子であるＨｐＨＡＣ１遺伝子とこれによる調節メカニズムを解明し、これを操作および活用して組み換えタンパク質の分泌発現効率を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母を始めとした全ての真核細胞は、細菌などの原核生物とは異なり、小胞体（ＥＲ）と呼ばれる細胞内小器官を持っているため、外に分泌されるタンパク質または細胞膜タンパク質は、この器官を通して移動する。すなわち、細胞質ではなく外部に出るタンパク質は、リボソーム(ribosome)で翻訳されて直ちに小胞体に転位(translocation)されるが、このような分泌過程中にフォールディングが不完全なタンパク質が小胞体内に蓄積されると、小胞体ストレスが発生する。このように小胞体から分泌ストレスが発生すると、これを認識し、発生した小胞体ストレス（または分泌ストレス）を解消しようとするＵＰＲと呼ばれる対応メカニズムが作動する。このようなＵＰＲメカニズムは、真核単細胞微生物である酵母からヒトなどの高等生物に至る全ての真核細胞から発見される。
【０００３】
酵母のＵＰＲメカニズムに関するゲノム水準における本格的な研究は、２０００年代に伝統酵母としてのサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)を対象として始まり(Cell 101, 249, 2000)、このような結果に基づいて調節および作用メカニズムの解明が行われている(Cell 107, 103, 2001; Nature 415, 92, 2002)。
【０００４】
酵母におけるＵＰＲメカニズムは、主にＨＡＣｌと呼ばれる転写調節因子によって調節されるという事実が先に発見されたが、以後、高等生物における研究がさらに盛んに行われることにより、ＨＡＣｌに該当するＸＢＰｌ遺伝子の他にＡＴＦ６、ＰＥＲＫなどの多様な調節因子があるという事実が明らかになった。
真核単細胞微生物である酵母は、高等生物と同一の細胞内小器官を備え、非常に類似のタンパク質分泌メカニズムを保有しているため、人体由来タンパク質を発現するための経済性が高く、操作が容易な組み換え発現宿主として脚光を浴びている。
【０００５】
動物細胞発現システムは、複雑な人体由来の糖タンパク質を発現することに利点があるが、低い生産性、高価の費用および長期間がかかる生産細胞株開発期間などが大きい欠点として作用している。そして、ヒトと類似しているため、むしろウイルスとプリオンの汚染可能性などの危険性を持っており、問題点として作用している。これに対し、酵母は、低廉な費用で容易に所望の組み換えタンパク質を生産することができるため経済性が高く、殆ど人類文明の発生時点から発酵過程に多く使用されてきた安全性が立証された微生物である。現在、大部分の酵母はヒトに安全な微生物(ＧＲＡＳ, Generally Recognized As Safe)として思われている。
【０００６】
酵母の中では、伝統酵母であるサッカロミスセレビシエが長らく生物学の研究対象とされてきて、現在まで多くの組み換えタンパク質の生産宿主として活用されている。ところが、産業的な活用において重要な活性型タンパク質を大量で分泌発現する能力がピキアパストリス(Pichia pastoris)またはハンセヌラポリモルファなどの産業用酵母より足りないため、分泌発現宿主としての主導権を漸次失っている。
【０００７】
メチロトローフ酵母であるハンセヌラポリモルファは、卓越した組み換えタンパク質分泌発現宿主として最近大きい脚光を浴びている。１３．５ｇ／Ｌの驚異的な生産性を示したフィターゼ(phytase)の生産を始めとして、医薬用としてはＢ型肝炎ワクチンの大量生産に成功して大きい注目を浴びている。特に、Ｂ型肝炎ワクチンの場合には、生産宿主としてハンセヌラポリモルファの経済性のおかげで第３世界へ低廉な費用で供給して全世界人類の保健福祉増進にも大きく寄与している。
【０００８】
ハンセヌラポリモルファは、産業用および医薬用組み換えタンパク質の大量生産宿主システムとして既に国際的に認められているため、今後のハンセヌラポリモルファを用いた組み換えタンパク質生産技術の展望は非常に高い。よって、ハンセヌラポリモルファの分泌発現能力をさらに向上させることにより、人体由来医薬用糖タンパク質を含む高付加価値の分泌タンパク質を高品質、高効率で生産する宿主として開発することは、市場と産業界が求めている技術である。
【０００９】
本発明者らは、去る１０余年間、ハンセヌラポリモルファを対象として組み換えタンパク質の分泌発現のための基礎および応用研究を行ってきた。最近では、全体遺伝体水準で調節メカニズムを分析することが可能な全体ゲノムマイクロアレイを自体製作した。これに基づき、ハンセヌラポリモルファの分泌発現を最適化するための細胞再設計技術を完成するための一環として、最も重要な転写調節因子であるＨｐＨＡＣ１遺伝子を同定し、その欠損および過発現菌株を作ってその特性を分析した。ひいては、本発明者らは、これらを対象としてマイクロアレイ実験を行い、分泌ストレスを解消するＵＰＲメカニズムを理解することが可能な基礎を設け、ハンセヌラポリモルファの分泌発現を最適化するための方法を提供することにより、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子の発現を増加させる活性を示すタンパク質を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記タンパク質をコードする核酸を提供することにある。好ましくは、該核酸は、配列番号２に示される核酸配列、又はこの遺伝子に特異的なスプライシング前の、配列番号２の前駆体である配列番号１に示される核酸配列、又は配列番号１の断片を含む。
【００１１】
本発明の別の目的は、配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子の発現を増加させる転写因子活性を示すタンパク質をコードする核酸を含む組み換えベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、前記組み換えベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、前記組み換えベクターで形質転換されたハンセヌラポリモルファ宿主細胞を提供することにある。
本発明の別の目的は、分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子の発現を増加させる新規の転写因子遺伝子ＨｐＨＡＣ１を破砕または変異させ、小胞体ストレス反応が減少したハンセヌラポリモルファ変異株を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、前記ＨｐＨＡＣ１遺伝子の常時発現を介して、良好な成長を示す生産宿主を開発することにある。
本発明の別の目的は、前記ＨｐＨＡＣ１遺伝子の常時発現または過発現を介して、組み換えタンパク質の分泌発現能力が向上した生産宿主を製作する方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１ＡはハンセヌラポリモルファのＨｐＨＡＣｌ遺伝子の塩基配列を示し、図１Ｂは逆転写重合酵素連鎖反応によって前記遺伝子のスプライシングを確認した実験結果およびその模式図を示す。逆転写重合酵素連鎖反応の産物をアガロースゲル電気泳動によって大きさ別に分析し、スプライシングによって大きさが減少した断片の塩基配列を分析した。これよりＨＡＣ１特異的スプライシング部位を確認し、その部位を下線で表示した（図１Ａ）。前記スプライシングによって変わるスプライシングの前と後の終止コドンは太字でそれぞれ表示した。
【００１５】
【図２】図２ＡはハンセヌラポリモルファＨｐＨＡＣ１タンパク質とサッカロミセスセレビシエのＳｃＨＡＣ１タンパク質とのアミノ酸配列の比較分析結果を示し、図２Ｂは相同性が高い部位を示す模式図である。
【００１６】
【図３】図３Ａおよび図３Ｂはハンセヌラポリモルファから分泌ストレス解消反応としてのＵＰＲを誘導する条件を探索した実験結果である。図３ＡはＨｐＨＡＣ１ ｍＲＮＡのスプライシングを用いて分析した結果であり、図３Ｂは伝統酵母であるサッカロミセスセレビシエで発現が増加すると知られているＵＰＲの伝統ターゲット遺伝子に対応するハンセヌラポリモルファ遺伝子（ＨｐＫＡＲ２、ＨｐＰＤＩ１、ＨｐＥＲＯ１）の発現量の変化様相を分析したものである。前記実験のためには、指数成長期にあるハンセヌラポリモルファ野生型菌株を使用し、最適の濃度で求められた５μｇ／ｍＬのツニカマイシン(tunicamycin)、５ｍＭ ＤＴＴ(Dithiothreitol)およびブレフェルジン(Blefeldin)Ａをそれぞれ３０分、６０分、１２０分間時間別に処理した細胞を回収して使用した。
【００１７】
【図４】図４はハンセヌラポリモルファのＨｐＨＡＣ１遺伝子を破砕するための融合重合酵素連鎖反応と細胞内遺伝子組み換えに関する模式図である。
【００１８】
【図５】図５Ａはハンセヌラポリモルファ野生型とＨｐＨＡＣ１遺伝子が破砕されたＨｐＨＡＣ１Δ変異株の成長特性を分析した図である。液体培養では、前記２つの菌株をＯＤ６００＝０．１として初期培養を開始して２時間間隔でＯＤ６００を測定した。また、指数成長期にある前記２つの菌株の培養液を１０倍ずつ連続して希釈し、２μＬずつ最小固体培地、イノシトール(inositol)を添加した最小固体培地、イノシトールとツニカマイシンを添加した固体培地にそれぞれ点滴した後、２日間培養して成長特性を分析した（図５Ｂ）。
【００１９】
【図６】図６はＨｐＨａｃ１タンパク質過発現細胞株を作るための過程を示す模式図である。スプライシングされたＨｐＨＡＣ１ ＲＮＡを逆転写重合酵素連鎖反応によって増幅し、これを遺伝子組み換え方法を用いてハンセヌラポリモルファ用ベクターにクローニングしてｐＧＡＰ−ＨｐＨＡＣ１ｓベクターを製作した。そして、そのベクターをハンセヌラポリモルファ菌株に形質転換によって導入して過発現菌株を製作した。
【００２０】
【図７】図７Ａおよび図７Ｂはハンセヌラポリモルファ野生型菌株とＨｐＨＡＣ１遺伝子が破砕された変異株（ＨｐＨＡＣ１Δ）を指数成長期（ＯＤ６００＝０．５）でマイクロアレイ実験によって全体的な遺伝子発現様相の差異を分析した図である。図７Ａは全体的なマイクロアレイ実験のデザインを示す模式図、図７Ｂは個別遺伝子の発現差異を比較した散布図である。
【００２１】
【図８】図８Ａおよび図８Ｂは２種のマイクロアレイ実験によってＨｐＨａｃ１タンパク質が調節するＵＰＲターゲット遺伝子を選別する実験および結果の模式図である。図８Ａは２種のマイクロアレイ実験のデザインを示す模式図、図８Ｂはマイクロアレイ実験によって選別されたＨｐＨＡＣ１が調節するＵＰＲターゲット遺伝子を酵母の分泌発現機能によって分け、その個数を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、組み換えタンパク質の生産宿主として脚光を浴びるハンセヌラポリモルファのタンパク質分泌発現を最適化して生産性を高めるための細胞再設計技術に関する。
全ての真核細胞において、外部に分泌されるタンパク質は、翻訳と同時に、小胞体という細胞内小器官へ移動し、そこでフォールディングと修飾過程が行われる。したがって、過発現プロモータなどを用いて組み換えタンパク質を大量で分泌発現すると、小胞体内のフォールディングと修飾を担当するタンパク質が処理可能な量を超過して入る場合が頻繁に発生する。このような特性タンパク質の過発現などによってフォールディングまたは修飾が不完全なタンパク質が小胞体内に蓄積されると、これは細胞にストレスとして作用し、激しい場合には成長阻害または怪死になることまである。
【００２３】
このようにフォールディングまたは修飾が不完全なタンパク質が小胞体に蓄積されて分泌ストレスが発生すると、これを認識し、ＵＰＲ(unfolded protein response)と呼ばれる対応メカニズムが作動して分泌ストレスを緩和させる。
伝統酵母であるサッカロミセスセレビシエでは、主にＩＲＥ１と呼ばれる膜タンパク質が、フォールディングが不完全なタンパク質を認識して核酸分解活性が活性化されると、唯一の基質として知られている転写因子ＨＡＣ１の前駆体ｍＲＮＡを切断する。このように切断されたＨＣＡ１のｍＲＮＡはｔＲＮＡ接合酵素（リガーゼ）によって接合され、ＨＡＣ１固有の特異的スプライシングが起り、始めてＨａｃ１タンパク質が翻訳されて出ることになる。
【００２４】
本発明者らは、メチロトローフ酵母であるハンセヌラポリモルファゲノム情報に基づいてハンセヌラポリモルファＤＬ−１菌株(Levine and Cooney, Appl. Microbiol., 26, 982-990)でＨｐＨＡＣ１遺伝子を発掘し、前記遺伝子が分泌ストレス発生の際にＨＣＡ１特異的スプライシングメカニズムを持つという事実を解明した。このように解明されたＨｐＨＡＣ１のスプライシングされた活性化ｍＲＮＡの塩基配列が配列番号２に示されており、スプライシングされる前の前駆体塩基配列が配列番号１に示されている。
【００２５】
一つの様態として、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、ＵＰＲ反応経路のターゲット遺伝子の発現を増加させる活性を示すタンパク質を提供する。
通常、ＨＡＣ１遺伝子の前駆体ｍＲＮＡは、２次元的な構造なので、タンパク質をコードする翻訳過程が行われず、Ｉｒｅ１タンパク質によるスプライシング過程が行われる場合にのみタンパク質の翻訳が行われ得る。したがって、ＨｐＨａｃ１タンパク質はスプライシングされた後の塩基配列によって決定され、このように発現されたタンパク質はＵＰＲ経路にある一群の遺伝子の発現を増加させる転写因子活性を有する。本発明によって明らかになった転写因子活性を持つＨｐＨａｃ１タンパク質のアミノ酸配列が配列番号３に示されている。
【００２６】
本発明によれば、ハンセヌラポリモルファのＨｐＨＡＣ１転写因子は、ＨＡＣ１特異的スプライシングによって、配列番号３に示されているアミノ酸配列を持つことが確認された。また、実施例５に記載されたマイクロアレイ実験によって、前記タンパク質はＵＰＲ反応経路にあるターゲット遺伝子の発現を増加させるという事実も解明した。よって、ＵＰＲターゲット遺伝子の発現を増加させる活性を持つ限りは、９０％以上の相同性を有するタンパク質およびその断片も本発明の範囲に含まれる。
【００２７】
本発明で使用された用語「相同性」とは、野生型アミノ酸配列との類似度を示すためのものであって、本発明のＨｐＨａｃ１タンパク質をコードするアミノ酸配列と好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上同一であり得るアミノ酸配列を含む。このような相同性の比較は、肉眼で購入容易な比較プログラムを用いて行うことができる。市販のコンピュータプログラムは２つ以上の配列間の相同性を百分率（％）で計算することができ、相同性（％）は隣接した配列に対して計算できる。
本発明で使用された用語「ＵＰＲターゲット遺伝子」とは、小胞体で発生した小胞体ストレス反応を解消するために発現が増加する遺伝子を指称し、小胞体内でタンパク質のフォールディングと修飾を助けて分泌効率を増加させる遺伝子を含む。好ましくは、実施例５でマイクロアレイ実験によって明らかになった一群の遺伝子を含む。
【００２８】
別の様態として、本発明は、前記タンパク質をコードする核酸を提供する。
ハンセヌラポリモルファのＨｐＨａｃ１タンパク質をコードする核酸配列は、好ましくは配列番号１または２に示される核酸配列を有する。配列番号１は、非活性型の前駆体ｍＲＮＡであり、分泌ストレスを受けると、スプライシングと呼ばれる切断と接合によって配列番号２のｍＲＮＡに変換される。本発明者らは、実際タンパク質コード配列である配列番号２に示される核酸配列を有するハンセヌラポリモルファのＨｐＨＡＣ１遺伝子をＧｅｎＢａｎｋに寄託番号第ＤＱ６７９９１５号で寄託した。また、前記遺伝子を含む組み換えベクターｐＧＡＰ−ＨｐＨＡＣ１ｓを製作した後、大腸菌(Escherichia coli)ＤＨ５α菌株に形質転換によって導入して２００６年６月１３日にＫＣＴＣ（Korean Collection for Type Cultures、韓国大田市儒城区魚慇洞５２番地所在の韓国生命工学研究院）に寄託番号第ＫＣＴＣ１０９６０ＢＰ号で寄託した。
【００２９】
別の様態として、本発明は、配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、ＵＰＲターゲット遺伝子の発現を増加させる転写因子活性を示すタンパク質をコードする核酸を含む組み換えベクターを提供する。
このような組み換えベクターは、好ましくは配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、ＵＰＲターゲット遺伝子の発現を増加させる転写因子活性を示すタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００３０】
本発明において、用語「ベクター」は、宿主細胞にＤＮＡを導入しようとする通常の全ての手段を意味し、例えばプラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターおよびウイルスベクターなどの通常のベクターを含む。
好ましいベクターは、プロモータ、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサなどの発現調節エレメントの他にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造できる。
【００３１】
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞を提供し、好ましくは寄託番号第ＫＣＴＣ第１０９６０ＢＰ号で寄託された、形質転換された宿主細胞を提供する。
また、本発明者らは、前記組み換えベクターをハンセヌラポリモルファにも導入してＨｐＨＡＣ１タンパク質が常時発現される形質転換宿主を製作した。前記宿主は、常時発現されるＨｐＨＡＣ１タンパク質によってＵＰＲターゲット遺伝子の発現量が増加して分泌発現能力が向上するという特徴を持つ。
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換されたハンセヌラポリモルファ宿主細胞を提供する。
【００３２】
本発明者らは、ハンセヌラポリモルファの分泌ストレス解消メカニズムであるＵＰＲ反応を理解するために、ＨｐＨＡＣ１遺伝子が欠損したハンセヌラポリモルファ変異株（Ｈｐｈａｃ１Δ）を製作した。ゲノム上で目的とした遺伝子のみの特異的不活性化は当分野で確立された方法によって行うことができ、その方法は特に制限されない。
【００３３】
本発明において、ＨｐＨＡＣ１遺伝子を特異的に欠損させるためには融合重合酵素連鎖反応と細胞内相同組み換え方法(homologous recombination)が利用できる。ＨｐＨＡＣ１遺伝子の５’−末端の切片と３’−末端の切片との間に選別マーカーを含むベクターでハンセヌラポリモルファを形質転換させることにより、ゲノムとベクター間の組み換えを誘導した。
別の様態として、本発明は、ＨｐＨＡＣ１遺伝子を破砕または変異させることにより、小胞体ストレス反応が減少したハンセヌラポリモルファ変異株を提供する。
【００３４】
本発明によって製造されたＨｐｈａｃ１Δ菌株は、基本複合培地であるＹＰＤで培養したとき、指数成長期の後半から安定期に至るまで野生型菌株に比べて成長が大きく遅延して安定期に遅く到達する成長特性が確認された（図５Ａ）。これは、一般にＨＡＣ１欠損酵母菌株が複合培地では別に発現形質を示さないことに比べれば異例的な現象である。そして、伝統酵母のＨＡＣ１欠損変異株は、イノシトールがないときに成長しないイノシトール成長要求性を示すが、ハンセヌラポリモルファＨｐｈａｃ１Δ菌株は、イノシトール成長要求性がなかった（図５Ｂ）。イノシトールの存在有無を問わずに野生型より遅く成長することを固体培養でも確認することができた。また、糖タンパク質のグリコシル化を阻害させて分泌ストレスを誘発する物質としてのツニカマイシンが固体培地に含まれた場合、野生型に比べてＨｐｈａｃ１Δ菌株の成長が大きく妨害されることを確認することができた。
【００３５】
上述したような本発明に係るＨｐｈａｃ１Δ菌株がブドウ糖を含む複合栄養培地において野生型に比べて指数成長期で成長が遅い特性を示すことは、伝統酵母などでは観察されなかった特性である。よって、ハンセヌラポリモルファではＨｐＨａｃ１タンパク質が正常的な成長および分裂においても重要な遺伝子調節役割を行うことを推論することができる。伝統酵母と同様に、ツニカマイシンまたはＤＴＴ処理などの分泌ストレス条件で野生型に比べてＨｐｈａｃ１Δ菌株の成長がより阻害されることを観察することができた。
【００３６】
本発明者らは、野生型およびＨｐＨＡＣ１破砕菌株を対象として成長の差異が現れる直前の指数成長期でマイクロアレイ実験を行い、遺伝体の発現様相にどんな差異が現れるかを分析した。野性型に比べてＨｐｈａｃ１Δ菌株における発現が減少した遺伝子は、殆ど転写調節因子であるＨｐＨａｃ１タンパク質によって調節される遺伝子と予想され、伝統酵母においてＵＰＲターゲット遺伝子として知られている遺伝子が含まれる。これに対し、野生型に比べてＨｐｈａｃ１Δ菌株における発現が増加した遺伝子には、ＵＰＲターゲット遺伝子以外のストレス反応遺伝子が多く含まれる。すなわち、小胞体ストレス反応を緩和させて分泌発現効率を増加させるＨｐＨＡＣ１遺伝子の欠損の際に、一般な成長環境でも細胞はストレスを受ける。このストレスを解消するために、他のストレス反応遺伝子の発現量が大きく増加するのである。
【００３７】
別の様態として、本発明は、ＨｐＨＡＣ１遺伝子の常時発現によって成長中に発生しうる分泌ストレスが解消されて良好な成長を示す生産宿主を開発する方法を提供する。
本発明では、ハンセヌラポリモルファ野生型菌株と前記Ｈｐｈａｃ１Δ変異株を対象としてマイクロアレイ実験を行い、ＨｐＨａｃ１タンパク質が直接発現を調節するＵＰＲターゲット遺伝子が選別された。このような遺伝子群には、小胞体におけるタンパク質のフォールディングを助けるシャペロン(chaperone)および二硫化結合を助ける遺伝子（ＫＡＲ２、ＥＲＯ１、ＳＣＪ１、ＬＨＳ１、ＰＤＩ１など）が含まれ、糖タンパク質のグリコシル化を助けるタンパク質群が多く含まれる。また、タンパク質の分泌のために必要な小胞体とゴルジ体間の小胞移動に関連した遺伝子（ＳＥＣ６６、ＳＥＣ６１、ＳＥＣ３１、ＳＥＣ４、ＴＰＭ１、ＶＰＳ２９、ＳＥＣ２１、ＳＥＣ２６、ＲＥＴ２）も含まれる。
【００３８】
上述したようなＨｐＨａｃ１タンパク質が発現を増加させる遺伝子群に対する分析結果は、ＨａＨＡＣ１がハンセヌラポリモルファの分泌発現効率を向上させる機能があるという事実を立証することである。特に、分泌能力向上と共に糖タンパク質のグリコシル化能力を向上させることにより、高付加価値の人体由来医薬用糖タンパク質の分泌発現に適した生産宿主の製作に有用であろう。よって、ＨｐＨａｃ１タンパク質の常時発現または過発現によって組み換えタンパク質の分泌発現能力が向上したハンセヌラポリモルファ生産宿主を製作することができる。
【００３９】
本発明によって生産できる組み換えタンパク質は、例えば、ＥＰＯ、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｇ−ＣＳＦなどのサイトカイン；ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、ヒトタンパク質Ｃなどの凝集因子；免疫グロブリン、Ｆａｂ、二重特異抗体、単一鎖抗体、ｄｉａｂｏｄｙなどの治療用抗体類、Ｆｃ融合タンパク質；グルコセレブロシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、α−グルコシダーゼなどの酵素治療剤；内皮成長因子；成長ホルモン放出因子；トリパノソーマクルジトランスシアリダーゼ(typanosoma cruzi trans-sialidase)、ＨＩＶ外皮タンパク質(HIV envelope protein)、インフルエンザウイルスＡヘマグルチニン(influenza virus A haemagglutinin)、インフルエンザノイラミニダーゼ(influenza neuraminidase)、牛のエンテロキナーゼ活性因子、牛のヘルペスウイルスタイプ−１糖タンパク質Ｄ(Bovine herpes virus type-1 glycoprotein D)；ヒトアンジオスタチン(human angiostatin)、ヒトＢ７−１、Ｂ７−２およびＢ−７受容体ＣＴＬＡ−４；ヒト組織因子(human tissue factor)；成長因子（例えば、血素板由来成長因子）；ヒトα−アンチトリプシン(human alpha-antitrypsin)；組織プラズミノゲン活性化因子(tissue plasminogen activator)；プラズミノゲン活性化因子抑制因子−１(plasminogen activator inhibitor-1)；ウロキナーゼ(urokinase)；プラズミノゲン；およびトロンビンなどを含む。
【００４０】
本発明によって生産された組み換えタンパク質は、従来の技術で知られている一般な方法によって精製でき、精製された特定タンパク質の特性に応じて精製方法を選択することができる。例えば、沈殿法、免疫吸着法、分画化法または多様なクロマトグラフィー法などの精製方法があり、これに限定されない。
別の様態として、本発明は、ＨｐＨＡＣ１遺伝子の常時発現または過発現によって組み換えタンパク質の分泌発現能力が向上した生産宿主を製作する方法を提供する。
【実施例】
【００４１】
（発明の様態）
（実施例１）
ハンセヌラポリモルファＨｐＨＡＣ１のスプライシング確認
最近完成されたハンセヌラポリモルファに対する遺伝体塩基配列データベース(Ramezani-Red et al., FEMS Yeast Res., 4, 207-5, 2003)から、サッカロミセスセレビシエのＵＰＲ調節転写因子であるＳｃＨＡＣ１遺伝子と最も類似性を示すＯＲＦ(open reading frame)の塩基配列情報を得ることができたが（図１Ａ）、その類似性が１５％程度と非常に低いため、実験によってその予測が合うかを確認する必要があった。前記遺伝子が実際サッカロミセスセレビシエのＳｃＨＡＣ１に対応する遺伝子であるかを確認するために、最も大きい特徴であるＵＰＲ条件でその遺伝子が特異的にスプライシングされるかを逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて確認した。ハンセヌラポリモルファＤＬ−１菌株(Levine and Cooney, Appl. Microbiol., 26, 982-990, (1973))に分泌タンパク質ストレス誘発物質としてのＤＴＴを様々な濃度で処理した後、細胞を回収して液体窒素で急速冷却させ、しかる後に、−７０℃に保管した。
【００４２】
そして、凍らせた細胞を氷でゆっくり溶かした後、ＤＥＰＣ(Diethylpyrocabohydrate)処理した蒸留水で洗浄し、しかる後に、次の方法でＲＮＡを分離精製した。７５０μＬのＴＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．０５％ＳＤＳ）溶液を仕込み、同量の酸性フェノール−クロロホルムを仕込んだ後、６５℃で１０分間加熱し、１０秒間ボルテキシング(vortexing)過程を交互に１時間繰り返し行った。さらに、１分間氷で冷やした後、２０秒間ボルテキシングし、１４，０００ｒｐｍで１５分間常温で遠心分離した。７００μＬの上澄み液のみを注意深く新しいチューブに移し、同量の酸性フェノール−クロロホルムを入れてよく混ぜた後、４℃で１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。さらに６００μＬの上澄み液を注意深く新しいチューブに移した後、同量のクロロホルム−イソアミルアルコールを入れてよく混ぜ、前記条件と同様に遠心分離した。最終的に上澄み液のみを取って２．５倍体積の１００％エタノールと１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウムを入れて１０秒間ボルテキシングし、−７０℃で３０分間（−２０℃で約１６時間）保管した。さらに７０％エタノールで洗浄し、沈殿物を空気中で乾燥させた。乾燥した沈殿物を水に溶かした後、分離したＲＮＡの定量のためにＯＤ２８０およびＯＤ２６０の値を測定し、１．２％アガロースゲル電気泳動によって純度を確認した。前述したように抽出されたＲＮＡ１００μｇを米国Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いて、提供された案内書の方法に従って追加精製した。最終的に回収したＲＮＡは、前述と同様に、ＯＤ２８０とＯＤ２６０値およびゲル電気泳動法によって濃度および純度を確認した。
【００４３】
前述した方法で精製したＲＮＡを鋳型として逆転写反応によってｃＤＮＡを合成し、さらにこれを鋳型として一対のプライマー（ＨｐＨＡＣ１−Ｓ−ｆｏｒ、ＨａＨＡＣ１−Ｓ−ｒｅｖ）を用いて重合酵素連鎖反応(Polymerase Chain Reaction;ＰＣＲ)を行った（表１参照）。そして、重合酵素連鎖反応の生産物は、アガロースゲル電気泳動によって分析し、５ｍＭ ＤＴＴを１５分間処理したサンプルから、ＨｐＨＡＣ１遺伝子がスプライシングされて２つのバンドとして現れることを確認することができた（図１Ｂ）。アガロースゲルデータの隣の模式図はＨｐＨＡＣ１が非活性化型（ＨｐＨＡＣ１ｕ）からスプライシングによって活性化型（ＨｐＨＡＣ１ｉ）に変わることを示した。確保された遺伝子断片の塩基配列を分析することにより、ＨｐＨＡＣ１のスプライシング部位を確認することができた。この部位は図１Ａに下線で示した。注目すべき点は、スプライシングによってタンパク質のＣ末端部位のアミノ酸配列が変わって元々の配列とは異なる配列になることである。非活性化型にあった終止コドンも、スプライシングによって切り出され、後部の新しい終止コドンで代替される。
【００４４】
前記実験から得られた結果に基づき、スプライシングされたＨｐＨＡＣ１のアミノ酸配列とＳｃＨＡＣ１のアミノ酸配列間の相同性をＷｅｂで利用可能なソフトウェア（ＧＥＮＥＤＯＣ、http://www.psc.edu/biomed/genedoc）によって分析したところ、８％の同一性(identity)と１５％の類似性(similarity)を示して２種間に低い相同性があることが分かった。ところが、転写調節因子としての重要なＤＮＡ結合部位である塩基モチーフ(basic motif)およびロイシンジッパー(leucine zipper)部分間には６８％の同一性と７７％の類似性を示して非常に高い相同性があることが分かった（図２）。
【００４５】
【表１】
【００４６】
（実施例２）
ハンセヌラポリモルファにおけるＵＰＲ(unfold protein response)誘導条件の探索
ＵＰＲ反応が誘導されたかは、逆転写酵素重合反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてＨｐＨＡＣ１遺伝子のスプライシング有無（図３Ａ）および伝統的なＵＰＲターゲット遺伝子の発現量増加（図３Ｂ）によって確認した。ハンセヌラポリモルファＣＢＳ４７３２に由来したＡ１６菌株を用いてツニカマイシンなどのグリコシル化阻害剤処理、ＤＴＴ(Dithiothreitol)による還元ストレス誘発およびブレフェルジン(Blefeldin)Ａ処理によるタンパク質の小胞体移動妨害などの多様な分泌ストレスを誘発し、どれほどの濃度でＵＰＲ反応が起るかを探索した。
まず、酵母の培養のためには、グルコースを主炭素源として含んでいるＹＰＤ（酵母抽出物１％、バクトペプトン２％、グルコース２％）培地を主に使用した。３ｍＬのＹＰＤ培地に１７０ｒｐｍにて３７℃で１６時間種菌培養した後、５０ｍＬのＹＰＤ培地に６００ｎｍにおけるＯＤ（ＯＤ６００）が０．１となるように接種し、しかる後に、同一の条件で本培養してＯＤ６００が０．３〜０．４となる時点で細胞を回収した。これらの細胞をｐＨ５．４のＹＰＤ培地と多様な濃度のツニカマイシン、ＤＴＴおよびブレフェルジンＡを含むｐＨ５．４のＹＰＤ培地に均等に分注して同一条件で培養し、３０分、１時間、２時間となる時点でそれぞれのＯＤ６００値を測定し、細胞を回収した。そして、これらの細胞からのＲＮＡの抽出、精製および逆転写重合酵素連鎖反応は実施例１と同様の方法を用いて行った。ＨｐＨＡＣ１のスプライシング確認のためには、表１に記述されたプライマーＨｐＨＡＣ１−Ｓ−ｆｏｒとＨａＨＡＣ１−Ｓ−ｒｅｖを使用した。伝統的なＵＰＲターゲット遺伝子の発現量確認実験のためには、表２に記述されたプライマーを用いて重合酵素連鎖反応実験を行った。
【００４７】
様々な濃度別にツニカマイシン、ＤＴＴおよびブレフェルジンＡを処理した試料からＨｐＨＡＣ１のスプライシング有無を確認した結果、５μｇ／ｍＬのツニカマイシン、５ｍＭ ＤＴＴ、５μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡで適当な程度のＨｐＨＡＣ１スプライシングパターンを確認することができた。時間別条件探索では、分泌タンパク質のグリコシル化を阻害するツニカマイシンとタンパク質の小胞体流出を妨害するブレフェルジンＡを処理した試料と、タンパク質の二硫化結合を妨害して分泌ストレスを誘発するＤＴＴを処理した試料とが、互に異なる様相を示した。ツニカマイシンとブレフェルジンＡの場合にはスプライシングパターンが大きく増加するが、ＤＴＴの場合には全般的にスプライシングの度合いが少ないうえ、３０分で最も高いスプライシング様相を示し、時間経過に伴って減少する様相を観察することができた（図３Ａ）。
【００４８】
伝統酵母であるサッカロミセスセレビシエでＵＰＲによって発現量が増加すると知られているターゲット遺伝子ＳｃＫＡＲ２、ＳｃＰＤＩ１およびＳｃＥＲＯ１に対応するハンセヌラポリモルファの遺伝子（ＨｐＫＡＲ２、ＨｐＰＤＩ１、ＨｐＥＲＯ１）に対して半定量逆転写重合酵素連鎖反応実験を行った。そして、比較のための対照区として、ＨｐＡＣＴ１に対しても同一の条件で逆転写重合酵素連鎖反応実験を行った。実験結果、ＨｐＫＡＲ２、ＨｐＥＲＯ１およびＨｐＰＤＩ１はいずれも小胞体ストレス反応によって発現量が増加することを確認することができた。
【００４９】
（実施例３）
ＨｐＨＡＣ１遺伝子欠損および過発現菌株の製作と特性分析
ＨｐＨＡＣ１遺伝子が破砕されたハンセヌラポリモルファ変異株を製作するために、融合重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）と細胞内遺伝子組み換え(in vivo DNA recombination)技術を用いて遺伝子を破砕した(Oldenburg et al., Nucleic Acid Res., 25, 451, 1997)。
【００５０】
一次重合酵素連鎖反応では、表１に記述された４対のプライマーを用いてＬＥＵ２遺伝子（Ｎ末端；ＬｅｕＮ−ｆｏｒ、ＬｅｕＮ−ｒｅｖ、Ｃ末端：ＬｅｕＣ−ｆｏｒ、ＬｅｕＣ−ｒｅｖ）とＨｐＨＡＣ１遺伝子（Ｎ末端；ＨｐＨＡＣ１−Ｎ−ｆｏｒ、ＨｐＨＡＣ１−Ｎ−ｒｅｖ、Ｃ末端；ＨｐＨＡＣ１−Ｃ−ｆｏｒ、ＨｐＨＡＣ１−Ｃ−ｒｅｖ）それぞれのＮ末端とＣ末端を増幅した後、二次融合重合酵素連鎖反応で２対のプライマーを用いてＨｐＨＡＣ１遺伝子のＮ末端とＬＥＵ２遺伝子のＮ末端とを連結（ＨｐＨＡＣ１−Ｎ−ｆｏｒ、ＬｅｕＮ−ｒｅｖし、ＬＥＵ２遺伝子のＣ末端とＨｐＨＡＣ１遺伝子のＣ末端とを連結（ＬｅｕＣ−ｆｏｒ、ＨｐＨＡＣ１−Ｃ−ｒｅｖ）した。確保したそれぞれのＤＮＡ切片を酵母細胞内に導入した後、細胞内遺伝子組み換えによってＨｐＨＡＣ１遺伝子が破砕された形質転換体を選別した（図４）。まず、ＬＥＵ２選別標識によって、ロイシンが欠乏した最小培地で成長する形質転換体を選別した後、重合酵素連鎖反応によって、野性型菌株とは異なるように増幅されたＤＮＡ切片を確認し、ＨｐＨＡＣ１遺伝子が破砕されたハンセヌラポリモルファ変異株であるＨｐｈａｃ１Δ（ｈａｃ１：：ＬＥＵ２）菌株を製作した。
【００５１】
ハンセヌラポリモルファＨｐＨＡＣ１遺伝子が過発現された変異株を製作するために、前記実施例１で確保されたｃＤＮＡを鋳型とし、表１に記述されたプライマーＨｐＨＡＣ１ｓ＿ｆｏｒとＨｐＨＡＣ１ｓ＿ｒｅｖを用いて重合酵素連鎖反応によってＨｐＨＡＣ１遺伝子を増幅した。そして、前記ＨｐＨＡＣ１遺伝子、ＬＥＵ２選別標識遺伝子および多重複製遺伝子（ＨＡＲＳ）が含まれたｐＧＡＰベクターにそれぞれＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を処理した後、これらを接合(ligation)し、大腸菌に導入してクローニングした（図６）。クローニング確認は、重合酵素連鎖反応および塩基配列分析によって行った。スプライシングされたｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡが含まれた組み換えベクターｐＧＡＰ−ＨｐＨＡＣ１ｓを選別した。そして、このように確保された前記ベクターを酵母細胞内に導入し、ＬＥＵ２標識遺伝子を用いて、ロイシンが欠乏した最小培地で成長する形質転換体を選別した。この形質転換体のＤＮＡを抽出し、これを鋳型として重合酵素連鎖反応実験を行い、ＨｐＨＡＣ１遺伝子が導入されて過発現される形質転換体ＤＬ１−Ｈ１ｓ菌株を最終製作した。
【００５２】
（実施例４）
ハンセヌラポリモルファ野性型とＨｐＨＡＣ１欠損菌株の遺伝子発現様相の分析
前記実施例３で言及したように、ＨｐＨＡＣ１欠損菌株は、野性型より成長が遅くてその理由に対する端緒を探すために、代表的な機能遺伝体研究方法であるマイクロアレイ実験方法を使用した。野生型菌株としては、ハンセヌラポリモルファＤＬ１菌株にロイシン遺伝子が入ったＤＬ１Ｌ菌株を使用し、ＨｐＨＡＣ１欠損菌株（Ｈｐｈａｃ１Δ）としては、前記実施例３で製作された菌株を使用した。ブドウ糖を主炭素源として含んでいる複合培地であるＹＰＤで培養し、指数成長期時点で２つの菌株をそれぞれ回収し、それからＲＮＡ分離精製して全体転写体の量の差異をマイクロアレイによって比較分析した（図３）。
【００５３】
実験方法をより詳しく説明すると、次のとおりである：ハンセヌラポリモルファＤＬ１ＬとＨｐｈａｃ１Δ菌株を３ｍＬのＹＰＤ培地に３７℃、１７０ｒｐｍで１６時間種菌培養した。次いで、これを５０ｍＬのＹＰＤ培地にＯＤ６００が０．１となるように菌株を接種した後、同一の条件で本培養し、成長の差異が見える以前の指数成長期であるＯＤ６００が０．５となる時点で細胞を回収した。総ＲＮＡは、前記回収された細胞から実施例１の方法と同様に分離精製した。
【００５４】
マイクロアレイ実験のためのｃＤＮＡの製造、ハイブリダイゼーションおよび蛍光標識などに用いられた全ての試薬と実験は、Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ社の３ＤＮＡ（商標）サブマイクロＥＸエクスプレションアレイ検出キットおよび提供された案内書に基づいて行った。簡略に述べると、ｃＤＮＡ合成のためには総ＲＮＡ７０μｇを使用し、キットから提供されたＲＴプライマーを入れて８０℃で１０分間反応させた。氷で冷却の後、ＲＮＡ分解酵素阻害剤であるＳｕｐｅｒａｓｅ−Ｉｎ（商標）とＲＴバッファ、ｄＮＴＰ混合物と逆転写酵素混合物を添加して４２℃で２時間反応させ、０．５Ｍ ＮａＯＨ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ３．５μＬを添加して反応を中止させた。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを変性させるために６５℃で２０分間反応させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）によって反応を中和させた。こうして得られたｃＤＮＡ反応物をＱｉａｇｅｎ社のＰＣＲ精製キットを用いて精製濃縮し、ハイブリダイゼーションバッファ、ＬＮＡ ｄＴブロッカーを添加して８０℃で１０分、５０℃で２０分間反応させ、アレイスライドに滴下して４５℃、１８時間暗反応を行った。スライドを２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、２×ＳＳＣ、０．２×ＳＳＣおよび蒸留水で洗浄し、完全に乾燥させた。次いで、蛍光物質である３ＤＮＡキャプチャ試薬とハイブリダイゼーション緩衝液を混合して８０℃で１０分間、５０℃で２０分間反応させ、この反応物を前記スライドに滴下させて５０℃で６時間暗反応を行った。そして、上述した過程と同一の過程を経てスライドを洗浄し、最終マイクロアレイスライドを得た。
【００５５】
前記マイクロアレイスライドをスキャンアレイ５０００でスキャニングしてアレイイメージを確保した。前記イメージをＡｘｏｎ社のＧｅｎｅＰｉｘ４．０プログラムを用いて、スポット発見(spot finding)、定量(quantification)、バックグラウンド測定(background estimation)の３段階からなるイメージプロセシング過程を経て実験誤差を矯正した。そして、前記プログラムを用いて発現差異を分析した。指数成長期で野生型とＨｐｈａｃ１Δ菌株の転写体発現差異を分析した結果、まだ成長の差異が現れない時点なのに多様な遺伝子が発現量の差異を示した（図７Ｂ）。野生型に比べてＨｐｈａｃ１Δ菌株における発現が減少した遺伝子は、殆ど転写調節因子であるＨｐＨａｃ１タンパク質によって調節されるＵＰＲ関連遺伝子と予想され、伝統酵母であるＵＰＲのターゲット遺伝子として知られている遺伝子が多く含まれた（表２）。より詳しく考察すると、小胞体でタンパク質のフォールディングを助けるシャペロン遺伝子（ＫＡＲ２、ＥＲＯ１、ＳＣＪ１、ＬＨＳ１）、糖タンパク質のグリコシル化に関連した遺伝子（ＯＳＴ１、ＯＳＴ４、ＳＷＰ１、ＷＢＰ１、ＳＴＴ３、ＭＮＮ２、ＭＮＮ９、ＫＴＲ１、ＫＴＲ４、ＰＭＩ４０、ＰＭＴ２、ＰＭＴ５）とタンパク質分泌関連遺伝子（ＥＲＶ４１、ＶＩＰ３６、ＳＥＣ５３、ＹＳＹ６、ＥＭＰ７９）の発現がＨｐＨＡＣ１遺伝子の欠損の際に減少した。
【００５６】
【表２】
【００５７】
野生型に比べてＨｐｈａｃ１菌株における発現が増加した遺伝子を考察すると、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ６０、ＤＤＲ４８、ＳＩＴ１、ＳＴＩ１、ＳＩＳ１、ＨＳＣ８２などのストレス回復に関連したＨＳＰ(heat shock protein)系列、細胞内遺伝物質またはタンパク質損傷を誘導する活性酸素を除去する遺伝子（ＳＫＮ７、ＳＯＤ２、ＨＹＲ１）、タンパク質のフォールディングを助ける一群の遺伝子（ＭＴＬ１、ＭＤＪ１、ＤＮＡＪ、ＣＲＰ６）、フォールディングが不完全なタンパク質を分解する役割を担当する遺伝子（ＰＲＢ１、ＢＵＬ１、ＣＤＣ４８、ＨＵＬ５）および一般なストレス状況で細胞内構造体の保護役割を果たすトレハロース(trehalose)の合成に関連した遺伝子（ＴＰＳ１、ＴＰＳ３）の発現が増加する様相を示した（表３）。この結果は、分泌ストレスを緩和させるための遺伝子の発現を増加させるＨｐＨＡＣ１遺伝子の欠損の際に、一般な成長環境でも分泌ストレスを解消することができないため、ＨｐＨＡＣ１によって調節されない他のストレス緩和遺伝子の発現が増加するものと推論することができる。すなわち、ＨｐＨＡＣ１の欠損により一群の分泌ストレス緩和遺伝子がその機能を行わないため、相対的に別のストレス緩和遺伝子の発現が増加するものと解釈することができる。
【００５８】
【表３】
【００５９】
（実施例５）
ＨｐＨａｃ１タンパク質が調節するＵＰＲターゲット遺伝子の選別
ＨｐＨａｃ１タンパク質が調節するＵＰＲターゲット遺伝子を選別するために、２種のマイクロアレイ実験を行った。まず、野生型菌株を対象として指数成長期まで培養し、２つに分け、一方はツニカマイシンまたはＤＴＴを処理した後で培養し続け、もう一方は対照区として無処理で培養した。３０分、６０分および１２０分でそれぞれ細胞を回収し、実施例４と同様にしてマイクロアレイ実験を行った（図８Ａの左）。第２のマイクロアレイ実験では、野生型菌株とＨｐｈａｃ１Δ菌株をそれぞれ指数成長期まで培養した後、２つの細胞にツニカマイシンまたはＤＴＴを処理してそれぞれ３０分、６０分および１２０分で細胞を回収した後、マイクロアレイ実験を行った（図８Ａの右）。
【００６０】
第１のマイクロアレイ実験では、ツニカマイシンまたはＤＴＴ処理の際に発現が増加する全ての遺伝子を選別し、分泌または類似ストレスに反応する遺伝子群を取ることができた。第２のマイクロアレイ実験は、分泌ストレス条件の下で野生型とＨｐｈａｃ１Δ菌株の遺伝子発現様相の差異を比較分析することにより、ＨｐＨＡＣ１が直接調節するＵＰＲターゲット遺伝子を選別するためのものである。よって、第１のマイクロアレイ実験で選別された全体遺伝子群の中から、第２のマイクロアレイ実験でＨｐＨａｃ１タンパク質依存的に発現が増加する遺伝子群のみを選別し、Ｈｐｈａｃ１破砕により発生しうる間接効果を除去した。また、前記２つの実験において、タンパク質の二硫化結合を妨害するＤＴＴ処理とタンパク質のグリコシル化を阻害するツニカマイシン処理という２種の分泌ストレスをそれぞれ与え、２種の分泌ストレスの下ではいずれも発現量が増加する遺伝子のみを選別することにより、それぞれの処理によって発生しうる副反応を除去した。
【００６１】
前述したように激しい基準を適用し、ＨｐＨａｃ１タンパク質によって調節されるＵＰＲターゲット遺伝子を選別して表４に示した。このように選別された遺伝子には、特定機能の遺伝子群が主に含まれた。特に、小胞体でタンパク質の正常的なフォールディングを助けるシャペロンおよび二硫化結合形成遺伝子（ＫＡＲ２、ＥＲＯ１、ＳＣＪ１、ＬＨＳ１、ＰＤＩ１）と糖タンパク質のグリコシル化に関連した遺伝子（ＡＬＧ５、ＯＰＵ２４、ＯＳＴ１、ＯＳＴ２、ＯＳＴ４、ＳＷＰ１、ＷＢＰ１、ＫＴＲ１、ＯＣＲ５、ＧＰＩ１７、ＭＮＮ４、ＭＮＮ１０、ＫＴＲ４）が多く含まれた（図８Ｂ）。また、小胞体からコルギ体への分泌タンパク質輸送に関連した遺伝子（ＳＥＣ６６、ＳＥＣ６１、ＳＥＣ３１、ＳＥＣ４、ＴＰＭ１、ＶＰＳ２９）とコルジ体から小胞体への小胞逆輸送に関連した遺伝子（ＳＥＣ２１、ＳＥＣ２６、ＲＥＴ２）の発現も著しかった。
【００６２】
【表４】
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明では、ハンセヌラポリモルファ分泌ストレス解消反応の核心調節因子であるＨｐＨＡＣ１遺伝子を同定し、実際ＨｐＨＡＣ１タンパク質をコードしうるＨＡＣ１特異的スプライシングされたｍＲＮＡも同定し、その塩基配列も解明した。また、本発明では、マイクロアレイ実験によってＨｐＨａｃ１タンパク質が直接発現を調節する分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子も解明した。
本発明によれば、ＨｐＨａｃ１タンパク質の常時発現または過発現によってハンセヌラポリモルファの分泌発現能力および成長能力を向上させることが可能な方法を提供することができる。
【００６４】
また、本発明によれば、分泌発現能力と成長能力が向上したハンセヌラポリモルファ生産宿主を開発することができる。このように開発されたハンセヌラポリモルファ分泌発現システムを用いて、産業用または医薬用として有用な分泌タンパク質を大量生産することにより、低廉な費用で大量のタンパク質を生産することが可能な経済性を獲得することができる。よって、本発明は、産業用および医薬用組み換えタンパク質の生産に適用するとき、患者の経済的負担を省くことにより、人類の保健福祉向上にも寄与することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子の発現を増加させる活性を示すタンパク質。
【請求項２】
請求項１のタンパク質をコードする核酸またはその切片。
【請求項３】
配列番号１または２に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載の核酸またはその切片。
【請求項４】
請求項２の核酸またはその切片を含む組み換えベクター。
【請求項５】
配列番号２に示されるＤＮＡ遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項６】
寄託番号第ＫＣＴＣ１０９６０ＢＰ号で寄託された組み換えベクター。
【請求項７】
請求項４の組み換えベクターで形質転換されたハンセヌラポリモルファ変異株。
【請求項８】
ハンセヌラポリモルファ由来の転写因子遺伝子ＨｐＨＡＣ１を破砕または変異させることにより、小胞体ストレス反応が減少したハンセヌラポリモルファ変異株。
【請求項９】
分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子の発現を増加させる転写因子遺伝子ＨｐＨＡＣ１（寄託番号ＤＱ６７９９１５）。
【請求項１０】
請求項７または８の変異株を用いる段階を含む、組み換えタンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法によって製造されて得られた組み換えタンパク質。
【請求項１】
配列番号３に示されるアミノ酸配列またはこれと９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子の発現を増加させる活性を示すタンパク質。
【請求項２】
請求項１のタンパク質をコードする核酸またはその切片。
【請求項３】
配列番号１または２に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載の核酸またはその切片。
【請求項４】
請求項２の核酸またはその切片を含む組み換えベクター。
【請求項５】
配列番号２に示されるＤＮＡ遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項６】
寄託番号第ＫＣＴＣ１０９６０ＢＰ号で寄託された組み換えベクター。
【請求項７】
請求項４の組み換えベクターで形質転換されたハンセヌラポリモルファ変異株。
【請求項８】
ハンセヌラポリモルファ由来の転写因子遺伝子ＨｐＨＡＣ１を破砕または変異させることにより、小胞体ストレス反応が減少したハンセヌラポリモルファ変異株。
【請求項９】
分泌ストレス解消反応に参与する遺伝子の発現を増加させる転写因子遺伝子ＨｐＨＡＣ１（寄託番号ＤＱ６７９９１５）。
【請求項１０】
請求項７または８の変異株を用いる段階を含む、組み換えタンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項１０の方法によって製造されて得られた組み換えタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【公表番号】特表２００９−５３９４０１（Ｐ２００９−５３９４０１Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１５３０６（Ｐ２００９−５１５３０６）
【出願日】平成１９年６月１３日（２００７．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００２８５３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４５４６７
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０５０９３３６７）コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１３日（２００７．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００２８５３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４５４６７
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５０５０９３３６７）コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
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