広範囲のＥｒｂＢリガンド結合分子ならびにそれを調製および使用するための方法
天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子が開示される。好ましくは、結合分子は、広範囲を、より好ましくは、ＥｒｂＢリガンドの全範囲を結合する。キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は一般的に、ＥｒｂＢ１、３、または４のうちの１つに由来するサブユニットＬＩ、および別の異なるＥｒｂＢ受容体タイプ由来のサブユニットＬＩＩを有する。ＬＩおよびＬＩＩを接合するサブドメインＳＩは、受容体タイプのいずれか１つに由来し得、またはその両方に由来する部分を有し得る。分子を含む医薬組成物、およびＥｒｂＢ感受性疾患のための方法も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
受容体チロシンキナーゼは、多くの癌の増殖を刺激することに関与する。一般的に、受容体チロシンキナーゼは、（１）特異的リガンドと結合することのできる細胞外ドメイン、（２）膜貫通ドメイン、（３）例えば、タンパク質のリン酸化によって受容体活性を調節し得る膜近傍ドメイン、（４）受容体の酵素構成要素であるチロシンキナーゼドメイン、および（５）カルボキシ末端尾部、からなる糖タンパク質である。１型受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーは、多くの固形腫瘍における細胞増殖、分化、および生存を仲介する上で重要であるため、重要なクラスの受容体の１つを構成する。この受容体ファミリーのメンバーには、ＥｒｂＢ１（ＨＥＲ１としても公知）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）を含む。１２個超のリガンドが、ＥｒｂＢ‐ファミリー受容体と相互作用する。例えば、ＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、およびアンフィレギュリンはすべて、ＥｒｂＢ１に結合する。ヘレグリンおよびＮｅｕ分化因子（ＮＤＦ）としても公知のニューレグリンのアイソフォームは、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４に対する特異的な親和性を有する。ベータセルリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ、およびエピレギュリンなどのリガンドは、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４の両方に結合する。
【背景技術】
【０００２】
ＥｒｂＢ活性化リガンドの過剰発現は、脱調節した受容体のものと類似の制御されていない細胞増殖を生じることが可能であることは明らかになりつつある。このような場合、活性化リガンドとその受容体との結合への干渉は、有効な治療戦略を提供し得、または干渉は、現行の受容体ベースの療法または他の療法を強め得る。ＥｒｂＢ３に対するリガンド結合に干渉する治療薬は、特に有効であり得る。ＥｒｂＢ３は、ＥＧＦＲファミリーにおける他の受容体とは異なっており、その理由は、ＥｒｂＢ３のチロシンキナーゼドメインが機能的に不活性であるからであるが、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３へテロ二量体は、ＥｒｂＢファミリーの任意のホモ二量体またはヘテロ二量体の組み合わせの最も強力な分裂促進シグナルを伝達する。それゆえ、ＥｒｂＢ３は重要な標的であるが、キナーゼ領域を標的にする小分子を通じて阻害されることができない。ＥｒｂＢ３が、ヘレグリンまたはＮＤＦなどの活性化リガンドを必要とするので、活性化されたヘテロ二量体が形成される前に、ＥｒｂＢ３受容体リガンドの結合に干渉することのできる分子は、ＥｒｂＢ二量体およびヘテロ二量体の形成を遮断または干渉するために使用され得る。このような分子の一例は、リガンド結合親和性を有する分子であろうし、それゆえ、リガンドを「捕捉する」ことができ、リガンドの濃度を効果的に低下させ、それによりリガンドがＥｒｂＢ３受容体を活性化させることができないようになっている。ＥｒｂＢ３リガンドに加えて、他の公知のＥｒｂＢ受容体リガンドは、様々な程度と類似の効果を有する。したがって、ＥｒｂＢリガンドの全範囲を捕捉できかつ隔離できる結合分子は、癌の治療においてさらにより使用され得る。
【０００３】
この捕捉または「デコイ」戦略を試みたいくつかの治療薬が存在する。例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（商標）（エタネルセプト‐Ａｍｇｅｎ）は、可溶性であり、炎症促進性リガンドＴＮＦαを結合および捕捉するＴＮＦＲ受容体の改変版である。加えて、ＶＥＧＦトラップと呼ばれる、ＶＥＧＦＲ１受容体およびＶＥＧＦＲ２受容体の可溶性融合タンパク質は、現在、黄斑変性症およびいくつかの形態の癌の療法の治療のための臨床治験にある（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。また、ＥｒｂＢ３トラップは、ＮＤＦで処理した細胞における二重ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２阻害薬および逆のＧＷ２９７４（ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２の小分子阻害薬）耐性の効果を増強する点で、インビトロで効力を示した。
【０００４】
現在、認可されているすべてのＥｒｂＢ阻害薬は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、または４つの受容体すべての組み合わせのいずれかを標的にする。しかしながら、複数のＥｒｂＢ受容体に対するリガンドの結合に同時に干渉する治療薬は公知ではない。明らかに、ＥｒｂＢリガンドなどの受容体リガンドを隔離し、それにより複数のＥｒｂＢ受容体に対するリガンド結合およびその後の受容体活性化を遮断するために用いることのできる新たな結合分子が必要とされる。すべての公知のＥｒｂＢリガンドを結合することのできる結合分子は、特に有用であろう。
【０００５】
いくつかの結合研究が、ＥｒｂＢ３のリガンドであるヘレグリンの結合にとって重要なＥｒｂＢ３の領域を決定するために実施された（Ｓｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６， ４４２６６−４４２７４）。キメラ受容体を用いる他の研究は、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４の細胞外ドメインのリガンド特異的シグナル伝達に対する相対的な関与を同定した（Ｋｉｍ， ｅｔ． ａｌ． （２００２）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６９， ２３２３−２３２９）。これらの研究は、ＥｒｂＢ４に対するニューレグリンの結合が、ドメインＩＩＩよりもドメインＩにおいて非常により大きく依存し、かつＥｒｂＢ１のドメインＩＩＩがＥＧＦ結合にとって主として重要であることを明らかにしている。しかしながら、これらの研究は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む受容体の全体の長さに及ぶ受容体の全長に関して実施された。これらの大きな分子は、より低い治療有効性を潜在的にもたらす製造および投与の問題を表す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６， ４４２６６−４４２７４
【非特許文献２】Ｋｉｍ， ｅｔ． ａｌ． （２００２）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６９， ２３２３−２３２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子が開示される。好ましくは、結合分子は、広範囲を、より好ましくはＥｒｂＢリガンドの全範囲を結合する。キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は一般的に、ＥｒｂＢ３または４のうちの１つに由来するサブドメインＬＩおよび、ＥｒｂＢ１など、連結された別の異なるＥｒｂＢ受容体タイプ由来のサブドメインＬＩＩを有する。サブドメインＳＩは、ＬＩおよびＬＩＩを接合するのに用いることができる。サブドメインＳＩは、受容体タイプのうちのいずれか１つに由来することができ、または療法に由来する部分を有することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ４由来のＬＩの少なくとも一部を含むことができる。ＬＩＩは、ＥｒｂＢ１由来のＳＩＩのモジュール１に連結することができる。ＳＩサブドメインは、ＬＩおよびＬＩＩサブドメインを連結させるのに用いることができ、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４のいずれかの受容体配列に由来することができあるいは両方の混合物であることができる。任意に、ＥｒｂＢキメラは、ＩｇＧ２Ｆｃなどの凝集体に融合することができる。
【０００９】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ４由来のＬＩの少なくとも一部；ＥｒｂＢ４由来の一部を有するＳＩ領域およびＥｒｂＢ１由来の一部を含むことができ、この中で、ＥｒｂＢ４部分は、２つの配列間に相同性を有する領域におけるＥｒｂＢ１部分に切り替わり；ＬＩＩの少なくとも一部は、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ１のＳＩＩのモジュール１に由来し得る。
【００１０】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部およびＥｒｂＢ１由来のＳＩＩのモジュール１に連結されたＥｒｂＢ３由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部を含む。連結領域は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはそれらの混合物に由来するＳＩドメインであり得る。
【００１１】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ３由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部を含むことができ、一部を有するＳＩ領域は、ＥｒｂＢ３に由来し、一部はＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部、およびＥｒｂＢ１由来のＳＩＩのモジュール１に由来する。
【００１２】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ４由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部を含むことができ、ＥｒｂＢ４および一部に由来する一部を有するＳＩ領域は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部、およびＥｒｂＢ１由来のＳＩＩのモジュール１に由来する。
【００１３】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ３由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部；ＥｒｂＢ３由来の一部とＥｒｂＢ１由来の一部とを有するＳＩ領域を含むことができ、この中で、ＥｒｂＢ３部分は、２つの配列；ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部、およびＥｒｂＢ１由来のＳＩＩのモジュール１の間に相同性を有する領域におけるＥｒｂＢ１部分に切り替わる。
【００１４】
また、開示されたキメラＥｒｂＢリガンド結合分子をコードするＤＮＡ配列は、発現を容易にする配列、ならびにこのようなＤＮＡ配列の維持および発現のための宿主細胞とともに企図される。
【００１５】
キメラＥｒｂＢリガンド結合分子および薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物も企図される。
【００１６】
キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は、それを、固相支持体に固定することによって用いることができ、固相支持体は順に、リガンドが、特にこのようなリガンドの過剰発現と関連した疾患に罹患している患者由来の生物学的流体から除去することができるよう、ＥｒｂＢリガンドを結合するために用いることができる。次に、ＥｒｂＢリガンドの枯渇した生物学的流体は、この患者において置き換えることができる。
【００１７】
薬学的に許容し得る賦形剤に治療有効量のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子を含む医薬組成物を投与することを包含する、ＥｒｂＢリガンドの過剰発現と関連した疾患を有する患者を治療するための方法も企図される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、キメラＥｒｂＢ４−ＥｒｂＢ１キメラのいくつかの可能性のあるサブユニット構造を示す。強調した配列は、ＥｒｂＢ４配列で開始するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子の１つの具体的な実施形態を示す。
【図２】図２は、キメラＥｒｂＢ３−ＥｒｂＢ１キメラのいくつかの可能性のあるサブユニット構造を示す。
【図３】図３は、ＥｒｂＢ１（下部配列）およびＥｒｂＢ４（上部配列）の整列化を提供する。強調したアミノ酸配列は、ＥｒｂＢ配列で開始するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子の１つの具体的な実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４の完全なヌクレオチド配列は公知であり、ＥｒｂＢ１については受入番号ＮＭ００５２２８、ＥｒｂＢ２については受入番号ＮＭ００４４４８、ＥｒｂＢ３については受入番号Ｍ２９３６６またはＮＭ００１９８２、およびＥｒｂＢ４については受入番号ＮＭ００５２３５としてＧｅｎｂａｎｋにおいて見出すことができる。ＥｒｂＢ受容体についての全長の外部ドメインである細胞外ドメインは、ＬＩ、ＣＲ１、Ｌ２、およびＣＲ２と時に呼ばれる４つのサブドメインを含み、ここで、ＬおよびＣＲは、それぞれ大きなことおよびシステインの多いことを表している。また、サブドメインは時にドメインＩ〜ＩＶとして、又はそれに代わるものとしてこのサブドメインがアミノ末端から伸びている場合、ＬＩ、ＳＩ、ＬＩＩ、およびＳＩＩとして公知である。受容体のアミノ酸配列はすでに分析されており、配列は相同であるように見え、すでに整列化されている。ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４の外部ドメインの整列化は、図１のＡおよびＢの米国特許出願公開第２００６／０２３４３４３号に提供される。
【００２０】
サブドメインは、サブ領域として公知のより小さなドメインから構成される。例えば、ＳＩサブドメインまたはＣＲＩサブドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端への方向で伸びている場合に１〜８と付番されるモジュールとして時に公知の８つのジスルフィド結合したサブ領域を含む。ＳＩＩは、１〜７と付番された７つのモジュールを含む。大きな整ったループは、モジュール５において同定されており、モジュール５は、リガンド結合部位から直接離れて突出していると考えられる。このループにおけるアミノ酸配列は高度に保存されている。
【００２１】
キメラＥｒｂＢリガンド結合分子が開示されており、この中で、サブドメインＬＩ、ＳＩ
ＬＩＩおよび、少なくとも２つの異なるＥｒｂＢ受容体由来のＳＩＩのモジュール１は、単一の結合分子において組み合わされる。この開示の目的にために、句「キメラ」は、ＥｒｂＢリガンド結合分子に関する場合、２つ以上のＥｒｂＢ受容体外部ドメインから作られるおよびその部分を含む単一のＥｒｂＢリガンド結合分子を意味するよう意図される。句「ＥｒｂＢキメラ」および「キメラＥｒｂＢリガンド結合分子」は、本出願において互換可能に用いられ、同義語でありかつ単量体のタンパク質配列を指すよう意図される。いくつかの実施形態において認めることができるように、キメラ分子は、ジスルフィド結合の形成を通じて二量体化してよい。
【００２２】
驚くべきことに、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４のアミノ酸配列の部分がＳＩ連結ドメインを通じてＥｒｂＢ１と組み合わさり、組み合わさった受容体の両方に対するリガンドを結合するキメラ結合分子を生成することができることが発見された。したがって、ＥｒｂＢ１ドメインおよびＥｒｂＢ４ドメインの組み合わせを用いて、ヘレグリン（ＥｒｂＢ４特異的リガンド）およびＴＧＦα（ＥｒｂＢ１特異的リガンド）の両方に対する親和性を有するキメラ結合分子を作製することができる。
【００２３】
１つの受容体タイプから別の受容体タイプへのアミノ酸配列における切り替えは、ＥｒｂＢリガンドの広範囲かつ高親和性結合を提供する任意の好適な位置にあることができる。いくつかの実施形態において、切り替えは、ＬＩサブドメインおよびＬＩＩサブドメインを連結するＳＩサブドメインにおいて生じることができる。いくつかの実施形態において、ＳＩサブドメインのモジュール５などにおいて、組み合わされている受容体間で、アミノ酸配列が相同または同一である領域において生じる。
【００２４】
本開示の目的のために、用語「相同性」は、本用語が当該技術分野で一般的に理解されるように、同一のまたは保存されたアミノ酸置換を有するアミノ酸の領域を意味するよう意図される。例えば、図３に示すように、ＥｒｂＢ４／ＥｒｂＢ１キメラに関して、ＥｒｂＢ４からＥｒｂＢ１への配列の切り替えは、ＥｒｂＢ４配列由来のＶＹＮＰにおいてコードする配列の後に、図３の強調された配列によって示されるように、ＥｒｂＢ１配列由来のＴＴＹＱが続くよう、ＳＩサブドメインのモジュール５において生じることができる。
【００２５】
配列は、ＥｒｂＢ１ ＬＩＩドメインへと、ＥｒｂＢ１リガンド結合に必要とされる範囲まで、延びることができる。全ＥｒｂＢ１ Ｌ１１ドメインを含むことができ、ＥｒｂＢ１由来のその後のＳＩＩ領域の一部またはすべても含むことができる。図３は、ＥｒｂＢ１のアミノ酸５０１で終端する、ＥｒｂＢ４およびＥｒｂＢ１のＬＩ、ＳＩ、ＬＩＩ、およびＳＩＩドメインのモジュール１の外部ドメインアミノ酸整列を示す。
【００２６】
図３に関して、１つのキメラＥｒｂＢ実施形態が示されており、この中で、サブドメインＬＩはＥｒｂＢ４に由来し；ＳＩ領域は、ＥｒｂＢ４のＳＩ領域の一部に由来し、モジュール５におけるＥｒｂＢ１のＳＩ領域の一部に切り替わる。この配列は、ＥｒｂＢ１ ＬＩＩサブドメインおよびＥｒｂＢ１ ＳＩＩドメインのモジュール１を含むよう続く。このことは、以下の通り指定することができる：ＬＩ（ＥｒｂＢ４）‐ＳＩ（ＥｒｂＢ４／ＥｒｂＢ１）‐ＬＩＩ（ＥｒｂＢ１）‐ＳＩＩｍ１（ＥｒｂＢ１）。より具体的には：ＬＩ（ＥｒｂＢ４アミノ酸１〜２４５）‐ＳＩ（アミノ酸２４９で開始するＥｒｂＢ１）‐ＬＩＩ（ＥｒｂＢ１）‐ＳＩ１ｍ１（天然ＥｒｂＢ１の付番に従ったアミノ酸５０１で終端するＥｒｂＢ１）である。
【００２７】
本出願におけるアミノ酸付番はすべて、天然シグナルペプチドを除外するよう意図される。
【００２８】
特定の実施形態において、ＳＩドメインは、先に示されるように、２つのサブドメインの各々の部分から構成することができる。さらに、種々の目的のためにアミノ酸配列に置換を導入することもできる。例えば、システイン‐システイン結合を通じての凝集体の形成を回避できるよう、キメラ結合分子のためのＤＮＡ配列は、システインを除去するよう変更することができる。１つのサブドメインにおけるアミノ酸の置換を用いて、リガンド結合親和性を修飾することができる。例えば、ＥｒｂＢ１由来のアミノ酸は、ＥｒｂＢ４ ＬＩサブドメインへと置換され、この分子のＥｒｂＢリガンドに対する親和性を修飾するために、ＥｒｂＢ１のそれとより類似のドメインの配列を作製することができる。同様に、ＥｒｂＢ３または４ ＬＩＩサブドメイン由来のアミノ酸置換は、ＥｒｂＢ１サブドメインへと含まれることができる。このような置換は、ＳＩサブドメインおよびＳＩＩサブドメインにおいても実施することができる。任意の数のこのような置換は、ＥｒｂＢ１由来のグルタミンから位置１３におけるＥｒｂＢ４部分のセリンへの置換を考慮することはできるが、位置４２におけるチロシンからセリンへの、位置１２３におけるアルギニンからチロシンへの置換は、代表例である。他の例は、単純に配列を比較することによって当業者によって同定することができる。相同ではない置換も考慮することができる。例えば、アスパラギンは、ＥｒｂＢ１において認められるグルタミンよりもむしろ位置１３におけるセリンに置換され得、または両受容体において認められる残基の中間的な特徴を有する残基を用いてよい。
【００２９】
また、これらの任意のキメラ分子は、（任意の増殖因子受容体ファミリーの）他のキメラ受容体を含む他の分子もしくはその部分に、または産物の精製を容易にする配列に融合し得る。ＤＮＡ配列は、商業的ソースから得ることができ、任意の好適な発現ベクターに配置することができ、その多くが公知である好適な宿主から発現させることができる。
【００３０】
一実施形態において、ＥｒｂＢキメラは、凝集体抱合体形成を生じさせる構成要素またはタンパク質の半減期を延長する構成要素と融合することができる。例えば、ＥｒｂＢキメラは、ＩｇＧのＦｃ領域など、免疫グロブリン分子の定常領域に融合することができる。本開示の目的のために、１つの好適なＦｃ領域は、ＩｇＧ２Ｆｃとして公知であるが、他のものも当該技術分野で公知であり、用いることができる。
【００３１】
本出願の目的において、好適な結合親和性とは、生理学的マトリックスにおけるＥｒｂＢリガンドを結合するのに十分高い親和性である。好ましくは、解離定数は、天然の受容体の解離定数を約１０倍〜約１００倍以下で超える。より好ましくは、ＥｒｂＢキメラについての解離定数は、その天然受容体対応物の１０倍以内であり、より好ましくは同程度内である。最も好ましくは、キメラ分子の結合親和性は、天然の対応物と識別できない。ＥｒｂＢリガンドを結合および隔離し、それによりＥｒｂＢ受容体を結合および活性化させるリガンド結合を防止または干渉するのに十分な任意の親和性は、使用に好適であり、開示された方法における使用を見出すことができる。結合分子の阻害薬の効力についての代わりである結合親和性は、バイオセンサーテクノロジーを用いて、または当該技術分野で周知のＥＬＩＳＡなどの古典的な結合アッセイによって測定することができる。
【００３２】
キメラＥｒｂＢリガンド結合分子配列をコードするＤＮＡも企図される。当業者は、遺伝暗号を用いて、好適なＤＮＡ配列を調製することができ、また、特異的発現宿主に対するコドン優先性がこのような配列に組み込めることを認識することができる。また、これらの配列との使用について企図されるのは、これらのＤＮＡ配列の発現に用いることのできる追加的なＤＮＡ配列である。種々のこれらは公知である。当該技術分野で周知のように、このような配列はまた、ＤＮＡの維持のためにおよびその発現のために宿主細胞へと導入することができ、これらのＤＮＡ配列を含むこのような宿主も企図される。
【００３３】
開示されたキメラＥｒｂＢリガンド結合分子を含む医薬組成物も企図される。このような組成物は、治療有効量のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子と、薬学的に許容し得る担体とを含む。用語「薬学的に許容し得る」は、連邦政府もしくは州政府の監督機関によって認可されたもの、または米国薬局方もしくは、哺乳類における、特にヒトにおける使用のための一般的に認識される他の薬局方において列挙されたものを意味する。用語「担体」は、治療薬が中に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、水および油などの滅菌性液体であり得、石油、動物、植物、または合成の起源のものを含み、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油、およびそれらに類するものである。好適な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、ならびにこれらに類する、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子が可溶性であり化学的に安定であるものを含む。また、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤、およびこれらに類するものの形態をとることができる。薬学的に許容し得る担体には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、およびＤＯＰＣなど、製剤における使用のための他の成分を含む。天然のまたは合成の界面活性剤を用いてよい。ＰＥＧを用いてよい（にもかかわらず、タンパク質またはアナログを誘導体化する上でのその使用を除く。）。シクロデキストランなどのデキストランを用いてよい。セルロースおよびセルロース誘導体を用いてよい。アミノ酸を、緩衝製剤における使用など、用いてよい。薬学的に許容し得る希釈剤には、種々の内容物（例えば、トリス‐ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨ、およびイオン強度を有する緩衝液；界面活性剤及び可溶化剤（例えば、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、ベンジルアルコール）、および増量性物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加物；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状調製物への、またはリポソームへの材料の組み込みを含む。また、ヒアルロン酸を用いてよく、これは、循環における持続時間を延長する効果を有し得る。このような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、インビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば、引用により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ． （１９９０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ １８０４２） ｐａｇｅｓ １４３５−１７１２を参照されたい。組成物は、液状で調製され得、または凍結乾燥した形態など、乾燥した粉末で存在し得る。また、経皮製剤のような埋め込み可能な徐放性製剤も企図される。リポソーム、ミクロカプセルもしくはミクロスフェア、封入複合体、または他の種類の担体も企図される。
【００３４】
活性型キメラ結合分子の意図された治療用途に有効な量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、インビトロでのアッセイを任意に採用して、最適な薬用量範囲を同定するのを助け得る。一般的に、１日の投与計画は、体重の活性薬（ＡＰＩ）キログラムの０．１〜１０００マイクログラムの範囲、好ましくは、キログラムあたり０．１〜１５０マイクログラムであるべきである。有効量は、インビトロまたは好適な動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から外挿され得る。薬用量および間隔は、治療効果を維持するのに十分な化合物の血漿レベルを提供するよう個々に調整され得る。局所投与または選択的取り込みの場合、化合物の有効な局所濃度は、血漿濃度と関連していなくてよい。治療のための方法に関与する薬用量投与計画は、薬剤の作用を修飾する種々の因子、例えば、患者の齢、容態、体重、性別、および食事、疾患の重症度、投与回数、ならびに他の臨床因子を考慮して、担当医によって決定することができる。
【００３５】
もちろん、投与される化合物の量は、治療される対象、対象の体重、苦痛の重症度、投与の様式、処方医の判断によるであろう。症状が検出可能な間、または症状が検出できない場合でさえ、療法は、間欠的に反復されてよい。療法は、単独でまたは他の薬剤との併用で提供され得る。
【００３６】
ＥｒｂＢリガンドを結合し、癌細胞のＥｒｂＢ受容体形に及ぼすリガンドの相互作用および効果に干渉するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子を得ること、ならびに治療有効量の分子を患者に投与することを含む、治療を必要とする患者を治療するための方法が開示される。投与は、静脈内投与、注射器もしくはカテーテルなどを通じての固形腫瘍への直接的な注入などの非経口的経路によって、または腹腔内注射によってであり得る。
【００３７】
治療の一方法において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は、標準的な方法によって、アフェレーシス支持体またはバイオコア（ｂｉｏｃｏｒｅ）支持体などの固形支持体に固定することができる。結合分子が固形支持体に結合すると、患者の血清、血液、または他の生物学的に関連のある流体は、アフェレーシスカラムにおける固形支持体と接触するよう配置され、流体からＥｒｂＢリガンドを除去することができる。次に、血清、血液、または流体は、患者へと再導入できる。
【００３８】
また、結合分子は、併用療法において用いることができる。したがって、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は、化学療養薬、手術、カテーテル装置、および放射線を含む、１つ以上の追加的な化合物または療法との併用で投与され得る。併用療法には、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子および１つ以上の追加薬を含む単一の医薬剤形の投与を含む。キメラＥｒｂＢリガンド結合分子および１つ以上の追加薬は、それ自体個別の医薬剤形で、または同じ製剤において投与することができる。例えば、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子と、細胞傷害薬、化学療法薬、もしくは増殖阻害薬とが、単一の薬用量組成物において互いに患者に投与することができるかまたは、各薬剤は、個別の剤形で投与することができる。より具体的には、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は、ラパチニブ（登録商標）、ハーセプチン（登録商標）、エルビタックス（登録商標）、およびこれらに類するものなどの治療薬を含む併用療法において用いることができる。個別の剤形を用いる場合、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子および１つ以上の追加薬は同時に、または個別にずらした時刻で、すなわち連続して投与することができる。当業者は、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子が、組み合わせにおける第二の治療薬に干渉しないがむしろ強めるよう、組み合わせが存在しなければならないことを認識することができる。
【００３９】
以下の実施例は、説明のためにのみ与えられ、本出願の対象事項を制限するものとして解釈されるためではない。以下の実施例において、開示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列も企図される。以下の実施例の多くは、ＥｒｂＢキメラに融合したＩｇＧ２Ｆｃについての配列を開示する。ＩｇＧＦｃの使用が任意であることは認識されるべきである。加えて、あるアミノ酸と、リガンド結合活性に実質的に（約１０倍）干渉しない別の類似のアミノ酸との保存的置換は、具体的に企図される。精製された生成物の従来の結合研究を用いて、結合親和性における実質的な差が存在するかどうかを決定することができる。下記に説明される構造の多くは、図１および図２における構造の線図に対する引用により、より十分に理解することができる。すべての配列には、マウス抗体重鎖遺伝子由来のシグナルペプチドを含む。すべての付番はシグナルペプチドを除外しており、各ＥｒｂＢ配列の第一のアミノ酸に下線を付している。
【実施例】
【００４０】
（実施例１）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＥｒｂＢ１ ＳＩＩサブドメインのモジュール１における残基５０１の後に終端するＥｒｂＢ１受容体のＬＩＩサブドメインに接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを具体的に開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する。
【化１】
【００４１】
（実施例２）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインならびにＥｒｂＢ１ ＳＩＩサブドメインのモジュール１における残基５０１後に終端するＥｂＢ１受容体のＬＩＩサブドメインに接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを具体的に開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２】
【００４２】
（実施例３）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜２、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール３〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化３】
【００４３】
（実施例４）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜３ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＳＩサブドメインのモジュール４〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化４】
【００４４】
（実施例５）
本実施例は、ＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール５〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１とともに、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜４に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化５】
【００４５】
（実施例６）
本実施例は、ＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール６〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１とともに、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜５に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化６】
【００４６】
（実施例７）
本実施例は、ＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール７〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１とともに、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜６に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを説明する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化７】
【００４７】
（実施例８）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜７、ならびにＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化８】
【００４８】
（実施例９）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール２〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化９】
【００４９】
（実施例１０）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメイン、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１０】
【００５０】
（実施例１１）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメイン、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＬＩＩサブドメインおよびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１１】
【００５１】
（実施例１２）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜２、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインモジュール３〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラに言及する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１２】
【００５２】
（実施例１３）
ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜３、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール４〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラに言及する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１３】
【００５３】
（実施例１４）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜４、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール５〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１４】
【００５４】
（実施例１５）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜５、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＳＩサブドメインのモジュール６〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１５】
【００５５】
（実施例１６）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜６、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール７〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラに言及する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１６】
【００５６】
（実施例１７）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜７、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラに言及する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１７】
【００５７】
（実施例１８）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＳＩサブドメインのモジュール２〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。キメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１８】
【００５８】
（実施例１９）
本実施例は、（図３の整列におけるＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸残基２４５を通じての）ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜５、ならびに（図３の整列におけるＥｒｂＢ１のアミノ酸残基２４９で開始する）ＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール５〜８、ＳＩＩサブドメインにおけるアミノ酸５０１の後ろでＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＬＩＩサブドメインおよびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。キメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１９】
【００５９】
（実施例２０）
本実施例は、（図３の整列におけるＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸残基２４５を通じての）ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜５、ならびに（図３の整列におけるＥｒｂＢ１受容体のアミノ酸残基２４９で開始する）ＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール５〜８、ＳＩＩサブドメインにおけるアミノ酸５０１の後ろでＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＬＩＩサブドメインおよびＳＩＩサブドメインのモジュール１を含むキメラを開示する。アミノ酸２４５は、ＥｒｂＢ４受容体の付番に基づいているのに対し、アミノ酸２４９および５０１は、ＥｒｂＢ１受容体の付番に基づいている。加えて、この配列は、ＩｇＧ２Ｆｃのヒンジ領域における２つのシステイン（Ｃｙｓ）からセリン（Ｓｅｒ）への置換を含む。これらの置換は、ＩｇＧ２Ｆｃタンパク質の付番に基づいたＣ２２６ＳおよびＣ２２９Ｓであり、以下で下線を付されている。キメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２０】
【００６０】
（実施例２１）
本実施例は、両方の受容体に対するリガンドについての実質的な結合親和性を有するＥｒｂＢキメラが、２つの異なるＥｒｂＢ受容体の選択的な組み合わせから作ることができることを示す。ＨＲＧ１βおよびＴＧＦαへの結合について、本実施例の目的のためにＥ１／Ｅ４−Ｆｃと命名された実施例１９由来のコンストラクト（配列番号１９）、およびＥ１／Ｅ４−ＭＦｃと命名された実施例２０由来のコンストラクト（配列番号２０）を含む４つのコンストラクトを試験した。対照は、Ｅ１と命名された、ＩｇＧ２Ｆｃ部分に接合したＥｒｂＢ１のアミノ酸１〜５０１、およびＥ４と命名された、ＩｇＧ２Ｆｃ部分に接合したＥｒｂＢ４のアミノ酸１〜４９７を含んだ。いくつかの研究において、別のＥ１対照を用いた。
【００６１】
トラップＤＮＡ分子を、所望のアミノ酸配列で開始し、哺乳類系の発現についてＤＮＡ配列を最適化することによって合成した。トラップＤＮＡ配列を、ハイグロマイシンを用いて選択でき、かつＭＡＲ／ＳＡＲ配列（絶縁因子および境界領域）ならびにトラップ発現のためのプロモーターおよびエンハンサーを含む好適な哺乳類発現ベクター（ｐＣｐＧｆｒｅｅ‐ｖｉｔｒｏＨｍｅｓ）へとクローニングした。トラップ配列を含むベクターを標準的なトランスフェクション法によってＣＨＯ細胞へとトランスフェクトし、細胞をベクターの組み込みのためにハイグロマイシンを用いて選択した。細胞培地を回収し、標準的な方法（プロテインＡカラム結合）によって精製することによって、安定してトランスフェクトされた細胞株からトラップを精製した。トラップを標準的な方法によってプロテインＡから溶出し、従来法由来のＩｇＧ‐ＦｃサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて定量化した。
【００６２】
トラップを、プロテインＡを用いて精製し、非還元条件（ＮＲ）および還元条件（Ｒ）の下で、ポリアクリルアミドゲル泳動を実施した。ジスルフィド連結した二量体は、およそ２２０〜２４０ｋＤａに泳動したのに対し、還元型単量体は１２０〜１３０ｋＤａに泳動した。ジスルフィド形成を防止する突然変異型システインを有するキメラトラップ単量体は、非還元条件下および還元条件下の両方でおよそ１２０〜１３０ｋＤａに泳動する。Ｅ１‐Ｆｃ、Ｅ４‐Ｆｃ、Ｅ１／Ｅ４‐Ｆｃは、非還元条件下で泳動する場合、２２０〜２４０ｋＤａの範囲に、還元条件下で泳動する場合、約１２０〜１３０の範囲にあるように見えた。Ｅ１／Ｅ４‐Ｆｃコンストラクトは、非還元条件下および還元条件下の両方で約１２０〜１３０の分子量を有すると思われる。
【００６３】
精製済みトラップ分子を９６ウェルプレートにコーティングし、ＴＧＦαまたはＨＲＧ１βのいずれかとともにインキュベートした。次に、ＴＧＦαまたはＨＲＧ１βに対する検出抗体を用いて、結合したリガンドの親和性（Ｋｄ）および量（Ｂｍａｘ）を測定した。
【００６４】
トラップを９６ウェルプレートにコーティングし、各種濃度のＴＧＦαまたはＨＲＧ１ベータのいずれかとともにインキュベートした。ＴＧＦαまたはＨＲＧ１βに対する検出抗体を用いて、結合したリガンドの親和性（Ｋｄ）および量（Ｂｍａｘ）を測定した。これらの研究において得られたデータを下記の表１〜４に提供する。
【００６５】
表１および表２において示されるように、キメラ単量体（Ｅ１／Ｅ４‐Ｆｃ）は、約４００〜６２０ｎＭの範囲の親和性でＴＧＦαを結合し、ＥｒｂＢ１‐ＩｇＧＦｃ（Ｅ１‐Ｆｃ）は、約２７〜４０ｎＭの範囲の親和性（Ｋｄ）で結合した。
【表１】
【表２】
【００６６】
表３および表４に示すように、キメラ単量体（Ｅ１／Ｅ４‐Ｆｃ）は、約およそ１５〜３０ｎＭの範囲の親和性でＨＲＧ１βを結合し、このことは、ＥｒｂＢ４‐ＩｇＧＦｃ（Ｅ４‐Ｆｃ）と本質的に同じであった。
【表３】
【表４】
【００６７】
Ｅ１／Ｅ４‐ＭＦｃ５０％データ点は、精製済みキメラ受容体の量の半分をウェルに添加すると、その結合が半分ほど低下し、それゆえ、結合が、添加した受容体の量に比例することを示す。
【００６８】
本実施例は、ＥｒｂＢキメラ受容体下位構成要素の両方に対するリガンドについての実質的な親和性を有するＥｒｂＢキメラを作製および精製することができることを示す。さらに、本実施例は、突然変異をキメラ受容体結合分子に導入して、ジスルフィドを変化させ、ジスルフィド結合形成を通じての二量体の形成を防止することができることを示す。
【００６９】
（実施例２２）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸１〜２４５およびＥｒｂＢ１受容体のアミノ酸２４９〜５０１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。また、融合には、先の配列にあるようにＩｇＧ２‐Ｆｃを含む。また、この配列に組み込まれているのは、位置１３におけるグルタミンとセリンとの置換、および分子のジスルフィドベースの二量体化を防止する、実施例２０由来のシステインからセリンへの２つの修飾である。位置１３におけるグルタミン（以下で下線）は、その位置のＥｒｂＢ１配列において認められ、ＴＧＦαに対するキメラの親和性を増大させるために配列に組み込まれる。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２１】
【００７０】
（実施例２３）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸１〜２４５およびＥｒｂＢ１受容体のアミノ酸２４９〜５０１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。また、融合には、先の配列にあるようにＩｇＧ２‐Ｆｃを含む。また、この配列に組み込まれているのは、位置４２におけるチロシンとセリンとの置換、および分子のジスルフィドベースの二量体化を防止する、実施例２０由来のシステインからセリンへの２つの修飾である。位置４２におけるチロシン（以下で下線）は、その位置のＥｒｂＢ１配列において認められ、ＴＧＦαに対するキメラの親和性を増大させるために配列に組み込まれる。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２２】
【００７１】
（実施例２４）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸１〜２４５およびＥｒｂＢ１受容体のアミノ酸２４９〜５０１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。また、融合には、先の配列にあるようにＩｇＧ２‐Ｆｃを含む。また、この配列に組み込まれているのは、位置１２３におけるアルギニンとチロシンとの置換（下線）、および分子のジスルフィドベースの二量体化を防止する、実施例２０由来のシステインからセリンへの２つの修飾である。位置１２３におけるアルギニンは、その位置のＥｒｂＢ１配列において認められ、ＴＧＦαに対するキメラの親和性を増大させるために配列に組み込まれる。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２３】
【００７２】
（実施例２５）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸１〜１８３およびＥｒｂＢ１受容体のアミノ酸１８７〜５０１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。この配列は、二量体化を防止するためにＩｇＧ２Ｆｃ領域にシステインからセリンへの２つの修飾を含むこと以外は、実施例１８における配列と本質的に同じである。この融合は、ＴＧＦαに対するキメラの親和性を増大させるためにより多くのＥｒｂＢ１配列を含む。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２４】
【技術分野】
【０００１】
受容体チロシンキナーゼは、多くの癌の増殖を刺激することに関与する。一般的に、受容体チロシンキナーゼは、（１）特異的リガンドと結合することのできる細胞外ドメイン、（２）膜貫通ドメイン、（３）例えば、タンパク質のリン酸化によって受容体活性を調節し得る膜近傍ドメイン、（４）受容体の酵素構成要素であるチロシンキナーゼドメイン、および（５）カルボキシ末端尾部、からなる糖タンパク質である。１型受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーは、多くの固形腫瘍における細胞増殖、分化、および生存を仲介する上で重要であるため、重要なクラスの受容体の１つを構成する。この受容体ファミリーのメンバーには、ＥｒｂＢ１（ＨＥＲ１としても公知）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）を含む。１２個超のリガンドが、ＥｒｂＢ‐ファミリー受容体と相互作用する。例えば、ＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、およびアンフィレギュリンはすべて、ＥｒｂＢ１に結合する。ヘレグリンおよびＮｅｕ分化因子（ＮＤＦ）としても公知のニューレグリンのアイソフォームは、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４に対する特異的な親和性を有する。ベータセルリン、ヘパリン結合性ＥＧＦ、およびエピレギュリンなどのリガンドは、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４の両方に結合する。
【背景技術】
【０００２】
ＥｒｂＢ活性化リガンドの過剰発現は、脱調節した受容体のものと類似の制御されていない細胞増殖を生じることが可能であることは明らかになりつつある。このような場合、活性化リガンドとその受容体との結合への干渉は、有効な治療戦略を提供し得、または干渉は、現行の受容体ベースの療法または他の療法を強め得る。ＥｒｂＢ３に対するリガンド結合に干渉する治療薬は、特に有効であり得る。ＥｒｂＢ３は、ＥＧＦＲファミリーにおける他の受容体とは異なっており、その理由は、ＥｒｂＢ３のチロシンキナーゼドメインが機能的に不活性であるからであるが、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３へテロ二量体は、ＥｒｂＢファミリーの任意のホモ二量体またはヘテロ二量体の組み合わせの最も強力な分裂促進シグナルを伝達する。それゆえ、ＥｒｂＢ３は重要な標的であるが、キナーゼ領域を標的にする小分子を通じて阻害されることができない。ＥｒｂＢ３が、ヘレグリンまたはＮＤＦなどの活性化リガンドを必要とするので、活性化されたヘテロ二量体が形成される前に、ＥｒｂＢ３受容体リガンドの結合に干渉することのできる分子は、ＥｒｂＢ二量体およびヘテロ二量体の形成を遮断または干渉するために使用され得る。このような分子の一例は、リガンド結合親和性を有する分子であろうし、それゆえ、リガンドを「捕捉する」ことができ、リガンドの濃度を効果的に低下させ、それによりリガンドがＥｒｂＢ３受容体を活性化させることができないようになっている。ＥｒｂＢ３リガンドに加えて、他の公知のＥｒｂＢ受容体リガンドは、様々な程度と類似の効果を有する。したがって、ＥｒｂＢリガンドの全範囲を捕捉できかつ隔離できる結合分子は、癌の治療においてさらにより使用され得る。
【０００３】
この捕捉または「デコイ」戦略を試みたいくつかの治療薬が存在する。例えば、Ｅｎｂｒｅｌ（商標）（エタネルセプト‐Ａｍｇｅｎ）は、可溶性であり、炎症促進性リガンドＴＮＦαを結合および捕捉するＴＮＦＲ受容体の改変版である。加えて、ＶＥＧＦトラップと呼ばれる、ＶＥＧＦＲ１受容体およびＶＥＧＦＲ２受容体の可溶性融合タンパク質は、現在、黄斑変性症およびいくつかの形態の癌の療法の治療のための臨床治験にある（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。また、ＥｒｂＢ３トラップは、ＮＤＦで処理した細胞における二重ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２阻害薬および逆のＧＷ２９７４（ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ２の小分子阻害薬）耐性の効果を増強する点で、インビトロで効力を示した。
【０００４】
現在、認可されているすべてのＥｒｂＢ阻害薬は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、または４つの受容体すべての組み合わせのいずれかを標的にする。しかしながら、複数のＥｒｂＢ受容体に対するリガンドの結合に同時に干渉する治療薬は公知ではない。明らかに、ＥｒｂＢリガンドなどの受容体リガンドを隔離し、それにより複数のＥｒｂＢ受容体に対するリガンド結合およびその後の受容体活性化を遮断するために用いることのできる新たな結合分子が必要とされる。すべての公知のＥｒｂＢリガンドを結合することのできる結合分子は、特に有用であろう。
【０００５】
いくつかの結合研究が、ＥｒｂＢ３のリガンドであるヘレグリンの結合にとって重要なＥｒｂＢ３の領域を決定するために実施された（Ｓｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６， ４４２６６−４４２７４）。キメラ受容体を用いる他の研究は、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ４の細胞外ドメインのリガンド特異的シグナル伝達に対する相対的な関与を同定した（Ｋｉｍ， ｅｔ． ａｌ． （２００２）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６９， ２３２３−２３２９）。これらの研究は、ＥｒｂＢ４に対するニューレグリンの結合が、ドメインＩＩＩよりもドメインＩにおいて非常により大きく依存し、かつＥｒｂＢ１のドメインＩＩＩがＥＧＦ結合にとって主として重要であることを明らかにしている。しかしながら、これらの研究は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む受容体の全体の長さに及ぶ受容体の全長に関して実施された。これらの大きな分子は、より低い治療有効性を潜在的にもたらす製造および投与の問題を表す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ． （２００１）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６， ４４２６６−４４２７４
【非特許文献２】Ｋｉｍ， ｅｔ． ａｌ． （２００２）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６９， ２３２３−２３２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子が開示される。好ましくは、結合分子は、広範囲を、より好ましくはＥｒｂＢリガンドの全範囲を結合する。キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は一般的に、ＥｒｂＢ３または４のうちの１つに由来するサブドメインＬＩおよび、ＥｒｂＢ１など、連結された別の異なるＥｒｂＢ受容体タイプ由来のサブドメインＬＩＩを有する。サブドメインＳＩは、ＬＩおよびＬＩＩを接合するのに用いることができる。サブドメインＳＩは、受容体タイプのうちのいずれか１つに由来することができ、または療法に由来する部分を有することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ４由来のＬＩの少なくとも一部を含むことができる。ＬＩＩは、ＥｒｂＢ１由来のＳＩＩのモジュール１に連結することができる。ＳＩサブドメインは、ＬＩおよびＬＩＩサブドメインを連結させるのに用いることができ、ＥｒｂＢ１またはＥｒｂＢ４のいずれかの受容体配列に由来することができあるいは両方の混合物であることができる。任意に、ＥｒｂＢキメラは、ＩｇＧ２Ｆｃなどの凝集体に融合することができる。
【０００９】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ４由来のＬＩの少なくとも一部；ＥｒｂＢ４由来の一部を有するＳＩ領域およびＥｒｂＢ１由来の一部を含むことができ、この中で、ＥｒｂＢ４部分は、２つの配列間に相同性を有する領域におけるＥｒｂＢ１部分に切り替わり；ＬＩＩの少なくとも一部は、ＥｒｂＢ１およびＥｒｂＢ１のＳＩＩのモジュール１に由来し得る。
【００１０】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部およびＥｒｂＢ１由来のＳＩＩのモジュール１に連結されたＥｒｂＢ３由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部を含む。連結領域は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはそれらの混合物に由来するＳＩドメインであり得る。
【００１１】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ３由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部を含むことができ、一部を有するＳＩ領域は、ＥｒｂＢ３に由来し、一部はＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部、およびＥｒｂＢ１由来のＳＩＩのモジュール１に由来する。
【００１２】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ４由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部を含むことができ、ＥｒｂＢ４および一部に由来する一部を有するＳＩ領域は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部、およびＥｒｂＢ１由来のＳＩＩのモジュール１に由来する。
【００１３】
一実施形態において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子には、ＥｒｂＢ３由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部；ＥｒｂＢ３由来の一部とＥｒｂＢ１由来の一部とを有するＳＩ領域を含むことができ、この中で、ＥｒｂＢ３部分は、２つの配列；ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部、およびＥｒｂＢ１由来のＳＩＩのモジュール１の間に相同性を有する領域におけるＥｒｂＢ１部分に切り替わる。
【００１４】
また、開示されたキメラＥｒｂＢリガンド結合分子をコードするＤＮＡ配列は、発現を容易にする配列、ならびにこのようなＤＮＡ配列の維持および発現のための宿主細胞とともに企図される。
【００１５】
キメラＥｒｂＢリガンド結合分子および薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物も企図される。
【００１６】
キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は、それを、固相支持体に固定することによって用いることができ、固相支持体は順に、リガンドが、特にこのようなリガンドの過剰発現と関連した疾患に罹患している患者由来の生物学的流体から除去することができるよう、ＥｒｂＢリガンドを結合するために用いることができる。次に、ＥｒｂＢリガンドの枯渇した生物学的流体は、この患者において置き換えることができる。
【００１７】
薬学的に許容し得る賦形剤に治療有効量のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子を含む医薬組成物を投与することを包含する、ＥｒｂＢリガンドの過剰発現と関連した疾患を有する患者を治療するための方法も企図される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、キメラＥｒｂＢ４−ＥｒｂＢ１キメラのいくつかの可能性のあるサブユニット構造を示す。強調した配列は、ＥｒｂＢ４配列で開始するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子の１つの具体的な実施形態を示す。
【図２】図２は、キメラＥｒｂＢ３−ＥｒｂＢ１キメラのいくつかの可能性のあるサブユニット構造を示す。
【図３】図３は、ＥｒｂＢ１（下部配列）およびＥｒｂＢ４（上部配列）の整列化を提供する。強調したアミノ酸配列は、ＥｒｂＢ配列で開始するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子の１つの具体的な実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４の完全なヌクレオチド配列は公知であり、ＥｒｂＢ１については受入番号ＮＭ００５２２８、ＥｒｂＢ２については受入番号ＮＭ００４４４８、ＥｒｂＢ３については受入番号Ｍ２９３６６またはＮＭ００１９８２、およびＥｒｂＢ４については受入番号ＮＭ００５２３５としてＧｅｎｂａｎｋにおいて見出すことができる。ＥｒｂＢ受容体についての全長の外部ドメインである細胞外ドメインは、ＬＩ、ＣＲ１、Ｌ２、およびＣＲ２と時に呼ばれる４つのサブドメインを含み、ここで、ＬおよびＣＲは、それぞれ大きなことおよびシステインの多いことを表している。また、サブドメインは時にドメインＩ〜ＩＶとして、又はそれに代わるものとしてこのサブドメインがアミノ末端から伸びている場合、ＬＩ、ＳＩ、ＬＩＩ、およびＳＩＩとして公知である。受容体のアミノ酸配列はすでに分析されており、配列は相同であるように見え、すでに整列化されている。ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４の外部ドメインの整列化は、図１のＡおよびＢの米国特許出願公開第２００６／０２３４３４３号に提供される。
【００２０】
サブドメインは、サブ領域として公知のより小さなドメインから構成される。例えば、ＳＩサブドメインまたはＣＲＩサブドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端への方向で伸びている場合に１〜８と付番されるモジュールとして時に公知の８つのジスルフィド結合したサブ領域を含む。ＳＩＩは、１〜７と付番された７つのモジュールを含む。大きな整ったループは、モジュール５において同定されており、モジュール５は、リガンド結合部位から直接離れて突出していると考えられる。このループにおけるアミノ酸配列は高度に保存されている。
【００２１】
キメラＥｒｂＢリガンド結合分子が開示されており、この中で、サブドメインＬＩ、ＳＩ
ＬＩＩおよび、少なくとも２つの異なるＥｒｂＢ受容体由来のＳＩＩのモジュール１は、単一の結合分子において組み合わされる。この開示の目的にために、句「キメラ」は、ＥｒｂＢリガンド結合分子に関する場合、２つ以上のＥｒｂＢ受容体外部ドメインから作られるおよびその部分を含む単一のＥｒｂＢリガンド結合分子を意味するよう意図される。句「ＥｒｂＢキメラ」および「キメラＥｒｂＢリガンド結合分子」は、本出願において互換可能に用いられ、同義語でありかつ単量体のタンパク質配列を指すよう意図される。いくつかの実施形態において認めることができるように、キメラ分子は、ジスルフィド結合の形成を通じて二量体化してよい。
【００２２】
驚くべきことに、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４のアミノ酸配列の部分がＳＩ連結ドメインを通じてＥｒｂＢ１と組み合わさり、組み合わさった受容体の両方に対するリガンドを結合するキメラ結合分子を生成することができることが発見された。したがって、ＥｒｂＢ１ドメインおよびＥｒｂＢ４ドメインの組み合わせを用いて、ヘレグリン（ＥｒｂＢ４特異的リガンド）およびＴＧＦα（ＥｒｂＢ１特異的リガンド）の両方に対する親和性を有するキメラ結合分子を作製することができる。
【００２３】
１つの受容体タイプから別の受容体タイプへのアミノ酸配列における切り替えは、ＥｒｂＢリガンドの広範囲かつ高親和性結合を提供する任意の好適な位置にあることができる。いくつかの実施形態において、切り替えは、ＬＩサブドメインおよびＬＩＩサブドメインを連結するＳＩサブドメインにおいて生じることができる。いくつかの実施形態において、ＳＩサブドメインのモジュール５などにおいて、組み合わされている受容体間で、アミノ酸配列が相同または同一である領域において生じる。
【００２４】
本開示の目的のために、用語「相同性」は、本用語が当該技術分野で一般的に理解されるように、同一のまたは保存されたアミノ酸置換を有するアミノ酸の領域を意味するよう意図される。例えば、図３に示すように、ＥｒｂＢ４／ＥｒｂＢ１キメラに関して、ＥｒｂＢ４からＥｒｂＢ１への配列の切り替えは、ＥｒｂＢ４配列由来のＶＹＮＰにおいてコードする配列の後に、図３の強調された配列によって示されるように、ＥｒｂＢ１配列由来のＴＴＹＱが続くよう、ＳＩサブドメインのモジュール５において生じることができる。
【００２５】
配列は、ＥｒｂＢ１ ＬＩＩドメインへと、ＥｒｂＢ１リガンド結合に必要とされる範囲まで、延びることができる。全ＥｒｂＢ１ Ｌ１１ドメインを含むことができ、ＥｒｂＢ１由来のその後のＳＩＩ領域の一部またはすべても含むことができる。図３は、ＥｒｂＢ１のアミノ酸５０１で終端する、ＥｒｂＢ４およびＥｒｂＢ１のＬＩ、ＳＩ、ＬＩＩ、およびＳＩＩドメインのモジュール１の外部ドメインアミノ酸整列を示す。
【００２６】
図３に関して、１つのキメラＥｒｂＢ実施形態が示されており、この中で、サブドメインＬＩはＥｒｂＢ４に由来し；ＳＩ領域は、ＥｒｂＢ４のＳＩ領域の一部に由来し、モジュール５におけるＥｒｂＢ１のＳＩ領域の一部に切り替わる。この配列は、ＥｒｂＢ１ ＬＩＩサブドメインおよびＥｒｂＢ１ ＳＩＩドメインのモジュール１を含むよう続く。このことは、以下の通り指定することができる：ＬＩ（ＥｒｂＢ４）‐ＳＩ（ＥｒｂＢ４／ＥｒｂＢ１）‐ＬＩＩ（ＥｒｂＢ１）‐ＳＩＩｍ１（ＥｒｂＢ１）。より具体的には：ＬＩ（ＥｒｂＢ４アミノ酸１〜２４５）‐ＳＩ（アミノ酸２４９で開始するＥｒｂＢ１）‐ＬＩＩ（ＥｒｂＢ１）‐ＳＩ１ｍ１（天然ＥｒｂＢ１の付番に従ったアミノ酸５０１で終端するＥｒｂＢ１）である。
【００２７】
本出願におけるアミノ酸付番はすべて、天然シグナルペプチドを除外するよう意図される。
【００２８】
特定の実施形態において、ＳＩドメインは、先に示されるように、２つのサブドメインの各々の部分から構成することができる。さらに、種々の目的のためにアミノ酸配列に置換を導入することもできる。例えば、システイン‐システイン結合を通じての凝集体の形成を回避できるよう、キメラ結合分子のためのＤＮＡ配列は、システインを除去するよう変更することができる。１つのサブドメインにおけるアミノ酸の置換を用いて、リガンド結合親和性を修飾することができる。例えば、ＥｒｂＢ１由来のアミノ酸は、ＥｒｂＢ４ ＬＩサブドメインへと置換され、この分子のＥｒｂＢリガンドに対する親和性を修飾するために、ＥｒｂＢ１のそれとより類似のドメインの配列を作製することができる。同様に、ＥｒｂＢ３または４ ＬＩＩサブドメイン由来のアミノ酸置換は、ＥｒｂＢ１サブドメインへと含まれることができる。このような置換は、ＳＩサブドメインおよびＳＩＩサブドメインにおいても実施することができる。任意の数のこのような置換は、ＥｒｂＢ１由来のグルタミンから位置１３におけるＥｒｂＢ４部分のセリンへの置換を考慮することはできるが、位置４２におけるチロシンからセリンへの、位置１２３におけるアルギニンからチロシンへの置換は、代表例である。他の例は、単純に配列を比較することによって当業者によって同定することができる。相同ではない置換も考慮することができる。例えば、アスパラギンは、ＥｒｂＢ１において認められるグルタミンよりもむしろ位置１３におけるセリンに置換され得、または両受容体において認められる残基の中間的な特徴を有する残基を用いてよい。
【００２９】
また、これらの任意のキメラ分子は、（任意の増殖因子受容体ファミリーの）他のキメラ受容体を含む他の分子もしくはその部分に、または産物の精製を容易にする配列に融合し得る。ＤＮＡ配列は、商業的ソースから得ることができ、任意の好適な発現ベクターに配置することができ、その多くが公知である好適な宿主から発現させることができる。
【００３０】
一実施形態において、ＥｒｂＢキメラは、凝集体抱合体形成を生じさせる構成要素またはタンパク質の半減期を延長する構成要素と融合することができる。例えば、ＥｒｂＢキメラは、ＩｇＧのＦｃ領域など、免疫グロブリン分子の定常領域に融合することができる。本開示の目的のために、１つの好適なＦｃ領域は、ＩｇＧ２Ｆｃとして公知であるが、他のものも当該技術分野で公知であり、用いることができる。
【００３１】
本出願の目的において、好適な結合親和性とは、生理学的マトリックスにおけるＥｒｂＢリガンドを結合するのに十分高い親和性である。好ましくは、解離定数は、天然の受容体の解離定数を約１０倍〜約１００倍以下で超える。より好ましくは、ＥｒｂＢキメラについての解離定数は、その天然受容体対応物の１０倍以内であり、より好ましくは同程度内である。最も好ましくは、キメラ分子の結合親和性は、天然の対応物と識別できない。ＥｒｂＢリガンドを結合および隔離し、それによりＥｒｂＢ受容体を結合および活性化させるリガンド結合を防止または干渉するのに十分な任意の親和性は、使用に好適であり、開示された方法における使用を見出すことができる。結合分子の阻害薬の効力についての代わりである結合親和性は、バイオセンサーテクノロジーを用いて、または当該技術分野で周知のＥＬＩＳＡなどの古典的な結合アッセイによって測定することができる。
【００３２】
キメラＥｒｂＢリガンド結合分子配列をコードするＤＮＡも企図される。当業者は、遺伝暗号を用いて、好適なＤＮＡ配列を調製することができ、また、特異的発現宿主に対するコドン優先性がこのような配列に組み込めることを認識することができる。また、これらの配列との使用について企図されるのは、これらのＤＮＡ配列の発現に用いることのできる追加的なＤＮＡ配列である。種々のこれらは公知である。当該技術分野で周知のように、このような配列はまた、ＤＮＡの維持のためにおよびその発現のために宿主細胞へと導入することができ、これらのＤＮＡ配列を含むこのような宿主も企図される。
【００３３】
開示されたキメラＥｒｂＢリガンド結合分子を含む医薬組成物も企図される。このような組成物は、治療有効量のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子と、薬学的に許容し得る担体とを含む。用語「薬学的に許容し得る」は、連邦政府もしくは州政府の監督機関によって認可されたもの、または米国薬局方もしくは、哺乳類における、特にヒトにおける使用のための一般的に認識される他の薬局方において列挙されたものを意味する。用語「担体」は、治療薬が中に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、水および油などの滅菌性液体であり得、石油、動物、植物、または合成の起源のものを含み、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油、およびそれらに類するものである。好適な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、ならびにこれらに類する、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子が可溶性であり化学的に安定であるものを含む。また、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤、およびこれらに類するものの形態をとることができる。薬学的に許容し得る担体には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、およびＤＯＰＣなど、製剤における使用のための他の成分を含む。天然のまたは合成の界面活性剤を用いてよい。ＰＥＧを用いてよい（にもかかわらず、タンパク質またはアナログを誘導体化する上でのその使用を除く。）。シクロデキストランなどのデキストランを用いてよい。セルロースおよびセルロース誘導体を用いてよい。アミノ酸を、緩衝製剤における使用など、用いてよい。薬学的に許容し得る希釈剤には、種々の内容物（例えば、トリス‐ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨ、およびイオン強度を有する緩衝液；界面活性剤及び可溶化剤（例えば、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、ベンジルアルコール）、および増量性物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加物；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状調製物への、またはリポソームへの材料の組み込みを含む。また、ヒアルロン酸を用いてよく、これは、循環における持続時間を延長する効果を有し得る。このような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、インビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。例えば、引用により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ． （１９９０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ １８０４２） ｐａｇｅｓ １４３５−１７１２を参照されたい。組成物は、液状で調製され得、または凍結乾燥した形態など、乾燥した粉末で存在し得る。また、経皮製剤のような埋め込み可能な徐放性製剤も企図される。リポソーム、ミクロカプセルもしくはミクロスフェア、封入複合体、または他の種類の担体も企図される。
【００３４】
活性型キメラ結合分子の意図された治療用途に有効な量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、インビトロでのアッセイを任意に採用して、最適な薬用量範囲を同定するのを助け得る。一般的に、１日の投与計画は、体重の活性薬（ＡＰＩ）キログラムの０．１〜１０００マイクログラムの範囲、好ましくは、キログラムあたり０．１〜１５０マイクログラムであるべきである。有効量は、インビトロまたは好適な動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から外挿され得る。薬用量および間隔は、治療効果を維持するのに十分な化合物の血漿レベルを提供するよう個々に調整され得る。局所投与または選択的取り込みの場合、化合物の有効な局所濃度は、血漿濃度と関連していなくてよい。治療のための方法に関与する薬用量投与計画は、薬剤の作用を修飾する種々の因子、例えば、患者の齢、容態、体重、性別、および食事、疾患の重症度、投与回数、ならびに他の臨床因子を考慮して、担当医によって決定することができる。
【００３５】
もちろん、投与される化合物の量は、治療される対象、対象の体重、苦痛の重症度、投与の様式、処方医の判断によるであろう。症状が検出可能な間、または症状が検出できない場合でさえ、療法は、間欠的に反復されてよい。療法は、単独でまたは他の薬剤との併用で提供され得る。
【００３６】
ＥｒｂＢリガンドを結合し、癌細胞のＥｒｂＢ受容体形に及ぼすリガンドの相互作用および効果に干渉するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子を得ること、ならびに治療有効量の分子を患者に投与することを含む、治療を必要とする患者を治療するための方法が開示される。投与は、静脈内投与、注射器もしくはカテーテルなどを通じての固形腫瘍への直接的な注入などの非経口的経路によって、または腹腔内注射によってであり得る。
【００３７】
治療の一方法において、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は、標準的な方法によって、アフェレーシス支持体またはバイオコア（ｂｉｏｃｏｒｅ）支持体などの固形支持体に固定することができる。結合分子が固形支持体に結合すると、患者の血清、血液、または他の生物学的に関連のある流体は、アフェレーシスカラムにおける固形支持体と接触するよう配置され、流体からＥｒｂＢリガンドを除去することができる。次に、血清、血液、または流体は、患者へと再導入できる。
【００３８】
また、結合分子は、併用療法において用いることができる。したがって、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は、化学療養薬、手術、カテーテル装置、および放射線を含む、１つ以上の追加的な化合物または療法との併用で投与され得る。併用療法には、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子および１つ以上の追加薬を含む単一の医薬剤形の投与を含む。キメラＥｒｂＢリガンド結合分子および１つ以上の追加薬は、それ自体個別の医薬剤形で、または同じ製剤において投与することができる。例えば、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子と、細胞傷害薬、化学療法薬、もしくは増殖阻害薬とが、単一の薬用量組成物において互いに患者に投与することができるかまたは、各薬剤は、個別の剤形で投与することができる。より具体的には、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子は、ラパチニブ（登録商標）、ハーセプチン（登録商標）、エルビタックス（登録商標）、およびこれらに類するものなどの治療薬を含む併用療法において用いることができる。個別の剤形を用いる場合、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子および１つ以上の追加薬は同時に、または個別にずらした時刻で、すなわち連続して投与することができる。当業者は、キメラＥｒｂＢリガンド結合分子が、組み合わせにおける第二の治療薬に干渉しないがむしろ強めるよう、組み合わせが存在しなければならないことを認識することができる。
【００３９】
以下の実施例は、説明のためにのみ与えられ、本出願の対象事項を制限するものとして解釈されるためではない。以下の実施例において、開示されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列も企図される。以下の実施例の多くは、ＥｒｂＢキメラに融合したＩｇＧ２Ｆｃについての配列を開示する。ＩｇＧＦｃの使用が任意であることは認識されるべきである。加えて、あるアミノ酸と、リガンド結合活性に実質的に（約１０倍）干渉しない別の類似のアミノ酸との保存的置換は、具体的に企図される。精製された生成物の従来の結合研究を用いて、結合親和性における実質的な差が存在するかどうかを決定することができる。下記に説明される構造の多くは、図１および図２における構造の線図に対する引用により、より十分に理解することができる。すべての配列には、マウス抗体重鎖遺伝子由来のシグナルペプチドを含む。すべての付番はシグナルペプチドを除外しており、各ＥｒｂＢ配列の第一のアミノ酸に下線を付している。
【実施例】
【００４０】
（実施例１）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＥｒｂＢ１ ＳＩＩサブドメインのモジュール１における残基５０１の後に終端するＥｒｂＢ１受容体のＬＩＩサブドメインに接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを具体的に開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する。
【化１】
【００４１】
（実施例２）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインならびにＥｒｂＢ１ ＳＩＩサブドメインのモジュール１における残基５０１後に終端するＥｂＢ１受容体のＬＩＩサブドメインに接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを具体的に開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２】
【００４２】
（実施例３）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜２、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール３〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化３】
【００４３】
（実施例４）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜３ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＳＩサブドメインのモジュール４〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化４】
【００４４】
（実施例５）
本実施例は、ＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール５〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１とともに、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜４に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化５】
【００４５】
（実施例６）
本実施例は、ＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール６〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１とともに、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜５に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化６】
【００４６】
（実施例７）
本実施例は、ＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール７〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１とともに、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜６に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを説明する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化７】
【００４７】
（実施例８）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜７、ならびにＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化８】
【００４８】
（実施例９）
本実施例は、ＥｒｂＢ３受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール２〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化９】
【００４９】
（実施例１０）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメイン、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１０】
【００５０】
（実施例１１）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメイン、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＬＩＩサブドメインおよびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１１】
【００５１】
（実施例１２）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜２、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインモジュール３〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラに言及する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１２】
【００５２】
（実施例１３）
ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜３、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール４〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラに言及する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１３】
【００５３】
（実施例１４）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜４、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール５〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１４】
【００５４】
（実施例１５）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜５、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＳＩサブドメインのモジュール６〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１５】
【００５５】
（実施例１６）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜６、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール７〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラに言及する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１６】
【００５６】
（実施例１７）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜７、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラに言及する。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１７】
【００５７】
（実施例１８）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１、ならびにＩｇＧ２Ｆｃに融合したＳＩサブドメインのモジュール２〜８、ＬＩＩサブドメイン、およびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。キメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１８】
【００５８】
（実施例１９）
本実施例は、（図３の整列におけるＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸残基２４５を通じての）ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜５、ならびに（図３の整列におけるＥｒｂＢ１のアミノ酸残基２４９で開始する）ＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール５〜８、ＳＩＩサブドメインにおけるアミノ酸５０１の後ろでＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＬＩＩサブドメインおよびＳＩＩサブドメインのモジュール１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。キメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１９】
【００５９】
（実施例２０）
本実施例は、（図３の整列におけるＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸残基２４５を通じての）ＥｒｂＢ４受容体のＬＩサブドメインおよびＳＩサブドメインのモジュール１〜５、ならびに（図３の整列におけるＥｒｂＢ１受容体のアミノ酸残基２４９で開始する）ＥｒｂＢ１受容体のＳＩサブドメインのモジュール５〜８、ＳＩＩサブドメインにおけるアミノ酸５０１の後ろでＩｇＧ２Ｆｃに融合したＥｒｂＢ１受容体のＬＩＩサブドメインおよびＳＩＩサブドメインのモジュール１を含むキメラを開示する。アミノ酸２４５は、ＥｒｂＢ４受容体の付番に基づいているのに対し、アミノ酸２４９および５０１は、ＥｒｂＢ１受容体の付番に基づいている。加えて、この配列は、ＩｇＧ２Ｆｃのヒンジ領域における２つのシステイン（Ｃｙｓ）からセリン（Ｓｅｒ）への置換を含む。これらの置換は、ＩｇＧ２Ｆｃタンパク質の付番に基づいたＣ２２６ＳおよびＣ２２９Ｓであり、以下で下線を付されている。キメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２０】
【００６０】
（実施例２１）
本実施例は、両方の受容体に対するリガンドについての実質的な結合親和性を有するＥｒｂＢキメラが、２つの異なるＥｒｂＢ受容体の選択的な組み合わせから作ることができることを示す。ＨＲＧ１βおよびＴＧＦαへの結合について、本実施例の目的のためにＥ１／Ｅ４−Ｆｃと命名された実施例１９由来のコンストラクト（配列番号１９）、およびＥ１／Ｅ４−ＭＦｃと命名された実施例２０由来のコンストラクト（配列番号２０）を含む４つのコンストラクトを試験した。対照は、Ｅ１と命名された、ＩｇＧ２Ｆｃ部分に接合したＥｒｂＢ１のアミノ酸１〜５０１、およびＥ４と命名された、ＩｇＧ２Ｆｃ部分に接合したＥｒｂＢ４のアミノ酸１〜４９７を含んだ。いくつかの研究において、別のＥ１対照を用いた。
【００６１】
トラップＤＮＡ分子を、所望のアミノ酸配列で開始し、哺乳類系の発現についてＤＮＡ配列を最適化することによって合成した。トラップＤＮＡ配列を、ハイグロマイシンを用いて選択でき、かつＭＡＲ／ＳＡＲ配列（絶縁因子および境界領域）ならびにトラップ発現のためのプロモーターおよびエンハンサーを含む好適な哺乳類発現ベクター（ｐＣｐＧｆｒｅｅ‐ｖｉｔｒｏＨｍｅｓ）へとクローニングした。トラップ配列を含むベクターを標準的なトランスフェクション法によってＣＨＯ細胞へとトランスフェクトし、細胞をベクターの組み込みのためにハイグロマイシンを用いて選択した。細胞培地を回収し、標準的な方法（プロテインＡカラム結合）によって精製することによって、安定してトランスフェクトされた細胞株からトラップを精製した。トラップを標準的な方法によってプロテインＡから溶出し、従来法由来のＩｇＧ‐ＦｃサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて定量化した。
【００６２】
トラップを、プロテインＡを用いて精製し、非還元条件（ＮＲ）および還元条件（Ｒ）の下で、ポリアクリルアミドゲル泳動を実施した。ジスルフィド連結した二量体は、およそ２２０〜２４０ｋＤａに泳動したのに対し、還元型単量体は１２０〜１３０ｋＤａに泳動した。ジスルフィド形成を防止する突然変異型システインを有するキメラトラップ単量体は、非還元条件下および還元条件下の両方でおよそ１２０〜１３０ｋＤａに泳動する。Ｅ１‐Ｆｃ、Ｅ４‐Ｆｃ、Ｅ１／Ｅ４‐Ｆｃは、非還元条件下で泳動する場合、２２０〜２４０ｋＤａの範囲に、還元条件下で泳動する場合、約１２０〜１３０の範囲にあるように見えた。Ｅ１／Ｅ４‐Ｆｃコンストラクトは、非還元条件下および還元条件下の両方で約１２０〜１３０の分子量を有すると思われる。
【００６３】
精製済みトラップ分子を９６ウェルプレートにコーティングし、ＴＧＦαまたはＨＲＧ１βのいずれかとともにインキュベートした。次に、ＴＧＦαまたはＨＲＧ１βに対する検出抗体を用いて、結合したリガンドの親和性（Ｋｄ）および量（Ｂｍａｘ）を測定した。
【００６４】
トラップを９６ウェルプレートにコーティングし、各種濃度のＴＧＦαまたはＨＲＧ１ベータのいずれかとともにインキュベートした。ＴＧＦαまたはＨＲＧ１βに対する検出抗体を用いて、結合したリガンドの親和性（Ｋｄ）および量（Ｂｍａｘ）を測定した。これらの研究において得られたデータを下記の表１〜４に提供する。
【００６５】
表１および表２において示されるように、キメラ単量体（Ｅ１／Ｅ４‐Ｆｃ）は、約４００〜６２０ｎＭの範囲の親和性でＴＧＦαを結合し、ＥｒｂＢ１‐ＩｇＧＦｃ（Ｅ１‐Ｆｃ）は、約２７〜４０ｎＭの範囲の親和性（Ｋｄ）で結合した。
【表１】
【表２】
【００６６】
表３および表４に示すように、キメラ単量体（Ｅ１／Ｅ４‐Ｆｃ）は、約およそ１５〜３０ｎＭの範囲の親和性でＨＲＧ１βを結合し、このことは、ＥｒｂＢ４‐ＩｇＧＦｃ（Ｅ４‐Ｆｃ）と本質的に同じであった。
【表３】
【表４】
【００６７】
Ｅ１／Ｅ４‐ＭＦｃ５０％データ点は、精製済みキメラ受容体の量の半分をウェルに添加すると、その結合が半分ほど低下し、それゆえ、結合が、添加した受容体の量に比例することを示す。
【００６８】
本実施例は、ＥｒｂＢキメラ受容体下位構成要素の両方に対するリガンドについての実質的な親和性を有するＥｒｂＢキメラを作製および精製することができることを示す。さらに、本実施例は、突然変異をキメラ受容体結合分子に導入して、ジスルフィドを変化させ、ジスルフィド結合形成を通じての二量体の形成を防止することができることを示す。
【００６９】
（実施例２２）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸１〜２４５およびＥｒｂＢ１受容体のアミノ酸２４９〜５０１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。また、融合には、先の配列にあるようにＩｇＧ２‐Ｆｃを含む。また、この配列に組み込まれているのは、位置１３におけるグルタミンとセリンとの置換、および分子のジスルフィドベースの二量体化を防止する、実施例２０由来のシステインからセリンへの２つの修飾である。位置１３におけるグルタミン（以下で下線）は、その位置のＥｒｂＢ１配列において認められ、ＴＧＦαに対するキメラの親和性を増大させるために配列に組み込まれる。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２１】
【００７０】
（実施例２３）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸１〜２４５およびＥｒｂＢ１受容体のアミノ酸２４９〜５０１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。また、融合には、先の配列にあるようにＩｇＧ２‐Ｆｃを含む。また、この配列に組み込まれているのは、位置４２におけるチロシンとセリンとの置換、および分子のジスルフィドベースの二量体化を防止する、実施例２０由来のシステインからセリンへの２つの修飾である。位置４２におけるチロシン（以下で下線）は、その位置のＥｒｂＢ１配列において認められ、ＴＧＦαに対するキメラの親和性を増大させるために配列に組み込まれる。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２２】
【００７１】
（実施例２４）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸１〜２４５およびＥｒｂＢ１受容体のアミノ酸２４９〜５０１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。また、融合には、先の配列にあるようにＩｇＧ２‐Ｆｃを含む。また、この配列に組み込まれているのは、位置１２３におけるアルギニンとチロシンとの置換（下線）、および分子のジスルフィドベースの二量体化を防止する、実施例２０由来のシステインからセリンへの２つの修飾である。位置１２３におけるアルギニンは、その位置のＥｒｂＢ１配列において認められ、ＴＧＦαに対するキメラの親和性を増大させるために配列に組み込まれる。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２３】
【００７２】
（実施例２５）
本実施例は、ＥｒｂＢ４受容体のアミノ酸１〜１８３およびＥｒｂＢ１受容体のアミノ酸１８７〜５０１に接合したシグナルペプチド（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ）を含むキメラを開示する。この配列は、二量体化を防止するためにＩｇＧ２Ｆｃ領域にシステインからセリンへの２つの修飾を含むこと以外は、実施例１８における配列と本質的に同じである。この融合は、ＴＧＦαに対するキメラの親和性を増大させるためにより多くのＥｒｂＢ１配列を含む。ＥｒｂＢキメラは、以下のアミノ酸配列を有する：
【化２４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４の任意の１よりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項２】
配列番号１〜２４からなるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項３】
ＥｒｂＢ１由来のサブドメインＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ４由来のサブドメインＬＩの少なくとも一部を有する、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項４】
ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ４由来の一部およびＥｒｂＢ１由来の一部を有するＳＩ領域に連結されたＥｒｂＢ４由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部を有する、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項５】
ＥｒｂＢ１由来のサブドメインＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ４由来のサブドメインＬＩの少なくとも一部を有し、前記ＥｒｂＢキメラがＩｇＧ２Ｆｃに融合された、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項６】
ＥｒｂＢ４由来の一部およびＥｒｂＢ１由来の一部を有するＳＩ領域に連結されたＥｒｂＢ４由来のサブドメインＬＩを有し、この中で、前記ＥｒｂＢ４部分が、ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結された、前記２つの配列間に相同性を有する領域における前記ＥｒｂＢ１部分に切り替わる、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項７】
ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ３由来のサブドメインＬＩを有する、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項８】
一部がＥｒｂＢ３由来でありかつ一部がＥｒｂＢ１、およびＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に由来する、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項９】
ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ３由来のサブドメインＬＩを有し、このなかで、前記ＥｒｂＢキメラがＩｇＧ２Ｆｃに融合した、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項１０】
ＥｒｂＢ３由来のサブドメインＬＩを有し；ＳＩ領域がＥｒｂＢ３由来の一部およびＥｒｂＢ１由来の一部を有し、この中で、前記ＥｒｂＢ３部分が、前記２つの配列間に相同性を有する領域における前記ＥｒｂＢ１部分に切り替わり；およびＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に切り替わる、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項１１】
前記分子が少なくとも部分的に二量体化される、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項１２】
天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子をコードするＤＮＡ排列。
【請求項１３】
宿主において前記キメラＥｒｂＢリガンド結合分子を発現するための追加的なＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ配列が宿主生細胞中にある、請求項１２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１５】
天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ４由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ３由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
固相支持体に固定された天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子を含む、ＥｒｂＢリガンドを結合するための組成物。
【請求項１９】
請求項１５に記載の医薬組成物を投与することを含む、１つ以上のＥｒｂＢリガンドに対して感受性のある癌を有する患者を治療するための方法。
【請求項２０】
固相支持体上に天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子を固定することと、ＥｒｂＢリガンドの少なくとも一部を除去するよう、１つ以上のＥｒｂＢリガンドに対して感受性のある癌を有する患者由来の生物学的流体を前記固相支持体に通過させることとを含む、１つ以上のＥｒｂＢリガンドに対して感受性のある癌を有する患者を治療するための方法。
【請求項１】
天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４の任意の１よりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項２】
配列番号１〜２４からなるアミノ酸配列の群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項３】
ＥｒｂＢ１由来のサブドメインＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ４由来のサブドメインＬＩの少なくとも一部を有する、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項４】
ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ４由来の一部およびＥｒｂＢ１由来の一部を有するＳＩ領域に連結されたＥｒｂＢ４由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部を有する、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項５】
ＥｒｂＢ１由来のサブドメインＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ４由来のサブドメインＬＩの少なくとも一部を有し、前記ＥｒｂＢキメラがＩｇＧ２Ｆｃに融合された、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項６】
ＥｒｂＢ４由来の一部およびＥｒｂＢ１由来の一部を有するＳＩ領域に連結されたＥｒｂＢ４由来のサブドメインＬＩを有し、この中で、前記ＥｒｂＢ４部分が、ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結された、前記２つの配列間に相同性を有する領域における前記ＥｒｂＢ１部分に切り替わる、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項７】
ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ３由来のサブドメインＬＩを有する、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項８】
一部がＥｒｂＢ３由来でありかつ一部がＥｒｂＢ１、およびＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に由来する、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項９】
ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ３由来のサブドメインＬＩを有し、このなかで、前記ＥｒｂＢキメラがＩｇＧ２Ｆｃに融合した、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項１０】
ＥｒｂＢ３由来のサブドメインＬＩを有し；ＳＩ領域がＥｒｂＢ３由来の一部およびＥｒｂＢ１由来の一部を有し、この中で、前記ＥｒｂＢ３部分が、前記２つの配列間に相同性を有する領域における前記ＥｒｂＢ１部分に切り替わり；およびＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に切り替わる、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項１１】
前記分子が少なくとも部分的に二量体化される、請求項１に記載のキメラＥｒｂＢリガンド結合分子。
【請求項１２】
天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子をコードするＤＮＡ排列。
【請求項１３】
宿主において前記キメラＥｒｂＢリガンド結合分子を発現するための追加的なＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ配列が宿主生細胞中にある、請求項１２に記載のＤＮＡ配列。
【請求項１５】
天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ４由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＥｒｂＢ１由来のＬＩＩの少なくとも一部に連結されたＥｒｂＢ３由来のサブユニットＬＩの少なくとも一部と、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
固相支持体に固定された天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子を含む、ＥｒｂＢリガンドを結合するための組成物。
【請求項１９】
請求項１５に記載の医薬組成物を投与することを含む、１つ以上のＥｒｂＢリガンドに対して感受性のある癌を有する患者を治療するための方法。
【請求項２０】
固相支持体上に天然のＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ３、またはＥｒｂＢ４のうちのいずれか１つよりも多くのＥｒｂＢリガンドについて検出可能な結合活性を有するキメラＥｒｂＢリガンド結合分子を固定することと、ＥｒｂＢリガンドの少なくとも一部を除去するよう、１つ以上のＥｒｂＢリガンドに対して感受性のある癌を有する患者由来の生物学的流体を前記固相支持体に通過させることとを含む、１つ以上のＥｒｂＢリガンドに対して感受性のある癌を有する患者を治療するための方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１３−５００７１９（Ｐ２０１３−５００７１９Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２２９９９（Ｐ２０１２−５２２９９９）
【出願日】平成２２年７月２８日（２０１０．７．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３５３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１７１５９
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５１２０２０２８０）リガセプト・エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２８日（２０１０．７．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３５３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１７１５９
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５１２０２０２８０）リガセプト・エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
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