微小力測定装置及び生体分子観察方法
【課題】感度の低下を防止しながらタンパク分子等の生体分子を正確に測定して、構造解析等の力学的性質を高精度に観察すること。
【解決手段】互いに向かい合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面２ａ、３ａに生体分子Ｐを固定可能な第１のプローブ２及び第２のプローブ３と、該第１のプローブと第２のプローブとを、それぞれ主面を向かい合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変手段４と、第１のプローブ及び第２のプローブの撓みをそれぞれ測定する測定手段５と、該測定手段による測定結果に基づいて、生体分子の解析を行う解析手段６とを備え、測定手段が、第１のプローブ及び第２のプローブにそれぞれ生体分子を固定させた状態で、可変手段４により互いの距離を可変させている間の撓み変化を測定する微小力測定装置１を提供する。
【解決手段】互いに向かい合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面２ａ、３ａに生体分子Ｐを固定可能な第１のプローブ２及び第２のプローブ３と、該第１のプローブと第２のプローブとを、それぞれ主面を向かい合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変手段４と、第１のプローブ及び第２のプローブの撓みをそれぞれ測定する測定手段５と、該測定手段による測定結果に基づいて、生体分子の解析を行う解析手段６とを備え、測定手段が、第１のプローブ及び第２のプローブにそれぞれ生体分子を固定させた状態で、可変手段４により互いの距離を可変させている間の撓み変化を測定する微小力測定装置１を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質等の生体分子の構造解析等、各種の観察を行う微小力測定装置及び生体分子観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代を迎え、分子生物学的なアプローチから、ＤＮＡやタンパク質をはじめとした生体分子や細胞等の生体試料の形態観察や機能解析への高分解能、多機能観察が求められている。その中で、ＤＮＡ、ＲＮＡやタンパク質等の生体分子の長さを測定したり、幾何学的な構造や力学的な性質等の各種の機能を調べたりすることは、生体分子の解析（解明）に繋がるので、生化学、医学を始めとする多くの分野において非常に有益に行われている。
このような解析においては、生体分子、例えば、例えば、立体構造をとっているタンパク質を両端末付近から引き伸ばして１本の直線状のポリペプチドとすることでタンパク質の力学的な性質を調べて構造解析を行うタンパク質ナノ力学法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
この方法は、図２４に示すように、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ；Atomic Force Microscope）等の走査型プローブ顕微鏡のプローブ５０を利用してタンパク質Ｐを引き伸ばす方法である。
まず、図２４に示すように、基板５１とカンチレバー５２の先端に設けられた探針５３とを、シラン化剤等で活性化すると共に、架橋剤等を使用してタンパク質Ｐの両端末近傍を化学的結合により固定する。固定後、プローブ５０を基板表面から離間するようにゆっくりと移動させる。これにより、タンパク質Ｐが徐々に引き伸ばされる。この際、図２５に示すように、カンチレバー５２に作用する力（張力）の測定を行う。これにより、タンパク質Ｐの力学的な性質を調べることができ、タンパク質Ｐの構造解析を行うことができる。
【０００４】
特に、タンパク質Ｐは、その種類によっては、引き伸ばされる前の立体構造の段階において、局所的に高分子鎖が絡まった結び目（結合部分）（図２４で示すＡ、Ｂ）が生じる場合がある。この場合には、上述した引っ張り操作をしたときに、各結び目Ａ、Ｂが離れる（結合が離れる）。この結び目Ａ、Ｂが離れた場合には、図２５に示すように、カンチレバー５２に作用する張力が瞬間的に低減する。また、この際の張力の低減具合を見ることで、各結び目Ａ、Ｂの結合力の大きさ等を検出することができる。
【０００５】
このように、タンパク質の力学的性質を調べることで、タンパク質を力学視点から見ることができ、より多角的な構造解析等を行うことができる。ところで、この力学的性質を調べるには、プローブの撓みを検出することが必要とされる。これは、探針にかかる力がプローブの撓みとして現れるためである。
【０００６】
この撓みの検出方法は、各種の方法があるが、その１つとして自己検知方式が知られている（例えば、特許文献１参照）。
この自己検知方式は、プローブ自体に、該プローブが撓むことで抵抗値が変化するピエゾ抵抗体を設け、この抵抗値の変化量をプローブの撓み量として検出する方法である。なお、この時のプローブにかかる力Ｆは、Ｆ＝ｋ（プローブのばね定数）×ｘ（プローブの撓み量（変位量））で表される。
【特許文献１】特開平９−３０４４０９号公報
【非特許文献１】竹安邦夫、「ナノバイオロジー ナノテクノロジーによる生命科学」、初版、共立出版株式会社、２００４年７月１５日、ｐ.５２−６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記従来の自己検知方式による方法では、以下の問題が残されていた。
即ち、生体分子を測定する際、特にタンパク質の延伸測定を行う際には、微小な力で結合している結合部分を明確に検出するため、ばね定数の大きな硬いプローブを使用せずに、ばね定数の小さな柔らかいプローブを使用するのが一般的である。ところが、自己検知方式の場合には、上述したようにプローブにかかる力Ｆは、Ｆ＝ｋ×ｘで表されるので、柔らかいばね定数のプローブを用いたときに、変位量に対する抵抗値の変化が少なくなってしまう。その結果、感度が劣ってしまい、タンパク質等の生体分子を正確に測定し難いものであった。
【０００８】
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、その目的は、感度の低下を防止しながらタンパク質等の生体分子を正確に測定して、構造解析等の力学的性質を高精度に観察することができる微小力測定装置及び生体分子観察方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、この発明は以下の手段を提供している。
本発明の微小力測定装置は、互いに向かい合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面に生体分子を固定可能な第１のプローブ及び第２のプローブと、該第１のプローブと第２のプローブとを、それぞれ前記主面を向かい合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変手段と、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの撓みをそれぞれ測定する測定手段と、該測定手段による測定結果に基づいて、前記生体分子の解析を行う解析手段とを備え、前記測定手段が、前記第１のプローブ及び第２のプローブにそれぞれ前記生体分子を固定させた状態で、前記可変手段により互いの距離を可変させている間の撓み変化を測定することを特徴とするものである。
【００１０】
また、本発明の生体分子観察方法は、互いに向かい合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面に生体分子を固定可能な第１のプローブ及び第２のプローブを利用して、生体分子を観察する生体分子観察方法であって、前記第１のプローブの前記主面に、前記生体分子の一端を固定させる第１の固定工程と、前記第２のプローブの前記主面に、前記生体分子の他端を固定させる第２の固定工程と、前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程後、前記第１のプローブと前記第２のプローブとを、それぞれ前記主面を向い合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変工程と、該可変工程中における、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの撓み変化をそれぞれ測定する測定工程と、該測定工程による測定結果に基づいて、前記生体分子を解析する解析工程とを備えていることを特徴とするものである。
【００１１】
この発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法においては、まず、第１のプローブの主面をシラン化剤等で活性化すると共に架橋剤等を使用して、タンパク質等の生体分子の一端を化学的結合により固定させる第１の固定工程を行う。次いで、可変手段により第２のプローブと第１のプローブとを相対的に移動させて接近させ、第２のプローブの主面に生体分子の他端を固定する第２の固定工程を行う。これにより、生体分子は、第１のプローブの主面及び第２のプローブの主面にそれぞれ両端が固定された状態となる。
【００１２】
生体分子の固定後、可変手段により、第１のプローブと第２のプローブとをそれぞれ主面を向かい合わせにした状態を維持しながら相対的に離間させる可変工程を行う。これにより、例えば、立体構造をとっているタンパク質は、両端末で引き伸ばされて（延伸）、１本の直線状ポリペプチドとなる。また、この可変工程を行っている間に、測定手段により両プローブの撓み変化をそれぞれ測定する測定工程を行う。そして、この測定工程による測定結果に基づいて、解析手段により生体分子を解析する解析工程を行う。
【００１３】
これにより、例えば、上述した直線状のポリペプチドとするのに必要な張力を測定することができる。また、タンパク質は、通常高分子鎖が絡まった結び目（結合部位）が存在している状態であるが、両プローブで引っ張られる際、これら結び目は解けてしまう。この際、例えば、結び目が解ける直前までは、その結合力により結び目が両プローブを引っ張る形になるので、両プローブの撓みが大きくなる。また、結び目が解けた瞬間は、瞬間的に両プローブに作用する力が低減するので、撓みが小さくなる。
このように、測定工程及び解析工程を行うことで、直線状ポリペプチドとするのに必要な張力や、結び目の結合力の大きさ等の力学的性質を調べることができ、タンパク質の構造解析を行うことができる。
【００１４】
特に、第１のプローブ及び第２のプローブとして、ばね定数の小さな柔らかいプローブを利用したとしても、従来と異なり２つのプローブにより生体分子を両端末から引っ張った状態で測定を行うので、作用反作用により両プローブにそれぞれ同じ力をかけることができる。よって、従来のように１つのプローブで測定を行う場合とは異なり、感度を約２倍に倍増することができる。従って、タンパク質等の生体分子を正確に測定することができ、構造解析等の力学的性質を高精度に観察することができる
また、２つのプローブで生体分子の両端末を引っ張るので、従来の場合と比べて、同じ力を加えるときに移動させる距離を伸ばすことができ、移動分解能を向上することができる。
【００１５】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明の微小力測定装置において、前記第１のプローブ又は前記第２のプローブの少なくともいずれか一方が、前記主面に探針を備えていることを特徴とするものである。
【００１６】
この発明に係る微小力測定装置においては、第１のプローブ又は第２のプローブの少なくともいずれか一方は、主面に探針を備えているので、タンパク質等の生体分子を固定する際に、狙った生体分子のみを確実に探針の先端に固定することができる。そのため、測定対象物質である生体分子の量を極力少なくすることができる。よって、多量の生体分子の測定結果が重なることがなく、より解析し易い力の変位曲線を得ることができる。
【００１７】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明の微小力測定装置において、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの主面にそれぞれ形成された導電膜と、該導電膜を介して、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間に所定の電圧を印加する電圧印加手段とを備えていることを特徴とするものである。
【００１８】
また、本発明の生体分子観察方法は、上記本発明の生体分子観察方法において、前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程が、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間に所定の電圧を印加して、前記生体分子を誘電泳動させて第１のプローブ及び第２のプローブの主面にそれぞれ固定させることを特徴とするものである。
【００１９】
この発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法においては、第１の固定工程及び第２の固定工程の際に、電圧印加手段により導電膜を介して第１のプローブと第２のプローブとの間に所定の電圧を印加することで、タンパク質等の生体分子を誘電泳動させて両プローブの主面に引き寄せることができる。よって、生体分子の両端を略同じタイミングで、確実に両プローブに固定することができる。従って、生体分子をより容易に固定することができ、固定工程にかける時間をさらに短縮することができる。また、タンパク質が１分子であっても、容易且つ確実に両プローブに固定することができる。
【００２０】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明のいずれかの微小力測定装置において、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブが、基端側から先端側に向かう方向が同一方向を向くように平行に並んで配されていることを特徴とするものである。
【００２１】
この発明に係る微小力測定装置においては、第１のプローブと第２のプローブとが、共に同一方向を向くように平行に並んで配されている。即ち、ピンセットの如く２重に重なるように配されている。よって、第１のプローブ及び第２のプローブが占める設置スペースを極力抑えることができ、小型化を図ることができる。また、両プローブの基端側を片側に揃えることができるので、可変手段により動かし易くなり、構成の簡略化を図ることができる。
【００２２】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明のいずれかの微小力測定装置において、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブで固定された前記生体分子を観察する顕微鏡装置を備えていることを特徴とするものである。
【００２３】
この発明に係る微小力測定装置においては、両プローブで生体分子を引っ張っている最中に、倒立顕微鏡等の顕微鏡装置により生体分子を、例えば、蛍光観察することができる。このように、測定手段による測定に加え、顕微鏡装置を利用して同時に各種の観察（例えば、タンパク質のどの結合部位が離れたか等の観察）を行えるので、生体分子をより多角的に観察することができる。
【００２４】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明の微小力測定装置において、前記可変手段が、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの相対的な位置関係を維持したまま、両プローブの向きを一体的に可変可能であることを特徴とするものである。
【００２５】
この発明に係る微小力測定装置においては、第１のプローブ及び第２のプローブに生体分子の両端をそれぞれ固定した後、可変手段により両プローブの相対的な位置関係を維持したまま、両プローブの向きを一体的に変化させることができる。これにより、生体分子を顕微鏡装置で観察し易い位置に位置させることができる。そして、この位置調整の後に、顕微鏡装置で観察を行いながら測定を行う。このように、顕微鏡装置で観察を行う前に、生体分子の位置を調整できるので、使い易く操作性が向上すると共に測定結果の信頼性を向上することができる。
【００２６】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明のいずれかの微小力測定装置において、前記測定手段が、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブにそれぞれ設けられ、撓み量に応じて抵抗値が変化する第１の歪み検出素子及び第２の歪み検出素子と、両歪み検出素子の抵抗値変化に基づいて、第１のプローブ及び第２のプローブの撓み変化を算出する算出回路とを備えていることを特徴とするものである。
【００２７】
この発明に係る微小力測定装置においては、第１のプローブ及び第２のプローブにそれぞれ設けられた歪み検出素子を利用した自己検知方式により、撓み変化（歪み変化）を検出する。即ち、第１のプローブが撓むと、撓み量に応じて第１の歪み検出素子の抵抗値が変化する。また、同様に第２のプローブが撓むと、撓み量に応じて第２の歪み検出素子の抵抗値が変化する。そして、ホイートストンブリッジ回路等の算出回路は、この両歪み検出素子の抵抗値変化に基づいて、両プローブの撓み変化を算出する。
このように、一般的な光てこ方式ではなく、自己検知方式により撓みを測定できるので、レーザ光を照射及び受光する光学系が不要となり、構成の簡略化を図ることができると共に、小型化を図ることができる。
【００２８】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明の微小力測定装置において、前記歪み検出素子が、ピエゾ抵抗素子であることを特徴とするものである。
【００２９】
この発明に係る微小力測定装置においては、歪み検出素子がピエゾ抵抗素子であるので、半導体プロセスを利用して容易且つ高精度に、狙った場所に作りこむことができる。よって、より正確に両プローブの撓み（歪み）を検出することができる。
【００３０】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明の微小力測定装置において、前記第１の歪み検出素子及び前記第２の歪み検出素子の近傍に、環境条件補正用の参照用素子を備えていることを特徴とするものである。
【００３１】
この発明に係る微小力測定装置においては、参照用素子を備えているので、温度条件等の各種の環状条件により発生する電気特性の影響を相殺することができる。よって、両歪み検出素子の抵抗値を温度等の環境条件に影響されずに、撓み量に応じてより正確に変化させることができる。その結果、測定結果の信頼性を向上することができる。
【００３２】
また、本発明の生体分子観察方法は、上記本発明の生体分子観察方法において、前記第１の固定工程が、前記第１のプローブの前記主面に設けられた探針に、前記生体分子の一端を固定することを特徴とするものである。
【００３３】
この発明に係る生体分子観察方法においては、タンパク質等の生体分子の一端を固定する際に、狙った生体分子のみを確実に探針の先端に固定することができる。そのため、測定対象物質である生体分子の量を極力少なくすることができる。よって、多量の生体分子の測定結果が重なることがなく、より解析し易い力の変位曲線を得ることができる。
【００３４】
また、本発明の生体分子観察方法は、上記本発明の生体分子観察方法において、前記第２の固定工程が、前記第２のプローブの前記主面に設けられた探針に、前記生体分子の他端を固定することを特徴とするものである。
【００３５】
この発明に係る生体分子観察方法においては、タンパク質等の生体分子の他端を固定する際に、狙った生体分子のみを確実に探針の先端に固定することができる。そのため、測定対象物質である生体分子の量を極力少なくすることができる。よって、多量の生体分子の測定結果が重なることがなく、より解析し易い力の変位曲線を得ることができる。
【００３６】
また、本発明の生体分子観察方法は、上記本発明のいずれかの生体分子観察方法において、前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程を行う前に、前記生体分子に蛍光物質を標識させる蛍光標識工程を備え、前記測定工程が、前記可変工程中における前記蛍光物質の動きを観察する観察工程を備えていることを特徴とするものである。
【００３７】
この発明に係る生体分子観察方法によれば、まず、第１の固定工程及び第２の工程を行う前に、生体分子に蛍光物質を標識させる蛍光標識工程を行う。これにより、例えば、タンパク質の結び目が蛍光物質で標識される。その後、可変工程中に、倒立顕微鏡等により蛍光物質の動きを観察する観察工程を行う。これにより、両プローブで引っ張られて結び目が破断した箇所を、蛍光物質の動きにより明確に判断することができる。
このように、測定手段による測定に加え、蛍光物質を利用した各種の観察を行えるので、生体分子をより多角的に観察することができる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法によれば、第１のプローブ及び第２のプローブとして、ばね定数の小さな柔らかいプローブを利用したとしても、２つのプローブを利用して生体分子を両端末側から引っ張った状態で測定を行うので、作用反作用により両プローブにそれぞれ同じ力をかけることができる。よって、従来のように１つのプローブで測定を行う場合とは異なり、感度を約２倍に倍増することができる。従って、タンパク質等の生体分子を正確に測定することができ、構造解析等の力学的性質を高精度に観察することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、本発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法の第１実施形態について、図１から図１０を参照して説明する。なお、本実施形態では、生体分子として、タンパク質を例にして説明する。
本実施形態の微小力測定装置１は、図１に示すように、互いに向い合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面２ａ、３ａにタンパク質Ｐを固定可能な第１のプローブ２及び第２のプローブ３と、これら第１のプローブ２と第２のプローブ３とを、それぞれ主面２ａ、３ａを向い合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変手段４と、第１のプローブ２及び第２のプローブ３の撓みをそれぞれ測定する測定手段５と、該測定手段５による測定結果に基づいて、タンパク質Ｐの解析を行うパーソナルコンピュータ（以下、ＰＣと称する）（解析手段）６とを備えている。
【００４０】
上記第１のプローブ２は、例えば、シリコン支持層、酸化層及びシリコン活性層の３層を熱的に貼り合わせたＳＯＩ基板から形成されており、図２に示すように、平板状のレバー部１０と、該レバー部１０の基端側を片持ち状に支持する支持部１１とを備えている。また、レバー部１０と支持部１１との接合部分であるレバー部１０の基端側には、開口１２が形成されており、レバー部１０が基端側でより屈曲して撓み易くなっている。即ち、レバー部１０の基端側は、応力が集中する応力集中部として機能するようになっている。なお、この開口１２の数は、１つに限定されず、２つ以上形成して構わないし、形成されていなくても構わない。
【００４１】
また、支持部１１及びレバー部１０の基端側には、第１のプローブ２の撓み量に応じて抵抗値が変化する歪み検出素子であるピエゾ抵抗素子（第１のピエゾ抵抗素子）１３が、開口１２の両側にレバー部１０の長手方向に向かって設けられている。なお、このピエゾ抵抗素子１３は、ＳＯＩ基板にイオン注入法や拡散法等により不純物が注入された形成されたものである。
また、このピエゾ抵抗素子１３には、アルミニウム等の金属配線１４が電気的に接続されており、金属配線１４と併せた全体的な形状がＵ字状になるように形成されている。また、金属配線１４の端部は、２つの外部接続端子１５にそれぞれ電気的に接続されている。つまり、一方の外部接続端子１５から金属配線１４に流れた電流は、一方のピエゾ抵抗素子１３を通った後、開口１２を回り込んで他方のピエゾ抵抗素子１３に流れ、その後、他方の外部接続端子１５から外部に流れるようになっている。
なお、ピエゾ抵抗素子１３及び金属配線１４上には、図示しない絶縁膜が成膜されており、外部と電気的に接触しないようになっている。
【００４２】
また、本実施形態の第１のプローブ２は、レバー部１０の近傍に隣接してレファレンスレバー部１６が支持部１１に片持ち状態に支持されている。このレファレンスレバー部１６は、レバー部１０より長さが若干短く形成され、レバー部１０と同様に基端側に開口１２が形成されていると共に、環境条件補正用のレファレンス用ピエゾ抵抗素子（参照用素子）１７が設けられている。このレファレンス用ピエゾ抵抗素子１７にも、金属配線１４を介して外部接続端子１５が電気的に接続されている。
本実施形態では、このレファレンス用ピエゾ抵抗素子１７は、ピエゾ抵抗素子１３の温度補償のために使用される。なお、このレファレンスレバー部１６は必須ではなく、設けなくても構わない。
【００４３】
上記第２のプローブ３は、第１のプローブ２と同様に例えば、シリコン支持層、酸化層及びシリコン活性層の３層を熱的に貼り合わせたＳＯＩ基板から形成されており、図３に示すように、平板状のレバー部２０と、該レバー部２０の主面３ａ上の先端に形成された探針２０ａと、レバー部２０の基端側を片持ち状に支持する支持部２１とを備えている。また、第１のプローブ２と同様に、レバー部２０の基端側に開口２２が形成されていると共に、第２のプローブ３の撓み量に応じて抵抗値が変化する歪み検出素子であるピエゾ抵抗素子（第２のピエゾ抵抗素子）２３が、開口２２の両側にレバー部２０の長手方向に向かって設けられている。このピエゾ抵抗素子２３も同様に、金属配線２４及び２つの外部接続端子２５が電気的に接続されている。
なお、ピエゾ抵抗素子２３及び金属配線２４上には、図示しない絶縁膜が成膜されており、外部と電気的に接触しないようになっている。
【００４４】
更に、本実施形態の第２のプローブ３も第１のプローブ２と同様に、レファレンスレバー部２６が支持部２１に片持ち状態に支持されており、基端側に開口２２が形成されていると共に環境条件補正用のレファレンス用ピエゾ抵抗素子２７が設けられている。
そして、このように構成された第２のプローブ３は、支持部２１を介して図示しない架台に固定されている。
【００４５】
一方、上記第１のプローブ２は、図１に示すように、支持部１１を介して、ＸＹ方向及びＺ方向に粗動移動及び微小移動するＸＹＺステージ３０上に載置されている。これにより、第１のプローブ２と第２のプローブ３とが、ＸＹ方向及びＺ方向に対して相対的に移動して、互いの距離が可変するようになっている。このＸＹＺステージ３０は、例えば、３方向に移動可能な圧電素子であり、駆動部３１から印加された電圧に応じて３方向に移動するようになっている。即ち、これらＸＹＺステージ３０及び駆動部３１は、上記可変手段４を構成している。
【００４６】
また、第１のプローブ２及び第２のプローブ３の外部接続端子１５、２５は、それぞれ歪み検出部３２に電気的に接続されている。この歪み検出部３２は、外部接続端子１５、２５及び金属配線１４、２４を介してピエゾ抵抗素子１３、２３にそれぞれ所定の電圧を印加すると共に、両ピエゾ抵抗素子１３、２３の抵抗値変化に基づいて第１のプローブ２及び第２のプローブ３の撓み変化を算出するブリッジバランス回路（算出回路）３３とを備えている。
このブリッジバランス回路３３は、図４に示すように、４個の抵抗Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４を結線し、対向する２組の頂点の一方を入力電圧Ｅ１、他方を出力電圧Ｅ２とした回路である。ここで、第１のプローブ２のピエゾ抵抗素子１３が抵抗Ｒ２として、第２のプローブ３のピエゾ抵抗素子２３が抵抗Ｒ４として結線されている。
【００４７】
そして、このブリッジバランス回路３３は、入力電圧Ｅ１と４つの抵抗Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の各抵抗値とで決定される出力電圧Ｅ２を出力するようになっている。よって、両プローブ２、３が撓んで各ピエゾ抵抗素子１３、２３の抵抗値が変化すると、ブリッジバランス回路３３は、この抵抗変化に応じた出力電圧Ｅ２を出力する。つまり、この出力電圧Ｅ２をモニタすることで、両プローブ２、３の撓み変化を算出することができる。
特に、ブリッジバランス回路３３の出力電圧Ｅ２は、（抵抗Ｒ２とＲ４との歪みの和）から（抵抗Ｒ１と抵抗Ｒ３との歪みの和）を引いたものに比例するものである。そして、本実施形態では、両ピエゾ抵抗素子１３、２３を抵抗Ｒ２、Ｒ４として結線しているので、高感度に両プローブ２、３の撓み変化を算出することができる。
【００４８】
即ち、上記ピエゾ抵抗素子１３、２３、金属配線１４、２４、外部接続端子１５、２５及びブリッジバランス回路３３は、上述した測定手段５を構成している。そして、該測定手段５は、第１のプローブ２及び第２のプローブ３にそれぞれタンパク質Ｐを固定させた状態で、可変手段４により互いの距離を可変させている間の撓み変化を測定するようにＰＣ６に制御されている。また、ブリッジバランス回路３３は、出力電圧Ｅ２をＰＣ６に出力している。
【００４９】
一方、ＰＣ６は、送られてきた出力電圧Ｅ２に基づいて、タンパク質Ｐを引っ張る際に必要な張力（引張力）等を算出し、タンパク質Ｐの力学的性質等の構造解析を行うようになっている。また、このＰＣ６は、可変手段４等、各構成品を総合的に制御していると共に、ＸＹＺステージ３０の移動距離から、両プローブ２、３にタンパク質Ｐを固定した後の、第１のプローブ２の移動距離を算出して、移動距離に対する張力の変化具合等を算出することができるようになっている。
【００５０】
次に、このように構成された微小力測定装置１により、タンパク質Ｐを観察する生体分子観察方法について以下に説明する。
本実施形態の生体分子観察方法は、第１のプローブ２の主面２ａに、タンパク質Ｐの一端Ｐ１を固定させる第１の固定工程と、第２のプローブ３の主面３ａに設けられた探針２０ａに、タンパク質Ｐの他端Ｐ２を固定させる第２の固定工程と、第１の固定工程及び第２の固定工程後、第１のプローブ２と第２のプローブ３とを、それぞれ主面２ａ、３ａを向い合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて互いの距離を可変させる可変工程と、該可変工程中における第１のプローブ２及び第２のプローブ３の撓み変化をそれぞれ測定する測定工程と、該測定工程による測定結果に基づいて、タンパク質Ｐを解析する解析工程とを備えている。
これら各工程について、以下に詳細に説明する。
【００５１】
まず、初期設定として、第１のプローブ２の主面２ａをシラン化剤等で活性化すると共に、架橋剤等を利用してタンパク質Ｐが化学的に結合するように予め準備を行う。また、第２のプローブ３の探針２０ａの表面についても同様に、シラン化剤や架橋剤等を用いて、タンパク質Ｐが化学的に結合するように準備を行う。
次いで、図５に示すように、第１のプローブ２の主面２ａ上に、複数のタンパク質Ｐの一端Ｐ１を化学的結合により固定させる第１の固定工程を行う。
【００５２】
次いで、図６に示すように、駆動部３１からＸＹＺステージ３０に電圧を印加して、ＸＹＺステージ３０を第２のプローブ３に向けて粗動移動させる。これにより、第１のプローブ２と第２のプローブ３とが、互いに主面２ａ、３ａを向い合わせにした状態で接近する。そして、第１のプローブ２と第２のプローブ３とが一定距離接近した段階で、図７に示すように、粗動移動から微動移動に切り替える。これにより、第１のプローブ２の主面２ａ上に固定された複数のタンパク質Ｐの中から、所望するタンパク質Ｐを選択し、該タンパク質Ｐの他端Ｐ２と第２のプローブ３の探針２０ａとを接触させることができる。その結果、図８に示すように、タンパク質Ｐの他端Ｐ２を探針２０ａの先端に固定することができる。この第２の固定工程により、選択されたタンパク質Ｐは、第１のプローブ２及び第２のプローブ３に両端が固定された状態となる。
なお、第１のプローブ２の主面２ａ上に固定され、選択されなかった他のタンパク質Ｐは、図８に示すように、他端Ｐ２が自由端となった状態になっている。
【００５３】
タンパク質Ｐの固定後、再度駆動部３１からＸＹＺステージ３０に電圧を印加して、図９に示すように、ＸＹＺステージ３０をＺ方向に微動移動させ、第１のプローブ２と第２のプローブ３とを、それぞれ主面２ａ、３ａを向い合わせにした状態を維持しながら離間させる可変工程を行う。これにより、立体構造をとっているタンパク質Ｐを引き伸ばして（延伸）、１本の直線状ポリペプチドとすることができる。
そして、この可変工程を行っている間に、測定手段５により両プローブ２、３の撓み変化をそれぞれ測定する測定工程を行うと共に、該測定手段５の測定結果に基づいて、ＰＣ６によりタンパク質Ｐを解析する解析工程を行う。
【００５４】
即ち、可変工程を行っている間、両プローブ２、３はタンパク質Ｐに引っ張られるので、撓んだ状態となる。ここで、第１のプローブ２が撓むと、第１のピエゾ抵抗素子１３の抵抗値が撓み量に応じて変化する。つまり、ブリッジバランス回路３３の抵抗Ｒ２の抵抗値が変化する。また、第２のプローブ３が撓むと、第２のピエゾ抵抗素子２３の抵抗値が撓み量に応じて変化する。つまり、ブリッジバランス回路３３の抵抗Ｒ４の抵抗値が変化する。その結果、ブリッジバランス回路３３は、該撓み量に応じた出力電圧Ｅ２をＰＣ６に出力する。
そして、ＰＣ６は、送られてきた出力電圧Ｅ２から両プローブ２、３の撓み変化を測定することができ、タンパク質Ｐを一本の直線状ポリペプチドとするのに必要な張力を測定することができる。
【００５５】
また、タンパク質Ｐは、図９に示すように、通常高分子鎖が絡まった結び目（結合部位）Ａ、Ｂが存在している状態であるが、両プローブで引っ張られる際にこれら結び目Ａ、Ｂは解けてしまう。この際、結び目Ａ、Ｂが解ける直前までは、その結合力により結び目Ａ、Ｂが両プローブ２、３を引っ張る形になるので、両プローブ２、３の撓みが大きくなる。また、結び目Ａ、Ｂが解けた瞬間は、瞬間的に両プローブ２、３に作用する力が低減するので、撓みが小さくなる。
このように、可変工程中の両プローブ２、３の撓み変化を測定することで、図１０に示すように、結び目Ａ、Ｂの結合力の大きさ等の力学的性質を調べることができ、タンパク質Ｐの構造解析を行うことができる。
【００５６】
特に、本実施形態の微小力測定装置１によれば、第１のプローブ２及び第２のプローブ３として、ばね定数の小さな柔らかいプローブを利用したとしても、従来と異なり２つのプローブによりタンパク質Ｐを両端末Ｐ１、Ｐ２側から引っ張った状態で測定するので、作用反作用により両プローブ２、３にそれぞれ同じ力をかけることができる。よって、従来のように１つのプローブで測定を行う場合とは異なり、感度を約２倍に倍増することができる。つまり、ブリッジバランス回路３３の４つの抵抗Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうち、抵抗Ｒ２及びＲ４を各ピエゾ抵抗素子１３、２３の抵抗として利用できるので、より大きな出力電圧Ｅ２を出力でき、感度を増加させることができる。従って、構造解析等の力学的性質を高精度に観察することができる。
【００５７】
また、第２のプローブ３が探針２０ａを備えており、第２の固定工程の際に探針２０ａの先端にタンパク質Ｐの他端Ｐ２を固定するので、狙ったタンパク質Ｐのみを確実に探針２０ａの先端に固定することができる。よって、タンパク質Ｐを固定し易くなり、操作性が向上すると共に、固定工程にかける時間を短縮することができる。
また、一般的な光てこ方式ではなく、ピエゾ抵抗素子１３、２３による自己検知方式により撓みを測定するので、レーザ光を照射及び受光する光学系が不要となり、構成の簡略化を図ることができると共に小型化を図ることができる。
【００５８】
更に、第１のプローブ２及び第２のプローブ３は、それぞれレファレンス用ピエゾ抵抗素子１７、２７を備えているので、温度条件等の各種の環境条件により発生する電気特性の影響を相殺することができる。レファレンス用ピエゾ抵抗素子１７、２７は、それぞれ図５に示す抵抗Ｒ１と抵抗Ｒ３である。即ち、ピエゾ抵抗素子１３、２３の抵抗値は、プローブ２、３の撓み以外に、温度条件等によっても変化してしまうが、レファレンス用ピエゾ抵抗素子１７、２７を参照することで、温度による影響を相殺することができる。その結果、測定結果の信頼性をより向上することができる。
【００５９】
次に、本発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法の第２実施形態について、図１１から図１６を参照して説明する。なお、第２実施形態において第１実施形態と同一の構成については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第１実施形態と第２実施形態との異なる点は、第１実施形態では、第２のプローブ３のみに探針２０ａを設けた構成にしたが、第２実施形態では、第１のプローブ４０が、図１１に示すように、第１のプローブ３と同様にレバー部１０の先端に探針４１を備えている点である。
【００６０】
このように構成された第１のプローブ４０を利用して、タンパク質Ｐの観察を行う場合には、まず、第１のプローブ４０の探針４１の表面を、シラン化剤や架橋剤等を利用してタンパク質Ｐが化学的結合するように予め準備しておく。次いで、図１１に示すように、第１のプローブ４０をＸＹＺステージ３０により微動移動させて、タンパク質Ｐに接近させ、図１２に示すように、探針４１にタンパク質Ｐの一端Ｐ１を固定する第１の固定工程を行う。
次いで、図１３に示すように、ＸＹＺステージ３０により第１のプローブ４０を粗動移動させて、第２のプローブ３に一定距離接近させる。そして、図１４に示すように、第１のプローブ４０を微動移動させて、タンパク質Ｐの他端Ｐ２を第１のプローブ４０の探針４１に近づける。そして、図１５に示すように、第１のプローブ４０の探針４１の先端にタンパク質Ｐの他端Ｐ２を固定させる。これにより、タンパク質Ｐは、両プローブ４０、３の探針２０ａ、４１の先端にそれぞれ固定される。その後、図１６に示すように、両プローブ４０、３が離間するように第１のプローブ４０を微動移動させて、タンパク質Ｐを引っ張って測定を開始する。
【００６１】
このように、両プローブ４０、３に探針２０ａ、４１をそれぞれ設けることで、タンパク質Ｐの両端Ｐ１、Ｐ２をそれぞれより確実に固定することができる。そのため、測定対象物質であるタンパク質Ｐの量を極力少なくすることができる。よって、多量のタンパク質Ｐの測定結果が重なることがなく、より解析し易い力の変位曲線を得ることができる。
【００６２】
次に、本発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法の第３実施形態について、図１７から図２０を参照して説明する。なお、第３実施形態において第２実施形態と同一の構成については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第３実施形態と第２実施形態との異なる点は、第２実施形態では、第１のプローブ４０の探針４１にタンパク質Ｐを固定する際に、第１のプローブ４０をＸＹＺステージ３０で微動移動させながら探針４１とタンパク質Ｐの一端Ｐ１とを接近させて、固定を行ったが、第３実施形態では、タンパク質Ｐを誘電泳動させて両探針２０ａ、４１に引き寄せる点である。
【００６３】
即ち、本実施形態の両プローブ４０、３には、それぞれ主面２ａ、３ａから探針２０ａ、４１にかけて図示しない導電膜が設けられており、導電性を有する探針２０ａ、４１となっている。また、本実施形態の微小力測定装置は、導電膜を介して両探針２０ａ、４１間、即ち、第１のプローブ４０と第２のプローブ３との間に所定の電圧を印加する図示しない電圧印加手段を備えている。
【００６４】
このように構成された微小力測定装置により、タンパク質Ｐの観察を行う場合には、まず、図１７に示すように、ＸＹＺステージ３０により第１のプローブ４０を粗動移動させて第２のプローブ３に一定距離まで接近させた後、図１８に示すように、第１のプローブ４０と第２のプローブ３との間に電圧印加手段により所定の電圧を印加しながら、第１のプローブ４０を微動移動させる。すると、タンパク質Ｐは誘電泳動により両プローブ４０、３の探針４１、２０ａに引き寄せられる。その結果、図１９に示すように、タンパク質Ｐの両端Ｐ１、Ｐ２を略同じタイミングで、確実に両探針２０ａ、４１に固定することができる。
【００６５】
従って、タンパク質Ｐをさらに容易且つ確実に固定することができる。よって、操作性を向上することができると共に、固定工程にかける時間をさらに短縮することができる。
そして、タンパク質Ｐの固定後、図２０に示すように、両プローブ４０、３が離間するように第１のプローブ４０を微動移動させて、タンパク質Ｐを引っ張って測定を開始する。
【００６６】
次に、本発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法の第４実施形態について、図２１から図２３を参照して説明する。なお、第４実施形態において第３実施形態と同一の構成については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第４実施形態と第３実施形態との異なる点は、第３実施形態では、第１のプローブ４０と第２のプローブ３とが基端側が逆向きになるように対向配置されていると共に、第１のプローブ４０のみがＸＹＺステージ３０により移動可能に構成されていたのに対し、第４実施形態の微小力測定装置は、第１のプローブ４０と第２のプローブ３とが、基端側から先端側に向かう方向が同一方向を向くように平行に並んで配されており、それぞれがＸＹＺステージ３０によりＸＹＺ方向に移動可能とされている点である。
【００６７】
即ち、本実施形態の第１のプローブ４０と第２のプローブ３とは、図２１に示すように、共に同一方向を向くように平行に並んだ状態で横向きに配されている。即ち、ピンセットの如く２重に重なるように配されている。そして、両プローブ４０、３は、共にＸＹＺステージ３０によって、ＸＹ方向に移動可能に構成されている。
また、本実施形態の微小力測定装置は、第１のプローブ４０及び第２のプローブ３で固定されたタンパク質Ｐを観察する倒立顕微鏡（顕微鏡装置）４５を備えている。この倒立顕微鏡４５は、第１のプローブ４０及び第２のプローブ３の上方側に配置されている。なお、第１のプローブ４０及び第２のプローブ３の下方側に配置しても構わない。
【００６８】
このように構成された微小力測定装置によりタンパク質Ｐを観察する場合を以下に説明する。また、本実施形態の生体分子観察方法は、第１の固定工程及び第２の固定方法を行う前に、タンパク質Ｐに蛍光物質を標識させる蛍光標識工程を備え、測定工程が、可変工程中における蛍光物質の動きを観察する観察工程を備えている。
【００６９】
まず、第１の固定工程及び第２の固定工程を行う前に、上記蛍光標識工程を行う。これにより、タンパク質Ｐの各結び目が蛍光物質で標識される。この標識が終了した後、図２１に示すように、タンパク質Ｐを間に挟んだ状態で両プローブ４０、３を微動移動させて接近させる。また、これと同時に両探針２０ａ、４１間に電圧を印加させる。その結果、図２２に示すように、タンパク質Ｐを誘電泳動させて両探針２０ａ、４１に引き寄せ、タンパク質Ｐの両端Ｐ１、Ｐ２を探針２０ａ、４１にそれぞれ固定することができる。
【００７０】
この第１の固定工程及び第２の固定工程が終了した後、図２３に示すように、ＸＹＺステージ３０により両プローブ４０、３を離間させるようにそれぞれ移動させて、タンパク質Ｐを引っ張る可変工程を行う。そして、この可変工程を行っている間に、測定工程及解析工程を行うと共に、倒立顕微鏡４５により蛍光物質の動きを観察する観察工程を行う。これにより、両プローブ４０、３で引っ張られて結び目Ａ、Ｂが破断した箇所を、蛍光物質の動きにより明確に判断することができる。このように、測定手段５による測定に加え、蛍光物質及び倒立顕微鏡４５を利用した蛍光観察を行えるので、タンパク質Ｐをより多角的に観察することができる。
【００７１】
特に、自己検知方式により両プローブ４０、３の撓みを測定しているので、光てこ方式とは異なり、レーザ等の光学系を両プローブ４０、３の近傍に設置する必要がない。そのため、倒立顕微鏡４５を両プローブ４０、３の近傍に自由に設置することができる。よって、倒立顕微鏡４５の特性を十分に引き出すことができると共に、設計の自由度を向上することができる。
【００７２】
なお、上記実施形態において、第１のプローブ４０と第２のプローブ３との相対的な位置関係を維持したまま、両プローブ４０、３の向きを一体的に可変するように可変手段４を構成しても構わない。
こうすることで、第１のプローブ４０及び第２のプローブ３でタンパク質Ｐを固定した後、両プローブ４０、３の相対的な位置関係を維持したまま、向きを一体的に変化させて、タンパク質Ｐを倒立顕微鏡４５で観察し易い位置に位置させることができる。このように、測定を開始する前に、タンパク質Ｐの位置を微調整できるので、使い易く操作性が向上すると共に測定結果の信頼性を向上することができる。
【００７３】
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の変更を加えることが可能である。
【００７４】
例えば、上記各実施形態では、生体分子としてタンパク質を例にしたが、タンパク質に限られるものではない。
また、第１のプローブ又は第２のプローブの少なくともいずれか一方に探針を設けた構成にしたが、この場合に限られず、第１実施形態の第１のプローブの如く、両プローブを共に探針がない平板状のレバー部のみで構成しても構わない。この場合においても、同様の作用効果を奏することができる。
【００７５】
また、ピエゾ抵抗素子を利用した自己検知方式により、プローブの撓みを測定したが、この場合に限られず、レーザ光を利用した光てこ方式によりプローブの撓みを測定するように構成しても構わない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の第１実施形態に係る微小力測定装置の構成図である。
【図２】図１に示す微小力測定装置の第１のプローブを示す斜視図である。
【図３】図１に示す微小力測定装置の第２のプローブを示す斜視図である。
【図４】図１に示す歪み検出部が有するブリッジバランス回路を示す図である。
【図５】図１に示す微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、第１のプローブの主面にタンパク質の一端を固定させた状態を示す図である。
【図６】図１に示す微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図５に示す状態から第１のプローブを第２のプローブに向けて微動移動させている状態を示す図である。
【図７】図１に示す微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図６に示す状態から第２のプローブに所定距離接近させた後、タンパク質の他端が第２のプローブの探針に接触するように、第１のプローブを微動移動させている状態を示す図である。
【図８】図１に示す微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図７に示す状態から、第２のプローブの探針とタンパク質の他端とを固定させた状態を示す図である。
【図９】図１に示す微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図８に示す状態から、第１のプローブと第２のプローブとが離間するように第１のプローブを微動移動させて、タンパク質を引き伸ばしている状態を示す図である。
【図１０】タンパク質を引き伸ばす際に、プローブに作用する引張力（張力）の変位を示す図である。
【図１１】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、第１のプローブの探針をタンパク質の一端に接触させるように、第１のプローブを微動移動させている状態を示す図である。
【図１２】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１１に示す状態から、第１のプローブの探針にタンパク質の一端を固定させた状態を示す図である。
【図１３】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１２に示す状態から、第１のプローブを第２のプローブに向けて微動移動させている状態を示す図である。
【図１４】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１３に示す状態から第２のプローブに所定距離接近させた後、タンパク質の他端が第２のプローブの探針に接触するように、第１のプローブを微動移動させている状態を示す図である。
【図１５】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１４に示す状態から、第２のプローブの探針とタンパク質の他端とを固定させた状態を示す図である。
【図１６】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１５に示す状態から、第１のプローブと第２のプローブとが離間するように第１のプローブを微動移動させて、タンパク質を引き伸ばしている状態を示す図である。
【図１７】本発明の第３実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、タンパク質を間に挟んだ状態で、第２のプローブに向けて第１のプローブを粗動移動させている状態を示す図である。
【図１８】本発明の第３実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１７に示す状態の後、両プローブの探針間に電圧を印加させながら第１のプローブを微動移動させ、タンパク質を誘電泳動により両探針に引き寄せている状態を示す図である。
【図１９】本発明の第３実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１８に示す状態の後、両プローブの探針とタンパク質の両端とを固定させた状態を示す図である。
【図２０】本発明の第３実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１９に示す状態から、第１のプローブと第２のプローブとが離間するように第１のプローブを微動移動させて、タンパク質を引き伸ばしている状態を示す図である。
【図２１】本発明の第４実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、蛍光標識されたタンパク質を間に挟んで、ピンセット状に平行に並んだ両プローブをそれぞれ微動させながら、両探針間に所定の電圧を印加させ、タンパク質を誘電泳動により両探針間に引き寄せている状態を示す図である。
【図２２】本発明の第４実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図２０に示す状態の後、両プローブの探針とタンパク質の両端とを固定させた状態を示す図である。
【図２３】本発明の第４実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図２２に示す状態から、第１のプローブと第２のプローブとが離間するように第１のプローブを微動移動させて、倒立顕微鏡で蛍光物質の動きを観察しながら、タンパク質を引き伸ばしている状態を示す図である。
【図２４】タンパク質の構造解析を行う従来のナノ力学法を説明する図であって、カンチレバー先端の探針にタンパク質の一端を固定させた後、探針を離間させてタンパク質を引き伸ばしている状態を示す図である。
【図２５】タンパク質Ｐを引き伸ばす際に、探針に作用する引張力（張力）の変位を示す図である。
【符号の説明】
【００７７】
Ｐ タンパク質（生体分子）
Ｐ１ タンパク質の一端
Ｐ２ タンパク質の他端
１ 微小力測定装置
２、４０ 第１のプローブ
２ａ 第１のプローブの主面
３ 第２のプローブ
３ａ 第２のプローブの主面
４ 可変手段
５ 測定手段
６ ＰＣ（解析手段）
１３ ピエゾ抵抗素子（第１の歪み検出素子、第１のピエゾ抵抗素子）
１７、２７ レファレンス用ピエゾ抵抗素子（参照用素子）
２０ａ 第２のプローブの探針
２３ ピエゾ抵抗素子（第２の歪み検出素子、第２のピエゾ抵抗素子）
３３ ブリッジバランス回路（算出回路）
４１ 第１のプローブの探針
４５ 倒立顕微鏡（顕微鏡装置）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質等の生体分子の構造解析等、各種の観察を行う微小力測定装置及び生体分子観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポストゲノム時代を迎え、分子生物学的なアプローチから、ＤＮＡやタンパク質をはじめとした生体分子や細胞等の生体試料の形態観察や機能解析への高分解能、多機能観察が求められている。その中で、ＤＮＡ、ＲＮＡやタンパク質等の生体分子の長さを測定したり、幾何学的な構造や力学的な性質等の各種の機能を調べたりすることは、生体分子の解析（解明）に繋がるので、生化学、医学を始めとする多くの分野において非常に有益に行われている。
このような解析においては、生体分子、例えば、例えば、立体構造をとっているタンパク質を両端末付近から引き伸ばして１本の直線状のポリペプチドとすることでタンパク質の力学的な性質を調べて構造解析を行うタンパク質ナノ力学法が知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
この方法は、図２４に示すように、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ；Atomic Force Microscope）等の走査型プローブ顕微鏡のプローブ５０を利用してタンパク質Ｐを引き伸ばす方法である。
まず、図２４に示すように、基板５１とカンチレバー５２の先端に設けられた探針５３とを、シラン化剤等で活性化すると共に、架橋剤等を使用してタンパク質Ｐの両端末近傍を化学的結合により固定する。固定後、プローブ５０を基板表面から離間するようにゆっくりと移動させる。これにより、タンパク質Ｐが徐々に引き伸ばされる。この際、図２５に示すように、カンチレバー５２に作用する力（張力）の測定を行う。これにより、タンパク質Ｐの力学的な性質を調べることができ、タンパク質Ｐの構造解析を行うことができる。
【０００４】
特に、タンパク質Ｐは、その種類によっては、引き伸ばされる前の立体構造の段階において、局所的に高分子鎖が絡まった結び目（結合部分）（図２４で示すＡ、Ｂ）が生じる場合がある。この場合には、上述した引っ張り操作をしたときに、各結び目Ａ、Ｂが離れる（結合が離れる）。この結び目Ａ、Ｂが離れた場合には、図２５に示すように、カンチレバー５２に作用する張力が瞬間的に低減する。また、この際の張力の低減具合を見ることで、各結び目Ａ、Ｂの結合力の大きさ等を検出することができる。
【０００５】
このように、タンパク質の力学的性質を調べることで、タンパク質を力学視点から見ることができ、より多角的な構造解析等を行うことができる。ところで、この力学的性質を調べるには、プローブの撓みを検出することが必要とされる。これは、探針にかかる力がプローブの撓みとして現れるためである。
【０００６】
この撓みの検出方法は、各種の方法があるが、その１つとして自己検知方式が知られている（例えば、特許文献１参照）。
この自己検知方式は、プローブ自体に、該プローブが撓むことで抵抗値が変化するピエゾ抵抗体を設け、この抵抗値の変化量をプローブの撓み量として検出する方法である。なお、この時のプローブにかかる力Ｆは、Ｆ＝ｋ（プローブのばね定数）×ｘ（プローブの撓み量（変位量））で表される。
【特許文献１】特開平９−３０４４０９号公報
【非特許文献１】竹安邦夫、「ナノバイオロジー ナノテクノロジーによる生命科学」、初版、共立出版株式会社、２００４年７月１５日、ｐ.５２−６１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記従来の自己検知方式による方法では、以下の問題が残されていた。
即ち、生体分子を測定する際、特にタンパク質の延伸測定を行う際には、微小な力で結合している結合部分を明確に検出するため、ばね定数の大きな硬いプローブを使用せずに、ばね定数の小さな柔らかいプローブを使用するのが一般的である。ところが、自己検知方式の場合には、上述したようにプローブにかかる力Ｆは、Ｆ＝ｋ×ｘで表されるので、柔らかいばね定数のプローブを用いたときに、変位量に対する抵抗値の変化が少なくなってしまう。その結果、感度が劣ってしまい、タンパク質等の生体分子を正確に測定し難いものであった。
【０００８】
この発明は、このような事情を考慮してなされたもので、その目的は、感度の低下を防止しながらタンパク質等の生体分子を正確に測定して、構造解析等の力学的性質を高精度に観察することができる微小力測定装置及び生体分子観察方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、この発明は以下の手段を提供している。
本発明の微小力測定装置は、互いに向かい合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面に生体分子を固定可能な第１のプローブ及び第２のプローブと、該第１のプローブと第２のプローブとを、それぞれ前記主面を向かい合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変手段と、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの撓みをそれぞれ測定する測定手段と、該測定手段による測定結果に基づいて、前記生体分子の解析を行う解析手段とを備え、前記測定手段が、前記第１のプローブ及び第２のプローブにそれぞれ前記生体分子を固定させた状態で、前記可変手段により互いの距離を可変させている間の撓み変化を測定することを特徴とするものである。
【００１０】
また、本発明の生体分子観察方法は、互いに向かい合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面に生体分子を固定可能な第１のプローブ及び第２のプローブを利用して、生体分子を観察する生体分子観察方法であって、前記第１のプローブの前記主面に、前記生体分子の一端を固定させる第１の固定工程と、前記第２のプローブの前記主面に、前記生体分子の他端を固定させる第２の固定工程と、前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程後、前記第１のプローブと前記第２のプローブとを、それぞれ前記主面を向い合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変工程と、該可変工程中における、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの撓み変化をそれぞれ測定する測定工程と、該測定工程による測定結果に基づいて、前記生体分子を解析する解析工程とを備えていることを特徴とするものである。
【００１１】
この発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法においては、まず、第１のプローブの主面をシラン化剤等で活性化すると共に架橋剤等を使用して、タンパク質等の生体分子の一端を化学的結合により固定させる第１の固定工程を行う。次いで、可変手段により第２のプローブと第１のプローブとを相対的に移動させて接近させ、第２のプローブの主面に生体分子の他端を固定する第２の固定工程を行う。これにより、生体分子は、第１のプローブの主面及び第２のプローブの主面にそれぞれ両端が固定された状態となる。
【００１２】
生体分子の固定後、可変手段により、第１のプローブと第２のプローブとをそれぞれ主面を向かい合わせにした状態を維持しながら相対的に離間させる可変工程を行う。これにより、例えば、立体構造をとっているタンパク質は、両端末で引き伸ばされて（延伸）、１本の直線状ポリペプチドとなる。また、この可変工程を行っている間に、測定手段により両プローブの撓み変化をそれぞれ測定する測定工程を行う。そして、この測定工程による測定結果に基づいて、解析手段により生体分子を解析する解析工程を行う。
【００１３】
これにより、例えば、上述した直線状のポリペプチドとするのに必要な張力を測定することができる。また、タンパク質は、通常高分子鎖が絡まった結び目（結合部位）が存在している状態であるが、両プローブで引っ張られる際、これら結び目は解けてしまう。この際、例えば、結び目が解ける直前までは、その結合力により結び目が両プローブを引っ張る形になるので、両プローブの撓みが大きくなる。また、結び目が解けた瞬間は、瞬間的に両プローブに作用する力が低減するので、撓みが小さくなる。
このように、測定工程及び解析工程を行うことで、直線状ポリペプチドとするのに必要な張力や、結び目の結合力の大きさ等の力学的性質を調べることができ、タンパク質の構造解析を行うことができる。
【００１４】
特に、第１のプローブ及び第２のプローブとして、ばね定数の小さな柔らかいプローブを利用したとしても、従来と異なり２つのプローブにより生体分子を両端末から引っ張った状態で測定を行うので、作用反作用により両プローブにそれぞれ同じ力をかけることができる。よって、従来のように１つのプローブで測定を行う場合とは異なり、感度を約２倍に倍増することができる。従って、タンパク質等の生体分子を正確に測定することができ、構造解析等の力学的性質を高精度に観察することができる
また、２つのプローブで生体分子の両端末を引っ張るので、従来の場合と比べて、同じ力を加えるときに移動させる距離を伸ばすことができ、移動分解能を向上することができる。
【００１５】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明の微小力測定装置において、前記第１のプローブ又は前記第２のプローブの少なくともいずれか一方が、前記主面に探針を備えていることを特徴とするものである。
【００１６】
この発明に係る微小力測定装置においては、第１のプローブ又は第２のプローブの少なくともいずれか一方は、主面に探針を備えているので、タンパク質等の生体分子を固定する際に、狙った生体分子のみを確実に探針の先端に固定することができる。そのため、測定対象物質である生体分子の量を極力少なくすることができる。よって、多量の生体分子の測定結果が重なることがなく、より解析し易い力の変位曲線を得ることができる。
【００１７】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明の微小力測定装置において、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの主面にそれぞれ形成された導電膜と、該導電膜を介して、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間に所定の電圧を印加する電圧印加手段とを備えていることを特徴とするものである。
【００１８】
また、本発明の生体分子観察方法は、上記本発明の生体分子観察方法において、前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程が、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間に所定の電圧を印加して、前記生体分子を誘電泳動させて第１のプローブ及び第２のプローブの主面にそれぞれ固定させることを特徴とするものである。
【００１９】
この発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法においては、第１の固定工程及び第２の固定工程の際に、電圧印加手段により導電膜を介して第１のプローブと第２のプローブとの間に所定の電圧を印加することで、タンパク質等の生体分子を誘電泳動させて両プローブの主面に引き寄せることができる。よって、生体分子の両端を略同じタイミングで、確実に両プローブに固定することができる。従って、生体分子をより容易に固定することができ、固定工程にかける時間をさらに短縮することができる。また、タンパク質が１分子であっても、容易且つ確実に両プローブに固定することができる。
【００２０】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明のいずれかの微小力測定装置において、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブが、基端側から先端側に向かう方向が同一方向を向くように平行に並んで配されていることを特徴とするものである。
【００２１】
この発明に係る微小力測定装置においては、第１のプローブと第２のプローブとが、共に同一方向を向くように平行に並んで配されている。即ち、ピンセットの如く２重に重なるように配されている。よって、第１のプローブ及び第２のプローブが占める設置スペースを極力抑えることができ、小型化を図ることができる。また、両プローブの基端側を片側に揃えることができるので、可変手段により動かし易くなり、構成の簡略化を図ることができる。
【００２２】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明のいずれかの微小力測定装置において、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブで固定された前記生体分子を観察する顕微鏡装置を備えていることを特徴とするものである。
【００２３】
この発明に係る微小力測定装置においては、両プローブで生体分子を引っ張っている最中に、倒立顕微鏡等の顕微鏡装置により生体分子を、例えば、蛍光観察することができる。このように、測定手段による測定に加え、顕微鏡装置を利用して同時に各種の観察（例えば、タンパク質のどの結合部位が離れたか等の観察）を行えるので、生体分子をより多角的に観察することができる。
【００２４】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明の微小力測定装置において、前記可変手段が、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの相対的な位置関係を維持したまま、両プローブの向きを一体的に可変可能であることを特徴とするものである。
【００２５】
この発明に係る微小力測定装置においては、第１のプローブ及び第２のプローブに生体分子の両端をそれぞれ固定した後、可変手段により両プローブの相対的な位置関係を維持したまま、両プローブの向きを一体的に変化させることができる。これにより、生体分子を顕微鏡装置で観察し易い位置に位置させることができる。そして、この位置調整の後に、顕微鏡装置で観察を行いながら測定を行う。このように、顕微鏡装置で観察を行う前に、生体分子の位置を調整できるので、使い易く操作性が向上すると共に測定結果の信頼性を向上することができる。
【００２６】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明のいずれかの微小力測定装置において、前記測定手段が、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブにそれぞれ設けられ、撓み量に応じて抵抗値が変化する第１の歪み検出素子及び第２の歪み検出素子と、両歪み検出素子の抵抗値変化に基づいて、第１のプローブ及び第２のプローブの撓み変化を算出する算出回路とを備えていることを特徴とするものである。
【００２７】
この発明に係る微小力測定装置においては、第１のプローブ及び第２のプローブにそれぞれ設けられた歪み検出素子を利用した自己検知方式により、撓み変化（歪み変化）を検出する。即ち、第１のプローブが撓むと、撓み量に応じて第１の歪み検出素子の抵抗値が変化する。また、同様に第２のプローブが撓むと、撓み量に応じて第２の歪み検出素子の抵抗値が変化する。そして、ホイートストンブリッジ回路等の算出回路は、この両歪み検出素子の抵抗値変化に基づいて、両プローブの撓み変化を算出する。
このように、一般的な光てこ方式ではなく、自己検知方式により撓みを測定できるので、レーザ光を照射及び受光する光学系が不要となり、構成の簡略化を図ることができると共に、小型化を図ることができる。
【００２８】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明の微小力測定装置において、前記歪み検出素子が、ピエゾ抵抗素子であることを特徴とするものである。
【００２９】
この発明に係る微小力測定装置においては、歪み検出素子がピエゾ抵抗素子であるので、半導体プロセスを利用して容易且つ高精度に、狙った場所に作りこむことができる。よって、より正確に両プローブの撓み（歪み）を検出することができる。
【００３０】
また、本発明の微小力測定装置は、上記本発明の微小力測定装置において、前記第１の歪み検出素子及び前記第２の歪み検出素子の近傍に、環境条件補正用の参照用素子を備えていることを特徴とするものである。
【００３１】
この発明に係る微小力測定装置においては、参照用素子を備えているので、温度条件等の各種の環状条件により発生する電気特性の影響を相殺することができる。よって、両歪み検出素子の抵抗値を温度等の環境条件に影響されずに、撓み量に応じてより正確に変化させることができる。その結果、測定結果の信頼性を向上することができる。
【００３２】
また、本発明の生体分子観察方法は、上記本発明の生体分子観察方法において、前記第１の固定工程が、前記第１のプローブの前記主面に設けられた探針に、前記生体分子の一端を固定することを特徴とするものである。
【００３３】
この発明に係る生体分子観察方法においては、タンパク質等の生体分子の一端を固定する際に、狙った生体分子のみを確実に探針の先端に固定することができる。そのため、測定対象物質である生体分子の量を極力少なくすることができる。よって、多量の生体分子の測定結果が重なることがなく、より解析し易い力の変位曲線を得ることができる。
【００３４】
また、本発明の生体分子観察方法は、上記本発明の生体分子観察方法において、前記第２の固定工程が、前記第２のプローブの前記主面に設けられた探針に、前記生体分子の他端を固定することを特徴とするものである。
【００３５】
この発明に係る生体分子観察方法においては、タンパク質等の生体分子の他端を固定する際に、狙った生体分子のみを確実に探針の先端に固定することができる。そのため、測定対象物質である生体分子の量を極力少なくすることができる。よって、多量の生体分子の測定結果が重なることがなく、より解析し易い力の変位曲線を得ることができる。
【００３６】
また、本発明の生体分子観察方法は、上記本発明のいずれかの生体分子観察方法において、前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程を行う前に、前記生体分子に蛍光物質を標識させる蛍光標識工程を備え、前記測定工程が、前記可変工程中における前記蛍光物質の動きを観察する観察工程を備えていることを特徴とするものである。
【００３７】
この発明に係る生体分子観察方法によれば、まず、第１の固定工程及び第２の工程を行う前に、生体分子に蛍光物質を標識させる蛍光標識工程を行う。これにより、例えば、タンパク質の結び目が蛍光物質で標識される。その後、可変工程中に、倒立顕微鏡等により蛍光物質の動きを観察する観察工程を行う。これにより、両プローブで引っ張られて結び目が破断した箇所を、蛍光物質の動きにより明確に判断することができる。
このように、測定手段による測定に加え、蛍光物質を利用した各種の観察を行えるので、生体分子をより多角的に観察することができる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法によれば、第１のプローブ及び第２のプローブとして、ばね定数の小さな柔らかいプローブを利用したとしても、２つのプローブを利用して生体分子を両端末側から引っ張った状態で測定を行うので、作用反作用により両プローブにそれぞれ同じ力をかけることができる。よって、従来のように１つのプローブで測定を行う場合とは異なり、感度を約２倍に倍増することができる。従って、タンパク質等の生体分子を正確に測定することができ、構造解析等の力学的性質を高精度に観察することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、本発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法の第１実施形態について、図１から図１０を参照して説明する。なお、本実施形態では、生体分子として、タンパク質を例にして説明する。
本実施形態の微小力測定装置１は、図１に示すように、互いに向い合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面２ａ、３ａにタンパク質Ｐを固定可能な第１のプローブ２及び第２のプローブ３と、これら第１のプローブ２と第２のプローブ３とを、それぞれ主面２ａ、３ａを向い合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変手段４と、第１のプローブ２及び第２のプローブ３の撓みをそれぞれ測定する測定手段５と、該測定手段５による測定結果に基づいて、タンパク質Ｐの解析を行うパーソナルコンピュータ（以下、ＰＣと称する）（解析手段）６とを備えている。
【００４０】
上記第１のプローブ２は、例えば、シリコン支持層、酸化層及びシリコン活性層の３層を熱的に貼り合わせたＳＯＩ基板から形成されており、図２に示すように、平板状のレバー部１０と、該レバー部１０の基端側を片持ち状に支持する支持部１１とを備えている。また、レバー部１０と支持部１１との接合部分であるレバー部１０の基端側には、開口１２が形成されており、レバー部１０が基端側でより屈曲して撓み易くなっている。即ち、レバー部１０の基端側は、応力が集中する応力集中部として機能するようになっている。なお、この開口１２の数は、１つに限定されず、２つ以上形成して構わないし、形成されていなくても構わない。
【００４１】
また、支持部１１及びレバー部１０の基端側には、第１のプローブ２の撓み量に応じて抵抗値が変化する歪み検出素子であるピエゾ抵抗素子（第１のピエゾ抵抗素子）１３が、開口１２の両側にレバー部１０の長手方向に向かって設けられている。なお、このピエゾ抵抗素子１３は、ＳＯＩ基板にイオン注入法や拡散法等により不純物が注入された形成されたものである。
また、このピエゾ抵抗素子１３には、アルミニウム等の金属配線１４が電気的に接続されており、金属配線１４と併せた全体的な形状がＵ字状になるように形成されている。また、金属配線１４の端部は、２つの外部接続端子１５にそれぞれ電気的に接続されている。つまり、一方の外部接続端子１５から金属配線１４に流れた電流は、一方のピエゾ抵抗素子１３を通った後、開口１２を回り込んで他方のピエゾ抵抗素子１３に流れ、その後、他方の外部接続端子１５から外部に流れるようになっている。
なお、ピエゾ抵抗素子１３及び金属配線１４上には、図示しない絶縁膜が成膜されており、外部と電気的に接触しないようになっている。
【００４２】
また、本実施形態の第１のプローブ２は、レバー部１０の近傍に隣接してレファレンスレバー部１６が支持部１１に片持ち状態に支持されている。このレファレンスレバー部１６は、レバー部１０より長さが若干短く形成され、レバー部１０と同様に基端側に開口１２が形成されていると共に、環境条件補正用のレファレンス用ピエゾ抵抗素子（参照用素子）１７が設けられている。このレファレンス用ピエゾ抵抗素子１７にも、金属配線１４を介して外部接続端子１５が電気的に接続されている。
本実施形態では、このレファレンス用ピエゾ抵抗素子１７は、ピエゾ抵抗素子１３の温度補償のために使用される。なお、このレファレンスレバー部１６は必須ではなく、設けなくても構わない。
【００４３】
上記第２のプローブ３は、第１のプローブ２と同様に例えば、シリコン支持層、酸化層及びシリコン活性層の３層を熱的に貼り合わせたＳＯＩ基板から形成されており、図３に示すように、平板状のレバー部２０と、該レバー部２０の主面３ａ上の先端に形成された探針２０ａと、レバー部２０の基端側を片持ち状に支持する支持部２１とを備えている。また、第１のプローブ２と同様に、レバー部２０の基端側に開口２２が形成されていると共に、第２のプローブ３の撓み量に応じて抵抗値が変化する歪み検出素子であるピエゾ抵抗素子（第２のピエゾ抵抗素子）２３が、開口２２の両側にレバー部２０の長手方向に向かって設けられている。このピエゾ抵抗素子２３も同様に、金属配線２４及び２つの外部接続端子２５が電気的に接続されている。
なお、ピエゾ抵抗素子２３及び金属配線２４上には、図示しない絶縁膜が成膜されており、外部と電気的に接触しないようになっている。
【００４４】
更に、本実施形態の第２のプローブ３も第１のプローブ２と同様に、レファレンスレバー部２６が支持部２１に片持ち状態に支持されており、基端側に開口２２が形成されていると共に環境条件補正用のレファレンス用ピエゾ抵抗素子２７が設けられている。
そして、このように構成された第２のプローブ３は、支持部２１を介して図示しない架台に固定されている。
【００４５】
一方、上記第１のプローブ２は、図１に示すように、支持部１１を介して、ＸＹ方向及びＺ方向に粗動移動及び微小移動するＸＹＺステージ３０上に載置されている。これにより、第１のプローブ２と第２のプローブ３とが、ＸＹ方向及びＺ方向に対して相対的に移動して、互いの距離が可変するようになっている。このＸＹＺステージ３０は、例えば、３方向に移動可能な圧電素子であり、駆動部３１から印加された電圧に応じて３方向に移動するようになっている。即ち、これらＸＹＺステージ３０及び駆動部３１は、上記可変手段４を構成している。
【００４６】
また、第１のプローブ２及び第２のプローブ３の外部接続端子１５、２５は、それぞれ歪み検出部３２に電気的に接続されている。この歪み検出部３２は、外部接続端子１５、２５及び金属配線１４、２４を介してピエゾ抵抗素子１３、２３にそれぞれ所定の電圧を印加すると共に、両ピエゾ抵抗素子１３、２３の抵抗値変化に基づいて第１のプローブ２及び第２のプローブ３の撓み変化を算出するブリッジバランス回路（算出回路）３３とを備えている。
このブリッジバランス回路３３は、図４に示すように、４個の抵抗Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４を結線し、対向する２組の頂点の一方を入力電圧Ｅ１、他方を出力電圧Ｅ２とした回路である。ここで、第１のプローブ２のピエゾ抵抗素子１３が抵抗Ｒ２として、第２のプローブ３のピエゾ抵抗素子２３が抵抗Ｒ４として結線されている。
【００４７】
そして、このブリッジバランス回路３３は、入力電圧Ｅ１と４つの抵抗Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の各抵抗値とで決定される出力電圧Ｅ２を出力するようになっている。よって、両プローブ２、３が撓んで各ピエゾ抵抗素子１３、２３の抵抗値が変化すると、ブリッジバランス回路３３は、この抵抗変化に応じた出力電圧Ｅ２を出力する。つまり、この出力電圧Ｅ２をモニタすることで、両プローブ２、３の撓み変化を算出することができる。
特に、ブリッジバランス回路３３の出力電圧Ｅ２は、（抵抗Ｒ２とＲ４との歪みの和）から（抵抗Ｒ１と抵抗Ｒ３との歪みの和）を引いたものに比例するものである。そして、本実施形態では、両ピエゾ抵抗素子１３、２３を抵抗Ｒ２、Ｒ４として結線しているので、高感度に両プローブ２、３の撓み変化を算出することができる。
【００４８】
即ち、上記ピエゾ抵抗素子１３、２３、金属配線１４、２４、外部接続端子１５、２５及びブリッジバランス回路３３は、上述した測定手段５を構成している。そして、該測定手段５は、第１のプローブ２及び第２のプローブ３にそれぞれタンパク質Ｐを固定させた状態で、可変手段４により互いの距離を可変させている間の撓み変化を測定するようにＰＣ６に制御されている。また、ブリッジバランス回路３３は、出力電圧Ｅ２をＰＣ６に出力している。
【００４９】
一方、ＰＣ６は、送られてきた出力電圧Ｅ２に基づいて、タンパク質Ｐを引っ張る際に必要な張力（引張力）等を算出し、タンパク質Ｐの力学的性質等の構造解析を行うようになっている。また、このＰＣ６は、可変手段４等、各構成品を総合的に制御していると共に、ＸＹＺステージ３０の移動距離から、両プローブ２、３にタンパク質Ｐを固定した後の、第１のプローブ２の移動距離を算出して、移動距離に対する張力の変化具合等を算出することができるようになっている。
【００５０】
次に、このように構成された微小力測定装置１により、タンパク質Ｐを観察する生体分子観察方法について以下に説明する。
本実施形態の生体分子観察方法は、第１のプローブ２の主面２ａに、タンパク質Ｐの一端Ｐ１を固定させる第１の固定工程と、第２のプローブ３の主面３ａに設けられた探針２０ａに、タンパク質Ｐの他端Ｐ２を固定させる第２の固定工程と、第１の固定工程及び第２の固定工程後、第１のプローブ２と第２のプローブ３とを、それぞれ主面２ａ、３ａを向い合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて互いの距離を可変させる可変工程と、該可変工程中における第１のプローブ２及び第２のプローブ３の撓み変化をそれぞれ測定する測定工程と、該測定工程による測定結果に基づいて、タンパク質Ｐを解析する解析工程とを備えている。
これら各工程について、以下に詳細に説明する。
【００５１】
まず、初期設定として、第１のプローブ２の主面２ａをシラン化剤等で活性化すると共に、架橋剤等を利用してタンパク質Ｐが化学的に結合するように予め準備を行う。また、第２のプローブ３の探針２０ａの表面についても同様に、シラン化剤や架橋剤等を用いて、タンパク質Ｐが化学的に結合するように準備を行う。
次いで、図５に示すように、第１のプローブ２の主面２ａ上に、複数のタンパク質Ｐの一端Ｐ１を化学的結合により固定させる第１の固定工程を行う。
【００５２】
次いで、図６に示すように、駆動部３１からＸＹＺステージ３０に電圧を印加して、ＸＹＺステージ３０を第２のプローブ３に向けて粗動移動させる。これにより、第１のプローブ２と第２のプローブ３とが、互いに主面２ａ、３ａを向い合わせにした状態で接近する。そして、第１のプローブ２と第２のプローブ３とが一定距離接近した段階で、図７に示すように、粗動移動から微動移動に切り替える。これにより、第１のプローブ２の主面２ａ上に固定された複数のタンパク質Ｐの中から、所望するタンパク質Ｐを選択し、該タンパク質Ｐの他端Ｐ２と第２のプローブ３の探針２０ａとを接触させることができる。その結果、図８に示すように、タンパク質Ｐの他端Ｐ２を探針２０ａの先端に固定することができる。この第２の固定工程により、選択されたタンパク質Ｐは、第１のプローブ２及び第２のプローブ３に両端が固定された状態となる。
なお、第１のプローブ２の主面２ａ上に固定され、選択されなかった他のタンパク質Ｐは、図８に示すように、他端Ｐ２が自由端となった状態になっている。
【００５３】
タンパク質Ｐの固定後、再度駆動部３１からＸＹＺステージ３０に電圧を印加して、図９に示すように、ＸＹＺステージ３０をＺ方向に微動移動させ、第１のプローブ２と第２のプローブ３とを、それぞれ主面２ａ、３ａを向い合わせにした状態を維持しながら離間させる可変工程を行う。これにより、立体構造をとっているタンパク質Ｐを引き伸ばして（延伸）、１本の直線状ポリペプチドとすることができる。
そして、この可変工程を行っている間に、測定手段５により両プローブ２、３の撓み変化をそれぞれ測定する測定工程を行うと共に、該測定手段５の測定結果に基づいて、ＰＣ６によりタンパク質Ｐを解析する解析工程を行う。
【００５４】
即ち、可変工程を行っている間、両プローブ２、３はタンパク質Ｐに引っ張られるので、撓んだ状態となる。ここで、第１のプローブ２が撓むと、第１のピエゾ抵抗素子１３の抵抗値が撓み量に応じて変化する。つまり、ブリッジバランス回路３３の抵抗Ｒ２の抵抗値が変化する。また、第２のプローブ３が撓むと、第２のピエゾ抵抗素子２３の抵抗値が撓み量に応じて変化する。つまり、ブリッジバランス回路３３の抵抗Ｒ４の抵抗値が変化する。その結果、ブリッジバランス回路３３は、該撓み量に応じた出力電圧Ｅ２をＰＣ６に出力する。
そして、ＰＣ６は、送られてきた出力電圧Ｅ２から両プローブ２、３の撓み変化を測定することができ、タンパク質Ｐを一本の直線状ポリペプチドとするのに必要な張力を測定することができる。
【００５５】
また、タンパク質Ｐは、図９に示すように、通常高分子鎖が絡まった結び目（結合部位）Ａ、Ｂが存在している状態であるが、両プローブで引っ張られる際にこれら結び目Ａ、Ｂは解けてしまう。この際、結び目Ａ、Ｂが解ける直前までは、その結合力により結び目Ａ、Ｂが両プローブ２、３を引っ張る形になるので、両プローブ２、３の撓みが大きくなる。また、結び目Ａ、Ｂが解けた瞬間は、瞬間的に両プローブ２、３に作用する力が低減するので、撓みが小さくなる。
このように、可変工程中の両プローブ２、３の撓み変化を測定することで、図１０に示すように、結び目Ａ、Ｂの結合力の大きさ等の力学的性質を調べることができ、タンパク質Ｐの構造解析を行うことができる。
【００５６】
特に、本実施形態の微小力測定装置１によれば、第１のプローブ２及び第２のプローブ３として、ばね定数の小さな柔らかいプローブを利用したとしても、従来と異なり２つのプローブによりタンパク質Ｐを両端末Ｐ１、Ｐ２側から引っ張った状態で測定するので、作用反作用により両プローブ２、３にそれぞれ同じ力をかけることができる。よって、従来のように１つのプローブで測定を行う場合とは異なり、感度を約２倍に倍増することができる。つまり、ブリッジバランス回路３３の４つの抵抗Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうち、抵抗Ｒ２及びＲ４を各ピエゾ抵抗素子１３、２３の抵抗として利用できるので、より大きな出力電圧Ｅ２を出力でき、感度を増加させることができる。従って、構造解析等の力学的性質を高精度に観察することができる。
【００５７】
また、第２のプローブ３が探針２０ａを備えており、第２の固定工程の際に探針２０ａの先端にタンパク質Ｐの他端Ｐ２を固定するので、狙ったタンパク質Ｐのみを確実に探針２０ａの先端に固定することができる。よって、タンパク質Ｐを固定し易くなり、操作性が向上すると共に、固定工程にかける時間を短縮することができる。
また、一般的な光てこ方式ではなく、ピエゾ抵抗素子１３、２３による自己検知方式により撓みを測定するので、レーザ光を照射及び受光する光学系が不要となり、構成の簡略化を図ることができると共に小型化を図ることができる。
【００５８】
更に、第１のプローブ２及び第２のプローブ３は、それぞれレファレンス用ピエゾ抵抗素子１７、２７を備えているので、温度条件等の各種の環境条件により発生する電気特性の影響を相殺することができる。レファレンス用ピエゾ抵抗素子１７、２７は、それぞれ図５に示す抵抗Ｒ１と抵抗Ｒ３である。即ち、ピエゾ抵抗素子１３、２３の抵抗値は、プローブ２、３の撓み以外に、温度条件等によっても変化してしまうが、レファレンス用ピエゾ抵抗素子１７、２７を参照することで、温度による影響を相殺することができる。その結果、測定結果の信頼性をより向上することができる。
【００５９】
次に、本発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法の第２実施形態について、図１１から図１６を参照して説明する。なお、第２実施形態において第１実施形態と同一の構成については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第１実施形態と第２実施形態との異なる点は、第１実施形態では、第２のプローブ３のみに探針２０ａを設けた構成にしたが、第２実施形態では、第１のプローブ４０が、図１１に示すように、第１のプローブ３と同様にレバー部１０の先端に探針４１を備えている点である。
【００６０】
このように構成された第１のプローブ４０を利用して、タンパク質Ｐの観察を行う場合には、まず、第１のプローブ４０の探針４１の表面を、シラン化剤や架橋剤等を利用してタンパク質Ｐが化学的結合するように予め準備しておく。次いで、図１１に示すように、第１のプローブ４０をＸＹＺステージ３０により微動移動させて、タンパク質Ｐに接近させ、図１２に示すように、探針４１にタンパク質Ｐの一端Ｐ１を固定する第１の固定工程を行う。
次いで、図１３に示すように、ＸＹＺステージ３０により第１のプローブ４０を粗動移動させて、第２のプローブ３に一定距離接近させる。そして、図１４に示すように、第１のプローブ４０を微動移動させて、タンパク質Ｐの他端Ｐ２を第１のプローブ４０の探針４１に近づける。そして、図１５に示すように、第１のプローブ４０の探針４１の先端にタンパク質Ｐの他端Ｐ２を固定させる。これにより、タンパク質Ｐは、両プローブ４０、３の探針２０ａ、４１の先端にそれぞれ固定される。その後、図１６に示すように、両プローブ４０、３が離間するように第１のプローブ４０を微動移動させて、タンパク質Ｐを引っ張って測定を開始する。
【００６１】
このように、両プローブ４０、３に探針２０ａ、４１をそれぞれ設けることで、タンパク質Ｐの両端Ｐ１、Ｐ２をそれぞれより確実に固定することができる。そのため、測定対象物質であるタンパク質Ｐの量を極力少なくすることができる。よって、多量のタンパク質Ｐの測定結果が重なることがなく、より解析し易い力の変位曲線を得ることができる。
【００６２】
次に、本発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法の第３実施形態について、図１７から図２０を参照して説明する。なお、第３実施形態において第２実施形態と同一の構成については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第３実施形態と第２実施形態との異なる点は、第２実施形態では、第１のプローブ４０の探針４１にタンパク質Ｐを固定する際に、第１のプローブ４０をＸＹＺステージ３０で微動移動させながら探針４１とタンパク質Ｐの一端Ｐ１とを接近させて、固定を行ったが、第３実施形態では、タンパク質Ｐを誘電泳動させて両探針２０ａ、４１に引き寄せる点である。
【００６３】
即ち、本実施形態の両プローブ４０、３には、それぞれ主面２ａ、３ａから探針２０ａ、４１にかけて図示しない導電膜が設けられており、導電性を有する探針２０ａ、４１となっている。また、本実施形態の微小力測定装置は、導電膜を介して両探針２０ａ、４１間、即ち、第１のプローブ４０と第２のプローブ３との間に所定の電圧を印加する図示しない電圧印加手段を備えている。
【００６４】
このように構成された微小力測定装置により、タンパク質Ｐの観察を行う場合には、まず、図１７に示すように、ＸＹＺステージ３０により第１のプローブ４０を粗動移動させて第２のプローブ３に一定距離まで接近させた後、図１８に示すように、第１のプローブ４０と第２のプローブ３との間に電圧印加手段により所定の電圧を印加しながら、第１のプローブ４０を微動移動させる。すると、タンパク質Ｐは誘電泳動により両プローブ４０、３の探針４１、２０ａに引き寄せられる。その結果、図１９に示すように、タンパク質Ｐの両端Ｐ１、Ｐ２を略同じタイミングで、確実に両探針２０ａ、４１に固定することができる。
【００６５】
従って、タンパク質Ｐをさらに容易且つ確実に固定することができる。よって、操作性を向上することができると共に、固定工程にかける時間をさらに短縮することができる。
そして、タンパク質Ｐの固定後、図２０に示すように、両プローブ４０、３が離間するように第１のプローブ４０を微動移動させて、タンパク質Ｐを引っ張って測定を開始する。
【００６６】
次に、本発明に係る微小力測定装置及び生体分子観察方法の第４実施形態について、図２１から図２３を参照して説明する。なお、第４実施形態において第３実施形態と同一の構成については、同一の符号を付しその説明を省略する。
第４実施形態と第３実施形態との異なる点は、第３実施形態では、第１のプローブ４０と第２のプローブ３とが基端側が逆向きになるように対向配置されていると共に、第１のプローブ４０のみがＸＹＺステージ３０により移動可能に構成されていたのに対し、第４実施形態の微小力測定装置は、第１のプローブ４０と第２のプローブ３とが、基端側から先端側に向かう方向が同一方向を向くように平行に並んで配されており、それぞれがＸＹＺステージ３０によりＸＹＺ方向に移動可能とされている点である。
【００６７】
即ち、本実施形態の第１のプローブ４０と第２のプローブ３とは、図２１に示すように、共に同一方向を向くように平行に並んだ状態で横向きに配されている。即ち、ピンセットの如く２重に重なるように配されている。そして、両プローブ４０、３は、共にＸＹＺステージ３０によって、ＸＹ方向に移動可能に構成されている。
また、本実施形態の微小力測定装置は、第１のプローブ４０及び第２のプローブ３で固定されたタンパク質Ｐを観察する倒立顕微鏡（顕微鏡装置）４５を備えている。この倒立顕微鏡４５は、第１のプローブ４０及び第２のプローブ３の上方側に配置されている。なお、第１のプローブ４０及び第２のプローブ３の下方側に配置しても構わない。
【００６８】
このように構成された微小力測定装置によりタンパク質Ｐを観察する場合を以下に説明する。また、本実施形態の生体分子観察方法は、第１の固定工程及び第２の固定方法を行う前に、タンパク質Ｐに蛍光物質を標識させる蛍光標識工程を備え、測定工程が、可変工程中における蛍光物質の動きを観察する観察工程を備えている。
【００６９】
まず、第１の固定工程及び第２の固定工程を行う前に、上記蛍光標識工程を行う。これにより、タンパク質Ｐの各結び目が蛍光物質で標識される。この標識が終了した後、図２１に示すように、タンパク質Ｐを間に挟んだ状態で両プローブ４０、３を微動移動させて接近させる。また、これと同時に両探針２０ａ、４１間に電圧を印加させる。その結果、図２２に示すように、タンパク質Ｐを誘電泳動させて両探針２０ａ、４１に引き寄せ、タンパク質Ｐの両端Ｐ１、Ｐ２を探針２０ａ、４１にそれぞれ固定することができる。
【００７０】
この第１の固定工程及び第２の固定工程が終了した後、図２３に示すように、ＸＹＺステージ３０により両プローブ４０、３を離間させるようにそれぞれ移動させて、タンパク質Ｐを引っ張る可変工程を行う。そして、この可変工程を行っている間に、測定工程及解析工程を行うと共に、倒立顕微鏡４５により蛍光物質の動きを観察する観察工程を行う。これにより、両プローブ４０、３で引っ張られて結び目Ａ、Ｂが破断した箇所を、蛍光物質の動きにより明確に判断することができる。このように、測定手段５による測定に加え、蛍光物質及び倒立顕微鏡４５を利用した蛍光観察を行えるので、タンパク質Ｐをより多角的に観察することができる。
【００７１】
特に、自己検知方式により両プローブ４０、３の撓みを測定しているので、光てこ方式とは異なり、レーザ等の光学系を両プローブ４０、３の近傍に設置する必要がない。そのため、倒立顕微鏡４５を両プローブ４０、３の近傍に自由に設置することができる。よって、倒立顕微鏡４５の特性を十分に引き出すことができると共に、設計の自由度を向上することができる。
【００７２】
なお、上記実施形態において、第１のプローブ４０と第２のプローブ３との相対的な位置関係を維持したまま、両プローブ４０、３の向きを一体的に可変するように可変手段４を構成しても構わない。
こうすることで、第１のプローブ４０及び第２のプローブ３でタンパク質Ｐを固定した後、両プローブ４０、３の相対的な位置関係を維持したまま、向きを一体的に変化させて、タンパク質Ｐを倒立顕微鏡４５で観察し易い位置に位置させることができる。このように、測定を開始する前に、タンパク質Ｐの位置を微調整できるので、使い易く操作性が向上すると共に測定結果の信頼性を向上することができる。
【００７３】
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、種々の変更を加えることが可能である。
【００７４】
例えば、上記各実施形態では、生体分子としてタンパク質を例にしたが、タンパク質に限られるものではない。
また、第１のプローブ又は第２のプローブの少なくともいずれか一方に探針を設けた構成にしたが、この場合に限られず、第１実施形態の第１のプローブの如く、両プローブを共に探針がない平板状のレバー部のみで構成しても構わない。この場合においても、同様の作用効果を奏することができる。
【００７５】
また、ピエゾ抵抗素子を利用した自己検知方式により、プローブの撓みを測定したが、この場合に限られず、レーザ光を利用した光てこ方式によりプローブの撓みを測定するように構成しても構わない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明の第１実施形態に係る微小力測定装置の構成図である。
【図２】図１に示す微小力測定装置の第１のプローブを示す斜視図である。
【図３】図１に示す微小力測定装置の第２のプローブを示す斜視図である。
【図４】図１に示す歪み検出部が有するブリッジバランス回路を示す図である。
【図５】図１に示す微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、第１のプローブの主面にタンパク質の一端を固定させた状態を示す図である。
【図６】図１に示す微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図５に示す状態から第１のプローブを第２のプローブに向けて微動移動させている状態を示す図である。
【図７】図１に示す微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図６に示す状態から第２のプローブに所定距離接近させた後、タンパク質の他端が第２のプローブの探針に接触するように、第１のプローブを微動移動させている状態を示す図である。
【図８】図１に示す微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図７に示す状態から、第２のプローブの探針とタンパク質の他端とを固定させた状態を示す図である。
【図９】図１に示す微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図８に示す状態から、第１のプローブと第２のプローブとが離間するように第１のプローブを微動移動させて、タンパク質を引き伸ばしている状態を示す図である。
【図１０】タンパク質を引き伸ばす際に、プローブに作用する引張力（張力）の変位を示す図である。
【図１１】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、第１のプローブの探針をタンパク質の一端に接触させるように、第１のプローブを微動移動させている状態を示す図である。
【図１２】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１１に示す状態から、第１のプローブの探針にタンパク質の一端を固定させた状態を示す図である。
【図１３】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１２に示す状態から、第１のプローブを第２のプローブに向けて微動移動させている状態を示す図である。
【図１４】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１３に示す状態から第２のプローブに所定距離接近させた後、タンパク質の他端が第２のプローブの探針に接触するように、第１のプローブを微動移動させている状態を示す図である。
【図１５】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１４に示す状態から、第２のプローブの探針とタンパク質の他端とを固定させた状態を示す図である。
【図１６】本発明の第２実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１５に示す状態から、第１のプローブと第２のプローブとが離間するように第１のプローブを微動移動させて、タンパク質を引き伸ばしている状態を示す図である。
【図１７】本発明の第３実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、タンパク質を間に挟んだ状態で、第２のプローブに向けて第１のプローブを粗動移動させている状態を示す図である。
【図１８】本発明の第３実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１７に示す状態の後、両プローブの探針間に電圧を印加させながら第１のプローブを微動移動させ、タンパク質を誘電泳動により両探針に引き寄せている状態を示す図である。
【図１９】本発明の第３実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１８に示す状態の後、両プローブの探針とタンパク質の両端とを固定させた状態を示す図である。
【図２０】本発明の第３実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図１９に示す状態から、第１のプローブと第２のプローブとが離間するように第１のプローブを微動移動させて、タンパク質を引き伸ばしている状態を示す図である。
【図２１】本発明の第４実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、蛍光標識されたタンパク質を間に挟んで、ピンセット状に平行に並んだ両プローブをそれぞれ微動させながら、両探針間に所定の電圧を印加させ、タンパク質を誘電泳動により両探針間に引き寄せている状態を示す図である。
【図２２】本発明の第４実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図２０に示す状態の後、両プローブの探針とタンパク質の両端とを固定させた状態を示す図である。
【図２３】本発明の第４実施形態に係る微小力測定装置により、タンパク質の構造解析を行う生体分子観察方法の一例を示した工程図であって、図２２に示す状態から、第１のプローブと第２のプローブとが離間するように第１のプローブを微動移動させて、倒立顕微鏡で蛍光物質の動きを観察しながら、タンパク質を引き伸ばしている状態を示す図である。
【図２４】タンパク質の構造解析を行う従来のナノ力学法を説明する図であって、カンチレバー先端の探針にタンパク質の一端を固定させた後、探針を離間させてタンパク質を引き伸ばしている状態を示す図である。
【図２５】タンパク質Ｐを引き伸ばす際に、探針に作用する引張力（張力）の変位を示す図である。
【符号の説明】
【００７７】
Ｐ タンパク質（生体分子）
Ｐ１ タンパク質の一端
Ｐ２ タンパク質の他端
１ 微小力測定装置
２、４０ 第１のプローブ
２ａ 第１のプローブの主面
３ 第２のプローブ
３ａ 第２のプローブの主面
４ 可変手段
５ 測定手段
６ ＰＣ（解析手段）
１３ ピエゾ抵抗素子（第１の歪み検出素子、第１のピエゾ抵抗素子）
１７、２７ レファレンス用ピエゾ抵抗素子（参照用素子）
２０ａ 第２のプローブの探針
２３ ピエゾ抵抗素子（第２の歪み検出素子、第２のピエゾ抵抗素子）
３３ ブリッジバランス回路（算出回路）
４１ 第１のプローブの探針
４５ 倒立顕微鏡（顕微鏡装置）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに向かい合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面に生体分子を固定可能な第１のプローブ及び第２のプローブと、
該第１のプローブと第２のプローブとを、それぞれ前記主面を向かい合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変手段と、
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの撓みをそれぞれ測定する測定手段と、
該測定手段による測定結果に基づいて、前記生体分子の解析を行う解析手段とを備え、
前記測定手段は、前記第１のプローブ及び第２のプローブにそれぞれ前記生体分子を固定させた状態で、前記可変手段により互いの距離を可変させている間の撓み変化を測定することを特徴とする微小力測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の微小力測定装置において、
前記第１のプローブ又は前記第２のプローブの少なくともいずれか一方は、前記主面に探針を備えていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の微小力測定装置において、
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの主面にそれぞれ形成された導電膜と、
該導電膜を介して、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間に所定の電圧を印加する電圧印加手段とを備えていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の微小力測定装置において、
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブは、基端側から先端側に向かう方向が同一方向を向くように平行に並んで配されていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の微小力測定装置において、
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブで固定された前記生体分子を観察する顕微鏡装置を備えていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項６】
請求項５に記載の微小力測定装置において、
前記可変手段は、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの相対的な位置関係を維持したまま、両プローブの向きを一体的に可変可能であることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の微小力測定装置において、
前記測定手段は、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブにそれぞれ設けられ、撓み量に応じて抵抗値が変化する第１の歪み検出素子及び第２の歪み検出素子と、両歪み検出素子の抵抗値変化に基づいて、第１のプローブ及び第２のプローブの撓み変化を算出する算出回路とを備えていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項８】
請求項７に記載の微小力測定装置において、
前記歪み検出素子は、ピエゾ抵抗素子であることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の微小力測定装置において、
前記第１の歪み検出素子及び前記第２の歪み検出素子の近傍に、環境条件補正用の参照用素子を備えていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項１０】
互いに向かい合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面に生体分子を固定可能な第１のプローブ及び第２のプローブを利用して、生体分子を観察する生体分子観察方法であって、
前記第１のプローブの前記主面に、前記生体分子の一端を固定させる第１の固定工程と、
前記第２のプローブの前記主面に、前記生体分子の他端を固定させる第２の固定工程と、
前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程後、前記第１のプローブと前記第２のプローブとを、それぞれ前記主面を向い合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変工程と、
該可変工程中における、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの撓み変化をそれぞれ測定する測定工程と、
該測定工程による測定結果に基づいて、前記生体分子を解析する解析工程とを備えていることを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の生体分子観察方法において、
前記第１の固定工程は、前記第１のプローブの前記主面に設けられた探針に、前記生体分子の一端を固定することを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の生体分子観察方法において、
前記第２の固定工程は、前記第２のプローブの前記主面に設けられた探針に、前記生体分子の他端を固定することを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか１項に記載の生体分子観察方法において、
前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程は、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間に所定の電圧を印加して、前記生体分子を誘電泳動させて第１のプローブ及び第２のプローブの主面にそれぞれ固定させることを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれか１項に記載の生体分子観察方法において、
前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程を行う前に、前記生体分子に蛍光物質を標識させる蛍光標識工程を備え、
前記測定工程が、前記可変工程中における前記蛍光物質の動きを観察する観察工程を備えていることを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項１】
互いに向かい合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面に生体分子を固定可能な第１のプローブ及び第２のプローブと、
該第１のプローブと第２のプローブとを、それぞれ前記主面を向かい合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変手段と、
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの撓みをそれぞれ測定する測定手段と、
該測定手段による測定結果に基づいて、前記生体分子の解析を行う解析手段とを備え、
前記測定手段は、前記第１のプローブ及び第２のプローブにそれぞれ前記生体分子を固定させた状態で、前記可変手段により互いの距離を可変させている間の撓み変化を測定することを特徴とする微小力測定装置。
【請求項２】
請求項１に記載の微小力測定装置において、
前記第１のプローブ又は前記第２のプローブの少なくともいずれか一方は、前記主面に探針を備えていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の微小力測定装置において、
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの主面にそれぞれ形成された導電膜と、
該導電膜を介して、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間に所定の電圧を印加する電圧印加手段とを備えていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の微小力測定装置において、
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブは、基端側から先端側に向かう方向が同一方向を向くように平行に並んで配されていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の微小力測定装置において、
前記第１のプローブ及び前記第２のプローブで固定された前記生体分子を観察する顕微鏡装置を備えていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項６】
請求項５に記載の微小力測定装置において、
前記可変手段は、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの相対的な位置関係を維持したまま、両プローブの向きを一体的に可変可能であることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の微小力測定装置において、
前記測定手段は、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブにそれぞれ設けられ、撓み量に応じて抵抗値が変化する第１の歪み検出素子及び第２の歪み検出素子と、両歪み検出素子の抵抗値変化に基づいて、第１のプローブ及び第２のプローブの撓み変化を算出する算出回路とを備えていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項８】
請求項７に記載の微小力測定装置において、
前記歪み検出素子は、ピエゾ抵抗素子であることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の微小力測定装置において、
前記第１の歪み検出素子及び前記第２の歪み検出素子の近傍に、環境条件補正用の参照用素子を備えていることを特徴とする微小力測定装置。
【請求項１０】
互いに向かい合うように対向配置され、それぞれ先端が自由端となるように片持ち状に形成されて主面に生体分子を固定可能な第１のプローブ及び第２のプローブを利用して、生体分子を観察する生体分子観察方法であって、
前記第１のプローブの前記主面に、前記生体分子の一端を固定させる第１の固定工程と、
前記第２のプローブの前記主面に、前記生体分子の他端を固定させる第２の固定工程と、
前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程後、前記第１のプローブと前記第２のプローブとを、それぞれ前記主面を向い合わせにした状態を維持しながら相対的に接近又は離間させて、互いの距離を可変させる可変工程と、
該可変工程中における、前記第１のプローブ及び前記第２のプローブの撓み変化をそれぞれ測定する測定工程と、
該測定工程による測定結果に基づいて、前記生体分子を解析する解析工程とを備えていることを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の生体分子観察方法において、
前記第１の固定工程は、前記第１のプローブの前記主面に設けられた探針に、前記生体分子の一端を固定することを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の生体分子観察方法において、
前記第２の固定工程は、前記第２のプローブの前記主面に設けられた探針に、前記生体分子の他端を固定することを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項１３】
請求項１０から１２のいずれか１項に記載の生体分子観察方法において、
前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程は、前記第１のプローブと前記第２のプローブとの間に所定の電圧を印加して、前記生体分子を誘電泳動させて第１のプローブ及び第２のプローブの主面にそれぞれ固定させることを特徴とする生体分子観察方法。
【請求項１４】
請求項１０から１３のいずれか１項に記載の生体分子観察方法において、
前記第１の固定工程及び前記第２の固定工程を行う前に、前記生体分子に蛍光物質を標識させる蛍光標識工程を備え、
前記測定工程が、前記可変工程中における前記蛍光物質の動きを観察する観察工程を備えていることを特徴とする生体分子観察方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公開番号】特開２００７−１２０９６７（Ｐ２００７−１２０９６７Ａ）
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３０９６９１（Ｐ２００５−３０９６９１）
【出願日】平成１７年１０月２５日（２００５．１０．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）「国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１７年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）／物性・生体情報ナノマッピングシステム（機能性ナノプローブ）」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願）」
【出願人】（０００００２３２５）セイコーインスツル株式会社 (3,629)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２５日（２００５．１０．２５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）「国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１７年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「基盤技術研究促進事業（民間基盤技術研究支援制度）／物性・生体情報ナノマッピングシステム（機能性ナノプローブ）」、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願）」
【出願人】（０００００２３２５）セイコーインスツル株式会社 (3,629)
【Ｆターム（参考）】
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