幹細胞動員に有用な医薬の組み合わせ
Ｇ−ＣＳＦ及びＰｌＧＦを活性物質として含有する組み合わせ医薬製剤は、それを必要とする患者又は被験者における血液幹細胞の動員に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それを必要とする患者又は被験者における血液幹細胞の動員に使用するための生物活性分子の組み合わせに関するものである。より詳細には、本発明は、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）の動員を刺激する際に特に有効な、Ｇ−ＣＳＦとＰｌＧＦとの組み合わせを提供するものであり、それにより、腫瘍患者における臓器移植又は細胞移植及び化学放射線療法プロトコールの実現可能性及び有効性を高める。
【背景技術】
【０００２】
自家ＰＢＰＣは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）３、再発性ホジキンリンパ腫（ＨＬ）４、及び多発性骨髄腫（ＭＭ）５に罹患する患者において高用量化学放射線療法及び自家幹細胞移植（ＳＣＴ）の適用、実現可能性及び有効性を有意に増加させる１，２。
【０００３】
同種ＰＢＰＣは、ＨＬＡ適合ＳＣＴのための好ましい幹細胞源であり、そしてＨＬＡ不適合同種移植のための唯一の細胞源である６，７，８，９，１０，１１。これは、ＨＬＡが適合する血縁又は非血縁ドナーのいない患者、即ち、同種移植を受けるかもしれない患者の世界人口のおよそ４０％に相当する、危険度の高い白血病患者にとって潜在的な治癒的療法である。
【０００４】
がん患者において自家ＰＢＰＣ動員に用いられるプロトコールには、骨髄成長因子の単独使用、又は細胞毒性を有する化学療法からの回復期での使用が含まれ、後者のアプローチは最適なＰＢＰＣ動員を可能にする１２，１３，１４。健常ドナーからの同種ＰＢＰＣ動員は、通常、１０〜２０μｇ／ｋｇ／日の用量の組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）による短期治療によって達成される１５，１６，１７，１８。
【０００５】
５×１０６以上のＣＤ３４＋細胞／ｋｇの自家移植を受けたがん患者は迅速で永続的な造血移植を体験するが、２×１０６以下のＣＤ３４＋細胞／ｋｇの自家移植を受けた患者には遅発性移植、移植の不成功又は２次性骨髄異形成の危険性がある１９。したがって、自家ＳＣＴでは、適当量のＣＤ３４＋細胞の入手可能性が必須の前提条件である。事前の非常に強力な化学放射線療法又は疾患関連因子のために、相当数の化学療法を受けたことがないがん患者（１０〜２０％）又は再発性／不応性がん患者（３０〜４０％）が、適量のＣＤ３４＋細胞の動員に失敗する２０，２１，２２。
【０００６】
適当量の同種ＣＤ３４＋細胞を回収することは、ＨＬＡ同一移植のレシピエントでは重大な問題ではない；しかしながら、５〜１５％の正常ドナーは幹細胞動員が弱く、ｒｈＧ−ＣＳＦ用量の増加と複数回のアフェレーシス処置を必要とする２３，２４，２５。ＨＬＡ不適合同種移植のレシピエントは、移植の不成功と重篤なＧｖＨＤを避けるため、Ｔリンパ球を除去した「メガ」用量のＣＤ３４＋細胞の再注入を必要とする２６。標準動員法（即ち、ｒｈＧ−ＣＳＦによる７日間の治療）では、ＨＬＡ不適合ＳＣＴのドナーは平均４回の白血球搬出法を受けて標的細胞用量のＣＤ３４＋細胞（１２×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ体重）を回収するが、相当数のドナー（２０〜２５％）は標的ＣＤ３４＋細胞用量の提供に失敗する。
【０００７】
年齢、性別、サイトカイン処置スケジュール、及び事前の化学放射線療法が幹細胞動員に影響し得るにもかかわらず２７，２８，２９、特定の特徴は何もサイトカイン動員の予測因子として明確に同定されていない。したがって、がん患者又は正常ドナーに適用可能であり、且つ毒性を与えることなく循環前駆細胞の収率を増加可能な手順は、自家ＳＣＴ及び同種ＳＣＴの実行可能性、毒性及び費用に重大な影響を有することが予想される。
【０００８】
ＰＢＰＣ動員の増加は、造血幹細胞の輸送を制御するメカニズム、即ち、回帰時の管腔内皮から血管外の骨髄内空間への遊出及び動員時のその逆に干渉可能な分子を使用することによって達成されるであろう３０，３１，３２，３３。ＰＢＰＣ動員を高めるための更なるアプローチの１つは、組換えヒト（ｒｈ）顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）＋ｒｈＧ−ＣＳＦ３４、インターロイキン−３（ｒｈＩＬ−３）＋ｒｈＧ−ＣＳＦ又はｒｈＧＭ−ＣＳＦ３５、及びＰＩＸＹ−３２１３６のようなサイトカインの組み合わせの使用に依拠する。最後に、ＰＢＰＣ動員の促進は、標準動員法に、骨髄前駆細胞を増量可能な幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）３７，３８、ｆｌｔ−３３９リガンドなどの即効性サイトカインを組み込むことにより達成され、それにより、ｒｈＧ−ＣＳＦによるその後の動員に影響を受けやすい細胞の数が増加するであろう。
【０００９】
これまで、ｒｈＧ−ＣＳＦの代替物も付加物も、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独で達成される血液前駆細胞の実質的な動員の改善に失敗しており、あるいは毒性の実質的増加のほうが勝った限定的な改善をもたらしている。
【００１０】
胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーであり、ＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦＲ１）を介したシグナル伝達による血管形成増幅因子として機能する。最近、ヒト（ｈ）ＰｌＧＦを発現するアデノウイルスベクターの投与が、骨髄抑制後の骨髄再生の促進及び造血前駆細胞の動員を含めた複雑な造血作用を発揮することが示された。しかしながら、
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組換えアデノウイルスベクター注入後の成長因子投与は、精製した因子の直接注入とは大きく異なる点をいくつか示しており、臨床設定で用いられる様式にしたがって投与した場合、その作用は予測できないであろう。
【非特許文献１】Ｇｉａｎｎｉ ＡＭ．高用量化学療法及び自家移植：指針の好機。Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９７；８：９３３−５
【非特許文献２】Ｄｅｍｉｒｅｒ Ｔ、Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ ＷＩ、Ｂｕｃｋｎｅｒ ＣＤ．高用量化学療法のための末梢血幹細胞動員。Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．１９９９；８：１０３−１３
【非特許文献３】Ｇｉａｎｎｉ ＡＭ、Ｂｒｅｇｎｉ Ｍ、Ｓｉｅｎａ Ｓら、侵襲性Ｂ細胞リンパ種におけるＭＡＣＯＰ−Ｂとの比較による高用量化学療法及び自家骨髄移植。Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９７；３３６：１２９０−７
【非特許文献４】Ｆｅｒｍｅ Ｃ、Ｍｏｕｎｉｅｒ Ｎ、Ｄｉｖｉｎｅ Ｍら、初期化学療法後の再発又は不成功の状態にある進行性ホジキン病患者に対する高用量化学療法を伴う集中的サルベージ療法：Ｇｒｏｕｐｅ ｄ’Ｅｔｕｄｅｓ ｄｅｓ Ｌｙｍｐｈｏｍｅｓ ｄｅ ｌ’Ａｄｕｌｔｅ Ｈ８９治験の結果。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００２；２０：４６７−７５
【非特許文献５】Ｂａｒｌｏｇｉｅ Ｂ、多発性骨髄腫治療のための高用量療法及び革新的アプローチ。Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００１；３８（２ Ｓｕｐｐｌ ３）：２１−７
【非特許文献６】Ｋｏｒｂｌｉｎｇ Ｍ、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ Ｄ、Ｈｕｈ ＹＯら、不応性白血病及びリンパ腫に対する同種血液幹細胞移植：骨髄同種移植に対する血液の潜在的利点。Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８５：１６５９−１６６５
【非特許文献７】Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｎ、Ｂａｃｉｇａｌｕｐｏ Ａ、Ｈａｓｅｎｃｌｅｖｅｒ Ｄら、初期白血病患者における同種骨髄移植対フィルグラスチムで動員した末梢血前駆細胞の移植：血液及び骨髄移植に対するヨーロッパ群の無作為多施設治験の最初の結果。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９８；２１：９９５−１００３
【非特許文献８】Ａｐｐｅｌｂａｕｍ ＦＲ、同種移植のための幹細胞源の選択：もはや末梢的問題ではない。Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９４：３８１−３８３
【非特許文献９】Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ ＷＩ、Ｍａｒｔｉｎ ＰＪ、Ｓｔｏｒｅｒ Ｂら、血液のがん患者における、ＨＬＡ同一血縁者からの末梢血細胞と比較した骨髄移植。Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００１；３４４：１７５−１８１
【非特許文献１０】Ａｎｄｅｒｌｉｎｉ Ｐ、Ｋｏｒｂｌｉｎｇ Ｍ、Ｄａｌｅ Ｄら、同種血液幹細胞移植：ドナーへの考慮。Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０：９０３−９０８
【非特許文献１１】Ａｖｅｒｓａ Ｆ、Ｔａｂｉｌｉｏ Ａ、Ｔｅｒｅｎｚｉ Ａら、白血病患者における組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子で動員した末梢血前駆細胞を接種骨髄へ添加することによるＴ細胞を除去した半合致「３遺伝子座」不適合移植の生着の成功。Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８４：３９４８−３９５５
【非特許文献１２】Ｈａａｓ Ｒ、Ｍｏｈｌｅ Ｒ、Ｆｒｕｈａｕｆ Ｓら、悪性リンパ腫において末梢血前駆細胞の動員及び自家移植に成功した患者の特徴。Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８３：３７８７−９４
【非特許文献１３】Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ ＷＩ、Ｌｏｎｇｉｎ Ｋ、Ａｐｐｅｌｂａｕｍ Ｆら、組換え顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）後に回収した末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）：移植後の生着速度に相関した因子の解析。Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９４；８７：８２５−３１
【非特許文献１４】Ｗａｔｔｓ ＭＪ、Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＡＭ、Ｊａｍｉｅｓｏｎ Ｅら、低用量シクロホスファミド及び顆粒球コロニー刺激因子の後の前駆細胞動員：１０１人の前処置された悪性リンパ腫患者におけるこれらのパラメータを予測する前駆細胞の量と質及び因子の解析。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９７；１５：５３５−４６
【非特許文献１５】Ｍａｔｓｕｎａｇａ Ｔ、Ｓａｋａｍａｋｉ Ｓ、Ｋｏｈｇｏ Ｙ、Ｏｈｉ Ｓ、Ｈｉｒａｙａｍａ Ｙ、Ｎｉｉｔｓｕ Ｙ、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子は十分な量の末梢血幹細胞を同種移植のための健常ボランティアにおいて動員することができる。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９３；１１：１０３−１０８
【非特許文献１６】Ｋｒｏｇｅｒ Ｎ、Ｒｅｎｇｅｓ Ｈ、Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ Ｓら、１６μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦ対１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦによる健常ドナーにおける同種移植のための幹細胞動員。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００２；２９：７２７−７３０
【非特許文献１７】Ｂａｓａｒａ Ｎ、Ｓｃｈｍｅｔｚｅｒ Ｂ、Ｂｌａｕ ＩＷら、ボランティアドナーにおいてレノグラスチムで動員した末梢血前駆細胞：非盲検無作為分割用量漸増試験。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０００；２５：３７１−３７６
【非特許文献１８】Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｍ、Ｂｅｒｔｚ Ｈ、Ａｆｔｉｎｇ Ｍ、Ｗａｌｌｅｒ ＣＦ、Ｆｉｎｋｅ Ｊ、同種ドナーからの末梢血前駆細胞の動員及びＣＤ３４＋免疫選択のための高用量対標準用量フィルグラスチム（ｒｈＧ−ＣＳＦ）。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９９；１７：２１６０−２１７２
【非特許文献１９】Ｓｉｅｎａ Ｓ、Ｓｃｈｉａｖｏ Ｒ、Ｐｅｄｒａｚｚｏｌｉ Ｐ、Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ Ｃ、がん治療のための血液細胞移植におけるＣＤ３４＋細胞量の治療的関連性。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０００；１８：１３６０−７７
【非特許文献２０】Ｄｒｅｇｅｒ Ｐ、Ｋｌｏｓｓ Ｍ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｂら、自家前駆細胞移植：幹細胞毒性薬物への事前の曝露が、骨髄移植ではなく、末梢血前駆細胞の収率及び生着を決定する。Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６：３９７０−８
【非特許文献２１】Ｗｅａｖｅｒ ＣＨ、Ｈａｚｅｌｔｏｎ Ｂ、Ｂｉｒｃｈ Ｒら、骨髄機能廃絶化学療法投与後の６９２人の患者における末梢血前駆細胞回収物のＣＤ３４含量の関数としての生着動態の解析。Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６：３９６１−９
【非特許文献２２】Ｔａｒｅｌｌａ Ｃ、Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ Ｍ、Ｃａｒａｃｃｉｏｌｏ Ｄ、自家末梢血前駆細胞による支援を伴う高用量ａｒａ−Ｃは顕著な前駆細胞動員を誘発する：低動員の危険性のある患者の兆候。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００２；３０：７２５−３２
【非特許文献２３】Ａｎｄｅｒｌｉｎｉ Ｐ、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ Ｄ、Ｓｅｏｎｇ Ｄら、正常ドナーからの顆粒球コロニー刺激因子（フィルグラスチム）動員及び血液幹細胞アフェレーシスの臨床毒性及び実験室内効果、並びに処置負担の解析。Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．１９９６；３６：５９０−５９５
【非特許文献２４】Ａｎｄｅｒｌｉｎｉ Ｐ、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ Ｄ、Ｈｕｈ Ｙら、同種移植のための正常ドナーにおけるＣＤ３４＋前駆細胞及びリンパ球サブセットのフィルグラスチム動員期間及びアフェレーシス収率。Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９６；９３：９４０−９４２
【非特許文献２５】Ｇｒｉｇｇ ＡＰ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＡＷ、Ｒａｕｎｏｗ Ｈら、健常ボランティアの末梢血前駆細胞を動員し、回収するためのフィルグラスチム（顆粒球コロニー刺激因子）の最適用量及びスケジューリング。Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６：４４３７−４４４５
【非特許文献２６】Ａｖｅｒｓａ Ｆ、Ｔａｂｉｌｉｏ Ａ、Ｖｅｌａｒｄｉ Ａら、１つの完全に不適合なＨＬＡハプロタイプを有する血縁ドナー由来の、Ｔ細胞を除去した幹細胞を用いた危険性の高い急性白血病の治療。Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９８；３３９：１１８６−１１９３
【非特許文献２７】Ｍｉｆｌｉｎ Ｇ、Ｃｈａｒｌｅｙ Ｃ、Ｓｔａｉｎｅｒ Ｃ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｓ、Ｈｕｎｔｅｒ Ａ、Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｎ、同種移植のための正常ドナーにおける幹細胞動員：安全性及び有効性に影響する因子の解析、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９６；９５：３４５−３４８
【非特許文献２８】Ａｎｄｅｒｌｉｎｉ Ｐ、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ Ｄ、Ｓｅｏｎｇ Ｃら、フィルグラスチムで処置した正常ドナーにおいてＣＤ３４＋細胞の動員に影響する因子。Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．１９９７；３７：５０７−５１２
【非特許文献２９】ｄｅ ｌａ Ｒｕｂｉａ Ｊ、Ａｒｂｏｎａ Ｃ、ｄｅ Ａｒｒｉｂａ Ｆら、正常ドナーにおける末梢血前駆細胞の低回収に関連する因子の解析。Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２００２；４２：４−９
【非特許文献３０】Ｃｒａｄｄｏｃｋ ＣＦ、Ｎａｋａｍｏｔｏ Ｂ、Ａｎｄｒｅｗｓ ＲＧ、Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ ＧＶ、Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ Ｔ、ＶＬＡ４インテグリンに対する抗体は、霊長類及びマウスにおいて長期増殖細胞を動員し、サイトカイン誘導性動員を増大させる。Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０：４７７９−８８
【非特許文献３１】Ｋｉｎｇ ＡＧ、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｄ、Ｄｉｌｌｏｎ ＳＢら、アカゲザルにおけるヒトＣＸＣケモカインＧＲＯβの特定の短鎖型であるＳＢ−２５１３５３の単回注射により生着特性の増したマウス造血幹細胞の急速動員及び造血前駆細胞動員の評価。Ｂｌｏｏｄ．２００１；９７：１５３４−４２
【非特許文献３２】Ｐｒｕｉｊｔ ＪＦ、ｖａｎ Ｋｏｏｙｋ Ｙ、Ｆｉｇｄｏｒ ＣＧ、Ｌｉｎｄｌｅｙ ＩＪ、Ｗｉｌｌｅｍｚｅ Ｒ、Ｆｉｂｂｅ ＷＥ、抗ＬＦＡ−１ブロッキング抗体は、インターロイキン−８で誘導される造血前駆細胞の動員を妨げる。Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：４０９９−１０５
【非特許文献３３】Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ Ｃ、Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ Ｍ、Ｍａｇｎｉ Ｍら、マウスにおいてデフィブロタイドを顆粒球コロニー刺激因子と組み合わせると、初期のコミットした末梢血前駆細胞の動員を顕著に促進する。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２；６２：６１５２−７
【非特許文献３４】Ｋｏｃ ＯＮ、Ｇｅｒｓｏｎ ＳＬ、Ｃｏｏｐｅｒ ＢＷら、前駆細胞動員の無作為交差治験：高用量シクロホスファミド＋顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）対顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子＋Ｇ−ＣＳＦ。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０００；１８：１８２４−３０
【非特許文献３５】Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ＣＳ、Ｂｏｌｗｅｌｌ Ｂ、ＬｅＦｅｖｅｒ Ａら、末梢血幹細胞を動員するための４種のサイトカイン処方計画の比較：ＩＬ−３単独及びＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦとの組み合わせ。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９６；１７：１７９−８３
【非特許文献３６】Ｂｉｓｈｏｐ ＭＲ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＪＤ、Ｏ’Ｋａｎｅ−Ｍｕｒｐｈｙ Ｂら、末梢血細胞を動員するための組換え融合タンパク質ＰＩＸＹ３２１の第１相試験。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９６；１４：２５２１−６
【非特許文献３７】Ｓｈｐａｌｌ ＥＪ、Ｗｈｅｅｌｅｒ ＣＡ、Ｔｕｒｎｅｒ ＳＡら、危険性の高い乳癌患者における幹細胞因子及びフィルグラスチムによる末梢血前駆細胞動員の無作為第３相試験。Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９３：２４９１−５０１
【非特許文献３８】Ｆａｃｏｎ Ｔ、Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ ＪＬ、Ｍａｌｏｉｓｅｌ Ｆら、多発性骨髄腫患者において化学療法後に幹細胞因子をフィルグラスチムと組み合わせると、末梢血前駆細胞の収率が向上し、アフェレーシス要求性が減少する：無作為対照臨床試験。Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９４：１２１８−２５
【非特許文献３９】Ｂｒａｓｅｌ Ｋ、ＭｃＫｅｎｎａ ＨＪ、Ｃｈａｒｒｉｅｒ Ｋ、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ＰＪ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＤＥ、Ｌｙｍａｎ ＳＤ、Ｆｌｔ３リガンドは顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子又は顆粒球コロニー刺激因子と相乗作用して造血前駆細胞をマウスの末梢血に動員する。Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０：３７８１−８
【非特許文献４０】Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ、Ｈｅｉｓｓｉｇ Ｂ、Ｗｕ Ｙら、胎盤成長因子は、骨髄微小環境からＶＥＧＦＲ１＋幹細胞を動員することによって造血を再構築する。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２００２；８：８４１−９
【非特許文献４１】ＭａｃＶｉｔｔｉｅ ＴＪ、Ｆａｒｅｓｅ ＡＭ、Ｄａｖｉｓ ＴＡ、Ｌｉｎｄ ＬＢ、ＭｃＫｅａｒｎ ＪＰ、ヒトインターロイキン３及び顆粒球コロニー刺激因子の受容体のキメラアゴニストであるミエロポエチンは、ＣＤ３４＋細胞を動員し、致死的なＸ線を照射した非ヒト霊長類に急速に生着する。Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９９；２７：１５５７−６８
【非特許文献４２】Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ Ｃ、Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ Ｍ、Ｌｏｎｇｏｎｉ Ｐ、Ｍｉｌａｎｉ Ｒ、Ｍｉｌａｎｅｓｉ Ｍ、Ｇｕｉｄｅｔｔｉ Ａ、Ｈａａｎｓｔｒａ Ｋ、Ｊｏｎｋｅｒ Ｍ、Ｃｌｅｒｉｓ Ｌ、Ｍａｇｎｉ Ｍ、Ｆｏｒｍｅｌｌｉ Ｆ、Ｇｉａｎｎｉ ＡＭ、デフィブロタイド及び組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子で処置した非ヒト霊長類における初期のコミットした造血前駆細胞の動員。Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４；３２：６８−７５
【非特許文献４３】Ｃｒａｄｄｏｃｋ ＣＦ、Ｎａｋａｍｏｔｏ Ｂ、Ａｎｄｒｅｗｓ ＲＧ、Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ ＧＶ、Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ Ｔ、ＶＬＡ−４インテグリンに対する抗体は、霊長類及びマウスにおいて長期増殖細胞を動員し、サイトカイン誘導性動員を増大させる。Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０：４７７９−８８
【非特許文献４４】Ｌｅｍｉｅｕｘ ＭＥ、Ｒｅｂｅｌ ＶＩ、Ｌａｎｓｄｏｒｐ ＰＭ、Ｅａｖｅｓ ＣＪ、長期骨髄「スイッチ」培養においてリンパ性骨髄分化の可能な成熟マウス骨髄における初期造血細胞タイプの特徴付け及び精製。Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６：１３３９−１３４７
【非特許文献４５】Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＨＪ、Ｅａｖｅｓ ＣＪ、Ｌａｎｓｄｏｒｐ ＰＭ、Ｔａｃｋｅｒ ＪＤ、Ｈｏｇｇｅ ＤＥ、遺伝子操作されたマウス間質細胞上に維持された長期培養における初期ヒト造血細胞の分化調節。Ｂｌｏｏｄ．１９９１；７８：６６６−７２
【非特許文献４６】Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ Ｃ、Ｒｅｇａｚｚｉ Ｅ、Ｓａｍｍａｒｅｌｌｉ Ｇら、チロシンキナーゼインヒビターＡＧ９５７及び抗Ｆａｓ受容体抗体のＣＤ３４＋慢性骨髄性白血病前駆細胞に対する効果。Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９３：３９７３−８２
【非特許文献４７】Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＨＪ、Ｅａｖｅｓ ＣＪ、Ｅａｖｅｓ ＡＣ、Ｄｒａｇｏｗｓｋａ ＡＣ、Ｌａｎｓｄｏｒｐ ＰＭ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで長期造血を開始可能なヒト骨髄細胞の特徴及び部分精製。Ｂｌｏｏｄ．１９８９；７４：１５６３−７０
【発明の詳細な説明】
【００１１】
発明の説明
幹細胞動員を改善可能な手順の相対的な臨床効果により、臨床症状で起こるようなＰＢＰＣ動員を刺激可能な動物モデルにおいてＰｌＧＦの動員活性を試験した。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに、対照ビヒクル（ＰＢＳ／ＭＳＡ）、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独（１０μｇ／日）、又はｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／日）と組換えマウス（ｒｍ）ＰｌＧＦ（２．５〜５μｇ／日）若しくは組換えヒト（ｒｈ）ＰｌＧＦ（５〜１０μｇ／日）との組み合わせを、５日間腹腔内（ＩＰ）注射した。サイトカインの最後の注射から２時間後に血液サンプルを回収し、以下のパラメータについて評価した：白血球（ＷＢＣ）数、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の頻度及び絶対数、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）の絶対数。
【００１２】
ｒｍＰｌＧＦの効果を以下の表１〜４に表す。ｒｍＰｌＧＦ単独注入ではＷＢＣ、ＣＦＣ、及びＬＴＣ−ＩＣの動員に効果がないことは明らかである。ｒｍＰｌＧＦ（５μｇ／日）をｒｈＧ−ＣＳＦと組み合わせて５日間注射すると、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較してＣＦＣ及びＬＴＣ−ＩＣの動員を有意に増加させる。
【００１３】
表５〜８にｒｈＰｌＧＦの動員効果をまとめる。同様に、ｒｈＰｌＧＦを単独で注入した場合、循環ＷＢＣ又は造血前駆細胞に効果がない。逆に、ｒｈＰｌＧＦとｒｈＧ−ＣＳＦとの組み合わせ注入は、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較して、ＣＦＣ及びＬＴＣ−ＩＣの動員を有意に増加させる。
【００１４】
ｒｈＰｌＧＦ（１０μｇ／日）とｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／日）による１２日間処置の動員効果についても試験した。１２日間処置を受けたマウスについて、療法の５日、８日、１０日、及び１２日目に分析した。ｒｈＰｌＧＦ／ｒｈＧ−ＣＳＦの組み合わせ処置は、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較して、試験中に分析した各時点において血中ＣＦＣの頻度及び絶対数を有意に増加させた（表９〜１１）。
【００１５】
更に、ＰｌＧＦ／Ｇ−ＣＳＦの組み合わせの動員活性を非ヒト霊長類モデル（アカゲザル）で試験した。マウスで得られた結果がこの動物モデルで更に確認された。特に、ＰｌＧＦ／Ｇ−ＣＳＦの組み合わせは、動態、頻度及び絶対数に関し、ＷＢＣ、ＣＦＣ、ＨＰＰ−ＣＦＣ及びＬＴＣ−ＩＣの動員を改善した。
【００１６】
上記研究は、ヒト患者への造血成長因子の投与に酷似した手順及び条件を用いて実施した。この結果は、末梢血前駆細胞の動員におけるｈＧ−ＣＳＦとｒｈＰｌＧＦとによる相乗作用の存在を明確に立証するものである。
【００１７】
したがって、本発明の目的は、それを必要とする患者又は被験者において血液幹細胞の動員を刺激するのに有用なＧ−ＣＳＦとＰｌＧＦとの組み合わせ製剤である。本明細書において、「患者」及び「被験者」という用語は、好ましくはヒトの個人を意味するが、動物、特に哺乳動物を意味してもよい。血液幹細胞の動員から恩恵を受ける状態、病状又は疾患の例としては、限定されるものではないが、ＮＨＬ、再発性ＨＬ４、ＭＭ５に罹患する患者における臓器移植又は細胞移植及び腫瘍化学−放射線療法、特に自家１，２又は同種のＳＣＴ、あるいは骨髄抑制化学療法後の回復期にある患者が挙げられる。
【００１８】
組み合わせ製剤の活性成分は、医薬的に許容可能なビヒクル及び賦形剤を有する製剤で同時に投与することも別個に投与することもできる。非経口経路の投与が好ましい。非経口投与に好適な医薬組成物の製造方法は当該技術分野において公知である；詳細は『レミントン：薬学の科学と実践』、Ｍａｃｋ出版社、中に見出すことができる。本発明の組み合わせ製剤中の活性成分量は、例えば投与経路、求められる効果又は治療すべき状態、及び患者の応答性に応じて変えることができる。原則として、有効量のＧ−ＣＳＦ及びＰｌＧＦは、血液幹細胞動員に関して所望の応答性を作り出すことが可能である。患者／被験者の応答性は、処置期間中、例えば循環血液幹細胞を計数することによってモニターでき、したがって、必要であれば容量を変更することができる。本発明の好ましい態様では、１〜１５０μｇ／ｋｇ、好ましくは５〜２０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦ及び１０〜３００μｇ／ｋｇ、好ましくは２０〜１５０μｇ／ｋｇのＰｌＧＦで構成される日用量の活性成分を供給する注射液の形態で組換えｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＰｌＧＦが用いられる。
【００１９】
以下の実施例によって本発明を更に説明する。
【実施例】
【００２０】
実施例１〜１１
マウスモデルにおけるＰｌＧＦ／Ｇ−ＣＳＦの組み合わせの動員効果
材料及び方法
動物
体重２０〜２５ｇの６〜８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（ミラノ、イタリア、ＥＵ）から購入した。動物に対して行った実験手順は、英国癌研究調整委員会（英国癌研究調整委員会。腫瘍実験における動物の福祉に関するＵＫＣＣＣＲ指針。Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．、５８：１０９−１１３、１９９８）の指針にしたがって実施した。対照ビヒクル（ＰＢＳ／ＭＳＡ）、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独（１０μｇ／日）、又はｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／日）と組換えマウス（ｒｍ）ＰｌＧＦ（２．５〜５μｇ／日）若しくは組換えヒト（ｒｈ）ＰｌＧＦ（５〜１０μｇ／日）との組み合わせを、マウスに５日間毎日腹腔内（ＩＰ）注射した。それぞれの実験は少なくとも３回の別々の機会に行い、時点あたり１群３〜４匹のマウスを用いた。
【００２１】
サイトカイン
組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ、ニューポゲン（登録商標））はロシュ（ミラノ、イタリア、ＥＵ）から購入した；ｒｍＰｌＧＦはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（アビンドン、英国）から購入した；ｒｈＰｌＧＦはＧｅｙｍｏｎａｔ ＳｐＡ（アナニ、イタリア、ＥＵ）から提供された。
【００２２】
動員プロトコール
標準動員プロトコールは、ＢＡＬＢ／ｃをｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／マウス、腹腔内）で１日１回、５日間処置することを含む。ＰｌＧＦの動員効果を評価するため、ｒｍＰｌＧＦ（２．５〜５μｇ／マウス、腹腔内）又はｒｈＰｌＧＦ（５〜１０μｇ／マウス、腹腔内）を１日１回、５日間、単剤として又はｒｈＧ−ＣＳＦと組み合わせて投与した。ｒｈＰｌＧＦ（１０μｇ／マウス／日）及びｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／マウス／日）で１２日間処置することにより、ｒｈＰｌＧＦの動員効果も試験した。対照にはＰＢＳ／ＭＳＡを注射した。
【００２３】
動員パラメータ
白血球（ＷＢＣ）数、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の頻度及び絶対数、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）の絶対数によって動員を評価した。特に明記しない限り、動物は最後の処置から２時間後に屠殺した。
【００２４】
細胞の回収及び分離
ＰＢを眼窩叢から回収してヘパリン含有チューブに移した。白血球（ＷＢＣ）を計数後、ＰＢをＰＢＳで希釈し（１：４、ｖ／ｖ）、単核細胞（ＭＮＣ）をフィコール不連続密度勾配遠心法（２８０ｇ、３０分、室温）で分離した。次に細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び抗生物質を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｓｅｒｏｍｅｄ、ベルリン、ドイツ、ＥＵ）で２回洗浄した。
【００２５】
ＷＢＣ計数
ヘパリン−抗凝固処理血液及び自動計測器（ＡＤＶＩＡ１２０、バイエル、ミラノ、イタリア、ＥＵ）を用いてＷＢＣ計数を行った。
【００２６】
コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイ
全コロニー形成細胞（ＣＦＣ）、即ち、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、及び多系列ＣＦＵ（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を標準メチルセルロース培養で評価した。簡潔にいえば、血液の１ｍｌアリコート（５×１０４〜２×１０５ＭＮＣ）を、組換えマウス（ｒｍ）幹細胞因子（ｒｍＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ）、マウスｒｍインターロイキン−３（ｒｍＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌ）、組換えヒト（ｒｈ）インターロイキン−６（ｒｈＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍｌ）及びｒｈエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ、３Ｕ／ｍｌ）を添加したメチルセルロース培地（ＨＣＣ−３４３４；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の入った３５ｍｍペトリ皿に蒔いた。空気中５％ＣＯ２の湿潤雰囲気において３７℃で１２〜１４日のインキュベーション後、標準的基準にしたがいコロニーを計数した（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ、Ｒ．Ｋ．ら、Ｂｌｏｏｄ、５３：７４６−７６３、１９７９）。
【００２７】
長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイ
ＬＴＣ−ＩＣをバルク培養で評価した（Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ Ｃら、Ｂｌｏｏｄ、１９９９、９３：３９７３−８２）。簡潔にいえば、試験細胞（５〜８×１０６）を完全培地（Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）５１００、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁し、放射線照射した（２，０００ｃＧｙ）マウスＡＦＴ０２４細胞（プリンストン大学、プリンストン、ニュージャージー、ＵＳＡのＫ．Ｍｏｏｒｅ博士から供与）による支持細胞層を含有する培地に蒔いた（Ｍｏｏｒｅ ＫＡら、Ｂｌｏｏｄ、１９９７；８９：４３３７−４７）。
【００２８】
完全培地は、ＦＢＳ（１２．５％）、ウマ血清（１２．５％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１０−４Ｍ）、イノシトール（０．２ｍＭ）、葉酸（２０μＭ）及び新たに溶解したヒドロコルチゾン（１０−６Ｍ）を添加したα培地から成る。毎週、増殖培地の半分を新鮮な完全培地と交換することによって培養物に栄養供給した。培養４週間後、トリプシン処理して回収した非接着細胞及び接着細胞をプールし、洗浄し、メチルセルロース培地中でコロニー形成性細胞に関してアッセイした。４週齢ＬＴＣ中に存在する全コロニー形成性細胞数（即ち、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ＋ＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−ＧＭ）は、試験懸濁液中にもともと存在したＬＴＣ−ＩＣ数の相対数を提供する。ＬＴＣ−ＩＣ絶対数は、全コロニー形成性細胞数を、ＬＴＣ−ＩＣあたりのコロニー形成性細胞の平均出力である４で割って計算した（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＨＪら、Ｂｌｏｏｄ．１９８９；７４：１５６３−７０）。
【００２９】
実施例１
【００３０】
【表１】
【００３１】
実施例２
【００３２】
【表２】
【００３３】
実施例３
【００３４】
【表３】
【００３５】
実施例４
【００３６】
【表４】
【００３７】
実施例５
【００３８】
【表５】
【００３９】
実施例６
【００４０】
【表６】
【００４１】
実施例７
【００４２】
【表７】
【００４３】
実施例８
【００４４】
【表８】
【００４５】
実施例９
【００４６】
【表９】
【００４７】
実施例１０
【００４８】
【表１０】
【００４９】
実施例１１
【００５０】
【表１１】
【００５１】
実施例１２〜１８
非ヒト霊長類モデルにおけるＰｌＧＦ／Ｇ−ＣＳＦの組み合わせの動員効果
材料及び方法
実験デザイン
アカゲザルの集団（ｎ＝４）にＧ−ＣＳＦ単独（１００μｇ／ｋｇ／日、皮下、５日間）（サイクル１）で最初に動員し、６週間の洗い流し期間後、ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ、静脈内、５日間）＋ｒｈＧ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ／日、皮下、５日間）から成る第２動員療法（サイクル２）を施した。更に６週間の洗い流し期間後、ｒｈＰｌＧＦ（２６０μｇ／ｋｇ、静脈内、５日間）＋ｒｈＧ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ／日、皮下、５日間）から成る第３動員サイクル（サイクル３）を同一サル集団に行った。研究デザインによれば、サイクル１の後の動員動態は、サイクル２及びサイクル３の後の動員を評価するためのサル内の対照として役立つ。
【００５２】
動員パラメータ
白血球（ＷＢＣ）の動員動態について解析し、同様にコミットしたコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の頻度及び絶対数、高増殖能前駆細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）、並びに長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）について解析した。処置期間中（１〜５日）毎日、並びに療法停止後３日及び５日に動員パラメータを解析した。無菌技術を使用して麻酔した霊長類（ケタミン、１０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）の大腿動脈から末梢血サンプルを得た。
【００５３】
ＷＢＣ計数
ＥＤＴＡ−抗凝固処理血液及び自動計測器（ＡＤＶＩＡ１２０、バイエル、ミラノ、イタリア、ＥＵ）を用いてＷＢＣ計数を行った。
【００５４】
ＣＦＣ及びＨＰＰ−ＣＦＣアッセイ
先に記載された技術にしたがい（４１，４２）、ヘパリン添加血液を用いて全ＣＦＣ［即ち、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、及び多系列（顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球）ＣＦＵ（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）］及びＨＰＰ−ＣＦＣをアッセイした。簡潔にいえば、フィコール不連続勾配（密度＝１．０７７ｇ／ｍｌ）遠心法によって得た単核細胞（ＭＮＣ）を、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、インターロイキン−３（ｒｈＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、インターロイキン−６（ｒｈＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｒｈＧ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ、３Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、アビンドン、英国）を添加したメチルセルロース培地（ＨＣＣ−４１００、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）を入れた４枚の３５ｍｍペトリ皿に蒔いた（１×１０４〜２×１０５／ｍｌ）。標準的基準にしたがい、１２〜１４日のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後にＣＦＣを記録した。ｒｈＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＧ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、及びｒｈＥｐｏ（３Ｕ／ｍｌ）を添加したメチルセルロース培地からの直径＞１ｍｍのコンパクトなコロニー増殖の肉眼で見えるコロニーとして定義されるＨＰＰ−ＣＦＣを、２８日のインキュベーション後に記録した（４３）。血中の循環ＣＦＣ又はＨＰＰ−ＣＦＣの絶対数は、ＣＦＣ頻度又はＨＰＰ−ＣＦＣ頻度に血液１ｍｌあたりの全ＭＮＣ数を乗じた関数である。
【００５５】
ＬＴＣ−ＩＣアッセイ
ＬＴＣ−ＩＣ頻度を限界希釈条件下で評価した（４４）。簡潔にいえば、段階希釈した試験細胞（２×１０５〜３×１０３）を、ウシ胎仔血清（１２．５％）、ウマ血清（１２．５％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１０−４Ｍ）、イノシトール（０．２ｍＭ）、葉酸（２０μＭ）＋新たに溶解したヒドロコルチゾン（１０−６Ｍ）を添加したα培地から成る１５０μＬの完全培地（Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）５１００、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、９６ウェル平底プレートに蒔いた。各試験細胞量に関し、１６〜２２回重複して蒔いた。レトロウイルス遺伝子の移入によりヒトＩＬ−３及びＧ−ＣＳＦを産生するように操作した放射線照射（８，０００ｃＧｙ）マウスＭ２−１０Ｂ４細胞（３×１０４／ｃｍ２、テリーフォックス研究所、バンクーバー、カナダのＤｒ．Ｃ．Ｅａｖｅｓより供与）による支持細胞層を含有するプレートに試験細胞を蒔いた（４５）。培養は、増殖培地の半分を新鮮な完全培地と交換することによって毎週栄養供給した。培養５週間後、トリプシン処理によって個々のウェルから非接着細胞及び接着細胞を回収し、洗浄し、ＣＦＣの増殖についてアッセイした。１２〜１４日間のインキュベーション後、培養を陽性（１以上のコロニー）又は陰性（コロニーなし）として記録し、ＬＴＣ−ＩＣ頻度はＬ−Ｃａｌｃソフトウェア（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて計算した。循環ＬＴＣ−ＩＣの絶対数をバルク培養にて評価した（４６）。簡潔にいえば、試験細胞（５〜８×１０６）を完全培地に再懸濁し、放射線照射したマウスＭ２−１０Ｂ４細胞（３×１０４／ｃｍ２）による支持細胞層を含有する培地に蒔いた。培養５週間後、トリプシン処理して回収した非接着細胞及び接着細胞をプールし、洗浄し、コロニー形成性細胞についてアッセイした。５週齢ＬＴＣに存在する全コロニー形成性細胞数（即ち、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ＋ＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−ＧＭ）は、試験懸濁液中にもともと存在するＬＴＣ−ＩＣ数の相対数を提供する。絶対ＬＴＣ−ＩＣ値は、全コロニー形成性細胞数を、ＬＴＣ−ＩＣあたりのコロニー形成性細胞の平均出力である４で割って計算した。
【００５６】
実施例１２
循環ＷＢＣ
ｒｈＧ−ＣＳＦ単独の５日間投与により、平均（±ＳＤ）ＷＢＣ数が、前処理値と比較して平均５倍増加した。１３０又は２６０μｇ／ｋｇのｒｈＰｌＧＦをｒｈＧ−ＣＳＦに添加することにより、処置５日目に検出されたＷＢＣ値が緩やかに増加した。
【００５７】
【表１２】
【００５８】
実施例１３
ＣＦＣ頻度
ベースライン値と比較して、ピーク時に検出された血中ＣＦＣ（１０５ＭＮＣあたり）の平均頻度は、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独、ｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）、及びｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（２６０μｇ／ｋｇ）によりそれぞれ１９倍、５３倍、及び５２倍に増加した。ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較すると、ｒｈＰｌＧＦ／ｒｈＧ−ＣＳＦの組み合わせ処置は、ＣＦＣ頻度がピーク時の２倍に増加した。
【００５９】
【表１３】
【００６０】
実施例１４
絶対ＣＦＣ値
血中循環ＣＦＣの絶対数は、ＣＦＣ頻度に血液１ｍｌあたりの全ＭＮＣ数を乗じた関数として計算した。ベースライン値と比較して、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独、ｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）、及びｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（２６０μｇ／ｋｇ）で処置することにより、ＣＦＣがそれぞれ８５倍、３３５倍及び３５８倍に増加した。サイクル２及び３では、ＣＦＣのピーク値が、サイクル１（ｒｈＧ−ＣＳＦ単独）に対して４倍及び５倍に増加した。
【００６１】
【表１４】
【００６２】
実施例１５
ＨＰＰ−ＣＦＣ頻度
動員５日目に検出された血中ＨＰＰ−ＣＦＣ（１０５ＭＮＣあたり）の平均頻度は、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独又はｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）により、ベースライン値と比較してそれぞれ５倍及び１２倍に増加した。ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較すると、ｒｈＰｌＧＦ／ｒｈＧ−ＣＳＦの組み合わせ処置は、ピーク時のＨＰＰ−ＣＦＣ頻度の２倍に増加した。
【００６３】
【表１５】
【００６４】
実施例１６
絶対ＨＰＰ−ＣＦＣ値
ｒｈＧ−ＣＳＦ療法５日目に検出された血液１ｍｌあたりのＨＰＰ−ＣＦＣの絶対数は、前処理値よりも１７倍高い。ｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）組み合わせ処置を受けたサルは、ベースライン値と比較して、ＨＰＰ−ＣＦＣが１５８倍増加した。サイクル２では、５日目のＨＰＰ−ＣＦＣレベルが、サイクル１に対して５倍増加した。
【００６５】
【表１６】
【００６６】
実施例１７
ＬＴＣ−ＩＣ頻度
限界希釈アッセイによりＬＴＣ−ＩＣ頻度を分析したところ、ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）とｒｈＧ−ＣＳＦとの組み合わせ投与は、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較して、ＬＴＣ−ＩＣ頻度が平均して１１倍（５，８２９細胞中に１細胞対６４，０６４細胞中に１細胞）増加したことを示した。
【００６７】
【表１７】
【００６８】
実施例１８
絶対ＬＴＣ−ＩＣ値
ｒｈＧ−ＣＳＦ単独では、循環ＬＴＣ−ＩＣの絶対数は、ベースライン値と比較して、処置４日目に５３倍に増加した。ｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）の組み合わせ処置は、ＬＴＣ−ＩＣを、前処理値と比較して３８９倍増加させ、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較して１５倍増加させた。
【００６９】
【表１８】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それを必要とする患者又は被験者における血液幹細胞の動員に使用するための生物活性分子の組み合わせに関するものである。より詳細には、本発明は、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）の動員を刺激する際に特に有効な、Ｇ−ＣＳＦとＰｌＧＦとの組み合わせを提供するものであり、それにより、腫瘍患者における臓器移植又は細胞移植及び化学放射線療法プロトコールの実現可能性及び有効性を高める。
【背景技術】
【０００２】
自家ＰＢＰＣは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）３、再発性ホジキンリンパ腫（ＨＬ）４、及び多発性骨髄腫（ＭＭ）５に罹患する患者において高用量化学放射線療法及び自家幹細胞移植（ＳＣＴ）の適用、実現可能性及び有効性を有意に増加させる１，２。
【０００３】
同種ＰＢＰＣは、ＨＬＡ適合ＳＣＴのための好ましい幹細胞源であり、そしてＨＬＡ不適合同種移植のための唯一の細胞源である６，７，８，９，１０，１１。これは、ＨＬＡが適合する血縁又は非血縁ドナーのいない患者、即ち、同種移植を受けるかもしれない患者の世界人口のおよそ４０％に相当する、危険度の高い白血病患者にとって潜在的な治癒的療法である。
【０００４】
がん患者において自家ＰＢＰＣ動員に用いられるプロトコールには、骨髄成長因子の単独使用、又は細胞毒性を有する化学療法からの回復期での使用が含まれ、後者のアプローチは最適なＰＢＰＣ動員を可能にする１２，１３，１４。健常ドナーからの同種ＰＢＰＣ動員は、通常、１０〜２０μｇ／ｋｇ／日の用量の組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）による短期治療によって達成される１５，１６，１７，１８。
【０００５】
５×１０６以上のＣＤ３４＋細胞／ｋｇの自家移植を受けたがん患者は迅速で永続的な造血移植を体験するが、２×１０６以下のＣＤ３４＋細胞／ｋｇの自家移植を受けた患者には遅発性移植、移植の不成功又は２次性骨髄異形成の危険性がある１９。したがって、自家ＳＣＴでは、適当量のＣＤ３４＋細胞の入手可能性が必須の前提条件である。事前の非常に強力な化学放射線療法又は疾患関連因子のために、相当数の化学療法を受けたことがないがん患者（１０〜２０％）又は再発性／不応性がん患者（３０〜４０％）が、適量のＣＤ３４＋細胞の動員に失敗する２０，２１，２２。
【０００６】
適当量の同種ＣＤ３４＋細胞を回収することは、ＨＬＡ同一移植のレシピエントでは重大な問題ではない；しかしながら、５〜１５％の正常ドナーは幹細胞動員が弱く、ｒｈＧ−ＣＳＦ用量の増加と複数回のアフェレーシス処置を必要とする２３，２４，２５。ＨＬＡ不適合同種移植のレシピエントは、移植の不成功と重篤なＧｖＨＤを避けるため、Ｔリンパ球を除去した「メガ」用量のＣＤ３４＋細胞の再注入を必要とする２６。標準動員法（即ち、ｒｈＧ−ＣＳＦによる７日間の治療）では、ＨＬＡ不適合ＳＣＴのドナーは平均４回の白血球搬出法を受けて標的細胞用量のＣＤ３４＋細胞（１２×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｋｇ体重）を回収するが、相当数のドナー（２０〜２５％）は標的ＣＤ３４＋細胞用量の提供に失敗する。
【０００７】
年齢、性別、サイトカイン処置スケジュール、及び事前の化学放射線療法が幹細胞動員に影響し得るにもかかわらず２７，２８，２９、特定の特徴は何もサイトカイン動員の予測因子として明確に同定されていない。したがって、がん患者又は正常ドナーに適用可能であり、且つ毒性を与えることなく循環前駆細胞の収率を増加可能な手順は、自家ＳＣＴ及び同種ＳＣＴの実行可能性、毒性及び費用に重大な影響を有することが予想される。
【０００８】
ＰＢＰＣ動員の増加は、造血幹細胞の輸送を制御するメカニズム、即ち、回帰時の管腔内皮から血管外の骨髄内空間への遊出及び動員時のその逆に干渉可能な分子を使用することによって達成されるであろう３０，３１，３２，３３。ＰＢＰＣ動員を高めるための更なるアプローチの１つは、組換えヒト（ｒｈ）顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）＋ｒｈＧ−ＣＳＦ３４、インターロイキン−３（ｒｈＩＬ−３）＋ｒｈＧ−ＣＳＦ又はｒｈＧＭ−ＣＳＦ３５、及びＰＩＸＹ−３２１３６のようなサイトカインの組み合わせの使用に依拠する。最後に、ＰＢＰＣ動員の促進は、標準動員法に、骨髄前駆細胞を増量可能な幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ）３７，３８、ｆｌｔ−３３９リガンドなどの即効性サイトカインを組み込むことにより達成され、それにより、ｒｈＧ−ＣＳＦによるその後の動員に影響を受けやすい細胞の数が増加するであろう。
【０００９】
これまで、ｒｈＧ−ＣＳＦの代替物も付加物も、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独で達成される血液前駆細胞の実質的な動員の改善に失敗しており、あるいは毒性の実質的増加のほうが勝った限定的な改善をもたらしている。
【００１０】
胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーであり、ＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦＲ１）を介したシグナル伝達による血管形成増幅因子として機能する。最近、ヒト（ｈ）ＰｌＧＦを発現するアデノウイルスベクターの投与が、骨髄抑制後の骨髄再生の促進及び造血前駆細胞の動員を含めた複雑な造血作用を発揮することが示された。しかしながら、
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組換えアデノウイルスベクター注入後の成長因子投与は、精製した因子の直接注入とは大きく異なる点をいくつか示しており、臨床設定で用いられる様式にしたがって投与した場合、その作用は予測できないであろう。
【非特許文献１】Ｇｉａｎｎｉ ＡＭ．高用量化学療法及び自家移植：指針の好機。Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９７；８：９３３−５
【非特許文献２】Ｄｅｍｉｒｅｒ Ｔ、Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ ＷＩ、Ｂｕｃｋｎｅｒ ＣＤ．高用量化学療法のための末梢血幹細胞動員。Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．１９９９；８：１０３−１３
【非特許文献３】Ｇｉａｎｎｉ ＡＭ、Ｂｒｅｇｎｉ Ｍ、Ｓｉｅｎａ Ｓら、侵襲性Ｂ細胞リンパ種におけるＭＡＣＯＰ−Ｂとの比較による高用量化学療法及び自家骨髄移植。Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９７；３３６：１２９０−７
【非特許文献４】Ｆｅｒｍｅ Ｃ、Ｍｏｕｎｉｅｒ Ｎ、Ｄｉｖｉｎｅ Ｍら、初期化学療法後の再発又は不成功の状態にある進行性ホジキン病患者に対する高用量化学療法を伴う集中的サルベージ療法：Ｇｒｏｕｐｅ ｄ’Ｅｔｕｄｅｓ ｄｅｓ Ｌｙｍｐｈｏｍｅｓ ｄｅ ｌ’Ａｄｕｌｔｅ Ｈ８９治験の結果。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００２；２０：４６７−７５
【非特許文献５】Ｂａｒｌｏｇｉｅ Ｂ、多発性骨髄腫治療のための高用量療法及び革新的アプローチ。Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００１；３８（２ Ｓｕｐｐｌ ３）：２１−７
【非特許文献６】Ｋｏｒｂｌｉｎｇ Ｍ、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ Ｄ、Ｈｕｈ ＹＯら、不応性白血病及びリンパ腫に対する同種血液幹細胞移植：骨髄同種移植に対する血液の潜在的利点。Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８５：１６５９−１６６５
【非特許文献７】Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｎ、Ｂａｃｉｇａｌｕｐｏ Ａ、Ｈａｓｅｎｃｌｅｖｅｒ Ｄら、初期白血病患者における同種骨髄移植対フィルグラスチムで動員した末梢血前駆細胞の移植：血液及び骨髄移植に対するヨーロッパ群の無作為多施設治験の最初の結果。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９８；２１：９９５−１００３
【非特許文献８】Ａｐｐｅｌｂａｕｍ ＦＲ、同種移植のための幹細胞源の選択：もはや末梢的問題ではない。Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９４：３８１−３８３
【非特許文献９】Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ ＷＩ、Ｍａｒｔｉｎ ＰＪ、Ｓｔｏｒｅｒ Ｂら、血液のがん患者における、ＨＬＡ同一血縁者からの末梢血細胞と比較した骨髄移植。Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００１；３４４：１７５−１８１
【非特許文献１０】Ａｎｄｅｒｌｉｎｉ Ｐ、Ｋｏｒｂｌｉｎｇ Ｍ、Ｄａｌｅ Ｄら、同種血液幹細胞移植：ドナーへの考慮。Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０：９０３−９０８
【非特許文献１１】Ａｖｅｒｓａ Ｆ、Ｔａｂｉｌｉｏ Ａ、Ｔｅｒｅｎｚｉ Ａら、白血病患者における組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子で動員した末梢血前駆細胞を接種骨髄へ添加することによるＴ細胞を除去した半合致「３遺伝子座」不適合移植の生着の成功。Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８４：３９４８−３９５５
【非特許文献１２】Ｈａａｓ Ｒ、Ｍｏｈｌｅ Ｒ、Ｆｒｕｈａｕｆ Ｓら、悪性リンパ腫において末梢血前駆細胞の動員及び自家移植に成功した患者の特徴。Ｂｌｏｏｄ．１９９４；８３：３７８７−９４
【非特許文献１３】Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ ＷＩ、Ｌｏｎｇｉｎ Ｋ、Ａｐｐｅｌｂａｕｍ Ｆら、組換え顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）後に回収した末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）：移植後の生着速度に相関した因子の解析。Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９４；８７：８２５−３１
【非特許文献１４】Ｗａｔｔｓ ＭＪ、Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＡＭ、Ｊａｍｉｅｓｏｎ Ｅら、低用量シクロホスファミド及び顆粒球コロニー刺激因子の後の前駆細胞動員：１０１人の前処置された悪性リンパ腫患者におけるこれらのパラメータを予測する前駆細胞の量と質及び因子の解析。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９７；１５：５３５−４６
【非特許文献１５】Ｍａｔｓｕｎａｇａ Ｔ、Ｓａｋａｍａｋｉ Ｓ、Ｋｏｈｇｏ Ｙ、Ｏｈｉ Ｓ、Ｈｉｒａｙａｍａ Ｙ、Ｎｉｉｔｓｕ Ｙ、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子は十分な量の末梢血幹細胞を同種移植のための健常ボランティアにおいて動員することができる。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９３；１１：１０３−１０８
【非特許文献１６】Ｋｒｏｇｅｒ Ｎ、Ｒｅｎｇｅｓ Ｈ、Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇ Ｓら、１６μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦ対１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦによる健常ドナーにおける同種移植のための幹細胞動員。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００２；２９：７２７−７３０
【非特許文献１７】Ｂａｓａｒａ Ｎ、Ｓｃｈｍｅｔｚｅｒ Ｂ、Ｂｌａｕ ＩＷら、ボランティアドナーにおいてレノグラスチムで動員した末梢血前駆細胞：非盲検無作為分割用量漸増試験。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０００；２５：３７１−３７６
【非特許文献１８】Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ Ｍ、Ｂｅｒｔｚ Ｈ、Ａｆｔｉｎｇ Ｍ、Ｗａｌｌｅｒ ＣＦ、Ｆｉｎｋｅ Ｊ、同種ドナーからの末梢血前駆細胞の動員及びＣＤ３４＋免疫選択のための高用量対標準用量フィルグラスチム（ｒｈＧ−ＣＳＦ）。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９９；１７：２１６０−２１７２
【非特許文献１９】Ｓｉｅｎａ Ｓ、Ｓｃｈｉａｖｏ Ｒ、Ｐｅｄｒａｚｚｏｌｉ Ｐ、Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ Ｃ、がん治療のための血液細胞移植におけるＣＤ３４＋細胞量の治療的関連性。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０００；１８：１３６０−７７
【非特許文献２０】Ｄｒｅｇｅｒ Ｐ、Ｋｌｏｓｓ Ｍ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｂら、自家前駆細胞移植：幹細胞毒性薬物への事前の曝露が、骨髄移植ではなく、末梢血前駆細胞の収率及び生着を決定する。Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６：３９７０−８
【非特許文献２１】Ｗｅａｖｅｒ ＣＨ、Ｈａｚｅｌｔｏｎ Ｂ、Ｂｉｒｃｈ Ｒら、骨髄機能廃絶化学療法投与後の６９２人の患者における末梢血前駆細胞回収物のＣＤ３４含量の関数としての生着動態の解析。Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６：３９６１−９
【非特許文献２２】Ｔａｒｅｌｌａ Ｃ、Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ Ｍ、Ｃａｒａｃｃｉｏｌｏ Ｄ、自家末梢血前駆細胞による支援を伴う高用量ａｒａ−Ｃは顕著な前駆細胞動員を誘発する：低動員の危険性のある患者の兆候。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００２；３０：７２５−３２
【非特許文献２３】Ａｎｄｅｒｌｉｎｉ Ｐ、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ Ｄ、Ｓｅｏｎｇ Ｄら、正常ドナーからの顆粒球コロニー刺激因子（フィルグラスチム）動員及び血液幹細胞アフェレーシスの臨床毒性及び実験室内効果、並びに処置負担の解析。Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．１９９６；３６：５９０−５９５
【非特許文献２４】Ａｎｄｅｒｌｉｎｉ Ｐ、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ Ｄ、Ｈｕｈ Ｙら、同種移植のための正常ドナーにおけるＣＤ３４＋前駆細胞及びリンパ球サブセットのフィルグラスチム動員期間及びアフェレーシス収率。Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９６；９３：９４０−９４２
【非特許文献２５】Ｇｒｉｇｇ ＡＰ、Ｒｏｂｅｒｔｓ ＡＷ、Ｒａｕｎｏｗ Ｈら、健常ボランティアの末梢血前駆細胞を動員し、回収するためのフィルグラスチム（顆粒球コロニー刺激因子）の最適用量及びスケジューリング。Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６：４４３７−４４４５
【非特許文献２６】Ａｖｅｒｓａ Ｆ、Ｔａｂｉｌｉｏ Ａ、Ｖｅｌａｒｄｉ Ａら、１つの完全に不適合なＨＬＡハプロタイプを有する血縁ドナー由来の、Ｔ細胞を除去した幹細胞を用いた危険性の高い急性白血病の治療。Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９８；３３９：１１８６−１１９３
【非特許文献２７】Ｍｉｆｌｉｎ Ｇ、Ｃｈａｒｌｅｙ Ｃ、Ｓｔａｉｎｅｒ Ｃ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｓ、Ｈｕｎｔｅｒ Ａ、Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｎ、同種移植のための正常ドナーにおける幹細胞動員：安全性及び有効性に影響する因子の解析、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９６；９５：３４５−３４８
【非特許文献２８】Ａｎｄｅｒｌｉｎｉ Ｐ、Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ Ｄ、Ｓｅｏｎｇ Ｃら、フィルグラスチムで処置した正常ドナーにおいてＣＤ３４＋細胞の動員に影響する因子。Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．１９９７；３７：５０７−５１２
【非特許文献２９】ｄｅ ｌａ Ｒｕｂｉａ Ｊ、Ａｒｂｏｎａ Ｃ、ｄｅ Ａｒｒｉｂａ Ｆら、正常ドナーにおける末梢血前駆細胞の低回収に関連する因子の解析。Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２００２；４２：４−９
【非特許文献３０】Ｃｒａｄｄｏｃｋ ＣＦ、Ｎａｋａｍｏｔｏ Ｂ、Ａｎｄｒｅｗｓ ＲＧ、Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ ＧＶ、Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ Ｔ、ＶＬＡ４インテグリンに対する抗体は、霊長類及びマウスにおいて長期増殖細胞を動員し、サイトカイン誘導性動員を増大させる。Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０：４７７９−８８
【非特許文献３１】Ｋｉｎｇ ＡＧ、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｄ、Ｄｉｌｌｏｎ ＳＢら、アカゲザルにおけるヒトＣＸＣケモカインＧＲＯβの特定の短鎖型であるＳＢ−２５１３５３の単回注射により生着特性の増したマウス造血幹細胞の急速動員及び造血前駆細胞動員の評価。Ｂｌｏｏｄ．２００１；９７：１５３４−４２
【非特許文献３２】Ｐｒｕｉｊｔ ＪＦ、ｖａｎ Ｋｏｏｙｋ Ｙ、Ｆｉｇｄｏｒ ＣＧ、Ｌｉｎｄｌｅｙ ＩＪ、Ｗｉｌｌｅｍｚｅ Ｒ、Ｆｉｂｂｅ ＷＥ、抗ＬＦＡ−１ブロッキング抗体は、インターロイキン−８で誘導される造血前駆細胞の動員を妨げる。Ｂｌｏｏｄ．１９９８；９１：４０９９−１０５
【非特許文献３３】Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ Ｃ、Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ Ｍ、Ｍａｇｎｉ Ｍら、マウスにおいてデフィブロタイドを顆粒球コロニー刺激因子と組み合わせると、初期のコミットした末梢血前駆細胞の動員を顕著に促進する。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２；６２：６１５２−７
【非特許文献３４】Ｋｏｃ ＯＮ、Ｇｅｒｓｏｎ ＳＬ、Ｃｏｏｐｅｒ ＢＷら、前駆細胞動員の無作為交差治験：高用量シクロホスファミド＋顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）対顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子＋Ｇ−ＣＳＦ。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０００；１８：１８２４−３０
【非特許文献３５】Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ＣＳ、Ｂｏｌｗｅｌｌ Ｂ、ＬｅＦｅｖｅｒ Ａら、末梢血幹細胞を動員するための４種のサイトカイン処方計画の比較：ＩＬ−３単独及びＧＭ−ＣＳＦ又はＧ−ＣＳＦとの組み合わせ。Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９６；１７：１７９−８３
【非特許文献３６】Ｂｉｓｈｏｐ ＭＲ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＪＤ、Ｏ’Ｋａｎｅ−Ｍｕｒｐｈｙ Ｂら、末梢血細胞を動員するための組換え融合タンパク質ＰＩＸＹ３２１の第１相試験。Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９９６；１４：２５２１−６
【非特許文献３７】Ｓｈｐａｌｌ ＥＪ、Ｗｈｅｅｌｅｒ ＣＡ、Ｔｕｒｎｅｒ ＳＡら、危険性の高い乳癌患者における幹細胞因子及びフィルグラスチムによる末梢血前駆細胞動員の無作為第３相試験。Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９３：２４９１−５０１
【非特許文献３８】Ｆａｃｏｎ Ｔ、Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ ＪＬ、Ｍａｌｏｉｓｅｌ Ｆら、多発性骨髄腫患者において化学療法後に幹細胞因子をフィルグラスチムと組み合わせると、末梢血前駆細胞の収率が向上し、アフェレーシス要求性が減少する：無作為対照臨床試験。Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９４：１２１８−２５
【非特許文献３９】Ｂｒａｓｅｌ Ｋ、ＭｃＫｅｎｎａ ＨＪ、Ｃｈａｒｒｉｅｒ Ｋ、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ＰＪ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＤＥ、Ｌｙｍａｎ ＳＤ、Ｆｌｔ３リガンドは顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子又は顆粒球コロニー刺激因子と相乗作用して造血前駆細胞をマウスの末梢血に動員する。Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０：３７８１−８
【非特許文献４０】Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ、Ｈｅｉｓｓｉｇ Ｂ、Ｗｕ Ｙら、胎盤成長因子は、骨髄微小環境からＶＥＧＦＲ１＋幹細胞を動員することによって造血を再構築する。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２００２；８：８４１−９
【非特許文献４１】ＭａｃＶｉｔｔｉｅ ＴＪ、Ｆａｒｅｓｅ ＡＭ、Ｄａｖｉｓ ＴＡ、Ｌｉｎｄ ＬＢ、ＭｃＫｅａｒｎ ＪＰ、ヒトインターロイキン３及び顆粒球コロニー刺激因子の受容体のキメラアゴニストであるミエロポエチンは、ＣＤ３４＋細胞を動員し、致死的なＸ線を照射した非ヒト霊長類に急速に生着する。Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９９；２７：１５５７−６８
【非特許文献４２】Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ Ｃ、Ｄｉ Ｎｉｃｏｌａ Ｍ、Ｌｏｎｇｏｎｉ Ｐ、Ｍｉｌａｎｉ Ｒ、Ｍｉｌａｎｅｓｉ Ｍ、Ｇｕｉｄｅｔｔｉ Ａ、Ｈａａｎｓｔｒａ Ｋ、Ｊｏｎｋｅｒ Ｍ、Ｃｌｅｒｉｓ Ｌ、Ｍａｇｎｉ Ｍ、Ｆｏｒｍｅｌｌｉ Ｆ、Ｇｉａｎｎｉ ＡＭ、デフィブロタイド及び組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子で処置した非ヒト霊長類における初期のコミットした造血前駆細胞の動員。Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００４；３２：６８−７５
【非特許文献４３】Ｃｒａｄｄｏｃｋ ＣＦ、Ｎａｋａｍｏｔｏ Ｂ、Ａｎｄｒｅｗｓ ＲＧ、Ｐｒｉｅｓｔｌｅｙ ＧＶ、Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ Ｔ、ＶＬＡ−４インテグリンに対する抗体は、霊長類及びマウスにおいて長期増殖細胞を動員し、サイトカイン誘導性動員を増大させる。Ｂｌｏｏｄ．１９９７；９０：４７７９−８８
【非特許文献４４】Ｌｅｍｉｅｕｘ ＭＥ、Ｒｅｂｅｌ ＶＩ、Ｌａｎｓｄｏｒｐ ＰＭ、Ｅａｖｅｓ ＣＪ、長期骨髄「スイッチ」培養においてリンパ性骨髄分化の可能な成熟マウス骨髄における初期造血細胞タイプの特徴付け及び精製。Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６：１３３９−１３４７
【非特許文献４５】Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＨＪ、Ｅａｖｅｓ ＣＪ、Ｌａｎｓｄｏｒｐ ＰＭ、Ｔａｃｋｅｒ ＪＤ、Ｈｏｇｇｅ ＤＥ、遺伝子操作されたマウス間質細胞上に維持された長期培養における初期ヒト造血細胞の分化調節。Ｂｌｏｏｄ．１９９１；７８：６６６−７２
【非特許文献４６】Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ Ｃ、Ｒｅｇａｚｚｉ Ｅ、Ｓａｍｍａｒｅｌｌｉ Ｇら、チロシンキナーゼインヒビターＡＧ９５７及び抗Ｆａｓ受容体抗体のＣＤ３４＋慢性骨髄性白血病前駆細胞に対する効果。Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９３：３９７３−８２
【非特許文献４７】Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＨＪ、Ｅａｖｅｓ ＣＪ、Ｅａｖｅｓ ＡＣ、Ｄｒａｇｏｗｓｋａ ＡＣ、Ｌａｎｓｄｏｒｐ ＰＭ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで長期造血を開始可能なヒト骨髄細胞の特徴及び部分精製。Ｂｌｏｏｄ．１９８９；７４：１５６３−７０
【発明の詳細な説明】
【００１１】
発明の説明
幹細胞動員を改善可能な手順の相対的な臨床効果により、臨床症状で起こるようなＰＢＰＣ動員を刺激可能な動物モデルにおいてＰｌＧＦの動員活性を試験した。正常ＢＡＬＢ／ｃマウスに、対照ビヒクル（ＰＢＳ／ＭＳＡ）、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独（１０μｇ／日）、又はｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／日）と組換えマウス（ｒｍ）ＰｌＧＦ（２．５〜５μｇ／日）若しくは組換えヒト（ｒｈ）ＰｌＧＦ（５〜１０μｇ／日）との組み合わせを、５日間腹腔内（ＩＰ）注射した。サイトカインの最後の注射から２時間後に血液サンプルを回収し、以下のパラメータについて評価した：白血球（ＷＢＣ）数、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の頻度及び絶対数、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）の絶対数。
【００１２】
ｒｍＰｌＧＦの効果を以下の表１〜４に表す。ｒｍＰｌＧＦ単独注入ではＷＢＣ、ＣＦＣ、及びＬＴＣ−ＩＣの動員に効果がないことは明らかである。ｒｍＰｌＧＦ（５μｇ／日）をｒｈＧ−ＣＳＦと組み合わせて５日間注射すると、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較してＣＦＣ及びＬＴＣ−ＩＣの動員を有意に増加させる。
【００１３】
表５〜８にｒｈＰｌＧＦの動員効果をまとめる。同様に、ｒｈＰｌＧＦを単独で注入した場合、循環ＷＢＣ又は造血前駆細胞に効果がない。逆に、ｒｈＰｌＧＦとｒｈＧ−ＣＳＦとの組み合わせ注入は、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較して、ＣＦＣ及びＬＴＣ−ＩＣの動員を有意に増加させる。
【００１４】
ｒｈＰｌＧＦ（１０μｇ／日）とｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／日）による１２日間処置の動員効果についても試験した。１２日間処置を受けたマウスについて、療法の５日、８日、１０日、及び１２日目に分析した。ｒｈＰｌＧＦ／ｒｈＧ−ＣＳＦの組み合わせ処置は、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較して、試験中に分析した各時点において血中ＣＦＣの頻度及び絶対数を有意に増加させた（表９〜１１）。
【００１５】
更に、ＰｌＧＦ／Ｇ−ＣＳＦの組み合わせの動員活性を非ヒト霊長類モデル（アカゲザル）で試験した。マウスで得られた結果がこの動物モデルで更に確認された。特に、ＰｌＧＦ／Ｇ−ＣＳＦの組み合わせは、動態、頻度及び絶対数に関し、ＷＢＣ、ＣＦＣ、ＨＰＰ−ＣＦＣ及びＬＴＣ−ＩＣの動員を改善した。
【００１６】
上記研究は、ヒト患者への造血成長因子の投与に酷似した手順及び条件を用いて実施した。この結果は、末梢血前駆細胞の動員におけるｈＧ−ＣＳＦとｒｈＰｌＧＦとによる相乗作用の存在を明確に立証するものである。
【００１７】
したがって、本発明の目的は、それを必要とする患者又は被験者において血液幹細胞の動員を刺激するのに有用なＧ−ＣＳＦとＰｌＧＦとの組み合わせ製剤である。本明細書において、「患者」及び「被験者」という用語は、好ましくはヒトの個人を意味するが、動物、特に哺乳動物を意味してもよい。血液幹細胞の動員から恩恵を受ける状態、病状又は疾患の例としては、限定されるものではないが、ＮＨＬ、再発性ＨＬ４、ＭＭ５に罹患する患者における臓器移植又は細胞移植及び腫瘍化学−放射線療法、特に自家１，２又は同種のＳＣＴ、あるいは骨髄抑制化学療法後の回復期にある患者が挙げられる。
【００１８】
組み合わせ製剤の活性成分は、医薬的に許容可能なビヒクル及び賦形剤を有する製剤で同時に投与することも別個に投与することもできる。非経口経路の投与が好ましい。非経口投与に好適な医薬組成物の製造方法は当該技術分野において公知である；詳細は『レミントン：薬学の科学と実践』、Ｍａｃｋ出版社、中に見出すことができる。本発明の組み合わせ製剤中の活性成分量は、例えば投与経路、求められる効果又は治療すべき状態、及び患者の応答性に応じて変えることができる。原則として、有効量のＧ−ＣＳＦ及びＰｌＧＦは、血液幹細胞動員に関して所望の応答性を作り出すことが可能である。患者／被験者の応答性は、処置期間中、例えば循環血液幹細胞を計数することによってモニターでき、したがって、必要であれば容量を変更することができる。本発明の好ましい態様では、１〜１５０μｇ／ｋｇ、好ましくは５〜２０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦ及び１０〜３００μｇ／ｋｇ、好ましくは２０〜１５０μｇ／ｋｇのＰｌＧＦで構成される日用量の活性成分を供給する注射液の形態で組換えｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＰｌＧＦが用いられる。
【００１９】
以下の実施例によって本発明を更に説明する。
【実施例】
【００２０】
実施例１〜１１
マウスモデルにおけるＰｌＧＦ／Ｇ−ＣＳＦの組み合わせの動員効果
材料及び方法
動物
体重２０〜２５ｇの６〜８週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（ミラノ、イタリア、ＥＵ）から購入した。動物に対して行った実験手順は、英国癌研究調整委員会（英国癌研究調整委員会。腫瘍実験における動物の福祉に関するＵＫＣＣＣＲ指針。Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．、５８：１０９−１１３、１９９８）の指針にしたがって実施した。対照ビヒクル（ＰＢＳ／ＭＳＡ）、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独（１０μｇ／日）、又はｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／日）と組換えマウス（ｒｍ）ＰｌＧＦ（２．５〜５μｇ／日）若しくは組換えヒト（ｒｈ）ＰｌＧＦ（５〜１０μｇ／日）との組み合わせを、マウスに５日間毎日腹腔内（ＩＰ）注射した。それぞれの実験は少なくとも３回の別々の機会に行い、時点あたり１群３〜４匹のマウスを用いた。
【００２１】
サイトカイン
組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ、ニューポゲン（登録商標））はロシュ（ミラノ、イタリア、ＥＵ）から購入した；ｒｍＰｌＧＦはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（アビンドン、英国）から購入した；ｒｈＰｌＧＦはＧｅｙｍｏｎａｔ ＳｐＡ（アナニ、イタリア、ＥＵ）から提供された。
【００２２】
動員プロトコール
標準動員プロトコールは、ＢＡＬＢ／ｃをｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／マウス、腹腔内）で１日１回、５日間処置することを含む。ＰｌＧＦの動員効果を評価するため、ｒｍＰｌＧＦ（２．５〜５μｇ／マウス、腹腔内）又はｒｈＰｌＧＦ（５〜１０μｇ／マウス、腹腔内）を１日１回、５日間、単剤として又はｒｈＧ−ＣＳＦと組み合わせて投与した。ｒｈＰｌＧＦ（１０μｇ／マウス／日）及びｒｈＧ−ＣＳＦ（１０μｇ／マウス／日）で１２日間処置することにより、ｒｈＰｌＧＦの動員効果も試験した。対照にはＰＢＳ／ＭＳＡを注射した。
【００２３】
動員パラメータ
白血球（ＷＢＣ）数、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の頻度及び絶対数、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）の絶対数によって動員を評価した。特に明記しない限り、動物は最後の処置から２時間後に屠殺した。
【００２４】
細胞の回収及び分離
ＰＢを眼窩叢から回収してヘパリン含有チューブに移した。白血球（ＷＢＣ）を計数後、ＰＢをＰＢＳで希釈し（１：４、ｖ／ｖ）、単核細胞（ＭＮＣ）をフィコール不連続密度勾配遠心法（２８０ｇ、３０分、室温）で分離した。次に細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び抗生物質を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｓｅｒｏｍｅｄ、ベルリン、ドイツ、ＥＵ）で２回洗浄した。
【００２５】
ＷＢＣ計数
ヘパリン−抗凝固処理血液及び自動計測器（ＡＤＶＩＡ１２０、バイエル、ミラノ、イタリア、ＥＵ）を用いてＷＢＣ計数を行った。
【００２６】
コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイ
全コロニー形成細胞（ＣＦＣ）、即ち、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、及び多系列ＣＦＵ（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を標準メチルセルロース培養で評価した。簡潔にいえば、血液の１ｍｌアリコート（５×１０４〜２×１０５ＭＮＣ）を、組換えマウス（ｒｍ）幹細胞因子（ｒｍＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ）、マウスｒｍインターロイキン−３（ｒｍＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍｌ）、組換えヒト（ｒｈ）インターロイキン−６（ｒｈＩＬ−６、１０ｎｇ／ｍｌ）及びｒｈエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ、３Ｕ／ｍｌ）を添加したメチルセルロース培地（ＨＣＣ−３４３４；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の入った３５ｍｍペトリ皿に蒔いた。空気中５％ＣＯ２の湿潤雰囲気において３７℃で１２〜１４日のインキュベーション後、標準的基準にしたがいコロニーを計数した（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ、Ｒ．Ｋ．ら、Ｂｌｏｏｄ、５３：７４６−７６３、１９７９）。
【００２７】
長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイ
ＬＴＣ−ＩＣをバルク培養で評価した（Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ Ｃら、Ｂｌｏｏｄ、１９９９、９３：３９７３−８２）。簡潔にいえば、試験細胞（５〜８×１０６）を完全培地（Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）５１００、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁し、放射線照射した（２，０００ｃＧｙ）マウスＡＦＴ０２４細胞（プリンストン大学、プリンストン、ニュージャージー、ＵＳＡのＫ．Ｍｏｏｒｅ博士から供与）による支持細胞層を含有する培地に蒔いた（Ｍｏｏｒｅ ＫＡら、Ｂｌｏｏｄ、１９９７；８９：４３３７−４７）。
【００２８】
完全培地は、ＦＢＳ（１２．５％）、ウマ血清（１２．５％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１０−４Ｍ）、イノシトール（０．２ｍＭ）、葉酸（２０μＭ）及び新たに溶解したヒドロコルチゾン（１０−６Ｍ）を添加したα培地から成る。毎週、増殖培地の半分を新鮮な完全培地と交換することによって培養物に栄養供給した。培養４週間後、トリプシン処理して回収した非接着細胞及び接着細胞をプールし、洗浄し、メチルセルロース培地中でコロニー形成性細胞に関してアッセイした。４週齢ＬＴＣ中に存在する全コロニー形成性細胞数（即ち、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ＋ＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−ＧＭ）は、試験懸濁液中にもともと存在したＬＴＣ−ＩＣ数の相対数を提供する。ＬＴＣ−ＩＣ絶対数は、全コロニー形成性細胞数を、ＬＴＣ−ＩＣあたりのコロニー形成性細胞の平均出力である４で割って計算した（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ ＨＪら、Ｂｌｏｏｄ．１９８９；７４：１５６３−７０）。
【００２９】
実施例１
【００３０】
【表１】
【００３１】
実施例２
【００３２】
【表２】
【００３３】
実施例３
【００３４】
【表３】
【００３５】
実施例４
【００３６】
【表４】
【００３７】
実施例５
【００３８】
【表５】
【００３９】
実施例６
【００４０】
【表６】
【００４１】
実施例７
【００４２】
【表７】
【００４３】
実施例８
【００４４】
【表８】
【００４５】
実施例９
【００４６】
【表９】
【００４７】
実施例１０
【００４８】
【表１０】
【００４９】
実施例１１
【００５０】
【表１１】
【００５１】
実施例１２〜１８
非ヒト霊長類モデルにおけるＰｌＧＦ／Ｇ−ＣＳＦの組み合わせの動員効果
材料及び方法
実験デザイン
アカゲザルの集団（ｎ＝４）にＧ−ＣＳＦ単独（１００μｇ／ｋｇ／日、皮下、５日間）（サイクル１）で最初に動員し、６週間の洗い流し期間後、ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ、静脈内、５日間）＋ｒｈＧ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ／日、皮下、５日間）から成る第２動員療法（サイクル２）を施した。更に６週間の洗い流し期間後、ｒｈＰｌＧＦ（２６０μｇ／ｋｇ、静脈内、５日間）＋ｒｈＧ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ／日、皮下、５日間）から成る第３動員サイクル（サイクル３）を同一サル集団に行った。研究デザインによれば、サイクル１の後の動員動態は、サイクル２及びサイクル３の後の動員を評価するためのサル内の対照として役立つ。
【００５２】
動員パラメータ
白血球（ＷＢＣ）の動員動態について解析し、同様にコミットしたコロニー形成細胞（ＣＦＣ）の頻度及び絶対数、高増殖能前駆細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）、並びに長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）について解析した。処置期間中（１〜５日）毎日、並びに療法停止後３日及び５日に動員パラメータを解析した。無菌技術を使用して麻酔した霊長類（ケタミン、１０ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）の大腿動脈から末梢血サンプルを得た。
【００５３】
ＷＢＣ計数
ＥＤＴＡ−抗凝固処理血液及び自動計測器（ＡＤＶＩＡ１２０、バイエル、ミラノ、イタリア、ＥＵ）を用いてＷＢＣ計数を行った。
【００５４】
ＣＦＣ及びＨＰＰ−ＣＦＣアッセイ
先に記載された技術にしたがい（４１，４２）、ヘパリン添加血液を用いて全ＣＦＣ［即ち、顆粒球−マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、及び多系列（顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球）ＣＦＵ（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）］及びＨＰＰ−ＣＦＣをアッセイした。簡潔にいえば、フィコール不連続勾配（密度＝１．０７７ｇ／ｍｌ）遠心法によって得た単核細胞（ＭＮＣ）を、組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、インターロイキン−３（ｒｈＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、インターロイキン−６（ｒｈＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｒｈＧ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ、３Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、アビンドン、英国）を添加したメチルセルロース培地（ＨＣＣ−４１００、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）を入れた４枚の３５ｍｍペトリ皿に蒔いた（１×１０４〜２×１０５／ｍｌ）。標準的基準にしたがい、１２〜１４日のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後にＣＦＣを記録した。ｒｈＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ−３（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＧ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、及びｒｈＥｐｏ（３Ｕ／ｍｌ）を添加したメチルセルロース培地からの直径＞１ｍｍのコンパクトなコロニー増殖の肉眼で見えるコロニーとして定義されるＨＰＰ−ＣＦＣを、２８日のインキュベーション後に記録した（４３）。血中の循環ＣＦＣ又はＨＰＰ−ＣＦＣの絶対数は、ＣＦＣ頻度又はＨＰＰ−ＣＦＣ頻度に血液１ｍｌあたりの全ＭＮＣ数を乗じた関数である。
【００５５】
ＬＴＣ−ＩＣアッセイ
ＬＴＣ−ＩＣ頻度を限界希釈条件下で評価した（４４）。簡潔にいえば、段階希釈した試験細胞（２×１０５〜３×１０３）を、ウシ胎仔血清（１２．５％）、ウマ血清（１２．５％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１０−４Ｍ）、イノシトール（０．２ｍＭ）、葉酸（２０μＭ）＋新たに溶解したヒドロコルチゾン（１０−６Ｍ）を添加したα培地から成る１５０μＬの完全培地（Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ（商標）５１００、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、９６ウェル平底プレートに蒔いた。各試験細胞量に関し、１６〜２２回重複して蒔いた。レトロウイルス遺伝子の移入によりヒトＩＬ−３及びＧ−ＣＳＦを産生するように操作した放射線照射（８，０００ｃＧｙ）マウスＭ２−１０Ｂ４細胞（３×１０４／ｃｍ２、テリーフォックス研究所、バンクーバー、カナダのＤｒ．Ｃ．Ｅａｖｅｓより供与）による支持細胞層を含有するプレートに試験細胞を蒔いた（４５）。培養は、増殖培地の半分を新鮮な完全培地と交換することによって毎週栄養供給した。培養５週間後、トリプシン処理によって個々のウェルから非接着細胞及び接着細胞を回収し、洗浄し、ＣＦＣの増殖についてアッセイした。１２〜１４日間のインキュベーション後、培養を陽性（１以上のコロニー）又は陰性（コロニーなし）として記録し、ＬＴＣ−ＩＣ頻度はＬ−Ｃａｌｃソフトウェア（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて計算した。循環ＬＴＣ−ＩＣの絶対数をバルク培養にて評価した（４６）。簡潔にいえば、試験細胞（５〜８×１０６）を完全培地に再懸濁し、放射線照射したマウスＭ２−１０Ｂ４細胞（３×１０４／ｃｍ２）による支持細胞層を含有する培地に蒔いた。培養５週間後、トリプシン処理して回収した非接着細胞及び接着細胞をプールし、洗浄し、コロニー形成性細胞についてアッセイした。５週齢ＬＴＣに存在する全コロニー形成性細胞数（即ち、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ＋ＢＦＵ−Ｅ＋ＣＦＵ−ＧＭ）は、試験懸濁液中にもともと存在するＬＴＣ−ＩＣ数の相対数を提供する。絶対ＬＴＣ−ＩＣ値は、全コロニー形成性細胞数を、ＬＴＣ−ＩＣあたりのコロニー形成性細胞の平均出力である４で割って計算した。
【００５６】
実施例１２
循環ＷＢＣ
ｒｈＧ−ＣＳＦ単独の５日間投与により、平均（±ＳＤ）ＷＢＣ数が、前処理値と比較して平均５倍増加した。１３０又は２６０μｇ／ｋｇのｒｈＰｌＧＦをｒｈＧ−ＣＳＦに添加することにより、処置５日目に検出されたＷＢＣ値が緩やかに増加した。
【００５７】
【表１２】
【００５８】
実施例１３
ＣＦＣ頻度
ベースライン値と比較して、ピーク時に検出された血中ＣＦＣ（１０５ＭＮＣあたり）の平均頻度は、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独、ｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）、及びｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（２６０μｇ／ｋｇ）によりそれぞれ１９倍、５３倍、及び５２倍に増加した。ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較すると、ｒｈＰｌＧＦ／ｒｈＧ−ＣＳＦの組み合わせ処置は、ＣＦＣ頻度がピーク時の２倍に増加した。
【００５９】
【表１３】
【００６０】
実施例１４
絶対ＣＦＣ値
血中循環ＣＦＣの絶対数は、ＣＦＣ頻度に血液１ｍｌあたりの全ＭＮＣ数を乗じた関数として計算した。ベースライン値と比較して、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独、ｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）、及びｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（２６０μｇ／ｋｇ）で処置することにより、ＣＦＣがそれぞれ８５倍、３３５倍及び３５８倍に増加した。サイクル２及び３では、ＣＦＣのピーク値が、サイクル１（ｒｈＧ−ＣＳＦ単独）に対して４倍及び５倍に増加した。
【００６１】
【表１４】
【００６２】
実施例１５
ＨＰＰ−ＣＦＣ頻度
動員５日目に検出された血中ＨＰＰ−ＣＦＣ（１０５ＭＮＣあたり）の平均頻度は、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独又はｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）により、ベースライン値と比較してそれぞれ５倍及び１２倍に増加した。ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較すると、ｒｈＰｌＧＦ／ｒｈＧ−ＣＳＦの組み合わせ処置は、ピーク時のＨＰＰ−ＣＦＣ頻度の２倍に増加した。
【００６３】
【表１５】
【００６４】
実施例１６
絶対ＨＰＰ−ＣＦＣ値
ｒｈＧ−ＣＳＦ療法５日目に検出された血液１ｍｌあたりのＨＰＰ−ＣＦＣの絶対数は、前処理値よりも１７倍高い。ｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）組み合わせ処置を受けたサルは、ベースライン値と比較して、ＨＰＰ−ＣＦＣが１５８倍増加した。サイクル２では、５日目のＨＰＰ−ＣＦＣレベルが、サイクル１に対して５倍増加した。
【００６５】
【表１６】
【００６６】
実施例１７
ＬＴＣ−ＩＣ頻度
限界希釈アッセイによりＬＴＣ−ＩＣ頻度を分析したところ、ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）とｒｈＧ−ＣＳＦとの組み合わせ投与は、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較して、ＬＴＣ−ＩＣ頻度が平均して１１倍（５，８２９細胞中に１細胞対６４，０６４細胞中に１細胞）増加したことを示した。
【００６７】
【表１７】
【００６８】
実施例１８
絶対ＬＴＣ−ＩＣ値
ｒｈＧ−ＣＳＦ単独では、循環ＬＴＣ−ＩＣの絶対数は、ベースライン値と比較して、処置４日目に５３倍に増加した。ｒｈＧ−ＣＳＦ／ｒｈＰｌＧＦ（１３０μｇ／ｋｇ）の組み合わせ処置は、ＬＴＣ−ＩＣを、前処理値と比較して３８９倍増加させ、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独と比較して１５倍増加させた。
【００６９】
【表１８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者又は被験者における血液幹細胞の動員に使用するための、活性物質としてＧ−ＣＳＦ及びＰｌＧＦを含有する組み合わせ医薬製剤。
【請求項２】
Ｇ−ＣＳＦ及びＰｌＧＦを患者又は被験者に同時に又は別個に投与する、請求項１に記載の組み合わせ製剤。
【請求項３】
非経口投与用である、請求項１又は２に記載の組み合わせ製剤。
【請求項４】
組換えｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＰｌＧＦを含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み合わせ製剤。
【請求項５】
１〜１５０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦと１０〜３００μｇ／ｋｇのＰｌＧＦを含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせ製剤。
【請求項６】
血液幹細胞の動員を必要とする状態、病状又は疾患を治療するための医薬組成物の製造におけるＧ−ＣＳＦとＰｌＧＦとの組み合わせの使用。
【請求項７】
非経口用組成物の製造における請求項６に記載の使用。
【請求項８】
組換えｈＧ−ＣＳＦとｒｈＰｌＧＦとの組み合わせである、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記状態、病状又は疾患が、臓器若しくは細胞の移植及び腫瘍化学放射線療法、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、再発性ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、多発性骨髄腫の罹患患者における自家若しくは同種幹細胞移植、又は骨髄抑制化学療法後の回復期を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
医薬組成物が１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦ及び１３０μｇ／ｋｇのＰｌＧＦの１日量を提供する、請求項６に記載の使用。
【請求項１】
それを必要とする患者又は被験者における血液幹細胞の動員に使用するための、活性物質としてＧ−ＣＳＦ及びＰｌＧＦを含有する組み合わせ医薬製剤。
【請求項２】
Ｇ−ＣＳＦ及びＰｌＧＦを患者又は被験者に同時に又は別個に投与する、請求項１に記載の組み合わせ製剤。
【請求項３】
非経口投与用である、請求項１又は２に記載の組み合わせ製剤。
【請求項４】
組換えｈＧ−ＣＳＦ及びｒｈＰｌＧＦを含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組み合わせ製剤。
【請求項５】
１〜１５０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦと１０〜３００μｇ／ｋｇのＰｌＧＦを含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせ製剤。
【請求項６】
血液幹細胞の動員を必要とする状態、病状又は疾患を治療するための医薬組成物の製造におけるＧ−ＣＳＦとＰｌＧＦとの組み合わせの使用。
【請求項７】
非経口用組成物の製造における請求項６に記載の使用。
【請求項８】
組換えｈＧ−ＣＳＦとｒｈＰｌＧＦとの組み合わせである、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記状態、病状又は疾患が、臓器若しくは細胞の移植及び腫瘍化学放射線療法、特に非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、再発性ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、多発性骨髄腫の罹患患者における自家若しくは同種幹細胞移植、又は骨髄抑制化学療法後の回復期を含む、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
医薬組成物が１０μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦ及び１３０μｇ／ｋｇのＰｌＧＦの１日量を提供する、請求項６に記載の使用。
【公表番号】特表２００７−５００１５７（Ｐ２００７−５００１５７Ａ）
【公表日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２１４８７（Ｐ２００６−５２１４８７）
【出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００８２４５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４０２３
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０６１０２２９３）ドムペ・ファ．ル．マ・ソチエタ・ペル・アツィオーニ (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２３日（２００４．７．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００８２４５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１４０２３
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【出願人】（５０６１０２２９３）ドムペ・ファ．ル．マ・ソチエタ・ペル・アツィオーニ (11)
【Ｆターム（参考）】
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