心血管または脳血管主要有害事象を検出するための方法
本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法に関する。本方法は、１セットの分析物、例えばアルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよび組織因子の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定することを含み得る。本方法は、前記セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数を決定すること、およびＭＡＣＣＥ指数がゼロより大きい場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度増加、またはＭＡＣＣＥ指数がゼロ以下である場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度低下を有するものとしてそのヒトを同定することも含み得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、２００７年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９８，５６３号および２００７年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／９９８，７５６号に対する優先権および利益を、米国特許法セクション１１９（ｅ）のもとに主張する。米国仮特許出願第６０／９９８，５６３号および米国仮特許出願第６０／９９８，７５６号のそれぞれの全ての開示は、参考により本明細書中に援用される。
【０００２】
本教示は、ヒトが心血管または脳血管主要有害事象、すなわちＭＡＣＣＥに罹患するかどうかを予測するための方法に関する。より具体的には、本教示は、１つ以上の分析物を使用することにより、心血管または脳血管主要有害事象を有するまたは発現するリスクがあることについて個体をスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
心臓発作は、単独首位の死因である（ｗｗｗ．ａｍｅｒｉｃａｎｈｅａｒｔ．ｏｒｇ参照）。米国における死亡の５件に１件は心臓発作に起因する。２００４年、米国では、およそ１，２００，０００件の新規および再発性心血管発作に起因する心臓発作による死亡が４５２，３２７件あった。
【０００４】
脳卒中は、米国における第三位の死因である（ｗｗｗ．ａｍｅｒｉｃａｎｈｅａｒｔ．ｏｒｇ参照）。およそ７００，０００件の新規および再発性脳血管事象に起因して２００４年には１５０，１４７人が脳卒中により命を奪われた。米国において、脳卒中は、重篤な長期能力障害の主要原因である。米国では、今日、約５，７００，０００人の脳卒中生存者が生き続けている。２，４００，０００人が男性であり、３，３００，０００人が女性である。
【０００５】
心臓発作も、一定のタイプの脳卒中も、受攻性アテローム硬化性プラークの破裂の結果として生じ得る（非特許文献１、非特許文献２）。現在、心臓発作または脳卒中を有するリスクは、一般人口において一定の臨床的および生化学的リスク因子を考慮することにより評定されている（非特許文献３；非特許文献４）が、これらの特徴は、心血管リスクを完全には説明しない（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００６】
心臓発作または脳卒中の将来の発生を予測する能力が向上すれば、そのようなリスクを有する個体を予防対策のターゲットにすることができ、また、これらの主要死因の発生全体を減少させることができよう。
【０００７】
個体の血液中の多数のタンパク質および代謝産物の測定により、その個体の生化学的状態への「窓口」の見通しが得られ、ならびに彼または彼女の心血管系の状態についてのより良好な示度、およびその被験者が将来心臓発作または脳卒中を経験する尤度が得られるだろう（非特許文献７）。この理論的根拠をもって、本発明者らは、血液または血漿中の分子バイオマーカープロフィール（例えば、１セットのタンパク質、１セットの代謝産物、１セットのタンパク質および代謝産物、またはタンパク質および／もしくは代謝産物を含み得る１セットの他の分析物）および近々の心血管または脳血管主要有害事象（ＭＡＣＣＥ）を予測する関連アルゴリズムの発見を目的として研究を行った。
【０００８】
このように、主要急性心臓事象を予測するための診断法が、依然として必要とされている。詳細には、心血管および脳血管主要悪性事象の診断および／または予測が可能となる、信頼でき、且つ、費用効率の高い方法および組成物が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎａｇｈａｖｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０８：１６６４−７２，２００３
【非特許文献２】Ｎａｇｈａｖｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０８：１７７２−８，２００３
【非特許文献３】Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９７：１８３７−４７，１９９８
【非特許文献４】ＡＴＰ ＩＩＩ，ＪＡＭＡ ２８５：２４８６−９７，２００１
【非特許文献５】Ｋｈｏｔら、ＪＡＭＡ２９０：８９８−９０４，２００３
【非特許文献６】Ｇｒｅｅｎｌａｎｄら、ＪＡＭＡ ２９０：８９１−７，２００３
【非特許文献７】Ｖａｓａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１１３：２３３５−６２，２００６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本教示は、個体が心血管または脳血管主要有害事象、すなわちＭＡＣＣＥ、に罹患することを予測するための方法に関する。この方法は、その個体からの血液サンプルから採取した血漿または血清中の一定の分析物、例えばタンパク質および代謝産物、の１つ以上についてのレベルを測定すること、およびその後、決定アルゴリズムを用いて、その個体がＭＡＣＣＥを経験する可能性が高いかどうかを予測することを含む。
【００１１】
被験者における心血管または脳血管主要有害事象の尤度の予測に有用である血液中のマーカーを同定した。これらのマーカーのレベルは、標準と異なるとき、心血管または脳血管主要有害事象の予兆となる。本教示による方法は、１つ以上の分析物を利用して心血管または脳血管主要有害事象を予測する。具体的には、これらの分析物のうちの１つ以上の使用、およびこれらの分析物のレベルが標準と異なるかどうかの判定により、心血管または脳血管主要有害事象を発現するリスクがあることについて被験者をスクリーニングすることができる。
【００１２】
本教示の分析物は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度の単なる予測以上に有用であり得る。それらの分析物を使用して、心血管または脳血管主要有害事象を予防するための候補薬をスクリーニングすることができる。それらの分析物を使用して、健康状態のモニターを必要とする被験者を同定することができる。また、それらの分析物を使用して、冠動脈疾患または脳血管疾患についての動物モデルを検証することができる。
【００１３】
１つの態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供する。この方法は、１セットの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度の測定を含む。セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および組織因子を含む場合がある。前記方法は、セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数を決定すること、およびそのＭＡＣＣＥ指数がより大きい場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度増加、またはそのＭＡＣＣＥ指数がゼロ以下である場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度低下を有するものとしてそのヒトを同定することをさらに含む。
【００１４】
別の態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づいて、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することを含む。セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および組織因子を含む場合がある。前記方法は、ＭＡＣＣＥ指数、心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することも含む。
【００１５】
さらなる態様において、本教示は、ヒトを治療する方法を提供する。この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥを決定することを含む。セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および組織因子を含む場合がある。前記方法は、ヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合、治療を推奨する、是認する、または施与することをさらに含む場合がある。
【００１６】
様々な実施形態によると、セットの分析物は、ＣＤ４０、フィブリノゲン、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、およびフォン・ヴィルブランド因子も含む場合がある。一部の実施形態によると、セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数の決定は、それぞれの分析物の測定濃度を標準化して、標準化濃度を得ること、それぞれの分析物の標準化濃度に分析物定数をかけて分析物値を得ること、次いで、それぞれの分析物の分析物値を合計してＭＡＣＣＥ指数を得ることを含む場合がある。一定の実施形態によると、測定濃度の標準化は、測定濃度から個体群平均値を引いて結果を得ること、およびその結果を個体群平均値の標準偏差で割ることを含む場合がある。
【００１７】
一部の実施形態において、前記方法は、１セットの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定することを含み、ここで、セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子から成る場合がある。前記方法は、セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数を決定すること、およびＭＡＣＣＥ指数がゼロより大きい場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度増加、またはＭＡＣＣＥ指数がゼロ以下である場合には心血管または脳血管主要有害事象の尤度低下を有するものとしてそのヒトを同定することをさらに含む。
【００１８】
さらなる態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づいて、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することを含む。セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子から成る場合がある。前記方法は、ＭＡＣＣＥ指数、心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することも含む場合がある。
【００１９】
本教示の追加の態様は、ヒトを治療する方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することを含む。セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子から成る場合がある。前記方法は、そのヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合、治療を推奨すること、是認すること、または施与することも含む場合がある。
【００２０】
本教示の様々な実施形態によると、セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数の決定は、それぞれの分析物の測定濃度を標準化して標準化濃度を得ること、それぞれの分析物の標準化濃度に分析物定数をかけて分析物値を得ること、次いで、それぞれの分析物の分析物値を合計してＭＡＣＣＥ指数を得ることを含む場合がある。一定の実施形態によると、測定濃度の標準化は、測定濃度から個体群平均値を引いて結果を得ること、およびその結果を個体群平均値の標準偏差で割ることを含む。
【００２１】
他の態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、１セットの分析物の少なくとも１つの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定することを含む。セットの分析物は、システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、アポリポタンパク質Ａ１、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８／１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、アラビノース、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群である。前記方法は、測定濃度と所定の閾値との比較に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定することをさらに含む。
【００２２】
別の態様において、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の少なくとも１つの分析物の測定濃度を所定の閾値と比較して、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を確認することを含む。セットの分析物は、システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、アポリポタンパク質Ａ１、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８／１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、アラビノース、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択される。前記方法は、測定濃度、所定の閾値、および心血管または脳血管主要有害事象の尤度のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することも含む場合がある。
【００２３】
追加の態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、１８：１／１７：１／１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択される１セットの分析物の少なくとも１つの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定することを含む。前記方法は、測定濃度と所定の閾値との比較に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定することも含む場合がある。
【００２４】
さらなる態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の少なくとも１つの分析物の測定濃度を所定の閾値と比較して、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を確認することを含む。分析物は、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、１８：１／１７：１／１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択される。前記方法は、測定濃度、所定の閾値、および心血管または脳血管主要有害事象の尤度のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することも含む場合がある。
【００２５】
様々な実施形態によると、分析物システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールのそれぞれについての所定の閾値は、それぞれ各々の分析物についての表４中の第４四分位数の下限であり得、この場合、第４四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる。一部の実施形態によると、分析物システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールのそれぞれについての所定の閾値は、それぞれ各々の分析物についての表４中の第３および第４四分位数の下限であり得、ここで、第３および第４四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる。
【００２６】
様々な実施形態によると、分析物アポリポタンパク質Ａ１、２０：４リゾホスファチジルコリンおよびアラビノースのそれぞれについての所定の閾値は、それぞれ各々の分析物についての表４中の第１四分位数の上限であり得、ここで、第１四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる。一部の実施形態によると、分析物アポリポタンパク質Ａ１、２０：４リゾホスファチジルコリンおよびアラビノースのそれぞれについての所定の閾値は、それぞれ各々の分析物についての表４中の第１および第２四分位数の上限であり得、ここで、第１および第２四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる。
【００２７】
本教示の様々な実施形態において、血液系サンプルは、血清または血漿であり得る。
【００２８】
さらなる態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトから少なくとも１つの血液系サンプルを得ること、そのヒトからのサンプル中の添付書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度を測定すること、および付属書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定することを含む場合がある。
【００２９】
さらなる態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法を提供し、ここで、この方法は、そのヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度を測定すること、絶対濃度を所定の閾値と比較すること、付属書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定すること、および心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、絶対濃度、所定の閾値またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む。
【００３０】
一部の態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトから少なくとも１つの血液系サンプルを得ること、そのヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度を測定すること、および付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定することを含む。
【００３１】
さらなる態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法を提供し、ここで、この方法は、そのヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度を測定すること、相対濃度を所定の閾値と比較すること、付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定すること、および心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、相対濃度、所定の閾値またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む。
【００３２】
前記方法の様々な実施形態によると、ＭＡＣＣＥ指数、心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、測定濃度、所定の閾値、またはそれらの等価物は、スクリーンもしくは有形媒体に表示され、またはＭＡＣＣＥ指数は、医療業界の人、医療保険プロバイダーもしくは医師に転送される。
【００３３】
別の態様において、本教示は、治療方法を提供し、ここで、この治療方法は、付属書類１において確認される１つ以上の分析物の、血液系サンプル中の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または低下を有するものとしてヒトを同定すること、およびそのヒトが心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合には、治療を推奨すること、是認することまたは施与することを含む場合がある。
【００３４】
さらなる態様において、本教示は、治療を受けるべきでないヒトを同定する方法を提供し、ここで、この方法は、付属書類１において確認される１つ以上の分析物の、血液系サンプル中の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または低下を有するものとしてヒトを同定すること、およびそのヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものと同定されない限り、治療の推奨、是認または施与を拒否することを含む場合がある。
【００３５】
本教示の前述ならびに他の特徴および利点は、以下の図、説明、実施例および特許請求の範囲から、さらに十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
上記の本教示の前述ならびに他の目的、特徴および利点は、添付の図面と一緒に読むと、様々な例証となる実施形態の以下の説明から、さらに十分に理解されるであろう。本図面中の同様の参照記号は、異なる図を通じて同じ要素を一般に指す。下記の図面が単に例証のためのものであることは、理解されるはずである。本図面は、いかなる点においても本教示の範囲を限定するためのものではない。
【図１】本教示の例示的実施形態による血漿サンプル中の表５からの上位２０の分析物のレベルを用いた２年以内のＭＡＣＣＥの発生についての予測を図示する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【図２】本教示の例示的実施形態による血漿サンプル中の表６からの上位１０のタンパク質分析物のレベルを用いた２年以内のＭＡＣＣＥの発生についての予測を図示する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
心血管または脳血管主要有害事象の予兆となる分析物を同定した。これらの分析物の１つ以上が、標準物質中のものとは異なる量で個体からの体液サンプル中に存在する場合、それらは、その個体が心血管または脳血管主要有害事象を有するまたは発現するリスクがあることを示し得る。本出願は、２００７年１０月１０日出願の米国特許仮出願番号６０／９９８，５６３、および２００７年１０月１１日出願の米国特許仮出願番号６０／９９８，７５６のそれぞれについての全開示を参照により本明細書に組み入れる。
【００３８】
本出願全体を通して、組成物を、特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載する場合、またはプロセスを、特定のプロセス工程を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載する場合、本教示の該組成物が、列挙する成分から本質的に成る、または成ることも考えられ、本教示の該プロセスが、列挙するプロセス工程から本質的に成る、または成ることも考えられる。
【００３９】
本出願において、要素または成分を、列挙する要素または成分のリストに含まれる、および／またはから選択されると言う場合、該要素または成分は、列挙する要素または成分のうちのいずか１つである場合もあり、列挙する要素または成分の２つ以上から成る群から選択される場合もあると解釈すべきである。さらに、本明細書に記載する組成物、装置または方法の要素および／または特徴は、本明細書中で明示的であろうと、暗示的であろうと、本教示の精神および範囲を逸脱することなく様々な方法で組み合わせることができると解釈すべきである。
【００４０】
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」または「有する（現在分詞形）（ｈａｖｉｎｇ）」の使用は、特に別様に述べていない限り、無制限であり、非限定的であると一般に解釈すべきである。
【００４１】
本明細書における単数形の使用は、特に別様に述べていない限り、複数形を含む（逆もまた同じ）。加えて、用語「約」の使用が、量的値の前にある場合、特に別様に述べていない限り、本教示は、その特定の量的値自体も含む。本明細書において用いる場合、用語「約」は、その公称値からの±１０％の偏差を指す。
【００４２】
工程の順序、または一定の動作を実施するための順序は、本教示が実施可能であり続ける限り、重要でないと解釈すべきである。さらに、２つ以上の工程または作用が、同時に行われることもある。
【００４３】
７２３の分析物を同定した。本教示による一定の方法は、これらの分析物の２つ以上を利用して、心血管または脳血管主要有害事象を予測する。具体的には、これらの方法では、被験者からのサンプルをスクリーニングして、そのサンプルが、これらの７２３の分析物のそれぞれについて、標準サンプルとは異なる２つ以上のレベルを含有するかどうかを判定することができる。サンプルが、これらの分析物の２つ以上のそれぞれについての、標準物質中のこれらの分析物の量とは異なる量を含有する場合、スクリーニングは、「陽性スクリーニング」（すなわち、その個体は、心血管または脳血管主要有害事象に罹患するリスクがある）とみなされる。心血管または脳血管主要有害事象を分類する際、一般に、多数の分析物を使用するほど、高い感度および特異性を得ることができる。これらの分析物を含有する可能性があるサンプルは、多数の源（例えば、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、上皮細胞、および内皮細胞）から得られる多数の生体サンプル（例えば、体液、組織、細胞）から抽出することができる。本明細書に開示する７２３の分析物（表５において確認されている５０の分析物だけでない）の可能な組み合わせすべてを、本教示による方法において使用することができると解釈すべきである。
【００４４】
実施例１においてさらに十分に説明する方法論を用いて、７２３の分析物を同定した。簡単に言うと、特定の分析分類プロトコルにより、７２３の分析物１セットを分析し、スペクトルのピークを得た。付属書類１から４は、分析した７２３の分析物を含む特定の分子を提供する。これらのピークは、特定の分子の特性を表す。（７２３の分析物すべてを含む）これらのピークを利用して、５０のピーク（ならびに下記のような他の好ましいピーク）を同定した。ピークが分子の特性を表す限り、５０のピークをそれよりはるかに多い数のピークの中から同定するということは、５０の分析物に対応する５０より多くの分子を含む一群の分子からそれらの分析物が選択されることを意味する。分析物（すなわち、分子）は、いずれのタイプの分子であってもよい。分析物（分子）としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、ステロイド、核酸、代謝産物および元素が挙げられるが、これらに限定されない。表５は、５０のピークを含む特定の分子を提供する（すなわち、選択した分析物を確認する）。表５の第２欄は、重量によってピークをランク順に配列している。従って、最高重量ピークが番号１にランク付けされ、最低重量ピークが番号５０にランク付けされる。
【００４５】
分析物（すなわち、７２３の同定された分析物のいずれか、または好ましい５０の分析物のいずれか）がわかったので、それらを使用して個体をスクリーニングして、その個体からのサンプル中のこれらの分析物のうちの２つ以上のそれぞれについての量または絶対濃度が、標準からの２つ以上の分析物のそれぞれについての量と異なるかどうかを判定することができ、標準と比較してそのサンプル中の２つ以上の分析物のそれぞれについてのその個体の相対濃度を決定することができ、および心血管または脳血管主要有害事象を発現するリスクを有するものとしてまたはリスクがあるものとして、ある一定の特異性および感度まで、その個体を分類することができる。勿論、分析物の測定量または濃度を比較前に標準化することができる。調査する分析物の数に基づき、アッセイの望ましい感度および特異性を選択することができる。標準は、実際のサンプルである場合もあり、以前に生成された実験データである場合もある。標準は、正常とわかっている人から得ることができる。正常とわかっている人は、健常人である場合もあり、サンプル採取前の所定の期間、所定の食事を摂る場合もある。さらに、サンプルを、被験者と同じ性別の、正常とわかっている人から得る場合ができる。あるいは、分析物を心血管または脳血管主要有害事象がわかっている被験者のものと比較してもよく、この場合、それら２サンプル間の類似性、または標準と比較した分析物の相対濃度を調査することとなろう。医療専門家は、被験サンプルをスクリーニングするために様々な技術および／またはキットを用いて被験サンプル中の特定の分析物のレベルおよび／または量を決定することができる。そのようなアッセイの例は、以下に記載するが、それらとしては、限定されないが、イムノアッセイ、質量分析、クロマトグラフィー、化学分析、比色アッセイ、分光分析、電気化学的分析、および核磁気共鳴が挙げられる。加えて、そのようなアッセイは、全血、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、尿、精液、乳頭穿刺液、膵液、およびこれらの組み合わせをはじめとする任意の生体サンプルを用いて行うことができる。これらのアッセイは、特定の分析物を検出するためにどれが一番適するのか、ならびに特定の生体サンプルと共に使用するためにどれが一番適するのかに基づいて選択される。従って、多数のアッセイを用いて所望の分析物を検出することができ、１つ以上の源からのサンプルを分析することができる。
【００４６】
分析物は、１つ以上の分離方法を用いることによって検出および／または定量することができる。例えば、適する分離方法をしては、質量分析法、例えば、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ（ｎは、ゼロより大きい整数である）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、表面強化レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン利用脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−ＭＳ（ＭＳ）ｎを挙げることができる。他の質量分析法としては、中でも、四重極、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）およびイオントラップを挙げることができる。同じく使用することができる分光測定技術としては、共鳴分光法および光学分光法が挙げられる。
【００４７】
他の適する分離方法としては、化学抽出分配、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性（逆相）液体クロマトグラフィー、等電点分画、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、または他のクロマトグラフ技術、例えば薄層、ガスもしくは液体クロマトグラフィー、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。１つの実施形態では、アッセイすべき生体サンプルを、分離方法の適用前に分画する場合がある。
【００４８】
クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」））と質量分析（「ＭＳ」）とのタンデム連結は、１つ以上の分析物の検出および定量に有用であり得る。ＬＣは、個体からのサンプル中の、分析物を含み得る分子を分離するために用いることができる。高温で保持することができるＬＣ装置の注入口に、溶媒に溶解した少量のサンプルを注入することができる。この装置のＬＣカラムには、極性である場合もありまたは非極性である場合もある固体支持体が収容されている。サンプル中の分子の様々な極性のため、分子は、カラム内の固体支持体に対して様々な親和性を有し、異なる時間で溶出するであろう。支持体への分子の親和性が強いほど、カラム内での分子の保持時間が長くなる。それらの分子は、カラムを出ると、質量分析計に入る。質量分析計によって、分子はイオン化される。タンデム質量分析モードで、システムを正しく標準化することができれば、質量分析計に送られたそれぞれの化合物は、様々な質量および存在度のイオンにフラグメント化して、その物質に特有のシグネチャーパターンを形成する。それぞれのピークのタンデム質量分析図をコンピュータデータベースと比較することにより、コンピュータは、通常、それらの分子を高い確度で同定することができる。あるいは、または加えて、この比較を人的検査によって行うことができる。素性が確認されたら、コンピュータは、それぞれのピーク下面積を積分することにより混合物中のそれぞれの分子の相対量を決定する。分子のいずれかが分析物として同定されれば、分析物の量を標準からの分析物の量と比較して、差があるかどうかを判定することができる。
【００４９】
分析物自体の物理的分離を必要としない方法によって分析物を検出および／または定量することもできる。例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を用いて、分子の複雑な混合物から分析物のプロフィールを解明することができる。腫瘍を分類するためのＮＭＲの類似の使用が、例えば、Ｈａｇｂｅｒｇ，ＮＭＲ Ｂｉｏｍｅｄ．１１：１４８−５６（１９９８）に開示されている。追加の手順としては、個々の分子の物理的分離を伴わずに分析物プロフィールを決定するために用いることができる、核酸増幅技術が挙げられる。（例えば、Ｓｔｏｒｄｅｕｒら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５９：５５−６４（２００２）およびＴａｎら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１３８７−１１３９２（２００２）参照）。
【００５０】
サンプル中の分析物は、分析物と特異的に結合することができる結合分子と分析物を化合させることによって検出および／または定量することができる。結合部分としては、例えば、リガンド−受容体ペア、すなわち、特異的結合相互作用を有することができる１対の分子のメンバーを挙げることができる。結合部分としては、例えば、特異的結合ペア、例えば、抗体−抗原、酵素−基質、核酸−核酸、タンパク質−核酸、タンパク質−タンパク質、または当該技術分野において公知の他の特異的結合ペアも挙げることができる。ターゲットに対する親和性が強化された結合タンパク質を設計することができる。場合によっては、結合部分を検出可能な標識、例えば、酵素標識、蛍光標識、放射性標識、リン光標識または着色粒子標識と連結させることができる。標識された複合体を、例えば目視でまたは分光分析計もしくは他の検出器によって検出することができ、ならびに／あるいは定量することができる。
【００５１】
当該技術分野において利用可能なゲル電気泳動技術を用いて、分析物を検出および／または定量することもできる。二次元ゲル電気泳動の場合は、先ず、分子を、それらの等電点に従ってｐＨ勾配ゲル中で分離する。次に、得られたゲルを第二ポリアクリルアミドゲル上に置き、分子量に従って分子を分離することができる（例えば、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７−４０２１（１９７５）参照）。心血管または脳血管主要有害事象のための分析物は、先ず、心血管または脳血管主要有害事象のリスクがあることが疑われる個体から得たサンプルから分子を単離し、次に、二次元ゲル電気泳動により分子を分離して特徴的な二次元ゲル電気泳動パターンを生じさせることによって検出することができる。その後、パターンを、標準（例えば、健常または主要急性心臓事象被験者）から単離した分子を同じまたは類似の条件下で分離することによって生じさせた標準ゲルパターンと比較することができる。標準ゲルパターンを電気泳動パターンの電子データベースに保存し、そこから検索することもできる。このようにして、被験者におけるマーカーの量が、標準における量と異なるかどうかを判定することができる。正常とわかっている標準とは異なる量での二次元ゲル上の複数の、例えば２から５０の、心血管または脳血管主要有害事象分析物の存在は、個体における心血管または脳血管主要有害事象についての陽性スクリーニングを示す。このようにして、アッセイにより、心血管または脳血管主要有害事象の予測および治療が可能となる。
【００５２】
当該技術分野において利用可能な広範なイムノアッセイ技術のいずれかを用いて、分析物を検出および／または定量することもできる。例えば、サンドイッチイムノアッセイ形式を用いて、被験者からのサンプル中の分析物を検出および／または定量することができる。あるいは、従来の免疫組織化学手順を用いて、１つ以上の標識結合タンパク質を使用してサンプル中の分析物の存在を検出および／または定量することができる。
【００５３】
サンドイッチイムノアッセイでは、分析物に結合することができる２つの抗体、例えば、固体支持体上に固定化されたもの、および、溶液中で遊離しており、検出可能な化合物で標識されているものが一般に使用される。第二の抗体のために使用することができる化学標識の例としては、放射性同位元素、蛍光化合物、および反応体または酵素基質に曝露されると有色のまたは電気化学的に活性な生成物を生じさせる酵素または他の分子が挙げられる。分析物を含有するサンプルをこの系の中に置くと、分析物は、固定化抗体と標識抗体との両方に結合して、支持体の表面に「サンドイッチ」免疫複合体を形成する。結合していないサンプル成分および過剰な標識抗体を洗浄除去し、支持体の表面で分析物と複合体化した標識抗体の量を測定することによって、複合体化した分析物を検出する。あるいは、化学部分、例えばハプテンで標識することができる、溶液中で遊離している抗体を、遊離抗体に結合する検出可能な部分で標識したまたは例えばハプテンをそれにカップリングさせた第三の抗体によって検出することができる。
【００５４】
良好な検出限界を有する標識を使用すれば、サンドイッチイムノアッセイおよび組織免疫組織化学手順の両方が高特異的であり、非常に感度が高い。免疫学的アッセイの設計、理論およびプロトコルの詳細な論評は、Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）およびＨａｒｌｏｗら Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）はじめとする、当該技術分野における非常に多数のテキストにおいて見出すことができる。
【００５５】
一般に、イムノアッセイ設計考慮事項としては、非特異的相互作用の生成物と確実に区別することができる複合体を形成するためにターゲットに対する十分高い結合特異性を有する抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）の調製が挙げられる。本明細書において用いる場合、用語「抗体」は、ターゲットに対する適切な結合親和性および特異性を有する結合タンパク質、例えば、抗体、または免疫グロブリン可変領域様結合領域を含む他のタンパク質を意味すると解釈する。抗体結合特異性が高いほど、検出することができるターゲット濃度は低い。本明細書において用いる場合、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、結合部分、例えば結合タンパク質が、約１０５Ｍ−１より大きい、さらに好ましくは約１０７Ｍ−１より大きいターゲットに対する結合親和性を有することを意味すると解釈する。
【００５６】
個体における心血管または脳血管主要有害事象を予測するためのアッセイにおいて有用である、単離されたターゲット分析物に対する抗体は、当該技術分野において周知であり記載されている標準的な免疫学的手順を用いて産生させることができる。例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，上記、参照。簡単に言うと、単離された分析物を使用して、マウス、ヤギまたは他の適する哺乳動物などの異種宿主において抗体を産生させることができる。宿主における抗体生産を増進することができる適切なアジュバントと分析物とを合わせ、例えば腹腔内投与によって宿主に注射することができる。宿主の免疫応答を刺激するために適する任意のアジュバントを使用することができる。一般に使用されるアジュバントは、フロイント完全アジュバント（死滅させ、乾燥させた微生物細胞を含み、例えば、サンディエゴのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．またはニューヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏから入手できる乳剤）である。多回抗原注射が所望される場合、後続の注射は、不完全アジュバント（例えば、無細胞乳剤）との組み合わせで抗原を含むことがある。ポリクローナル抗体は、対象となるタンパク質に対する抗体を含有する血清を抽出することによって、抗体生産宿主から単離することができる。モノクローナル抗体は、所望の抗体を生産する宿主細胞を単離すること、免疫学技術分野において公知の標準的な手順を用いてこれらの細胞を骨髄腫細胞と融合させること、およびターゲットと特異的に結合し、所望の結合親和性を有するハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）についてスクリーニングすることによって生産することができる。
【００５７】
抗体結合ドメインを生合成により生産し、結合ドメインのアミノ酸配列を操作して、ターゲット上の好ましいエピトープとの結合親和性を強化することもできる。特異的抗体方法論は十分に理解されており、文献に記載されている。それらの調製についてのより詳細な説明は、例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（上記）において見出すことができる。
【００５８】
加えて、当該技術分野においてＢＡＢＳまたはｓＦｖとしても公知である、遺伝子操作された生合成抗体結合部位を使用して、サンプルが分析物を含有するかどうかを判定することができる。（ｉ）非共有結合的に会合しているまたはジスルフィド結合している合成ＶＨおよびＶＬ二量体、（ｉｉ）共有結合で連結されているＶＨ−ＶＬ単鎖結合部位、（ｉｉｉ）個々のＶＨもしくはＶＬドメイン、または（ｉｖ）単鎖抗体結合部位を含むＢＡＢＳの作製および使用方法は、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；同第５，１３２，４０５号；同第４，７０４，６９２号；および同第４，９４６，７７８号に開示されている。さらに、分析物に対する必要不可欠な特異性を有するＢＡＢＳを、コンビナトリアル遺伝子ライブラリーからのファージ抗体クローニングによって誘導することができる（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）参照）。簡単に言うと、ファージ（単離された分析物で予備免疫したマウスに由来する可変領域遺伝子配列、またはそれらのフラグメントによってコードされた免疫グロブリン可変領域を有するＢＡＢＳを、それぞれがそれらのコート表面で発現）を、固定化分析物に対する生物活性についてスクリーニングする。固定化分析物に結合するファージを回収し、ＢＡＢＳをコードする遺伝子の塩基配列を決定することができる。その後、対象となるＢＡＢＳをコードする、得られた核酸配列を、従来の発現系において発現させて、ＢＡＢＳタンパク質を生産することができる。
【００５９】
組織または液体サンプル中の分析物のレベルをモニターするための診断および他の組織評価キットおよびアッセイの開発に、単離された分析物を使用することもできる。例えば、キットは、１つ以上の分析物に特異的に結合する、ならびに組織または液体サンプル中の１つ以上の分析物の存在および／または量を検出および／または定量できるようにする、抗体または他の特異的結合タンパク質を含む場合がある。
【００６０】
１つ以上の分析物の検出に適するキットは、評価すべきサンプルを捕捉するレセプタクルまたは他の手段、ならびにサンプル中の、本明細書に記載する分析物の１つ以上の存在および／または量を検出するための手段を含む（しかし、これらに限定されない）と考えられる。１つの実施形態において、検出のための手段としては、これらの分析物に特異的な１つ以上の抗体、およびこれらの分析物への抗体の結合を、例えば本明細書に記載する標準的なサンドイッチイムノアッセイにより検出するための手段が挙げられるが、それらに限定されない。細胞内に位置する分析物の存在を（例えば、組織サンプルから）検出すべき場合、キットは、細胞構造を破壊して細胞内成分を露出させる手段を含むこともある。
【００６１】
本教示の分析物は、特定の配列の核酸を含む場合がある。例えば実時間定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、サンプル中の分析物核酸の量または絶対濃度を決定し、測定量と標準とを比較してサンプル中の分析物核酸の相対濃度を決定することにより、分析物のうちの１つ以上を検出および／または定量することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲの結果として生ずる分析物核酸の量を有効に測定する。陽性の結果は、標準からの分析物の量と異なる分析物核酸の測定量、またはゼロより上もしくは下の値を有する相対濃度を表す。
【００６２】
特定の核酸分析物の核酸配列に相補的であるプライマーを開発することができる。これらのプライマーは、特定の核酸をコピーおよび増幅するようにポリメラーゼに命令する。ＲＴ−ＰＣＲは、反応中に増幅された核酸分析物の蓄積を検出する。ＰＣＲ反応の対数期の間、蓄積する核酸分析物を測定することができる。既知濃度の核酸を有する較正標準を使用して較正曲線を作成することができ、そこから試験サンプル中の核酸分析物の量を外挿法で推定することができる。
【００６３】
サンプル中の核酸分析物の量または絶対濃度がわかったら、それを、標準からの分析物の量と比較して、サンプル中の核酸分析物の相対濃度を決定することができる。心血管または脳血管主要有害事象被験者の分類のための標準は、経験的手段によって決定することができる。例えば、１人以上の正常とわかっている個体の個体群からのサンプル中の核酸分析物を増幅し、個体群における核酸分析物の量を定量分析することによって量を決定することができる。
【００６４】
また、サンプルについてのさらなる形態の化学分析を行うことができる。例えば、サンプル中のそれぞれの分析物の量または絶対濃度を示す定量試験を行うことができる。比色アッセイは、サンプル中のアッセイ材料の量の代用としてサンプルと反応物との反応によって生じる色強度を測定する定量化学分析である。試薬は、任意の分析物と反応したとき、アッセイサンプルに色を生じさせることを条件とし得る。その色の強度は、サンプル中の分析物の量に依存し得る。強度と較正カラーカードおよび／または標準との比較により、サンプル中の分析物の量を決定することができる。その後、この量を標準からの（例えば、正常とわかっている人からの）分析物の量と比較して、サンプル中の分析物の相対濃度を決定することができる。
【００６５】
加えて、尿検査を用いて、尿サンプル中の分析物の量または絶対濃度を決定することができる。尿サンプルは、様々な異なる計器および技術で検査される。一部の検査は、特定の物質の存在下で色を変えるプラスチックの薄いストリップであるディップスティックを使用する。ディップスティックを使用して、分析物の量を測定することができる。
【００６６】
少なくとも２つの分析物のそれぞれの絶対レベルまたは濃度を標準からの２つの分析物のそれぞれのレベルと比較して、それぞれの分析物の相対濃度を決定することにより、心血管または脳血管主要有害事象を有することまたは有するリスクがあることを診断できるばかりでなく、この同じ比較方法論を他の用途に適応させることができる。例えば、分析物を用いて、心血管または脳血管主要有害事象を治療するための候補薬をスクリーニングすることができる。この場合、分析物のレベルをモニターすることによって、候補薬での治療をモニターすることができる。分析物の絶対濃度が罹病レベルから標準レベルに戻し、それによって相対濃度がゼロに近づくならば、効力を判定することができる。さらに、心血管または脳血管主要有害事象を治療するために有効であることが既に判明している任意の薬物に関して、ある被験者は応答者である場合があり、またある被験者は非応答者である場合があるということもある。従って、治療の間、分析物をモニターして、分析物の絶対レベルまたは濃度が標準レベルに戻り、それによって相対濃度がゼロに近づくかどうかを判定することにより、薬物が有効であるかどうかを判定することができる。勿論、応答者および非応答者の既知個体群が一切存在しない場合もあるので、任意の心血管または脳血管主要有害事象被験者に対する薬物治療の効力を経時的にモニターしてもよい。それが意図した効果を生じない場合、その使用を継続することもあり、その代わりに別の薬物を供給することもある。
【００６７】
さらに、少なくとも２つの分析物のそれぞれの絶対濃度レベルを標準からの２つの分析物のそれぞれのレベルと比較することによる相対濃度の決定は、予防的スクリーニング手段として、心血管または脳血管有害事象が観察されたまさにそのときでなく（すなわち、該疾病が進行してしまった場合がある後に）行うことができる。例えば、心血管または脳血管有害事象の証拠が無いということを前提にして、心血管または脳血管主要有害事象を有するまたは有するリスクがあるという診断をできる限り早期に得るために、一定の年齢より後に所定の間隔で被験者をモニターしてもよい。スクリーニングが陽性である場合、医療専門家は、疾病の進行についてさらなるスクリーニングを推奨する可能性があり、および／または医療専門家は、薬物もしくは他の療法での治療を開始する可能性がある。
【００６８】
例えば分析物のそれぞれの量もしくは絶対濃度、分析物のそれぞれの標準に対する相対濃度、および／または心血管または脳血管主要有害事象を有するもしくは有するリスクがある尤度をはじめとする分析結果を、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに表示するまたは出力することができる。結果または診断の表示または出力は、例えば、口述、記述、視覚的表示など、コンピュータ可読媒体またはコンピュータシステムなどの任意の媒体を使用して、前述の分析のいずれかの結果をユーザーに伝達することを意味する。結果の出力が、ユーザーまたは連結された外部コンポーネント（複数可）、例えばコンピュータシステムまたはコンピュータメモリへの出力に限定されず、代替としてまたは追加として、任意のコンピュータ可読媒体などの内部コンポーネントに出力され得ることは、当業者には明らかであろう。コンピュータ可読媒体としては、ハードデバイス、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、およびＤＡＴを挙げることができるが、これらに限定されない。コンピュータ可読媒体は、データ通信のための搬送波または他の波形を含まない。本明細書で開示し、特許請求する様々なサンプル評価および診断方法をコンピュータで実施することが、必要ではないが、できること、および例えば、表示または出力を、例えば口述でまたは書面で（例えば手書きで）人に伝達することによって行うことができることは、当業者には明らかであろう。
【００６９】
さらに、分析物を使用して、心血管または脳血管主要有害事象の動物モデルを検証することができる。例えば、任意特定のモデルにおいて、サンプルを分析して、動物中の分析物のレベルが、心血管または脳血管主要有害事象がわかっている被験者における分析物のレベルと同じであるか判定することができる。これにより、例えば、上記の様式で候補薬を試験するためのモデルを検証することができる。
【実施例】
【００７０】
実施例１
この実施例は、心血管または脳血管主要有害事象のための分析物を同定するために用いる方法論を説明する。簡単に言うと、１３６人の被験者をこの研究に組み入れた。心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術または死亡と定義する心血管または脳血管主要有害事象を指標心カテーテル検査の２年以内に経験する被験者を同定することによって、疾病または対照カテゴリーのいずれかへの被験者の分類を果たした。
【００７１】
Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒで心カテーテル検査を受けた個体の長期研究（ｔｈｅ ＣＡＴＨＧＥＮ Ｓｔｕｄｙ）において得られたサンプルのコレクションから、冷凍血漿サンプルを得た。この血漿サンプルは、１３６人の研究被験者、６８の症例および６８のマッチした対照（以下で定義するとおり）からのものであった。症例および対照を彼らの冠動脈疾患（ＣＡＤ）指数、年齢、性別および人種に従ってマッチングした。症例および対照群の両方における研究被験者の一部は、心カテーテル検査および血管造影で冠動脈疾患の徴候を示さなかった。他の被験者は、より高いＣＡＤ指数スコアによって示されるような、様々な重症度の冠動脈狭窄を有した。
【００７２】
すべてのサンプルについて記録した臨床パラメータは、以下の表１に示すものであった。症例と対照とをマッチングしたときのものでないこれらのパラメータを、一部の統計解析（以下で論じるとおり）に追加の臨床因子として含めた。
【００７３】
【表１】
症例は、以下の特徴を有するものとして同定した。指標カテーテル検査の前に、被験者は、心臓事象または心筋梗塞（ＭＩ）のための冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）の履歴を有さなかった。被験者は、その後のＣＡＢＧを有さなかった。被験者の駆出分画は、≧４０％であり（指標カテーテル検査時）、欠測はなかった。指標カテーテル検査および血液サンプル採取の２年以内にＭＩ、ＰＣＩまたは死亡が発生した。非冠動脈疾患関連死（すなわち、肺性高血圧、癌など）を明確に有する被験者は除外した。指標カテーテル検査の７日以内にＰＣＩ関連事象を有する被験者は除外した。
【００７４】
対照例は、次の特徴を有するものとして同定した。指標カテーテル検査の前に、被験者は、心臓事象または心筋梗塞（ＭＩ）のための冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）の履歴を有さなかった。被験者は、その後のＣＡＢＧを有さなかった。被験者の駆出分画は、≧４０％であり（指標カテーテル検査時）、欠測はなかった。指標カテーテル検査および血液サンプル採取後少なくとも２年の期間、ＭＩ、ＰＣＩまたは死亡は発生しなかった。
【００７５】
下の表２に提示し、以下で詳細に説明するプラットホームを用いて、サンプルを包括的バイオ分析に付した。
【００７６】
【表２】
合計７２３の分析物をこの研究のバイオ分析パートで測定することに成功した。バイオ分析プラットホームそれぞれからのその合計に対する寄与を上の表２に示す。バイオ分析プラットホームの結果をプラットホーム単位で分析し、また、後続の統計解析（以下で論述）のために併せて単一の統合データセットにした。
【００７７】
液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）タンデム質量分析（「ＬＣ／ＭＳ」）メタボロミクス
この方法は、脂質分子の分解および検出のために最適化されている、液体クロマトグラフィーおよび質量分析条件を利用する。
【００７８】
この方法に従って、以下の材料を使用した。水、メタノールおよびイソプロパノールならびにジクロロメタン（ＨＰＬＣグレード）をはじめとする溶媒および試薬は、ＶＷＲ（ＵＳＡ）から購入した。ギ酸（９９％）、酢酸アンモニウム、ジクロロメタンおよびレセルピンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入した。ＨＰＬＣガードカラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ３００ Ｃ４ ３００Å ２．５μ ２．１×１０ｍｍ）および分析用カラム（Ｃ４ ３００Å ３．５μ ２．１×１５０ｍｍ）は、Ｗａｔｅｒｓ（マサチューセッツ州、ミルフォード）から購入した。オートサンプラーバイアル、３００μＬトータル・リカバリー・バイアル、およびねじ蓋は、Ｗａｔｅｒｓ（マサチューセッツ州、ミルフォード）から購入した。保管用の５００μＬエッペンドルフ管は、ＶＷＲから購入した。脂質内部標準物質１７：０ ＬＰＣ、２４：０ ＰＣおよび４０：０ ＰＣは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州、アラバスター）から購入し、３０：０ ＰＣおよび５１：０ ＴＧは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入した。
【００７９】
以下のプロトコルに従って、サンプルを抽出した。データ正規化のために、５つの内部標準物質を抽出溶液にスパイクした。内部標準物質の保存溶液は、個々の脂質に依存して１〜３ｍｇ／ｍＬの範囲の最終濃度を達成するように適切に計量した量のそれぞれの内部標準化合物を１：９ ＤＣＭ／ＩＰＡ溶液に溶解することによって調製した。抽出溶液は、５つの保存溶液それぞれの３００μＬを、３００ｍＬの１：９ ＤＣＭ／ＩＰＡ溶液に等分することによって作製した（ＳＯＰ：ＢＧ−ＱＣ２７ Ｒ０１参照）。この溶液は、１７：０ ＬＰＣ、２４：０ ＰＣ、３０：０ ＰＣ、４０：０ ＰＣ、５１：０ ＴＧついてそれぞれ２：１：２：３：２（（ｇ／ｍＬ）の濃度比でスパイクした５つの標準物質を有する脂質抽出溶液として使用した。
【００８０】
次のプロトコルに従ってＬＣ／ＭＳ分析のためにサンプルを調製した。それぞれのバッチのサンプルを品質管理サンプルと共に冷凍器から取り出し、氷上で解凍した。１０μＬの血漿を含むそれぞれのサンプルバイアルに適切な量の抽出溶液を添加した。バイアルを穏やかにボルテックスにかけ、１４，０００ＲＰＭで２４℃で１０分間、スピンダウンした。上清を中間バイアルに移し、数秒間、Ｖｏｒｔｅｘによってさらに混合し、反復実験分としてそれぞれ６０μＬの２つのアリコートをＬＣ／ＭＳ分析用の２つのバーコード付オートサンプラーバイアルにピペットで移した。残存する上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析での使用のために−４０℃で保管した。残りの抽出物とペレットは廃棄した。
【００８１】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を以下のプロトコルに従って行った。クロマトグラフ装置は、４元勾配システムを有するＷａｔｅｒｓ ２７９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣシステムと、オートサンプラーと、４５℃に設定された外部カラムヒーターと、インラインプレカラムを有する分析用ＨＰＬＣカラムから成った。分析物を分離し、３５０μＬ／分の流量で質量分析計に送った。分析物分離には、９５％Ｈ２Ｏおよび５％ＭｅＯＨを含む溶媒Ａならびに９９％ＭｅＯＨおよび１％Ｈ２Ｏから成る溶媒Ｂでの二元勾配（０分−２０％Ｂ、２分−２０％Ｂ、４分−８０％Ｂ、２０分−１００％Ｂ、２５分−１００％Ｂ、２５．１分−２０％Ｂ、３５分−２０％Ｂ）を用いた。両方の溶媒流が、１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび０．１％ギ酸を含有した。５μＬのサンプルを２０μＬサンプルループに注入し、プレカラムに負荷した後、分析用カラムによって分離した。それぞれのサンプル間に、注射針、ループおよび注射器をイソプロパノール／ＭｅＯＨ溶液で洗浄した。
【００８２】
ＬＣ／ＭＳ分析は、ＬｏｃｋＳｐｒａｙ ＥＳＩ源を装備したＷａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ四重極飛行時間型計器（Ｗａｔｅｒｓ、Ｑ−ＴｏＦ）で行った。ＥＳＩ源ブロック温度を１２０℃で維持し、脱溶媒温度を３２０℃に設定した。６０９．２８１４でのレセルピンピークを使用して、ＭＳシグナル感度を最適化した。ポリアラニンのプロトン化ピークを用いてＭＳモードで質量較正を行った。３から５ｐｐｍのロックマス補正精度での５つのＩＳピークについては、〜８５００の平均計器分解能をターゲットにした。前の研究に基づき、ＬＣ溶離中、７から２３分、ＭＳデータを収集した。すべてのＬＣ／ＭＳデータは、０．３秒間、ｍ／ｚ ３００−１０００をスキャンすることによって、重心モードで収集した。
【００８３】
分析物同定のための後続のＭＳ／ＭＳ分析は、同一ＬＣ条件で同じＬＣ／ＭＳシステムを用いて行った。ＭＭＳ／ＭＳ較正は、ｍ／ｚ １０８４での先駆物質のポリアラニンピークのフラグメントを用いて行った。すべてのＭＳ／ＭＳデータは、１または２秒間、ｍ／ｚ １００−１０００をスキャンすることによって重心モードで収集した。必要な場合には、ＬＣ保持時間補正をそのターゲットリストに適用した。ＭＳ／ＭＳデータは、ターゲット分析によって収集される。
【００８４】
次のプロトコルに従ってピーク検出を行った。許容されるランの生データファイルをピークピッキングし、積分した。定義閾値に達するピークのみをアラインメントプロセスに進めた。それぞれのピークをｍ／ｚ値および保持時間によって特性づけし、例えば、ｍ／ｚ ５１０で検出され、７．８８分で溶出されたピークは、５１０＿０７８８と標識されることなる。それぞれのサンプルは、独立して処理される。
【００８５】
ピークピッキングが完了した後、ピーク・ピッキング・アルゴリズムによって生成された．ＭＬＬファイルを互いに「アライン」した。プログラムは、先ず、すべての注入物からの内部標準物質ピーク用いて保持時間ウインドウを設定し、次に、参照ピークの平均保持時間に基づいてバッチ内のそれぞれの分析物を論理的に「アライン」する。ププロセス終了時、物理的保持時間を５１０＿０７８５から５１０＿０７８８に変えることができ、追加の閾値をそれらのピーク面積に適用することができる。
【００８６】
すべてのサンプルにわたって内部標準物質の相対標準偏差パーセント（％ＲＳＤ）を計算すること、内部標準物質ピークの抽出面積（強度）を時間の関数としてプロットしてあらゆる傾向を同定すること、およびアラインメント前と後、両方の保持時間変動をチェックすることを含む多くの測定によって、それぞれのバッチついての品質管理（ＱＣ）を評価した。分析中にそれぞれの注入についての目視ＱＣ検査も行った。これらの検査は、反復注入が如何によく重なったか、ＱＣサンプルの経時的挙動、および一般的計器傾向に照準をあてた。研究中に発生し得る保持時間およびピーク面積の小変化（例えば、わずかな一時的傾向）は、データ正規化プロセスにおいて補正したが、（部分的な注入のような）より有意な変化は、再分析を必要とする場合があった。
【００８７】
ＬＣ／ＭＳの測定プロセスにおいて、対象となるそれぞれの分子種は、概して、多数の化学的エンティティとして出現する。これは、幾つかの要因に起因し得る：第一に、成分元素の多数の安定な同位体の存在、ならびに第二に、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、アンモニウム（ＮＨ４）、および多数タイプのイオンを生じさせる他の分析物との付加体形成による分析物の偽分子イオンの形成。加えて、質量分析イオン化プロセスは、多くの場合、原分子のフラグメント化によって遂行され得る。結果として、収集されるデータセットは、分析物を表すピークの数が一桁膨張する。情報内容が重複しているこれらの追加のピークは、ノイズの誘導、統計力の低下、バイオインフォマティック分析の効果遮蔽の一因となり、その多大なピーク数のため、明瞭な科学的結論を引き出すことをより難しくする場合がある。測定したエンティティをそれらの推定される起源化合物に従ってグループ分けする自動コンピュータプラットホームを、ピークピッキングおよびスペクトルアラインメントの後に、ならびにデータ正規化および統計解析の前にまたはそれらと並行して用いた。コアアルゴリズムは、狭い移動時間ウインドウで保持時間（ＲＴ）に従ってデータをスキャンする。類似した保持時間の候補ピークを、プラットホームの特定の化学的特性に依存する既知質量差パターンに従ってグループ分けする。
【００８８】
ピーク検出およびアラインメント後、幾つかの追加のデータ処理工程を行った後、データは、一変量および多変量解析に利用することができる。これらの工程は、サンプル／研究ブランクに割り当てられるピークおよび他のバックグラウンドピークの除去、バッチ修正および正規化を含む。これらの段階の完了は、「ロックされたデータセット」と呼ばれる重要時点を意味する。
【００８９】
質量分析プロファイリングおよびその後のデータ処理によって、後続の統計解析用の分析物のリストが得られた。主要分析物、通常はそれぞれの分析物ファミリーについての最も存在度が高いピークを、最初のプロファイリング実験と同じまたは同様のＬＣ／ＭＳセットアップを用いてターゲットＭＳ／ＭＳに付した。ターゲットＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトルは、重心モードで収集した。分析物のターゲットＭＳ／ＭＳ分析によって得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを、保持時間、質量、窒素ルール、脂肪酸（ＦＡ）側鎖特異的フラグメントイオン、および脂質のＭＳ／ＭＳのライブラリーからの参照スペクトルとの比較によって解釈した。
【００９０】
ガスクロマトグラフィータンデム質量スペクトル（ＧＣ／ＭＳ）メタボロミクス
ＧＣは、高感度で選択的な（電子衝撃）質量検出と併せて高い分離効率および確固とした保持時間という利点を有する。しかし、多くの化合物は、それらを分離するために必要とされる温度で熱不安定性であるか全く揮発性でない、極性官能基を含有する。加えて、極性官能基を有する化合物のピーク形は、不可逆的吸着などの望ましくないカラム相互作用のため、不満足なものである場合がある。これらの問題に対処するために、ＧＣ分析前に化合物の誘導体化が必要となる場合がある。
【００９１】
以下の材料をこの方法に従って使用した。溶媒および試薬としては、メタノール、ピリジン、塩酸エトキシアミン、およびＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）が挙げられた。内部標準物質としては、ロイシン−Ｄ３、フェニルアラニン−Ｄ５、グルタミン酸−Ｄ３、グルコース−Ｄ７、コール酸−Ｄ４、アラニン−Ｄ４、トリフルオロアセチルアントラセン（ＴＦＡＡ）、ジフルオロビフェニル（ＤＦＢＰ）、およびフタル酸ジシクロヘキシル（ＤＣＨＰ）が挙げられた。
【００９２】
これらのサンプルを室温で解凍し、２５０ｎｇ／μＬ 標準物質のロイシン−Ｄ３、フェニルアラニン−Ｄ５、グルタミン酸−Ｄ３およびグルコース−Ｄ７のＨ２Ｏ溶液１０μＬを添加し、その後、４００μＬのメタノールを（タンパク質沈殿のために）添加した。サンプルをボルテックスにかけ、１０分間１００００ｒｐｍで遠心分離し、上清をオートサンプラーバイアルに移した。窒素での乾燥工程の後、ピリジン中の２５０ｎｇ／μＬ 標準物質のコール酸Ｄ４およびアラニン−Ｄ４を１０μＬ添加した。オートサンプラーバイアルに蓋をする前に、ピリジン中の塩酸エトキシアミン溶液３０μＬを添加し、４０℃で９０分間、インキュベートした。
【００９３】
オキシム化後、残りの内部標準物質を添加した：２５０ｎｇ／μＬ 標準物質のジフルオロビフェニル、フタル酸ジシクロヘキシルおよびトリフルオロアセチルアントラセンのピリジン溶液（１０μＬ）。１００μＬ ＭＳＴＦＡの添加および５０分間、４０℃での加熱によって、サンプルをシリル化した。ＧＣに注入する前に、それらのサンプルを１０分間、３５００ｒｐｍで遠心分離した。
【００９４】
ＧＣ／ＭＳ分析は、ＰＴＶ（温度プログラム式気化器）インジェクターおよびＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｃｏｍｂｉ−Ｐａｌオートサンプラーを装備したＡｇｌｉｅｎｔ ６８９０ Ｎガスクロマトグラフを利用した。検出には、Ａｇｉｌｅｎｔ ５９７３ Ｍａｓｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを使用した。Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ Ｇ１７０１ＣＡ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｄ．０１．０２ソフトウェアによってシステムを制御した。
【００９５】
ＧＣ／ＭＳカラムから溶出するすべての化合物をフルスキャンモードで検出した。それぞれのピークをその保持時間およびフラグメント数（ｍ／ｚ値）によって特性づけした。ターゲット処理手順を適用することによって、データ量（すなわち、変数の数）を減らした。
【００９６】
ターゲットアプローチは、変数の数を少なくとも２０分の１に減少させる。このプロシージャーアーティファクトの大部分は、ターゲットテーブルにこれらのピークを含めないことでデータから除去することができる。研究特異的ターゲットテーブルをこの研究のためにコンパイルした。様々なヒト血漿ＣＧ／ＭＳプロジェクトからの情報をこのプロセスに利用した。この研究において観察されたできる限り多くのピークをターゲットテーブルに含めるために、極値サンプルを含む研究サンプルから、多数の代表的クロマトグラムを選択した。プロジェクトの初期段階の間、ピークの素性は未知であり、そこでそれらに「未知１」から「未知ｘ」まで標識し、それぞれのピークをその保持時間およびイオンを定量したものによって特性づけした。プロシージャーブランクの中で見つけられるピークは、ターゲットテーブルから除去した。ピークの起源が不確実である場合、関連分析物を損失する可能性を避けるためにピークをターゲットリストに保留した。
【００９７】
研究サンプルにおいて、代表クロマトグラムで見出される、内部標準物質以外の個々の分析物／化合物を参照化合物データベース（保持時間および質量スペクトル）とマッチングした。このマッチング工程の後、参照データベースに基づき多数の化合物に仮のＩＤを割り当てた。
【００９８】
ターゲット処理アプローチを適用するときには、ピークの保持時間アラインメントは必要ない。保持時間のシフトが観察された場合には、ターゲットテーブルを調整することができる（内部標準物質が「ランドマーク」として役立つ）。標準的な積分設定を用いて、ターゲットテーブル中に存在するすべての化合物をまず積分した。これらの設定は、すべての化合物およびサンプルに適用することはできず、一部の化合物については積分結果を補正することにつながる場合がある。積分エラーを見出すための手順を開発した。すべてのターゲットについて、（すべての研究およびＱＣサンプルの）平均からのピーク面積の偏差を計算することができる。結果をプロットし、問題ピーク（多数のサンプルにわたるそれらのピークについての積分誤差）および問題サンプル（１つのサンプルにおける多数のピークについての積分）を検出するために用いた。問題サンプルについては、手作業で積分を行った。問題ピークについては積分設定を調整した後に自動積分を行った）。
【００９９】
サンプル調製および分析における様々な工程で、１つ以上の内部標準物質を追加して、分析後のデータの質をモニターした。それぞれのバッチ後、ＤＣＨＰについて修正した後の内部標準物質の応答をすべてのサンプルにおいて評価した。それぞれの内部標準物質の修正ピーク面積が、バッチ平均から２０％未満しかずれない場合、そのバッチは、許容され得る。１つ以上のサンプルについて、偏差が２０％より大きい場合には、それらのサンプルを次のバッチで再分析した。最終的に、ロックされたデータセットをＧＣ／ＭＳ分析のために生成することができる。
【０１００】
第一の同定工程は、ターゲット化合物リストと参照データベースとのマッチングであり得る。参照データベースとの比較および参照標準物質の分析によって、ターゲットリストからの多数の化合物を同定および確認することができる。一変量および多変量解析後、優先順位をつけた未知物質を、生データおよびＱＣ結果をチェックすることによって、先ず評価した。それらを２つのカテゴリーに分けた：ｉ）非常に低い強度および／またはＱＣ標準における高いＲＳＤを有する化合物ならびにｉｉ）１つ以上のサンプルにおける良好なシグナルおよびＱＣ標準における高いＲＳＤを有する化合物。第二のカテゴリーでの同定が開始する。両方のカテゴリーについて、アーティファクト対する追加のチェックを行った。
【０１０１】
この分析の後、（同定すべき）個々の化合物に依存して追加の同定方法を選択した。一部の化合物については、市販のスペクトルライブラリーにおいてヒットを見出し、追加のＩＤ実験の必要がなかった。他の化合物については、化学的イオン化、正確な質量または他の誘導体化実験を行った。
【０１０２】
極性ＬＣ／ＭＳメタボロミクス
以下の材料をこの方法に従って用いた：メタノール、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ、ＬＣ−ＭＳグレード、ｃａｔ．＃１３６８７８０１、または等価物；ＨＣｌ、Ｍｅｒｃｋ、３７％ ｃａｔ．＃１．００３１７、または等価物；ｎ−ブタノール、Ｂａｋｅｒ ｃａｔ．＃８０１７、または等価物；Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、ＥＬＧＡ Ｓｙｓｔｅｍで精製した水、または等価物；ジチオトレイトールＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ ９９％、ｃａｔ．＃Ｄ９７７９、または等価物；ギ酸、Ｍｅｒｃｋ ｃａｔ．＃１．００２６４、または等価物；アセトニトリル、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ ＨＰＬＣ−Ｓ Ｇｒａｄｉｅｎｔグレード、ｃａｔ．＃１２０００７０１、または等価物；フェニルアラニン−ｄ５、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１５９７、または等価物；グルタメート−ｄ３、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１１９６、または等価物；ロイシン−ｄ３、ＣＤＮ同位体 ９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１９７３、または等価物；アラニン−ｄ３、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１４６２、または等価物；クレアチン−ｄ３、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１４６２、または等価物；メチオニン−ｄ４、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１４６２、または等価物；メチル−（ｄ３）−ヒスチジン、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１４６２、または等価物；チロシン−ｄ７、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１４６２、または等価物。
【０１０３】
以下の機器をこの方法に従って用いた：ボルテックス；遠心機；オーブン；蒸発装置；ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＳｕｒｖｅｙｏｒまたはＳｕｒｖｅｙｏｒ Ｐｌｕｓ ＨＰＬＣ；ＥＩＳ源を装備したＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱイオントラップ質量分析計。
【０１０４】
小型エッペンドルフバイアル中の１０μＬ血漿サンプルに、１０μＬ ＩＳ−使用液を添加し、サンプルを短時間、ボルテックスにかけた。ＤＴＴ溶液の添加およびサンプルの除タンパク後、上清を凍結乾燥させた。その後、サンプルを６５℃のＨＣｌ−ブタノールで誘導体化した。過剰の試薬を凍結乾燥によって除去した。非誘導体化チロシンＤ７を内部標準物質として含有するＤＴＴの水溶液でサンプルを再構成した。
【０１０５】
次の仕様に従って高速液体クロマトグラフィーを行った：
カラム： Ｖａｒｉａｎ／Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ５μｍ ＯＤＳ−３ １００＊３ｍｍ
ガードカラム： Ｖａｒｉａｎ／Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ Ｒ２ １０×２ｍｍ ｉ．ｄ．
移動相Ａ： ０．１％ギ酸
１ｍＬのギ酸を１０００ｍＬの水に添加し、混合し、５分間、超音波処理によって脱気する
移動相Ｂ： ０．１％ギ酸中の８０％アセトニトリル
８００ｍＬのアセトニトリルに水１０００ｍＬおよび１ｍＬのギ酸を添加し、混合し、５分間、超音波処理によって脱気する。
カラム温度： ２５℃〜３０℃
オートサンプラー温度： １０℃
注入量： １０μＬ
ＥＳＩ源への〜７５μＬの流量を意図するおよそ４：１の比の分流で質量分析を行った。ＥＳＩおよびＭＳ設定は下記である：
ＥＳＩスプレー電圧： ４ｋＶ
加熱キャピラリー： ２５０〜３００℃
シースガス： ５０〜６０
補助ガス： ５
極性： 陽性
スキャン範囲： １２５〜１２５０
マイクロスキャン数： ５〜６
最大注入時間： ２００ｍｓ
ソースＣＩＤ： ０〜５Ｖ
ソース距離 位置Ｃ
選択したサンプルを正確な質量について分析した。このために、それぞれの誘導体化ロットから２つのＱＣサンプルを選択し、多数の「極値」サンプルも選択した。上記と同じ設定を用いて、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ−ＦＴ ＭＳ計器で正確な質量実験を行った。イオンの検出は、ＦＴＭＳで行った。ｍ／ｚ ４００での分解能は、〜１００，０００である。
【０１０６】
ＬＣ／ＭＳカラムから溶出するすべての化合物をフルスキャンモードで検出した。それぞれのピークをその保持時間および多数のイオン（ｍ／ｚ値）によって特性づけした。それぞれの化合物を、殆どの場合、ターゲットテーブルへの１つだけの登録によって表現するターゲット処理手順を適用することにより、データの量（すなわち、変数の数）を減少させた。
【０１０７】
ターゲットアプローチは、変数の数を少なくとも２０分の１に減少させた。プロシージャーアーティファクトの大部分は、ターゲットテーブルにこれらのピークを含めないことでデータから除去することができた。
【０１０８】
研究特異的ターゲットテーブルをこの研究のためにコンパイルした。これは、最初の少数のバッチからのすべてのＱＣＹおよび研究サンプルのピークピッキングによって行った。得られたピークテーブルを強度に基づいてソートし、上位１０００ピークを選択した。この部分テーブルから、同位体ピークおよび識別できる限り付加体を除去した。この段階では、ピークの素性はわからず、そこでそれらを（分での）保持時間におけるｍ／ｚとして標識した。
【０１０９】
ターゲット処理アプローチを適用する場合、ピークの保持時間アラインメントは必要ない。保持時間のシフトが観察された場合には、ターゲットテーブルを調整した（内部標準物質が「ランドマーク」として役立つ）。
【０１１０】
すべてのランについての分析が完了した後、標準的な積分設定を用いて、ターゲットテーブル中に存在するすべての化合物を先ず積分した。これらの設定は、すべての化合物およびサンプルに適用することはできず、一部の化合物については積分結果を補正することにつながる場合がある。積分エラーを見つけるための手順を開発した。すべてのターゲットについて、（すべての研究およびＱＣサンプルの）平均からのピーク面積の偏差を計算した。
【０１１１】
完全データセットの品質管理は、ブランクを除くすべてのサンプルにおけるＩＳ応答、ならびにＱＣＹおよびＣＴＲＬサンプル中のすべてのターゲット化合物の相対標準偏差のチェックに基づいて行った。これらの結果を、前の研究において観察されたものと比較した。これらの工程が完了した時点で、「ロックされたデータセット」を極性ＰＣ／ＭＳプラットホームのために生成することができる。このデータセットが、すべての後続の統計解析の基礎になる。
【０１１２】
第一の同定工程は、ターゲット化合物と多数のアミノ酸および関連化合物を含有する参照標準のデータベースとのマッチングであった。保持時間および正確な質量を比較し、必要な場合には、ＭＳ／ＭＳスペクトルを比較した。
【０１１３】
残りのターゲット化合物は、それらを優先リストに載せた後、同定した（一変量／多変量）。それらの優先順位をつけた未知物質を、先ず、生データおよびＱＣ結果をチェックすることによって評価した。それらを２つのカテゴリーに分けた：ｉ）非常に低い強度および／またはＱＣ標準における高いＲＳＤを有する化合物ならびにｉｉ）１つ以上のサンプルにおける良好なシグナルおよびＱＣ標準における高いＲＳＤを有する化合物。第二のカテゴリーでの同定が開始した。両方のカテゴリーについて、アーティファクト対する追加のチェックを行い、ブランク分析をこれらの化合物の存在についてチェックした。
【０１１４】
さらなる同定のために、保持時間、正確な質量およびＭＳ／ＭＳデータを用いた。正確な質量、および用いた誘導体化についての知識に基づき、ＫＥＧＧ、ＭｅｒｃｋおよびＣｈｅｍｉｆｉｎｄｅｒデータベース内の可能性のある元素組成を検索した。可能性のあるヒットを評価し、このために、保持時間およびＭＳ／ＭＳスペクトルを用いた。幾つかの場合、標準物質を購入し、溶解状態で分析し、そしてその後、研究サンプルに標準物質を追加した。
【０１１５】
遊離脂肪酸のＬＣ／ＭＳプロファイリング
血漿を除タンパクし、ＩＰＡで抽出した。遊離脂肪酸を分析用カラムで分離し、エレクトロスプレーにより陰イオンモードでイオン化し、フルスキャンモードで検出した。多数の遊離脂肪酸を外部標準物質として分析し、血漿中の実際の濃度を決定する必要がある場合には較正標準を用いてこれらを計算（概算）した。
【０１１６】
次の材料を使用してサンプルを調製し、分析した。計器としては、エッペンドルフ管用の遠心機、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ＬＴＱ、オートサンプラーとカラムオーブンとを有するＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＨＰＬＣ、およびボルテックスが挙げられた。化学薬品としては、脱塩水、（ＥＬＧＡ Ｓｙｓｔｅｍ ４または任意の他の製造元、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）；イソプロパノール ｐ．ａ．、（Ｂａｋｅｒ ６０６８または同等物）、メタノール、（ＨＰＬＣグレード、Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖｅ ３４９６６）、ジクロロメタン ｐ．ａ．、（Ｂａｋｅｒ ７０５３または同等物）、酢酸アンモニウム ｐ．ａ．、（Ｆｌｕｋａ ０９６９０または同等物）、およびギ酸 ｐ．ａ．、（Ｍｅｒｃｋ １．００２６４．１０００または同等物）が挙げられた。
【０１１７】
材料としては、Ａｌｌｔｅｃｈ Ｐｒｏｓｈｅｒｅ ＣＡ ３００Å ＨＰＬＣカラム（１５０×３．０ｍｍ ｉ．ｄ．、５μｍ）、ｐａｒｔｎｏ．３５５４８、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ３００ Ｃ４ガードカラム（１０×２．１ｍｍ ｉ．ｄ．３．５μｍ）、ｐａｒｔｎｏ．１８６０００２７８、オートサンプラーバイアル（Ａｌｌｔｅｃｈ ｐａｒｔｎｏ．ＡＶ０５５２０１、３２＊１１．６ｍｍ）、エッペンドルフ管、およびピペット（例えば、エッペンドルフ）が挙げられた。
【０１１８】
次の標準物質を使用した：ヘプタデカン酸 Ｃ１７：０ ＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ３５００）、Ｃ１４：０ ＦＡ ミリスチン酸（Ｓｉｇｍａ Ｍ３１２８）、Ｃ１６：０ ＦＡ パルミチン酸（Ｓｉｇｍａ Ｐ５５８５）、Ｃ１６：１ ＦＡ パルミトレイン酸（Ｓｉｇｍａ Ｐ９４１７）、Ｃ１８：０ ＦＡ ステアリン酸（Ｓｉｇｍａ Ｓ４７５１）、Ｃ１８：１ ＦＡ オレイン酸（Ｓｉｇｍａ Ｏ１００８）、Ｃ１８：２ ＦＡ リノール酸（Ｓｉｇｍａ Ｌ１３７６）、およびＣ２０：４ ＦＡ アラキドン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ９６７３）。
【０１１９】
内部標準溶液は、次の方法に従って調製した。ヘプタデカン酸 Ｃ１７：０ ＦＡ（１ｍｇ／ｍＬ）の保存溶液は、５ｍＬメスフラスコに５ｍｇを量り入れ、５００μＬ ＤＣＭを添加し、超音波処理により溶解し、ＩＰＡで５ｍＬにすることによって調製した。ＩＳ使用液（タンパク質沈殿および脂質抽出用）は、Ｃ１７：０ ＦＡを１μｇ／ｍＬの濃度で含有するＩＰＡ中で調製した。
【０１２０】
サンプルは、次の方法に従って調製した。３００μＬのＩＳ使用液をエッペンドルフカップ内の１０μＬの解凍血漿サンプルに添加し、ボルテックスにかけた。溶液を３〜５分間、１０，０００ｒｐｍでのエッペンドルフ遠心分離に付し、５０μＬのその透明な上清をインサートを有する２つのオートサンプラーバイアルに２回移し、残りの抽出物を＜−１８℃で保管した。
【０１２１】
Ａｌｌｔｅｃｈ Ｐｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ４ ３００Å ＨＰＬＣカラム（１５０×３．２ｍｍ ｉ．ｄ．、５μｍ）およびＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｗｉｄｅｐｏｒｅ Ｃ４ガードカラム（４×３ｍｍ ｉ．ｄ．、５μｍ）を使用して、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を行った。移動相Ａは、バッファー中の５％メタノールから成り、移動相Ｂは、２ｍＭ ＮＨ４Ａｃを含有するメタノールから成り、針洗浄液は、ＭｅＯＨ中の６０％ＩＰＡから成った。勾配は次のとおりであった
【０１２２】
【数１】
カラム温度は、４０℃であり、オートサンプラー温度は、２０℃であり、注入量は、２０μＬであった。
【０１２３】
質量分析手順のために、次の較正標準を使用してＬＣ／ＭＳ計器をチューニングした：
【０１２４】
【数２】
選択されたターゲット分析物の積分にはＴｈｅｒｍｏ ＸＣａｌｉｂｕｒ ＬＣＱｕａｎ Ｖ ２．０を使用した。（前の研究に基づき）少なくとも次の脂肪酸を含むターゲットテーブルを用いて、データを処理した：Ｃ１２：０ ＦＡ、Ｃ１２：１ ＦＡ、Ｃ１４：０ ＦＡ、Ｃ１４：１ ＦＡ、Ｃ１６：０ ＦＡ、Ｃ１６：１ ＦＡ、Ｃ１６：２ ＦＡ、Ｃ１８：０ ＦＡ、Ｃ１８：１ ＦＡ、Ｃ１８：２ ＦＡ、Ｃ１８：３ ＦＡ、Ｃ２０：０ ＦＡ、Ｃ２０：１ ＦＡ、Ｃ２０：２ ＦＡ、Ｃ２０：３ ＦＡ、Ｃ２０：４ ＦＡ、Ｃ２０：５．ＦＡ、Ｃ２２：５ ＦＡ、Ｃ２２：６ ＦＡ、およびＣ２２：７ ＦＡ。
【０１２５】
ターゲットテーブルからのすべての化合物についての積分データを得た。結果は、それぞれのターゲット化合物についての積分値を含むＥｘｃｅｌテーブルであった。
【０１２６】
ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳディスカバリープロテオミクス
プロテオミクスワークフローは、血漿サンプルから生成されたペプチドの多次元液体クロマトグラフィー−ＭＳ／ＭＳ分析に基づくものであった。このアプローチの利点としては、２Ｄゲルに基づくアプローチにおける困難の原因となる血漿タンパク質の多数の異成分に対する鈍感性、液体クロマトグラフィー技術の容易な自動化、およびペプチドの安定な同位体標識の利用の可能性が挙げられる。
【０１２７】
最近紹介されたｉＴＲＡＱ（商標）方法論（ｉＴＲＡＱは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの商標である）は、標識反応を完了まで遂行することが容易であり、一般的な、ほぼすべてのペプチドがｉＴＲＡＱで標識され、１実験につき４サンプルまでの複合定量が可能であったので、本研究に特に好適であった。後者は、サンプル間の一致した定量（および同定）が重要要件である本研究において重要である。安定な同位体標識の別の有意な利点は、（差別的に標識されたプールを併用すると）サンプル間でのペプチドの液体クロマトグラフ挙動の変動に対してプロセスが頑強であることであった。
【０１２８】
ｉＴＲＡＱ法では、タンパク質サンプルからの酵素的消化物を、ペプチドの遊離第一級アミノ基：Ｎ−末端（ブロックされていない場合）およびリシン残基を誘導体化する試薬（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル）で処理する。試薬の４つの異なる変種は、同じ質量、しかし安定な同位体標識の異なる位置を特徴とする。従って、イオンシグナルがペプチドの分子量を反映するＭＳモードでは、４つの別様に標識されたペプチドのすべてが単一の成分のように見える。ＭＳ／ＭＳモードでは、標識の構造の微妙な違いが見えるようになり、また、ペプチド骨格フラグメント（いわゆるａ、ｂ、およびｙ）は、依然として等重であるが、ｍ／ｚ １１４、１１５、１１６および１１７にそれぞれ対応する４つの異なるレポーターフラグメントが生成される。これらのレポーターイオンの相対強度の判定によって、４つの異なるサンプルからのペプチドの相対定量を遂行することができる。
【０１２９】
この研究では、サンプルが自動画分回収手順によってＭＡＬＤＩプレートに堆積されるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（ＡＢＩ４８００）を使用した。ＭＡＬＤＩ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの特別な利点は、ＬＣ−ＭＳ連結のオフライン性にある。先ず、ＭＳモードで全２Ｄ ＬＣ分離を分析し、その後、ＭＳ／ＭＳモードでペプチド同定および定量的データを生成することができた。この特徴は、ペプチドの一定のセットを多数のサンプルにわたって測定しなければならないとき、非常に便利であり得る。
【０１３０】
血漿サンプルの分析に関する１つの特有の態様は、存在度が高い血漿タンパク質（アルブミン、免疫グロブリンなど）によって表される膨大なバックグラウンドである。この難題に対処するために、多数の枯渇技術を用いた。この研究では、ニワトリＩｇＹ抗体カラムを使用して、１２の存在度が高いタンパク質のサンプルを枯渇させた。抗体カラムに保持されなかったタンパク質プールを、逆相カラムで回収した。回収したタンパク質プールを還元し、アルキル化し、トリプシンによって消化した。得られたペプチド混合物をｉＴＲＡＱ試薬で標識し、同じｉＴＲＡＱミックス用に指定された３つの他のサンプルと併せた。併せた４プレックス（ｆｏｕｒ−ｐｌｅｘ）ミックスを、先ず、強カチオン交換クロマトグラフィーで分画した。ＳＣＸ溶離から画分を回収した。これらの画分を、−それらの画分の一部をプールした後−さらにＨＰＬＣ ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０１３１】
ｉＴＲＡＱ分析によって、１回の２Ｄ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験（４プレックス）で４つの異なるサンプルの相対定量が可能となる。しかし、ｉＴＲＡＱ ４プレックスミックスに４つの一次サンプルを割り当てることにより、異なるｉＴＲＡＱに指定された２つの一次サンプルを比較することはできない。そのプロジェクトのために分析するｉＴＲＡＱミックスの数に従ってアリコートされた参照プール、それぞれのｉＴＲＡＱミックスの定常成分、を作り、この参照アリコートのためのサンプル調製を同じｉＴＲＡＱミックスの３つの他のメンバーと共に行い、１１７の試薬で標識することによって、これに対処した。
【０１３２】
参照プールは、この研究において分析したおよそ２５％の各一次研究サンプルの組み合わせから作った。その参照プールからのアリコートをＱＣＲサンプルと呼んだ。
【０１３３】
ＭＳ／ＭＳ収集は、組み入れおよび除外の両方のためのＭＳ先駆物質のリストによって誘導され得る。原組み入れリストは、研究のカタログ期の間に行った分析から得た。この期において、サンプルのＱＣプールからの少数のサンプルを完全プロテオミクスワークフローによって処理した。ペプチドを同定し、これらのミックスからのタンパク質をマッチングした後、組み入れおよび除外リストをコンパイルした。
【０１３４】
組み入れリストの内容としては、完全にアルキル化され、ｉＴＲＡＱ標識されたトリプシンペプチド；キモトリプシン活性（Ｆ、ＹおよびＷでの開裂）に起因するものを除外して、完全にアルキル化され、ｉＴＲＡＱ標識された半トリプシンペプチド；ならびに翻訳後修飾を有するとき、Ｍａｓｃｏｔによるルーチンサーチでなく手作業で同定されたペプチドが挙げられる。
【０１３５】
除外リストの内容としては、不完全なｉＴＲＡＱ標識またはアルキル化を伴うペプチド；多数のトリプシン誤開裂部位を含有する３，０００Ｄａを超える分子量のペプチド；トリプシンのキモトリプシン側活性によって生成されたペプチド；Ｍ＋Ｈ＋形態で組み入れリストにある電位Ｍ＋Ｋ＋形態の存在度が高いペプチド；およびトリプシンからの自己分解ペプチドをはじめとする、２，０００の最も存在度が高い未同定成分を含む。
【０１３６】
カスタム・ソフトウェア・アプリケーションを用いて、組み入れ／除外基準を考え、そして組み入れまたは除外のいずれかに選択された先駆物質を箇条書きにする別のテキストファイルに基づくＡＢ４８００でＭＳ／ＭＳ収集物を大量にもたらした。ＨＰＬＣ保持時間の潜在的シフトの自動調節にもそのソフトウェアは適応した。組み入れ先駆物質を先ず分析した後、収集時間が許せば、日和見的に追加のＭＳ／ＭＳスペクトルを収集した。
【０１３７】
９つの一次サンプルおよび３つの参照プールサンプルから成る１２の１日分バッチのサンプルを氷上で解凍し、３つの一次サンプルに続いて１つの参照プールサンプル（すなわち、サンプル１、２、３、その後、Ｒ、４、５、６、Ｒなど）で逐次的に処理した。サンプルを完全に解凍したら、それらを脱脂した。サンプルをＰＢＳで希釈し、トリクロロトリフルオロエタン（Ｆｒｅｏｎ １３）で抽出し、その後、遠心分離段階に付した。上部水性層を新たな試験管に移し、氷上で短時間保管した後、存在度が高いタンパク質を除去するためにＬＣシステムの冷却したオートサンプラーの中に入れた。
【０１３８】
存在度が高いタンパク質の除去（ＡＰＲ）を用いて、１２の最も存在度が高い血漿タンパク質を脱脂サンプルから枯渇させた。この手順は、２カラム法（２ＤＬＣ）を用い、この場合、アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、トランスフェリン、α−１アンチトリプシン、ハプトグロビンファミリー、フィブリノゲン、α−１酸性糖タンパク質、ＩｇＭ、α−２マクログロブリンおよびＨＤＬ（アポリポタンパク質Ａ−ＩおよびＡＩＩ）を含む１２のタンパク質は親和性ＩｇＹカラムのターゲットになるが、枯渇材料は流れて通り過ぎて逆相（ＲＰ）カラムで補足された。ＲＰカラムを独立して洗浄し、段階溶離した。洗浄され、枯渇された材料から成る溶離ピークを分画カラムで回収し、その後、ワークフローにおける後続の処理のためにスピード真空によって乾燥させた。その後、次のランへの持ち越しをなくすストリップ溶液でそのＲＰカラムを洗浄した。その後、独立してＩｇＹカラムを溶離し、次のランの前に中和した。１２の枯渇サンプル（単一バッチ）を２４時間の間処理し、その後、回収画分を一晩、スピード真空に付した。
【０１３９】
枯渇血清サンプルを還元し、アルキル化し、消化し、ｉＴＲＡＱ標識した。乾燥させた枯渇サンプルを１Ｍ ＴＥＡＢ Ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．５に再び懸濁させた。ＴＣＥＰおよびＳＤＳを添加して変性させ、サンプルを還元した。７１℃での１時間のインキュベーション後、サンプルを暗所にて３０分間、室温でヨードアセトアミドによってアルキル化した。Ｎ−アセチル−Ｌ−システインに懸濁させたトリプシンを添加し、サンプルを放置して一晩、４８℃で消化させた。翌日、ｉＴＲＡＱ試薬を解凍し、１００％エタノールに再懸濁させた。サンプルをｉＴＲＡＱ試薬で標識した。標識するために室温で１時間インキュベートした後、アセチル化反応を４マイクロリットルの１Ｍ重炭酸アンモニウムの添加で停止させた。同じミックスのｉＴＲＡＱ標識サンプルを併せ、Ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させ、その後、カチオン交換クロマトグラフィーのために再び懸濁させた。
【０１４０】
４．６×５０ｍｍポリスルホエチル強カチオン交換カラムを使用するＶｉｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、併せたｉＴＲＡＱミックスの強カチオン交換分画を行った。分離は、ペプチドプールを先ずＰｏｒｏｓ Ｒ２逆相カラムに負荷して大量のｉＴＲＡＱ加水分解産物を除去する、２カラム法を用いた。
【０１４１】
３５％ＡＣＮ含量のＳＣＸローディングバッファーを使用してそれらのペプチドをＳＣＸカラムへと溶出させた。ＲＰカラムに付着したより疎水性の材料（すなわち、残留トリプシン）を高有機洗浄液によって除去した。ＳＣＸカラムに結合したペプチドを勾配で溶離した。注入前、１Ｎ ＨＣｌを使用してサンプルのｐＨを３．５に調整する。ＳＣＸ分離から、０．８ｍＬの１０の画分（Ａ１からＡ１０）を回収した。これらの画分をＳｐｅｅｄｖａｃで乾燥させ、ＨＰＬＣローディングバッファーに再び懸濁させた。
【０１４２】
ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳディスカバリープロテオミクス
ＨＰＬＣとＭＡＬＤＩとの連結は、ＭＡＬＤＩターゲットへの画分回収によってオフラインで行った。装置は、Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ（カリフォルニア州、ハーキュリーズ）からのＰｒｏｂｏｔ ＭＡＬＤＩスポッティングデバイスを装備したＵｌｔｉＭａｔｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍであった。画分回収器の内蔵シリンジポンプによって、ＭＡＬＤＩプレートへの堆積前にＨＰＬＣ溶離物とＭＡＬＤＩマトリックスとを共混合することができた。ＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルの良好な質量補正を確保するために、内部標準物質−ＡＣＴＨ（１８−３９）ぺプチド、ＭＨ＋＝２４６５．１９９−をマトリックス溶液に添加した。
【０１４３】
３回のＨＰＬＣランが単一の４８００ ＭＡＬＤＩプレートに堆積されるように、ＭＡＬＤＩプレートへのスポッティングを設定した。それぞれのＨＰＬＣランが６×３５アレイの画分を含有した（２１０画分／ＨＰＬＣ）。ｉＴＲＡＱミックスを代表する６回のＨＰＬＣランを２つのＭＡＬＤＩプレートにスポッティングした。
【０１４４】
ＨＰＬＣ−ＭＡＬＤＩ動作パラメータを以下に列挙する。ＨＰＬＣグレードの水および分析グレードのアセトニトリルは、Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ製であり、酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、ＴＦＡおよびα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸は、Ｓｉｇｍａ製であった。
【０１４５】
【数３】
ＨＰＬＣ勾配は、次のようにプログラムした
０〜５％Ｂ ８分間
５〜１０％Ｂ ２分間
１０〜３７．５％Ｂ ３０分間
３７．５〜１００％Ｂ ２分間
４５−ｎＬフローセルを使用して２８０ｎｍの波長をモニターすることによってＵＶトレースを記録した。
【０１４６】
それぞれのＳＣＸ画分の注入量は、ＨＰＬＣカラムへの過負荷を避けながらサンプル負荷量を最大にするように決定した。これらの量は、予備カタログ実験で決定した。
【０１４７】
ｉＴＲＡＱミックスからのＭＡＬＤＩサンプルを代表する６の注入の各セットの前に、（Ｍｉｃｈｒｏｍからの）ペプチドの標準混合物を注入してＨＰＬＣ保持時間の一致性をモニターした。直前のＳＣＸ画分のＬＣ−ＭＳランを自動的にアラインすることによる先駆物質選択プログラムによって、ＨＰＬＣ溶離時間の穏やかな変化を継続的に処理したことに留意すること。標準ＱＣミックスの後、６つのＳＣＸ画分を注入し、２つのＭＡＬＤＩプレートを作製した。
【０１４８】
２つのＭＡＬＤＩプレートのセットをＡＢ４８００計器のオートローダーに載せた。それぞれのプレートを次の順序によりＭＳモードでランした：
●４８００標準ミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してプレートモデルおよびアップデートデフォルト検量線を作製してプレートの８つの「Ｃａｌ」位置にスポッティングする
●ｍ／ｚ ２４６５．１９９（ペプチド標準物質）およびｍ／ｚ ５６８．１３６（マトリックス三量体）ピークを用いる内部質量較正でのＭＳモードでＬＣ画分をランする
先駆物質選択の主目的は、収集時間を最小にすること（余剰先駆物質を排除する）、ＭＳスペクトルにおける隣接ピークからの干渉を排除すること、およびすべてのｉＴＲＡＱミックスについて同じ先駆物質を一貫して選択することであった。ＭＳ／ＭＳ収集および処理パラメータを、ｍ／ｚ １１４、１１５、１１６、１１７でのｉＴＲＡＱレポーターピークの最善の測定を生じさせるように最適化した。ｉＴＲＡＱシグナルが、わずか１，０５０ショットの後にシグナル対ノイズ基準を超えない限り、２，１００レーザーショットを累積するようにＭＳ／ＭＳ収集を設定したことに留意すること。このようにして、ｉＴＲＡＱピーク面積測定の質を危うくすることなく収集時間を減少させることができた。
【０１４９】
ＡＢ４８００ ＭＳ／ＭＳスペクトルは、収集制御コンピュータで、パイプライン制御ソフトウェアによって駆動されるカスタムＰｅｒｌスクリプトを使用してＯｒａｃｌｅデータベースから得た。ＭＳ／ＭＳピークを２つの異なるファイルへと処理して、定量ｉＴＲＡＱピークデータとペプチド分画ピークとを別々に記録した。それぞれの個々のＭＳ／ＭＳスペクトルを、一意的データベースピークテーブルＩＤおよびデータを収集するＭＡＬＤＩプレートの一意的データベースＩＤによって同定した。これら２つの値によって、収集データおよび内部実験情報管理システム（ＬＩＭＳ）の両方に記録された追加の情報とのさらなる関連づけが可能となった。ｉＴＲＡＱ定量情報を第一ファイルからＰｅｐｔｉｄｅｄＢと呼ばれるデータベースに移した。二次出力は、ＭＧＦ（Ｍａｓｃｏｔ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｆｏｒｍａｔ）ファイルであり、これは、ペプチド分画ピーク、およびＭａｓｃｏｔ結果とインプットＭＳ／ＭＳスペクトルとの間の追跡を可能にする追加の関連コメントラインを含んでいた。
【０１５０】
ＭＧＦファイルに含まれているピークを濾過して、高質量ピーク（６４Ｄａ以内または先駆物質ＭＨ＋）を除去し、低質量ピーク（＜１４６Ｄａ）を除去し、ピークの「密度」を２００Ｄａウインドウあたり１５フラグメント質量に限定した。
【０１５１】
ＡＢ４８００を用いてＭＳ／ＭＳジョブごとに別個のＭＧＦファイルを作った（ＭＳ／ＭＳジョブは、同じＭＡＬＤＩプレートから収集される１と数千との間の別個のＭＳ／ＭＳ収集から成り得る）。同じｉＴＲＡＱミックスに対応する個々のＭＧＦファイルを連結させた後、Ｍａｃｏｔサーチを開始した。
【０１５２】
それぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルをＰｅｐｔｉｄｅＤＢにおけるｍ／ｚ １１４、１１５、１１６および１１７イオンシグナルのイオン強度に関連づけた。上記のように、ｍ／ｚ １１７強度に相対してｉＴＲＡＱ比を決定した（参照プールのためにこの標識を使用したからである）。比は、４８００データについてのピーク面積の比（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓソフトウェアによって用いられるようなクラスター面積ではない）およびＱＴｏＦデータについてのピークカウントの比として計算した。
【０１５３】
データベース検索後、ＭＳ／ＭＳスペクトルに割り当てられた定量数を「受け継いでいる」ＭＳ／ＭＳスペクトルとペプチド配列をマッチングした。タンパク質比は、タンパク質に割り当てられたペプチドの比から平均比（またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓソフトウェアにおける平均比）として誘導した。しかし、ＢＧＭワークフローにおける最終的なペプチド−タンパク質アラインメントは、それぞれのｉＴＲＡＱミックスからのペプチド同定が完了するまで行わなかった。この時点で、タンパク質の割り当てを統合するばかりでなく、全研究の定量情報に基づき個々のタンパク質を多数のノードに解体することができる（すなわち、タンパク質アイソフォーム、多形部位を収容しているペプチド配列、対立変異体などが分解される）。その後、タンパク質ノード−最終的に統計および相関ネットワーク解析に用いるもの−を、それらにマッチするペプチド比の平均として表した。
【０１５４】
ペプチド比をタンパク質またはタンパク質ノード比に広めるとき、（ａ）予想される程度まで完全に修飾された、すなわち、完全にｉＴＲＡＱ標識され、およびそれらがシステイン（複数可）を含有する場合には完全にアルキル化された、または（ｂ）ＡＰＲがターゲットにするタンパク質に、もしくはチロシンに、ヘモグロビンに（これらのタンパク質は、不純物とみなされる）マッチングしないペプチドのみを考慮した。
【０１５５】
ペプチド／タンパク質同定は、市販のＭａｓｃｏｔデータベースサーチプログラム（英国のＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．）の三方向からのアプローチ、科学者によるエキスパートバリデーション、およびＭＳ／ＭＳスペクトルマッチング手順を用いて行った。
【０１５６】
研究の全プロテオミクス成分についてのデータ収集が完了し、Ｍａｓｃｏｔサーチ結果をＰｅｐｔｉｄｅＤＢにロードしたら、スペクトルマッチング手順をランした。目的は、プロテオミクスプロジェクトにおいて分析した任意のｉＴＲＡＱに関する自動バリデーションの基準に対してペプチド配列にマッチするＭＳ／ＭＳスペクトルを見出すことであった。ペプチドの素性は、ぴったりとマッチした先駆物質質量、ＳＣＸ画分数およびＨＰＬＣ保持時間、および最も存在度が高いフラグメントイオンの質量に基づいて確立した。このように、Ｍａｓｃｏｔによる自動バリデーション基準を満たさないが、他のｉＴＲＡＱミックス（複数可）での自動またはエキスパートバリデーション例を有する、多数のＭＳ／ＭＳスペクトルを救うことができた。そのような手順の重要性は、プロテオミクス研究においてできる限り多くのタンパク質にわたって測定されるペプチドおよびタンパク質の表現を増やすことである。
【０１５７】
（可能な最も完全なペプチドセットを有する）全研究についてのペプチド同定が完了した後、タンパク質バリデーションツールをランして、バリデーションされたすべてのペプチド配列を説明するタンパク質の最小セットを同定した。タンパク質バリデーションツールぺプチドの専門用語で、配列を（ａ）ゲノム内の一意的遺伝子を表すタンパク質クラスまたは（ｂ）（スプライス変異体、多形などの中の）タンパク質クラス内の好ましい（通常、最も多くの注釈情報を有するもの）配列例を表すタンパク質典型に割り当てた。
【０１５８】
多数のデータ処理工程は完全データセットに適用され、この研究について報告されているタンパク質／ペプチドおよび定量マトリックスの数に影響を及ぼした。これらのデータ処理工程としては、下記が挙げられる：
ペプチド測定の統合：同じｉＴＲＡＱミックス中の同じペプチド（同じ配列および同じ修飾）の多数のＭＳ／ＭＳ測定からのｉＴＲＡＱシグナルを合計し、その時点から単一比測定を用いた。
【０１５９】
外れ値排除：５％の外れ値のペプチド測定値を除去する標準的な統計手順。ペプチド測定値は、それが、同じタンパク質にマッチするすべてのペプチド測定値の分布から十分に外れている場合（２より大きい標準偏差）、外れ値とみなした。
【０１６０】
最終タンパク質／ノード割り当て：タンパク質バリデーションツール分析が完了したら、全プロジェクトについての定量結果を用いて、一変量および多変量統計解析のためのタンパク質リストを仕上げた。最終タンパク質によって相関ネットワーク分析のためのノードを定義した。このプロセスは、タンパク質の処理形態（すなわち、補体Ｃ３からのＣ３ａおよびＣ３ｂ、フィブリノゲンアルファ鎖からのフィブリノペプチドＡ、ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮからのアルファ−ミクログロブリンおよびビクニンなど）およびタンパク質の多形変異体の処理形態の正しい追跡に必要であった。
【０１６１】
同じタンパク質にマッチするペプチドの比の一致性によって、定量性能を評価した。これらのペプチド測定値の相対標準偏差は、タンパク質測定値が（マッチするペプチド測定値の平均として）如何に正確であるかを示した。これらの手順は、ペプチド相対標準偏差を数パーセント点低下させた。
【０１６２】
ターゲットプロテオミクス：多重化イムノアッセイ
以下の表３に示す８９のターゲットタンパク質の濃度を多重化イムノアッセイシステム（米国、テキサス州、オースチンのＲｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）［ＭｃＤａｄｅ ＆ Ｆｕｌｔｏｎ、Ｄｅｖｉｃｅ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｄ １９：７５−８２，１９９７；Ｆｕｌｔｏｎら，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４３：１７４９−５６，１９９７］で測定した。このシステムは、フローサイトメーターおよびデジタル・シグナル・プロセッサーを用いて多数のマイクロスフェアベースのアッセイの実時間分析を行うことにより、非常に多数の併発反応を遂行する。このシステムの３つの重要な構成要素は、ベンチトップフローサイトメーター、マイクロスフェア、ならびにコンピュータハードウェアおよびソフトウェアである。これらの測定において用いた血漿の量は、５０マイクロリットルであった。ターゲットタンパク質それぞれについての、フローサイトメーターによって記録された蛍光シグナルを、それらのターゲットタンパク質それぞれの濃度の計算のために、標準曲線と比較することができる。品質管理サンプルをこの分析に含めた。
【０１６３】
【表３】
ターゲットタンパク質分析は、症例および対照からのサンプルのセット全体にわたって６６のタンパク質の濃度に関する有用な情報をもたらした。これら６６タンパク質についてのデータセットをこの個々のバイオ分析プラットホームのための一変量および多変量分析物において使用し、また、他のバイオ分析プラットホームと併用して、７２３の分析物を含む統合データセットを生成した。
【０１６４】
統計学的方法
この研究の主目的に取り組むために、すなわち、血液または血漿中の分子分析物（セット）を発見し、近々のＭＡＣＣを予測する関連アルゴリズムを発見するために、統計解析を行った。２年の経過観察中にＭＡＣＣＥの発生を有した被験者を症例として、および経過観察中にＭＡＣＣの発生がなかった者を対照として示す。
【０１６５】
統計解析は、次の成分を含んだ：
１．研究被験者のベースライン特性。
２．すべてのプラットホームによってプロファイルされたデータからの症例および対照の間の隔たりを（もしあれば）視覚化するための主成分分析（ＰＣＡ）。
３．従来のリスク因子を調整した後、近々のＭＡＣＣＥの確率と統計学的に有意に関連づけられる個々の分析物を検出するための一変量モード。
４．多変量モード：従来のリスク因子を伴うおよび伴わない、近々のＭＡＣＣＥの確率と統計学的に有意に関連づけられる分析物の最適なサブセットを得るための分類。従来の臨床因子を伴う分類器からの結果に基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線と従来の臨床因子を伴わない分類器からの結果に基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線とを比較した。
【０１６６】
ベースライン特性：ベースライン特性についての平均および割合を症例および対照について計算した。症例と対照の間のベースライン測定の差の統計学的優位性は、ウィルコクソンの順位和検定（連続変数）およびカイ二乗検定（割合およびＲｘＣテーブルについて）に基づいた。
【０１６７】
主成分分析：本研究におけるメタボロミクスおよびプロテオミクスプラットホームそれぞれから得られたデータについてのＰＣＡスコアプロットを生成した。これらの分析の動機としては、症例と対照との間の隔たりの視覚化、および品質のために外れ値サンプルの同定およびデータセットの評価が挙げられた。
【０１６８】
一変量モード：一次一変量分析は、症例対対照の１対１マッチングを考慮に入れて条件付ロジスティック回帰に基づく。一変量分析は、関連臨床共変量を調整した後、個別に各血漿分析物と転帰との関連性（症例対対照状態）の統計学的有意性を評価する回帰モデルから成った。症例を対照と年齢、人種、性別およびＣＡＤ指数とに関してマッチングさせたので、これらの変数は、回帰モデルには現れない。条件付ロジスティック回帰モデルは、マッチング戦略に含まれない交絡因子に適応した。モデルへの組み入れのための従来のリスク因子の選択は、心血管の転帰に対する分析物の影響を調査する研究からの結果に関して報告している医学文献中の最近の論文の再考に基づいた。それぞれの血漿分析物を、対照被験者における分析物の分布に基づき、四分位数としてモデル化した。尤度比検定を用いて、転帰を予測する際のそれぞれの分析物の統計学的優位性を評価した。多重比較についての調整は、Ｓｔｏｒｅｙ（Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔｉｓｔ Ｓｏｃ Ｂ ６４：４７９−４９８，２００２）による方法に基づいた。症例または対照のいずれかにおける５０％より大きい欠測値は、この一変量分析から除外した。
【０１６９】
分析物値を二値変数に変換する第二セットの一変量分析を行った（ここで、０は、欠測値を示し、１はそうでないものを示す）。前の一変量分析のように、尤度比検定を用いて、転帰を予測する際のそれぞれの分析物の統計学的有意性を評価した。多重比較についての調整は、Ｓｔｏｒｅｙ（Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔｉｓｔ Ｓｏｃ Ｂ ６４：４７９−４９８，２００２）による方法に基づいた。
【０１７０】
症例および対照を別々に図示する、統計学的に有意な分析物それぞれについての箱ひげ図も生成した。
【０１７１】
生ｐ値と比較したＦＤＲ調整ｐ値のプロットを生成した。プロットに見られるｐ値の分布を、それぞれのプラットホームにおける推定分析物の選択のためのｐ値閾値を選択するために基礎として用いた。すべてのプラットホームからのデータを入手できたら、すべてのプラットホームからのデータを積分することによってＦＤＲ調整ｐ値を生成した。最終一変量分析物リストを積分解析から生成した。選択した結果を下の表４に列挙する。
【０１７２】
【表４】
【０１７３】
【表４Ｂ】
上の表４において、ＰＣは、ホスファチジルコリンを意味し、ＰＥは、ホスファチジルエタノールアミンを意味し、ＴＧは、トリアシルグリセロールを意味し、ＳＭは、スフィンゴミエリンを意味し、ＬＰＣは、リゾ−ホスファチジルコリンを意味し、ＩＬは、インターロイキンを意味し、およびｘ：ｙは、ｘ個の炭素原子とｙ個の二重結合とを含有する脂肪酸鎖を示す。「オッズ比」を示す縦列の記載事項は、本研究におけるすべての被験者にわたる分析物についての濃度の全分布の第１四分位数内の分析物濃度を有する被験者に対する第４四分位数内の分析物濃度を有する被験者の比較に対応するオッズ比である。質量分析によって測定した分析物について、測定単位を「任意単位」または「ＡＵ」として示す。質量分析計から得た濃度測定値は、質量分析計装置の検出器によって検出されるような処理済イオンカウントを表す。質量分析によって測定した分析物について、絶対定量は行わなかった。
【０１７４】
次の脂肪酸分析物は、ＭＡＣＣＥについてのリスクに関連がある（ここで、それぞれ、同定分析物のリスト中の最初の分析物は、ＭＡＣＣＥについてのリスクと最も強い関連性を有し、最後の分析物は、ＭＡＣＣＥについてのリスクと最も弱い関連性を有する）：１８：２／１８：１／１７：０ＴＧ、１８：０／２０：４ＰＥ、１６：０／１８：１ＰＣ、１６：０／２２：６ＰＥ、２０：４ＬＰＣ、２０：１／１８：１／１８：１ＴＧ、１８：１／１７：１／１６：０ＴＧ、１８：１／１８：０／１８：０ＴＧ、１８：１／１８：１／１７：０ＴＧ、１６：０ＳＭ、および１６：０／１６：０ＰＣ。
【０１７５】
２０：４ＬＰＣを除き、表４中において確認される脂肪酸分析物それぞれについて、脂肪酸の濃度が高いほど、ＭＡＣＣＥについてのリスクと強い関係があり得る（例えば、１８：０／２０：４ＰＥの個体群分布の第４四分位数内の被験者は、最も低い、すなわち第１、四分位数内のものよりＭＡＣＣＥに罹患する可能性が高い）。２０：４ＬＰＣについては、その反対であり得る：２０：４ＬＰＣの個体群分布の最も低い、すなわち第１四分位数内の被験者は、最も高い、すなわち第４、四分位数内の者よりＭＡＣＣＥに罹患する可能性が高い。
【０１７６】
一部の実施形態によると、臨床家は、上の表４の第４四分位数内の分析物測定値を有する被験者を、潜在的に２年以内のＭＡＣＣＥについての高いリスクがある個体として同定することができる（第１四分位数内の値を有する被験者の方がより高いリスクがあることを意味する、１未満のオッズ比を有する、アポリポタンパク質Ａ１、２０：４ＬＰＣ、またはアラビノースを除く）。別の実施形態によると、臨床家は、上の表４の第３または第４四分位数範囲内の分析物測定値を有する被験者を、潜在的に２年以内のＭＡＣＣＥについての高いリスクがある個体として同定することができる。さらなる実施形態によると、臨床家は、上の表４の第２、第３または第４四分位数範囲内の分析物測定値を有する被験者を、潜在的に２年以内のＭＡＣＣＥについての高いリスクがある個体として同定することができる。
【０１７７】
多変量分類法
監視多変量予測モデル：予測される転帰が指標特性づけの２年以内のＭＡＣＣＥの発生である、多変量予測モデルを構築した。モデルにインプットした変量は、（ｉ）バイオ分析プラットホーム特異的血漿分析物、および（ｉｉ）すべてのバイオ分析プラットホームによって一緒にプロファイルされるような血漿分析物であった。従来の臨床因子について調整を伴うおよび伴わない、それぞれの多変量モデルも構築した。
【０１７８】
多変量分類手順Ｒａｎｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ（Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ４５：５−３２，２００１）をデータに適用して、ＭＡＣＣＥの予兆となる多変量フィンガープリントを得た。外部クロスバリデーションおよびラベル順列検定を実行して、得られたモデルの統計学的有意性を評価した（Ａｍｂｒｏｉｓｅ ＆ ＭｃＬａｃｈｌａｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９９：６５６２−２，２００２）。以下の出力をそれぞれの分類器からから得ることができた：１．「症例」および「対照」群におけるＭＡＣＥ予測のための予測多変量血漿分析物候補が、分類精度における重要性によってランクづけされた分析物と共に報告された。
２．それぞれの分類器についての特異性に対する感度のＲＯＣ曲線（例えば、図１および２を参照）
症例または対照のいずれかにおける５０％より大きい欠測値を有する特徴は、多変量分析から除外した。症例および対照における５０％未満の欠測値を有する特徴は、Ｔｒｙｏｙａｎｓｋａｙａらによって記載された方法（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７（６）５２０−５２５，２００１）を用いて一定の価値があると評価された欠測値を有した。
【０１７９】
方法に従って同定した分析物
７２３の分析物の総合バイオ分析データセットと共に多変量統計学的分類器分析法（Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ−Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ４５：５−３２，２００１）を用いることにより、本発明者らは、血液サンプルを得た時点から２年以内の個体における心血管または脳血管主要有害事象の発生を予測するために用いることができる分析物およびアルゴリズムのセットを発見した。下の表５は、１つの出発シードに基づくＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分類器における合計７２３の分析物のリスト中のそれらの重要性順での５０の最も重要な分析物を表す（分析＃１）。Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分析および分析＃１と同じ出発シードを用いるちょうど５０の分析物成分を有する分類器の獲得への再帰的特徴排除アプローチからの部分的分析物重要性リストを、縦列マーカー「分析＃２からの重要性の順番」に示す。３つの追加のＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分析および異なる出発シードから誘導されたちょうど５０の分析物成分を有する分類器の獲得への再帰的特徴排除アプローチからの部分分析物重要性リストを、分析＃３、＃４および＃５についての縦列に示す。Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分析のための出発シードまたは５０固定の分析物成分の分類器を得るための再帰的特徴排除の使用に関係なく、最も重要な２０の分析物は、ほぼ常に、分析＃１からの重要性によってランク付けして上位５０位以内である。
【０１８０】
【表５−１】
【０１８１】
【表５−２】
４つの出発シードを用いるＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分析からの分析物の完全リストを、添付の付属書類５−８における同じ４つの出発シードについてのＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔプラス回帰的特徴排除アプローチからの上位５０の分析物と共に、添付の付属書類１−４に示す。
【０１８２】
アルゴリズムと共に個体からの血漿サンプル中の分析＃１からの上位２０の分析物のレベルを用いることにより、２年以内のＭＡＣＣＥの発生についてのその個体に関する予測を、感度８７％および特異性８７％で行うことができた。これを図１に示す受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によって例証する。
【０１８３】
６６の個々の分析物のターゲットプロテオミクスバイオ分析データセットと共に多変量統計学的分類器分析法（Ｒｏｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ−Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ４５：５−３２，２００１）を用いることにより、本発明者らは、血液サンプルを得た時点から２年以内の個体における心臓発作の発生を予測するために用いることができる分析物およびアルゴリズムのセットを発見した。下の表６は、１つのそのような分析物セットにおける最も重要な１０の分析物、および多変量分析から得た分類器におけるそれらの重要性の順番を表す。
【０１８４】
【表６】
アルゴリズムと共に個体からの血漿サンプル中のこれら上位１０の分析物のレベルを用いることにより、２年以内のＭＡＣＣＥの発生についてのその個体に関する予測を、感度８２％および特異性８７％で行うことができた。これを図２に示す受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によって例証する。
【０１８５】
一部の実施形態によると、上位１０の分析を用いて次の一次方程式によりＭＡＣＣＥ指数を定義することができる：
ｙ＝ｃ１ｘ１＋ｃ２ｘ２＋ｃ３ｘ３＋ｃ４ｘ４＋ｃ５ｘ５＋ｃ６ｘ６＋ｃ７ｘ７＋ｃ８ｘ８＋ｃ９ｘ９＋ｃ１０ｘ１０
［方程式１］
（式中、ｃ１からｃ１０の値は、下の表９に列挙する値であり、変数ｘ１からｘ１０は、下の表７に列挙する分析物の測定値を表す）。分析物を、上のターゲットプロテオミクス：多重化イムノアッセイのセクションにおいて説明したように測定する。それぞれの分析物についての測定単位を下の表に列挙する。方程式１に測定値を入れる前に、それらの値を標準化しなければならない。すなわち、それぞれの測定値から、全研究個体群（すなわち、すべての症例および対照被験者）から得たすべての値の平均を引き、その後、結果を、全研究個体群（すなわち、すべての症例および対照被験者）から得た分析物測定値の標準偏差で割った。方程式１の１０の分析物についての対応する値、すなわち、個体群平均および標準偏差を表８に列挙する。
【０１８６】
方程式１のような方程式を用いると、上記方程式において得られる値ｙ（ＭＡＣＣＥ指数）がゼロより大きいこれら１０の分析物についての測定値（それぞれ、表８からの適切な値を用いて上記したように標準化した測定値）を有する被験者は、２年以内のＭＡＣＣＥのリスクがあると分類されることとなり、そうでない者は、２年以内のＭＡＣＣＥについてのリスクがないと分類されることとなる。
【０１８７】
【表７】
【０１８８】
【表８】
【０１８９】
【表９】
上位四（４）の分析物を用いて、次の一次方程式により、さらに別のＭＡＣＣＥ指数を定義することができる：
ｙ＝ｃ１ｘ１＋ｃ２ｘ２＋ｃ３ｘ３＋ｃ４ｘ４ ［方程式２］
（式中、ｃ１からｃ４の値は、下の表１１に列挙する値をとり、変数ｘ１からｘ１０は、下の表１０に列挙する分析物の測定値を表す）。分析物を、上のターゲットプロテオミクス：多重化イムノアッセイのセクションにおいて説明したように測定する。それぞれの分析物についての測定単位は、下の表に列挙する。方程式２に測定値を入れる前に、それらの値を標準化しなければならない。すなわち、それぞれの測定値から、全研究個体群（すなわち、すべての症例および対照被験者）から得たすべての値の平均を引き、その後、結果を、全研究個体群（すなわち、すべての症例および対照被験者）から得た分析物測定値の標準偏差で割った。方程式２の４つの分析物についての対応する値、すなわち、個体群平均および標準偏差を上の表８に列挙する。
【０１９０】
【表１０】
【０１９１】
【表１１】
方程式２のような方程式を用いて、上記方程式において得られる値ｙ（ＭＡＣＣＥ指数）がゼロより大きい、これら４つの分析物についての測定値（それぞれ、表８からの適切な値を用いて上記したように標準化した測定値）を有する被験者は、２年以内のＭＡＣＣＥのリスクがあると分類されることとなり、そうでない者は、２年以内のＭＡＣＣＥについてのリスクがないと分類されることとなる。
【０１９２】
追加の多変量分類分析法、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（ＰＡＭ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら，ＰＮＡＳ ９９：６５６７−６５７２，２００２）、を７２３の分析物の総合プラットホームデータセットに適用した。この分析によって、症例または対照の分類に最適な最小分析セットが得られた。上のＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓケースにおける、分析物＃２、＃３、＃４および＃５についてのものと同じ４つのシードを用いる４つのＰＡＭ分析物のための分析セットを次の表に示す：
【０１９３】
【表１２】
【０１９４】
【表１３】
【０１９５】
【表１４】
【０１９６】
【表１５】
ＰＡＭによるこの代替多変量分類器分析により、異なる出発シードに対して本質的に同じ分析物、およびＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分析の結果と、同一ではないが、一致する重要性の順番で上位にランク付けされる分析物が得られた。
【０１９７】
本教示は、個体からの血液サンプルにおいて測定することができる、ならびにＭＡＣＣＥ指数を計算するためのアルゴリズムおよびその個体についての血液サンプル採取時から２年以内のＭＡＣＣＥの発生を予測するためのアルゴリズムと併用することができる、分析物セットの素性を含む。
【０１９８】
本教示は、分析物セットの血液、血漿または血清レベルに関する情報と共に用いて、ＭＡＣＣＥを計算することができる、およびＢｒｅｉｍａｎが分析物セット、例えばこれ、について記載した（Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ４５：５−３２，２００１）ような個体についての血液サンプル採取時から２年以内のＭＡＣＣＥの発生を予測することができる、アルゴリズムも含む。
【０１９９】
本教示は、ＭＡＣＣＥ指数を計算するためのおよびその個体についての血液サンプル採取時から２年以内のＭＡＣＣＥの発生を予測するためのアルゴリズムと併用することができる、分析物セットのレベルを個体の血液、血漿または血清サンプルから測定することができる計器も含む。
【０２００】
本教示は、ＭＡＣＣＥ指数を計算するためのおよび個体についての血液サンプル採取時から２年以内のＭＡＣＣＥの発生を予測するためのアルゴリズムと併用することができる、分析物セットの血液、血漿または血清レベルを測定するアッセイに利用することができる試薬（抗体および他のタイプの親和性試薬）も含む。
【０２０１】
本教示は、その本質的な精神または特徴から逸脱することのない他の特定の形での実施形態を包含する。従って、上述の実施形態は、すべての点で、本明細書に記載する本教示に対する限定ではなく例証であると考えなければならない。本発明の範囲は、上述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に入るすべての変更が意図されており、特許請求の範囲に包含される。
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、２００７年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９８，５６３号および２００７年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／９９８，７５６号に対する優先権および利益を、米国特許法セクション１１９（ｅ）のもとに主張する。米国仮特許出願第６０／９９８，５６３号および米国仮特許出願第６０／９９８，７５６号のそれぞれの全ての開示は、参考により本明細書中に援用される。
【０００２】
本教示は、ヒトが心血管または脳血管主要有害事象、すなわちＭＡＣＣＥに罹患するかどうかを予測するための方法に関する。より具体的には、本教示は、１つ以上の分析物を使用することにより、心血管または脳血管主要有害事象を有するまたは発現するリスクがあることについて個体をスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
心臓発作は、単独首位の死因である（ｗｗｗ．ａｍｅｒｉｃａｎｈｅａｒｔ．ｏｒｇ参照）。米国における死亡の５件に１件は心臓発作に起因する。２００４年、米国では、およそ１，２００，０００件の新規および再発性心血管発作に起因する心臓発作による死亡が４５２，３２７件あった。
【０００４】
脳卒中は、米国における第三位の死因である（ｗｗｗ．ａｍｅｒｉｃａｎｈｅａｒｔ．ｏｒｇ参照）。およそ７００，０００件の新規および再発性脳血管事象に起因して２００４年には１５０，１４７人が脳卒中により命を奪われた。米国において、脳卒中は、重篤な長期能力障害の主要原因である。米国では、今日、約５，７００，０００人の脳卒中生存者が生き続けている。２，４００，０００人が男性であり、３，３００，０００人が女性である。
【０００５】
心臓発作も、一定のタイプの脳卒中も、受攻性アテローム硬化性プラークの破裂の結果として生じ得る（非特許文献１、非特許文献２）。現在、心臓発作または脳卒中を有するリスクは、一般人口において一定の臨床的および生化学的リスク因子を考慮することにより評定されている（非特許文献３；非特許文献４）が、これらの特徴は、心血管リスクを完全には説明しない（非特許文献５；非特許文献６）。
【０００６】
心臓発作または脳卒中の将来の発生を予測する能力が向上すれば、そのようなリスクを有する個体を予防対策のターゲットにすることができ、また、これらの主要死因の発生全体を減少させることができよう。
【０００７】
個体の血液中の多数のタンパク質および代謝産物の測定により、その個体の生化学的状態への「窓口」の見通しが得られ、ならびに彼または彼女の心血管系の状態についてのより良好な示度、およびその被験者が将来心臓発作または脳卒中を経験する尤度が得られるだろう（非特許文献７）。この理論的根拠をもって、本発明者らは、血液または血漿中の分子バイオマーカープロフィール（例えば、１セットのタンパク質、１セットの代謝産物、１セットのタンパク質および代謝産物、またはタンパク質および／もしくは代謝産物を含み得る１セットの他の分析物）および近々の心血管または脳血管主要有害事象（ＭＡＣＣＥ）を予測する関連アルゴリズムの発見を目的として研究を行った。
【０００８】
このように、主要急性心臓事象を予測するための診断法が、依然として必要とされている。詳細には、心血管および脳血管主要悪性事象の診断および／または予測が可能となる、信頼でき、且つ、費用効率の高い方法および組成物が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎａｇｈａｖｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０８：１６６４−７２，２００３
【非特許文献２】Ｎａｇｈａｖｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０８：１７７２−８，２００３
【非特許文献３】Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９７：１８３７−４７，１９９８
【非特許文献４】ＡＴＰ ＩＩＩ，ＪＡＭＡ ２８５：２４８６−９７，２００１
【非特許文献５】Ｋｈｏｔら、ＪＡＭＡ２９０：８９８−９０４，２００３
【非特許文献６】Ｇｒｅｅｎｌａｎｄら、ＪＡＭＡ ２９０：８９１−７，２００３
【非特許文献７】Ｖａｓａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ１１３：２３３５−６２，２００６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本教示は、個体が心血管または脳血管主要有害事象、すなわちＭＡＣＣＥ、に罹患することを予測するための方法に関する。この方法は、その個体からの血液サンプルから採取した血漿または血清中の一定の分析物、例えばタンパク質および代謝産物、の１つ以上についてのレベルを測定すること、およびその後、決定アルゴリズムを用いて、その個体がＭＡＣＣＥを経験する可能性が高いかどうかを予測することを含む。
【００１１】
被験者における心血管または脳血管主要有害事象の尤度の予測に有用である血液中のマーカーを同定した。これらのマーカーのレベルは、標準と異なるとき、心血管または脳血管主要有害事象の予兆となる。本教示による方法は、１つ以上の分析物を利用して心血管または脳血管主要有害事象を予測する。具体的には、これらの分析物のうちの１つ以上の使用、およびこれらの分析物のレベルが標準と異なるかどうかの判定により、心血管または脳血管主要有害事象を発現するリスクがあることについて被験者をスクリーニングすることができる。
【００１２】
本教示の分析物は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度の単なる予測以上に有用であり得る。それらの分析物を使用して、心血管または脳血管主要有害事象を予防するための候補薬をスクリーニングすることができる。それらの分析物を使用して、健康状態のモニターを必要とする被験者を同定することができる。また、それらの分析物を使用して、冠動脈疾患または脳血管疾患についての動物モデルを検証することができる。
【００１３】
１つの態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供する。この方法は、１セットの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度の測定を含む。セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および組織因子を含む場合がある。前記方法は、セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数を決定すること、およびそのＭＡＣＣＥ指数がより大きい場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度増加、またはそのＭＡＣＣＥ指数がゼロ以下である場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度低下を有するものとしてそのヒトを同定することをさらに含む。
【００１４】
別の態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づいて、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することを含む。セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および組織因子を含む場合がある。前記方法は、ＭＡＣＣＥ指数、心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することも含む。
【００１５】
さらなる態様において、本教示は、ヒトを治療する方法を提供する。この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥを決定することを含む。セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および組織因子を含む場合がある。前記方法は、ヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合、治療を推奨する、是認する、または施与することをさらに含む場合がある。
【００１６】
様々な実施形態によると、セットの分析物は、ＣＤ４０、フィブリノゲン、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、およびフォン・ヴィルブランド因子も含む場合がある。一部の実施形態によると、セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数の決定は、それぞれの分析物の測定濃度を標準化して、標準化濃度を得ること、それぞれの分析物の標準化濃度に分析物定数をかけて分析物値を得ること、次いで、それぞれの分析物の分析物値を合計してＭＡＣＣＥ指数を得ることを含む場合がある。一定の実施形態によると、測定濃度の標準化は、測定濃度から個体群平均値を引いて結果を得ること、およびその結果を個体群平均値の標準偏差で割ることを含む場合がある。
【００１７】
一部の実施形態において、前記方法は、１セットの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定することを含み、ここで、セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子から成る場合がある。前記方法は、セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数を決定すること、およびＭＡＣＣＥ指数がゼロより大きい場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度増加、またはＭＡＣＣＥ指数がゼロ以下である場合には心血管または脳血管主要有害事象の尤度低下を有するものとしてそのヒトを同定することをさらに含む。
【００１８】
さらなる態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づいて、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することを含む。セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子から成る場合がある。前記方法は、ＭＡＣＣＥ指数、心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することも含む場合がある。
【００１９】
本教示の追加の態様は、ヒトを治療する方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することを含む。セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子から成る場合がある。前記方法は、そのヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合、治療を推奨すること、是認すること、または施与することも含む場合がある。
【００２０】
本教示の様々な実施形態によると、セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数の決定は、それぞれの分析物の測定濃度を標準化して標準化濃度を得ること、それぞれの分析物の標準化濃度に分析物定数をかけて分析物値を得ること、次いで、それぞれの分析物の分析物値を合計してＭＡＣＣＥ指数を得ることを含む場合がある。一定の実施形態によると、測定濃度の標準化は、測定濃度から個体群平均値を引いて結果を得ること、およびその結果を個体群平均値の標準偏差で割ることを含む。
【００２１】
他の態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、１セットの分析物の少なくとも１つの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定することを含む。セットの分析物は、システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、アポリポタンパク質Ａ１、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８／１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、アラビノース、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群である。前記方法は、測定濃度と所定の閾値との比較に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定することをさらに含む。
【００２２】
別の態様において、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の少なくとも１つの分析物の測定濃度を所定の閾値と比較して、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を確認することを含む。セットの分析物は、システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、アポリポタンパク質Ａ１、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８／１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、アラビノース、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択される。前記方法は、測定濃度、所定の閾値、および心血管または脳血管主要有害事象の尤度のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することも含む場合がある。
【００２３】
追加の態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、１８：１／１７：１／１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択される１セットの分析物の少なくとも１つの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定することを含む。前記方法は、測定濃度と所定の閾値との比較に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定することも含む場合がある。
【００２４】
さらなる態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の少なくとも１つの分析物の測定濃度を所定の閾値と比較して、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を確認することを含む。分析物は、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、１８：１／１７：１／１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択される。前記方法は、測定濃度、所定の閾値、および心血管または脳血管主要有害事象の尤度のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することも含む場合がある。
【００２５】
様々な実施形態によると、分析物システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールのそれぞれについての所定の閾値は、それぞれ各々の分析物についての表４中の第４四分位数の下限であり得、この場合、第４四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる。一部の実施形態によると、分析物システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールのそれぞれについての所定の閾値は、それぞれ各々の分析物についての表４中の第３および第４四分位数の下限であり得、ここで、第３および第４四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる。
【００２６】
様々な実施形態によると、分析物アポリポタンパク質Ａ１、２０：４リゾホスファチジルコリンおよびアラビノースのそれぞれについての所定の閾値は、それぞれ各々の分析物についての表４中の第１四分位数の上限であり得、ここで、第１四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる。一部の実施形態によると、分析物アポリポタンパク質Ａ１、２０：４リゾホスファチジルコリンおよびアラビノースのそれぞれについての所定の閾値は、それぞれ各々の分析物についての表４中の第１および第２四分位数の上限であり得、ここで、第１および第２四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる。
【００２７】
本教示の様々な実施形態において、血液系サンプルは、血清または血漿であり得る。
【００２８】
さらなる態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトから少なくとも１つの血液系サンプルを得ること、そのヒトからのサンプル中の添付書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度を測定すること、および付属書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定することを含む場合がある。
【００２９】
さらなる態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法を提供し、ここで、この方法は、そのヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度を測定すること、絶対濃度を所定の閾値と比較すること、付属書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定すること、および心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、絶対濃度、所定の閾値またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む。
【００３０】
一部の態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法を提供し、ここで、この方法は、ヒトから少なくとも１つの血液系サンプルを得ること、そのヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度を測定すること、および付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定することを含む。
【００３１】
さらなる態様において、本教示は、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法を提供し、ここで、この方法は、そのヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度を測定すること、相対濃度を所定の閾値と比較すること、付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度に基づき、そのヒトを、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして同定すること、および心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、相対濃度、所定の閾値またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む。
【００３２】
前記方法の様々な実施形態によると、ＭＡＣＣＥ指数、心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、測定濃度、所定の閾値、またはそれらの等価物は、スクリーンもしくは有形媒体に表示され、またはＭＡＣＣＥ指数は、医療業界の人、医療保険プロバイダーもしくは医師に転送される。
【００３３】
別の態様において、本教示は、治療方法を提供し、ここで、この治療方法は、付属書類１において確認される１つ以上の分析物の、血液系サンプル中の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または低下を有するものとしてヒトを同定すること、およびそのヒトが心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合には、治療を推奨すること、是認することまたは施与することを含む場合がある。
【００３４】
さらなる態様において、本教示は、治療を受けるべきでないヒトを同定する方法を提供し、ここで、この方法は、付属書類１において確認される１つ以上の分析物の、血液系サンプル中の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または低下を有するものとしてヒトを同定すること、およびそのヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものと同定されない限り、治療の推奨、是認または施与を拒否することを含む場合がある。
【００３５】
本教示の前述ならびに他の特徴および利点は、以下の図、説明、実施例および特許請求の範囲から、さらに十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
上記の本教示の前述ならびに他の目的、特徴および利点は、添付の図面と一緒に読むと、様々な例証となる実施形態の以下の説明から、さらに十分に理解されるであろう。本図面中の同様の参照記号は、異なる図を通じて同じ要素を一般に指す。下記の図面が単に例証のためのものであることは、理解されるはずである。本図面は、いかなる点においても本教示の範囲を限定するためのものではない。
【図１】本教示の例示的実施形態による血漿サンプル中の表５からの上位２０の分析物のレベルを用いた２年以内のＭＡＣＣＥの発生についての予測を図示する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【図２】本教示の例示的実施形態による血漿サンプル中の表６からの上位１０のタンパク質分析物のレベルを用いた２年以内のＭＡＣＣＥの発生についての予測を図示する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
心血管または脳血管主要有害事象の予兆となる分析物を同定した。これらの分析物の１つ以上が、標準物質中のものとは異なる量で個体からの体液サンプル中に存在する場合、それらは、その個体が心血管または脳血管主要有害事象を有するまたは発現するリスクがあることを示し得る。本出願は、２００７年１０月１０日出願の米国特許仮出願番号６０／９９８，５６３、および２００７年１０月１１日出願の米国特許仮出願番号６０／９９８，７５６のそれぞれについての全開示を参照により本明細書に組み入れる。
【００３８】
本出願全体を通して、組成物を、特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載する場合、またはプロセスを、特定のプロセス工程を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載する場合、本教示の該組成物が、列挙する成分から本質的に成る、または成ることも考えられ、本教示の該プロセスが、列挙するプロセス工程から本質的に成る、または成ることも考えられる。
【００３９】
本出願において、要素または成分を、列挙する要素または成分のリストに含まれる、および／またはから選択されると言う場合、該要素または成分は、列挙する要素または成分のうちのいずか１つである場合もあり、列挙する要素または成分の２つ以上から成る群から選択される場合もあると解釈すべきである。さらに、本明細書に記載する組成物、装置または方法の要素および／または特徴は、本明細書中で明示的であろうと、暗示的であろうと、本教示の精神および範囲を逸脱することなく様々な方法で組み合わせることができると解釈すべきである。
【００４０】
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」または「有する（現在分詞形）（ｈａｖｉｎｇ）」の使用は、特に別様に述べていない限り、無制限であり、非限定的であると一般に解釈すべきである。
【００４１】
本明細書における単数形の使用は、特に別様に述べていない限り、複数形を含む（逆もまた同じ）。加えて、用語「約」の使用が、量的値の前にある場合、特に別様に述べていない限り、本教示は、その特定の量的値自体も含む。本明細書において用いる場合、用語「約」は、その公称値からの±１０％の偏差を指す。
【００４２】
工程の順序、または一定の動作を実施するための順序は、本教示が実施可能であり続ける限り、重要でないと解釈すべきである。さらに、２つ以上の工程または作用が、同時に行われることもある。
【００４３】
７２３の分析物を同定した。本教示による一定の方法は、これらの分析物の２つ以上を利用して、心血管または脳血管主要有害事象を予測する。具体的には、これらの方法では、被験者からのサンプルをスクリーニングして、そのサンプルが、これらの７２３の分析物のそれぞれについて、標準サンプルとは異なる２つ以上のレベルを含有するかどうかを判定することができる。サンプルが、これらの分析物の２つ以上のそれぞれについての、標準物質中のこれらの分析物の量とは異なる量を含有する場合、スクリーニングは、「陽性スクリーニング」（すなわち、その個体は、心血管または脳血管主要有害事象に罹患するリスクがある）とみなされる。心血管または脳血管主要有害事象を分類する際、一般に、多数の分析物を使用するほど、高い感度および特異性を得ることができる。これらの分析物を含有する可能性があるサンプルは、多数の源（例えば、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、上皮細胞、および内皮細胞）から得られる多数の生体サンプル（例えば、体液、組織、細胞）から抽出することができる。本明細書に開示する７２３の分析物（表５において確認されている５０の分析物だけでない）の可能な組み合わせすべてを、本教示による方法において使用することができると解釈すべきである。
【００４４】
実施例１においてさらに十分に説明する方法論を用いて、７２３の分析物を同定した。簡単に言うと、特定の分析分類プロトコルにより、７２３の分析物１セットを分析し、スペクトルのピークを得た。付属書類１から４は、分析した７２３の分析物を含む特定の分子を提供する。これらのピークは、特定の分子の特性を表す。（７２３の分析物すべてを含む）これらのピークを利用して、５０のピーク（ならびに下記のような他の好ましいピーク）を同定した。ピークが分子の特性を表す限り、５０のピークをそれよりはるかに多い数のピークの中から同定するということは、５０の分析物に対応する５０より多くの分子を含む一群の分子からそれらの分析物が選択されることを意味する。分析物（すなわち、分子）は、いずれのタイプの分子であってもよい。分析物（分子）としては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、ステロイド、核酸、代謝産物および元素が挙げられるが、これらに限定されない。表５は、５０のピークを含む特定の分子を提供する（すなわち、選択した分析物を確認する）。表５の第２欄は、重量によってピークをランク順に配列している。従って、最高重量ピークが番号１にランク付けされ、最低重量ピークが番号５０にランク付けされる。
【００４５】
分析物（すなわち、７２３の同定された分析物のいずれか、または好ましい５０の分析物のいずれか）がわかったので、それらを使用して個体をスクリーニングして、その個体からのサンプル中のこれらの分析物のうちの２つ以上のそれぞれについての量または絶対濃度が、標準からの２つ以上の分析物のそれぞれについての量と異なるかどうかを判定することができ、標準と比較してそのサンプル中の２つ以上の分析物のそれぞれについてのその個体の相対濃度を決定することができ、および心血管または脳血管主要有害事象を発現するリスクを有するものとしてまたはリスクがあるものとして、ある一定の特異性および感度まで、その個体を分類することができる。勿論、分析物の測定量または濃度を比較前に標準化することができる。調査する分析物の数に基づき、アッセイの望ましい感度および特異性を選択することができる。標準は、実際のサンプルである場合もあり、以前に生成された実験データである場合もある。標準は、正常とわかっている人から得ることができる。正常とわかっている人は、健常人である場合もあり、サンプル採取前の所定の期間、所定の食事を摂る場合もある。さらに、サンプルを、被験者と同じ性別の、正常とわかっている人から得る場合ができる。あるいは、分析物を心血管または脳血管主要有害事象がわかっている被験者のものと比較してもよく、この場合、それら２サンプル間の類似性、または標準と比較した分析物の相対濃度を調査することとなろう。医療専門家は、被験サンプルをスクリーニングするために様々な技術および／またはキットを用いて被験サンプル中の特定の分析物のレベルおよび／または量を決定することができる。そのようなアッセイの例は、以下に記載するが、それらとしては、限定されないが、イムノアッセイ、質量分析、クロマトグラフィー、化学分析、比色アッセイ、分光分析、電気化学的分析、および核磁気共鳴が挙げられる。加えて、そのようなアッセイは、全血、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、尿、精液、乳頭穿刺液、膵液、およびこれらの組み合わせをはじめとする任意の生体サンプルを用いて行うことができる。これらのアッセイは、特定の分析物を検出するためにどれが一番適するのか、ならびに特定の生体サンプルと共に使用するためにどれが一番適するのかに基づいて選択される。従って、多数のアッセイを用いて所望の分析物を検出することができ、１つ以上の源からのサンプルを分析することができる。
【００４６】
分析物は、１つ以上の分離方法を用いることによって検出および／または定量することができる。例えば、適する分離方法をしては、質量分析法、例えば、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ（ｎは、ゼロより大きい整数である）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、表面強化レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン利用脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）ｎ、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−ＭＳ（ＭＳ）ｎを挙げることができる。他の質量分析法としては、中でも、四重極、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）およびイオントラップを挙げることができる。同じく使用することができる分光測定技術としては、共鳴分光法および光学分光法が挙げられる。
【００４７】
他の適する分離方法としては、化学抽出分配、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性（逆相）液体クロマトグラフィー、等電点分画、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、または他のクロマトグラフ技術、例えば薄層、ガスもしくは液体クロマトグラフィー、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。１つの実施形態では、アッセイすべき生体サンプルを、分離方法の適用前に分画する場合がある。
【００４８】
クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」））と質量分析（「ＭＳ」）とのタンデム連結は、１つ以上の分析物の検出および定量に有用であり得る。ＬＣは、個体からのサンプル中の、分析物を含み得る分子を分離するために用いることができる。高温で保持することができるＬＣ装置の注入口に、溶媒に溶解した少量のサンプルを注入することができる。この装置のＬＣカラムには、極性である場合もありまたは非極性である場合もある固体支持体が収容されている。サンプル中の分子の様々な極性のため、分子は、カラム内の固体支持体に対して様々な親和性を有し、異なる時間で溶出するであろう。支持体への分子の親和性が強いほど、カラム内での分子の保持時間が長くなる。それらの分子は、カラムを出ると、質量分析計に入る。質量分析計によって、分子はイオン化される。タンデム質量分析モードで、システムを正しく標準化することができれば、質量分析計に送られたそれぞれの化合物は、様々な質量および存在度のイオンにフラグメント化して、その物質に特有のシグネチャーパターンを形成する。それぞれのピークのタンデム質量分析図をコンピュータデータベースと比較することにより、コンピュータは、通常、それらの分子を高い確度で同定することができる。あるいは、または加えて、この比較を人的検査によって行うことができる。素性が確認されたら、コンピュータは、それぞれのピーク下面積を積分することにより混合物中のそれぞれの分子の相対量を決定する。分子のいずれかが分析物として同定されれば、分析物の量を標準からの分析物の量と比較して、差があるかどうかを判定することができる。
【００４９】
分析物自体の物理的分離を必要としない方法によって分析物を検出および／または定量することもできる。例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を用いて、分子の複雑な混合物から分析物のプロフィールを解明することができる。腫瘍を分類するためのＮＭＲの類似の使用が、例えば、Ｈａｇｂｅｒｇ，ＮＭＲ Ｂｉｏｍｅｄ．１１：１４８−５６（１９９８）に開示されている。追加の手順としては、個々の分子の物理的分離を伴わずに分析物プロフィールを決定するために用いることができる、核酸増幅技術が挙げられる。（例えば、Ｓｔｏｒｄｅｕｒら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５９：５５−６４（２００２）およびＴａｎら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１３８７−１１３９２（２００２）参照）。
【００５０】
サンプル中の分析物は、分析物と特異的に結合することができる結合分子と分析物を化合させることによって検出および／または定量することができる。結合部分としては、例えば、リガンド−受容体ペア、すなわち、特異的結合相互作用を有することができる１対の分子のメンバーを挙げることができる。結合部分としては、例えば、特異的結合ペア、例えば、抗体−抗原、酵素−基質、核酸−核酸、タンパク質−核酸、タンパク質−タンパク質、または当該技術分野において公知の他の特異的結合ペアも挙げることができる。ターゲットに対する親和性が強化された結合タンパク質を設計することができる。場合によっては、結合部分を検出可能な標識、例えば、酵素標識、蛍光標識、放射性標識、リン光標識または着色粒子標識と連結させることができる。標識された複合体を、例えば目視でまたは分光分析計もしくは他の検出器によって検出することができ、ならびに／あるいは定量することができる。
【００５１】
当該技術分野において利用可能なゲル電気泳動技術を用いて、分析物を検出および／または定量することもできる。二次元ゲル電気泳動の場合は、先ず、分子を、それらの等電点に従ってｐＨ勾配ゲル中で分離する。次に、得られたゲルを第二ポリアクリルアミドゲル上に置き、分子量に従って分子を分離することができる（例えば、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７−４０２１（１９７５）参照）。心血管または脳血管主要有害事象のための分析物は、先ず、心血管または脳血管主要有害事象のリスクがあることが疑われる個体から得たサンプルから分子を単離し、次に、二次元ゲル電気泳動により分子を分離して特徴的な二次元ゲル電気泳動パターンを生じさせることによって検出することができる。その後、パターンを、標準（例えば、健常または主要急性心臓事象被験者）から単離した分子を同じまたは類似の条件下で分離することによって生じさせた標準ゲルパターンと比較することができる。標準ゲルパターンを電気泳動パターンの電子データベースに保存し、そこから検索することもできる。このようにして、被験者におけるマーカーの量が、標準における量と異なるかどうかを判定することができる。正常とわかっている標準とは異なる量での二次元ゲル上の複数の、例えば２から５０の、心血管または脳血管主要有害事象分析物の存在は、個体における心血管または脳血管主要有害事象についての陽性スクリーニングを示す。このようにして、アッセイにより、心血管または脳血管主要有害事象の予測および治療が可能となる。
【００５２】
当該技術分野において利用可能な広範なイムノアッセイ技術のいずれかを用いて、分析物を検出および／または定量することもできる。例えば、サンドイッチイムノアッセイ形式を用いて、被験者からのサンプル中の分析物を検出および／または定量することができる。あるいは、従来の免疫組織化学手順を用いて、１つ以上の標識結合タンパク質を使用してサンプル中の分析物の存在を検出および／または定量することができる。
【００５３】
サンドイッチイムノアッセイでは、分析物に結合することができる２つの抗体、例えば、固体支持体上に固定化されたもの、および、溶液中で遊離しており、検出可能な化合物で標識されているものが一般に使用される。第二の抗体のために使用することができる化学標識の例としては、放射性同位元素、蛍光化合物、および反応体または酵素基質に曝露されると有色のまたは電気化学的に活性な生成物を生じさせる酵素または他の分子が挙げられる。分析物を含有するサンプルをこの系の中に置くと、分析物は、固定化抗体と標識抗体との両方に結合して、支持体の表面に「サンドイッチ」免疫複合体を形成する。結合していないサンプル成分および過剰な標識抗体を洗浄除去し、支持体の表面で分析物と複合体化した標識抗体の量を測定することによって、複合体化した分析物を検出する。あるいは、化学部分、例えばハプテンで標識することができる、溶液中で遊離している抗体を、遊離抗体に結合する検出可能な部分で標識したまたは例えばハプテンをそれにカップリングさせた第三の抗体によって検出することができる。
【００５４】
良好な検出限界を有する標識を使用すれば、サンドイッチイムノアッセイおよび組織免疫組織化学手順の両方が高特異的であり、非常に感度が高い。免疫学的アッセイの設計、理論およびプロトコルの詳細な論評は、Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）およびＨａｒｌｏｗら Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）はじめとする、当該技術分野における非常に多数のテキストにおいて見出すことができる。
【００５５】
一般に、イムノアッセイ設計考慮事項としては、非特異的相互作用の生成物と確実に区別することができる複合体を形成するためにターゲットに対する十分高い結合特異性を有する抗体（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体）の調製が挙げられる。本明細書において用いる場合、用語「抗体」は、ターゲットに対する適切な結合親和性および特異性を有する結合タンパク質、例えば、抗体、または免疫グロブリン可変領域様結合領域を含む他のタンパク質を意味すると解釈する。抗体結合特異性が高いほど、検出することができるターゲット濃度は低い。本明細書において用いる場合、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、結合部分、例えば結合タンパク質が、約１０５Ｍ−１より大きい、さらに好ましくは約１０７Ｍ−１より大きいターゲットに対する結合親和性を有することを意味すると解釈する。
【００５６】
個体における心血管または脳血管主要有害事象を予測するためのアッセイにおいて有用である、単離されたターゲット分析物に対する抗体は、当該技術分野において周知であり記載されている標準的な免疫学的手順を用いて産生させることができる。例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，上記、参照。簡単に言うと、単離された分析物を使用して、マウス、ヤギまたは他の適する哺乳動物などの異種宿主において抗体を産生させることができる。宿主における抗体生産を増進することができる適切なアジュバントと分析物とを合わせ、例えば腹腔内投与によって宿主に注射することができる。宿主の免疫応答を刺激するために適する任意のアジュバントを使用することができる。一般に使用されるアジュバントは、フロイント完全アジュバント（死滅させ、乾燥させた微生物細胞を含み、例えば、サンディエゴのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．またはニューヨーク州グランドアイランドのＧｉｂｃｏから入手できる乳剤）である。多回抗原注射が所望される場合、後続の注射は、不完全アジュバント（例えば、無細胞乳剤）との組み合わせで抗原を含むことがある。ポリクローナル抗体は、対象となるタンパク質に対する抗体を含有する血清を抽出することによって、抗体生産宿主から単離することができる。モノクローナル抗体は、所望の抗体を生産する宿主細胞を単離すること、免疫学技術分野において公知の標準的な手順を用いてこれらの細胞を骨髄腫細胞と融合させること、およびターゲットと特異的に結合し、所望の結合親和性を有するハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）についてスクリーニングすることによって生産することができる。
【００５７】
抗体結合ドメインを生合成により生産し、結合ドメインのアミノ酸配列を操作して、ターゲット上の好ましいエピトープとの結合親和性を強化することもできる。特異的抗体方法論は十分に理解されており、文献に記載されている。それらの調製についてのより詳細な説明は、例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（上記）において見出すことができる。
【００５８】
加えて、当該技術分野においてＢＡＢＳまたはｓＦｖとしても公知である、遺伝子操作された生合成抗体結合部位を使用して、サンプルが分析物を含有するかどうかを判定することができる。（ｉ）非共有結合的に会合しているまたはジスルフィド結合している合成ＶＨおよびＶＬ二量体、（ｉｉ）共有結合で連結されているＶＨ−ＶＬ単鎖結合部位、（ｉｉｉ）個々のＶＨもしくはＶＬドメイン、または（ｉｖ）単鎖抗体結合部位を含むＢＡＢＳの作製および使用方法は、例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；同第５，１３２，４０５号；同第４，７０４，６９２号；および同第４，９４６，７７８号に開示されている。さらに、分析物に対する必要不可欠な特異性を有するＢＡＢＳを、コンビナトリアル遺伝子ライブラリーからのファージ抗体クローニングによって誘導することができる（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）参照）。簡単に言うと、ファージ（単離された分析物で予備免疫したマウスに由来する可変領域遺伝子配列、またはそれらのフラグメントによってコードされた免疫グロブリン可変領域を有するＢＡＢＳを、それぞれがそれらのコート表面で発現）を、固定化分析物に対する生物活性についてスクリーニングする。固定化分析物に結合するファージを回収し、ＢＡＢＳをコードする遺伝子の塩基配列を決定することができる。その後、対象となるＢＡＢＳをコードする、得られた核酸配列を、従来の発現系において発現させて、ＢＡＢＳタンパク質を生産することができる。
【００５９】
組織または液体サンプル中の分析物のレベルをモニターするための診断および他の組織評価キットおよびアッセイの開発に、単離された分析物を使用することもできる。例えば、キットは、１つ以上の分析物に特異的に結合する、ならびに組織または液体サンプル中の１つ以上の分析物の存在および／または量を検出および／または定量できるようにする、抗体または他の特異的結合タンパク質を含む場合がある。
【００６０】
１つ以上の分析物の検出に適するキットは、評価すべきサンプルを捕捉するレセプタクルまたは他の手段、ならびにサンプル中の、本明細書に記載する分析物の１つ以上の存在および／または量を検出するための手段を含む（しかし、これらに限定されない）と考えられる。１つの実施形態において、検出のための手段としては、これらの分析物に特異的な１つ以上の抗体、およびこれらの分析物への抗体の結合を、例えば本明細書に記載する標準的なサンドイッチイムノアッセイにより検出するための手段が挙げられるが、それらに限定されない。細胞内に位置する分析物の存在を（例えば、組織サンプルから）検出すべき場合、キットは、細胞構造を破壊して細胞内成分を露出させる手段を含むこともある。
【００６１】
本教示の分析物は、特定の配列の核酸を含む場合がある。例えば実時間定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、サンプル中の分析物核酸の量または絶対濃度を決定し、測定量と標準とを比較してサンプル中の分析物核酸の相対濃度を決定することにより、分析物のうちの１つ以上を検出および／または定量することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲの結果として生ずる分析物核酸の量を有効に測定する。陽性の結果は、標準からの分析物の量と異なる分析物核酸の測定量、またはゼロより上もしくは下の値を有する相対濃度を表す。
【００６２】
特定の核酸分析物の核酸配列に相補的であるプライマーを開発することができる。これらのプライマーは、特定の核酸をコピーおよび増幅するようにポリメラーゼに命令する。ＲＴ−ＰＣＲは、反応中に増幅された核酸分析物の蓄積を検出する。ＰＣＲ反応の対数期の間、蓄積する核酸分析物を測定することができる。既知濃度の核酸を有する較正標準を使用して較正曲線を作成することができ、そこから試験サンプル中の核酸分析物の量を外挿法で推定することができる。
【００６３】
サンプル中の核酸分析物の量または絶対濃度がわかったら、それを、標準からの分析物の量と比較して、サンプル中の核酸分析物の相対濃度を決定することができる。心血管または脳血管主要有害事象被験者の分類のための標準は、経験的手段によって決定することができる。例えば、１人以上の正常とわかっている個体の個体群からのサンプル中の核酸分析物を増幅し、個体群における核酸分析物の量を定量分析することによって量を決定することができる。
【００６４】
また、サンプルについてのさらなる形態の化学分析を行うことができる。例えば、サンプル中のそれぞれの分析物の量または絶対濃度を示す定量試験を行うことができる。比色アッセイは、サンプル中のアッセイ材料の量の代用としてサンプルと反応物との反応によって生じる色強度を測定する定量化学分析である。試薬は、任意の分析物と反応したとき、アッセイサンプルに色を生じさせることを条件とし得る。その色の強度は、サンプル中の分析物の量に依存し得る。強度と較正カラーカードおよび／または標準との比較により、サンプル中の分析物の量を決定することができる。その後、この量を標準からの（例えば、正常とわかっている人からの）分析物の量と比較して、サンプル中の分析物の相対濃度を決定することができる。
【００６５】
加えて、尿検査を用いて、尿サンプル中の分析物の量または絶対濃度を決定することができる。尿サンプルは、様々な異なる計器および技術で検査される。一部の検査は、特定の物質の存在下で色を変えるプラスチックの薄いストリップであるディップスティックを使用する。ディップスティックを使用して、分析物の量を測定することができる。
【００６６】
少なくとも２つの分析物のそれぞれの絶対レベルまたは濃度を標準からの２つの分析物のそれぞれのレベルと比較して、それぞれの分析物の相対濃度を決定することにより、心血管または脳血管主要有害事象を有することまたは有するリスクがあることを診断できるばかりでなく、この同じ比較方法論を他の用途に適応させることができる。例えば、分析物を用いて、心血管または脳血管主要有害事象を治療するための候補薬をスクリーニングすることができる。この場合、分析物のレベルをモニターすることによって、候補薬での治療をモニターすることができる。分析物の絶対濃度が罹病レベルから標準レベルに戻し、それによって相対濃度がゼロに近づくならば、効力を判定することができる。さらに、心血管または脳血管主要有害事象を治療するために有効であることが既に判明している任意の薬物に関して、ある被験者は応答者である場合があり、またある被験者は非応答者である場合があるということもある。従って、治療の間、分析物をモニターして、分析物の絶対レベルまたは濃度が標準レベルに戻り、それによって相対濃度がゼロに近づくかどうかを判定することにより、薬物が有効であるかどうかを判定することができる。勿論、応答者および非応答者の既知個体群が一切存在しない場合もあるので、任意の心血管または脳血管主要有害事象被験者に対する薬物治療の効力を経時的にモニターしてもよい。それが意図した効果を生じない場合、その使用を継続することもあり、その代わりに別の薬物を供給することもある。
【００６７】
さらに、少なくとも２つの分析物のそれぞれの絶対濃度レベルを標準からの２つの分析物のそれぞれのレベルと比較することによる相対濃度の決定は、予防的スクリーニング手段として、心血管または脳血管有害事象が観察されたまさにそのときでなく（すなわち、該疾病が進行してしまった場合がある後に）行うことができる。例えば、心血管または脳血管有害事象の証拠が無いということを前提にして、心血管または脳血管主要有害事象を有するまたは有するリスクがあるという診断をできる限り早期に得るために、一定の年齢より後に所定の間隔で被験者をモニターしてもよい。スクリーニングが陽性である場合、医療専門家は、疾病の進行についてさらなるスクリーニングを推奨する可能性があり、および／または医療専門家は、薬物もしくは他の療法での治療を開始する可能性がある。
【００６８】
例えば分析物のそれぞれの量もしくは絶対濃度、分析物のそれぞれの標準に対する相対濃度、および／または心血管または脳血管主要有害事象を有するもしくは有するリスクがある尤度をはじめとする分析結果を、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに表示するまたは出力することができる。結果または診断の表示または出力は、例えば、口述、記述、視覚的表示など、コンピュータ可読媒体またはコンピュータシステムなどの任意の媒体を使用して、前述の分析のいずれかの結果をユーザーに伝達することを意味する。結果の出力が、ユーザーまたは連結された外部コンポーネント（複数可）、例えばコンピュータシステムまたはコンピュータメモリへの出力に限定されず、代替としてまたは追加として、任意のコンピュータ可読媒体などの内部コンポーネントに出力され得ることは、当業者には明らかであろう。コンピュータ可読媒体としては、ハードデバイス、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、およびＤＡＴを挙げることができるが、これらに限定されない。コンピュータ可読媒体は、データ通信のための搬送波または他の波形を含まない。本明細書で開示し、特許請求する様々なサンプル評価および診断方法をコンピュータで実施することが、必要ではないが、できること、および例えば、表示または出力を、例えば口述でまたは書面で（例えば手書きで）人に伝達することによって行うことができることは、当業者には明らかであろう。
【００６９】
さらに、分析物を使用して、心血管または脳血管主要有害事象の動物モデルを検証することができる。例えば、任意特定のモデルにおいて、サンプルを分析して、動物中の分析物のレベルが、心血管または脳血管主要有害事象がわかっている被験者における分析物のレベルと同じであるか判定することができる。これにより、例えば、上記の様式で候補薬を試験するためのモデルを検証することができる。
【実施例】
【００７０】
実施例１
この実施例は、心血管または脳血管主要有害事象のための分析物を同定するために用いる方法論を説明する。簡単に言うと、１３６人の被験者をこの研究に組み入れた。心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術または死亡と定義する心血管または脳血管主要有害事象を指標心カテーテル検査の２年以内に経験する被験者を同定することによって、疾病または対照カテゴリーのいずれかへの被験者の分類を果たした。
【００７１】
Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒで心カテーテル検査を受けた個体の長期研究（ｔｈｅ ＣＡＴＨＧＥＮ Ｓｔｕｄｙ）において得られたサンプルのコレクションから、冷凍血漿サンプルを得た。この血漿サンプルは、１３６人の研究被験者、６８の症例および６８のマッチした対照（以下で定義するとおり）からのものであった。症例および対照を彼らの冠動脈疾患（ＣＡＤ）指数、年齢、性別および人種に従ってマッチングした。症例および対照群の両方における研究被験者の一部は、心カテーテル検査および血管造影で冠動脈疾患の徴候を示さなかった。他の被験者は、より高いＣＡＤ指数スコアによって示されるような、様々な重症度の冠動脈狭窄を有した。
【００７２】
すべてのサンプルについて記録した臨床パラメータは、以下の表１に示すものであった。症例と対照とをマッチングしたときのものでないこれらのパラメータを、一部の統計解析（以下で論じるとおり）に追加の臨床因子として含めた。
【００７３】
【表１】
症例は、以下の特徴を有するものとして同定した。指標カテーテル検査の前に、被験者は、心臓事象または心筋梗塞（ＭＩ）のための冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）の履歴を有さなかった。被験者は、その後のＣＡＢＧを有さなかった。被験者の駆出分画は、≧４０％であり（指標カテーテル検査時）、欠測はなかった。指標カテーテル検査および血液サンプル採取の２年以内にＭＩ、ＰＣＩまたは死亡が発生した。非冠動脈疾患関連死（すなわち、肺性高血圧、癌など）を明確に有する被験者は除外した。指標カテーテル検査の７日以内にＰＣＩ関連事象を有する被験者は除外した。
【００７４】
対照例は、次の特徴を有するものとして同定した。指標カテーテル検査の前に、被験者は、心臓事象または心筋梗塞（ＭＩ）のための冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）の履歴を有さなかった。被験者は、その後のＣＡＢＧを有さなかった。被験者の駆出分画は、≧４０％であり（指標カテーテル検査時）、欠測はなかった。指標カテーテル検査および血液サンプル採取後少なくとも２年の期間、ＭＩ、ＰＣＩまたは死亡は発生しなかった。
【００７５】
下の表２に提示し、以下で詳細に説明するプラットホームを用いて、サンプルを包括的バイオ分析に付した。
【００７６】
【表２】
合計７２３の分析物をこの研究のバイオ分析パートで測定することに成功した。バイオ分析プラットホームそれぞれからのその合計に対する寄与を上の表２に示す。バイオ分析プラットホームの結果をプラットホーム単位で分析し、また、後続の統計解析（以下で論述）のために併せて単一の統合データセットにした。
【００７７】
液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）タンデム質量分析（「ＬＣ／ＭＳ」）メタボロミクス
この方法は、脂質分子の分解および検出のために最適化されている、液体クロマトグラフィーおよび質量分析条件を利用する。
【００７８】
この方法に従って、以下の材料を使用した。水、メタノールおよびイソプロパノールならびにジクロロメタン（ＨＰＬＣグレード）をはじめとする溶媒および試薬は、ＶＷＲ（ＵＳＡ）から購入した。ギ酸（９９％）、酢酸アンモニウム、ジクロロメタンおよびレセルピンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入した。ＨＰＬＣガードカラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ３００ Ｃ４ ３００Å ２．５μ ２．１×１０ｍｍ）および分析用カラム（Ｃ４ ３００Å ３．５μ ２．１×１５０ｍｍ）は、Ｗａｔｅｒｓ（マサチューセッツ州、ミルフォード）から購入した。オートサンプラーバイアル、３００μＬトータル・リカバリー・バイアル、およびねじ蓋は、Ｗａｔｅｒｓ（マサチューセッツ州、ミルフォード）から購入した。保管用の５００μＬエッペンドルフ管は、ＶＷＲから購入した。脂質内部標準物質１７：０ ＬＰＣ、２４：０ ＰＣおよび４０：０ ＰＣは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州、アラバスター）から購入し、３０：０ ＰＣおよび５１：０ ＴＧは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入した。
【００７９】
以下のプロトコルに従って、サンプルを抽出した。データ正規化のために、５つの内部標準物質を抽出溶液にスパイクした。内部標準物質の保存溶液は、個々の脂質に依存して１〜３ｍｇ／ｍＬの範囲の最終濃度を達成するように適切に計量した量のそれぞれの内部標準化合物を１：９ ＤＣＭ／ＩＰＡ溶液に溶解することによって調製した。抽出溶液は、５つの保存溶液それぞれの３００μＬを、３００ｍＬの１：９ ＤＣＭ／ＩＰＡ溶液に等分することによって作製した（ＳＯＰ：ＢＧ−ＱＣ２７ Ｒ０１参照）。この溶液は、１７：０ ＬＰＣ、２４：０ ＰＣ、３０：０ ＰＣ、４０：０ ＰＣ、５１：０ ＴＧついてそれぞれ２：１：２：３：２（（ｇ／ｍＬ）の濃度比でスパイクした５つの標準物質を有する脂質抽出溶液として使用した。
【００８０】
次のプロトコルに従ってＬＣ／ＭＳ分析のためにサンプルを調製した。それぞれのバッチのサンプルを品質管理サンプルと共に冷凍器から取り出し、氷上で解凍した。１０μＬの血漿を含むそれぞれのサンプルバイアルに適切な量の抽出溶液を添加した。バイアルを穏やかにボルテックスにかけ、１４，０００ＲＰＭで２４℃で１０分間、スピンダウンした。上清を中間バイアルに移し、数秒間、Ｖｏｒｔｅｘによってさらに混合し、反復実験分としてそれぞれ６０μＬの２つのアリコートをＬＣ／ＭＳ分析用の２つのバーコード付オートサンプラーバイアルにピペットで移した。残存する上清をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析での使用のために−４０℃で保管した。残りの抽出物とペレットは廃棄した。
【００８１】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を以下のプロトコルに従って行った。クロマトグラフ装置は、４元勾配システムを有するＷａｔｅｒｓ ２７９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣシステムと、オートサンプラーと、４５℃に設定された外部カラムヒーターと、インラインプレカラムを有する分析用ＨＰＬＣカラムから成った。分析物を分離し、３５０μＬ／分の流量で質量分析計に送った。分析物分離には、９５％Ｈ２Ｏおよび５％ＭｅＯＨを含む溶媒Ａならびに９９％ＭｅＯＨおよび１％Ｈ２Ｏから成る溶媒Ｂでの二元勾配（０分−２０％Ｂ、２分−２０％Ｂ、４分−８０％Ｂ、２０分−１００％Ｂ、２５分−１００％Ｂ、２５．１分−２０％Ｂ、３５分−２０％Ｂ）を用いた。両方の溶媒流が、１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび０．１％ギ酸を含有した。５μＬのサンプルを２０μＬサンプルループに注入し、プレカラムに負荷した後、分析用カラムによって分離した。それぞれのサンプル間に、注射針、ループおよび注射器をイソプロパノール／ＭｅＯＨ溶液で洗浄した。
【００８２】
ＬＣ／ＭＳ分析は、ＬｏｃｋＳｐｒａｙ ＥＳＩ源を装備したＷａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ四重極飛行時間型計器（Ｗａｔｅｒｓ、Ｑ−ＴｏＦ）で行った。ＥＳＩ源ブロック温度を１２０℃で維持し、脱溶媒温度を３２０℃に設定した。６０９．２８１４でのレセルピンピークを使用して、ＭＳシグナル感度を最適化した。ポリアラニンのプロトン化ピークを用いてＭＳモードで質量較正を行った。３から５ｐｐｍのロックマス補正精度での５つのＩＳピークについては、〜８５００の平均計器分解能をターゲットにした。前の研究に基づき、ＬＣ溶離中、７から２３分、ＭＳデータを収集した。すべてのＬＣ／ＭＳデータは、０．３秒間、ｍ／ｚ ３００−１０００をスキャンすることによって、重心モードで収集した。
【００８３】
分析物同定のための後続のＭＳ／ＭＳ分析は、同一ＬＣ条件で同じＬＣ／ＭＳシステムを用いて行った。ＭＭＳ／ＭＳ較正は、ｍ／ｚ １０８４での先駆物質のポリアラニンピークのフラグメントを用いて行った。すべてのＭＳ／ＭＳデータは、１または２秒間、ｍ／ｚ １００−１０００をスキャンすることによって重心モードで収集した。必要な場合には、ＬＣ保持時間補正をそのターゲットリストに適用した。ＭＳ／ＭＳデータは、ターゲット分析によって収集される。
【００８４】
次のプロトコルに従ってピーク検出を行った。許容されるランの生データファイルをピークピッキングし、積分した。定義閾値に達するピークのみをアラインメントプロセスに進めた。それぞれのピークをｍ／ｚ値および保持時間によって特性づけし、例えば、ｍ／ｚ ５１０で検出され、７．８８分で溶出されたピークは、５１０＿０７８８と標識されることなる。それぞれのサンプルは、独立して処理される。
【００８５】
ピークピッキングが完了した後、ピーク・ピッキング・アルゴリズムによって生成された．ＭＬＬファイルを互いに「アライン」した。プログラムは、先ず、すべての注入物からの内部標準物質ピーク用いて保持時間ウインドウを設定し、次に、参照ピークの平均保持時間に基づいてバッチ内のそれぞれの分析物を論理的に「アライン」する。ププロセス終了時、物理的保持時間を５１０＿０７８５から５１０＿０７８８に変えることができ、追加の閾値をそれらのピーク面積に適用することができる。
【００８６】
すべてのサンプルにわたって内部標準物質の相対標準偏差パーセント（％ＲＳＤ）を計算すること、内部標準物質ピークの抽出面積（強度）を時間の関数としてプロットしてあらゆる傾向を同定すること、およびアラインメント前と後、両方の保持時間変動をチェックすることを含む多くの測定によって、それぞれのバッチついての品質管理（ＱＣ）を評価した。分析中にそれぞれの注入についての目視ＱＣ検査も行った。これらの検査は、反復注入が如何によく重なったか、ＱＣサンプルの経時的挙動、および一般的計器傾向に照準をあてた。研究中に発生し得る保持時間およびピーク面積の小変化（例えば、わずかな一時的傾向）は、データ正規化プロセスにおいて補正したが、（部分的な注入のような）より有意な変化は、再分析を必要とする場合があった。
【００８７】
ＬＣ／ＭＳの測定プロセスにおいて、対象となるそれぞれの分子種は、概して、多数の化学的エンティティとして出現する。これは、幾つかの要因に起因し得る：第一に、成分元素の多数の安定な同位体の存在、ならびに第二に、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、アンモニウム（ＮＨ４）、および多数タイプのイオンを生じさせる他の分析物との付加体形成による分析物の偽分子イオンの形成。加えて、質量分析イオン化プロセスは、多くの場合、原分子のフラグメント化によって遂行され得る。結果として、収集されるデータセットは、分析物を表すピークの数が一桁膨張する。情報内容が重複しているこれらの追加のピークは、ノイズの誘導、統計力の低下、バイオインフォマティック分析の効果遮蔽の一因となり、その多大なピーク数のため、明瞭な科学的結論を引き出すことをより難しくする場合がある。測定したエンティティをそれらの推定される起源化合物に従ってグループ分けする自動コンピュータプラットホームを、ピークピッキングおよびスペクトルアラインメントの後に、ならびにデータ正規化および統計解析の前にまたはそれらと並行して用いた。コアアルゴリズムは、狭い移動時間ウインドウで保持時間（ＲＴ）に従ってデータをスキャンする。類似した保持時間の候補ピークを、プラットホームの特定の化学的特性に依存する既知質量差パターンに従ってグループ分けする。
【００８８】
ピーク検出およびアラインメント後、幾つかの追加のデータ処理工程を行った後、データは、一変量および多変量解析に利用することができる。これらの工程は、サンプル／研究ブランクに割り当てられるピークおよび他のバックグラウンドピークの除去、バッチ修正および正規化を含む。これらの段階の完了は、「ロックされたデータセット」と呼ばれる重要時点を意味する。
【００８９】
質量分析プロファイリングおよびその後のデータ処理によって、後続の統計解析用の分析物のリストが得られた。主要分析物、通常はそれぞれの分析物ファミリーについての最も存在度が高いピークを、最初のプロファイリング実験と同じまたは同様のＬＣ／ＭＳセットアップを用いてターゲットＭＳ／ＭＳに付した。ターゲットＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトルは、重心モードで収集した。分析物のターゲットＭＳ／ＭＳ分析によって得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを、保持時間、質量、窒素ルール、脂肪酸（ＦＡ）側鎖特異的フラグメントイオン、および脂質のＭＳ／ＭＳのライブラリーからの参照スペクトルとの比較によって解釈した。
【００９０】
ガスクロマトグラフィータンデム質量スペクトル（ＧＣ／ＭＳ）メタボロミクス
ＧＣは、高感度で選択的な（電子衝撃）質量検出と併せて高い分離効率および確固とした保持時間という利点を有する。しかし、多くの化合物は、それらを分離するために必要とされる温度で熱不安定性であるか全く揮発性でない、極性官能基を含有する。加えて、極性官能基を有する化合物のピーク形は、不可逆的吸着などの望ましくないカラム相互作用のため、不満足なものである場合がある。これらの問題に対処するために、ＧＣ分析前に化合物の誘導体化が必要となる場合がある。
【００９１】
以下の材料をこの方法に従って使用した。溶媒および試薬としては、メタノール、ピリジン、塩酸エトキシアミン、およびＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）が挙げられた。内部標準物質としては、ロイシン−Ｄ３、フェニルアラニン−Ｄ５、グルタミン酸−Ｄ３、グルコース−Ｄ７、コール酸−Ｄ４、アラニン−Ｄ４、トリフルオロアセチルアントラセン（ＴＦＡＡ）、ジフルオロビフェニル（ＤＦＢＰ）、およびフタル酸ジシクロヘキシル（ＤＣＨＰ）が挙げられた。
【００９２】
これらのサンプルを室温で解凍し、２５０ｎｇ／μＬ 標準物質のロイシン−Ｄ３、フェニルアラニン−Ｄ５、グルタミン酸−Ｄ３およびグルコース−Ｄ７のＨ２Ｏ溶液１０μＬを添加し、その後、４００μＬのメタノールを（タンパク質沈殿のために）添加した。サンプルをボルテックスにかけ、１０分間１００００ｒｐｍで遠心分離し、上清をオートサンプラーバイアルに移した。窒素での乾燥工程の後、ピリジン中の２５０ｎｇ／μＬ 標準物質のコール酸Ｄ４およびアラニン−Ｄ４を１０μＬ添加した。オートサンプラーバイアルに蓋をする前に、ピリジン中の塩酸エトキシアミン溶液３０μＬを添加し、４０℃で９０分間、インキュベートした。
【００９３】
オキシム化後、残りの内部標準物質を添加した：２５０ｎｇ／μＬ 標準物質のジフルオロビフェニル、フタル酸ジシクロヘキシルおよびトリフルオロアセチルアントラセンのピリジン溶液（１０μＬ）。１００μＬ ＭＳＴＦＡの添加および５０分間、４０℃での加熱によって、サンプルをシリル化した。ＧＣに注入する前に、それらのサンプルを１０分間、３５００ｒｐｍで遠心分離した。
【００９４】
ＧＣ／ＭＳ分析は、ＰＴＶ（温度プログラム式気化器）インジェクターおよびＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃ Ｃｏｍｂｉ−Ｐａｌオートサンプラーを装備したＡｇｌｉｅｎｔ ６８９０ Ｎガスクロマトグラフを利用した。検出には、Ａｇｉｌｅｎｔ ５９７３ Ｍａｓｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを使用した。Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ Ｇ１７０１ＣＡ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ｄ．０１．０２ソフトウェアによってシステムを制御した。
【００９５】
ＧＣ／ＭＳカラムから溶出するすべての化合物をフルスキャンモードで検出した。それぞれのピークをその保持時間およびフラグメント数（ｍ／ｚ値）によって特性づけした。ターゲット処理手順を適用することによって、データ量（すなわち、変数の数）を減らした。
【００９６】
ターゲットアプローチは、変数の数を少なくとも２０分の１に減少させる。このプロシージャーアーティファクトの大部分は、ターゲットテーブルにこれらのピークを含めないことでデータから除去することができる。研究特異的ターゲットテーブルをこの研究のためにコンパイルした。様々なヒト血漿ＣＧ／ＭＳプロジェクトからの情報をこのプロセスに利用した。この研究において観察されたできる限り多くのピークをターゲットテーブルに含めるために、極値サンプルを含む研究サンプルから、多数の代表的クロマトグラムを選択した。プロジェクトの初期段階の間、ピークの素性は未知であり、そこでそれらに「未知１」から「未知ｘ」まで標識し、それぞれのピークをその保持時間およびイオンを定量したものによって特性づけした。プロシージャーブランクの中で見つけられるピークは、ターゲットテーブルから除去した。ピークの起源が不確実である場合、関連分析物を損失する可能性を避けるためにピークをターゲットリストに保留した。
【００９７】
研究サンプルにおいて、代表クロマトグラムで見出される、内部標準物質以外の個々の分析物／化合物を参照化合物データベース（保持時間および質量スペクトル）とマッチングした。このマッチング工程の後、参照データベースに基づき多数の化合物に仮のＩＤを割り当てた。
【００９８】
ターゲット処理アプローチを適用するときには、ピークの保持時間アラインメントは必要ない。保持時間のシフトが観察された場合には、ターゲットテーブルを調整することができる（内部標準物質が「ランドマーク」として役立つ）。標準的な積分設定を用いて、ターゲットテーブル中に存在するすべての化合物をまず積分した。これらの設定は、すべての化合物およびサンプルに適用することはできず、一部の化合物については積分結果を補正することにつながる場合がある。積分エラーを見出すための手順を開発した。すべてのターゲットについて、（すべての研究およびＱＣサンプルの）平均からのピーク面積の偏差を計算することができる。結果をプロットし、問題ピーク（多数のサンプルにわたるそれらのピークについての積分誤差）および問題サンプル（１つのサンプルにおける多数のピークについての積分）を検出するために用いた。問題サンプルについては、手作業で積分を行った。問題ピークについては積分設定を調整した後に自動積分を行った）。
【００９９】
サンプル調製および分析における様々な工程で、１つ以上の内部標準物質を追加して、分析後のデータの質をモニターした。それぞれのバッチ後、ＤＣＨＰについて修正した後の内部標準物質の応答をすべてのサンプルにおいて評価した。それぞれの内部標準物質の修正ピーク面積が、バッチ平均から２０％未満しかずれない場合、そのバッチは、許容され得る。１つ以上のサンプルについて、偏差が２０％より大きい場合には、それらのサンプルを次のバッチで再分析した。最終的に、ロックされたデータセットをＧＣ／ＭＳ分析のために生成することができる。
【０１００】
第一の同定工程は、ターゲット化合物リストと参照データベースとのマッチングであり得る。参照データベースとの比較および参照標準物質の分析によって、ターゲットリストからの多数の化合物を同定および確認することができる。一変量および多変量解析後、優先順位をつけた未知物質を、生データおよびＱＣ結果をチェックすることによって、先ず評価した。それらを２つのカテゴリーに分けた：ｉ）非常に低い強度および／またはＱＣ標準における高いＲＳＤを有する化合物ならびにｉｉ）１つ以上のサンプルにおける良好なシグナルおよびＱＣ標準における高いＲＳＤを有する化合物。第二のカテゴリーでの同定が開始する。両方のカテゴリーについて、アーティファクト対する追加のチェックを行った。
【０１０１】
この分析の後、（同定すべき）個々の化合物に依存して追加の同定方法を選択した。一部の化合物については、市販のスペクトルライブラリーにおいてヒットを見出し、追加のＩＤ実験の必要がなかった。他の化合物については、化学的イオン化、正確な質量または他の誘導体化実験を行った。
【０１０２】
極性ＬＣ／ＭＳメタボロミクス
以下の材料をこの方法に従って用いた：メタノール、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ、ＬＣ−ＭＳグレード、ｃａｔ．＃１３６８７８０１、または等価物；ＨＣｌ、Ｍｅｒｃｋ、３７％ ｃａｔ．＃１．００３１７、または等価物；ｎ−ブタノール、Ｂａｋｅｒ ｃａｔ．＃８０１７、または等価物；Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、ＥＬＧＡ Ｓｙｓｔｅｍで精製した水、または等価物；ジチオトレイトールＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ ９９％、ｃａｔ．＃Ｄ９７７９、または等価物；ギ酸、Ｍｅｒｃｋ ｃａｔ．＃１．００２６４、または等価物；アセトニトリル、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ ＨＰＬＣ−Ｓ Ｇｒａｄｉｅｎｔグレード、ｃａｔ．＃１２０００７０１、または等価物；フェニルアラニン−ｄ５、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１５９７、または等価物；グルタメート−ｄ３、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１１９６、または等価物；ロイシン−ｄ３、ＣＤＮ同位体 ９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１９７３、または等価物；アラニン−ｄ３、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１４６２、または等価物；クレアチン−ｄ３、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１４６２、または等価物；メチオニン−ｄ４、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１４６２、または等価物；メチル−（ｄ３）−ヒスチジン、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１４６２、または等価物；チロシン−ｄ７、ＣＤＮ同位体９９原子％ Ｄ、ｃａｔ．＃Ｄ−１４６２、または等価物。
【０１０３】
以下の機器をこの方法に従って用いた：ボルテックス；遠心機；オーブン；蒸発装置；ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＳｕｒｖｅｙｏｒまたはＳｕｒｖｅｙｏｒ Ｐｌｕｓ ＨＰＬＣ；ＥＩＳ源を装備したＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱイオントラップ質量分析計。
【０１０４】
小型エッペンドルフバイアル中の１０μＬ血漿サンプルに、１０μＬ ＩＳ−使用液を添加し、サンプルを短時間、ボルテックスにかけた。ＤＴＴ溶液の添加およびサンプルの除タンパク後、上清を凍結乾燥させた。その後、サンプルを６５℃のＨＣｌ−ブタノールで誘導体化した。過剰の試薬を凍結乾燥によって除去した。非誘導体化チロシンＤ７を内部標準物質として含有するＤＴＴの水溶液でサンプルを再構成した。
【０１０５】
次の仕様に従って高速液体クロマトグラフィーを行った：
カラム： Ｖａｒｉａｎ／Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ５μｍ ＯＤＳ−３ １００＊３ｍｍ
ガードカラム： Ｖａｒｉａｎ／Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ Ｒ２ １０×２ｍｍ ｉ．ｄ．
移動相Ａ： ０．１％ギ酸
１ｍＬのギ酸を１０００ｍＬの水に添加し、混合し、５分間、超音波処理によって脱気する
移動相Ｂ： ０．１％ギ酸中の８０％アセトニトリル
８００ｍＬのアセトニトリルに水１０００ｍＬおよび１ｍＬのギ酸を添加し、混合し、５分間、超音波処理によって脱気する。
カラム温度： ２５℃〜３０℃
オートサンプラー温度： １０℃
注入量： １０μＬ
ＥＳＩ源への〜７５μＬの流量を意図するおよそ４：１の比の分流で質量分析を行った。ＥＳＩおよびＭＳ設定は下記である：
ＥＳＩスプレー電圧： ４ｋＶ
加熱キャピラリー： ２５０〜３００℃
シースガス： ５０〜６０
補助ガス： ５
極性： 陽性
スキャン範囲： １２５〜１２５０
マイクロスキャン数： ５〜６
最大注入時間： ２００ｍｓ
ソースＣＩＤ： ０〜５Ｖ
ソース距離 位置Ｃ
選択したサンプルを正確な質量について分析した。このために、それぞれの誘導体化ロットから２つのＱＣサンプルを選択し、多数の「極値」サンプルも選択した。上記と同じ設定を用いて、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱ−ＦＴ ＭＳ計器で正確な質量実験を行った。イオンの検出は、ＦＴＭＳで行った。ｍ／ｚ ４００での分解能は、〜１００，０００である。
【０１０６】
ＬＣ／ＭＳカラムから溶出するすべての化合物をフルスキャンモードで検出した。それぞれのピークをその保持時間および多数のイオン（ｍ／ｚ値）によって特性づけした。それぞれの化合物を、殆どの場合、ターゲットテーブルへの１つだけの登録によって表現するターゲット処理手順を適用することにより、データの量（すなわち、変数の数）を減少させた。
【０１０７】
ターゲットアプローチは、変数の数を少なくとも２０分の１に減少させた。プロシージャーアーティファクトの大部分は、ターゲットテーブルにこれらのピークを含めないことでデータから除去することができた。
【０１０８】
研究特異的ターゲットテーブルをこの研究のためにコンパイルした。これは、最初の少数のバッチからのすべてのＱＣＹおよび研究サンプルのピークピッキングによって行った。得られたピークテーブルを強度に基づいてソートし、上位１０００ピークを選択した。この部分テーブルから、同位体ピークおよび識別できる限り付加体を除去した。この段階では、ピークの素性はわからず、そこでそれらを（分での）保持時間におけるｍ／ｚとして標識した。
【０１０９】
ターゲット処理アプローチを適用する場合、ピークの保持時間アラインメントは必要ない。保持時間のシフトが観察された場合には、ターゲットテーブルを調整した（内部標準物質が「ランドマーク」として役立つ）。
【０１１０】
すべてのランについての分析が完了した後、標準的な積分設定を用いて、ターゲットテーブル中に存在するすべての化合物を先ず積分した。これらの設定は、すべての化合物およびサンプルに適用することはできず、一部の化合物については積分結果を補正することにつながる場合がある。積分エラーを見つけるための手順を開発した。すべてのターゲットについて、（すべての研究およびＱＣサンプルの）平均からのピーク面積の偏差を計算した。
【０１１１】
完全データセットの品質管理は、ブランクを除くすべてのサンプルにおけるＩＳ応答、ならびにＱＣＹおよびＣＴＲＬサンプル中のすべてのターゲット化合物の相対標準偏差のチェックに基づいて行った。これらの結果を、前の研究において観察されたものと比較した。これらの工程が完了した時点で、「ロックされたデータセット」を極性ＰＣ／ＭＳプラットホームのために生成することができる。このデータセットが、すべての後続の統計解析の基礎になる。
【０１１２】
第一の同定工程は、ターゲット化合物と多数のアミノ酸および関連化合物を含有する参照標準のデータベースとのマッチングであった。保持時間および正確な質量を比較し、必要な場合には、ＭＳ／ＭＳスペクトルを比較した。
【０１１３】
残りのターゲット化合物は、それらを優先リストに載せた後、同定した（一変量／多変量）。それらの優先順位をつけた未知物質を、先ず、生データおよびＱＣ結果をチェックすることによって評価した。それらを２つのカテゴリーに分けた：ｉ）非常に低い強度および／またはＱＣ標準における高いＲＳＤを有する化合物ならびにｉｉ）１つ以上のサンプルにおける良好なシグナルおよびＱＣ標準における高いＲＳＤを有する化合物。第二のカテゴリーでの同定が開始した。両方のカテゴリーについて、アーティファクト対する追加のチェックを行い、ブランク分析をこれらの化合物の存在についてチェックした。
【０１１４】
さらなる同定のために、保持時間、正確な質量およびＭＳ／ＭＳデータを用いた。正確な質量、および用いた誘導体化についての知識に基づき、ＫＥＧＧ、ＭｅｒｃｋおよびＣｈｅｍｉｆｉｎｄｅｒデータベース内の可能性のある元素組成を検索した。可能性のあるヒットを評価し、このために、保持時間およびＭＳ／ＭＳスペクトルを用いた。幾つかの場合、標準物質を購入し、溶解状態で分析し、そしてその後、研究サンプルに標準物質を追加した。
【０１１５】
遊離脂肪酸のＬＣ／ＭＳプロファイリング
血漿を除タンパクし、ＩＰＡで抽出した。遊離脂肪酸を分析用カラムで分離し、エレクトロスプレーにより陰イオンモードでイオン化し、フルスキャンモードで検出した。多数の遊離脂肪酸を外部標準物質として分析し、血漿中の実際の濃度を決定する必要がある場合には較正標準を用いてこれらを計算（概算）した。
【０１１６】
次の材料を使用してサンプルを調製し、分析した。計器としては、エッペンドルフ管用の遠心機、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ＬＴＱ、オートサンプラーとカラムオーブンとを有するＴｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＨＰＬＣ、およびボルテックスが挙げられた。化学薬品としては、脱塩水、（ＥＬＧＡ Ｓｙｓｔｅｍ ４または任意の他の製造元、例えばＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）；イソプロパノール ｐ．ａ．、（Ｂａｋｅｒ ６０６８または同等物）、メタノール、（ＨＰＬＣグレード、Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖｅ ３４９６６）、ジクロロメタン ｐ．ａ．、（Ｂａｋｅｒ ７０５３または同等物）、酢酸アンモニウム ｐ．ａ．、（Ｆｌｕｋａ ０９６９０または同等物）、およびギ酸 ｐ．ａ．、（Ｍｅｒｃｋ １．００２６４．１０００または同等物）が挙げられた。
【０１１７】
材料としては、Ａｌｌｔｅｃｈ Ｐｒｏｓｈｅｒｅ ＣＡ ３００Å ＨＰＬＣカラム（１５０×３．０ｍｍ ｉ．ｄ．、５μｍ）、ｐａｒｔｎｏ．３５５４８、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ ３００ Ｃ４ガードカラム（１０×２．１ｍｍ ｉ．ｄ．３．５μｍ）、ｐａｒｔｎｏ．１８６０００２７８、オートサンプラーバイアル（Ａｌｌｔｅｃｈ ｐａｒｔｎｏ．ＡＶ０５５２０１、３２＊１１．６ｍｍ）、エッペンドルフ管、およびピペット（例えば、エッペンドルフ）が挙げられた。
【０１１８】
次の標準物質を使用した：ヘプタデカン酸 Ｃ１７：０ ＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ３５００）、Ｃ１４：０ ＦＡ ミリスチン酸（Ｓｉｇｍａ Ｍ３１２８）、Ｃ１６：０ ＦＡ パルミチン酸（Ｓｉｇｍａ Ｐ５５８５）、Ｃ１６：１ ＦＡ パルミトレイン酸（Ｓｉｇｍａ Ｐ９４１７）、Ｃ１８：０ ＦＡ ステアリン酸（Ｓｉｇｍａ Ｓ４７５１）、Ｃ１８：１ ＦＡ オレイン酸（Ｓｉｇｍａ Ｏ１００８）、Ｃ１８：２ ＦＡ リノール酸（Ｓｉｇｍａ Ｌ１３７６）、およびＣ２０：４ ＦＡ アラキドン酸（Ｓｉｇｍａ Ａ９６７３）。
【０１１９】
内部標準溶液は、次の方法に従って調製した。ヘプタデカン酸 Ｃ１７：０ ＦＡ（１ｍｇ／ｍＬ）の保存溶液は、５ｍＬメスフラスコに５ｍｇを量り入れ、５００μＬ ＤＣＭを添加し、超音波処理により溶解し、ＩＰＡで５ｍＬにすることによって調製した。ＩＳ使用液（タンパク質沈殿および脂質抽出用）は、Ｃ１７：０ ＦＡを１μｇ／ｍＬの濃度で含有するＩＰＡ中で調製した。
【０１２０】
サンプルは、次の方法に従って調製した。３００μＬのＩＳ使用液をエッペンドルフカップ内の１０μＬの解凍血漿サンプルに添加し、ボルテックスにかけた。溶液を３〜５分間、１０，０００ｒｐｍでのエッペンドルフ遠心分離に付し、５０μＬのその透明な上清をインサートを有する２つのオートサンプラーバイアルに２回移し、残りの抽出物を＜−１８℃で保管した。
【０１２１】
Ａｌｌｔｅｃｈ Ｐｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ４ ３００Å ＨＰＬＣカラム（１５０×３．２ｍｍ ｉ．ｄ．、５μｍ）およびＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｗｉｄｅｐｏｒｅ Ｃ４ガードカラム（４×３ｍｍ ｉ．ｄ．、５μｍ）を使用して、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を行った。移動相Ａは、バッファー中の５％メタノールから成り、移動相Ｂは、２ｍＭ ＮＨ４Ａｃを含有するメタノールから成り、針洗浄液は、ＭｅＯＨ中の６０％ＩＰＡから成った。勾配は次のとおりであった
【０１２２】
【数１】
カラム温度は、４０℃であり、オートサンプラー温度は、２０℃であり、注入量は、２０μＬであった。
【０１２３】
質量分析手順のために、次の較正標準を使用してＬＣ／ＭＳ計器をチューニングした：
【０１２４】
【数２】
選択されたターゲット分析物の積分にはＴｈｅｒｍｏ ＸＣａｌｉｂｕｒ ＬＣＱｕａｎ Ｖ ２．０を使用した。（前の研究に基づき）少なくとも次の脂肪酸を含むターゲットテーブルを用いて、データを処理した：Ｃ１２：０ ＦＡ、Ｃ１２：１ ＦＡ、Ｃ１４：０ ＦＡ、Ｃ１４：１ ＦＡ、Ｃ１６：０ ＦＡ、Ｃ１６：１ ＦＡ、Ｃ１６：２ ＦＡ、Ｃ１８：０ ＦＡ、Ｃ１８：１ ＦＡ、Ｃ１８：２ ＦＡ、Ｃ１８：３ ＦＡ、Ｃ２０：０ ＦＡ、Ｃ２０：１ ＦＡ、Ｃ２０：２ ＦＡ、Ｃ２０：３ ＦＡ、Ｃ２０：４ ＦＡ、Ｃ２０：５．ＦＡ、Ｃ２２：５ ＦＡ、Ｃ２２：６ ＦＡ、およびＣ２２：７ ＦＡ。
【０１２５】
ターゲットテーブルからのすべての化合物についての積分データを得た。結果は、それぞれのターゲット化合物についての積分値を含むＥｘｃｅｌテーブルであった。
【０１２６】
ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳディスカバリープロテオミクス
プロテオミクスワークフローは、血漿サンプルから生成されたペプチドの多次元液体クロマトグラフィー−ＭＳ／ＭＳ分析に基づくものであった。このアプローチの利点としては、２Ｄゲルに基づくアプローチにおける困難の原因となる血漿タンパク質の多数の異成分に対する鈍感性、液体クロマトグラフィー技術の容易な自動化、およびペプチドの安定な同位体標識の利用の可能性が挙げられる。
【０１２７】
最近紹介されたｉＴＲＡＱ（商標）方法論（ｉＴＲＡＱは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの商標である）は、標識反応を完了まで遂行することが容易であり、一般的な、ほぼすべてのペプチドがｉＴＲＡＱで標識され、１実験につき４サンプルまでの複合定量が可能であったので、本研究に特に好適であった。後者は、サンプル間の一致した定量（および同定）が重要要件である本研究において重要である。安定な同位体標識の別の有意な利点は、（差別的に標識されたプールを併用すると）サンプル間でのペプチドの液体クロマトグラフ挙動の変動に対してプロセスが頑強であることであった。
【０１２８】
ｉＴＲＡＱ法では、タンパク質サンプルからの酵素的消化物を、ペプチドの遊離第一級アミノ基：Ｎ−末端（ブロックされていない場合）およびリシン残基を誘導体化する試薬（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル）で処理する。試薬の４つの異なる変種は、同じ質量、しかし安定な同位体標識の異なる位置を特徴とする。従って、イオンシグナルがペプチドの分子量を反映するＭＳモードでは、４つの別様に標識されたペプチドのすべてが単一の成分のように見える。ＭＳ／ＭＳモードでは、標識の構造の微妙な違いが見えるようになり、また、ペプチド骨格フラグメント（いわゆるａ、ｂ、およびｙ）は、依然として等重であるが、ｍ／ｚ １１４、１１５、１１６および１１７にそれぞれ対応する４つの異なるレポーターフラグメントが生成される。これらのレポーターイオンの相対強度の判定によって、４つの異なるサンプルからのペプチドの相対定量を遂行することができる。
【０１２９】
この研究では、サンプルが自動画分回収手順によってＭＡＬＤＩプレートに堆積されるＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（ＡＢＩ４８００）を使用した。ＭＡＬＤＩ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの特別な利点は、ＬＣ−ＭＳ連結のオフライン性にある。先ず、ＭＳモードで全２Ｄ ＬＣ分離を分析し、その後、ＭＳ／ＭＳモードでペプチド同定および定量的データを生成することができた。この特徴は、ペプチドの一定のセットを多数のサンプルにわたって測定しなければならないとき、非常に便利であり得る。
【０１３０】
血漿サンプルの分析に関する１つの特有の態様は、存在度が高い血漿タンパク質（アルブミン、免疫グロブリンなど）によって表される膨大なバックグラウンドである。この難題に対処するために、多数の枯渇技術を用いた。この研究では、ニワトリＩｇＹ抗体カラムを使用して、１２の存在度が高いタンパク質のサンプルを枯渇させた。抗体カラムに保持されなかったタンパク質プールを、逆相カラムで回収した。回収したタンパク質プールを還元し、アルキル化し、トリプシンによって消化した。得られたペプチド混合物をｉＴＲＡＱ試薬で標識し、同じｉＴＲＡＱミックス用に指定された３つの他のサンプルと併せた。併せた４プレックス（ｆｏｕｒ−ｐｌｅｘ）ミックスを、先ず、強カチオン交換クロマトグラフィーで分画した。ＳＣＸ溶離から画分を回収した。これらの画分を、−それらの画分の一部をプールした後−さらにＨＰＬＣ ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０１３１】
ｉＴＲＡＱ分析によって、１回の２Ｄ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験（４プレックス）で４つの異なるサンプルの相対定量が可能となる。しかし、ｉＴＲＡＱ ４プレックスミックスに４つの一次サンプルを割り当てることにより、異なるｉＴＲＡＱに指定された２つの一次サンプルを比較することはできない。そのプロジェクトのために分析するｉＴＲＡＱミックスの数に従ってアリコートされた参照プール、それぞれのｉＴＲＡＱミックスの定常成分、を作り、この参照アリコートのためのサンプル調製を同じｉＴＲＡＱミックスの３つの他のメンバーと共に行い、１１７の試薬で標識することによって、これに対処した。
【０１３２】
参照プールは、この研究において分析したおよそ２５％の各一次研究サンプルの組み合わせから作った。その参照プールからのアリコートをＱＣＲサンプルと呼んだ。
【０１３３】
ＭＳ／ＭＳ収集は、組み入れおよび除外の両方のためのＭＳ先駆物質のリストによって誘導され得る。原組み入れリストは、研究のカタログ期の間に行った分析から得た。この期において、サンプルのＱＣプールからの少数のサンプルを完全プロテオミクスワークフローによって処理した。ペプチドを同定し、これらのミックスからのタンパク質をマッチングした後、組み入れおよび除外リストをコンパイルした。
【０１３４】
組み入れリストの内容としては、完全にアルキル化され、ｉＴＲＡＱ標識されたトリプシンペプチド；キモトリプシン活性（Ｆ、ＹおよびＷでの開裂）に起因するものを除外して、完全にアルキル化され、ｉＴＲＡＱ標識された半トリプシンペプチド；ならびに翻訳後修飾を有するとき、Ｍａｓｃｏｔによるルーチンサーチでなく手作業で同定されたペプチドが挙げられる。
【０１３５】
除外リストの内容としては、不完全なｉＴＲＡＱ標識またはアルキル化を伴うペプチド；多数のトリプシン誤開裂部位を含有する３，０００Ｄａを超える分子量のペプチド；トリプシンのキモトリプシン側活性によって生成されたペプチド；Ｍ＋Ｈ＋形態で組み入れリストにある電位Ｍ＋Ｋ＋形態の存在度が高いペプチド；およびトリプシンからの自己分解ペプチドをはじめとする、２，０００の最も存在度が高い未同定成分を含む。
【０１３６】
カスタム・ソフトウェア・アプリケーションを用いて、組み入れ／除外基準を考え、そして組み入れまたは除外のいずれかに選択された先駆物質を箇条書きにする別のテキストファイルに基づくＡＢ４８００でＭＳ／ＭＳ収集物を大量にもたらした。ＨＰＬＣ保持時間の潜在的シフトの自動調節にもそのソフトウェアは適応した。組み入れ先駆物質を先ず分析した後、収集時間が許せば、日和見的に追加のＭＳ／ＭＳスペクトルを収集した。
【０１３７】
９つの一次サンプルおよび３つの参照プールサンプルから成る１２の１日分バッチのサンプルを氷上で解凍し、３つの一次サンプルに続いて１つの参照プールサンプル（すなわち、サンプル１、２、３、その後、Ｒ、４、５、６、Ｒなど）で逐次的に処理した。サンプルを完全に解凍したら、それらを脱脂した。サンプルをＰＢＳで希釈し、トリクロロトリフルオロエタン（Ｆｒｅｏｎ １３）で抽出し、その後、遠心分離段階に付した。上部水性層を新たな試験管に移し、氷上で短時間保管した後、存在度が高いタンパク質を除去するためにＬＣシステムの冷却したオートサンプラーの中に入れた。
【０１３８】
存在度が高いタンパク質の除去（ＡＰＲ）を用いて、１２の最も存在度が高い血漿タンパク質を脱脂サンプルから枯渇させた。この手順は、２カラム法（２ＤＬＣ）を用い、この場合、アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、トランスフェリン、α−１アンチトリプシン、ハプトグロビンファミリー、フィブリノゲン、α−１酸性糖タンパク質、ＩｇＭ、α−２マクログロブリンおよびＨＤＬ（アポリポタンパク質Ａ−ＩおよびＡＩＩ）を含む１２のタンパク質は親和性ＩｇＹカラムのターゲットになるが、枯渇材料は流れて通り過ぎて逆相（ＲＰ）カラムで補足された。ＲＰカラムを独立して洗浄し、段階溶離した。洗浄され、枯渇された材料から成る溶離ピークを分画カラムで回収し、その後、ワークフローにおける後続の処理のためにスピード真空によって乾燥させた。その後、次のランへの持ち越しをなくすストリップ溶液でそのＲＰカラムを洗浄した。その後、独立してＩｇＹカラムを溶離し、次のランの前に中和した。１２の枯渇サンプル（単一バッチ）を２４時間の間処理し、その後、回収画分を一晩、スピード真空に付した。
【０１３９】
枯渇血清サンプルを還元し、アルキル化し、消化し、ｉＴＲＡＱ標識した。乾燥させた枯渇サンプルを１Ｍ ＴＥＡＢ Ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．５に再び懸濁させた。ＴＣＥＰおよびＳＤＳを添加して変性させ、サンプルを還元した。７１℃での１時間のインキュベーション後、サンプルを暗所にて３０分間、室温でヨードアセトアミドによってアルキル化した。Ｎ−アセチル−Ｌ−システインに懸濁させたトリプシンを添加し、サンプルを放置して一晩、４８℃で消化させた。翌日、ｉＴＲＡＱ試薬を解凍し、１００％エタノールに再懸濁させた。サンプルをｉＴＲＡＱ試薬で標識した。標識するために室温で１時間インキュベートした後、アセチル化反応を４マイクロリットルの１Ｍ重炭酸アンモニウムの添加で停止させた。同じミックスのｉＴＲＡＱ標識サンプルを併せ、Ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させ、その後、カチオン交換クロマトグラフィーのために再び懸濁させた。
【０１４０】
４．６×５０ｍｍポリスルホエチル強カチオン交換カラムを使用するＶｉｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、併せたｉＴＲＡＱミックスの強カチオン交換分画を行った。分離は、ペプチドプールを先ずＰｏｒｏｓ Ｒ２逆相カラムに負荷して大量のｉＴＲＡＱ加水分解産物を除去する、２カラム法を用いた。
【０１４１】
３５％ＡＣＮ含量のＳＣＸローディングバッファーを使用してそれらのペプチドをＳＣＸカラムへと溶出させた。ＲＰカラムに付着したより疎水性の材料（すなわち、残留トリプシン）を高有機洗浄液によって除去した。ＳＣＸカラムに結合したペプチドを勾配で溶離した。注入前、１Ｎ ＨＣｌを使用してサンプルのｐＨを３．５に調整する。ＳＣＸ分離から、０．８ｍＬの１０の画分（Ａ１からＡ１０）を回収した。これらの画分をＳｐｅｅｄｖａｃで乾燥させ、ＨＰＬＣローディングバッファーに再び懸濁させた。
【０１４２】
ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳディスカバリープロテオミクス
ＨＰＬＣとＭＡＬＤＩとの連結は、ＭＡＬＤＩターゲットへの画分回収によってオフラインで行った。装置は、Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ（カリフォルニア州、ハーキュリーズ）からのＰｒｏｂｏｔ ＭＡＬＤＩスポッティングデバイスを装備したＵｌｔｉＭａｔｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｓｙｓｔｅｍであった。画分回収器の内蔵シリンジポンプによって、ＭＡＬＤＩプレートへの堆積前にＨＰＬＣ溶離物とＭＡＬＤＩマトリックスとを共混合することができた。ＭＡＬＤＩ ＭＳスペクトルの良好な質量補正を確保するために、内部標準物質−ＡＣＴＨ（１８−３９）ぺプチド、ＭＨ＋＝２４６５．１９９−をマトリックス溶液に添加した。
【０１４３】
３回のＨＰＬＣランが単一の４８００ ＭＡＬＤＩプレートに堆積されるように、ＭＡＬＤＩプレートへのスポッティングを設定した。それぞれのＨＰＬＣランが６×３５アレイの画分を含有した（２１０画分／ＨＰＬＣ）。ｉＴＲＡＱミックスを代表する６回のＨＰＬＣランを２つのＭＡＬＤＩプレートにスポッティングした。
【０１４４】
ＨＰＬＣ−ＭＡＬＤＩ動作パラメータを以下に列挙する。ＨＰＬＣグレードの水および分析グレードのアセトニトリルは、Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ製であり、酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、ＴＦＡおよびα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸は、Ｓｉｇｍａ製であった。
【０１４５】
【数３】
ＨＰＬＣ勾配は、次のようにプログラムした
０〜５％Ｂ ８分間
５〜１０％Ｂ ２分間
１０〜３７．５％Ｂ ３０分間
３７．５〜１００％Ｂ ２分間
４５−ｎＬフローセルを使用して２８０ｎｍの波長をモニターすることによってＵＶトレースを記録した。
【０１４６】
それぞれのＳＣＸ画分の注入量は、ＨＰＬＣカラムへの過負荷を避けながらサンプル負荷量を最大にするように決定した。これらの量は、予備カタログ実験で決定した。
【０１４７】
ｉＴＲＡＱミックスからのＭＡＬＤＩサンプルを代表する６の注入の各セットの前に、（Ｍｉｃｈｒｏｍからの）ペプチドの標準混合物を注入してＨＰＬＣ保持時間の一致性をモニターした。直前のＳＣＸ画分のＬＣ−ＭＳランを自動的にアラインすることによる先駆物質選択プログラムによって、ＨＰＬＣ溶離時間の穏やかな変化を継続的に処理したことに留意すること。標準ＱＣミックスの後、６つのＳＣＸ画分を注入し、２つのＭＡＬＤＩプレートを作製した。
【０１４８】
２つのＭＡＬＤＩプレートのセットをＡＢ４８００計器のオートローダーに載せた。それぞれのプレートを次の順序によりＭＳモードでランした：
●４８００標準ミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してプレートモデルおよびアップデートデフォルト検量線を作製してプレートの８つの「Ｃａｌ」位置にスポッティングする
●ｍ／ｚ ２４６５．１９９（ペプチド標準物質）およびｍ／ｚ ５６８．１３６（マトリックス三量体）ピークを用いる内部質量較正でのＭＳモードでＬＣ画分をランする
先駆物質選択の主目的は、収集時間を最小にすること（余剰先駆物質を排除する）、ＭＳスペクトルにおける隣接ピークからの干渉を排除すること、およびすべてのｉＴＲＡＱミックスについて同じ先駆物質を一貫して選択することであった。ＭＳ／ＭＳ収集および処理パラメータを、ｍ／ｚ １１４、１１５、１１６、１１７でのｉＴＲＡＱレポーターピークの最善の測定を生じさせるように最適化した。ｉＴＲＡＱシグナルが、わずか１，０５０ショットの後にシグナル対ノイズ基準を超えない限り、２，１００レーザーショットを累積するようにＭＳ／ＭＳ収集を設定したことに留意すること。このようにして、ｉＴＲＡＱピーク面積測定の質を危うくすることなく収集時間を減少させることができた。
【０１４９】
ＡＢ４８００ ＭＳ／ＭＳスペクトルは、収集制御コンピュータで、パイプライン制御ソフトウェアによって駆動されるカスタムＰｅｒｌスクリプトを使用してＯｒａｃｌｅデータベースから得た。ＭＳ／ＭＳピークを２つの異なるファイルへと処理して、定量ｉＴＲＡＱピークデータとペプチド分画ピークとを別々に記録した。それぞれの個々のＭＳ／ＭＳスペクトルを、一意的データベースピークテーブルＩＤおよびデータを収集するＭＡＬＤＩプレートの一意的データベースＩＤによって同定した。これら２つの値によって、収集データおよび内部実験情報管理システム（ＬＩＭＳ）の両方に記録された追加の情報とのさらなる関連づけが可能となった。ｉＴＲＡＱ定量情報を第一ファイルからＰｅｐｔｉｄｅｄＢと呼ばれるデータベースに移した。二次出力は、ＭＧＦ（Ｍａｓｃｏｔ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｆｏｒｍａｔ）ファイルであり、これは、ペプチド分画ピーク、およびＭａｓｃｏｔ結果とインプットＭＳ／ＭＳスペクトルとの間の追跡を可能にする追加の関連コメントラインを含んでいた。
【０１５０】
ＭＧＦファイルに含まれているピークを濾過して、高質量ピーク（６４Ｄａ以内または先駆物質ＭＨ＋）を除去し、低質量ピーク（＜１４６Ｄａ）を除去し、ピークの「密度」を２００Ｄａウインドウあたり１５フラグメント質量に限定した。
【０１５１】
ＡＢ４８００を用いてＭＳ／ＭＳジョブごとに別個のＭＧＦファイルを作った（ＭＳ／ＭＳジョブは、同じＭＡＬＤＩプレートから収集される１と数千との間の別個のＭＳ／ＭＳ収集から成り得る）。同じｉＴＲＡＱミックスに対応する個々のＭＧＦファイルを連結させた後、Ｍａｃｏｔサーチを開始した。
【０１５２】
それぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルをＰｅｐｔｉｄｅＤＢにおけるｍ／ｚ １１４、１１５、１１６および１１７イオンシグナルのイオン強度に関連づけた。上記のように、ｍ／ｚ １１７強度に相対してｉＴＲＡＱ比を決定した（参照プールのためにこの標識を使用したからである）。比は、４８００データについてのピーク面積の比（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓソフトウェアによって用いられるようなクラスター面積ではない）およびＱＴｏＦデータについてのピークカウントの比として計算した。
【０１５３】
データベース検索後、ＭＳ／ＭＳスペクトルに割り当てられた定量数を「受け継いでいる」ＭＳ／ＭＳスペクトルとペプチド配列をマッチングした。タンパク質比は、タンパク質に割り当てられたペプチドの比から平均比（またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓソフトウェアにおける平均比）として誘導した。しかし、ＢＧＭワークフローにおける最終的なペプチド−タンパク質アラインメントは、それぞれのｉＴＲＡＱミックスからのペプチド同定が完了するまで行わなかった。この時点で、タンパク質の割り当てを統合するばかりでなく、全研究の定量情報に基づき個々のタンパク質を多数のノードに解体することができる（すなわち、タンパク質アイソフォーム、多形部位を収容しているペプチド配列、対立変異体などが分解される）。その後、タンパク質ノード−最終的に統計および相関ネットワーク解析に用いるもの−を、それらにマッチするペプチド比の平均として表した。
【０１５４】
ペプチド比をタンパク質またはタンパク質ノード比に広めるとき、（ａ）予想される程度まで完全に修飾された、すなわち、完全にｉＴＲＡＱ標識され、およびそれらがシステイン（複数可）を含有する場合には完全にアルキル化された、または（ｂ）ＡＰＲがターゲットにするタンパク質に、もしくはチロシンに、ヘモグロビンに（これらのタンパク質は、不純物とみなされる）マッチングしないペプチドのみを考慮した。
【０１５５】
ペプチド／タンパク質同定は、市販のＭａｓｃｏｔデータベースサーチプログラム（英国のＭａｔｒｉｘＳｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．）の三方向からのアプローチ、科学者によるエキスパートバリデーション、およびＭＳ／ＭＳスペクトルマッチング手順を用いて行った。
【０１５６】
研究の全プロテオミクス成分についてのデータ収集が完了し、Ｍａｓｃｏｔサーチ結果をＰｅｐｔｉｄｅＤＢにロードしたら、スペクトルマッチング手順をランした。目的は、プロテオミクスプロジェクトにおいて分析した任意のｉＴＲＡＱに関する自動バリデーションの基準に対してペプチド配列にマッチするＭＳ／ＭＳスペクトルを見出すことであった。ペプチドの素性は、ぴったりとマッチした先駆物質質量、ＳＣＸ画分数およびＨＰＬＣ保持時間、および最も存在度が高いフラグメントイオンの質量に基づいて確立した。このように、Ｍａｓｃｏｔによる自動バリデーション基準を満たさないが、他のｉＴＲＡＱミックス（複数可）での自動またはエキスパートバリデーション例を有する、多数のＭＳ／ＭＳスペクトルを救うことができた。そのような手順の重要性は、プロテオミクス研究においてできる限り多くのタンパク質にわたって測定されるペプチドおよびタンパク質の表現を増やすことである。
【０１５７】
（可能な最も完全なペプチドセットを有する）全研究についてのペプチド同定が完了した後、タンパク質バリデーションツールをランして、バリデーションされたすべてのペプチド配列を説明するタンパク質の最小セットを同定した。タンパク質バリデーションツールぺプチドの専門用語で、配列を（ａ）ゲノム内の一意的遺伝子を表すタンパク質クラスまたは（ｂ）（スプライス変異体、多形などの中の）タンパク質クラス内の好ましい（通常、最も多くの注釈情報を有するもの）配列例を表すタンパク質典型に割り当てた。
【０１５８】
多数のデータ処理工程は完全データセットに適用され、この研究について報告されているタンパク質／ペプチドおよび定量マトリックスの数に影響を及ぼした。これらのデータ処理工程としては、下記が挙げられる：
ペプチド測定の統合：同じｉＴＲＡＱミックス中の同じペプチド（同じ配列および同じ修飾）の多数のＭＳ／ＭＳ測定からのｉＴＲＡＱシグナルを合計し、その時点から単一比測定を用いた。
【０１５９】
外れ値排除：５％の外れ値のペプチド測定値を除去する標準的な統計手順。ペプチド測定値は、それが、同じタンパク質にマッチするすべてのペプチド測定値の分布から十分に外れている場合（２より大きい標準偏差）、外れ値とみなした。
【０１６０】
最終タンパク質／ノード割り当て：タンパク質バリデーションツール分析が完了したら、全プロジェクトについての定量結果を用いて、一変量および多変量統計解析のためのタンパク質リストを仕上げた。最終タンパク質によって相関ネットワーク分析のためのノードを定義した。このプロセスは、タンパク質の処理形態（すなわち、補体Ｃ３からのＣ３ａおよびＣ３ｂ、フィブリノゲンアルファ鎖からのフィブリノペプチドＡ、ＡＭＢＰ＿ＨＵＭＡＮからのアルファ−ミクログロブリンおよびビクニンなど）およびタンパク質の多形変異体の処理形態の正しい追跡に必要であった。
【０１６１】
同じタンパク質にマッチするペプチドの比の一致性によって、定量性能を評価した。これらのペプチド測定値の相対標準偏差は、タンパク質測定値が（マッチするペプチド測定値の平均として）如何に正確であるかを示した。これらの手順は、ペプチド相対標準偏差を数パーセント点低下させた。
【０１６２】
ターゲットプロテオミクス：多重化イムノアッセイ
以下の表３に示す８９のターゲットタンパク質の濃度を多重化イムノアッセイシステム（米国、テキサス州、オースチンのＲｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）［ＭｃＤａｄｅ ＆ Ｆｕｌｔｏｎ、Ｄｅｖｉｃｅ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｄ １９：７５−８２，１９９７；Ｆｕｌｔｏｎら，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４３：１７４９−５６，１９９７］で測定した。このシステムは、フローサイトメーターおよびデジタル・シグナル・プロセッサーを用いて多数のマイクロスフェアベースのアッセイの実時間分析を行うことにより、非常に多数の併発反応を遂行する。このシステムの３つの重要な構成要素は、ベンチトップフローサイトメーター、マイクロスフェア、ならびにコンピュータハードウェアおよびソフトウェアである。これらの測定において用いた血漿の量は、５０マイクロリットルであった。ターゲットタンパク質それぞれについての、フローサイトメーターによって記録された蛍光シグナルを、それらのターゲットタンパク質それぞれの濃度の計算のために、標準曲線と比較することができる。品質管理サンプルをこの分析に含めた。
【０１６３】
【表３】
ターゲットタンパク質分析は、症例および対照からのサンプルのセット全体にわたって６６のタンパク質の濃度に関する有用な情報をもたらした。これら６６タンパク質についてのデータセットをこの個々のバイオ分析プラットホームのための一変量および多変量分析物において使用し、また、他のバイオ分析プラットホームと併用して、７２３の分析物を含む統合データセットを生成した。
【０１６４】
統計学的方法
この研究の主目的に取り組むために、すなわち、血液または血漿中の分子分析物（セット）を発見し、近々のＭＡＣＣを予測する関連アルゴリズムを発見するために、統計解析を行った。２年の経過観察中にＭＡＣＣＥの発生を有した被験者を症例として、および経過観察中にＭＡＣＣの発生がなかった者を対照として示す。
【０１６５】
統計解析は、次の成分を含んだ：
１．研究被験者のベースライン特性。
２．すべてのプラットホームによってプロファイルされたデータからの症例および対照の間の隔たりを（もしあれば）視覚化するための主成分分析（ＰＣＡ）。
３．従来のリスク因子を調整した後、近々のＭＡＣＣＥの確率と統計学的に有意に関連づけられる個々の分析物を検出するための一変量モード。
４．多変量モード：従来のリスク因子を伴うおよび伴わない、近々のＭＡＣＣＥの確率と統計学的に有意に関連づけられる分析物の最適なサブセットを得るための分類。従来の臨床因子を伴う分類器からの結果に基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線と従来の臨床因子を伴わない分類器からの結果に基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線とを比較した。
【０１６６】
ベースライン特性：ベースライン特性についての平均および割合を症例および対照について計算した。症例と対照の間のベースライン測定の差の統計学的優位性は、ウィルコクソンの順位和検定（連続変数）およびカイ二乗検定（割合およびＲｘＣテーブルについて）に基づいた。
【０１６７】
主成分分析：本研究におけるメタボロミクスおよびプロテオミクスプラットホームそれぞれから得られたデータについてのＰＣＡスコアプロットを生成した。これらの分析の動機としては、症例と対照との間の隔たりの視覚化、および品質のために外れ値サンプルの同定およびデータセットの評価が挙げられた。
【０１６８】
一変量モード：一次一変量分析は、症例対対照の１対１マッチングを考慮に入れて条件付ロジスティック回帰に基づく。一変量分析は、関連臨床共変量を調整した後、個別に各血漿分析物と転帰との関連性（症例対対照状態）の統計学的有意性を評価する回帰モデルから成った。症例を対照と年齢、人種、性別およびＣＡＤ指数とに関してマッチングさせたので、これらの変数は、回帰モデルには現れない。条件付ロジスティック回帰モデルは、マッチング戦略に含まれない交絡因子に適応した。モデルへの組み入れのための従来のリスク因子の選択は、心血管の転帰に対する分析物の影響を調査する研究からの結果に関して報告している医学文献中の最近の論文の再考に基づいた。それぞれの血漿分析物を、対照被験者における分析物の分布に基づき、四分位数としてモデル化した。尤度比検定を用いて、転帰を予測する際のそれぞれの分析物の統計学的優位性を評価した。多重比較についての調整は、Ｓｔｏｒｅｙ（Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔｉｓｔ Ｓｏｃ Ｂ ６４：４７９−４９８，２００２）による方法に基づいた。症例または対照のいずれかにおける５０％より大きい欠測値は、この一変量分析から除外した。
【０１６９】
分析物値を二値変数に変換する第二セットの一変量分析を行った（ここで、０は、欠測値を示し、１はそうでないものを示す）。前の一変量分析のように、尤度比検定を用いて、転帰を予測する際のそれぞれの分析物の統計学的有意性を評価した。多重比較についての調整は、Ｓｔｏｒｅｙ（Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔｉｓｔ Ｓｏｃ Ｂ ６４：４７９−４９８，２００２）による方法に基づいた。
【０１７０】
症例および対照を別々に図示する、統計学的に有意な分析物それぞれについての箱ひげ図も生成した。
【０１７１】
生ｐ値と比較したＦＤＲ調整ｐ値のプロットを生成した。プロットに見られるｐ値の分布を、それぞれのプラットホームにおける推定分析物の選択のためのｐ値閾値を選択するために基礎として用いた。すべてのプラットホームからのデータを入手できたら、すべてのプラットホームからのデータを積分することによってＦＤＲ調整ｐ値を生成した。最終一変量分析物リストを積分解析から生成した。選択した結果を下の表４に列挙する。
【０１７２】
【表４】
【０１７３】
【表４Ｂ】
上の表４において、ＰＣは、ホスファチジルコリンを意味し、ＰＥは、ホスファチジルエタノールアミンを意味し、ＴＧは、トリアシルグリセロールを意味し、ＳＭは、スフィンゴミエリンを意味し、ＬＰＣは、リゾ−ホスファチジルコリンを意味し、ＩＬは、インターロイキンを意味し、およびｘ：ｙは、ｘ個の炭素原子とｙ個の二重結合とを含有する脂肪酸鎖を示す。「オッズ比」を示す縦列の記載事項は、本研究におけるすべての被験者にわたる分析物についての濃度の全分布の第１四分位数内の分析物濃度を有する被験者に対する第４四分位数内の分析物濃度を有する被験者の比較に対応するオッズ比である。質量分析によって測定した分析物について、測定単位を「任意単位」または「ＡＵ」として示す。質量分析計から得た濃度測定値は、質量分析計装置の検出器によって検出されるような処理済イオンカウントを表す。質量分析によって測定した分析物について、絶対定量は行わなかった。
【０１７４】
次の脂肪酸分析物は、ＭＡＣＣＥについてのリスクに関連がある（ここで、それぞれ、同定分析物のリスト中の最初の分析物は、ＭＡＣＣＥについてのリスクと最も強い関連性を有し、最後の分析物は、ＭＡＣＣＥについてのリスクと最も弱い関連性を有する）：１８：２／１８：１／１７：０ＴＧ、１８：０／２０：４ＰＥ、１６：０／１８：１ＰＣ、１６：０／２２：６ＰＥ、２０：４ＬＰＣ、２０：１／１８：１／１８：１ＴＧ、１８：１／１７：１／１６：０ＴＧ、１８：１／１８：０／１８：０ＴＧ、１８：１／１８：１／１７：０ＴＧ、１６：０ＳＭ、および１６：０／１６：０ＰＣ。
【０１７５】
２０：４ＬＰＣを除き、表４中において確認される脂肪酸分析物それぞれについて、脂肪酸の濃度が高いほど、ＭＡＣＣＥについてのリスクと強い関係があり得る（例えば、１８：０／２０：４ＰＥの個体群分布の第４四分位数内の被験者は、最も低い、すなわち第１、四分位数内のものよりＭＡＣＣＥに罹患する可能性が高い）。２０：４ＬＰＣについては、その反対であり得る：２０：４ＬＰＣの個体群分布の最も低い、すなわち第１四分位数内の被験者は、最も高い、すなわち第４、四分位数内の者よりＭＡＣＣＥに罹患する可能性が高い。
【０１７６】
一部の実施形態によると、臨床家は、上の表４の第４四分位数内の分析物測定値を有する被験者を、潜在的に２年以内のＭＡＣＣＥについての高いリスクがある個体として同定することができる（第１四分位数内の値を有する被験者の方がより高いリスクがあることを意味する、１未満のオッズ比を有する、アポリポタンパク質Ａ１、２０：４ＬＰＣ、またはアラビノースを除く）。別の実施形態によると、臨床家は、上の表４の第３または第４四分位数範囲内の分析物測定値を有する被験者を、潜在的に２年以内のＭＡＣＣＥについての高いリスクがある個体として同定することができる。さらなる実施形態によると、臨床家は、上の表４の第２、第３または第４四分位数範囲内の分析物測定値を有する被験者を、潜在的に２年以内のＭＡＣＣＥについての高いリスクがある個体として同定することができる。
【０１７７】
多変量分類法
監視多変量予測モデル：予測される転帰が指標特性づけの２年以内のＭＡＣＣＥの発生である、多変量予測モデルを構築した。モデルにインプットした変量は、（ｉ）バイオ分析プラットホーム特異的血漿分析物、および（ｉｉ）すべてのバイオ分析プラットホームによって一緒にプロファイルされるような血漿分析物であった。従来の臨床因子について調整を伴うおよび伴わない、それぞれの多変量モデルも構築した。
【０１７８】
多変量分類手順Ｒａｎｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ（Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ４５：５−３２，２００１）をデータに適用して、ＭＡＣＣＥの予兆となる多変量フィンガープリントを得た。外部クロスバリデーションおよびラベル順列検定を実行して、得られたモデルの統計学的有意性を評価した（Ａｍｂｒｏｉｓｅ ＆ ＭｃＬａｃｈｌａｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９９：６５６２−２，２００２）。以下の出力をそれぞれの分類器からから得ることができた：１．「症例」および「対照」群におけるＭＡＣＥ予測のための予測多変量血漿分析物候補が、分類精度における重要性によってランクづけされた分析物と共に報告された。
２．それぞれの分類器についての特異性に対する感度のＲＯＣ曲線（例えば、図１および２を参照）
症例または対照のいずれかにおける５０％より大きい欠測値を有する特徴は、多変量分析から除外した。症例および対照における５０％未満の欠測値を有する特徴は、Ｔｒｙｏｙａｎｓｋａｙａらによって記載された方法（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７（６）５２０−５２５，２００１）を用いて一定の価値があると評価された欠測値を有した。
【０１７９】
方法に従って同定した分析物
７２３の分析物の総合バイオ分析データセットと共に多変量統計学的分類器分析法（Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ−Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ４５：５−３２，２００１）を用いることにより、本発明者らは、血液サンプルを得た時点から２年以内の個体における心血管または脳血管主要有害事象の発生を予測するために用いることができる分析物およびアルゴリズムのセットを発見した。下の表５は、１つの出発シードに基づくＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分類器における合計７２３の分析物のリスト中のそれらの重要性順での５０の最も重要な分析物を表す（分析＃１）。Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分析および分析＃１と同じ出発シードを用いるちょうど５０の分析物成分を有する分類器の獲得への再帰的特徴排除アプローチからの部分的分析物重要性リストを、縦列マーカー「分析＃２からの重要性の順番」に示す。３つの追加のＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分析および異なる出発シードから誘導されたちょうど５０の分析物成分を有する分類器の獲得への再帰的特徴排除アプローチからの部分分析物重要性リストを、分析＃３、＃４および＃５についての縦列に示す。Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分析のための出発シードまたは５０固定の分析物成分の分類器を得るための再帰的特徴排除の使用に関係なく、最も重要な２０の分析物は、ほぼ常に、分析＃１からの重要性によってランク付けして上位５０位以内である。
【０１８０】
【表５−１】
【０１８１】
【表５−２】
４つの出発シードを用いるＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分析からの分析物の完全リストを、添付の付属書類５−８における同じ４つの出発シードについてのＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔプラス回帰的特徴排除アプローチからの上位５０の分析物と共に、添付の付属書類１−４に示す。
【０１８２】
アルゴリズムと共に個体からの血漿サンプル中の分析＃１からの上位２０の分析物のレベルを用いることにより、２年以内のＭＡＣＣＥの発生についてのその個体に関する予測を、感度８７％および特異性８７％で行うことができた。これを図１に示す受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によって例証する。
【０１８３】
６６の個々の分析物のターゲットプロテオミクスバイオ分析データセットと共に多変量統計学的分類器分析法（Ｒｏｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ−Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ４５：５−３２，２００１）を用いることにより、本発明者らは、血液サンプルを得た時点から２年以内の個体における心臓発作の発生を予測するために用いることができる分析物およびアルゴリズムのセットを発見した。下の表６は、１つのそのような分析物セットにおける最も重要な１０の分析物、および多変量分析から得た分類器におけるそれらの重要性の順番を表す。
【０１８４】
【表６】
アルゴリズムと共に個体からの血漿サンプル中のこれら上位１０の分析物のレベルを用いることにより、２年以内のＭＡＣＣＥの発生についてのその個体に関する予測を、感度８２％および特異性８７％で行うことができた。これを図２に示す受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によって例証する。
【０１８５】
一部の実施形態によると、上位１０の分析を用いて次の一次方程式によりＭＡＣＣＥ指数を定義することができる：
ｙ＝ｃ１ｘ１＋ｃ２ｘ２＋ｃ３ｘ３＋ｃ４ｘ４＋ｃ５ｘ５＋ｃ６ｘ６＋ｃ７ｘ７＋ｃ８ｘ８＋ｃ９ｘ９＋ｃ１０ｘ１０
［方程式１］
（式中、ｃ１からｃ１０の値は、下の表９に列挙する値であり、変数ｘ１からｘ１０は、下の表７に列挙する分析物の測定値を表す）。分析物を、上のターゲットプロテオミクス：多重化イムノアッセイのセクションにおいて説明したように測定する。それぞれの分析物についての測定単位を下の表に列挙する。方程式１に測定値を入れる前に、それらの値を標準化しなければならない。すなわち、それぞれの測定値から、全研究個体群（すなわち、すべての症例および対照被験者）から得たすべての値の平均を引き、その後、結果を、全研究個体群（すなわち、すべての症例および対照被験者）から得た分析物測定値の標準偏差で割った。方程式１の１０の分析物についての対応する値、すなわち、個体群平均および標準偏差を表８に列挙する。
【０１８６】
方程式１のような方程式を用いると、上記方程式において得られる値ｙ（ＭＡＣＣＥ指数）がゼロより大きいこれら１０の分析物についての測定値（それぞれ、表８からの適切な値を用いて上記したように標準化した測定値）を有する被験者は、２年以内のＭＡＣＣＥのリスクがあると分類されることとなり、そうでない者は、２年以内のＭＡＣＣＥについてのリスクがないと分類されることとなる。
【０１８７】
【表７】
【０１８８】
【表８】
【０１８９】
【表９】
上位四（４）の分析物を用いて、次の一次方程式により、さらに別のＭＡＣＣＥ指数を定義することができる：
ｙ＝ｃ１ｘ１＋ｃ２ｘ２＋ｃ３ｘ３＋ｃ４ｘ４ ［方程式２］
（式中、ｃ１からｃ４の値は、下の表１１に列挙する値をとり、変数ｘ１からｘ１０は、下の表１０に列挙する分析物の測定値を表す）。分析物を、上のターゲットプロテオミクス：多重化イムノアッセイのセクションにおいて説明したように測定する。それぞれの分析物についての測定単位は、下の表に列挙する。方程式２に測定値を入れる前に、それらの値を標準化しなければならない。すなわち、それぞれの測定値から、全研究個体群（すなわち、すべての症例および対照被験者）から得たすべての値の平均を引き、その後、結果を、全研究個体群（すなわち、すべての症例および対照被験者）から得た分析物測定値の標準偏差で割った。方程式２の４つの分析物についての対応する値、すなわち、個体群平均および標準偏差を上の表８に列挙する。
【０１９０】
【表１０】
【０１９１】
【表１１】
方程式２のような方程式を用いて、上記方程式において得られる値ｙ（ＭＡＣＣＥ指数）がゼロより大きい、これら４つの分析物についての測定値（それぞれ、表８からの適切な値を用いて上記したように標準化した測定値）を有する被験者は、２年以内のＭＡＣＣＥのリスクがあると分類されることとなり、そうでない者は、２年以内のＭＡＣＣＥについてのリスクがないと分類されることとなる。
【０１９２】
追加の多変量分類分析法、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（ＰＡＭ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉら，ＰＮＡＳ ９９：６５６７−６５７２，２００２）、を７２３の分析物の総合プラットホームデータセットに適用した。この分析によって、症例または対照の分類に最適な最小分析セットが得られた。上のＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓケースにおける、分析物＃２、＃３、＃４および＃５についてのものと同じ４つのシードを用いる４つのＰＡＭ分析物のための分析セットを次の表に示す：
【０１９３】
【表１２】
【０１９４】
【表１３】
【０１９５】
【表１４】
【０１９６】
【表１５】
ＰＡＭによるこの代替多変量分類器分析により、異なる出発シードに対して本質的に同じ分析物、およびＲａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔｓ分析の結果と、同一ではないが、一致する重要性の順番で上位にランク付けされる分析物が得られた。
【０１９７】
本教示は、個体からの血液サンプルにおいて測定することができる、ならびにＭＡＣＣＥ指数を計算するためのアルゴリズムおよびその個体についての血液サンプル採取時から２年以内のＭＡＣＣＥの発生を予測するためのアルゴリズムと併用することができる、分析物セットの素性を含む。
【０１９８】
本教示は、分析物セットの血液、血漿または血清レベルに関する情報と共に用いて、ＭＡＣＣＥを計算することができる、およびＢｒｅｉｍａｎが分析物セット、例えばこれ、について記載した（Ｍａｃｈｉｎｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ４５：５−３２，２００１）ような個体についての血液サンプル採取時から２年以内のＭＡＣＣＥの発生を予測することができる、アルゴリズムも含む。
【０１９９】
本教示は、ＭＡＣＣＥ指数を計算するためのおよびその個体についての血液サンプル採取時から２年以内のＭＡＣＣＥの発生を予測するためのアルゴリズムと併用することができる、分析物セットのレベルを個体の血液、血漿または血清サンプルから測定することができる計器も含む。
【０２００】
本教示は、ＭＡＣＣＥ指数を計算するためのおよび個体についての血液サンプル採取時から２年以内のＭＡＣＣＥの発生を予測するためのアルゴリズムと併用することができる、分析物セットの血液、血漿または血清レベルを測定するアッセイに利用することができる試薬（抗体および他のタイプの親和性試薬）も含む。
【０２０１】
本教示は、その本質的な精神または特徴から逸脱することのない他の特定の形での実施形態を包含する。従って、上述の実施形態は、すべての点で、本明細書に記載する本教示に対する限定ではなく例証であると考えなければならない。本発明の範囲は、上述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に入るすべての変更が意図されており、特許請求の範囲に包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよび組織因子を含む１セットの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定すること；前記セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数を決定すること；および前記ＭＡＣＣＥ指数がゼロより大きい場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度増加、または前記ＭＡＣＣＥ指数がゼロ以下である場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度低下を有するものとしてそのヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項２】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することであって、ここで、前記セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および組織因子を含むこと；および前記ＭＡＣＣＥ指数、前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項３】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することであって、ここで、前記セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および組織因子を含むこと；および前記ヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合、治療を推奨すること、是認すること、または施与することを含む、ヒトを治療する方法。
【請求項４】
前記セットの分析物が、ＣＤ４０、フィブリノゲン、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、およびフォン・ヴィルブランド因子をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数の決定が：それぞれの分析物の測定濃度を標準化して標準濃度を得ること；前記それぞれの分析物の標準濃度に分析物定数をかけて分析物値を得ること；および前記それぞれの分析物の分析物値を合計してＭＡＣＣＥ指数を得ることを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定濃度の標準化が、前記測定濃度から個体群平均値を引いて結果を得、その後、該結果を前記個体群平均値の標準偏差で割ることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子およびフォン・ヴィルブランド因子から成る１セットの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定すること；前記セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数を決定すること；および前記ＭＡＣＣＥ指数がゼロより大きい場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度増加、または前記ＭＡＣＣＥ指数がゼロ以下である場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度低下を有するものとして前記ヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項８】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することであって、ここで、前記セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子から成ること；および前記ＭＡＣＣＥ指数、前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項９】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することであって、ここで、前記セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子から成ること；および前記ヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合、治療を推奨すること、是認することまたは施与することを含む、ヒトを治療する方法。
【請求項１０】
前記セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数の決定が：それぞれの分析物の測定濃度を標準化して標準濃度を得ること；前記それぞれの分析物の標準濃度に分析物定数をかけて分析物値を得ること；および前記それぞれの分析物の分析物値を合計してＭＡＣＣＥ指数を得ることを含む、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記測定濃度の標準化が、前記測定濃度から個体群平均値を引いて結果を得、その後、該結果を前記個体群平均値の標準偏差で割ることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、アポリポタンパク質Ａ１、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、アラビノース、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択される１セットの分析物のうちの少なくとも１つ分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定すること；および前記測定濃度と所定の閾値との比較に基づき心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するとして前記ヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項１３】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物のうちの少なくとも１つの分析物の測定濃度を所定の閾値と比較して、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を確認することであって、ここで、前記セットの分析物は、システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、アポリポタンパク質Ａ１、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、アラビノース、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択されること；および、前記測定濃度、前記所定の閾値、および前記心血管または脳血管主要有害事象の尤度のうちの少なくとも１つをユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項１４】
１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、１８：１／１７：１／１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択される１セットの分析物のうちの少なくとも１つの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定すること；およびその測定濃度と所定の閾値との比較に基づき心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして前記ヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項１５】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物のうちの少なくとも１つの分析物の測定濃度を所定の閾値と比較して、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を確認することであって、ここで、前記分析物は、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、１８：１／１７：１／１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択されること；および、前記測定濃度、前記所定の閾値、および前記心血管または脳血管主要有害事象の尤度のうちの少なくとも１つをユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項１６】
分析物：システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールのそれぞれについての所定の閾値が、それぞれ各々の分析物についての表４中の第４四分位数の下限であり、ここで、第４四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
分析物：システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールのそれぞれについての所定の閾値が、それぞれ各々の分析物についての表４中の第３および第４四分位数の下限であり、ここで、第３および第４四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
分析物アポリポタンパク質Ａ１、２０：４リゾホスファチジルコリンおよびアラビノースのそれぞれについての所定の閾値が、それぞれ各々の分析物についての表４中の第１四分位数の上限であり、ここで、第１四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
分析物アポリポタンパク質Ａ１、２０：４リゾホスファチジルコリンおよびアラビノースのそれぞれについての所定の閾値は、それぞれ各々の分析物についての表４中の第１および第２四分位数の上限であり、ここで、第１および第２四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記血液系サンプルが、血清または血漿を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒトから少なくとも１つの血液系サンプルを得ること；前記ヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度を測定すること；および付録書類１において確認される１つ以上の分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして前記ヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法。
【請求項２２】
ヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度を測定すること；前記絶対濃度を所定の閾値と比較すること；前記付属書類１において確認される１つ以上の分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして前記ヒトを同定すること；および前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、前記絶対濃度、前記所定の閾値またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに、転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法。
【請求項２３】
ヒトから少なくとも１つの血液系サンプルを得ること；前記ヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度を決定すること；および付録書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして前記ヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法。
【請求項２４】
ヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度を決定すること；前記相対濃度を所定の閾値と比較すること；前記付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして前記ヒトを同定すること；および前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、前記絶対濃度、前記所定の閾値またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに、転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法。
【請求項２５】
前記ＭＡＣＣＥ指数、前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、前記測定濃度、前記所定の閾値、またはそれらの等価物が、スクリーンまたは有形媒体に表示される、請求項２、８、１３または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＡＣＣＥ指数、前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、前記測定濃度、前記所定の閾値、またはそれらの等価物が、医療業界の人に転送される、請求項２、８、１３または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＭＡＣＣＥ指数、前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、前記測定濃度、前記所定の閾値、またはそれらの等価物が、医療保険のプロバイダーまたは医師に転送される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
付属書類１において確認される１つ以上の分析物の、ヒトの血液系サンプル中の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または低下を有するものとしてヒトを同定すること；および前記ヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合には治療を推奨すること、是認すること、または施与することを含む、治療方法。
【請求項２９】
付属書類１において確認される１つ以上の分析物の、ヒトの血液系サンプル中の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または低下を有するものとしてヒトを同定すること、およびそのヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定されない限り、治療の推奨、是認または施与を拒否することを含む、治療を受けるべきでないヒトを同定する方法。
【請求項１】
アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼおよび組織因子を含む１セットの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定すること；前記セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数を決定すること；および前記ＭＡＣＣＥ指数がゼロより大きい場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度増加、または前記ＭＡＣＣＥ指数がゼロ以下である場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度低下を有するものとしてそのヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項２】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することであって、ここで、前記セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および組織因子を含むこと；および前記ＭＡＣＣＥ指数、前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項３】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することであって、ここで、前記セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および組織因子を含むこと；および前記ヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合、治療を推奨すること、是認すること、または施与することを含む、ヒトを治療する方法。
【請求項４】
前記セットの分析物が、ＣＤ４０、フィブリノゲン、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、およびフォン・ヴィルブランド因子をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数の決定が：それぞれの分析物の測定濃度を標準化して標準濃度を得ること；前記それぞれの分析物の標準濃度に分析物定数をかけて分析物値を得ること；および前記それぞれの分析物の分析物値を合計してＭＡＣＣＥ指数を得ることを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定濃度の標準化が、前記測定濃度から個体群平均値を引いて結果を得、その後、該結果を前記個体群平均値の標準偏差で割ることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子およびフォン・ヴィルブランド因子から成る１セットの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定すること；前記セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数を決定すること；および前記ＭＡＣＣＥ指数がゼロより大きい場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度増加、または前記ＭＡＣＣＥ指数がゼロ以下である場合には心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度低下を有するものとして前記ヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項８】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することであって、ここで、前記セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子から成ること；および前記ＭＡＣＣＥ指数、前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項９】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を示す値を有するＭＡＣＣＥ指数を決定することであって、ここで、前記セットの分析物は、アルファ−フェトプロテイン、癌抗原１２５、ＣＤ４０、フィブリノゲン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＳＧＯＴ、組織因子、およびフォン・ヴィルブランド因子から成ること；および前記ヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合、治療を推奨すること、是認することまたは施与することを含む、ヒトを治療する方法。
【請求項１０】
前記セットの分析物についてのＭＡＣＣＥ指数の決定が：それぞれの分析物の測定濃度を標準化して標準濃度を得ること；前記それぞれの分析物の標準濃度に分析物定数をかけて分析物値を得ること；および前記それぞれの分析物の分析物値を合計してＭＡＣＣＥ指数を得ることを含む、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記測定濃度の標準化が、前記測定濃度から個体群平均値を引いて結果を得、その後、該結果を前記個体群平均値の標準偏差で割ることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、アポリポタンパク質Ａ１、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、アラビノース、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択される１セットの分析物のうちの少なくとも１つ分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定すること；および前記測定濃度と所定の閾値との比較に基づき心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するとして前記ヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項１３】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物のうちの少なくとも１つの分析物の測定濃度を所定の閾値と比較して、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を確認することであって、ここで、前記セットの分析物は、システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、アポリポタンパク質Ａ１、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、アラビノース、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択されること；および、前記測定濃度、前記所定の閾値、および前記心血管または脳血管主要有害事象の尤度のうちの少なくとも１つをユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項１４】
１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、１８：１／１７：１／１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択される１セットの分析物のうちの少なくとも１つの分析物の、ヒトの血液系サンプル中の濃度を測定すること；およびその測定濃度と所定の閾値との比較に基づき心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして前記ヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項１５】
ヒトの血液系サンプル中の１セットの分析物のうちの少なくとも１つの分析物の測定濃度を所定の閾値と比較して、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を確認することであって、ここで、前記分析物は、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、２０：４リゾホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、１８：１／１７：１／１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールから成る群より選択されること；および、前記測定濃度、前記所定の閾値、および前記心血管または脳血管主要有害事象の尤度のうちの少なくとも１つをユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象の確率を評定する方法。
【請求項１６】
分析物：システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールのそれぞれについての所定の閾値が、それぞれ各々の分析物についての表４中の第４四分位数の下限であり、ここで、第４四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
分析物：システイン、フォン・ヴィルブランド因子、ＩＬ−８、１６：０／１８：１ホスファチジルコリン、Ｎ−カルボキシ−アラニン、フィブリノゲン、ＭＭＰ−２、１８：０／２０：４ホスファチジルエタノールアミン、１６：０／２２：６ホスファチジルエタノールアミン、１８：１／１８：０／１８：０トリアシルグリセロール、アルファ−１アンチトリプシン、１８：２／１８：１／１７：０トリアシルグリセロール、２０：１／１８：１／１８：１トリアシルグリセロール、１６：０／１６：０ホスファチジルコリン、１６：０スフィンゴミエリン、ＳＨＢＧ、１８：１／１７：１，１６：０トリアシルグリセロール、および１８：１／１８：１／１７：０トリアシルグリセロールのそれぞれについての所定の閾値が、それぞれ各々の分析物についての表４中の第３および第４四分位数の下限であり、ここで、第３および第４四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
分析物アポリポタンパク質Ａ１、２０：４リゾホスファチジルコリンおよびアラビノースのそれぞれについての所定の閾値が、それぞれ各々の分析物についての表４中の第１四分位数の上限であり、ここで、第１四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
分析物アポリポタンパク質Ａ１、２０：４リゾホスファチジルコリンおよびアラビノースのそれぞれについての所定の閾値は、それぞれ各々の分析物についての表４中の第１および第２四分位数の上限であり、ここで、第１および第２四分位数内の測定濃度は、心血管または脳血管主要有害事象の尤度を増加させる、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記血液系サンプルが、血清または血漿を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒトから少なくとも１つの血液系サンプルを得ること；前記ヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度を測定すること；および付録書類１において確認される１つ以上の分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして前記ヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法。
【請求項２２】
ヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の絶対濃度を測定すること；前記絶対濃度を所定の閾値と比較すること；前記付属書類１において確認される１つ以上の分析物の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして前記ヒトを同定すること；および前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、前記絶対濃度、前記所定の閾値またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに、転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法。
【請求項２３】
ヒトから少なくとも１つの血液系サンプルを得ること；前記ヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度を決定すること；および付録書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして前記ヒトを同定することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法。
【請求項２４】
ヒトからのサンプル中の付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度を決定すること；前記相対濃度を所定の閾値と比較すること；前記付属書類１において確認される１つ以上の分析物の相対濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または減少を有するものとして前記ヒトを同定すること；および前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、前記絶対濃度、前記所定の閾値またはそれらの等価物のうちの少なくとも１つを、ユーザー・インターフェース・デバイス、コンピュータ可読記憶媒体、またはローカルもしくはリモート・コンピュータ・システムに、転送すること、表示すること、保存すること、または出力することを含む、ヒトにおける心血管または脳血管主要有害事象を予測するための方法。
【請求項２５】
前記ＭＡＣＣＥ指数、前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、前記測定濃度、前記所定の閾値、またはそれらの等価物が、スクリーンまたは有形媒体に表示される、請求項２、８、１３または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＭＡＣＣＥ指数、前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、前記測定濃度、前記所定の閾値、またはそれらの等価物が、医療業界の人に転送される、請求項２、８、１３または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＭＡＣＣＥ指数、前記心血管もしくは脳血管主要有害事象の尤度、前記測定濃度、前記所定の閾値、またはそれらの等価物が、医療保険のプロバイダーまたは医師に転送される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
付属書類１において確認される１つ以上の分析物の、ヒトの血液系サンプル中の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または低下を有するものとしてヒトを同定すること；および前記ヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定された場合には治療を推奨すること、是認すること、または施与することを含む、治療方法。
【請求項２９】
付属書類１において確認される１つ以上の分析物の、ヒトの血液系サンプル中の測定濃度に基づき、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加または低下を有するものとしてヒトを同定すること、およびそのヒトが、心血管または脳血管主要有害事象の尤度増加を有するものとして同定されない限り、治療の推奨、是認または施与を拒否することを含む、治療を受けるべきでないヒトを同定する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５０１１３３（Ｐ２０１１−５０１１３３Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２９０９６（Ｐ２０１０−５２９０９６）
【出願日】平成２０年１０月１０日（２００８．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９５５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４９１８９
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５０６０５７６３８）ビージー メディシン， インコーポレイテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１０日（２００８．１０．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９５５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４９１８９
【国際公開日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【出願人】（５０６０５７６３８）ビージー メディシン， インコーポレイテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
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