微生物検査装置及び微生物検査用チップ
【課題】
チップの正確な位置あわせを行うことを課題とする。
【解決手段】
少なくとも、微生物を含む検体液を保持する検体容器と、検体液と反応する試薬液を保持するとともに、検体液と試薬液とを反応させる反応容器と、微生物を検出する検出用流路と、検出用流路の位置あわせを行う位置あわせ用試薬が保持された位置あわせ用試薬容器とを有する分析チップと、分析チップと連結され、分析チップに、少なくとも、検体液，試薬液及び位置あわせ用試薬とを搬送する搬送装置と、分析チップを保持するとともに、分析チップを移動させるステージと、少なくとも、検出用流路に光を照射する光源と、検出用流路からの光を検出するとともに、光を電気信号に変換する処理を行う光検出器とを有する検出装置と、光検出器で変換された電気信号を出力する出力装置とを備え、位置あわせ用試薬容器は、少なくとも検体容器及び反応容器よりも下流側に設けられる。
チップの正確な位置あわせを行うことを課題とする。
【解決手段】
少なくとも、微生物を含む検体液を保持する検体容器と、検体液と反応する試薬液を保持するとともに、検体液と試薬液とを反応させる反応容器と、微生物を検出する検出用流路と、検出用流路の位置あわせを行う位置あわせ用試薬が保持された位置あわせ用試薬容器とを有する分析チップと、分析チップと連結され、分析チップに、少なくとも、検体液，試薬液及び位置あわせ用試薬とを搬送する搬送装置と、分析チップを保持するとともに、分析チップを移動させるステージと、少なくとも、検出用流路に光を照射する光源と、検出用流路からの光を検出するとともに、光を電気信号に変換する処理を行う光検出器とを有する検出装置と、光検出器で変換された電気信号を出力する出力装置とを備え、位置あわせ用試薬容器は、少なくとも検体容器及び反応容器よりも下流側に設けられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の計測を行う微生物検査装置及び微生物検査用チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生菌数計測の迅速化および簡便化を目的としたさまざまな簡便迅速測定法を実施する計測装置が知られている。特に、生菌数を迅速に直接計測する手法として、蛍光フローサイトメトリ法を用いた菌数測定装置がある。
【０００３】
蛍光フローサイトメトリ法は、蛍光色素で染色した検体を含む検体の流径を細くし、検体を一個ずつ流し計測する粒子計測方法であり、この方法を用いた菌数測定装置は、短時間に検体を一個ずつ計測することができる。
【０００４】
また、蛍光フローサイトメトリ法において、検体中の成分が流路壁面に付着することを防止するため、検体とシース液の層流を形成し、二液の圧力差を利用し、検体の流径を絞り込むことが行われている。
【０００５】
さらに、低価格化を実現したり、洗浄の手間を省略したりするため、蛍光フローサイトメトリ法による測定を行う流路部分をディスポーザブルのチップにし、ディスポーザブルのチップ内で測定を行い、測定する流路部分を使い捨てにすることが知られ、例えば、非特許文献１に記載されている。
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Biomolecular Techniques、Vol14、Issue2、pp.119-127
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記蛍光フローサイトメトリ法を用いた計測装置では、細い検出用の流路に励起光を照射し、微粒子の出す蛍光を検出するため、励起光および検出器の焦点に流路の位置をあわせる必要がある。しかし、励起光および検出器の焦点の範囲，流路の幅は、数ミクロンから数百ミクロンであり、高精度の測定をするためには数十ミクロンの精度の位置あわせが必要になる。さらに、流路部分をディスポーザブルなチップにする場合には、測定毎に流路の位置あわせを行う必要がある。
【０００８】
チップの位置あわせの手段としては、チップの一部に特定の目印を設け、目印の位置を基準に検出用の流路の位置調整を行う方法がある。しかし、一般的にチップは、樹脂の射出成型で作製されるため、金型内の樹脂の熱流動現象や、離型後の成型品の収縮変形が生じ、検出用の流路と目印の相対位置が安定しない。そのため、数十ミクロンの精度を再現するには、射出成型後に機械加工を行う必要があるが、使い捨てのチップには不向きである。また、微粒子の出す蛍光を検出するための光学系のほかに、目印を認識するための光学系が必要になるため、装置の大型化や高コスト化につながる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、少なくとも、微生物を含む検体液を保持する検体容器と、前記検体液と反応する試薬液を保持するとともに、前記検体液と前記試薬液とを反応させる反応容器と、前記微生物を検出する検出用流路と、前記検出用流路の位置あわせを行う位置あわせ用試薬が保持された位置あわせ用試薬容器とを有する分析チップと、前記分析チップと連結され、前記分析チップに、少なくとも、前記検体液，前記試薬液及び前記位置あわせ用試薬とを搬送する搬送装置と、前記分析チップを保持するとともに、前記分析チップを移動させるステージと、少なくとも、前記検出用流路に光を照射する光源と、前記検出用流路からの光を検出するとともに、前記光を電気信号に変換する処理を行う光検出器とを有する検出装置と、前記光検出器で変換された電気信号を出力する出力装置とを備え、前記位置あわせ用試薬容器は、少なくとも前記検体容器及び前記反応容器よりも下流側に設けられる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、微生物検出用流路の精度の高い位置あわせを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１２】
図１は、本発明の微生物検査装置１の構成図である。微生物検査装置１は、検体や試薬を内部に保持し、微生物計測に必要な工程を行うための機構を内部に備えた分析チップ１０と、微生物計測に必要な工程を行うために、分析チップ１０と連結したチップ連結管１４４を介して、分析チップ１０内の検体や試薬の搬送を制御するための搬送装置１４と、分析チップ１０を保持し、分析チップ１０の位置を調整するＸ−Ｙ可動ステージ１２５と、分析チップ１０内の微生物に励起光を照射し、微生物からの蛍光を電気信号に変換する検出装置２１で構成されている。微生物検査装置１に連結したシステム装置１８は、搬送装置１４に制御のための信号の出力と、検出装置２１からの電気信号の処理を行う。電気信号の処理により得られた計測結果は出力装置１９に表示される。
【００１３】
分析チップ１０は、検体１５１１を保持するための検体容器１５１と、検体中の微生物を染色するための染色液（試薬液）１４１１を保持し、検体と染色液を混合，反応させる反応容器１４１と、蛍光性の位置あわせ用試薬１５４１を保持するための位置あわせ用試薬容器１５４と、励起光源２１１より励起光２１３を照射し、微生物もしくは位置あわせ用試薬の蛍光を観測するための微生物検出用流路１７と、微生物検出用流路１７を通過した検体１５１１，染色液１４１１の混合液を廃棄するための検出液廃液容器１５６と、検体容器１５１，反応容器１４１，微生物検出用流路１７を連結し、検体１５１１や混合液が流動するための溶液用流路１５７と、検体１５１１や混合液を気圧により流動させるため搬送装置１４と各容器を接続する通気用流路１５８とで構成されている。染色液１４１１，位置あわせ用試薬１５４１の励起光，蛍光の波長は同じもしくは数十ｎｍ以内の差異である。また、微生物検査時に他の試薬とのコンタミを防ぐため、位置あわせ用試薬容器１５４は、他の容器よりも微生物検出用流路１７に近い場所（下流側）に設けられる。さらに、位置あわせ用試薬容器１５４から微生物検出用流路１７に至る流路は、他の容器の流路と異なる流路である。ここで、検体液の流れに沿って、検体容器１５１を上流側、微生物検出用流路１７を下流側と定義する。位置あわせ用試薬容器１５４から微生物検出用流路１７までの流路と、検体容器１５１から反応容器１４１を介して微生物検出用流路１７に至るまでの流路は、反応容器１４１と微生物検出用流路１７との間で結合される。
【００１４】
検出装置２１は、励起光源２１１と、励起光源２１１からの光を集光するための集光レンズ２１２から構成される照射部と、微生物検出用流路１７を通過する微生物もしくは位置あわせ用試薬からの蛍光を集光し、平行光にする対物レンズ２１４と、微生物もしくは位置あわせ用試薬の蛍光を通過するバンドパスフィルタ２４３と、平行光を集光させるための集光レンズ２４４と、迷光をカットするための空間フィルタとして用いるピンホール２４５と、バンドパスフィルタ２４３を通過した光を検出する光検出器２４６である検出部で構成される。照射部および検出部は、互いの焦点が重なるように配置し、測定時には微生物検出用流路１７を焦点の位置に調整する。
【００１５】
位置あわせ用試薬１５４１を微生物検出用流路１７に流動し、微生物検出用流路１７から発する位置あわせ用試薬１５４１の蛍光量が最も高くなるようＸ−Ｙ可動ステージ１２５で分析チップ１０を動かし、分析チップ１０の位置あわせを行う。
【００１６】
図２及び図３は、微生物検出用流路１７の位置調整の仕組みを説明するための模式図である。
【００１７】
分析チップ１０をＸ−Ｙ可動ステージ１２５にセットしたのち、微生物検出用流路１７に位置あわせ用試薬１５４１を流動する。次にＸ−Ｙ可動ステージ１２５により、分析チップ１０を励起光２１３の光軸に対し垂直方向（Ｘ方向）に動かす（図２）。このとき微生物検出用流路１７のＸ方向の変位と検出装置２１で検出される蛍光量Ｉの関係はグラフ１２８のようになり、微生物検出用流路１７が励起光２１３の光軸上を通過するとき（ｘc）最も蛍光強度が高くなる。Ｘ方向の変位と検出装置２１で検出される蛍光量Ｉのプロファイルをシステム装置１８でストックし、蛍光量Ｉが最大、もしくはｘ方向に対する蛍光量Ｉの一次微分が０となる位置をｘcとし、分析チップ１０をｘcに移動する。次に、Ｘ−Ｙ可動ステージ１２５により、分析チップを励起光２１３の光軸に対し平行方向（Ｙ方向）に動かす（図３）。このとき、微生物検出用流路Ｙ方向の変位と検出装置２１で検出される蛍光量Ｉの関係はグラフ１２９のようになり、微生物検出用流路１７が励起光２１３の焦点を通過するとき（ｙc）最も蛍光強度が高くなる。Ｘ方向と同様にＹ方向の変位と検出装置２１で検出される蛍光量Ｉのプロファイルをシステム装置１８でストックし、蛍光量Ｉが最大、もしくはｙ方向に対する蛍光量Ｉの一次微分が０となる位置をｙcとする。また、再度ｘ方向，ｙ方向についてｘc，ｙcを求める操作を繰り返すことでより高精度に位置あわせを行うことができる。
【００１８】
Ｙ方向に位置あわせを行う際は、光検出器直前のピンホールの径をより小さいものを使用することでより高精度に位置あわせを行うことができる。図４は、ピンホールの位置に投影される微生物検出用流路１７の像の模式図である。ピンホール１３０では、微生物検出用流路１７の位置が範囲１３２内にあるときに、微生物検出用流路１７からの蛍光は検出されるが、より小さいピンホール１３１では、微生物検出用流路１７の位置が範囲１３３内にあるときのみ、微生物検出用流路１７からの蛍光は検出されるため、より高精度に位置あわせを行うことができる。
【００１９】
ピンホールの径が小さすぎるとピンホールを通過する光量が減少するため、微生物検出用流路１７の位置あわせでは径の小さいピンホール１３１を用い、微生物検出では、検出する光量を増やすため径の大きいピンホール１３０を用いることが好ましい。
【００２０】
図５は、分析チップ１０の位置あわせの手順をフロー図で表したものである。
【００２１】
以下、食品由来の検体中の生菌数を計測するための実施例を示す。
【００２２】
図６は、本発明の微生物検査装置で用いる分析チップ１０の平面図である。最初に分析チップ１０の構成について説明する。
【００２３】
分析チップ１０は、検体１５１１を保持するための検体容器１５１と、死菌染色色素１５２１を保持するための死菌染色液容器１５２と、全菌染色色素１５３１を保持する反応容器である全菌染色液容器１５３と、位置あわせ用試薬１５４１を保持するための位置あわせ用試薬容器１５４と、洗浄液１５５１を保持するための洗浄液容器１５５と、検体中に含まれる食品残渣を取り除くためのフィルタである食品残渣除去部１６０と、外部光源より励起光を照射し、微生物の蛍光を観測するための微生物検出用流路１７と、微生物検出用流路１７を通過した検体１５１１，死菌染色色素１５２１，全菌染色色素１５３１の混合液を廃棄するための検出液廃液容器１５６と、検体容器１５１，食品残渣除去部１６０，死菌染色液容器１５２，全菌染色液容器１５３，微生物検出用流路１７を連結し、検体１５１１や混合液が流動するための溶液用流路１５７１〜１５７６と、各容器内の検体１５１１や混合液を気圧により流動させるための通気口１５９１〜１５９６と、通気口１５９１〜１５９６と各容器を接続する通気用流路１５８１〜１５８６とを備える。溶液用流路１５７１〜１５７６，通気口１５９１〜１５９６及び通気用流路１５８１〜１５８６は連結する容器の名称から、検体容器−死菌染色液容器間流路１５７１，死菌染色液容器−全菌染色液容器間流路１５７２，全菌染色液容器−洗浄液容器間流路１５７３，洗浄液容器−微生物検出用流路間流路１５７４，位置あわせ用試薬容器−微生物検出用流路間流路１５７５，微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６，検体容器通気口１５９１，死菌染色液容器通気口１５９２，全菌染色液容器通気口１５９３，洗浄液容器通気口１５９４，位置あわせ用試薬容器通気口１５９５，検出液廃棄容器通気口１５９６，検体容器通気流路１５８１，死菌染色液容器通気流路１５８２，全菌染色液容器通気流路１５８３，洗浄液容器通気流路１５８４，位置あわせ用試薬容器通気流路１５８５，検出液廃棄容器通気流路１５８６とする。
【００２４】
検体容器１５１１と、食品残渣除去部１６０と、死菌染色液容器１５２と、全菌染色液容器１５３と、洗浄液容器１５５と、微生物検出用流路１７と、検出液廃液容器１５６は、溶液用流路１５７１〜１５７４，１５７６により直列に連結されている。位置あわせ用試薬容器通気流路１５８５は、洗浄液容器通気流路１５８４から分岐する。
【００２５】
溶液用流路１５７１〜１５７６の深さおよび流路幅は１０μｍ〜１mm、通気用流路１５８１〜１５８６の深さ及び流路幅は１０μｍ〜１mmの範囲で形成され、溶液用流路１５７１〜１５７６の断面積は通気用流路１５８１〜１５８６の断面積より大きくなるように形成される。
【００２６】
微生物検出用流路１７は、蛍光計測を行うため光透過性，面精度，屈折率などの光学特性に優れている必要がある。別工程で作製した分析チップ１０に光学特性に優れた石英や光学ガラスの管を接続し微生物検出用流路１７として使用するか、ポリメタクリル酸メチルエステル，ポリジメチルシロキサンなどの光学特性に優れた樹脂材料を用い、分析チップ１０と一体で作製する。微生物検出用流路１７の断面形状は、好ましくは矩形だが円形であってもよい。微生物検出用流路１７の断面寸法が大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには寸法は小さいほうがいいため、一辺１μｍ〜１mmが好ましく、長さは、０.０１mm〜１０mmが好ましい。微生物検出用流路１７に照射する励起光の光軸は、微生物検出用流路１７に対して垂直方向である。
【００２７】
死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１，位置あわせ用試薬１５４１は、分析チップ１０内に前もって封入されている。検体１５１１は、検査前に通気口１５９１より、検体容器１５１に注入し、洗浄液１５５１は検査前に通気口１５９４から洗浄液容器１５５に注入する。
【００２８】
検体容器１５１の体積は、検体１５１１の体積より大きい。死菌染色液容器１５２の体積は、検体１５１１と死菌染色液１５２１の合計体積より大きい。全菌染色液容器１５３の体積は、検体１５１１と死菌染色液１５２１と全菌染色液１５３１との合計体積より大きい。洗浄液容器１５５の体積は、検体１５１１，死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１及び洗浄液１５５１の合計体積より大きい。また、検体容器−死菌染色液容器間流路１５７１の最高点は、検体容器１５１中の検体１５１１の水位より高くなるように形成される。これと同様に、死菌染色液容器−全菌染色液容器間流路１５７２の最高点は、検体１５１１と死菌染色色素１５２１の混合液の水位より高くなるように形成される。さらに、全菌染色液容器−洗浄液容器間流路１５７３の最高点は、検体１５１１，死菌染色色素１５２１，全菌染色色素１５３１の混合液の水位より高くなるように形成される。また、洗浄液容器−微生物検出用流路間流路１５７４の最高点は、検体１５１１，死菌染色色素１５２１，全菌染色色素１５３１，洗浄液１５５１の混合液の水位より高くなるように形成される。また、位置あわせ用試薬容器−微生物検出用流路間流路１５７５の最高点は、位置あわせ用試薬１５４１の水位より高くなるように形成される。
【００２９】
ここで使用した検体１５１１は、検査する食品に対し質量比１０倍の生理食塩水を加え、ストマッキング処理を行ったものであり、洗浄液１５５１は主に生理食塩水もしくは純水である。
【００３０】
死菌染色液１５２１には、例えば、ＰＩ（プロピディウムイオダイド）（０.１μｇ／ml〜１mg／ml）を使用し、全菌染色液１５４１には、例えば、ＤＡＰＩ（４′，６−ヂアミジン−２′−フェニルインドール）（１μｇ／ml〜１mg／ml），ＡＯ（アクリジンオレンジ）（１μｇ／ml〜１mg／ml），ＥＢ（エチジウムブロマイド）（１μｇ／ml〜１mg／ml），ＬＤＳ７５１（０.１μｇ／ml〜１mg／ml）などを使用する。
【００３１】
位置あわせ用試薬１５４１には、ＰＩ，ＤＡＰＩ，ＡＯ，ＥＢ，ＬＤＳ７５１などの蛍光色素や、特定の波長の蛍光を発する微粒子を含んだ溶液を使用する。検出のための光学系を共通化できるため、位置あわせ用試薬１５４１は死菌染色液１５２１か全菌染色液１５３１と波長ピークが近いほうが好ましい。
【００３２】
分析チップ１０を用いた生菌数測定は、始めに分析チップの位置あわせを行い、次に生菌数測定を行う。微生物計測の各工程における各液体の流動について説明する。
【００３３】
始めに、分析チップ１０の位置あわせにおける各液体の流動について説明する。分析チップ１０は、図中下辺を下にして立てて使用する。位置調整では、位置あわせ用試薬１５４１（ここではＰＩ（波長ピーク５３２ｎｍ）を使用する）を微生物検出用流路１７に流動する。位置あわせ用試薬容器通気口１６９５を介し、搬送装置１４からの圧力を加え、位置あわせ用試薬容器１５４内の気圧をあげる。同時に検出液廃棄容器通気口１５９６を介し、検出液廃液容器１５６を大気開放する。気圧差により、位置あわせ用試薬１５４１は、微生物検出用流路１７を経由し、検出液廃液容器１５６に入る。微生物検出用流路１７は検出装置から励起光が照射されているため、位置あわせ用試薬１５４１は微生物検出用流路１７を通過するときに蛍光を発する。検出装置で検出される蛍光が最も強くなるように分析チップ１０の位置を調整する。続いて、位置あわせ用試薬１５４１が微生物検出用流路１７に残存する可能性があり、微生物検出用流路１７を洗浄するため、位置調整後に洗浄液１５５１の一部を微生物検出用流路１７に流動する。
【００３４】
次に生菌数測定の工程における各液体の流動について説明する。
【００３５】
１．検体１５１１を死菌染色液容器１５２へ流動する。通気口１６３１を介し、搬送装置１４からの圧力を加え、検体容器１５１内の気圧をあげる。同時に死菌染色液容器通気口１５９２を介し、死菌染色液容器１５２を大気開放する。気圧差により、検体１５１１は、死菌染色液容器１５２に入り、死菌染色液１５３１と混合する。検体１５１１中の死菌は、死菌染色液１５２１（ここではＰＩ（ピーク波長５３２ｎｍ）を使用する）により染色される。
【００３６】
一方、検体１５１１中の生菌は、染色されない。二液の混合液の水位は、死菌染色液容器１５２と全菌染色液容器１５３を連結する死菌染色液容器−全菌染色液容器間流路１５７２の最高点を越えず、さらに死菌染色液容器１５２中に入っている空気は、死菌染色液容器通気口１５９２を介し外部に放出される。死菌染色液容器１５２の気圧は大気圧と等しいため、二液の混合液は全菌染色液容器１５３に押し出されず、混合液を反応に必要な時間中、死菌染色液容器１５２に保持することができる。同様に、全菌染色液１５３１（ここではＬＤＳ７５１を（ピーク波長７１０ｎｍ）使用）は、洗浄液容器１５５に押し出されず、また死菌染色液容器１５２に逆流もしない。
【００３７】
このとき、混合液の全菌染色液容器１５３への流入をさらに防ぐ目的で、各通気口１５９３〜１５９６を介し、搬送装置からの圧力を加え、検体容器１５１の気圧より低い範囲まで全菌染色液容器１５３，位置あわせ用試薬容器１５４，洗浄液容器１５５，検出液廃液容器１５６の気圧を上げてもよい。
【００３８】
なお、染色中は、分析チップ１０の温度を一定に保つことにより、温度変化による染色の影響を小さくすることが良い。
【００３９】
また、検体１５１１が食品残渣除去部１６０を経て、死菌染色液容器１５２へ流動する際に、検体１５１１中の食品残渣は、食品残渣除去部１６０により検体１５１１から取り除かれる。
【００４０】
２．検体１５１１と死菌染色液１５２１の混合液を全菌染色液容器１５３に流動する。全菌染色液１５３１が混合液に追加され、検体１５１１中の死菌と生菌は、全菌染色液１５３１により染色される。
【００４１】
３．検体１５１１，死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１の混合液を洗浄液容器１５５に流動する。洗浄液１５４１が混合液に追加され、混合液中に含まれる未結合色素（微生物を染色しない死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１）の濃度を低下する。未結合色素の濃度を低下することで、検出の際にノイズの原因となる未結合色素の発する蛍光量を低減する。
【００４２】
４．検体１５１１，死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１，洗浄液１５４１の混合液を微生物検出用流路１７に流動する。図中垂直方向より、励起光が照射されているため、微生物は蛍光を発する。蛍光を検出する検出装置２１により、生菌は全菌染色液１５３１の蛍光のみ検出され、死菌は全菌染色液１５３１と死菌染色液１５２１の蛍光が検出されるため、生菌と死菌の判別が可能になる。
【００４３】
図７は、生菌，死菌を判別するための検出装置２１の光学系の構成図である。光学装置やその配置は使用する蛍光色素の励起スペクトルと蛍光スペクトルによって異なる場合もある。ここでは、死菌染色液としてＰＩ（励起波長ピーク５３２ｎｍ，蛍光波長ピーク６１５ｎｍ）と全菌染色液としてＬＤＳ７５１（励起波長ピーク５４１ｎｍ，蛍光波長ピーク７１０ｎｍ）の二種類の蛍光色素を使用に対応した光学系について説明する。
【００４４】
検出装置２１は、励起光源２１１（波長５３２ｎｍ）と、励起光源２１１からの光を集光するための集光レンズ２１２から構成される照射系と、微生物検出用流路１７を通過する微生物からの蛍光を集光し、平行光にする対物レンズ２１４と、波長６１０ｎｍ以下の光を反射し、波長６１０ｎｍ以上の光を通過させるダイクロイックミラー２１５と、ミラー２１６と、波長６１０ｎｍ近傍の波長の光のみ通過させる短波長用バンドパスフィルタ２１７と、波長７１０ｎｍ近傍の波長の光を通過させる長波長用バンドパスフィルタ２１８と、平行光を集光させるための集光レンズ２１９，２２０と、迷光をカットするための空間フィルタとして用いるピンホール２２１，２２２と、短波長用バンドパスフィルタ２１７を通過した光を検出する短波長用光検出器２２３と、長波長用バンドパスフィルタ２１８を通過した光を検出する長波長用光検出器２２４とを備えた検出系で構成される。
【００４５】
集光レンズ２１２の焦点と対物レンズ２１４の焦点は交わるように構成され、検査時には、Ｘ−Ｙ可動ステージ１２５により分析チップ１０の微生物検出用流路１７を集光レンズ２１２及び対物レンズ２１４の焦点の位置に調整する。励起光源２１１はレーザーを使用し、短波長光検出器２２３と長波長光検出器２２４はフォトマルを使用する。
【００４６】
励起光源２１１から出力された励起光（波長５３２ｎｍ）は、集光レンズ２１２で集光され、微生物検出用流路１７を流れる微生物を染色したＰＩおよびＬＤＳ７５１を励起する。ＰＩからの蛍光２２６、及びＬＤＳ７５１からの蛍光２２７（ＰＩは中心波長６１０ｎｍ、ＬＤＳ７５１は中心波長７１０ｎｍ）は集光レンズ２２０に入射する。ＰＩからの蛍光２２６はダイクロイックミラー２１５で反射し、ＬＤＳ７５１からの蛍光２２７はダイクロイックミラー２１５を通過するため、二つの色素由来の蛍光は波長の違いにより分離できる。ＰＩからの蛍光２２６は短波長用バンドパスフィルタ２１７を通過し、集光レンズ２１９で集光し、ピンホール２２１を通過し、短波長用光検出器２２３に入射し、ＬＤＳ７５１からの蛍光２２７は長波長用バンドパスフィルタ２１８を通過し、集光レンズ２２０で集光し、ピンホール２２２を通過し、長波長用光検出器２２４に入射する。
【００４７】
入射した蛍光は、短波長用光検出器２２３及び長波長用光検出器２２４により電気信号に変換され、電気信号はシステム装置１８に送られる。システム装置１８は、短波長用光検出器２２３，長波長用光検出器２２４から送られた電気信号を処理し、微生物数の情報を検査結果として、出力装置１９に出力する。
【００４８】
図８は、分析チップ１０を用いた生菌数計測の工程をフロー図で表したものである。
【００４９】
図９は、自己発光試薬を位置あわせ用試薬に使用したときの分析チップ１０の平面図である。混合することで発光反応する二つの試薬を保持するための容器を分析チップ１０内に備える。それぞれ、第１の発光試薬１５４１を保持するための第１の発光試薬容器１５４１と、第２の発光試薬１５４３を保持するための第２の発光試薬容器１５４２とする。例えば、第１の発光試薬１５４１にはルシフェリン−ルシフェラーゼ混合液を、第２の発光試薬１５４３にはＡＴＰ水溶液を使用することで、第１の発光試薬１５４１を第２の発光試薬１５４３と混合後、微生物検出用流路１７に流動し、ＡＴＰ発光を利用し位置調整を行うことができる。
【００５０】
図１０は、位置あわせ用試薬が流れる流路と微生物検出用流路１７を別流路にした分析チップ１０の平面図である。微生物検出用流路１７に隣接する位置あわせ用流路１７１に位置あわせ用試薬１５４１を流動させ、分析チップ１０の位置あわせを行う。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の一実施の形態である微生物検査装置の構成図である。
【図２】本発明の微生物検査装置における位置調整の仕組みを説明するための模式図である。
【図３】本発明の微生物検査装置における位置調整の仕組みを説明するための模式図である。
【図４】本発明の微生物検査装置における微生物検出用流路の像の模式図である。
【図５】本発明の微生物検査装置における分析チップ１０の位置あわせの手順のフロー図である。
【図６】本発明の一実施の形態である微生物検査装置における分析チップを示す平面図である。
【図７】一実施の形態である微生物検査装置における検出装置を示す構成図である。
【図８】一実施の形態である微生物検査装置における分析工程のフロー図である。
【図９】一実施の形態である微生物検査装置における分析チップを示す平面図である。
【図１０】一実施の形態である微生物検査装置における分析チップを示す平面図である。
【符号の説明】
【００５２】
１ 微生物検査装置
１０ 分析チップ
１４ 搬送装置
１７ 微生物検出用流路
１８ システム装置
１９ 出力装置
２１ 検出装置
１２５ Ｘ−Ｙ可動ステージ
１２８ ｘ方向変位と出力値の関係を示すグラフ
１２９ ｙ方向変位と出力値の関係を示すグラフ
１３０，２２１，２２２ ピンホール
１３１ 小さいピンホール
１３２，１３３ 範囲
１５１ 検体容器
１５２ 死菌染色液容器
１５３ 全菌染色液容器
１５４ 位置あわせ用試薬容器
１５５ 洗浄液容器
１５６ 検出液廃液容器
１５７ 溶液用流路
１５８ 通気用流路
１５９ 通気口
２１１ 励起光源
２１２，２１９，２２０ 集光レンズ
２１３ 励起光
２１４ 対物レンズ
２１５ ダイクロイックミラー
２１６ ミラー
２１７ 短波長用バンドパスフィルタ
２１８ 長波長用バンドパスフィルタ
２２３ 短波長用光検出器
２２４ 長波長用光検出器
２２６ ＰＩからの蛍光
２２７ ＬＤＳ７５１からの蛍光
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の計測を行う微生物検査装置及び微生物検査用チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生菌数計測の迅速化および簡便化を目的としたさまざまな簡便迅速測定法を実施する計測装置が知られている。特に、生菌数を迅速に直接計測する手法として、蛍光フローサイトメトリ法を用いた菌数測定装置がある。
【０００３】
蛍光フローサイトメトリ法は、蛍光色素で染色した検体を含む検体の流径を細くし、検体を一個ずつ流し計測する粒子計測方法であり、この方法を用いた菌数測定装置は、短時間に検体を一個ずつ計測することができる。
【０００４】
また、蛍光フローサイトメトリ法において、検体中の成分が流路壁面に付着することを防止するため、検体とシース液の層流を形成し、二液の圧力差を利用し、検体の流径を絞り込むことが行われている。
【０００５】
さらに、低価格化を実現したり、洗浄の手間を省略したりするため、蛍光フローサイトメトリ法による測定を行う流路部分をディスポーザブルのチップにし、ディスポーザブルのチップ内で測定を行い、測定する流路部分を使い捨てにすることが知られ、例えば、非特許文献１に記載されている。
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Biomolecular Techniques、Vol14、Issue2、pp.119-127
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記蛍光フローサイトメトリ法を用いた計測装置では、細い検出用の流路に励起光を照射し、微粒子の出す蛍光を検出するため、励起光および検出器の焦点に流路の位置をあわせる必要がある。しかし、励起光および検出器の焦点の範囲，流路の幅は、数ミクロンから数百ミクロンであり、高精度の測定をするためには数十ミクロンの精度の位置あわせが必要になる。さらに、流路部分をディスポーザブルなチップにする場合には、測定毎に流路の位置あわせを行う必要がある。
【０００８】
チップの位置あわせの手段としては、チップの一部に特定の目印を設け、目印の位置を基準に検出用の流路の位置調整を行う方法がある。しかし、一般的にチップは、樹脂の射出成型で作製されるため、金型内の樹脂の熱流動現象や、離型後の成型品の収縮変形が生じ、検出用の流路と目印の相対位置が安定しない。そのため、数十ミクロンの精度を再現するには、射出成型後に機械加工を行う必要があるが、使い捨てのチップには不向きである。また、微粒子の出す蛍光を検出するための光学系のほかに、目印を認識するための光学系が必要になるため、装置の大型化や高コスト化につながる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、少なくとも、微生物を含む検体液を保持する検体容器と、前記検体液と反応する試薬液を保持するとともに、前記検体液と前記試薬液とを反応させる反応容器と、前記微生物を検出する検出用流路と、前記検出用流路の位置あわせを行う位置あわせ用試薬が保持された位置あわせ用試薬容器とを有する分析チップと、前記分析チップと連結され、前記分析チップに、少なくとも、前記検体液，前記試薬液及び前記位置あわせ用試薬とを搬送する搬送装置と、前記分析チップを保持するとともに、前記分析チップを移動させるステージと、少なくとも、前記検出用流路に光を照射する光源と、前記検出用流路からの光を検出するとともに、前記光を電気信号に変換する処理を行う光検出器とを有する検出装置と、前記光検出器で変換された電気信号を出力する出力装置とを備え、前記位置あわせ用試薬容器は、少なくとも前記検体容器及び前記反応容器よりも下流側に設けられる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、微生物検出用流路の精度の高い位置あわせを可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１２】
図１は、本発明の微生物検査装置１の構成図である。微生物検査装置１は、検体や試薬を内部に保持し、微生物計測に必要な工程を行うための機構を内部に備えた分析チップ１０と、微生物計測に必要な工程を行うために、分析チップ１０と連結したチップ連結管１４４を介して、分析チップ１０内の検体や試薬の搬送を制御するための搬送装置１４と、分析チップ１０を保持し、分析チップ１０の位置を調整するＸ−Ｙ可動ステージ１２５と、分析チップ１０内の微生物に励起光を照射し、微生物からの蛍光を電気信号に変換する検出装置２１で構成されている。微生物検査装置１に連結したシステム装置１８は、搬送装置１４に制御のための信号の出力と、検出装置２１からの電気信号の処理を行う。電気信号の処理により得られた計測結果は出力装置１９に表示される。
【００１３】
分析チップ１０は、検体１５１１を保持するための検体容器１５１と、検体中の微生物を染色するための染色液（試薬液）１４１１を保持し、検体と染色液を混合，反応させる反応容器１４１と、蛍光性の位置あわせ用試薬１５４１を保持するための位置あわせ用試薬容器１５４と、励起光源２１１より励起光２１３を照射し、微生物もしくは位置あわせ用試薬の蛍光を観測するための微生物検出用流路１７と、微生物検出用流路１７を通過した検体１５１１，染色液１４１１の混合液を廃棄するための検出液廃液容器１５６と、検体容器１５１，反応容器１４１，微生物検出用流路１７を連結し、検体１５１１や混合液が流動するための溶液用流路１５７と、検体１５１１や混合液を気圧により流動させるため搬送装置１４と各容器を接続する通気用流路１５８とで構成されている。染色液１４１１，位置あわせ用試薬１５４１の励起光，蛍光の波長は同じもしくは数十ｎｍ以内の差異である。また、微生物検査時に他の試薬とのコンタミを防ぐため、位置あわせ用試薬容器１５４は、他の容器よりも微生物検出用流路１７に近い場所（下流側）に設けられる。さらに、位置あわせ用試薬容器１５４から微生物検出用流路１７に至る流路は、他の容器の流路と異なる流路である。ここで、検体液の流れに沿って、検体容器１５１を上流側、微生物検出用流路１７を下流側と定義する。位置あわせ用試薬容器１５４から微生物検出用流路１７までの流路と、検体容器１５１から反応容器１４１を介して微生物検出用流路１７に至るまでの流路は、反応容器１４１と微生物検出用流路１７との間で結合される。
【００１４】
検出装置２１は、励起光源２１１と、励起光源２１１からの光を集光するための集光レンズ２１２から構成される照射部と、微生物検出用流路１７を通過する微生物もしくは位置あわせ用試薬からの蛍光を集光し、平行光にする対物レンズ２１４と、微生物もしくは位置あわせ用試薬の蛍光を通過するバンドパスフィルタ２４３と、平行光を集光させるための集光レンズ２４４と、迷光をカットするための空間フィルタとして用いるピンホール２４５と、バンドパスフィルタ２４３を通過した光を検出する光検出器２４６である検出部で構成される。照射部および検出部は、互いの焦点が重なるように配置し、測定時には微生物検出用流路１７を焦点の位置に調整する。
【００１５】
位置あわせ用試薬１５４１を微生物検出用流路１７に流動し、微生物検出用流路１７から発する位置あわせ用試薬１５４１の蛍光量が最も高くなるようＸ−Ｙ可動ステージ１２５で分析チップ１０を動かし、分析チップ１０の位置あわせを行う。
【００１６】
図２及び図３は、微生物検出用流路１７の位置調整の仕組みを説明するための模式図である。
【００１７】
分析チップ１０をＸ−Ｙ可動ステージ１２５にセットしたのち、微生物検出用流路１７に位置あわせ用試薬１５４１を流動する。次にＸ−Ｙ可動ステージ１２５により、分析チップ１０を励起光２１３の光軸に対し垂直方向（Ｘ方向）に動かす（図２）。このとき微生物検出用流路１７のＸ方向の変位と検出装置２１で検出される蛍光量Ｉの関係はグラフ１２８のようになり、微生物検出用流路１７が励起光２１３の光軸上を通過するとき（ｘc）最も蛍光強度が高くなる。Ｘ方向の変位と検出装置２１で検出される蛍光量Ｉのプロファイルをシステム装置１８でストックし、蛍光量Ｉが最大、もしくはｘ方向に対する蛍光量Ｉの一次微分が０となる位置をｘcとし、分析チップ１０をｘcに移動する。次に、Ｘ−Ｙ可動ステージ１２５により、分析チップを励起光２１３の光軸に対し平行方向（Ｙ方向）に動かす（図３）。このとき、微生物検出用流路Ｙ方向の変位と検出装置２１で検出される蛍光量Ｉの関係はグラフ１２９のようになり、微生物検出用流路１７が励起光２１３の焦点を通過するとき（ｙc）最も蛍光強度が高くなる。Ｘ方向と同様にＹ方向の変位と検出装置２１で検出される蛍光量Ｉのプロファイルをシステム装置１８でストックし、蛍光量Ｉが最大、もしくはｙ方向に対する蛍光量Ｉの一次微分が０となる位置をｙcとする。また、再度ｘ方向，ｙ方向についてｘc，ｙcを求める操作を繰り返すことでより高精度に位置あわせを行うことができる。
【００１８】
Ｙ方向に位置あわせを行う際は、光検出器直前のピンホールの径をより小さいものを使用することでより高精度に位置あわせを行うことができる。図４は、ピンホールの位置に投影される微生物検出用流路１７の像の模式図である。ピンホール１３０では、微生物検出用流路１７の位置が範囲１３２内にあるときに、微生物検出用流路１７からの蛍光は検出されるが、より小さいピンホール１３１では、微生物検出用流路１７の位置が範囲１３３内にあるときのみ、微生物検出用流路１７からの蛍光は検出されるため、より高精度に位置あわせを行うことができる。
【００１９】
ピンホールの径が小さすぎるとピンホールを通過する光量が減少するため、微生物検出用流路１７の位置あわせでは径の小さいピンホール１３１を用い、微生物検出では、検出する光量を増やすため径の大きいピンホール１３０を用いることが好ましい。
【００２０】
図５は、分析チップ１０の位置あわせの手順をフロー図で表したものである。
【００２１】
以下、食品由来の検体中の生菌数を計測するための実施例を示す。
【００２２】
図６は、本発明の微生物検査装置で用いる分析チップ１０の平面図である。最初に分析チップ１０の構成について説明する。
【００２３】
分析チップ１０は、検体１５１１を保持するための検体容器１５１と、死菌染色色素１５２１を保持するための死菌染色液容器１５２と、全菌染色色素１５３１を保持する反応容器である全菌染色液容器１５３と、位置あわせ用試薬１５４１を保持するための位置あわせ用試薬容器１５４と、洗浄液１５５１を保持するための洗浄液容器１５５と、検体中に含まれる食品残渣を取り除くためのフィルタである食品残渣除去部１６０と、外部光源より励起光を照射し、微生物の蛍光を観測するための微生物検出用流路１７と、微生物検出用流路１７を通過した検体１５１１，死菌染色色素１５２１，全菌染色色素１５３１の混合液を廃棄するための検出液廃液容器１５６と、検体容器１５１，食品残渣除去部１６０，死菌染色液容器１５２，全菌染色液容器１５３，微生物検出用流路１７を連結し、検体１５１１や混合液が流動するための溶液用流路１５７１〜１５７６と、各容器内の検体１５１１や混合液を気圧により流動させるための通気口１５９１〜１５９６と、通気口１５９１〜１５９６と各容器を接続する通気用流路１５８１〜１５８６とを備える。溶液用流路１５７１〜１５７６，通気口１５９１〜１５９６及び通気用流路１５８１〜１５８６は連結する容器の名称から、検体容器−死菌染色液容器間流路１５７１，死菌染色液容器−全菌染色液容器間流路１５７２，全菌染色液容器−洗浄液容器間流路１５７３，洗浄液容器−微生物検出用流路間流路１５７４，位置あわせ用試薬容器−微生物検出用流路間流路１５７５，微生物検出用流路−検出液廃棄容器間流路１５７６，検体容器通気口１５９１，死菌染色液容器通気口１５９２，全菌染色液容器通気口１５９３，洗浄液容器通気口１５９４，位置あわせ用試薬容器通気口１５９５，検出液廃棄容器通気口１５９６，検体容器通気流路１５８１，死菌染色液容器通気流路１５８２，全菌染色液容器通気流路１５８３，洗浄液容器通気流路１５８４，位置あわせ用試薬容器通気流路１５８５，検出液廃棄容器通気流路１５８６とする。
【００２４】
検体容器１５１１と、食品残渣除去部１６０と、死菌染色液容器１５２と、全菌染色液容器１５３と、洗浄液容器１５５と、微生物検出用流路１７と、検出液廃液容器１５６は、溶液用流路１５７１〜１５７４，１５７６により直列に連結されている。位置あわせ用試薬容器通気流路１５８５は、洗浄液容器通気流路１５８４から分岐する。
【００２５】
溶液用流路１５７１〜１５７６の深さおよび流路幅は１０μｍ〜１mm、通気用流路１５８１〜１５８６の深さ及び流路幅は１０μｍ〜１mmの範囲で形成され、溶液用流路１５７１〜１５７６の断面積は通気用流路１５８１〜１５８６の断面積より大きくなるように形成される。
【００２６】
微生物検出用流路１７は、蛍光計測を行うため光透過性，面精度，屈折率などの光学特性に優れている必要がある。別工程で作製した分析チップ１０に光学特性に優れた石英や光学ガラスの管を接続し微生物検出用流路１７として使用するか、ポリメタクリル酸メチルエステル，ポリジメチルシロキサンなどの光学特性に優れた樹脂材料を用い、分析チップ１０と一体で作製する。微生物検出用流路１７の断面形状は、好ましくは矩形だが円形であってもよい。微生物検出用流路１７の断面寸法が大きいほど圧力損失は小さくなるが、微生物を一個ずつ流すためには寸法は小さいほうがいいため、一辺１μｍ〜１mmが好ましく、長さは、０.０１mm〜１０mmが好ましい。微生物検出用流路１７に照射する励起光の光軸は、微生物検出用流路１７に対して垂直方向である。
【００２７】
死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１，位置あわせ用試薬１５４１は、分析チップ１０内に前もって封入されている。検体１５１１は、検査前に通気口１５９１より、検体容器１５１に注入し、洗浄液１５５１は検査前に通気口１５９４から洗浄液容器１５５に注入する。
【００２８】
検体容器１５１の体積は、検体１５１１の体積より大きい。死菌染色液容器１５２の体積は、検体１５１１と死菌染色液１５２１の合計体積より大きい。全菌染色液容器１５３の体積は、検体１５１１と死菌染色液１５２１と全菌染色液１５３１との合計体積より大きい。洗浄液容器１５５の体積は、検体１５１１，死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１及び洗浄液１５５１の合計体積より大きい。また、検体容器−死菌染色液容器間流路１５７１の最高点は、検体容器１５１中の検体１５１１の水位より高くなるように形成される。これと同様に、死菌染色液容器−全菌染色液容器間流路１５７２の最高点は、検体１５１１と死菌染色色素１５２１の混合液の水位より高くなるように形成される。さらに、全菌染色液容器−洗浄液容器間流路１５７３の最高点は、検体１５１１，死菌染色色素１５２１，全菌染色色素１５３１の混合液の水位より高くなるように形成される。また、洗浄液容器−微生物検出用流路間流路１５７４の最高点は、検体１５１１，死菌染色色素１５２１，全菌染色色素１５３１，洗浄液１５５１の混合液の水位より高くなるように形成される。また、位置あわせ用試薬容器−微生物検出用流路間流路１５７５の最高点は、位置あわせ用試薬１５４１の水位より高くなるように形成される。
【００２９】
ここで使用した検体１５１１は、検査する食品に対し質量比１０倍の生理食塩水を加え、ストマッキング処理を行ったものであり、洗浄液１５５１は主に生理食塩水もしくは純水である。
【００３０】
死菌染色液１５２１には、例えば、ＰＩ（プロピディウムイオダイド）（０.１μｇ／ml〜１mg／ml）を使用し、全菌染色液１５４１には、例えば、ＤＡＰＩ（４′，６−ヂアミジン−２′−フェニルインドール）（１μｇ／ml〜１mg／ml），ＡＯ（アクリジンオレンジ）（１μｇ／ml〜１mg／ml），ＥＢ（エチジウムブロマイド）（１μｇ／ml〜１mg／ml），ＬＤＳ７５１（０.１μｇ／ml〜１mg／ml）などを使用する。
【００３１】
位置あわせ用試薬１５４１には、ＰＩ，ＤＡＰＩ，ＡＯ，ＥＢ，ＬＤＳ７５１などの蛍光色素や、特定の波長の蛍光を発する微粒子を含んだ溶液を使用する。検出のための光学系を共通化できるため、位置あわせ用試薬１５４１は死菌染色液１５２１か全菌染色液１５３１と波長ピークが近いほうが好ましい。
【００３２】
分析チップ１０を用いた生菌数測定は、始めに分析チップの位置あわせを行い、次に生菌数測定を行う。微生物計測の各工程における各液体の流動について説明する。
【００３３】
始めに、分析チップ１０の位置あわせにおける各液体の流動について説明する。分析チップ１０は、図中下辺を下にして立てて使用する。位置調整では、位置あわせ用試薬１５４１（ここではＰＩ（波長ピーク５３２ｎｍ）を使用する）を微生物検出用流路１７に流動する。位置あわせ用試薬容器通気口１６９５を介し、搬送装置１４からの圧力を加え、位置あわせ用試薬容器１５４内の気圧をあげる。同時に検出液廃棄容器通気口１５９６を介し、検出液廃液容器１５６を大気開放する。気圧差により、位置あわせ用試薬１５４１は、微生物検出用流路１７を経由し、検出液廃液容器１５６に入る。微生物検出用流路１７は検出装置から励起光が照射されているため、位置あわせ用試薬１５４１は微生物検出用流路１７を通過するときに蛍光を発する。検出装置で検出される蛍光が最も強くなるように分析チップ１０の位置を調整する。続いて、位置あわせ用試薬１５４１が微生物検出用流路１７に残存する可能性があり、微生物検出用流路１７を洗浄するため、位置調整後に洗浄液１５５１の一部を微生物検出用流路１７に流動する。
【００３４】
次に生菌数測定の工程における各液体の流動について説明する。
【００３５】
１．検体１５１１を死菌染色液容器１５２へ流動する。通気口１６３１を介し、搬送装置１４からの圧力を加え、検体容器１５１内の気圧をあげる。同時に死菌染色液容器通気口１５９２を介し、死菌染色液容器１５２を大気開放する。気圧差により、検体１５１１は、死菌染色液容器１５２に入り、死菌染色液１５３１と混合する。検体１５１１中の死菌は、死菌染色液１５２１（ここではＰＩ（ピーク波長５３２ｎｍ）を使用する）により染色される。
【００３６】
一方、検体１５１１中の生菌は、染色されない。二液の混合液の水位は、死菌染色液容器１５２と全菌染色液容器１５３を連結する死菌染色液容器−全菌染色液容器間流路１５７２の最高点を越えず、さらに死菌染色液容器１５２中に入っている空気は、死菌染色液容器通気口１５９２を介し外部に放出される。死菌染色液容器１５２の気圧は大気圧と等しいため、二液の混合液は全菌染色液容器１５３に押し出されず、混合液を反応に必要な時間中、死菌染色液容器１５２に保持することができる。同様に、全菌染色液１５３１（ここではＬＤＳ７５１を（ピーク波長７１０ｎｍ）使用）は、洗浄液容器１５５に押し出されず、また死菌染色液容器１５２に逆流もしない。
【００３７】
このとき、混合液の全菌染色液容器１５３への流入をさらに防ぐ目的で、各通気口１５９３〜１５９６を介し、搬送装置からの圧力を加え、検体容器１５１の気圧より低い範囲まで全菌染色液容器１５３，位置あわせ用試薬容器１５４，洗浄液容器１５５，検出液廃液容器１５６の気圧を上げてもよい。
【００３８】
なお、染色中は、分析チップ１０の温度を一定に保つことにより、温度変化による染色の影響を小さくすることが良い。
【００３９】
また、検体１５１１が食品残渣除去部１６０を経て、死菌染色液容器１５２へ流動する際に、検体１５１１中の食品残渣は、食品残渣除去部１６０により検体１５１１から取り除かれる。
【００４０】
２．検体１５１１と死菌染色液１５２１の混合液を全菌染色液容器１５３に流動する。全菌染色液１５３１が混合液に追加され、検体１５１１中の死菌と生菌は、全菌染色液１５３１により染色される。
【００４１】
３．検体１５１１，死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１の混合液を洗浄液容器１５５に流動する。洗浄液１５４１が混合液に追加され、混合液中に含まれる未結合色素（微生物を染色しない死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１）の濃度を低下する。未結合色素の濃度を低下することで、検出の際にノイズの原因となる未結合色素の発する蛍光量を低減する。
【００４２】
４．検体１５１１，死菌染色液１５２１，全菌染色液１５３１，洗浄液１５４１の混合液を微生物検出用流路１７に流動する。図中垂直方向より、励起光が照射されているため、微生物は蛍光を発する。蛍光を検出する検出装置２１により、生菌は全菌染色液１５３１の蛍光のみ検出され、死菌は全菌染色液１５３１と死菌染色液１５２１の蛍光が検出されるため、生菌と死菌の判別が可能になる。
【００４３】
図７は、生菌，死菌を判別するための検出装置２１の光学系の構成図である。光学装置やその配置は使用する蛍光色素の励起スペクトルと蛍光スペクトルによって異なる場合もある。ここでは、死菌染色液としてＰＩ（励起波長ピーク５３２ｎｍ，蛍光波長ピーク６１５ｎｍ）と全菌染色液としてＬＤＳ７５１（励起波長ピーク５４１ｎｍ，蛍光波長ピーク７１０ｎｍ）の二種類の蛍光色素を使用に対応した光学系について説明する。
【００４４】
検出装置２１は、励起光源２１１（波長５３２ｎｍ）と、励起光源２１１からの光を集光するための集光レンズ２１２から構成される照射系と、微生物検出用流路１７を通過する微生物からの蛍光を集光し、平行光にする対物レンズ２１４と、波長６１０ｎｍ以下の光を反射し、波長６１０ｎｍ以上の光を通過させるダイクロイックミラー２１５と、ミラー２１６と、波長６１０ｎｍ近傍の波長の光のみ通過させる短波長用バンドパスフィルタ２１７と、波長７１０ｎｍ近傍の波長の光を通過させる長波長用バンドパスフィルタ２１８と、平行光を集光させるための集光レンズ２１９，２２０と、迷光をカットするための空間フィルタとして用いるピンホール２２１，２２２と、短波長用バンドパスフィルタ２１７を通過した光を検出する短波長用光検出器２２３と、長波長用バンドパスフィルタ２１８を通過した光を検出する長波長用光検出器２２４とを備えた検出系で構成される。
【００４５】
集光レンズ２１２の焦点と対物レンズ２１４の焦点は交わるように構成され、検査時には、Ｘ−Ｙ可動ステージ１２５により分析チップ１０の微生物検出用流路１７を集光レンズ２１２及び対物レンズ２１４の焦点の位置に調整する。励起光源２１１はレーザーを使用し、短波長光検出器２２３と長波長光検出器２２４はフォトマルを使用する。
【００４６】
励起光源２１１から出力された励起光（波長５３２ｎｍ）は、集光レンズ２１２で集光され、微生物検出用流路１７を流れる微生物を染色したＰＩおよびＬＤＳ７５１を励起する。ＰＩからの蛍光２２６、及びＬＤＳ７５１からの蛍光２２７（ＰＩは中心波長６１０ｎｍ、ＬＤＳ７５１は中心波長７１０ｎｍ）は集光レンズ２２０に入射する。ＰＩからの蛍光２２６はダイクロイックミラー２１５で反射し、ＬＤＳ７５１からの蛍光２２７はダイクロイックミラー２１５を通過するため、二つの色素由来の蛍光は波長の違いにより分離できる。ＰＩからの蛍光２２６は短波長用バンドパスフィルタ２１７を通過し、集光レンズ２１９で集光し、ピンホール２２１を通過し、短波長用光検出器２２３に入射し、ＬＤＳ７５１からの蛍光２２７は長波長用バンドパスフィルタ２１８を通過し、集光レンズ２２０で集光し、ピンホール２２２を通過し、長波長用光検出器２２４に入射する。
【００４７】
入射した蛍光は、短波長用光検出器２２３及び長波長用光検出器２２４により電気信号に変換され、電気信号はシステム装置１８に送られる。システム装置１８は、短波長用光検出器２２３，長波長用光検出器２２４から送られた電気信号を処理し、微生物数の情報を検査結果として、出力装置１９に出力する。
【００４８】
図８は、分析チップ１０を用いた生菌数計測の工程をフロー図で表したものである。
【００４９】
図９は、自己発光試薬を位置あわせ用試薬に使用したときの分析チップ１０の平面図である。混合することで発光反応する二つの試薬を保持するための容器を分析チップ１０内に備える。それぞれ、第１の発光試薬１５４１を保持するための第１の発光試薬容器１５４１と、第２の発光試薬１５４３を保持するための第２の発光試薬容器１５４２とする。例えば、第１の発光試薬１５４１にはルシフェリン−ルシフェラーゼ混合液を、第２の発光試薬１５４３にはＡＴＰ水溶液を使用することで、第１の発光試薬１５４１を第２の発光試薬１５４３と混合後、微生物検出用流路１７に流動し、ＡＴＰ発光を利用し位置調整を行うことができる。
【００５０】
図１０は、位置あわせ用試薬が流れる流路と微生物検出用流路１７を別流路にした分析チップ１０の平面図である。微生物検出用流路１７に隣接する位置あわせ用流路１７１に位置あわせ用試薬１５４１を流動させ、分析チップ１０の位置あわせを行う。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の一実施の形態である微生物検査装置の構成図である。
【図２】本発明の微生物検査装置における位置調整の仕組みを説明するための模式図である。
【図３】本発明の微生物検査装置における位置調整の仕組みを説明するための模式図である。
【図４】本発明の微生物検査装置における微生物検出用流路の像の模式図である。
【図５】本発明の微生物検査装置における分析チップ１０の位置あわせの手順のフロー図である。
【図６】本発明の一実施の形態である微生物検査装置における分析チップを示す平面図である。
【図７】一実施の形態である微生物検査装置における検出装置を示す構成図である。
【図８】一実施の形態である微生物検査装置における分析工程のフロー図である。
【図９】一実施の形態である微生物検査装置における分析チップを示す平面図である。
【図１０】一実施の形態である微生物検査装置における分析チップを示す平面図である。
【符号の説明】
【００５２】
１ 微生物検査装置
１０ 分析チップ
１４ 搬送装置
１７ 微生物検出用流路
１８ システム装置
１９ 出力装置
２１ 検出装置
１２５ Ｘ−Ｙ可動ステージ
１２８ ｘ方向変位と出力値の関係を示すグラフ
１２９ ｙ方向変位と出力値の関係を示すグラフ
１３０，２２１，２２２ ピンホール
１３１ 小さいピンホール
１３２，１３３ 範囲
１５１ 検体容器
１５２ 死菌染色液容器
１５３ 全菌染色液容器
１５４ 位置あわせ用試薬容器
１５５ 洗浄液容器
１５６ 検出液廃液容器
１５７ 溶液用流路
１５８ 通気用流路
１５９ 通気口
２１１ 励起光源
２１２，２１９，２２０ 集光レンズ
２１３ 励起光
２１４ 対物レンズ
２１５ ダイクロイックミラー
２１６ ミラー
２１７ 短波長用バンドパスフィルタ
２１８ 長波長用バンドパスフィルタ
２２３ 短波長用光検出器
２２４ 長波長用光検出器
２２６ ＰＩからの蛍光
２２７ ＬＤＳ７５１からの蛍光
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、微生物を含む検体液を保持する検体容器と、前記検体液と反応する試薬液を保持するとともに、前記検体液と前記試薬液とを反応させる反応容器と、前記微生物を検出する検出用流路と、前記検出用流路の位置あわせを行う位置あわせ用試薬が保持された位置あわせ用試薬容器とを有する分析チップと、
前記分析チップと連結され、前記分析チップに、少なくとも、前記検体液，前記試薬液及び前記位置あわせ用試薬とを搬送する搬送装置と、
前記分析チップを保持するとともに、前記分析チップを移動させるステージと、
少なくとも、前記検出用流路に光を照射する光源と、前記検出用流路からの光を検出するとともに、前記光を電気信号に変換する処理を行う光検出器とを有する検出装置と、
前記光検出器で変換された電気信号を出力する出力装置とを備え、
前記位置合わせ用試薬容器は、少なくとも前記検体容器及び前記反応容器よりも下流側に設けられたことを特徴とする微生物検査装置。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物検査装置において、
前記位置あわせ用試薬容器から前記検出用流路までの流路は、前記検体容器，前記反応容器及び前記検出用流路とを連結する流路とは異なる流路であって、前記反応容器と前記検出用流路との間で結合されたことを特徴とする微生物検査装置。
【請求項３】
請求項２に記載の微生物検査装置において、
前記位置あわせ用試薬容器から前記検出用流路までの流路の最高点は、前記位置あわせ用試薬容器に保持された位置あわせ用試薬の最高点よりも高い位置に設けられたことを特徴とする微生物検査装置。
【請求項４】
請求項１に記載の微生物検査装置において、
前記分析チップは、少なくとも前記検出用流路を洗浄する洗浄液を保持するとともに、前記反応容器と前記検出用流路との間に設けられた洗浄液容器を備えたことを特徴とする微生物検査装置。
【請求項５】
微生物を含む検体液を保持する検体容器と、
前記検体液と反応する試薬液を保持するとともに、前記検体液と前記試薬液とを反応させる反応容器と、前記微生物を検出する検出用流路と、
前記検出用流路の位置あわせを行う位置あわせ用試薬が保持された位置あわせ用試薬容器とを備え、
前記位置あわせ用試薬容器は、少なくとも前記検体容器及び前記反応容器よりも下流側に設けられたことを特徴とする微生物検査用チップ。
【請求項６】
請求項５に記載の微生物検査用チップにおいて、
前記位置あわせ用試薬容器から前記検出用流路までの流路は、前記検体容器，前記反応容器及び前記検出用流路とを連結する流路とは異なる流路であって、前記反応容器と前記検出用流路との間で結合されたことを特徴とする微生物検査用チップ。
【請求項７】
請求項６に記載の微生物検査用チップにおいて、
前記位置あわせ用試薬容器から前記検出用流路までの流路の最高点は、前記位置あわせ用試薬容器に保持された位置あわせ用試薬の最高点よりも高い位置に設けられたことを特徴とする微生物検査用チップ。
【請求項８】
請求項５に記載の微生物検査用チップにおいて、
少なくとも前記検出用流路を洗浄する洗浄液を保持するとともに、前記反応容器と前記検出用流路との間に設けられた洗浄液容器を備えたことを特徴とする微生物検査用チップ。
【請求項１】
少なくとも、微生物を含む検体液を保持する検体容器と、前記検体液と反応する試薬液を保持するとともに、前記検体液と前記試薬液とを反応させる反応容器と、前記微生物を検出する検出用流路と、前記検出用流路の位置あわせを行う位置あわせ用試薬が保持された位置あわせ用試薬容器とを有する分析チップと、
前記分析チップと連結され、前記分析チップに、少なくとも、前記検体液，前記試薬液及び前記位置あわせ用試薬とを搬送する搬送装置と、
前記分析チップを保持するとともに、前記分析チップを移動させるステージと、
少なくとも、前記検出用流路に光を照射する光源と、前記検出用流路からの光を検出するとともに、前記光を電気信号に変換する処理を行う光検出器とを有する検出装置と、
前記光検出器で変換された電気信号を出力する出力装置とを備え、
前記位置合わせ用試薬容器は、少なくとも前記検体容器及び前記反応容器よりも下流側に設けられたことを特徴とする微生物検査装置。
【請求項２】
請求項１に記載の微生物検査装置において、
前記位置あわせ用試薬容器から前記検出用流路までの流路は、前記検体容器，前記反応容器及び前記検出用流路とを連結する流路とは異なる流路であって、前記反応容器と前記検出用流路との間で結合されたことを特徴とする微生物検査装置。
【請求項３】
請求項２に記載の微生物検査装置において、
前記位置あわせ用試薬容器から前記検出用流路までの流路の最高点は、前記位置あわせ用試薬容器に保持された位置あわせ用試薬の最高点よりも高い位置に設けられたことを特徴とする微生物検査装置。
【請求項４】
請求項１に記載の微生物検査装置において、
前記分析チップは、少なくとも前記検出用流路を洗浄する洗浄液を保持するとともに、前記反応容器と前記検出用流路との間に設けられた洗浄液容器を備えたことを特徴とする微生物検査装置。
【請求項５】
微生物を含む検体液を保持する検体容器と、
前記検体液と反応する試薬液を保持するとともに、前記検体液と前記試薬液とを反応させる反応容器と、前記微生物を検出する検出用流路と、
前記検出用流路の位置あわせを行う位置あわせ用試薬が保持された位置あわせ用試薬容器とを備え、
前記位置あわせ用試薬容器は、少なくとも前記検体容器及び前記反応容器よりも下流側に設けられたことを特徴とする微生物検査用チップ。
【請求項６】
請求項５に記載の微生物検査用チップにおいて、
前記位置あわせ用試薬容器から前記検出用流路までの流路は、前記検体容器，前記反応容器及び前記検出用流路とを連結する流路とは異なる流路であって、前記反応容器と前記検出用流路との間で結合されたことを特徴とする微生物検査用チップ。
【請求項７】
請求項６に記載の微生物検査用チップにおいて、
前記位置あわせ用試薬容器から前記検出用流路までの流路の最高点は、前記位置あわせ用試薬容器に保持された位置あわせ用試薬の最高点よりも高い位置に設けられたことを特徴とする微生物検査用チップ。
【請求項８】
請求項５に記載の微生物検査用チップにおいて、
少なくとも前記検出用流路を洗浄する洗浄液を保持するとともに、前記反応容器と前記検出用流路との間に設けられた洗浄液容器を備えたことを特徴とする微生物検査用チップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００９−２８１７５３（Ｐ２００９−２８１７５３Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３１４６２（Ｐ２００８−１３１４６２）
【出願日】平成２０年５月２０日（２００８．５．２０）
【出願人】（０００２３３０４４）株式会社日立エンジニアリング・アンド・サービス (276)
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２０日（２００８．５．２０）
【出願人】（０００２３３０４４）株式会社日立エンジニアリング・アンド・サービス (276)
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