微生物醗酵生産物の製造方法
【課題】高純度のジオール体を効率よく製造できるジオール体の製造方法を提供する。
【解決手段】次の式（１a）及び／又は（１b）
で表される化合物を基質として微生物変換により得られる式（２）
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法。
【解決手段】次の式（１a）及び／又は（１b）
で表される化合物を基質として微生物変換により得られる式（２）
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの製造中間体として有用な１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン（以下、「化合物Ａ」と表記する）は、抹香鯨の体内に生ずる病的分泌物アンバーグリースに含まれている香気成分で、アンバー系香料として欠かせない重要化合物である。化合物Ａは、主にクラリーセージ（Salvia sclarea L.）から抽出されたスクラレオールを出発原料として化学合成法により製造されている。化合物Ａの中間体としては、３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルデカヒドロナフト[２,１−ｂ]フラン−２（１Ｈ）−オン（以下、「スクラレオリド」と表記する）及び１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール（以下、「ジオール体」と表記する）が知られている。
しかしながら、上記化学合成法では環境負荷が大きく、また収率、純度を十分に確保できないという問題があった。
【０００３】
そこで、スクラレオールから微生物変換により化合物Ａ中間体を得、これを環化させて化合物Ａを製造する方法が報告されている（例えば特許文献１及び２）。具体的には、上記特許文献１及び２において、微生物変換により得られたジオール体の分離・精製は、培養液を酢酸エチルにより溶剤抽出した後、乾燥して得られた抽出物を温ヘキサン／酢酸エチル又はヘキサン／クロロホルムに溶解し、溶解液から結晶化することにより行っている。
また、スクラレオールから微生物変換により得られたジオール体の分離・精製において、特定範囲の目開きのフィルターを用いて濾過することにより菌体を分離後、ＳＰ値が８．３〜２０の溶剤に溶解して再度濾過等する方法が報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平３−２２４４７８号公報
【特許文献２】特開昭６２−７４２８１号公報
【特許文献３】特開２００８−２１２０８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述のように酢酸エチル等を用いた溶剤抽出法で得られたジオール体の結晶化物は、異臭強度が高いものであった。特に、微生物由来の培養臭が溶剤により抽出されることで、晶析によりジオール体を得たとしても培養臭低減のための更なる種々の精製工程が必要となり、製造工程が非常に煩雑となることが判明した。また、菌体をフィルターで分離後、特定の溶剤に溶解して濾過する方法は、２度の濾過を必要とすることからやはり製造工程が煩雑である。
一方で、異臭強度が低減できたとしてもジオール体そのものの回収率が低すぎると、ジオール体の製造効率が低下し、高純度のジオール体を効率よく製造することができない。
【０００６】
従って、本発明の課題は、異臭強度の低い高純度のジオール体を効率よく製造できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従来、菌体外に難水溶性や疎水性の有用物質が生産される場合には、作業効率を考慮して有用物質を含む培養液に疎水性溶剤を加えて分級や抽出により有用物質の回収を行なうが、実際には、上述のような微生物変換によるジオール体の製造の場合、培養液中にはジオール体の他に未反応のスクラレオールやスクラレオリド、微生物、培地成分等が混在しているため、分級や抽出の際にジオール体以外の成分も同時に回収されてしまい、得られたジオール体の異臭強度や着色度が高いものであった。
そこで、本発明者は、ジオール体の製造方法について鋭意検討したところ、ジオール体を含む培養液を溶剤に接触させる前に乾燥を行って培養液の乾燥物を得、次いで当該乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値を特定の範囲に制御し、その後菌体を除去し、さらに晶析すれば、ジオール体を高収率で得ることができ、得られたジオール体の微生物由来の培養臭や着色が低減され、脱臭や再精製などの後工程を軽減できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の式（１ａ）及び／又は（１ｂ）
【０００９】
【化１】
【００１０】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られる培養液を乾燥した後、前記培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値が９．５〜１６〔（ｃａｌ／ｃｍ3）1/2〕の範囲内となる溶媒を培養液に接触させ、その後微生物を除去し、さらに晶析する、
式（２）
【００１１】
【化２】
【００１２】
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、化合物Ａの製造中間体として有用なジオール体を、匂い及び色相を良好なものとした高品質品として効率よく製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、微生物変換に利用できる微生物としては、前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を基質として化合物Ａ中間体であるジオール体を生成し、菌体外に産出する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば子嚢菌綱（Ascomycetes）に属する微生物、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する微生物、担子菌網に属する微生物、ハイホジーマ（Hyphozyma）属に属する微生物等が挙げられる。これらのうち、化合物Ａ中間体であるジオール体の生成効率の点から、子嚢菌綱に属する微生物、ハイホジーマ属に属する微生物が好ましい。子嚢菌綱に属する微生物としては、例えば、Ascomycete sp. KSM-JL2842と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）にFERM P-20759として２００６年１月１２日に寄託された微生物が挙げられる。ハイホジーマ属に属する微生物としては、例えば特許第2547713号明細書に記載のATCC20624株が挙げられる。
【００１５】
微生物変換に利用できる微生物は、化合物Ａ中間体であるジオール体の生成能を指標として土壌から単離することができる。化合物Ａ中間体であるジオール体の生成能は供試微生物を前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物含有培地にて培養し、培地中に含まれる化合物Ａ中間体であるジオール体を検出することで評価することができる。化合物Ａ中間体であるジオール体の検出は、例えばガスクロマトグラフィー（GC）、気液クロマトグラフィー（GLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、赤外スペクトル（IR）、核磁気共鳴（NMR）等従来公知の分析方法を用いることができる。
【００１６】
微生物変換時の培養条件としては、特に限定されず、前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を含み、該微生物が生育可能である培地であればいかなる組成の培地をも使用することができる。使用可能な培地としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、有機酸塩等の炭素源；無機・有機アンモニウム塩、窒素含有有機物、アミノ酸等の窒素源；塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等のミネラル類及びビタミン類等を含有する固体培地及び液体培地等を挙げることができる。また、培養条件等に応じて界面活性剤や消泡剤を添加してもよい。
【００１７】
培養条件として、至適ｐＨ範囲及び至適温度は特に限定されず、好ましくはｐＨ３〜８、より好ましくはｐＨ４〜８、より更に好ましくはｐＨ５〜７であり、また、好ましくは液温１０〜３５℃、より好ましくは１５〜３０℃、より更に好ましくは２０〜３０℃である。培養日数は特に限定されず、好ましくは、基質添加から１〜１０日である。培養は、振盪培養、通気培養、攪拌培養、嫌気培養、静置培養、醗酵層による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。
【００１８】
基質として培地に添加する前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物の濃度は、化合物Ａ中間体であるジオール体の生成効率の点から、培地中に０．１〜５０質量％（以下、単に「％」と記載する）とすることが好ましい。基質は培養に先立って培地に添加してもよく、培養途中で添加してもよい。
【００１９】
本発明において、先ず、前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を基質として前記微生物を用いて菌体外に生産された前記式（２）で表されるジオール体を含む培養液を得る。更に、微生物変換により得られた培養液を乾燥し、培養液の乾燥物を得る。そして、得られた培養液の乾燥物に溶剤を添加し、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値が９．５〜１６〔（ｃａｌ／ｃｍ3）1/2〕（以下、単位を略す）の範囲内となるようにする。培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値は、好ましくは９．５〜１４．５、より好ましくは１１〜１４、更に好ましくは１２〜１３．５とすることが、ジオール体の溶解性、ジオール体の回収率（歩留まり）、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点で、有利である。ここで、媒質には、用いる溶剤と培養液の乾燥物中に含まれる水分とが含まれる。また、ＳＰ値とは、溶解度パラメーターを示し、例えば、「ＳＰ値基礎・応用と計算方法」（株式会社情報機構，２００５年）、Polymer handbook Third edition(A Wiley-Interscience publication,1989）等に記載されている。また、ＳＰ値の具体的数値が前記文献に記載されていない溶剤については、例えば、前記「ＳＰ値基礎・応用と計算方法」又はPolymer Engineering and Science,Vol.14,No.2,147-154(1974)等に記載されているＦｅｄｏｒｓ法を用いて、そのＳＰ値を求めることができる。複数の溶剤を組み合わせて用いる場合には、各溶剤の値の体積平均値を計算することにより求め、また、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質には、用いた溶剤及び培養液の乾燥物由来の水分が含まれるため、そのＳＰ値は、ＳＰ値の分かっている溶剤と培養液の乾燥物中の水分量とから、同様に体積平均値を計算することにより求めることができる。
【００２０】
微生物変換により得られた培養液の乾燥手段としては、培養液中の水分含量が低減できる乾燥手段であれば特に限定されず、例えば噴霧乾燥、熱風乾燥、室温（１０〜４０℃）乾燥、伝熱乾燥、流動乾燥、回転式ドラム乾燥、凍結乾燥、気流乾燥及び減圧乾燥などが挙げられる。これらのうち、微生物由来の培養臭及び着色の低減の点から噴霧乾燥、熱風又は室温乾燥や回転式ドラム乾燥が好ましく、乾燥時間短縮の点から、噴霧乾燥、熱風乾燥や回転式ドラム乾燥がより好ましく、更に噴霧乾燥が好ましい。
加熱する際の乾燥温度は、乾燥時間短縮の点、及び匂いを悪化させない点から、好ましくは４０〜１５０℃である。噴霧乾燥の場合には、乾燥時間短縮の点及び匂いを悪化させない点から、より好ましくは５０〜１４０℃、より更に好ましくは６０〜１３０℃である。噴霧乾燥以外の乾燥手段の場合は、より好ましくは４０〜１２０℃、更に好ましくは５０〜１００℃、より更に好ましくは６０〜８０℃である。
培養液の乾燥物の水分含量は、好ましくは０．０１〜２０％であり、ジオール体の溶解性の点、ジオール体の回収率（歩留まり）および微生物由来の培養臭及び着色の低減の点から、より好ましくは０．０５〜１０％、更に好ましくは０．１〜５％、より更に好ましくは０．１５〜３％とするのが、有利である。尚、当該水分含量は培養液を乾燥することで調整できるが、乾燥後に適宜水を加えて乾燥物の水分含量を更に調整してもよい。
【００２１】
次いで、培養液の乾燥物を混合等によって溶剤に接触させて懸濁し、当該溶剤にジオール体を溶解する。培養液又は培養液の乾燥物は、菌体内に存在する夾雑物の溶剤への混入を抑制し、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点から、溶剤に接触させる前に、微生物に対して、破砕・粉砕などの物理的処理、界面活性剤処理などの化学的処理、溶菌酵素などの生化学的処理などを行なわないことが望ましい。
【００２２】
培養液の乾燥物に接触させる溶剤としては、例えばメタノール（ＳＰ値１４．５）、エタノール（ＳＰ値１３．０）、１−プロパノール（ＳＰ値１２．０）、２−プロパノール（ＳＰ値１１．５）、１−ペンタノール（ＳＰ値１０．６）等の低級アルコール類；酢酸エチル（ＳＰ値９．１）、酢酸（ＳＰ値１０．５）、ジエチレングリコール（ＳＰ値１４．６）、アセトン（ＳＰ値９．９）等が挙げられる。
これらを、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値が前記範囲となるように、１種単独で又は２種以上を組み合わせ、更に量を適宜設定等して使用することが好ましい。
これらのうち、ジオール体の回収率（歩留まり）や純度向上の点及び匂い及び色相を良好なものとする点から、ＳＰ値９．５〜１６の溶剤を使用することが好ましく、より好ましくはＳＰ値１１〜１４の溶剤、更に好ましくはＳＰ値１２〜１３の溶剤、より更に好ましくは２−プロパノール、エタノール又はこれらの各水溶液、より好ましくはエタノール又はエタノール水溶液を使用するのが、有利である。当該エタノール水溶液中のエタノール濃度は、ジオール体の溶解性の点から７０％以上であることが好ましく、微生物由来の培養臭及び着色の低減の点から、より好ましくは８５〜９９．５％、更に好ましくは９０〜９９．５％、より更に９５〜９９．５％、殊更に好ましくは９９〜９９．５％である。
【００２３】
また、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の系内の媒質は、水が分相していないことが、溶剤相と水相を分離する工程が不要となる点から好ましい。なお、水と相溶性のない非水溶性の溶剤を用いる場合は、他の溶剤を組み合わせることにより、水と分相しないようにすることが好ましい。
【００２４】
本発明において、溶剤の使用量は、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値が前記範囲となるように、使用する溶剤のＳＰ値により適宜設定することが好ましいが、ジオール体の溶解性、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点、ジオール体の回収率（歩留まり）の点から、培養液の乾燥物１００ｇに対して、好ましくは６０〜６０００ｍＬ、より好ましくは１８０〜６００ｍＬである。また、溶剤の使用量は、培養液の乾燥物中に存在するジオール体１ｇに対し、好ましくは１〜１００ｍＬ、より好ましくは２〜５０ｍＬ、更に好ましくは２〜２５ｍＬ、より更に好ましくは３〜１０ｍＬである。
また、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質の温度は、好ましくは０〜８０℃、より好ましくは２０〜６０℃である。このときの接触時間は、好ましくは１〜６０分、より好ましくは１〜４５分であり、ジオール体の溶解性の点および製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点から、より好ましくは５〜３０分である。
【００２５】
次いで、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた分散液から微生物を除去する。微生物を除去する手段としては、濾過或いは遠心分離などが挙げられる。
遠心分離は、分離板型、円筒型、デカンター型等の一般的な遠心分離機を用い、処理後の上澄み液を分取することが好ましい。遠心分離の条件としては、温度は、好ましくは５〜６０℃、より好ましくは２０〜３０℃であり、また回転数は、例えば円筒型の場合、好ましくは２０００〜１２０００ｒ／ｍｉｎ、より好ましくは３０００〜１２０００ｒ／ｍｉｎ、更に好ましくは５０００〜１２０００ｒ／ｍｉｎであり、このときの時間は、好ましくは１〜３０分、より好ましくは２〜１０分、更に好ましくは５〜１０分である。
また、濾過は、吸引濾過、加圧濾過、遠心濾過や自然濾過などの一般的な方法を用い、処理後の濾過液を分取すればよく、このうち吸引濾過が好ましい。濾過に用いる濾過フィルターの大きさは、ジオール体の回収率及び純度向上の点から、目開き０．１〜１０μｍが好ましく、特に目開き０．２〜１μｍが好ましい。濾過フィルターの材質としては、特に限定されず、具体的には、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロンなどの樹脂製、セラミック製、金属製、セルロース製などが挙げられる。
【００２６】
本発明においては、前記得られた濾液又は上澄み液から晶析を行うことにより、高純度で匂い及び色相の良好なジオール体を収率よく得ることができる。
【００２７】
晶析の方法は特に制限されない。
一例として、前記得られた濾液又は上澄み液を、必要により活性炭濾過や精密濾過などの不純物除去操作を行った後、冷却、濃縮、貧溶媒の添加等により、ジオール体の結晶を析出させる方法が好ましい。また、前記得られた濾液又は上澄み液を乾燥し、次いで有機溶剤に溶解し、冷却、濃縮、貧溶媒の添加等により、ジオール体の結晶を析出させる方法もある。そして、こうして得られた結晶を、再度晶析することにより精製しても良い。
具体的には、前記得られた濾液又は上澄み液、又は析出させたジオール体の結晶を溶解した有機溶剤を、好ましくは２０〜８０℃、より好ましくは４０〜７０℃に昇温し、必要に応じて濃縮（溶剤を留去）し、その後、室温まで放冷するか、水のような貧溶媒を添加して結晶を析出させるのが、望ましい。なお、昇温、冷却は一定速度で行う必要はなく結晶が析出しはじめれば、その温度でしばらく保持するのが好ましい。
そして、結晶を有機溶剤と分離するため、前記微生物の除去の際に用い得る方法と同様な手段により濾過や遠心分離などを行い、ケークを得、適宜、有機溶剤でこれを洗浄するのが好ましい。得られたケークを乾燥することにより、異臭の低減されたジオール体を得ることができる。
【００２８】
晶析に用いられる有機溶剤としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール等の炭素数１〜４のアルコール類、アセトン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトニトリル等の有機溶剤が挙げられ、このうち、炭素数１〜４のアルコール類が好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノールがより好ましく、特にエタノールが好ましい。
尚、これら有機溶剤は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
貧溶媒の添加による場合は、水を用いることが好ましい。
この水の使用量は、ジオール体を溶解する有機溶剤１容量部に対して、好ましくは０．５〜１０容量部、より好ましくは１〜５容量部である。このときの有機溶剤中のジオール体の濃度は、好ましくは１０〜１０００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜５００ｇ／Ｌであり、また析出する際の液温は、好ましくは０〜６０℃、より好ましくは０〜３０℃である。
ケークを洗浄する有機溶剤は、ＳＰ値が９以下の溶剤を用いることが、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点、及び回収率の点から好ましく、当該溶剤の量は、ジオール体の純度向上の点から、ケーク１００ｇに対して５０〜３００ｍＬとするのが好ましく、また洗浄に用いる溶剤の温度は１０℃以下とするのが好ましい。
【００２９】
なお、晶析物を乾燥する際、前記培養液の乾燥物を得る際に用い得る方法と同様な乾燥手段を用いればよく、加熱する際の乾燥温度は室温〜９０℃であるのが好ましい。
【００３０】
本発明においては、前記得られた濾液又は上澄み液から晶析した後のジオール体の回収率（歩留まり）が、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、更に好ましくは７０％以上であることが、製造効率の点で、有利である。
【００３１】
本発明のジオール体の製造方法は、本発明の方法により得られたジオール体は異臭強度や着色度が低い高品質であるので、異臭低減や着色低減のための精製工程を簡略化することができると共にこのような高品質のジオール体の回収率も高いため、ジオール体の生産効率を向上させることができる。また、本発明のジオール体の製造において、得られた培養液を乾燥することによって抽出前の前処理を行なわなくともよく、また抽出時間を短縮化できると共に抽出溶剤の使用量を低減できるので、作業効率の点からも好ましい。
更に、得られたジオール体は、酸性触媒、例えばｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸及び酸性イオン交換体を用いて、種々の溶媒中で脱臭環化により化合物Ａに変換される。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３３】
［微生物変換１］
Hyphozyma roseoniger ATCC20624株（以下、「ATCC」とも云う）を２．１％ＹＭブロスに１白金耳植菌し、２５℃にて３日間振盪培養したものを種菌とした。次いで、２．１％ＹＭブロス、０．１％硫酸マグネシウムからなる培地に０．３％植菌し、３０Ｌ培養槽にて液温２４℃、空気通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度２００ｒ／ｍｉｎにて３日通気撹拌培養を行った。その後、１０％Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、２０％スクラレオールからなる基質を、培養液中のスクラレオール濃度が２％になるように添加し、基質添加から４日間１Ｎ ＮａＯＨおよび１Ｎ ＨＣｌによるｐＨ６．０制御の通気撹拌培養を行った。得られた培養液を培養液１とした。なお、当該培養液１には、ジオール体１．９％、スクラレオール０．１％、水分９７．４％、その他固形分（菌体など）０．６％が含まれていた。
【００３４】
［微生物変換２］
微生物としてAscomycete sp. KSM-JL2842（FERM P-20759）株（以下、「KSM」とも云う）を用いた以外は、前記微生物変換１と同様の操作を行うことにより、培養液２を得た。なお、培養液２には、ジオール体１．５％、スクラレオール０．３％、水分９７．２％、その他固形分（菌体など）１．０％が含まれていた。
【００３５】
［分析法］
スクラレオール、スクラレオリドおよびジオール体は、培養液又はその乾燥物から酢酸エチルにて抽出し、適宜希釈してガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を行い、その含有量を測定した。ＧＣ分析装置は６８９０Ｎ ＧＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Agilent technologies社）で行い、分析条件は以下のとおりである。検出器としてはＦＩＤ（Flame Ionization Detector）（Agilent technologies社）を使用し、注入口温度を２５０℃とし、注入法をスプリットモード（スプリット比１００：１）とし、トータルフローを２００ｍＬ／分とし、カラム流速を０．４ｍＬ／分とし、カラムはＤＢ−ＷＡＸ（φ０．１ｍｍ×１０ｍ）（Ｊ＆Ｗ社）を使用し、オーブン温度を２５０℃とした。
培養液の水分量は、１２０℃の電気乾燥機を用いて２時間乾燥させ、質量減少量から算出した。また、乾燥物の水分量は、平沼水分測定装置ＡＱ−７（平沼産業（株））により測定した。
【００３６】
[匂い評価方法]
ジオール体の結晶の匂い評価は、パネル８名により次に示す基準に従って行い、その平均値を匂い評価値とした。
５：微生物培養液の匂いが強く残っている
４：微生物培養液の匂いがやや強く残っている
３：微生物培養液の匂いが少ない
２：微生物培養液の匂いが微少
１：微生物培養液の匂いが無い
【００３７】
［抽出液の色の評価方法］
ジオール体抽出液の色の評価は、ジオール体を溶剤に溶解して遠心分離により微生物を除去した後、得られた上澄み液の波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、その値をジオール体の濃度（ｇ／Ｌ）で除して算出した。その値が小さいほど色相良好とした。
【００３８】
［結晶の色の評価方法］
ジオール体の結晶の色は、測色色差計ＺＥ−２０００型（日本電色工業（株））で測定し、黄色味を示す値（ｂ値）が小さいほど色相良好とした。
【００３９】
実施例１
培養液１を１３０℃で噴霧乾燥して水分量２％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノール（９９．５％、ＳＰ値１３．０）に、前記培養液１の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
なお、濾液からジオール体を析出させるためには、あらかじめ前記分析法に従って前記培養液の乾燥物中のジオール体の濃度及び溶剤へのジオール体の溶解度を測定し、ジオール体がほぼ全量析出するよう添加する水の量を決定した（以下の実施例にて同じ）。
【００４０】
実施例２及び３
培養液１を１３０℃で噴霧乾燥して水分量２％の乾燥物を２つ得、それぞれに水を加えて水分量を５％及び１０％に調整したものを水分量５％及び１０％の乾燥物として作成した。
１５ｍＬのエタノールに、前記水分量５％に調整した物を５ｇ加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過し、析出物を得た。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た（実施例２）。
上記と同様にして、水分量を１０％に調整した物（５ｇ）からジオール体の結晶を得た（実施例３）。
【００４１】
実施例４
培養液１を、電気乾燥機で８０℃で熱風乾燥し、水分量５％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００４２】
実施例５
培養液１を、２５℃の室温で乾燥し、水分量５％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の乾燥物５ｇをそれぞれ加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００４３】
実施例６及び７
実施例１と同様にして、但し前記乾燥物５ｇを加えるエタノールを、２−プロパノール（ＩＰＡ）に替えて、ジオール体の結晶を得た（実施例６）。また、エタノールをメタノールに替えて、ジオール体の結晶を得た（実施例７）。
【００４４】
比較例１
培養液１を、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）し、上澄み液を除き沈殿物を得た。沈殿物は乾燥せず、水分量は５８％であった。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の沈殿物１１．９ｇ（乾燥物５ｇ相当）を加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解した。遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。次いで、８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００４５】
比較例２
実施例１と同様にして、但し前記乾燥物５ｇを加えるエタノールを６５％エタノール水溶液に替えて、ジオール体の結晶を得た。
【００４６】
比較例３
培養液１を１３０℃で噴霧乾燥し、水分量２％の乾燥物を得た。１５ｍＬのトルエン（ＳＰ値８．９）に、前記培養液の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで得られる濾液を４０℃減圧下で溶剤留去し、蒸発乾固によりジオール体を全量析出させてジオール体の結晶を得た。
【００４７】
実施例１〜７及び比較例１〜３の結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
実施例８
培養液２を、１３０℃で噴霧乾燥し、水分量２％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノール（ＳＰ値１３．０）に、前記培養液の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００５０】
実施例９及び１０
培養液２を、１３０℃で噴霧乾燥して水分量２％の乾燥物を２つ得、それぞれに水を加えて水分量５％及び１０％に調整したものを水分量５％及び１０％の乾燥物として作成した。
１５ｍＬのエタノールに、前記水分量を５％に調整した物を５ｇ加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、得られた析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た（実施例９）。
上記と同様にして水分量を１０％に調整した物（５ｇ）からジオール体の結晶を得た（実施例１０）。
【００５１】
実施例１１
培養液２を、電気乾燥機で８０℃で熱風乾燥し、水分量４％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００５２】
実施例１２
培養液２を、２５℃の室温で乾燥し、水分量４％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００５３】
比較例４〜６
培養液２を１３０℃で噴霧乾燥し、水分量２％の乾燥物を得た。トルエン（ＳＰ値８．９）、６５％エタノール（ＳＰ値１６．７）及びヘキサン（ＳＰ値７．３）の各溶剤１５ｍＬに、前記培養液の乾燥物５ｇをそれぞれ加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにてそれぞれを濾過した。次いで、得られた各濾液を４０℃減圧下で溶剤留去し、ジオール体を全量析出させてジオール体の結晶を得た。なお、比較例６においてはジオール体の収率が非常に低かったため、結晶の色の評価を行わなかった。
【００５４】
比較例７
培養液２を、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）し、上澄み液を除き沈殿物を得た。沈殿物は乾燥せず、水分量は５７％であった。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の沈殿物１１．６（乾燥物５ｇ相当）を加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解した。遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００５５】
実施例８〜１２、比較例４〜７の結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表１及び２の結果から、培養液を乾燥させたものを溶剤に接触させ、媒質のＳＰ値を９．５〜１６の範囲内とし、微生物を除去した後の濾液から晶析工程を行った場合は、匂い及び色相とも高品質のジオール体を得ることができ、ジオール体の回収率も高かった。また、培養液と溶剤を接触させた後の媒質のＳＰ値を９．５〜１６の範囲内としても、培養液を乾燥せずに溶剤と接触させたのでは高品質のものを得ることはできなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フランの製造中間体として有用な１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３ａ,６，６，９ａ−テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１−ｂ］フラン（以下、「化合物Ａ」と表記する）は、抹香鯨の体内に生ずる病的分泌物アンバーグリースに含まれている香気成分で、アンバー系香料として欠かせない重要化合物である。化合物Ａは、主にクラリーセージ（Salvia sclarea L.）から抽出されたスクラレオールを出発原料として化学合成法により製造されている。化合物Ａの中間体としては、３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルデカヒドロナフト[２,１−ｂ]フラン−２（１Ｈ）−オン（以下、「スクラレオリド」と表記する）及び１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール（以下、「ジオール体」と表記する）が知られている。
しかしながら、上記化学合成法では環境負荷が大きく、また収率、純度を十分に確保できないという問題があった。
【０００３】
そこで、スクラレオールから微生物変換により化合物Ａ中間体を得、これを環化させて化合物Ａを製造する方法が報告されている（例えば特許文献１及び２）。具体的には、上記特許文献１及び２において、微生物変換により得られたジオール体の分離・精製は、培養液を酢酸エチルにより溶剤抽出した後、乾燥して得られた抽出物を温ヘキサン／酢酸エチル又はヘキサン／クロロホルムに溶解し、溶解液から結晶化することにより行っている。
また、スクラレオールから微生物変換により得られたジオール体の分離・精製において、特定範囲の目開きのフィルターを用いて濾過することにより菌体を分離後、ＳＰ値が８．３〜２０の溶剤に溶解して再度濾過等する方法が報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平３−２２４４７８号公報
【特許文献２】特開昭６２−７４２８１号公報
【特許文献３】特開２００８−２１２０８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述のように酢酸エチル等を用いた溶剤抽出法で得られたジオール体の結晶化物は、異臭強度が高いものであった。特に、微生物由来の培養臭が溶剤により抽出されることで、晶析によりジオール体を得たとしても培養臭低減のための更なる種々の精製工程が必要となり、製造工程が非常に煩雑となることが判明した。また、菌体をフィルターで分離後、特定の溶剤に溶解して濾過する方法は、２度の濾過を必要とすることからやはり製造工程が煩雑である。
一方で、異臭強度が低減できたとしてもジオール体そのものの回収率が低すぎると、ジオール体の製造効率が低下し、高純度のジオール体を効率よく製造することができない。
【０００６】
従って、本発明の課題は、異臭強度の低い高純度のジオール体を効率よく製造できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従来、菌体外に難水溶性や疎水性の有用物質が生産される場合には、作業効率を考慮して有用物質を含む培養液に疎水性溶剤を加えて分級や抽出により有用物質の回収を行なうが、実際には、上述のような微生物変換によるジオール体の製造の場合、培養液中にはジオール体の他に未反応のスクラレオールやスクラレオリド、微生物、培地成分等が混在しているため、分級や抽出の際にジオール体以外の成分も同時に回収されてしまい、得られたジオール体の異臭強度や着色度が高いものであった。
そこで、本発明者は、ジオール体の製造方法について鋭意検討したところ、ジオール体を含む培養液を溶剤に接触させる前に乾燥を行って培養液の乾燥物を得、次いで当該乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値を特定の範囲に制御し、その後菌体を除去し、さらに晶析すれば、ジオール体を高収率で得ることができ、得られたジオール体の微生物由来の培養臭や着色が低減され、脱臭や再精製などの後工程を軽減できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の式（１ａ）及び／又は（１ｂ）
【０００９】
【化１】
【００１０】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られる培養液を乾燥した後、前記培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値が９．５〜１６〔（ｃａｌ／ｃｍ3）1/2〕の範囲内となる溶媒を培養液に接触させ、その後微生物を除去し、さらに晶析する、
式（２）
【００１１】
【化２】
【００１２】
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、化合物Ａの製造中間体として有用なジオール体を、匂い及び色相を良好なものとした高品質品として効率よく製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、微生物変換に利用できる微生物としては、前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を基質として化合物Ａ中間体であるジオール体を生成し、菌体外に産出する能力を有する微生物であれば特に限定されないが、例えば子嚢菌綱（Ascomycetes）に属する微生物、クリプトコッカス（Cryptococcus）属に属する微生物、担子菌網に属する微生物、ハイホジーマ（Hyphozyma）属に属する微生物等が挙げられる。これらのうち、化合物Ａ中間体であるジオール体の生成効率の点から、子嚢菌綱に属する微生物、ハイホジーマ属に属する微生物が好ましい。子嚢菌綱に属する微生物としては、例えば、Ascomycete sp. KSM-JL2842と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所：茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）にFERM P-20759として２００６年１月１２日に寄託された微生物が挙げられる。ハイホジーマ属に属する微生物としては、例えば特許第2547713号明細書に記載のATCC20624株が挙げられる。
【００１５】
微生物変換に利用できる微生物は、化合物Ａ中間体であるジオール体の生成能を指標として土壌から単離することができる。化合物Ａ中間体であるジオール体の生成能は供試微生物を前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物含有培地にて培養し、培地中に含まれる化合物Ａ中間体であるジオール体を検出することで評価することができる。化合物Ａ中間体であるジオール体の検出は、例えばガスクロマトグラフィー（GC）、気液クロマトグラフィー（GLC）、薄層クロマトグラフィー（TLC）、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、赤外スペクトル（IR）、核磁気共鳴（NMR）等従来公知の分析方法を用いることができる。
【００１６】
微生物変換時の培養条件としては、特に限定されず、前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を含み、該微生物が生育可能である培地であればいかなる組成の培地をも使用することができる。使用可能な培地としては、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、有機酸塩等の炭素源；無機・有機アンモニウム塩、窒素含有有機物、アミノ酸等の窒素源；塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウム等のミネラル類及びビタミン類等を含有する固体培地及び液体培地等を挙げることができる。また、培養条件等に応じて界面活性剤や消泡剤を添加してもよい。
【００１７】
培養条件として、至適ｐＨ範囲及び至適温度は特に限定されず、好ましくはｐＨ３〜８、より好ましくはｐＨ４〜８、より更に好ましくはｐＨ５〜７であり、また、好ましくは液温１０〜３５℃、より好ましくは１５〜３０℃、より更に好ましくは２０〜３０℃である。培養日数は特に限定されず、好ましくは、基質添加から１〜１０日である。培養は、振盪培養、通気培養、攪拌培養、嫌気培養、静置培養、醗酵層による培養の他、休止菌体反応及び固定化菌体反応も用いることができる。
【００１８】
基質として培地に添加する前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物の濃度は、化合物Ａ中間体であるジオール体の生成効率の点から、培地中に０．１〜５０質量％（以下、単に「％」と記載する）とすることが好ましい。基質は培養に先立って培地に添加してもよく、培養途中で添加してもよい。
【００１９】
本発明において、先ず、前記式（１ａ）及び／又は（１ｂ）で表される化合物を基質として前記微生物を用いて菌体外に生産された前記式（２）で表されるジオール体を含む培養液を得る。更に、微生物変換により得られた培養液を乾燥し、培養液の乾燥物を得る。そして、得られた培養液の乾燥物に溶剤を添加し、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値が９．５〜１６〔（ｃａｌ／ｃｍ3）1/2〕（以下、単位を略す）の範囲内となるようにする。培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値は、好ましくは９．５〜１４．５、より好ましくは１１〜１４、更に好ましくは１２〜１３．５とすることが、ジオール体の溶解性、ジオール体の回収率（歩留まり）、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点で、有利である。ここで、媒質には、用いる溶剤と培養液の乾燥物中に含まれる水分とが含まれる。また、ＳＰ値とは、溶解度パラメーターを示し、例えば、「ＳＰ値基礎・応用と計算方法」（株式会社情報機構，２００５年）、Polymer handbook Third edition(A Wiley-Interscience publication,1989）等に記載されている。また、ＳＰ値の具体的数値が前記文献に記載されていない溶剤については、例えば、前記「ＳＰ値基礎・応用と計算方法」又はPolymer Engineering and Science,Vol.14,No.2,147-154(1974)等に記載されているＦｅｄｏｒｓ法を用いて、そのＳＰ値を求めることができる。複数の溶剤を組み合わせて用いる場合には、各溶剤の値の体積平均値を計算することにより求め、また、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質には、用いた溶剤及び培養液の乾燥物由来の水分が含まれるため、そのＳＰ値は、ＳＰ値の分かっている溶剤と培養液の乾燥物中の水分量とから、同様に体積平均値を計算することにより求めることができる。
【００２０】
微生物変換により得られた培養液の乾燥手段としては、培養液中の水分含量が低減できる乾燥手段であれば特に限定されず、例えば噴霧乾燥、熱風乾燥、室温（１０〜４０℃）乾燥、伝熱乾燥、流動乾燥、回転式ドラム乾燥、凍結乾燥、気流乾燥及び減圧乾燥などが挙げられる。これらのうち、微生物由来の培養臭及び着色の低減の点から噴霧乾燥、熱風又は室温乾燥や回転式ドラム乾燥が好ましく、乾燥時間短縮の点から、噴霧乾燥、熱風乾燥や回転式ドラム乾燥がより好ましく、更に噴霧乾燥が好ましい。
加熱する際の乾燥温度は、乾燥時間短縮の点、及び匂いを悪化させない点から、好ましくは４０〜１５０℃である。噴霧乾燥の場合には、乾燥時間短縮の点及び匂いを悪化させない点から、より好ましくは５０〜１４０℃、より更に好ましくは６０〜１３０℃である。噴霧乾燥以外の乾燥手段の場合は、より好ましくは４０〜１２０℃、更に好ましくは５０〜１００℃、より更に好ましくは６０〜８０℃である。
培養液の乾燥物の水分含量は、好ましくは０．０１〜２０％であり、ジオール体の溶解性の点、ジオール体の回収率（歩留まり）および微生物由来の培養臭及び着色の低減の点から、より好ましくは０．０５〜１０％、更に好ましくは０．１〜５％、より更に好ましくは０．１５〜３％とするのが、有利である。尚、当該水分含量は培養液を乾燥することで調整できるが、乾燥後に適宜水を加えて乾燥物の水分含量を更に調整してもよい。
【００２１】
次いで、培養液の乾燥物を混合等によって溶剤に接触させて懸濁し、当該溶剤にジオール体を溶解する。培養液又は培養液の乾燥物は、菌体内に存在する夾雑物の溶剤への混入を抑制し、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点から、溶剤に接触させる前に、微生物に対して、破砕・粉砕などの物理的処理、界面活性剤処理などの化学的処理、溶菌酵素などの生化学的処理などを行なわないことが望ましい。
【００２２】
培養液の乾燥物に接触させる溶剤としては、例えばメタノール（ＳＰ値１４．５）、エタノール（ＳＰ値１３．０）、１−プロパノール（ＳＰ値１２．０）、２−プロパノール（ＳＰ値１１．５）、１−ペンタノール（ＳＰ値１０．６）等の低級アルコール類；酢酸エチル（ＳＰ値９．１）、酢酸（ＳＰ値１０．５）、ジエチレングリコール（ＳＰ値１４．６）、アセトン（ＳＰ値９．９）等が挙げられる。
これらを、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値が前記範囲となるように、１種単独で又は２種以上を組み合わせ、更に量を適宜設定等して使用することが好ましい。
これらのうち、ジオール体の回収率（歩留まり）や純度向上の点及び匂い及び色相を良好なものとする点から、ＳＰ値９．５〜１６の溶剤を使用することが好ましく、より好ましくはＳＰ値１１〜１４の溶剤、更に好ましくはＳＰ値１２〜１３の溶剤、より更に好ましくは２−プロパノール、エタノール又はこれらの各水溶液、より好ましくはエタノール又はエタノール水溶液を使用するのが、有利である。当該エタノール水溶液中のエタノール濃度は、ジオール体の溶解性の点から７０％以上であることが好ましく、微生物由来の培養臭及び着色の低減の点から、より好ましくは８５〜９９．５％、更に好ましくは９０〜９９．５％、より更に９５〜９９．５％、殊更に好ましくは９９〜９９．５％である。
【００２３】
また、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の系内の媒質は、水が分相していないことが、溶剤相と水相を分離する工程が不要となる点から好ましい。なお、水と相溶性のない非水溶性の溶剤を用いる場合は、他の溶剤を組み合わせることにより、水と分相しないようにすることが好ましい。
【００２４】
本発明において、溶剤の使用量は、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値が前記範囲となるように、使用する溶剤のＳＰ値により適宜設定することが好ましいが、ジオール体の溶解性、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点、ジオール体の回収率（歩留まり）の点から、培養液の乾燥物１００ｇに対して、好ましくは６０〜６０００ｍＬ、より好ましくは１８０〜６００ｍＬである。また、溶剤の使用量は、培養液の乾燥物中に存在するジオール体１ｇに対し、好ましくは１〜１００ｍＬ、より好ましくは２〜５０ｍＬ、更に好ましくは２〜２５ｍＬ、より更に好ましくは３〜１０ｍＬである。
また、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質の温度は、好ましくは０〜８０℃、より好ましくは２０〜６０℃である。このときの接触時間は、好ましくは１〜６０分、より好ましくは１〜４５分であり、ジオール体の溶解性の点および製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点から、より好ましくは５〜３０分である。
【００２５】
次いで、培養液の乾燥物を溶剤に接触させた分散液から微生物を除去する。微生物を除去する手段としては、濾過或いは遠心分離などが挙げられる。
遠心分離は、分離板型、円筒型、デカンター型等の一般的な遠心分離機を用い、処理後の上澄み液を分取することが好ましい。遠心分離の条件としては、温度は、好ましくは５〜６０℃、より好ましくは２０〜３０℃であり、また回転数は、例えば円筒型の場合、好ましくは２０００〜１２０００ｒ／ｍｉｎ、より好ましくは３０００〜１２０００ｒ／ｍｉｎ、更に好ましくは５０００〜１２０００ｒ／ｍｉｎであり、このときの時間は、好ましくは１〜３０分、より好ましくは２〜１０分、更に好ましくは５〜１０分である。
また、濾過は、吸引濾過、加圧濾過、遠心濾過や自然濾過などの一般的な方法を用い、処理後の濾過液を分取すればよく、このうち吸引濾過が好ましい。濾過に用いる濾過フィルターの大きさは、ジオール体の回収率及び純度向上の点から、目開き０．１〜１０μｍが好ましく、特に目開き０．２〜１μｍが好ましい。濾過フィルターの材質としては、特に限定されず、具体的には、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロンなどの樹脂製、セラミック製、金属製、セルロース製などが挙げられる。
【００２６】
本発明においては、前記得られた濾液又は上澄み液から晶析を行うことにより、高純度で匂い及び色相の良好なジオール体を収率よく得ることができる。
【００２７】
晶析の方法は特に制限されない。
一例として、前記得られた濾液又は上澄み液を、必要により活性炭濾過や精密濾過などの不純物除去操作を行った後、冷却、濃縮、貧溶媒の添加等により、ジオール体の結晶を析出させる方法が好ましい。また、前記得られた濾液又は上澄み液を乾燥し、次いで有機溶剤に溶解し、冷却、濃縮、貧溶媒の添加等により、ジオール体の結晶を析出させる方法もある。そして、こうして得られた結晶を、再度晶析することにより精製しても良い。
具体的には、前記得られた濾液又は上澄み液、又は析出させたジオール体の結晶を溶解した有機溶剤を、好ましくは２０〜８０℃、より好ましくは４０〜７０℃に昇温し、必要に応じて濃縮（溶剤を留去）し、その後、室温まで放冷するか、水のような貧溶媒を添加して結晶を析出させるのが、望ましい。なお、昇温、冷却は一定速度で行う必要はなく結晶が析出しはじめれば、その温度でしばらく保持するのが好ましい。
そして、結晶を有機溶剤と分離するため、前記微生物の除去の際に用い得る方法と同様な手段により濾過や遠心分離などを行い、ケークを得、適宜、有機溶剤でこれを洗浄するのが好ましい。得られたケークを乾燥することにより、異臭の低減されたジオール体を得ることができる。
【００２８】
晶析に用いられる有機溶剤としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール等の炭素数１〜４のアルコール類、アセトン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトニトリル等の有機溶剤が挙げられ、このうち、炭素数１〜４のアルコール類が好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノールがより好ましく、特にエタノールが好ましい。
尚、これら有機溶剤は単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
貧溶媒の添加による場合は、水を用いることが好ましい。
この水の使用量は、ジオール体を溶解する有機溶剤１容量部に対して、好ましくは０．５〜１０容量部、より好ましくは１〜５容量部である。このときの有機溶剤中のジオール体の濃度は、好ましくは１０〜１０００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜５００ｇ／Ｌであり、また析出する際の液温は、好ましくは０〜６０℃、より好ましくは０〜３０℃である。
ケークを洗浄する有機溶剤は、ＳＰ値が９以下の溶剤を用いることが、製造されるジオール体の匂い及び色相を良好なものとする点、及び回収率の点から好ましく、当該溶剤の量は、ジオール体の純度向上の点から、ケーク１００ｇに対して５０〜３００ｍＬとするのが好ましく、また洗浄に用いる溶剤の温度は１０℃以下とするのが好ましい。
【００２９】
なお、晶析物を乾燥する際、前記培養液の乾燥物を得る際に用い得る方法と同様な乾燥手段を用いればよく、加熱する際の乾燥温度は室温〜９０℃であるのが好ましい。
【００３０】
本発明においては、前記得られた濾液又は上澄み液から晶析した後のジオール体の回収率（歩留まり）が、好ましくは６０％以上、より好ましくは６５％以上、更に好ましくは７０％以上であることが、製造効率の点で、有利である。
【００３１】
本発明のジオール体の製造方法は、本発明の方法により得られたジオール体は異臭強度や着色度が低い高品質であるので、異臭低減や着色低減のための精製工程を簡略化することができると共にこのような高品質のジオール体の回収率も高いため、ジオール体の生産効率を向上させることができる。また、本発明のジオール体の製造において、得られた培養液を乾燥することによって抽出前の前処理を行なわなくともよく、また抽出時間を短縮化できると共に抽出溶剤の使用量を低減できるので、作業効率の点からも好ましい。
更に、得られたジオール体は、酸性触媒、例えばｐ−トルエンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸クロリド、触媒量の硫酸及び酸性イオン交換体を用いて、種々の溶媒中で脱臭環化により化合物Ａに変換される。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００３３】
［微生物変換１］
Hyphozyma roseoniger ATCC20624株（以下、「ATCC」とも云う）を２．１％ＹＭブロスに１白金耳植菌し、２５℃にて３日間振盪培養したものを種菌とした。次いで、２．１％ＹＭブロス、０．１％硫酸マグネシウムからなる培地に０．３％植菌し、３０Ｌ培養槽にて液温２４℃、空気通気量０．５ｖｖｍ、攪拌速度２００ｒ／ｍｉｎにて３日通気撹拌培養を行った。その後、１０％Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、２０％スクラレオールからなる基質を、培養液中のスクラレオール濃度が２％になるように添加し、基質添加から４日間１Ｎ ＮａＯＨおよび１Ｎ ＨＣｌによるｐＨ６．０制御の通気撹拌培養を行った。得られた培養液を培養液１とした。なお、当該培養液１には、ジオール体１．９％、スクラレオール０．１％、水分９７．４％、その他固形分（菌体など）０．６％が含まれていた。
【００３４】
［微生物変換２］
微生物としてAscomycete sp. KSM-JL2842（FERM P-20759）株（以下、「KSM」とも云う）を用いた以外は、前記微生物変換１と同様の操作を行うことにより、培養液２を得た。なお、培養液２には、ジオール体１．５％、スクラレオール０．３％、水分９７．２％、その他固形分（菌体など）１．０％が含まれていた。
【００３５】
［分析法］
スクラレオール、スクラレオリドおよびジオール体は、培養液又はその乾燥物から酢酸エチルにて抽出し、適宜希釈してガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を行い、その含有量を測定した。ＧＣ分析装置は６８９０Ｎ ＧＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Agilent technologies社）で行い、分析条件は以下のとおりである。検出器としてはＦＩＤ（Flame Ionization Detector）（Agilent technologies社）を使用し、注入口温度を２５０℃とし、注入法をスプリットモード（スプリット比１００：１）とし、トータルフローを２００ｍＬ／分とし、カラム流速を０．４ｍＬ／分とし、カラムはＤＢ−ＷＡＸ（φ０．１ｍｍ×１０ｍ）（Ｊ＆Ｗ社）を使用し、オーブン温度を２５０℃とした。
培養液の水分量は、１２０℃の電気乾燥機を用いて２時間乾燥させ、質量減少量から算出した。また、乾燥物の水分量は、平沼水分測定装置ＡＱ−７（平沼産業（株））により測定した。
【００３６】
[匂い評価方法]
ジオール体の結晶の匂い評価は、パネル８名により次に示す基準に従って行い、その平均値を匂い評価値とした。
５：微生物培養液の匂いが強く残っている
４：微生物培養液の匂いがやや強く残っている
３：微生物培養液の匂いが少ない
２：微生物培養液の匂いが微少
１：微生物培養液の匂いが無い
【００３７】
［抽出液の色の評価方法］
ジオール体抽出液の色の評価は、ジオール体を溶剤に溶解して遠心分離により微生物を除去した後、得られた上澄み液の波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、その値をジオール体の濃度（ｇ／Ｌ）で除して算出した。その値が小さいほど色相良好とした。
【００３８】
［結晶の色の評価方法］
ジオール体の結晶の色は、測色色差計ＺＥ−２０００型（日本電色工業（株））で測定し、黄色味を示す値（ｂ値）が小さいほど色相良好とした。
【００３９】
実施例１
培養液１を１３０℃で噴霧乾燥して水分量２％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノール（９９．５％、ＳＰ値１３．０）に、前記培養液１の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
なお、濾液からジオール体を析出させるためには、あらかじめ前記分析法に従って前記培養液の乾燥物中のジオール体の濃度及び溶剤へのジオール体の溶解度を測定し、ジオール体がほぼ全量析出するよう添加する水の量を決定した（以下の実施例にて同じ）。
【００４０】
実施例２及び３
培養液１を１３０℃で噴霧乾燥して水分量２％の乾燥物を２つ得、それぞれに水を加えて水分量を５％及び１０％に調整したものを水分量５％及び１０％の乾燥物として作成した。
１５ｍＬのエタノールに、前記水分量５％に調整した物を５ｇ加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過し、析出物を得た。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た（実施例２）。
上記と同様にして、水分量を１０％に調整した物（５ｇ）からジオール体の結晶を得た（実施例３）。
【００４１】
実施例４
培養液１を、電気乾燥機で８０℃で熱風乾燥し、水分量５％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００４２】
実施例５
培養液１を、２５℃の室温で乾燥し、水分量５％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の乾燥物５ｇをそれぞれ加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００４３】
実施例６及び７
実施例１と同様にして、但し前記乾燥物５ｇを加えるエタノールを、２−プロパノール（ＩＰＡ）に替えて、ジオール体の結晶を得た（実施例６）。また、エタノールをメタノールに替えて、ジオール体の結晶を得た（実施例７）。
【００４４】
比較例１
培養液１を、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）し、上澄み液を除き沈殿物を得た。沈殿物は乾燥せず、水分量は５８％であった。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の沈殿物１１．９ｇ（乾燥物５ｇ相当）を加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解した。遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。次いで、８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００４５】
比較例２
実施例１と同様にして、但し前記乾燥物５ｇを加えるエタノールを６５％エタノール水溶液に替えて、ジオール体の結晶を得た。
【００４６】
比較例３
培養液１を１３０℃で噴霧乾燥し、水分量２％の乾燥物を得た。１５ｍＬのトルエン（ＳＰ値８．９）に、前記培養液の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで得られる濾液を４０℃減圧下で溶剤留去し、蒸発乾固によりジオール体を全量析出させてジオール体の結晶を得た。
【００４７】
実施例１〜７及び比較例１〜３の結果を表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
実施例８
培養液２を、１３０℃で噴霧乾燥し、水分量２％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノール（ＳＰ値１３．０）に、前記培養液の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００５０】
実施例９及び１０
培養液２を、１３０℃で噴霧乾燥して水分量２％の乾燥物を２つ得、それぞれに水を加えて水分量５％及び１０％に調整したものを水分量５％及び１０％の乾燥物として作成した。
１５ｍＬのエタノールに、前記水分量を５％に調整した物を５ｇ加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、得られた析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た（実施例９）。
上記と同様にして水分量を１０％に調整した物（５ｇ）からジオール体の結晶を得た（実施例１０）。
【００５１】
実施例１１
培養液２を、電気乾燥機で８０℃で熱風乾燥し、水分量４％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００５２】
実施例１２
培養液２を、２５℃の室温で乾燥し、水分量４％の乾燥物を得た。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の乾燥物５ｇを加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。析出の際の液温は、２５℃であった。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００５３】
比較例４〜６
培養液２を１３０℃で噴霧乾燥し、水分量２％の乾燥物を得た。トルエン（ＳＰ値８．９）、６５％エタノール（ＳＰ値１６．７）及びヘキサン（ＳＰ値７．３）の各溶剤１５ｍＬに、前記培養液の乾燥物５ｇをそれぞれ加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解し、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにてそれぞれを濾過した。次いで、得られた各濾液を４０℃減圧下で溶剤留去し、ジオール体を全量析出させてジオール体の結晶を得た。なお、比較例６においてはジオール体の収率が非常に低かったため、結晶の色の評価を行わなかった。
【００５４】
比較例７
培養液２を、遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）し、上澄み液を除き沈殿物を得た。沈殿物は乾燥せず、水分量は５７％であった。１５ｍＬのエタノールに、前記培養液の沈殿物１１．６（乾燥物５ｇ相当）を加え、１０分間混合（液温２０℃）してジオール体を溶解した。遠心分離（５０００ｒ／ｍｉｎ、５分）により微生物を除去し、０．２μｍのＰＴＦＥフィルターにて濾過した。次いで、得られた濾液１１ｍＬに３０ｍＬの水を添加し、ジオール体を析出させてＮｏ．２のろ紙により濾過した。次いで、析出物を８０℃において乾燥することによりジオール体の結晶を得た。
【００５５】
実施例８〜１２、比較例４〜７の結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
表１及び２の結果から、培養液を乾燥させたものを溶剤に接触させ、媒質のＳＰ値を９．５〜１６の範囲内とし、微生物を除去した後の濾液から晶析工程を行った場合は、匂い及び色相とも高品質のジオール体を得ることができ、ジオール体の回収率も高かった。また、培養液と溶剤を接触させた後の媒質のＳＰ値を９．５〜１６の範囲内としても、培養液を乾燥せずに溶剤と接触させたのでは高品質のものを得ることはできなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（１ａ）及び／又は（１ｂ）
【化１】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られる培養液を乾燥した後、前記培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値が９．５〜１６〔（ｃａｌ／ｃｍ3）1/2〕の範囲内となる溶媒を培養液に接触させ、その後微生物を除去し、さらに晶析する、
式（２）
【化２】
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法。
【請求項２】
前記培養液を乾燥し、水分含量０．０１〜２０質量％とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記培養液を乾燥した後、微生物に対して物理的処理、化学的処理又は生化学的処理を行わずに前記溶剤に接触させる請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記溶剤の使用量が、前記培養液の乾燥物中に存在する１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール１ｇに対し１〜１００ｍＬである請求項１〜３の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記培養液の乾燥物と溶剤の接触時間が１〜６０分である請求項１〜４の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項１】
次の式（１ａ）及び／又は（１ｂ）
【化１】
で表される化合物を基質として微生物変換により得られる培養液を乾燥した後、前記培養液の乾燥物を溶剤に接触させた後の媒質のＳＰ値が９．５〜１６〔（ｃａｌ／ｃｍ3）1/2〕の範囲内となる溶媒を培養液に接触させ、その後微生物を除去し、さらに晶析する、
式（２）
【化２】
で表される１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オールの製造方法。
【請求項２】
前記培養液を乾燥し、水分含量０．０１〜２０質量％とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記培養液を乾燥した後、微生物に対して物理的処理、化学的処理又は生化学的処理を行わずに前記溶剤に接触させる請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
前記溶剤の使用量が、前記培養液の乾燥物中に存在する１−（２−ヒドロキシエチル）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−２−オール１ｇに対し１〜１００ｍＬである請求項１〜３の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記培養液の乾燥物と溶剤の接触時間が１〜６０分である請求項１〜４の何れか１項に記載の製造方法。
【公開番号】特開２０１０−２１３６８６（Ｐ２０１０−２１３６８６Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２６４４９（Ｐ２０１０−２６４４９）
【出願日】平成２２年２月９日（２０１０．２．９）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月９日（２０１０．２．９）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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