微生物醗酵生産物の製造方法
【課題】異臭を呈しない、高純度のジオール体を効率よく製造できるジオール体の製造方法の提供。
【解決手段】次の式（１a）及び／又は（１b）
で表される化合物を基質として微生物変換により得られる培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する、１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法。
【解決手段】次の式（１a）及び／又は（１b）
で表される化合物を基質として微生物変換により得られる培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する、１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの製造中間体として有用なジオール体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン（以下、「化合物Ａ」と記載する）は、抹香鯨の体内に生ずる病的分泌物アンバーグリースに含まれている香気成分で、アンバー系合成香料として欠かせない重要化合物である。化合物Ａは、主にクラリーセージ（Salvia sclarea L.）から抽出されたスクラレオールを出発原料として化学合成法により製造されている。化合物Ａの中間体としては、３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン−２（１Ｈ）−オン（以下、「スクラレオリド」と記載する）及び１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール（以下、「ジオール体」と記載する）が知られている。
しかしながら、上記化学合成法では環境負荷が大きく、また収率、純度を十分に確保できないという問題があった。そこで、スクラレオールから微生物変換により化合物Ａの中間体を得、これを環化させて化合物Ａを製造する方法が報告されている（例えば特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平３−２２４４７８号公報
【特許文献２】特開昭６２−７４２８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記特許文献１及び２において、微生物変換により得られたジオール体の分離・精製は、培養液を酢酸エチルにより溶剤抽出した後、乾燥して得られた抽出物を温ヘキサン／酢酸エチル又はヘキサン／クロロホルムに溶解し、溶解液から結晶化することにより行っている。しかしながら、酢酸エチル等を用いた従来の溶剤抽出法で得られた結晶は異臭を呈し、また未反応のスクラレオールも回収されてしまうため純度が低い、という問題があることが判明した。ジオール体を香料原料として使用する場合には、この異臭を十分に除去し、ジオール体本来の香気をもった、満足できる品質のものとする必要がある。
【０００５】
従って、本発明の目的は、異臭を呈することなく、本来の香気をもった高純度のジオール体を効率よく製造できるジオール体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ジオール体の分離・精製手段について種々検討したところ、微生物変換により得られた培養液から菌体を除去した後、晶析して得られた結晶を特定の溶媒で洗浄すれば、スクラレオールを除去することができ、ジオール体を高収率で取得できることを見出した。そして、洗浄後の結晶について臭いを確認したところ、異臭を発せずジオール体本来の香気を持っていることを見出した。すなわち、結晶中にはジオール体やスクラレオールの他にも培養液由来のスクラレオリド、培地成分等が混在しており、精製後も除去されない夾雑成分があるが、全く意外にも、前記洗浄操作を行うことで該夾雑成分の中でも異臭の原因となる物質が除去され、異臭の低減されたジオール体が得られたのである。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の式（１a）及び／又は（１b）
【０００８】
【化１】
【０００９】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られた培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過して得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する、式（２）
【００１０】
【化２】
【００１１】
で表されるジオール体の製造方法を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、次に示す（Ａ）〜（Ｃ）の工程を有する、式（２）
【００１３】
【化３】
【００１４】
で表されるジオール体の製造方法を提供するものである。
（Ａ）：次の式（１a）及び／又は（１b）
【００１５】
【化４】
【００１６】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られた培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得た後、晶析母液を回収する工程
（Ｂ）：回収された晶析母液から結晶を析出させ、次いで濾過して得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄した後、有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得る工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られたケークを再度SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する工程
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、異臭の低減された高純度のジオール体を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、微生物変換に利用できる微生物としては、次の一般式（１a）及び／又は(１b)
【００１９】
【化５】
【００２０】
で表される化合物（以下、「スクラレオール」と記載する）を基質として化合物Ａの中間体であるジオール体を生成する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば子嚢菌網（Ascomycetes）に属する微生物、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する微生物、担子菌網に属する微生物、ハイホジーマ（Hyphozyma）属に属する微生物等が挙げられる。これらのうち、ジオール体の生成効率の点から、子嚢菌網に属する微生物、ハイホジーマ属に属する微生物が好ましい。子嚢菌網に属する微生物としては、例えば、Ascomycete sp. KSM-JL2842と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P-20759として寄託された微生物が挙げられる。ハイホジーマ属に属する微生物としては、例えば特許第2547713号明細書に記載のATCC20624株が挙げられる。
【００２１】
上記微生物は、ジオール体の生成能を指標として土壌から単離することができる。ジオール体の生成能は供試微生物を前記式（１a）及び／又は(１b)で表される化合物含有培地にて培養し、培地中に含まれるジオール体を検出することで評価することができる。ジオール体の検出は、例えばガスクロマトグラフィー（GC）、気液クロマトグラフィー（GLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、赤外スペクトル（IR）、核磁気共鳴（NMR）等従来公知の分析方法を用いることができる。
【００２２】
微生物を培養する際の培養条件としては特に限定されず、基質を含み、該微生物が生育可能である培地であればいかなる組成の培地をも使用することができる。使用可能な培地としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、有機酸塩等の炭素源；無機・有機アンモニウム塩、窒素含有有機物、アミノ酸等の窒素源；塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等の金属ミネラル類及びビタミン類等を含有する固体培地及び液体培地等を挙げることができる。また、培養条件等に応じて界面活性剤や消泡剤を添加してもよい。
【００２３】
至適ｐＨ範囲及び至適温度は特に限定されず、例えばｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ５〜７で、１０〜３５℃、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜３０℃である。培養は、振盪培養、嫌気培養、静置培養、醗酵層による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。
【００２４】
培地に添加する基質の濃度は、ジオール体の生成効率の点から０．１〜５０質量％とすることが好ましい。基質は培養に先立って培地に添加してもよく、培養途中で添加してもよい。
【００２５】
本発明方法においては、先ず得られた培養液中に含まれる菌体を除去する。菌体の除去手段としては、濾過が好ましい。濾過手段としては、吸引濾過、加圧濾過、遠心濾過のいずれでも実施可能であるが、収率の観点から特に吸引濾過が好ましい。濾過の際、フィルター上のケークを適量の水で洗浄しても良い。フィルターの口径は、ジオール体の回収率及び異臭低減の点から、目開き１０〜１００μｍが好ましく、更に目開き１０〜９０μｍが好ましく、特に回収率と濾過効率の点から目開き２０〜４０μｍが好ましい。
フィルターの材質としては、種々のものを用いることができ、具体的にはポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン等の樹脂製、セラミック製、金属製等を用いることができる。
【００２６】
次いで、有機溶媒の存在下に晶析を行ってジオール体ケークを得る。晶析方法は、特に制限されないが、有機溶媒に溶解し、冷却、濃縮、貧溶媒の添加等により、ジオール体の結晶を析出させる方法が挙げられる。貧溶媒の添加による場合は、水を用いることが好ましい。また、必要により有機溶媒に溶解した状態で活性炭濾過や精密濾過を行ってもよい。
晶析に用いられる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトニトリル等が挙げられ、メタノール、エタノール、イソプロパノールが好ましく、特にエタノールが好ましい。これら有機溶媒は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２７】
晶析に用いる溶媒の量は、ジオール体の純度向上の点から、フィルター上の残渣１００ｇに対して50〜300mLとするのが好ましい。晶析の好ましい方法としては、溶媒を加えた後、20〜80℃、更に好ましくは40〜70℃に昇温する。その後、室温まで放冷して結晶を析出させる。なお、昇温、冷却は一定速度で行う必要はなく結晶が析出しはじめれば、その温度でしばらく保持するのが好ましい。結晶の分離方法としては、濾過や遠心分離等が用いられる。
【００２８】
上記晶析操作によりジオール体ケークを得ることができるが、該ケークには、ジオール体以外に、培養液由来のスクラレオールや、スクラレオリド、培地成分等が混在している。ケーク中のジオール体以外の成分は０．０１〜１０質量％、特に０．１〜５質量％であることが好ましい。
【００２９】
次いで、得られたジオール体ケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する。当該洗浄操作により、スクラレオールだけでなく、その他の夾雑成分のうち異臭の原因となる物質も除去することができる。ここで、ＳＰ値とは、溶解度パラメーターを示し、例えば、参考文献「ＳＰ値基礎・応用と計算方法」（株式会社情報機構，２００５年）、Ｐｏｌｙｍｅｒ ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａ Ｗｉｌｅｙ-Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１９８９）等に記載されている。
【００３０】
SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒（カッコ内は前記参考文献中に記載されているSP値を示す）としては、例えば、シクロペンタン（8.7）、ｐ−キシレン（8.8）、ｍ−キシレン（8.8）、エチルベンゼン（8.8）、シクロヘキサン（8.2）、ペンタン（7.0）、ヘキサン（7.3）、ヘプタン（7.4）、オクタン（7.6）、デカン（6.6）等が挙げられる。これらは１種単独でも２種以上を組み合わせても用いることができる。洗浄溶媒は、ジオール体の回収率及び臭い低減の点から、SP値が６．５〜９(cal/cm3)1/2の溶媒が好ましく、更に７〜８(cal/cm3)1/2の溶媒が好ましく、特にペンタン（7.0）、ヘキサン（7.3）、ヘプタン（7.4）、オクタン（7.6）が好ましい。混合溶媒のSP値は、各溶媒の値の体積平均値を用いることとする。なお、上記以外の溶媒については、例えば、前記「ＳＰ値基礎・応用と計算方法」又はＰｏｌｙｍｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．２，１４７−１５４（１９７４）等に記載されているＦｅｄｏｒｓ法を用いて求めることができる。
【００３１】
本発明方法において、洗浄効率を高める点から、洗浄に用いる溶媒として、SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒に両親媒性物質を添加した混合溶媒を用いるのが好ましい。特に後述するリカバリーフローで用いるのが、ジオール体の純度向上の点から好ましい。
両親媒性物質としては、ＳＰ値(cal/cm3)1/2が９〜１３(cal/cm3)1/2で、これを上記溶媒に添加した場合のSP値が９(cal/cm3)1/2以下となるものが好ましい。両親媒性物質（カッコ内はSP値を示す）としては、２−メトキシエタノール（11.4）、エタノール（12.7）、プロパノール（12.0）、イソプロピルアルコール（11.5）、ｔ−ブチルアルコール（10.6）、２−ブタノール（10.8）、２−メチル−１−プロパノール（10.5）、１−ペンタノール（10.6）、ヘキサノール（10.7）、シクロヘキサノール（11.4）、アリルアルコール（11.8）等のアルコール類；アセトン（9.9）、メチルエチルケトン（9.3）、シクロヘキサノン（9.9）等のケトン類；クロロホルム（9.3）、クロロベンゼン（9.5）等のハロゲン化炭化水素類；酢酸エチル（9.1）、酢酸メチル（9.6）等のエステル類；酢酸（10.5）等が挙げられ、これらのうち、特にエタノールが好ましい。
【００３２】
両親媒性物質の含量は、混合溶媒中０．５〜２０質量％、特に１〜１０質量％とするのがジオール体の回収率、純度及び異臭低減の点から好ましい。
混合溶媒を使用した場合は、ジオール体の回収率、溶媒量低減の点から、その後にSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄するのが好ましい。
【００３３】
洗浄操作の回数は、スクラレオールを除去し、ジオール体を残存させることができる点、及び夾雑成分を除去する点から１〜６回が好ましく、更に２〜３回が好ましい。また、１回の洗浄に用いる洗浄液の量は、固形分１００ｇに対して３０〜５００ｇとするのが好ましく、６０〜３００ｇとするのが更に好ましい。洗浄液の温度は、５〜９０℃が好ましく、１０〜５０℃とするのが更に好ましい。
【００３４】
晶析工程において、溶媒量が増えると純度は高まるものの溶解ロスが大きくなるため、ジオール体ケークを取得した後の晶析母液を回収し、リサイクル使用するのが好ましい。回収した晶析母液に対して本発明方法を適用すれば、よりジオール体の回収率を向上させることができる。
晶析母液からジオール体を再取得するリカバリーフローは、次の工程（Ａ）〜（Ｃ）から構成される。すなわち、（Ａ）：スクラレオールを基質として微生物変換により得られた培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得た後、晶析母液を回収する工程、（Ｂ）：回収された晶析母液から結晶を析出させ、次いで濾過して得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄した後、有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得る工程、及び（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたケークを再度SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する工程である。
【００３５】
工程（Ｂ）における晶析後の晶析母液から結晶を析出させる方法は、工程（Ａ）における晶析操作と同様であり、これは前記した晶析操作のことである。工程（Ｂ）で回収された晶析母液から結晶を析出させて濾過して得られたケーク中のジオール体以外の成分は２〜５０質量％、特に１０〜４０質量％であることが好ましい。また、このケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄した後、有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過して得たケーク中のジオール体以外の成分は０．０１〜１０質量％、特に０．１〜５質量％であることが好ましい。
【００３６】
工程（Ｂ）及び（Ｃ）における析出された結晶をSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する方法は、前記洗浄操作と同様であるが、洗浄効率を高める点から、洗浄に用いる溶媒として、SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒に両親媒性物質を添加した混合溶媒を用いるのが好ましく、特にエタノールを添加した混合溶媒を用いるのが好ましい。なお、前記一連の操作は、必要に応じて何回でも繰り返して行ってもよい。
【００３７】
このように得られたジオール体ケークを乾燥することにより、臭いの低減された高純度のジオール体を収率よく得ることができる。乾燥温度は室温〜９０℃が好ましく、減圧乾燥を行ってもよい。
ジオール体は、酸性触媒、例えばｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸及び酸性イオン交換体を用いて、種々の溶媒中で脱臭環化によりアンブロキサンに変換される。
【実施例】
【００３８】
［微生物変換］
Hyphozyma roseoniger ATCC20624株を２．１％YMブロスに１白金耳植菌し、25℃にて３日間振盪培養したものを種菌とした。次いで、２．１％YMブロス、0.1％硫酸マグネシウムからなる培地に植菌し、１L培養槽にて25℃、０．５vvm、４００r/minにて2日通気撹拌培養を行った後、１０％Tween８０、２０％スクラレオールからなる基質を最終濃度が、スクラレオール４％になるように適時添加し、基質添加から５日間１N NaOHおよび１N HClによるｐH６．０制御の通気撹拌培養を行った。
【００３９】
［分析法］
スクラレオール、スクラレオリドおよびジオール体の分析法は、酢酸エチルにて抽出し、適宜希釈してガスクロマトグラフィー（GC）分析を行った。GC分析装置は6890N GC System（Agilent technologies社）で行い、分析条件は以下のとおりである。検出器としてはFID（Flame Ionization Detector）（Agilent technologies社）を使用し、注入口温度を250℃とし、注入法をスプリットモード（スプリット比100：1）とし、トータルフローを200ml/分とし、カラム流速を0.4ml/分とし、カラムはDB-WAX（φ0.1mm×10m）（Ｊ＆Ｗ社）を使用し、オーブン温度を250℃とした。
【００４０】
[匂い評価]
匂い評価は、パネル６名により次に示す基準に従って行い、その平均値を匂い評価値とした。
５：微生物培養液の匂いが強く残っている
４：微生物培養液の匂いがやや強く残っている
３：微生物培養液の匂いが少ない
２：微生物培養液の匂いが微少
１：微生物培養液の匂いが無い
【００４１】
実施例１
ATCC20624株を用い微生物変換して得られた培養液(1000mL)を、20μmフィルターで吸引濾過して微生物を除去し、反応終了品ケークを得た。反応終了品ケークを1000mLの蒸留水を用いて３回洗浄を繰り返した。次いで、得られたケークをエタノール(和光純薬工業（株）、特級試薬)300mLに溶解し、溶解液に３gの活性炭を入れて15分間攪拌後、0.2μmのフィルターで濾過して活性炭処理を行い、濾過液として、粗ジオール体溶液を得た。粗ジオール体溶液を60℃まで加温しながらエタノールを減圧留去して、ジオール体濃度40質量％まで濃縮した。この後、室温まで放冷して結晶を析出させた後、更に水をエタノール濃度50質量％になるように添加して結晶を析出させ、粗ジオール体スラリー１を得た。粗ジオール体スラリー１を20μmフィルターで濾過して粗ジオール体ケーク１を得た。得られた粗ジオール体ケーク１を、固形分に対して100質量％のヘキサン（20℃）を加えて攪拌した後に濾過をすることによって洗浄した。この洗浄をもう１回繰り返した（合計２回行った）後に、乾燥（80℃、15hrにて常圧乾燥）し、ジオール体１を得た。ジオール体１の組成と匂い評価の結果を表１に示す。
【００４２】
比較例１
実施例１における粗ジオール体ケーク１を乾燥したものを、比較例１とする。
【００４３】
【表１】
【００４４】
実施例２
実施例１の粗ジオール体スラリー１を、20μmフィルターで濾過し、濾過液を得た。
この濾過液に、水をエタノール濃度20質量％になるように添加して結晶を析出させ、回収ジオール体スラリーを得た。回収ジオール体スラリーを、20μmフィルターで濾過して粗回収ジオール体ケークを得た。得られた粗回収ジオール体ケークを、固形分に対して300質量％のヘキサンを加えて攪拌した後に濾過をすることによって、洗浄した。更に固形分に対して100質量％のヘキサンを加えて攪拌した後に濾過をすることによって洗浄した後に、乾燥し、回収ジオール体を得た。回収ジオール体にジオール体濃度40質量％になるようにエタノールを加え、60℃まで加熱溶解して室温まで放冷して結晶を析出して更に水をエタノール濃度50質量％になるように添加して結晶を析出させ粗ジオール体スラリー２を得た。粗ジオール体スラリー２を、20μmフィルターで濾過して粗ジオール体ケーク２を得た。得られた粗ジオール体ケーク２を、固形分に対して100質量％のヘキサンを加えて攪拌した後に濾過をすることによって、洗浄した。この洗浄をもう１回繰り返した（合計２回行った）後に、乾燥し、ジオール体２を得た。組成と匂い評価の結果を表2に示す。
【００４５】
比較例２
実施例２における粗ジオール体ケーク２を乾燥したものを、比較例２とする。
【００４６】
【表２】
【００４７】
参考例
粗回収ジオール体ケークに、５質量％のエタノールを含んだヘキサン(SP値7.5)を、固形分に対して255質量％加えて、攪拌した後に濾過をすることによって、洗浄した。それを乾燥してジオール体３を得た。組成と匂い評価の結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
比較例３
ATCC20624株を用い微生物変換して得られた培養液(1000mL)に酢酸エチルを3000mL加えて抽出して抽出した酢酸エチルを減圧蒸留して全て蒸発させてジオール体４を得た。組成と匂い評価の結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
【００５１】
上記の結果から明らかなように、洗浄操作を行うことにより、異臭の低減された高純度のジオール体を収率よく得られることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの製造中間体として有用なジオール体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン（以下、「化合物Ａ」と記載する）は、抹香鯨の体内に生ずる病的分泌物アンバーグリースに含まれている香気成分で、アンバー系合成香料として欠かせない重要化合物である。化合物Ａは、主にクラリーセージ（Salvia sclarea L.）から抽出されたスクラレオールを出発原料として化学合成法により製造されている。化合物Ａの中間体としては、３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン−２（１Ｈ）−オン（以下、「スクラレオリド」と記載する）及び１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール（以下、「ジオール体」と記載する）が知られている。
しかしながら、上記化学合成法では環境負荷が大きく、また収率、純度を十分に確保できないという問題があった。そこで、スクラレオールから微生物変換により化合物Ａの中間体を得、これを環化させて化合物Ａを製造する方法が報告されている（例えば特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平３−２２４４７８号公報
【特許文献２】特開昭６２−７４２８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記特許文献１及び２において、微生物変換により得られたジオール体の分離・精製は、培養液を酢酸エチルにより溶剤抽出した後、乾燥して得られた抽出物を温ヘキサン／酢酸エチル又はヘキサン／クロロホルムに溶解し、溶解液から結晶化することにより行っている。しかしながら、酢酸エチル等を用いた従来の溶剤抽出法で得られた結晶は異臭を呈し、また未反応のスクラレオールも回収されてしまうため純度が低い、という問題があることが判明した。ジオール体を香料原料として使用する場合には、この異臭を十分に除去し、ジオール体本来の香気をもった、満足できる品質のものとする必要がある。
【０００５】
従って、本発明の目的は、異臭を呈することなく、本来の香気をもった高純度のジオール体を効率よく製造できるジオール体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ジオール体の分離・精製手段について種々検討したところ、微生物変換により得られた培養液から菌体を除去した後、晶析して得られた結晶を特定の溶媒で洗浄すれば、スクラレオールを除去することができ、ジオール体を高収率で取得できることを見出した。そして、洗浄後の結晶について臭いを確認したところ、異臭を発せずジオール体本来の香気を持っていることを見出した。すなわち、結晶中にはジオール体やスクラレオールの他にも培養液由来のスクラレオリド、培地成分等が混在しており、精製後も除去されない夾雑成分があるが、全く意外にも、前記洗浄操作を行うことで該夾雑成分の中でも異臭の原因となる物質が除去され、異臭の低減されたジオール体が得られたのである。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の式（１a）及び／又は（１b）
【０００８】
【化１】
【０００９】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られた培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過して得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する、式（２）
【００１０】
【化２】
【００１１】
で表されるジオール体の製造方法を提供するものである。
【００１２】
また、本発明は、次に示す（Ａ）〜（Ｃ）の工程を有する、式（２）
【００１３】
【化３】
【００１４】
で表されるジオール体の製造方法を提供するものである。
（Ａ）：次の式（１a）及び／又は（１b）
【００１５】
【化４】
【００１６】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られた培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得た後、晶析母液を回収する工程
（Ｂ）：回収された晶析母液から結晶を析出させ、次いで濾過して得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄した後、有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得る工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られたケークを再度SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する工程
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、異臭の低減された高純度のジオール体を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において、微生物変換に利用できる微生物としては、次の一般式（１a）及び／又は(１b)
【００１９】
【化５】
【００２０】
で表される化合物（以下、「スクラレオール」と記載する）を基質として化合物Ａの中間体であるジオール体を生成する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば子嚢菌網（Ascomycetes）に属する微生物、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する微生物、担子菌網に属する微生物、ハイホジーマ（Hyphozyma）属に属する微生物等が挙げられる。これらのうち、ジオール体の生成効率の点から、子嚢菌網に属する微生物、ハイホジーマ属に属する微生物が好ましい。子嚢菌網に属する微生物としては、例えば、Ascomycete sp. KSM-JL2842と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM P-20759として寄託された微生物が挙げられる。ハイホジーマ属に属する微生物としては、例えば特許第2547713号明細書に記載のATCC20624株が挙げられる。
【００２１】
上記微生物は、ジオール体の生成能を指標として土壌から単離することができる。ジオール体の生成能は供試微生物を前記式（１a）及び／又は(１b)で表される化合物含有培地にて培養し、培地中に含まれるジオール体を検出することで評価することができる。ジオール体の検出は、例えばガスクロマトグラフィー（GC）、気液クロマトグラフィー（GLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、赤外スペクトル（IR）、核磁気共鳴（NMR）等従来公知の分析方法を用いることができる。
【００２２】
微生物を培養する際の培養条件としては特に限定されず、基質を含み、該微生物が生育可能である培地であればいかなる組成の培地をも使用することができる。使用可能な培地としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、有機酸塩等の炭素源；無機・有機アンモニウム塩、窒素含有有機物、アミノ酸等の窒素源；塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等の金属ミネラル類及びビタミン類等を含有する固体培地及び液体培地等を挙げることができる。また、培養条件等に応じて界面活性剤や消泡剤を添加してもよい。
【００２３】
至適ｐＨ範囲及び至適温度は特に限定されず、例えばｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ５〜７で、１０〜３５℃、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜３０℃である。培養は、振盪培養、嫌気培養、静置培養、醗酵層による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。
【００２４】
培地に添加する基質の濃度は、ジオール体の生成効率の点から０．１〜５０質量％とすることが好ましい。基質は培養に先立って培地に添加してもよく、培養途中で添加してもよい。
【００２５】
本発明方法においては、先ず得られた培養液中に含まれる菌体を除去する。菌体の除去手段としては、濾過が好ましい。濾過手段としては、吸引濾過、加圧濾過、遠心濾過のいずれでも実施可能であるが、収率の観点から特に吸引濾過が好ましい。濾過の際、フィルター上のケークを適量の水で洗浄しても良い。フィルターの口径は、ジオール体の回収率及び異臭低減の点から、目開き１０〜１００μｍが好ましく、更に目開き１０〜９０μｍが好ましく、特に回収率と濾過効率の点から目開き２０〜４０μｍが好ましい。
フィルターの材質としては、種々のものを用いることができ、具体的にはポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン等の樹脂製、セラミック製、金属製等を用いることができる。
【００２６】
次いで、有機溶媒の存在下に晶析を行ってジオール体ケークを得る。晶析方法は、特に制限されないが、有機溶媒に溶解し、冷却、濃縮、貧溶媒の添加等により、ジオール体の結晶を析出させる方法が挙げられる。貧溶媒の添加による場合は、水を用いることが好ましい。また、必要により有機溶媒に溶解した状態で活性炭濾過や精密濾過を行ってもよい。
晶析に用いられる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトニトリル等が挙げられ、メタノール、エタノール、イソプロパノールが好ましく、特にエタノールが好ましい。これら有機溶媒は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００２７】
晶析に用いる溶媒の量は、ジオール体の純度向上の点から、フィルター上の残渣１００ｇに対して50〜300mLとするのが好ましい。晶析の好ましい方法としては、溶媒を加えた後、20〜80℃、更に好ましくは40〜70℃に昇温する。その後、室温まで放冷して結晶を析出させる。なお、昇温、冷却は一定速度で行う必要はなく結晶が析出しはじめれば、その温度でしばらく保持するのが好ましい。結晶の分離方法としては、濾過や遠心分離等が用いられる。
【００２８】
上記晶析操作によりジオール体ケークを得ることができるが、該ケークには、ジオール体以外に、培養液由来のスクラレオールや、スクラレオリド、培地成分等が混在している。ケーク中のジオール体以外の成分は０．０１〜１０質量％、特に０．１〜５質量％であることが好ましい。
【００２９】
次いで、得られたジオール体ケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する。当該洗浄操作により、スクラレオールだけでなく、その他の夾雑成分のうち異臭の原因となる物質も除去することができる。ここで、ＳＰ値とは、溶解度パラメーターを示し、例えば、参考文献「ＳＰ値基礎・応用と計算方法」（株式会社情報機構，２００５年）、Ｐｏｌｙｍｅｒ ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａ Ｗｉｌｅｙ-Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１９８９）等に記載されている。
【００３０】
SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒（カッコ内は前記参考文献中に記載されているSP値を示す）としては、例えば、シクロペンタン（8.7）、ｐ−キシレン（8.8）、ｍ−キシレン（8.8）、エチルベンゼン（8.8）、シクロヘキサン（8.2）、ペンタン（7.0）、ヘキサン（7.3）、ヘプタン（7.4）、オクタン（7.6）、デカン（6.6）等が挙げられる。これらは１種単独でも２種以上を組み合わせても用いることができる。洗浄溶媒は、ジオール体の回収率及び臭い低減の点から、SP値が６．５〜９(cal/cm3)1/2の溶媒が好ましく、更に７〜８(cal/cm3)1/2の溶媒が好ましく、特にペンタン（7.0）、ヘキサン（7.3）、ヘプタン（7.4）、オクタン（7.6）が好ましい。混合溶媒のSP値は、各溶媒の値の体積平均値を用いることとする。なお、上記以外の溶媒については、例えば、前記「ＳＰ値基礎・応用と計算方法」又はＰｏｌｙｍｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．２，１４７−１５４（１９７４）等に記載されているＦｅｄｏｒｓ法を用いて求めることができる。
【００３１】
本発明方法において、洗浄効率を高める点から、洗浄に用いる溶媒として、SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒に両親媒性物質を添加した混合溶媒を用いるのが好ましい。特に後述するリカバリーフローで用いるのが、ジオール体の純度向上の点から好ましい。
両親媒性物質としては、ＳＰ値(cal/cm3)1/2が９〜１３(cal/cm3)1/2で、これを上記溶媒に添加した場合のSP値が９(cal/cm3)1/2以下となるものが好ましい。両親媒性物質（カッコ内はSP値を示す）としては、２−メトキシエタノール（11.4）、エタノール（12.7）、プロパノール（12.0）、イソプロピルアルコール（11.5）、ｔ−ブチルアルコール（10.6）、２−ブタノール（10.8）、２−メチル−１−プロパノール（10.5）、１−ペンタノール（10.6）、ヘキサノール（10.7）、シクロヘキサノール（11.4）、アリルアルコール（11.8）等のアルコール類；アセトン（9.9）、メチルエチルケトン（9.3）、シクロヘキサノン（9.9）等のケトン類；クロロホルム（9.3）、クロロベンゼン（9.5）等のハロゲン化炭化水素類；酢酸エチル（9.1）、酢酸メチル（9.6）等のエステル類；酢酸（10.5）等が挙げられ、これらのうち、特にエタノールが好ましい。
【００３２】
両親媒性物質の含量は、混合溶媒中０．５〜２０質量％、特に１〜１０質量％とするのがジオール体の回収率、純度及び異臭低減の点から好ましい。
混合溶媒を使用した場合は、ジオール体の回収率、溶媒量低減の点から、その後にSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄するのが好ましい。
【００３３】
洗浄操作の回数は、スクラレオールを除去し、ジオール体を残存させることができる点、及び夾雑成分を除去する点から１〜６回が好ましく、更に２〜３回が好ましい。また、１回の洗浄に用いる洗浄液の量は、固形分１００ｇに対して３０〜５００ｇとするのが好ましく、６０〜３００ｇとするのが更に好ましい。洗浄液の温度は、５〜９０℃が好ましく、１０〜５０℃とするのが更に好ましい。
【００３４】
晶析工程において、溶媒量が増えると純度は高まるものの溶解ロスが大きくなるため、ジオール体ケークを取得した後の晶析母液を回収し、リサイクル使用するのが好ましい。回収した晶析母液に対して本発明方法を適用すれば、よりジオール体の回収率を向上させることができる。
晶析母液からジオール体を再取得するリカバリーフローは、次の工程（Ａ）〜（Ｃ）から構成される。すなわち、（Ａ）：スクラレオールを基質として微生物変換により得られた培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得た後、晶析母液を回収する工程、（Ｂ）：回収された晶析母液から結晶を析出させ、次いで濾過して得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄した後、有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得る工程、及び（Ｃ）工程（Ｂ）で得られたケークを再度SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する工程である。
【００３５】
工程（Ｂ）における晶析後の晶析母液から結晶を析出させる方法は、工程（Ａ）における晶析操作と同様であり、これは前記した晶析操作のことである。工程（Ｂ）で回収された晶析母液から結晶を析出させて濾過して得られたケーク中のジオール体以外の成分は２〜５０質量％、特に１０〜４０質量％であることが好ましい。また、このケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄した後、有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過して得たケーク中のジオール体以外の成分は０．０１〜１０質量％、特に０．１〜５質量％であることが好ましい。
【００３６】
工程（Ｂ）及び（Ｃ）における析出された結晶をSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する方法は、前記洗浄操作と同様であるが、洗浄効率を高める点から、洗浄に用いる溶媒として、SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒に両親媒性物質を添加した混合溶媒を用いるのが好ましく、特にエタノールを添加した混合溶媒を用いるのが好ましい。なお、前記一連の操作は、必要に応じて何回でも繰り返して行ってもよい。
【００３７】
このように得られたジオール体ケークを乾燥することにより、臭いの低減された高純度のジオール体を収率よく得ることができる。乾燥温度は室温〜９０℃が好ましく、減圧乾燥を行ってもよい。
ジオール体は、酸性触媒、例えばｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸及び酸性イオン交換体を用いて、種々の溶媒中で脱臭環化によりアンブロキサンに変換される。
【実施例】
【００３８】
［微生物変換］
Hyphozyma roseoniger ATCC20624株を２．１％YMブロスに１白金耳植菌し、25℃にて３日間振盪培養したものを種菌とした。次いで、２．１％YMブロス、0.1％硫酸マグネシウムからなる培地に植菌し、１L培養槽にて25℃、０．５vvm、４００r/minにて2日通気撹拌培養を行った後、１０％Tween８０、２０％スクラレオールからなる基質を最終濃度が、スクラレオール４％になるように適時添加し、基質添加から５日間１N NaOHおよび１N HClによるｐH６．０制御の通気撹拌培養を行った。
【００３９】
［分析法］
スクラレオール、スクラレオリドおよびジオール体の分析法は、酢酸エチルにて抽出し、適宜希釈してガスクロマトグラフィー（GC）分析を行った。GC分析装置は6890N GC System（Agilent technologies社）で行い、分析条件は以下のとおりである。検出器としてはFID（Flame Ionization Detector）（Agilent technologies社）を使用し、注入口温度を250℃とし、注入法をスプリットモード（スプリット比100：1）とし、トータルフローを200ml/分とし、カラム流速を0.4ml/分とし、カラムはDB-WAX（φ0.1mm×10m）（Ｊ＆Ｗ社）を使用し、オーブン温度を250℃とした。
【００４０】
[匂い評価]
匂い評価は、パネル６名により次に示す基準に従って行い、その平均値を匂い評価値とした。
５：微生物培養液の匂いが強く残っている
４：微生物培養液の匂いがやや強く残っている
３：微生物培養液の匂いが少ない
２：微生物培養液の匂いが微少
１：微生物培養液の匂いが無い
【００４１】
実施例１
ATCC20624株を用い微生物変換して得られた培養液(1000mL)を、20μmフィルターで吸引濾過して微生物を除去し、反応終了品ケークを得た。反応終了品ケークを1000mLの蒸留水を用いて３回洗浄を繰り返した。次いで、得られたケークをエタノール(和光純薬工業（株）、特級試薬)300mLに溶解し、溶解液に３gの活性炭を入れて15分間攪拌後、0.2μmのフィルターで濾過して活性炭処理を行い、濾過液として、粗ジオール体溶液を得た。粗ジオール体溶液を60℃まで加温しながらエタノールを減圧留去して、ジオール体濃度40質量％まで濃縮した。この後、室温まで放冷して結晶を析出させた後、更に水をエタノール濃度50質量％になるように添加して結晶を析出させ、粗ジオール体スラリー１を得た。粗ジオール体スラリー１を20μmフィルターで濾過して粗ジオール体ケーク１を得た。得られた粗ジオール体ケーク１を、固形分に対して100質量％のヘキサン（20℃）を加えて攪拌した後に濾過をすることによって洗浄した。この洗浄をもう１回繰り返した（合計２回行った）後に、乾燥（80℃、15hrにて常圧乾燥）し、ジオール体１を得た。ジオール体１の組成と匂い評価の結果を表１に示す。
【００４２】
比較例１
実施例１における粗ジオール体ケーク１を乾燥したものを、比較例１とする。
【００４３】
【表１】
【００４４】
実施例２
実施例１の粗ジオール体スラリー１を、20μmフィルターで濾過し、濾過液を得た。
この濾過液に、水をエタノール濃度20質量％になるように添加して結晶を析出させ、回収ジオール体スラリーを得た。回収ジオール体スラリーを、20μmフィルターで濾過して粗回収ジオール体ケークを得た。得られた粗回収ジオール体ケークを、固形分に対して300質量％のヘキサンを加えて攪拌した後に濾過をすることによって、洗浄した。更に固形分に対して100質量％のヘキサンを加えて攪拌した後に濾過をすることによって洗浄した後に、乾燥し、回収ジオール体を得た。回収ジオール体にジオール体濃度40質量％になるようにエタノールを加え、60℃まで加熱溶解して室温まで放冷して結晶を析出して更に水をエタノール濃度50質量％になるように添加して結晶を析出させ粗ジオール体スラリー２を得た。粗ジオール体スラリー２を、20μmフィルターで濾過して粗ジオール体ケーク２を得た。得られた粗ジオール体ケーク２を、固形分に対して100質量％のヘキサンを加えて攪拌した後に濾過をすることによって、洗浄した。この洗浄をもう１回繰り返した（合計２回行った）後に、乾燥し、ジオール体２を得た。組成と匂い評価の結果を表2に示す。
【００４５】
比較例２
実施例２における粗ジオール体ケーク２を乾燥したものを、比較例２とする。
【００４６】
【表２】
【００４７】
参考例
粗回収ジオール体ケークに、５質量％のエタノールを含んだヘキサン(SP値7.5)を、固形分に対して255質量％加えて、攪拌した後に濾過をすることによって、洗浄した。それを乾燥してジオール体３を得た。組成と匂い評価の結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
【００４９】
比較例３
ATCC20624株を用い微生物変換して得られた培養液(1000mL)に酢酸エチルを3000mL加えて抽出して抽出した酢酸エチルを減圧蒸留して全て蒸発させてジオール体４を得た。組成と匂い評価の結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
【００５１】
上記の結果から明らかなように、洗浄操作を行うことにより、異臭の低減された高純度のジオール体を収率よく得られることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（１a）及び／又は（１b）
【化１】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られた培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過して得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する、式（２）
【化２】
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法。
【請求項２】
次に示す（Ａ）〜（Ｃ）の工程を有する、式（２）
【化３】
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法。
（Ａ）：次の式（１a）及び／又は（１b）
【化４】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られた培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得た後、晶析母液を回収する工程
（Ｂ）：回収された晶析母液から結晶を析出させ、次いで濾過して得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄した後、有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得る工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られたケークを再度SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する工程
【請求項３】
洗浄に用いる溶媒が、SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒に両親媒性物質を添加した混合溶媒である請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記両親媒性物質が、ＳＰ値が９〜１３(cal/cm3)1/2の物質である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒が、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン及びオクタンから選ばれる１種又は２種以上である請求項１〜４の何れか１項記載の製造方法。
【請求項１】
次の式（１a）及び／又は（１b）
【化１】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られた培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過して得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する、式（２）
【化２】
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法。
【請求項２】
次に示す（Ａ）〜（Ｃ）の工程を有する、式（２）
【化３】
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法。
（Ａ）：次の式（１a）及び／又は（１b）
【化４】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られた培養液から菌体を除去し、次いで有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得た後、晶析母液を回収する工程
（Ｂ）：回収された晶析母液から結晶を析出させ、次いで濾過して得られたケークをSP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄した後、有機溶媒の存在下に晶析を行い、濾過してケークを得る工程
（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られたケークを再度SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒で洗浄する工程
【請求項３】
洗浄に用いる溶媒が、SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒に両親媒性物質を添加した混合溶媒である請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記両親媒性物質が、ＳＰ値が９〜１３(cal/cm3)1/2の物質である請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
前記SP値が９(cal/cm3)1/2以下の溶媒が、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン及びオクタンから選ばれる１種又は２種以上である請求項１〜４の何れか１項記載の製造方法。
【公開番号】特開２００９−２６８４６０（Ｐ２００９−２６８４６０Ａ）
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４２８１（Ｐ２００９−１４２８１）
【出願日】平成２１年１月２６日（２００９．１．２６）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２６日（２００９．１．２６）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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