心臓病理学を処置するための筋肉由来の細胞およびその作製法および使用法
本発明は、体組織への移植後に長期的な生存を示し、軟組織の部位への導入（たとえば注射または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）による）後に軟組織を増加させることができる筋由来始原細胞を提供する。また、筋由来始原細胞を単離する方法、および遺伝子導入治療のために細胞を遺伝的に修飾する方法が提供される。本発明はさらに、奇形、損傷、脱力、疾患または機能不全を含む様々な美容的または機能的症状の治療において、ヒトを含む哺乳動物の軟組織の増加および増量のために筋由来始原細胞を含有する組成物を使用する方法を提供する。特に、本発明は、皮膚疾患、胃食道逆流、膀胱尿管逆流、尿失禁、便失禁、心不全および心筋梗塞のための治療および改善を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋由来始原細胞（ＭＤＣ）および体組織、特に心筋のような軟組織の増加におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、軟組織および骨への導入後長期的な生存を示す筋由来始原細胞、ＭＤＣを単離する方法、および上皮、脂肪、神経、器官、筋肉、靱帯および軟骨組織を含む、ヒトまたは動物の軟組織および骨の増加のためにＭＤＣ含有組成物を使用する方法に関する。本発明はまた、心不全および心筋梗塞に関連する損傷または脱力のような機能的状態の治療のための筋由来始原細胞の新規使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シリコーンまたはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のような合成材料を用いた軟組織の増加は当技術分野において周知である。Ａｒｎｅｔｔへの特許文献１は、顔面形成外科用のシリコーンインプラントの使用を開示する。しかし、そのような合成材料は宿主組織にとって異質であり、インプラントの被包および周辺組織の瘢痕化を生じさせる免疫応答を引き起こす。それ故、インプラントは付加的な機能的または審美的問題をもたらし得る。
【０００３】
コラーゲンまたはヒアルロン酸のような生体高分子を用いた軟組織増加も記述されている。たとえばＷａｌｌａｃｅらへの特許文献２は、コラーゲンインプラント材料を用いて軟組織を増加させる方法を開示する。加えて、ｄｅｌｌａ Ｖａｌｌｅらへの特許文献３は、美容外科において使用できるヒアルロン酸のエステルを開示する。しかし、これらの生体高分子もまた宿主組織にとって異質であり、注入材料の再吸収を生じさせる免疫応答を引き起こす。生体高分子は、それ故、長期的な組織増加を提供することができない。全体として、生体高分子または合成材料の使用は、軟組織を増加させるという目的には全く満足のいかないものであった。
【０００４】
細胞に基づく組成物を使用した軟組織増加も開発された。Ｂｏｓｓ，Ｊｒ．への特許文献４は、美容的および審美的皮膚欠陥の治療のための自己皮膚線維芽細胞の使用を開示する。この治療は、合成材料または生体高分子の移植または注入に固有の問題を回避するが、他の合併症を生じさせる。線維芽細胞はコラーゲンを産生するので、細胞は、移植部位の周囲の組織の硬化および変形を引き起こし得る。
【０００５】
注入用増量剤としての自己脂肪細胞の使用も記述されている（総説については、Ｋ．Ｍａｋら、１９９４，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．２７：２１１−２２；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ：Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｆａｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ａｄ ｈｏｃ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｎｅｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，１９８７，Ｃｈｉｃａｇｏ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ；Ａ．Ｃｈａｉｃｈｉｒら、１９８９，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８４：９２１−９３５；Ｒ．Ａ．Ｅｒｓｅｋ，１９９１，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８７：２１９−２２８；Ｈ．Ｗ．Ｈｏｒｌら、１９９１，Ａｎｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．２６：２４８−２５８；Ａ．Ｎｇｕｙｅｎら、１９９０，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８５：３７８−３８９；Ｊ．Ｓａｒｔｙｎｓｋｉら、１９９０，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．１０２：３１４−３２１参照）。しかし、注入された脂肪は宿主に再吸収されるので、脂肪移植処置は一時的な増量しか提供しない。加えて、脂肪移植は結節形成および組織非対称を生じさせ得る。
【０００６】
筋繊維の前駆体である筋芽細胞は、融合して有糸分裂後の多核筋管を形成する単核筋細胞であり、生物活性タンパク質の長期的発現と送達を提供することができる（Ｔ．Ａ．ＰａｒｔｒｉｄｇｅとＫ．Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ，１９９５，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１：１２３−１３７；Ｊ．Ｄｈａｗａｎら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１５０９−１２；Ａ．Ｄ．Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，１９９４，Ｍｙｏｌｏｇｙ Ｅｄ ２，Ａ．Ｇ．ＥｎｇｅｌとＣ．Ｆ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，３０３−３０４；Ｓ．ＪｉａｏとＪ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，１９９２，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７５：１４３−７；Ｈ．Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ，１９９６，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：２１９５−２２００）。
【０００７】
培養した筋芽細胞は、幹細胞の自己更新特性の一部を示す細胞の亜集団を含む（Ａ．Ｂａｒｏｆｆｉｏら、１９９６，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６０：４７−５７）。そのような細胞は融合して筋管を形成することができず、別途に培養しない限り分裂しない（Ａ．Ｂａｒｏｆｆｉｏら、前出）。筋芽細胞移植の試験（以下参照）は、移植された細胞の大部分は速やかに死滅するが、少数は生存し、新たな筋形成を媒介することを示した（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｍｐら、１９９９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４４：１１１３−１１２２）。この少数の細胞は、組織培養での緩やかな増殖と移植後の迅速な増殖を含む独特の挙動を示し、これらの細胞が筋芽幹細胞であり得ることを示唆する（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｍｐら、前出）。
【０００８】
筋芽細胞は、様々な筋関連および非筋関連疾患の治療における遺伝子療法のためのビヒクルとして使用されてきた。たとえば遺伝的に修飾されたまたは修飾されていない筋芽細胞の移植は、デュシェーヌ筋ジストロフィーの治療のために使用されてきた（Ｅ．Ｇｕｓｓｏｎｉら、１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，３５６：４３５−８；Ｊ．Ｈｕａｒｄら、１９９２，Ｍｕｓｃｌｅ ＆ Ｎｅｒｖｅ，１５：５５０−６０；Ｇ．Ｋａｒｐａｔｉら、１９９３，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３４：８−１７；Ｊ．Ｐ．Ｔｒｅｍｂｌａｙら、１９９３，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２：９９−１１２；Ｐ．Ａ．Ｍｏｉｓｓｅｔら、１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４７：９４−９；Ｐ．Ａ．Ｍｏｉｓｓｅｔら、１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１３４０−４６）。加えて、筋芽細胞は、１型糖尿病の治療のためのプロインスリン（Ｌ．Ｇｒｏｓら、１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１０：１２０７−１７）；血友病Ｂの治療のための第ＩＸ因子（Ｍ．Ｒｏｍａｎら、１９９２，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２４７−５８；Ｓ．Ｎ．Ｙａｏら、１９９４，Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１：９９−１０７；Ｊ．Ｍ．Ｗａｎｇら、１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０：１０７５−８２；Ｇ．Ｈｏｒｔｅｌａｎｏら、１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１２８１−８）；アデノシンデアミナーゼ欠損症候群の治療のためのアデノシンデアミナーゼ（Ｃ．Ｍ．Ｌｙｎｃｈら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１１３８−４２）；慢性貧血の治療のためのエリトロポエチン（Ｅ．Ｒｅｇｕｌｉｅｒら、１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１０１４−２２；Ｂ．Ｄａｌｌｅら、１９９９，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１５７−６１）、および成長遅滞の治療のためのヒト成長ホルモン（Ｋ．Ａｎｗｅｒら、１９９８，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．９：６５９−７０）を生産するために遺伝子操作されてきた。
【０００９】
筋芽細胞はまた、Ｌａｗらへの特許文献５、Ｂｌａｕらへの特許文献６、およびＣｈａｎｃｅｌｌｏｒらによる１９９９年４月３０日出願の米国特許出願第０９／３０２，８９６号に開示されているように、筋組織の損傷または疾患を治療するためにも使用されてきた。加えて、筋芽細胞移植は心筋梗塞の修復のために用いられてきた（Ｃ．Ｅ．Ｍｕｒｒｙら、１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２５１２−２３；Ｂ．Ｚ．Ａｔｋｉｎｓら、１９９９，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６７：１２４−１２９；Ｂ．Ｚ．Ａｔｋｉｎｓら、１９９９，Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１８：１１７３−８０）。
【００１０】
上記にもかかわらず、ほとんどの症例で、一次筋芽細胞由来治療は、遊走および／または食作用に起因する移植後の細胞の低い生存率に結び付いてきた。この問題を回避するため、Ａｔａｌａへの特許文献７は、アルギネートのような液体ポリマーに懸濁した筋芽細胞の使用を開示している。ポリマー溶液は、筋芽細胞が注入後に移動するおよび／または食作用を受けることを防ぐための基質として働く。しかし、ポリマー溶液は、上記で論じた生体高分子と同じ問題を提起する。さらに、特許文献７は筋組織だけにおける筋芽細胞の使用に限定され、他の組織は取り上げられていない。
【００１１】
それ故、長期間持続性で、広い範囲の宿主組織と適合性であり、移植部位の周囲の組織の炎症、瘢痕化および／または硬化を最小限に抑える、他の異なる軟組織増加材料が求められている。従って、本発明の筋由来始原細胞含有組成物は、軟組織を増加させるための改善された新規材料として提供される。さらに、移植後に長期的な生存を示す筋由来始原細胞を生成する方法、および、たとえば皮膚症状または損傷、および筋力の低下、筋の損傷、疾患または機能不全を含む、様々な審美的および／または機能的欠陥を治療するためにＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を使用する方法が提供される。
【００１２】
非筋肉軟組織増量のために筋芽細胞を使用するこれまでの試みが不成功に終わっていることに注目すべきである（Ａｔａｌａへの特許文献７）。それ故、ここで開示する所見は、本発明に従った筋由来始原細胞が上皮組織を含む非筋および筋軟組織に成功裏に移植され、長期的な生存を示し得ることを明らかにするので、予想外である。その結果、ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、筋または非筋軟組織増加のため、ならびに骨生産のための一般的増量材料として使用できる。さらに、本発明の筋由来始原細胞および組成物は自己ソースに由来し得るので、増量材料の再吸収、および移植部位の周囲の組織の炎症および／または瘢痕化を含む、宿主における免疫学的合併症の危険性が低い。
【００１３】
間葉幹細胞は、筋肉、骨、軟骨等を含む身体の様々な結合組織において認められ得るが（Ｈ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇら、１９９３，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２９Ａ：７２３−７３６；Ｈ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇら、１９９５，Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍ．２０２：１３７−１４４）、間葉という用語は、歴史的には、筋肉からではなく骨髄から精製された幹細胞のクラスを表すために使用されてきた。それ故、間葉幹細胞は本発明の筋由来始原細胞とは区別される。さらに、間葉細胞は、ここで述べる筋由来始原細胞によって発現される、ＣＤ３４細胞マーカーを発現しない（Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１４３−１４７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，８７６，４４７号明細書
【特許文献２】米国特許第４，４２４，２０８号明細書
【特許文献３】米国特許第４，９６５，３５３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８５８，３９０号明細書
【特許文献５】米国特許第５，１３０，１４１号明細書
【特許文献６】米国特許第５，５３８，７２２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６６７，７７８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
要旨
移植後に長期的な生存を示す新規な筋由来始原細胞（ＭＤＣ）およびＭＤＣ組成物を提供することが本発明の１つの目的である。本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、デスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２のような始原細胞マーカーを発現する初期前駆筋細胞、すなわち筋由来幹細胞を含む。加えて、これらの初期前駆筋細胞は、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦおよびｃ−ｍｅｔ細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーを発現しない。
【００１６】
出発筋細胞集団から筋由来始原細胞を単離し、冨化するための方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。これらの方法は、軟組織の部位への移植または導入後に長期的な生存能を有するＭＤＣの冨化を生じさせる。本発明に従ったＭＤＣ集団は、特に、デスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２のような始原細胞マーカーを発現する細胞に富む。このＭＤＣ集団はまた、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦおよびｃ−ｍｅｔ細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーを発現しない。
【００１７】
移植のためのポリマー担体または特殊な培養培地を必要とせずに、皮膚、血管、脂肪、神経、骨格筋、平滑筋、靭帯、軟骨および様々な器官組織を含む筋軟組織または非筋軟組織の増加のために、ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を使用する方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。そのような方法は、軟組織への導入による、たとえば組織への直接注入または組成物の全身分布による、ＭＤＣ組成物の投与を含む。好ましくは、軟組織は非骨体組織を含む。より好ましくは、軟組織は、非横紋筋、非骨体組織を含む。最も好ましくは、軟組織は非筋・非骨体組織を含む。ここで使用するとき、増加とは、体組織の大きさまたは質量を補填する、膨張させる、支持する、増大する、拡大するまたは増加させることを指す。
【００１８】
ａ）美容的または審美的症状：ｂ）胃食道逆流症状および状態；ｃ）便失禁および尿失禁；ｄ）骨格筋および平滑筋の筋力低下、損傷、疾患または機能不全およびｅ）心筋梗塞を含む心臓状態のために、ＭＤＣに基づく治療を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００１９】
傷害、創傷、手術、外傷、非外傷、もしくは皮膚または内部軟組織または器官に裂、孔、陥凹、創傷等を生じさせる他の行為後に、骨または、筋由来軟組織または非筋由来軟組織にかかわらず、軟組織を増加させる方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【００２０】
化学物質、増殖培地および／または遺伝子操作の使用を通して改変されたＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を提供することが本発明のさらなる目的である。そのようなＭＤＣおよびその組成物は、生物学的化合物の生産と送達、および様々な疾患、症状、傷害または疾病のために有用な化学的または遺伝的に修飾された細胞を含む。
【００２１】
ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を含む医薬組成物を提供することが本発明のさらにもう１つの実施形態である。これらの医薬組成物は単離されたＭＤＣを含む。これらのＭＤＣは、その後、単離後の細胞培養によって増殖され得る。これらのＭＤＣは、その医薬組成物を必要とする被験体への送達の前に凍結される。
【００２２】
１つの実施形態では、ＭＤＣおよびその組成物が心臓状態を治療するために使用されるとき、それらは心臓に直接注射される。それらは、心房内または心臓壁に注射され得る。
【００２３】
本発明はまた、単一平板手法（ｓｉｎｇｌｅ ｐｌａｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いたＭＤＣの単離を含む組成物および方法を提供する。ＭＤＣは骨格筋の生検から単離される。１つの実施形態では、生検からの骨格筋は１〜３０日間保存され得る。この実施形態の１つの態様では、生検からの骨格筋は４℃で保存される。細胞を細かく刻み、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、別の酵素または酵素の組合せを用いて消化する。細胞から酵素を洗浄した後、細胞をフラスコ内の培地で約３０〜約１２０分間培養する。この期間中、「急速接着細胞」はフラスコまたは容器の壁に付着し、一方「緩慢接着細胞」またはＭＤＣは懸濁液中に残存する。「緩慢接着細胞」を２番目のフラスコまたは容器に移し、１〜３日間その中で培養する。この２番目の期間中に、「緩慢接着細胞」またはＭＤＣは２番目のフラスコまたは容器の壁に付着する。
【００２４】
本発明のもう１つの実施形態では、これらのＭＤＣはいかなる細胞数にも増殖する。この実施形態の好ましい態様では、細胞を約１０〜２０日間新しい培地で増殖させる。より好ましくは細胞を１７日間増殖させる。
【００２５】
増殖したまたは増殖していないＭＤＣは、輸送するためまたは使用までの期間中貯蔵するために保存され得る。１つの実施形態では、ＭＤＣを凍結する。好ましくは、ＭＤＣを約−２０℃から−９０℃で凍結する。より好ましくは、ＭＤＣを約−８０℃で凍結する。これらの凍結ＭＤＣは医薬組成物として使用される。
【００２６】
医薬組成物として凍結または保存された、または新鮮使用されるＭＤＣは、多くの心臓状態を治療するために使用され得る。これらの症状は、心筋梗塞、心不全、アダムズ‐ストークス病、先天性心疾患、狭心症、不整脈、心房細動、細菌性心内膜炎、心筋症、うっ血性心不全、拡張機能障害、心雑音および心室期外収縮（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）を含む。ＭＤＣは何らかの心臓病変によって引き起こされる心臓欠陥を治癒するためまたは心機能を改善するために使用され得る。１つの実施形態では、ＭＤＣは心臓に直接投与される。
【００２７】
好ましくは、ＭＤＣは心筋梗塞（ＭＩ）を治療するために使用される。１つの実施形態では、この治療は、ＭＩ患者から採集した骨格筋からＭＤＣを単離し、患者自身のＭＤＣを患者の心臓に投与して戻すことによって実施される。この治療は患者の心臓の機能を高め、ＭＩ後に起こる有害な心臓リモデリングおよび瘢痕化（を回避する、予防する等が続くと思われます）。
【００２８】
本発明によって提供されるさらなる目的および利点は、以下の詳細な説明と実施例から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
付属の図面は、本発明をさらに説明し、その様々な態様の明瞭化を通してその理解を助けるために提示されるものである。
【図１】図１Ａ−１Ｆは、従来のウシコラーゲンの注射と比較した、ＭＤＣ組成物の注射を使用した軟組織増加の結果を示す。図１Ａ−１Ｆに関して、ＭＤＣ（図１Ｄ−１Ｆ）またはコラーゲン（１Ａ−１Ｃ）のいずれかを腹壁の皮膚に注射した。注射の領域は、真皮と、皮膚である皮下結合組織の界面であった。図１Ａ−１Ｆは、コラーゲンまたはＭＤＣの皮膚への注射後の、４０Ｘ倍率でのトリクローム染色を示す。注射後５日目、２週間目または４週間目に、組織試料を採取し、分析用に調製した。図１Ａおよび１Ｄは、注射後５日目の、皮膚へのＭＤＣ注射とコラーゲン注射の結果を示す；図１Ｂおよび１Ｅは、注射後２週間目の結果を示す；および図１Ｃおよび１Ｆは、注射後４週間目の結果を示す。図１Ｄ−１Ｆにおける矢印は、注射領域（濃い桃色）におけるＭＤＣの存在を指示する。図１Ａ−１Ｆは、皮下腔への注射後、ＭＤＣは少なくとも４週間まで存在し、腹壁皮下組織を維持／増加させたが、コラーゲンは皮膚への注射後２週間まで存続しなかったことを明らかにする。（実施例３）。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＭＤＣ組成物の注射を使用した下部食道括約筋（図２Ａ）および肛門括約筋（図２Ｂ）軟組織増加の結果を示す。注射は、胃食道接合部または肛門括約筋に対して実施した。注射後３日目に、組織試料を採取し、分析用に調製した。ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図２Ａは、注射した組織を１００Ｘ倍率で示す；図２Ｂは、注射した組織を４０Ｘ倍率で示す。図２Ａおよび２Ｂは、ＭＤＣ注射が、注射後３日間まで下部食道括約筋および肛門括約筋軟組織増加を維持したことを明らかにする。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ＭＤＣ組成物の注射を使用した膀胱尿管接合部軟組織増加の結果を示す。注射は膀胱尿管接合部に実施した。注射後３日目に、組織試料を採取し、分析用に調製した。ＭＤＣは、矢印の近くで見られるようにβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図３Ａは、注射した組織を低（４０Ｘ）倍率で示す；図３Ｂは、注射した組織を高（１００Ｘ）倍率で示す。図３Ａおよび３Ｂは、ＭＤＣ注射が、注射後３日目まで膀胱尿管接合部軟組織増加を維持したことを明らかにする。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＭＤＣ組成物の軟組織注射を使用した膀胱低温傷害の治療を示す。注射は、低温傷害の部位の膀胱壁に実施した。注射後３０日目に、組織試料を採取し、染色用に調製した。矢印は低温傷害およびＭＤＣ注射の部位を指示する。倍率は１００Ｘである。図４Ａは、未処置の低温損傷膀胱組織を示す。図４Ｂは、ＭＤＣ注射で処置した低温損傷膀胱組織を示す；ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図４Ａおよび４Ｂは、ＭＤＣ注射が、注射後３０日間まで低温損傷膀胱組織の軟組織増加を維持したことを明らかにする。
【図５−１】図５Ａ−５Ｉは、低温損傷膀胱組織への注射後のＭＤＣの細胞分化を示す。注射は、低温傷害の部位の膀胱壁に実施し、注射後５、３５または７０日目に組織試料を採取し、分析用に調製した。注射したＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって示され、未分化ＭＤＣはα平滑筋アクチン（α−ＳＭアクチン）染色によって示されている。筋管または筋線維に分化したＭＤＣは、速ミオシン重鎖（速ＭｙＨＣ）染色によって示されている。矢印は速ＭｙＨＣを示す。注射後５日目に、多数のＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ（図５Ａ）およびα−ＳＭアクチン（図５Ｄ）染色、および比較的低レベルの速ＭｙＨＣ（図５Ｇ）染色によって示されるように、一部のＭＤＣだけが筋管に分化していた。注射後３５日目には、多数のＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ染色（図５Ｂ）、α−ＳＭアクチン（図５Ｅ）染色の低下、および速ＭｙＨＣ（図５Ｈ）染色の上昇によって示されるように、多くが筋管に分化していた。注射後７０日目には、ＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ（図５Ｃ）、α−ＳＭアクチン（図５Ｆ）染色の低下、および高レベルの速ＭｙＨＣ（図５Ｉ）染色によって示されるように、ほとんどすべてのＭＤＣが筋線維に分化していた。倍率は２００Ｘである。図５Ａ−５Ｉは、ＭＤＣが膀胱軟組織への注射後７０日間まで生存可能なままであり、分化を開始することを明らかにする。
【図５−２】図５Ａ−５Ｉは、低温損傷膀胱組織への注射後のＭＤＣの細胞分化を示す。注射は、低温傷害の部位の膀胱壁に実施し、注射後５、３５または７０日目に組織試料を採取し、分析用に調製した。注射したＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって示され、未分化ＭＤＣはα平滑筋アクチン（α−ＳＭアクチン）染色によって示されている。筋管または筋線維に分化したＭＤＣは、速ミオシン重鎖（速ＭｙＨＣ）染色によって示されている。矢印は速ＭｙＨＣを示す。注射後５日目に、多数のＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ（図５Ａ）およびα−ＳＭアクチン（図５Ｄ）染色、および比較的低レベルの速ＭｙＨＣ（図５Ｇ）染色によって示されるように、一部のＭＤＣだけが筋管に分化していた。注射後３５日目には、多数のＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ染色（図５Ｂ）、α−ＳＭアクチン（図５Ｅ）染色の低下、および速ＭｙＨＣ（図５Ｈ）染色の上昇によって示されるように、多くが筋管に分化していた。注射後７０日目には、ＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ（図５Ｃ）、α−ＳＭアクチン（図５Ｆ）染色の低下、および高レベルの速ＭｙＨＣ（図５Ｉ）染色によって示されるように、ほとんどすべてのＭＤＣが筋線維に分化していた。倍率は２００Ｘである。図５Ａ−５Ｉは、ＭＤＣが膀胱軟組織への注射後７０日間まで生存可能なままであり、分化を開始することを明らかにする。
【図６】図６Ａ−６Ｄは、膀胱の軟組織に注射したＭＤＣの再神経支配を示す。神経支配は、神経筋接合部を示す、アセチルコリン（Ａｃｈ）染色によって指示される。注射後３日目には、Ａｃｈ染色によって示されるように、神経支配はほとんど認められない（図６Ａ）。注射後１５日目には、いくつかの神経支配が認められる（図６Ｂ）。注射後３０日目には、より多くの神経支配が認められる（図６Ｃ）。注射の６か月後には、低（１００Ｘ）倍率で数多くの神経支配が認められる（図６Ｄ）。図６Ａ−６Ｃは、注射した組織を高（２００Ｘ）倍率で示す。図６Ａ−６Ｄは、ＭＤＣが低温損傷膀胱組織への注射後６か月間まで神経支配を誘導することを明らかにする。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＭＤＣ組成物の注射を使用した心筋平滑筋の軟組織増加の結果を示す。注射は心室壁に実施し、注射後３日目に組織試料を調製した。ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図７Ａは、注射した組織を低（１００Ｘ）倍率で示す；図７Ｂは、注射した組織を高（２００Ｘ）倍率で示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、肝組織へのＭＤＣ注射の結果を示す。注射は左下葉の肝臓組織に実施し、注射後４日目に組織試料を調製した。ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図８Ａは低（１００Ｘ）倍率を示す；図８Ｂは高（２００Ｘ）倍率を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、脾組織へのＭＤＣ注射の結果を示す。注射は内面の脾臓組織に実施し、注射後４日目に組織試料を調製した。ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図９Ａは、低（１００Ｘ）倍率で観察した注射組織を示す；図９Ｂは、高（２００Ｘ）倍率で観察した注射組織を示す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、脊髄組織へのＭＤＣ注射の結果を示す。注射を脊髄組織に実施し、注射後４日目に組織試料を調製した。ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図１０Ａは、低（１００Ｘ）倍率で観察した注射組織を示す；図１０Ｂは、高（２００Ｘ）倍率で観察した注射組織を示す。図７Ａ−７Ｂ、８Ａ−８Ｂ、９Ａ−９Ｂおよび１０Ａ−１０Ｂは、ＭＤＣが、宿主組織を損傷することなく様々な異なる組織型への注射後に生存可能なままであることを明らかにする。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｌは、デスミン、ＭｙｏＤおよびミオゲニン（筋形成系統に特異的なマーカー）、Ｍ−カドヘリン（衛星細胞特異的マーカー）、Ｂｃｌ−２（初期筋形成マーカー）、ＣＤ３４（造血または間質細胞マーカー）を含む細胞マーカーの発現を示すｍｄｘマウスからのＰＰ１−４およびＰＰ６細胞集団の免疫組織化学分析を示す。図１１Ａ−１１Ｌは、ＰＰ１−４およびＰＰ６細胞集団はデスミン（図１１Ａおよび１１Ｇ）、ＭｙｏＤ（図１１Ｅおよび１１Ｋ）およびミオゲニン（図１１Ｆおよび１１Ｌ）を発現する細胞の同等のパーセンテージを示し、一方ＰＰ６集団はＰＰ１−４集団と比較して、Ｍ−カドヘリンを発現する細胞のより低いパーセンテージを示すが（図１１Ｄおよび１１Ｊ）、Ｂｃｌ−２（図１１Ｃおよび１１Ｉ）およびＣＤ３４（図１１Ｂおよび１１Ｈ）を発現する細胞のより高いパーセンテージを示すことを明らかにする。
【図１２−１】図１２Ａ−１２Ｉは、マウス筋細胞および血管内皮細胞におけるデスミン染色とＣＤ３４またはＢｃｌ−２染色の細胞内共局在を示す。図１２Ａは、抗ＣＤ３４抗体で染色し、蛍光顕微鏡で視覚化した正常なマウス筋細胞（矢印参照）および血管内皮細胞（矢じり参照）を示す。図１２Ｂは、デスミンとコラーゲンＩＶ型抗体で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｃは、核を示すためにヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｄは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型およびヘキストに関して共染色した細胞の合成画像を示す。図１２Ｅは、抗Ｂｃｌ−２抗体で染色し、蛍光顕微鏡で視覚化した正常マウス筋細胞（矢印参照）を示す。図１２Ｆは、デスミンとコラーゲンＩＶ型抗体で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｇは、核を示すためにヘキストで共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｈは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型およびヘキストに関して共染色した細胞の合成画像を示す。図１２Ｉは、抗Ｍ−カドヘリン抗体で染色した衛星細胞を示す（矢印参照）。細胞は４０Ｘ倍率で観察した。図１２Ａ−１２ＤはＣＤ３４とデスミンの共局在を明らかにし、図１２Ｅ−１２ＨはＢｃｌ−２とデスミンの共局在を明らかにする。
【図１２−２】図１２Ａ−１２Ｉは、マウス筋細胞および血管内皮細胞におけるデスミン染色とＣＤ３４またはＢｃｌ−２染色の細胞内共局在を示す。図１２Ａは、抗ＣＤ３４抗体で染色し、蛍光顕微鏡で視覚化した正常なマウス筋細胞（矢印参照）および血管内皮細胞（矢じり参照）を示す。図１２Ｂは、デスミンとコラーゲンＩＶ型抗体で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｃは、核を示すためにヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｄは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型およびヘキストに関して共染色した細胞の合成画像を示す。図１２Ｅは、抗Ｂｃｌ−２抗体で染色し、蛍光顕微鏡で視覚化した正常マウス筋細胞（矢印参照）を示す。図１２Ｆは、デスミンとコラーゲンＩＶ型抗体で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｇは、核を示すためにヘキストで共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｈは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型およびヘキストに関して共染色した細胞の合成画像を示す。図１２Ｉは、抗Ｍ−カドヘリン抗体で染色した衛星細胞を示す（矢印参照）。細胞は４０Ｘ倍率で観察した。図１２Ａ−１２ＤはＣＤ３４とデスミンの共局在を明らかにし、図１２Ｅ−１２ＨはＢｃｌ−２とデスミンの共局在を明らかにする。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｅは、ｍｃ１３細胞のｒｈＢＭＰ−２への暴露から生じるオステオカルシンの形態学的変化と発現を示す。ｍｃ１３細胞を、ｒｈＢＭＰ−２を含むまたは含まない増殖培地で６日間インキュベートした。図１３Ａは、ｒｈＢＭＰ−２の不在下で＞５０％細胞集密度に増殖した細胞を示す。図１３Ｂは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下で＞５０％細胞集密度に増殖した細胞を示す。図１３Ｃは、ｒｈＢＭＰ−２の不在下で＞９０％細胞集密度に増殖した細胞を示す。図１３Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下で＞９０％集密度に増殖した細胞を示す。図１３Ｅは、オステオカルシン発現（骨芽細胞マーカー；矢印参照）に関して染色した細胞を示す。細胞は１０Ｘ倍率で観察した。図１３Ａ−１３Ｅは、ｍｃ１３細胞がｒｈＢＭＰ−２への暴露後に骨芽細胞に分化できることを明らかにする。
【図１４−１】図１４Ａ−１４Ｂは、ｒｈＢＭＰ−２処理に応答してデスミンおよびアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞のパーセンテージへの影響を示す。図１４Ａは、新たに単離したｍｃ１３クローンのデスミン染色を示す。図１４Ｂは、同じ細胞の位相差顕微鏡写真を示す。
【図１４−２】図１４Ｃ−１４Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２処理に応答してデスミンおよびアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞のパーセンテージへの影響を示す。図１４Ｃは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を含むまたは含まない増殖培地での６日間のインキュベーション後のｍｃ１３細胞におけるデスミン染色のレベルを示す。図１４Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を含むまたは含まない増殖培地での６日間のインキュベーション後のＰＰ１−４細胞およびｍｃ１３細胞におけるアルカリホスフェート染色のレベルを示す。＊は統計的に有意の結果を指示する（スチューデントｔ検定）。図１４Ｃは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下でデスミンを発現するｍｃ１３細胞の数が減少することを明らかにし、一方図１４Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下でアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞の数が増加することを明らかにし、ｒｈＢＭＰ−２の存在下では細胞の筋形成特徴が低下し、骨形成特徴が上昇することを示唆する。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｇは、筋形成および骨形成系統へのｍｃ１３細胞のインビボ分化を示す。ｍｃ１３細胞を、ＬａｃＺおよびジストロフィン遺伝子を含む構築物で安定にトランスフェクトし、筋肉内または静脈内注射によってｍｄｘマウスの後肢に導入した。１５日後、動物を犠死させ、組織学的検査のために後肢筋系を単離した。図１５Ａは、ＬａｃＺに関して染色した筋肉内注射部位におけるｍｃ１３細胞を示す。図１５Ｂは、ジストロフィンに関して共染色した同じ細胞を示す。図１５Ｃは、ＬａｃＺに関して染色した静脈内注射の領域におけるｍｃ１３細胞を示す。図１５Ｄは、ジストロフィンに関して共染色した同じ細胞を示す。別の実験では、ｍｃ１３細胞をａｄＢＭＰ−２で形質導入し、０．５−１．０×１０６細胞をＳＣＩＤマウスの後肢に注射した。１４日後、動物を犠死させ、後肢筋組織を分析した。図１５Ｅは、骨形成を測定するための後肢のＸ線撮影分析を示す。図１５Ｆは、ＬａｃＺに関して染色した後肢に由来する細胞を示す。図１５Ｇは、ジストロフィンに関して染色した細胞を示す。図１５Ａ−１５Ｄは、ｍｃ１３細胞が筋肉内または静脈内送達によってジストロフィン発現を救済し得ることを明らかにする。図１５Ｅ−１５Ｇは、ｍｃ１３細胞が異所性骨形成に関与することを明らかにする。細胞は以下の倍率で観察した：４０Ｘ（図１５Ａ−１５Ｄ）、１０Ｘ（図１５Ｆ−１５Ｇ）。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｅは、ｒｈＢＭＰ−２を産生する一次筋細胞による骨治癒の増強を示す。歯科用バーを使用して雌性ＳＣＩＤマウスにおいて５ｍｍの頭蓋欠損を創造し、その欠損に、ａｄＢＭＰ−２と共にまたはａｄＢＭＰ−２なしでｍｃ１３細胞を接種したコラーゲンスポンジを充填した。動物を１４日目に犠死させ、骨治癒の徴候に関して検査し、顕微鏡で分析した。図１６Ａは、ａｄＢＭＰ−２なしでｍｃ１３細胞によって処置した頭蓋を示す。図１６Ｂは、ａｄＢＭＰ−２で形質導入したｍｃ１３細胞によって処置した頭蓋を示す。図１６Ｃは、フォン・コッサ染色によって分析した、ａｄＢＭＰ−２なしでｍｃ１３細胞によって処置した頭蓋の組織学的試料を示す。図１６Ｄは、フォン・コッサ染色によって分析した、ａｄＢＭＰ−２で形質導入したｍｃ１３細胞によって処置した頭蓋の組織学的試料を示す。図１６Ｅは、注射した細胞（矢印で示す緑色蛍光）を同定するためにＹ染色体特異的プローブでのハイブリダイゼーションによって分析し、核（赤色蛍光で指示される）を同定するために臭化エチジウムで染色した、ａｄＢＭＰ−２で形質導入したｍｃ１３細胞によって処置した頭蓋の組織学的試料を示す。図１６Ａ−１６Ｅは、ｒｈＢＭＰ−２を発現するｍｃ１３細胞が骨欠損の治癒に寄与し得ることを明らかにする。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、それぞれ急速に接着する細胞と緩慢に接着する細胞についての、ＣＤ５６の様々な発現％でのクレアチンキナーゼ活性の量を示すグラフである。
【図１８】図１８は、心臓内注射後２週間目と６週間目の、対照細胞および急速接着ＭＤＣと緩慢接着ＭＤＣにおける左心室収縮性の指標である、左室内腔面積変化率（ｆｕｒａｃｔｉｏｎａｌ ａｒｅａ ｃｈａｎｇｅ）（ＦＡＣ）を示す一連の棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
筋由来細胞および組成物
本発明は、体組織、好ましくは軟組織への移植後に長期的な生存率を示す初期始原細胞（ここでは筋由来始原細胞または筋由来幹細胞とも称する）から成るＭＤＣを提供する。本発明のＭＤＣを得るため、筋外植片、好ましくは骨格筋を動物ドナーから、好ましくはヒトを含む哺乳動物から入手する。この外植片は、筋始原細胞の「休止細胞（ｒｅｓｔｓ）」を含む構造的および機能的シンシチウムとして働く（Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９７８，Ｎａｔｕｒｅ ７３：３０６−８；Ｂ．Ｈ．Ｌｉｐｔｏｎら、１９７９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５：１２９２４）。
【００３１】
一次筋組織から単離された細胞は、線維芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、造血および筋由来始原細胞の混合物を含む。筋由来集団の始原細胞は、Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号に述べられているような、コラーゲン被覆した組織フラスコへの一次筋細胞の差次接着特性を利用して冨化することができる。緩やかに接着する細胞は形態的に丸い傾向があり、高レベルのデスミンを発現し、融合して多核筋管へと分化する能力を有する（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。これらの細胞の亜集団は、高レベルのアルカリホスファターゼ、副甲状腺ホルモン依存性３’，５’−ｃＡＭＰ、および骨形成系統および筋形成系統を発現することによってインビトロで組換えヒト骨形態形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ−２）に応答することが示された（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号；Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４，Ｊ．Ｃｅｇ Ｂｉｏｌ．１２７：１７５５−１７６６）。
【００３２】
本発明の１つの実施形態では、緩慢接着細胞（ＭＤＣ）から急速接着細胞を区別するためにプレプレーティング手順を使用し得る。本発明に従って、急速接着細胞（ＰＰ１−４）と緩慢接着円形ＭＤＣ（ＰＰ６）の集団を単離し、骨格筋外植片から冨化して、緩慢接着細胞の中で多能性細胞の存在を判定するために免疫組織化学を用いて様々なマーカーの発現に関して試験した（実施例１：Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許出願第０９／３０２，８９６号）。表３、ここでは実施例９に示すように、ＰＰ６細胞は、デスミン、ＭｙｏＤおよびミオゲニンを含む筋形成マーカーを発現した。ＰＰ６細胞はまた、筋形成の初期段階で発現される２つの遺伝子、ｃ−ｍｅｔおよびＭＮＦも発現した（Ｊ．Ｂ．Ｍｉｌｌｅｒら、１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３：１９１−２１９；表３参照）。ＰＰ６は、衛星細胞特異的マーカーであるＭ−カドヘリンを発現する細胞のより低いパーセンテージを示したが（Ａ．Ｉｒｉｎｔｃｈｅｖら、１９９４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｄｙｎａｍｉｃｓ １９９：３２６−３３７）、筋形成の初期段階の細胞に限定されるマーカー、Ｂｃｌ−２を発現する細胞のより高いパーセンテージを示した（Ｊ．Ａ．Ｄｏｍｉｎｏｖら、１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４２：５３７−５４４）。ＰＰ６細胞はまた、ヒト造血始原細胞ならびに骨髄中の間質細胞前駆体に関して同定されたマーカー、ＣＤ３４も発現した（Ｒ．Ｇ．Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８６，Ｂｌｏｏｄ ６７：８４２−８４５；Ｃ．Ｉ．Ｃｉｖｉｎら、１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１５７−１６５；Ｌ．Ｆｉｎａら、１９９０，Ｂｌｏｏｄ ７５：２４１７−２４２６；Ｐ．Ｊ．Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９１，Ｂｌｏｏｄ ７８：２８４８−２８５３；表３参照）。ＰＰ６細胞はまた、幹細胞様特徴を有する造血細胞のマーカーとして最近同定されたヒトＫＤＲ遺伝子のマウスホモログ、Ｆｌｋ−１を発現した（Ｂ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５５３−１５５８；表３参照）。同様に、ＰＰ６細胞は、幹細胞様特徴を有する造血細胞に存在するマーカー、Ｓｃａ−１を発現した（Ｍ．ｖａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６３４−８；Ｍ．Ｏｓａｗａら、１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３２０７−１４；表３参照）。しかし、ＰＰ６細胞はＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ造血幹細胞マーカーを発現しなかった（ＬＫ．Ａｓｈｍａｎ，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１：１０３７−５１；Ｇ．Ａ．Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，１９９３，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：４２０−４２６において総説されている；表３参照）。
【００３３】
本発明の１つの実施形態は、ここで述べる特徴を有する筋由来始原細胞のＰＰ６集団である。これらの筋由来始原細胞は、デスミン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２細胞マーカーを発現する。本発明に従って、ＰＰ６細胞は、移植後に長期的な生存能を有する筋由来始原細胞の集団を得るためにここで述べる手法によって単離される（実施例１）。ＰＰ６筋由来始原細胞集団は、デスミン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２のような始原細胞マーカーを発現する細胞の有意のパーセンテージを含む。加えて、ＰＰ６細胞は、Ｆｌｋ−１およびＳｃａ−１細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔマーカーを発現しない。好ましくは、ＰＰ６細胞の９５％以上がデスミン、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔマーカーを発現しない。ＰＰ６細胞は、最後のプレーティング後約１日以内または約２４時間以内に使用されることが好ましい。
【００３４】
好ましい実施形態では、急速接着細胞と緩慢接着細胞（ＭＤＣ）は、単一プレーティング手法を用いて互いから分離される。そのような手法の１つを実施例１０で述べる。最初に、骨格筋生検から細胞を得る。生検必要量は、約１００ｍｇの細胞を含むだけでよい。約５０ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲の大きさの生検が、本発明のプレプレーティングおよび単一プレーティングの両方法に従って使用される。５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、４００および５００ｍｇのさらなる生検が、本発明のプレプレーティングおよび単一プレーティングの両方法に従って使用される。１つの実施形態では、生検からの組織は入手後２４時間以内に処理される。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、生検からの組織は、その後１〜３０日間保存される。この保存はほぼ室温から約４℃までの温度である。この待機期間は、生検された骨格筋組織にストレスを生じさせる。このストレスは、この単一プレーティング手法を用いたＭＤＣの単離に必要ではないが、待機期間を用いることはＭＤＣのより高い収率をもたらすと思われる。
【００３６】
生検からの組織を細かく切り刻み、遠心分離する。ペレットを再懸濁し、消化酵素を用いて消化する。使用し得る酵素は、コラゲナーゼ、ジスパーゼまたはこれらの酵素の組合せを含む。消化後、酵素を細胞から洗い流す。急速接着細胞の単離のために細胞をフラスコの培地中に移す。多くの培地を使用してもよい。特に好ましい培地は、Ｃａｍｂｒｅｘ内皮増殖培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ）を含む、内皮細胞の培養用に設計されたものを含む。この培地に、ウシ胎仔血清、ＩＧＦ−１、ｂＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ヘパリンおよび／またはアスコルビン酸を含む他の成分を添加してもよい。単一プレーティング手法において使用し得る他の培地は、ＩｎＣｅｌｌ Ｍ３１０Ｆ培地を含む。この培地に、上述したように添加してもよく、または添加せずに使用してもよい。
【００３７】
急速接着細胞の単離のための工程は、約３０〜約１２０分間の期間にわたるフラスコでの培養を必要とし得る。急速接着細胞は、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０分でフラスコに付着する。それらが接着した後、急速接着細胞が付着しているフラスコから培地を取り出して、緩慢接着細胞を急速接着細胞から分離する。
【００３８】
次に、このフラスコから取り出した培地を２番目のフラスコに移す。２番目のフラスコに移す前に、細胞を遠心分離し、培地に再懸濁してもよい。細胞をこの２番目のフラスコで１〜３日間培養する。好ましくは、細胞を２日間培養する。この期間中に、緩慢接着細胞（ＭＤＣ）がフラスコに付着する。ＭＤＣが付着した後、培地を除去し、ＭＤＣの数が増大し得るように新たな培地を添加する。ＭＤＣを約１０〜約２０日間培養することによってその数を増大させ得る。ＭＤＣを１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日間培養することによってその数を増大させ得る。好ましくはＭＤＣを１７日間の拡大培養に供する。
【００３９】
プレプレーティングおよび単一プレーティング法の代替法として、本発明のＭＤＣは、ＭＤＣによって発現される細胞表面マーカーの１またはそれ以上に対する標識抗体を用いた蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって単離できる（Ｃ．Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９８８，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１７４：２５２−６５；Ｊ．Ｒ．Ｂｌａｎｔｏｎら、１９９９，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ２２：４３−５０）。たとえばＦＡＣＳ分析は、宿主組織に導入したとき長期的生存能を示すＰＰ６様細胞の集団を選択するために、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、および／またはここで述べるその他の細胞表面マーカーに対する標識抗体を使用して実施できる。また、種々の細胞マーカータンパク質の抗体検出のための１またはそれ以上の蛍光検出標識、たとえばフルオレセインまたはローダミンの使用も本発明に包含される。
【００４０】
上述したＭＤＣ単離法のいずれかを使用した後、輸送する予定であるまたは一定期間使用しない予定であるＭＤＣは、当技術分野で公知の方法を用いて保存し得る。より詳細には、単離したＭＤＣは約−２５℃から約−９０℃の範囲の温度で凍結し得る。好ましくは、ＭＤＣは、後日の使用または輸送のためにドライアイス上にて約−８０℃で凍結される。凍結は、当技術分野で公知の何らかの凍結保存媒体で実施され得る。
【００４１】
筋由来細胞に基づく治療
本発明の１つの実施形態では、ＭＤＣを骨格筋供給源から単離し、対象とする筋または非筋軟組織部位または骨構造に導入または移植する。好都合には、本発明のＭＤＣは、移植後に長期的な生存を示す多数の始原細胞を含むように単離され、冨化される。加えて、本発明の筋由来始原細胞は、デスミン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２のような多くの特徴的細胞マーカーを発現する。さらに、本発明の筋由来始原細胞は、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーを発現しない（実施例１参照）。
【００４２】
本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、筋または非筋軟組織の増加を通して様々な審美的または機能的症状（たとえば欠陥）を修復する、治療するまたは改善するために使用できる。特に、そのような組成物は、以下の治療のための軟組織増量剤として使用できる：１）皮膚の美容的および審美的症状；２）管腔の症状；３）胃食道逆流症状または状態；４）便失禁；５）骨格筋の筋力低下、疾患、損傷または機能不全；および６）平滑筋の筋力低下、疾患、損傷または機能不全。加えて、そのようなＭＤＣおよびその組成物は、疾患または外傷の不在下で、軟組織領域、孔、陥凹、空隙に増量剤を添加することによって損傷に関連しない軟組織を増加させるため、たとえばしわを「滑らかにする」または取り除くために使用できる。ＭＤＣの多回の連続投与も本発明に包含される。
【００４３】
ＭＤＣに基づく治療のために、骨格筋外植片は、好ましくは自系または異種ヒトまたは動物ソースから入手される。自系動物またはヒトソースがより好ましい。ＭＤＣ組成物は、その後、ここで述べるように調製され、単離される。本発明に従ったＭＤＣおよび／またはＭＤＣを含有する組成物をヒトまたは動物レシピエントに導入するため、単核筋細胞の懸濁液を調製する。そのような懸濁液は、生理的に許容される担体、賦形剤または希釈剤中に本発明の筋由来始原細胞の濃縮物を含む。たとえば被験体に投与するためのＭＤＣの懸濁液は、ウシ胎仔血清の代替物として被験体の血清を含むように改変された完全培地の滅菌用液中に１０８−１０９細胞／ｍｌを含み得る。あるいは、ＭＤＣ懸濁液は、凍結保存溶液（Ｃｅｌｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）のような無血清滅菌溶液であり得る。ＭＤＣ懸濁液は、その後、たとえば注射によって、ドナー組織の１またはそれ以上の部位に導入され得る。
【００４４】
前述した細胞は、医薬的または生理的に許容される製剤としてまたは生理的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む組成物として投与でき、ヒトおよび非ヒト動物を含む対象レシピエント生物の組織に投与できる。ＭＤＣ含有組成物は、滅菌生理食塩水または他の生理的に許容される注射用水性液体のような適切な液体または溶液中に細胞を再懸濁することによって調製され得る。そのような組成物において使用される成分の量は、当業者によって常套的に決定され得る。
【００４５】
ＭＤＣまたはその組成物は、ＭＤＣ懸濁液を吸着または接着材料、すなわちコラーゲン・スポンジ・マトリックス上に置くこと、およびＭＤＣ含有材料を対象部位内または対象部位上に挿入することによって投与され得る。あるいは、ＭＤＣは、皮下、静脈内、筋肉内および胸骨内を含む、非経口的経路の注射によって投与され得る。他の投与方法は、鼻内、髄腔内、皮内、経皮、経腸および舌下を含むが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態では、ＭＤＣの投与は内視鏡手術によって媒介され得る。
【００４６】
注射投与に関しては、組成物は、滅菌溶液または懸濁液中に存在するか、または、防腐剤、安定剤、および溶液または懸濁液をレシピエントの体液（すなわち血液）と等張にするための物質を含有し得る、医薬的および生理的に許容される水性または油性ビヒクルに再懸濁され得る。使用に適する賦形剤の非限定的な例は、水、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、デキストロース、グリセロール、希エタノール等、およびそれらの混合物を含む。例示的な安定剤は、単独でまたは混合物として使用され得る、ポリエチレングリコール、タンパク質、サッカリド、アミノ酸、無機酸および有機酸である。使用される量（ａｍｏｕｎｔｓ、ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ）ならびに投与経路は個人ごとのベースで決定され、当業者に公知の同様のタイプの適用または適応症において使用される量に対応する。
【００４７】
移植の成功を最適化するため、ドナーとレシピエントの間の可能な限り最も密接な免疫学的適合が望ましい。自系ソースが入手不能である場合は、最も密接な適合が得られるかどうかを判定するためにドナーとレシピエントのクラスＩおよびクラスＩＩ組織適合抗原を分析することができる。これは免疫拒絶反応を最小限に抑えるかまたは排除し、免疫抑制または免疫調節治療の必要性を低減する。必要に応じて、移植手技の前、その間、および／または移植手技後に免疫抑制または免疫調節治療を開始することができる。たとえばシクロスポリンＡまたは他の免疫抑制薬を移植レシピエントに投与することができる。また、当技術分野で公知の選択的方法によって移植の前に免疫学的寛容を誘導し得る（Ｄ．Ｊ Ｗａｔｔら、１９８４，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４１９；Ｄ．Ｆａｕｓｔｍａｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１７０１）。
【００４８】
本発明と一致して、ＭＤＣは、骨、上皮組織（すなわち皮膚、管腔等）、結合組織（すなわち脂肪、軟骨、靭帯、リンパ等）、筋組織（すなわち骨格／横紋筋または平滑筋）、および消化器系に関連する器官（すなわち口、舌、食道、胃、肝臓、膵臓、胆嚢、腸、肛門等）、心臓血管系（すなわち心臓、静脈、動脈、毛細血管等）、呼吸器系（すなわち肺、気管等）、生殖器系（すなわち精管、陰嚢、精巣、陰茎、ファローピウス管、膣、陰核、子宮、乳房、卵巣、外陰等）、泌尿器系（すなわち膀胱、尿道、尿管、腎臓等）、および神経系（すなわち脳、脊髄、神経等）に関連する器官のような様々な器官組織を含む、体組織に投与され得る。
【００４９】
ＭＤＣ懸濁液中の細胞の数および投与方法は、治療される部位と症状に依存して異なり得る。非限定的な例として、本発明に従って、約１−１．５×１０６ＭＤＣが膀胱平滑筋組織における低温傷害の直径約８ｍｍの領域の治療のために注射され、約０．５−１．０×１０６ＭＤＣが頭蓋欠損の約５ｍｍの領域の治療のためにコラーゲン・スポンジ・マトリックスによって投与される（実施例９参照）。ここで開示する実施例と一致して、熟達した医師は、各々の症例について決定される必要条件、制限および／または最適化に従ってＭＤＣに基づく治療の量および方法を調節することができる。
【００５０】
皮膚症状：本発明に従ったＭＤＣおよびその組成物は、美容的処置、たとえば形成外科または老化防止処置における軟組織増加のための材料として著明な有用性を有する。特に、そのようなＭＤＣおよびＭＤＣ含有組成物は、創傷、皮膚のひだ、しわ、非外傷性起源の皮膚陥凹、皮膚萎縮線条、陥凹性瘢痕、尋常性ざ瘡からの瘢痕化、および唇の形成不全を含むがこれらに限定されない、ヒトまたは動物被験体における様々な皮膚症状を治療するために使用できる。より詳細には、本発明のＭＤＣおよび組成物は、皮膚のひだ、しわまたは顔面、特に眼の周囲の領域の皮膚陥凹を治療するために使用できる。皮膚症状を治療するため、ＭＤＣはここで開示するように調製され、その後、たとえば注射によって、欠陥を補填する、増量するまたは修復するために皮膚、皮下または皮内に投与される。導入されるＭＤＣの数は、深い皮膚陥凹または欠陥ならびに表在表面の陥凹または欠陥を修復するために必要に応じて調節される。たとえば皮膚の約５ｍｍの領域の増加のためには約１−１．５×１０６ＭＤＣが使用される（実施例３参照）。
【００５１】
管腔の症状：もう１つの実施形態では、本発明に従ったＭＤＣおよびその組成物は、動物またはヒトを含む哺乳動物被験体における管腔の症状のための治療としてさらなる有用性を有する。特に、筋由来始原細胞は、身体内の様々な生物学的管腔または空隙を完全にまたは部分的にブロックする、増強する、拡大する、密封する、修復する、増量するまたは補填するために使用される。管腔は、限定を伴わずに、血管、腸、胃、食道、尿道、膣、ファローピウス管、輸精管および気管を含む。空隙は、限定を伴わずに、様々な組織創傷（すなわち外傷による筋肉および軟組織容積の喪失；刺創または銃創のような貫通発射体による軟組織の破壊；乳癌のための乳房切除術後の乳房組織の喪失または肉種を治療するための手術後の筋組織の喪失を含む、組織の外科的切除による疾患または組織死からの軟組織の喪失等）、病巣、裂溝、憩室、嚢胞、フィステル、動脈瘤、および動物またはヒトを含む哺乳動物の体内に存在し得る他の望ましくないまたは不要の陥凹または孔を含み得る。管腔の症状の治療のために、ＭＤＣはここで開示するように調製され、その後、たとえば注射または静脈内送達によって、空隙を満たすまたは修復するために管腔組織に投与される。導入されるＭＤＣの数は、軟組織環境における大きなまたは小さな空隙を修復するために必要に応じて調節される。
【００５２】
括約筋の症状：本発明に従ったＭＤＣおよびその組成物は、動物またはヒトを含む哺乳動物被験体における括約筋の損傷、筋力低下、疾患または機能不全の治療のためにも使用され得る。特に、ＭＤＣは、食道、肛門、心臓、幽門および尿道括約筋の組織を増加させるために使用される。より詳細には、本発明は、胃食道逆流症状、および尿および便失禁のための軟組織増加治療を提供する。括約筋欠陥の治療のために、ＭＤＣはここで述べるように調製され、その後、たとえば注射によって、付加的な容積、補填材または支持を提供するために括約筋組織に投与される。導入されるＭＤＣの数は、様々な量の増量材を提供するために必要に応じて調節される。たとえば胃食道接合部の約５ｍｍの領域または肛門括約筋の約５−１０ｍｍの領域の増加を提供するために約１−１．５×１０６ＭＤＣが使用される（実施例４参照）。
【００５３】
筋増加および収縮性：本発明のさらにもう１つの実施形態では、ＭＤＣおよびその組成物は、ヒトまたは動物被験体における筋症状の治療のために使用される。特に、ＭＤＣは、傷害、疾患、不活動、もしくは無酸素または手術誘発性外傷によって引き起こされる筋力低下または機能不全を治療するために骨格筋または平滑筋を増加させるために使用され得る。より詳細には、本発明は、スポーツ関連傷害のような骨格筋の筋力低下または機能不全のための治療を提供する。本発明はまた、心不全、または心筋梗塞に関連する損傷のような、平滑筋疾患または機能不全のための治療を提供する。
【００５４】
筋増加または筋関連症状の治療のために、ＭＤＣはここで述べるように調製され、たとえば注射によって、付加的な容積、補填剤または支持を提供するために筋組織に投与される。熟達した医師によって認識されるように、導入されるＭＤＣの数は、様々な量の増量材を提供するために必要または要求に応じて調節される。たとえば心臓組織の約５ｍｍの領域の増加のためには約１−１．５×１０６ＭＤＣが注射される（実施例７参照）。
【００５５】
加えて、ＭＤＣおよびその組成物は、たとえば胃腸組織、食道組織および膀胱組織のような平滑筋組織の収縮性に影響を及ぼすために使用され得る。実際に、実施例６で明らかにされるように、筋由来始原細胞、すなわちＭＤＣの導入後、低温損傷膀胱組織において筋収縮性が回復することが認められた。それ故、本発明はまた、筋収縮を回復する上での、および／または、食道、胃および腸平滑筋を含む胃腸運動性低下のような、平滑筋収縮性の問題を改善するまたは克服する上での本発明のＭＤＣの使用を包含する。本発明のＭＤＣが改善、軽減または矯正し得る症状のさらなる非限定的な例は、胃不全麻痺、すなわち胃の運動および排出低下である。
【００５６】
心臓の症状：さらにもう１つの実施形態では、ＭＤＣおよびその組成物は、ヒトまたは哺乳動物被験体における心臓状態の治療または予防のために使用される。これらの心臓状態は、心筋梗塞、心不全、アダムズ‐ストークス病、先天性心疾患、狭心症、不整脈、心房細動、細菌性心内膜炎、心筋症、うっ血性心不全、拡張機能障害、心雑音および心室期外収縮を含む。ＭＤＣおよびその組成物は、これらの心臓状態が起こるのを防ぐために予防的に投与され得るか、または疾病が起こった後、心臓状態によって引き起こされる心臓への損傷を修復するために投与され得る。たとえばＭＤＣおよびその組成物は、心臓発作（心筋梗塞）の危険度が高いヒトまたは動物に、心臓発作が起こる前に投与され得る。同じかまたは別のヒトまたは動物に、心臓発作の発症後に心臓を修復するためにＭＤＣおよびその組成物を投与し得る。
【００５７】
心臓状態の治療または予防のために使用されるＭＤＣおよびその組成物は、ここで述べる方法を用いてヒトまたは動物骨格筋組織から単離され得る。緩慢接着細胞（ＭＤＣ）を単離した後、ヒトまたは動物患者への輸送のために細胞を凍結し得る。好ましい実施形態では、骨格筋細胞をヒトまたは動物患者から単離し、低温であるが凍結しない温度（たとえば４℃）に置き、ＭＤＣ単離のために収集する。ＭＤＣおよびその組成物を単離した後、ＭＤＣを細胞培養で増殖させ、凍結して、解凍と投与のために患者に送り返す。
【００５８】
投与するとき、ＭＤＣおよびその組成物は、心臓内に直接または心臓のすぐ外側に注射され得る。心臓内に注射するとき、ＭＤＣおよびその組成物は、心室・心房のいずれかまたは心臓壁に注射され得る。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、ＭＤＣは、心筋梗塞（ＭＩ）、特に急性期の治療のために使用される。ＭＩ後の損傷を治療することは、その後有害なリモデリングと瘢痕化を予防し、機能の低下を予防しながら、有益なリモデリングを促進するために不可欠である。急性期のＭＤＣにより、より少ない細胞用量でＭＩ患者へのより大きな利益が提供され得る。
【００６０】
遺伝子操作された筋由来細胞
本発明のもう１つの態様では、本発明のＭＤＣは、１またはそれ以上の活性生体分子をコードする核酸配列を含むように、およびタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ホルモン、代謝産物、薬剤、酵素等を含むこれらの生体分子を発現するように遺伝的に操作され得る。そのようなＭＤＣは、ヒトを含むレシピエントに対して組織適合性（自系）または非組織適合性（同種異系）であり得る。これらの細胞は、様々な治療のため、たとえば癌、移植拒絶反応、および筋および神経組織の再生、糖尿病、肝不全、腎不全、パーキンソン病のような神経障害および疾患のような疾患および疾病の治療のため、およびここで述べるように、治療薬などの遺伝子産物を組織増加または空隙補填の部位に送達するための、長期的な局所送達システムとしての機能を果たすことができる。
【００６１】
本発明において好ましいのは、レシピエントに外来性と認識されない自系の筋由来始原細胞である。これに関して、細胞を介した遺伝子導入または送達のために使用されるＭＤＣは、望ましくは主要組織適合遺伝子座（ヒトにおけるＭＨＣまたはＨＬＡ）に適合する。そのようなＭＨＣまたはＨＬＡ適合細胞は自系であり得る。あるいは、細胞は、同じかまたは類似のＭＨＣまたはＨＬＡ抗原プロフィールを有する人物からであり得る。患者はまた、同種異系ＭＨＣ抗原に寛容化され得る。本発明はまた、米国特許第５，５３８，７２２号に述べられているような、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ抗原を欠く細胞の使用を包含する。
【００６２】
ＭＤＣは、当業者に公知の様々な分子学的手法および方法、たとえばトランスフェクション、感染または形質導入によって遺伝子操作され得る。ここで使用する形質導入は、一般に、ウイルスまたは非ウイルスベクターの細胞への導入によって外来性または異種遺伝子を含むように遺伝的に操作された細胞を指す。トランスフェクションは、より一般的に、プラスミドまたは非ウイルスベクター内に保有される外来性遺伝子を含むように遺伝的に操作された細胞を指す。ＭＤＣは種々のベクターによってトランスフェクトまたは形質導入され得、それ故発現された産物を筋肉に移入するための遺伝子送達ビヒクルとして働くことができる。
【００６３】
ウイルスベクターは好ましいが、当業者は、所望タンパク質またはポリペプチド、サイトカイン等をコードする核酸配列を含むための細胞の遺伝子操作は、融合、トランスフェクション、リポソームの使用によって媒介されるリポフェクション、電気穿孔、ＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウムでの沈殿、核酸被覆粒子（たとえば金粒子）による微粒子銃法（バイオリスティック法）、微量注入等を含む、たとえば米国特許第５，５３８，７２２号に述べられているような、当技術分野で公知の方法によって実施され得る。
【００６４】
異種（すなわち外来性）核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、生物活性産物の発現のために筋細胞に導入するためのベクターは当技術分野において周知である。そのようなベクターは、プロモーター配列、好ましくは細胞特異的であり、発現される配列の上流に位置するプロモーターを有する。ベクターはまた、場合により、トランスフェクションの成功とベクターに含まれる核酸配列の発現の指標としての発現のための、１またはそれ以上の発現マーカー遺伝子を含み得る。
【００６５】
本発明の筋由来細胞のトランスフェクションまたは感染のためのビヒクルまたはベクター構築物の説明的な例は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびアデノ関連ウイルスベクターのような、複製欠損ウイルスベクター、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス（レトロウイルス）ベクターを含む。アデノ関連ウイルスベクターは一本鎖であり、細胞の核への多数のコピーの核酸の効率的な送達を可能にする。アデノウイルスベクターが好ましい。ベクターは通常、原核生物ＤＮＡを実質的に含まず、多くの異なる機能的核酸配列を含み得る。そのような機能的配列の例は、筋細胞において活性なプロモーター（たとえば強力プロモーター、誘導的プロモーター等）およびエンハンサーを含む、転写および翻訳開始および終結調節配列を含むポリヌクレオチド配列、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ配列を包含する。
【００６６】
また、対象とするタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ポリヌクレオチド配列）も機能的配列の一部として含まれる；フランキング配列も、部位指定組込みのために含まれ得る。一部の状況では、５’フランキング配列は相同的組換えを可能にし、それ故、一例として、転写のレベルを高めるまたは低下させるために誘導的または非誘導的転写を提供するように、転写開始領域の性質を変化させる。
【００６７】
一般に、筋由来始原細胞によって発現されることが所望される核酸配列は、筋由来始原細胞にとって異種である、構造遺伝子、または機能的フラグメント、セグメントまたは遺伝子の部分の核酸配列であり、たとえば所望タンパク質またはポリペプチド産物をコードする。コードされ、発現される産物は、細胞内に存在し得る、すなわち細胞質、核または細胞の小器官に保持され得るか、または細胞によって分泌され得る。分泌のために、構造遺伝子内に存在する天然シグナル配列が保持され得るか、または天然では構造遺伝子内に存在しないシグナル配列が使用され得る。ポリペプチドまたはペプチドがより大きなタンパク質のフラグメントであるとき、シグナル配列は、分泌およびプロセシング部位でのプロセシング後、所望タンパク質が天然配列を有するように提供され得る。本発明に従った使用のための対象遺伝子の例は、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞シグナル伝達因子およびプログラムされた細胞死因子をコードする遺伝子を含む。特定例は、ＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）、ＩＬ−１Ｒａ、第ＩＸ因子およびコネキシン４３を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
上述したように、ベクター構築物を含む細胞の選択のためにマーカーが存在し得る。マーカーは、誘導的または非誘導的遺伝子であり得、一般にそれぞれ誘導下または誘導不在下での陽性選択を可能にする。一般的に使用されるマーカー遺伝子の例は、ネオマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ等を含む。
【００６９】
使用するベクターは、一般に、当業者によって常套的に使用されるように、複製起点および宿主細胞における複製のために必要な他の遺伝子も同時に含む。一例として、複製起点および特定ウイルスによってコードされる複製に関連するタンパク質を含む複製系が構築物の一部として含まれ得る。複製系は、複製のために必要な産物をコードする遺伝子が最終的に筋由来細胞を形質転換しないように選択しなければならない。そのような複製系は、たとえばＧ．Ａｃｓａｄｉら、１９９４，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：５７９−５８４によって述べられているように構築される複製欠損アデノウイルス、およびエプスタイン‐バーウイルスに代表される。複製欠損ベクター、特に複製欠損のレトロウイルスベクターの例は、Ｐｒｉｃｅら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：１５６；およびＳａｎｅｓら、１９８６，ＥＭＢＯ Ｊ．，５：３１３３によって述べられている、ＢＡＧである。最終的な遺伝子構築物は、１またはそれ以上の対象遺伝子、たとえば生物活性代謝分子をコードする遺伝子を含み得る。加えて、ｃＤＮＡ、合成によって生産されるＤＮＡまたは染色体ＤＮＡが、当業者に公知であり、当業者によって実施される方法およびプロトコールを用いて使用され得る。
【００７０】
所望する場合は、感染性複製欠損ウイルスベクターを、細胞のインビボ注射に先立って細胞を遺伝子操作するために使用し得る。これに関して、ベクターを両栄養性パッケージングのためにレトロウイルスプロデューサー細胞に導入し得る。筋由来始原細胞の隣接領域への自然拡大は、対象部位内または対象部位における多回の注射を回避する。
【００７１】
もう１つの態様では、本発明は、所望遺伝子産物をコードする異種遺伝子を含むように操作されたアデノウイルスベクターを用いて、ウイルスによって形質導入されたＭＤＣ、たとえば初期前駆体筋細胞の使用を通して、ヒトを含むレシピエント哺乳動物宿主の細胞および組織へのエクスビボ遺伝子送達を提供する。そのようなエクスビボアプローチは、直接遺伝子導入アプローチに勝る、効率的なウイルス遺伝子導入の利点を提供する。エクスビボ手順は、筋組織の単離細胞からの筋由来始原細胞の使用を含む。筋由来始原細胞の供給源として役立つ筋生検は、損傷部位から、または臨床外科医からより容易に入手可能であり得る別の領域から入手できる。
【００７２】
本発明に従って、クローン単離物が、当技術分野で公知の様々な手順、たとえば組織培養培地での限界希釈プレーティングを用いて筋由来始原細胞（すなわちＰＰ６細胞）の集団から誘導され得ることは認識される。クローン単離物は、１個の単独細胞から生じる遺伝的に同一の細胞を含む。加えて、クローン単離物は、クローン単離細胞系を樹立するために、上述したようなＦＡＣＳ分析、続いて各穴につき１個の細胞を達成するための限界希釈を用いて誘導され得る。ＰＰ６細胞集団に由来するクローン単離物の一例は、実施例９で説明されるｍｃ１３である。好ましくは、ＭＤＣクローン単離物が、本発明の方法において、ならびに１またはそれ以上の生物活性分子の発現のための遺伝子操作のために、または遺伝子置換療法において使用される。
【００７３】
ＭＤＣを、最初に、食塩水またはリン酸緩衝食塩水のような生理的に許容される担体または希釈剤中に懸濁された、所望遺伝子産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む操作されたウイルスベクターに感染させ、次に宿主において適切な部位に投与する。本発明と一致して、ＭＤＣは、上述したように、骨、上皮組織、結合組織、筋肉組織、および消化器系、心臓血管系、呼吸器系、生殖器系、泌尿器系および神経系に関連する器官のような様々な器官組織を含む、体組織に投与され得る。所望遺伝子産物が注入された細胞によって発現され、それ故遺伝子産物が宿主に導入される。導入され、発現された遺伝子産物は、それにより、宿主において長期的な生存を有する本発明のＭＤＣによって長期間にわたって発現されるので、損傷、機能不全または疾患を治療する、修復するまたは改善するために利用され得る。
【００７４】
筋芽細胞を介した遺伝子治療の動物モデル試験では、筋酵素欠損の部分的矯正のために筋肉１００ｍｇにつき１０６筋芽細胞の移植が必要であった（Ｊ．Ｅ．Ｍｏｒｇａｎら、１９８８，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｓｃｉ．８６：１３７；Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：１７６）。このデータから推定すると、７０ｋｇのヒトについての遺伝子治療のために、生理的に適合性の媒質に懸濁された約１０１２ＭＤＣを筋組織に移植することができる。この数の本発明のＭＤＣは、ヒトソースからの１回の１００ｍｇ骨格筋生検から生産できる（以下参照）。特定損傷部位の治療に関して、所与の組織または損傷部位への遺伝子操作されたＭＤＣの注入は、溶液または懸濁液中に治療有効量の細胞、好ましくは、生理的に許容される媒質中に、治療される組織ｃｍ３につき約１０５−１０６細胞を含む。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
ＭＤＣの冨化、単離および分析
ＭＤＣの冨化と単離：ＭＤＣを、記述されているように（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）作製した。筋外植片を多くの供給源の後肢から、すなわち３週齢のｍｄｘ（ジストロフィー）マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ ｍｄｘ／ｍｄｘ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、４−６週齢の正常雌性ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット、またはＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全）マウスの後肢から得た。動物ソースの各々からの筋組織を切開して骨を除去し、切り刻んでスラリーにした。次にスラリーを、０．２％ＸＩ型コラゲナーゼ、ジスパーゼ（グレードＩＩ、２４０単位）および０．１％トリプシンとの３７℃で１時間の連続インキュベーションによって消化した。生じた細胞懸濁液を１８、２０および２２ゲージの針に通し、３０００ｒｐｍ で５分間遠心分離した。その後、細胞を増殖培地（１０％ウシ胎仔血清、１０％ウマ血清、０．５％ニワトリ胚抽出物および２％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ）に懸濁した。次に細胞をコラーゲン被覆したフラスコでプレプレーティングした（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。約１時間後、上清をフラスコから取り出し、新鮮コラーゲン被覆フラスコに再プレーティングした。この１時間のインキュベーション内に迅速に接着した細胞は主として線維芽細胞であった（Ｚ．Ｑｕら、前出；Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。細胞の３０−４０％が各フラスコに接着した後、上清を取り出し、再プレーティングした。約５−６回の連続プレーティング後、培養物を、出発細胞集団から単離され、さらなる試験において使用される、ＰＰ６細胞と称される小さな円形細胞で冨化した。初期プレーティングで単離された接着細胞を一緒にプールし、ＰＰ１−４細胞と称した。
【００７６】
ｍｄｘ ＰＰ１−４、ｍｄｘ ＰＰ６、正常ＰＰ６および線維芽細胞集団を、細胞マーカーの発現に関して免疫組織化学分析によって検査した。この分析の結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
ｍｄｘ ＰＰ１−４、ｍｄｘ ＰＰ６、正常ＰＰ６および線維芽細胞をプレプレーティング手法によって誘導し、免疫組織化学分析によって検査した。「−」は細胞の２％未満が発現を示したことを指示し；「（−）」；「−／＋」は細胞の５−５０％が発現を示したことを指示し；「＋／−」は細胞の〜４０−８０％が発現を示したことを指示し；「＋」は細胞の＞９５％が発現を示したことを指示し：「ｎｏｒ」は正常細胞を指示し；「ｎａ」は免疫組織化学データが入手できないことを指示する。
【００７８】
ｍｄｘおよび正常マウスの両方が、このアッセイで試験したすべての細胞マーカーの同一の分布を示したことが注目される。それ故、ｍｄｘ突然変異の存在は、単離ＰＰ６筋細胞由来集団の細胞マーカー発現に影響を及ぼさない。
【００７９】
ＭＤＣを、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１０％ＨＳウマ血清、０．５％ニワトリ胚抽出物および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を含む増殖培地、または２％ウシ胎仔血清と１％抗生物質溶液を添加したＤＭＥＭを含む融合培地で増殖させた。すべての培地供給量はＧｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を通して購入した。
【００８０】
（実施例２）
ＭＤＣベクターおよびトランスフェクション
レトロウイルスおよびアデノウイルスベクター：ＭＦＧ−ＮＢ（Ｎ．Ｆｅｒｒｙら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７−８１）レトロウイルスベクターをＭＤＣ実験のために使用した。このベクターは、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）から転写されたシミアンウイルス（ＳＶ４０）ラージＴ抗原からクローニングされた核局在化配列を含む修飾ＬａｃＺ遺伝子（ＮＬＳ−ＬａｃＺ）を含む。レトロウイルス株を増殖させ、以前に述べられているように調製した（Ｊ．Ｃ．ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、１９９８，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．８：１３５−４８）。レトロウイルスの力価は１×１０７−１×１０９ｃｆｕ／ｍｌと測定された。
【００８１】
アデノウイルスベクターも使用した。 このベクターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨｕＣＭＶ）プロモーターの制御下にあるＬａｃＺ遺伝子を含んだ（Ｊ．Ｈｕａｒｄら、１９９４，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：９４９−５８）。Ｅ１−Ｅ３欠失組換えアデノウイルスを、Ｄｒ．Ｉ．Ｋｏｖｅｓｄｉ（Ｇｅｎｅ Ｖｅｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を通して入手した。
【００８２】
ＭＤＣのウイルス形質導入：ウイルス形質導入のために、ＭＤＣをＴ ７５フラスコに１−１．５×１０６の密度で植え付けた。ＰＰ６ ＭＤＣをＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）で洗浄し、８μｇ／ｍｌ Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ．）を含むＤＭＥＭ ５ｍｌ中のレトロウイルス（１×１０７−１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）またはアデノウイルス（１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）懸濁液と共に３７℃で４時間インキュベートした。ウイルス形質導入したＭＤＣを、増殖培地１０ｍｌ中、３７℃で２４時間増殖させた。次にＭＤＣをＨＢＳＳで洗い、０．２５％トリプシンで１分間酵素消化した。処理したウイルス形質導入ＭＤＣを３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットをＨＢＳＳ ２０μｌに再懸濁した。
【００８３】
（実施例３）
皮膚の軟組織増加
ＭＤＣおよびコラーゲンの注射：ＳＤラットを、標準的な方法を用いてハロタンで麻酔し、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（登録商標）溶液で手術部位を洗浄することによって手術用に準備した。下腹部の皮膚に、ハミルトンマイクロシリンジを用いてＨＢＳＳ中のＭＤＣ懸濁液１０μｌ（約１−１．５×１０６細胞）、市販のウシコラーゲン（Ｃｏｎｔｉｇｅｎ（商標）；Ｃ．Ｒ．Ｂａｒｄ，Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，Ｇａ．）１０μｌ、または滅菌食塩水１０μｌのいずれかを注射した。注射後５日目、２週間目および４週間目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製して、顕微鏡で検査し、写真撮影した。組織化学分析は、ヘマトキシリン、エオシンまたはトリクローム染色を含んだ。
【００８４】
結果は、ＭＤＣが皮膚組織への注射後少なくとも４週間まで生存可能であり、注射部位の組織の炎症の証拠を伴わなかったことを明らかにする（図１Ｄ−１Ｆ）。これに対し、コラーゲンは皮膚組織への注射後２週間目に生存可能ではなかった（図１Ｂおよび１Ｃ）。それ故、ＭＤＣ組成物は、たとえば美容的および審美的適用または手術における使用のための皮膚増加材料として使用することができる。これまで、移植した筋細胞は、生存するためにそれが結合する周囲の宿主筋線維を必要とすると考えられていたので、これは予想外の所見である。非筋組織への注射後の本発明のＭＤＣの生存は、実施例８および９においてさらに明らかにされる。
【００８５】
（実施例４）
胃食道接合部および肛門括約筋の軟組織増加
ＳＤラットを上述したように手術のために準備した。胃食道接合部および肛門括約筋を露出させるために腹部正中切開を実施した。ハミルトンマイクロシリンジを用いて軟組織にＨＢＳＳ中の筋由来始原細胞懸濁液１０μｌ（１−１．５×１０６細胞）を注射した。注射後３日目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製して、ＬａｃＺマーカーを担持する細胞の局在と生存能を調べるためにβ−ガラクトシダーゼで染色し、顕微鏡で検査して、写真撮影した。これらの実験の結果は、ＭＤＣ組成物が、胃食道逆流または便失禁症状または状態の治療のために食道および肛門括約筋増量材料として使用できることを明らかにする（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００８６】
（実施例５）
膀胱尿管接合部の軟組織増加
ＳＤラットを上述したように手術のために準備した。尿管−膀胱（膀胱尿管）接合部を露出させるために腹部正中切開を実施した。ハミルトンマイクロシリンジを用いて組織にＨＢＳＳ中のＭＤＣ懸濁液１０μｌ（１−１．５×１０６細胞）を注射した。注射後３日目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製して、ＬａｃＺマーカーを担持する細胞の局在と生存能を調べるためにβ−ガラクトシダーゼで染色し、顕微鏡で検査して、写真撮影した。これらの結果は、ＭＤＣに基づく組成物が、膀胱尿管逆流症状または状態の治療のために尿管膀胱増加材料として使用できることを明らかにする（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００８７】
（実施例６）
低温損傷膀胱組織のＭＤＣ治療
低温損傷とＭＤＣ移植：ＳＤラットを上述したように手術のために準備した。膀胱と尿道を露出させるために下腹部正中切開を実施した。次に膀胱に食塩水１ｍｌを満たした。ドライアイス上で冷却した直径８ｍｍのアルミニウム棒で低温損傷を実施した。冷却した探針を膀胱壁の一方の側に１５または３０秒間（それぞれ「軽度」または「重度」損傷と称する）当てる。低温損傷後直ちに、１つの重度損傷群に本発明の筋由来細胞（ＨＢＳＳ １５μｌ中１−１．５×１０６細胞）を注射し、対照重度損傷群にはＨＢＳＳ（１５μｌ）を注射した（ｎ＝３／群）。低温損傷の１週間後、その他の軽度および重度損傷群にＨＢＳＳ ５０μｌ中のＭＤＣ懸濁液（２−３×１０６細胞）を注射し、対照軽度および重度損傷群にはＨＢＳＳ ５０μｌを注射した（ｎ＝４／群）。各々の群に関して、注射は、３０ゲージの針とハミルトンマイクリシリンジを用いて損傷領域の中心に実施した。
【００８８】
平滑筋アクチン（α−ＳＭアクチン）についての免疫組織化学染色：免疫組織化学分析のための試料を調製するため、組織または細胞試料を−２０℃の低温アセトンに２分間固定し、５％ＨＳで１時間ブロックした。試料を、マウスモノクローナル抗平滑筋アクチン一次抗体（カタログ番号Ｆ−３７７７；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（ＰＢＳ ｐＨ７．４中１：４００希釈）と共に湿度室において室温で一晩インキュベートした。次に試料をＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｙ３蛍光色素と結合した抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ＰＢＳ ｐＨ７．４中１：２００希釈）と共にインキュベートした。
【００８９】
速ミオシン重鎖（Ｆａｓｔ ＭｙＨＣ）についての免疫組織化学染色：組織または細胞試料を−２０℃の低温アセトンに２分間固定し、５％ＨＳで１時間ブロックした。試料を、その後、マウスモノクローナル抗骨格筋ミオシン（速）一次抗体（カタログ番号Ｍ４２７６；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ＰＢＳ ｐＨ７．４中１：４００希釈）と共に湿度室において室温で一晩インキュベートした。次に試料をＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｙ３結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ＰＢＳ ｐＨ７．４中１：２００希釈）と共にインキュベートした。
【００９０】
細胞培養：実施例１で調製した筋由来始原細胞を、３５ｍｍコラーゲン被覆皿において増殖培地に接種した。２４時間後、増殖培地を融合培地と交換した。ＭＤＣが筋管に分化するまで、培地を毎日交換しながら細胞を融合培地に維持した。
【００９１】
収縮性試験：ＭＤＣ注射の２週間後、動物を安楽死させ、膀胱細片を作製するために使用した。２つの細片を各々の膀胱から作製し、両方の細片を、膀胱の周囲に沿って伸びるように切断した。膀胱細片を組織バスに入れ、神経収縮に供して（２０Ｈｚ、１０および８０ショック）、以下で述べるように記録し、分析した。
【００９２】
組織の採取および組織学的検査：ＳＤラットを安楽死させ、注射部位の周囲の組織の試料を切除した。液体窒素中であらかじめ冷却した２−メチルブタンを用いて試料を瞬間凍結した。試料の組織化学分析は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を含んだ。試料を染色し、顕微鏡で検査して、写真撮影した。各々のクリオスタット切片は厚さ１０μｍと測定された。
【００９３】
膀胱平滑筋組織の電気刺激：動物を安楽死させ、膀胱を迅速に切除した。膀胱壁の周囲をカバーする２つの切片を各々の膀胱から得た。細片を、９５％Ｏ２と５％ＣＯ２で通気したクレブス溶液（１１３ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、４．７ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１．２５ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２、１．２ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＳ０４、２５ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１．２ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４および１１．５ｍｍｏｌ／ｌグルコース）を含む５ｍｌ器官バスに入れた。初期張力を１０ｍＮに設定し、ＴＢＭ４ストレインゲージ増幅器（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に連結されたストレインゲージ変換器で等尺性収縮を測定した。データ取得プログラムを用いて（Ｗｉｎｄａｑ，ＤＡＴＡＱ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｋｒｏｎ，ＯＨ）収縮測定を蓄積した。チャネルごとのサンプリング率を１００Ｈｚに設定した。算定プログラムを使用して（ＷｉｎｄａｑＥｘ，ＤＡＴＡＱ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）収縮の大きさを計算した。２０分間の平衡期間後、器官バスの上部と底部の４ｃｍ離れた２つの白金ワイヤ電極を通して電場刺激を適用した。温度は実験全体を通して３７℃に保持した。
【００９４】
膀胱平滑筋組織の化学刺激：膀胱細片を最大電圧（１００Ｖ）で０．２５ミリ秒間の矩形波パルスで刺激し、１、２、５、１０、２０または４０Ｈｚで１０または８０ショックを使用して周波数応答曲線を構築した。電気刺激後、収縮を誘導するために５、１０または２０μＭカルバコールを膀胱細片に添加した。平行実験では、１μＭアトロピンを添加し、上述したように電気刺激を適用して、収縮を誘導するために５０μＭメチレンＡＴＰを添加した。
【００９５】
神経支配についての染色：平滑筋におけるＭＤＣの再神経支配を評価するためにアセチルコリン（Ａｃｈ）染色を使用した。Ａｃｈは、神経終末の存在を指示する神経筋接合部についての染色である。ＭＤＣ注射後、３、１５、３０日目または６カ月後に組織を切除し、Ａｃｈに関して染色し、顕微鏡で観察して、写真撮影した。
【００９６】
統計解析：数値は平均±標準偏差として報告されている。０．０５未満の「Ｐ」値を統計的に有意とみなした。スチューデントｔ検定を使用した。
【００９７】
ＭＤＣ分化：実施例１で作製した筋由来始原細胞を細胞分化に関して評価した。α−ＳＭアクチンは平滑筋細胞表現型についての最初期の公知のマーカーであり（Ｋ．Ｍ．ＭｃＨｕｇｈ，１９９５，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０４：２７８−９０）、筋線維芽細胞表現型の主要マーカーである（Ｉ．Ｄａｒｂｙら、１９９０，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３：２１−９）。筋細胞分化の間に、α−ＳＭアクチンの発現は低下し、一方速ＭｙＨＣ発現が上昇する。α−ＳＭアクチンおよび速ＭｙＨＣマーカーを使用したＭＤＣ処置膀胱組織の組織化学分析は、低温損傷の部位への注射後のＭＤＣの分化を明らかにする。低温損傷膀胱組織への注射後５日目に、いくつかのＭＤＣ（少なくとも２０％）はα−ＳＭアクチン染色を示し（図５Ｂ）、細胞がまだ未分化であることを指示する。注射の６カ月後には、しかし、速ＭｙＨＣ染色の同時上昇（図５Ｉ）を伴う、α−ＳＭアクチン染色の低下（図５Ｆ）によって示されるように、実質的にすべてのＭＤＣが筋管または筋線維に分化していた。
【００９８】
筋の再神経支配：アセチルコリン（Ａｃｈ）は神経筋接合部に存在するので、筋神経支配のインジケータの役割を果たすことができる。Ａｃｈマーカーを使用したＭＤＣ処置膀胱組織の組織化学分析は、低温損傷の部位への注射後のＭＤＣの再神経支配を明らかにする。低温損傷膀胱組織への注射後３日目に、注射されたＭＤＣは、比較的低いレベルのＡｃｈ染色によって指示されるように（図６Ａ）、最小限の神経支配を示す。注射後１５日目に、Ａｃｈ染色のレベル上昇によって指示されるように（図６Ｂ）、神経支配のレベル上昇が認められる。注射後３０日目には、神経支配のさらなる上昇を指示する、より一層のＡｃｈ染色が認められる（図６Ｃ）。注射後６か月目に、低倍率で観察されるＭＤＣ注射領域全体にわたる実質的なＡｃｈ染色によって指示されるように（図６Ｄ）、広汎な神経支配が認められる。これらの結果は、骨盤神経が膀胱のＭＤＣ注射領域へと成長しつつあることを指示し、ＭＤＣが注射した組織の収縮性と機能を改善し得ることを示唆する。
【００９９】
注射したＭＤＣが処置した膀胱組織の機能を改善したかどうかを判定するために、いくつかの収縮性試験を実施した（上記参照）。表２は、ＭＤＣ注射を実施したまたは実施しなかった低温損傷後の膀胱筋の収縮性パラメータを示すデータを提示する。
【０１００】
【表２】
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。数値は平均±標準偏差である。統計分析のために、対照およびＭＤＣ注射群に関してスチューデントｔ検定を実施した。第１群：低温損傷後直ちにＭＤＣを注射した重度損傷群。第２群：低温損傷の１週間後にＭＤＣを注射した軽度損傷群。第３群：低温損傷の１週間後にＭＤＣを注射した重度損傷群。第４群：正常膀胱組織。
【０１０１】
低温損傷後直ちにＭＤＣを注射した重度損傷群（第１群）は、対照（擬似）群と同様の収縮性を示した（表２の第１群の擬似とＭＤＣの列に示されている収縮性レベルを比較する）。しかし、低温損傷の１週間後にＭＤＣを注射した重度損傷群（第３群）は、対照群と比較して（表２において星印で指示されている擬似とＭＤＣの列に示されている収縮の大きさのレベルを比較する）高い収縮率を示した（それぞれ２０Ｈｚ／１０ショックおよび２０Ｈｚ／８０ショックで対照膀胱の１４５％および１６１％）。同様に、低温損傷の１週間後にＭＤＣを注射した重度損傷群（第３群）は、対照群と比較して（表２の第３群の擬似とＭＤＣの列における収縮速度値を比較する）高い収縮速度（それぞれ２０Ｈｚ／１０ショックおよび２０Ｈｚ／８０ショックで対照細片の１１９％および１２１％）を示した。低温損傷の１週間後にＭＤＣを注射した軽度損傷群（第２群）も、対照群と比較して（表２の第２群の擬似とＭＤＣの列に示されている収縮性レベルを比較する）高い収縮の大きさおよび速度を示した。これらの試験の結果は、ＭＤＣ注射が低温損傷した膀胱筋組織に収縮性を回復させ得ることを示し、ＭＤＣに基づく組成物が尿失禁の治療のために使用できることを指示する。
【０１０２】
（実施例７）
心筋層の軟組織増加
ＳＤラットを上述したように手術のために準備した。心臓を露出させるために胸部切開を実施した。ハミルトンマイクロシリンジを用いてＨＢＳＳ中のＭＤＣ懸濁液１０μｌ（１−１．５×１０６細胞）を心室壁に注射した。３日目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製して、ＬａｃＺマーカーを担持する細胞の局在と生存能を調べるためにβ−ガラクトシダーゼで染色し、顕微鏡で検査して、写真撮影した。これらの実験の結果は、ＭＤＣ組成物が、心不全または心筋梗塞に続発する傷害または脱力の治療のために心筋軟組織増加材料として使用できることを明らかにする（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０１０３】
（実施例８）
肝臓、脾臓および脊髄組織へのＭＤＣ注射
ＳＤラットを上述したように手術のために準備した。肝臓および脾臓を露出させるために腹部正中切開を実施した。両方の部位に、ハミルトンマイクロシリンジを用いてＨＢＳＳ中のＭＤＣ懸濁液１０μｌ（１−１．５×１０６細胞）を注射した。同時に、脊髄を露出させるために背部正中切開と部分椎弓切除術を実施した。次に、レベルＴ１０の脊髄組織に、肝臓および脾臓組織に関して実施したようにＨＢＳＳ中のＭＤＣ懸濁液を注射した。
注射後４日目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製して、ＬａｃＺマーカーを担持する細胞の局在と生存能を調べるためにβ−ガラクトシダーゼで染色し、顕微鏡で検査して、写真撮影した。これらの実験は、ＭＤＣ組成物が、様々な肝臓、脾臓および脊髄の損傷、疾患または機能不全を治療するために肝臓、脾臓および脊髄軟組織増加材料として使用できることを示す（図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０１０４】
（実施例９）
骨欠損のＭＤＣ治療
筋由来細胞の単離：ＭＤＣを、実施例１で述べたようにｍｄｘマウスから得た。
【０１０５】
ＰＰ６筋由来始原細胞のクローン単離：ＰＰ６細胞集団からクローンを単離するため、ＰＰ６細胞を、ＬａｃＺ、ミニジストロフィンおよびネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクトした。簡単に述べると、ｐＰＧＫ−ＮＥＯからのネオマイシン耐性遺伝子を含むＳｍａＩ／Ｓａ／Ｉフラグメントを、ＬａｃＺ遺伝子を含むｐＩＥＰｌａｃＺプラスミド内のＳｍａＩ／Ｓａ／Ｉ部位に挿入し、ｐＮＥＯｌａｃＺプラスミドを創製した。短縮型のジストロフィン遺伝子を含むＤｙｓＭ３からのＸｈｏＩ／Ｓａ／Ｉフラグメント（Ｋ．Ｙｕａｓａら、１９９８，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２５：３２９３３６；Ｄｒ．Ｔａｋｅｄａ，Ｊａｐａｎからの贈呈品）をｐＮＥＯｌａｃＺ内のＳａ／Ｉ部位に挿入して、ミニジストロフィン、ＬａｃＺおよびネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを作製した。トランスフェクションの前にＳａ／Ｉ消化によってプラスミドを線状化した。
【０１０６】
ＰＰ６細胞を、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して、ミニジストロフィン、ＬａｃＺおよびネオマイシン耐性遺伝子を含む線状プラスミド１０μｇでトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、個別のコロニーが出現するまで１０日間、細胞を３０００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で選択した。次に、コロニーを単離し、大量のトランスフェクト細胞を得るために増殖させて、その後ＬａｃＺの発現に関して試験した。これらのＰＰ６由来クローンの１つ、ｍｃ１３をさらなる試験のために使用した。
【０１０７】
免疫組織化学：ＰＰ６、ｍｃ１３およびマウス線維芽細胞を６穴培養皿に接種し、低温メタノールで１分間固定した。次に細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、室温にて１時間、５％ウマ血清でブロックした。一次抗体を以下のようにＰＢＳに希釈した：抗デスミン（１：１００，Ｓｉｇｍａ）、ビオチニル化抗マウスＣＤ３４（１：２００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＢｃｌ−２（１：５００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＭ−カドヘリン（１：５０、Ｄｒ．Ａ．Ｗｅｒｎｉｇからの贈呈品）、マウス抗マウスＭｙｏＤ（１：１００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウス抗ラットミオゲニン（１：１００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＦｌｋ−１（１：５０，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、およびビオチニル化Ｓｃａ−１（１：１００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。細胞を一次抗体と共に室温で一晩インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、適切なビオチニル化二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗い、Ｃｙ３蛍光色素と結合した１／３００ストレプトアビジンと共に室温で１時間インキュベートした。次に細胞を蛍光顕微鏡によって分析した。各々のマーカーについて、細胞の無作為に選択した１０の視野に関して染色細胞のパーセンテージを算定した。
【０１０８】
４週齢の正常マウス（Ｃ−５７ ＢＬ／６Ｊ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの筋試料の凍結切片を低温アセトンで２分間固定し、ＰＢＳに希釈した５％ウマ血清中で１時間プレインキュベートした。ＣＤ３４、Ｂｃｌ−２およびコラーゲンＩＶ型に関して、以下の一次抗体を使用した：ビオチン抗マウスＣＤ３４（ＰＢＳ中１：２００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＢｃｌ−２（１：１０００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびウサギ抗マウスコラーゲンＩＶ型（ＰＢＳ中１：１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。ジストロフィン染色のために、ヒツジ抗ヒトＤＹ１０抗体（ＰＢＳ中１：２５０希釈）を一次抗体として使用し、抗ヒツジビオチン（ＰＢＳ中１：２５０希釈）およびストレプトアビジン（ＰＢＳ中１：２５０希釈）を用いてシグナルを増幅した。
【０１０９】
ｒｈＢＭＰ−２での刺激、オステオカルシン染色およびアルカリホスファターゼアッセイ：細胞を、１２穴コラーゲン被覆フラスコにおいて１−２×１０４細胞／穴の密度で３穴ずつにプレートした。２００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）を増殖培地に添加することによって細胞を刺激した。最初のプレーティング後１、３および５日目に増殖培地を交換した。対照群の細胞は、ｒｈＢＭＰ−２を添加せずに並行して増殖させた。ｒｈＢＭＰ−２刺激を伴うまたはｒｈＢＭＰ−２刺激なしでの６日後に、マイクロサイトメーターを用いて細胞を計数し、オステオカルシンおよびアルカリホスファターゼ発現に関して分析した。オステオカルシン染色のために、細胞をヤギ抗マウスオステオカルシン抗体（ＰＢＳ中１：１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と共にインキュベートし、次いでＣｙ３蛍光色素と結合した抗ヤギ抗体と共にインキュベートした。アルカリホスファターゼ活性を測定するため、細胞溶解産物を調製し、ｐ−ニトロフェニルホスフェートからの無機リン酸の加水分解による試薬の色の変化を利用する市販のキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて分析した。生じた色の変化を分光光度計で測定し、データを、１０６細胞に基準化した国際単位ＡＬＰ活性／リットルとして表した。スチューデントｔ検定を用いて統計的有意性を解析した（ｐ＜０．０５）。
【０１１０】
筋形成および骨形成系統におけるｍｃ１３細胞のインビボでの分化−筋形成系統：ｍｃ１３細胞（５×１０５細胞）をｍｄｘマウスの後肢筋に筋肉内注射した。動物を注射後１５日目に犠死させ、注射した筋組織を凍結し、クリオスタット切片を作製して、ジストロフィン（上記参照）およびＬａｃＺ発現に関して検定した。ＬａｃＺ発現に関して試験するため、筋切片を１％グルタルアルデヒドで固定し、その後Ｘ−ｇａｌ基質（リン酸緩衝食塩水中の０．４ｍｇ／ｍｌ ５−ブロモクロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６および５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）と共に１−３時間インキュベートした。分析の前に切片をエオシンで対比染色した。並行実験では、ｍｃ１３細胞（５×１０５細胞）をｍｄｘマウスの尾静脈に静脈内注射した。動物を注射後７日目に犠死させ、後肢を単離して、上述したようにジストロフィンおよびβ−ガラクトシダーゼの存在に関して検定した。
【０１１１】
骨形成系統：アデノウイルスＢＭＰ−２プラスミド（ａｄＢＭＰ−２）を構築するため、ｒｈＢＭＰ−２コード配列をＢＭＰ−２−１２５プラスミド（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）から切り出し、ＨｕＣＭＶプロモーターを含む複製欠損（Ｅ１およびＥ３遺伝子が欠失している）アデノウイルスベクターにサブクローニングした。簡単に述べると、ＢＭＰ−２−１２５プラスミドをＳａ／Ｉで消化し、ｒｈＢＭＰ−２ ｃＤＮＡを含む１２３７塩基対フラグメントを生成した。次にｒｈＢＭＰ−２ ｃＤＮＡをｐＡｄ．ｌｏｘプラスミドのＳａ／Ｉ部位に挿入し、それにより遺伝子をＨｕＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。ｐｓｉ−５ウイルスＤＮＡとｐＡｄ．ｌｏｘのＣＲＥＷ細胞へのコトランスフェクションによって組換えアデノウイルスを得た。生じたａｄＢＭＰ−２プラスミドを、さらなる使用時まで−８０℃で保存した。
【０１１２】
ｍｃ１３細胞をトリプシン化し、感染の前にマイクロサイトメーターで計数した。ＨＢＳＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて細胞を数回洗浄した。５０感染多重度単位に等しいアデノウイルス粒子をＨＢＳＳに前混合し、その後細胞の上に層状に重ねた。細胞を３７℃で４時間インキュベートし、次に等量の増殖培地と共にインキュベートした。気密注射器の３０ゲージ針を使用して、露出させたＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の下腿三頭筋に０．５−１．０×１０６細胞の注射を実施した。１４−１５日目に、動物をメトキシフルランで麻酔し、頸部脱臼によって犠死させた。後肢をＸ線撮影によって分析した。その後、下腿三頭筋を単離し、リン酸緩衝食塩水で緩衝し、液体窒素中で予備冷却した２−メチルブタン中で瞬間凍結した。凍結試料を、クリオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ，ＨＭ ５０５ Ｅ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５×１０μｍ切片に切断し、さらなる分析のために−２０℃で保存した。
【０１１３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全ＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標） Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造者の指示に従って逆転写を実施した。簡単に述べると、ランダムヘキサマー１００ｎｇを７０℃で１０分間、全ＲＮＡ １μｇにアニーリングし、その後氷上で冷却した。１０ＸＰＣＲ緩衝液２μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ １１逆転写酵素２００Ｕで逆転写を実施した。反応混合物を４２℃で５０分間インキュベートした。
【０１１４】
標的のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を、逆転写酵素反応産物２μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１００μｌ（５Ｕ）および１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む反応混合物５０μｌ中で実施した。Ｏｌｉｇｏソフトウエアを用いてＣＤ３４ ＰＣＲプライマーを設計し、それらは以下の配列を有した：ＣＤ３４ ＵＰ：ＴＡＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＡＣ ＣＡ（配列番号１）；およびＣＤ３４ ＤＯＷＮ：ＧＴＧ ＧＴＣ ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＴＧ（配列番号２）。その他のプライマーは以前の試験に従って設計し（Ｊ．Ｒｏｈｗｅｄｅｌら、１９９５，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２２０：９２−１００；Ｄ．Ｄ．Ｃｏｍｅｌｉｓｏｎら、１９９７，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９１：２７０−２８３）、それらは以下の配列を有した：
【０１１５】
【化１】
以下のＰＣＲパラメータを使用した：１）９４℃、４５秒間；２）５０℃、６０秒間（ＣＤ３４）または６０℃、６０秒間（ミオゲニンおよびｃ−ｍｅｔ）；および３）７２℃、９０秒間を４０サイクル。ＰＣＲ産物を、アガロース−ＴＢＥ−臭化エチジウムゲルによって確認した。予想されたＰＣＲ産物の大きさは以下のとおりである：ＣＤ３４に関しては１４７ｂｐ；ミオゲニンに関しては８６ｂｐ；およびｃ−ｍｅｔに関しては３７０ｂｐ。ゲノムＤＮＡ汚染の可能性を排除するため、２つの対照反応を実施した：１）逆転写酵素の不在下での並行逆転写、および２）イントロンにまたがるプライマーセット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用したβ−アクチンの増幅。
【０１１６】
頭蓋欠損アッセイ：３匹の６−８週齢の雌性ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を対照群と実験群において使用した。動物をメトキシフルランで麻酔し、腹臥位で手術台上に置いた。１０番の刃を使用して、頭皮を切開して頭蓋を露出させ、骨膜を除去した。硬膜の貫通を最小限に抑えながら、歯科用バーを使用して約５ｍｍの全層円形頭蓋欠損を創造した。コラーゲン・スポンジ・マトリックス（Ｈｅｌｉｓｔａｔ（商標），Ｃｏｌｌａ−Ｔｅｃ，Ｉｎｃ．）に、ａｄＢＭＰ−２形質導入を伴ってまたは伴わずに、０．５−１．０×１０６ＭＤＣを接種し、頭蓋欠損内に置いた。４−０ナイロン縫合糸を用いて頭皮を閉じ、動物に給餌して、活動させた。１４日後、動物を犠死させ、頭蓋標本を観察して、その後顕微鏡で分析した。フォン・コッサ染色のために、頭蓋標本を４％ホルムアルデヒドに固定し、次に０．１Ｍ ＡｇＮＯ３溶液に１５分間浸けた。標本を少なくとも１５分間光に暴露し、ＰＢＳで洗浄して、その後観察のためにヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【０１１７】
Ｙ−プローブを使用したインサイチューハイブリダイゼーションにおける蛍光：凍結切片を３：１ メタノール／氷酢酸（ｖ：ｖ）に１０分間固定し、空気乾燥した。次に切片を２ＸＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、ｐＨ７．０中の７０％ホルムアミドにおいて７０℃で２分間変性した。その後、スライドガラスを各濃度で２分間の一連のエタノール洗浄（７０％、８０％および９５％）によって脱水した。Ｙ染色体特異的プローブ（Ｙ．Ｆａｎら、１９９６，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １９：８５３−８６０）を、ＢｉｏＮｉｃｋキット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して製造者の指示に従ってビオチニル化した。ビオチニル化したプローブを、次に、Ｇ−５０ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて精製し、５ｎｇ／ｍｌの超音波処理したニシン精子ＤＮＡと共に凍結乾燥した。ハイブリダイゼーションの前に、５０％ホルムアミド、１ＸＳＳＣおよび１０％硫酸デキストランを含む溶液にプローブを再懸濁した。７５℃で１０分間の変性後、プローブを変性切片上に置き、３７℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片を２ＸＳＳＣ溶液、ｐＨ７．０によって７２℃で５分間洗浄した。次に切片をＢＭＳ溶液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、ｐＨ８．０）中で洗浄した。ハイブリダイズしたプローブをフルオレセイン標識アビジン（ＯＮＣＯＲ，Ｉｎｃ）で検出した。核を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ）中１０ｎｇ／ｍｌの臭化エチジウムで対比染色した。
【０１１８】
ｍｃ１３細胞のマーカー分析：ｍｃ１３、ＰＰ６および線維芽細胞によって発現された生化学的マーカーを、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学を用いて分析した。表３（下記）は、ｍｃ１３細胞が、幹細胞様特性を有する造血細胞のマーカーとして最近同定された（Ｂ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、前出）、ヒトＫＤＲ遺伝子のマウスホモログであるＦｌｋ−１を発現したが、ＣＤ３４またはＣＤ４５を発現しなかったことを示す。しかし、本発明のＰＰ６ ＭＤＣに由来する他のクローン単離物は、ＣＤ３４ならびに他のＰＰ６細胞マーカーを発現した。ここで述べる手順が、ＰＰ６筋由来始原細胞集団をクローン化し、筋由来始原細胞に特徴的な細胞マーカーを発現するクローン単離物を得るために使用できることは当業者に認識される。そのようなクローン単離物は本発明の方法に従って使用できる。たとえばクローン単離物は、デスミン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２を含む始原細胞マーカーを発現する。好ましくは、クローン単離物はまた、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーを発現しない。
【０１１９】
【表３】
細胞を上述したように単離し、免疫組織化学分析によって検査した。「−」は、細胞の０％が発現を示したことを指示する；「＋」は、細胞の＞９８％が発現を示したことを指示する；「＋／−」は、細胞の４０−８０％が発現を示したことを指示する；「−／＋」は、細胞の５−３０％が発現を示したことを指示する；「ｎａ」は、データが入手できないことを指示する。
【０１２０】
ＣＤ３４＋およびＢｃｌ−２＋細胞のインビボでの局在化：インビボでのＣＤ３４＋およびＢｃｌ−２＋細胞の位置を同定するため、正常マウスの下腿三頭筋からの筋組織切片を、抗ＣＤ３４および抗Ｂｃｌ−２抗体を用いて染色した。ＣＤ３４陽性細胞は、デスミンに関しても陽性である（図１２Ｂ）筋由来細胞の小集団を構成した（図１２Ａ）。抗コラーゲンＩＶ型抗体とＣＤ３４＋・デスミン＋細胞の共染色は、それらを基底膜に局在化した（図１２Ｂおよび１２Ｄ）。図１２Ａ−Ｄにおいて矢じりで指示されるように、小さな血管もＣＤ３４およびコラーゲンＩＶ型に関して陽性であったが、核染色で共局在しなかった。血管内皮細胞によるＣＤ３４の発現が以前の試験で示された（Ｌ．Ｆｉｎａら、前出）。Ｂｃｌ−２＋・デスミン＋細胞が同様に同定され（図１２Ｅ−１２Ｈ）、基底膜内に局在化された（図１２Ｆおよび１２Ｈ）。衛星細胞の位置を同定するために切片をＭ−カドヘリンに関しても染色した（図１２Ｉ）。衛星細胞は、ＣＤ３４＋・デスミン＋細胞、またはＢｃｌ−２＋・デスミン＋細胞と同様の位置で同定された（矢印、図１２Ｉ）。しかし、Ｍ−カドヘリンとＣＤ３４またはＢｃｌ−２を共局在化する多数の試みは成功せず、Ｍ−カドヘリン発現細胞がＢｃｌ−２またはＣＤ３４を共発現しないことを示唆した。これは、ここで開示するように、高レベルのＣＤ３４およびＢｃｌ−２を発現するが、Ｍ−カドヘリンは極微のレベルでしか発現しないＰＰ６細胞と一致する。
【０１２１】
クローン化筋始原細胞の骨形成系統へのインビトロ分化：ｍｃ１３細胞を、ｒｈＢＭＰ−２での刺激によって骨形成分化能に関して評価した。細胞を６穴培養皿にプレートし、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下または不在下で集密まで増殖させた。３４日以内に、ｒｈＢＭＰ−２に暴露したｍｃ１３細胞は、ｒｈＢＭＰ−２不在下の細胞と比較して劇的な形態形成変化を示した。ｒｈＢＭＰ−２の不在下では、ｍｃ１３細胞は多核筋管に融合し始めた（図１３Ａ）。２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２に暴露したときは、しかし、細胞は単核のままであり、融合しなかった（図１３Ｂ）。細胞密度が＞９０％の集密度に達したとき、未処置培養物は融合して多数の筋管を形成したが（図１３Ｃ）、処置細胞は円形で肥大性になった（図１３Ｄ）。免疫組織化学を使用して、これらの肥大細胞をオステオカルシンの発現に関して分析した。オステオカルシンは、骨に沈着し、骨芽細胞によって特異的に発現されるマトリックスタンパク質である。未処置群と異なり、ｒｈＢＭＰ−２処置した肥大細胞はオステオカルシンの有意の発現を示し（図１３Ｅ）、それ故、ｍｃ１３細胞がｒｈＢＭＰ−２への暴露後に骨芽細胞に分化できることを示唆した。
【０１２２】
ｍｃ１３細胞を、次に、ｒｈＢＭＰ−２刺激後のデスミンの発現に関して分析した。新たに単離したｍｃ１３細胞は均一なデスミン染色を示した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。ｒｈＢＭＰ−２への暴露から６日以内に、ｍｃ１３細胞の３０〜４０％だけがデスミン染色を示した。ｒｈＢＭＰ−２刺激の不在下では、ｍｃ１３細胞の約９０〜１００％がデスミン染色を示した（図１４Ｃ）。この結果は、ｒｈＢＭＰ−２によるｍｃ１３細胞の刺激がこれらの細胞についての筋形成能の喪失を生じさせることを示唆する。
【０１２３】
さらに、ｍｃ１３細胞をｒｈＢＭＰ−２刺激後のアルカリホスファターゼの発現に関して分析した。アルカリホスファターゼは骨芽細胞分化についての生化学的マーカーとして使用されてきた（Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２７：１７５５−１７６６）。図１４Ｄに示すように、ｍｃ１３細胞のアルカリホスファターゼ発現はｒｈＢＭＰ−２に応答して６００倍以上上昇した。対照として使用したＰＰ１−４細胞は、ｒｈＢＭＰ−２に応答したアルカリホスファターゼ活性の上昇を示さなかった（図１４Ｄ）。合わせて考慮すると、これらのデータは、ＰＰ６クローン単離物、たとえばｍｃ１３細胞が、インビトロでｒｈＢＭＰ−２暴露に応答して筋形成マーカーを喪失し、骨形成系統を通して分化し得ることを明らかにする。
【０１２４】
ｍｃ１３細胞の筋形成および骨形成系統へのインビボでの分化：ｍｃ１３細胞がインビボで筋形成系統を通して分化できるかどうかを判定するため、細胞をｍｄｘマウスの後肢筋組織に注射した。動物を注射後１５日目に犠死させ、組織学的および免疫組織化学的分析のためにそれらの後肢を採取した。いくつかの筋線維は、注射部位の周囲の領域においてＬａｃＺおよびジストロフィン染色を示し（図１５Ａおよび１５Ｂ）、ｍｃ１３細胞がインビボで筋形成系統に分化することができ、ジストロフィー筋において筋再生を増強し、ジストロフィンを回復させ得ることを指示する。
【０１２５】
並行実験では、ｍｃ１３細胞をｍｄｘマウスの尾静脈に静脈内注射した。動物を注射後７日目に犠死させ、組織学的および免疫組織化学的分析のために後肢筋を採取した。いくつかの後肢筋細胞はＬａｃＺおよびジストロフィン染色を示し（図１５Ｃ、１５Ｄ：「＊」も参照のこと）、ｍｃ１３細胞がジストロフィン発現の救済のために標的組織に全身的に送達され得ることを示唆した。
【０１２６】
インビボでのｍｃ１３細胞の多能特性を試験するため、細胞をｒｈＢＭＰ−２をコードするアデノウイルスベクター（ａｄＢＭＰ−２）で形質導入した。ａｄＢＭＰ−２を有するｍｃ１３細胞を、次に、ＳＣＩＤマウスの後肢に注射した。動物を注射後１４日目に犠死させ、後肢を組織化学的および免疫化学的分析のために切除した。ａｄＢＭＰ−２で形質導入したｍｃ１３細胞の酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）分析は、感染細胞がｒｈＢＭＰ−２を産生できることを示した。注射したＳＣＩＤマウスの後肢のＸ線分析は、注射の１４日以内に堅固な異所性骨形成を明らかにした（図１５Ｅ）。異所性骨のＬａｃＺ染色を用いた組織学的分析は、ＬａｃＺ陽性ｍｃ１３細胞が、骨芽細胞および骨細胞が認められる典型的な位置である、石灰化マトリックスまたは小窩内に均一に位置したことを示す（図１５Ｆ）。
【０１２７】
異所性骨の形成におけるｍｃ１３の役割をさらに確認するため、筋切片をジストロフィンの存在に関しても染色した。図１５Ｇに示すように、異所性骨はジストロフィンに関して高度に陽性の細胞を含み、ｍｃ１３細胞が骨形成に密接に関与していることを示唆する。対照として、線維芽細胞に関して同様の実験を実施した。線維芽細胞は堅固な異所性骨形成を支持することが認められたが、注射した細胞は一様に骨の外側で認められ、いずれも石灰化マトリックス内に位置することができなかった。これは、線維芽細胞が、異所性骨を形成するようにｒｈＢＭＰ−２を送達することができるが、骨芽細胞に分化することはできないことを示唆する。この場合、異所性骨の石灰化に関与する細胞はおそらく宿主組織に由来すると考えられる。それ故、これらの結果は、ｍｃ１３細胞がインビボおよびインビトロの両方で骨芽細胞に分化できることを明らかにする。
【０１２８】
遺伝子操作された筋由来細胞による骨治癒の増強：骨格的に成熟した（６−８週齢）雌性ＳＣＩＤマウスにおいて上述したように歯科用バーを用いて頭蓋欠損（約５ｍｍ）を創造した。以前の実験は、５ｍｍの頭蓋欠損が「非治癒性（ｎｏｎ−ｈｅａｌｉｎｇ）」であることを明らかにした（Ｐ．Ｈ．Ｋｒｅｂｓｂａｃｈら、１９９８，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６６：１２７２−１２７８）。頭蓋欠損に、ａｄＢＭＰ−２で形質導入したｍｃ１３細胞または形質導入していないｍｃ１３細胞を接種したコラーゲン・スポンジ・マトリックスを充填した。これらのマウスを１４日目に犠死させ、頭蓋欠損の治癒を分析した。図１６Ａに示すように、ｒｈＢＭＰ−２なしのｍｃ１３細胞で処置した対照群は欠損の治癒の証拠を示さなかった。これに対し、ｒｈＢＭＰ−２を発現するように形質導入したｍｃ１３細胞で処置した実験群は、２週間目に頭蓋欠損のほとんど完全な閉鎖を示した（図１６Ｂ）。石灰化した骨を強調するフォン・コッサ染色は、ｒｈＢＭＰ−２を発現するように形質導入したｍｃ１３細胞で処置した群において堅固な骨形成を示したが（図１６Ｄ）、対照群では極微の骨形成しか認められなかった（図１６Ｃ）。
【０１２９】
実験群における新しい骨の領域を、移植した細胞を同定するためにＹ染色体特異的プローブとの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって分析した。図１６Ｅに示すように、Ｙ染色体陽性細胞が新たに形成された骨内で同定され、ｒｈＢＭＰ−２の影響下での移植細胞の骨形成への能動的な関与を指示した。Ｙ染色体陰性細胞も新たに形成された頭蓋内で同定され、それ故宿主由来細胞の能動的な関与も指示した。これらの結果は、ｍｃ１３細胞がｒｈＢＭＰ−２での刺激後に「非治癒性」骨欠損の治癒を媒介し得ることを明らかにし、本発明のＭＤＣが骨欠損、損傷または外傷の治療において使用できることを指示する。
【０１３０】
（実施例１０）
緩慢接着ヒトＭＤＣは性質としてより筋形成性であり、誘発性心筋梗塞を有するマウスにおいて左心室機能を改善する。
【０１３１】
急速および緩慢接着ＭＤＣの集団を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ（ＣＯＲＥ）から入手した３名の男性と３名の女性ドナー（１３歳の男性、５７歳の男性、７０歳の男性、３２歳の女性、５９歳の女性、６４歳の女性）の直筋から単離した。１４の試料についての生検の大きさは４２−２４７ｍｇの範囲であった。平均の大きさは１２９ｍｇであった。５７歳の男性ドナーから単離した急速および緩慢接着ＭＤＣを心臓内注射のために使用した。
【０１３２】
骨格筋生検組織を直ちに低温溶液（硫酸ゲンタマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）を添加したＨｙｐｏ Ｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（ＢｉｏＬｉｆｅ））に入れ、４℃で保存する。３−７日後、生検組織を保存から取り出し、生産を開始させる。結合組織または非筋組織を生検試料から切除する。単離のために使用する残存筋組織を計量する。組織をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で細かく切り刻み、円錐管に移して、遠心分離する（２，５００×ｇ、５分間）。次にペレットを消化酵素溶液（Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ４（０．４−１．０Ｕ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）に再懸濁する。生検試料１００ｍｇにつき消化酵素溶液２ｍＬを使用して、回転板上で３７℃にて３０分間インキュベートする。その後試料を遠心分離する（２，５００×ｇ、５分間）。ペレットを培地に再懸濁し、７０μｍのセルストレーナーに通す。この実施例で述べる手順のために使用する培地は、以下の成分を添加したＣａｍｂｒｅｘ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＥＧＭ−２基本培地であった：ｉ．１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、およびｉｉ．インスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、ヘパリンおよびアスコルビン酸を含む、Ｃａｍｂｒｅｘ ＥＧＭ−２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ Ｋｉｔ。次に、ろ過した細胞溶液をＴ２５培養フラスコに移し、５％ＣＯ２中３７℃で３０−１２０分間インキュベートする。このフラスコに付着する細胞が「急速接着細胞」である。
【０１３３】
インキュベーション後、Ｔ２５フラスコから細胞培養上清を取り、１５ｍＬ円錐管に入れる。Ｔ２５培養フラスコを温めた培地２ｍＬで洗浄し、前記１５ｍＬ円錐管に移す。１５ｍＬ円錐管を遠心分離する（２，５００×ｇ、５分間）。ペレットを培地に再懸濁し、新しいＴ２５培養フラスコに移す。フラスコを５％ＣＯ２中３７℃で〜２日間インキュベートする（このフラスコに付着する細胞が「緩慢接着細胞」である）。インキュベーション後、細胞培養上清を吸引し、新しい培地をフラスコに添加する。その後フラスコを増殖のためにインキュベーターに戻す。このあと、培養フラスコ中の細胞集密度を５０％未満に維持するように標準培養継代を実施する。継代の間にフラスコから接着細胞を分離するためにトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する。「緩慢接着細胞」の典型的な増殖は、３，７００万細胞の平均総生細胞数を達成するために平均１７日間（生産を開始させる日から出発して）を要する（ｎ＝１４の生産を１４の異なる生検試料から実施し、生検重量は４２−２４７ｍｇの範囲であり、平均１２９ｍｇである）。
【０１３４】
ひとたび所望細胞数が達成されれば、トリプシン−ＥＤＴＡを使用してフラスコから細胞を採取し、遠心分離する（２，５００×ｇ、５分間）。ペレットをＢＳＳ−Ｐ溶液（ヒト血清アルブミン（２％ｖ／ｖ、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ）を添加したＨＢＳＳ）に再懸濁し、計数する。次に細胞溶液を再び遠心分離し（２，５００×ｇ、５分間）、低温保存溶液（ヒト血清アルブミン（２％ｖ／ｖ、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ）を添加したＣｒｙｏＳｔｏｒ（Ｂｉｏｌｉｆｅ））で所望細胞濃度に再懸濁して、極低温保存のために適切なバイアルにパッケージする。クライオバイアルを冷凍容器に入れ、−８０℃の冷凍庫内に置く。凍結細胞懸濁液を室温で解凍して細胞を等量の生理食塩水と共に投与し、直接注射する（追加操作なしで）ことによって細胞を投与する。緩慢接着細胞集団（ｎ＝７生検）の系統特性決定は以下を示す：筋形成（８７．４％ＣＤ５６＋、８９．２％デスミン＋）、内皮（０．０％ＣＤ３１＋）、造血（０．３％ＣＤ４５＋）、および線維芽細胞（６．８％ＣＤ９０＋／ＣＤ５６−）。
【０１３５】
骨格筋生検組織の解離後、細胞の２つの分画を培養フラスコへのそれらの急速または緩慢接着に基づいて収集した。次に細胞を増殖培地での培養で増殖させ、その後１．５ｍｌエッペンドルフ管の低温保存溶液中で凍結した（１５μ中３×１０５細胞）。対照群については、低温保存溶液１５μｌだけを管に入れた。これらの管を注射時まで−８０℃で保存した。注射の直前に、管を保存から取り出し、室温で解凍して、０．９％塩化ナトリウム溶液１５μｌで再懸濁した。生じた３０μｌ溶液を、次に、３０ゲージ針を用いて０．５ｃｃインスリンシリンジに導入した。手術および注射を実施する試験者には管の内容物がわからないようにした。
【０１３６】
細胞数および生存能を、ＧｕａｖａフローサイトメーターおよびＶｉａｃｏｕｎｔアッセイキット（Ｇｕａｖａ）を用いて測定した。ＣＤ５６は、ＰＥ結合抗ＣＤ５６抗体（１：５０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＰＥ結合アイソタイプ対照モノクローナル抗体（１：５０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。デスミンは、モノクローナルデスミン抗体（１：１００、Ｄａｋｏ）およびアイソタイプ対照モノクローナル抗体（１：２００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してパラホルムアルデヒド固定細胞（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に関するフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。Ｃｙ３結合抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０、Ｓｉｇｍａ）を用いて蛍光標識化を実施した。各工程の間に、細胞を透過性上昇緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で洗浄した。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アッセイのために、各穴につき１×１０５細胞を１２穴プレートの分化誘導培地に接種した。４−６日後、細胞をトリプシン処理によって採取し、遠心分離にかけてペレットにした。細胞溶解産物上清を、ＣＫ Ｌｉｑｕｉ−ＵＶキット（Ｓｔａｎｂｉｏ）を用いてＣＫ活性に関して検定した。
【０１３７】
ヒト細胞の異種移植に関連する免疫拒絶反応を回避するために、細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの心臓に注射した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈは、この試験において実施される動物および手術手順を承認した（プロトコール３７／０４）。２２週齢のＮＯＤ．ＣＢ１７ ｐｒｋｄｃ重症複合型免疫不全（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）をこの試験で使用した。マウスをイソフルランと酸素の気体混合物で麻酔し、挿管した。手術中、人工呼吸器で陽圧換気を維持した。正常に位置する左心耳の先端から２ｍｍの左冠動脈前下行枝の結紮によって急性心筋梗塞を誘導した。結紮後直ちに、調製した溶液を梗塞に隣接する収縮壁の前面と側面および梗塞の中心部に注射した（各領域につき１０μｌ）。
【０１３８】
移植の２週間後と６週間後に、左心室機能を評価するために心エコー検査を実施した。心エコー検査は、１３−Ｍｈｚリニアアレイ変換器（１５Ｌ８）を備えたＳｅｑｕｏｉａ Ｃ２５６システム（Ａｃｕｓｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて盲検化された試験者によって実施された。マウスをイソフルランガスで麻酔し（１分間の誘導のために３％イソフルランおよび維持のために１．５０％イソフルラン）、背臥位で拘束した。収縮末期面積（ＥＳＡ）と拡張末期面積（ＥＤＡ）の両方を左心室の短軸像から測定した。ＬＶ収縮性の指標である左室内腔面積変化率（ＦＡＣ）を、ＦＡＣ（％）＝［（ＥＤＡ−ＥＳＡ）／ＥＤＡ］×１００として算定した。
【０１３９】
データを平均±ＳＥとして提示する。心機能データにおける統計的有意差は二方向ＡＮＯＶＡによって決定した。Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定でポストホック解析を実施した。
【０１４０】
急速および緩慢接着ＭＤＣの筋形成特性決定
６名の異なるドナー（男性３名と女性３名）の組織から単離した細胞において、我々は、急速接着ＭＤＣの集団が、緩慢接着ＭＤＣの集団（平均７１．０％）と比較したとき、より低いレベルの筋形成マーカーＣＤ５６発現を示す（６集団すべての平均、４９．５％）ことを認めた（図１７）。各群について同数の細胞を、筋形成分化を誘導する条件に供したとき、急速接着ＭＤＣ（平均６９Ｕ／Ｌ）は緩慢接着ＭＤＣ（平均１４２Ｕ／Ｌ）よりも低いクレアチンキナーゼ活性レベルを示し（図１７）、緩慢接着細胞が急速接着細胞よりも多量の筋を生産できることを指示した。合わせて考慮すると、これらの結果は、緩慢接着ＭＤＣの集団が、急速接着ＭＤＣの集団と比較したとき、より筋形成性であり（ＣＤ５６含量）、筋生成に関してより強力である（ＣＫ活性）ことを示唆する（図１７）。
【０１４１】
注射用にパッケージし、凍結した細胞の解凍後特性決定
我々は、心臓内注射用にパッケージし、凍結したＭＤＣ（５７歳の男性ドナーから単離した）の解凍後試料を分析した。どちらの細胞集団も解凍直後には等しく高い割合の生存能を有しており（９２％）、両集団の細胞の非常に高いパーセンテージが注射の時点で生存可能であることを指示した（表１）。筋形成マーカーＣＤ５６を発現した細胞の割合は、表４に示すように、急速接着ＭＤＣと緩慢接着ＭＤＣについてそれぞれ４３．８％と８５．１％であった。
【０１４２】
【表４】
同様の傾向が、急速（６２．５％）および緩慢接着ＭＤＣ（９３．６％）についての筋形成マーカー、デスミンの発現レベルにおいて認められた。解凍後にＣＫ活性によって測定した細胞の筋形成能は、急速および緩慢接着細胞についてそれぞれ８２および１８１Ｕ／Ｌであった。これら２つの集団の間での筋形成含量（ＣＤ５６およびデスミン）および筋形成分化（ＣＫ）の差は、心臓内注射のために使用された細胞が、典型的にはドナー骨格筋から単離される急速および緩慢接着細胞の代表集団であることを指示する（図１７参照）。
【０１４３】
心機能
２つの理由から、５７歳の男性から単離したＭＤＣを心臓内注射のために使用した。第一に、このドナーからの急速および緩慢接着細胞集団は、表５および図１７に示すようにその他のドナーから単離した細胞を代表する筋形成特性を示した。
【０１４４】
【表５】
第二に、ドナーの筋生検の年齢および性別がそのような治療を必要とする標的集団と適合性であると思われる。
【０１４５】
対照群と比較したとき、急速または緩慢接着細胞を注射した心臓は、図１８に示すように心筋梗塞後２週間目で早くも、ＦＡＣによって測定したとき、ＬＶ収縮性の改善を示した。また、表５に示す結果は、それぞれ２３．０％および６９．７％の上昇を明らかにする。６週間目まで、ＬＶ収縮性レベルはどちらの細胞群においても安定なままであったが、対照群では小さな低下が認められ、表５および図１８に示すように、対照溶液を注射した心臓と比較したとき急速および緩慢接着細胞を注射した心臓に関してそれぞれ４５．２％および１１８．９％のＬＶ収縮性のさらに一層大きな改善を生じさせた。対照群と比べての有意差は、緩慢接着ＭＤＣ群においてのみ達成された（図１８；＊Ｐ＜０．０５、緩慢接着ＭＤＣ対対照）。加えて、緩慢接着ＭＤＣを注射した心臓は、急速接着細胞を注射した心臓を上回るＬＶ収縮性を明らかにし（図１８；†Ｐ＜０．０５、緩慢接着細胞（ＭＤＣ）対急速接着細胞）、心筋梗塞修復に関して緩慢接着細胞が急速接着細胞よりも優れていることを示唆した。
【０１４６】
我々は、ヒト骨格筋生検組織の解離後、培養フラスコへのそれらの急速または緩慢接着に基づいて細胞の２つの分画を単離した。培養フラスコに緩慢に接着した細胞の集団は、急速に接着した細胞の集団と比較したとき、より高い筋形成含量とより大きな筋形成効率／効力によって特徴づけられる。心筋梗塞修復に関して、細胞のいずれかの分画を注射した心臓は、対照を注射した心臓と比較したとき機能的改善を提供した。しかし、緩慢接着細胞は、急速接着細胞と比較したとき心筋梗塞後のより優れた機能回復を提供した。
【０１４７】
本明細書において引用するすべての特許出願、特許、テキストおよび文献参照、本発明が属する技術分野の技術水準をより詳細に説明するためにそれらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０１４８】
様々な変更が、上述したような本発明の範囲と精神から逸脱することなく上記方法および組成物において実施され得るので、付属の図面で示す、または付属の特許請求の範囲で定義される、上記説明に含まれるすべての対象物は、例示と解釈され、限定的な意味ではないことが意図されている。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図５Ｉ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１１Ｉ】
【図１１Ｊ】
【図１１Ｋ】
【図１１Ｌ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１２Ｇ】
【図１２Ｈ】
【図１２Ｉ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋由来始原細胞（ＭＤＣ）および体組織、特に心筋のような軟組織の増加におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、軟組織および骨への導入後長期的な生存を示す筋由来始原細胞、ＭＤＣを単離する方法、および上皮、脂肪、神経、器官、筋肉、靱帯および軟骨組織を含む、ヒトまたは動物の軟組織および骨の増加のためにＭＤＣ含有組成物を使用する方法に関する。本発明はまた、心不全および心筋梗塞に関連する損傷または脱力のような機能的状態の治療のための筋由来始原細胞の新規使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シリコーンまたはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のような合成材料を用いた軟組織の増加は当技術分野において周知である。Ａｒｎｅｔｔへの特許文献１は、顔面形成外科用のシリコーンインプラントの使用を開示する。しかし、そのような合成材料は宿主組織にとって異質であり、インプラントの被包および周辺組織の瘢痕化を生じさせる免疫応答を引き起こす。それ故、インプラントは付加的な機能的または審美的問題をもたらし得る。
【０００３】
コラーゲンまたはヒアルロン酸のような生体高分子を用いた軟組織増加も記述されている。たとえばＷａｌｌａｃｅらへの特許文献２は、コラーゲンインプラント材料を用いて軟組織を増加させる方法を開示する。加えて、ｄｅｌｌａ Ｖａｌｌｅらへの特許文献３は、美容外科において使用できるヒアルロン酸のエステルを開示する。しかし、これらの生体高分子もまた宿主組織にとって異質であり、注入材料の再吸収を生じさせる免疫応答を引き起こす。生体高分子は、それ故、長期的な組織増加を提供することができない。全体として、生体高分子または合成材料の使用は、軟組織を増加させるという目的には全く満足のいかないものであった。
【０００４】
細胞に基づく組成物を使用した軟組織増加も開発された。Ｂｏｓｓ，Ｊｒ．への特許文献４は、美容的および審美的皮膚欠陥の治療のための自己皮膚線維芽細胞の使用を開示する。この治療は、合成材料または生体高分子の移植または注入に固有の問題を回避するが、他の合併症を生じさせる。線維芽細胞はコラーゲンを産生するので、細胞は、移植部位の周囲の組織の硬化および変形を引き起こし得る。
【０００５】
注入用増量剤としての自己脂肪細胞の使用も記述されている（総説については、Ｋ．Ｍａｋら、１９９４，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．２７：２１１−２２；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ：Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｆａｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ａｄ ｈｏｃ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｎｅｗ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，１９８７，Ｃｈｉｃａｇｏ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ；Ａ．Ｃｈａｉｃｈｉｒら、１９８９，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８４：９２１−９３５；Ｒ．Ａ．Ｅｒｓｅｋ，１９９１，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８７：２１９−２２８；Ｈ．Ｗ．Ｈｏｒｌら、１９９１，Ａｎｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．２６：２４８−２５８；Ａ．Ｎｇｕｙｅｎら、１９９０，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８５：３７８−３８９；Ｊ．Ｓａｒｔｙｎｓｋｉら、１９９０，Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．１０２：３１４−３２１参照）。しかし、注入された脂肪は宿主に再吸収されるので、脂肪移植処置は一時的な増量しか提供しない。加えて、脂肪移植は結節形成および組織非対称を生じさせ得る。
【０００６】
筋繊維の前駆体である筋芽細胞は、融合して有糸分裂後の多核筋管を形成する単核筋細胞であり、生物活性タンパク質の長期的発現と送達を提供することができる（Ｔ．Ａ．ＰａｒｔｒｉｄｇｅとＫ．Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ，１９９５，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１：１２３−１３７；Ｊ．Ｄｈａｗａｎら、１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１５０９−１２；Ａ．Ｄ．Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，１９９４，Ｍｙｏｌｏｇｙ Ｅｄ ２，Ａ．Ｇ．ＥｎｇｅｌとＣ．Ｆ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，３０３−３０４；Ｓ．ＪｉａｏとＪ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，１９９２，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７５：１４３−７；Ｈ．Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ，１９９６，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：２１９５−２２００）。
【０００７】
培養した筋芽細胞は、幹細胞の自己更新特性の一部を示す細胞の亜集団を含む（Ａ．Ｂａｒｏｆｆｉｏら、１９９６，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６０：４７−５７）。そのような細胞は融合して筋管を形成することができず、別途に培養しない限り分裂しない（Ａ．Ｂａｒｏｆｆｉｏら、前出）。筋芽細胞移植の試験（以下参照）は、移植された細胞の大部分は速やかに死滅するが、少数は生存し、新たな筋形成を媒介することを示した（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｍｐら、１９９９，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４４：１１１３−１１２２）。この少数の細胞は、組織培養での緩やかな増殖と移植後の迅速な増殖を含む独特の挙動を示し、これらの細胞が筋芽幹細胞であり得ることを示唆する（Ｊ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａｍｐら、前出）。
【０００８】
筋芽細胞は、様々な筋関連および非筋関連疾患の治療における遺伝子療法のためのビヒクルとして使用されてきた。たとえば遺伝的に修飾されたまたは修飾されていない筋芽細胞の移植は、デュシェーヌ筋ジストロフィーの治療のために使用されてきた（Ｅ．Ｇｕｓｓｏｎｉら、１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，３５６：４３５−８；Ｊ．Ｈｕａｒｄら、１９９２，Ｍｕｓｃｌｅ ＆ Ｎｅｒｖｅ，１５：５５０−６０；Ｇ．Ｋａｒｐａｔｉら、１９９３，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３４：８−１７；Ｊ．Ｐ．Ｔｒｅｍｂｌａｙら、１９９３，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２：９９−１１２；Ｐ．Ａ．Ｍｏｉｓｓｅｔら、１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４７：９４−９；Ｐ．Ａ．Ｍｏｉｓｓｅｔら、１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１３４０−４６）。加えて、筋芽細胞は、１型糖尿病の治療のためのプロインスリン（Ｌ．Ｇｒｏｓら、１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１０：１２０７−１７）；血友病Ｂの治療のための第ＩＸ因子（Ｍ．Ｒｏｍａｎら、１９９２，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１８：２４７−５８；Ｓ．Ｎ．Ｙａｏら、１９９４，Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１：９９−１０７；Ｊ．Ｍ．Ｗａｎｇら、１９９７，Ｂｌｏｏｄ ９０：１０７５−８２；Ｇ．Ｈｏｒｔｅｌａｎｏら、１９９９，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０：１２８１−８）；アデノシンデアミナーゼ欠損症候群の治療のためのアデノシンデアミナーゼ（Ｃ．Ｍ．Ｌｙｎｃｈら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１１３８−４２）；慢性貧血の治療のためのエリトロポエチン（Ｅ．Ｒｅｇｕｌｉｅｒら、１９９８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１０１４−２２；Ｂ．Ｄａｌｌｅら、１９９９，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１５７−６１）、および成長遅滞の治療のためのヒト成長ホルモン（Ｋ．Ａｎｗｅｒら、１９９８，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．９：６５９−７０）を生産するために遺伝子操作されてきた。
【０００９】
筋芽細胞はまた、Ｌａｗらへの特許文献５、Ｂｌａｕらへの特許文献６、およびＣｈａｎｃｅｌｌｏｒらによる１９９９年４月３０日出願の米国特許出願第０９／３０２，８９６号に開示されているように、筋組織の損傷または疾患を治療するためにも使用されてきた。加えて、筋芽細胞移植は心筋梗塞の修復のために用いられてきた（Ｃ．Ｅ．Ｍｕｒｒｙら、１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２５１２−２３；Ｂ．Ｚ．Ａｔｋｉｎｓら、１９９９，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６７：１２４−１２９；Ｂ．Ｚ．Ａｔｋｉｎｓら、１９９９，Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１８：１１７３−８０）。
【００１０】
上記にもかかわらず、ほとんどの症例で、一次筋芽細胞由来治療は、遊走および／または食作用に起因する移植後の細胞の低い生存率に結び付いてきた。この問題を回避するため、Ａｔａｌａへの特許文献７は、アルギネートのような液体ポリマーに懸濁した筋芽細胞の使用を開示している。ポリマー溶液は、筋芽細胞が注入後に移動するおよび／または食作用を受けることを防ぐための基質として働く。しかし、ポリマー溶液は、上記で論じた生体高分子と同じ問題を提起する。さらに、特許文献７は筋組織だけにおける筋芽細胞の使用に限定され、他の組織は取り上げられていない。
【００１１】
それ故、長期間持続性で、広い範囲の宿主組織と適合性であり、移植部位の周囲の組織の炎症、瘢痕化および／または硬化を最小限に抑える、他の異なる軟組織増加材料が求められている。従って、本発明の筋由来始原細胞含有組成物は、軟組織を増加させるための改善された新規材料として提供される。さらに、移植後に長期的な生存を示す筋由来始原細胞を生成する方法、および、たとえば皮膚症状または損傷、および筋力の低下、筋の損傷、疾患または機能不全を含む、様々な審美的および／または機能的欠陥を治療するためにＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を使用する方法が提供される。
【００１２】
非筋肉軟組織増量のために筋芽細胞を使用するこれまでの試みが不成功に終わっていることに注目すべきである（Ａｔａｌａへの特許文献７）。それ故、ここで開示する所見は、本発明に従った筋由来始原細胞が上皮組織を含む非筋および筋軟組織に成功裏に移植され、長期的な生存を示し得ることを明らかにするので、予想外である。その結果、ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、筋または非筋軟組織増加のため、ならびに骨生産のための一般的増量材料として使用できる。さらに、本発明の筋由来始原細胞および組成物は自己ソースに由来し得るので、増量材料の再吸収、および移植部位の周囲の組織の炎症および／または瘢痕化を含む、宿主における免疫学的合併症の危険性が低い。
【００１３】
間葉幹細胞は、筋肉、骨、軟骨等を含む身体の様々な結合組織において認められ得るが（Ｈ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇら、１９９３，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２９Ａ：７２３−７３６；Ｈ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇら、１９９５，Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍ．２０２：１３７−１４４）、間葉という用語は、歴史的には、筋肉からではなく骨髄から精製された幹細胞のクラスを表すために使用されてきた。それ故、間葉幹細胞は本発明の筋由来始原細胞とは区別される。さらに、間葉細胞は、ここで述べる筋由来始原細胞によって発現される、ＣＤ３４細胞マーカーを発現しない（Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１４３−１４７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，８７６，４４７号明細書
【特許文献２】米国特許第４，４２４，２０８号明細書
【特許文献３】米国特許第４，９６５，３５３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８５８，３９０号明細書
【特許文献５】米国特許第５，１３０，１４１号明細書
【特許文献６】米国特許第５，５３８，７２２号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６６７，７７８号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
要旨
移植後に長期的な生存を示す新規な筋由来始原細胞（ＭＤＣ）およびＭＤＣ組成物を提供することが本発明の１つの目的である。本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、デスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２のような始原細胞マーカーを発現する初期前駆筋細胞、すなわち筋由来幹細胞を含む。加えて、これらの初期前駆筋細胞は、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦおよびｃ−ｍｅｔ細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーを発現しない。
【００１６】
出発筋細胞集団から筋由来始原細胞を単離し、冨化するための方法を提供することが本発明のもう１つの目的である。これらの方法は、軟組織の部位への移植または導入後に長期的な生存能を有するＭＤＣの冨化を生じさせる。本発明に従ったＭＤＣ集団は、特に、デスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２のような始原細胞マーカーを発現する細胞に富む。このＭＤＣ集団はまた、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦおよびｃ−ｍｅｔ細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーを発現しない。
【００１７】
移植のためのポリマー担体または特殊な培養培地を必要とせずに、皮膚、血管、脂肪、神経、骨格筋、平滑筋、靭帯、軟骨および様々な器官組織を含む筋軟組織または非筋軟組織の増加のために、ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を使用する方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。そのような方法は、軟組織への導入による、たとえば組織への直接注入または組成物の全身分布による、ＭＤＣ組成物の投与を含む。好ましくは、軟組織は非骨体組織を含む。より好ましくは、軟組織は、非横紋筋、非骨体組織を含む。最も好ましくは、軟組織は非筋・非骨体組織を含む。ここで使用するとき、増加とは、体組織の大きさまたは質量を補填する、膨張させる、支持する、増大する、拡大するまたは増加させることを指す。
【００１８】
ａ）美容的または審美的症状：ｂ）胃食道逆流症状および状態；ｃ）便失禁および尿失禁；ｄ）骨格筋および平滑筋の筋力低下、損傷、疾患または機能不全およびｅ）心筋梗塞を含む心臓状態のために、ＭＤＣに基づく治療を提供することが本発明のもう１つの目的である。
【００１９】
傷害、創傷、手術、外傷、非外傷、もしくは皮膚または内部軟組織または器官に裂、孔、陥凹、創傷等を生じさせる他の行為後に、骨または、筋由来軟組織または非筋由来軟組織にかかわらず、軟組織を増加させる方法を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【００２０】
化学物質、増殖培地および／または遺伝子操作の使用を通して改変されたＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を提供することが本発明のさらなる目的である。そのようなＭＤＣおよびその組成物は、生物学的化合物の生産と送達、および様々な疾患、症状、傷害または疾病のために有用な化学的または遺伝的に修飾された細胞を含む。
【００２１】
ＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物を含む医薬組成物を提供することが本発明のさらにもう１つの実施形態である。これらの医薬組成物は単離されたＭＤＣを含む。これらのＭＤＣは、その後、単離後の細胞培養によって増殖され得る。これらのＭＤＣは、その医薬組成物を必要とする被験体への送達の前に凍結される。
【００２２】
１つの実施形態では、ＭＤＣおよびその組成物が心臓状態を治療するために使用されるとき、それらは心臓に直接注射される。それらは、心房内または心臓壁に注射され得る。
【００２３】
本発明はまた、単一平板手法（ｓｉｎｇｌｅ ｐｌａｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いたＭＤＣの単離を含む組成物および方法を提供する。ＭＤＣは骨格筋の生検から単離される。１つの実施形態では、生検からの骨格筋は１〜３０日間保存され得る。この実施形態の１つの態様では、生検からの骨格筋は４℃で保存される。細胞を細かく刻み、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、別の酵素または酵素の組合せを用いて消化する。細胞から酵素を洗浄した後、細胞をフラスコ内の培地で約３０〜約１２０分間培養する。この期間中、「急速接着細胞」はフラスコまたは容器の壁に付着し、一方「緩慢接着細胞」またはＭＤＣは懸濁液中に残存する。「緩慢接着細胞」を２番目のフラスコまたは容器に移し、１〜３日間その中で培養する。この２番目の期間中に、「緩慢接着細胞」またはＭＤＣは２番目のフラスコまたは容器の壁に付着する。
【００２４】
本発明のもう１つの実施形態では、これらのＭＤＣはいかなる細胞数にも増殖する。この実施形態の好ましい態様では、細胞を約１０〜２０日間新しい培地で増殖させる。より好ましくは細胞を１７日間増殖させる。
【００２５】
増殖したまたは増殖していないＭＤＣは、輸送するためまたは使用までの期間中貯蔵するために保存され得る。１つの実施形態では、ＭＤＣを凍結する。好ましくは、ＭＤＣを約−２０℃から−９０℃で凍結する。より好ましくは、ＭＤＣを約−８０℃で凍結する。これらの凍結ＭＤＣは医薬組成物として使用される。
【００２６】
医薬組成物として凍結または保存された、または新鮮使用されるＭＤＣは、多くの心臓状態を治療するために使用され得る。これらの症状は、心筋梗塞、心不全、アダムズ‐ストークス病、先天性心疾患、狭心症、不整脈、心房細動、細菌性心内膜炎、心筋症、うっ血性心不全、拡張機能障害、心雑音および心室期外収縮（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）を含む。ＭＤＣは何らかの心臓病変によって引き起こされる心臓欠陥を治癒するためまたは心機能を改善するために使用され得る。１つの実施形態では、ＭＤＣは心臓に直接投与される。
【００２７】
好ましくは、ＭＤＣは心筋梗塞（ＭＩ）を治療するために使用される。１つの実施形態では、この治療は、ＭＩ患者から採集した骨格筋からＭＤＣを単離し、患者自身のＭＤＣを患者の心臓に投与して戻すことによって実施される。この治療は患者の心臓の機能を高め、ＭＩ後に起こる有害な心臓リモデリングおよび瘢痕化（を回避する、予防する等が続くと思われます）。
【００２８】
本発明によって提供されるさらなる目的および利点は、以下の詳細な説明と実施例から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
付属の図面は、本発明をさらに説明し、その様々な態様の明瞭化を通してその理解を助けるために提示されるものである。
【図１】図１Ａ−１Ｆは、従来のウシコラーゲンの注射と比較した、ＭＤＣ組成物の注射を使用した軟組織増加の結果を示す。図１Ａ−１Ｆに関して、ＭＤＣ（図１Ｄ−１Ｆ）またはコラーゲン（１Ａ−１Ｃ）のいずれかを腹壁の皮膚に注射した。注射の領域は、真皮と、皮膚である皮下結合組織の界面であった。図１Ａ−１Ｆは、コラーゲンまたはＭＤＣの皮膚への注射後の、４０Ｘ倍率でのトリクローム染色を示す。注射後５日目、２週間目または４週間目に、組織試料を採取し、分析用に調製した。図１Ａおよび１Ｄは、注射後５日目の、皮膚へのＭＤＣ注射とコラーゲン注射の結果を示す；図１Ｂおよび１Ｅは、注射後２週間目の結果を示す；および図１Ｃおよび１Ｆは、注射後４週間目の結果を示す。図１Ｄ−１Ｆにおける矢印は、注射領域（濃い桃色）におけるＭＤＣの存在を指示する。図１Ａ−１Ｆは、皮下腔への注射後、ＭＤＣは少なくとも４週間まで存在し、腹壁皮下組織を維持／増加させたが、コラーゲンは皮膚への注射後２週間まで存続しなかったことを明らかにする。（実施例３）。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＭＤＣ組成物の注射を使用した下部食道括約筋（図２Ａ）および肛門括約筋（図２Ｂ）軟組織増加の結果を示す。注射は、胃食道接合部または肛門括約筋に対して実施した。注射後３日目に、組織試料を採取し、分析用に調製した。ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図２Ａは、注射した組織を１００Ｘ倍率で示す；図２Ｂは、注射した組織を４０Ｘ倍率で示す。図２Ａおよび２Ｂは、ＭＤＣ注射が、注射後３日間まで下部食道括約筋および肛門括約筋軟組織増加を維持したことを明らかにする。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ＭＤＣ組成物の注射を使用した膀胱尿管接合部軟組織増加の結果を示す。注射は膀胱尿管接合部に実施した。注射後３日目に、組織試料を採取し、分析用に調製した。ＭＤＣは、矢印の近くで見られるようにβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図３Ａは、注射した組織を低（４０Ｘ）倍率で示す；図３Ｂは、注射した組織を高（１００Ｘ）倍率で示す。図３Ａおよび３Ｂは、ＭＤＣ注射が、注射後３日目まで膀胱尿管接合部軟組織増加を維持したことを明らかにする。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、ＭＤＣ組成物の軟組織注射を使用した膀胱低温傷害の治療を示す。注射は、低温傷害の部位の膀胱壁に実施した。注射後３０日目に、組織試料を採取し、染色用に調製した。矢印は低温傷害およびＭＤＣ注射の部位を指示する。倍率は１００Ｘである。図４Ａは、未処置の低温損傷膀胱組織を示す。図４Ｂは、ＭＤＣ注射で処置した低温損傷膀胱組織を示す；ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図４Ａおよび４Ｂは、ＭＤＣ注射が、注射後３０日間まで低温損傷膀胱組織の軟組織増加を維持したことを明らかにする。
【図５−１】図５Ａ−５Ｉは、低温損傷膀胱組織への注射後のＭＤＣの細胞分化を示す。注射は、低温傷害の部位の膀胱壁に実施し、注射後５、３５または７０日目に組織試料を採取し、分析用に調製した。注射したＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって示され、未分化ＭＤＣはα平滑筋アクチン（α−ＳＭアクチン）染色によって示されている。筋管または筋線維に分化したＭＤＣは、速ミオシン重鎖（速ＭｙＨＣ）染色によって示されている。矢印は速ＭｙＨＣを示す。注射後５日目に、多数のＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ（図５Ａ）およびα−ＳＭアクチン（図５Ｄ）染色、および比較的低レベルの速ＭｙＨＣ（図５Ｇ）染色によって示されるように、一部のＭＤＣだけが筋管に分化していた。注射後３５日目には、多数のＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ染色（図５Ｂ）、α−ＳＭアクチン（図５Ｅ）染色の低下、および速ＭｙＨＣ（図５Ｈ）染色の上昇によって示されるように、多くが筋管に分化していた。注射後７０日目には、ＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ（図５Ｃ）、α−ＳＭアクチン（図５Ｆ）染色の低下、および高レベルの速ＭｙＨＣ（図５Ｉ）染色によって示されるように、ほとんどすべてのＭＤＣが筋線維に分化していた。倍率は２００Ｘである。図５Ａ−５Ｉは、ＭＤＣが膀胱軟組織への注射後７０日間まで生存可能なままであり、分化を開始することを明らかにする。
【図５−２】図５Ａ−５Ｉは、低温損傷膀胱組織への注射後のＭＤＣの細胞分化を示す。注射は、低温傷害の部位の膀胱壁に実施し、注射後５、３５または７０日目に組織試料を採取し、分析用に調製した。注射したＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって示され、未分化ＭＤＣはα平滑筋アクチン（α−ＳＭアクチン）染色によって示されている。筋管または筋線維に分化したＭＤＣは、速ミオシン重鎖（速ＭｙＨＣ）染色によって示されている。矢印は速ＭｙＨＣを示す。注射後５日目に、多数のＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ（図５Ａ）およびα−ＳＭアクチン（図５Ｄ）染色、および比較的低レベルの速ＭｙＨＣ（図５Ｇ）染色によって示されるように、一部のＭＤＣだけが筋管に分化していた。注射後３５日目には、多数のＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ染色（図５Ｂ）、α−ＳＭアクチン（図５Ｅ）染色の低下、および速ＭｙＨＣ（図５Ｈ）染色の上昇によって示されるように、多くが筋管に分化していた。注射後７０日目には、ＭＤＣが注射領域で認められ、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ（図５Ｃ）、α−ＳＭアクチン（図５Ｆ）染色の低下、および高レベルの速ＭｙＨＣ（図５Ｉ）染色によって示されるように、ほとんどすべてのＭＤＣが筋線維に分化していた。倍率は２００Ｘである。図５Ａ−５Ｉは、ＭＤＣが膀胱軟組織への注射後７０日間まで生存可能なままであり、分化を開始することを明らかにする。
【図６】図６Ａ−６Ｄは、膀胱の軟組織に注射したＭＤＣの再神経支配を示す。神経支配は、神経筋接合部を示す、アセチルコリン（Ａｃｈ）染色によって指示される。注射後３日目には、Ａｃｈ染色によって示されるように、神経支配はほとんど認められない（図６Ａ）。注射後１５日目には、いくつかの神経支配が認められる（図６Ｂ）。注射後３０日目には、より多くの神経支配が認められる（図６Ｃ）。注射の６か月後には、低（１００Ｘ）倍率で数多くの神経支配が認められる（図６Ｄ）。図６Ａ−６Ｃは、注射した組織を高（２００Ｘ）倍率で示す。図６Ａ−６Ｄは、ＭＤＣが低温損傷膀胱組織への注射後６か月間まで神経支配を誘導することを明らかにする。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＭＤＣ組成物の注射を使用した心筋平滑筋の軟組織増加の結果を示す。注射は心室壁に実施し、注射後３日目に組織試料を調製した。ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図７Ａは、注射した組織を低（１００Ｘ）倍率で示す；図７Ｂは、注射した組織を高（２００Ｘ）倍率で示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、肝組織へのＭＤＣ注射の結果を示す。注射は左下葉の肝臓組織に実施し、注射後４日目に組織試料を調製した。ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図８Ａは低（１００Ｘ）倍率を示す；図８Ｂは高（２００Ｘ）倍率を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、脾組織へのＭＤＣ注射の結果を示す。注射は内面の脾臓組織に実施し、注射後４日目に組織試料を調製した。ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図９Ａは、低（１００Ｘ）倍率で観察した注射組織を示す；図９Ｂは、高（２００Ｘ）倍率で観察した注射組織を示す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、脊髄組織へのＭＤＣ注射の結果を示す。注射を脊髄組織に実施し、注射後４日目に組織試料を調製した。ＭＤＣはβ−ガラクトシダーゼ染色によって指示されている。図１０Ａは、低（１００Ｘ）倍率で観察した注射組織を示す；図１０Ｂは、高（２００Ｘ）倍率で観察した注射組織を示す。図７Ａ−７Ｂ、８Ａ−８Ｂ、９Ａ−９Ｂおよび１０Ａ−１０Ｂは、ＭＤＣが、宿主組織を損傷することなく様々な異なる組織型への注射後に生存可能なままであることを明らかにする。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｌは、デスミン、ＭｙｏＤおよびミオゲニン（筋形成系統に特異的なマーカー）、Ｍ−カドヘリン（衛星細胞特異的マーカー）、Ｂｃｌ−２（初期筋形成マーカー）、ＣＤ３４（造血または間質細胞マーカー）を含む細胞マーカーの発現を示すｍｄｘマウスからのＰＰ１−４およびＰＰ６細胞集団の免疫組織化学分析を示す。図１１Ａ−１１Ｌは、ＰＰ１−４およびＰＰ６細胞集団はデスミン（図１１Ａおよび１１Ｇ）、ＭｙｏＤ（図１１Ｅおよび１１Ｋ）およびミオゲニン（図１１Ｆおよび１１Ｌ）を発現する細胞の同等のパーセンテージを示し、一方ＰＰ６集団はＰＰ１−４集団と比較して、Ｍ−カドヘリンを発現する細胞のより低いパーセンテージを示すが（図１１Ｄおよび１１Ｊ）、Ｂｃｌ−２（図１１Ｃおよび１１Ｉ）およびＣＤ３４（図１１Ｂおよび１１Ｈ）を発現する細胞のより高いパーセンテージを示すことを明らかにする。
【図１２−１】図１２Ａ−１２Ｉは、マウス筋細胞および血管内皮細胞におけるデスミン染色とＣＤ３４またはＢｃｌ−２染色の細胞内共局在を示す。図１２Ａは、抗ＣＤ３４抗体で染色し、蛍光顕微鏡で視覚化した正常なマウス筋細胞（矢印参照）および血管内皮細胞（矢じり参照）を示す。図１２Ｂは、デスミンとコラーゲンＩＶ型抗体で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｃは、核を示すためにヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｄは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型およびヘキストに関して共染色した細胞の合成画像を示す。図１２Ｅは、抗Ｂｃｌ−２抗体で染色し、蛍光顕微鏡で視覚化した正常マウス筋細胞（矢印参照）を示す。図１２Ｆは、デスミンとコラーゲンＩＶ型抗体で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｇは、核を示すためにヘキストで共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｈは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型およびヘキストに関して共染色した細胞の合成画像を示す。図１２Ｉは、抗Ｍ−カドヘリン抗体で染色した衛星細胞を示す（矢印参照）。細胞は４０Ｘ倍率で観察した。図１２Ａ−１２ＤはＣＤ３４とデスミンの共局在を明らかにし、図１２Ｅ−１２ＨはＢｃｌ−２とデスミンの共局在を明らかにする。
【図１２−２】図１２Ａ−１２Ｉは、マウス筋細胞および血管内皮細胞におけるデスミン染色とＣＤ３４またはＢｃｌ−２染色の細胞内共局在を示す。図１２Ａは、抗ＣＤ３４抗体で染色し、蛍光顕微鏡で視覚化した正常なマウス筋細胞（矢印参照）および血管内皮細胞（矢じり参照）を示す。図１２Ｂは、デスミンとコラーゲンＩＶ型抗体で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｃは、核を示すためにヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｄは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型およびヘキストに関して共染色した細胞の合成画像を示す。図１２Ｅは、抗Ｂｃｌ−２抗体で染色し、蛍光顕微鏡で視覚化した正常マウス筋細胞（矢印参照）を示す。図１２Ｆは、デスミンとコラーゲンＩＶ型抗体で共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｇは、核を示すためにヘキストで共染色した同じ細胞を示す。図１２Ｈは、ＣＤ３４、デスミン、コラーゲンＩＶ型およびヘキストに関して共染色した細胞の合成画像を示す。図１２Ｉは、抗Ｍ−カドヘリン抗体で染色した衛星細胞を示す（矢印参照）。細胞は４０Ｘ倍率で観察した。図１２Ａ−１２ＤはＣＤ３４とデスミンの共局在を明らかにし、図１２Ｅ−１２ＨはＢｃｌ−２とデスミンの共局在を明らかにする。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｅは、ｍｃ１３細胞のｒｈＢＭＰ−２への暴露から生じるオステオカルシンの形態学的変化と発現を示す。ｍｃ１３細胞を、ｒｈＢＭＰ−２を含むまたは含まない増殖培地で６日間インキュベートした。図１３Ａは、ｒｈＢＭＰ−２の不在下で＞５０％細胞集密度に増殖した細胞を示す。図１３Ｂは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下で＞５０％細胞集密度に増殖した細胞を示す。図１３Ｃは、ｒｈＢＭＰ−２の不在下で＞９０％細胞集密度に増殖した細胞を示す。図１３Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下で＞９０％集密度に増殖した細胞を示す。図１３Ｅは、オステオカルシン発現（骨芽細胞マーカー；矢印参照）に関して染色した細胞を示す。細胞は１０Ｘ倍率で観察した。図１３Ａ−１３Ｅは、ｍｃ１３細胞がｒｈＢＭＰ−２への暴露後に骨芽細胞に分化できることを明らかにする。
【図１４−１】図１４Ａ−１４Ｂは、ｒｈＢＭＰ−２処理に応答してデスミンおよびアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞のパーセンテージへの影響を示す。図１４Ａは、新たに単離したｍｃ１３クローンのデスミン染色を示す。図１４Ｂは、同じ細胞の位相差顕微鏡写真を示す。
【図１４−２】図１４Ｃ−１４Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２処理に応答してデスミンおよびアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞のパーセンテージへの影響を示す。図１４Ｃは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を含むまたは含まない増殖培地での６日間のインキュベーション後のｍｃ１３細胞におけるデスミン染色のレベルを示す。図１４Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を含むまたは含まない増殖培地での６日間のインキュベーション後のＰＰ１−４細胞およびｍｃ１３細胞におけるアルカリホスフェート染色のレベルを示す。＊は統計的に有意の結果を指示する（スチューデントｔ検定）。図１４Ｃは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下でデスミンを発現するｍｃ１３細胞の数が減少することを明らかにし、一方図１４Ｄは、ｒｈＢＭＰ−２の存在下でアルカリホスファターゼを発現するｍｃ１３細胞の数が増加することを明らかにし、ｒｈＢＭＰ−２の存在下では細胞の筋形成特徴が低下し、骨形成特徴が上昇することを示唆する。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｇは、筋形成および骨形成系統へのｍｃ１３細胞のインビボ分化を示す。ｍｃ１３細胞を、ＬａｃＺおよびジストロフィン遺伝子を含む構築物で安定にトランスフェクトし、筋肉内または静脈内注射によってｍｄｘマウスの後肢に導入した。１５日後、動物を犠死させ、組織学的検査のために後肢筋系を単離した。図１５Ａは、ＬａｃＺに関して染色した筋肉内注射部位におけるｍｃ１３細胞を示す。図１５Ｂは、ジストロフィンに関して共染色した同じ細胞を示す。図１５Ｃは、ＬａｃＺに関して染色した静脈内注射の領域におけるｍｃ１３細胞を示す。図１５Ｄは、ジストロフィンに関して共染色した同じ細胞を示す。別の実験では、ｍｃ１３細胞をａｄＢＭＰ−２で形質導入し、０．５−１．０×１０６細胞をＳＣＩＤマウスの後肢に注射した。１４日後、動物を犠死させ、後肢筋組織を分析した。図１５Ｅは、骨形成を測定するための後肢のＸ線撮影分析を示す。図１５Ｆは、ＬａｃＺに関して染色した後肢に由来する細胞を示す。図１５Ｇは、ジストロフィンに関して染色した細胞を示す。図１５Ａ−１５Ｄは、ｍｃ１３細胞が筋肉内または静脈内送達によってジストロフィン発現を救済し得ることを明らかにする。図１５Ｅ−１５Ｇは、ｍｃ１３細胞が異所性骨形成に関与することを明らかにする。細胞は以下の倍率で観察した：４０Ｘ（図１５Ａ−１５Ｄ）、１０Ｘ（図１５Ｆ−１５Ｇ）。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｅは、ｒｈＢＭＰ−２を産生する一次筋細胞による骨治癒の増強を示す。歯科用バーを使用して雌性ＳＣＩＤマウスにおいて５ｍｍの頭蓋欠損を創造し、その欠損に、ａｄＢＭＰ−２と共にまたはａｄＢＭＰ−２なしでｍｃ１３細胞を接種したコラーゲンスポンジを充填した。動物を１４日目に犠死させ、骨治癒の徴候に関して検査し、顕微鏡で分析した。図１６Ａは、ａｄＢＭＰ−２なしでｍｃ１３細胞によって処置した頭蓋を示す。図１６Ｂは、ａｄＢＭＰ−２で形質導入したｍｃ１３細胞によって処置した頭蓋を示す。図１６Ｃは、フォン・コッサ染色によって分析した、ａｄＢＭＰ−２なしでｍｃ１３細胞によって処置した頭蓋の組織学的試料を示す。図１６Ｄは、フォン・コッサ染色によって分析した、ａｄＢＭＰ−２で形質導入したｍｃ１３細胞によって処置した頭蓋の組織学的試料を示す。図１６Ｅは、注射した細胞（矢印で示す緑色蛍光）を同定するためにＹ染色体特異的プローブでのハイブリダイゼーションによって分析し、核（赤色蛍光で指示される）を同定するために臭化エチジウムで染色した、ａｄＢＭＰ−２で形質導入したｍｃ１３細胞によって処置した頭蓋の組織学的試料を示す。図１６Ａ−１６Ｅは、ｒｈＢＭＰ−２を発現するｍｃ１３細胞が骨欠損の治癒に寄与し得ることを明らかにする。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、それぞれ急速に接着する細胞と緩慢に接着する細胞についての、ＣＤ５６の様々な発現％でのクレアチンキナーゼ活性の量を示すグラフである。
【図１８】図１８は、心臓内注射後２週間目と６週間目の、対照細胞および急速接着ＭＤＣと緩慢接着ＭＤＣにおける左心室収縮性の指標である、左室内腔面積変化率（ｆｕｒａｃｔｉｏｎａｌ ａｒｅａ ｃｈａｎｇｅ）（ＦＡＣ）を示す一連の棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
筋由来細胞および組成物
本発明は、体組織、好ましくは軟組織への移植後に長期的な生存率を示す初期始原細胞（ここでは筋由来始原細胞または筋由来幹細胞とも称する）から成るＭＤＣを提供する。本発明のＭＤＣを得るため、筋外植片、好ましくは骨格筋を動物ドナーから、好ましくはヒトを含む哺乳動物から入手する。この外植片は、筋始原細胞の「休止細胞（ｒｅｓｔｓ）」を含む構造的および機能的シンシチウムとして働く（Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９７８，Ｎａｔｕｒｅ ７３：３０６−８；Ｂ．Ｈ．Ｌｉｐｔｏｎら、１９７９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５：１２９２４）。
【００３１】
一次筋組織から単離された細胞は、線維芽細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、造血および筋由来始原細胞の混合物を含む。筋由来集団の始原細胞は、Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号に述べられているような、コラーゲン被覆した組織フラスコへの一次筋細胞の差次接着特性を利用して冨化することができる。緩やかに接着する細胞は形態的に丸い傾向があり、高レベルのデスミンを発現し、融合して多核筋管へと分化する能力を有する（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。これらの細胞の亜集団は、高レベルのアルカリホスファターゼ、副甲状腺ホルモン依存性３’，５’−ｃＡＭＰ、および骨形成系統および筋形成系統を発現することによってインビトロで組換えヒト骨形態形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ−２）に応答することが示された（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号；Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４，Ｊ．Ｃｅｇ Ｂｉｏｌ．１２７：１７５５−１７６６）。
【００３２】
本発明の１つの実施形態では、緩慢接着細胞（ＭＤＣ）から急速接着細胞を区別するためにプレプレーティング手順を使用し得る。本発明に従って、急速接着細胞（ＰＰ１−４）と緩慢接着円形ＭＤＣ（ＰＰ６）の集団を単離し、骨格筋外植片から冨化して、緩慢接着細胞の中で多能性細胞の存在を判定するために免疫組織化学を用いて様々なマーカーの発現に関して試験した（実施例１：Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許出願第０９／３０２，８９６号）。表３、ここでは実施例９に示すように、ＰＰ６細胞は、デスミン、ＭｙｏＤおよびミオゲニンを含む筋形成マーカーを発現した。ＰＰ６細胞はまた、筋形成の初期段階で発現される２つの遺伝子、ｃ−ｍｅｔおよびＭＮＦも発現した（Ｊ．Ｂ．Ｍｉｌｌｅｒら、１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３：１９１−２１９；表３参照）。ＰＰ６は、衛星細胞特異的マーカーであるＭ−カドヘリンを発現する細胞のより低いパーセンテージを示したが（Ａ．Ｉｒｉｎｔｃｈｅｖら、１９９４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｄｙｎａｍｉｃｓ １９９：３２６−３３７）、筋形成の初期段階の細胞に限定されるマーカー、Ｂｃｌ−２を発現する細胞のより高いパーセンテージを示した（Ｊ．Ａ．Ｄｏｍｉｎｏｖら、１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４２：５３７−５４４）。ＰＰ６細胞はまた、ヒト造血始原細胞ならびに骨髄中の間質細胞前駆体に関して同定されたマーカー、ＣＤ３４も発現した（Ｒ．Ｇ．Ａｎｄｒｅｗｓら、１９８６，Ｂｌｏｏｄ ６７：８４２−８４５；Ｃ．Ｉ．Ｃｉｖｉｎら、１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１５７−１６５；Ｌ．Ｆｉｎａら、１９９０，Ｂｌｏｏｄ ７５：２４１７−２４２６；Ｐ．Ｊ．Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９９１，Ｂｌｏｏｄ ７８：２８４８−２８５３；表３参照）。ＰＰ６細胞はまた、幹細胞様特徴を有する造血細胞のマーカーとして最近同定されたヒトＫＤＲ遺伝子のマウスホモログ、Ｆｌｋ−１を発現した（Ｂ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５５３−１５５８；表３参照）。同様に、ＰＰ６細胞は、幹細胞様特徴を有する造血細胞に存在するマーカー、Ｓｃａ−１を発現した（Ｍ．ｖａｎ ｄｅ Ｒｉｊｎら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：４６３４−８；Ｍ．Ｏｓａｗａら、１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３２０７−１４；表３参照）。しかし、ＰＰ６細胞はＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ造血幹細胞マーカーを発現しなかった（ＬＫ．Ａｓｈｍａｎ，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１：１０３７−５１；Ｇ．Ａ．Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，１９９３，ＦＡＳＥＢ Ｊ．７：４２０−４２６において総説されている；表３参照）。
【００３３】
本発明の１つの実施形態は、ここで述べる特徴を有する筋由来始原細胞のＰＰ６集団である。これらの筋由来始原細胞は、デスミン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２細胞マーカーを発現する。本発明に従って、ＰＰ６細胞は、移植後に長期的な生存能を有する筋由来始原細胞の集団を得るためにここで述べる手法によって単離される（実施例１）。ＰＰ６筋由来始原細胞集団は、デスミン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２のような始原細胞マーカーを発現する細胞の有意のパーセンテージを含む。加えて、ＰＰ６細胞は、Ｆｌｋ−１およびＳｃａ−１細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔマーカーを発現しない。好ましくは、ＰＰ６細胞の９５％以上がデスミン、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔマーカーを発現しない。ＰＰ６細胞は、最後のプレーティング後約１日以内または約２４時間以内に使用されることが好ましい。
【００３４】
好ましい実施形態では、急速接着細胞と緩慢接着細胞（ＭＤＣ）は、単一プレーティング手法を用いて互いから分離される。そのような手法の１つを実施例１０で述べる。最初に、骨格筋生検から細胞を得る。生検必要量は、約１００ｍｇの細胞を含むだけでよい。約５０ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲の大きさの生検が、本発明のプレプレーティングおよび単一プレーティングの両方法に従って使用される。５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、４００および５００ｍｇのさらなる生検が、本発明のプレプレーティングおよび単一プレーティングの両方法に従って使用される。１つの実施形態では、生検からの組織は入手後２４時間以内に処理される。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、生検からの組織は、その後１〜３０日間保存される。この保存はほぼ室温から約４℃までの温度である。この待機期間は、生検された骨格筋組織にストレスを生じさせる。このストレスは、この単一プレーティング手法を用いたＭＤＣの単離に必要ではないが、待機期間を用いることはＭＤＣのより高い収率をもたらすと思われる。
【００３６】
生検からの組織を細かく切り刻み、遠心分離する。ペレットを再懸濁し、消化酵素を用いて消化する。使用し得る酵素は、コラゲナーゼ、ジスパーゼまたはこれらの酵素の組合せを含む。消化後、酵素を細胞から洗い流す。急速接着細胞の単離のために細胞をフラスコの培地中に移す。多くの培地を使用してもよい。特に好ましい培地は、Ｃａｍｂｒｅｘ内皮増殖培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ）を含む、内皮細胞の培養用に設計されたものを含む。この培地に、ウシ胎仔血清、ＩＧＦ−１、ｂＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ヘパリンおよび／またはアスコルビン酸を含む他の成分を添加してもよい。単一プレーティング手法において使用し得る他の培地は、ＩｎＣｅｌｌ Ｍ３１０Ｆ培地を含む。この培地に、上述したように添加してもよく、または添加せずに使用してもよい。
【００３７】
急速接着細胞の単離のための工程は、約３０〜約１２０分間の期間にわたるフラスコでの培養を必要とし得る。急速接着細胞は、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０分でフラスコに付着する。それらが接着した後、急速接着細胞が付着しているフラスコから培地を取り出して、緩慢接着細胞を急速接着細胞から分離する。
【００３８】
次に、このフラスコから取り出した培地を２番目のフラスコに移す。２番目のフラスコに移す前に、細胞を遠心分離し、培地に再懸濁してもよい。細胞をこの２番目のフラスコで１〜３日間培養する。好ましくは、細胞を２日間培養する。この期間中に、緩慢接着細胞（ＭＤＣ）がフラスコに付着する。ＭＤＣが付着した後、培地を除去し、ＭＤＣの数が増大し得るように新たな培地を添加する。ＭＤＣを約１０〜約２０日間培養することによってその数を増大させ得る。ＭＤＣを１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０日間培養することによってその数を増大させ得る。好ましくはＭＤＣを１７日間の拡大培養に供する。
【００３９】
プレプレーティングおよび単一プレーティング法の代替法として、本発明のＭＤＣは、ＭＤＣによって発現される細胞表面マーカーの１またはそれ以上に対する標識抗体を用いた蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって単離できる（Ｃ．Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９８８，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１７４：２５２−６５；Ｊ．Ｒ．Ｂｌａｎｔｏｎら、１９９９，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ２２：４３−５０）。たとえばＦＡＣＳ分析は、宿主組織に導入したとき長期的生存能を示すＰＰ６様細胞の集団を選択するために、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、および／またはここで述べるその他の細胞表面マーカーに対する標識抗体を使用して実施できる。また、種々の細胞マーカータンパク質の抗体検出のための１またはそれ以上の蛍光検出標識、たとえばフルオレセインまたはローダミンの使用も本発明に包含される。
【００４０】
上述したＭＤＣ単離法のいずれかを使用した後、輸送する予定であるまたは一定期間使用しない予定であるＭＤＣは、当技術分野で公知の方法を用いて保存し得る。より詳細には、単離したＭＤＣは約−２５℃から約−９０℃の範囲の温度で凍結し得る。好ましくは、ＭＤＣは、後日の使用または輸送のためにドライアイス上にて約−８０℃で凍結される。凍結は、当技術分野で公知の何らかの凍結保存媒体で実施され得る。
【００４１】
筋由来細胞に基づく治療
本発明の１つの実施形態では、ＭＤＣを骨格筋供給源から単離し、対象とする筋または非筋軟組織部位または骨構造に導入または移植する。好都合には、本発明のＭＤＣは、移植後に長期的な生存を示す多数の始原細胞を含むように単離され、冨化される。加えて、本発明の筋由来始原細胞は、デスミン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２のような多くの特徴的細胞マーカーを発現する。さらに、本発明の筋由来始原細胞は、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーを発現しない（実施例１参照）。
【００４２】
本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含有する組成物は、筋または非筋軟組織の増加を通して様々な審美的または機能的症状（たとえば欠陥）を修復する、治療するまたは改善するために使用できる。特に、そのような組成物は、以下の治療のための軟組織増量剤として使用できる：１）皮膚の美容的および審美的症状；２）管腔の症状；３）胃食道逆流症状または状態；４）便失禁；５）骨格筋の筋力低下、疾患、損傷または機能不全；および６）平滑筋の筋力低下、疾患、損傷または機能不全。加えて、そのようなＭＤＣおよびその組成物は、疾患または外傷の不在下で、軟組織領域、孔、陥凹、空隙に増量剤を添加することによって損傷に関連しない軟組織を増加させるため、たとえばしわを「滑らかにする」または取り除くために使用できる。ＭＤＣの多回の連続投与も本発明に包含される。
【００４３】
ＭＤＣに基づく治療のために、骨格筋外植片は、好ましくは自系または異種ヒトまたは動物ソースから入手される。自系動物またはヒトソースがより好ましい。ＭＤＣ組成物は、その後、ここで述べるように調製され、単離される。本発明に従ったＭＤＣおよび／またはＭＤＣを含有する組成物をヒトまたは動物レシピエントに導入するため、単核筋細胞の懸濁液を調製する。そのような懸濁液は、生理的に許容される担体、賦形剤または希釈剤中に本発明の筋由来始原細胞の濃縮物を含む。たとえば被験体に投与するためのＭＤＣの懸濁液は、ウシ胎仔血清の代替物として被験体の血清を含むように改変された完全培地の滅菌用液中に１０８−１０９細胞／ｍｌを含み得る。あるいは、ＭＤＣ懸濁液は、凍結保存溶液（Ｃｅｌｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）のような無血清滅菌溶液であり得る。ＭＤＣ懸濁液は、その後、たとえば注射によって、ドナー組織の１またはそれ以上の部位に導入され得る。
【００４４】
前述した細胞は、医薬的または生理的に許容される製剤としてまたは生理的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む組成物として投与でき、ヒトおよび非ヒト動物を含む対象レシピエント生物の組織に投与できる。ＭＤＣ含有組成物は、滅菌生理食塩水または他の生理的に許容される注射用水性液体のような適切な液体または溶液中に細胞を再懸濁することによって調製され得る。そのような組成物において使用される成分の量は、当業者によって常套的に決定され得る。
【００４５】
ＭＤＣまたはその組成物は、ＭＤＣ懸濁液を吸着または接着材料、すなわちコラーゲン・スポンジ・マトリックス上に置くこと、およびＭＤＣ含有材料を対象部位内または対象部位上に挿入することによって投与され得る。あるいは、ＭＤＣは、皮下、静脈内、筋肉内および胸骨内を含む、非経口的経路の注射によって投与され得る。他の投与方法は、鼻内、髄腔内、皮内、経皮、経腸および舌下を含むが、これらに限定されない。本発明の１つの実施形態では、ＭＤＣの投与は内視鏡手術によって媒介され得る。
【００４６】
注射投与に関しては、組成物は、滅菌溶液または懸濁液中に存在するか、または、防腐剤、安定剤、および溶液または懸濁液をレシピエントの体液（すなわち血液）と等張にするための物質を含有し得る、医薬的および生理的に許容される水性または油性ビヒクルに再懸濁され得る。使用に適する賦形剤の非限定的な例は、水、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、デキストロース、グリセロール、希エタノール等、およびそれらの混合物を含む。例示的な安定剤は、単独でまたは混合物として使用され得る、ポリエチレングリコール、タンパク質、サッカリド、アミノ酸、無機酸および有機酸である。使用される量（ａｍｏｕｎｔｓ、ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ）ならびに投与経路は個人ごとのベースで決定され、当業者に公知の同様のタイプの適用または適応症において使用される量に対応する。
【００４７】
移植の成功を最適化するため、ドナーとレシピエントの間の可能な限り最も密接な免疫学的適合が望ましい。自系ソースが入手不能である場合は、最も密接な適合が得られるかどうかを判定するためにドナーとレシピエントのクラスＩおよびクラスＩＩ組織適合抗原を分析することができる。これは免疫拒絶反応を最小限に抑えるかまたは排除し、免疫抑制または免疫調節治療の必要性を低減する。必要に応じて、移植手技の前、その間、および／または移植手技後に免疫抑制または免疫調節治療を開始することができる。たとえばシクロスポリンＡまたは他の免疫抑制薬を移植レシピエントに投与することができる。また、当技術分野で公知の選択的方法によって移植の前に免疫学的寛容を誘導し得る（Ｄ．Ｊ Ｗａｔｔら、１９８４，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４１９；Ｄ．Ｆａｕｓｔｍａｎら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１７０１）。
【００４８】
本発明と一致して、ＭＤＣは、骨、上皮組織（すなわち皮膚、管腔等）、結合組織（すなわち脂肪、軟骨、靭帯、リンパ等）、筋組織（すなわち骨格／横紋筋または平滑筋）、および消化器系に関連する器官（すなわち口、舌、食道、胃、肝臓、膵臓、胆嚢、腸、肛門等）、心臓血管系（すなわち心臓、静脈、動脈、毛細血管等）、呼吸器系（すなわち肺、気管等）、生殖器系（すなわち精管、陰嚢、精巣、陰茎、ファローピウス管、膣、陰核、子宮、乳房、卵巣、外陰等）、泌尿器系（すなわち膀胱、尿道、尿管、腎臓等）、および神経系（すなわち脳、脊髄、神経等）に関連する器官のような様々な器官組織を含む、体組織に投与され得る。
【００４９】
ＭＤＣ懸濁液中の細胞の数および投与方法は、治療される部位と症状に依存して異なり得る。非限定的な例として、本発明に従って、約１−１．５×１０６ＭＤＣが膀胱平滑筋組織における低温傷害の直径約８ｍｍの領域の治療のために注射され、約０．５−１．０×１０６ＭＤＣが頭蓋欠損の約５ｍｍの領域の治療のためにコラーゲン・スポンジ・マトリックスによって投与される（実施例９参照）。ここで開示する実施例と一致して、熟達した医師は、各々の症例について決定される必要条件、制限および／または最適化に従ってＭＤＣに基づく治療の量および方法を調節することができる。
【００５０】
皮膚症状：本発明に従ったＭＤＣおよびその組成物は、美容的処置、たとえば形成外科または老化防止処置における軟組織増加のための材料として著明な有用性を有する。特に、そのようなＭＤＣおよびＭＤＣ含有組成物は、創傷、皮膚のひだ、しわ、非外傷性起源の皮膚陥凹、皮膚萎縮線条、陥凹性瘢痕、尋常性ざ瘡からの瘢痕化、および唇の形成不全を含むがこれらに限定されない、ヒトまたは動物被験体における様々な皮膚症状を治療するために使用できる。より詳細には、本発明のＭＤＣおよび組成物は、皮膚のひだ、しわまたは顔面、特に眼の周囲の領域の皮膚陥凹を治療するために使用できる。皮膚症状を治療するため、ＭＤＣはここで開示するように調製され、その後、たとえば注射によって、欠陥を補填する、増量するまたは修復するために皮膚、皮下または皮内に投与される。導入されるＭＤＣの数は、深い皮膚陥凹または欠陥ならびに表在表面の陥凹または欠陥を修復するために必要に応じて調節される。たとえば皮膚の約５ｍｍの領域の増加のためには約１−１．５×１０６ＭＤＣが使用される（実施例３参照）。
【００５１】
管腔の症状：もう１つの実施形態では、本発明に従ったＭＤＣおよびその組成物は、動物またはヒトを含む哺乳動物被験体における管腔の症状のための治療としてさらなる有用性を有する。特に、筋由来始原細胞は、身体内の様々な生物学的管腔または空隙を完全にまたは部分的にブロックする、増強する、拡大する、密封する、修復する、増量するまたは補填するために使用される。管腔は、限定を伴わずに、血管、腸、胃、食道、尿道、膣、ファローピウス管、輸精管および気管を含む。空隙は、限定を伴わずに、様々な組織創傷（すなわち外傷による筋肉および軟組織容積の喪失；刺創または銃創のような貫通発射体による軟組織の破壊；乳癌のための乳房切除術後の乳房組織の喪失または肉種を治療するための手術後の筋組織の喪失を含む、組織の外科的切除による疾患または組織死からの軟組織の喪失等）、病巣、裂溝、憩室、嚢胞、フィステル、動脈瘤、および動物またはヒトを含む哺乳動物の体内に存在し得る他の望ましくないまたは不要の陥凹または孔を含み得る。管腔の症状の治療のために、ＭＤＣはここで開示するように調製され、その後、たとえば注射または静脈内送達によって、空隙を満たすまたは修復するために管腔組織に投与される。導入されるＭＤＣの数は、軟組織環境における大きなまたは小さな空隙を修復するために必要に応じて調節される。
【００５２】
括約筋の症状：本発明に従ったＭＤＣおよびその組成物は、動物またはヒトを含む哺乳動物被験体における括約筋の損傷、筋力低下、疾患または機能不全の治療のためにも使用され得る。特に、ＭＤＣは、食道、肛門、心臓、幽門および尿道括約筋の組織を増加させるために使用される。より詳細には、本発明は、胃食道逆流症状、および尿および便失禁のための軟組織増加治療を提供する。括約筋欠陥の治療のために、ＭＤＣはここで述べるように調製され、その後、たとえば注射によって、付加的な容積、補填材または支持を提供するために括約筋組織に投与される。導入されるＭＤＣの数は、様々な量の増量材を提供するために必要に応じて調節される。たとえば胃食道接合部の約５ｍｍの領域または肛門括約筋の約５−１０ｍｍの領域の増加を提供するために約１−１．５×１０６ＭＤＣが使用される（実施例４参照）。
【００５３】
筋増加および収縮性：本発明のさらにもう１つの実施形態では、ＭＤＣおよびその組成物は、ヒトまたは動物被験体における筋症状の治療のために使用される。特に、ＭＤＣは、傷害、疾患、不活動、もしくは無酸素または手術誘発性外傷によって引き起こされる筋力低下または機能不全を治療するために骨格筋または平滑筋を増加させるために使用され得る。より詳細には、本発明は、スポーツ関連傷害のような骨格筋の筋力低下または機能不全のための治療を提供する。本発明はまた、心不全、または心筋梗塞に関連する損傷のような、平滑筋疾患または機能不全のための治療を提供する。
【００５４】
筋増加または筋関連症状の治療のために、ＭＤＣはここで述べるように調製され、たとえば注射によって、付加的な容積、補填剤または支持を提供するために筋組織に投与される。熟達した医師によって認識されるように、導入されるＭＤＣの数は、様々な量の増量材を提供するために必要または要求に応じて調節される。たとえば心臓組織の約５ｍｍの領域の増加のためには約１−１．５×１０６ＭＤＣが注射される（実施例７参照）。
【００５５】
加えて、ＭＤＣおよびその組成物は、たとえば胃腸組織、食道組織および膀胱組織のような平滑筋組織の収縮性に影響を及ぼすために使用され得る。実際に、実施例６で明らかにされるように、筋由来始原細胞、すなわちＭＤＣの導入後、低温損傷膀胱組織において筋収縮性が回復することが認められた。それ故、本発明はまた、筋収縮を回復する上での、および／または、食道、胃および腸平滑筋を含む胃腸運動性低下のような、平滑筋収縮性の問題を改善するまたは克服する上での本発明のＭＤＣの使用を包含する。本発明のＭＤＣが改善、軽減または矯正し得る症状のさらなる非限定的な例は、胃不全麻痺、すなわち胃の運動および排出低下である。
【００５６】
心臓の症状：さらにもう１つの実施形態では、ＭＤＣおよびその組成物は、ヒトまたは哺乳動物被験体における心臓状態の治療または予防のために使用される。これらの心臓状態は、心筋梗塞、心不全、アダムズ‐ストークス病、先天性心疾患、狭心症、不整脈、心房細動、細菌性心内膜炎、心筋症、うっ血性心不全、拡張機能障害、心雑音および心室期外収縮を含む。ＭＤＣおよびその組成物は、これらの心臓状態が起こるのを防ぐために予防的に投与され得るか、または疾病が起こった後、心臓状態によって引き起こされる心臓への損傷を修復するために投与され得る。たとえばＭＤＣおよびその組成物は、心臓発作（心筋梗塞）の危険度が高いヒトまたは動物に、心臓発作が起こる前に投与され得る。同じかまたは別のヒトまたは動物に、心臓発作の発症後に心臓を修復するためにＭＤＣおよびその組成物を投与し得る。
【００５７】
心臓状態の治療または予防のために使用されるＭＤＣおよびその組成物は、ここで述べる方法を用いてヒトまたは動物骨格筋組織から単離され得る。緩慢接着細胞（ＭＤＣ）を単離した後、ヒトまたは動物患者への輸送のために細胞を凍結し得る。好ましい実施形態では、骨格筋細胞をヒトまたは動物患者から単離し、低温であるが凍結しない温度（たとえば４℃）に置き、ＭＤＣ単離のために収集する。ＭＤＣおよびその組成物を単離した後、ＭＤＣを細胞培養で増殖させ、凍結して、解凍と投与のために患者に送り返す。
【００５８】
投与するとき、ＭＤＣおよびその組成物は、心臓内に直接または心臓のすぐ外側に注射され得る。心臓内に注射するとき、ＭＤＣおよびその組成物は、心室・心房のいずれかまたは心臓壁に注射され得る。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、ＭＤＣは、心筋梗塞（ＭＩ）、特に急性期の治療のために使用される。ＭＩ後の損傷を治療することは、その後有害なリモデリングと瘢痕化を予防し、機能の低下を予防しながら、有益なリモデリングを促進するために不可欠である。急性期のＭＤＣにより、より少ない細胞用量でＭＩ患者へのより大きな利益が提供され得る。
【００６０】
遺伝子操作された筋由来細胞
本発明のもう１つの態様では、本発明のＭＤＣは、１またはそれ以上の活性生体分子をコードする核酸配列を含むように、およびタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ホルモン、代謝産物、薬剤、酵素等を含むこれらの生体分子を発現するように遺伝的に操作され得る。そのようなＭＤＣは、ヒトを含むレシピエントに対して組織適合性（自系）または非組織適合性（同種異系）であり得る。これらの細胞は、様々な治療のため、たとえば癌、移植拒絶反応、および筋および神経組織の再生、糖尿病、肝不全、腎不全、パーキンソン病のような神経障害および疾患のような疾患および疾病の治療のため、およびここで述べるように、治療薬などの遺伝子産物を組織増加または空隙補填の部位に送達するための、長期的な局所送達システムとしての機能を果たすことができる。
【００６１】
本発明において好ましいのは、レシピエントに外来性と認識されない自系の筋由来始原細胞である。これに関して、細胞を介した遺伝子導入または送達のために使用されるＭＤＣは、望ましくは主要組織適合遺伝子座（ヒトにおけるＭＨＣまたはＨＬＡ）に適合する。そのようなＭＨＣまたはＨＬＡ適合細胞は自系であり得る。あるいは、細胞は、同じかまたは類似のＭＨＣまたはＨＬＡ抗原プロフィールを有する人物からであり得る。患者はまた、同種異系ＭＨＣ抗原に寛容化され得る。本発明はまた、米国特許第５，５３８，７２２号に述べられているような、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ抗原を欠く細胞の使用を包含する。
【００６２】
ＭＤＣは、当業者に公知の様々な分子学的手法および方法、たとえばトランスフェクション、感染または形質導入によって遺伝子操作され得る。ここで使用する形質導入は、一般に、ウイルスまたは非ウイルスベクターの細胞への導入によって外来性または異種遺伝子を含むように遺伝的に操作された細胞を指す。トランスフェクションは、より一般的に、プラスミドまたは非ウイルスベクター内に保有される外来性遺伝子を含むように遺伝的に操作された細胞を指す。ＭＤＣは種々のベクターによってトランスフェクトまたは形質導入され得、それ故発現された産物を筋肉に移入するための遺伝子送達ビヒクルとして働くことができる。
【００６３】
ウイルスベクターは好ましいが、当業者は、所望タンパク質またはポリペプチド、サイトカイン等をコードする核酸配列を含むための細胞の遺伝子操作は、融合、トランスフェクション、リポソームの使用によって媒介されるリポフェクション、電気穿孔、ＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウムでの沈殿、核酸被覆粒子（たとえば金粒子）による微粒子銃法（バイオリスティック法）、微量注入等を含む、たとえば米国特許第５，５３８，７２２号に述べられているような、当技術分野で公知の方法によって実施され得る。
【００６４】
異種（すなわち外来性）核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、生物活性産物の発現のために筋細胞に導入するためのベクターは当技術分野において周知である。そのようなベクターは、プロモーター配列、好ましくは細胞特異的であり、発現される配列の上流に位置するプロモーターを有する。ベクターはまた、場合により、トランスフェクションの成功とベクターに含まれる核酸配列の発現の指標としての発現のための、１またはそれ以上の発現マーカー遺伝子を含み得る。
【００６５】
本発明の筋由来細胞のトランスフェクションまたは感染のためのビヒクルまたはベクター構築物の説明的な例は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびアデノ関連ウイルスベクターのような、複製欠損ウイルスベクター、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス（レトロウイルス）ベクターを含む。アデノ関連ウイルスベクターは一本鎖であり、細胞の核への多数のコピーの核酸の効率的な送達を可能にする。アデノウイルスベクターが好ましい。ベクターは通常、原核生物ＤＮＡを実質的に含まず、多くの異なる機能的核酸配列を含み得る。そのような機能的配列の例は、筋細胞において活性なプロモーター（たとえば強力プロモーター、誘導的プロモーター等）およびエンハンサーを含む、転写および翻訳開始および終結調節配列を含むポリヌクレオチド配列、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ配列を包含する。
【００６６】
また、対象とするタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ポリヌクレオチド配列）も機能的配列の一部として含まれる；フランキング配列も、部位指定組込みのために含まれ得る。一部の状況では、５’フランキング配列は相同的組換えを可能にし、それ故、一例として、転写のレベルを高めるまたは低下させるために誘導的または非誘導的転写を提供するように、転写開始領域の性質を変化させる。
【００６７】
一般に、筋由来始原細胞によって発現されることが所望される核酸配列は、筋由来始原細胞にとって異種である、構造遺伝子、または機能的フラグメント、セグメントまたは遺伝子の部分の核酸配列であり、たとえば所望タンパク質またはポリペプチド産物をコードする。コードされ、発現される産物は、細胞内に存在し得る、すなわち細胞質、核または細胞の小器官に保持され得るか、または細胞によって分泌され得る。分泌のために、構造遺伝子内に存在する天然シグナル配列が保持され得るか、または天然では構造遺伝子内に存在しないシグナル配列が使用され得る。ポリペプチドまたはペプチドがより大きなタンパク質のフラグメントであるとき、シグナル配列は、分泌およびプロセシング部位でのプロセシング後、所望タンパク質が天然配列を有するように提供され得る。本発明に従った使用のための対象遺伝子の例は、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞シグナル伝達因子およびプログラムされた細胞死因子をコードする遺伝子を含む。特定例は、ＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）、ＩＬ−１Ｒａ、第ＩＸ因子およびコネキシン４３を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
上述したように、ベクター構築物を含む細胞の選択のためにマーカーが存在し得る。マーカーは、誘導的または非誘導的遺伝子であり得、一般にそれぞれ誘導下または誘導不在下での陽性選択を可能にする。一般的に使用されるマーカー遺伝子の例は、ネオマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンテターゼ等を含む。
【００６９】
使用するベクターは、一般に、当業者によって常套的に使用されるように、複製起点および宿主細胞における複製のために必要な他の遺伝子も同時に含む。一例として、複製起点および特定ウイルスによってコードされる複製に関連するタンパク質を含む複製系が構築物の一部として含まれ得る。複製系は、複製のために必要な産物をコードする遺伝子が最終的に筋由来細胞を形質転換しないように選択しなければならない。そのような複製系は、たとえばＧ．Ａｃｓａｄｉら、１９９４，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：５７９−５８４によって述べられているように構築される複製欠損アデノウイルス、およびエプスタイン‐バーウイルスに代表される。複製欠損ベクター、特に複製欠損のレトロウイルスベクターの例は、Ｐｒｉｃｅら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：１５６；およびＳａｎｅｓら、１９８６，ＥＭＢＯ Ｊ．，５：３１３３によって述べられている、ＢＡＧである。最終的な遺伝子構築物は、１またはそれ以上の対象遺伝子、たとえば生物活性代謝分子をコードする遺伝子を含み得る。加えて、ｃＤＮＡ、合成によって生産されるＤＮＡまたは染色体ＤＮＡが、当業者に公知であり、当業者によって実施される方法およびプロトコールを用いて使用され得る。
【００７０】
所望する場合は、感染性複製欠損ウイルスベクターを、細胞のインビボ注射に先立って細胞を遺伝子操作するために使用し得る。これに関して、ベクターを両栄養性パッケージングのためにレトロウイルスプロデューサー細胞に導入し得る。筋由来始原細胞の隣接領域への自然拡大は、対象部位内または対象部位における多回の注射を回避する。
【００７１】
もう１つの態様では、本発明は、所望遺伝子産物をコードする異種遺伝子を含むように操作されたアデノウイルスベクターを用いて、ウイルスによって形質導入されたＭＤＣ、たとえば初期前駆体筋細胞の使用を通して、ヒトを含むレシピエント哺乳動物宿主の細胞および組織へのエクスビボ遺伝子送達を提供する。そのようなエクスビボアプローチは、直接遺伝子導入アプローチに勝る、効率的なウイルス遺伝子導入の利点を提供する。エクスビボ手順は、筋組織の単離細胞からの筋由来始原細胞の使用を含む。筋由来始原細胞の供給源として役立つ筋生検は、損傷部位から、または臨床外科医からより容易に入手可能であり得る別の領域から入手できる。
【００７２】
本発明に従って、クローン単離物が、当技術分野で公知の様々な手順、たとえば組織培養培地での限界希釈プレーティングを用いて筋由来始原細胞（すなわちＰＰ６細胞）の集団から誘導され得ることは認識される。クローン単離物は、１個の単独細胞から生じる遺伝的に同一の細胞を含む。加えて、クローン単離物は、クローン単離細胞系を樹立するために、上述したようなＦＡＣＳ分析、続いて各穴につき１個の細胞を達成するための限界希釈を用いて誘導され得る。ＰＰ６細胞集団に由来するクローン単離物の一例は、実施例９で説明されるｍｃ１３である。好ましくは、ＭＤＣクローン単離物が、本発明の方法において、ならびに１またはそれ以上の生物活性分子の発現のための遺伝子操作のために、または遺伝子置換療法において使用される。
【００７３】
ＭＤＣを、最初に、食塩水またはリン酸緩衝食塩水のような生理的に許容される担体または希釈剤中に懸濁された、所望遺伝子産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子を含む操作されたウイルスベクターに感染させ、次に宿主において適切な部位に投与する。本発明と一致して、ＭＤＣは、上述したように、骨、上皮組織、結合組織、筋肉組織、および消化器系、心臓血管系、呼吸器系、生殖器系、泌尿器系および神経系に関連する器官のような様々な器官組織を含む、体組織に投与され得る。所望遺伝子産物が注入された細胞によって発現され、それ故遺伝子産物が宿主に導入される。導入され、発現された遺伝子産物は、それにより、宿主において長期的な生存を有する本発明のＭＤＣによって長期間にわたって発現されるので、損傷、機能不全または疾患を治療する、修復するまたは改善するために利用され得る。
【００７４】
筋芽細胞を介した遺伝子治療の動物モデル試験では、筋酵素欠損の部分的矯正のために筋肉１００ｍｇにつき１０６筋芽細胞の移植が必要であった（Ｊ．Ｅ．Ｍｏｒｇａｎら、１９８８，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｓｃｉ．８６：１３７；Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：１７６）。このデータから推定すると、７０ｋｇのヒトについての遺伝子治療のために、生理的に適合性の媒質に懸濁された約１０１２ＭＤＣを筋組織に移植することができる。この数の本発明のＭＤＣは、ヒトソースからの１回の１００ｍｇ骨格筋生検から生産できる（以下参照）。特定損傷部位の治療に関して、所与の組織または損傷部位への遺伝子操作されたＭＤＣの注入は、溶液または懸濁液中に治療有効量の細胞、好ましくは、生理的に許容される媒質中に、治療される組織ｃｍ３につき約１０５−１０６細胞を含む。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
ＭＤＣの冨化、単離および分析
ＭＤＣの冨化と単離：ＭＤＣを、記述されているように（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）作製した。筋外植片を多くの供給源の後肢から、すなわち３週齢のｍｄｘ（ジストロフィー）マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ ｍｄｘ／ｍｄｘ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、４−６週齢の正常雌性ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット、またはＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全）マウスの後肢から得た。動物ソースの各々からの筋組織を切開して骨を除去し、切り刻んでスラリーにした。次にスラリーを、０．２％ＸＩ型コラゲナーゼ、ジスパーゼ（グレードＩＩ、２４０単位）および０．１％トリプシンとの３７℃で１時間の連続インキュベーションによって消化した。生じた細胞懸濁液を１８、２０および２２ゲージの針に通し、３０００ｒｐｍ で５分間遠心分離した。その後、細胞を増殖培地（１０％ウシ胎仔血清、１０％ウマ血清、０．５％ニワトリ胚抽出物および２％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ）に懸濁した。次に細胞をコラーゲン被覆したフラスコでプレプレーティングした（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。約１時間後、上清をフラスコから取り出し、新鮮コラーゲン被覆フラスコに再プレーティングした。この１時間のインキュベーション内に迅速に接着した細胞は主として線維芽細胞であった（Ｚ．Ｑｕら、前出；Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。細胞の３０−４０％が各フラスコに接着した後、上清を取り出し、再プレーティングした。約５−６回の連続プレーティング後、培養物を、出発細胞集団から単離され、さらなる試験において使用される、ＰＰ６細胞と称される小さな円形細胞で冨化した。初期プレーティングで単離された接着細胞を一緒にプールし、ＰＰ１−４細胞と称した。
【００７６】
ｍｄｘ ＰＰ１−４、ｍｄｘ ＰＰ６、正常ＰＰ６および線維芽細胞集団を、細胞マーカーの発現に関して免疫組織化学分析によって検査した。この分析の結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
ｍｄｘ ＰＰ１−４、ｍｄｘ ＰＰ６、正常ＰＰ６および線維芽細胞をプレプレーティング手法によって誘導し、免疫組織化学分析によって検査した。「−」は細胞の２％未満が発現を示したことを指示し；「（−）」；「−／＋」は細胞の５−５０％が発現を示したことを指示し；「＋／−」は細胞の〜４０−８０％が発現を示したことを指示し；「＋」は細胞の＞９５％が発現を示したことを指示し：「ｎｏｒ」は正常細胞を指示し；「ｎａ」は免疫組織化学データが入手できないことを指示する。
【００７８】
ｍｄｘおよび正常マウスの両方が、このアッセイで試験したすべての細胞マーカーの同一の分布を示したことが注目される。それ故、ｍｄｘ突然変異の存在は、単離ＰＰ６筋細胞由来集団の細胞マーカー発現に影響を及ぼさない。
【００７９】
ＭＤＣを、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１０％ＨＳウマ血清、０．５％ニワトリ胚抽出物および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を含む増殖培地、または２％ウシ胎仔血清と１％抗生物質溶液を添加したＤＭＥＭを含む融合培地で増殖させた。すべての培地供給量はＧｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を通して購入した。
【００８０】
（実施例２）
ＭＤＣベクターおよびトランスフェクション
レトロウイルスおよびアデノウイルスベクター：ＭＦＧ−ＮＢ（Ｎ．Ｆｅｒｒｙら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７−８１）レトロウイルスベクターをＭＤＣ実験のために使用した。このベクターは、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）から転写されたシミアンウイルス（ＳＶ４０）ラージＴ抗原からクローニングされた核局在化配列を含む修飾ＬａｃＺ遺伝子（ＮＬＳ−ＬａｃＺ）を含む。レトロウイルス株を増殖させ、以前に述べられているように調製した（Ｊ．Ｃ．ｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍら、１９９８，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．８：１３５−４８）。レトロウイルスの力価は１×１０７−１×１０９ｃｆｕ／ｍｌと測定された。
【００８１】
アデノウイルスベクターも使用した。 このベクターは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨｕＣＭＶ）プロモーターの制御下にあるＬａｃＺ遺伝子を含んだ（Ｊ．Ｈｕａｒｄら、１９９４，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：９４９−５８）。Ｅ１−Ｅ３欠失組換えアデノウイルスを、Ｄｒ．Ｉ．Ｋｏｖｅｓｄｉ（Ｇｅｎｅ Ｖｅｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を通して入手した。
【００８２】
ＭＤＣのウイルス形質導入：ウイルス形質導入のために、ＭＤＣをＴ ７５フラスコに１−１．５×１０６の密度で植え付けた。ＰＰ６ ＭＤＣをＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）で洗浄し、８μｇ／ｍｌ Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌ．）を含むＤＭＥＭ ５ｍｌ中のレトロウイルス（１×１０７−１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）またはアデノウイルス（１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）懸濁液と共に３７℃で４時間インキュベートした。ウイルス形質導入したＭＤＣを、増殖培地１０ｍｌ中、３７℃で２４時間増殖させた。次にＭＤＣをＨＢＳＳで洗い、０．２５％トリプシンで１分間酵素消化した。処理したウイルス形質導入ＭＤＣを３，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ペレットをＨＢＳＳ ２０μｌに再懸濁した。
【００８３】
（実施例３）
皮膚の軟組織増加
ＭＤＣおよびコラーゲンの注射：ＳＤラットを、標準的な方法を用いてハロタンで麻酔し、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（登録商標）溶液で手術部位を洗浄することによって手術用に準備した。下腹部の皮膚に、ハミルトンマイクロシリンジを用いてＨＢＳＳ中のＭＤＣ懸濁液１０μｌ（約１−１．５×１０６細胞）、市販のウシコラーゲン（Ｃｏｎｔｉｇｅｎ（商標）；Ｃ．Ｒ．Ｂａｒｄ，Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ，Ｇａ．）１０μｌ、または滅菌食塩水１０μｌのいずれかを注射した。注射後５日目、２週間目および４週間目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製して、顕微鏡で検査し、写真撮影した。組織化学分析は、ヘマトキシリン、エオシンまたはトリクローム染色を含んだ。
【００８４】
結果は、ＭＤＣが皮膚組織への注射後少なくとも４週間まで生存可能であり、注射部位の組織の炎症の証拠を伴わなかったことを明らかにする（図１Ｄ−１Ｆ）。これに対し、コラーゲンは皮膚組織への注射後２週間目に生存可能ではなかった（図１Ｂおよび１Ｃ）。それ故、ＭＤＣ組成物は、たとえば美容的および審美的適用または手術における使用のための皮膚増加材料として使用することができる。これまで、移植した筋細胞は、生存するためにそれが結合する周囲の宿主筋線維を必要とすると考えられていたので、これは予想外の所見である。非筋組織への注射後の本発明のＭＤＣの生存は、実施例８および９においてさらに明らかにされる。
【００８５】
（実施例４）
胃食道接合部および肛門括約筋の軟組織増加
ＳＤラットを上述したように手術のために準備した。胃食道接合部および肛門括約筋を露出させるために腹部正中切開を実施した。ハミルトンマイクロシリンジを用いて軟組織にＨＢＳＳ中の筋由来始原細胞懸濁液１０μｌ（１−１．５×１０６細胞）を注射した。注射後３日目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製して、ＬａｃＺマーカーを担持する細胞の局在と生存能を調べるためにβ−ガラクトシダーゼで染色し、顕微鏡で検査して、写真撮影した。これらの実験の結果は、ＭＤＣ組成物が、胃食道逆流または便失禁症状または状態の治療のために食道および肛門括約筋増量材料として使用できることを明らかにする（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００８６】
（実施例５）
膀胱尿管接合部の軟組織増加
ＳＤラットを上述したように手術のために準備した。尿管−膀胱（膀胱尿管）接合部を露出させるために腹部正中切開を実施した。ハミルトンマイクロシリンジを用いて組織にＨＢＳＳ中のＭＤＣ懸濁液１０μｌ（１−１．５×１０６細胞）を注射した。注射後３日目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製して、ＬａｃＺマーカーを担持する細胞の局在と生存能を調べるためにβ−ガラクトシダーゼで染色し、顕微鏡で検査して、写真撮影した。これらの結果は、ＭＤＣに基づく組成物が、膀胱尿管逆流症状または状態の治療のために尿管膀胱増加材料として使用できることを明らかにする（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００８７】
（実施例６）
低温損傷膀胱組織のＭＤＣ治療
低温損傷とＭＤＣ移植：ＳＤラットを上述したように手術のために準備した。膀胱と尿道を露出させるために下腹部正中切開を実施した。次に膀胱に食塩水１ｍｌを満たした。ドライアイス上で冷却した直径８ｍｍのアルミニウム棒で低温損傷を実施した。冷却した探針を膀胱壁の一方の側に１５または３０秒間（それぞれ「軽度」または「重度」損傷と称する）当てる。低温損傷後直ちに、１つの重度損傷群に本発明の筋由来細胞（ＨＢＳＳ １５μｌ中１−１．５×１０６細胞）を注射し、対照重度損傷群にはＨＢＳＳ（１５μｌ）を注射した（ｎ＝３／群）。低温損傷の１週間後、その他の軽度および重度損傷群にＨＢＳＳ ５０μｌ中のＭＤＣ懸濁液（２−３×１０６細胞）を注射し、対照軽度および重度損傷群にはＨＢＳＳ ５０μｌを注射した（ｎ＝４／群）。各々の群に関して、注射は、３０ゲージの針とハミルトンマイクリシリンジを用いて損傷領域の中心に実施した。
【００８８】
平滑筋アクチン（α−ＳＭアクチン）についての免疫組織化学染色：免疫組織化学分析のための試料を調製するため、組織または細胞試料を−２０℃の低温アセトンに２分間固定し、５％ＨＳで１時間ブロックした。試料を、マウスモノクローナル抗平滑筋アクチン一次抗体（カタログ番号Ｆ−３７７７；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（ＰＢＳ ｐＨ７．４中１：４００希釈）と共に湿度室において室温で一晩インキュベートした。次に試料をＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｙ３蛍光色素と結合した抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ＰＢＳ ｐＨ７．４中１：２００希釈）と共にインキュベートした。
【００８９】
速ミオシン重鎖（Ｆａｓｔ ＭｙＨＣ）についての免疫組織化学染色：組織または細胞試料を−２０℃の低温アセトンに２分間固定し、５％ＨＳで１時間ブロックした。試料を、その後、マウスモノクローナル抗骨格筋ミオシン（速）一次抗体（カタログ番号Ｍ４２７６；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ＰＢＳ ｐＨ７．４中１：４００希釈）と共に湿度室において室温で一晩インキュベートした。次に試料をＰＢＳで３回洗浄し、Ｃｙ３結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（ＰＢＳ ｐＨ７．４中１：２００希釈）と共にインキュベートした。
【００９０】
細胞培養：実施例１で調製した筋由来始原細胞を、３５ｍｍコラーゲン被覆皿において増殖培地に接種した。２４時間後、増殖培地を融合培地と交換した。ＭＤＣが筋管に分化するまで、培地を毎日交換しながら細胞を融合培地に維持した。
【００９１】
収縮性試験：ＭＤＣ注射の２週間後、動物を安楽死させ、膀胱細片を作製するために使用した。２つの細片を各々の膀胱から作製し、両方の細片を、膀胱の周囲に沿って伸びるように切断した。膀胱細片を組織バスに入れ、神経収縮に供して（２０Ｈｚ、１０および８０ショック）、以下で述べるように記録し、分析した。
【００９２】
組織の採取および組織学的検査：ＳＤラットを安楽死させ、注射部位の周囲の組織の試料を切除した。液体窒素中であらかじめ冷却した２−メチルブタンを用いて試料を瞬間凍結した。試料の組織化学分析は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を含んだ。試料を染色し、顕微鏡で検査して、写真撮影した。各々のクリオスタット切片は厚さ１０μｍと測定された。
【００９３】
膀胱平滑筋組織の電気刺激：動物を安楽死させ、膀胱を迅速に切除した。膀胱壁の周囲をカバーする２つの切片を各々の膀胱から得た。細片を、９５％Ｏ２と５％ＣＯ２で通気したクレブス溶液（１１３ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、４．７ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１．２５ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２、１．２ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＳ０４、２５ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１．２ｍｍｏｌ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４および１１．５ｍｍｏｌ／ｌグルコース）を含む５ｍｌ器官バスに入れた。初期張力を１０ｍＮに設定し、ＴＢＭ４ストレインゲージ増幅器（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に連結されたストレインゲージ変換器で等尺性収縮を測定した。データ取得プログラムを用いて（Ｗｉｎｄａｑ，ＤＡＴＡＱ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｋｒｏｎ，ＯＨ）収縮測定を蓄積した。チャネルごとのサンプリング率を１００Ｈｚに設定した。算定プログラムを使用して（ＷｉｎｄａｑＥｘ，ＤＡＴＡＱ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）収縮の大きさを計算した。２０分間の平衡期間後、器官バスの上部と底部の４ｃｍ離れた２つの白金ワイヤ電極を通して電場刺激を適用した。温度は実験全体を通して３７℃に保持した。
【００９４】
膀胱平滑筋組織の化学刺激：膀胱細片を最大電圧（１００Ｖ）で０．２５ミリ秒間の矩形波パルスで刺激し、１、２、５、１０、２０または４０Ｈｚで１０または８０ショックを使用して周波数応答曲線を構築した。電気刺激後、収縮を誘導するために５、１０または２０μＭカルバコールを膀胱細片に添加した。平行実験では、１μＭアトロピンを添加し、上述したように電気刺激を適用して、収縮を誘導するために５０μＭメチレンＡＴＰを添加した。
【００９５】
神経支配についての染色：平滑筋におけるＭＤＣの再神経支配を評価するためにアセチルコリン（Ａｃｈ）染色を使用した。Ａｃｈは、神経終末の存在を指示する神経筋接合部についての染色である。ＭＤＣ注射後、３、１５、３０日目または６カ月後に組織を切除し、Ａｃｈに関して染色し、顕微鏡で観察して、写真撮影した。
【００９６】
統計解析：数値は平均±標準偏差として報告されている。０．０５未満の「Ｐ」値を統計的に有意とみなした。スチューデントｔ検定を使用した。
【００９７】
ＭＤＣ分化：実施例１で作製した筋由来始原細胞を細胞分化に関して評価した。α−ＳＭアクチンは平滑筋細胞表現型についての最初期の公知のマーカーであり（Ｋ．Ｍ．ＭｃＨｕｇｈ，１９９５，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０４：２７８−９０）、筋線維芽細胞表現型の主要マーカーである（Ｉ．Ｄａｒｂｙら、１９９０，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３：２１−９）。筋細胞分化の間に、α−ＳＭアクチンの発現は低下し、一方速ＭｙＨＣ発現が上昇する。α−ＳＭアクチンおよび速ＭｙＨＣマーカーを使用したＭＤＣ処置膀胱組織の組織化学分析は、低温損傷の部位への注射後のＭＤＣの分化を明らかにする。低温損傷膀胱組織への注射後５日目に、いくつかのＭＤＣ（少なくとも２０％）はα−ＳＭアクチン染色を示し（図５Ｂ）、細胞がまだ未分化であることを指示する。注射の６カ月後には、しかし、速ＭｙＨＣ染色の同時上昇（図５Ｉ）を伴う、α−ＳＭアクチン染色の低下（図５Ｆ）によって示されるように、実質的にすべてのＭＤＣが筋管または筋線維に分化していた。
【００９８】
筋の再神経支配：アセチルコリン（Ａｃｈ）は神経筋接合部に存在するので、筋神経支配のインジケータの役割を果たすことができる。Ａｃｈマーカーを使用したＭＤＣ処置膀胱組織の組織化学分析は、低温損傷の部位への注射後のＭＤＣの再神経支配を明らかにする。低温損傷膀胱組織への注射後３日目に、注射されたＭＤＣは、比較的低いレベルのＡｃｈ染色によって指示されるように（図６Ａ）、最小限の神経支配を示す。注射後１５日目に、Ａｃｈ染色のレベル上昇によって指示されるように（図６Ｂ）、神経支配のレベル上昇が認められる。注射後３０日目には、神経支配のさらなる上昇を指示する、より一層のＡｃｈ染色が認められる（図６Ｃ）。注射後６か月目に、低倍率で観察されるＭＤＣ注射領域全体にわたる実質的なＡｃｈ染色によって指示されるように（図６Ｄ）、広汎な神経支配が認められる。これらの結果は、骨盤神経が膀胱のＭＤＣ注射領域へと成長しつつあることを指示し、ＭＤＣが注射した組織の収縮性と機能を改善し得ることを示唆する。
【００９９】
注射したＭＤＣが処置した膀胱組織の機能を改善したかどうかを判定するために、いくつかの収縮性試験を実施した（上記参照）。表２は、ＭＤＣ注射を実施したまたは実施しなかった低温損傷後の膀胱筋の収縮性パラメータを示すデータを提示する。
【０１００】
【表２】
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。数値は平均±標準偏差である。統計分析のために、対照およびＭＤＣ注射群に関してスチューデントｔ検定を実施した。第１群：低温損傷後直ちにＭＤＣを注射した重度損傷群。第２群：低温損傷の１週間後にＭＤＣを注射した軽度損傷群。第３群：低温損傷の１週間後にＭＤＣを注射した重度損傷群。第４群：正常膀胱組織。
【０１０１】
低温損傷後直ちにＭＤＣを注射した重度損傷群（第１群）は、対照（擬似）群と同様の収縮性を示した（表２の第１群の擬似とＭＤＣの列に示されている収縮性レベルを比較する）。しかし、低温損傷の１週間後にＭＤＣを注射した重度損傷群（第３群）は、対照群と比較して（表２において星印で指示されている擬似とＭＤＣの列に示されている収縮の大きさのレベルを比較する）高い収縮率を示した（それぞれ２０Ｈｚ／１０ショックおよび２０Ｈｚ／８０ショックで対照膀胱の１４５％および１６１％）。同様に、低温損傷の１週間後にＭＤＣを注射した重度損傷群（第３群）は、対照群と比較して（表２の第３群の擬似とＭＤＣの列における収縮速度値を比較する）高い収縮速度（それぞれ２０Ｈｚ／１０ショックおよび２０Ｈｚ／８０ショックで対照細片の１１９％および１２１％）を示した。低温損傷の１週間後にＭＤＣを注射した軽度損傷群（第２群）も、対照群と比較して（表２の第２群の擬似とＭＤＣの列に示されている収縮性レベルを比較する）高い収縮の大きさおよび速度を示した。これらの試験の結果は、ＭＤＣ注射が低温損傷した膀胱筋組織に収縮性を回復させ得ることを示し、ＭＤＣに基づく組成物が尿失禁の治療のために使用できることを指示する。
【０１０２】
（実施例７）
心筋層の軟組織増加
ＳＤラットを上述したように手術のために準備した。心臓を露出させるために胸部切開を実施した。ハミルトンマイクロシリンジを用いてＨＢＳＳ中のＭＤＣ懸濁液１０μｌ（１−１．５×１０６細胞）を心室壁に注射した。３日目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製して、ＬａｃＺマーカーを担持する細胞の局在と生存能を調べるためにβ−ガラクトシダーゼで染色し、顕微鏡で検査して、写真撮影した。これらの実験の結果は、ＭＤＣ組成物が、心不全または心筋梗塞に続発する傷害または脱力の治療のために心筋軟組織増加材料として使用できることを明らかにする（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０１０３】
（実施例８）
肝臓、脾臓および脊髄組織へのＭＤＣ注射
ＳＤラットを上述したように手術のために準備した。肝臓および脾臓を露出させるために腹部正中切開を実施した。両方の部位に、ハミルトンマイクロシリンジを用いてＨＢＳＳ中のＭＤＣ懸濁液１０μｌ（１−１．５×１０６細胞）を注射した。同時に、脊髄を露出させるために背部正中切開と部分椎弓切除術を実施した。次に、レベルＴ１０の脊髄組織に、肝臓および脾臓組織に関して実施したようにＨＢＳＳ中のＭＤＣ懸濁液を注射した。
注射後４日目に、各注射部位の周囲の領域を切除し、組織化学分析用に調製して、ＬａｃＺマーカーを担持する細胞の局在と生存能を調べるためにβ−ガラクトシダーゼで染色し、顕微鏡で検査して、写真撮影した。これらの実験は、ＭＤＣ組成物が、様々な肝臓、脾臓および脊髄の損傷、疾患または機能不全を治療するために肝臓、脾臓および脊髄軟組織増加材料として使用できることを示す（図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０１０４】
（実施例９）
骨欠損のＭＤＣ治療
筋由来細胞の単離：ＭＤＣを、実施例１で述べたようにｍｄｘマウスから得た。
【０１０５】
ＰＰ６筋由来始原細胞のクローン単離：ＰＰ６細胞集団からクローンを単離するため、ＰＰ６細胞を、ＬａｃＺ、ミニジストロフィンおよびネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクトした。簡単に述べると、ｐＰＧＫ−ＮＥＯからのネオマイシン耐性遺伝子を含むＳｍａＩ／Ｓａ／Ｉフラグメントを、ＬａｃＺ遺伝子を含むｐＩＥＰｌａｃＺプラスミド内のＳｍａＩ／Ｓａ／Ｉ部位に挿入し、ｐＮＥＯｌａｃＺプラスミドを創製した。短縮型のジストロフィン遺伝子を含むＤｙｓＭ３からのＸｈｏＩ／Ｓａ／Ｉフラグメント（Ｋ．Ｙｕａｓａら、１９９８，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２５：３２９３３６；Ｄｒ．Ｔａｋｅｄａ，Ｊａｐａｎからの贈呈品）をｐＮＥＯｌａｃＺ内のＳａ／Ｉ部位に挿入して、ミニジストロフィン、ＬａｃＺおよびネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを作製した。トランスフェクションの前にＳａ／Ｉ消化によってプラスミドを線状化した。
【０１０６】
ＰＰ６細胞を、製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して、ミニジストロフィン、ＬａｃＺおよびネオマイシン耐性遺伝子を含む線状プラスミド１０μｇでトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、個別のコロニーが出現するまで１０日間、細胞を３０００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で選択した。次に、コロニーを単離し、大量のトランスフェクト細胞を得るために増殖させて、その後ＬａｃＺの発現に関して試験した。これらのＰＰ６由来クローンの１つ、ｍｃ１３をさらなる試験のために使用した。
【０１０７】
免疫組織化学：ＰＰ６、ｍｃ１３およびマウス線維芽細胞を６穴培養皿に接種し、低温メタノールで１分間固定した。次に細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、室温にて１時間、５％ウマ血清でブロックした。一次抗体を以下のようにＰＢＳに希釈した：抗デスミン（１：１００，Ｓｉｇｍａ）、ビオチニル化抗マウスＣＤ３４（１：２００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＢｃｌ−２（１：５００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＭ−カドヘリン（１：５０、Ｄｒ．Ａ．Ｗｅｒｎｉｇからの贈呈品）、マウス抗マウスＭｙｏＤ（１：１００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、マウス抗ラットミオゲニン（１：１００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＦｌｋ−１（１：５０，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、およびビオチニル化Ｓｃａ−１（１：１００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。細胞を一次抗体と共に室温で一晩インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、適切なビオチニル化二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗い、Ｃｙ３蛍光色素と結合した１／３００ストレプトアビジンと共に室温で１時間インキュベートした。次に細胞を蛍光顕微鏡によって分析した。各々のマーカーについて、細胞の無作為に選択した１０の視野に関して染色細胞のパーセンテージを算定した。
【０１０８】
４週齢の正常マウス（Ｃ−５７ ＢＬ／６Ｊ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からの筋試料の凍結切片を低温アセトンで２分間固定し、ＰＢＳに希釈した５％ウマ血清中で１時間プレインキュベートした。ＣＤ３４、Ｂｃｌ−２およびコラーゲンＩＶ型に関して、以下の一次抗体を使用した：ビオチン抗マウスＣＤ３４（ＰＢＳ中１：２００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ウサギ抗マウスＢｃｌ−２（１：１０００，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびウサギ抗マウスコラーゲンＩＶ型（ＰＢＳ中１：１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。ジストロフィン染色のために、ヒツジ抗ヒトＤＹ１０抗体（ＰＢＳ中１：２５０希釈）を一次抗体として使用し、抗ヒツジビオチン（ＰＢＳ中１：２５０希釈）およびストレプトアビジン（ＰＢＳ中１：２５０希釈）を用いてシグナルを増幅した。
【０１０９】
ｒｈＢＭＰ−２での刺激、オステオカルシン染色およびアルカリホスファターゼアッセイ：細胞を、１２穴コラーゲン被覆フラスコにおいて１−２×１０４細胞／穴の密度で３穴ずつにプレートした。２００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）を増殖培地に添加することによって細胞を刺激した。最初のプレーティング後１、３および５日目に増殖培地を交換した。対照群の細胞は、ｒｈＢＭＰ−２を添加せずに並行して増殖させた。ｒｈＢＭＰ−２刺激を伴うまたはｒｈＢＭＰ−２刺激なしでの６日後に、マイクロサイトメーターを用いて細胞を計数し、オステオカルシンおよびアルカリホスファターゼ発現に関して分析した。オステオカルシン染色のために、細胞をヤギ抗マウスオステオカルシン抗体（ＰＢＳ中１：１００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）と共にインキュベートし、次いでＣｙ３蛍光色素と結合した抗ヤギ抗体と共にインキュベートした。アルカリホスファターゼ活性を測定するため、細胞溶解産物を調製し、ｐ−ニトロフェニルホスフェートからの無機リン酸の加水分解による試薬の色の変化を利用する市販のキット（Ｓｉｇｍａ）を用いて分析した。生じた色の変化を分光光度計で測定し、データを、１０６細胞に基準化した国際単位ＡＬＰ活性／リットルとして表した。スチューデントｔ検定を用いて統計的有意性を解析した（ｐ＜０．０５）。
【０１１０】
筋形成および骨形成系統におけるｍｃ１３細胞のインビボでの分化−筋形成系統：ｍｃ１３細胞（５×１０５細胞）をｍｄｘマウスの後肢筋に筋肉内注射した。動物を注射後１５日目に犠死させ、注射した筋組織を凍結し、クリオスタット切片を作製して、ジストロフィン（上記参照）およびＬａｃＺ発現に関して検定した。ＬａｃＺ発現に関して試験するため、筋切片を１％グルタルアルデヒドで固定し、その後Ｘ−ｇａｌ基質（リン酸緩衝食塩水中の０．４ｍｇ／ｍｌ ５−ブロモクロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６および５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）と共に１−３時間インキュベートした。分析の前に切片をエオシンで対比染色した。並行実験では、ｍｃ１３細胞（５×１０５細胞）をｍｄｘマウスの尾静脈に静脈内注射した。動物を注射後７日目に犠死させ、後肢を単離して、上述したようにジストロフィンおよびβ−ガラクトシダーゼの存在に関して検定した。
【０１１１】
骨形成系統：アデノウイルスＢＭＰ−２プラスミド（ａｄＢＭＰ−２）を構築するため、ｒｈＢＭＰ−２コード配列をＢＭＰ−２−１２５プラスミド（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）から切り出し、ＨｕＣＭＶプロモーターを含む複製欠損（Ｅ１およびＥ３遺伝子が欠失している）アデノウイルスベクターにサブクローニングした。簡単に述べると、ＢＭＰ−２−１２５プラスミドをＳａ／Ｉで消化し、ｒｈＢＭＰ−２ ｃＤＮＡを含む１２３７塩基対フラグメントを生成した。次にｒｈＢＭＰ−２ ｃＤＮＡをｐＡｄ．ｌｏｘプラスミドのＳａ／Ｉ部位に挿入し、それにより遺伝子をＨｕＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。ｐｓｉ−５ウイルスＤＮＡとｐＡｄ．ｌｏｘのＣＲＥＷ細胞へのコトランスフェクションによって組換えアデノウイルスを得た。生じたａｄＢＭＰ−２プラスミドを、さらなる使用時まで−８０℃で保存した。
【０１１２】
ｍｃ１３細胞をトリプシン化し、感染の前にマイクロサイトメーターで計数した。ＨＢＳＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて細胞を数回洗浄した。５０感染多重度単位に等しいアデノウイルス粒子をＨＢＳＳに前混合し、その後細胞の上に層状に重ねた。細胞を３７℃で４時間インキュベートし、次に等量の増殖培地と共にインキュベートした。気密注射器の３０ゲージ針を使用して、露出させたＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の下腿三頭筋に０．５−１．０×１０６細胞の注射を実施した。１４−１５日目に、動物をメトキシフルランで麻酔し、頸部脱臼によって犠死させた。後肢をＸ線撮影によって分析した。その後、下腿三頭筋を単離し、リン酸緩衝食塩水で緩衝し、液体窒素中で予備冷却した２−メチルブタン中で瞬間凍結した。凍結試料を、クリオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ，ＨＭ ５０５ Ｅ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５×１０μｍ切片に切断し、さらなる分析のために−２０℃で保存した。
【０１１３】
ＲＴ−ＰＣＲ分析：ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して全ＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標） Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造者の指示に従って逆転写を実施した。簡単に述べると、ランダムヘキサマー１００ｎｇを７０℃で１０分間、全ＲＮＡ １μｇにアニーリングし、その後氷上で冷却した。１０ＸＰＣＲ緩衝液２μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ １１逆転写酵素２００Ｕで逆転写を実施した。反応混合物を４２℃で５０分間インキュベートした。
【０１１４】
標的のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を、逆転写酵素反応産物２μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１００μｌ（５Ｕ）および１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む反応混合物５０μｌ中で実施した。Ｏｌｉｇｏソフトウエアを用いてＣＤ３４ ＰＣＲプライマーを設計し、それらは以下の配列を有した：ＣＤ３４ ＵＰ：ＴＡＡ ＣＴＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＴＡＣ ＣＡ（配列番号１）；およびＣＤ３４ ＤＯＷＮ：ＧＴＧ ＧＴＣ ＴＴＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＴＧ（配列番号２）。その他のプライマーは以前の試験に従って設計し（Ｊ．Ｒｏｈｗｅｄｅｌら、１９９５，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２２０：９２−１００；Ｄ．Ｄ．Ｃｏｍｅｌｉｓｏｎら、１９９７，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９１：２７０−２８３）、それらは以下の配列を有した：
【０１１５】
【化１】
以下のＰＣＲパラメータを使用した：１）９４℃、４５秒間；２）５０℃、６０秒間（ＣＤ３４）または６０℃、６０秒間（ミオゲニンおよびｃ−ｍｅｔ）；および３）７２℃、９０秒間を４０サイクル。ＰＣＲ産物を、アガロース−ＴＢＥ−臭化エチジウムゲルによって確認した。予想されたＰＣＲ産物の大きさは以下のとおりである：ＣＤ３４に関しては１４７ｂｐ；ミオゲニンに関しては８６ｂｐ；およびｃ−ｍｅｔに関しては３７０ｂｐ。ゲノムＤＮＡ汚染の可能性を排除するため、２つの対照反応を実施した：１）逆転写酵素の不在下での並行逆転写、および２）イントロンにまたがるプライマーセット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用したβ−アクチンの増幅。
【０１１６】
頭蓋欠損アッセイ：３匹の６−８週齢の雌性ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を対照群と実験群において使用した。動物をメトキシフルランで麻酔し、腹臥位で手術台上に置いた。１０番の刃を使用して、頭皮を切開して頭蓋を露出させ、骨膜を除去した。硬膜の貫通を最小限に抑えながら、歯科用バーを使用して約５ｍｍの全層円形頭蓋欠損を創造した。コラーゲン・スポンジ・マトリックス（Ｈｅｌｉｓｔａｔ（商標），Ｃｏｌｌａ−Ｔｅｃ，Ｉｎｃ．）に、ａｄＢＭＰ−２形質導入を伴ってまたは伴わずに、０．５−１．０×１０６ＭＤＣを接種し、頭蓋欠損内に置いた。４−０ナイロン縫合糸を用いて頭皮を閉じ、動物に給餌して、活動させた。１４日後、動物を犠死させ、頭蓋標本を観察して、その後顕微鏡で分析した。フォン・コッサ染色のために、頭蓋標本を４％ホルムアルデヒドに固定し、次に０．１Ｍ ＡｇＮＯ３溶液に１５分間浸けた。標本を少なくとも１５分間光に暴露し、ＰＢＳで洗浄して、その後観察のためにヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【０１１７】
Ｙ−プローブを使用したインサイチューハイブリダイゼーションにおける蛍光：凍結切片を３：１ メタノール／氷酢酸（ｖ：ｖ）に１０分間固定し、空気乾燥した。次に切片を２ＸＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、ｐＨ７．０中の７０％ホルムアミドにおいて７０℃で２分間変性した。その後、スライドガラスを各濃度で２分間の一連のエタノール洗浄（７０％、８０％および９５％）によって脱水した。Ｙ染色体特異的プローブ（Ｙ．Ｆａｎら、１９９６，Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １９：８５３−８６０）を、ＢｉｏＮｉｃｋキット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を使用して製造者の指示に従ってビオチニル化した。ビオチニル化したプローブを、次に、Ｇ−５０ Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて精製し、５ｎｇ／ｍｌの超音波処理したニシン精子ＤＮＡと共に凍結乾燥した。ハイブリダイゼーションの前に、５０％ホルムアミド、１ＸＳＳＣおよび１０％硫酸デキストランを含む溶液にプローブを再懸濁した。７５℃で１０分間の変性後、プローブを変性切片上に置き、３７℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、切片を２ＸＳＳＣ溶液、ｐＨ７．０によって７２℃で５分間洗浄した。次に切片をＢＭＳ溶液（０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、ｐＨ８．０）中で洗浄した。ハイブリダイズしたプローブをフルオレセイン標識アビジン（ＯＮＣＯＲ，Ｉｎｃ）で検出した。核を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｉｎｃ）中１０ｎｇ／ｍｌの臭化エチジウムで対比染色した。
【０１１８】
ｍｃ１３細胞のマーカー分析：ｍｃ１３、ＰＰ６および線維芽細胞によって発現された生化学的マーカーを、ＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学を用いて分析した。表３（下記）は、ｍｃ１３細胞が、幹細胞様特性を有する造血細胞のマーカーとして最近同定された（Ｂ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒら、前出）、ヒトＫＤＲ遺伝子のマウスホモログであるＦｌｋ−１を発現したが、ＣＤ３４またはＣＤ４５を発現しなかったことを示す。しかし、本発明のＰＰ６ ＭＤＣに由来する他のクローン単離物は、ＣＤ３４ならびに他のＰＰ６細胞マーカーを発現した。ここで述べる手順が、ＰＰ６筋由来始原細胞集団をクローン化し、筋由来始原細胞に特徴的な細胞マーカーを発現するクローン単離物を得るために使用できることは当業者に認識される。そのようなクローン単離物は本発明の方法に従って使用できる。たとえばクローン単離物は、デスミン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２を含む始原細胞マーカーを発現する。好ましくは、クローン単離物はまた、Ｓｃａ−１およびＦｌｋ−１細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５またはｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーを発現しない。
【０１１９】
【表３】
細胞を上述したように単離し、免疫組織化学分析によって検査した。「−」は、細胞の０％が発現を示したことを指示する；「＋」は、細胞の＞９８％が発現を示したことを指示する；「＋／−」は、細胞の４０−８０％が発現を示したことを指示する；「−／＋」は、細胞の５−３０％が発現を示したことを指示する；「ｎａ」は、データが入手できないことを指示する。
【０１２０】
ＣＤ３４＋およびＢｃｌ−２＋細胞のインビボでの局在化：インビボでのＣＤ３４＋およびＢｃｌ−２＋細胞の位置を同定するため、正常マウスの下腿三頭筋からの筋組織切片を、抗ＣＤ３４および抗Ｂｃｌ−２抗体を用いて染色した。ＣＤ３４陽性細胞は、デスミンに関しても陽性である（図１２Ｂ）筋由来細胞の小集団を構成した（図１２Ａ）。抗コラーゲンＩＶ型抗体とＣＤ３４＋・デスミン＋細胞の共染色は、それらを基底膜に局在化した（図１２Ｂおよび１２Ｄ）。図１２Ａ−Ｄにおいて矢じりで指示されるように、小さな血管もＣＤ３４およびコラーゲンＩＶ型に関して陽性であったが、核染色で共局在しなかった。血管内皮細胞によるＣＤ３４の発現が以前の試験で示された（Ｌ．Ｆｉｎａら、前出）。Ｂｃｌ−２＋・デスミン＋細胞が同様に同定され（図１２Ｅ−１２Ｈ）、基底膜内に局在化された（図１２Ｆおよび１２Ｈ）。衛星細胞の位置を同定するために切片をＭ−カドヘリンに関しても染色した（図１２Ｉ）。衛星細胞は、ＣＤ３４＋・デスミン＋細胞、またはＢｃｌ−２＋・デスミン＋細胞と同様の位置で同定された（矢印、図１２Ｉ）。しかし、Ｍ−カドヘリンとＣＤ３４またはＢｃｌ−２を共局在化する多数の試みは成功せず、Ｍ−カドヘリン発現細胞がＢｃｌ−２またはＣＤ３４を共発現しないことを示唆した。これは、ここで開示するように、高レベルのＣＤ３４およびＢｃｌ−２を発現するが、Ｍ−カドヘリンは極微のレベルでしか発現しないＰＰ６細胞と一致する。
【０１２１】
クローン化筋始原細胞の骨形成系統へのインビトロ分化：ｍｃ１３細胞を、ｒｈＢＭＰ−２での刺激によって骨形成分化能に関して評価した。細胞を６穴培養皿にプレートし、２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２の存在下または不在下で集密まで増殖させた。３４日以内に、ｒｈＢＭＰ−２に暴露したｍｃ１３細胞は、ｒｈＢＭＰ−２不在下の細胞と比較して劇的な形態形成変化を示した。ｒｈＢＭＰ−２の不在下では、ｍｃ１３細胞は多核筋管に融合し始めた（図１３Ａ）。２００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２に暴露したときは、しかし、細胞は単核のままであり、融合しなかった（図１３Ｂ）。細胞密度が＞９０％の集密度に達したとき、未処置培養物は融合して多数の筋管を形成したが（図１３Ｃ）、処置細胞は円形で肥大性になった（図１３Ｄ）。免疫組織化学を使用して、これらの肥大細胞をオステオカルシンの発現に関して分析した。オステオカルシンは、骨に沈着し、骨芽細胞によって特異的に発現されるマトリックスタンパク質である。未処置群と異なり、ｒｈＢＭＰ−２処置した肥大細胞はオステオカルシンの有意の発現を示し（図１３Ｅ）、それ故、ｍｃ１３細胞がｒｈＢＭＰ−２への暴露後に骨芽細胞に分化できることを示唆した。
【０１２２】
ｍｃ１３細胞を、次に、ｒｈＢＭＰ−２刺激後のデスミンの発現に関して分析した。新たに単離したｍｃ１３細胞は均一なデスミン染色を示した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。ｒｈＢＭＰ−２への暴露から６日以内に、ｍｃ１３細胞の３０〜４０％だけがデスミン染色を示した。ｒｈＢＭＰ−２刺激の不在下では、ｍｃ１３細胞の約９０〜１００％がデスミン染色を示した（図１４Ｃ）。この結果は、ｒｈＢＭＰ−２によるｍｃ１３細胞の刺激がこれらの細胞についての筋形成能の喪失を生じさせることを示唆する。
【０１２３】
さらに、ｍｃ１３細胞をｒｈＢＭＰ−２刺激後のアルカリホスファターゼの発現に関して分析した。アルカリホスファターゼは骨芽細胞分化についての生化学的マーカーとして使用されてきた（Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉら、１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２７：１７５５−１７６６）。図１４Ｄに示すように、ｍｃ１３細胞のアルカリホスファターゼ発現はｒｈＢＭＰ−２に応答して６００倍以上上昇した。対照として使用したＰＰ１−４細胞は、ｒｈＢＭＰ−２に応答したアルカリホスファターゼ活性の上昇を示さなかった（図１４Ｄ）。合わせて考慮すると、これらのデータは、ＰＰ６クローン単離物、たとえばｍｃ１３細胞が、インビトロでｒｈＢＭＰ−２暴露に応答して筋形成マーカーを喪失し、骨形成系統を通して分化し得ることを明らかにする。
【０１２４】
ｍｃ１３細胞の筋形成および骨形成系統へのインビボでの分化：ｍｃ１３細胞がインビボで筋形成系統を通して分化できるかどうかを判定するため、細胞をｍｄｘマウスの後肢筋組織に注射した。動物を注射後１５日目に犠死させ、組織学的および免疫組織化学的分析のためにそれらの後肢を採取した。いくつかの筋線維は、注射部位の周囲の領域においてＬａｃＺおよびジストロフィン染色を示し（図１５Ａおよび１５Ｂ）、ｍｃ１３細胞がインビボで筋形成系統に分化することができ、ジストロフィー筋において筋再生を増強し、ジストロフィンを回復させ得ることを指示する。
【０１２５】
並行実験では、ｍｃ１３細胞をｍｄｘマウスの尾静脈に静脈内注射した。動物を注射後７日目に犠死させ、組織学的および免疫組織化学的分析のために後肢筋を採取した。いくつかの後肢筋細胞はＬａｃＺおよびジストロフィン染色を示し（図１５Ｃ、１５Ｄ：「＊」も参照のこと）、ｍｃ１３細胞がジストロフィン発現の救済のために標的組織に全身的に送達され得ることを示唆した。
【０１２６】
インビボでのｍｃ１３細胞の多能特性を試験するため、細胞をｒｈＢＭＰ−２をコードするアデノウイルスベクター（ａｄＢＭＰ−２）で形質導入した。ａｄＢＭＰ−２を有するｍｃ１３細胞を、次に、ＳＣＩＤマウスの後肢に注射した。動物を注射後１４日目に犠死させ、後肢を組織化学的および免疫化学的分析のために切除した。ａｄＢＭＰ−２で形質導入したｍｃ１３細胞の酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）分析は、感染細胞がｒｈＢＭＰ−２を産生できることを示した。注射したＳＣＩＤマウスの後肢のＸ線分析は、注射の１４日以内に堅固な異所性骨形成を明らかにした（図１５Ｅ）。異所性骨のＬａｃＺ染色を用いた組織学的分析は、ＬａｃＺ陽性ｍｃ１３細胞が、骨芽細胞および骨細胞が認められる典型的な位置である、石灰化マトリックスまたは小窩内に均一に位置したことを示す（図１５Ｆ）。
【０１２７】
異所性骨の形成におけるｍｃ１３の役割をさらに確認するため、筋切片をジストロフィンの存在に関しても染色した。図１５Ｇに示すように、異所性骨はジストロフィンに関して高度に陽性の細胞を含み、ｍｃ１３細胞が骨形成に密接に関与していることを示唆する。対照として、線維芽細胞に関して同様の実験を実施した。線維芽細胞は堅固な異所性骨形成を支持することが認められたが、注射した細胞は一様に骨の外側で認められ、いずれも石灰化マトリックス内に位置することができなかった。これは、線維芽細胞が、異所性骨を形成するようにｒｈＢＭＰ−２を送達することができるが、骨芽細胞に分化することはできないことを示唆する。この場合、異所性骨の石灰化に関与する細胞はおそらく宿主組織に由来すると考えられる。それ故、これらの結果は、ｍｃ１３細胞がインビボおよびインビトロの両方で骨芽細胞に分化できることを明らかにする。
【０１２８】
遺伝子操作された筋由来細胞による骨治癒の増強：骨格的に成熟した（６−８週齢）雌性ＳＣＩＤマウスにおいて上述したように歯科用バーを用いて頭蓋欠損（約５ｍｍ）を創造した。以前の実験は、５ｍｍの頭蓋欠損が「非治癒性（ｎｏｎ−ｈｅａｌｉｎｇ）」であることを明らかにした（Ｐ．Ｈ．Ｋｒｅｂｓｂａｃｈら、１９９８，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６６：１２７２−１２７８）。頭蓋欠損に、ａｄＢＭＰ−２で形質導入したｍｃ１３細胞または形質導入していないｍｃ１３細胞を接種したコラーゲン・スポンジ・マトリックスを充填した。これらのマウスを１４日目に犠死させ、頭蓋欠損の治癒を分析した。図１６Ａに示すように、ｒｈＢＭＰ−２なしのｍｃ１３細胞で処置した対照群は欠損の治癒の証拠を示さなかった。これに対し、ｒｈＢＭＰ−２を発現するように形質導入したｍｃ１３細胞で処置した実験群は、２週間目に頭蓋欠損のほとんど完全な閉鎖を示した（図１６Ｂ）。石灰化した骨を強調するフォン・コッサ染色は、ｒｈＢＭＰ−２を発現するように形質導入したｍｃ１３細胞で処置した群において堅固な骨形成を示したが（図１６Ｄ）、対照群では極微の骨形成しか認められなかった（図１６Ｃ）。
【０１２９】
実験群における新しい骨の領域を、移植した細胞を同定するためにＹ染色体特異的プローブとの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって分析した。図１６Ｅに示すように、Ｙ染色体陽性細胞が新たに形成された骨内で同定され、ｒｈＢＭＰ−２の影響下での移植細胞の骨形成への能動的な関与を指示した。Ｙ染色体陰性細胞も新たに形成された頭蓋内で同定され、それ故宿主由来細胞の能動的な関与も指示した。これらの結果は、ｍｃ１３細胞がｒｈＢＭＰ−２での刺激後に「非治癒性」骨欠損の治癒を媒介し得ることを明らかにし、本発明のＭＤＣが骨欠損、損傷または外傷の治療において使用できることを指示する。
【０１３０】
（実施例１０）
緩慢接着ヒトＭＤＣは性質としてより筋形成性であり、誘発性心筋梗塞を有するマウスにおいて左心室機能を改善する。
【０１３１】
急速および緩慢接着ＭＤＣの集団を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ（ＣＯＲＥ）から入手した３名の男性と３名の女性ドナー（１３歳の男性、５７歳の男性、７０歳の男性、３２歳の女性、５９歳の女性、６４歳の女性）の直筋から単離した。１４の試料についての生検の大きさは４２−２４７ｍｇの範囲であった。平均の大きさは１２９ｍｇであった。５７歳の男性ドナーから単離した急速および緩慢接着ＭＤＣを心臓内注射のために使用した。
【０１３２】
骨格筋生検組織を直ちに低温溶液（硫酸ゲンタマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）を添加したＨｙｐｏ Ｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（ＢｉｏＬｉｆｅ））に入れ、４℃で保存する。３−７日後、生検組織を保存から取り出し、生産を開始させる。結合組織または非筋組織を生検試料から切除する。単離のために使用する残存筋組織を計量する。組織をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で細かく切り刻み、円錐管に移して、遠心分離する（２，５００×ｇ、５分間）。次にペレットを消化酵素溶液（Ｌｉｂｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ４（０．４−１．０Ｕ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）に再懸濁する。生検試料１００ｍｇにつき消化酵素溶液２ｍＬを使用して、回転板上で３７℃にて３０分間インキュベートする。その後試料を遠心分離する（２，５００×ｇ、５分間）。ペレットを培地に再懸濁し、７０μｍのセルストレーナーに通す。この実施例で述べる手順のために使用する培地は、以下の成分を添加したＣａｍｂｒｅｘ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＥＧＭ−２基本培地であった：ｉ．１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、およびｉｉ．インスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、ヘパリンおよびアスコルビン酸を含む、Ｃａｍｂｒｅｘ ＥＧＭ−２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ Ｋｉｔ。次に、ろ過した細胞溶液をＴ２５培養フラスコに移し、５％ＣＯ２中３７℃で３０−１２０分間インキュベートする。このフラスコに付着する細胞が「急速接着細胞」である。
【０１３３】
インキュベーション後、Ｔ２５フラスコから細胞培養上清を取り、１５ｍＬ円錐管に入れる。Ｔ２５培養フラスコを温めた培地２ｍＬで洗浄し、前記１５ｍＬ円錐管に移す。１５ｍＬ円錐管を遠心分離する（２，５００×ｇ、５分間）。ペレットを培地に再懸濁し、新しいＴ２５培養フラスコに移す。フラスコを５％ＣＯ２中３７℃で〜２日間インキュベートする（このフラスコに付着する細胞が「緩慢接着細胞」である）。インキュベーション後、細胞培養上清を吸引し、新しい培地をフラスコに添加する。その後フラスコを増殖のためにインキュベーターに戻す。このあと、培養フラスコ中の細胞集密度を５０％未満に維持するように標準培養継代を実施する。継代の間にフラスコから接着細胞を分離するためにトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する。「緩慢接着細胞」の典型的な増殖は、３，７００万細胞の平均総生細胞数を達成するために平均１７日間（生産を開始させる日から出発して）を要する（ｎ＝１４の生産を１４の異なる生検試料から実施し、生検重量は４２−２４７ｍｇの範囲であり、平均１２９ｍｇである）。
【０１３４】
ひとたび所望細胞数が達成されれば、トリプシン−ＥＤＴＡを使用してフラスコから細胞を採取し、遠心分離する（２，５００×ｇ、５分間）。ペレットをＢＳＳ−Ｐ溶液（ヒト血清アルブミン（２％ｖ／ｖ、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ）を添加したＨＢＳＳ）に再懸濁し、計数する。次に細胞溶液を再び遠心分離し（２，５００×ｇ、５分間）、低温保存溶液（ヒト血清アルブミン（２％ｖ／ｖ、Ｓｅｒａ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ）を添加したＣｒｙｏＳｔｏｒ（Ｂｉｏｌｉｆｅ））で所望細胞濃度に再懸濁して、極低温保存のために適切なバイアルにパッケージする。クライオバイアルを冷凍容器に入れ、−８０℃の冷凍庫内に置く。凍結細胞懸濁液を室温で解凍して細胞を等量の生理食塩水と共に投与し、直接注射する（追加操作なしで）ことによって細胞を投与する。緩慢接着細胞集団（ｎ＝７生検）の系統特性決定は以下を示す：筋形成（８７．４％ＣＤ５６＋、８９．２％デスミン＋）、内皮（０．０％ＣＤ３１＋）、造血（０．３％ＣＤ４５＋）、および線維芽細胞（６．８％ＣＤ９０＋／ＣＤ５６−）。
【０１３５】
骨格筋生検組織の解離後、細胞の２つの分画を培養フラスコへのそれらの急速または緩慢接着に基づいて収集した。次に細胞を増殖培地での培養で増殖させ、その後１．５ｍｌエッペンドルフ管の低温保存溶液中で凍結した（１５μ中３×１０５細胞）。対照群については、低温保存溶液１５μｌだけを管に入れた。これらの管を注射時まで−８０℃で保存した。注射の直前に、管を保存から取り出し、室温で解凍して、０．９％塩化ナトリウム溶液１５μｌで再懸濁した。生じた３０μｌ溶液を、次に、３０ゲージ針を用いて０．５ｃｃインスリンシリンジに導入した。手術および注射を実施する試験者には管の内容物がわからないようにした。
【０１３６】
細胞数および生存能を、ＧｕａｖａフローサイトメーターおよびＶｉａｃｏｕｎｔアッセイキット（Ｇｕａｖａ）を用いて測定した。ＣＤ５６は、ＰＥ結合抗ＣＤ５６抗体（１：５０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＰＥ結合アイソタイプ対照モノクローナル抗体（１：５０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。デスミンは、モノクローナルデスミン抗体（１：１００、Ｄａｋｏ）およびアイソタイプ対照モノクローナル抗体（１：２００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用してパラホルムアルデヒド固定細胞（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に関するフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。Ｃｙ３結合抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０、Ｓｉｇｍａ）を用いて蛍光標識化を実施した。各工程の間に、細胞を透過性上昇緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で洗浄した。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アッセイのために、各穴につき１×１０５細胞を１２穴プレートの分化誘導培地に接種した。４−６日後、細胞をトリプシン処理によって採取し、遠心分離にかけてペレットにした。細胞溶解産物上清を、ＣＫ Ｌｉｑｕｉ−ＵＶキット（Ｓｔａｎｂｉｏ）を用いてＣＫ活性に関して検定した。
【０１３７】
ヒト細胞の異種移植に関連する免疫拒絶反応を回避するために、細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの心臓に注射した。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈは、この試験において実施される動物および手術手順を承認した（プロトコール３７／０４）。２２週齢のＮＯＤ．ＣＢ１７ ｐｒｋｄｃ重症複合型免疫不全（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）をこの試験で使用した。マウスをイソフルランと酸素の気体混合物で麻酔し、挿管した。手術中、人工呼吸器で陽圧換気を維持した。正常に位置する左心耳の先端から２ｍｍの左冠動脈前下行枝の結紮によって急性心筋梗塞を誘導した。結紮後直ちに、調製した溶液を梗塞に隣接する収縮壁の前面と側面および梗塞の中心部に注射した（各領域につき１０μｌ）。
【０１３８】
移植の２週間後と６週間後に、左心室機能を評価するために心エコー検査を実施した。心エコー検査は、１３−Ｍｈｚリニアアレイ変換器（１５Ｌ８）を備えたＳｅｑｕｏｉａ Ｃ２５６システム（Ａｃｕｓｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて盲検化された試験者によって実施された。マウスをイソフルランガスで麻酔し（１分間の誘導のために３％イソフルランおよび維持のために１．５０％イソフルラン）、背臥位で拘束した。収縮末期面積（ＥＳＡ）と拡張末期面積（ＥＤＡ）の両方を左心室の短軸像から測定した。ＬＶ収縮性の指標である左室内腔面積変化率（ＦＡＣ）を、ＦＡＣ（％）＝［（ＥＤＡ−ＥＳＡ）／ＥＤＡ］×１００として算定した。
【０１３９】
データを平均±ＳＥとして提示する。心機能データにおける統計的有意差は二方向ＡＮＯＶＡによって決定した。Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重比較検定でポストホック解析を実施した。
【０１４０】
急速および緩慢接着ＭＤＣの筋形成特性決定
６名の異なるドナー（男性３名と女性３名）の組織から単離した細胞において、我々は、急速接着ＭＤＣの集団が、緩慢接着ＭＤＣの集団（平均７１．０％）と比較したとき、より低いレベルの筋形成マーカーＣＤ５６発現を示す（６集団すべての平均、４９．５％）ことを認めた（図１７）。各群について同数の細胞を、筋形成分化を誘導する条件に供したとき、急速接着ＭＤＣ（平均６９Ｕ／Ｌ）は緩慢接着ＭＤＣ（平均１４２Ｕ／Ｌ）よりも低いクレアチンキナーゼ活性レベルを示し（図１７）、緩慢接着細胞が急速接着細胞よりも多量の筋を生産できることを指示した。合わせて考慮すると、これらの結果は、緩慢接着ＭＤＣの集団が、急速接着ＭＤＣの集団と比較したとき、より筋形成性であり（ＣＤ５６含量）、筋生成に関してより強力である（ＣＫ活性）ことを示唆する（図１７）。
【０１４１】
注射用にパッケージし、凍結した細胞の解凍後特性決定
我々は、心臓内注射用にパッケージし、凍結したＭＤＣ（５７歳の男性ドナーから単離した）の解凍後試料を分析した。どちらの細胞集団も解凍直後には等しく高い割合の生存能を有しており（９２％）、両集団の細胞の非常に高いパーセンテージが注射の時点で生存可能であることを指示した（表１）。筋形成マーカーＣＤ５６を発現した細胞の割合は、表４に示すように、急速接着ＭＤＣと緩慢接着ＭＤＣについてそれぞれ４３．８％と８５．１％であった。
【０１４２】
【表４】
同様の傾向が、急速（６２．５％）および緩慢接着ＭＤＣ（９３．６％）についての筋形成マーカー、デスミンの発現レベルにおいて認められた。解凍後にＣＫ活性によって測定した細胞の筋形成能は、急速および緩慢接着細胞についてそれぞれ８２および１８１Ｕ／Ｌであった。これら２つの集団の間での筋形成含量（ＣＤ５６およびデスミン）および筋形成分化（ＣＫ）の差は、心臓内注射のために使用された細胞が、典型的にはドナー骨格筋から単離される急速および緩慢接着細胞の代表集団であることを指示する（図１７参照）。
【０１４３】
心機能
２つの理由から、５７歳の男性から単離したＭＤＣを心臓内注射のために使用した。第一に、このドナーからの急速および緩慢接着細胞集団は、表５および図１７に示すようにその他のドナーから単離した細胞を代表する筋形成特性を示した。
【０１４４】
【表５】
第二に、ドナーの筋生検の年齢および性別がそのような治療を必要とする標的集団と適合性であると思われる。
【０１４５】
対照群と比較したとき、急速または緩慢接着細胞を注射した心臓は、図１８に示すように心筋梗塞後２週間目で早くも、ＦＡＣによって測定したとき、ＬＶ収縮性の改善を示した。また、表５に示す結果は、それぞれ２３．０％および６９．７％の上昇を明らかにする。６週間目まで、ＬＶ収縮性レベルはどちらの細胞群においても安定なままであったが、対照群では小さな低下が認められ、表５および図１８に示すように、対照溶液を注射した心臓と比較したとき急速および緩慢接着細胞を注射した心臓に関してそれぞれ４５．２％および１１８．９％のＬＶ収縮性のさらに一層大きな改善を生じさせた。対照群と比べての有意差は、緩慢接着ＭＤＣ群においてのみ達成された（図１８；＊Ｐ＜０．０５、緩慢接着ＭＤＣ対対照）。加えて、緩慢接着ＭＤＣを注射した心臓は、急速接着細胞を注射した心臓を上回るＬＶ収縮性を明らかにし（図１８；†Ｐ＜０．０５、緩慢接着細胞（ＭＤＣ）対急速接着細胞）、心筋梗塞修復に関して緩慢接着細胞が急速接着細胞よりも優れていることを示唆した。
【０１４６】
我々は、ヒト骨格筋生検組織の解離後、培養フラスコへのそれらの急速または緩慢接着に基づいて細胞の２つの分画を単離した。培養フラスコに緩慢に接着した細胞の集団は、急速に接着した細胞の集団と比較したとき、より高い筋形成含量とより大きな筋形成効率／効力によって特徴づけられる。心筋梗塞修復に関して、細胞のいずれかの分画を注射した心臓は、対照を注射した心臓と比較したとき機能的改善を提供した。しかし、緩慢接着細胞は、急速接着細胞と比較したとき心筋梗塞後のより優れた機能回復を提供した。
【０１４７】
本明細書において引用するすべての特許出願、特許、テキストおよび文献参照、本発明が属する技術分野の技術水準をより詳細に説明するためにそれらの全体が参照によりここに組み込まれる。
【０１４８】
様々な変更が、上述したような本発明の範囲と精神から逸脱することなく上記方法および組成物において実施され得るので、付属の図面で示す、または付属の特許請求の範囲で定義される、上記説明に含まれるすべての対象物は、例示と解釈され、限定的な意味ではないことが意図されている。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図５Ｉ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１１Ｉ】
【図１１Ｊ】
【図１１Ｋ】
【図１１Ｌ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図１２Ｇ】
【図１２Ｈ】
【図１２Ｉ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結ヒト筋由来始原細胞（ＭＤＣ）を含む医薬組成物であって、該ＭＤＣが、
（ａ）ヒト骨格筋細胞を第一細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁する工程；
（ｂ）培地を該第一細胞培養容器から第二細胞培養容器に傾瀉する工程；
（ｃ）該培地中に残存する細胞を該第二細胞培養容器の壁に付着させる工程；
（ｄ）該第二細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程；
（ｅ）細胞数を増大させるために該細胞を培養する工程；および
（ｆ）該細胞を凍結する工程
を含む方法に従って単離され、凍結細胞がヒトＭＤＣである、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＭＤＣが−３０℃未満の温度で凍結される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＭＤＣが−７０℃未満の温度で凍結される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＭＤＣがドライアイス上で凍結される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
治療を必要とするヒト被験体において心臓状態によって引き起こされる心臓の欠陥を治療する方法であって、
（ａ）該ヒト被験体から骨格筋細胞を単離する工程；
（ｂ）該細胞を１０℃未満の温度に冷却する工程；
（ｃ）ヒト骨格筋細胞を第一細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁する工程；
（ｄ）培地を該第一細胞培養容器から第二細胞培養容器に傾瀉する工程；
（ｅ）該培地中に残存する細胞を該第二細胞培養容器の壁に付着させる工程；
（ｆ）該第二細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程であって、単離された細胞がＭＤＣである、工程；
（ｇ）細胞数を増大させるために該細胞を培養する工程；
（ｈ）該ＭＤＣを−３０℃未満の温度で凍結する工程；および
（ｉ）該ＭＤＣを解凍して、該ヒト被験体の心臓に該ＭＤＣを投与する工程；
を含み、それによって治療を必要とするヒト被験体において心臓状態によって引き起こされる心臓の欠陥を治療する、方法。
【請求項６】
前記心臓状態が、心筋梗塞、心不全、アダムズ‐ストークス病、先天性心疾患、狭心症、不整脈、心房細動、細菌性心内膜炎、心筋症、うっ血性心不全、拡張機能障害、心雑音および心室期外収縮から成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記心臓状態が前記ヒト被験体において開始する前に、前記骨格筋細胞が該ヒト被験体から単離される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記心臓状態が前記ヒト被験体において開始した後に、前記骨格筋細胞が該ヒト被験体から単離される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＤＣが、前記心臓に該ＭＤＣを注射する工程によって投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＭＤＣが前記心臓壁に注射される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
心機能の改善を必要とする哺乳動物被験体において心機能を改善する方法であって、
（ａ）ヒト被験体から骨格筋細胞を単離する工程；
（ｂ）ヒト骨格筋細胞を第一細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁する工程；
（ｃ）培地を該第一細胞培養容器から第二細胞培養容器に傾瀉する工程；
（ｄ）該培地中に残存する細胞を該第二細胞培養容器の壁に付着させる工程；
（ｅ）該第二細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程であって、単離された細胞がＭＤＣである、工程；および
（ｆ）該ＭＤＣを該ヒト被験体の心臓に投与する工程；
を含み、それによって心機能を改善を必要とする哺乳動物被験体において心機能を改善する、方法。
【請求項１２】
前記心機能の改善が、左心室収縮性の改善である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＤＣが、前記心臓に該ＭＤＣを注射する工程によって投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＤＣが心臓壁に注射される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＤＣが、前記ヒト被験体の心臓に投与される前にその数を増大させるために培養される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物骨格筋由来始原細胞（ＭＤＣ）の目標集団を単離する方法であって、
（ａ）ヒト骨格筋細胞を第一細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁する工程；
（ｂ）培地を該第一細胞培養容器から第二細胞培養容器に傾瀉する工程；
（ｃ）該培地中に残存する細胞を該第二細胞培養容器の壁に付着させる工程；および
（ｄ）該第二細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程；
を含み、それによってＭＤＣの目標集団を単離する、方法。
【請求項１８】
前記ＭＤＣがその後凍結される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＭＤＣが−３０℃未満の温度で凍結される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＤＣが−７０℃未満の温度で凍結される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭＤＣがドライアイス上で凍結される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１】
凍結ヒト筋由来始原細胞（ＭＤＣ）を含む医薬組成物であって、該ＭＤＣが、
（ａ）ヒト骨格筋細胞を第一細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁する工程；
（ｂ）培地を該第一細胞培養容器から第二細胞培養容器に傾瀉する工程；
（ｃ）該培地中に残存する細胞を該第二細胞培養容器の壁に付着させる工程；
（ｄ）該第二細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程；
（ｅ）細胞数を増大させるために該細胞を培養する工程；および
（ｆ）該細胞を凍結する工程
を含む方法に従って単離され、凍結細胞がヒトＭＤＣである、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＭＤＣが−３０℃未満の温度で凍結される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＭＤＣが−７０℃未満の温度で凍結される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＭＤＣがドライアイス上で凍結される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
治療を必要とするヒト被験体において心臓状態によって引き起こされる心臓の欠陥を治療する方法であって、
（ａ）該ヒト被験体から骨格筋細胞を単離する工程；
（ｂ）該細胞を１０℃未満の温度に冷却する工程；
（ｃ）ヒト骨格筋細胞を第一細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁する工程；
（ｄ）培地を該第一細胞培養容器から第二細胞培養容器に傾瀉する工程；
（ｅ）該培地中に残存する細胞を該第二細胞培養容器の壁に付着させる工程；
（ｆ）該第二細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程であって、単離された細胞がＭＤＣである、工程；
（ｇ）細胞数を増大させるために該細胞を培養する工程；
（ｈ）該ＭＤＣを−３０℃未満の温度で凍結する工程；および
（ｉ）該ＭＤＣを解凍して、該ヒト被験体の心臓に該ＭＤＣを投与する工程；
を含み、それによって治療を必要とするヒト被験体において心臓状態によって引き起こされる心臓の欠陥を治療する、方法。
【請求項６】
前記心臓状態が、心筋梗塞、心不全、アダムズ‐ストークス病、先天性心疾患、狭心症、不整脈、心房細動、細菌性心内膜炎、心筋症、うっ血性心不全、拡張機能障害、心雑音および心室期外収縮から成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記心臓状態が前記ヒト被験体において開始する前に、前記骨格筋細胞が該ヒト被験体から単離される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記心臓状態が前記ヒト被験体において開始した後に、前記骨格筋細胞が該ヒト被験体から単離される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＤＣが、前記心臓に該ＭＤＣを注射する工程によって投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＭＤＣが前記心臓壁に注射される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
心機能の改善を必要とする哺乳動物被験体において心機能を改善する方法であって、
（ａ）ヒト被験体から骨格筋細胞を単離する工程；
（ｂ）ヒト骨格筋細胞を第一細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁する工程；
（ｃ）培地を該第一細胞培養容器から第二細胞培養容器に傾瀉する工程；
（ｄ）該培地中に残存する細胞を該第二細胞培養容器の壁に付着させる工程；
（ｅ）該第二細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程であって、単離された細胞がＭＤＣである、工程；および
（ｆ）該ＭＤＣを該ヒト被験体の心臓に投与する工程；
を含み、それによって心機能を改善を必要とする哺乳動物被験体において心機能を改善する、方法。
【請求項１２】
前記心機能の改善が、左心室収縮性の改善である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＤＣが、前記心臓に該ＭＤＣを注射する工程によって投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＤＣが心臓壁に注射される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＤＣが、前記ヒト被験体の心臓に投与される前にその数を増大させるために培養される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物骨格筋由来始原細胞（ＭＤＣ）の目標集団を単離する方法であって、
（ａ）ヒト骨格筋細胞を第一細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁する工程；
（ｂ）培地を該第一細胞培養容器から第二細胞培養容器に傾瀉する工程；
（ｃ）該培地中に残存する細胞を該第二細胞培養容器の壁に付着させる工程；および
（ｄ）該第二細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程；
を含み、それによってＭＤＣの目標集団を単離する、方法。
【請求項１８】
前記ＭＤＣがその後凍結される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＭＤＣが−３０℃未満の温度で凍結される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＤＣが−７０℃未満の温度で凍結される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭＤＣがドライアイス上で凍結される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１７に記載の方法。
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図１５Ｇ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１７】
【図１８】
【図１４−２】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１５Ｄ】
【図１５Ｅ】
【図１５Ｆ】
【図１５Ｇ】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２０１０−５１１０５１（Ｐ２０１０−５１１０５１Ａ）
【公表日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３９３１９（Ｐ２００９−５３９３１９）
【出願日】平成１９年１１月２８日（２００７．１１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２４５６６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６６８８６
【国際公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【出願人】（５０４２７９９６８）ユニバーシティー オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション (24)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２８日（２００７．１１．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２４５６６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６６８８６
【国際公開日】平成２０年６月５日（２００８．６．５）
【出願人】（５０４２７９９６８）ユニバーシティー オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション (24)
【Ｆターム（参考）】
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