微生物による代謝工学および産物形成の改善のための方法および手段
本発明は、生化学、分子生物学および微生物学の領域に関する。より詳しくは、本発明は、糸状体微生物または低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌による、代謝工学および産物形成の改善のための方法および手段に関する。本発明は、ＤａｓＲおよびＤａｓＲ結合部位が、微生物中の遺伝子の発現の制御において、重要かつ普遍的な役割を果たすことを開示している。この発見に基づいて、本発明は、目的遺伝子の発現を調節するための方法、代謝を制御するための方法、不要な発現を減少させるための方法などのような、多数の有用な適用を提供する。さらに、本発明はまた、前記方法を確立するために使用可能な方法、たとえば特定の遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位が、前記遺伝子によってコードされたタンパク質（必要または不要タンパク質）の発現の増加または減少を得るように改変された微生物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学、分子生物学および微生物学の領域に関する。より詳しくは、本発明は、糸状体微生物または低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌による、代謝工学および産物形成を改善する方法および手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状体微生物は、抗生物質、抗がん剤、抗真菌剤および酵素のような産物の工業生産者として広く使用されている（Bennett、1998；Demain、1991；Hopwoodら、1995）。これらの微生物には、真核糸状体真菌（子嚢菌）および原核放線菌（たとえばアミコラトプシス（Amycolatopsis）、ノカルディア（Nocardia）、サーモビフィド（Thermobifido）およびストレプトミセス（Streptomyces））が含まれる。抗生物質および酵素の市場資本は、合計で、それぞれ年間２８０および２０億ドルである。土壌居住放線菌ストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor)は、細菌発達および構成物産出の研究に対する重要なモデル系を構築している(Locci、1986）。ストレプトミセスコロニーは、気中胞子形成菌糸とは異なる栄養菌糸の網を形成する（Chater、1998）。これらの形態形成は、栄養制限に際して変化する、複雑な、空間的広がりのある、そして一時的な遺伝的にプログラムされたスキームによって制御される（Schauerら、1998；Willeyら、1991）。放線菌は、ポリサッカライドセルロース、キシランおよびキチンからなる、真核植物、真菌および昆虫の有機化合物のリサイクリングおよび栄養化における主要な主役であり、地球上のもっとも豊富な炭素供給源である（Hodgson、2000）。したがって、これらはまた、再生可能な供給源に対する我々の探求において、重要な役割を果たしている。興味深いことに、放線菌のゲノム配列の研究によって、驚くべき多数の潜在性抗生物質生合成クラスターと、工業的に可能性のある新規酵素が明らかになり、したがって、薬物および酵素を含む、天然産物の直接的発見に対する新たな挑戦が提示される（Hopwood、2003）。たとえば、選択的増殖条件が、エンジイン型抗がん抗生物質のために、正常休眠生合成クラスターを誘導可能である、新規スクリーニング技術が確立された（Zazopoulosら、2003）。
【０００３】
細菌における広範囲な規制には、異なる細胞工程の遺伝子、オペロンおよびレギュロンの発現を調整する、多様活性転写因子の存在が含まれる（Martinez-AntonioおよびCollado-Vides、2003）。大腸菌（Escherichia coli）は、その遺伝子のおよそ半分を共に調節する７つの包括的な転写因子を持つ。もっとも目立つものは、約２００の標的遺伝子を直接制御している、環状ＡＭＰレセプタータンパク質Ｃｒｐである（BrucknerおよびTitgemeyer、2002；Gossetら、2004；Zhangら、2005）。Ｃｒｐは、遺伝的調節因子のパラダイムを表しており、到達したテキストブック状態を持つその特性および大腸菌内の他の炭素供給源のＣｒｐ−ｃＡＭＰ仲介調節がおそらく、遺伝子発現を調整する機構を例示するためのもっとも古典的な例である。そのような多様調節の覆いを取り除くことが、本発明者らの細菌の生活様式の理解のために重要であり、炭素触媒カタボライトリプレッション（ＣＣＲ）におけるＣｒｐの役割の説明以来、炭素利用に専念した研究者らは、他の微生物における状況を議論するために、このモデルをいつも参照する。したがって、代謝物制御タンパク質ＣｃｐＡは同様に、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌における包括的な調節因子であり、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）中、３００以上の遺伝子を制御する（Morenoら、2001；TitgemeyerおよびHillen、2002）。ＣｃｐＡは、ＣＣＲ、解糖、窒素同化、およびリン酸代謝に関与する遺伝子を制御する（BrucknerおよびTitgemeyer、2002)。
【０００４】
今まで、放線菌における炭素利用の研究は、広範囲の制御因子を発見できず、個々の糖鎖レギュロンを制御している特定の調節因子の例が得られただけである（HindleおよびSmith、1994；Parcheら、1999；van Wezelら、1997）。興味深いことに、放線菌は、エネルギーを多くの糖鎖特異的ＡＢＣトランスポーターに提供するためのマスタースイッチとしてＭｓｉＫを用いて、ＣＣＲから基質誘導へのシフトを全体的に調節するために、制御因子／センサー要素の他のカテゴリーに特権を与えた（Hurtubiseら、1995；Schlosserら、1997；Schlosserら、1999；Schlosserら、2000）。しかしながら、炭化水素代謝に関連した小数の遺伝子の上流を同定した保存調節モチーフが、炭素制御に専念したリサーチコミュニティーに興味を引きつけ、おそらく広範囲の制御因子が存在するであろうという考えを維持した（Nothaftら、2003；Rigaliら、2004；Studholmeら、2004）。へリックス−ターン−へリックスＧｎｔＲファミリーの本発明者らのコンピュータ解析（Rigaliら、2002）によって最近、ＤａｓＲ（ＳＣＯ５２３１）が、特にＮ−アセチルグルコサミンの取り込みに対するホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳNag）を調節すると予測する、新規シス／トランス調節コードを同定された（Rigaliら、2004）。
【発明の開示】
【０００５】
本発明者らは、タンパク質ＤａｓＲが、微生物における多重工程に関与する調節マスタースイッチであることを開示する。
【０００６】
第一の実施形態において、本発明は、ＤａｓＲ結合部位コンセンサス配列を、候補配列と比較すること、および少なくとも５．０のマトリックススコアを持つ候補配列を選択することを含む、発現がＤａｓＲ−様タンパク質によって制御される遺伝子を同定するための方法を提供する。
【０００７】
ＤａｓＲタンパク質は、放線菌において高い相同性を示している。これらのＤａｓＲタンパク質のすべてが、ＤＮＡ結合モチーフ、好ましくは、へリックス−ターン−へリックスＤＮＡ結合モチーフを含む。図１４は、放線菌のＤａｓＲ相同物のアライメントを示している。ＤＮＡ結合モチーフは、大体タンパク質の最初の８０アミノ酸中に存在する（もっとも重要な形跡が、図１４にて、へリックス−ターン−へリックスドメインに関して、ＨＴＨによって示唆されている）。図２０は、１０の異なる放線菌からの、ＤａｓＲ結合モチーフのアライメントを表している。タンパク質の第二の部分（およそ８０〜２５５）が、他のＧｎｔＲ−型転写制御因子のエフェクター結合ドメイン（ＥＢＤ）に対して相同性を持ち、したがってグルコサミン−６−Ｐの結合が発生することが予想される場所である。
【０００８】
ＤａｓＲ−様タンパク質は典型的に、好ましくは、放線菌から得た／由来したＤａｓＲタンパク質またはその機能的等価物および／または機能的断片であり、ＤａｓＲタンパク質は、以上で概略した特徴を含み、すなわちＤＮＡ結合ドメイン、ＥＢＤを含み、およびたとえば、（コンセンサス）ＤａｓＲ結合部位へ結合可能である。ＤａｓＲタンパク質の例は、図１４（ＡまたはＢまたはＣ）にて示されているＤａｓＲタンパク質である。当業者には、たとえばストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）からのＤａｓＲタンパク質を、たとえば、点変異または（小）欠損を導入することによって、以上で概略した特徴を明らかに変更することなしに改変可能であることが明らかである。したがって、ＤａｓＲ−様タンパク質は、おそらく、前記ＤａｓＲ−様タンパク質の（コンセンサス）ＤａｓＲ結合部位（またはＤａｓＲ標的部位：語句は本明細書で互換的に使用される）への結合をあきらかに干渉しない変異を含む、好ましくは、たとえば、ストレプトミセス クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）、ストレプトミセス アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトミセス スカビエス（Streptomyces scabies）、ストレプトミセス種１３９またはサーモビフィド フスカ（Thermobifido fusca）から得た、ＤａｓＲタンパク質である。ストレプトコッカス クラブリゲルスＤａｓＲ配列が、本発明者らによって決定され、核酸配列ならびにアミノ酸配列を図１９に描写している。したがって、また他の実施形態において、本発明は、図１９Ｂにて描写されたようなタンパク質をコードしている単離または組換え核酸を提供する。好ましい実施形態において、前記核酸は、図１９Ａにて描写されたような核酸である。
【０００９】
種々の他の放線菌中のＤａｓＲのＤＮＡ結合モチーフ間の違いの程度を確立するために、本発明者らは、いくつかの他の放線菌からのｄａｓＲの相当する部分のＤＮＡ配列を決定し、アミノ酸配列（図２０）を導き出した。このことは、放線菌ｄａｓＲ遺伝子のＤＮＡ結合モチーフおよびそれらの遺伝子産物が非常に高く保存されており、すべての放線菌中で、同一の結合部位に結合することを示している。したがって、他の好ましい実施形態において、ＤａｓＲのＤＮＡ結合モチーフは、図２０にて提供されるコンセンサス配列のものと一致する。
【００１０】
図１４ＡまたはＢより、ＤａｓＲ−様タンパク質が、放線菌から由来するだけでなく、ストレプトコッカス（Streptococcus）のような低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌からも由来可能であることが明らかである。さらに、図１４Ｃより、本発明にしたがった方法または手段を、ストレプトミセス コエリカラーにて同定されたものであるＤａｓＲ相同物で実施／提供可能でもあることが明らかである。したがって、語句ＤａｓＲ−様タンパク質は、放線菌からのＤａｓＲタンパク質のみでなく、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌の、または任意の言及した有機体にて同定されたＤａｓＲ相同物も含む。
【００１１】
放線菌中のＤａｓＲ結合部位（ｄｒｅ）に対するコンセンサス配列は、ＮＮ（Ｔ／Ａ）ＧＧ（Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）Ｔ（Ａ／Ｇ）Ｎ（Ａ／Ｔ）Ｃ（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｃ）Ｎであり、（すべての公知のＤａｓＲ結合部位の８０％以上で発生する）もっとも高く保存されたヌクレオチドに下線を引いている。好ましい実施形態において、コンセンサス配列は、（Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ａ）ＧＧＴＣＴＡＮＡＣＣＡＮである。より好ましい実施形態において、放線菌中のＤａｓＲ結合部位は、ＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡ（Ｇ／Ｃ）である。Ｎは任意のヌクレオチド（Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ）であり、たとえば（Ｔ／Ａ）のような、丸括弧間の２つのヌクレオチドは、言及されたヌクレオチドの１つが存在することを意味する。特定の例において、ＴまたはＡである。
【００１２】
放線菌中のＤａｓＲ結合部位に対するコンセンサス配列をまた、他の細菌、好ましくはグラム陽性細菌における部位を探すために使用する。バチルス（Bacillis）種に対する同定されたコンセンサス配列は、（Ａ／Ｇ）Ｎ（Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）Ｔ（Ｃ／Ａ）ＴＡ（Ｇ／Ｔ）Ａ（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ）であり、ラクトコッカス（Lactococcus）種に対しては、Ａ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ｃ）（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ａ）ＴＡＴＡＴＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）Ｔであり、リステリア（Literia）種に対しては、Ａ（Ｔ／Ｃ）（Ｔ／Ｃ）（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）Ｔ（Ａ／Ｃ）ＴＡ（Ｔ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）Ｔであり、ストレプトコッカス（Streptococcus）種に対しては、（Ａ／Ｔ）（Ｔ／Ａ）Ｔ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｃ）ＴＡ（Ｔ／Ｇ）Ｎ（Ｃ／Ａ）（Ｃ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｔ）（Ｔ／Ａ）である。再び、Ｎは任意のヌクレオチド（Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ）でありえ、たとえば（Ａ／Ｇ）のような、丸括弧間の２つのヌクレオチドは、言及されたヌクレオチドの１つが存在することを意味する。特定の例において、ＡまたはＧである。したがって本発明は、ＤａｓＲ結合部位コンセンサス配列を候補配列と比較すること、および少なくとも５．０のマトリックススコアを持つ候補配列を選別することを含む、発現がＤａｓＲ−様タンパク質によって制御される遺伝子を同定するための方法を提供し、前記遺伝子は、好ましくは、相当する同定されたＤａｓＲ結合部位コンセンサス配列との組合せで、放線菌、バチルス、ラクトコッカス、リステリアまたはストレプトコッカス中に存在する。
【００１３】
好ましくは、発現がＤａｓＲ−様タンパク質によって制御される候補遺伝子を、位置加重マトリックスを用いて決定する。マトリックススコアを、Rigaliら、2004によって、また本発明の物質および方法にて記述された方法にしたがって決定する。簡単に記すと、公知のＤａｓＲ結合部位の組を、標的有機体、たとえばストレプトミセス コエリカラーにおける第一検索を実施するために使用する。これによって結果として新規部位となり、実験的に検証される。得られた公知の標的を使用して、位置加重マトリックスを構築し、これを、標的有機体の完全なレギュロンを予想するために使用する。
【００１４】
好ましい実施形態において、候補配列は、少なくとも７．０のマトリックススコアを持つ。より好ましくは、スコアは９．０と等しいか、より高い。試験した９以上のスコアを持つすべての標的が、ＤａｓＲによって結合されるとわかった。
【００１５】
またより好ましい実施形態において、本発明にしたがった方法にはさらに、前記選択された候補配列の発現が、実際にＤａｓＲによって制御されるかどうかを試験することが含まれる。これはたとえば、ＤａｓＲ−様タンパク質の、前記選択された、同定された候補配列への結合を試験することによって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
ＤａｓＲ結合部位は典型的に、目的遺伝子の上流に局在する。表２は、目的遺伝子の転写開始部位に対する、ＤａｓＲ結合部位の位置を示している。より詳しくは、非限定的解釈にて、ＤａｓＲ結合部位が、目的遺伝子のプロモーターの上流に局在する場合、前記目的遺伝子の転写における活性化の役割をもつ可能性がある。反対に、ＤａｓＲ結合部位がプロモーターと重なる場合、またはその下流に局在する場合、前記目的遺伝子の転写のリプレッサーとして機能する可能性がある。しかしながら、いくつかの証明されたＤａｓＲ結合部位が、目的遺伝子の内部で見つかった。この１つの例が、Ｓ．オリバセオビリジス（S.olivaceoviridis）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｑ８ＧＢＴ８）の標的遺伝子ｍａｌＸ２である。この場合、ｄｒｅ部位（ＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣ）は、Ｓ．コエリカラーｍａｌＸ２（ＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＴ；表２中＃３、マトリックススコア１６．２）のものとほとんど同一であるが、転写開始部位のｎｔ位置＋３６〜＋５１間で局在する。ＤａｓＲのこの部位への結合は、二本鎖オリゴヌクレオチド上のＥＭＳＡによって証明された。したがって、ＤａｓＲ結合部位が、目的遺伝子の上流および内部両方で機能的でありうることが明らかである。
【００１７】
上記方法にて、本発明者らは、主要および二次代謝のためのレギュロンを含む、２００以上の遺伝子が、ＤａｓＲによって直接制御されることを、（新規および限定的ＤａｓＲ結合部位位置加重マトリックスを用いることによって）確立した。これらの遺伝子は、表２にて記述した約１３０転写ユニットから由来する。同定された遺伝子は、（表１Ｂにて要約した）糖またはアミノ糖代謝に関連した遺伝子、またはポリサッカライド分解に関与する遺伝子のような、異なる遺伝子のカテゴリーまたは遺伝子に属する。ＤａｓＲ標的のリストにはまた、転写因子も含まれ、したがって、ＤａｓＲ標的がまた、間接転写制御にも関与すると結論づけられる。ＤａｓＲによって制御／調節される遺伝子の多様性は大きく、したがって、本発明者らは、ＤａｓＲを、微生物における遺伝子発現の調節におけるマスタースイッチであると考える。
【００１８】
今や本発明者らが、ＤａｓＲおよびＤａｓＲ結合部位が、微生物における遺伝子発現の制御において、そのような重要かつ普遍的役割を果たすことを開示しているから、本発明は、目的遺伝子の発現を制御するための方法、代謝を制御するための方法、望まない発現を減少させるための方法などのような、多数の有用な適用を提供する。さらに、本発明はまた、前記方法を確立するために利用可能な方法を提供し、たとえば、特定の遺伝子と動作可能に結合するＤａｓＲ結合部位を、前記遺伝子によってコードされた（必要または不要タンパク質である）タンパク質の発現の増加または減少を得るために改変し得る。方法および手段の他の例が以下の記述で提供されるであろう。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明は、微生物に、前記目的遺伝子と動作可能に結合したＤａｓ−結合部位、またはその産物が前記目的遺伝子の発現に関与する遺伝子と動作可能に結合したＤａｓＲ−結合部位への、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の、目的遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。
【００２０】
目的遺伝子の発現を調節するための前記方法は、目的遺伝子の発現を増加させるための方法、または目的遺伝子の発現を減少させるための方法でありうる。これは、とりわけ、前記目的遺伝子の発現が望ましいか、または望ましくないか、に依存する。目的遺伝子の発現が望まれる場合、発現は好ましく増加し、目的遺伝子の発現が望まれない（すなわち望まない）場合、発現が好ましく減少される。ＤａｓＲ−様タンパク質の、ＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な前記化合物の活性が結果として、前記タンパク質と前記部位間の結合の増加、または減少となるに違いなく、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ結合部位への結合に際して、前記目的遺伝子の発現が、抑制されるか、または活性化されるかに依存する。表２（ならびに表４）より、遺伝子の発現が、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合に際して抑制されること（たとえば、表２の＃１、３、５または７）、およびＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合に際して、他の遺伝子の発現が活性化されること（たとえば表２の＃１３）が明らかである。正しい活性経路を決定するためのすべての必要な情報が、本明細書で提示されている。さらに、特定の遺伝子またはオペロンの発現が活性化される、または抑制されるかどうかにおける情報が、マイクロアレイアプローチを用いることによって展開される。そのような実験の１つの例が、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の遺伝子の発現の、ＤａｓＲ−様タンパク質、（ヌル）変異体を含む微生物中の遺伝子の発現に対する比較である。他の例は、誘導体分子（たとえばグルコサミン−６−Ｐ）の存在する状態、または存在しない状態で増殖したＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の遺伝子の発現の比較である。また他の例は、ＣｈＩＰ−オン−チップアプローチと呼ばれるものを利用することであり、ＤａｓＲ−様タンパク質結合ＤＮＡ断片がマイクロアレイにハイブリッド形成される。これは、ＤａｓＲによって直接結合した標的を同定する。
【００２１】
後に、より詳細に議論するように、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物は、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物、または前記タンパク質をコードしている核酸から前記ＤａｓＲ−様タンパク質を発現可能な有機体である。さらに、前記微生物は、ＤａｓＲ−様タンパク質を発現可能な性質によっての有機体でありえ、またはＤａｓＲ−様タンパク質を産出するように遺伝的に改変された微生物でありうる。さらに、（内因性）ＤａｓＲ−様タンパク質をすでに発現可能な微生物に、よりＤａｓＲ−タンパク質の産出を可能にするさらなる核酸を、提供することも可能である。そのようなＤａｓＲ−様タンパク質をコードしているさらなる核酸は、内因性ＤａｓＲをコードしてよく、または異種ＤａｓＲ−様タンパク質をコードし得る。
【００２２】
すでに以上で概説したように、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な化合物は結果として、ＤａｓＲ−様タンパク質の前記結合部位への結合の増加、または減少となり、すなわち干渉が、前記タンパク質と前記結合部位間の結合を増加させる、または結合を減少させると読むことが理解されなければならない。
【００２３】
またすでに以上で概説したように、ＤａｓＲ−調節遺伝子は非常に多様であり、たとえば代謝工程に関与する遺伝子、ならびに転写因子である遺伝子の範囲であり得る。さらに、有機体中の多数の工程が、（酵素）反応のカスケードと呼ばれるものを含む。したがって、ＤａｓＲ−結合部位は、特定の目的遺伝子と動作可能に連結してよく（すなわち直接末端産物）、またはＤａｓＲ−結合部位は、その産物が前記目的遺伝子の発現に関与する遺伝子に動作可能に連結し得る（たとえば、カスケード中の中間体、または目的遺伝子の遺伝子発現に関与する転写因子）。したがって、本発明にしたがった方法は、目的遺伝子の発現を直接調節可能であり、または本発明にしたがった方法は、目的遺伝子の発現を間接的に調節可能である。
【００２４】
直接調節には、目的遺伝子が、単一転写ユニットまたは座であるか、または目的遺伝子がオペロンの一部分である状況が含まれる。
【００２５】
間接調節にはまた、ＤａｓＲ−様タンパク質が、調節因子（タンパク質または核酸）の発現を制御し、それによって調節因子が他の遺伝子の発現を調節可能である状況が含まれる。前記調節因子は、標的遺伝子または標的オペロンまたは標的レギュロンの発現を調節することの元であり得る。本発明のこの部分は、表２がまた１６の転写因子（＃２７、３１、４６、５１、５６、６２、６７、７１、７７、８１、８４、１０５、１１９、１２９、１３０および１３１）を含むという発見によって支持され、大規模なレベルのＤａｓＲによる間接転写調節を支持している。
【００２６】
ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な化合物を微生物に提供し得る多数の方法が存在する。これはまた、（本明細書以下でより詳細に議論される）化合物の型に依存する。ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能である化合物が、たとえば前記微生物によって（たとえばエンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスを介して、または膜を通しての活発な輸送を介して）微生物によって取り込まれる、低分子量および／または化学化合物である場合、前記化合物は、前記微生物の環境（たとえば増殖培地）に単純に加えられる。ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能である化合物が核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である場合、前記微生物に好ましくは、任意のよく知られている技術で、前記核酸を（たとえば、トランスフェクション、形質導入または形質転換を介して）提供する。
【００２７】
すでに言及したように、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な化合物は、性質上非常に多様であり、たとえば、低（化学）分子、金属またはイオン、γ−ブチロラクトンのような、またはペプチド由来のシグナル伝達化合物、非リボソームペプチド、タンパク質または核酸でありうる。好ましい実施形態の１つにおいて、前記化合物は、遺伝的化合物、すなわち核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。好適な核酸の１つの例は、ｄａｓＲ核酸、すなわち、ＤａｓＲ−様タンパク質（またはその機能的断片または誘導体）をコードしている核酸である。より好ましくは、そのようなｄａｓＲ核酸は、強力な、または誘導可能なプロモーターの制御下である。ＤａｓＲ−結合部位と動作可能に連結した目的遺伝子の発現が、通常ＤａｓＲ−様タンパク質の結合に際して活性化される場合、より（たとえば過剰発現ＤａｓＲ）の存在が、前記目的遺伝子の発現をさらに誘導／増加／活性化可能である。ＤａｓＲ−結合部位と動作可能に連結した目的遺伝子の発現が通常、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合に際して抑制される場合、および前記目的遺伝子の発現が結果として不要な産物となる場合、より（たとえば過剰発現ＤａｓＲ）の存在が、前記目的遺伝子の発現をさらに低減／減少／抑制可能であり、不要な産物の量は、少なくとも部分的に（さらに）減少する。好適な核酸の第二の例は、変異タンパク質ＤａｓＲ−様タンパク質、たとえば、ＤａｓＲ−結合部位に対する結合能力が減少したＤａｓＲ−様タンパク質、またはＤａｓＲ−結合部位に対する結合能力が改善されたＤａｓＲ−様タンパク質、またはもはや誘導因子と呼ばれるものによって活性化されないＤａｓＲ−様タンパク質（たとえば、エフェクター結合ドメイン中変異したか、または欠損しているＤａｓＲ−様タンパク質）をコードしている核酸である。図１４にて提供された情報に基づいて、当業者は簡単に、特定の結果を得るためにどのＤａｓＲタンパク質の部分を改変可能であるかを決定可能である。たとえば、ＤＮＡ結合部位中の変異（欠損、挿入、（点）変異）が、そのような改変されたＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合配列への結合能力において効果を持ちうる。提供された変異の効果は、結合アッセイによって簡単に試験される。好適な核酸の第三の例は、（ＤａｓＲ−タンパク質結合能力が減少したか、増加したかのいずれかである）改変されたＤａｓＲ−結合部位を含む核酸である。好ましくは、そのような核酸は、通常目的遺伝子の前に存在するＤａｓＲ−結合部位が、改変された結合部位と交換される方法で、特定の微生物のゲノム内に配置される。さらに、その発現がＤａｓＲによって調節されない目的遺伝子を、遺伝子の上流または内部に、（改変した）ＤａｓＲ−結合部位を含むように改変可能である。場合によっては、関連微生物にさらに、（タンパク質として、または前記ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸として）ＤａｓＲ−様タンパク質が提供され、前記遺伝子の発現がここでＤａｓＲによって制御される。（改変）ＤａｓＲ−結合部位の利用には典型的に、相同組換え工程が含まれる。相同組換えを得るための技術が、当業者に公知であり、したがって、さらなる詳細は前記主題においては提供しない。好適な核酸の第四の例は、改変ｄａｓＲプロモーターを提示している核酸である。ＤａｓＲの内因性の発現は自動制御される。ＤａｓＲタンパク質が、特定の量で存在する場合、ＤａｓＲの量が特定の閾値レベル以下であるまで、その固有の発現が自己抑制される。ＤａｓＲ−プロモーターを、自動制御されないプロモーターへ改変することによって、利用可能なＤａｓＲタンパク質の量が増加し、したがって、特に前記遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合に際して増加する目的遺伝子の発現が増加する。そのような核酸の利用に、好ましくは、本来提示されたｄａｓＲプロモーターが、改変ｄａｓＲプロモーターに対して（少なくとも部分的に）交換される、組換え工程が含まれることが、当業者に明らかである。好適な核酸の第五の例は、第三の例に関連し、さらなる、または欠損ＤａｓＲ結合部位に対してアレンジされる核酸が含まれる。目的遺伝子と動作可能に連結したさらなるＤａｓＲ結合部位の導入は、とりわけ、ＤａｓＲ結合に際して活性化される遺伝子発現の場合に有用であり、ＤａｓＲ結合部位の欠損は、たとえば、ＤａｓＲ結合に際して抑制されるが、その発現が望まれる遺伝子発現の場合に有用である。
【００２８】
ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な非常に有用な化合物のまた他の例は、誘導因子である。そのような誘導因子は、目的遺伝子の発現が、ＤａｓＲ−様タンパク質の、目的遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位への結合に際して抑制される場合に、非常に有用である。好ましくは、そのような誘導因子は、糖の誘導体である。実験部分内で開示するように、グルコサミン−６−リン酸（語句グルコサミン−６−Ｐは本明細書で互換的に使用される）が、ＤａｓＲ−抑制遺伝子発現の非常に強力な誘導因子である。好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（またはその誘導体または多重体）を微生物の環境に加え、前記Ｎ−アセチルグルコサミンが、前記微生物内への伝達に際して、グルコサミン−６−リン酸へ変換される。そのような誘導因子の利用は、それが微生物の遺伝的操作をまったく含まず、単純に、外部からの操作（すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体の添加）からなるので、非常に利点がある。
【００２９】
本発明者らは、Ｎ−アセチルグルコサミンに対する２つの潜在的トランスポーター、すなわち近接遺伝子ｎａｇＥ１およびｎａｇＥ２を同定した。実験部分で記述したように、これらの遺伝子の変異体が構築され、ｎａｇＥ２が、Ｎ−アセチルグルコサミンに対するトランスポーターをコードしている遺伝子であることが明らかである。この発見によって、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能なより有用な化合物が提供される。たとえば、本発明の任意の方法にて使用されるようなＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物は、（機能的な）ＮａｇＥ２を産出不能であり、前記微生物は、外部に提供された、および／または形成／産出されたＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）へ応答可能ではなく、ＤａｓＲが活性のままである（ＤａｓＲ抑制遺伝子の場合、ＤａｓＲは結合したままである）。他の例において、ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの量が増加し、これはたとえば、微生物に、前記ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードしている核酸（好ましくはｎａｇＥ２）を提供することによって得られる。この場合、さらにＧｌｃＮＡｃが細胞内に輸送され、結果として、さらにグルコサミン−６−リン酸が産出される。結果として、ＤａｓＲ−抑制発現が減少し、発現が通常抑制される遺伝子の発現が増加する。また他の例において、ＧｌｃＮＡｃ−輸送をコードしている遺伝子を、ＧｌｃＮＡｃの変異体のみを細胞内に輸送するように変異させる。
【００３０】
ＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物のまた他の例は、ＤａｓＲ、またはＤａｓＲ結合部位いずれかへ結合する抗体（またはその断片、たとえば結合部分）の利用であり、したがって、少なくとも部分的に、ＤａｓＲのＤａｓＲ結合部位への結合を阻害する。
【００３１】
ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な任意の上記化合物を場合によって混合し得ることが、当業者に対して明らかである。
【００３２】
すでに記述したように、その発現が、ＤａｓＲによって調節された遺伝子の種類は非常に多様である。ＤａｓＲによって調節される異なるカテゴリーの遺伝子の要約に関して、また図１Ｂを参照のこと。そのような遺伝子の１つの群は、代謝工程に関与する遺伝子である。したがって、また他の実施形態において、本発明は、その産物が、代謝経路の一部である遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を調節することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の代謝を制御するための方法を提供する。好ましい実施形態において、その産物が代謝経路の一部である遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を、前記微生物に、前記ＤａｓＲ−結合部位への前記ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を提供することによって調節する。
【００３３】
その産物が代謝経路の一部分である遺伝子の動作可能に連結した、ＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物が、（すでに以上で議論したような）特徴において非常に多様であり、たとえば低（化学）分子、金属またはイオン、γ−ブチロラクトンのような、またはペプチド由来のシグナル伝達分子、非リボソームペプチド、またはタンパク質または核酸でありうる。１つの好ましい実施形態において、前記化合物は、遺伝的化合物、すなわち核酸である。好適な核酸の例はすでに以上で記述している。そのような代謝遺伝子の発現が、前記遺伝子と動作可能に連結した、ＤａｓＲ結合部位へのＤａｓＲタンパク質の結合に際して減少する場合、（以上で議論したように）グルコサミン−６−リン酸のような誘導因子を利用することも可能である。
【００３４】
その産物が、代謝経路の一部である（または代謝に関与する）前記特定の遺伝子の発現が、前記特定の遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位へのＤａｓＲの結合に際して、抑制されるか、または活性化されるかどうかに依存して、当業者が、前記特定の遺伝子の前で、ＤａｓＲタンパク質とＤａｓＲ結合部位間の結合が、増加するまたは減少する、さらにそれ以上でなければならないか決定することが可能であり、本明細書は、どのようにして結合を増加させる、または減少させるかの多数の例を提供している。
【００３５】
その産物が、代謝経路の一部である遺伝子の例を、表２にて非限定的に言及している。１つの例が、グルタミン酸／グルタミン代謝に関与する遺伝子に関する。表４にて要約している。これらの遺伝子は、Ｇｌｕ／Ｇｌｎの合成または分解に関与する酵素をコードしているが、またリボソームによって合成されたポリペプチドへのＧｌｕまたはＧｌｎアミノ酸の取り込みを特定する、コドンの転写に必要であるｔＲＮＡ分子もコードしている。
【００３６】
第二の例には、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび関連分子の代謝が含まれる。Ｎ−アセチルグルコサミンに対する経路は、図５にて示したような、グルタミン酸の経路に関連する。例には、ポリマーキチンをＮ−アセチルグルコサミンへ変換するキチン分解遺伝子（たとえば、表２中＃７、１１、１２、１４、１９、２３、２５、２６）、Ｎ−アセチルグルコサミンを細胞内へ輸送するＰＴＳ（たとえば表２中＃１、２、３、５）、および代謝遺伝子ｎａｇＫ、ｎａｇＡ（＃１０オペロン）、およびｎａｇＢ（＃１５）が含まれる。
【００３７】
グルタミン酸およびＮ−アセチルグルコサミン代謝に関連する他の核酸は、ＲＮＡリボザイムであり、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）中のｇｌｍＳ遺伝子を処理し（Winklerら、2004）、したがって、放線菌のような他のグラム陽性細菌中で珍しくはない。ｇｌｍＳ遺伝子は、ＤａｓＲによる制御の標的であり（表２中８６）、その遺伝子産物ＧｌｍＳは、グルコサミン−６−Ｐを形成するために、グルタミンおよびフルクトース−６−Ｐを利用する。ｇｌｍＳ転写物の処理は、ｍＲＮＡの活性化のために必要とされる。おもしろいことに、リボザイムは、ＧｌｍＳ酵素の代謝産物である、グルコサミン−６−Ｐによって活性化される。本発明者らは本明細書で、グルコサミン−６−ＰがまたＤａｓＲの誘導因子分子であることを示した。Winklerらによるさらなるデータが、リボザイムが、代謝状態に応答し、グルコサミン−６−Ｐ濃度の上昇に対する応答で、ｇｌｍＳ遺伝子を抑制することを示した。
【００３８】
第三の例は、解糖に関与する酵素（たとえば、ホスホフルクトキナーゼ、表２中＃７４、また表８中フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、フルクトース−１−リン酸キナーゼおよびホスホエノールピルビン酸シンターゼを参照のこと）およびアセチル−ＣｏＡ形成または処理（たとえばアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、＃１２表２、アセチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、表２中＃２５、およびアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ＴｈｉＬ、ＤａｓＲによる活性化、図４））のような、エネルギー供給に関する。アセチルＣｏＡは、ＴＣＡ回路の重大な開始化合物である。驚くべきことに、ＤａｓＲがまた、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのサブユニットをコードしているｎｕｏオペロンの制御を直接介して、エネルギー供給を制御する（表２中＃１０４、２つのＤａｓＲ結合部位）。この酵素は、エレクトロン輸送（酸化還元）連鎖の第一である。
【００３９】
表２に対して言及した多くの例がまた、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌中に存在する標的遺伝子を意味する、表４〜７および９の一部でもある。したがって、代謝改変アプローチをまた、バチルス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ストレプトコッカスおよびリステリアを含む、この重要なクラスの細菌に類似の様式で適用する。
【００４０】
本発明にしたがって影響をうけうる代謝工程または経路は、アミノ酸代謝、ペプチドグリカン分解または合成、脂肪酸生合成、代謝物の輸送、細胞外ポリサッカライドの分解（好ましくはグルコース、フルクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン、マンノースまたはキトビオース、またはこれらの組合せのポリマー）または窒素代謝である。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明は、その産物が、代謝経路の一部である遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を制御することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の代謝を制御するための方法を提供し、そこで、前記遺伝子の発現が結果として、前記微生物中の、解糖へ、またはから、またはクエン酸（ＴＣＡ）回路へ、またはから指向する相当する産物の存在となる。
【００４２】
本発明者らは、サーモビフィド フスカ（Thermobifido fusca）中のそのような代謝制御のとくに驚くべき例を同定し、そこでは、解糖のすべての段階が、ＤａｓＲ−様タンパク質によって制御されている（図１７および表９）。したがって、たとえば、ＤａｓＲの活性が、前記微生物中の解糖およびＴＣＡ回路の制御を可能にすることが、当業者に対して明らかである。
【００４３】
本発明者らによって同定される他のＤａｓＲ−制御遺伝子には、抗生物質または抗生物質クラスター（商業的な面から見て魅力のある）酵素などが含まれる。
【００４４】
したがって、本発明は、また他の実施形態において、前記目的産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または前記目的産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を、前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の目的産物の発現を得るための方法を提供する。
【００４５】
前記目的産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または前記目的産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉することは、結合が少なくとも部分的に阻害されることでありえ、または結合が少なくとも部分的に増加されることでありうる。「少なくとも部分的に（at least in part）」は、化合物を加えない状態と、前記化合物を加えた状態間で、検出可能な差が存在することを意味する。好ましい実施形態において、ＤａｓＲ結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合が、本質的に完全に阻害されるか、または結合が本質的に不可逆性である。
【００４６】
目的産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位とＤａｓＲタンパク質間の結合に影響を与えることが可能な異なる化合物がすでに以上で議論されており、遺伝的化合物（すなわち、核酸、場合によって、相当する微生物のゲノム中に安定に統合された、または前記微生物中エピソーム核酸として存在する）、またはタンパク質またはホルモン−様シグナル伝達低分子、またはたとえば低分子量（化学）化合物が含まれる。他の好ましい実施形態において、前記化合物は、ＤａｓＲ−調節工程の誘導因子である。そのような誘導因子は、ＤａｓＲ−抑制発現の場合にとりわけ有用である。そのような誘導因子の例は、グルコサミン−６−リン酸またはその機能的等価物または機能的断片である。好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミン（またはその誘導体または多重体）を、前記目的産物の産出のために使用する微生物の培地に提供する。
【００４７】
好適な化合物は、前記目的産物に相当する遺伝子の発現が、前記遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位へのＤａｓＲ−タンパク質の結合に際して、活性化されるか、または抑制されるかどうかの事実に依存して選択される。発現が結合に際して活性化される場合、ＤａｓＲタンパク質の、関連する遺伝子と動作可能に連結した結合部位への結合を、発現を増強または改善または得るために、改善することが望ましい。これはたとえば、関連する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位を加えることによって、またはＤａｓＲとのその相互作用を改善するために結合部位（より高いマトリックススコア）に変異導入することによって、または改善された結合能力を持つＤａｓＲを加えることによって、などで達成される。ＤａｓＲの結合に際して発現が抑制される場合、前記結合部位へのＤａｓＲの結合を減少させ、したがって抑制から前記発現を開放すことが望ましい。これはたとえば、関連するＤａｓＲ結合部位の欠損または変異導入によって達成される。
【００４８】
好ましい実施形態において、前記目的産物は二次代謝物である。二次代謝物の例を、表３にて提供しており、クラブラン酸またはブチロラクトン類のような化合物が含まれる。
【００４９】
クラブラン酸は、ペニシリンを不活性化可能なベータ−ラクタマーゼ−型酵素、および他のベータ−ラクタム−型抗生物質の非常に重要な阻害剤である。したがって、クラブラン酸はしばしば、患者がペニシリン耐性細菌に感染していると予想される時に、ペニシリンのようなベータ−ラクタム抗生物質との組合せで、患者に投与される。したがって、本発明の方法をまた、クラブラン酸の発現を増加させるために使用する。
【００５０】
ＤａｓＲはまた、Ｓ．ビルギニアエ（S. virginiae）中のｂａｒＢのような、ホルモン−様γ−ブチロラクトン類の生合成に関与する（表３）。これらのγ−ブチロラクトン類は、放線菌における抗生物質産出および形態形成を制御する重大なシグナル伝達化合物である（Horinouchi、2002；BeppuおよびHorinouchi、1991；HorinouchiおよびBeppu、1993；HorinouchiおよびBeppu、1992）。たとえば、Ａ−因子が、Ｓ．グリセウス（S. griseus）におけるストレプトマイシン産出を制御する。したがって、他の実施形態において、本発明は、シグナル伝達分子の制御を間接的に介して、抗生物質産出を間接的に調節するための方法を提供する。
【００５１】
また他の好ましい実施形態において、前記目的産物は抗生物質、酵素、潜在性遺伝子クラスターからの産物、抗がん剤または農業化合物である。酵素の例は、セルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、マンナーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、または糖イソメラーゼである。抗生物質の例は、（ストレプトミセス トヨカエンシス（Streptomyces toyocaensis）およびアミロカトプシス オリエンタリス（Amylocatopsis orientalis）によって産出される）バンコマイシン、（ストレプトミセス ロセオスポルス（Streptomyces roseosporus）によって産出される）ダプトマイシンおよび（ストレプトミセス トヨカエンシスによって産出される）テイコプラニン−様化合物Ａ４７９３４、（ストレプトミセス ベネズエラ（Streptomyces venezuelae）によって産出される）クロラムフェニコール、（ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus)によって産出される）ストレプトマイシン、（ストレプトミセス スフェロイド（Streptomyces spheroides）によって産出される）ノボビオシンを含むグリコペプチド抗生物質、および抗生物質産出のためのよく研究されたモデルクラスター、すなわちストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）のアクチノルホジンおよびウンデシルプロジギオシンである。後者の２つはそれぞれ、経路特異的活性化因子遺伝子ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４（表２中＃２７）およびｒｅｄＺ（表２中＃１２９）によって制御される。また、アクチノルホジン生合成酵素ＡｃｔＶＡ４は、ＤａｓＲのない状態で強く活性化される（図４）。抗生物質生合成に関連した公知の配列の本発明者らの解析に基づいて、本発明者らは驚くべきことに、すべての公知の抗生物質生合成クラスターの半分が、ＤａｓＲによって調節されており、したがって、ＤａｓＲ制御発現を介した干渉によって、抗生物質産出を改変するための非常に有用な方法が提供される。
【００５２】
さらに、本発明者らはまた、アクチノルホジン生合成クラスターが、（間接的に）ＤａｓＲの制御下であることを開示している。図４Ｂにて開示されたように、ＤａｓＲヌル変異体が、ＳＣＯ５０７４（デヒドラターゼ）として指定される多量の（分泌されたタンパク質の総量のおよそ９５％）タンパク質を分泌する。このデヒドラターゼは、アクチノルホジン生合成クラスターの一部であり、このデヒドラターゼは、分泌された抗生物質を調整する。したがって、本発明はさらに、産出／分泌されたアクチノルホジンの量を制御（好ましくは増加）するための手段および方法を提供する。
【００５３】
糸状体微生物ならびに低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌両方が、本発明にしたがった方法を適用可能な微生物の例である。しかしながら、たとえば、目的産物の発現を得るための方法にてこれらの微生物を用いることは、不要な産物の産出が付随する。これらの不要な産物のいくつかが現在、ＤａｓＲによって調節されることが知られており、したがって、本発明はまた他の実施形態において、前記微生物に、前記不要な産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または不要な産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の不要な産物の産出を少なくとも部分的に減少させるための方法を提供する。
【００５４】
前記不要な産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または前記不要な産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位への、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉することは、結合が少なくとも部分的に阻害されることでありえ、または結合が少なくとも部分的に増加することであり得る。「少なくとも部分的に（at least in part）」は、化合物を加えない状態と、前記化合物を加えた状態間で、検出可能な差が存在することを意味する。好ましい実施形態において、結合が、本質的に完全に阻害されるか、または結合が本質的に不可逆性である。
【００５５】
好ましくは、ＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合は、前記微生物に、前記不要な産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結した、または前記不要な産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結した、増加量のＤａｓＲ−結合部位を提供することによって、少なくとも部分的に増加する。また他の好ましい実施形態において、ＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合は、前記微生物に、本来前記不要な産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結した、または前記不要な産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結した、微生物中の少なくとも１つのＤａｓＲ結合部位を除去することによって、少なくとも部分的に減少する。
【００５６】
本明細書で開示したように、いくつかのプロテアーゼの発現が、ＤａｓＲ−様タンパク質によって調節される。例を表２で提供している。＃６０（メタロペプチダーゼ）または＃１０９（ペプチダーゼ）。本方法を、目的タンパク質様産物を産出するために使用する場合、言及したペプチダーゼの発現が同時に影響を受けうる。
【００５７】
好ましい実施形態において、前記不要な産物は、不要な副産物または不要なシャント産物である。
【００５８】
本発明にしたがった任意の方法を場合によっては組み合わせることが可能であることが、当業者に対して明らかである。たとえば、代謝を制御するための方法を、不要な産物の産出を少なくとも部分的に減少するための方法と組み合わせる。好ましい実施形態において、本発明は、目的産物の発現を得るための方法の、不要な産物の産出を少なくとも部分的に減少させるための方法との組合せを提供し、したがって、本発明は、不要な産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または不要な産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を前記微生物に提供することをさらに含む、以上で記述したようなＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の目的産物の発現を得るための方法を提供する。
【００５９】
たとえば、目的産物が、その発現が、前記遺伝子の前で、ＤａｓＲによるＤａｓＲ結合部位への結合に際して抑制される遺伝子によってコードされている場合、この目的産物の発現は、誘導因子を提供することによって少なくとも部分的に増加する。同時に不要な産物が発現し、その存在がたとえば、前記目的産物の単離／精製を干渉する場合、この不要な産物が、ＤａｓＲタンパク質の関連ＤａｓＲ結合部位への結合に際して活性化される場合、この結合部位はたとえば、ＤａｓＲタンパク質の前記関連ＤａｓＲ結合部位への結合を少なくとも部分的に阻害するように遺伝的に改変する。本発明に基づいて、目的産物および不要な産物のＤａｓＲ調節の種々の状況がおそらく、本明細書で記述したオプションの任意の１つを介して解決され得ることが、当業者に明らかである。
【００６０】
その発現が、ＤａｓＲによって調節（活性化または抑制いずれか）される遺伝子の例を、表２にて概説している。本発明がまた、これらの遺伝子の産物の特定の特徴に基づいた方法を提供することが当業者に対して明らかである。さらに、本発明者らは、ＤａｓＲの存在しない状態が、結果として、特定の増殖培地上の異常な増殖性質となることも観察した。以下の記述部分によって、表２にて示した結果に基づく利用、ならびにＤａｓＲヌル変異体での観察に基づく利用の例を提供している。
【００６１】
１つの例は、ＤａｓＲ（ＤａｓＲヌル変異体に関する実験部分を参照のこと）が存在しないこと、またはＤａｓＲの増強された発現によって、結果として、異常な増殖性質となる、という観察である。たとえば、グルコース上でのＤａｓＲヌル変異体増殖が、結果として糸状体細菌の断片化された増殖となる。液体培養液中、ＤａｓＲが存在しないことにより結果として、分岐が増強され（図１６）、一方で、多コピープラスミドを用いるＤａｓＲの発現が、分岐を減少させる。さらに、本発明者らは、細胞骨格またはペプチドグリカンに関連する遺伝子を同定した。したがって、本発明はさらに、ＤａｓＲ−調節遺伝子の発現を変更することを含む、増殖中の断片化および／または分岐性質が変更された糸状体微生物を得るための方法を提供する。ほとんどの糸状体微生物（たとえば放線菌）のみが固体培地上で胞子を形成し、一方で液体培養液中の増殖は、植物菌糸体の形成に制限される。これは典型的には、高い生理学的活性を示しているもっとも外側に指向した区画をもつ、菌糸の複雑なネットワークの形成に発達し、とりわけ結果としてペレット形成となり、結果として増殖速度の減少、およびバイオマスのユニットあたりの望む産物の低収率となる。さらに、それらの糸状形態のために、生物技術的に興味深い放線菌の高濃度の発酵がしばしば、非常に粘着性であり、結果として、たとえば通気および混合の問題によって、低バイオマス蓄積となる。本予測より、水中培地中の菌糸体の断片化が刺激されること、菌糸体の分岐が減少されること、および一般的に培養液の粘着度が減少すること、が望ましい。
【００６２】
他の例は、同定されたＤａｓＲ調節遺伝子のいくつかが、タンパク質分泌および／またはタンパク質ホールディングに関与する遺伝子であるという発見に基づいている。例としては、ｓｅｃＥ（表２中＃１０２）およびｓｅｃＹ（表２中＃１００）であり、これらは、Ｓｅｃ分泌系の必須の膜成分である。事実、大培養中の分泌された総タンパク質の繰り返し測定によって、ＤａｓＲの活性コピーが存在しない状態で、分泌されたタンパク質の総量が５０％まで減少したことが明らかになった。したがって、本発明はまた、タンパク質分泌および／またはタンパク質ホールディングに関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の、タンパク質分泌および／またはタンパク質ホールディングを調節するための方法を提供する。
【００６３】
また他の例は、同定されたＤａｓＲ調節遺伝子のいくつかが、銅、鉄または亜鉛のような、金属イオンの輸送に関与する遺伝子であるという発見に基づいている。関連遺伝子はたとえば、ｃｕｔＣ−型銅ホメオスタシス遺伝子（表２中＃３０）、および鉄の取り込みを制御する鉄調節遺伝子ｄｅｓＲ（表２中＃６２）である。したがって、本発明は、前記金属イオンの輸送に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の金属イオンの輸送を調節するための方法を提供する。
【００６４】
他の例は、同定されたＤａｓＲ調節遺伝子のいくつかが、糖の輸送に関与する遺伝子であるという発見に基づいている。非限定例を、ＰＴＳ遺伝子（ｎａｇＥ１、ｎａｇＥ２、ｍａｌＸ２、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒ、＃１、２、３、５）、ＡＢＣトランスポーター（たとえば表２中＃４、８、１７、２２、３３、５３、６６、１１１および１２２）、および放線菌におけるＡＢＣトランスポーターに対する不変ＡＴＰａｓｅであり、それらの輸送活性に対して必須であるＭｓｉＫ（＃３８）を含んで、表Ｉにて提供している。これらの例のうち、ＰＴＳ、ＭｓｉＫおよび種々のＡＢＣトランスポーターが、実験的に検証された。したがって、本発明は、糖の輸送に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の、糖の輸送を調節するための方法も提供する。たとえば、ＰＴＳNAGによるＮ−アセチルグルコサミン、およびＡＢＣトランスポーターＮｇｃＥＦＧ（表２中＃３３）によるキトビオース。ＤａｓＲ−抑制ＭｓｉＫは、多くのＡＢＣトランスポーターの活性に必要であり、たとえば、セルビオース（ＣｅｂＥＦＧ）、マルトース（ＭａｌＥＦＧ）およびキシロビオース（ＢｘｌＥＦＧ）に対して必要である。
【００６５】
また他の例は、ＤａｓＲヌル変異体中の抗生物質の産出が、いくつかの培地発達が増強され、他で完全に無効化されるという、培地依存発達を示したという発見に基づいている。したがって、本発明は、ｄａｓＲ遺伝子を機能的に改善することを含み、さらに特定の抗生物質に対して好適な糖供給源を選別することを含む、（糸状体）微生物中の抗生物質産出に影響を与えるための方法も提供する。特定の抗生物質との組合せでの、好適な糖供給源が、図１１で提供されている。
【００６６】
本発明の任意の方法において、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物は、ＤａｓＲ−様タンパク質、または前記ＤａｓＲ−様タンパク質を、前記タンパク質をコードしている核酸から発現可能な有機体である。さらに、前記微生物は、前記ＤａｓＲ−様タンパク質を発現可能な性質によってである有機体であってよく、またはＤａｓＲ−様タンパク質を産出するために遺伝的に改変された微生物であってよい。さらに、よりＤａｓＲ−タンパク質の産出を可能にするさらなる核酸を、ＤａｓＲ−様タンパク質をすでに発現可能な微生物に提供することも可能である。そのようなＤａｓＲ−様タンパク質の追加核酸は、すでに存在している、内因性ＤａｓＲをコードしている核酸と同一であってよく、異種であってもよい。好ましい実施形態において、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物を、ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸を微生物に提供することによって得る。より好ましくは、前記ＤａｓＲ−様タンパク質は異種である。ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸を、したがって任意の公知の方法によって微生物に提供し得る。さらに、前記核酸は、前記微生物中で、エピソーム要素として存在してよく、または前記微生物のゲノム内に統合されてよい。
【００６７】
さらに、前記目的遺伝子は、内生遺伝子、ならびに外因性遺伝子であってよく、したがって、本発明の方法はさらに、目的遺伝子をコードしている核酸を、ＤａｓＲ−様を含む有機体に提供することを含みうる。
【００６８】
本発明の任意の方法にて使用する微生物は、好ましくは海洋または土壌起源からの細菌である。好ましい実施形態において、前記微生物は糸状微生物である。糸状体微生物の例は、子嚢菌、バシド菌または放線菌である。好適な放線菌の例は、ストレプトミセス（Streptomyces）、ノカルディア（Nocardia）、サーモビフィド（Thermobifido）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、プラノビスポラ（Planobispora）、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）、フォードコッカス（Rhodococcus）、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）である。
【００６９】
本発明のまた他の実施形態において、微生物は、バチルス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、ストレプトコッカスまたはリステリアのような、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌である。驚くべきことに、本発明者らは本発明において、コア遺伝子クラスターｎａｇＡ−ｎａｇＢ−ｄａｓＲ（およびｄｒｅ要素）がまた、バチルス、ラクトコッカス、リステリアおよびストレプトコッカスを含む、低Ｇ＋Ｃグラム陽性間で広範囲に広がることを開示している。バチルスのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量（４３％）が、ストレプトミセスのＧ＋Ｃ含量（７２〜７３％）よりも約３０％低いけれども、組織のみが保存されているのではなく、ｄｒｅ部位の配列も保存されている。バチルス サブチリスおよびバチルス ハロデュランス（Bacillus halodurans）のｄｒｅ部位を表５にて要約しており、ラクトコッカス ラクティスのものを表６に、ストレプトコッカス種のものを表７に、リステリア インノクア（Listeria innocua）およびリステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のものを表８にて要約している。
【００７０】
低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌は、たとえば多くの日常製品の産出で重要であり、これらの細菌はしばしばプロバイオティクスとして使用される。
【００７１】
表４〜７より、これらの細菌においてまた、糖取り込み、代謝またはバクテリオシン産出のような工程が、本明細書で記述された任意の方法によって影響を受けることが明らかである。
【００７２】
驚くべきことに、本発明は、ｄａｓＲ変異体が、抗生物質の産出の強力な増強を示したという発見も開示している。さらに、表３にて同定したように、多数の抗生物質（クラスター）が、ＤａｓＲの制御下である。潜在性抗生物質（クラスター）がまた、ＤａｓＲの制御下であることがわかった（表３）。本発明はしたがって、前記抗生物質をコードしている遺伝子と動作可能に結合したＤａｓＲ−結合部位、または前記抗生物質の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位への、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を、前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の抗生物質の発現を調節する、得るまたは増加させるための方法を提供する。好ましくは、そのような方法を、抗生物質の発現を得るため、または増加させるために使用する。より好ましくは、前記抗生物質は、潜在性抗生物質または潜在性抗生物質クラスターの一部である。好ましい実施形態において、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な前記化合物は、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体である。
【００７３】
また他の実施形態において、本発明は、活性化ＤａｓＲ−抑制潜在性遺伝子（クラスター）を提供し、そこで、前記潜在性遺伝子（クラスター）が、前記遺伝子（クラスター）と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合に影響を与えることによって活性化される。前記タンパク質と前記結合部位間の結合に影響を与えることによって結果として、結合が減少、または増加／改善され得る。好ましい実施形態において、前記遺伝子（クラスター）は、抗生物質遺伝子（クラスター）である。
【００７４】
関連結合部位へのＤａｓＲの結合が結果として、たとえば抗生物質産出のレベルの抑制となる場合、前記抗生物質の産出がたとえば、前記抗生物質と動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位に変異導入することによって達成される。変異導入は好ましくは、ＤａｓＲタンパク質がもはや、前記結合部位へ十分結合可能ではないものである。また他の実施形態において、（グルコサミン−６−Ｐへ変換される）Ｎ−アセチルグルコサミンのような誘導因子を、抑制を軽減するために使用する。
【００７５】
本発明はまた、少なくとも１つのＤａｓＲ調節遺伝子の発現が改変されるような方法で、遺伝子工学によって生産された微生物を提供する。
【００７６】
１つの好適な例は、上記したような、活性化潜在性クラスターを含む微生物、たとえば、前記クラスターに動作可能に結合したＤａｓＲ結合部位が、前記クラスターが、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合が増加、または減少するように変異導入された微生物である。
【００７７】
他の例は、ＤａｓＲ−様タンパク質に対する変異導入結合部位を含む微生物である。前記結合部位は、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合が増加、または減少するように変異導入される。または、前記結合部位が、（たとえば、その発現がほとんど望まれない遺伝子を特異的に抑制するために）遺伝子が異なる抑制因子タンパク質によって制御されるように改変され得る。当業者は、種々のＤＮＡ結合タンパク質が、特定の微生物中で天然に存在しない結合部位のみを認識するように存在することに気がついている。そのようなタンパク質の例は、（ｔｅｔＯオペレーターを認識する）ＴｅｔＲまたは（真核ゲルプロモーターを認識する）Ｇａｌ４である。
【００７８】
また他の例は、ＤａｓＲ−様タンパク質の変異体を含む微生物である。たとえば、結合能力が改善した、または結合能力が減少した変異体、またはグルコサミン−６−Ｐ（または同様の化合物）による誘導に不感受性のＤａｓＲの変異体。他の例は、本質的に非機能的な変異体、たとえばＤａｓＲ−様タンパク質のヌル変異体である。また他の例は、エフェクター結合ドメイン（の部分）が変異導入（たとえば欠損）されたＤａｓＲ−様タンパク質である。
【００７９】
他の例は、増加したＤａｓＲの発現を含む微生物である。これはたとえば、微生物に、ＤａｓＲに対する（過剰）発現カセットを提供することによって達成される。そのようなカセットには、同種または異種ｄａｓＲ遺伝子が含まれうる。微生物がすでに、ＤａｓＲをコードするために遺伝的情報を含む場合、前記微生物中のＤａｓＲの自己調節を改善することがまたオプションである。
【００８０】
２つの他の例は、本質的に栄養増殖し、二次代謝物のレベルの変更を産出する微生物、または本質的に栄養増殖し、潜在性遺伝子クラスターから産物を産出する微生物である。
【００８１】
好ましくは、任意の言及した微生物が、（たとえば、酵素または抗生物質のような）増加量の目的産物を産出する。
【００８２】
より好ましくは、本発明にしたがった微生物は、海洋または土壌起源からの細菌である。他の好ましい実施形態において、前記微生物は糸状体微生物である。糸状体微生物の例は、子嚢菌、バシド菌または放線菌である。好適な放線菌の例は、ストレプトミセス（Streptomyces）、ノカルディア（Nocardia）、サーモビフィド（Thermobifido）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、プラノビスポラ（Planobispora）、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）、フォードコッカス（Rhodococcus）、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）である。
【００８３】
本発明のまた他の実施形態において、微生物は、バチルス、ラクトコッカス、ストレプトコッカスまたはリステリアのような、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌である。
【００８４】
本発明の任意の方法を、ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸、ならびにＤａｓＲ−結合部位と動作可能に連結した核酸をすでに含む微生物で開始することが便利であるけれども、本方法を、前記核酸を含まない微生物で使用することも可能である。したがって、本発明はさらに、前記目的産物をコードしている核酸、またはＤａｓＲ−様タンパク質に対する結合部位を持つ前記目的産物の産出に関与するタンパク質をコードしている核酸を提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の、目的産物の発現を調節するための方法を提供し、そこで、前記結合部位は、前記核酸に動作可能に連結する。好ましい実施形態において、前記微生物にはさらに、ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸が提供される。
【００８５】
また他の実施形態において、本発明は、ＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するための変異導入ＤａｓＲ−結合部位の利用、またはＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するための変異導入ＤａｓＲ−様タンパク質の利用、またはＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するためのＤａｓＲの利用、またはＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するためのＤａｓＲ−誘導因子の利用を提供する。
【００８６】
本明細書で記述された任意の方法にはさらに、精製段階、たとえば目的遺伝子の産物の精製、または（酵素または抗生物質のような）目的産物の精製が含まれうる。さらに、本発明にしたがった方法を、小規模基準、または大規模基準で実施し得る。
【００８７】
また他の実施形態において、本発明は、前記微生物にＮ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体を提供することを含む、微生物中の二次代謝物の産出を得る、または改善するための方法を提供する。前記二次代謝物は、公知または未知の二次代謝物であってよく、したがって前記方法は、スクリーニング法、たとえば新規薬物の同定のためのスクリーニング法の一部でありうる。好ましい実施形態において、前記二次代謝物は抗生物質である。また他の好ましい実施形態において、本発明は、前記有機体に、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体を提供することを含む、微生物中の潜在性（抗生物質）クラスターからの発現を喚起する、または増強するための方法を提供する。他の好ましい実施形態において、利用した微生物は、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む。また他の好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体を、前記微生物の増殖培地に加える。また他の好ましい実施形態において、前記Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体を、少なくとも１０ｍＭ、または好ましくはそれ以上の濃度で、前記増殖培地に加える。
【００８８】
また他の好ましい実施形態において、使用した微生物は糸状体微生物、好ましくは子嚢菌、バシド菌、または放線菌である。好適な放線菌の例は、ストレプトミセス（Streptomyces）、ノカルディア（Nocardia）、サーモビフィド（Thermobifido)、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、プラノビスポラ（Planobispora）、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）、フォードコッカス（Rhodococcus）、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）である。
【００８９】
また他の実施形態において、本発明は、微生物中の潜在性（たとえば抗生物質）クラスターを喚起する、または増強するための、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体の利用を提供する。
【００９０】
本発明は、本発明を限定していない、以下の記述にてより詳細に説明されるであろう。
【実施例】
【００９１】
実験の部
材料および方法
細菌株 大腸菌ＤＨ５αおよびＢＬ２１（ＤＥ３）を、サブクローニングおよびＤａｓＲ過剰発現実験のために利用した。Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５、Ｍ５１０（Ｍ１４５ ΔｒｅｄＤ）、Ｍ５１１（Ｍ１４５ ΔａｃｔＩＩ−ＩＶ）およびＭ５１２（Ｍ１４５ ΔａｃｔＩＩ−ＩＶ ΔｒｅｄＤ）（FlorianoおよびBibb、1996）およびストレプトミセス リビダンス（Streptomyces lividans）１３２６は、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ株コレクションより入手し、ストレプトミセス アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）ＮＲＲＬ８１６５（ＭＡ−４６８０）、ストレプトミセス ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）ＡＴＣＣ２７４３８、ストレプトミセス リモサス（Streptomyces limosus）ＡＴＣＣ１９７７８、ストレプトミセス リモサス（Streptomyces rimosus）ＡＴＣＣＤ１０９７０、ストレプトミセス ロセオスポラス（Streptomyces roseosporus）ＡＴＣＣ３１５６８およびストレプトミセス ベネズエラ（Streptomyces venezuelae）ＡＣＴＴ１５４３９は、ＡＴＣＣ株コレクションから入手し、ストレプトミセス アクリミシニ（Streptomyces acrimycini）ＤＳＭ４０５４０、ストレプトミセス シナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）ＤＳＭ４０４６７、ストレプトミセス クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）ＮＲＲＬ３５８５、ストレプトミセス コリヌス（Streptomyces collinus）ＤＳＭ４０７３３およびストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）ＮＲＲＬ Ｂ２６８２は、ＤＳＭＺ株コレクションより入手した。ｄａｓＲ変異体ＢＡＰ２９（ΔｄａｓＲ：：ａｃｃＣ４）は、通常の手順（Nothaftら、2003）にしたがって、プラスミドｐＷＨＭ３を用いて、アパラマイシン耐性遺伝子カセットによる、遺伝子のコード領域の置換によって作製した。同様の戦略を用いて、ｐｔｓＨ（ＢＡＰ１）、ｃｒｒ（ＢＡＰ２）、ｐｔｓＩ（ＢＡＰ３）、ｎａｇＥ１（ＢＡＰ４）、ｎａｇＥ２（ＢＡＰ５）およびｎａｇＥ１／Ｅ２（ＢＡＰ６）に対するノックアウト変異体を作製した。ＢＡＰ１〜３はすでに発行されている（Nothaftら、2003）。Ｓ．コエリカラー株を、完全培地（ＴＳＢ、Ｄｉｆｃｏ）または最少培地（van Wezelら、2005）として、デキストロースを含まないトリプシン大豆ブロスを用いて、２８℃にて増殖させた。大腸菌培養液は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）中で、３７℃にて増殖させた。変異体の表現系特性化を、テキスト（Kieserら、2000）にて示されたような種々の炭素供給源を含む、最少培地寒天プレート上で実施した。ＡｃｔおよびＲｅｄの定量化を、先に記述された（Martinez-Costaら、1996）ように実施した。
【００９２】
ＤＮａｓｅＩフットプリンティング Ｓ．コエリカラーｃｒｒ遺伝子（ＳＣＯ１３９０）の開始に関連した−２０２／＋８領域に相当する２２２−ｂｐ ＤＮＡ断片を、ＤＮａｓｅＩフットプリンティングのために選択した。ＤＮＡ断片を、ＰＣＲによってクロモソームＤＮＡから増幅した。５０ｆｍｏｌの32Ｐ末端標識化プローブを、関連タンパク質（ＤａｓＲ−（Ｈｉｓ）6および／またはＢＳＡ）およびＤＮａｓｅＩ（０．４μｇ／ｍｌ）とともに、記述された（Sambrookら、1989）ようにインキュベートした。
【００９３】
算定予測 多重アライメントおよび位置加重マトリックスを先に記述された（Rigaliら、2004）ように、Ｔａｒｔｇｅｔ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ自動化ツール（http://trantor.bioc.columbia.edu/Target_Explorer/）（Sosinskyら、2003）によって産出した。加重マトリックスを「ＤａｓＲ４」として描写した。
【００９４】
【００９５】
マトリックスＤａｓＲ４によってスキャンされた配列によって得た最小スコアは、−３８．５５であり、最大スコアは１７．２５である。現在の実験検証にしたがって、ＤａｓＲ−結合部位は、１６ヌクレオチドの配列として定義され、ＤａｓＲ４マトリックスによってスキャンされた場合、６より大きな（そして１７．２５までの）間を含むスコアを得る。具体的に、−２，９７のみのスコアを持つ正しく、実験的に検証されたＤａｓＲ−結合部位が、ＮＡＤＰ−特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードしているｇｄｈＡの上流で見られた。
【００９６】
顕微鏡 菌糸体と胞子の薄い切片の解析のための透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を、フィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＥＭ４１０透過型電子顕微鏡（Mahrら、2000）で実施した。位相差顕微鏡を、Ｚｅｉｓｓ標準２５位相差顕微鏡、および５メガピクセルデジタルカメラを用いて産出した。
【００９７】
糖取り込み ２０μＭ Ｎ−［14Ｃ］アセチル−Ｄ−グルコサミン（６．２ｍＣｉ ｍｍｏｌ-1）の菌糸内への取り込みアッセイを、記述された（Nothaftら、2003）ように実施した。
【００９８】
タンパク質精製およびウェスタンブロット 組換え体ヒスチジン−タグＤａｓＲの精製（Rigaliら、2004）およびＨＰｒおよびＩＩＡCrrに対して産出された抗体でのウェスタンブロット解析は、他で記述されている（Nothaftら、2003）。
【００９９】
ＲＴ−ＰＣＲ ＲＮＡをＳ．コエリカラーＭ１４５およびＢＡＰ２９の菌糸体から単離した。５０ｍＭグリセロールを含む最少培地培養液を、胞子で植菌し、０．６のＯＤ550（指数増殖）まで増殖させた。Ｎ−アセチルグルコサミンを０．５％にて加え、試料を０、１５、３０および６０分後に得た。ＲＴ−ＰＣＲ解析を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ一段階ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（インビトロジェン（Invitrogen））にて実施した。逆転写なしでのＲＴ−ＰＣＲｓを、残余ＤＮＡが存在しないことに対する対照として使用した。半定量解析のために、試料を１８〜３５サイクルの間の３サイクル間隔で得、不飽和ＰＣＲ産物形成を比較した（van Wezelら、2005）。データを、３回の独立した実験で検証した。
【０１００】
図２１Ｂにて記述したＲＴ−ＰＣＲ実験のために使用したオリゴヌクレオチドは、
であった。
【０１０１】
二次元ゲル電気泳動およびタンパク質スポット同定 Ｓ．コエリカラーＭ１４５およびＢＡＰ２９の菌糸体を、５０ｍＭグリセロールを含む最少培地中で増殖させ、指数期内の異なる時間点で回収し、洗浄し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５および５０ｍＭ ＭｇＳＯ4中で再懸濁し、超音波処理し、細胞残骸を遠心後に除去した。ＤＮＡおよびＲＮＡを、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理によって削除した。タンパク質抽出物を、水に対して４℃にて２回透析し、続いて、６Ｍ固体尿素および２Ｍチオ尿素、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（２．５％（ｖ／ｖ））、ＩＰＧ緩衝液（０．５％（ｖ／ｖ））、ＤＴＴ（２５ｍＭ）およびブロモフェノールブルーを添加した。膜タンパク質を１時間、６５．０００ｇでの超遠心によって除去した。１．５ｍｇの細胞質タンパク質画分を、ＩＰＧＰｈｏｒユニット（アマシャム／ファルマシア（Amersham/Pharmacia））上２４−ｃｍ ＩＰＧストリップ上に適用した。ＩＰＧストリップを、１２．５％ポリアクリルアミドゲルにかけ、Ｅｔｔａｎ ＤＡＬＴ ＩＩシステム（アマシャム／ファルマシア）上で作動した。ゲルをＰｈａｓｔＧｅｌ Ｂｌｕｅ Ｒで染色し、スキャンした。プロテオームパターンを、独立した実験から由来した２つのゲルセットを用いて比較した。タンパク質強度を、ＴＩＮＡソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ）とともに、密度グレースケール解析によって解析した。タンパク質スポットを切り出し、トリプシンによるゲル内消化にかけ、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって解析した（Marvin-Guyら、2005）。
【０１０２】
電子移動度ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ） ＥＭＳＡを、ＡＬＦ発現シークエンサーにて、蛍光プローブ（１０ｎＭ）で実施した（Fileeら、2001）。精製ＤａｓＲ（３μＭ）および１０００−倍過剰の非特異的ＤＮＡを反応混合液中で使用した。予想されたシス−活性エレメントを、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４のプロモーター領域からとった。
ｃｒｒ
およびｃｒｐ
の公知のシス−活性エレメント上流をそれぞれ、陽性および陰性対照として使用した。１６ｎｔ ｄｒｅ部位に下線を引いている。
【０１０３】
酵素活性 キチナーゼ活性を、基質としてカルボキシメチルキチン−Ｒｅｍａｚｏｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５Ｒ（Ｌｏｅｗｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で比色分析アッセイを用いて、すでに記述された（Zhangら、2002）ように測定した。Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａアミノペプチダーゼ測定を、基質としてＤ−Ａｌａ−パラニトロアニリドで実施した（Cheggourら、2000）。ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアス（Pierce））を、タンパク質濃度を測定するために使用した。
【０１０４】
広範囲抗生物質活性アッセイ 希釈胞子懸濁液の試料（１μｌ）を、１％ＧｌｃＮＡｃを含む、または含まない状態の、０．５％マンニトールを含む最小培地プレート上にスポットし、２８℃にて３日間インキュベートした。バイオアッセイのために、本発明者らは、５００μｌのバチルス サブチリス（Bacillus subtilis）一晩培養液（ＯＤ600〜１）を、１０ｍｌの溶解軟栄養素寒天（ＳＮＡ）に植菌し、混合液を、一辺１２ｃｍの正方形ペトリ皿内に注いだ。プレートを２時間、４℃にて維持し、ＳＮＡを凝固させ、産出された抗生物質の拡散を可能にし、ついで３０℃にて一晩インキュベートした。
【０１０５】
実験の部
結果
ＤａｓＲレギュロンの予測
Ｓ．コエリカラーゲノムを、ＤａｓＲオペレーター部位の発生に関して精査可能にするために、本発明者らは、ＰＴＳ酵素ＩＩＡ（ＩＩＡCrr）および酵素Ｉ（ＥＩ）をコードしているｃｒｒ−ｐｔｓＩオペロンのｄｒｅ上で、ＤＮａｓｅＩフットプリンティングを実施した（図１Ａ）。保護配列（ＴＧＴＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＴ）は、ｃｒｒの開始に関連した、位置−１３０〜−１１５に相当し、由来ＤａｓＲ結合部位コンセンサス配列に対して、１６のうち１３ｂｐ一致を有した（以下を参照のこと）。本情報を、すでに本発明者らが検証した、標的遺伝子のｄｒｅ部位を決定するために使用した（表１および（Rigaliら、2004））。本トレーニングセットを用いて、本発明者らは、精密な位置加重マトリックス（「ＤａｓＲ４」、物質および方法を参照のこと）を構築し、結果として、完全Ｓ．コエリカラーゲノムをスキャンするために使用した、アライメントマトリックスとなった。
【０１０６】
ゲノムスキャンによって、２００以上の候補遺伝子を示している、１３１転写ユニットに対して、１６０ｄｒｅ部位が明らかになった。約４０％の標的遺伝子が、中心サッカライド成分として、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とともに、糖またはアミノ糖代謝に関連している。ＧｌｃＮＡｃとの関係がまた、細胞壁関連ペプチダーゼの同定に連結する。予想されたＤａｓＲレギュロンにはさらに、グルタミン／グルタミン酸アミノ酸代謝に関連した遺伝子を含む、窒素代謝のための遺伝子が含まれる。標的のリストにはまた、１６の転写因子（表２中、＃２７、３１、４６、５１、５６、６２、６７、７１、７７、８１、８４、１０５、１１９、１２９、１３０および１３１）が含まれ、ＤａｓＲによる間接転写制御の大規模なレベルを示唆している。
【０１０７】
ｄａｓＲ変異体の表現系
ｄａｓＲヌル変異体（ＢＡＰ２９）を、インビボでのＤａｓＲの役割を研究するために、アパラマイシン耐性カセット（ａａｃＣ４）による、ほとんどのコード領域（７６５のうちｎｔ１４〜６３５）の置換によって構築した。
【０１０８】
Ｓ．コエリカラーのｄａｓＲ変異体は、培地依存発達を示し、いくつかの培地では発達が増加し、一方他の培地では、完全に無効になった。図１１にて要約している。このことは、ＤａｓＲの機能が、使用した炭素および窒素供給源に依存していることを強力に示唆している。
【０１０９】
驚くべきことに、ｄａｓＲ変異体は、抗生物質産出の強力な増強を示した（図２Ａ）。株Ｍ１４５（ｐＦＴ２４１ ｄａｓＲ+）中のＤａｓＲの過剰産出が結果として、反転、非芽胞形成バルド（ｂｌｄ）表現系となった（図２Ｂ）。凍結走査電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）によるｄａｓＲ変異体のより詳しい検査によって、ｄａｓＲ変異体中で胞子がほとんど完全に存在しないこと、および試料調製の間に簡単に気中菌糸体が崩壊したことが示された（図２Ｃ）。Ｓ．コエリカラーＭ１４５およびＢＡＰ２９の交差切片のＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ＥＭによる高解析度の解析によって、Ｍ１４５が正常の胞子を産出した一方で、ｄａｓＲ変異体が、これは胞子壁に近いより小さいか、またはより大きな空洞を持つ、多くの胞子（およそ３０％）を産出したことが明らかになり（図２Ｄ、矢印で示した空洞）、胞子壁からの細胞質膜の大規模な分離を示唆している。さらに、胞子形態が、明らかにより異質であり、一方で、野生型胞子は典型的には、０．６×０．８μｍの大きさを持つ一方で、ｄａｓＲ変異体が、胞子サイズにおいて、普通ではない強い変動を示した（長さにして０．５〜１．４μｍ、しかし０．８μｍの同一幅）。さらに、多くの変異体胞子が、気中菌糸体のものと同様の厚さを持ち、典型的な厚さの胞子壁を作製できない。これらの発見は、ｄａｓＲが、前駆体Ｎ−アセチルグルコサミンの代謝に関する遺伝子を含む、ペプチドグリカンの生涯に関与する遺伝子を制御するという、本発明者らのコンピュータ予測（表２）とよく連結している。
【０１１０】
ＤａｓＲおよび発達の制御
ＤａｓＲはどのようにして発達へのスイッチを制御するのだろうか。ｄａｓＲレギュロン中のｐｔｓ遺伝子の導入によって、本発明者らは、少なくとも１つの関連性が、ＰＴＳのＤａｓＲ−調節制御を介してであることを提案することが許される。先の発行物（Nothaftら、2003）において、本発明者らは、個々のｐｔｓノックアウト変異体、すなわちＢＡＰ１（ΔｐｔｓＨ、ＨＰｒに対する遺伝子）、ＢＡＰ２（Δｃｒｒ、ＩＩＡCrrに対する遺伝子）、およびＢＡＰ３（ΔｐｔｓＩ、酵素Ｉ（ＥＩ）に対する遺伝子）に対して正常であるが、停滞した発達を記述した。ＰＴＳ変異体のより詳細な表現系解析によって、結局、すべてのｐｔｓ変異体が、培地上で胞子を産出可能である一方で、形態形成が、マンニトールおよびアラビノースの存在下で増殖した場合にもっとも強い差を持って、異なる複合および最小培地寒天プレート上で明らかに遅延したことが明らかになった。株を、ＳＦＭまたはＲ２ＹＥ寒天プレート上で、５日間増殖させた。図３Ａにて示したように、ｃｒｒ変異体ＢＡＰ２が、ＳＦＭ上で白色気中菌糸体を産出するが、これらの条件下では胞子を産出できず、一方、ｐｔｓＨ（ＢＡＰ１）またはｐｔｓＩ（ＢＡＰ３）の欠損が、灰色着色胞子の産出を可能にした。
【０１１１】
興味深いことに、Ｒ２ＹＥ寒天プレート上で、すべての３つのＰＴＳ変異体が、栄養増殖性停止（ｂａｌｄまたはｂｌｄ表現型と呼ばれる）を示している。
【０１１２】
本発明者らは、早期気中増殖に対する鍵となる発達σ因子である（Chaterら、1989）、ＷｈｉＧタンパク質の（ＢＡＰ２およびＢＡＰ３中の）発現パターンまたは（ＢＡＰ１中の）改変パターンが、親株Ｍ１４５におけるものからは強く異なったことを、これらの変異体のプロテオミクススクリーンにて発見した。ｗｈｉＧの発現を確立するために、その転写を、すべての３つの変異体、およびＭ１４５において解析した。興味深いことに、ｗｈｉＧ転写が、ＢＡＰ２およびＢＡＰ３変異体にて強く減少し（図３Ｂ）、ｗｈｉＧ変異体が、特徴的な非胞子形成表現系をもつので、それらが完全胞子形成を失敗することに関する可能性のある説明を提供している。
【０１１３】
したがって、本発明者らは、ＤａｓＲが、栄養センサーとして働き、ＰＴＳの制御を介してこれを翻訳し、順にｗｈｉＧを制御し、ｐｔｓ変異体の発達停止に関して、たいがい、少なくとも１つまたはそれ以上の他の早期発達遺伝子を制御することを提案している。ホスホトランスフェラーゼＷＩ、ＨＰｒおよびＩＩＡCrrが、他の細菌では、種々の、しかしいつも炭素関連の応答のために使用される、可逆代謝物依存リン酸化を介して、完全なシグナル伝達経路を提供するということは注目に値する（BruckneおよびTithemeyer,2002）。
【０１１４】
プロテオーム解析
ＤａｓＲの効果の査定を得るために、本発明者らは、ＢＡＰ２９およびその親Ｍ１４５のタンパク質プロファイルを比較した。タンパク質抽出物を、グリセロール（中性炭素供給源）の存在下での菌糸体増殖から調製し、二次元ゲル電気泳動で解析した。クーマシーブリリアントブルー染色ゲル上の約４％のタンパク質スポットは、２倍以上まで強度が変化し、８つが質量分析によって同定された（図４Ａ）。Ｍ１４５とＢＡＰ２９間の１１のもっとも顕著な差を解析し、これらのうち、質量分析によって本発明者らは、９つのタンパク質を確実に同定した（図４Ａ）。２つのタンパク質、すなわち多重糖インポートタンパク質ＭｓｉＫおよびＮａｇＡ（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐ−デアセチラーゼ）が、本発明者らのコンピュータスクリーンにて予想された。ｎａｇＡおよびｍｓｉＫのみが表２に含まれ、予想ｄｒｅ部位を含んだ。他は、中心および二次代謝に関連し得る（以下および図５を参照のこと）。ｍｓｉＫプロモーター領域中のＤａｓＲのｄｒｅへの結合が、ＥＭＳＡによって示された（以下を参照のこと）。ポリサッカライド−分解計の誘導因子の取り込みにおけるＭｓｉＫの役割にしたがって、これらの酵素的蓄積（約１００の遺伝子）がまた、ｄａｓＲ欠損によって影響を受けるべきである（議論を参照のこと）。他の７つの遺伝子のｄｒｅ上流の欠損が、ＤａｓＲによるこれらの遺伝子の間接制御を示唆している。プロテオーム解析によって同定されたタンパク質に関連した代謝経路の可視化によって、ＧｌｃＮＡｃおよびグルタミン酸代謝周辺にもっとも引きつけられることが明らかになり、以上で示した、コンピュータ内およびインビトロデータとよく一致する（図５）。
【０１１５】
ＤａｓＲは、放線菌における二次代謝および抗生物質産出を制御する
興味深いことに、ｄａｓＲ変異体において両方がアップレギュレートされる、本発明者らのプロテオミクススクリーンにて同定された２つの標的、すなわちＡｃｔＶＡ４およびＧｐｓＩが、ｄａｓＲ変異体におけるブルーγ−アクチノルホジンの産出の活性化に早期によく相関する、抗生物質γ−アクチノルホジンの産出に関与する（bibb、2005）（図２Ａ）。ＧｐｓＩは、ｐｐＧｐｐ前駆体を合成するグアノシンペンタホスフェート（ｐｐｐＧｐｐ）シンターゼである。逼迫因子ｐｐＧｐｐが、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４転写を活性化することにおいて、原因的な役割を持つ（Heskethら、2001）。ＢＡＰ２９中の多量のＧｐｓＩが、ｐｐＧｐｐ前駆体のプールの増加を示唆し、したがって、アクチノルホジンの早期および増強産出を示唆している。ＡｃｔＶＡ４の機能は未知であるが、しかし遺伝子が、アクチノルホジン産出に関連するクラスター（２０遺伝子）中に含まれ、転写活性因子ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４に依存している（Ariasら、1999）。表２からしたがうように、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４は、予想ＤａｓＲ標的遺伝子間で特徴づけられる。精製ＤａｓＲの本遺伝子のｄｒｅ上流への直接結合が、ＤａｓＲタンパク質が、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４プロモーター領域にて見られるｄｒｅ要素を含む二本鎖オリゴヌクレオチドに直接結合するという本発明者らの発見によって検証される（図９）。このことは、実際にＤａｓＲが、この刺激的な化合物の合成のための、経路−特異的活性因子遺伝子に結合することによる、アクチノルホジン産出を制御することを証明しており、ＤａｓＲが、子嚢菌における抗生物質産出の制御において重大な役割を果たすことを示唆している。
【０１１６】
おもしろいことに、一次ゲル電気泳動による、ｄａｓＲ変異体が存在しない状態での分泌タンパク質と、その親Ｓ．コエリカラーＭ１４５の比較が、１つの単一タンパク質が、ｄａｓＲ変異体中で、異常に高く過剰発現したことを示した（図４Ｂ）。このタンパク質は、質量分析によって、ＳＣＯ５０７４として同定された。本タンパク質は最近、アクチノルホジン生合成クラスターの一部としてみられ、分泌抗生物質のテイリングに対してもっとも関与する可能性がある分泌デヒドラターゼである（Hesketh & Chater 2003；Taguchiら、2000）。遺伝子産物は、たいがい、アクチノルホジン前駆体中のアルコールの環化−脱水を補助して、ピラン環を与え、この反応は自然発生的に進行するが、有さない場合にはきわめて効果が低い。Taguchiら、（2000）にて記述されたように、ａｃｔＶＩ−ＯＲＦ３崩壊変異体は、親と比べて少ない（約半分の）アクチノルホジンを産出する。このことは、野生型株が青色色素を産出する一方で、ｄａｓＲ変異体が、紫／すみれ色色素を産出し、たいがいＳＣＯ５０７４の極端な過剰発現によるアクチノルホジンの変異体である、という本発明者らの観察と一致する。また非常に興味深いことに、以上で記述した新規バイオインフォマティクス技術を用いて、本発明者らは、抗生物質の調節および／または産出に関与する多くの遺伝子のｄｒｅ部位上流を同定した。これらの標的を、表３にて要約している。
【０１１７】
酵素産出の制御
１６の予測遺伝子にて、キチン−関連（ｃｈｉ）遺伝子が、キチナーゼ、キチン結合タンパク質、（キト−オリゴサッカライドをＧｌｃＮＡｃとキトビオースに変換する）細胞外β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、および（キトビオースをＧｌｃＮＡｃに加水分解する）細胞内β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを含む、潜在的ＤａｓＲ標的の大きなサブセットを構築する。これを検証するために、本発明者らは、誘導（キチン）または抑制（グリセロール、グリセロール＋ＧｌｃＮＡｃ、およびグルコース＋キチン）下増殖した、ＢＡＰ２９およびＭ１４５の総キチン分解活性を測定した。図６Ａにて描写したように、本発明者らは、細胞をグルコースが存在する状態、またはしない状態で、キチン上で増殖させた時に、ＢＡＰ２９におけるキチン分解活性が強く減少したことを観察した。同様の観察が、総β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性をアッセイしたときに得られた（図６Ａ）。
【０１１８】
地球上で１つの、しかしもっとも豊富な炭素供給源であり、Ｎ−アセチルグルコサミンのポリマーである、キチンの利用に必要である、キチン分解系に関して、ＤａｓＲとｃｈｉ遺伝子間の予想されるシス−トランス関係を検証するために、７つの試料を選択した。いくつかは低い結合効率であったが、陽性ＤＮＡ−ＤａｓＲ相互作用が、すべての試験したプロモーターに関して観察された（図９）。３つのキチナーゼ遺伝子の転写を、ＧｌｃＮＡｃの取り込みを含む（グリセロールおよびＧｌｃＮＡｃ）、または含まない（グリセロール）条件下の培養培地から単離したＲＮＡ上で、ＲＴ−ＰＣＲによってモニタした（図６Ｂ）。解析した遺伝子は、ｃｈｉＩ（ＳＣＯ１４４４）、ｃｈｉＦ（ＳＣＯ７２６３）、および推定分泌β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＳＣＯ６３００であった。広範囲キチン分解活性から推定されるように、基礎発現が、グリセロール上にのみ培養培地中の、３つすべての遺伝子で観察された。ｃｈｉＩおよびＳＣＯ６３００に関して、Ｍ１４５とＢＡＰ２９間の転写レベルに有意な差はなかった。おもしろいことに、ｃｈｉＦ転写は、ＤａｓＲに完全に依存しており、一方で、本発明者らは、ＢＡＰ２９からのＲＮＡ調製において任意の転写物を検出できず、野生型のＲＮＡ試料中で、強力なｃｈｉＦ転写が存在した。これらのデータは、ＧｌｃＮＡｃ輸送のための遺伝子と、それに続く細胞内異化作用に対する機能の抑制とは反対に、ＤａｓＲが、キチン分解系を正に制御していることを示唆している（以下を参照のこと）。
【０１１９】
他の細胞外酵素も、ＤａｓＲによって制御される（図７）。実際、本発明者らは、キチン分解系に加えて、マンナナーゼ、α−アミラーゼ、キシラナーゼの活性が、ＤａｓＲに依存することを発見した（図７）。これらのポリサッカライド−分解系のすべてが、事実、ｄａｓＲによる基質誘導とグルコース制御両方において影響を持ち、酵素分泌に対する制御機構におけるその重要な位置を強調している。
【０１２０】
糖輸送のＤａｓＲ−仲介制御
多くの予想ＤａｓＲ標的が、炭素供給源の運命に関与したので（表２）、本発明者らは、糖輸送におけるｄａｓＲ変異導入の効果を解析した。輸送アッセイによって、ＧｌｃＮＡｃのＰＴＳ−仲介内部化が、ＢＡＰ２９において構成的になり、一方で、親Ｍ１４５において、取り込みがＧｌｃＮＡｃによって誘導されたことが明らかになった（図８Ａ）。これは、普遍ＰＴＳホスホトランスフェラーゼＨＰｒおよびＩＩＡCrrの構成タンパク質レベルと相関し（図８Ａ）、ＰＴＳペルメアーゼ複合体（ＩＩＢGlcNAc、ＩＩＣGlcNAc、ＩＩＡCrr、ＥＩ、ＨＰｒ）をコードしているそれぞれの遺伝子（ｍａｌＸ２、ｎａｇＥ２、ｃｒｒ−ｐｔｓＩおよびｐｔｓＨ、図８Ｃ）のＲＴ−ＰＣＲによって支持された。
【０１２１】
以上で示したように、コンピュータによる予測およびプロテオーム解析によって、ＤａｓＲに対する標的として、普遍ＡＴＰａｓｅ ＭｓｉＫをコードしているｍｓｉＫ（ＳＣＯ４２４０）が同定された（図４）。ＤＮＡ結合実験によって、ＤａｓＲが、ｍｓｉＫプロモーター領域中に存在するｄｒｅに直接結合することが示され（図９）、これは、ＤａｓＲが、セルビオース、トレハロース、マルトース、キシロビオース、キトビオース、およびおそらく他のさらに２０〜３０の炭化水素の取り込みのためのものを含む、ＭｓｉＫ−依存ＡＢＣ型（ＡＴＰ−結合カセット）輸送の制御に関与することを示している（Bertramら、2004）。ＭｓｉＫのＤａｓＲ−依存制御の明らかな結果として、ＤａｓＲが、糖オペロン誘導因子の能力を間接的に制御し、したがって、すべての細胞外糖ヒドロラーゼの発現に影響を与える。これは、キチン分解系に加えて、マンナナーゼ、α−アミラーゼ、キシラナーゼがＤａｓＲに依存するという本発明者らの発見と非常に相関する（７）。
【０１２２】
ＤａｓＲ−依存ペプチドグリカン関連タンパク質
ｄａｓＲ変異体中の観察された細胞壁異常（図２Ｄ）が、ペプチドグリカン−関連ペプチダーゼをコードしているいくつかの遺伝子が、潜在的ＤａｓＲ標的のリスト（表２）内に含まれているという発見によって、少なくとも部分的に説明される。事実、部位は、五員ｄｐｐＡオペロンの７１ｂｐ上流（ＳＣＯ６４８６−６４９０）で予測された。ｄｐｐＡそれ自身は、バチルス サブチリスのＤｐｐＡ（ＤｐｐＡBsu）に３０％同一および５０％類似の、推定二核亜鉛依存、Ｄ−特異的アミノペプチダーゼ（ｐｆａｍ ０４９５１）をコードし（Cheggourら、2000）、ＤｐｐＡBsuは、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａおよびＤ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ基質上で唯一活性である。ＤｐｐＡBsuの生理学的役割はおそらく、ペプチドグリカン生合成において必要とされる、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａジペプチドを加水分解することによる、栄養欠如に対する適合である（Cheggourら、2000）。ｄｐｐＡオペロンの他のｏｒｆ（ＳＣＯ６４８９）にはまた、ペプチドグリカン前駆体またはペプチドグリカン分解産物異化に関与する。ＳＣＯ６４８９の予測遺伝子産物は、ペプチドグリカンのテトラペプチド部位中の二塩基アミノ酸とＣ−末端Ｄ−アラニン間のペプチド結合を加水分解する（Templinら、1999）大腸菌からのＬｄｃＡ（Ｌ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼＡ）に、３２％同一、および４７％類似である。大腸菌内のｌｄｃＡの不活性化によって結果として、ペプチドグリカンの総架橋が劇的に減少する。
【０１２３】
ＤａｓＲが、ｄｐｐＡオペロンの発現を制御するかどうか査定するために、本発明者らは、精製Ｈｉｓ−タグ化ＤａｓＲと、ｄｐｐＡの１９３ｂｐ上流に相当する断片で、ＤＮＡ結合実験を実施した。ＥＭＳＡｓを用いた解析によって、弱いが、有意なＤａｓＲのｄｐｐＡプロモーターとの相互作用が確立された（図９）。ｄｐｐＡの発現におけるＤａｓＲに対する調節の役割をさらに検証するために、細胞内Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａアミノペプチダーゼ活性を、変異体ＢＡＰ２９にて測定し、親株Ｓ．コエリカラーＭ１４５と比較した。両方の株を、種々の炭素供給源を含むＭＭ中で２４時間増殖させた（図１０）。本発明者らは、キチン中で増殖したＭ１４５間の総Ｄ−ａｌａ−Ｄ−Ａｌａアミノペプチダーゼ活性における実質的な変化を検出できなかった。しかしながら、グルコース＋キチンにおいて、本発明者らは、Ｍ１４５と比べて、変異体ＢＡＰ２９において、平均８５％の活性の減少を測定した。グリセロールおよびグリセロール＋ＧｌｃＮＡｃにおいて、ｄａｓＲ変異体は、それぞれ約７０％および３３％増加した活性を持ち、したがって、反対の効果が明らかになっている。これらの実験によって、ＤａｓＲが、培養液の条件にしたがって、ｄｐｐＡ活性を制御しており、したがって、ペプチドグリカン前駆体生合成のために必要なＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａプールを調節することが示されている。
【０１２４】
ＤａｓＲと中央代謝
予想ｄｒｅ部位のリストにおける多数のＮ−アセチルグルコサミン関連遺伝子を考慮して、本発明者らは、ｎａｇ代謝遺伝子の制御におけるＤａｓＲのインパクトを調査した。ＥＭＳＡｓを、精製ＤａｓＲタンパク質と、ｎａｇＢ（グルコサミン−６−Ｐイソメラーゼ）に対する予想ｄｒｅ部位およびｎａｇＫＡオペロン（ＧｌｃＮＡｃキナーゼ、およびＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐデアセチラーゼ）を含むＤＮＡを用いて実施した。両方の場合で、ＤａｓＲ−ｄｒｅ複合体が示され得た（図９）。これは、ＮａｇＡ（図４）における本発明者らのプロテオーム解析、およびｄａｓＲ変異体で構造的に発現する、ｎａｇＢのＲＴ−ＰＣＲ解析と一致する（図８Ｃ）。ＤａｓＲレギュロンはさらに、アミノ糖およびグルタミン／グルタミン酸代謝を含む、窒素代謝に対する遺伝子の制御を介して、Ｎ−アセチルグルコサミンの運命に焦点を当てる。本発明者らのプロテオーム解析によって、反対の反応を触媒する、標的としてグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｄｈＡ；完全にＤａｓＲに依存する）、およびホスホセリン アミノトランスフェラーゼ（ＳＣＯ４３６６、抑制される）が明らかになった（Altermann and Klaenhammer,2005）（図４＆５）。ＮａｇＡによってＮ−アセチルグルコサミンから遊離する酢酸が、アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＳＣＯ３５６３の強力なｄｒｅ部位上流であり、ＥＭＳＡによって確認される）によって、ＴＣＡ回路の前駆体である、アセチル−ＣｏＡに変換される。アセチル−ＣｏＡは、二者択一的に、チオレート（ＴｈｉＬ、プロテオミクスによって検出された標的、図４）によって、アセトアセチル−ＣｏＡに変換されて、脂肪酸代謝に入る。このことは、順番に、Ｇｌｎ（アンチコドンＣＵＧ）およびＧｌｕ（アンチコドンＣＵＣ）に対するすべての主要なｔＲＮＡを含むオペロン中の少なくとも２つの遺伝子、ｔＲＮＡGln−ｔＲＮＡＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｕ−ｔＲＮＡGln−ｔＲＮＡＧｌｕ−が、ＤａｓＲによって調節されることが予想され、一方で最初の３つがそうではないので、転写レベルで、異常な型の制御までよく広がり得、このことはＤａｓＲによるｔＲＮＡ利用性の微調整を示唆している。ｔＲＮＡ存在量のレベルでのそのような制御を支持する証拠は、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡGlnアミノトランスフェラーゼの予想ｄｒｅ部位上流の存在に由来する（表２）。
【０１２５】
したがって、関連したすべての対処段階のほとんど完全な制御をもつ、細胞エネルギーバランス、およびトライアングルＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ／Ｇｌｕ−アセチル−ＣｏＡ周辺の回転のために重要な、ＤａｓＲレギュロンの超制御コアネットワークの図が明らかになる。したがって、ＤａｓＲは、中央代謝の制御において、とりわけ顕著な役割を果たし、代謝工業技術に対する非常に魅力ある標的である。Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルタミン酸代謝に関するすべての標的を、表４にて強調している。
【０１２６】
驚くべきことに、本発明者らのサーモビフィド フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄｏ ｆｕｓｃａ）ゲノムの解析によって、それぞれの酵素コード遺伝子の上流に局在する非常に信頼性のあるｄｒｅ配列で、事実解糖のそれぞれの単独の段階が、ＤａｓＲによって制御されることが示された（表９および図１７）。この意味合いは、この工業的に関連する放線菌において、解糖を介したフラックスが、ＤａｓＲの発現の増強または減少（または不活性化）によって簡単に制御され得るということを意味するので、本当に困難である。
【０１２７】
グルコサミン−６−ＰはＤａｓＲのエフェクターである
きわめて重要な質問は、なにがＤａｓＲを調節するエフェクター分子であるか、である。本明細書で示したように、ＤａｓＲに対する多くの標的が、Ｎ−アセチルグルコサミンの産出（キチン分解系）、輸送（ＰＴＳGlcNAc）、および代謝（フルクトース６−Ｐを介した解糖）に関する。本発明者らはしたがって、アミノ糖代謝周辺に引かれる中間体分子周辺の誘導因子を探した。ｄａｓＲのｎａｇＢおよびｃｒｒプロモーターの結合を干渉するための化合物の能力を試験する、結合干渉実験を設定した。これらの化合物は、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐ、グルコサミン−６−Ｐ、グルタミン酸、グルタミン、アセチル−ＣｏＡ、およびフルクトース６−Ｐであった。これらの結合干渉実験により、ｎａｇＢ（図１２）およびｃｒｒプロモーター領域（示していない）とのＤａｓＲの複合体の形成を防止した唯一の試験化合物であったので、誘導因子／エフェクター分子として、グルコサミン−６−Ｐが同定された。グルコサミン−６−ＰがＤａｓＲのエフェクターとして働くという発見が、（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ細胞外分解、Ｎ−アセチルグルコサミン輸送および細胞内代謝、脂質および窒素代謝、解糖、およびペプチドグリカン合成間の代謝岐路でのその中心的位置によって説明される（図１３）。
【０１２８】
Ｎ−アセチルグルコサミンは、ＮａｇＥ２トランスポーターによって輸送される
Ｎ−アセチルグルコサミンに対する２つの潜在的トランスポーター、すなわち近接遺伝子ｎａｇＥ１（ＳＣＯ２９０６）およびｎａｇＥ２（ＳＣＯ２９０７）が、Ｓ．コエリカラーゲノム上で同定された。変異体を、全遺伝子をアパラマイシン耐性カセットａａｃＣ４で置換することによって、両方の遺伝子に対して作製した。二重変異体をまた産出した（ＢＡＰ６）。これを実施するために使用した方法は、先に記述された（Nothaftら、2003）ように、ｐＷＨＭ３を用いることによってであった。輸送遺伝子ｎａｇＥ１（ＢＡＰ４）、ｎａｇＥ２（ＢＡＰ５）、または両方（ＢＡＰ６）に関して欠損した変異体を、Ｎ−アセチルグルコサミン（１％ｗ／ｖ）の存在する状態またはしない状態で、Ｒ２ＹＥ寒天プレート上にプレートした。寒天プレート上の他の株として、Ｓ．コエリカラーＭ１４５（すべての変異体の親）、ｄａｓＲ変異体ＢＡＰ２９およびｐｔｓ変異体ｐｔｓＨ（ＢＡＰ１）、ｃｒｒ（ＢＡＰ２）、およびｐｔｓＩ（ＢＡＰ３）を使用した。ｐｔｓ変異体の表現系に関して、図３Ａ）を参照のこと。おもしろいことに、ｎａｇＥ２（またはｎａｇＥ２およびｎａｇＥ１）がない状態で、Ｎ−アセチルグルコサミンの添加が、発達に何らかの効果も持たず、一方で、ｎａｇＥ１変異体および親株Ｓ．コエリカラーＭ１４５が、増殖状態にて停止することになる。このことは、実際にｎａｇＥ２が、Ｎ−アセチルグルコサミンのトランスポーターであり、ＤａｓＲ制御系に対する誘導体分子の輸送にとって必須であることを証明した。
【０１２９】
明らかに、ＮａｇＥ２の活性に（正にまたは負に）影響を与えることが、ストレプトミセス細胞内へ導入された誘導因子分子の量に強い影響を持ち、したがって、ＤａｓＲ制御系に強く影響を与える。
【０１３０】
ＤａｓＲレギュロンのフルスケール
本発明者らは本発明書で、約２００の標的を記述している一方（表２）、正確な数字は、疑いもなくずっと大きく、たとえば、本発明者らは、擬陽性を避けるために、非常に制限されたｄｒｅ位置加重マトリックスを使用したが、本発明者らは、そのようにすることによって、多くの正確なｄｒｅ部位があいまいになったという証拠をもつ。さらに、本発明者らは、予想されたＤａｓＲ標的のリスト中、少なくとも８つの転写因子遺伝子を同定した。ＤａｓＲは、多くの検出／輸送要素、およびＧｌｕ−とＧｌｎ−ｔＲＮＡｓの発現を制御する。このことは、ＤａｓＲが、多様な環境の変化に受容的でありえ、たいがい転写レベルおよび翻訳レベル両方で、多くの他のレギュロンを支配することを示唆している。このＤａｓＲによる多重レベル制御を、表１３で要約している。
【０１３１】
レギュロンの絶対的サイズに加えて、広範囲活性調節物に対する必要条件はさらに、単独活性転写因子と呼応して働くべきであるということである（Morenoら、2001）。実際、ＤａｓＲは、ｃｈｉ−関連遺伝子を制御し、これはまたＣｈｉＳ／ＣｈｉＲ二要素系によって（Kormanecら、2000）、そして最近同定された第三の未知のＤＮＡ−結合タンパク質によって（Fujiiら、2005）調節され、このことはキチン分解系の多重−パートナー制御を示唆している。他の例は、ＰＴＳの調節における本発明者らの研究から発生し、そこで本発明者らは、ＤａｓＲに加えて、また、ＲＯＫ−ファミリー調節物をコードしている（Titgemeyerら、1994）、ＳＣＯ６００８が、ｐｔｓ遺伝子の活性化に必要であることを発見した。
【０１３２】
広く広がったＤａｓＲレギュロンは、新規スクリーニング手順のための標的である
おもしろいことに、ＤａｓＲ調節ネットワークが、Ｓ．アベルミチリス（S. avermitilis）およびＳ．スカビエス（S. scabies）にて非常に保存されており、Ｓ．コエリカラーにて予想されるｄｒｅ部位の７５％以上が、Ｓ．アベルミチリス中のオーソロガス遺伝子の上流でみられ、提示された予測のための、強力な系統発生議論を提供する。他の放線菌におけるｄａｓＲレギュロンの強力な保存がまた、ＤａｓＲは、このクラスの細菌中の天然産物と酵素に関する多くの遺伝子を制御し得ることも示している。ＤａｓＲレギュロンの保存が、ＤａｓＲタンパク質の高い保存によって強調される（図１４）。
【０１３３】
Ｓ．クラブリゲルス（S. clavuligerus）中のクラブラン酸産出の予想された制御を考慮して（表３）、本発明者らは、遺伝子の開始に関連するｎｔ位置で、Ｓ．コエリカラーｄａｓＲの−５０／−３０および＋９００／＋９２０領域とマッチするオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによって、ｄａｓＲ遺伝子をクローン化した。クローンを配列決定し、予想される遺伝子産物は、単一アミノ位置で異なり、すなわちＳ．クラブリゲルスＤａｓＲ中Ａｓｎ５５、およびＳ．コエリカラーＤａｓＲ中Ａｓｐ５５であった。これに基づいて、Ｓ．クラブリゲルス中のＤａｓＲ結合部位が、Ｓ．コエリカラー中のものと非常に類似していることが明らかである。相当する核酸およびアミノ酸配列を図１９にて開示している。
【０１３４】
驚くべきことに、本発明者らは最近、コア遺伝子クラスターｎａｇＡ−ｎａｇＢ−ｄａｓＲ（およびｄｒｅ要素）がまた、バチルス、ラクトコッカス、リステリアおよびストレプトコッカスを含む、低Ｇ＋Ｃグラム陽性間で広く広がっていることを発見した。バチルスのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量（４３％）が、放線菌のもの（７２〜７３％）よりも約３０％低いけれども、組織が保存されているだけでなく、ｄｒｅ部位の配列も保存されている。バチルス サブチリスおよびバチルス ハロドゥランス（Bacillus halodurans）のｄｒｅ部位を表５にて要約しており、ストレプトコッカス種のものを表７で、ラクトコッカス ラクティスのものを表６で、そしてリステリア インノキュアおよびリステリア モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）のものを表８で要約している。これらの種におけるＤａｓＲ結合部位に関する由来コンセンサス配列が、図１５中、カートーン（cartoon）にて要約されている。
【０１３５】
このことから、本発明者らは、そのような分岐微生物中のそれらの存在が、ＤａｓＲ制御系が、少なくとも５０億年の進化で残っていることを意味するので、ＤａｓＲコアレギュロンが、非常に重要なコンセプトであると結論づけた。遺伝的改変による以外の外部からの、多くの工業的および医学的に関連する化合物（酵素、抗生物質、抗がん剤、農業化合物、および他の二次代謝物）の発現を制御可能にするので、ＤａｓＲの活性を操作するためのツールを発見することがしたがって、非常に重要である。これはたとえば、個々の株操作が選択肢ではないので、新規のスクリーニング戦略を設定するための必須条件である。誘導因子（とりわけ、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび誘導体）の添加が、広範囲の天然産物の発現を誘引し、または少なくとも増強し、これは、より簡単なスクリーニングを可能にする。明白な例は、封じられて、したがって活性に基づくスクリーニングアッセイによって同定不可能である、潜在性クラスターの制御である。本発明者らは、抗生物質生合成クラスターが、ＤａｓＲの活性の除去または減少によって活性化されることを示し、また本発明者らは、誘導体の添加が、これらのクラスターを軽減し、したがって新規のスクリーニング手順の可能性を押し上げることを予想している。
【０１３６】
ＡｃｔおよびＲｅｄ産出におけるＤａｓＲの効果の詳細な解析
以上で示したように、発達を可能にする培地（たとえばマンニトール−含有固体培地）上、ｄａｓＲ変異体が、着色抗生物質アクチノルホジン（Ａｃｔ）およびウンデシルプロジギオシン（Ｒｅｄ）の増強した産出を示した。ｄａｓＲ変異体中の抗生物質産出における相対的増加を、固体褐色培養液のスペント寒天（炭素供給源添加なしのＭＭ）中のＡｃｔおよびＲｅｄ濃度を決定することによって定量した。これらの条件下、Ｓ．コエリカラーが唯一寒天上で増殖し、ＤａｓＡ寒天ラーゼの誘導によって可能となる（Buttnerら、1987）。顕微鏡測定によって、ＡｃｔおよびＲｅｄ産出が、それぞれ３．２（±０．２）および３．９（±０．３）の因子（三回の独立した実験の平均）によって、ＢＡＰ２９中で一定に増強した。図４で示したように、ｄａｓＲ変異体による増強されたＡｃｔ産出のさらなる支持にて、Ｍ１４５およびＢＡＰ２９の細胞外画分の初期プロテオーム解析によって、アクチノルホジンの立体特異的ピラン環形成に関与する分泌タンパク質、ＳＣＯ５０７４によってコードされたｄａｓＲ変異体、すなわちＡｃｔＶＩ−ＯＲＦ３（HeskethおよびChater、2003;Ichinoseら、1999）、保存仮想細胞質タンパク質、ＳＣＯ５０７９の産物、ＡｃｔＶＡ−ＯＲＦ４（Caballeroら、1991）中で強力にアップレギュレートされたａｃｔクラスター中の遺伝子によってコードされた２つのタンパク質が同定された。
【０１３７】
本発明者らは、それぞれａｃｔおよびｒｅｄ遺伝子クラスターの転写活性化因子をコードしている、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４とｒｅｄＺの推定ｄｒｅ部位上流を観察した（ｄｒｅ部位に関して、表２を参照のこと）。ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４のｄｒｅ部位上流（転写開始部位に対してｎｔ位置−５９／−４４）が、プロモーターのカノニカル−３５〜−１０配列の間に正確に存在し、位置は、ＤａｓＲが、転写抑制因子として機能すべきであることを示唆している。ｒｅｄＺのｄｒｅ部位上流（転写開始部位に対してｎｔ位置−２０１／１８６）が、ｒｅｄＺプロモーターの−３５配列の５０ｂｐ上流周辺に存在する。
【０１３８】
精製Ｈｉｓ６−タグ化ＤａｓＲおよび二本鎖オリゴヌクレオチドプローブでの電気泳動移動ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡｓ）によって、ｒｅｄＺおよびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４の予想ｄｒｅ部位への、そして陽性対照（ｃｒｒ−ｐｔｓＩのｄｒｅ部位）への直接結合が示され、一方で、ＤａｓＲはｄｒｅ要素への類似性を欠く、したがって陰性対照として使用した、ｃｒｒのシス活性要素に結合しなかったことが示された（図２１Ａ）。ＤａｓＲがｃｒｒ断片に結合した場合、遊離鋳型は見られなかったが、一方で、５０％以上のｒｅｄＺプローブが結合し、約１０％のみのａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４ ｄｒｅ部位が結合した。したがって、本発明者らは、それらの「統計学的強度」に相当する結合効果を持つ、予想ｄｒｅ部位へのＤａｓＲタンパク質の直接結合を確立した。
【０１３９】
ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４、ｒｅｄＺおよびｒｅｄＤの制御におけるＤａｓＲの役割をさらに、ＭＭマンニトール寒天プレート上、３０時間（植物増殖）、４２時間（気中増殖の開始）および７２時間（気中増殖および胞子）で増殖させた、親株（Ｍ１４５）およびｄａｓＲ変異体（ＢＡＰ２９）から回収したＲＮＡ試料上の、半定量的ＲＴ−ＰＣＴによって査定した。ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、ｄａｓＲ変異体中、すべての時間点で、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４の転写の強力な増強と、個別の、しかし有意に増強したｒｅｄＺの転写が明らかになった（図２１Ｂ）。明らかに、ＤａｓＲ−依存転写抑制の程度が、ＤＮＡ−タンパク質相互作用の強度に関するだけでなく、プロモーターコンセンサス配列に関するｄｒｅ部位の相対的な位置づけがまた、重要な因子でもある。先に、ｒｅｄＺの増強された発現によって、ｒｅｄＤ転写が誘導され、ｂｌｄＡ変異体中の抗生物質産出におけるブロックをバイパスしていることが示されている（Guthrieら、1998）。実際、ｒｅｄＺの増強した発現が、ｒｅｄ経路−特異的活性因子遺伝子ｒｅｄＤの発現の明らかな増強にて反映された。結論として、ｒｅｄクラスターの公知の活性因子遺伝子が、ＤａｓＲによって負に制御され、これは、ｄａｓＲ変異体中のＲｅｄの産出の増強を説明している。ａｃｔクラスターに対して、ＤａｓＲは、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４のプロモーター領域への結合に対する転写活性因子ＡｔｒＡ、およびそのインビボ活性の調節を介して、または遺伝子不活性化を介してのいずれかで、ＤａｓＲの不活性化と競合し、結果としてＡｃｔ産出の増強となる。
【０１４０】
Ｎ−アセチルグルコサミンが、抗生物質産出を開放するために、ＤａｓＲを標的とする、さらなる証拠
生理学的および化学的差違の開始に対する、環境の栄養状態の初期検出からのシグナル伝達カスケードが、以下の段階を少なくとも含むべきである。（１）細胞外シグナルの利用性および検出、（２）細胞内への「シグナル伝達栄養素」の輸送、（３）誘導体分子へのそれらの細胞内改変、（４）チェックポイントである、広範囲調節物へのその結合、（５）情報の、経路特異的活性因子へのシグナル伝達、および（６）発達および抗生物質産出へのスイッチ。本発明者らの実験によって、ＤａｓＲによって制御されるＧｌｃＮＡｃセンサーカスケードが、栄養素に対する直接の応答において、抗生物質産出を誘引する、広範囲の系であることが示唆される。段階は、（１）ＧｌｃＮＡｃの検出、（２）ＰＴＳGlcNAcを介した輸送、（３）ＮａｇＡによるグルコサミン−６−Ｐへの変換、（４）シグナル伝達物質のＤａｓＲへの結合、であり、したがってａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４およびｒｅｄＺにおけるその抑制活性を阻害し、アクチノルホジンおよびウンデシルプロジジオシンの生合成に対する経路を活性化する。
【０１４１】
ＤａｓＲレギュロンの新規に広がった特性から推定される制御経路からの論争で（図２２）、本発明者らは、ＤａｓＲ−依存輸送およびＰＴＳを介したＧｌｃＮＡｃのリン酸化が、Ｓ．コエリカラーにおけるアクチノルホジンおよびウンデシルプロジジオシン生合成を誘引するための決定的なシグナルでありうると予想した。この仮説を、ＧｌｃＮＡｃの存在する状態またはしない状態でのＭＭ寒天プレート上で、Ｓ．コエリカラーＭ５１０（ΔｒｅｄＤ）、Ｍ５１１（ΔａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４）、およびＭ５１２（ΔｒｅｄＤ、ΔａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４）をプレートすることによって試験した。それぞれの経路特異的活性因子の欠損の結果として、Ｓ．コエリカラーＭ５１０は、赤色着色ウンデシルプロジジオシンを産出不能であり、Ｍ５１１は青色着色アクチノルホジンを産出できず、一方で、Ｍ５１２はいずれの抗生物質も産出しない。これらの株によって、本発明者らは、それらの着色がｐＨ依存であり、生合成誘導体が、種々の色を示すので（Bystrykhら、1996、Ichinoseら、1999）、必要な対照である、それぞれの抗生物質を特異的にモニタ可能である。いずれの株も、単独炭素供給源として、寒天でのＭＭ上、５日間増殖させた場合、有意な量のアクチノルホジンまたはウンデシルプロジジオシンを産出しなかった。ＧｌｃＮＡｃ（１０ｍＭ）が存在する場合、ＡｃｔまたはＲｅｄの産出が、それぞれＳ．コエリカラーＭ５１０およびＭ５１１において誘導された（図２２）。着色抗生物質は、予想されたように、Ｍ５１２に関して観察されなかった（示していない）。したがって、飢餓条件下、ＡｃｔおよびＲｅｄの産出が、ＧｌｃＮＡｃのレベルの増加に対する応答で、そしてＤａｓＲの存在しない状態によっての両方で誘導される。
【０１４２】
薬物ディスカバリーのためのＧｌｃＮＡｃの適用
抗生物質産出のＧｌｃＮＡｃ−仲介制御が、放線菌において、より広く広がる現象であるのか。このことを査定するために、本発明者らは、指標株としてバチルス サブチリスを用いて、種々の放線菌の総抗細菌活性（殺菌および静菌）におけるＧｌｃＮＡｃの効果を評価した。試験した株を、ＧｌｃＮＡｃ（１％）の存在する状態または存在しない状態で、マンニトール（０．５％）を含む最少培地上にスポットした。おもしろいことに、抗生物質産出の増殖阻害ゾーン指標が、ストレプトミセス クラブリゲルス（セファマイシンの産出物）、（キロマイシンを産出する）ストレプトミセス コリヌス、ストレプトミセス グリセウス（ストレプトマイシン産出物）、（ヒグロマイシンを産出する）ストレプトミセス ヒグロスコピクス、（オキシテトラシクリンを産出する）ストレプト０マイセス リモサス、およびストレプトミセス ベネズエラ（クロラムフェニコール、メチマイシン）に関して、非常に大きかった（図２３）。Ｎ−アセチルグルコサミンは、ストレプトミセス アクリマイシニ、ストレプトミセス アベルミティリス、ストレプトミセス シンナモネンシス、ストレプトミセス リモサスおよびストレプトミセス リビダンスにおける、Ｂ．サブチリスに対する抗生活性に影響を与えたように見えなかった。興味深いことに、本発明者らは、ストレプトミセス ロセオスポルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）にて抑制効果を観察した。これらの結果によって、ＧｌｃＮＡｃによる（そしてＤａｓＲを介した）抗生物質産出の救済が、放線菌中での共通の制御機構であることが示唆されている。
【０１４３】
ＤａｓＲが、放線菌における潜在性二次代謝物クラスターをサイレンスすることにおいて役割を果たすかどうかを査定するために、本発明者らは、今まで研究した唯一の潜在性クラスターである、仮想Ｉ型ポリケチド（ＳＣＯ６２７８−６２８８）に対する予想抗生物質生合成クラスターの発現レベルを解析した。この生合成経路の誘導は、経路特異的活性化因子、ＫａｓＯ（ＳＣＯ６２８０）に依存し、順に、γ−ブチロラクトン（ＳＣＢ１）結合タンパク質ＳｃｂＲによって抑制される（Takanoら、2005）。ｋａｓＯの抑制は、ＳＣＢ１の産出によって救済される。ｄａｓＲがないことによってこのクラスターの潜在的「覚醒」を試験するために、本発明者らは、ＭＭマンニトール寒天プレート上で、３０時間（植物増殖）、４２時間（気中増殖の開始）、および７２時間（気中増殖および胞子）増殖した、親株（Ｍ１４５）およびｄａｓ変異体（ＢＡＰ２９）から回収したＲＮＡ試料上で、半定量ＲＴ−ＰＣＲを実施した。おもしろいことに、ｋａｓＯ転写物が、ＢＡＰ２９の３０時間および７２時間ＲＮＡ試料中で検出されたが、任意の試料において、Ｍ１４５では見られなかった（図２４）。ｋａｓＯの誘導の結果としてたいがい、生合成クラスターの最後のＯＲＦであり、推定Ｉ型ポリケチドシンターゼをコードしている、ＳＣＯ６２７３の転写が、劇的に増加した（図２４）。ＳＣＯ６２７３の発現の増強が、栄養増殖間でのみ観察された。ｄｒｅ部位は、ｋａｓＯの推測上流に存在せず、ＤａｓＲとこの潜在性クラスター間のシス−トランス相互作用は、調査中である。
【０１４４】
細胞壁溶解の制御におけるＤａｓＲの関与
キチンは、ＧｌｃＮＡｃの保存の主要な形態であり、地球上で第二のもっとも豊富なポリマーであり、それ自体は土壌−住居細菌にとって非常に重要なものである。ＧｌｃＮＡｃは、富Ｎ−およびＣ−供給源であり、その代謝産物酢酸、アンモニアおよびフルクトース−６−Ｐが、主要な一次代謝経路の交差にて存在する。このことは、異なる型のキチン含有基質をコロニー化可能である選択的利点を強調する（Saitoら、2003、Schrempf、2001）。本発明者らの実験によって、ＧｌｃＮＡｃが反対のシグナル、すなわち栄養−富条件下、拡大（増殖および発達阻止）、および栄養が限定された条件下、増殖停止と続く発達（抗生物質産出、胞子形成）を提供可能である。ＧｌｃＮＡｃの２つの主要な供給源、キチンおよび細菌固有の細胞壁が存在し、これらは反対の応答を誘引し得る。細菌キチナーゼは主に、キト−オリゴサッカライド、およびキチンからのＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ）2を産出し、ＧｌｃＮＡｃはほとんど産出されない。また、ｄａｓＲ変異体は、親株と比べて、５倍低いキチン分解活性を持つが（Colsonら、2007）、抗生物質を過剰産出し、これはキチナーゼがシグナルを産出しないことを示唆している。「ＧｌｃＮＡｃ効果」が、より高い濃度（＞５ｍＭ）でのみ観察された。おそらく、たいがい天然の供給源が、細菌細胞壁の自己消化でありうる。多量のＧｌｃＮＡｃが、プログラムされた細胞溶解後、局所で蓄積することが発見され、一般的栄養制限が、栄養菌糸の消費にて、気中菌糸体の発達を必要とする時である（Miguelezら、2000）。本発明者らが、栄養検出、細胞壁溶解およびタンパク質分解および二次代謝（とりわけ抗生物質産出における）がすべてＤａｓＲの機能に連結していることを示しているので、抗生物質経路特異的活性因子とともに、ペプチドグリカン前駆体の異化に関与する遺伝子の単一レギュロン内で、非常に示唆的なクラスタリングが存在する。
【０１４５】
放線菌によって産出された多数の二次代謝物と、それらの産出を誘引する広範囲調節機構における相対的に制限された知識間の対比が、多くが、有機体それ自身から学習することによる、薬物ディスカバリーに関して得られることを暗示している。本発明者らは、抗生物質産出に対する栄養ストレスからのシグナル伝達カスケードを提案する。本発明者らの推定された経路が、ＧｌｃＮＡｃが放線菌に対する重要なシグナル分子として提案され、生息環境の栄養状態を決定可能である。ＰＴＳGlcNAcによって輸送されるシグナルが、グルコサミン−６−Ｐに代謝され、ＤａｓＲを不活性化し、順に抗生物質産出および栄養富条件下での発達の抑制に関連する。ＰＴＳGlcNAcに加えて、ＤａｓＲが、多くのよりＡＢＣ糖トランスポーターを制御し、種々のこれらの機能が現在調査中である。抗生物質産出が、ＤａｓＲ−仲介制御系を干渉することによって覚醒および／または増強可能であるという発見が、新規の天然産物のディスカバリーにて指向される、スクリーニングプログラムに対する新たな見通しをひらく。考えられる限りでは、数千の株の可能性を産出することは、ＧｌｃＮＡｃの添加によって促進され、本発明者らは、多くの場合で、ヒットおよびミス間の差を作り出すという強力な証拠を持っている。これは、（ＭＤＲ−およびＸＤＲ−マイコバクテリウム チューベルクローシス、メチシリン耐性スタフィロコッカス アウレウス（ＭＲＳＡ）、およびバンコマイシン耐性塩テロコッカス ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＶＲＥ）のような）再発性多剤耐性株によって引き起こされる感染性疾患、また特定のがんの処置のための薬物のディスカバリーにて目指されるスクリーニング手順の成功率を改善する。
【０１４６】
【０１４７】
【表１】
【０１４８】
【表２】
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
【表４】
【０１５１】
【表５】
【０１５２】
【表６】
【０１５３】
【表７】
【０１５４】
【表８】
【０１５５】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１Ａ】ＤａｓＲ結合部位の同定およびＤａｓＲレギュロンの予測を示す図である。ｃｒｒ−ｐｔｓＩ領域内のＤａｓＲ結合部位のＤＮａｓｅＩフットプリント法（ｃｒｒの開始点に対して−２０２／＋８のｎｔ位置）の結果を示す図である。ｃｒｒ−ｐｔｓＩプロ−ブをＤＮａｓｅＩ（０．４μ／ｍｌ）と一緒にインキュベートし、精製したＤａｓＲの量を増加させた（レーン２〜７中、それぞれ０、１０、２０、４０、６０、または８０ｐｍｏｌのＤａｓＲ）。追加対照群：レーン１はＤａｓＲ含有、ＤＮａｓｅＩ非含有のプローブである。レーン８は、ＤＮａｓｅＩおよび非特異的なタンパク質（ＢＳＡ）３５０ｐｍｏｌ有りのプローブである。ＡＣＧＴは、ＤＮＡ配列レーンである。ｃｒｒ−ｐｔｓＩプローブのＤＮＡ配列はＤａｓＲ保護配列（“フットプリント”と示した）を表す。ＤａｓＲコンセンサス（標的部位の下）に一致する配列を黒で強調し、ｃｒｒ翻訳開始コドンをグレーで強調した。
【図１Ｂ】ＤａｓＲ結合部位の同定およびＤａｓＲレギュロンの予測を示す図である。ＤａｓＲによって制御されていることが示された、および／または予測される遺伝子の分類および数を示す円グラフである。
【図２Ａ】成長および抗生物質産生に対するｄａｓＲの効果を示す図である。Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５およびそのｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９による、ＧｌｃＮＡｃを含む、または含まない最小寒天プレートにおける抗生物質産生を示す図である。ＧｌｃＮＡｃの存在は、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５への色素性抗生物質アクチノロージンおよびウンデシルプロジギオシンの誘導に必要であるが、一方、発現はｄａｓＲ変異株で構成的である。後者は、（ｉ）ＡｃｔＶ４Ａは変異株において増大される（図４）、および（ii）アクチノロージン産生のための経路特異的活性遺伝子ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４、およびウンデシルプロジギオシン産生のための経路特異的活性遺伝子ｒｅｄＺのＤａｓＲ結合ｄｒｅ上流の同定という、本発明者らの発見に一致する。予想外に、ＧＩｃＮＡｃを含む最小培地で成長したｄａｓＲ変異株は今までのところ未同定である緑色色素の発現を示している。
【図２Ｂ】成長および抗生物質産生に対するｄａｓＲの効果を示す図である。ＤａｓＲの過剰発現は成長停止を引き起こす。左は、対照プラスミドｐＵＷＬ−ＫＳを有するＳ．コエリカラー（S. colicolor）Ｍ１４５である。右は、過剰発現したｄａｓＲプラスミドを有する同株である（３００℃で４日間培養した）。ＤａｓＲ過剰発現株では気菌糸がほとんど欠如している（白色）ことに注意されたい。
【図２Ｃ】成長および抗生物質産生に対するｄａｓＲの効果を示す図である。Ｓ．コエリカラー（S. colicolor）Ｍ１４５およびｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９の、気菌糸および胞子の走査電子顕微鏡写真である。書き込みの見出しはＤａｓＲ変異株の異常な胞子を示す。棒線は５μｍを示す。
【図２Ｄ】成長および抗生物質産生に対するｄａｓＲの効果を示す図である。左は、Ｍ１４５の透過電子顕微鏡写真、右はＢＡＰ２９の透過電子顕微鏡写真である。矢印は細胞壁と細胞膜との間の空隙を示す。ＦＤは完全分離を示し、ＩＤは不完全分離を示す。
【図３Ａ】ＰＴＳによる成長制御を示す図である。正確な成長にはＰＴＳ系が不可欠である。菌株をＳＦＭまたはＲ２ＹＥ寒天プレート上で５日間培養した。ＳＦＭ上では、ｃｒｒ変異株ＢＡＰ２は白色の気中菌糸体を産生したが、それらの条件下では胞子を産生することはできなかった。一方、ｐｔｓＨが欠失（ＢＡＰ１）またはｐｔｓＩが欠失（ＢＡＰ３）していると、グレーに着色された胞子が多少産生された。興味深いことに、Ｒ２ＹＥ寒天プレート上では、３種のＰＴＳ変異株全てにおいて成長停止が見られた（いわゆる、ｂａｌｄまたｂｌｄ表現型）。
【図３Ｂ】ＰＴＳによる成長制御を示す図である。ＰＴＳによりｗｈｉＧの転写が制御されることを示す図である。本図は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物含有の１％寒天・ゲルを示す。野生株およびＰＴＳ変異株ＢＡＰ１（ΔＨＰｒ）、ＢＡＰ２（ΔＩＩＡcrr）、およびＢＡＰ３（ΔＥＩ）の対数増殖した菌糸体から全ｍＲＮＡを調製した。本図では、ホスホトランスフェラーゼＩＩＡcrrおよびＥＩ欠乏菌株においてｗｈｉＧ−ｍＲＮＡ濃度が減少したことが示されている。結果は、指数増殖期中の異なる時点で採取した菌糸体により、３連で再現された。標準対照として１６Ｓ ｒＲＮＡを検出した。
【図３Ｃ】ＰＴＳによる成長制御を示す図である。ＨＰｒによる、ＷｈｉＧの翻訳後修飾の制御を示す図である。Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５（ｗｔ）、およびそのｐｔｓ変異株（それぞれ、Ｈｐｒキナーゼ、酵素ＩＩＡ（Ｃｒｒ）または酵素Ｉの遺伝子が欠損している）由来の全抽出タンパク質について二次元ゲル電気泳動を行った。ＷｈｉＧタンパク質の周りの領域をクローズアップして示す。予想されたように、非常に低下した転写（３Ｂ）の結果として、酵素ＩＩＡおよび酵素Ｉが欠乏している変異株におけるＷｈｉＧタンパク質濃度が非常に低い。意外にも、ＷｈｉＧと比べ分子量は小さいが同じ等電点を有するいくつかのバンドが、ＨＰｒ変異株では見られず、このことはＷｈｉＧの翻訳後修飾におけるＨＰｒの関与を強く示している。修飾の正確な性質は不明であるが、影響が質量に対してのみで、ｐＩには影響しないことを考えると、本発明者らは、このことはＷｈｉＧ前タンパク質の加工に起因すると考える。
【図４Ａ】プロテオーム解析によるＤａｓＲ標的の同定を示す図である。強度がＤａｓＲに依存するタンパク質スポットのクローズアップ図である（２倍より大きい）。矢印は、質量分析によって同定されたタンパク質スポットを強調している。１、ＴｈｉＬ（ＳＣＯ５３９９）、アセトアセチル−ＣｏＡ チオラーゼ；２、ＧｄｈＡ（ＳＣＯ４６８３）、グルタミン酸脱水素酵素；３、ＳＣＯ５５２０、Δ−１−ピロリン−５−カルボン酸デヒドロゲナーゼ；４、ＡｃｔＶ−Ａ４（ＳＣＯ５０７９）、アクチノロージン生合成経路の一員（機能不明）；５、ＭｓｉＫ（ＳＣＯ４２４０）、多糖取り込みタンパク質；６、Ｇｐｓｌ（ＳＣＯ５７３７）、グアノシン５リン酸シンテターゼ；７、ＳＣＯ４３６６、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ；８、ＮａｇＡ（ＳＣＯ４２８４）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸脱アセチル化酵素；９、ＧａｌＴ（ＳＣＯ３１３８）、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ。タンパク質：ＴｈｉＬ（ＳＣＯ５３９９）、アセトアセチル−ＣｏＡ チオラーゼ；ＧｄｈＡ（ＳＣＯ４６８３）、グルタミン酸脱水素酵素；ＳＣＯ５５２０、Δ−１−ピロリン−５−カルボン酸デヒドロゲナーゼ；ＭｓｉＫ（ＳＣＯ４２４０）、多糖取り込みタンパク質；Ｇｐｓｌ（ＳＣＯ５７３７）、グアノシン５リン酸シンテターゼ；ＳＣＯ４３６６、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ；ＮａｇＡ（ＳＣＯ４２８４）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸脱アセチル化酵素；９、ＧａｌＴ（ＳＣＯ３１３８）、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ。
【図４Ｂ】プロテオーム解析によるＤａｓＲ標的の同定を示す図である。Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor） Ｍ１４５およびそのｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９の液体培養の使用済み培地から分離した分泌タンパク質を示す一次元のＰＡＧＥゲルの図である。Ｍは分子サイズ標識（ｎｋＤａ）を示す。ＳＣＯ５０７４として同定されＡｃｔＶＩ−ＯＲＦ３としても知られる単一タンパク質がｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９において強く過剰発現していることに注意されたい。
【図５】Ｎ−アセチルグルコサミン関連の酵素反応およびグルコサミン−６−Ｐの中心位置の略図である。ＤａｓＲ標的の同定が示されている。矢印は、ｄａｓＲ変異株における促進（太い矢印）または阻害（細い矢印）を示す。細胞外キチンは加水分解されて一度細胞内に組み込まれると、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に転換され、それは次いでＮａｇＫによりＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐにリン酸化される。ＮａｇＡはＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐを脱アセチル化してＧｌｃＮ−６−Ｐにする。ＧｌｃＮ−６−Ｐは、窒素代謝、ＴＣＡ回路、ペプチドグリカン前駆体合成、およびＮａｇＢを介した解糖（ＧｌｃＮ−６−Ｐからフルクト−ス−６−リン酸（Ｆｒｕ−６−Ｐ）への転換）の間の中心位置を占める。本略図は、グルコサミン−６−Ｐ、ＤａｓＲレギュロンのエフェクター分子の中心位置を強調している。大きい縦の矢印は、ｄａｓＲに制御される、細胞外（多）糖類から解糖およびＴＣＡ回路に向かう流れを強調している。関係する経路はＫＥＧＧデータベースで検索することができる。（http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html）。
【図６Ａ】ＤａｓＲがキチン関連遺伝子を活性化することを示す図である。さまざまな炭素供給源が補充される最小培地で４８時間培養した後の、ＢＡＰ２９、Ｍ１４５間の広範囲のキナーゼ、細胞外および細胞内６−Ｎ−アセチルグルコサミダーゼ活性の比較を示す図である。活性は、誘導条件下での親株Ｍ１４５に対する百分率（％）で表されている。
【図６Ｂ】ＤａｓＲがキチン関連遺伝子を活性化することを示す図である。ｃｈｉＩ、ｃｈｉＦ、およびＳＣＯ６３００に対するＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【図７】ＤａｓＲが主な多糖類分解系の発現を制御することを示す図である。酵素活性を、特異的な分解活性に起因するコロニーの周りにできる透明帯の大きさとして測定した。左がＭ１４５、右がｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９の結果である。一番上は、キシラナーゼ活性測定、真ん中はマンナナーゼ活性測定、一番下は、α−アミラーゼ活性測定の結果である。ＣＣＲはグルコースによって誘導される炭素カタボライト抑制、ＳＩはキシラン（一番上）、マンナン（真中）、およびデンプン（一番下）によって誘導される基質誘導を表す。ｄａｓＲ欠損下ではキシラナーゼ発現が誘導されないが、一方マンナナーゼおよびα−アミラーゼ活性は過剰発現することに注意されたい。ＣＣＲ条件下においては、全ての系でグルコース抑制の促進が見られる。
【図８Ａ】ＤａｓＲがＮ−アセチルグルコサミンレギュロン遺伝子を抑制することを示す図である。ＧｌｃＮＡｃの取り込みに対するｄａｓＲ欠失の影響を示す図である。左は、グリセロール培養培地における取り込み、右は、グリセロールおよび誘導物質（ＧｌｃＮＡｃ）培養培地における取り込みを示す。発現はＢＡＰ２９において構成的であることに注意されたい。
【図８Ｂ】ＤａｓＲがＮ−アセチルグルコサミンレギュロン遺伝子を抑制することを示す図である。ＨＰｒ（上）およびＩＩＡCrr（下）のウェスタンブロットを示す図であり、これらのＰＴＳタンパク質の誘導性はＤａｓＲにより制御されることが示されている。
【図８Ｃ】ＤａｓＲがＮ−アセチルグルコサミンレギュロン遺伝子を抑制することを示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲによるｃｒｒ（ＩＩＡCrrに対する）、ｎａｇＥ２（ＩＩＣGlcNAcに対する）、ｍａｌＸ２（ＩＩＢGlcNAcに対する）、ｎａｇＢ、およびｃｈｉＦの転写解析を示す図である。対照として１６Ｓ ｒＲＮＡを用いた。
【図９】ＤａｓＲと種々の標的遺伝子とのシス／トランス相関を示す図である。電気泳動ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により、コンピュータで予測されたＤａｓＲの標的への結合が実証されることが示されている。上は、１０ｎＭの蛍光プローブを用いて行った、１００倍の過剰非特異的ＤＮＡの存在下で精製ＤａｓＲ無し（上部のプロット）および精製ＤａｓＲ有り（３μＭ、下部のプロット）での、ＥＭＳＡの結果、下は、体積１０μｌ、１０ｐｍｏｌのｄｒｅ−含有ＤＮＡ、１００倍の過剰非特異的ＤＮＡの条件下で、４μｇの精製ＤａｓＲ無し（−）または有り（＋）で実施したＥＭＳＡの結果を示す。ＤａｓＲ−ｄｒｅ複合体は１×ＴＡＥ緩衝液中の１％寒天ロース・ゲル上で分解した。ｄｒｅ部位を示すが、ここでＰXlnAおよびＰcrpは負の制御として機能し、Ｐcrrは正の制御として機能する。
【図１０】ＤｐｐＡ活性測定の結果を示す図である。Ｓ．コエリカラー（S.coelicolor） Ｍ１４５およびＢＡＰ２９（ΔｄａｓＲ）によるＤｐｐＡ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａアミノペプチダ−ゼ）産生を、ＤｐｐＡの細胞内活性として測定した。培養物を、さまざまな（組み合わせの）炭素源、すなわちグリセロ−ル、グリセロ−ル＋Ｎ−アセチルグルコサミン、キチン、またはグルコ−ス＋キチンを含有する液体ＮＭ培地で２４時間培養した。
【図１１】ストレプトミセス コエリカラーにおける抗生物質産生に対する糖類の影響およびＤａｓＲの影響を示す図である。Ａｃｔはアクチノロ−ジン（青色色素）、Ｒｅｄはウンデシルプロジギオシン（赤色色素）、ｇｒｅｅｎは未知の新規化合物を示す。Ｄｅｕは培養物の成長段階を表す（ｂａｌはｂａｌｄ／栄養表現型、ｗｈｉは白色／気菌糸、ｓｐｏは胞子形成を示す）。
【図１２】ＤａｓＲによるＤＮＡ結合がグルコサミン−６−Ｐによって阻害されることを示す図である。本図は、ｎａｇＢプロモーターに結合するＤａｓＲのＥＭＳＡの結果を示す。１０ｎＭの蛍光プローブ、３μＭの精製ＤａｓＲ、および５００倍の過剰非特異的ＤＮＡを用いてＥＭＳＡを行った。プロット１は、ｎａｇＢプロモーター（ＤａｓＲは加えず）についての制御実験、プロット２〜５は、ＤａｓＲおよび５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、および２００ｍＭのＧｌｃＮＡｃ（左側のパネル、影響は見られず）、ならびにＧｌｃＮ−６−Ｐ（右側のパネル、ｄｒｅ部位からＤａｓＲが放出）が存在する場合のｎａｇＢプロモーターについての制御実験を示す。
【図１３】ＤａｓＲによる炭素源利用の包括的制御モデルである。本モデルは、土壌中の豊富な多糖類性の炭素源（セルロース、キシラン、キチンなど）が、細胞外加水分解酵素によって分解されて各々の単糖および二糖になることを例証している。Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）はＰＴＳによって、ＰＥＰ→酵素Ｉ（ＥＩ、ｐｔｓｌによってコードされている）→ＨＰｒ（ｐｔｓＨ）→ＥＩＩＡCrr（ｃｒｒ）と移され、次々にＧｌｃＮＡｃ特異的なパーミアーゼＥＩＩＢＣのＥＩＩＢタンパク質をリン酸化する、順次的なホスホリル基を経て運ばれる。ＤａｓＲは、ＰＴＳＧｌｃＮＡｃの全ての遺伝子のレプレッサーとして機能する。他の分解産物は、２つの糖特異的な膜タンパク質、特異的な、細胞外かつ脂質支持された糖結合タンパク質で構成されるＡＢＣ−パーミアーゼによって運ばれる。これらのＡＢＣ系（４０を上回ると予測される）は、ＤａｓＲによって調節される普遍的なＡＴＰａｓｅ ＭｓｉＫ（多糖取り込みタンパク質）により補助される。代謝酵素ＮａｇＡおよびＮａｇＢ（両遺伝子ともＤａｓＲにより制御される）は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐ（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）およびフルクトース−６−Ｐに変換させる。ＧｌｃＮ−６−ＰはＤａｓＲに対するエフェクターとして供給され、したがってｐｔｓ遺伝子およびｍｓｉＫの遺伝子発現を引き起こす。ｎａｇＢ、およびｄｐｐＡオペロン（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａアミノペプチダーゼ）に対するＤａｓＲ媒介制御は、細胞壁合成の調節におけるその役割を示唆する。ｓｈは糖加水分解遺伝子、ｓｒは、ＡＢＣパーミアーゼおよび関連する細胞外の糖加水分解酵素をコードするオペロンの特異的な調節因子に対する遺伝子を示す。架空のクロモソーム上の黄色の円および赤色の囲みは、それぞれＤａｓＲ応答配列、および糖特異的な調節因子応答配列を示す。
【図１４Ａ】グラム陽性細菌由来のＤａｓＲ相同体の配列を示す図である。放線菌類由来のＤａｓＲ相同体を示す図である。重層に含まれる相同体は下記由来のタンパク質である。Ｓｃｏｅｌ、ストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）（ＳＣＯ５２３１）；Ｓｃｌａｖ、ストレプトミセス クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）；Ｓａｖｅｒ、ストレプトミセス アヴェルミティリス（Streptomyces avermitilis）（ＳＡＶ３０２３）；Ｓｇｒｉｓ、ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）（ＢＡＢ７９２９６）；Ｓｓｃａｂ、ストレプトミセス スカビエス（Streptomyces scabies）；Ｓ１３９、ストレプトミセス種（Streptomyces species）１３９（ＡＡＮ０４２２８）；Ｔｆｕｓｃ、サーモビフィド フスカ（Thermobifido fusca）（ＡＡＺ５４５９２）。
【図１４Ｂ】グラム陽性細菌由来のＤａｓＲ相同体の配列を示す図である。高Ｇ＋Ｃおよび低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌由来のＤａｓＲ様タンパク質の比較を示す図である。興味深いことに、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）ＤａｓＲはバチルス サブチリス（Bacillus subtilis）ＧｎｔＲ型タンパク質ＣＡＢ１５５０８と約４０％同一である。追加のタンパク質は下記由来のものである。Ｃｅｆｆｉ、コリネバクテリウム エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）（ＢＡＣ１９１３１）；Ｌｍｏｎｏ、リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）（ＡＡＴ０３７５６）；Ｓｔｈｅｒ、ストレプトコッカス サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（ＡＡＶ６２４７５）；Ｂｓｕｂｔ、バチルス サブチリス（ＣＡＢ１５５０８）。第２のＤａｓＲ相同体（指定ＤａｓＲ２）がストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）（ＳＣＯ０５３０）に見られたので累積に含めた。唯一の既知標的はＡＢＣトランスポーターオペロンＳＣＯ５３１−５３２−５３３のすぐ上流に位置している。
【図１４Ｃ】グラム陽性細菌由来のＤａｓＲ相同体の配列を示す図である。遺伝子ＳＣＯ５２３１−５２３５間、およびＳＣＯ５３０−５３４間の類似性は、遺伝子重複事象を強く示唆している。
【図１５】ストレプトミセス（Streptomyces）、バチルス（Bacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、リステリア（Listeria）およびストレプトコッカス（Streptococcus）由来のコンセンサス配列を示す図である。本図は、Ｌｏｇｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Crooksら、2004）を用いて作成した。それぞれの生物中の全予測ＤａｓＲ結合部位のヌクレオチドについて、大きい文字は高度の保存を示し、小さい文字は低度の保存を示す。これらの予測の為に、本発明者らはＳ．コエリカラー（S. coelicolor）由来のコンセンサスＤａｓＲ結合配列を用いて、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌中のｐｔｓおよびｎａｇ遺伝子上流の相同配列を探索した。次いで、得られたコンセンサス配列を用いてストレプトミセス、バチルス、ラクトコッカス、リステリアおよびストレプトコッカスに存在する推定ＤａｓＲ結合部位の新規鋳型を構築した。
【図１６】ストレプトミセス コエリカラーＭ１４５およびそのｄａｓＲ変異株の液体培養ＴＳＢ培地における形態および分岐を示す図である。ストレプトミセス コエリカラーＭ１４５（上の写真）が典型的な偶発的分岐を示しているのに対し、ｄａｓＲ遺伝子が欠失していると分岐が非常に増加する結果となる（下の写真）。このことは、ｄａｓＲの発現レベルを変更することによって、形態の制御に重要であり、故に大規模な発酵における成長の具合を改良するための手段である分岐頻度を測定することができることを示唆している。棒線＝１０μｍ。
【図１７】サーモビフィド フスカ（Thermobifido fusca）における、ＤａｓＲによる解糖および関連経路の完全制御を示す図である。オキサロ酢酸までの解糖および関連経路のほとんど全ての段階がＤａｓＲによって直接制御されていることが予測される。それぞれの遺伝子についてのデータベース参照番号を示す。解糖のすべての単一段階がＤａｓＲ依存的であることが予測されることに注意されたい。
【図１８】Ｎ−アセチルグルコサミンがＮａｇＥ２２（ＳＣＯ２９０７）によって輸送されることを示す図である。輸送遺伝子ｎａｇＥ１（ＳＣＯ２９０６）、ｎａｇＥ２（ＳＣＯ２９０７）、または両者を欠失した変異株を、Ｎ−アセチルグルコサミン（１％ｗ／ｖ）含有、または非含有のＲ２ＹＥ寒天プレート上で平板培養した。寒天プレート上の他の菌株は、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５（全ての変異株の親株）、ｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９、ならびにｐｔｓ変異株ｐｔｓＨ（ＢＡＰ１）、ｃｒｒ（ＢＡＰ２）、およびｐｔｓＩ（ＢＡＰ３）である。ｐｔｓ変異株の表現型については、図３Ａも参照されたい。面白いことに、ｎａｇＥ２（またはｎａｇＥ２とｎａｇＥ１）が欠如していると、Ｎ−アセチルグルコサミンを加えても成長に影響を及ぼさないが、一方ｎａｇＥ１変異株および親株のＳ．コエリカラー（S. coelicolor ）Ｍ１４５では増殖状態が停止する。このことは、実際にｎａｇＥ２がＮ−アセチルグルコサミンのトランスポーターであり、ＤａｓＲ制御系の誘導因子を取り込むために必須であることを証明している。
【図１９Ａ】Ｓ．クラブリゲルス（S. clavuligerus）ｄａｓＲ／ＤａｒＲの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。ｄａｓＲの核酸配列を示す図である。
【図１９Ｂ】Ｓ．クラブリゲルス（S. clavuligerus）ｄａｓＲ／ＤａｒＲの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。ＤａｓＲのアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】さまざまなストレプトミセス種から得たＤａｓＲのヘリックス−ターン−ヘリックスＤＮＡ結合モチーフに対応するタンパク質配列のアラインメントを示す図である。ＳａｍｂｏはＳ．アムボファシエンス（S. ambofaciens）、ＳａｖｅｒはＳ．アベルミチリス（S. avermitilis）、ＳｃｉｎｎはＳ．シンナモネウス（S. cinnamoneus）、ＳｃｏｅｌはＳ．コエリカラー（S. coelicolor）、ＳｃｏｌｌはＳ．コリヌス（S. collinus）、ＳｄｉａｓはＳ．ジアスタトクロモゲネス（S. diastatochromogenes）、ＳｇｒａｎはＳ．グラナチカラー（S. granaticolor）、ＳｇｏｌｄはＳ．ゴールデニエンシス（S. goldeniensis）、ＳｇｒｉｓはＳ．グリセウス（S. griseus）、ＳｌｉｍｏはＳ．リモサス（S. limosus）、ＳｖｅｎｅはＳ．ベネズエラ（S. venezuelae）を示す。アミノ酸番号は、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）ＤａｓＲ（ＳＣＯ５２３１）のアミノ酸配列に対応している。配列上部の記号ＨＴＨは、ヘリックス−ターン−ヘリックスＤＮＡ結合のサインを示す。
【図２１Ａ】ＤａｓＲがＡｃｔおよびＲｅｄ経路特異的活性化因子の発現を抑制することを示す図である。電気泳動移動度シフトアッセイにより、ＤａｓＲがａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４およびｒｅｄＺの予測上流のｄｒｅ部位と相互作用することが示されている。ｃｒｒ−ｐｔｓＩオペロン（ＰＴＳの酵素ＥＩＩＡおよび酵素ＥＩをコードしている）、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４、およびｒｅｄＺの上流に発見されたｄｒｅ部位を包括するＤＮＡプローブを、Ｈｉｓ標識した精製ＤａｓＲの存在下（＋）または非存在下（−）でインキュベートした。実験的に確認されたｃｒｒ−ｐｙｓＩオペロン（Rigaliら、2004）の上流のｄｒｅ部位、およびＳ．コエリカラー（S. coelicolor）のｃｒｐの予測シス作用因子（Derouauxら、2004）をそれぞれ陽性対照、陰性対照として用いた。
【図２１Ｂ】ＤａｓＲがＡｃｔおよびＲｅｄ経路特異的活性化因子の発現を抑制することを示す図である。ＡｃｔおよびＲｅｄ経路特異的活性化因子の、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによる転写解析の結果を示す図である。ＤａｓＲはａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４およびｒｅｄＺの転写発現を直接的に抑制している。試料は、ＭＭマンニトール寒天プレート上で培養したＳ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５およびｄａｓＲ変異株から、３０時間後（栄養増殖）、４２時間後（気中増殖）の開始）、７２時間後（気中増殖および胞子）に採取した。ｖは栄養菌糸、ａは気菌糸、ｓは胞子を示す。
【図２２】Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）におけるアクチノロージンおよびウンデシルプロジギオシン産生に関するＮ−アセチルグルコサミン依存性情報伝達カスケードを示す図である。Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は細胞質に入り、続いて、細胞内の一般ＰＴＳタンパク質ＥＩ、ＨＰｒ、およびＥＩＩＡ、ならびにＧｌｃＮＡｃ特異的なＥＩＩＢおよびＥＩＩＣ組成物で構成されるＧｌｃＮＡｃ特異的なホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系を経由してリン酸化される。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ）はさらにＮａｇＡ、ＧｌｃＮ−６Ｐ脱アセチル化酵素によって脱アセチル化される。結果生じたグルコサミン−６−リン酸（ＧｌｃＮ−６Ｐ）は、ＤａｓＲのＤＮＡ結合能を阻害し、その結果、それぞれアクチノロージンおよびウンデシルプロジギオシン生合成群の経路特異的な転写活性化因子をコードしているａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４およびｒｅｄＺの転写抑制を低下させることができるＤａｓＲのアロステリックエフェクターとして知られている。推定される抗生物質の生合成情報伝達カスケードの支持のもと、ＧｌｃＮＡｃはＳ．コエリカラー（S. coelicolor）のそれぞれΔｒｅｄＤ（Ｍ５１０）およびΔａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４（Ｍ５１１）変異株におけるＡｃｔおよびＲｅｄ産生を引き起こす。
【図２３】放線菌類の間でのＧｌｃＮＡｃ依存性の抗生物質誘導経路の保存を示す図である。放線菌を０．５％マンニトール単独含有（左側のパネル）、または１％ＧｌｃＮＡｃを加えた（右側のパネル）ＭＭ寒天プレート上で培養し、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）を含有するオーバーレイを当てて、抗生物質産生によって引き起こされる増殖阻害を可視できるようにした。試験した放線菌は、ストレプトミセス リビダンス（Streptomyces lividans）１３２６（１３２６）、ストレプトミセス ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）（ｈｙｇｒｏ）、ストレプトミセス コリヌス（Streptomyces collinus）（ｃｏｌｌｉ）、ストレプトミセス ロセオスポルス（Streptomyces roseosporus）（ｒｏｓｅｏ）、ストレプトミセス シンナモネシス（Streptomyces cinnamonensis）（ｃｉｎｎａ）、ストレプトミセス ベネズエラ（Streptomyces venezuelae）（ｖｅｎｅｚ）、ストレプトミセス クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）（ｃｌａｖｕ）、ストレプトミセス リモサス（Streptomyces rimosus）（ｒｉｍｏｓ）、ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）（ｇｒｉｓｅ）、ストレプトミセス アクリミシニ（Streptomyces acrimycini）（ａｃｒｉｍ）、ストレプトミセス リモサス（Streptomyces limosus）（ｌｉｍｏｓ）、およびストレプトミセス アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）（ａｖｅｒｍ）である。正確な学名は、物質と方法の項を参照されたい。
【図２４】ＤａｓＲがＩ型ポリケチド「潜在性」群の発現を抑制することを示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＳ．コエリカラー（S. coelicolor）（ＳＣＯ６２７３〜ＳＣＯ６２８８）の潜在性Ｉ型ポリケチド群の転写分析の結果を示す図である。ｄａｓＲの不活性化により、栄養増殖中に、潜在性経路特異的な活性化遺伝子、ｋａｓＯ（ＳＣＯ６２８０）の転写「覚醒」が起こり、続いて推定Ｉ型ポリケチドシンターゼをコードしているＳＣＯ６２７３の転写が促進される。試料は、ＭＭマンニトール寒天プレート上で培養したＳ．コエリカラー（S. coelicolor） Ｍ１４５およびｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９から、３０時間後（栄養増殖）、４２時間後（気中増殖の開始）、７２時間後（気中増殖および胞子）に採取した。ｖは栄養菌糸、ａは気菌糸、ｓは胞子を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学、分子生物学および微生物学の領域に関する。より詳しくは、本発明は、糸状体微生物または低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌による、代謝工学および産物形成を改善する方法および手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状体微生物は、抗生物質、抗がん剤、抗真菌剤および酵素のような産物の工業生産者として広く使用されている（Bennett、1998；Demain、1991；Hopwoodら、1995）。これらの微生物には、真核糸状体真菌（子嚢菌）および原核放線菌（たとえばアミコラトプシス（Amycolatopsis）、ノカルディア（Nocardia）、サーモビフィド（Thermobifido）およびストレプトミセス（Streptomyces））が含まれる。抗生物質および酵素の市場資本は、合計で、それぞれ年間２８０および２０億ドルである。土壌居住放線菌ストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor)は、細菌発達および構成物産出の研究に対する重要なモデル系を構築している(Locci、1986）。ストレプトミセスコロニーは、気中胞子形成菌糸とは異なる栄養菌糸の網を形成する（Chater、1998）。これらの形態形成は、栄養制限に際して変化する、複雑な、空間的広がりのある、そして一時的な遺伝的にプログラムされたスキームによって制御される（Schauerら、1998；Willeyら、1991）。放線菌は、ポリサッカライドセルロース、キシランおよびキチンからなる、真核植物、真菌および昆虫の有機化合物のリサイクリングおよび栄養化における主要な主役であり、地球上のもっとも豊富な炭素供給源である（Hodgson、2000）。したがって、これらはまた、再生可能な供給源に対する我々の探求において、重要な役割を果たしている。興味深いことに、放線菌のゲノム配列の研究によって、驚くべき多数の潜在性抗生物質生合成クラスターと、工業的に可能性のある新規酵素が明らかになり、したがって、薬物および酵素を含む、天然産物の直接的発見に対する新たな挑戦が提示される（Hopwood、2003）。たとえば、選択的増殖条件が、エンジイン型抗がん抗生物質のために、正常休眠生合成クラスターを誘導可能である、新規スクリーニング技術が確立された（Zazopoulosら、2003）。
【０００３】
細菌における広範囲な規制には、異なる細胞工程の遺伝子、オペロンおよびレギュロンの発現を調整する、多様活性転写因子の存在が含まれる（Martinez-AntonioおよびCollado-Vides、2003）。大腸菌（Escherichia coli）は、その遺伝子のおよそ半分を共に調節する７つの包括的な転写因子を持つ。もっとも目立つものは、約２００の標的遺伝子を直接制御している、環状ＡＭＰレセプタータンパク質Ｃｒｐである（BrucknerおよびTitgemeyer、2002；Gossetら、2004；Zhangら、2005）。Ｃｒｐは、遺伝的調節因子のパラダイムを表しており、到達したテキストブック状態を持つその特性および大腸菌内の他の炭素供給源のＣｒｐ−ｃＡＭＰ仲介調節がおそらく、遺伝子発現を調整する機構を例示するためのもっとも古典的な例である。そのような多様調節の覆いを取り除くことが、本発明者らの細菌の生活様式の理解のために重要であり、炭素触媒カタボライトリプレッション（ＣＣＲ）におけるＣｒｐの役割の説明以来、炭素利用に専念した研究者らは、他の微生物における状況を議論するために、このモデルをいつも参照する。したがって、代謝物制御タンパク質ＣｃｐＡは同様に、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌における包括的な調節因子であり、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）中、３００以上の遺伝子を制御する（Morenoら、2001；TitgemeyerおよびHillen、2002）。ＣｃｐＡは、ＣＣＲ、解糖、窒素同化、およびリン酸代謝に関与する遺伝子を制御する（BrucknerおよびTitgemeyer、2002)。
【０００４】
今まで、放線菌における炭素利用の研究は、広範囲の制御因子を発見できず、個々の糖鎖レギュロンを制御している特定の調節因子の例が得られただけである（HindleおよびSmith、1994；Parcheら、1999；van Wezelら、1997）。興味深いことに、放線菌は、エネルギーを多くの糖鎖特異的ＡＢＣトランスポーターに提供するためのマスタースイッチとしてＭｓｉＫを用いて、ＣＣＲから基質誘導へのシフトを全体的に調節するために、制御因子／センサー要素の他のカテゴリーに特権を与えた（Hurtubiseら、1995；Schlosserら、1997；Schlosserら、1999；Schlosserら、2000）。しかしながら、炭化水素代謝に関連した小数の遺伝子の上流を同定した保存調節モチーフが、炭素制御に専念したリサーチコミュニティーに興味を引きつけ、おそらく広範囲の制御因子が存在するであろうという考えを維持した（Nothaftら、2003；Rigaliら、2004；Studholmeら、2004）。へリックス−ターン−へリックスＧｎｔＲファミリーの本発明者らのコンピュータ解析（Rigaliら、2002）によって最近、ＤａｓＲ（ＳＣＯ５２３１）が、特にＮ−アセチルグルコサミンの取り込みに対するホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳNag）を調節すると予測する、新規シス／トランス調節コードを同定された（Rigaliら、2004）。
【発明の開示】
【０００５】
本発明者らは、タンパク質ＤａｓＲが、微生物における多重工程に関与する調節マスタースイッチであることを開示する。
【０００６】
第一の実施形態において、本発明は、ＤａｓＲ結合部位コンセンサス配列を、候補配列と比較すること、および少なくとも５．０のマトリックススコアを持つ候補配列を選択することを含む、発現がＤａｓＲ−様タンパク質によって制御される遺伝子を同定するための方法を提供する。
【０００７】
ＤａｓＲタンパク質は、放線菌において高い相同性を示している。これらのＤａｓＲタンパク質のすべてが、ＤＮＡ結合モチーフ、好ましくは、へリックス−ターン−へリックスＤＮＡ結合モチーフを含む。図１４は、放線菌のＤａｓＲ相同物のアライメントを示している。ＤＮＡ結合モチーフは、大体タンパク質の最初の８０アミノ酸中に存在する（もっとも重要な形跡が、図１４にて、へリックス−ターン−へリックスドメインに関して、ＨＴＨによって示唆されている）。図２０は、１０の異なる放線菌からの、ＤａｓＲ結合モチーフのアライメントを表している。タンパク質の第二の部分（およそ８０〜２５５）が、他のＧｎｔＲ−型転写制御因子のエフェクター結合ドメイン（ＥＢＤ）に対して相同性を持ち、したがってグルコサミン−６−Ｐの結合が発生することが予想される場所である。
【０００８】
ＤａｓＲ−様タンパク質は典型的に、好ましくは、放線菌から得た／由来したＤａｓＲタンパク質またはその機能的等価物および／または機能的断片であり、ＤａｓＲタンパク質は、以上で概略した特徴を含み、すなわちＤＮＡ結合ドメイン、ＥＢＤを含み、およびたとえば、（コンセンサス）ＤａｓＲ結合部位へ結合可能である。ＤａｓＲタンパク質の例は、図１４（ＡまたはＢまたはＣ）にて示されているＤａｓＲタンパク質である。当業者には、たとえばストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）からのＤａｓＲタンパク質を、たとえば、点変異または（小）欠損を導入することによって、以上で概略した特徴を明らかに変更することなしに改変可能であることが明らかである。したがって、ＤａｓＲ−様タンパク質は、おそらく、前記ＤａｓＲ−様タンパク質の（コンセンサス）ＤａｓＲ結合部位（またはＤａｓＲ標的部位：語句は本明細書で互換的に使用される）への結合をあきらかに干渉しない変異を含む、好ましくは、たとえば、ストレプトミセス クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）、ストレプトミセス アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトミセス スカビエス（Streptomyces scabies）、ストレプトミセス種１３９またはサーモビフィド フスカ（Thermobifido fusca）から得た、ＤａｓＲタンパク質である。ストレプトコッカス クラブリゲルスＤａｓＲ配列が、本発明者らによって決定され、核酸配列ならびにアミノ酸配列を図１９に描写している。したがって、また他の実施形態において、本発明は、図１９Ｂにて描写されたようなタンパク質をコードしている単離または組換え核酸を提供する。好ましい実施形態において、前記核酸は、図１９Ａにて描写されたような核酸である。
【０００９】
種々の他の放線菌中のＤａｓＲのＤＮＡ結合モチーフ間の違いの程度を確立するために、本発明者らは、いくつかの他の放線菌からのｄａｓＲの相当する部分のＤＮＡ配列を決定し、アミノ酸配列（図２０）を導き出した。このことは、放線菌ｄａｓＲ遺伝子のＤＮＡ結合モチーフおよびそれらの遺伝子産物が非常に高く保存されており、すべての放線菌中で、同一の結合部位に結合することを示している。したがって、他の好ましい実施形態において、ＤａｓＲのＤＮＡ結合モチーフは、図２０にて提供されるコンセンサス配列のものと一致する。
【００１０】
図１４ＡまたはＢより、ＤａｓＲ−様タンパク質が、放線菌から由来するだけでなく、ストレプトコッカス（Streptococcus）のような低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌からも由来可能であることが明らかである。さらに、図１４Ｃより、本発明にしたがった方法または手段を、ストレプトミセス コエリカラーにて同定されたものであるＤａｓＲ相同物で実施／提供可能でもあることが明らかである。したがって、語句ＤａｓＲ−様タンパク質は、放線菌からのＤａｓＲタンパク質のみでなく、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌の、または任意の言及した有機体にて同定されたＤａｓＲ相同物も含む。
【００１１】
放線菌中のＤａｓＲ結合部位（ｄｒｅ）に対するコンセンサス配列は、ＮＮ（Ｔ／Ａ）ＧＧ（Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）Ｔ（Ａ／Ｇ）Ｎ（Ａ／Ｔ）Ｃ（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｃ）Ｎであり、（すべての公知のＤａｓＲ結合部位の８０％以上で発生する）もっとも高く保存されたヌクレオチドに下線を引いている。好ましい実施形態において、コンセンサス配列は、（Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ａ）ＧＧＴＣＴＡＮＡＣＣＡＮである。より好ましい実施形態において、放線菌中のＤａｓＲ結合部位は、ＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡ（Ｇ／Ｃ）である。Ｎは任意のヌクレオチド（Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ）であり、たとえば（Ｔ／Ａ）のような、丸括弧間の２つのヌクレオチドは、言及されたヌクレオチドの１つが存在することを意味する。特定の例において、ＴまたはＡである。
【００１２】
放線菌中のＤａｓＲ結合部位に対するコンセンサス配列をまた、他の細菌、好ましくはグラム陽性細菌における部位を探すために使用する。バチルス（Bacillis）種に対する同定されたコンセンサス配列は、（Ａ／Ｇ）Ｎ（Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）Ｔ（Ｃ／Ａ）ＴＡ（Ｇ／Ｔ）Ａ（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ）であり、ラクトコッカス（Lactococcus）種に対しては、Ａ（Ｔ／Ａ）（Ｔ／Ｃ）（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ａ）ＴＡＴＡＴＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｔ）Ｔであり、リステリア（Literia）種に対しては、Ａ（Ｔ／Ｃ）（Ｔ／Ｃ）（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）Ｔ（Ａ／Ｃ）ＴＡ（Ｔ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／Ａ）（Ａ／Ｇ）（Ａ／Ｇ）Ｔであり、ストレプトコッカス（Streptococcus）種に対しては、（Ａ／Ｔ）（Ｔ／Ａ）Ｔ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｃ）ＴＡ（Ｔ／Ｇ）Ｎ（Ｃ／Ａ）（Ｃ／Ｔ）Ａ（Ａ／Ｔ）（Ｔ／Ａ）である。再び、Ｎは任意のヌクレオチド（Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ）でありえ、たとえば（Ａ／Ｇ）のような、丸括弧間の２つのヌクレオチドは、言及されたヌクレオチドの１つが存在することを意味する。特定の例において、ＡまたはＧである。したがって本発明は、ＤａｓＲ結合部位コンセンサス配列を候補配列と比較すること、および少なくとも５．０のマトリックススコアを持つ候補配列を選別することを含む、発現がＤａｓＲ−様タンパク質によって制御される遺伝子を同定するための方法を提供し、前記遺伝子は、好ましくは、相当する同定されたＤａｓＲ結合部位コンセンサス配列との組合せで、放線菌、バチルス、ラクトコッカス、リステリアまたはストレプトコッカス中に存在する。
【００１３】
好ましくは、発現がＤａｓＲ−様タンパク質によって制御される候補遺伝子を、位置加重マトリックスを用いて決定する。マトリックススコアを、Rigaliら、2004によって、また本発明の物質および方法にて記述された方法にしたがって決定する。簡単に記すと、公知のＤａｓＲ結合部位の組を、標的有機体、たとえばストレプトミセス コエリカラーにおける第一検索を実施するために使用する。これによって結果として新規部位となり、実験的に検証される。得られた公知の標的を使用して、位置加重マトリックスを構築し、これを、標的有機体の完全なレギュロンを予想するために使用する。
【００１４】
好ましい実施形態において、候補配列は、少なくとも７．０のマトリックススコアを持つ。より好ましくは、スコアは９．０と等しいか、より高い。試験した９以上のスコアを持つすべての標的が、ＤａｓＲによって結合されるとわかった。
【００１５】
またより好ましい実施形態において、本発明にしたがった方法にはさらに、前記選択された候補配列の発現が、実際にＤａｓＲによって制御されるかどうかを試験することが含まれる。これはたとえば、ＤａｓＲ−様タンパク質の、前記選択された、同定された候補配列への結合を試験することによって達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
ＤａｓＲ結合部位は典型的に、目的遺伝子の上流に局在する。表２は、目的遺伝子の転写開始部位に対する、ＤａｓＲ結合部位の位置を示している。より詳しくは、非限定的解釈にて、ＤａｓＲ結合部位が、目的遺伝子のプロモーターの上流に局在する場合、前記目的遺伝子の転写における活性化の役割をもつ可能性がある。反対に、ＤａｓＲ結合部位がプロモーターと重なる場合、またはその下流に局在する場合、前記目的遺伝子の転写のリプレッサーとして機能する可能性がある。しかしながら、いくつかの証明されたＤａｓＲ結合部位が、目的遺伝子の内部で見つかった。この１つの例が、Ｓ．オリバセオビリジス（S.olivaceoviridis）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｑ８ＧＢＴ８）の標的遺伝子ｍａｌＸ２である。この場合、ｄｒｅ部位（ＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣ）は、Ｓ．コエリカラーｍａｌＸ２（ＡＣＴＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＡＧＴ；表２中＃３、マトリックススコア１６．２）のものとほとんど同一であるが、転写開始部位のｎｔ位置＋３６〜＋５１間で局在する。ＤａｓＲのこの部位への結合は、二本鎖オリゴヌクレオチド上のＥＭＳＡによって証明された。したがって、ＤａｓＲ結合部位が、目的遺伝子の上流および内部両方で機能的でありうることが明らかである。
【００１７】
上記方法にて、本発明者らは、主要および二次代謝のためのレギュロンを含む、２００以上の遺伝子が、ＤａｓＲによって直接制御されることを、（新規および限定的ＤａｓＲ結合部位位置加重マトリックスを用いることによって）確立した。これらの遺伝子は、表２にて記述した約１３０転写ユニットから由来する。同定された遺伝子は、（表１Ｂにて要約した）糖またはアミノ糖代謝に関連した遺伝子、またはポリサッカライド分解に関与する遺伝子のような、異なる遺伝子のカテゴリーまたは遺伝子に属する。ＤａｓＲ標的のリストにはまた、転写因子も含まれ、したがって、ＤａｓＲ標的がまた、間接転写制御にも関与すると結論づけられる。ＤａｓＲによって制御／調節される遺伝子の多様性は大きく、したがって、本発明者らは、ＤａｓＲを、微生物における遺伝子発現の調節におけるマスタースイッチであると考える。
【００１８】
今や本発明者らが、ＤａｓＲおよびＤａｓＲ結合部位が、微生物における遺伝子発現の制御において、そのような重要かつ普遍的役割を果たすことを開示しているから、本発明は、目的遺伝子の発現を制御するための方法、代謝を制御するための方法、望まない発現を減少させるための方法などのような、多数の有用な適用を提供する。さらに、本発明はまた、前記方法を確立するために利用可能な方法を提供し、たとえば、特定の遺伝子と動作可能に結合するＤａｓＲ結合部位を、前記遺伝子によってコードされた（必要または不要タンパク質である）タンパク質の発現の増加または減少を得るために改変し得る。方法および手段の他の例が以下の記述で提供されるであろう。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明は、微生物に、前記目的遺伝子と動作可能に結合したＤａｓ−結合部位、またはその産物が前記目的遺伝子の発現に関与する遺伝子と動作可能に結合したＤａｓＲ−結合部位への、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の、目的遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。
【００２０】
目的遺伝子の発現を調節するための前記方法は、目的遺伝子の発現を増加させるための方法、または目的遺伝子の発現を減少させるための方法でありうる。これは、とりわけ、前記目的遺伝子の発現が望ましいか、または望ましくないか、に依存する。目的遺伝子の発現が望まれる場合、発現は好ましく増加し、目的遺伝子の発現が望まれない（すなわち望まない）場合、発現が好ましく減少される。ＤａｓＲ−様タンパク質の、ＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な前記化合物の活性が結果として、前記タンパク質と前記部位間の結合の増加、または減少となるに違いなく、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ結合部位への結合に際して、前記目的遺伝子の発現が、抑制されるか、または活性化されるかに依存する。表２（ならびに表４）より、遺伝子の発現が、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合に際して抑制されること（たとえば、表２の＃１、３、５または７）、およびＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合に際して、他の遺伝子の発現が活性化されること（たとえば表２の＃１３）が明らかである。正しい活性経路を決定するためのすべての必要な情報が、本明細書で提示されている。さらに、特定の遺伝子またはオペロンの発現が活性化される、または抑制されるかどうかにおける情報が、マイクロアレイアプローチを用いることによって展開される。そのような実験の１つの例が、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の遺伝子の発現の、ＤａｓＲ−様タンパク質、（ヌル）変異体を含む微生物中の遺伝子の発現に対する比較である。他の例は、誘導体分子（たとえばグルコサミン−６−Ｐ）の存在する状態、または存在しない状態で増殖したＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の遺伝子の発現の比較である。また他の例は、ＣｈＩＰ−オン−チップアプローチと呼ばれるものを利用することであり、ＤａｓＲ−様タンパク質結合ＤＮＡ断片がマイクロアレイにハイブリッド形成される。これは、ＤａｓＲによって直接結合した標的を同定する。
【００２１】
後に、より詳細に議論するように、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物は、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物、または前記タンパク質をコードしている核酸から前記ＤａｓＲ−様タンパク質を発現可能な有機体である。さらに、前記微生物は、ＤａｓＲ−様タンパク質を発現可能な性質によっての有機体でありえ、またはＤａｓＲ−様タンパク質を産出するように遺伝的に改変された微生物でありうる。さらに、（内因性）ＤａｓＲ−様タンパク質をすでに発現可能な微生物に、よりＤａｓＲ−タンパク質の産出を可能にするさらなる核酸を、提供することも可能である。そのようなＤａｓＲ−様タンパク質をコードしているさらなる核酸は、内因性ＤａｓＲをコードしてよく、または異種ＤａｓＲ−様タンパク質をコードし得る。
【００２２】
すでに以上で概説したように、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な化合物は結果として、ＤａｓＲ−様タンパク質の前記結合部位への結合の増加、または減少となり、すなわち干渉が、前記タンパク質と前記結合部位間の結合を増加させる、または結合を減少させると読むことが理解されなければならない。
【００２３】
またすでに以上で概説したように、ＤａｓＲ−調節遺伝子は非常に多様であり、たとえば代謝工程に関与する遺伝子、ならびに転写因子である遺伝子の範囲であり得る。さらに、有機体中の多数の工程が、（酵素）反応のカスケードと呼ばれるものを含む。したがって、ＤａｓＲ−結合部位は、特定の目的遺伝子と動作可能に連結してよく（すなわち直接末端産物）、またはＤａｓＲ−結合部位は、その産物が前記目的遺伝子の発現に関与する遺伝子に動作可能に連結し得る（たとえば、カスケード中の中間体、または目的遺伝子の遺伝子発現に関与する転写因子）。したがって、本発明にしたがった方法は、目的遺伝子の発現を直接調節可能であり、または本発明にしたがった方法は、目的遺伝子の発現を間接的に調節可能である。
【００２４】
直接調節には、目的遺伝子が、単一転写ユニットまたは座であるか、または目的遺伝子がオペロンの一部分である状況が含まれる。
【００２５】
間接調節にはまた、ＤａｓＲ−様タンパク質が、調節因子（タンパク質または核酸）の発現を制御し、それによって調節因子が他の遺伝子の発現を調節可能である状況が含まれる。前記調節因子は、標的遺伝子または標的オペロンまたは標的レギュロンの発現を調節することの元であり得る。本発明のこの部分は、表２がまた１６の転写因子（＃２７、３１、４６、５１、５６、６２、６７、７１、７７、８１、８４、１０５、１１９、１２９、１３０および１３１）を含むという発見によって支持され、大規模なレベルのＤａｓＲによる間接転写調節を支持している。
【００２６】
ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な化合物を微生物に提供し得る多数の方法が存在する。これはまた、（本明細書以下でより詳細に議論される）化合物の型に依存する。ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能である化合物が、たとえば前記微生物によって（たとえばエンドサイトーシスまたはファゴサイトーシスを介して、または膜を通しての活発な輸送を介して）微生物によって取り込まれる、低分子量および／または化学化合物である場合、前記化合物は、前記微生物の環境（たとえば増殖培地）に単純に加えられる。ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能である化合物が核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である場合、前記微生物に好ましくは、任意のよく知られている技術で、前記核酸を（たとえば、トランスフェクション、形質導入または形質転換を介して）提供する。
【００２７】
すでに言及したように、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な化合物は、性質上非常に多様であり、たとえば、低（化学）分子、金属またはイオン、γ−ブチロラクトンのような、またはペプチド由来のシグナル伝達化合物、非リボソームペプチド、タンパク質または核酸でありうる。好ましい実施形態の１つにおいて、前記化合物は、遺伝的化合物、すなわち核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。好適な核酸の１つの例は、ｄａｓＲ核酸、すなわち、ＤａｓＲ−様タンパク質（またはその機能的断片または誘導体）をコードしている核酸である。より好ましくは、そのようなｄａｓＲ核酸は、強力な、または誘導可能なプロモーターの制御下である。ＤａｓＲ−結合部位と動作可能に連結した目的遺伝子の発現が、通常ＤａｓＲ−様タンパク質の結合に際して活性化される場合、より（たとえば過剰発現ＤａｓＲ）の存在が、前記目的遺伝子の発現をさらに誘導／増加／活性化可能である。ＤａｓＲ−結合部位と動作可能に連結した目的遺伝子の発現が通常、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合に際して抑制される場合、および前記目的遺伝子の発現が結果として不要な産物となる場合、より（たとえば過剰発現ＤａｓＲ）の存在が、前記目的遺伝子の発現をさらに低減／減少／抑制可能であり、不要な産物の量は、少なくとも部分的に（さらに）減少する。好適な核酸の第二の例は、変異タンパク質ＤａｓＲ−様タンパク質、たとえば、ＤａｓＲ−結合部位に対する結合能力が減少したＤａｓＲ−様タンパク質、またはＤａｓＲ−結合部位に対する結合能力が改善されたＤａｓＲ−様タンパク質、またはもはや誘導因子と呼ばれるものによって活性化されないＤａｓＲ−様タンパク質（たとえば、エフェクター結合ドメイン中変異したか、または欠損しているＤａｓＲ−様タンパク質）をコードしている核酸である。図１４にて提供された情報に基づいて、当業者は簡単に、特定の結果を得るためにどのＤａｓＲタンパク質の部分を改変可能であるかを決定可能である。たとえば、ＤＮＡ結合部位中の変異（欠損、挿入、（点）変異）が、そのような改変されたＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合配列への結合能力において効果を持ちうる。提供された変異の効果は、結合アッセイによって簡単に試験される。好適な核酸の第三の例は、（ＤａｓＲ−タンパク質結合能力が減少したか、増加したかのいずれかである）改変されたＤａｓＲ−結合部位を含む核酸である。好ましくは、そのような核酸は、通常目的遺伝子の前に存在するＤａｓＲ−結合部位が、改変された結合部位と交換される方法で、特定の微生物のゲノム内に配置される。さらに、その発現がＤａｓＲによって調節されない目的遺伝子を、遺伝子の上流または内部に、（改変した）ＤａｓＲ−結合部位を含むように改変可能である。場合によっては、関連微生物にさらに、（タンパク質として、または前記ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸として）ＤａｓＲ−様タンパク質が提供され、前記遺伝子の発現がここでＤａｓＲによって制御される。（改変）ＤａｓＲ−結合部位の利用には典型的に、相同組換え工程が含まれる。相同組換えを得るための技術が、当業者に公知であり、したがって、さらなる詳細は前記主題においては提供しない。好適な核酸の第四の例は、改変ｄａｓＲプロモーターを提示している核酸である。ＤａｓＲの内因性の発現は自動制御される。ＤａｓＲタンパク質が、特定の量で存在する場合、ＤａｓＲの量が特定の閾値レベル以下であるまで、その固有の発現が自己抑制される。ＤａｓＲ−プロモーターを、自動制御されないプロモーターへ改変することによって、利用可能なＤａｓＲタンパク質の量が増加し、したがって、特に前記遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合に際して増加する目的遺伝子の発現が増加する。そのような核酸の利用に、好ましくは、本来提示されたｄａｓＲプロモーターが、改変ｄａｓＲプロモーターに対して（少なくとも部分的に）交換される、組換え工程が含まれることが、当業者に明らかである。好適な核酸の第五の例は、第三の例に関連し、さらなる、または欠損ＤａｓＲ結合部位に対してアレンジされる核酸が含まれる。目的遺伝子と動作可能に連結したさらなるＤａｓＲ結合部位の導入は、とりわけ、ＤａｓＲ結合に際して活性化される遺伝子発現の場合に有用であり、ＤａｓＲ結合部位の欠損は、たとえば、ＤａｓＲ結合に際して抑制されるが、その発現が望まれる遺伝子発現の場合に有用である。
【００２８】
ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な非常に有用な化合物のまた他の例は、誘導因子である。そのような誘導因子は、目的遺伝子の発現が、ＤａｓＲ−様タンパク質の、目的遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位への結合に際して抑制される場合に、非常に有用である。好ましくは、そのような誘導因子は、糖の誘導体である。実験部分内で開示するように、グルコサミン−６−リン酸（語句グルコサミン−６−Ｐは本明細書で互換的に使用される）が、ＤａｓＲ−抑制遺伝子発現の非常に強力な誘導因子である。好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン（またはその誘導体または多重体）を微生物の環境に加え、前記Ｎ−アセチルグルコサミンが、前記微生物内への伝達に際して、グルコサミン−６−リン酸へ変換される。そのような誘導因子の利用は、それが微生物の遺伝的操作をまったく含まず、単純に、外部からの操作（すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体の添加）からなるので、非常に利点がある。
【００２９】
本発明者らは、Ｎ−アセチルグルコサミンに対する２つの潜在的トランスポーター、すなわち近接遺伝子ｎａｇＥ１およびｎａｇＥ２を同定した。実験部分で記述したように、これらの遺伝子の変異体が構築され、ｎａｇＥ２が、Ｎ−アセチルグルコサミンに対するトランスポーターをコードしている遺伝子であることが明らかである。この発見によって、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能なより有用な化合物が提供される。たとえば、本発明の任意の方法にて使用されるようなＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物は、（機能的な）ＮａｇＥ２を産出不能であり、前記微生物は、外部に提供された、および／または形成／産出されたＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）へ応答可能ではなく、ＤａｓＲが活性のままである（ＤａｓＲ抑制遺伝子の場合、ＤａｓＲは結合したままである）。他の例において、ＧｌｃＮＡｃトランスポーターの量が増加し、これはたとえば、微生物に、前記ＧｌｃＮＡｃトランスポーターをコードしている核酸（好ましくはｎａｇＥ２）を提供することによって得られる。この場合、さらにＧｌｃＮＡｃが細胞内に輸送され、結果として、さらにグルコサミン−６−リン酸が産出される。結果として、ＤａｓＲ−抑制発現が減少し、発現が通常抑制される遺伝子の発現が増加する。また他の例において、ＧｌｃＮＡｃ−輸送をコードしている遺伝子を、ＧｌｃＮＡｃの変異体のみを細胞内に輸送するように変異させる。
【００３０】
ＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物のまた他の例は、ＤａｓＲ、またはＤａｓＲ結合部位いずれかへ結合する抗体（またはその断片、たとえば結合部分）の利用であり、したがって、少なくとも部分的に、ＤａｓＲのＤａｓＲ結合部位への結合を阻害する。
【００３１】
ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な任意の上記化合物を場合によって混合し得ることが、当業者に対して明らかである。
【００３２】
すでに記述したように、その発現が、ＤａｓＲによって調節された遺伝子の種類は非常に多様である。ＤａｓＲによって調節される異なるカテゴリーの遺伝子の要約に関して、また図１Ｂを参照のこと。そのような遺伝子の１つの群は、代謝工程に関与する遺伝子である。したがって、また他の実施形態において、本発明は、その産物が、代謝経路の一部である遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を調節することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の代謝を制御するための方法を提供する。好ましい実施形態において、その産物が代謝経路の一部である遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を、前記微生物に、前記ＤａｓＲ−結合部位への前記ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を提供することによって調節する。
【００３３】
その産物が代謝経路の一部分である遺伝子の動作可能に連結した、ＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物が、（すでに以上で議論したような）特徴において非常に多様であり、たとえば低（化学）分子、金属またはイオン、γ−ブチロラクトンのような、またはペプチド由来のシグナル伝達分子、非リボソームペプチド、またはタンパク質または核酸でありうる。１つの好ましい実施形態において、前記化合物は、遺伝的化合物、すなわち核酸である。好適な核酸の例はすでに以上で記述している。そのような代謝遺伝子の発現が、前記遺伝子と動作可能に連結した、ＤａｓＲ結合部位へのＤａｓＲタンパク質の結合に際して減少する場合、（以上で議論したように）グルコサミン−６−リン酸のような誘導因子を利用することも可能である。
【００３４】
その産物が、代謝経路の一部である（または代謝に関与する）前記特定の遺伝子の発現が、前記特定の遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位へのＤａｓＲの結合に際して、抑制されるか、または活性化されるかどうかに依存して、当業者が、前記特定の遺伝子の前で、ＤａｓＲタンパク質とＤａｓＲ結合部位間の結合が、増加するまたは減少する、さらにそれ以上でなければならないか決定することが可能であり、本明細書は、どのようにして結合を増加させる、または減少させるかの多数の例を提供している。
【００３５】
その産物が、代謝経路の一部である遺伝子の例を、表２にて非限定的に言及している。１つの例が、グルタミン酸／グルタミン代謝に関与する遺伝子に関する。表４にて要約している。これらの遺伝子は、Ｇｌｕ／Ｇｌｎの合成または分解に関与する酵素をコードしているが、またリボソームによって合成されたポリペプチドへのＧｌｕまたはＧｌｎアミノ酸の取り込みを特定する、コドンの転写に必要であるｔＲＮＡ分子もコードしている。
【００３６】
第二の例には、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび関連分子の代謝が含まれる。Ｎ−アセチルグルコサミンに対する経路は、図５にて示したような、グルタミン酸の経路に関連する。例には、ポリマーキチンをＮ−アセチルグルコサミンへ変換するキチン分解遺伝子（たとえば、表２中＃７、１１、１２、１４、１９、２３、２５、２６）、Ｎ−アセチルグルコサミンを細胞内へ輸送するＰＴＳ（たとえば表２中＃１、２、３、５）、および代謝遺伝子ｎａｇＫ、ｎａｇＡ（＃１０オペロン）、およびｎａｇＢ（＃１５）が含まれる。
【００３７】
グルタミン酸およびＮ−アセチルグルコサミン代謝に関連する他の核酸は、ＲＮＡリボザイムであり、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）中のｇｌｍＳ遺伝子を処理し（Winklerら、2004）、したがって、放線菌のような他のグラム陽性細菌中で珍しくはない。ｇｌｍＳ遺伝子は、ＤａｓＲによる制御の標的であり（表２中８６）、その遺伝子産物ＧｌｍＳは、グルコサミン−６−Ｐを形成するために、グルタミンおよびフルクトース−６−Ｐを利用する。ｇｌｍＳ転写物の処理は、ｍＲＮＡの活性化のために必要とされる。おもしろいことに、リボザイムは、ＧｌｍＳ酵素の代謝産物である、グルコサミン−６−Ｐによって活性化される。本発明者らは本明細書で、グルコサミン−６−ＰがまたＤａｓＲの誘導因子分子であることを示した。Winklerらによるさらなるデータが、リボザイムが、代謝状態に応答し、グルコサミン−６−Ｐ濃度の上昇に対する応答で、ｇｌｍＳ遺伝子を抑制することを示した。
【００３８】
第三の例は、解糖に関与する酵素（たとえば、ホスホフルクトキナーゼ、表２中＃７４、また表８中フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、フルクトース−１−リン酸キナーゼおよびホスホエノールピルビン酸シンターゼを参照のこと）およびアセチル−ＣｏＡ形成または処理（たとえばアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、＃１２表２、アセチル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、表２中＃２５、およびアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ＴｈｉＬ、ＤａｓＲによる活性化、図４））のような、エネルギー供給に関する。アセチルＣｏＡは、ＴＣＡ回路の重大な開始化合物である。驚くべきことに、ＤａｓＲがまた、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼのサブユニットをコードしているｎｕｏオペロンの制御を直接介して、エネルギー供給を制御する（表２中＃１０４、２つのＤａｓＲ結合部位）。この酵素は、エレクトロン輸送（酸化還元）連鎖の第一である。
【００３９】
表２に対して言及した多くの例がまた、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌中に存在する標的遺伝子を意味する、表４〜７および９の一部でもある。したがって、代謝改変アプローチをまた、バチルス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ストレプトコッカスおよびリステリアを含む、この重要なクラスの細菌に類似の様式で適用する。
【００４０】
本発明にしたがって影響をうけうる代謝工程または経路は、アミノ酸代謝、ペプチドグリカン分解または合成、脂肪酸生合成、代謝物の輸送、細胞外ポリサッカライドの分解（好ましくはグルコース、フルクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコサミン、マンノースまたはキトビオース、またはこれらの組合せのポリマー）または窒素代謝である。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明は、その産物が、代謝経路の一部である遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を制御することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の代謝を制御するための方法を提供し、そこで、前記遺伝子の発現が結果として、前記微生物中の、解糖へ、またはから、またはクエン酸（ＴＣＡ）回路へ、またはから指向する相当する産物の存在となる。
【００４２】
本発明者らは、サーモビフィド フスカ（Thermobifido fusca）中のそのような代謝制御のとくに驚くべき例を同定し、そこでは、解糖のすべての段階が、ＤａｓＲ−様タンパク質によって制御されている（図１７および表９）。したがって、たとえば、ＤａｓＲの活性が、前記微生物中の解糖およびＴＣＡ回路の制御を可能にすることが、当業者に対して明らかである。
【００４３】
本発明者らによって同定される他のＤａｓＲ−制御遺伝子には、抗生物質または抗生物質クラスター（商業的な面から見て魅力のある）酵素などが含まれる。
【００４４】
したがって、本発明は、また他の実施形態において、前記目的産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または前記目的産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を、前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の目的産物の発現を得るための方法を提供する。
【００４５】
前記目的産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または前記目的産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉することは、結合が少なくとも部分的に阻害されることでありえ、または結合が少なくとも部分的に増加されることでありうる。「少なくとも部分的に（at least in part）」は、化合物を加えない状態と、前記化合物を加えた状態間で、検出可能な差が存在することを意味する。好ましい実施形態において、ＤａｓＲ結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合が、本質的に完全に阻害されるか、または結合が本質的に不可逆性である。
【００４６】
目的産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位とＤａｓＲタンパク質間の結合に影響を与えることが可能な異なる化合物がすでに以上で議論されており、遺伝的化合物（すなわち、核酸、場合によって、相当する微生物のゲノム中に安定に統合された、または前記微生物中エピソーム核酸として存在する）、またはタンパク質またはホルモン−様シグナル伝達低分子、またはたとえば低分子量（化学）化合物が含まれる。他の好ましい実施形態において、前記化合物は、ＤａｓＲ−調節工程の誘導因子である。そのような誘導因子は、ＤａｓＲ−抑制発現の場合にとりわけ有用である。そのような誘導因子の例は、グルコサミン−６−リン酸またはその機能的等価物または機能的断片である。好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミン（またはその誘導体または多重体）を、前記目的産物の産出のために使用する微生物の培地に提供する。
【００４７】
好適な化合物は、前記目的産物に相当する遺伝子の発現が、前記遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位へのＤａｓＲ−タンパク質の結合に際して、活性化されるか、または抑制されるかどうかの事実に依存して選択される。発現が結合に際して活性化される場合、ＤａｓＲタンパク質の、関連する遺伝子と動作可能に連結した結合部位への結合を、発現を増強または改善または得るために、改善することが望ましい。これはたとえば、関連する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位を加えることによって、またはＤａｓＲとのその相互作用を改善するために結合部位（より高いマトリックススコア）に変異導入することによって、または改善された結合能力を持つＤａｓＲを加えることによって、などで達成される。ＤａｓＲの結合に際して発現が抑制される場合、前記結合部位へのＤａｓＲの結合を減少させ、したがって抑制から前記発現を開放すことが望ましい。これはたとえば、関連するＤａｓＲ結合部位の欠損または変異導入によって達成される。
【００４８】
好ましい実施形態において、前記目的産物は二次代謝物である。二次代謝物の例を、表３にて提供しており、クラブラン酸またはブチロラクトン類のような化合物が含まれる。
【００４９】
クラブラン酸は、ペニシリンを不活性化可能なベータ−ラクタマーゼ−型酵素、および他のベータ−ラクタム−型抗生物質の非常に重要な阻害剤である。したがって、クラブラン酸はしばしば、患者がペニシリン耐性細菌に感染していると予想される時に、ペニシリンのようなベータ−ラクタム抗生物質との組合せで、患者に投与される。したがって、本発明の方法をまた、クラブラン酸の発現を増加させるために使用する。
【００５０】
ＤａｓＲはまた、Ｓ．ビルギニアエ（S. virginiae）中のｂａｒＢのような、ホルモン−様γ−ブチロラクトン類の生合成に関与する（表３）。これらのγ−ブチロラクトン類は、放線菌における抗生物質産出および形態形成を制御する重大なシグナル伝達化合物である（Horinouchi、2002；BeppuおよびHorinouchi、1991；HorinouchiおよびBeppu、1993；HorinouchiおよびBeppu、1992）。たとえば、Ａ−因子が、Ｓ．グリセウス（S. griseus）におけるストレプトマイシン産出を制御する。したがって、他の実施形態において、本発明は、シグナル伝達分子の制御を間接的に介して、抗生物質産出を間接的に調節するための方法を提供する。
【００５１】
また他の好ましい実施形態において、前記目的産物は抗生物質、酵素、潜在性遺伝子クラスターからの産物、抗がん剤または農業化合物である。酵素の例は、セルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、マンナーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、または糖イソメラーゼである。抗生物質の例は、（ストレプトミセス トヨカエンシス（Streptomyces toyocaensis）およびアミロカトプシス オリエンタリス（Amylocatopsis orientalis）によって産出される）バンコマイシン、（ストレプトミセス ロセオスポルス（Streptomyces roseosporus）によって産出される）ダプトマイシンおよび（ストレプトミセス トヨカエンシスによって産出される）テイコプラニン−様化合物Ａ４７９３４、（ストレプトミセス ベネズエラ（Streptomyces venezuelae）によって産出される）クロラムフェニコール、（ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus)によって産出される）ストレプトマイシン、（ストレプトミセス スフェロイド（Streptomyces spheroides）によって産出される）ノボビオシンを含むグリコペプチド抗生物質、および抗生物質産出のためのよく研究されたモデルクラスター、すなわちストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）のアクチノルホジンおよびウンデシルプロジギオシンである。後者の２つはそれぞれ、経路特異的活性化因子遺伝子ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４（表２中＃２７）およびｒｅｄＺ（表２中＃１２９）によって制御される。また、アクチノルホジン生合成酵素ＡｃｔＶＡ４は、ＤａｓＲのない状態で強く活性化される（図４）。抗生物質生合成に関連した公知の配列の本発明者らの解析に基づいて、本発明者らは驚くべきことに、すべての公知の抗生物質生合成クラスターの半分が、ＤａｓＲによって調節されており、したがって、ＤａｓＲ制御発現を介した干渉によって、抗生物質産出を改変するための非常に有用な方法が提供される。
【００５２】
さらに、本発明者らはまた、アクチノルホジン生合成クラスターが、（間接的に）ＤａｓＲの制御下であることを開示している。図４Ｂにて開示されたように、ＤａｓＲヌル変異体が、ＳＣＯ５０７４（デヒドラターゼ）として指定される多量の（分泌されたタンパク質の総量のおよそ９５％）タンパク質を分泌する。このデヒドラターゼは、アクチノルホジン生合成クラスターの一部であり、このデヒドラターゼは、分泌された抗生物質を調整する。したがって、本発明はさらに、産出／分泌されたアクチノルホジンの量を制御（好ましくは増加）するための手段および方法を提供する。
【００５３】
糸状体微生物ならびに低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌両方が、本発明にしたがった方法を適用可能な微生物の例である。しかしながら、たとえば、目的産物の発現を得るための方法にてこれらの微生物を用いることは、不要な産物の産出が付随する。これらの不要な産物のいくつかが現在、ＤａｓＲによって調節されることが知られており、したがって、本発明はまた他の実施形態において、前記微生物に、前記不要な産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または不要な産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の不要な産物の産出を少なくとも部分的に減少させるための方法を提供する。
【００５４】
前記不要な産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または前記不要な産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位への、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉することは、結合が少なくとも部分的に阻害されることでありえ、または結合が少なくとも部分的に増加することであり得る。「少なくとも部分的に（at least in part）」は、化合物を加えない状態と、前記化合物を加えた状態間で、検出可能な差が存在することを意味する。好ましい実施形態において、結合が、本質的に完全に阻害されるか、または結合が本質的に不可逆性である。
【００５５】
好ましくは、ＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合は、前記微生物に、前記不要な産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結した、または前記不要な産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結した、増加量のＤａｓＲ−結合部位を提供することによって、少なくとも部分的に増加する。また他の好ましい実施形態において、ＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合は、前記微生物に、本来前記不要な産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結した、または前記不要な産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結した、微生物中の少なくとも１つのＤａｓＲ結合部位を除去することによって、少なくとも部分的に減少する。
【００５６】
本明細書で開示したように、いくつかのプロテアーゼの発現が、ＤａｓＲ−様タンパク質によって調節される。例を表２で提供している。＃６０（メタロペプチダーゼ）または＃１０９（ペプチダーゼ）。本方法を、目的タンパク質様産物を産出するために使用する場合、言及したペプチダーゼの発現が同時に影響を受けうる。
【００５７】
好ましい実施形態において、前記不要な産物は、不要な副産物または不要なシャント産物である。
【００５８】
本発明にしたがった任意の方法を場合によっては組み合わせることが可能であることが、当業者に対して明らかである。たとえば、代謝を制御するための方法を、不要な産物の産出を少なくとも部分的に減少するための方法と組み合わせる。好ましい実施形態において、本発明は、目的産物の発現を得るための方法の、不要な産物の産出を少なくとも部分的に減少させるための方法との組合せを提供し、したがって、本発明は、不要な産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または不要な産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を前記微生物に提供することをさらに含む、以上で記述したようなＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の目的産物の発現を得るための方法を提供する。
【００５９】
たとえば、目的産物が、その発現が、前記遺伝子の前で、ＤａｓＲによるＤａｓＲ結合部位への結合に際して抑制される遺伝子によってコードされている場合、この目的産物の発現は、誘導因子を提供することによって少なくとも部分的に増加する。同時に不要な産物が発現し、その存在がたとえば、前記目的産物の単離／精製を干渉する場合、この不要な産物が、ＤａｓＲタンパク質の関連ＤａｓＲ結合部位への結合に際して活性化される場合、この結合部位はたとえば、ＤａｓＲタンパク質の前記関連ＤａｓＲ結合部位への結合を少なくとも部分的に阻害するように遺伝的に改変する。本発明に基づいて、目的産物および不要な産物のＤａｓＲ調節の種々の状況がおそらく、本明細書で記述したオプションの任意の１つを介して解決され得ることが、当業者に明らかである。
【００６０】
その発現が、ＤａｓＲによって調節（活性化または抑制いずれか）される遺伝子の例を、表２にて概説している。本発明がまた、これらの遺伝子の産物の特定の特徴に基づいた方法を提供することが当業者に対して明らかである。さらに、本発明者らは、ＤａｓＲの存在しない状態が、結果として、特定の増殖培地上の異常な増殖性質となることも観察した。以下の記述部分によって、表２にて示した結果に基づく利用、ならびにＤａｓＲヌル変異体での観察に基づく利用の例を提供している。
【００６１】
１つの例は、ＤａｓＲ（ＤａｓＲヌル変異体に関する実験部分を参照のこと）が存在しないこと、またはＤａｓＲの増強された発現によって、結果として、異常な増殖性質となる、という観察である。たとえば、グルコース上でのＤａｓＲヌル変異体増殖が、結果として糸状体細菌の断片化された増殖となる。液体培養液中、ＤａｓＲが存在しないことにより結果として、分岐が増強され（図１６）、一方で、多コピープラスミドを用いるＤａｓＲの発現が、分岐を減少させる。さらに、本発明者らは、細胞骨格またはペプチドグリカンに関連する遺伝子を同定した。したがって、本発明はさらに、ＤａｓＲ−調節遺伝子の発現を変更することを含む、増殖中の断片化および／または分岐性質が変更された糸状体微生物を得るための方法を提供する。ほとんどの糸状体微生物（たとえば放線菌）のみが固体培地上で胞子を形成し、一方で液体培養液中の増殖は、植物菌糸体の形成に制限される。これは典型的には、高い生理学的活性を示しているもっとも外側に指向した区画をもつ、菌糸の複雑なネットワークの形成に発達し、とりわけ結果としてペレット形成となり、結果として増殖速度の減少、およびバイオマスのユニットあたりの望む産物の低収率となる。さらに、それらの糸状形態のために、生物技術的に興味深い放線菌の高濃度の発酵がしばしば、非常に粘着性であり、結果として、たとえば通気および混合の問題によって、低バイオマス蓄積となる。本予測より、水中培地中の菌糸体の断片化が刺激されること、菌糸体の分岐が減少されること、および一般的に培養液の粘着度が減少すること、が望ましい。
【００６２】
他の例は、同定されたＤａｓＲ調節遺伝子のいくつかが、タンパク質分泌および／またはタンパク質ホールディングに関与する遺伝子であるという発見に基づいている。例としては、ｓｅｃＥ（表２中＃１０２）およびｓｅｃＹ（表２中＃１００）であり、これらは、Ｓｅｃ分泌系の必須の膜成分である。事実、大培養中の分泌された総タンパク質の繰り返し測定によって、ＤａｓＲの活性コピーが存在しない状態で、分泌されたタンパク質の総量が５０％まで減少したことが明らかになった。したがって、本発明はまた、タンパク質分泌および／またはタンパク質ホールディングに関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の、タンパク質分泌および／またはタンパク質ホールディングを調節するための方法を提供する。
【００６３】
また他の例は、同定されたＤａｓＲ調節遺伝子のいくつかが、銅、鉄または亜鉛のような、金属イオンの輸送に関与する遺伝子であるという発見に基づいている。関連遺伝子はたとえば、ｃｕｔＣ−型銅ホメオスタシス遺伝子（表２中＃３０）、および鉄の取り込みを制御する鉄調節遺伝子ｄｅｓＲ（表２中＃６２）である。したがって、本発明は、前記金属イオンの輸送に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の金属イオンの輸送を調節するための方法を提供する。
【００６４】
他の例は、同定されたＤａｓＲ調節遺伝子のいくつかが、糖の輸送に関与する遺伝子であるという発見に基づいている。非限定例を、ＰＴＳ遺伝子（ｎａｇＥ１、ｎａｇＥ２、ｍａｌＸ２、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒ、＃１、２、３、５）、ＡＢＣトランスポーター（たとえば表２中＃４、８、１７、２２、３３、５３、６６、１１１および１２２）、および放線菌におけるＡＢＣトランスポーターに対する不変ＡＴＰａｓｅであり、それらの輸送活性に対して必須であるＭｓｉＫ（＃３８）を含んで、表Ｉにて提供している。これらの例のうち、ＰＴＳ、ＭｓｉＫおよび種々のＡＢＣトランスポーターが、実験的に検証された。したがって、本発明は、糖の輸送に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の、糖の輸送を調節するための方法も提供する。たとえば、ＰＴＳNAGによるＮ−アセチルグルコサミン、およびＡＢＣトランスポーターＮｇｃＥＦＧ（表２中＃３３）によるキトビオース。ＤａｓＲ−抑制ＭｓｉＫは、多くのＡＢＣトランスポーターの活性に必要であり、たとえば、セルビオース（ＣｅｂＥＦＧ）、マルトース（ＭａｌＥＦＧ）およびキシロビオース（ＢｘｌＥＦＧ）に対して必要である。
【００６５】
また他の例は、ＤａｓＲヌル変異体中の抗生物質の産出が、いくつかの培地発達が増強され、他で完全に無効化されるという、培地依存発達を示したという発見に基づいている。したがって、本発明は、ｄａｓＲ遺伝子を機能的に改善することを含み、さらに特定の抗生物質に対して好適な糖供給源を選別することを含む、（糸状体）微生物中の抗生物質産出に影響を与えるための方法も提供する。特定の抗生物質との組合せでの、好適な糖供給源が、図１１で提供されている。
【００６６】
本発明の任意の方法において、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物は、ＤａｓＲ−様タンパク質、または前記ＤａｓＲ−様タンパク質を、前記タンパク質をコードしている核酸から発現可能な有機体である。さらに、前記微生物は、前記ＤａｓＲ−様タンパク質を発現可能な性質によってである有機体であってよく、またはＤａｓＲ−様タンパク質を産出するために遺伝的に改変された微生物であってよい。さらに、よりＤａｓＲ−タンパク質の産出を可能にするさらなる核酸を、ＤａｓＲ−様タンパク質をすでに発現可能な微生物に提供することも可能である。そのようなＤａｓＲ−様タンパク質の追加核酸は、すでに存在している、内因性ＤａｓＲをコードしている核酸と同一であってよく、異種であってもよい。好ましい実施形態において、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物を、ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸を微生物に提供することによって得る。より好ましくは、前記ＤａｓＲ−様タンパク質は異種である。ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸を、したがって任意の公知の方法によって微生物に提供し得る。さらに、前記核酸は、前記微生物中で、エピソーム要素として存在してよく、または前記微生物のゲノム内に統合されてよい。
【００６７】
さらに、前記目的遺伝子は、内生遺伝子、ならびに外因性遺伝子であってよく、したがって、本発明の方法はさらに、目的遺伝子をコードしている核酸を、ＤａｓＲ−様を含む有機体に提供することを含みうる。
【００６８】
本発明の任意の方法にて使用する微生物は、好ましくは海洋または土壌起源からの細菌である。好ましい実施形態において、前記微生物は糸状微生物である。糸状体微生物の例は、子嚢菌、バシド菌または放線菌である。好適な放線菌の例は、ストレプトミセス（Streptomyces）、ノカルディア（Nocardia）、サーモビフィド（Thermobifido）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、プラノビスポラ（Planobispora）、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）、フォードコッカス（Rhodococcus）、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）である。
【００６９】
本発明のまた他の実施形態において、微生物は、バチルス、ラクトバチルス、ラクトコッカス、ストレプトコッカスまたはリステリアのような、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌である。驚くべきことに、本発明者らは本発明において、コア遺伝子クラスターｎａｇＡ−ｎａｇＢ−ｄａｓＲ（およびｄｒｅ要素）がまた、バチルス、ラクトコッカス、リステリアおよびストレプトコッカスを含む、低Ｇ＋Ｃグラム陽性間で広範囲に広がることを開示している。バチルスのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量（４３％）が、ストレプトミセスのＧ＋Ｃ含量（７２〜７３％）よりも約３０％低いけれども、組織のみが保存されているのではなく、ｄｒｅ部位の配列も保存されている。バチルス サブチリスおよびバチルス ハロデュランス（Bacillus halodurans）のｄｒｅ部位を表５にて要約しており、ラクトコッカス ラクティスのものを表６に、ストレプトコッカス種のものを表７に、リステリア インノクア（Listeria innocua）およびリステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）のものを表８にて要約している。
【００７０】
低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌は、たとえば多くの日常製品の産出で重要であり、これらの細菌はしばしばプロバイオティクスとして使用される。
【００７１】
表４〜７より、これらの細菌においてまた、糖取り込み、代謝またはバクテリオシン産出のような工程が、本明細書で記述された任意の方法によって影響を受けることが明らかである。
【００７２】
驚くべきことに、本発明は、ｄａｓＲ変異体が、抗生物質の産出の強力な増強を示したという発見も開示している。さらに、表３にて同定したように、多数の抗生物質（クラスター）が、ＤａｓＲの制御下である。潜在性抗生物質（クラスター）がまた、ＤａｓＲの制御下であることがわかった（表３）。本発明はしたがって、前記抗生物質をコードしている遺伝子と動作可能に結合したＤａｓＲ−結合部位、または前記抗生物質の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位への、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を、前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の抗生物質の発現を調節する、得るまたは増加させるための方法を提供する。好ましくは、そのような方法を、抗生物質の発現を得るため、または増加させるために使用する。より好ましくは、前記抗生物質は、潜在性抗生物質または潜在性抗生物質クラスターの一部である。好ましい実施形態において、ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合を干渉可能な前記化合物は、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体である。
【００７３】
また他の実施形態において、本発明は、活性化ＤａｓＲ−抑制潜在性遺伝子（クラスター）を提供し、そこで、前記潜在性遺伝子（クラスター）が、前記遺伝子（クラスター）と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合に影響を与えることによって活性化される。前記タンパク質と前記結合部位間の結合に影響を与えることによって結果として、結合が減少、または増加／改善され得る。好ましい実施形態において、前記遺伝子（クラスター）は、抗生物質遺伝子（クラスター）である。
【００７４】
関連結合部位へのＤａｓＲの結合が結果として、たとえば抗生物質産出のレベルの抑制となる場合、前記抗生物質の産出がたとえば、前記抗生物質と動作可能に連結したＤａｓＲ結合部位に変異導入することによって達成される。変異導入は好ましくは、ＤａｓＲタンパク質がもはや、前記結合部位へ十分結合可能ではないものである。また他の実施形態において、（グルコサミン−６−Ｐへ変換される）Ｎ−アセチルグルコサミンのような誘導因子を、抑制を軽減するために使用する。
【００７５】
本発明はまた、少なくとも１つのＤａｓＲ調節遺伝子の発現が改変されるような方法で、遺伝子工学によって生産された微生物を提供する。
【００７６】
１つの好適な例は、上記したような、活性化潜在性クラスターを含む微生物、たとえば、前記クラスターに動作可能に結合したＤａｓＲ結合部位が、前記クラスターが、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合が増加、または減少するように変異導入された微生物である。
【００７７】
他の例は、ＤａｓＲ−様タンパク質に対する変異導入結合部位を含む微生物である。前記結合部位は、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合が増加、または減少するように変異導入される。または、前記結合部位が、（たとえば、その発現がほとんど望まれない遺伝子を特異的に抑制するために）遺伝子が異なる抑制因子タンパク質によって制御されるように改変され得る。当業者は、種々のＤＮＡ結合タンパク質が、特定の微生物中で天然に存在しない結合部位のみを認識するように存在することに気がついている。そのようなタンパク質の例は、（ｔｅｔＯオペレーターを認識する）ＴｅｔＲまたは（真核ゲルプロモーターを認識する）Ｇａｌ４である。
【００７８】
また他の例は、ＤａｓＲ−様タンパク質の変異体を含む微生物である。たとえば、結合能力が改善した、または結合能力が減少した変異体、またはグルコサミン−６−Ｐ（または同様の化合物）による誘導に不感受性のＤａｓＲの変異体。他の例は、本質的に非機能的な変異体、たとえばＤａｓＲ−様タンパク質のヌル変異体である。また他の例は、エフェクター結合ドメイン（の部分）が変異導入（たとえば欠損）されたＤａｓＲ−様タンパク質である。
【００７９】
他の例は、増加したＤａｓＲの発現を含む微生物である。これはたとえば、微生物に、ＤａｓＲに対する（過剰）発現カセットを提供することによって達成される。そのようなカセットには、同種または異種ｄａｓＲ遺伝子が含まれうる。微生物がすでに、ＤａｓＲをコードするために遺伝的情報を含む場合、前記微生物中のＤａｓＲの自己調節を改善することがまたオプションである。
【００８０】
２つの他の例は、本質的に栄養増殖し、二次代謝物のレベルの変更を産出する微生物、または本質的に栄養増殖し、潜在性遺伝子クラスターから産物を産出する微生物である。
【００８１】
好ましくは、任意の言及した微生物が、（たとえば、酵素または抗生物質のような）増加量の目的産物を産出する。
【００８２】
より好ましくは、本発明にしたがった微生物は、海洋または土壌起源からの細菌である。他の好ましい実施形態において、前記微生物は糸状体微生物である。糸状体微生物の例は、子嚢菌、バシド菌または放線菌である。好適な放線菌の例は、ストレプトミセス（Streptomyces）、ノカルディア（Nocardia）、サーモビフィド（Thermobifido）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、プラノビスポラ（Planobispora）、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）、フォードコッカス（Rhodococcus）、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）である。
【００８３】
本発明のまた他の実施形態において、微生物は、バチルス、ラクトコッカス、ストレプトコッカスまたはリステリアのような、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌である。
【００８４】
本発明の任意の方法を、ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸、ならびにＤａｓＲ−結合部位と動作可能に連結した核酸をすでに含む微生物で開始することが便利であるけれども、本方法を、前記核酸を含まない微生物で使用することも可能である。したがって、本発明はさらに、前記目的産物をコードしている核酸、またはＤａｓＲ−様タンパク質に対する結合部位を持つ前記目的産物の産出に関与するタンパク質をコードしている核酸を提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物中の、目的産物の発現を調節するための方法を提供し、そこで、前記結合部位は、前記核酸に動作可能に連結する。好ましい実施形態において、前記微生物にはさらに、ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸が提供される。
【００８５】
また他の実施形態において、本発明は、ＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するための変異導入ＤａｓＲ−結合部位の利用、またはＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するための変異導入ＤａｓＲ−様タンパク質の利用、またはＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するためのＤａｓＲの利用、またはＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するためのＤａｓＲ−誘導因子の利用を提供する。
【００８６】
本明細書で記述された任意の方法にはさらに、精製段階、たとえば目的遺伝子の産物の精製、または（酵素または抗生物質のような）目的産物の精製が含まれうる。さらに、本発明にしたがった方法を、小規模基準、または大規模基準で実施し得る。
【００８７】
また他の実施形態において、本発明は、前記微生物にＮ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体を提供することを含む、微生物中の二次代謝物の産出を得る、または改善するための方法を提供する。前記二次代謝物は、公知または未知の二次代謝物であってよく、したがって前記方法は、スクリーニング法、たとえば新規薬物の同定のためのスクリーニング法の一部でありうる。好ましい実施形態において、前記二次代謝物は抗生物質である。また他の好ましい実施形態において、本発明は、前記有機体に、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体を提供することを含む、微生物中の潜在性（抗生物質）クラスターからの発現を喚起する、または増強するための方法を提供する。他の好ましい実施形態において、利用した微生物は、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む。また他の好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体を、前記微生物の増殖培地に加える。また他の好ましい実施形態において、前記Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体を、少なくとも１０ｍＭ、または好ましくはそれ以上の濃度で、前記増殖培地に加える。
【００８８】
また他の好ましい実施形態において、使用した微生物は糸状体微生物、好ましくは子嚢菌、バシド菌、または放線菌である。好適な放線菌の例は、ストレプトミセス（Streptomyces）、ノカルディア（Nocardia）、サーモビフィド（Thermobifido)、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、プラノビスポラ（Planobispora）、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）、フォードコッカス（Rhodococcus）、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）である。
【００８９】
また他の実施形態において、本発明は、微生物中の潜在性（たとえば抗生物質）クラスターを喚起する、または増強するための、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体または多重体の利用を提供する。
【００９０】
本発明は、本発明を限定していない、以下の記述にてより詳細に説明されるであろう。
【実施例】
【００９１】
実験の部
材料および方法
細菌株 大腸菌ＤＨ５αおよびＢＬ２１（ＤＥ３）を、サブクローニングおよびＤａｓＲ過剰発現実験のために利用した。Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５、Ｍ５１０（Ｍ１４５ ΔｒｅｄＤ）、Ｍ５１１（Ｍ１４５ ΔａｃｔＩＩ−ＩＶ）およびＭ５１２（Ｍ１４５ ΔａｃｔＩＩ−ＩＶ ΔｒｅｄＤ）（FlorianoおよびBibb、1996）およびストレプトミセス リビダンス（Streptomyces lividans）１３２６は、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ株コレクションより入手し、ストレプトミセス アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）ＮＲＲＬ８１６５（ＭＡ−４６８０）、ストレプトミセス ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）ＡＴＣＣ２７４３８、ストレプトミセス リモサス（Streptomyces limosus）ＡＴＣＣ１９７７８、ストレプトミセス リモサス（Streptomyces rimosus）ＡＴＣＣＤ１０９７０、ストレプトミセス ロセオスポラス（Streptomyces roseosporus）ＡＴＣＣ３１５６８およびストレプトミセス ベネズエラ（Streptomyces venezuelae）ＡＣＴＴ１５４３９は、ＡＴＣＣ株コレクションから入手し、ストレプトミセス アクリミシニ（Streptomyces acrimycini）ＤＳＭ４０５４０、ストレプトミセス シナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）ＤＳＭ４０４６７、ストレプトミセス クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）ＮＲＲＬ３５８５、ストレプトミセス コリヌス（Streptomyces collinus）ＤＳＭ４０７３３およびストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）ＮＲＲＬ Ｂ２６８２は、ＤＳＭＺ株コレクションより入手した。ｄａｓＲ変異体ＢＡＰ２９（ΔｄａｓＲ：：ａｃｃＣ４）は、通常の手順（Nothaftら、2003）にしたがって、プラスミドｐＷＨＭ３を用いて、アパラマイシン耐性遺伝子カセットによる、遺伝子のコード領域の置換によって作製した。同様の戦略を用いて、ｐｔｓＨ（ＢＡＰ１）、ｃｒｒ（ＢＡＰ２）、ｐｔｓＩ（ＢＡＰ３）、ｎａｇＥ１（ＢＡＰ４）、ｎａｇＥ２（ＢＡＰ５）およびｎａｇＥ１／Ｅ２（ＢＡＰ６）に対するノックアウト変異体を作製した。ＢＡＰ１〜３はすでに発行されている（Nothaftら、2003）。Ｓ．コエリカラー株を、完全培地（ＴＳＢ、Ｄｉｆｃｏ）または最少培地（van Wezelら、2005）として、デキストロースを含まないトリプシン大豆ブロスを用いて、２８℃にて増殖させた。大腸菌培養液は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）中で、３７℃にて増殖させた。変異体の表現系特性化を、テキスト（Kieserら、2000）にて示されたような種々の炭素供給源を含む、最少培地寒天プレート上で実施した。ＡｃｔおよびＲｅｄの定量化を、先に記述された（Martinez-Costaら、1996）ように実施した。
【００９２】
ＤＮａｓｅＩフットプリンティング Ｓ．コエリカラーｃｒｒ遺伝子（ＳＣＯ１３９０）の開始に関連した−２０２／＋８領域に相当する２２２−ｂｐ ＤＮＡ断片を、ＤＮａｓｅＩフットプリンティングのために選択した。ＤＮＡ断片を、ＰＣＲによってクロモソームＤＮＡから増幅した。５０ｆｍｏｌの32Ｐ末端標識化プローブを、関連タンパク質（ＤａｓＲ−（Ｈｉｓ）6および／またはＢＳＡ）およびＤＮａｓｅＩ（０．４μｇ／ｍｌ）とともに、記述された（Sambrookら、1989）ようにインキュベートした。
【００９３】
算定予測 多重アライメントおよび位置加重マトリックスを先に記述された（Rigaliら、2004）ように、Ｔａｒｔｇｅｔ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ自動化ツール（http://trantor.bioc.columbia.edu/Target_Explorer/）（Sosinskyら、2003）によって産出した。加重マトリックスを「ＤａｓＲ４」として描写した。
【００９４】
【００９５】
マトリックスＤａｓＲ４によってスキャンされた配列によって得た最小スコアは、−３８．５５であり、最大スコアは１７．２５である。現在の実験検証にしたがって、ＤａｓＲ−結合部位は、１６ヌクレオチドの配列として定義され、ＤａｓＲ４マトリックスによってスキャンされた場合、６より大きな（そして１７．２５までの）間を含むスコアを得る。具体的に、−２，９７のみのスコアを持つ正しく、実験的に検証されたＤａｓＲ−結合部位が、ＮＡＤＰ−特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードしているｇｄｈＡの上流で見られた。
【００９６】
顕微鏡 菌糸体と胞子の薄い切片の解析のための透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を、フィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＥＭ４１０透過型電子顕微鏡（Mahrら、2000）で実施した。位相差顕微鏡を、Ｚｅｉｓｓ標準２５位相差顕微鏡、および５メガピクセルデジタルカメラを用いて産出した。
【００９７】
糖取り込み ２０μＭ Ｎ−［14Ｃ］アセチル−Ｄ−グルコサミン（６．２ｍＣｉ ｍｍｏｌ-1）の菌糸内への取り込みアッセイを、記述された（Nothaftら、2003）ように実施した。
【００９８】
タンパク質精製およびウェスタンブロット 組換え体ヒスチジン−タグＤａｓＲの精製（Rigaliら、2004）およびＨＰｒおよびＩＩＡCrrに対して産出された抗体でのウェスタンブロット解析は、他で記述されている（Nothaftら、2003）。
【００９９】
ＲＴ−ＰＣＲ ＲＮＡをＳ．コエリカラーＭ１４５およびＢＡＰ２９の菌糸体から単離した。５０ｍＭグリセロールを含む最少培地培養液を、胞子で植菌し、０．６のＯＤ550（指数増殖）まで増殖させた。Ｎ−アセチルグルコサミンを０．５％にて加え、試料を０、１５、３０および６０分後に得た。ＲＴ−ＰＣＲ解析を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ一段階ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（インビトロジェン（Invitrogen））にて実施した。逆転写なしでのＲＴ−ＰＣＲｓを、残余ＤＮＡが存在しないことに対する対照として使用した。半定量解析のために、試料を１８〜３５サイクルの間の３サイクル間隔で得、不飽和ＰＣＲ産物形成を比較した（van Wezelら、2005）。データを、３回の独立した実験で検証した。
【０１００】
図２１Ｂにて記述したＲＴ−ＰＣＲ実験のために使用したオリゴヌクレオチドは、
であった。
【０１０１】
二次元ゲル電気泳動およびタンパク質スポット同定 Ｓ．コエリカラーＭ１４５およびＢＡＰ２９の菌糸体を、５０ｍＭグリセロールを含む最少培地中で増殖させ、指数期内の異なる時間点で回収し、洗浄し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５および５０ｍＭ ＭｇＳＯ4中で再懸濁し、超音波処理し、細胞残骸を遠心後に除去した。ＤＮＡおよびＲＮＡを、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ処理によって削除した。タンパク質抽出物を、水に対して４℃にて２回透析し、続いて、６Ｍ固体尿素および２Ｍチオ尿素、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（２．５％（ｖ／ｖ））、ＩＰＧ緩衝液（０．５％（ｖ／ｖ））、ＤＴＴ（２５ｍＭ）およびブロモフェノールブルーを添加した。膜タンパク質を１時間、６５．０００ｇでの超遠心によって除去した。１．５ｍｇの細胞質タンパク質画分を、ＩＰＧＰｈｏｒユニット（アマシャム／ファルマシア（Amersham/Pharmacia））上２４−ｃｍ ＩＰＧストリップ上に適用した。ＩＰＧストリップを、１２．５％ポリアクリルアミドゲルにかけ、Ｅｔｔａｎ ＤＡＬＴ ＩＩシステム（アマシャム／ファルマシア）上で作動した。ゲルをＰｈａｓｔＧｅｌ Ｂｌｕｅ Ｒで染色し、スキャンした。プロテオームパターンを、独立した実験から由来した２つのゲルセットを用いて比較した。タンパク質強度を、ＴＩＮＡソフトウェア（Ｒａｙｔｅｓｔ）とともに、密度グレースケール解析によって解析した。タンパク質スポットを切り出し、トリプシンによるゲル内消化にかけ、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって解析した（Marvin-Guyら、2005）。
【０１０２】
電子移動度ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ） ＥＭＳＡを、ＡＬＦ発現シークエンサーにて、蛍光プローブ（１０ｎＭ）で実施した（Fileeら、2001）。精製ＤａｓＲ（３μＭ）および１０００−倍過剰の非特異的ＤＮＡを反応混合液中で使用した。予想されたシス−活性エレメントを、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４のプロモーター領域からとった。
ｃｒｒ
およびｃｒｐ
の公知のシス−活性エレメント上流をそれぞれ、陽性および陰性対照として使用した。１６ｎｔ ｄｒｅ部位に下線を引いている。
【０１０３】
酵素活性 キチナーゼ活性を、基質としてカルボキシメチルキチン−Ｒｅｍａｚｏｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５Ｒ（Ｌｏｅｗｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で比色分析アッセイを用いて、すでに記述された（Zhangら、2002）ように測定した。Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａアミノペプチダーゼ測定を、基質としてＤ−Ａｌａ−パラニトロアニリドで実施した（Cheggourら、2000）。ＢＣＡタンパク質アッセイ（ピアス（Pierce））を、タンパク質濃度を測定するために使用した。
【０１０４】
広範囲抗生物質活性アッセイ 希釈胞子懸濁液の試料（１μｌ）を、１％ＧｌｃＮＡｃを含む、または含まない状態の、０．５％マンニトールを含む最小培地プレート上にスポットし、２８℃にて３日間インキュベートした。バイオアッセイのために、本発明者らは、５００μｌのバチルス サブチリス（Bacillus subtilis）一晩培養液（ＯＤ600〜１）を、１０ｍｌの溶解軟栄養素寒天（ＳＮＡ）に植菌し、混合液を、一辺１２ｃｍの正方形ペトリ皿内に注いだ。プレートを２時間、４℃にて維持し、ＳＮＡを凝固させ、産出された抗生物質の拡散を可能にし、ついで３０℃にて一晩インキュベートした。
【０１０５】
実験の部
結果
ＤａｓＲレギュロンの予測
Ｓ．コエリカラーゲノムを、ＤａｓＲオペレーター部位の発生に関して精査可能にするために、本発明者らは、ＰＴＳ酵素ＩＩＡ（ＩＩＡCrr）および酵素Ｉ（ＥＩ）をコードしているｃｒｒ−ｐｔｓＩオペロンのｄｒｅ上で、ＤＮａｓｅＩフットプリンティングを実施した（図１Ａ）。保護配列（ＴＧＴＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＴ）は、ｃｒｒの開始に関連した、位置−１３０〜−１１５に相当し、由来ＤａｓＲ結合部位コンセンサス配列に対して、１６のうち１３ｂｐ一致を有した（以下を参照のこと）。本情報を、すでに本発明者らが検証した、標的遺伝子のｄｒｅ部位を決定するために使用した（表１および（Rigaliら、2004））。本トレーニングセットを用いて、本発明者らは、精密な位置加重マトリックス（「ＤａｓＲ４」、物質および方法を参照のこと）を構築し、結果として、完全Ｓ．コエリカラーゲノムをスキャンするために使用した、アライメントマトリックスとなった。
【０１０６】
ゲノムスキャンによって、２００以上の候補遺伝子を示している、１３１転写ユニットに対して、１６０ｄｒｅ部位が明らかになった。約４０％の標的遺伝子が、中心サッカライド成分として、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とともに、糖またはアミノ糖代謝に関連している。ＧｌｃＮＡｃとの関係がまた、細胞壁関連ペプチダーゼの同定に連結する。予想されたＤａｓＲレギュロンにはさらに、グルタミン／グルタミン酸アミノ酸代謝に関連した遺伝子を含む、窒素代謝のための遺伝子が含まれる。標的のリストにはまた、１６の転写因子（表２中、＃２７、３１、４６、５１、５６、６２、６７、７１、７７、８１、８４、１０５、１１９、１２９、１３０および１３１）が含まれ、ＤａｓＲによる間接転写制御の大規模なレベルを示唆している。
【０１０７】
ｄａｓＲ変異体の表現系
ｄａｓＲヌル変異体（ＢＡＰ２９）を、インビボでのＤａｓＲの役割を研究するために、アパラマイシン耐性カセット（ａａｃＣ４）による、ほとんどのコード領域（７６５のうちｎｔ１４〜６３５）の置換によって構築した。
【０１０８】
Ｓ．コエリカラーのｄａｓＲ変異体は、培地依存発達を示し、いくつかの培地では発達が増加し、一方他の培地では、完全に無効になった。図１１にて要約している。このことは、ＤａｓＲの機能が、使用した炭素および窒素供給源に依存していることを強力に示唆している。
【０１０９】
驚くべきことに、ｄａｓＲ変異体は、抗生物質産出の強力な増強を示した（図２Ａ）。株Ｍ１４５（ｐＦＴ２４１ ｄａｓＲ+）中のＤａｓＲの過剰産出が結果として、反転、非芽胞形成バルド（ｂｌｄ）表現系となった（図２Ｂ）。凍結走査電子顕微鏡（ｃｒｙｏ−ＳＥＭ）によるｄａｓＲ変異体のより詳しい検査によって、ｄａｓＲ変異体中で胞子がほとんど完全に存在しないこと、および試料調製の間に簡単に気中菌糸体が崩壊したことが示された（図２Ｃ）。Ｓ．コエリカラーＭ１４５およびＢＡＰ２９の交差切片のＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ＥＭによる高解析度の解析によって、Ｍ１４５が正常の胞子を産出した一方で、ｄａｓＲ変異体が、これは胞子壁に近いより小さいか、またはより大きな空洞を持つ、多くの胞子（およそ３０％）を産出したことが明らかになり（図２Ｄ、矢印で示した空洞）、胞子壁からの細胞質膜の大規模な分離を示唆している。さらに、胞子形態が、明らかにより異質であり、一方で、野生型胞子は典型的には、０．６×０．８μｍの大きさを持つ一方で、ｄａｓＲ変異体が、胞子サイズにおいて、普通ではない強い変動を示した（長さにして０．５〜１．４μｍ、しかし０．８μｍの同一幅）。さらに、多くの変異体胞子が、気中菌糸体のものと同様の厚さを持ち、典型的な厚さの胞子壁を作製できない。これらの発見は、ｄａｓＲが、前駆体Ｎ−アセチルグルコサミンの代謝に関する遺伝子を含む、ペプチドグリカンの生涯に関与する遺伝子を制御するという、本発明者らのコンピュータ予測（表２）とよく連結している。
【０１１０】
ＤａｓＲおよび発達の制御
ＤａｓＲはどのようにして発達へのスイッチを制御するのだろうか。ｄａｓＲレギュロン中のｐｔｓ遺伝子の導入によって、本発明者らは、少なくとも１つの関連性が、ＰＴＳのＤａｓＲ−調節制御を介してであることを提案することが許される。先の発行物（Nothaftら、2003）において、本発明者らは、個々のｐｔｓノックアウト変異体、すなわちＢＡＰ１（ΔｐｔｓＨ、ＨＰｒに対する遺伝子）、ＢＡＰ２（Δｃｒｒ、ＩＩＡCrrに対する遺伝子）、およびＢＡＰ３（ΔｐｔｓＩ、酵素Ｉ（ＥＩ）に対する遺伝子）に対して正常であるが、停滞した発達を記述した。ＰＴＳ変異体のより詳細な表現系解析によって、結局、すべてのｐｔｓ変異体が、培地上で胞子を産出可能である一方で、形態形成が、マンニトールおよびアラビノースの存在下で増殖した場合にもっとも強い差を持って、異なる複合および最小培地寒天プレート上で明らかに遅延したことが明らかになった。株を、ＳＦＭまたはＲ２ＹＥ寒天プレート上で、５日間増殖させた。図３Ａにて示したように、ｃｒｒ変異体ＢＡＰ２が、ＳＦＭ上で白色気中菌糸体を産出するが、これらの条件下では胞子を産出できず、一方、ｐｔｓＨ（ＢＡＰ１）またはｐｔｓＩ（ＢＡＰ３）の欠損が、灰色着色胞子の産出を可能にした。
【０１１１】
興味深いことに、Ｒ２ＹＥ寒天プレート上で、すべての３つのＰＴＳ変異体が、栄養増殖性停止（ｂａｌｄまたはｂｌｄ表現型と呼ばれる）を示している。
【０１１２】
本発明者らは、早期気中増殖に対する鍵となる発達σ因子である（Chaterら、1989）、ＷｈｉＧタンパク質の（ＢＡＰ２およびＢＡＰ３中の）発現パターンまたは（ＢＡＰ１中の）改変パターンが、親株Ｍ１４５におけるものからは強く異なったことを、これらの変異体のプロテオミクススクリーンにて発見した。ｗｈｉＧの発現を確立するために、その転写を、すべての３つの変異体、およびＭ１４５において解析した。興味深いことに、ｗｈｉＧ転写が、ＢＡＰ２およびＢＡＰ３変異体にて強く減少し（図３Ｂ）、ｗｈｉＧ変異体が、特徴的な非胞子形成表現系をもつので、それらが完全胞子形成を失敗することに関する可能性のある説明を提供している。
【０１１３】
したがって、本発明者らは、ＤａｓＲが、栄養センサーとして働き、ＰＴＳの制御を介してこれを翻訳し、順にｗｈｉＧを制御し、ｐｔｓ変異体の発達停止に関して、たいがい、少なくとも１つまたはそれ以上の他の早期発達遺伝子を制御することを提案している。ホスホトランスフェラーゼＷＩ、ＨＰｒおよびＩＩＡCrrが、他の細菌では、種々の、しかしいつも炭素関連の応答のために使用される、可逆代謝物依存リン酸化を介して、完全なシグナル伝達経路を提供するということは注目に値する（BruckneおよびTithemeyer,2002）。
【０１１４】
プロテオーム解析
ＤａｓＲの効果の査定を得るために、本発明者らは、ＢＡＰ２９およびその親Ｍ１４５のタンパク質プロファイルを比較した。タンパク質抽出物を、グリセロール（中性炭素供給源）の存在下での菌糸体増殖から調製し、二次元ゲル電気泳動で解析した。クーマシーブリリアントブルー染色ゲル上の約４％のタンパク質スポットは、２倍以上まで強度が変化し、８つが質量分析によって同定された（図４Ａ）。Ｍ１４５とＢＡＰ２９間の１１のもっとも顕著な差を解析し、これらのうち、質量分析によって本発明者らは、９つのタンパク質を確実に同定した（図４Ａ）。２つのタンパク質、すなわち多重糖インポートタンパク質ＭｓｉＫおよびＮａｇＡ（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐ−デアセチラーゼ）が、本発明者らのコンピュータスクリーンにて予想された。ｎａｇＡおよびｍｓｉＫのみが表２に含まれ、予想ｄｒｅ部位を含んだ。他は、中心および二次代謝に関連し得る（以下および図５を参照のこと）。ｍｓｉＫプロモーター領域中のＤａｓＲのｄｒｅへの結合が、ＥＭＳＡによって示された（以下を参照のこと）。ポリサッカライド−分解計の誘導因子の取り込みにおけるＭｓｉＫの役割にしたがって、これらの酵素的蓄積（約１００の遺伝子）がまた、ｄａｓＲ欠損によって影響を受けるべきである（議論を参照のこと）。他の７つの遺伝子のｄｒｅ上流の欠損が、ＤａｓＲによるこれらの遺伝子の間接制御を示唆している。プロテオーム解析によって同定されたタンパク質に関連した代謝経路の可視化によって、ＧｌｃＮＡｃおよびグルタミン酸代謝周辺にもっとも引きつけられることが明らかになり、以上で示した、コンピュータ内およびインビトロデータとよく一致する（図５）。
【０１１５】
ＤａｓＲは、放線菌における二次代謝および抗生物質産出を制御する
興味深いことに、ｄａｓＲ変異体において両方がアップレギュレートされる、本発明者らのプロテオミクススクリーンにて同定された２つの標的、すなわちＡｃｔＶＡ４およびＧｐｓＩが、ｄａｓＲ変異体におけるブルーγ−アクチノルホジンの産出の活性化に早期によく相関する、抗生物質γ−アクチノルホジンの産出に関与する（bibb、2005）（図２Ａ）。ＧｐｓＩは、ｐｐＧｐｐ前駆体を合成するグアノシンペンタホスフェート（ｐｐｐＧｐｐ）シンターゼである。逼迫因子ｐｐＧｐｐが、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４転写を活性化することにおいて、原因的な役割を持つ（Heskethら、2001）。ＢＡＰ２９中の多量のＧｐｓＩが、ｐｐＧｐｐ前駆体のプールの増加を示唆し、したがって、アクチノルホジンの早期および増強産出を示唆している。ＡｃｔＶＡ４の機能は未知であるが、しかし遺伝子が、アクチノルホジン産出に関連するクラスター（２０遺伝子）中に含まれ、転写活性因子ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４に依存している（Ariasら、1999）。表２からしたがうように、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４は、予想ＤａｓＲ標的遺伝子間で特徴づけられる。精製ＤａｓＲの本遺伝子のｄｒｅ上流への直接結合が、ＤａｓＲタンパク質が、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４プロモーター領域にて見られるｄｒｅ要素を含む二本鎖オリゴヌクレオチドに直接結合するという本発明者らの発見によって検証される（図９）。このことは、実際にＤａｓＲが、この刺激的な化合物の合成のための、経路−特異的活性因子遺伝子に結合することによる、アクチノルホジン産出を制御することを証明しており、ＤａｓＲが、子嚢菌における抗生物質産出の制御において重大な役割を果たすことを示唆している。
【０１１６】
おもしろいことに、一次ゲル電気泳動による、ｄａｓＲ変異体が存在しない状態での分泌タンパク質と、その親Ｓ．コエリカラーＭ１４５の比較が、１つの単一タンパク質が、ｄａｓＲ変異体中で、異常に高く過剰発現したことを示した（図４Ｂ）。このタンパク質は、質量分析によって、ＳＣＯ５０７４として同定された。本タンパク質は最近、アクチノルホジン生合成クラスターの一部としてみられ、分泌抗生物質のテイリングに対してもっとも関与する可能性がある分泌デヒドラターゼである（Hesketh & Chater 2003；Taguchiら、2000）。遺伝子産物は、たいがい、アクチノルホジン前駆体中のアルコールの環化−脱水を補助して、ピラン環を与え、この反応は自然発生的に進行するが、有さない場合にはきわめて効果が低い。Taguchiら、（2000）にて記述されたように、ａｃｔＶＩ−ＯＲＦ３崩壊変異体は、親と比べて少ない（約半分の）アクチノルホジンを産出する。このことは、野生型株が青色色素を産出する一方で、ｄａｓＲ変異体が、紫／すみれ色色素を産出し、たいがいＳＣＯ５０７４の極端な過剰発現によるアクチノルホジンの変異体である、という本発明者らの観察と一致する。また非常に興味深いことに、以上で記述した新規バイオインフォマティクス技術を用いて、本発明者らは、抗生物質の調節および／または産出に関与する多くの遺伝子のｄｒｅ部位上流を同定した。これらの標的を、表３にて要約している。
【０１１７】
酵素産出の制御
１６の予測遺伝子にて、キチン−関連（ｃｈｉ）遺伝子が、キチナーゼ、キチン結合タンパク質、（キト−オリゴサッカライドをＧｌｃＮＡｃとキトビオースに変換する）細胞外β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、および（キトビオースをＧｌｃＮＡｃに加水分解する）細胞内β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを含む、潜在的ＤａｓＲ標的の大きなサブセットを構築する。これを検証するために、本発明者らは、誘導（キチン）または抑制（グリセロール、グリセロール＋ＧｌｃＮＡｃ、およびグルコース＋キチン）下増殖した、ＢＡＰ２９およびＭ１４５の総キチン分解活性を測定した。図６Ａにて描写したように、本発明者らは、細胞をグルコースが存在する状態、またはしない状態で、キチン上で増殖させた時に、ＢＡＰ２９におけるキチン分解活性が強く減少したことを観察した。同様の観察が、総β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性をアッセイしたときに得られた（図６Ａ）。
【０１１８】
地球上で１つの、しかしもっとも豊富な炭素供給源であり、Ｎ−アセチルグルコサミンのポリマーである、キチンの利用に必要である、キチン分解系に関して、ＤａｓＲとｃｈｉ遺伝子間の予想されるシス−トランス関係を検証するために、７つの試料を選択した。いくつかは低い結合効率であったが、陽性ＤＮＡ−ＤａｓＲ相互作用が、すべての試験したプロモーターに関して観察された（図９）。３つのキチナーゼ遺伝子の転写を、ＧｌｃＮＡｃの取り込みを含む（グリセロールおよびＧｌｃＮＡｃ）、または含まない（グリセロール）条件下の培養培地から単離したＲＮＡ上で、ＲＴ−ＰＣＲによってモニタした（図６Ｂ）。解析した遺伝子は、ｃｈｉＩ（ＳＣＯ１４４４）、ｃｈｉＦ（ＳＣＯ７２６３）、および推定分泌β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをコードしているＳＣＯ６３００であった。広範囲キチン分解活性から推定されるように、基礎発現が、グリセロール上にのみ培養培地中の、３つすべての遺伝子で観察された。ｃｈｉＩおよびＳＣＯ６３００に関して、Ｍ１４５とＢＡＰ２９間の転写レベルに有意な差はなかった。おもしろいことに、ｃｈｉＦ転写は、ＤａｓＲに完全に依存しており、一方で、本発明者らは、ＢＡＰ２９からのＲＮＡ調製において任意の転写物を検出できず、野生型のＲＮＡ試料中で、強力なｃｈｉＦ転写が存在した。これらのデータは、ＧｌｃＮＡｃ輸送のための遺伝子と、それに続く細胞内異化作用に対する機能の抑制とは反対に、ＤａｓＲが、キチン分解系を正に制御していることを示唆している（以下を参照のこと）。
【０１１９】
他の細胞外酵素も、ＤａｓＲによって制御される（図７）。実際、本発明者らは、キチン分解系に加えて、マンナナーゼ、α−アミラーゼ、キシラナーゼの活性が、ＤａｓＲに依存することを発見した（図７）。これらのポリサッカライド−分解系のすべてが、事実、ｄａｓＲによる基質誘導とグルコース制御両方において影響を持ち、酵素分泌に対する制御機構におけるその重要な位置を強調している。
【０１２０】
糖輸送のＤａｓＲ−仲介制御
多くの予想ＤａｓＲ標的が、炭素供給源の運命に関与したので（表２）、本発明者らは、糖輸送におけるｄａｓＲ変異導入の効果を解析した。輸送アッセイによって、ＧｌｃＮＡｃのＰＴＳ−仲介内部化が、ＢＡＰ２９において構成的になり、一方で、親Ｍ１４５において、取り込みがＧｌｃＮＡｃによって誘導されたことが明らかになった（図８Ａ）。これは、普遍ＰＴＳホスホトランスフェラーゼＨＰｒおよびＩＩＡCrrの構成タンパク質レベルと相関し（図８Ａ）、ＰＴＳペルメアーゼ複合体（ＩＩＢGlcNAc、ＩＩＣGlcNAc、ＩＩＡCrr、ＥＩ、ＨＰｒ）をコードしているそれぞれの遺伝子（ｍａｌＸ２、ｎａｇＥ２、ｃｒｒ−ｐｔｓＩおよびｐｔｓＨ、図８Ｃ）のＲＴ−ＰＣＲによって支持された。
【０１２１】
以上で示したように、コンピュータによる予測およびプロテオーム解析によって、ＤａｓＲに対する標的として、普遍ＡＴＰａｓｅ ＭｓｉＫをコードしているｍｓｉＫ（ＳＣＯ４２４０）が同定された（図４）。ＤＮＡ結合実験によって、ＤａｓＲが、ｍｓｉＫプロモーター領域中に存在するｄｒｅに直接結合することが示され（図９）、これは、ＤａｓＲが、セルビオース、トレハロース、マルトース、キシロビオース、キトビオース、およびおそらく他のさらに２０〜３０の炭化水素の取り込みのためのものを含む、ＭｓｉＫ−依存ＡＢＣ型（ＡＴＰ−結合カセット）輸送の制御に関与することを示している（Bertramら、2004）。ＭｓｉＫのＤａｓＲ−依存制御の明らかな結果として、ＤａｓＲが、糖オペロン誘導因子の能力を間接的に制御し、したがって、すべての細胞外糖ヒドロラーゼの発現に影響を与える。これは、キチン分解系に加えて、マンナナーゼ、α−アミラーゼ、キシラナーゼがＤａｓＲに依存するという本発明者らの発見と非常に相関する（７）。
【０１２２】
ＤａｓＲ−依存ペプチドグリカン関連タンパク質
ｄａｓＲ変異体中の観察された細胞壁異常（図２Ｄ）が、ペプチドグリカン−関連ペプチダーゼをコードしているいくつかの遺伝子が、潜在的ＤａｓＲ標的のリスト（表２）内に含まれているという発見によって、少なくとも部分的に説明される。事実、部位は、五員ｄｐｐＡオペロンの７１ｂｐ上流（ＳＣＯ６４８６−６４９０）で予測された。ｄｐｐＡそれ自身は、バチルス サブチリスのＤｐｐＡ（ＤｐｐＡBsu）に３０％同一および５０％類似の、推定二核亜鉛依存、Ｄ−特異的アミノペプチダーゼ（ｐｆａｍ ０４９５１）をコードし（Cheggourら、2000）、ＤｐｐＡBsuは、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−ＡｌａおよびＤ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ基質上で唯一活性である。ＤｐｐＡBsuの生理学的役割はおそらく、ペプチドグリカン生合成において必要とされる、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａジペプチドを加水分解することによる、栄養欠如に対する適合である（Cheggourら、2000）。ｄｐｐＡオペロンの他のｏｒｆ（ＳＣＯ６４８９）にはまた、ペプチドグリカン前駆体またはペプチドグリカン分解産物異化に関与する。ＳＣＯ６４８９の予測遺伝子産物は、ペプチドグリカンのテトラペプチド部位中の二塩基アミノ酸とＣ−末端Ｄ−アラニン間のペプチド結合を加水分解する（Templinら、1999）大腸菌からのＬｄｃＡ（Ｌ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼＡ）に、３２％同一、および４７％類似である。大腸菌内のｌｄｃＡの不活性化によって結果として、ペプチドグリカンの総架橋が劇的に減少する。
【０１２３】
ＤａｓＲが、ｄｐｐＡオペロンの発現を制御するかどうか査定するために、本発明者らは、精製Ｈｉｓ−タグ化ＤａｓＲと、ｄｐｐＡの１９３ｂｐ上流に相当する断片で、ＤＮＡ結合実験を実施した。ＥＭＳＡｓを用いた解析によって、弱いが、有意なＤａｓＲのｄｐｐＡプロモーターとの相互作用が確立された（図９）。ｄｐｐＡの発現におけるＤａｓＲに対する調節の役割をさらに検証するために、細胞内Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａアミノペプチダーゼ活性を、変異体ＢＡＰ２９にて測定し、親株Ｓ．コエリカラーＭ１４５と比較した。両方の株を、種々の炭素供給源を含むＭＭ中で２４時間増殖させた（図１０）。本発明者らは、キチン中で増殖したＭ１４５間の総Ｄ−ａｌａ−Ｄ−Ａｌａアミノペプチダーゼ活性における実質的な変化を検出できなかった。しかしながら、グルコース＋キチンにおいて、本発明者らは、Ｍ１４５と比べて、変異体ＢＡＰ２９において、平均８５％の活性の減少を測定した。グリセロールおよびグリセロール＋ＧｌｃＮＡｃにおいて、ｄａｓＲ変異体は、それぞれ約７０％および３３％増加した活性を持ち、したがって、反対の効果が明らかになっている。これらの実験によって、ＤａｓＲが、培養液の条件にしたがって、ｄｐｐＡ活性を制御しており、したがって、ペプチドグリカン前駆体生合成のために必要なＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａプールを調節することが示されている。
【０１２４】
ＤａｓＲと中央代謝
予想ｄｒｅ部位のリストにおける多数のＮ−アセチルグルコサミン関連遺伝子を考慮して、本発明者らは、ｎａｇ代謝遺伝子の制御におけるＤａｓＲのインパクトを調査した。ＥＭＳＡｓを、精製ＤａｓＲタンパク質と、ｎａｇＢ（グルコサミン−６−Ｐイソメラーゼ）に対する予想ｄｒｅ部位およびｎａｇＫＡオペロン（ＧｌｃＮＡｃキナーゼ、およびＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐデアセチラーゼ）を含むＤＮＡを用いて実施した。両方の場合で、ＤａｓＲ−ｄｒｅ複合体が示され得た（図９）。これは、ＮａｇＡ（図４）における本発明者らのプロテオーム解析、およびｄａｓＲ変異体で構造的に発現する、ｎａｇＢのＲＴ−ＰＣＲ解析と一致する（図８Ｃ）。ＤａｓＲレギュロンはさらに、アミノ糖およびグルタミン／グルタミン酸代謝を含む、窒素代謝に対する遺伝子の制御を介して、Ｎ−アセチルグルコサミンの運命に焦点を当てる。本発明者らのプロテオーム解析によって、反対の反応を触媒する、標的としてグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｄｈＡ；完全にＤａｓＲに依存する）、およびホスホセリン アミノトランスフェラーゼ（ＳＣＯ４３６６、抑制される）が明らかになった（Altermann and Klaenhammer,2005）（図４＆５）。ＮａｇＡによってＮ−アセチルグルコサミンから遊離する酢酸が、アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＳＣＯ３５６３の強力なｄｒｅ部位上流であり、ＥＭＳＡによって確認される）によって、ＴＣＡ回路の前駆体である、アセチル−ＣｏＡに変換される。アセチル−ＣｏＡは、二者択一的に、チオレート（ＴｈｉＬ、プロテオミクスによって検出された標的、図４）によって、アセトアセチル−ＣｏＡに変換されて、脂肪酸代謝に入る。このことは、順番に、Ｇｌｎ（アンチコドンＣＵＧ）およびＧｌｕ（アンチコドンＣＵＣ）に対するすべての主要なｔＲＮＡを含むオペロン中の少なくとも２つの遺伝子、ｔＲＮＡGln−ｔＲＮＡＧｌｕ−ｔＲＮＡＧｌｕ−ｔＲＮＡGln−ｔＲＮＡＧｌｕ−が、ＤａｓＲによって調節されることが予想され、一方で最初の３つがそうではないので、転写レベルで、異常な型の制御までよく広がり得、このことはＤａｓＲによるｔＲＮＡ利用性の微調整を示唆している。ｔＲＮＡ存在量のレベルでのそのような制御を支持する証拠は、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡGlnアミノトランスフェラーゼの予想ｄｒｅ部位上流の存在に由来する（表２）。
【０１２５】
したがって、関連したすべての対処段階のほとんど完全な制御をもつ、細胞エネルギーバランス、およびトライアングルＧｌｃＮＡｃ−Ｇｌｎ／Ｇｌｕ−アセチル−ＣｏＡ周辺の回転のために重要な、ＤａｓＲレギュロンの超制御コアネットワークの図が明らかになる。したがって、ＤａｓＲは、中央代謝の制御において、とりわけ顕著な役割を果たし、代謝工業技術に対する非常に魅力ある標的である。Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルタミン酸代謝に関するすべての標的を、表４にて強調している。
【０１２６】
驚くべきことに、本発明者らのサーモビフィド フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄｏ ｆｕｓｃａ）ゲノムの解析によって、それぞれの酵素コード遺伝子の上流に局在する非常に信頼性のあるｄｒｅ配列で、事実解糖のそれぞれの単独の段階が、ＤａｓＲによって制御されることが示された（表９および図１７）。この意味合いは、この工業的に関連する放線菌において、解糖を介したフラックスが、ＤａｓＲの発現の増強または減少（または不活性化）によって簡単に制御され得るということを意味するので、本当に困難である。
【０１２７】
グルコサミン−６−ＰはＤａｓＲのエフェクターである
きわめて重要な質問は、なにがＤａｓＲを調節するエフェクター分子であるか、である。本明細書で示したように、ＤａｓＲに対する多くの標的が、Ｎ−アセチルグルコサミンの産出（キチン分解系）、輸送（ＰＴＳGlcNAc）、および代謝（フルクトース６−Ｐを介した解糖）に関する。本発明者らはしたがって、アミノ糖代謝周辺に引かれる中間体分子周辺の誘導因子を探した。ｄａｓＲのｎａｇＢおよびｃｒｒプロモーターの結合を干渉するための化合物の能力を試験する、結合干渉実験を設定した。これらの化合物は、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐ、グルコサミン−６−Ｐ、グルタミン酸、グルタミン、アセチル−ＣｏＡ、およびフルクトース６−Ｐであった。これらの結合干渉実験により、ｎａｇＢ（図１２）およびｃｒｒプロモーター領域（示していない）とのＤａｓＲの複合体の形成を防止した唯一の試験化合物であったので、誘導因子／エフェクター分子として、グルコサミン−６−Ｐが同定された。グルコサミン−６−ＰがＤａｓＲのエフェクターとして働くという発見が、（ＧｌｃＮＡｃ）ｎ細胞外分解、Ｎ−アセチルグルコサミン輸送および細胞内代謝、脂質および窒素代謝、解糖、およびペプチドグリカン合成間の代謝岐路でのその中心的位置によって説明される（図１３）。
【０１２８】
Ｎ−アセチルグルコサミンは、ＮａｇＥ２トランスポーターによって輸送される
Ｎ−アセチルグルコサミンに対する２つの潜在的トランスポーター、すなわち近接遺伝子ｎａｇＥ１（ＳＣＯ２９０６）およびｎａｇＥ２（ＳＣＯ２９０７）が、Ｓ．コエリカラーゲノム上で同定された。変異体を、全遺伝子をアパラマイシン耐性カセットａａｃＣ４で置換することによって、両方の遺伝子に対して作製した。二重変異体をまた産出した（ＢＡＰ６）。これを実施するために使用した方法は、先に記述された（Nothaftら、2003）ように、ｐＷＨＭ３を用いることによってであった。輸送遺伝子ｎａｇＥ１（ＢＡＰ４）、ｎａｇＥ２（ＢＡＰ５）、または両方（ＢＡＰ６）に関して欠損した変異体を、Ｎ−アセチルグルコサミン（１％ｗ／ｖ）の存在する状態またはしない状態で、Ｒ２ＹＥ寒天プレート上にプレートした。寒天プレート上の他の株として、Ｓ．コエリカラーＭ１４５（すべての変異体の親）、ｄａｓＲ変異体ＢＡＰ２９およびｐｔｓ変異体ｐｔｓＨ（ＢＡＰ１）、ｃｒｒ（ＢＡＰ２）、およびｐｔｓＩ（ＢＡＰ３）を使用した。ｐｔｓ変異体の表現系に関して、図３Ａ）を参照のこと。おもしろいことに、ｎａｇＥ２（またはｎａｇＥ２およびｎａｇＥ１）がない状態で、Ｎ−アセチルグルコサミンの添加が、発達に何らかの効果も持たず、一方で、ｎａｇＥ１変異体および親株Ｓ．コエリカラーＭ１４５が、増殖状態にて停止することになる。このことは、実際にｎａｇＥ２が、Ｎ−アセチルグルコサミンのトランスポーターであり、ＤａｓＲ制御系に対する誘導体分子の輸送にとって必須であることを証明した。
【０１２９】
明らかに、ＮａｇＥ２の活性に（正にまたは負に）影響を与えることが、ストレプトミセス細胞内へ導入された誘導因子分子の量に強い影響を持ち、したがって、ＤａｓＲ制御系に強く影響を与える。
【０１３０】
ＤａｓＲレギュロンのフルスケール
本発明者らは本発明書で、約２００の標的を記述している一方（表２）、正確な数字は、疑いもなくずっと大きく、たとえば、本発明者らは、擬陽性を避けるために、非常に制限されたｄｒｅ位置加重マトリックスを使用したが、本発明者らは、そのようにすることによって、多くの正確なｄｒｅ部位があいまいになったという証拠をもつ。さらに、本発明者らは、予想されたＤａｓＲ標的のリスト中、少なくとも８つの転写因子遺伝子を同定した。ＤａｓＲは、多くの検出／輸送要素、およびＧｌｕ−とＧｌｎ−ｔＲＮＡｓの発現を制御する。このことは、ＤａｓＲが、多様な環境の変化に受容的でありえ、たいがい転写レベルおよび翻訳レベル両方で、多くの他のレギュロンを支配することを示唆している。このＤａｓＲによる多重レベル制御を、表１３で要約している。
【０１３１】
レギュロンの絶対的サイズに加えて、広範囲活性調節物に対する必要条件はさらに、単独活性転写因子と呼応して働くべきであるということである（Morenoら、2001）。実際、ＤａｓＲは、ｃｈｉ−関連遺伝子を制御し、これはまたＣｈｉＳ／ＣｈｉＲ二要素系によって（Kormanecら、2000）、そして最近同定された第三の未知のＤＮＡ−結合タンパク質によって（Fujiiら、2005）調節され、このことはキチン分解系の多重−パートナー制御を示唆している。他の例は、ＰＴＳの調節における本発明者らの研究から発生し、そこで本発明者らは、ＤａｓＲに加えて、また、ＲＯＫ−ファミリー調節物をコードしている（Titgemeyerら、1994）、ＳＣＯ６００８が、ｐｔｓ遺伝子の活性化に必要であることを発見した。
【０１３２】
広く広がったＤａｓＲレギュロンは、新規スクリーニング手順のための標的である
おもしろいことに、ＤａｓＲ調節ネットワークが、Ｓ．アベルミチリス（S. avermitilis）およびＳ．スカビエス（S. scabies）にて非常に保存されており、Ｓ．コエリカラーにて予想されるｄｒｅ部位の７５％以上が、Ｓ．アベルミチリス中のオーソロガス遺伝子の上流でみられ、提示された予測のための、強力な系統発生議論を提供する。他の放線菌におけるｄａｓＲレギュロンの強力な保存がまた、ＤａｓＲは、このクラスの細菌中の天然産物と酵素に関する多くの遺伝子を制御し得ることも示している。ＤａｓＲレギュロンの保存が、ＤａｓＲタンパク質の高い保存によって強調される（図１４）。
【０１３３】
Ｓ．クラブリゲルス（S. clavuligerus）中のクラブラン酸産出の予想された制御を考慮して（表３）、本発明者らは、遺伝子の開始に関連するｎｔ位置で、Ｓ．コエリカラーｄａｓＲの−５０／−３０および＋９００／＋９２０領域とマッチするオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによって、ｄａｓＲ遺伝子をクローン化した。クローンを配列決定し、予想される遺伝子産物は、単一アミノ位置で異なり、すなわちＳ．クラブリゲルスＤａｓＲ中Ａｓｎ５５、およびＳ．コエリカラーＤａｓＲ中Ａｓｐ５５であった。これに基づいて、Ｓ．クラブリゲルス中のＤａｓＲ結合部位が、Ｓ．コエリカラー中のものと非常に類似していることが明らかである。相当する核酸およびアミノ酸配列を図１９にて開示している。
【０１３４】
驚くべきことに、本発明者らは最近、コア遺伝子クラスターｎａｇＡ−ｎａｇＢ−ｄａｓＲ（およびｄｒｅ要素）がまた、バチルス、ラクトコッカス、リステリアおよびストレプトコッカスを含む、低Ｇ＋Ｃグラム陽性間で広く広がっていることを発見した。バチルスのＤＮＡのＧ＋Ｃ含量（４３％）が、放線菌のもの（７２〜７３％）よりも約３０％低いけれども、組織が保存されているだけでなく、ｄｒｅ部位の配列も保存されている。バチルス サブチリスおよびバチルス ハロドゥランス（Bacillus halodurans）のｄｒｅ部位を表５にて要約しており、ストレプトコッカス種のものを表７で、ラクトコッカス ラクティスのものを表６で、そしてリステリア インノキュアおよびリステリア モノサイトジェネス（Listeria monocytogenes）のものを表８で要約している。これらの種におけるＤａｓＲ結合部位に関する由来コンセンサス配列が、図１５中、カートーン（cartoon）にて要約されている。
【０１３５】
このことから、本発明者らは、そのような分岐微生物中のそれらの存在が、ＤａｓＲ制御系が、少なくとも５０億年の進化で残っていることを意味するので、ＤａｓＲコアレギュロンが、非常に重要なコンセプトであると結論づけた。遺伝的改変による以外の外部からの、多くの工業的および医学的に関連する化合物（酵素、抗生物質、抗がん剤、農業化合物、および他の二次代謝物）の発現を制御可能にするので、ＤａｓＲの活性を操作するためのツールを発見することがしたがって、非常に重要である。これはたとえば、個々の株操作が選択肢ではないので、新規のスクリーニング戦略を設定するための必須条件である。誘導因子（とりわけ、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび誘導体）の添加が、広範囲の天然産物の発現を誘引し、または少なくとも増強し、これは、より簡単なスクリーニングを可能にする。明白な例は、封じられて、したがって活性に基づくスクリーニングアッセイによって同定不可能である、潜在性クラスターの制御である。本発明者らは、抗生物質生合成クラスターが、ＤａｓＲの活性の除去または減少によって活性化されることを示し、また本発明者らは、誘導体の添加が、これらのクラスターを軽減し、したがって新規のスクリーニング手順の可能性を押し上げることを予想している。
【０１３６】
ＡｃｔおよびＲｅｄ産出におけるＤａｓＲの効果の詳細な解析
以上で示したように、発達を可能にする培地（たとえばマンニトール−含有固体培地）上、ｄａｓＲ変異体が、着色抗生物質アクチノルホジン（Ａｃｔ）およびウンデシルプロジギオシン（Ｒｅｄ）の増強した産出を示した。ｄａｓＲ変異体中の抗生物質産出における相対的増加を、固体褐色培養液のスペント寒天（炭素供給源添加なしのＭＭ）中のＡｃｔおよびＲｅｄ濃度を決定することによって定量した。これらの条件下、Ｓ．コエリカラーが唯一寒天上で増殖し、ＤａｓＡ寒天ラーゼの誘導によって可能となる（Buttnerら、1987）。顕微鏡測定によって、ＡｃｔおよびＲｅｄ産出が、それぞれ３．２（±０．２）および３．９（±０．３）の因子（三回の独立した実験の平均）によって、ＢＡＰ２９中で一定に増強した。図４で示したように、ｄａｓＲ変異体による増強されたＡｃｔ産出のさらなる支持にて、Ｍ１４５およびＢＡＰ２９の細胞外画分の初期プロテオーム解析によって、アクチノルホジンの立体特異的ピラン環形成に関与する分泌タンパク質、ＳＣＯ５０７４によってコードされたｄａｓＲ変異体、すなわちＡｃｔＶＩ−ＯＲＦ３（HeskethおよびChater、2003;Ichinoseら、1999）、保存仮想細胞質タンパク質、ＳＣＯ５０７９の産物、ＡｃｔＶＡ−ＯＲＦ４（Caballeroら、1991）中で強力にアップレギュレートされたａｃｔクラスター中の遺伝子によってコードされた２つのタンパク質が同定された。
【０１３７】
本発明者らは、それぞれａｃｔおよびｒｅｄ遺伝子クラスターの転写活性化因子をコードしている、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４とｒｅｄＺの推定ｄｒｅ部位上流を観察した（ｄｒｅ部位に関して、表２を参照のこと）。ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４のｄｒｅ部位上流（転写開始部位に対してｎｔ位置−５９／−４４）が、プロモーターのカノニカル−３５〜−１０配列の間に正確に存在し、位置は、ＤａｓＲが、転写抑制因子として機能すべきであることを示唆している。ｒｅｄＺのｄｒｅ部位上流（転写開始部位に対してｎｔ位置−２０１／１８６）が、ｒｅｄＺプロモーターの−３５配列の５０ｂｐ上流周辺に存在する。
【０１３８】
精製Ｈｉｓ６−タグ化ＤａｓＲおよび二本鎖オリゴヌクレオチドプローブでの電気泳動移動ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡｓ）によって、ｒｅｄＺおよびａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４の予想ｄｒｅ部位への、そして陽性対照（ｃｒｒ−ｐｔｓＩのｄｒｅ部位）への直接結合が示され、一方で、ＤａｓＲはｄｒｅ要素への類似性を欠く、したがって陰性対照として使用した、ｃｒｒのシス活性要素に結合しなかったことが示された（図２１Ａ）。ＤａｓＲがｃｒｒ断片に結合した場合、遊離鋳型は見られなかったが、一方で、５０％以上のｒｅｄＺプローブが結合し、約１０％のみのａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４ ｄｒｅ部位が結合した。したがって、本発明者らは、それらの「統計学的強度」に相当する結合効果を持つ、予想ｄｒｅ部位へのＤａｓＲタンパク質の直接結合を確立した。
【０１３９】
ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４、ｒｅｄＺおよびｒｅｄＤの制御におけるＤａｓＲの役割をさらに、ＭＭマンニトール寒天プレート上、３０時間（植物増殖）、４２時間（気中増殖の開始）および７２時間（気中増殖および胞子）で増殖させた、親株（Ｍ１４５）およびｄａｓＲ変異体（ＢＡＰ２９）から回収したＲＮＡ試料上の、半定量的ＲＴ−ＰＣＴによって査定した。ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、ｄａｓＲ変異体中、すべての時間点で、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４の転写の強力な増強と、個別の、しかし有意に増強したｒｅｄＺの転写が明らかになった（図２１Ｂ）。明らかに、ＤａｓＲ−依存転写抑制の程度が、ＤＮＡ−タンパク質相互作用の強度に関するだけでなく、プロモーターコンセンサス配列に関するｄｒｅ部位の相対的な位置づけがまた、重要な因子でもある。先に、ｒｅｄＺの増強された発現によって、ｒｅｄＤ転写が誘導され、ｂｌｄＡ変異体中の抗生物質産出におけるブロックをバイパスしていることが示されている（Guthrieら、1998）。実際、ｒｅｄＺの増強した発現が、ｒｅｄ経路−特異的活性因子遺伝子ｒｅｄＤの発現の明らかな増強にて反映された。結論として、ｒｅｄクラスターの公知の活性因子遺伝子が、ＤａｓＲによって負に制御され、これは、ｄａｓＲ変異体中のＲｅｄの産出の増強を説明している。ａｃｔクラスターに対して、ＤａｓＲは、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４のプロモーター領域への結合に対する転写活性因子ＡｔｒＡ、およびそのインビボ活性の調節を介して、または遺伝子不活性化を介してのいずれかで、ＤａｓＲの不活性化と競合し、結果としてＡｃｔ産出の増強となる。
【０１４０】
Ｎ−アセチルグルコサミンが、抗生物質産出を開放するために、ＤａｓＲを標的とする、さらなる証拠
生理学的および化学的差違の開始に対する、環境の栄養状態の初期検出からのシグナル伝達カスケードが、以下の段階を少なくとも含むべきである。（１）細胞外シグナルの利用性および検出、（２）細胞内への「シグナル伝達栄養素」の輸送、（３）誘導体分子へのそれらの細胞内改変、（４）チェックポイントである、広範囲調節物へのその結合、（５）情報の、経路特異的活性因子へのシグナル伝達、および（６）発達および抗生物質産出へのスイッチ。本発明者らの実験によって、ＤａｓＲによって制御されるＧｌｃＮＡｃセンサーカスケードが、栄養素に対する直接の応答において、抗生物質産出を誘引する、広範囲の系であることが示唆される。段階は、（１）ＧｌｃＮＡｃの検出、（２）ＰＴＳGlcNAcを介した輸送、（３）ＮａｇＡによるグルコサミン−６−Ｐへの変換、（４）シグナル伝達物質のＤａｓＲへの結合、であり、したがってａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４およびｒｅｄＺにおけるその抑制活性を阻害し、アクチノルホジンおよびウンデシルプロジジオシンの生合成に対する経路を活性化する。
【０１４１】
ＤａｓＲレギュロンの新規に広がった特性から推定される制御経路からの論争で（図２２）、本発明者らは、ＤａｓＲ−依存輸送およびＰＴＳを介したＧｌｃＮＡｃのリン酸化が、Ｓ．コエリカラーにおけるアクチノルホジンおよびウンデシルプロジジオシン生合成を誘引するための決定的なシグナルでありうると予想した。この仮説を、ＧｌｃＮＡｃの存在する状態またはしない状態でのＭＭ寒天プレート上で、Ｓ．コエリカラーＭ５１０（ΔｒｅｄＤ）、Ｍ５１１（ΔａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４）、およびＭ５１２（ΔｒｅｄＤ、ΔａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４）をプレートすることによって試験した。それぞれの経路特異的活性因子の欠損の結果として、Ｓ．コエリカラーＭ５１０は、赤色着色ウンデシルプロジジオシンを産出不能であり、Ｍ５１１は青色着色アクチノルホジンを産出できず、一方で、Ｍ５１２はいずれの抗生物質も産出しない。これらの株によって、本発明者らは、それらの着色がｐＨ依存であり、生合成誘導体が、種々の色を示すので（Bystrykhら、1996、Ichinoseら、1999）、必要な対照である、それぞれの抗生物質を特異的にモニタ可能である。いずれの株も、単独炭素供給源として、寒天でのＭＭ上、５日間増殖させた場合、有意な量のアクチノルホジンまたはウンデシルプロジジオシンを産出しなかった。ＧｌｃＮＡｃ（１０ｍＭ）が存在する場合、ＡｃｔまたはＲｅｄの産出が、それぞれＳ．コエリカラーＭ５１０およびＭ５１１において誘導された（図２２）。着色抗生物質は、予想されたように、Ｍ５１２に関して観察されなかった（示していない）。したがって、飢餓条件下、ＡｃｔおよびＲｅｄの産出が、ＧｌｃＮＡｃのレベルの増加に対する応答で、そしてＤａｓＲの存在しない状態によっての両方で誘導される。
【０１４２】
薬物ディスカバリーのためのＧｌｃＮＡｃの適用
抗生物質産出のＧｌｃＮＡｃ−仲介制御が、放線菌において、より広く広がる現象であるのか。このことを査定するために、本発明者らは、指標株としてバチルス サブチリスを用いて、種々の放線菌の総抗細菌活性（殺菌および静菌）におけるＧｌｃＮＡｃの効果を評価した。試験した株を、ＧｌｃＮＡｃ（１％）の存在する状態または存在しない状態で、マンニトール（０．５％）を含む最少培地上にスポットした。おもしろいことに、抗生物質産出の増殖阻害ゾーン指標が、ストレプトミセス クラブリゲルス（セファマイシンの産出物）、（キロマイシンを産出する）ストレプトミセス コリヌス、ストレプトミセス グリセウス（ストレプトマイシン産出物）、（ヒグロマイシンを産出する）ストレプトミセス ヒグロスコピクス、（オキシテトラシクリンを産出する）ストレプト０マイセス リモサス、およびストレプトミセス ベネズエラ（クロラムフェニコール、メチマイシン）に関して、非常に大きかった（図２３）。Ｎ−アセチルグルコサミンは、ストレプトミセス アクリマイシニ、ストレプトミセス アベルミティリス、ストレプトミセス シンナモネンシス、ストレプトミセス リモサスおよびストレプトミセス リビダンスにおける、Ｂ．サブチリスに対する抗生活性に影響を与えたように見えなかった。興味深いことに、本発明者らは、ストレプトミセス ロセオスポルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｓｅｏｓｐｏｒｕｓ）にて抑制効果を観察した。これらの結果によって、ＧｌｃＮＡｃによる（そしてＤａｓＲを介した）抗生物質産出の救済が、放線菌中での共通の制御機構であることが示唆されている。
【０１４３】
ＤａｓＲが、放線菌における潜在性二次代謝物クラスターをサイレンスすることにおいて役割を果たすかどうかを査定するために、本発明者らは、今まで研究した唯一の潜在性クラスターである、仮想Ｉ型ポリケチド（ＳＣＯ６２７８−６２８８）に対する予想抗生物質生合成クラスターの発現レベルを解析した。この生合成経路の誘導は、経路特異的活性化因子、ＫａｓＯ（ＳＣＯ６２８０）に依存し、順に、γ−ブチロラクトン（ＳＣＢ１）結合タンパク質ＳｃｂＲによって抑制される（Takanoら、2005）。ｋａｓＯの抑制は、ＳＣＢ１の産出によって救済される。ｄａｓＲがないことによってこのクラスターの潜在的「覚醒」を試験するために、本発明者らは、ＭＭマンニトール寒天プレート上で、３０時間（植物増殖）、４２時間（気中増殖の開始）、および７２時間（気中増殖および胞子）増殖した、親株（Ｍ１４５）およびｄａｓ変異体（ＢＡＰ２９）から回収したＲＮＡ試料上で、半定量ＲＴ−ＰＣＲを実施した。おもしろいことに、ｋａｓＯ転写物が、ＢＡＰ２９の３０時間および７２時間ＲＮＡ試料中で検出されたが、任意の試料において、Ｍ１４５では見られなかった（図２４）。ｋａｓＯの誘導の結果としてたいがい、生合成クラスターの最後のＯＲＦであり、推定Ｉ型ポリケチドシンターゼをコードしている、ＳＣＯ６２７３の転写が、劇的に増加した（図２４）。ＳＣＯ６２７３の発現の増強が、栄養増殖間でのみ観察された。ｄｒｅ部位は、ｋａｓＯの推測上流に存在せず、ＤａｓＲとこの潜在性クラスター間のシス−トランス相互作用は、調査中である。
【０１４４】
細胞壁溶解の制御におけるＤａｓＲの関与
キチンは、ＧｌｃＮＡｃの保存の主要な形態であり、地球上で第二のもっとも豊富なポリマーであり、それ自体は土壌−住居細菌にとって非常に重要なものである。ＧｌｃＮＡｃは、富Ｎ−およびＣ−供給源であり、その代謝産物酢酸、アンモニアおよびフルクトース−６−Ｐが、主要な一次代謝経路の交差にて存在する。このことは、異なる型のキチン含有基質をコロニー化可能である選択的利点を強調する（Saitoら、2003、Schrempf、2001）。本発明者らの実験によって、ＧｌｃＮＡｃが反対のシグナル、すなわち栄養−富条件下、拡大（増殖および発達阻止）、および栄養が限定された条件下、増殖停止と続く発達（抗生物質産出、胞子形成）を提供可能である。ＧｌｃＮＡｃの２つの主要な供給源、キチンおよび細菌固有の細胞壁が存在し、これらは反対の応答を誘引し得る。細菌キチナーゼは主に、キト−オリゴサッカライド、およびキチンからのＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオース（ＧｌｃＮＡｃ）2を産出し、ＧｌｃＮＡｃはほとんど産出されない。また、ｄａｓＲ変異体は、親株と比べて、５倍低いキチン分解活性を持つが（Colsonら、2007）、抗生物質を過剰産出し、これはキチナーゼがシグナルを産出しないことを示唆している。「ＧｌｃＮＡｃ効果」が、より高い濃度（＞５ｍＭ）でのみ観察された。おそらく、たいがい天然の供給源が、細菌細胞壁の自己消化でありうる。多量のＧｌｃＮＡｃが、プログラムされた細胞溶解後、局所で蓄積することが発見され、一般的栄養制限が、栄養菌糸の消費にて、気中菌糸体の発達を必要とする時である（Miguelezら、2000）。本発明者らが、栄養検出、細胞壁溶解およびタンパク質分解および二次代謝（とりわけ抗生物質産出における）がすべてＤａｓＲの機能に連結していることを示しているので、抗生物質経路特異的活性因子とともに、ペプチドグリカン前駆体の異化に関与する遺伝子の単一レギュロン内で、非常に示唆的なクラスタリングが存在する。
【０１４５】
放線菌によって産出された多数の二次代謝物と、それらの産出を誘引する広範囲調節機構における相対的に制限された知識間の対比が、多くが、有機体それ自身から学習することによる、薬物ディスカバリーに関して得られることを暗示している。本発明者らは、抗生物質産出に対する栄養ストレスからのシグナル伝達カスケードを提案する。本発明者らの推定された経路が、ＧｌｃＮＡｃが放線菌に対する重要なシグナル分子として提案され、生息環境の栄養状態を決定可能である。ＰＴＳGlcNAcによって輸送されるシグナルが、グルコサミン−６−Ｐに代謝され、ＤａｓＲを不活性化し、順に抗生物質産出および栄養富条件下での発達の抑制に関連する。ＰＴＳGlcNAcに加えて、ＤａｓＲが、多くのよりＡＢＣ糖トランスポーターを制御し、種々のこれらの機能が現在調査中である。抗生物質産出が、ＤａｓＲ−仲介制御系を干渉することによって覚醒および／または増強可能であるという発見が、新規の天然産物のディスカバリーにて指向される、スクリーニングプログラムに対する新たな見通しをひらく。考えられる限りでは、数千の株の可能性を産出することは、ＧｌｃＮＡｃの添加によって促進され、本発明者らは、多くの場合で、ヒットおよびミス間の差を作り出すという強力な証拠を持っている。これは、（ＭＤＲ−およびＸＤＲ−マイコバクテリウム チューベルクローシス、メチシリン耐性スタフィロコッカス アウレウス（ＭＲＳＡ）、およびバンコマイシン耐性塩テロコッカス ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＶＲＥ）のような）再発性多剤耐性株によって引き起こされる感染性疾患、また特定のがんの処置のための薬物のディスカバリーにて目指されるスクリーニング手順の成功率を改善する。
【０１４６】
【０１４７】
【表１】
【０１４８】
【表２】
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
【表４】
【０１５１】
【表５】
【０１５２】
【表６】
【０１５３】
【表７】
【０１５４】
【表８】
【０１５５】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１Ａ】ＤａｓＲ結合部位の同定およびＤａｓＲレギュロンの予測を示す図である。ｃｒｒ−ｐｔｓＩ領域内のＤａｓＲ結合部位のＤＮａｓｅＩフットプリント法（ｃｒｒの開始点に対して−２０２／＋８のｎｔ位置）の結果を示す図である。ｃｒｒ−ｐｔｓＩプロ−ブをＤＮａｓｅＩ（０．４μ／ｍｌ）と一緒にインキュベートし、精製したＤａｓＲの量を増加させた（レーン２〜７中、それぞれ０、１０、２０、４０、６０、または８０ｐｍｏｌのＤａｓＲ）。追加対照群：レーン１はＤａｓＲ含有、ＤＮａｓｅＩ非含有のプローブである。レーン８は、ＤＮａｓｅＩおよび非特異的なタンパク質（ＢＳＡ）３５０ｐｍｏｌ有りのプローブである。ＡＣＧＴは、ＤＮＡ配列レーンである。ｃｒｒ−ｐｔｓＩプローブのＤＮＡ配列はＤａｓＲ保護配列（“フットプリント”と示した）を表す。ＤａｓＲコンセンサス（標的部位の下）に一致する配列を黒で強調し、ｃｒｒ翻訳開始コドンをグレーで強調した。
【図１Ｂ】ＤａｓＲ結合部位の同定およびＤａｓＲレギュロンの予測を示す図である。ＤａｓＲによって制御されていることが示された、および／または予測される遺伝子の分類および数を示す円グラフである。
【図２Ａ】成長および抗生物質産生に対するｄａｓＲの効果を示す図である。Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５およびそのｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９による、ＧｌｃＮＡｃを含む、または含まない最小寒天プレートにおける抗生物質産生を示す図である。ＧｌｃＮＡｃの存在は、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５への色素性抗生物質アクチノロージンおよびウンデシルプロジギオシンの誘導に必要であるが、一方、発現はｄａｓＲ変異株で構成的である。後者は、（ｉ）ＡｃｔＶ４Ａは変異株において増大される（図４）、および（ii）アクチノロージン産生のための経路特異的活性遺伝子ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４、およびウンデシルプロジギオシン産生のための経路特異的活性遺伝子ｒｅｄＺのＤａｓＲ結合ｄｒｅ上流の同定という、本発明者らの発見に一致する。予想外に、ＧＩｃＮＡｃを含む最小培地で成長したｄａｓＲ変異株は今までのところ未同定である緑色色素の発現を示している。
【図２Ｂ】成長および抗生物質産生に対するｄａｓＲの効果を示す図である。ＤａｓＲの過剰発現は成長停止を引き起こす。左は、対照プラスミドｐＵＷＬ−ＫＳを有するＳ．コエリカラー（S. colicolor）Ｍ１４５である。右は、過剰発現したｄａｓＲプラスミドを有する同株である（３００℃で４日間培養した）。ＤａｓＲ過剰発現株では気菌糸がほとんど欠如している（白色）ことに注意されたい。
【図２Ｃ】成長および抗生物質産生に対するｄａｓＲの効果を示す図である。Ｓ．コエリカラー（S. colicolor）Ｍ１４５およびｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９の、気菌糸および胞子の走査電子顕微鏡写真である。書き込みの見出しはＤａｓＲ変異株の異常な胞子を示す。棒線は５μｍを示す。
【図２Ｄ】成長および抗生物質産生に対するｄａｓＲの効果を示す図である。左は、Ｍ１４５の透過電子顕微鏡写真、右はＢＡＰ２９の透過電子顕微鏡写真である。矢印は細胞壁と細胞膜との間の空隙を示す。ＦＤは完全分離を示し、ＩＤは不完全分離を示す。
【図３Ａ】ＰＴＳによる成長制御を示す図である。正確な成長にはＰＴＳ系が不可欠である。菌株をＳＦＭまたはＲ２ＹＥ寒天プレート上で５日間培養した。ＳＦＭ上では、ｃｒｒ変異株ＢＡＰ２は白色の気中菌糸体を産生したが、それらの条件下では胞子を産生することはできなかった。一方、ｐｔｓＨが欠失（ＢＡＰ１）またはｐｔｓＩが欠失（ＢＡＰ３）していると、グレーに着色された胞子が多少産生された。興味深いことに、Ｒ２ＹＥ寒天プレート上では、３種のＰＴＳ変異株全てにおいて成長停止が見られた（いわゆる、ｂａｌｄまたｂｌｄ表現型）。
【図３Ｂ】ＰＴＳによる成長制御を示す図である。ＰＴＳによりｗｈｉＧの転写が制御されることを示す図である。本図は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって得られた増幅産物含有の１％寒天・ゲルを示す。野生株およびＰＴＳ変異株ＢＡＰ１（ΔＨＰｒ）、ＢＡＰ２（ΔＩＩＡcrr）、およびＢＡＰ３（ΔＥＩ）の対数増殖した菌糸体から全ｍＲＮＡを調製した。本図では、ホスホトランスフェラーゼＩＩＡcrrおよびＥＩ欠乏菌株においてｗｈｉＧ−ｍＲＮＡ濃度が減少したことが示されている。結果は、指数増殖期中の異なる時点で採取した菌糸体により、３連で再現された。標準対照として１６Ｓ ｒＲＮＡを検出した。
【図３Ｃ】ＰＴＳによる成長制御を示す図である。ＨＰｒによる、ＷｈｉＧの翻訳後修飾の制御を示す図である。Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５（ｗｔ）、およびそのｐｔｓ変異株（それぞれ、Ｈｐｒキナーゼ、酵素ＩＩＡ（Ｃｒｒ）または酵素Ｉの遺伝子が欠損している）由来の全抽出タンパク質について二次元ゲル電気泳動を行った。ＷｈｉＧタンパク質の周りの領域をクローズアップして示す。予想されたように、非常に低下した転写（３Ｂ）の結果として、酵素ＩＩＡおよび酵素Ｉが欠乏している変異株におけるＷｈｉＧタンパク質濃度が非常に低い。意外にも、ＷｈｉＧと比べ分子量は小さいが同じ等電点を有するいくつかのバンドが、ＨＰｒ変異株では見られず、このことはＷｈｉＧの翻訳後修飾におけるＨＰｒの関与を強く示している。修飾の正確な性質は不明であるが、影響が質量に対してのみで、ｐＩには影響しないことを考えると、本発明者らは、このことはＷｈｉＧ前タンパク質の加工に起因すると考える。
【図４Ａ】プロテオーム解析によるＤａｓＲ標的の同定を示す図である。強度がＤａｓＲに依存するタンパク質スポットのクローズアップ図である（２倍より大きい）。矢印は、質量分析によって同定されたタンパク質スポットを強調している。１、ＴｈｉＬ（ＳＣＯ５３９９）、アセトアセチル−ＣｏＡ チオラーゼ；２、ＧｄｈＡ（ＳＣＯ４６８３）、グルタミン酸脱水素酵素；３、ＳＣＯ５５２０、Δ−１−ピロリン−５−カルボン酸デヒドロゲナーゼ；４、ＡｃｔＶ−Ａ４（ＳＣＯ５０７９）、アクチノロージン生合成経路の一員（機能不明）；５、ＭｓｉＫ（ＳＣＯ４２４０）、多糖取り込みタンパク質；６、Ｇｐｓｌ（ＳＣＯ５７３７）、グアノシン５リン酸シンテターゼ；７、ＳＣＯ４３６６、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ；８、ＮａｇＡ（ＳＣＯ４２８４）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸脱アセチル化酵素；９、ＧａｌＴ（ＳＣＯ３１３８）、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ。タンパク質：ＴｈｉＬ（ＳＣＯ５３９９）、アセトアセチル−ＣｏＡ チオラーゼ；ＧｄｈＡ（ＳＣＯ４６８３）、グルタミン酸脱水素酵素；ＳＣＯ５５２０、Δ−１−ピロリン−５−カルボン酸デヒドロゲナーゼ；ＭｓｉＫ（ＳＣＯ４２４０）、多糖取り込みタンパク質；Ｇｐｓｌ（ＳＣＯ５７３７）、グアノシン５リン酸シンテターゼ；ＳＣＯ４３６６、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ；ＮａｇＡ（ＳＣＯ４２８４）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸脱アセチル化酵素；９、ＧａｌＴ（ＳＣＯ３１３８）、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ。
【図４Ｂ】プロテオーム解析によるＤａｓＲ標的の同定を示す図である。Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor） Ｍ１４５およびそのｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９の液体培養の使用済み培地から分離した分泌タンパク質を示す一次元のＰＡＧＥゲルの図である。Ｍは分子サイズ標識（ｎｋＤａ）を示す。ＳＣＯ５０７４として同定されＡｃｔＶＩ−ＯＲＦ３としても知られる単一タンパク質がｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９において強く過剰発現していることに注意されたい。
【図５】Ｎ−アセチルグルコサミン関連の酵素反応およびグルコサミン−６−Ｐの中心位置の略図である。ＤａｓＲ標的の同定が示されている。矢印は、ｄａｓＲ変異株における促進（太い矢印）または阻害（細い矢印）を示す。細胞外キチンは加水分解されて一度細胞内に組み込まれると、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に転換され、それは次いでＮａｇＫによりＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐにリン酸化される。ＮａｇＡはＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐを脱アセチル化してＧｌｃＮ−６−Ｐにする。ＧｌｃＮ−６−Ｐは、窒素代謝、ＴＣＡ回路、ペプチドグリカン前駆体合成、およびＮａｇＢを介した解糖（ＧｌｃＮ−６−Ｐからフルクト−ス−６−リン酸（Ｆｒｕ−６−Ｐ）への転換）の間の中心位置を占める。本略図は、グルコサミン−６−Ｐ、ＤａｓＲレギュロンのエフェクター分子の中心位置を強調している。大きい縦の矢印は、ｄａｓＲに制御される、細胞外（多）糖類から解糖およびＴＣＡ回路に向かう流れを強調している。関係する経路はＫＥＧＧデータベースで検索することができる。（http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html）。
【図６Ａ】ＤａｓＲがキチン関連遺伝子を活性化することを示す図である。さまざまな炭素供給源が補充される最小培地で４８時間培養した後の、ＢＡＰ２９、Ｍ１４５間の広範囲のキナーゼ、細胞外および細胞内６−Ｎ−アセチルグルコサミダーゼ活性の比較を示す図である。活性は、誘導条件下での親株Ｍ１４５に対する百分率（％）で表されている。
【図６Ｂ】ＤａｓＲがキチン関連遺伝子を活性化することを示す図である。ｃｈｉＩ、ｃｈｉＦ、およびＳＣＯ６３００に対するＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。
【図７】ＤａｓＲが主な多糖類分解系の発現を制御することを示す図である。酵素活性を、特異的な分解活性に起因するコロニーの周りにできる透明帯の大きさとして測定した。左がＭ１４５、右がｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９の結果である。一番上は、キシラナーゼ活性測定、真ん中はマンナナーゼ活性測定、一番下は、α−アミラーゼ活性測定の結果である。ＣＣＲはグルコースによって誘導される炭素カタボライト抑制、ＳＩはキシラン（一番上）、マンナン（真中）、およびデンプン（一番下）によって誘導される基質誘導を表す。ｄａｓＲ欠損下ではキシラナーゼ発現が誘導されないが、一方マンナナーゼおよびα−アミラーゼ活性は過剰発現することに注意されたい。ＣＣＲ条件下においては、全ての系でグルコース抑制の促進が見られる。
【図８Ａ】ＤａｓＲがＮ−アセチルグルコサミンレギュロン遺伝子を抑制することを示す図である。ＧｌｃＮＡｃの取り込みに対するｄａｓＲ欠失の影響を示す図である。左は、グリセロール培養培地における取り込み、右は、グリセロールおよび誘導物質（ＧｌｃＮＡｃ）培養培地における取り込みを示す。発現はＢＡＰ２９において構成的であることに注意されたい。
【図８Ｂ】ＤａｓＲがＮ−アセチルグルコサミンレギュロン遺伝子を抑制することを示す図である。ＨＰｒ（上）およびＩＩＡCrr（下）のウェスタンブロットを示す図であり、これらのＰＴＳタンパク質の誘導性はＤａｓＲにより制御されることが示されている。
【図８Ｃ】ＤａｓＲがＮ−アセチルグルコサミンレギュロン遺伝子を抑制することを示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲによるｃｒｒ（ＩＩＡCrrに対する）、ｎａｇＥ２（ＩＩＣGlcNAcに対する）、ｍａｌＸ２（ＩＩＢGlcNAcに対する）、ｎａｇＢ、およびｃｈｉＦの転写解析を示す図である。対照として１６Ｓ ｒＲＮＡを用いた。
【図９】ＤａｓＲと種々の標的遺伝子とのシス／トランス相関を示す図である。電気泳動ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により、コンピュータで予測されたＤａｓＲの標的への結合が実証されることが示されている。上は、１０ｎＭの蛍光プローブを用いて行った、１００倍の過剰非特異的ＤＮＡの存在下で精製ＤａｓＲ無し（上部のプロット）および精製ＤａｓＲ有り（３μＭ、下部のプロット）での、ＥＭＳＡの結果、下は、体積１０μｌ、１０ｐｍｏｌのｄｒｅ−含有ＤＮＡ、１００倍の過剰非特異的ＤＮＡの条件下で、４μｇの精製ＤａｓＲ無し（−）または有り（＋）で実施したＥＭＳＡの結果を示す。ＤａｓＲ−ｄｒｅ複合体は１×ＴＡＥ緩衝液中の１％寒天ロース・ゲル上で分解した。ｄｒｅ部位を示すが、ここでＰXlnAおよびＰcrpは負の制御として機能し、Ｐcrrは正の制御として機能する。
【図１０】ＤｐｐＡ活性測定の結果を示す図である。Ｓ．コエリカラー（S.coelicolor） Ｍ１４５およびＢＡＰ２９（ΔｄａｓＲ）によるＤｐｐＡ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａアミノペプチダ−ゼ）産生を、ＤｐｐＡの細胞内活性として測定した。培養物を、さまざまな（組み合わせの）炭素源、すなわちグリセロ−ル、グリセロ−ル＋Ｎ−アセチルグルコサミン、キチン、またはグルコ−ス＋キチンを含有する液体ＮＭ培地で２４時間培養した。
【図１１】ストレプトミセス コエリカラーにおける抗生物質産生に対する糖類の影響およびＤａｓＲの影響を示す図である。Ａｃｔはアクチノロ−ジン（青色色素）、Ｒｅｄはウンデシルプロジギオシン（赤色色素）、ｇｒｅｅｎは未知の新規化合物を示す。Ｄｅｕは培養物の成長段階を表す（ｂａｌはｂａｌｄ／栄養表現型、ｗｈｉは白色／気菌糸、ｓｐｏは胞子形成を示す）。
【図１２】ＤａｓＲによるＤＮＡ結合がグルコサミン−６−Ｐによって阻害されることを示す図である。本図は、ｎａｇＢプロモーターに結合するＤａｓＲのＥＭＳＡの結果を示す。１０ｎＭの蛍光プローブ、３μＭの精製ＤａｓＲ、および５００倍の過剰非特異的ＤＮＡを用いてＥＭＳＡを行った。プロット１は、ｎａｇＢプロモーター（ＤａｓＲは加えず）についての制御実験、プロット２〜５は、ＤａｓＲおよび５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、および２００ｍＭのＧｌｃＮＡｃ（左側のパネル、影響は見られず）、ならびにＧｌｃＮ−６−Ｐ（右側のパネル、ｄｒｅ部位からＤａｓＲが放出）が存在する場合のｎａｇＢプロモーターについての制御実験を示す。
【図１３】ＤａｓＲによる炭素源利用の包括的制御モデルである。本モデルは、土壌中の豊富な多糖類性の炭素源（セルロース、キシラン、キチンなど）が、細胞外加水分解酵素によって分解されて各々の単糖および二糖になることを例証している。Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）はＰＴＳによって、ＰＥＰ→酵素Ｉ（ＥＩ、ｐｔｓｌによってコードされている）→ＨＰｒ（ｐｔｓＨ）→ＥＩＩＡCrr（ｃｒｒ）と移され、次々にＧｌｃＮＡｃ特異的なパーミアーゼＥＩＩＢＣのＥＩＩＢタンパク質をリン酸化する、順次的なホスホリル基を経て運ばれる。ＤａｓＲは、ＰＴＳＧｌｃＮＡｃの全ての遺伝子のレプレッサーとして機能する。他の分解産物は、２つの糖特異的な膜タンパク質、特異的な、細胞外かつ脂質支持された糖結合タンパク質で構成されるＡＢＣ−パーミアーゼによって運ばれる。これらのＡＢＣ系（４０を上回ると予測される）は、ＤａｓＲによって調節される普遍的なＡＴＰａｓｅ ＭｓｉＫ（多糖取り込みタンパク質）により補助される。代謝酵素ＮａｇＡおよびＮａｇＢ（両遺伝子ともＤａｓＲにより制御される）は、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐ（ＧｌｃＮ−６−Ｐ）およびフルクトース−６−Ｐに変換させる。ＧｌｃＮ−６−ＰはＤａｓＲに対するエフェクターとして供給され、したがってｐｔｓ遺伝子およびｍｓｉＫの遺伝子発現を引き起こす。ｎａｇＢ、およびｄｐｐＡオペロン（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａアミノペプチダーゼ）に対するＤａｓＲ媒介制御は、細胞壁合成の調節におけるその役割を示唆する。ｓｈは糖加水分解遺伝子、ｓｒは、ＡＢＣパーミアーゼおよび関連する細胞外の糖加水分解酵素をコードするオペロンの特異的な調節因子に対する遺伝子を示す。架空のクロモソーム上の黄色の円および赤色の囲みは、それぞれＤａｓＲ応答配列、および糖特異的な調節因子応答配列を示す。
【図１４Ａ】グラム陽性細菌由来のＤａｓＲ相同体の配列を示す図である。放線菌類由来のＤａｓＲ相同体を示す図である。重層に含まれる相同体は下記由来のタンパク質である。Ｓｃｏｅｌ、ストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）（ＳＣＯ５２３１）；Ｓｃｌａｖ、ストレプトミセス クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）；Ｓａｖｅｒ、ストレプトミセス アヴェルミティリス（Streptomyces avermitilis）（ＳＡＶ３０２３）；Ｓｇｒｉｓ、ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）（ＢＡＢ７９２９６）；Ｓｓｃａｂ、ストレプトミセス スカビエス（Streptomyces scabies）；Ｓ１３９、ストレプトミセス種（Streptomyces species）１３９（ＡＡＮ０４２２８）；Ｔｆｕｓｃ、サーモビフィド フスカ（Thermobifido fusca）（ＡＡＺ５４５９２）。
【図１４Ｂ】グラム陽性細菌由来のＤａｓＲ相同体の配列を示す図である。高Ｇ＋Ｃおよび低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌由来のＤａｓＲ様タンパク質の比較を示す図である。興味深いことに、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）ＤａｓＲはバチルス サブチリス（Bacillus subtilis）ＧｎｔＲ型タンパク質ＣＡＢ１５５０８と約４０％同一である。追加のタンパク質は下記由来のものである。Ｃｅｆｆｉ、コリネバクテリウム エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）（ＢＡＣ１９１３１）；Ｌｍｏｎｏ、リステリア モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）（ＡＡＴ０３７５６）；Ｓｔｈｅｒ、ストレプトコッカス サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（ＡＡＶ６２４７５）；Ｂｓｕｂｔ、バチルス サブチリス（ＣＡＢ１５５０８）。第２のＤａｓＲ相同体（指定ＤａｓＲ２）がストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）（ＳＣＯ０５３０）に見られたので累積に含めた。唯一の既知標的はＡＢＣトランスポーターオペロンＳＣＯ５３１−５３２−５３３のすぐ上流に位置している。
【図１４Ｃ】グラム陽性細菌由来のＤａｓＲ相同体の配列を示す図である。遺伝子ＳＣＯ５２３１−５２３５間、およびＳＣＯ５３０−５３４間の類似性は、遺伝子重複事象を強く示唆している。
【図１５】ストレプトミセス（Streptomyces）、バチルス（Bacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、リステリア（Listeria）およびストレプトコッカス（Streptococcus）由来のコンセンサス配列を示す図である。本図は、Ｌｏｇｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Crooksら、2004）を用いて作成した。それぞれの生物中の全予測ＤａｓＲ結合部位のヌクレオチドについて、大きい文字は高度の保存を示し、小さい文字は低度の保存を示す。これらの予測の為に、本発明者らはＳ．コエリカラー（S. coelicolor）由来のコンセンサスＤａｓＲ結合配列を用いて、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌中のｐｔｓおよびｎａｇ遺伝子上流の相同配列を探索した。次いで、得られたコンセンサス配列を用いてストレプトミセス、バチルス、ラクトコッカス、リステリアおよびストレプトコッカスに存在する推定ＤａｓＲ結合部位の新規鋳型を構築した。
【図１６】ストレプトミセス コエリカラーＭ１４５およびそのｄａｓＲ変異株の液体培養ＴＳＢ培地における形態および分岐を示す図である。ストレプトミセス コエリカラーＭ１４５（上の写真）が典型的な偶発的分岐を示しているのに対し、ｄａｓＲ遺伝子が欠失していると分岐が非常に増加する結果となる（下の写真）。このことは、ｄａｓＲの発現レベルを変更することによって、形態の制御に重要であり、故に大規模な発酵における成長の具合を改良するための手段である分岐頻度を測定することができることを示唆している。棒線＝１０μｍ。
【図１７】サーモビフィド フスカ（Thermobifido fusca）における、ＤａｓＲによる解糖および関連経路の完全制御を示す図である。オキサロ酢酸までの解糖および関連経路のほとんど全ての段階がＤａｓＲによって直接制御されていることが予測される。それぞれの遺伝子についてのデータベース参照番号を示す。解糖のすべての単一段階がＤａｓＲ依存的であることが予測されることに注意されたい。
【図１８】Ｎ−アセチルグルコサミンがＮａｇＥ２２（ＳＣＯ２９０７）によって輸送されることを示す図である。輸送遺伝子ｎａｇＥ１（ＳＣＯ２９０６）、ｎａｇＥ２（ＳＣＯ２９０７）、または両者を欠失した変異株を、Ｎ−アセチルグルコサミン（１％ｗ／ｖ）含有、または非含有のＲ２ＹＥ寒天プレート上で平板培養した。寒天プレート上の他の菌株は、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５（全ての変異株の親株）、ｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９、ならびにｐｔｓ変異株ｐｔｓＨ（ＢＡＰ１）、ｃｒｒ（ＢＡＰ２）、およびｐｔｓＩ（ＢＡＰ３）である。ｐｔｓ変異株の表現型については、図３Ａも参照されたい。面白いことに、ｎａｇＥ２（またはｎａｇＥ２とｎａｇＥ１）が欠如していると、Ｎ−アセチルグルコサミンを加えても成長に影響を及ぼさないが、一方ｎａｇＥ１変異株および親株のＳ．コエリカラー（S. coelicolor ）Ｍ１４５では増殖状態が停止する。このことは、実際にｎａｇＥ２がＮ−アセチルグルコサミンのトランスポーターであり、ＤａｓＲ制御系の誘導因子を取り込むために必須であることを証明している。
【図１９Ａ】Ｓ．クラブリゲルス（S. clavuligerus）ｄａｓＲ／ＤａｒＲの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。ｄａｓＲの核酸配列を示す図である。
【図１９Ｂ】Ｓ．クラブリゲルス（S. clavuligerus）ｄａｓＲ／ＤａｒＲの核酸配列およびアミノ酸配列を示す図である。ＤａｓＲのアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】さまざまなストレプトミセス種から得たＤａｓＲのヘリックス−ターン−ヘリックスＤＮＡ結合モチーフに対応するタンパク質配列のアラインメントを示す図である。ＳａｍｂｏはＳ．アムボファシエンス（S. ambofaciens）、ＳａｖｅｒはＳ．アベルミチリス（S. avermitilis）、ＳｃｉｎｎはＳ．シンナモネウス（S. cinnamoneus）、ＳｃｏｅｌはＳ．コエリカラー（S. coelicolor）、ＳｃｏｌｌはＳ．コリヌス（S. collinus）、ＳｄｉａｓはＳ．ジアスタトクロモゲネス（S. diastatochromogenes）、ＳｇｒａｎはＳ．グラナチカラー（S. granaticolor）、ＳｇｏｌｄはＳ．ゴールデニエンシス（S. goldeniensis）、ＳｇｒｉｓはＳ．グリセウス（S. griseus）、ＳｌｉｍｏはＳ．リモサス（S. limosus）、ＳｖｅｎｅはＳ．ベネズエラ（S. venezuelae）を示す。アミノ酸番号は、Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）ＤａｓＲ（ＳＣＯ５２３１）のアミノ酸配列に対応している。配列上部の記号ＨＴＨは、ヘリックス−ターン−ヘリックスＤＮＡ結合のサインを示す。
【図２１Ａ】ＤａｓＲがＡｃｔおよびＲｅｄ経路特異的活性化因子の発現を抑制することを示す図である。電気泳動移動度シフトアッセイにより、ＤａｓＲがａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４およびｒｅｄＺの予測上流のｄｒｅ部位と相互作用することが示されている。ｃｒｒ−ｐｔｓＩオペロン（ＰＴＳの酵素ＥＩＩＡおよび酵素ＥＩをコードしている）、ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４、およびｒｅｄＺの上流に発見されたｄｒｅ部位を包括するＤＮＡプローブを、Ｈｉｓ標識した精製ＤａｓＲの存在下（＋）または非存在下（−）でインキュベートした。実験的に確認されたｃｒｒ−ｐｙｓＩオペロン（Rigaliら、2004）の上流のｄｒｅ部位、およびＳ．コエリカラー（S. coelicolor）のｃｒｐの予測シス作用因子（Derouauxら、2004）をそれぞれ陽性対照、陰性対照として用いた。
【図２１Ｂ】ＤａｓＲがＡｃｔおよびＲｅｄ経路特異的活性化因子の発現を抑制することを示す図である。ＡｃｔおよびＲｅｄ経路特異的活性化因子の、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによる転写解析の結果を示す図である。ＤａｓＲはａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４およびｒｅｄＺの転写発現を直接的に抑制している。試料は、ＭＭマンニトール寒天プレート上で培養したＳ．コエリカラー（S. coelicolor）Ｍ１４５およびｄａｓＲ変異株から、３０時間後（栄養増殖）、４２時間後（気中増殖）の開始）、７２時間後（気中増殖および胞子）に採取した。ｖは栄養菌糸、ａは気菌糸、ｓは胞子を示す。
【図２２】Ｓ．コエリカラー（S. coelicolor）におけるアクチノロージンおよびウンデシルプロジギオシン産生に関するＮ−アセチルグルコサミン依存性情報伝達カスケードを示す図である。Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）は細胞質に入り、続いて、細胞内の一般ＰＴＳタンパク質ＥＩ、ＨＰｒ、およびＥＩＩＡ、ならびにＧｌｃＮＡｃ特異的なＥＩＩＢおよびＥＩＩＣ組成物で構成されるＧｌｃＮＡｃ特異的なホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系を経由してリン酸化される。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ）はさらにＮａｇＡ、ＧｌｃＮ−６Ｐ脱アセチル化酵素によって脱アセチル化される。結果生じたグルコサミン−６−リン酸（ＧｌｃＮ−６Ｐ）は、ＤａｓＲのＤＮＡ結合能を阻害し、その結果、それぞれアクチノロージンおよびウンデシルプロジギオシン生合成群の経路特異的な転写活性化因子をコードしているａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４およびｒｅｄＺの転写抑制を低下させることができるＤａｓＲのアロステリックエフェクターとして知られている。推定される抗生物質の生合成情報伝達カスケードの支持のもと、ＧｌｃＮＡｃはＳ．コエリカラー（S. coelicolor）のそれぞれΔｒｅｄＤ（Ｍ５１０）およびΔａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４（Ｍ５１１）変異株におけるＡｃｔおよびＲｅｄ産生を引き起こす。
【図２３】放線菌類の間でのＧｌｃＮＡｃ依存性の抗生物質誘導経路の保存を示す図である。放線菌を０．５％マンニトール単独含有（左側のパネル）、または１％ＧｌｃＮＡｃを加えた（右側のパネル）ＭＭ寒天プレート上で培養し、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）を含有するオーバーレイを当てて、抗生物質産生によって引き起こされる増殖阻害を可視できるようにした。試験した放線菌は、ストレプトミセス リビダンス（Streptomyces lividans）１３２６（１３２６）、ストレプトミセス ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）（ｈｙｇｒｏ）、ストレプトミセス コリヌス（Streptomyces collinus）（ｃｏｌｌｉ）、ストレプトミセス ロセオスポルス（Streptomyces roseosporus）（ｒｏｓｅｏ）、ストレプトミセス シンナモネシス（Streptomyces cinnamonensis）（ｃｉｎｎａ）、ストレプトミセス ベネズエラ（Streptomyces venezuelae）（ｖｅｎｅｚ）、ストレプトミセス クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）（ｃｌａｖｕ）、ストレプトミセス リモサス（Streptomyces rimosus）（ｒｉｍｏｓ）、ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseus）（ｇｒｉｓｅ）、ストレプトミセス アクリミシニ（Streptomyces acrimycini）（ａｃｒｉｍ）、ストレプトミセス リモサス（Streptomyces limosus）（ｌｉｍｏｓ）、およびストレプトミセス アベルミチリス（Streptomyces avermitilis）（ａｖｅｒｍ）である。正確な学名は、物質と方法の項を参照されたい。
【図２４】ＤａｓＲがＩ型ポリケチド「潜在性」群の発現を抑制することを示す図である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＳ．コエリカラー（S. coelicolor）（ＳＣＯ６２７３〜ＳＣＯ６２８８）の潜在性Ｉ型ポリケチド群の転写分析の結果を示す図である。ｄａｓＲの不活性化により、栄養増殖中に、潜在性経路特異的な活性化遺伝子、ｋａｓＯ（ＳＣＯ６２８０）の転写「覚醒」が起こり、続いて推定Ｉ型ポリケチドシンターゼをコードしているＳＣＯ６２７３の転写が促進される。試料は、ＭＭマンニトール寒天プレート上で培養したＳ．コエリカラー（S. coelicolor） Ｍ１４５およびｄａｓＲ変異株ＢＡＰ２９から、３０時間後（栄養増殖）、４２時間後（気中増殖の開始）、７２時間後（気中増殖および胞子）に採取した。ｖは栄養菌糸、ａは気菌糸、ｓは胞子を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物に、目的遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、またはその産物が該目的遺伝子の発現に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能である化合物を提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む前記微生物における、目的遺伝子の発現を調節するための方法。
【請求項２】
前記化合物が遺伝的化合物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、ＤａｓＲ−調節工程の誘導因子である請求項１記載の方法。
【請求項４】
その産物が代謝経路の一部である遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を制御することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物における代謝を制御するための方法。
【請求項５】
前記ＤａｓＲ−結合部位への前記ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を、前記微生物に提供することを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が遺伝的化合物である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、ＤａｓＲ−調節代謝工程の誘導因子である請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記産物の存在が、前記微生物における、解糖へ、または解糖からの代謝フラックスを制御する請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記産物の存在が、前記微生物における、クエン酸（ＴＣＡ）回路へ、またはクエン酸回路からの代謝フラックスを制御する請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
目的産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または該目的産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位への、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を、前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物において目的産物の発現を得るための方法。
【請求項１１】
前記ＤａｓＲ−様タンパク質の前記ＤａｓＲ−結合部位への結合が、前記微生物に前記化合物を提供することによって、少なくとも部分的に阻害される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤａｓＲ−様タンパク質の前記ＤａｓＲ−結合部位の結合が、前記微生物に前記化合物を提供することよって、少なくとも部分的に増加する請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が遺伝的化合物である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、ＤａｓＲ−調節工程の誘導物である請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記誘導物が、グルコサミン−６−リン酸またはその機能的等価物または機能的断片である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記目的産物が、二次的代謝物である請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記目的産物が抗生物質、潜在性遺伝子クラスターからの産物、抗腫瘍薬剤または農業化合物である請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記目的産物が酵素である請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素が、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、モノキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、または糖イソメラーゼである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
不要産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または不要産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を、微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む前記微生物中の不要産物の産出を少なくとも部分的に減少させるための方法。
【請求項２１】
前記化合物が、前記ＤａｓＲ−様タンパク質と前記ＤａｓＲ−結合部位間の結合を少なくとも部分的に増加させることが可能である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物が、前記ＤａｓＲ−様タンパク質と前記ＤａｓＲ−結合部位間の結合を少なくとも部分的に減少させることが可能である請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合が、前記不要産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結した、または前記不要産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結した、増加量のＤａｓＲ−結合部位を前記微生物に提供することによって、少なくとも部分的に増加する請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２４】
ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合が、本来前記不要産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結した、または前記不要産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結した、前記微生物中の少なくとも１つのＤａｓＲ結合部位を取り除くことによって、少なくとも部分的に減少する請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２５】
前記不要産物が、不要副産物または不要シャント産物である請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、前記微生物に、不要産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結した、または不要産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結した、ＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を提供することを含む請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸を前記微生物に提供することを含む請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤａｓＲ−様タンパク質が、異種である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記微生物が、糸状体微生物である請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記糸状体微生物が、子嚢菌、バシド菌または放線菌である請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記放線菌が、ストレプトミセス（Streptomyces）、ノカルディア（Nocardia）、サーモビフィド（Thermobifido）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、プラノビスポラ（Planobispora）、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）、フォードコッカス（Rhodococcus）、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記微生物が、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌である請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌が、バチルス（Bacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）またはリステリア（Listeria）である請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記潜在性遺伝子クラスターが、前記遺伝子クラスターに動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を減少することによって活性化される活性化ＤａｓＲ−抑制潜在性遺伝子クラスター。
【請求項３５】
前記遺伝子クラスターが、抗生物質遺伝子クラスターである請求項３４記載の活性化潜在性遺伝子クラスター。
【請求項３６】
請求項３４または３５記載の活性化潜在性クラスターを含む微生物。
【請求項３７】
ＤａｓＲ−様タンパク質に対する変異結合部位を含む微生物。
【請求項３８】
ＤａｓＲ−様タンパク質の変異体を含む微生物。
【請求項３９】
ＤａｓＲ−様タンパク質のヌル変異体である請求項３８記載の微生物。
【請求項４０】
増加したＤａｓＲの発現を含む微生物。
【請求項４１】
本質的に植物にて増殖し、二次代謝物のレベルの変化を産出する微生物。
【請求項４２】
本質的に植物にて増殖し、潜在性遺伝子クラスターから産物を産出する微生物。
【請求項４３】
ＤａｓＲ−様タンパク質に対する結合部位を持つ、前記目的産物をコードしている核酸、または前記目的産物の産出に関与するタンパク質をコードしている核酸を提供することを含み、前記結合部位が、前記核酸と動作可能に連結する、微生物を含むＤａｓＲ−様タンパク質中の目的産物の発現を調節するための方法。
【請求項４４】
前記微生物がさらに、ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸を含む請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
ＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するための変異導入ＤａｓＲ−結合部位の利用。
【請求項４６】
ＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するための変異導入ＤａｓＲ様−タンパク質の利用。
【請求項４７】
ＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するためのＤａｓＲの利用。
【請求項４８】
ＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するためのＤａｓＲ−誘導物の利用。
【請求項４９】
微生物に、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体またはマルチマーを提供することを含む、前記微生物中の、二次代謝物、好ましくは抗生物質を得るため、またはその産出を改善するための方法。
【請求項５０】
前記微生物が、糸状体微生物、好ましくは子嚢菌、バシド菌または放線菌である請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記放線菌が、ストレプトミセス（Streptomyces）、ノカルディア（Nocardia)、サーモビフィド(Thermobifido）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、プラノビスポラ（Planobispora）、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）、フォードコッカス（Rhodococcus）、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）である請求項５０記載の方法。
【請求項１】
微生物に、目的遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、またはその産物が該目的遺伝子の発現に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能である化合物を提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む前記微生物における、目的遺伝子の発現を調節するための方法。
【請求項２】
前記化合物が遺伝的化合物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、ＤａｓＲ−調節工程の誘導因子である請求項１記載の方法。
【請求項４】
その産物が代謝経路の一部である遺伝子に動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を制御することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物における代謝を制御するための方法。
【請求項５】
前記ＤａｓＲ−結合部位への前記ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を、前記微生物に提供することを含む請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が遺伝的化合物である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記化合物が、ＤａｓＲ−調節代謝工程の誘導因子である請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記産物の存在が、前記微生物における、解糖へ、または解糖からの代謝フラックスを制御する請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記産物の存在が、前記微生物における、クエン酸（ＴＣＡ）回路へ、またはクエン酸回路からの代謝フラックスを制御する請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
目的産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または該目的産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位への、ＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を、前記微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む微生物において目的産物の発現を得るための方法。
【請求項１１】
前記ＤａｓＲ−様タンパク質の前記ＤａｓＲ−結合部位への結合が、前記微生物に前記化合物を提供することによって、少なくとも部分的に阻害される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤａｓＲ−様タンパク質の前記ＤａｓＲ−結合部位の結合が、前記微生物に前記化合物を提供することよって、少なくとも部分的に増加する請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物が遺伝的化合物である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、ＤａｓＲ−調節工程の誘導物である請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記誘導物が、グルコサミン−６−リン酸またはその機能的等価物または機能的断片である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記目的産物が、二次的代謝物である請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記目的産物が抗生物質、潜在性遺伝子クラスターからの産物、抗腫瘍薬剤または農業化合物である請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記目的産物が酵素である請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素が、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、キチナーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、モノキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、または糖イソメラーゼである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
不要産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位、または不要産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を、微生物に提供することを含む、ＤａｓＲ−様タンパク質を含む前記微生物中の不要産物の産出を少なくとも部分的に減少させるための方法。
【請求項２１】
前記化合物が、前記ＤａｓＲ−様タンパク質と前記ＤａｓＲ−結合部位間の結合を少なくとも部分的に増加させることが可能である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物が、前記ＤａｓＲ−様タンパク質と前記ＤａｓＲ−結合部位間の結合を少なくとも部分的に減少させることが可能である請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合が、前記不要産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結した、または前記不要産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結した、増加量のＤａｓＲ−結合部位を前記微生物に提供することによって、少なくとも部分的に増加する請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２４】
ＤａｓＲ−様タンパク質のＤａｓＲ−結合部位への結合が、本来前記不要産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結した、または前記不要産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結した、前記微生物中の少なくとも１つのＤａｓＲ結合部位を取り除くことによって、少なくとも部分的に減少する請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２５】
前記不要産物が、不要副産物または不要シャント産物である請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、前記微生物に、不要産物をコードしている遺伝子と動作可能に連結した、または不要産物の産出に関与する遺伝子と動作可能に連結した、ＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を干渉可能な化合物を提供することを含む請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
さらに、ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸を前記微生物に提供することを含む請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤａｓＲ−様タンパク質が、異種である請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記微生物が、糸状体微生物である請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記糸状体微生物が、子嚢菌、バシド菌または放線菌である請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記放線菌が、ストレプトミセス（Streptomyces）、ノカルディア（Nocardia）、サーモビフィド（Thermobifido）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、プラノビスポラ（Planobispora）、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）、フォードコッカス（Rhodococcus）、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記微生物が、低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌である請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌が、バチルス（Bacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）またはリステリア（Listeria）である請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記潜在性遺伝子クラスターが、前記遺伝子クラスターに動作可能に連結したＤａｓＲ−結合部位へのＤａｓＲ−様タンパク質の結合を減少することによって活性化される活性化ＤａｓＲ−抑制潜在性遺伝子クラスター。
【請求項３５】
前記遺伝子クラスターが、抗生物質遺伝子クラスターである請求項３４記載の活性化潜在性遺伝子クラスター。
【請求項３６】
請求項３４または３５記載の活性化潜在性クラスターを含む微生物。
【請求項３７】
ＤａｓＲ−様タンパク質に対する変異結合部位を含む微生物。
【請求項３８】
ＤａｓＲ−様タンパク質の変異体を含む微生物。
【請求項３９】
ＤａｓＲ−様タンパク質のヌル変異体である請求項３８記載の微生物。
【請求項４０】
増加したＤａｓＲの発現を含む微生物。
【請求項４１】
本質的に植物にて増殖し、二次代謝物のレベルの変化を産出する微生物。
【請求項４２】
本質的に植物にて増殖し、潜在性遺伝子クラスターから産物を産出する微生物。
【請求項４３】
ＤａｓＲ−様タンパク質に対する結合部位を持つ、前記目的産物をコードしている核酸、または前記目的産物の産出に関与するタンパク質をコードしている核酸を提供することを含み、前記結合部位が、前記核酸と動作可能に連結する、微生物を含むＤａｓＲ−様タンパク質中の目的産物の発現を調節するための方法。
【請求項４４】
前記微生物がさらに、ＤａｓＲ−様タンパク質をコードしている核酸を含む請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
ＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するための変異導入ＤａｓＲ−結合部位の利用。
【請求項４６】
ＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するための変異導入ＤａｓＲ様−タンパク質の利用。
【請求項４７】
ＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するためのＤａｓＲの利用。
【請求項４８】
ＤａｓＲ−制御遺伝子の発現を調節するためのＤａｓＲ−誘導物の利用。
【請求項４９】
微生物に、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはその誘導体またはマルチマーを提供することを含む、前記微生物中の、二次代謝物、好ましくは抗生物質を得るため、またはその産出を改善するための方法。
【請求項５０】
前記微生物が、糸状体微生物、好ましくは子嚢菌、バシド菌または放線菌である請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記放線菌が、ストレプトミセス（Streptomyces）、ノカルディア（Nocardia)、サーモビフィド(Thermobifido）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、プラノビスポラ（Planobispora）、ストレプトベルティシリウム（Streptoverticillium）、フォードコッカス（Rhodococcus）、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）である請求項５０記載の方法。
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３ＢＣ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図６Ｂ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１２】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０】
【図２１】
【図２３】
【図２４】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図５】
【図６Ａ】
【図７】
【図８Ａ】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図２２】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３ＢＣ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図６Ｂ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１２】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０】
【図２１】
【図２３】
【図２４】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図５】
【図６Ａ】
【図７】
【図８Ａ】
【図１０】
【図１１】
【図１３】
【図１４Ｃ】
【図１５】
【図２２】
【公表番号】特表２００９−５２６５４８（Ｐ２００９−５２６５４８Ａ）
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５５１７８（Ｐ２００８−５５５１７８）
【出願日】平成１９年２月１４日（２００７．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０５００６１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９４６６７
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０８２４５６００）ユニベルジテイト レイデン (1)
【出願人】（５０８２４６０５４）ユニヴァーシティ オブ リージ (1)
【出願人】（５０８２４６０２１）フリートリッヒ−アレキサンダー−ウニベルジテート エアランゲン−ニュールンベルグ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１４日（２００７．２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００７／０５００６１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９４６６７
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０８２４５６００）ユニベルジテイト レイデン (1)
【出願人】（５０８２４６０５４）ユニヴァーシティ オブ リージ (1)
【出願人】（５０８２４６０２１）フリートリッヒ−アレキサンダー−ウニベルジテート エアランゲン−ニュールンベルグ (1)
【Ｆターム（参考）】
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