微生物による環状アミノ酸の製造法
【課題】医農薬化合物を創製する際の合成原料または中間体として重要な光学純度の高い環状アミノ酸を、簡便で安価に製造する方法を提供する。
【解決手段】式（Ｉ）
［式（Ｉ）中、Ｘは、直鎖または分枝鎖のＣ1−Ｃ6炭化水素鎖を表す］で示されるＬ−ジアミノ酸を、式（ＩＩ）
で示される環状アミノ酸に変換する活性を有するパラコッカス属に属する微生物を用い、式（Ｉ）のＬ−ジアミノ酸から式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸を製造する。
【解決手段】式（Ｉ）
［式（Ｉ）中、Ｘは、直鎖または分枝鎖のＣ1−Ｃ6炭化水素鎖を表す］で示されるＬ−ジアミノ酸を、式（ＩＩ）
で示される環状アミノ酸に変換する活性を有するパラコッカス属に属する微生物を用い、式（Ｉ）のＬ−ジアミノ酸から式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医農薬化合物を創製する際の合成原料または中間体として重要な、光学活性環状アミノ酸の微生物を用いる製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬理活性を有する化合物の創製において、環状アミノ酸である（Ｓ）−ピペコリン酸や（Ｓ）−3−モルホリンカルボン酸等を分子内に含んだ化合物や、環状アミノ酸を合成中
間体または原料として利用した例は多い（非特許文献１、特許文献１〜８参照）。従って、光学純度の高い光学活性環状アミノ酸である（Ｓ）−ピペコリン酸、（Ｓ）−3−モル
ホリンカルボン酸、（Ｒ）−３‐チオモルホリンカルボン酸、５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸等は、合成医農薬品の原料として有用な化合物である。
【０００３】
【化３】
従来の光学活性（Ｓ）−3‐モルホリンカルボン酸を製造する方法としては、
光学活性アジリジン−２−カルボン酸誘導体を出発物質として、３段階の合成反応（２−クロロエタンの付加、ベンジル基の脱離およびトリエチルアミン環化剤として使用する環化反応）を経て製造する方法（非特許文献２、３参照）、
Ｌ−セリン誘導体から５段階の合成反応を経て製造する方法（非特許文献４参照）、
ジアミノ酸等からα位のアミノ基を脱アミノ化して１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成する酵素（たとえばアミノ酸オキシダーゼ）と、シュードモナス属の微生物等から得られるＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼとを用いた酵素反応によって、Ｌ−４−オキサリジンから中間体の上記環状アミノ酸を経て（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を製造する方法（特許文献９参照）が知られている。
【０００４】
また、光学活性（Ｓ）−ピペコリン酸（Ｌ−ピペコリン酸と表記されることもある。）を製造する方法としては、
Ｌ−リジンやその誘導体を出発物質として、亜硝酸ナトリウムによるα位アミノ基のジアゾ化および水酸化バリウムや水酸化ナトリウムを環化剤として用いる環化反応によって（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（非特許文献５、特許文献１０参照）、
Ｌ−α−アミノカプロン酸のε位にエチレンアセタールを持つ化合物を酸性条件下で還元して（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１１参照）、
前述のようにシュードモナス属の微生物から得られるＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼなどを用いた酵素反応によってＬ−リジンからから（Ｓ）−ピペコリン酸を製
造する方法（特許文献９参照）、
アルカリゲネス属、プロデンシア属、プロテウス属、バチルス属、アグロバクテリウム属、モルガネラ属、プラノコッカス属の何れかに属する微生物を用いて菌体反応によってＬ−リジンから（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１２参照）、
フラボバクテリウム属の微生物等が有するリジン−６−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子（lat）と大腸菌やコリネ型細菌等が有するピロリン−５−カルボン酸レ
ダクターゼをコードする遺伝子（proC）とが導入された組換え大腸菌を用いた培養変換によって、あるいはそのような組換え大腸菌の菌体破砕液を用いて、Ｌ−リジンからデルタ−１−ピペリデイン−２−カルボン酸を経て（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１３参照）、
アグロバクテリウム属の微生物が有するオルニチンシクロデアミナーゼまたはこれと相同のストレプトミセス属の微生物が有する酵素を用いた酵素反応により、あるいはこれらの酵素をコードする遺伝子（ocd、pipA、rapL）が導入された組換え大腸菌の菌体破砕液
を用いて、Ｌ−リジンから（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献１４参照)、
ノイロスポラ属、シュードモナス属、大腸菌及びメタノール資化性菌などの微生物起源の、または豚腎などの動物起源のＤ−アミノ酸オキシダーゼと水素化ホウ素等の還元剤とを、Ｄ−またはＤＬ−ピペコリン酸に作用させ、Ｄ−ピペコリン酸からΔ1−ピペリデイ
ン−２−カルボン酸への選択的な酸化と還元剤によるラセミ体の生成反応との共役反応により（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１５参照）、
Ｎ−保護−Ｄ−ピペコリン酸誘導体を加水分解しうる酵素（Ｄ−アミノアシラーゼ）を用いた酵素反応により、または当該酵素を含有するアルスロバクター属の微生物を用いた菌体培養により、ラセミ体ピペコリン酸誘導体から（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１６参照）、
アルカリゲネス属の微生物が有するＮ−アシル−ピペコリン酸アシラーゼを用いた酵素反応による、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−ピペコリン酸の立体選択的な加水分解により（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１７参照）、
シュードモナス属またはクレブシエラ属の微生物を用いた菌体反応により、あるいはこれらの微生物に含まれるＳ−アミノ酸アミダーゼを用いた酵素反応により、（Ｒ，Ｓ）−ピペコリン酸アミドから（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１８参照）、
（±）−ピペコリン酸を溶媒中で光学分割剤としてのＳ−（−）−２−フェノキシプロピオン酸と反応させ、生成した難水溶性のＳ−（−）−ピペコリン酸・Ｓ−（−）−２−フェノキシプロピオン酸塩を回収し、これを酸で複分解することにより光学的に純粋なＳ−（−）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１９参照）、
ハロゲン基を側鎖末端に有し、アミノ基がアセチル基等で保護されたアミノ酸誘導体（たとえば比較的安価なアセタミドマロン酸ジエチルから４段階の合成反応を経て得られるＮ−アセチル−２−アミノ−６−ブロモヘキサン酸）のラセミ体溶液に、アスペルギルス属の微生物が有するＬ−アミノアシラーゼを添加し、Ｌ−エナンチオマー特異的作用による脱アセチル化を行う酵素反応および分子内環化によって（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献２０参照）が知られている。
【０００５】
光学活性（Ｒ）−３−チオモルホリンカルボン酸を製造する方法としては、有機合成による方法（非特許文献２、３参照）や、Ｌ−４−チアリジンから酵素反応或いは菌体破砕液によって製造する方法（特許文献９、１４参照）が知られている。
【０００６】
５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸を製造する方法としては５−ヒドロキシ−ＤＬ−リジンから酵素反応或いは菌体破砕液によって製造する方法（特許文献９、１４参照）が知られている。
【特許文献１】国際公開第０２／８３６２４号パンプレット
【特許文献２】国際公開第０２／８５８６０号パンプレット
【特許文献３】国際公開第２００４／７４２９１号パンプレット
【特許文献４】国際公開第２００４／９２１６７号パンプレット
【特許文献５】国際公開第２００５／１０８３５９号パンプレット
【特許文献６】米国特許第７１６９７８０号
【特許文献７】米国公開２００２−００９９０４７号
【特許文献８】米国公開２００４−０１５２７４５号
【特許文献９】特開２００５−９５１６７号公報
【特許文献１０】特開２００４−５１６０６号公報
【特許文献１１】特開２００８−７４８０号公報
【特許文献１２】日本国特許第３２６６６３５号
【特許文献１３】国際公開第０１／４８２１６号パンプレット
【特許文献１４】日本国特許第３９４３５４０号
【特許文献１５】日本国特許第３１３５３６７号
【特許文献１６】特表２００２−５０９４４１号公報
【特許文献１７】特表平０９−５０３６６９号公報
【特許文献１８】特開平０８−５６６５２号公報
【特許文献１９】特開２０００−１７８２５３号公報
【特許文献２０】特開２００４−２６１０８６号公報
【非特許文献１】J. Med. Chem. , 1995, Vol. 38, p.1853‐1864
【非特許文献２】Bull. Chem. Soc. Jpn. , 1987, Vol. 60, p.2963‐2965
【非特許文献３】Peptide Chemistry , 1986, p.153-156
【非特許文献４】Ｊ. Org. Chem. , 2007, Vol. 72, p.4254-4257
【非特許文献５】Chem. Pharm. Bull. , 1976, Vol. 24, p.621-631
【非特許文献６】Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967, p.401-406
【非特許文献７】Bull. Soc. Chim. Belg. , 1982, p.713-723
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献２〜４記載の化学合成による光学活性(Ｓ)‐3‐モルホリンカルボン酸また
は（Ｒ）−３−チオモルホリンカルボン酸の製造方法では、各反応終了時に中間体を反応液から取り出す工程が必要であり、操作が煩雑であることから生産コストが高くなる問題点がある。非特許文献５記載の化学合成による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造方法も反応工程数が多く操作が煩雑であり、特許文献１１の製造方法は原料物質がＬ−リジンのように安価ではないという問題がある。特許文献１９記載の光学分割剤を使用する製造方法では光学分割剤が高価であり、また非修飾ピペコリン酸のみを対象としていて(Ｓ)‐３‐モルホリンカルボン酸の製造には利用できないという問題がある。
【０００８】
また、特許文献９に記載された、酵素反応によってジアミノ酸から(Ｓ)‐３‐モルホリンカルボン酸、（Ｓ）−ピペコリン酸、(Ｒ)‐3‐チオモルホリンカルボン酸、５−ヒド
ロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸など製造する方法は、収率が低いことに加え、酵素反応を行うための酵素が高価であったり、酵素の調製を菌体から行う必要があるなど、製造時の工程数増加・製造コスト増という問題がある。特許文献１４記載の酵素反応を利用した（Ｓ）−ピペコリン酸、（Ｒ）−３−チオモルホリンカルボン酸、５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸などを製造する方法も、酵素反応を行うための酵素を遺伝子組み換え大腸菌の菌体破砕などにより調製する必要があり、製造時の工程数増加・製造コスト増という問題があるため、必ずしも満足できるものではない。酵素反応を利用してラセミ体から（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する特許文献１５〜１７記載の方法もやはり、酵素の調製が煩雑で製造工程が多いという問題がある。特許文献２０記載の方法には、酵素反応の基質となる化合物を有機合成により調製するため工程数が多いという問題もある。
【０００９】
さらに、特許文献１２に記載された、自然界から分離されたアルカリゲネス属等に属す
る微生物を利用して（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法では、菌体反応に使用する微生物の生産時の培養温度が２０℃という低温であり、工業的に製造する場合にはコスト増要因となる。また、この菌体反応における最大生産量も約４．２ｇ／Ｌと低く工業的に満足できるものではなかった。更に、Ｌ−リジン以外のジアミノ酸を原料にして（Ｓ）−ピペコリン酸以外の環状アミノ酸を製造することに関する記載が全く無いため、(Ｓ)‐3‐モ
ルホリンカルボン酸等の製造に応用できるかどうか不明である。
【００１０】
特許文献１３記載の遺伝子組換え大腸菌を利用した培養変換による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造法についても、Ｌ−リジン以外のジアミノ酸を原料にして（Ｓ）−ピペコリン酸以外の環状アミノ酸を製造することに関する記載が全く無いため、(Ｓ)‐3‐モルホリン
カルボン酸等の製造に応用できるかどうか不明である。特許文献１８記載のラセミ体ピペコールアミドからシュードモナス属またはクレブシエラ属の微生物を利用した菌体反応による（Ｓ）−ピペコリン酸製造方法には光学純度が低いという問題がある。
【００１１】
すなわち、本発明の目的は、自然界から分離された微生物またはその変異株を用いて、微生物変換により工業製法的に効率よく、安価に、各種のジアミノ酸から光学活性環状Ｌ−アミノ酸の生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記の目的を達成すべく鋭意研究を行った。その結果、本発明者により自然界の種々の分離源から分離された各種の微生物のうち、パラコッカス（Paracoccus）属に属する微生物、その中でもパラコッカス・エスピーＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株またはその変異株であるパラコッカス・エスピーＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株とパラコッカス属基準株が、各種のジアミノ酸から光学活性環状アミノ酸を生産することを発見し、本発明を完成した。
【００１３】
即ち本発明は、
式（Ｉ）
【００１４】
【化４】
［式（Ｉ）中、Ｘは、飽和のまたは部分的に若しくは全体的に不飽和の、直鎖または分枝鎖のＣ1−Ｃ6炭化水素鎖を表し、該炭化水素鎖は、その内部および／または末端に、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｎの内から選択する一個または数個のヘテロ原子またはヘテロ原子団を含んでいてもよく、あるいは、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、＝Ｏ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ、−Ｃ(Ｓ)ＯＲ、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ'Ｒ"、−Ｃ(Ｓ)ＮＲ'ＲＲ"、−ＣＮ、−ＮＯ2、−Ｘ、−ＭｇＸ、−ＮＲ'Ｒ"、
−ＮＲ'Ｃ(Ｏ)Ｒ、−ＳｉＲ及び−ＳｉＯＲ（Ｒ、Ｒ'及びＲ"は、同一のまたは相違する
、水素または２〜２０の炭素原子を有する直鎖若しくは分枝鎖の飽和のまたは全体的に若しくは部分的に不飽和の炭化水素基を表す。）の内から選択する一個または数個の同じまたは異なる基によって置換されていてもよく、Ｒ'とＲ"は、それらを有する原子と共に環を形成していてもよい。］で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を、式（ＩＩ）
【００１５】
【化５】
［式（ＩＩ）中、Ｘは式（Ｉ）中で規定した通りである。］で示される環状アミノ酸および／またはその塩類に変換する活性を有するパラコッカス属に属する微生物を用い、培養変換或いは菌体反応変換によって、式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類、または式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および対応するＤ−ジアミノ酸、それらの塩類を様々な割合で含む鏡像体混合物から、式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸および／またはその塩類を効率よく生産する製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の微生物による環状アミノ酸の製造法は、培養が容易なパラコッカス属に属する微生物またはその変異株を利用して、安価なジアミノ酸から各種の光学活性環状Ｌ−アミノ酸への安定した生産・供給を実現するものであり、光学活性環状アミノ酸の製造効率の向上や製造コストの削減を図ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明で使用する式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類、または式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および対応するＤ−ジアミノ酸、それらの塩類を様々な割合で含む鏡像体混合物は、市販品を購入して使用することができるし、公知の方法によって微生物による発酵生産物から製造することもできる。
【００１８】
たとえば、L−4−オキサリジンであれば、L−4−オキサリジン一塩酸塩（和光純薬工業社製及びAldrich社製）が市販されており、非特許文献６に記載のように、Streptomyces chartreuseまたはStreptomyces erythrochromogenesに属する放線菌を培養し、培養液中
からL−4−オキサリジンおよび／またはその塩類を分離・精製することも可能である。また、新たにL−4−オキサリジン生産微生物を自然界から分離して製造に使用してもよい。発酵生産によってL−4−オキサリジンを製造することで、安価に出発物質としてのL−4−オキサリジンを容易に入手することができる。
【００１９】
L−リジン塩酸塩またはL−およびＤ−リジン塩酸塩混合物、L−４−チアリジン塩酸塩
および５−（Ｒ，Ｓ）ヒドロキシ−Ｌ−および５−（Ｒ，Ｓ）ヒドロキシ−Ｄ−リジン塩酸塩混合物は市販品（和光純薬工業社製など）を購入して使用することができる。
【００２０】
本発明の方法で用いられる光学活性環状アミノ酸の生産菌は、パラコッカス属に属する微生物で、光学活性環状アミノ酸を産生する能力を有するものであれば、いかなる微生物でもよい。パラコッカス属に属する微生物としては、例えば、パラコッカス・ヴェルスタス ＮＢＲＣ１４５６７（Paracoccus versutus）、パラコッカス・チオシアネイタス Ｎ
ＢＲＣ１４５６９（Paracoccus thiocyanatus）、パラコッカス・アミノフィルス ＮＢＲＣ１６７１０（Paracoccus aminophilus）、パラコッカス・アミノボランス ＮＢＲＣ１
６７１１（Paracoccus aminovorans）、パラコッカス・コクリイ ＮＢＲＣ１６７１３（Paracoccus kocurii）、パラコッカス・アルカリフィルス ＮＢＲＣ１６７１９（Paracoccus alcaliphilus）、パラコッカス・セリニフィルス ＮＢＲＣ１００７９８（Paracoccus
seriniphilus）、パラコッカス・コリエンシス ＮＢＲＣ１０２２９２（Paracoccus koreensis）、パラコッカス・パントトロフス ＮＢＲＣ１０２４９３（Paracoccus pantotrophus）、パラコッカス・デニトリフィカンス ＮＢＲＣ１０２５２８（Paracoccus denitr
ificans）、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）、パラ
コッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）等があげられる。
【００２１】
上記パラコッカス属に属する微生物の中で、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２
（Paracoccus sp. AB10292）株は、本発明者が神奈川県伊勢原市より採取した土壌から新たに分離した菌株である。このＡＢ１０２９２株の菌学的諸性質を次に記載する。
【００２２】
（Ａ）形態的特徴
（１）細胞形態：桿菌で大きさは０．１〜１．１×１．１〜２．０μｍ
（２）ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地上での生育：生育は良好。コロニー形状は円形、隆起状態は半球状、コロニー周縁は全縁状であり、色調は光沢を帯びたクリーム色である。
【００２３】
（Ｂ）生理生化学的性状
（１）グラム染色： −
（２）ＯＦテスト： −
（３）好気条件での生育： ＋
（４）嫌気条件での生育： −
（５）生育温度：
１０℃ ＋
２７℃ ＋
３７℃ −
（６）カタラーゼ： ＋
（７）オキシダーゼ： ＋
（８）ウレアーゼ： −
（９）硝酸塩還元性： ＋
（１０）脱窒反応： −
（１１）６％食塩耐性： −
（１２）β‐ガラクトシダーゼ： −
（１３）アルギニンジヒドロラーゼ： −
（１４）Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ： −
（１５）Ｌ−オルニチンデカルボキシラーゼ： −
（１６）クエン酸の利用性： −
（１７）硫化水素産生： −
（１８）トリプトファミナーゼ： −
（１９）インドール産生： −
（２０）アセトイン産生： −
（２１）ゼラチナーゼ： −
（２２）各種糖から酸の生成：
Ｄ−グルコース −
Ｄ−マンニトール −
Ｄ−ソルビトール −
Ｄ−メリビオース −
Ｌ−ラムノース −
Ｌ−アラビノース −
シュークロース −
ミオ‐イノシトール −
Ｄ−アミダグリン −
（２３）炭素源の資化性
Ｄ−グルコース ＋
Ｄ−キシロース ＋
Ｄ−マンニトール −
Ｄ−フルクトース −
シュークロース −
ミオ‐イノシトール −
以上のとおりＡＢ１０２９２株の主性状は、グラム陰性の桿菌で好気条件にて生育し、カタラーゼ、オキシダーゼ、硝酸塩還元性が陽性であり、ウレアーゼ、脱窒反応が陰性であった。
【００２４】
さらに１６Ｓリボゾームの塩基配列解析結果から、本菌株はパラコッカス属に近縁の細菌であると考えられた。しかし、表１に示すようにパラコッカス属基準株との相同性の一致率は低いため、１６Ｓリボゾームの塩基配列解析結果から種まで特定することは困難であった。
【００２５】
【表１】
そのため、Bergey's manual of Systematic Bacteriology (1984) 及び International
Journal of Systematic Bacteriology 誌を参考にして、上記５菌株とＡＢ１０２９２株との生理・生化学的比較試験を行った。
【００２６】
その結果、パラコッカス・デニトリフィカンス ＮＢＲＣ１０２５２８（Paracoccus denitrificans）及びパラコッカス・アミノボランス ＮＢＲＣ１６７１１（Paracoccus aminovorans）とはＡＢ１０２９２株が脱窒反応活性を持たない点、３７℃での生育ができない点で異なった。
【００２７】
パラコッカス・アルカリフィルス ＮＢＲＣ１６７１９（Paracoccus alcaliphilus）とはＡＢ１０２９２株がウレアーゼ活性を持たない点、３７℃での生育ができない点で異なり、パラコッカス・セリニフィルス ＮＢＲＣ１００７９８（Paracoccus seriniphilus）とはＡＢ１０２９２株が生育可能なソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地でパラコッカス・セリニフィルス ＮＢＲＣ１００７９８（Paracoccus seriniphilus）が生育できない点から明らかに異なるものであった。
【００２８】
パラコッカス・アミノフィルス ＮＢＲＣ１６７１０（Paracoccus aminophilus）とは
硝酸塩還元活性をＡＢ１０２９２株が硝酸塩還元活性を持つ点で異なった。以上の結果から、生理・生化学的性状の比較を行っても種まで特定することは困難であった。
【００２９】
従って、本発明者は本菌株をパラコッカス・エスピー（Paracoccus sp.）と同定し、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）と命名した。なお、この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所生物寄託センターに寄託申請され、平成２０年７月１６日、ＦＥＲＭ Ｐ―２１６０５号として受託されている。
【００３０】
ここまで光学活性環状アミノ酸生産菌パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Parac
occus sp.AB10292）株について説明したが、一般的には菌類の菌学上の性状は極めて変化しやすく、一定したものではない。菌類は、自然的あるいは通常行われている紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンおよびエチルメタンスルホネート等）または遺伝子組換えを用いる人為的変異手段により変異することは周知の事実である。このような自然変異株ならびに人工変異株も含め、パラコッカス属に属し、光学活性環状アミノ酸を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
【００３１】
その具体的な例として、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株の高濃度Ｌ-リジン塩酸塩耐性変異株であるパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株があげられる。なお、この変異株は、独立行政法人産
業技術総合研究所生物寄託センターに寄託申請され、平成２０年７月１６日、ＦＥＲＭ Ｐ―２１６０６号として受託されている。
【００３２】
これらの微生物を培養中に、直接ジアミノ酸を培養液に添加させ、ジアミノ酸の大部分が光学活性アミノ酸に変換されるまで培養を行う。これらの微生物を培養して菌体をえた後、ジアミノ酸をふくむ反応液中に菌体を懸濁して、反応させてもよい。また、これらの微生物の突然変異体や遺伝子組換え体あるいはそれらの菌体処理物等を本発明に使用することができる。
【００３３】
本発明の培養変換および菌体反応に使用する菌体の生産で使用されるジアミノ酸以外の培地成分としては、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子及び使用する微生物が要求する栄養物質を含有する培地であればいずれであってもよい。炭素源としては、グルコース、キシロース、マルトース、グリセリン、デンプン、デキストリン、水飴、糖蜜、動・植物油等の光学活性環状アミノ酸生産菌が利用可能なものが使用可能である。窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、魚粉、コーンスティープリカー、酵母エキス、アミノ酸、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等光学活性環状アミノ酸生産菌が利用可能なものを使用できる。また、必要により微量金属塩、例えばコバルト、鉄、ニッケル、マンガン等を添加できる。また、６‐アミノヘキサン酸のような光学活性環状アミノ酸の生産を促進するような無機および有機物を適当に添加することが出来る。また、硫酸アンモニウムのような無機窒素源を添加しない培地で、且つジアミノ酸を添加しない培地を使用しても菌体反応に使用可能な菌体を生産することができる。
【００３４】
本発明の培養変換における培養は好気条件下で、静置培養、振とう培養、攪拌培養等で行う。通常培養温度は１５〜４０℃の範囲であるが、多くの場合２４〜３０℃で培養する。培養中のｐＨは３．０〜８．０の範囲で行なうのが好ましく、必要に応じて培養液中のｐＨ調整を行ってもよいし、炭酸カルシウムのようなｐＨ調整剤を添加してもよい。ジアミノ酸および／またはその塩類は初発に添加してもよいし、培養途中から一度に或いは少量ずつ添加してもよい。培養日数は通常１〜１４日間であるが、培養中の光学活性環状アミノ酸蓄積量が最高に達したときに培養を停止し、培養液から生産物を一般的な方法に準じて採取する。これらの培地組成、培地の液性、培養温度、撹拌速度および通気量等の培養条件は、使用する菌株の種類および外部条件等に応じて好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選抜する。液体培養において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。
【００３５】
本発明の菌体反応に使用する菌体の培養は、好気条件下で、静置培養、振とう培養、攪拌培養等で行う。通常培養温度は１５〜４０℃の範囲であるが、多くの場合２４〜３０℃で培養する。培養中のｐＨは３．０〜８．０の範囲で行なうのが好ましく、必要に応じて培養液中のｐＨ調整を行ってもよいし、炭酸カルシウムのようなｐＨ調整剤を添加してもよい。ジアミノ酸や６‐アミノヘキサン酸のような変換活性を増強する物質は、初発に添
加してもよいし、培養途中から一度に或いは少量ずつ添加してもよい。培養日数は通常１２時間〜７日間であるが、菌体反応時に環状アミノ酸を変換できる活性を有した微生物が生育したときに培養を停止し、培養液から菌体を一般的な方法に準じて回収する。これらの培地組成、培地の液性、培養温度、撹拌速度および通気量等の培養条件は、使用する菌株の種類および外部条件等に応じて好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選抜する。液体培養において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。
【００３６】
菌体反応は好気条件下で、振とう条件、通気攪拌条件等で行う。通常反応温度は１５〜４０℃の範囲であるが、多くの場合２５〜３７℃で反応する。混合液中のｐＨは３．０〜８．０の範囲で行なうのが好ましく、緩衝液中か或いは必要に応じて反応液中のｐＨ調整を行っても良い。ジアミノ酸は初発に添加しても良いし、反応途中から一度に或いは少量ずつ添加しても良い。また、環状アミノ酸の生産効率を高めるために、培地中にグルコースやキシロース等の糖類、有機酸、アミノ酸、無機塩類、微量元素、界面活性剤等の生産効率を高められる物質を添加して反応を行っても良い。混合日数は通常６時間〜７日間であるが、混合液中の光学活性環状アミノ酸蓄積量が最高に達したときに反応を停止し、反応液から生産物を一般的な方法に準じて採取する。これらの反応液組成、反応温度、撹拌速度および通気量等の混合反応条件は、使用する菌株の種類や使用するジアミノ酸および外部条件等に応じて好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選抜する。液体反応において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。
【００３７】
培養液や菌体反応液からの光学活性環状アミノ酸の精製は通常の方法で行う。具体的な精製方法としては遠心分離装置や膜分離装置または菌体凝集剤で菌体とろ液を分離或いは溶液をアルカリ性にして菌体を溶菌した後、ろ液あるいは溶菌液から光学活性環状アミノ酸をイオン交換樹脂法、電気透析法、カラムクロマトグラフィー法、晶析法などを用いるか、あるいはこれらを組み合わせて精製できる。
【実施例】
【００３８】
本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこの具体例に限定されるものではない。
本実施例では、（Ｓ）−3−モルホリンカルボン酸及び（Ｓ）−ピペコリン酸の定量分
析及び光学純度分析を以下の方法で実施した。
【００３９】
培養液上清或いは混合液上清中の定量分析は高速液体クロマトグラフィーを用い内部標準法にて算出した。分析条件は以下のとおりである。
カラム ：ＹＭＣ社製 Hydrosphere C18（内径4.6mm、長さ25cm）
カラム温度 ：４０℃
検出器 ：ＵＶ検出器
測定波長 ：４１０ｎｍ
溶媒 ：Ａ液；アセトニトリル：水（０．０４％リン酸）＝３５：６５
Ｂ液；アセトニトリル：水（０．０４％リン酸）＝８０：２０
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
グラジエント：測定開始から５分後までＡ液１００％、３０分後にＡ液８０％・Ｂ液２０％となるよう直線的グラジエントを行い、３０分から３５分までＢ液１００％で溶媒を流した。
内部標準 ：２−アミノエタノール
サンプル調製：測定液１ｍｌに活性炭を１０ｍｇ添加して１分間よく撹拌し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って遠心上清を得た。その上清中の（Ｓ）−3−モル
ホリンカルボン酸または（Ｓ）−ピペコリン酸濃度が1ｍｇ/ｍｌ以下になるよう蒸留水で
希釈し、その希釈液１０μｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の２−アミノエタノール溶液（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液）９０μｌ、１８６ｍｇ／ｍｌ濃度の２,４−ジニトロフ
ルオエロベンゼン溶液（メタノール溶液）５０μｌ、エタノール４００μｌを混合撹拌後、室温で１時間放置して誘導体化した。
溶出時間 ：（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸 １３．６（ｍｉｎ）
（Ｓ）−ピペコリン酸 ２６．７（ｍｉｎ）
２−アミノエタノール ９．９（ｍｉｎ）
（Ｓ）−3−モルホリンカルボン酸及び（Ｓ）−ピペコリン酸の光学純度分析法はキラ
ルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。分析条件は以下の通りである。
カラム ：ダイセル社製 CHIRALPAK WH（内径4.6mm、長さ25cm）
カラム温度 ：５０℃
検出器 ：ＵＶ検出器
測定波長 ：２５４ｎｍ
溶媒 ：０．２５ｍＭ硫酸銅水溶液
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶出時間 ：（Ｒ）−３−モルホリンカルボン酸 ３６．９（ｍｉｎ）
（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸 ４３．９（ｍｉｎ）
（Ｒ）−ピペコリン酸 １３．７（ｍｉｎ）
（Ｓ）−ピペコリン酸 ２０．７（ｍｉｎ）
1H‐および13C‐NMRは特に指示がない限り、重水（D2O）の溶液で、日本電子（株）社
製の核磁気共鳴装置（モデルJNM−LA300）を使用して測定した。
【００４０】
［実施例１］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株を利用した、培養変換による（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の製造
Ｌ−４−オキサリジン一塩酸塩３ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラ
スコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス
・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株をスラントから一白金耳接種した。合計１０本の三角フラスコを２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。培養終了後、培養液中の（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸濃度を測定したところ、３７５ｍｇ／Ｌであった。
【００４１】
この１０本の三角フラスコから回収した培養液約１Ｌを遠心分離により菌体と上清に分けた。その上清に活性炭５ｇを加えて１時間攪拌した後、ろ紙を使用して活性炭を除去した。そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）５００ｍｌを充
填したカラムに通過させて（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を吸着させ、更に２Ｌの脱イオン交換水を通過させてカラムを洗浄した後、２％アンモニア水２．５Ｌで溶出した。（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水２５０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液をデュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）２５０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に２Ｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄して（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を回収した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水８０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐３６８Ｓ ８０ｍｌを充填したカラムに通過させ
、その後８００ｍｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄して（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を回収した。
【００４２】
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮し、メタノールを加えて結晶化させた。結
晶をろ別して回収し、乾燥させたところ１５２ｍｇの白色結晶が得られた。
この結晶のＮＭＲ分析における1Ｈ-ＮＭＲと13Ｃ-ＮＭＲのケミカルシフト値が、非特許
文献２記載の（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸のそれと一致した。
1Ｈ-ＮＭＲ
d (ｐｐｍ)：３．９８(１Ｈ，ｄｄ)、３．７７(１Ｈ，ｄｔ)、３．５１‐３．６８(３Ｈ
，ｍ)、３．１７(１Ｈ，ｄｔ)、３．０１(１Ｈ，ｄｄｄ)
13Ｃ-ＮＭＲ
d (ｐｐｍ)：１７１．３、６６．８、６４．０、５７．７、４２．９
また、光学純度を測定するためにＨＰＬＣ分析を行ったが（Ｒ）−３−モルホリンカルボン酸のピークは検出されず、得られた結晶は（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸のみであった。
【００４３】
［実施例２］
高濃度Ｌ‐リジン塩酸塩耐性変異株パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株の調製
ＳＣＤ液体培地（日本製薬製）にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株を一白金耳植菌し、２７℃の往復振とう機で１８時間培養した。その培養液１ｍｌを０．８５％食塩水で１０倍に希釈し直径９ｃｍの滅菌シャーレに分注した後、この菌体懸濁液に東芝製ＧＬ-１５殺菌灯を使用して紫外線を９０秒間照射した。
【００４４】
Ｌ‐リジン一塩酸塩 ５５ｇ／Ｌ、酵母エキス ０．１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム １ｇ／
Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム １ｇ／Ｌ、 塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フ
ラスコに入れたフラスコを１本作成し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更に
、そのフラスコに紫外線を照射した菌体懸濁液１０ｍｌを接種して、２７℃、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで７日間好気培養した。
【００４５】
Ｌ‐リジン一塩酸塩濃度が５０ｇ／Ｌになるよう調整したソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地（日本製薬製）を直径９ｃｍの滅菌シャーレに分注して寒天培地を作成し、ロータリーシェーカーで培養した培養液を塗沫して２７℃で培養を行った。寒天上に生育してきたコロニーを分離・選抜して、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を調製した。
【００４６】
［実施例３］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、培養変換による（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の製造
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を用いる以外は実施例１と同様に実施した。培養液中の（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の生産量は５０１ｍｇ／Ｌであった。
【００４７】
［実施例４］
パラコッカス基準株を利用した、培養変換による（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の製造
表２に示したパラコッカス属に属する種々の基準株を用いる以外は実施例１と同様に実施した。各菌株の培養液中の（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の生産量は表２に示すようであった。
【００４８】
【表２】
［実施例５］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、菌体反応による（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の製造
６−アミノヘキサン酸７．２ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物
８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコ
に入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、その培地中にパラコッカス・エスピ
ー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで２４時間好気培養して前培養液を作成した。
【００４９】
次に、６５Ｌ容ジャファーメンターに６−アミノヘキサン酸７．２ｇ／Ｌ、酵母エキス８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム １ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地を３０Ｌ加え、１２１℃で２５分間蒸気滅菌した。植菌直前に別滅菌したグルコース溶液（３００ｇ/Ｌ
）をジャファーメンターに２Ｌ添加し、更に前培養液３００ｍｌを植菌して２７℃、攪拌回転数１８０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍで３８時間培養を行った。
【００５０】
培養液から遠心分離機で菌体を回収し、ろ過滅菌した基質溶液（Ｌ−４−オキサリジン一塩酸塩３０ｇ／Ｌ、グルコース ２２．５ｇ／ＬとなるようｐＨ６．９８の３００ｍＭ
リン酸バッファーで溶解）３Ｌをその回収した菌体に加えて懸濁し、５Ｌ容ミニジャーファーメンターに菌体懸濁液を加えた。反応温度２７℃、攪拌回転数４５０ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍで２５時間菌体反応を行った。反応終了後の反応液中の（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸濃度を測定したところ、１３．８ｇ／Ｌであった。
【００５１】
この反応液から遠心分離により菌体を除去し、その上清に活性炭２４ｇを加えて１時間攪拌した後、ろ紙を使用して活性炭を除去した。そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）２Ｌを充填したカラムに通過させて（Ｓ）−３−モルホリン
カルボン酸を吸着させ、更に５Ｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、２％アンモニア水で溶出した。（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水１Ｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液をデュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）１Ｌを充填したカラムに通過させ、更に２Ｌの脱イオン交換水でカラム
を洗浄して（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を回収した。
【００５２】
その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水９００ｍｌを加えて固形物を溶解した。強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐１１３（ＣＨ3ＣＯＯ-型）２００ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後このカラムを脱イオン交換水で洗浄して（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を回収した。
【００５３】
上記により得た通過液と回収液を減圧濃縮し、活性炭による脱色、０．４５μｍフィルターによるろ過後、ろ液を濃縮しつつメタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の白色結晶が３４．５ｇ得られた。
【００５４】
光学純度を測定するためにＨＰＬＣ分析を行ったが（Ｒ）−３−モルホリンカルボン酸のピークは検出されず、得られた結晶は（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸のみであった。
【００５５】
［実施例６］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株を利用した、培養変換による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造
Ｌ−リジン一塩酸塩１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８
０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピ
ー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp. AB10292）株をスラントから一白金耳接種した。合
計１０本の三角フラスコを２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。培養液中の（Ｓ）−ピペコリン酸濃度を測定したところ、５．８ｇ／Ｌであった。
【００５６】
この１０本の三角フラスコから回収した培養液約１Ｌを遠心分離により菌体と上清に分けた。その培養液上清に活性炭５ｇを加えて１時間攪拌した後、ろ紙を使用して活性炭を除去した。そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）１Ｌを充
填したカラムに通過させて（Ｓ）−ピペコリン酸を吸着させ、更に４Ｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、２％アンモニア水５Ｌで溶出した。（Ｓ）−ピペコリン酸を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水５００ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液をデュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）５００ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に２Ｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄して（Ｓ）−ピペコリン酸を回収した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水２００ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐３６８Ｓ １
００ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに １Ｌの脱イオン交換水を通
過させて（Ｓ）−ピペコリン酸を回収した。
【００５７】
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮し、メタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ３．２ｇの白色結晶が得られた。
この結晶のＨＰＬＣ分析による溶出時間及びＮＭＲ分析における1Ｈ-ＮＭＲと13Ｃ-ＮＭ
Ｒのケミカルシフト値が、標準品である（Ｓ）−ピペコリン酸のそれと一致した。
1ＨＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１．３７−１．５９(３Ｈ，ｍ)、１．７０−１．７７(２Ｈ，ｍ)、２．０８(１Ｈ，ｍ)、２．８６(１Ｈ，ｍ)、３．２７(１Ｈ，ｍ)、３．４３(１Ｈ，ｍ)
13ＣＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１７５.４、５９．８、４４．５、２７．３、２２．６、２２．４
また、光学純度を測定するためにＨＰＬＣ分析を行ったが（Ｒ）−ピペコリン酸のピークは検出さず、得られた結晶は（Ｓ）−ピペコリン酸のみであった。
【００５８】
［実施例７］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株を利用した、ＤＬ−リジン一塩酸からの培養変換による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造
ＤＬ−リジン一塩酸塩３ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム １ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピ
ー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株をスラントから一白金耳接種した。その三角フラスコを２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。培養液中の（Ｓ）−ピペコリン酸濃度を測定したところ、０．７６ｇ／Ｌであった。
【００５９】
［実施例８］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、培養変換による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造
Ｌ−リジン一塩酸塩５ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０
μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種した。２７℃
で２４時間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養して前培養液を作成した。
【００６０】
Ｌ−リジン一塩酸塩６５ｇ／Ｌ、酵母エキス５．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物８０μｇ／Ｌ、炭酸カルシウム２ｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前にそのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（３７５ｇ/Ｌ）を１６ｍｌ添加し、更にそ
の培地中に前培養液を５ｍｌ接種した。２７℃で１２日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養し、培養液中の（Ｓ）-ピペコリン酸濃度を測定したところ３
８．４ｇ／Ｌであった。
【００６１】
［実施例９］
パラコッカス属基準株を利用した、培養変換による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造
Ｌ−リジン一塩酸塩３ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前にそのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中に表３に示したパラコッカ
ス属に属する種々の菌株をスラントから一白金耳接種した。その後、２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。各菌株培養液中の（Ｓ）−ピペコリン酸生産量は表３に示すようであった。
【００６２】
【表３】
［実施例１０］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、菌体反応による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造
６−アミノヘキサン酸７．２ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム １ｇ／Ｌ
、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラス
コに入れたフラスコを１０本作成し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、その培
地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種して、２７℃で２日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００６３】
次に、培養液を集めて約１Ｌとし、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行って上清を除去した。その沈殿した菌体に５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．９８）を２００ｍｌ加えてよく撹拌し、再び８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行って上清を除去して菌体反応用の菌体を得た。
【００６４】
その菌体に、ろ過滅菌した基質溶液（Ｌ−リジン一塩酸塩 ３０ｇ／Ｌ、グルコース ２２．５ｇ／ＬになるようｐＨ６．９８の３００ｍＭリン酸バッファーで溶解）を１００ｍｌ加えて懸濁し、５００ｍｌ容三角フラスコにその菌体懸濁液を加えた。２７℃、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで２７時間菌体反応を行った後、反応液中の（Ｓ）−ピペコリン酸濃度を測定したところ、１６．２ｇ／Ｌであった。
【００６５】
［実施例１１］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株を利用した、培養変換によるｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸及びｃｉｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸の製造
５−ヒドロキシ−ＤＬ−リシン塩酸塩３.３ｇ／Ｌ(和光純薬製)、酵母エキス２ｇ／Ｌ
、塩化ナトリウム １ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０.２９ｇ／Ｌ、リン酸水素２ナトリウム１２水和物 ６．８６ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ
）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株をスラントから一白金耳接種した。この三角フラスコ３本を２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００６６】
培養液上清をＴＬＣで分析したところ、５−ヒドロキシ−ＤＬ−リシン塩酸塩とは明らかに異なるＲｆ値を示す青紫色のニンヒドリン発色物質が２物質認められた（展開溶媒 アセトニトリル：メタノール：水＝３：１：１、Ｒｆ値＝０．３０８、０．３５６、メルク社製ＴＬＣプレート；シリカゲル６０Ｆ254）。
【００６７】
この三角フラスコから回収した培養液約３００ｍＬを遠心分離により菌体と上清に分けた。その遠心上清を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）１００ｍｌ
を充填したカラムに通過させてニンヒドリン発色物質を吸着させ、更に５００ｍＬの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、２％アンモニア水５００ｍＬで溶出した。溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水５０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）５０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に２５０ｍＬの脱イオン交換水でカラムを洗浄してニンヒドリン発色物質を回収した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水５０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐１１３（ＣＨ3ＣＯＯ-型） １０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に５０ｍｌの脱イ
オン交換水でカラムを洗浄してニンヒドリン発色物質を回収した。
【００６８】
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水１ｍｌを加えて固形物を溶解した。活性炭素(顆粒状・和光純薬製)７０ｍｌを充填したカラムを用いて溶解液のカラムクロマトグラフィーを行い、ニンヒドリン発色する２物質を回収した。
【００６９】
上記により得た回収液を減圧下濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水０．５ｍｌを加えて固形物を溶解した。強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン ＵＢＫ５３０（Ｃａ2+型
）２００ｍｌを充填したカラムを用いて溶解液のカラムクロマトグラフィーを行い、Ｒｆ値＝０．３５６を示す物質を４４ｍｇ、Ｒｆ値＝０．３０８を示す物質を８４ｍｇ単離した。
【００７０】
Ｒｆ値＝０．３５６を示す物質をＮＭＲ分析したところ、その1Ｈ-ＮＭＲと13Ｃ-ＮＭ
Ｒのケミカルシフト値が、非特許文献７に記載されているｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ-
（Ｓ）-ピペコリン酸のそれと一致した。また、この物質の比旋光度は［α］D＝−２０．２°（ｃ；１．０、Ｈ2Ｏ、２３℃）であった。
1ＨＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１．５４−１．６４(１Ｈ，ｍ)、１．６８−１．８１（1Ｈ，ｍ）、２．０１−２．１０（１Ｈ，ｍ）、２．２４−２．３３（１Ｈ，ｍ）、２．７８−２．８６（１Ｈ，ｍ）、３．４３(１Ｈ，ｄｄ)、３．５９(１Ｈ，ｄｄ)、３．９４(１Ｈ，ｍ)
13ＣＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１７３．８、６３．２、５８．０、４７．２、２９．８、２３．８
【００７１】
【化６】
Ｒｆ値＝０．３０８を示す物質は、1Ｈ-ＮＭＲと13Ｃ-ＮＭＲの分析結果及び生成に使
用した基質から考えてciｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸と考えられる。また、この物質の比旋光度は［α］D＝−３０．６°（ｃ；２．０、Ｈ2Ｏ、２３℃）であった。1ＨＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１．７７−２．１４(４Ｈ，ｍ)、３．１９(１Ｈ，ｄｄ)、３．３２(１Ｈ，ｄｔ)、３．６３(１Ｈ，ｄｄ)、４．１５−４．１９(１Ｈ，ｍ)
13ＣＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１７３．４、６０．８、２、５８．０、４７．５、２７．６、２０．５
【００７２】
【化７】
［実施例１２］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、菌体反応によるｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸及びｃｉｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸の製造
６−アミノヘキサン酸 ７．２ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム １ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム １ｇ／Ｌ、 塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラ
スコに入れたフラスコを２本作成し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、その培
地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で４０時間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００７３】
次に、培養液から遠心分離機で菌体を回収し、ろ過滅菌した基質溶液（５−ヒドロキシ−ＤＬ−リシン塩酸塩２０ｇ／Ｌ、グルコース １５ｇ／ＬとなるようｐＨ６．９８の３
００ｍＭリン酸バッファーで溶解）２０ｍＬをその回収した菌体に加えて懸濁し、１００ｍｌ容三角フラスコに菌体懸濁液を加えた。その後、反応温度２７℃、回転数１６０ｒｐｍのロータリーシェーカーで３２時間菌体反応を行った。
【００７４】
生産を確認するために反応液上清をＴＬＣで分析したところ、Ｒｆ値＝０．３０８と０．３５６にそれぞれ、ｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸とciｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸のニンヒドリン発色が認められた（展開溶媒 アセトニトリル：メタノール：水＝３：１：１、メルク社製ＴＬＣプレート；シリカゲル６０Ｆ254
）。
【００７５】
［実施例１３］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、培養変換による（Ｒ）−３−チオモルホリンカルボン酸の製造
Ｌ−アラニン２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸水素ナトリウム一水和物２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン２０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／Ｌ、（＋）ビオチン０．１ｍｇ／Ｌ、シアノコバラミン２.５ｍ
ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物２５０μｇ／Ｌ、硫酸銅５水和物２５０μｇ／Ｌ、塩化カルシウム２．５ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛７水和物５００μｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物５００μｇ／Ｌ、塩化ニッケル６水和物２５０μｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水和物２５０μｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム５μｇ／Ｌ、ホウ酸２５μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れたフラスコを１０本作成し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコにＬ−４−チアリジン一塩酸塩水溶液（２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌを各フラスコにろ過滅菌して添加した。同様に別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を各フラスコに８ｍｌ添加し、その培
地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で９０時間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００７６】
次に、培養液から遠心分離機で菌体を除去し、その上清を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）５００ｍｌを充填したカラムに通過させて（Ｒ）−３−チオ
モルホリンカルボン酸を吸着させ、更に２Ｌの脱イオン交換水で洗浄した後、２％アンモニア水５Ｌで溶出した。溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水２５０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）２５０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に２Ｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水８０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐１１６（ＣＨ3ＣＯＯ-型）８０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に８００ｍｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄した。
【００７７】
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水２０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶液をＴＬＣで分析したところ、Ｒｆ値＝０．４９４にニンヒドリン発色物質が認められた（展開溶媒 アセトニトリル：メタノール：水＝３：１：１、メルク社製ＴＬＣプレート；シリカゲル６０Ｆ254）。
【００７８】
その溶液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水４ｍｌを加えて固形物を溶解した。弱酸性陽イオン交換樹脂アンバーライト ＣＧ−５０（ＮＨ4+型）２５０ｍｌを充填
したカラムを用いてその溶液のカラムクロマトグラフィーを行い、Ｒｆ値＝０．４９４を示す物質を含む画分を回収した。その溶液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水２０ｍｌを加えて固形物を溶解し、活性炭による脱色、０．４５μｍフィルターによるろ過後、その溶液を濃縮しつつメタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ白色結晶が８４ｍｇ得られた。
【００７９】
このＲｆ値＝０．４９４を示すニンヒドリン発色物質は、1Ｈ-ＮＭＲと13Ｃ-ＮＭＲの
分析結果及び生成に使用した基質から考えて（Ｒ）-３-チオモルホリンカルボン酸と考えられる。また、この物質の比旋光度は［α］D＝−５３．２°（ｃ；２．０、Ｈ2Ｏ、２３℃）であった。
1ＨＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：２．７４−２．８２(１Ｈ，ｍ)、２．８９−３．１３ (３Ｈ，ｍ)、３．２９(１Ｈ，ｄｄｄ)、３．６９(１Ｈ，ｄｔ)、３．８４(１Ｈ，ｄｄ)
13ＣＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１７２．３、５９．３、４５．３、２７．５、２３．８
【００８０】
【化８】
［実施例１４］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、菌体反応による（Ｒ）−３−チオモルホリンカルボン酸の製造
６−アミノヘキサン酸７．２ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物
８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコ
に入れたフラスコを４本作成し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、その培地中
にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で４４時間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００８１】
次に、培養液から遠心分離機で菌体を回収し、基質溶液（Ｌ−４−チアリジン一塩酸塩
１０ｇ／Ｌ、グルコース ７．５ｇ／ＬとなるようｐＨ６．９８の３００ｍＭリン酸バッファーで溶解）４０ｍＬをその回収した菌体に加えて懸濁し、２００ｍｌ容三角フラスコに菌体懸濁液を加えた。その後、反応温度２７℃、回転数１６０ｒｐｍのロータリーシェーカーで２７時間菌体反応を行った。
【００８２】
反応液上清をＴＬＣで分析したところ、Ｌ−４−チアリジン一塩酸塩はほとんど消失し、Ｒｆ値＝０．４９４に（Ｒ）-３-チオモルホリンカルボン酸のニンヒドリン発色が認められた（展開溶媒 アセトニトリル：メタノール：水＝３：１：１、メルク社製ＴＬＣプレート；シリカゲル６０Ｆ254）。
【００８３】
この反応液から遠心分離により菌体を除去し、そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）４０ｍｌを充填したカラムに通過させて（Ｒ）-３-チオモル
ホリンカルボン酸を吸着させ、更に２００ｍｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、２％アンモニア水で溶出した。ニンヒドリン発色物質を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水４０Ｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）２０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に１００ｍｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄して（Ｒ）-３-チオモルホリンカルボン酸を回収した。
【００８４】
その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水１０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐１１３（ＣＨ3
ＣＯＯ-型）３ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に脱イオン交換水でカラムを洗浄し
て（Ｒ）-３-チオモルホリンカルボン酸を回収した。
【００８５】
上記により得た通過液と回収液を減圧濃縮し、活性炭による脱色、０．４５μｍフィルターによるろ過後、溶液を濃縮しつつメタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ（Ｒ）-３-チオモルホリンカルボン酸の白色結晶が７０．５ｍｇ得られた。この結晶の比旋光度は、［α］D＝−５３．７°（ｃ；２．０、Ｈ2Ｏ、２３℃）であった。
【００８６】
［比較例１］
Ｄ−リジン一塩酸塩３ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株をスラントから一白金耳接種した。その三角
フラスコを２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。培養終了後の培養液中に（Ｓ）-ピペコリン酸及び（Ｒ）-ピペコリン酸のいずれも検出されなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医農薬化合物を創製する際の合成原料または中間体として重要な、光学活性環状アミノ酸の微生物を用いる製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬理活性を有する化合物の創製において、環状アミノ酸である（Ｓ）−ピペコリン酸や（Ｓ）−3−モルホリンカルボン酸等を分子内に含んだ化合物や、環状アミノ酸を合成中
間体または原料として利用した例は多い（非特許文献１、特許文献１〜８参照）。従って、光学純度の高い光学活性環状アミノ酸である（Ｓ）−ピペコリン酸、（Ｓ）−3−モル
ホリンカルボン酸、（Ｒ）−３‐チオモルホリンカルボン酸、５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸等は、合成医農薬品の原料として有用な化合物である。
【０００３】
【化３】
従来の光学活性（Ｓ）−3‐モルホリンカルボン酸を製造する方法としては、
光学活性アジリジン−２−カルボン酸誘導体を出発物質として、３段階の合成反応（２−クロロエタンの付加、ベンジル基の脱離およびトリエチルアミン環化剤として使用する環化反応）を経て製造する方法（非特許文献２、３参照）、
Ｌ−セリン誘導体から５段階の合成反応を経て製造する方法（非特許文献４参照）、
ジアミノ酸等からα位のアミノ基を脱アミノ化して１位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成する酵素（たとえばアミノ酸オキシダーゼ）と、シュードモナス属の微生物等から得られるＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼとを用いた酵素反応によって、Ｌ−４−オキサリジンから中間体の上記環状アミノ酸を経て（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を製造する方法（特許文献９参照）が知られている。
【０００４】
また、光学活性（Ｓ）−ピペコリン酸（Ｌ−ピペコリン酸と表記されることもある。）を製造する方法としては、
Ｌ−リジンやその誘導体を出発物質として、亜硝酸ナトリウムによるα位アミノ基のジアゾ化および水酸化バリウムや水酸化ナトリウムを環化剤として用いる環化反応によって（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（非特許文献５、特許文献１０参照）、
Ｌ−α−アミノカプロン酸のε位にエチレンアセタールを持つ化合物を酸性条件下で還元して（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１１参照）、
前述のようにシュードモナス属の微生物から得られるＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼなどを用いた酵素反応によってＬ−リジンからから（Ｓ）−ピペコリン酸を製
造する方法（特許文献９参照）、
アルカリゲネス属、プロデンシア属、プロテウス属、バチルス属、アグロバクテリウム属、モルガネラ属、プラノコッカス属の何れかに属する微生物を用いて菌体反応によってＬ−リジンから（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１２参照）、
フラボバクテリウム属の微生物等が有するリジン−６−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子（lat）と大腸菌やコリネ型細菌等が有するピロリン−５−カルボン酸レ
ダクターゼをコードする遺伝子（proC）とが導入された組換え大腸菌を用いた培養変換によって、あるいはそのような組換え大腸菌の菌体破砕液を用いて、Ｌ−リジンからデルタ−１−ピペリデイン−２−カルボン酸を経て（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１３参照）、
アグロバクテリウム属の微生物が有するオルニチンシクロデアミナーゼまたはこれと相同のストレプトミセス属の微生物が有する酵素を用いた酵素反応により、あるいはこれらの酵素をコードする遺伝子（ocd、pipA、rapL）が導入された組換え大腸菌の菌体破砕液
を用いて、Ｌ−リジンから（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献１４参照)、
ノイロスポラ属、シュードモナス属、大腸菌及びメタノール資化性菌などの微生物起源の、または豚腎などの動物起源のＤ−アミノ酸オキシダーゼと水素化ホウ素等の還元剤とを、Ｄ−またはＤＬ−ピペコリン酸に作用させ、Ｄ−ピペコリン酸からΔ1−ピペリデイ
ン−２−カルボン酸への選択的な酸化と還元剤によるラセミ体の生成反応との共役反応により（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１５参照）、
Ｎ−保護−Ｄ−ピペコリン酸誘導体を加水分解しうる酵素（Ｄ−アミノアシラーゼ）を用いた酵素反応により、または当該酵素を含有するアルスロバクター属の微生物を用いた菌体培養により、ラセミ体ピペコリン酸誘導体から（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１６参照）、
アルカリゲネス属の微生物が有するＮ−アシル−ピペコリン酸アシラーゼを用いた酵素反応による、Ｎ−アセチル−（Ｒ，Ｓ）−ピペコリン酸の立体選択的な加水分解により（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１７参照）、
シュードモナス属またはクレブシエラ属の微生物を用いた菌体反応により、あるいはこれらの微生物に含まれるＳ−アミノ酸アミダーゼを用いた酵素反応により、（Ｒ，Ｓ）−ピペコリン酸アミドから（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１８参照）、
（±）−ピペコリン酸を溶媒中で光学分割剤としてのＳ−（−）−２−フェノキシプロピオン酸と反応させ、生成した難水溶性のＳ−（−）−ピペコリン酸・Ｓ−（−）−２−フェノキシプロピオン酸塩を回収し、これを酸で複分解することにより光学的に純粋なＳ−（−）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献１９参照）、
ハロゲン基を側鎖末端に有し、アミノ基がアセチル基等で保護されたアミノ酸誘導体（たとえば比較的安価なアセタミドマロン酸ジエチルから４段階の合成反応を経て得られるＮ−アセチル−２−アミノ−６−ブロモヘキサン酸）のラセミ体溶液に、アスペルギルス属の微生物が有するＬ−アミノアシラーゼを添加し、Ｌ−エナンチオマー特異的作用による脱アセチル化を行う酵素反応および分子内環化によって（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法（特許文献２０参照）が知られている。
【０００５】
光学活性（Ｒ）−３−チオモルホリンカルボン酸を製造する方法としては、有機合成による方法（非特許文献２、３参照）や、Ｌ−４−チアリジンから酵素反応或いは菌体破砕液によって製造する方法（特許文献９、１４参照）が知られている。
【０００６】
５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸を製造する方法としては５−ヒドロキシ−ＤＬ−リジンから酵素反応或いは菌体破砕液によって製造する方法（特許文献９、１４参照）が知られている。
【特許文献１】国際公開第０２／８３６２４号パンプレット
【特許文献２】国際公開第０２／８５８６０号パンプレット
【特許文献３】国際公開第２００４／７４２９１号パンプレット
【特許文献４】国際公開第２００４／９２１６７号パンプレット
【特許文献５】国際公開第２００５／１０８３５９号パンプレット
【特許文献６】米国特許第７１６９７８０号
【特許文献７】米国公開２００２−００９９０４７号
【特許文献８】米国公開２００４−０１５２７４５号
【特許文献９】特開２００５−９５１６７号公報
【特許文献１０】特開２００４−５１６０６号公報
【特許文献１１】特開２００８−７４８０号公報
【特許文献１２】日本国特許第３２６６６３５号
【特許文献１３】国際公開第０１／４８２１６号パンプレット
【特許文献１４】日本国特許第３９４３５４０号
【特許文献１５】日本国特許第３１３５３６７号
【特許文献１６】特表２００２−５０９４４１号公報
【特許文献１７】特表平０９−５０３６６９号公報
【特許文献１８】特開平０８−５６６５２号公報
【特許文献１９】特開２０００−１７８２５３号公報
【特許文献２０】特開２００４−２６１０８６号公報
【非特許文献１】J. Med. Chem. , 1995, Vol. 38, p.1853‐1864
【非特許文献２】Bull. Chem. Soc. Jpn. , 1987, Vol. 60, p.2963‐2965
【非特許文献３】Peptide Chemistry , 1986, p.153-156
【非特許文献４】Ｊ. Org. Chem. , 2007, Vol. 72, p.4254-4257
【非特許文献５】Chem. Pharm. Bull. , 1976, Vol. 24, p.621-631
【非特許文献６】Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967, p.401-406
【非特許文献７】Bull. Soc. Chim. Belg. , 1982, p.713-723
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献２〜４記載の化学合成による光学活性(Ｓ)‐3‐モルホリンカルボン酸また
は（Ｒ）−３−チオモルホリンカルボン酸の製造方法では、各反応終了時に中間体を反応液から取り出す工程が必要であり、操作が煩雑であることから生産コストが高くなる問題点がある。非特許文献５記載の化学合成による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造方法も反応工程数が多く操作が煩雑であり、特許文献１１の製造方法は原料物質がＬ−リジンのように安価ではないという問題がある。特許文献１９記載の光学分割剤を使用する製造方法では光学分割剤が高価であり、また非修飾ピペコリン酸のみを対象としていて(Ｓ)‐３‐モルホリンカルボン酸の製造には利用できないという問題がある。
【０００８】
また、特許文献９に記載された、酵素反応によってジアミノ酸から(Ｓ)‐３‐モルホリンカルボン酸、（Ｓ）−ピペコリン酸、(Ｒ)‐3‐チオモルホリンカルボン酸、５−ヒド
ロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸など製造する方法は、収率が低いことに加え、酵素反応を行うための酵素が高価であったり、酵素の調製を菌体から行う必要があるなど、製造時の工程数増加・製造コスト増という問題がある。特許文献１４記載の酵素反応を利用した（Ｓ）−ピペコリン酸、（Ｒ）−３−チオモルホリンカルボン酸、５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸などを製造する方法も、酵素反応を行うための酵素を遺伝子組み換え大腸菌の菌体破砕などにより調製する必要があり、製造時の工程数増加・製造コスト増という問題があるため、必ずしも満足できるものではない。酵素反応を利用してラセミ体から（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する特許文献１５〜１７記載の方法もやはり、酵素の調製が煩雑で製造工程が多いという問題がある。特許文献２０記載の方法には、酵素反応の基質となる化合物を有機合成により調製するため工程数が多いという問題もある。
【０００９】
さらに、特許文献１２に記載された、自然界から分離されたアルカリゲネス属等に属す
る微生物を利用して（Ｓ）−ピペコリン酸を製造する方法では、菌体反応に使用する微生物の生産時の培養温度が２０℃という低温であり、工業的に製造する場合にはコスト増要因となる。また、この菌体反応における最大生産量も約４．２ｇ／Ｌと低く工業的に満足できるものではなかった。更に、Ｌ−リジン以外のジアミノ酸を原料にして（Ｓ）−ピペコリン酸以外の環状アミノ酸を製造することに関する記載が全く無いため、(Ｓ)‐3‐モ
ルホリンカルボン酸等の製造に応用できるかどうか不明である。
【００１０】
特許文献１３記載の遺伝子組換え大腸菌を利用した培養変換による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造法についても、Ｌ−リジン以外のジアミノ酸を原料にして（Ｓ）−ピペコリン酸以外の環状アミノ酸を製造することに関する記載が全く無いため、(Ｓ)‐3‐モルホリン
カルボン酸等の製造に応用できるかどうか不明である。特許文献１８記載のラセミ体ピペコールアミドからシュードモナス属またはクレブシエラ属の微生物を利用した菌体反応による（Ｓ）−ピペコリン酸製造方法には光学純度が低いという問題がある。
【００１１】
すなわち、本発明の目的は、自然界から分離された微生物またはその変異株を用いて、微生物変換により工業製法的に効率よく、安価に、各種のジアミノ酸から光学活性環状Ｌ−アミノ酸の生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記の目的を達成すべく鋭意研究を行った。その結果、本発明者により自然界の種々の分離源から分離された各種の微生物のうち、パラコッカス（Paracoccus）属に属する微生物、その中でもパラコッカス・エスピーＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株またはその変異株であるパラコッカス・エスピーＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株とパラコッカス属基準株が、各種のジアミノ酸から光学活性環状アミノ酸を生産することを発見し、本発明を完成した。
【００１３】
即ち本発明は、
式（Ｉ）
【００１４】
【化４】
［式（Ｉ）中、Ｘは、飽和のまたは部分的に若しくは全体的に不飽和の、直鎖または分枝鎖のＣ1−Ｃ6炭化水素鎖を表し、該炭化水素鎖は、その内部および／または末端に、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｎの内から選択する一個または数個のヘテロ原子またはヘテロ原子団を含んでいてもよく、あるいは、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、＝Ｏ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ、−Ｃ(Ｓ)ＯＲ、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ'Ｒ"、−Ｃ(Ｓ)ＮＲ'ＲＲ"、−ＣＮ、−ＮＯ2、−Ｘ、−ＭｇＸ、−ＮＲ'Ｒ"、
−ＮＲ'Ｃ(Ｏ)Ｒ、−ＳｉＲ及び−ＳｉＯＲ（Ｒ、Ｒ'及びＲ"は、同一のまたは相違する
、水素または２〜２０の炭素原子を有する直鎖若しくは分枝鎖の飽和のまたは全体的に若しくは部分的に不飽和の炭化水素基を表す。）の内から選択する一個または数個の同じまたは異なる基によって置換されていてもよく、Ｒ'とＲ"は、それらを有する原子と共に環を形成していてもよい。］で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を、式（ＩＩ）
【００１５】
【化５】
［式（ＩＩ）中、Ｘは式（Ｉ）中で規定した通りである。］で示される環状アミノ酸および／またはその塩類に変換する活性を有するパラコッカス属に属する微生物を用い、培養変換或いは菌体反応変換によって、式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類、または式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および対応するＤ−ジアミノ酸、それらの塩類を様々な割合で含む鏡像体混合物から、式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸および／またはその塩類を効率よく生産する製造方法に関するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の微生物による環状アミノ酸の製造法は、培養が容易なパラコッカス属に属する微生物またはその変異株を利用して、安価なジアミノ酸から各種の光学活性環状Ｌ−アミノ酸への安定した生産・供給を実現するものであり、光学活性環状アミノ酸の製造効率の向上や製造コストの削減を図ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明で使用する式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類、または式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および対応するＤ−ジアミノ酸、それらの塩類を様々な割合で含む鏡像体混合物は、市販品を購入して使用することができるし、公知の方法によって微生物による発酵生産物から製造することもできる。
【００１８】
たとえば、L−4−オキサリジンであれば、L−4−オキサリジン一塩酸塩（和光純薬工業社製及びAldrich社製）が市販されており、非特許文献６に記載のように、Streptomyces chartreuseまたはStreptomyces erythrochromogenesに属する放線菌を培養し、培養液中
からL−4−オキサリジンおよび／またはその塩類を分離・精製することも可能である。また、新たにL−4−オキサリジン生産微生物を自然界から分離して製造に使用してもよい。発酵生産によってL−4−オキサリジンを製造することで、安価に出発物質としてのL−4−オキサリジンを容易に入手することができる。
【００１９】
L−リジン塩酸塩またはL−およびＤ−リジン塩酸塩混合物、L−４−チアリジン塩酸塩
および５−（Ｒ，Ｓ）ヒドロキシ−Ｌ−および５−（Ｒ，Ｓ）ヒドロキシ−Ｄ−リジン塩酸塩混合物は市販品（和光純薬工業社製など）を購入して使用することができる。
【００２０】
本発明の方法で用いられる光学活性環状アミノ酸の生産菌は、パラコッカス属に属する微生物で、光学活性環状アミノ酸を産生する能力を有するものであれば、いかなる微生物でもよい。パラコッカス属に属する微生物としては、例えば、パラコッカス・ヴェルスタス ＮＢＲＣ１４５６７（Paracoccus versutus）、パラコッカス・チオシアネイタス Ｎ
ＢＲＣ１４５６９（Paracoccus thiocyanatus）、パラコッカス・アミノフィルス ＮＢＲＣ１６７１０（Paracoccus aminophilus）、パラコッカス・アミノボランス ＮＢＲＣ１
６７１１（Paracoccus aminovorans）、パラコッカス・コクリイ ＮＢＲＣ１６７１３（Paracoccus kocurii）、パラコッカス・アルカリフィルス ＮＢＲＣ１６７１９（Paracoccus alcaliphilus）、パラコッカス・セリニフィルス ＮＢＲＣ１００７９８（Paracoccus
seriniphilus）、パラコッカス・コリエンシス ＮＢＲＣ１０２２９２（Paracoccus koreensis）、パラコッカス・パントトロフス ＮＢＲＣ１０２４９３（Paracoccus pantotrophus）、パラコッカス・デニトリフィカンス ＮＢＲＣ１０２５２８（Paracoccus denitr
ificans）、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）、パラ
コッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）等があげられる。
【００２１】
上記パラコッカス属に属する微生物の中で、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２
（Paracoccus sp. AB10292）株は、本発明者が神奈川県伊勢原市より採取した土壌から新たに分離した菌株である。このＡＢ１０２９２株の菌学的諸性質を次に記載する。
【００２２】
（Ａ）形態的特徴
（１）細胞形態：桿菌で大きさは０．１〜１．１×１．１〜２．０μｍ
（２）ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地上での生育：生育は良好。コロニー形状は円形、隆起状態は半球状、コロニー周縁は全縁状であり、色調は光沢を帯びたクリーム色である。
【００２３】
（Ｂ）生理生化学的性状
（１）グラム染色： −
（２）ＯＦテスト： −
（３）好気条件での生育： ＋
（４）嫌気条件での生育： −
（５）生育温度：
１０℃ ＋
２７℃ ＋
３７℃ −
（６）カタラーゼ： ＋
（７）オキシダーゼ： ＋
（８）ウレアーゼ： −
（９）硝酸塩還元性： ＋
（１０）脱窒反応： −
（１１）６％食塩耐性： −
（１２）β‐ガラクトシダーゼ： −
（１３）アルギニンジヒドロラーゼ： −
（１４）Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ： −
（１５）Ｌ−オルニチンデカルボキシラーゼ： −
（１６）クエン酸の利用性： −
（１７）硫化水素産生： −
（１８）トリプトファミナーゼ： −
（１９）インドール産生： −
（２０）アセトイン産生： −
（２１）ゼラチナーゼ： −
（２２）各種糖から酸の生成：
Ｄ−グルコース −
Ｄ−マンニトール −
Ｄ−ソルビトール −
Ｄ−メリビオース −
Ｌ−ラムノース −
Ｌ−アラビノース −
シュークロース −
ミオ‐イノシトール −
Ｄ−アミダグリン −
（２３）炭素源の資化性
Ｄ−グルコース ＋
Ｄ−キシロース ＋
Ｄ−マンニトール −
Ｄ−フルクトース −
シュークロース −
ミオ‐イノシトール −
以上のとおりＡＢ１０２９２株の主性状は、グラム陰性の桿菌で好気条件にて生育し、カタラーゼ、オキシダーゼ、硝酸塩還元性が陽性であり、ウレアーゼ、脱窒反応が陰性であった。
【００２４】
さらに１６Ｓリボゾームの塩基配列解析結果から、本菌株はパラコッカス属に近縁の細菌であると考えられた。しかし、表１に示すようにパラコッカス属基準株との相同性の一致率は低いため、１６Ｓリボゾームの塩基配列解析結果から種まで特定することは困難であった。
【００２５】
【表１】
そのため、Bergey's manual of Systematic Bacteriology (1984) 及び International
Journal of Systematic Bacteriology 誌を参考にして、上記５菌株とＡＢ１０２９２株との生理・生化学的比較試験を行った。
【００２６】
その結果、パラコッカス・デニトリフィカンス ＮＢＲＣ１０２５２８（Paracoccus denitrificans）及びパラコッカス・アミノボランス ＮＢＲＣ１６７１１（Paracoccus aminovorans）とはＡＢ１０２９２株が脱窒反応活性を持たない点、３７℃での生育ができない点で異なった。
【００２７】
パラコッカス・アルカリフィルス ＮＢＲＣ１６７１９（Paracoccus alcaliphilus）とはＡＢ１０２９２株がウレアーゼ活性を持たない点、３７℃での生育ができない点で異なり、パラコッカス・セリニフィルス ＮＢＲＣ１００７９８（Paracoccus seriniphilus）とはＡＢ１０２９２株が生育可能なソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地でパラコッカス・セリニフィルス ＮＢＲＣ１００７９８（Paracoccus seriniphilus）が生育できない点から明らかに異なるものであった。
【００２８】
パラコッカス・アミノフィルス ＮＢＲＣ１６７１０（Paracoccus aminophilus）とは
硝酸塩還元活性をＡＢ１０２９２株が硝酸塩還元活性を持つ点で異なった。以上の結果から、生理・生化学的性状の比較を行っても種まで特定することは困難であった。
【００２９】
従って、本発明者は本菌株をパラコッカス・エスピー（Paracoccus sp.）と同定し、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）と命名した。なお、この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所生物寄託センターに寄託申請され、平成２０年７月１６日、ＦＥＲＭ Ｐ―２１６０５号として受託されている。
【００３０】
ここまで光学活性環状アミノ酸生産菌パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Parac
occus sp.AB10292）株について説明したが、一般的には菌類の菌学上の性状は極めて変化しやすく、一定したものではない。菌類は、自然的あるいは通常行われている紫外線照射、Ｘ線照射、変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンおよびエチルメタンスルホネート等）または遺伝子組換えを用いる人為的変異手段により変異することは周知の事実である。このような自然変異株ならびに人工変異株も含め、パラコッカス属に属し、光学活性環状アミノ酸を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
【００３１】
その具体的な例として、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株の高濃度Ｌ-リジン塩酸塩耐性変異株であるパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株があげられる。なお、この変異株は、独立行政法人産
業技術総合研究所生物寄託センターに寄託申請され、平成２０年７月１６日、ＦＥＲＭ Ｐ―２１６０６号として受託されている。
【００３２】
これらの微生物を培養中に、直接ジアミノ酸を培養液に添加させ、ジアミノ酸の大部分が光学活性アミノ酸に変換されるまで培養を行う。これらの微生物を培養して菌体をえた後、ジアミノ酸をふくむ反応液中に菌体を懸濁して、反応させてもよい。また、これらの微生物の突然変異体や遺伝子組換え体あるいはそれらの菌体処理物等を本発明に使用することができる。
【００３３】
本発明の培養変換および菌体反応に使用する菌体の生産で使用されるジアミノ酸以外の培地成分としては、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子及び使用する微生物が要求する栄養物質を含有する培地であればいずれであってもよい。炭素源としては、グルコース、キシロース、マルトース、グリセリン、デンプン、デキストリン、水飴、糖蜜、動・植物油等の光学活性環状アミノ酸生産菌が利用可能なものが使用可能である。窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、魚粉、コーンスティープリカー、酵母エキス、アミノ酸、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等光学活性環状アミノ酸生産菌が利用可能なものを使用できる。また、必要により微量金属塩、例えばコバルト、鉄、ニッケル、マンガン等を添加できる。また、６‐アミノヘキサン酸のような光学活性環状アミノ酸の生産を促進するような無機および有機物を適当に添加することが出来る。また、硫酸アンモニウムのような無機窒素源を添加しない培地で、且つジアミノ酸を添加しない培地を使用しても菌体反応に使用可能な菌体を生産することができる。
【００３４】
本発明の培養変換における培養は好気条件下で、静置培養、振とう培養、攪拌培養等で行う。通常培養温度は１５〜４０℃の範囲であるが、多くの場合２４〜３０℃で培養する。培養中のｐＨは３．０〜８．０の範囲で行なうのが好ましく、必要に応じて培養液中のｐＨ調整を行ってもよいし、炭酸カルシウムのようなｐＨ調整剤を添加してもよい。ジアミノ酸および／またはその塩類は初発に添加してもよいし、培養途中から一度に或いは少量ずつ添加してもよい。培養日数は通常１〜１４日間であるが、培養中の光学活性環状アミノ酸蓄積量が最高に達したときに培養を停止し、培養液から生産物を一般的な方法に準じて採取する。これらの培地組成、培地の液性、培養温度、撹拌速度および通気量等の培養条件は、使用する菌株の種類および外部条件等に応じて好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選抜する。液体培養において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。
【００３５】
本発明の菌体反応に使用する菌体の培養は、好気条件下で、静置培養、振とう培養、攪拌培養等で行う。通常培養温度は１５〜４０℃の範囲であるが、多くの場合２４〜３０℃で培養する。培養中のｐＨは３．０〜８．０の範囲で行なうのが好ましく、必要に応じて培養液中のｐＨ調整を行ってもよいし、炭酸カルシウムのようなｐＨ調整剤を添加してもよい。ジアミノ酸や６‐アミノヘキサン酸のような変換活性を増強する物質は、初発に添
加してもよいし、培養途中から一度に或いは少量ずつ添加してもよい。培養日数は通常１２時間〜７日間であるが、菌体反応時に環状アミノ酸を変換できる活性を有した微生物が生育したときに培養を停止し、培養液から菌体を一般的な方法に準じて回収する。これらの培地組成、培地の液性、培養温度、撹拌速度および通気量等の培養条件は、使用する菌株の種類および外部条件等に応じて好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選抜する。液体培養において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。
【００３６】
菌体反応は好気条件下で、振とう条件、通気攪拌条件等で行う。通常反応温度は１５〜４０℃の範囲であるが、多くの場合２５〜３７℃で反応する。混合液中のｐＨは３．０〜８．０の範囲で行なうのが好ましく、緩衝液中か或いは必要に応じて反応液中のｐＨ調整を行っても良い。ジアミノ酸は初発に添加しても良いし、反応途中から一度に或いは少量ずつ添加しても良い。また、環状アミノ酸の生産効率を高めるために、培地中にグルコースやキシロース等の糖類、有機酸、アミノ酸、無機塩類、微量元素、界面活性剤等の生産効率を高められる物質を添加して反応を行っても良い。混合日数は通常６時間〜７日間であるが、混合液中の光学活性環状アミノ酸蓄積量が最高に達したときに反応を停止し、反応液から生産物を一般的な方法に準じて採取する。これらの反応液組成、反応温度、撹拌速度および通気量等の混合反応条件は、使用する菌株の種類や使用するジアミノ酸および外部条件等に応じて好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選抜する。液体反応において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。
【００３７】
培養液や菌体反応液からの光学活性環状アミノ酸の精製は通常の方法で行う。具体的な精製方法としては遠心分離装置や膜分離装置または菌体凝集剤で菌体とろ液を分離或いは溶液をアルカリ性にして菌体を溶菌した後、ろ液あるいは溶菌液から光学活性環状アミノ酸をイオン交換樹脂法、電気透析法、カラムクロマトグラフィー法、晶析法などを用いるか、あるいはこれらを組み合わせて精製できる。
【実施例】
【００３８】
本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこの具体例に限定されるものではない。
本実施例では、（Ｓ）−3−モルホリンカルボン酸及び（Ｓ）−ピペコリン酸の定量分
析及び光学純度分析を以下の方法で実施した。
【００３９】
培養液上清或いは混合液上清中の定量分析は高速液体クロマトグラフィーを用い内部標準法にて算出した。分析条件は以下のとおりである。
カラム ：ＹＭＣ社製 Hydrosphere C18（内径4.6mm、長さ25cm）
カラム温度 ：４０℃
検出器 ：ＵＶ検出器
測定波長 ：４１０ｎｍ
溶媒 ：Ａ液；アセトニトリル：水（０．０４％リン酸）＝３５：６５
Ｂ液；アセトニトリル：水（０．０４％リン酸）＝８０：２０
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
グラジエント：測定開始から５分後までＡ液１００％、３０分後にＡ液８０％・Ｂ液２０％となるよう直線的グラジエントを行い、３０分から３５分までＢ液１００％で溶媒を流した。
内部標準 ：２−アミノエタノール
サンプル調製：測定液１ｍｌに活性炭を１０ｍｇ添加して１分間よく撹拌し、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って遠心上清を得た。その上清中の（Ｓ）−3−モル
ホリンカルボン酸または（Ｓ）−ピペコリン酸濃度が1ｍｇ/ｍｌ以下になるよう蒸留水で
希釈し、その希釈液１０μｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ濃度の２−アミノエタノール溶液（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液）９０μｌ、１８６ｍｇ／ｍｌ濃度の２,４−ジニトロフ
ルオエロベンゼン溶液（メタノール溶液）５０μｌ、エタノール４００μｌを混合撹拌後、室温で１時間放置して誘導体化した。
溶出時間 ：（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸 １３．６（ｍｉｎ）
（Ｓ）−ピペコリン酸 ２６．７（ｍｉｎ）
２−アミノエタノール ９．９（ｍｉｎ）
（Ｓ）−3−モルホリンカルボン酸及び（Ｓ）−ピペコリン酸の光学純度分析法はキラ
ルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。分析条件は以下の通りである。
カラム ：ダイセル社製 CHIRALPAK WH（内径4.6mm、長さ25cm）
カラム温度 ：５０℃
検出器 ：ＵＶ検出器
測定波長 ：２５４ｎｍ
溶媒 ：０．２５ｍＭ硫酸銅水溶液
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶出時間 ：（Ｒ）−３−モルホリンカルボン酸 ３６．９（ｍｉｎ）
（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸 ４３．９（ｍｉｎ）
（Ｒ）−ピペコリン酸 １３．７（ｍｉｎ）
（Ｓ）−ピペコリン酸 ２０．７（ｍｉｎ）
1H‐および13C‐NMRは特に指示がない限り、重水（D2O）の溶液で、日本電子（株）社
製の核磁気共鳴装置（モデルJNM−LA300）を使用して測定した。
【００４０】
［実施例１］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株を利用した、培養変換による（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の製造
Ｌ−４−オキサリジン一塩酸塩３ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラ
スコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス
・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株をスラントから一白金耳接種した。合計１０本の三角フラスコを２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。培養終了後、培養液中の（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸濃度を測定したところ、３７５ｍｇ／Ｌであった。
【００４１】
この１０本の三角フラスコから回収した培養液約１Ｌを遠心分離により菌体と上清に分けた。その上清に活性炭５ｇを加えて１時間攪拌した後、ろ紙を使用して活性炭を除去した。そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）５００ｍｌを充
填したカラムに通過させて（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を吸着させ、更に２Ｌの脱イオン交換水を通過させてカラムを洗浄した後、２％アンモニア水２．５Ｌで溶出した。（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水２５０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液をデュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）２５０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に２Ｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄して（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を回収した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水８０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐３６８Ｓ ８０ｍｌを充填したカラムに通過させ
、その後８００ｍｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄して（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を回収した。
【００４２】
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮し、メタノールを加えて結晶化させた。結
晶をろ別して回収し、乾燥させたところ１５２ｍｇの白色結晶が得られた。
この結晶のＮＭＲ分析における1Ｈ-ＮＭＲと13Ｃ-ＮＭＲのケミカルシフト値が、非特許
文献２記載の（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸のそれと一致した。
1Ｈ-ＮＭＲ
d (ｐｐｍ)：３．９８(１Ｈ，ｄｄ)、３．７７(１Ｈ，ｄｔ)、３．５１‐３．６８(３Ｈ
，ｍ)、３．１７(１Ｈ，ｄｔ)、３．０１(１Ｈ，ｄｄｄ)
13Ｃ-ＮＭＲ
d (ｐｐｍ)：１７１．３、６６．８、６４．０、５７．７、４２．９
また、光学純度を測定するためにＨＰＬＣ分析を行ったが（Ｒ）−３−モルホリンカルボン酸のピークは検出されず、得られた結晶は（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸のみであった。
【００４３】
［実施例２］
高濃度Ｌ‐リジン塩酸塩耐性変異株パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株の調製
ＳＣＤ液体培地（日本製薬製）にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株を一白金耳植菌し、２７℃の往復振とう機で１８時間培養した。その培養液１ｍｌを０．８５％食塩水で１０倍に希釈し直径９ｃｍの滅菌シャーレに分注した後、この菌体懸濁液に東芝製ＧＬ-１５殺菌灯を使用して紫外線を９０秒間照射した。
【００４４】
Ｌ‐リジン一塩酸塩 ５５ｇ／Ｌ、酵母エキス ０．１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム １ｇ／
Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム １ｇ／Ｌ、 塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フ
ラスコに入れたフラスコを１本作成し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更に
、そのフラスコに紫外線を照射した菌体懸濁液１０ｍｌを接種して、２７℃、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで７日間好気培養した。
【００４５】
Ｌ‐リジン一塩酸塩濃度が５０ｇ／Ｌになるよう調整したソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地（日本製薬製）を直径９ｃｍの滅菌シャーレに分注して寒天培地を作成し、ロータリーシェーカーで培養した培養液を塗沫して２７℃で培養を行った。寒天上に生育してきたコロニーを分離・選抜して、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を調製した。
【００４６】
［実施例３］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、培養変換による（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の製造
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を用いる以外は実施例１と同様に実施した。培養液中の（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の生産量は５０１ｍｇ／Ｌであった。
【００４７】
［実施例４］
パラコッカス基準株を利用した、培養変換による（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の製造
表２に示したパラコッカス属に属する種々の基準株を用いる以外は実施例１と同様に実施した。各菌株の培養液中の（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の生産量は表２に示すようであった。
【００４８】
【表２】
［実施例５］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、菌体反応による（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の製造
６−アミノヘキサン酸７．２ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物
８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコ
に入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、その培地中にパラコッカス・エスピ
ー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで２４時間好気培養して前培養液を作成した。
【００４９】
次に、６５Ｌ容ジャファーメンターに６−アミノヘキサン酸７．２ｇ／Ｌ、酵母エキス８ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム １ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地を３０Ｌ加え、１２１℃で２５分間蒸気滅菌した。植菌直前に別滅菌したグルコース溶液（３００ｇ/Ｌ
）をジャファーメンターに２Ｌ添加し、更に前培養液３００ｍｌを植菌して２７℃、攪拌回転数１８０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍで３８時間培養を行った。
【００５０】
培養液から遠心分離機で菌体を回収し、ろ過滅菌した基質溶液（Ｌ−４−オキサリジン一塩酸塩３０ｇ／Ｌ、グルコース ２２．５ｇ／ＬとなるようｐＨ６．９８の３００ｍＭ
リン酸バッファーで溶解）３Ｌをその回収した菌体に加えて懸濁し、５Ｌ容ミニジャーファーメンターに菌体懸濁液を加えた。反応温度２７℃、攪拌回転数４５０ｒｐｍ、通気量０．５ｖｖｍで２５時間菌体反応を行った。反応終了後の反応液中の（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸濃度を測定したところ、１３．８ｇ／Ｌであった。
【００５１】
この反応液から遠心分離により菌体を除去し、その上清に活性炭２４ｇを加えて１時間攪拌した後、ろ紙を使用して活性炭を除去した。そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）２Ｌを充填したカラムに通過させて（Ｓ）−３−モルホリン
カルボン酸を吸着させ、更に５Ｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、２％アンモニア水で溶出した。（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水１Ｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液をデュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）１Ｌを充填したカラムに通過させ、更に２Ｌの脱イオン交換水でカラム
を洗浄して（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を回収した。
【００５２】
その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水９００ｍｌを加えて固形物を溶解した。強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐１１３（ＣＨ3ＣＯＯ-型）２００ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後このカラムを脱イオン交換水で洗浄して（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸を回収した。
【００５３】
上記により得た通過液と回収液を減圧濃縮し、活性炭による脱色、０．４５μｍフィルターによるろ過後、ろ液を濃縮しつつメタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸の白色結晶が３４．５ｇ得られた。
【００５４】
光学純度を測定するためにＨＰＬＣ分析を行ったが（Ｒ）−３−モルホリンカルボン酸のピークは検出されず、得られた結晶は（Ｓ）−３−モルホリンカルボン酸のみであった。
【００５５】
［実施例６］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株を利用した、培養変換による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造
Ｌ−リジン一塩酸塩１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８
０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピ
ー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp. AB10292）株をスラントから一白金耳接種した。合
計１０本の三角フラスコを２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。培養液中の（Ｓ）−ピペコリン酸濃度を測定したところ、５．８ｇ／Ｌであった。
【００５６】
この１０本の三角フラスコから回収した培養液約１Ｌを遠心分離により菌体と上清に分けた。その培養液上清に活性炭５ｇを加えて１時間攪拌した後、ろ紙を使用して活性炭を除去した。そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）１Ｌを充
填したカラムに通過させて（Ｓ）−ピペコリン酸を吸着させ、更に４Ｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、２％アンモニア水５Ｌで溶出した。（Ｓ）−ピペコリン酸を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水５００ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液をデュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）５００ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に２Ｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄して（Ｓ）−ピペコリン酸を回収した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水２００ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐３６８Ｓ １
００ｍｌを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに １Ｌの脱イオン交換水を通
過させて（Ｓ）−ピペコリン酸を回収した。
【００５７】
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮し、メタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ３．２ｇの白色結晶が得られた。
この結晶のＨＰＬＣ分析による溶出時間及びＮＭＲ分析における1Ｈ-ＮＭＲと13Ｃ-ＮＭ
Ｒのケミカルシフト値が、標準品である（Ｓ）−ピペコリン酸のそれと一致した。
1ＨＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１．３７−１．５９(３Ｈ，ｍ)、１．７０−１．７７(２Ｈ，ｍ)、２．０８(１Ｈ，ｍ)、２．８６(１Ｈ，ｍ)、３．２７(１Ｈ，ｍ)、３．４３(１Ｈ，ｍ)
13ＣＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１７５.４、５９．８、４４．５、２７．３、２２．６、２２．４
また、光学純度を測定するためにＨＰＬＣ分析を行ったが（Ｒ）−ピペコリン酸のピークは検出さず、得られた結晶は（Ｓ）−ピペコリン酸のみであった。
【００５８】
［実施例７］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株を利用した、ＤＬ−リジン一塩酸からの培養変換による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造
ＤＬ−リジン一塩酸塩３ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム １ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピ
ー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株をスラントから一白金耳接種した。その三角フラスコを２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。培養液中の（Ｓ）−ピペコリン酸濃度を測定したところ、０．７６ｇ／Ｌであった。
【００５９】
［実施例８］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、培養変換による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造
Ｌ−リジン一塩酸塩５ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０
μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種した。２７℃
で２４時間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養して前培養液を作成した。
【００６０】
Ｌ−リジン一塩酸塩６５ｇ／Ｌ、酵母エキス５．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物８０μｇ／Ｌ、炭酸カルシウム２ｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前にそのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（３７５ｇ/Ｌ）を１６ｍｌ添加し、更にそ
の培地中に前培養液を５ｍｌ接種した。２７℃で１２日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養し、培養液中の（Ｓ）-ピペコリン酸濃度を測定したところ３
８．４ｇ／Ｌであった。
【００６１】
［実施例９］
パラコッカス属基準株を利用した、培養変換による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造
Ｌ−リジン一塩酸塩３ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前にそのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中に表３に示したパラコッカ
ス属に属する種々の菌株をスラントから一白金耳接種した。その後、２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。各菌株培養液中の（Ｓ）−ピペコリン酸生産量は表３に示すようであった。
【００６２】
【表３】
［実施例１０］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、菌体反応による（Ｓ）−ピペコリン酸の製造
６−アミノヘキサン酸７．２ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム １ｇ／Ｌ
、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラス
コに入れたフラスコを１０本作成し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、その培
地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種して、２７℃で２日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００６３】
次に、培養液を集めて約１Ｌとし、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行って上清を除去した。その沈殿した菌体に５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．９８）を２００ｍｌ加えてよく撹拌し、再び８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行って上清を除去して菌体反応用の菌体を得た。
【００６４】
その菌体に、ろ過滅菌した基質溶液（Ｌ−リジン一塩酸塩 ３０ｇ／Ｌ、グルコース ２２．５ｇ／ＬになるようｐＨ６．９８の３００ｍＭリン酸バッファーで溶解）を１００ｍｌ加えて懸濁し、５００ｍｌ容三角フラスコにその菌体懸濁液を加えた。２７℃、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで２７時間菌体反応を行った後、反応液中の（Ｓ）−ピペコリン酸濃度を測定したところ、１６．２ｇ／Ｌであった。
【００６５】
［実施例１１］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株を利用した、培養変換によるｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸及びｃｉｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸の製造
５−ヒドロキシ−ＤＬ−リシン塩酸塩３.３ｇ／Ｌ(和光純薬製)、酵母エキス２ｇ／Ｌ
、塩化ナトリウム １ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０.２９ｇ／Ｌ、リン酸水素２ナトリウム１２水和物 ６．８６ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ
）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株をスラントから一白金耳接種した。この三角フラスコ３本を２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００６６】
培養液上清をＴＬＣで分析したところ、５−ヒドロキシ−ＤＬ−リシン塩酸塩とは明らかに異なるＲｆ値を示す青紫色のニンヒドリン発色物質が２物質認められた（展開溶媒 アセトニトリル：メタノール：水＝３：１：１、Ｒｆ値＝０．３０８、０．３５６、メルク社製ＴＬＣプレート；シリカゲル６０Ｆ254）。
【００６７】
この三角フラスコから回収した培養液約３００ｍＬを遠心分離により菌体と上清に分けた。その遠心上清を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）１００ｍｌ
を充填したカラムに通過させてニンヒドリン発色物質を吸着させ、更に５００ｍＬの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、２％アンモニア水５００ｍＬで溶出した。溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水５０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）５０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に２５０ｍＬの脱イオン交換水でカラムを洗浄してニンヒドリン発色物質を回収した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水５０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐１１３（ＣＨ3ＣＯＯ-型） １０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に５０ｍｌの脱イ
オン交換水でカラムを洗浄してニンヒドリン発色物質を回収した。
【００６８】
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水１ｍｌを加えて固形物を溶解した。活性炭素(顆粒状・和光純薬製)７０ｍｌを充填したカラムを用いて溶解液のカラムクロマトグラフィーを行い、ニンヒドリン発色する２物質を回収した。
【００６９】
上記により得た回収液を減圧下濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水０．５ｍｌを加えて固形物を溶解した。強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン ＵＢＫ５３０（Ｃａ2+型
）２００ｍｌを充填したカラムを用いて溶解液のカラムクロマトグラフィーを行い、Ｒｆ値＝０．３５６を示す物質を４４ｍｇ、Ｒｆ値＝０．３０８を示す物質を８４ｍｇ単離した。
【００７０】
Ｒｆ値＝０．３５６を示す物質をＮＭＲ分析したところ、その1Ｈ-ＮＭＲと13Ｃ-ＮＭ
Ｒのケミカルシフト値が、非特許文献７に記載されているｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ-
（Ｓ）-ピペコリン酸のそれと一致した。また、この物質の比旋光度は［α］D＝−２０．２°（ｃ；１．０、Ｈ2Ｏ、２３℃）であった。
1ＨＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１．５４−１．６４(１Ｈ，ｍ)、１．６８−１．８１（1Ｈ，ｍ）、２．０１−２．１０（１Ｈ，ｍ）、２．２４−２．３３（１Ｈ，ｍ）、２．７８−２．８６（１Ｈ，ｍ）、３．４３(１Ｈ，ｄｄ)、３．５９(１Ｈ，ｄｄ)、３．９４(１Ｈ，ｍ)
13ＣＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１７３．８、６３．２、５８．０、４７．２、２９．８、２３．８
【００７１】
【化６】
Ｒｆ値＝０．３０８を示す物質は、1Ｈ-ＮＭＲと13Ｃ-ＮＭＲの分析結果及び生成に使
用した基質から考えてciｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸と考えられる。また、この物質の比旋光度は［α］D＝−３０．６°（ｃ；２．０、Ｈ2Ｏ、２３℃）であった。1ＨＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１．７７−２．１４(４Ｈ，ｍ)、３．１９(１Ｈ，ｄｄ)、３．３２(１Ｈ，ｄｔ)、３．６３(１Ｈ，ｄｄ)、４．１５−４．１９(１Ｈ，ｍ)
13ＣＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１７３．４、６０．８、２、５８．０、４７．５、２７．６、２０．５
【００７２】
【化７】
［実施例１２］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、菌体反応によるｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸及びｃｉｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸の製造
６−アミノヘキサン酸 ７．２ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム １ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム １ｇ／Ｌ、 塩化マンガン４水和物 ８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラ
スコに入れたフラスコを２本作成し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、その培
地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で４０時間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００７３】
次に、培養液から遠心分離機で菌体を回収し、ろ過滅菌した基質溶液（５−ヒドロキシ−ＤＬ−リシン塩酸塩２０ｇ／Ｌ、グルコース １５ｇ／ＬとなるようｐＨ６．９８の３
００ｍＭリン酸バッファーで溶解）２０ｍＬをその回収した菌体に加えて懸濁し、１００ｍｌ容三角フラスコに菌体懸濁液を加えた。その後、反応温度２７℃、回転数１６０ｒｐｍのロータリーシェーカーで３２時間菌体反応を行った。
【００７４】
生産を確認するために反応液上清をＴＬＣで分析したところ、Ｒｆ値＝０．３０８と０．３５６にそれぞれ、ｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸とciｓ−５−ヒドロキシ-（Ｓ）-ピペコリン酸のニンヒドリン発色が認められた（展開溶媒 アセトニトリル：メタノール：水＝３：１：１、メルク社製ＴＬＣプレート；シリカゲル６０Ｆ254
）。
【００７５】
［実施例１３］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、培養変換による（Ｒ）−３−チオモルホリンカルボン酸の製造
Ｌ−アラニン２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸水素ナトリウム一水和物２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン２０ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／Ｌ、（＋）ビオチン０．１ｍｇ／Ｌ、シアノコバラミン２.５ｍ
ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸鉄７水和物２５０μｇ／Ｌ、硫酸銅５水和物２５０μｇ／Ｌ、塩化カルシウム２．５ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛７水和物５００μｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物５００μｇ／Ｌ、塩化ニッケル６水和物２５０μｇ／Ｌ、モリブデン酸ナトリウム２水和物２５０μｇ／Ｌ、ヨウ化カリウム５μｇ／Ｌ、ホウ酸２５μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れたフラスコを１０本作成し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコにＬ−４−チアリジン一塩酸塩水溶液（２０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）１０ｍｌを各フラスコにろ過滅菌して添加した。同様に別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を各フラスコに８ｍｌ添加し、その培
地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で９０時間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００７６】
次に、培養液から遠心分離機で菌体を除去し、その上清を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）５００ｍｌを充填したカラムに通過させて（Ｒ）−３−チオ
モルホリンカルボン酸を吸着させ、更に２Ｌの脱イオン交換水で洗浄した後、２％アンモニア水５Ｌで溶出した。溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水２５０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）２５０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に２Ｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水８０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐１１６（ＣＨ3ＣＯＯ-型）８０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に８００ｍｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄した。
【００７７】
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水２０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶液をＴＬＣで分析したところ、Ｒｆ値＝０．４９４にニンヒドリン発色物質が認められた（展開溶媒 アセトニトリル：メタノール：水＝３：１：１、メルク社製ＴＬＣプレート；シリカゲル６０Ｆ254）。
【００７８】
その溶液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水４ｍｌを加えて固形物を溶解した。弱酸性陽イオン交換樹脂アンバーライト ＣＧ−５０（ＮＨ4+型）２５０ｍｌを充填
したカラムを用いてその溶液のカラムクロマトグラフィーを行い、Ｒｆ値＝０．４９４を示す物質を含む画分を回収した。その溶液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水２０ｍｌを加えて固形物を溶解し、活性炭による脱色、０．４５μｍフィルターによるろ過後、その溶液を濃縮しつつメタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ白色結晶が８４ｍｇ得られた。
【００７９】
このＲｆ値＝０．４９４を示すニンヒドリン発色物質は、1Ｈ-ＮＭＲと13Ｃ-ＮＭＲの
分析結果及び生成に使用した基質から考えて（Ｒ）-３-チオモルホリンカルボン酸と考えられる。また、この物質の比旋光度は［α］D＝−５３．２°（ｃ；２．０、Ｈ2Ｏ、２３℃）であった。
1ＨＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：２．７４−２．８２(１Ｈ，ｍ)、２．８９−３．１３ (３Ｈ，ｍ)、３．２９(１Ｈ，ｄｄｄ)、３．６９(１Ｈ，ｄｔ)、３．８４(１Ｈ，ｄｄ)
13ＣＮＭＲデータ：
d(ｐｐｍ)：１７２．３、５９．３、４５．３、２７．５、２３．８
【００８０】
【化８】
［実施例１４］
パラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株を利用した、菌体反応による（Ｒ）−３−チオモルホリンカルボン酸の製造
６−アミノヘキサン酸７．２ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物
８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコ
に入れたフラスコを４本作成し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、その培地中
にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２（Paracoccus sp.AB10302）株をスラントから一白金耳接種し、２７℃で４４時間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。
【００８１】
次に、培養液から遠心分離機で菌体を回収し、基質溶液（Ｌ−４−チアリジン一塩酸塩
１０ｇ／Ｌ、グルコース ７．５ｇ／ＬとなるようｐＨ６．９８の３００ｍＭリン酸バッファーで溶解）４０ｍＬをその回収した菌体に加えて懸濁し、２００ｍｌ容三角フラスコに菌体懸濁液を加えた。その後、反応温度２７℃、回転数１６０ｒｐｍのロータリーシェーカーで２７時間菌体反応を行った。
【００８２】
反応液上清をＴＬＣで分析したところ、Ｌ−４−チアリジン一塩酸塩はほとんど消失し、Ｒｆ値＝０．４９４に（Ｒ）-３-チオモルホリンカルボン酸のニンヒドリン発色が認められた（展開溶媒 アセトニトリル：メタノール：水＝３：１：１、メルク社製ＴＬＣプレート；シリカゲル６０Ｆ254）。
【００８３】
この反応液から遠心分離により菌体を除去し、そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（Ｈ+型）４０ｍｌを充填したカラムに通過させて（Ｒ）-３-チオモル
ホリンカルボン酸を吸着させ、更に２００ｍｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、２％アンモニア水で溶出した。ニンヒドリン発色物質を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水４０Ｌを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトＣ‐２０（ＮＨ4+型）２０ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に１００ｍｌの脱イオン交換水でカラムを洗浄して（Ｒ）-３-チオモルホリンカルボン酸を回収した。
【００８４】
その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水１０ｍｌを加えて固形物を溶解した。その溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトＡ‐１１３（ＣＨ3
ＣＯＯ-型）３ｍｌを充填したカラムに通過させ、更に脱イオン交換水でカラムを洗浄し
て（Ｒ）-３-チオモルホリンカルボン酸を回収した。
【００８５】
上記により得た通過液と回収液を減圧濃縮し、活性炭による脱色、０．４５μｍフィルターによるろ過後、溶液を濃縮しつつメタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ（Ｒ）-３-チオモルホリンカルボン酸の白色結晶が７０．５ｍｇ得られた。この結晶の比旋光度は、［α］D＝−５３．７°（ｃ；２．０、Ｈ2Ｏ、２３℃）であった。
【００８６】
［比較例１］
Ｄ−リジン一塩酸塩３ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム２ｇ／Ｌ、リン酸水素２カリウム１ｇ／Ｌ、塩化マンガン４水和物８０μｇ／Ｌ、ｐＨ８．０の培地１００ｍｌをバッフル付き５００ｍｌ容三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液（２５０ｇ/Ｌ）を８ｍｌ添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２（Paracoccus sp.AB10292）株をスラントから一白金耳接種した。その三角
フラスコを２７℃で３日間、回転数１８０ｒｐｍのロータリーシェーカーで好気培養した。培養終了後の培養液中に（Ｓ）-ピペコリン酸及び（Ｒ）-ピペコリン酸のいずれも検出されなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
［式（Ｉ）中、Ｘは、飽和のまたは部分的に若しくは全体的に不飽和の、直鎖または分枝鎖のＣ1−Ｃ6炭化水素鎖を表し、該炭化水素鎖は、その内部および／または末端に、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｎの内から選択する一個または数個のヘテロ原子またはヘテロ原子団を含んでいてもよく、あるいは、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、＝Ｏ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ、−Ｃ(Ｓ)ＯＲ、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ'Ｒ"、−Ｃ(Ｓ)ＮＲ'ＲＲ"、−ＣＮ、−ＮＯ2、−Ｘ、−ＭｇＸ、−ＮＲ'Ｒ"、
−ＮＲ'Ｃ(Ｏ)Ｒ、−ＳｉＲ及び−ＳｉＯＲ（Ｒ、Ｒ'及びＲ"は、同一のまたは相違する
、水素または２〜２０の炭素原子を有する直鎖若しくは分枝鎖の飽和のまたは全体的に若しくは部分的に不飽和の炭化水素基を表す。）の内から選択する一個または数個の同じまたは異なる基によって置換されていてもよく、Ｒ'とＲ"は、それらを有する原子と共に環を形成していてもよい。］で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を、式（ＩＩ）
【化２】
［式（ＩＩ）中、Ｘは式（Ｉ）中で規定した通りである。］で示される環状アミノ酸および／またはその塩類に変換する活性を有するパラコッカス属に属する微生物を、式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を含有する培地、あるいは式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類とそれらに対応するＤ−ジアミノ酸および／またはその塩類とからなる鏡像体混合物を含有する培地で培養し、式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸および／またはその塩類を生成させることを特徴とする光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸および／またはその塩類に変換する活性を有するパラコッカス属に属する微生物の菌体を、前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を含有する溶液、あるいは前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類とそれらに対応するＤ−ジアミノ酸および／またはその塩類とからなる鏡像体混合物を含有する溶液と懸濁し、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸および／またはその塩類を生成させることを特徴とする光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項３】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸がＬ-４-オキサリジンであり、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸が(Ｓ)−３−モルホリンカルボン酸である、請求項１または２に記載の光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項４】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸がＬ-リジンであり、前記式（ＩＩ）で示され
る環状アミノ酸が(Ｓ)−ピペコリン酸である、請求項１または２に記載の光学活性環状ア
ミノ酸製造方法。
【請求項５】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸が５−ヒドロキシ−Ｌ−リジンであり、前記前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸がｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−（Ｓ）−ピペコリン酸である、請求項１または２に記載の光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項６】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸が５−ヒドロキシ−Ｌ−リジンであり、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸がｃｉｓ−５−ヒドロキシ−（Ｓ）−ピペコリン酸である、請求項１または２に記載の光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項７】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸がＬ-４-チアリジンであり、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸が(Ｒ)−３−チオモルホリンカルボン酸である、請求項１または２に記載の光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項８】
前記パラコッカス属に属する微生物が、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２株（Paracoccus sp. AB10292 FERM P-21605）またはその変異株パラコッカス・エスピー ＡＢ
１０３０２株（Paracoccus sp. AB10302 FERM P-21606）であることを特徴とする、請求
項１〜７のいずれかに記載の光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項９】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸および／またはその塩類に変換する活性を有するパラコッカス属に属する微生物である、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２株（Paracoccus sp. AB10292 FERM P-21605）およびその変異株であるパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２株
（Paracoccus sp. AB10302 FERM P-21606）。
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
［式（Ｉ）中、Ｘは、飽和のまたは部分的に若しくは全体的に不飽和の、直鎖または分枝鎖のＣ1−Ｃ6炭化水素鎖を表し、該炭化水素鎖は、その内部および／または末端に、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｎの内から選択する一個または数個のヘテロ原子またはヘテロ原子団を含んでいてもよく、あるいは、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、＝Ｏ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ、−Ｃ(Ｓ)ＯＲ、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ'Ｒ"、−Ｃ(Ｓ)ＮＲ'ＲＲ"、−ＣＮ、−ＮＯ2、−Ｘ、−ＭｇＸ、−ＮＲ'Ｒ"、
−ＮＲ'Ｃ(Ｏ)Ｒ、−ＳｉＲ及び−ＳｉＯＲ（Ｒ、Ｒ'及びＲ"は、同一のまたは相違する
、水素または２〜２０の炭素原子を有する直鎖若しくは分枝鎖の飽和のまたは全体的に若しくは部分的に不飽和の炭化水素基を表す。）の内から選択する一個または数個の同じまたは異なる基によって置換されていてもよく、Ｒ'とＲ"は、それらを有する原子と共に環を形成していてもよい。］で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を、式（ＩＩ）
【化２】
［式（ＩＩ）中、Ｘは式（Ｉ）中で規定した通りである。］で示される環状アミノ酸および／またはその塩類に変換する活性を有するパラコッカス属に属する微生物を、式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を含有する培地、あるいは式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類とそれらに対応するＤ−ジアミノ酸および／またはその塩類とからなる鏡像体混合物を含有する培地で培養し、式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸および／またはその塩類を生成させることを特徴とする光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸および／またはその塩類に変換する活性を有するパラコッカス属に属する微生物の菌体を、前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を含有する溶液、あるいは前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類とそれらに対応するＤ−ジアミノ酸および／またはその塩類とからなる鏡像体混合物を含有する溶液と懸濁し、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸および／またはその塩類を生成させることを特徴とする光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項３】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸がＬ-４-オキサリジンであり、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸が(Ｓ)−３−モルホリンカルボン酸である、請求項１または２に記載の光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項４】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸がＬ-リジンであり、前記式（ＩＩ）で示され
る環状アミノ酸が(Ｓ)−ピペコリン酸である、請求項１または２に記載の光学活性環状ア
ミノ酸製造方法。
【請求項５】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸が５−ヒドロキシ−Ｌ−リジンであり、前記前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸がｔｒａｎｓ−５−ヒドロキシ−（Ｓ）−ピペコリン酸である、請求項１または２に記載の光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項６】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸が５−ヒドロキシ−Ｌ−リジンであり、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸がｃｉｓ−５−ヒドロキシ−（Ｓ）−ピペコリン酸である、請求項１または２に記載の光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項７】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸がＬ-４-チアリジンであり、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸が(Ｒ)−３−チオモルホリンカルボン酸である、請求項１または２に記載の光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項８】
前記パラコッカス属に属する微生物が、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２株（Paracoccus sp. AB10292 FERM P-21605）またはその変異株パラコッカス・エスピー ＡＢ
１０３０２株（Paracoccus sp. AB10302 FERM P-21606）であることを特徴とする、請求
項１〜７のいずれかに記載の光学活性環状アミノ酸製造方法。
【請求項９】
前記式（Ｉ）で示されるＬ−ジアミノ酸および／またはその塩類を、前記式（ＩＩ）で示される環状アミノ酸および／またはその塩類に変換する活性を有するパラコッカス属に属する微生物である、パラコッカス・エスピー ＡＢ１０２９２株（Paracoccus sp. AB10292 FERM P-21605）およびその変異株であるパラコッカス・エスピー ＡＢ１０３０２株
（Paracoccus sp. AB10302 FERM P-21606）。
【公開番号】特開２０１０−８８３９５（Ｐ２０１０−８８３９５Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６３９７８（Ｐ２００８−２６３９７８）
【出願日】平成２０年１０月１０日（２００８．１０．１０）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１０日（２００８．１０．１０）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】
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