志賀毒素および志賀様毒素を阻害するための組成物および方法
本発明は、志賀毒素産生細菌による感染を治療または予防するための組成物および方法を提供する。本発明は、志賀毒素および／または志賀様毒素の宿主細胞表面への結合に影響する（すなわち、遮断する、阻害する）糖鎖エピトープが、高密度で、ムチン型タンパク質主鎖上の種々のコア糖鎖によって特異的に発現され得るという発見に一部基づいている。このポリペプチドは、本明細書において志賀毒素阻害性（ＳＴＩ）融合タンパク質またはＳＩポリペプチドと称される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して志賀毒素産生細菌および志賀様毒素産生細菌による感染を治療または予防するための組成物および方法に関し、より具体的には、志賀毒素および志賀様毒素を阻害する糖鎖エピトープを含む融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
志賀毒素および志賀様毒素は、毒性のＡサブユニットと５つの糖鎖結合性Ｂサブユニットからなる。志賀毒素はＳｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅによって産生される。この毒素は、Ｇｂ３（Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）発現細胞に結合し、内部移行するとタンパク質合成を阻害し、それにより感染個体において下痢、出血性大腸炎または溶血性尿毒症症候群が生じる。Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの感染によって誘発されるサイトカインにより、一部の細胞においてＧｂ３産生が引き起こされ得ることが示されている。志賀様毒素１は志賀毒素とほぼ同一であり、同様にＧｂ３を認識する。志賀様毒素２は違う形態で存在し、その大部分は同様にＧｂ３を認識するが、ある形態はＧｂ４（ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）にも結合することが示されている。複数の研究により、糖鎖リガンドの脂質部も認識において重要な役割を果たしていることが示されている。志賀様毒素１および志賀様毒素２は主に腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）によって産生されるが、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅによっても産生される。志賀毒素と志賀様毒素間に類似性があるにもかかわらず、細胞への作用および宿主免疫系との相互作用に関しては相違がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、志賀毒素および／または志賀様毒素の宿主細胞表面への結合に影響する（すなわち、遮断する、阻害する）糖鎖エピトープが、高密度で、ムチン型タンパク質主鎖上の種々のコア糖鎖によって特異的に発現され得るという発見に一部基づいている。このポリペプチドは、本明細書において志賀毒素阻害性（ＳＴＩ）融合タンパク質またはＳＩポリペプチドと称される。公知の細菌毒素結合活性を有する糖鎖決定基で覆われた十分なＯ−結合型グリカンを担持するこれらの重度にグリコシル化された組換え型タンパク質は、デコイとして、また、例えば気道または消化管における細菌毒素感染を特異的に予防する（例えば立体的に阻害する）ように働き得る。この融合タンパク質は、毒性が低く、薬物に対する細菌の耐性を誘発する危険性が少ない。
【０００４】
一態様において、本発明は、Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα糖鎖エピトープおよび／またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃ糖鎖エピトープを担持し、第２のポリペプチドに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。第１のポリペプチドはこれらのエピトープに対して多価である。第１のポリペプチドは、例えば、ＰＳＧＬ−１またはその一部分などのムチンポリペプチドである。ムチンポリペプチドはＰＳＧＬ−１の細胞外部分であることが好ましい。
【０００５】
第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一領域を含む。例えば、第２のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドの一領域を含む。あるいは、第２のポリペプチドは免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む。
【０００６】
融合ポリペプチドは多量体である。融合ポリペプチドは二量体であることが好ましい。
【０００７】
ＳＩ融合ポリペプチドをコードする核酸、ならびにここに記載したＳＩ融合ポリペプチドコード核酸を含有するベクターおよびここに記載したベクターまたは核酸を含有する細胞も、本発明に含まれる。場合によって、ベクターは、所望の糖鎖エピトープを合成するために必要な１種または複数種のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む。例えば、ベクターはα１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸、および場合によってコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする核酸を含有する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、志賀毒素および／または志賀様毒素の細胞表面への結合を阻害する（例えば減少させる）方法を提供する。志賀毒素産生細菌および／もしくは志賀様毒素産生細菌または遊離の志賀毒素および志賀様毒素をＳＩ融合ポリペプチドと接触させることによって結合を阻害する。本発明は、患者における志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染、または志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染に付随する障害の症状を、志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染を受けている、またはそれを生じる危険性のある患者を識別し、その患者に本発明の融合ポリペプチドを投与することによって予防または緩和する方法も特色とする。細菌は、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、Ｅｓｃｈｅｒｉａ Ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、腸管出血性大腸菌、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）である。
【０００９】
対象は、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物である。対象は、志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染、または志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染に付随する障害を受けている、またはそれを生じる危険性がある。志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染、または志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染に付随する障害を受けている、またはそれを生じる危険性がある対象は、当技術分野で公知の方法によって識別される。
【００１０】
本発明の融合ポリペプチドを含む医薬組成物も本発明に含まれる。
【００１１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似しているまたは同等である方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で挙げた全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照により組み込まれている。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書に支配される。さらに、材料、方法および実施例は例示しているのみであり、限定するものではない。
【００１２】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、志賀毒素および／または志賀様毒素の結合活性に影響する（すなわち、遮断する、阻害する）糖鎖エピトープが、糖タンパク質、例えばムチン型タンパク質主鎖上に高密度で特異的に発現され得るという発見に一部基づいている。このより高い密度の糖鎖エピトープにより、単価のオリゴ糖および野生型、例えば未変性の非組換えで発現された糖タンパク質と比較して結合価および親和性が増加する。
【００１４】
志賀毒素産生細菌および志賀様毒素産生細菌は、特異的な細胞表面糖脂質であるＧｂ３（Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）および／またはＧｂ４（ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）を介して宿主細胞に結合する。宿主細胞の表面に結合すると、毒素は内部移行し、標的細胞内部のタンパク質合成の阻害を引き起こす。細胞に入った後、タンパク質はＮ−グリコシダーゼとして機能し、リボソームを含むＲＮＡからいくつかの核酸塩基を切断し、それによってタンパク質合成が停止し、その結果、下痢、出血性大腸炎および／または溶血性尿毒症症候群が生じる。
【００１５】
本発明は、志賀毒素および／または志賀様毒素と宿主細胞表面との間の結合相互作用に影響を及ぼす（すなわち、遮断する、阻害する）のに有用な、多数のＧａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃαエピトープおよび／またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃエピトープを含有する糖タンパク質−免疫グロブリン融合タンパク質（本明細書では「ＳＩ融合タンパク質またはＳＩ融合ペプチド」と称する）を提供する。エピトープは末端である、すなわちグリカンの末端にある。ＳＩ融合タンパク質は、志賀毒素および／または志賀様毒素の細胞表面への結合を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％阻害する。例えば、ＳＩ融合タンパク質は、志賀毒素、志賀様毒素１および／または志賀様毒素２の宿主細胞表面への結合を阻害するのに有用である。
【００１６】
ＳＩ融合ペプチドは、志賀毒素および／または志賀様毒素を阻害する結合活性において、糖鎖のモルベースで遊離のサッカライドと比較して効率的である。ＳＩ融合ペプチドは、同等量の遊離のサッカライドと比較して、２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、８０倍、１００倍以上多い量の毒素を阻害する。
融合ポリペプチド
さまざまな態様において、本発明は、糖タンパク質、例えばムチンポリペプチドの少なくとも一部分を含有し、第２のポリペプチドに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。本明細書で使用する「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」とは、非ムチンポリペプチドに作動可能に連結された糖タンパク質ポリペプチドの少なくとも一部分を含む。
【００１７】
「ムチンポリペプチド」とは、ムチンドメインを有するポリペプチドを指す。ムチンポリペプチドは、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個またはそれ以上のムチンドメインを有する。ムチンポリペプチドは、Ｏ−グリカンで置換されたアミノ酸配列を特徴とする任意の糖タンパク質である。例えば、ムチンポリペプチドは、アミノ酸が１つおき、または２つおきにセリンまたはトレオニンになっている。ムチンポリペプチドは分泌タンパク質である。あるいは、ムチンポリペプチドは細胞表面タンパク質である。
【００１８】
ムチンドメインは、アミノ酸のトレオニン、セリンおよびプロリンに富み、そこでオリゴ糖がＮ−アセチルガラクトサミンを介してヒドロキシアミノ酸（Ｏ−グリカン）に連結している。ムチンドメインは、Ｏ−結合グリコシル化部位を含むかあるいはＯ−結合グリコシル化部位からなる。ムチンドメインは、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個、５０個、１００個またはそれ以上のＯ−結合グリコシル化部位を有する。あるいは、ムチンドメインはＮ−結合グリコシル化部位を含む。ムチンポリペプチドは、その質量の５０％、６０％、８０％、９０％、９５％または１００％がグリカンによるものである。ムチンポリペプチドは、ＭＵＣ遺伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ５ｃ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２など）によってコードされる任意のポリペプチドである。あるいは、ムチンポリペプチドはＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ−１、赤血球グリコホリン、グリコカリシン、グリコホリン、シアロホリン、ロイコシアリン、ＬＤＬ−Ｒ、ＺＰ３、およびエピグリカニンである。ムチンはＰＳＧＬ−１であることが好ましい。ＰＳＧＬ−１は、各々が４０２アミノ酸を含有する、１型膜貫通トポロジーの１２０ｋＤａのサブユニットが２個ジスルフィド結合したホモ二量体糖タンパク質である。細胞外ドメインにおいて、Ｏ−結合オリゴ糖を付加するための３個または４個の潜在部位を含有する１０アミノ酸のコンセンサス配列の繰り返しが１５ある。一実施形態において、１０アミノ酸のコンセンサス配列は、Ａ（Ｉ）ＱＴＴＱ（ＰＡＲ）Ｐ（ＬＴ）Ａ（ＴＥＶ）Ａ（ＰＧ）Ｔ（ＭＬ）Ｅ（配列番号１）である。別の実施形態において、１０アミノ酸のコンセンサス配列はＡＱ（Ｍ）ＴＴＰ（Ｑ）Ｐ（ＬＴ）ＡＡ（ＰＧ）Ｔ（Ｍ）Ｅ（配列番号２）である。ＰＳＧＬ−１は、各単量体に、Ｏ−結合グリコシル化のための部位を５４以上、およびＮ−結合グリコシル化のための部位を４以上有すると予測される。
【００１９】
ムチンポリペプチドは、ムチンタンパク質の全部または一部分を含有する。あるいは、ムチンタンパク質は、ポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分またはその一部分（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ５７４６８に開示されているアミノ酸１９〜３１９）を含む。ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１のシグナル配列部分（例えば、アミノ酸１〜１８）、膜貫通ドメイン（例えばアミノ酸３２０〜３４３）、および細胞質ドメイン（例えば、アミノ酸３４４〜４１２）も含む。
【００２０】
「非ムチンポリペプチド」は、グリカンによる質量分が少なくとも４０％未満であるポリペプチドを指す。
【００２１】
本発明のＳＩ融合タンパク質の中で、ムチンポリペプチドはムチンタンパク質の全部または一部分に相当する。ＳＩ融合タンパク質は、ムチンタンパク質の少なくとも一部分を含む。「少なくとも一部分」とは、ムチンポリペプチドが少なくとも１つのムチンドメイン（例えば、Ｏ−結合グリコシル化部位）を含有することを意味する。ムチンタンパク質は、ポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、ムチンポリペプチドはＰＳＧＬ−１の細胞外部分を含む。
【００２２】
第１のポリペプチドは、１種または複数種のグリコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。第１のポリペプチドは、２種、３種、５種またはそれ以上のグリコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。グリコシル化は逐次的または連続的である。あるいは、グリコシル化は同時的またはランダムである、すなわち特定の順序がない。第１のポリペプチドは、Ｎ−結合グリカンまたはＯ−結合グリカンを、タンパク質主鎖に付加またはタンパク質主鎖上に産生することができる任意の酵素によってグリコシル化される。例えば、第１のポリペプチドは、α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼの適切な供給源としては、これらに限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５９１３２、ＡＡＯ３９１５０、ＡＢＰ３５５３３、ＡＢＰ３５５３２、ＡＢＱ１０７４１、ＡＢＱ１０７４０、ＡＡＳ７７２２１、ＡＡＳ７７２２０、ＡＡＳ７７２１９、ＡＡＳ７７２１６、ＡＡＳ７７２１５、ＡＡＳ７７２１４、ＡＡＸ２０１０９、ＡＡＯ３９１５１、ＡＡＯ３９１４９、ＡＡＰ４７１７０、ＡＡＰ４７１６９、ＡＡＰ４７１６８、ＡＡＰ４７１６７、ＡＡＰ４７１６６、ＡＡＰ４７１６５、およびＡＡＰ４７１６４が挙げられ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。特定の実施形態において、第１のポリペプチドは、α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼおよびコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの両方によってグリコシル化される。コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの適切な供給源としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ７９６１０、Ｚ１９５５０、ＢＡＢ６６０２４、ＡＰ００１５１５、ＡＪ４２０４１６．１、ＡＫ３１３３４３．１、ＡＬ８３２６４７．２、ＡＹ１９６２９３．１、ＢＣ０７４８８５．２、ＢＣ０７４８８６、ＢＣ１０９１０１、ＢＣ１０９１０２．１、Ｍ９７３４７．１、ＢＡＧ３６１４６．１、ＣＡＤ８９９５６．１、ＡＡＨ７４８８５．１、ＡＡＨ７４８８６．１、ＡＡＩ０９１０２．１、ＡＡＩ０９１０３．１、ＡＡＡ３５９１９．１、ＡＡＨ１７０３２、Ｏ９５３９５、ＮＰ＿００４７４２、ＥＡＷ７７５７２、ＮＰ＿００４７４２．１、ＢＣ０１７０３２、ＡＦ１０２５４２．１、ＡＡＤ１０８２４．１、ＡＦ０３８６５０．１、ＮＭ＿００４７５１．２、Ｑ９Ｐ１０９、ＮＰ＿０５７６７５、ＥＡＷ９５７５１、ＡＦ１３２０３５．１、ＡＡＦ６３１５６．１、およびＮＰ＿０５７６７５．１が挙げられるが、これらに限定されない。第１のポリペプチドは、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える、糖鎖による質量分を含有する。
【００２３】
融合タンパク質の中で、「作動可能に連結された」という用語は、第１のポリペプチドをＯ−結合グリコシル化および／またはＮ−結合グリコシル化することが可能になるように、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドが化学的に連結している（最も一般的には、ペプチド結合などの共有結合によって）ことを指すものとする。融合ポリペプチドをコードする核酸を指して用いる場合、作動可能に連結されたという用語は、ムチンポリペプチドをコードする核酸と非ムチンポリペプチドをコードする核酸が互いにインフレーム融合していることを意味する。非ムチンポリペプチドは、ムチンポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【００２４】
ＳＩ融合タンパク質は、１つまたは複数の追加成分に連結される。例えば、ＳＩ融合タンパク質は、ＳＩ融合タンパク質配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合したＧＳＴ融合タンパク質にさらに連結することができる。そのような融合タンパク質により、ＳＩ融合タンパク質の精製を容易にすることができる。あるいは、ＳＩ融合タンパク質は、固体支持体にさらに連結することができる。さまざまな固体支持体が当業者に公知である。例えば、ＳＩ融合タンパク質は、例えば、金属化合物、シリカ、ラテックス、ポリマー材料、マイクロタイタープレート、ニトロセルロース、またはナイロンまたはそれらの組み合わせで作られた粒子に連結される。固体支持体に連結されたＳＩ融合タンパク質は、志賀毒素産生細菌および志賀様毒素産生細菌によって引き起こされる感染を診断またはスクリーニングするツールとして使用することができる。
【００２５】
融合タンパク質は、異種性シグナル配列（すなわち、ムチン核酸によってコードされるポリペプチド内に存在しないポリペプチド配列）をそのＮ末端に含む。例えば、天然のムチン糖タンパク質シグナル配列を取り出して別のタンパク質からのシグナル配列と置き換えることができる。ある種の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）において、異種性シグナル配列の使用によってポリペプチドの発現および／または分泌を増加させることができる。
【００２６】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技法によって作製することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、従来技法に従って、例えば、ライゲーション用の平滑末端または付着末端の利用、適当な末端をもたらす制限酵素消化、必要に応じて突出末端の埋め込み、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションにより、インフレームで互いにライゲーションさせる。融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含めた従来技法によって合成される。あるいは、２つの連続的な遺伝子断片間に相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行い、続いて遺伝子断片をアニーリングし再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年を参照されたい）。さらに、融合成分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。ムチンをコードする核酸をそのような発現ベクターにクローニングし、それによって融合成分を免疫グロブリンタンパク質にインフレームで連結することができる。
【００２７】
ＳＩ融合ポリペプチドは、二量体、三量体または五量体などのオリゴマーとして存在しうる。ＳＩ融合ポリペプチドは二量体であることが好ましい。
【００２８】
第１のポリペプチド、および／または第１のポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野で公知のムチンをコードする配列を用いて構築される。ムチンポリペプチドおよびムチンポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源としては、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ６６３６２５およびＮＭ１４５６５０、ＣＡＤ１０６２５およびＡＪ４１７８１５、ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４、ＸＰ００６８６７およびＸＭ００６８６７ならびにＮＰ００３３１７７７およびＮＭ００９１５１が挙げられ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００２９】
ムチンポリペプチド成分は、天然に存在するムチン配列（野生型）に、糖鎖含有量の増加（突然変異していない配列と比べて）をもたらす改変を有する変異型ムチンポリペプチドとして提供される。本明細書で用いる天然に存在する（野生型）ムチン配列における改変とは、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列において１つまたは複数の置換、付加または欠失を含み、それによって、コードされるタンパク質に１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失が導入される。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準の技法によって、天然に存在するムチン配列中に導入することができる。
【００３０】
例えば、変異型ムチンポリペプチドは、野生型ムチンと比較して追加的なＯ−結合グリコシル化部位を含んだ。あるいは、変異型ムチンポリペプチドは、野生型ムチンポリペプチドと比較してセリン残基、トレオニン残基またはプロリン残基の数の増加をもたらすアミノ酸配列の改変を含む。この糖鎖含有量の増加は、当業者に公知の方法によって、ムチンのタンパク質と糖鎖の比を決定することにより評価可能である。
【００３１】
あるいは、ムチンポリペプチド成分は、天然に存在するムチン配列（野生型）に、Ｏ−結合グリコシル化部位が多いムチン配列またはより高度なグリコシル化をもたらすペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼによって好んで認識されるムチン配列をもたらす改変を有する変異型ムチンポリペプチドとして提供される。
【００３２】
一部の実施形態において、ムチンポリペプチド成分は、タンパク質分解に対して耐性が高い（突然変異していない配列と比べて）ムチン配列をもたらす、天然に存在するムチン配列（野生型）に改変を有する変異型ムチンポリペプチドとして提供される。
【００３３】
第１のポリペプチドは全長ＰＳＧＬ−１を含む。あるいは、第１のポリペプチドは、全長に満たないＰＳＧＬ−１ポリペプチド、例えばＰＧＳＬ−１ポリペプチドの機能的断片を含む。例えば、第１のポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドの４００隣接アミノ酸未満の長さ、例えば、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドの３００、２５０、１５０、１００または５０隣接アミノ酸以下の長さ、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドの少なくとも２５隣接アミノ酸の長さである。第１のポリペプチドは、例えば、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分である、またはその一部分を含む。代表的なＰＳＧＬ−１ポリペプチドおよび核酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ００６８６７；ＸＭ００６８６７；ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４が挙げられる。
【００３４】
第２のポリペプチドは可溶性であることが好ましい。一部の実施形態において、第２のポリペプチドは、ＳＩ融合ポリペプチドと第２のムチンポリペプチドの連関を容易にする配列を含む。第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一領域を含む。「少なくとも一領域」とは、軽鎖、重鎖、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域またはそれらの任意の断片などの免疫グロブリン分子の任意の部分を含むことを意味する。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５１６，９６４号、同第５，２２５，５３８号、同第５，４２８，１３０号、同第５，５１４，５８２号、同第５，７１４，１４７号および同第５，４５５，１６５号に記載されている。
【００３５】
第２のポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、第２のポリペプチドは、全長に満たない免疫グロブリンポリペプチド、例えば重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖ、またはＦｃを含む。第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含むことが好ましい。第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含むことがより好ましい。
【００３６】
第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能よりも低いエフェクター機能を有する。あるいは、第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域と同様またはそれより高いエフェクター機能を有する。Ｆｃのエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃ受容体結合性、補体結合およびＴ細胞除去活性が挙げられる（例えば米国特許第６，１３６，３１０号を参照されたい）。Ｔ細胞除去活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性をアッセイする方法は当技術分野で公知である。一実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｆｃ受容体に対する親和性が低いまたは親和性を有さない。あるいは、第２のポリペプチドは補体タンパク質Ｃ１ｑに対する親和性が低いまたは親和性を有さない。
【００３７】
本発明の別の態様は、ムチンポリペプチド、またはその派生体、断片、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。ベクターは、免疫グロブリンポリペプチド、またはその派生体、断片、類似体または相同体をコードする核酸に作動可能に連結された、ムチンポリペプチドをコードする核酸を含有する。さらに、ベクターは、α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。本明細書で用いる「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を運搬する能力がある核酸分子を指す。ベクターの１種は「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントをその中にライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲーションすることができる。ある種のベクターは、それが導入された宿主細胞において自己複製する能力がある（例えば、細菌の複製起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導する能力がある。本明細書ではそのようなベクターを「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ技法において有益である発現ベクターは多くの場合プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」とは、プラスミドがベクターの最も一般的な使用形態であるので、互換的に使用することができる。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの、同等の機能を果たすような他の形態の発現ベクターを含むものとする。
【００３８】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞において核酸が発現するのに適した形態で含み、これは組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つまたは複数の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターの中で、「作動可能に連結された」とは、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現が可能になるように（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入された場合は宿主細胞において）制御配列（複数可）に連結されていることを意味するものとする。
【００３９】
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。そのような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、（１９９０年）に記載されている。制御配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を誘導するものを含む（例えば、組織特異的制御配列）。当業者には当然のことながら、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に左右され得る。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質または融合ペプチド（例えば、ＳＩ融合ポリペプチド、ＳＩ融合ポリペプチドの突然変異型など）を含めた、タンパク質またはペプチドを作製することができる。
【００４０】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞においてＳＩ融合ポリペプチドを発現させるために設計することができる。例えば、ＳＩ融合ポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、（１９９０年）でさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳することができる。
【００４１】
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質か非融合タンパク質のいずれかの発現を誘導する構成プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて行われる。融合ベクターは、その中にコードされているタンパク質、通常組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつものアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは一般に３つの目的にかなう：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を増加させること；および（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして働くことにより組換えタンパク質の精製を助長すること。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、融合成分と組換えタンパク質の接合部にタンパク質分解の切断部位を導入して、組換えタンパク質を融合成分から分離し、続いて融合タンパク質を精製できるようにする。そのような酵素、および同種の認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８年、Ｇｅｎｅ ６７巻、３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合性タンパク質、またはプロテインＡを標的の組換えタンパク質に融合する。
【００４２】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら、（１９８８年）、Ｇｅｎｅ、６９巻、３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、（１９９０年）、６０〜８９頁）が挙げられる。
【００４３】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質の発現を最大にするための１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解性切断する能力に障害がある宿主細菌においてタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、（１９９０年）１１９〜１２８頁を参照されたい。別の戦略は、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を、各アミノ酸に対する個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて優先的に使用されるものになるように改変することである（例えば、Ｗａｄａら、１９９２年、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０巻、２１１１〜２１１８頁を参照されたい）。本発明の核酸配列のそのような改変は、標準のＤＮＡ合成技法によって行うことができる。
【００４４】
ＳＩ融合ポリペプチド発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおいて発現させるためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７年、ＥＭＢＯＪ．、６巻、２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２年、Ｃｅｌｌ、３０巻、９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７年、Ｇｅｎｅ、５４巻、１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００４５】
あるいは、ＳＩ融合ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ細胞またはＳＦ９細胞）においてタンパク質を発現させるために入手可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、１９８３年、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、３巻、２１５６〜２１６５頁）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０巻、３１〜３９頁）が挙げられる。
【００４６】
本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ、３２９巻、８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７年、ＥＭＢＯ Ｊ．、６巻、１８７〜１９５頁）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用する場合、発現ベクターの調節機能は、多くの場合ウイルス制御要素によってもたらされる。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス４０に由来する。原核細胞と真核細胞の両方に適した他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年の第１６章および第１７章を参照されたい。
【００４７】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」と「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書では互換的に用いられる。そのような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の後代または潜在的な後代も指すことが理解されよう。突然変異か環境の影響のいずれかによって、続く世代にある種の一時的変異が起こり得るため、そのような後代は、実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で使用する用語の範囲内に含める。
【００４８】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、ＳＩ融合ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅなどの昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（ヒト、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯＳ細胞など）において発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００４９】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技法またはトランスフェクション技法によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、宿主細胞に外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための、当技術分野で認められているさまざまな技法を指すものとし、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション法、リポフェクション法、または電気穿孔法が挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）、および他の実験マニュアルで見ることができる。
【００５０】
哺乳動物細胞の安定トランスフェクションに関して、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技法によっては、ごく一部の細胞のみがそのゲノムに外来ＤＮＡを組み込み得ることが公知である。これらの組み込み体を同定し選択するために、一般に、選択マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、対象の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。さまざまな選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する選択マーカーが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、融合ポリペプチドをコードするベクターと同じベクターで宿主細胞に導入することができ、または別々のベクターで導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死ぬ）。
【００５１】
培養した宿主原核細胞または培養した宿主真核細胞などの本発明の宿主細胞は、ＳＩ融合ポリペプチドを作製する（すなわち、発現させる）ために使用することができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いてＳＩ融合ポリペプチドを作製する方法をさらに提供する。一実施形態において、この方法は、本発明の宿主細胞（ＳＩ融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入された宿主細胞）を、ＳＩ融合ポリペプチドが作製されるように適切な培地で培養する工程を含む。別の実施形態において、この方法は、培地または宿主細胞からＳＩポリペプチドを単離する工程をさらに含む。
【００５２】
ＳＩ融合ポリペプチドは、抽出、沈降、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの従来の条件に従って単離し、精製することができる。例えば、免疫グロブリン融合タンパク質は、融合タンパク質のＦｃ部分に選択的に結合する、固定化プロテインＡまたは固定化プロテインＧを含有するカラムに溶液を通すことによって精製することができる。例えば、Ｒｅｉｓ， Ｋ． Ｊ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３２巻、３０９８〜３１０２頁（１９８４年）、ＰＣＴ出願、公開番号ＷＯ８７／００３２９を参照されたい。次いで、カオトロピック塩を用いた処理によって、または酢酸水溶液（１Ｍ）を用いた溶出によって、融合ポリペプチドを溶出することができる。
【００５３】
あるいは、本発明によるＳＩ融合ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて化学合成することができる。ポリペプチドの化学合成については、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、Ｂｏｄａｓｎｓｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９８８年、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻、２４１〜２４７頁、（１９８６年）；Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、３０巻、７０５〜７３９頁（１９８７年）； Ｋｅｎｔ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７巻、９５７〜９８９頁（１９８８年）、およびＫａｉｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３巻、１８７〜１９８頁、（１９８９年）に記載されている。ポリペプチドは、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないように標準のペプチド精製技法を用いて精製する。「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言葉は、ペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質からペプチドを分離した、ペプチド調製物を含む。一実施形態において、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言葉は、約３０％（乾燥重量）未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質、さらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチド調製物を含む。
【００５４】
ポリペプチドの化学合成により、Ｄ−アミノ酸および他の小さい有機分子を含めた、修飾されたアミノ酸または非天然アミノ酸の組み込みが容易になる。ペプチドの１つまたは複数のＬ−アミノ酸の、対応するＤ−アミノ酸アイソフォームへの置き換えを用いて、酵素的加水分解に対するペプチドの抵抗性を増加させ、生物活性のあるペプチドの１つまたは複数の特質、すなわち受容体結合性、機能的効力または作用の持続を増強することができる。例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９３年、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、３６巻、２５８５〜２５９４頁、Ｋｉｒｂｙら、１９９３年、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、３６巻、３８０２〜３８０８頁；Ｍｏｒｉｔａら、１９９４年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３５３巻、８４〜８８頁；Ｗａｎｇら、１９９３年、Ｉｎｔ．Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、４２巻、３９２〜３９９頁；ＦａｕｃｈｅｒｅおよびＴｈｉｕｎｉｅａｕ、１９９２年、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．、２３巻、１２７〜１５９頁を参照されたい。
【００５５】
ペプチド配列に共有結合架橋を導入することにより、ポリペプチド主鎖を立体配座的かつ組織分布的に制約することができる。この戦略は、効力、選択性および安定性が増加した、融合ポリペプチドのペプチド類似体を開発するために使用することができる。環状ペプチドの立体配座エントロピーは、対応する直鎖状ペプチドよりも低いため、非環状類似体よりも環状類似体に対して、より少ないエントロピー減少で特異的な立体配座が採用される可能性があり、その結果、結合自由エネルギーがより有利なものになる。大環状化は、多くの場合、ペプチドのＮ末端とＣ末端の間、側鎖とＮ末端もしくはＣ末端の間［例えば、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６をｐＨ８．５で用いて］（Ｓａｍｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３７巻、５１８２〜５１８５頁（１９９６年））、または２つのアミノ酸側鎖間にアミド結合を形成することによってなされる。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ、３９巻、５１〜１２４頁（１９８８年）を参照されたい。可動性を低減させるために、直鎖配列にジスルフィド架橋も導入される。例えば、Ｒｏｓｅら、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ、３７巻、１〜１０９頁（１９８５年）；Ｍｏｓｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１０６巻、５０５〜５１２頁（１９８２年）を参照されたい。さらに、システイン残基のペニシラミン（Ｐｅｎ、３−メルカプト−（Ｄ）バリン）での置き換えが、一部のオピオイド受容体相互作用の選択性を増加させるために用いられる。ＬｉｐｋｏｗｓｋｉおよびＣａｒｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、およびＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｇｕｔｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２８７〜３２０頁（１９９５年）。
志賀毒素および／または志賀様毒素の宿主細胞への結合を減少させる方法
志賀毒素および／または志賀様毒素の細胞表面への結合は、細胞を本発明のＳＩ融合ペプチドと接触させることによって阻害される（例えば減少する）。ＳＩ融合タンパク質は、細菌毒素の細胞表面への結合を立体的に阻害し、その結果、細菌毒素の感染を予防する。あるいは、細胞表面への志賀毒素および／または志賀様毒素の結合は、志賀毒素および／または志賀様毒素を本発明のＳＩ融合ペプチドと接触させ、それによってＳＩ融合ペプチドが志賀毒素および／または志賀様毒素に結合し、その結果、志賀毒素および／または志賀様毒素の天然エピトープへの結合が予防されることによって阻害され（例えば減少し）、その結果、細菌毒素の感染が予防される。志賀毒素または志賀様毒素は、例えば、志賀毒素、志賀様毒素１または志賀様毒素２である。志賀様毒素産生細菌は、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉおよび／またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａである。
【００５６】
付着の阻害は、細胞内部移行の減少およびタンパク質合成阻害の減少を特徴とする。ＳＩ融合ペプチドを対象に全身投与および／または直腸内投与することによって、ＳＩペプチドを対象の１つまたは複数の細胞と接触させる。ＳＩペプチドは、細菌毒素の細胞表面への結合および／または細胞への内部移行を減少させる（例えば、阻害する）のに十分な量を投与する。あるいは、志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌を直接ＳＩペプチドと接触させる。志賀毒素／志賀様毒素の細胞表面への結合は、当技術分野で公知の標準の免疫細胞化学アッセイを用いて、例えば、放射活性を用いて毒素の細胞への結合を測定することによって、または他の手段、標識化毒素によって、抗志賀毒素抗体を用いて付着した毒素を検出することによって、または細胞に毒素を接触もしくは暴露させた後のタンパク質合成レベルを測定することによって測定される。
【００５７】
この方法は、志賀毒素および／または志賀様毒素の感染または志賀毒素および／または志賀様毒素に関連付けられる疾患の症状を緩和するのに有用である。志賀毒素および／または志賀様毒素の感染に付随する症状としては、例えば、下痢、出血性大腸炎および／または溶血性尿毒症症候群が挙げられる。
【００５８】
本明細書に記載の方法により、本明細書に記載のような志賀毒素および／または志賀様毒素の感染または障害の１つまたは複数の症状の重症度の軽減またはその緩和がもたらされる。志賀毒素および／または志賀様毒素の感染または志賀毒素および／または志賀様毒素による感染に付随する障害は、一般に、標準の方法論を用いて、医師によって診断および／またはモニタリングされる。
【００５９】
対象は、例えば、任意の哺乳動物、例えばヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタである。治療は、細菌毒素の感染または障害の診断に先立って施される。あるいは、治療は、対象が感染した後に施される。
【００６０】
治療の効果は、特定の細菌毒素感染または細菌毒素感染に付随する障害を診断または治療するための任意の公知の方法に関連して決定される。細菌毒素感染または障害の１つまたは複数の症状が緩和されることで、化合物が臨床上の利点を付与することが示される。
ＳＩ融合ポリペプチドまたはＳＩ融合ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物
本発明のＳＩ融合タンパク質、またはそれらの融合タンパク質をコードする核酸分子（本明細書では「治療用物質」または「有効化合物」とも称される）、およびそれらの派生体、断片、類似体および相同体は、投与するために適した医薬組成物中に組み込むことができる。そのような組成物は、一般に、核酸分子、タンパク質、または抗体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」とは、医薬投与に適合する任意の、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張液および吸収遅延剤などを含めるものとする。適切な担体は、本明細書に参照により組み込まれている、当分野で標準の参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液（ｆｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび固定油などの非水性ビヒクルも使用することができる。医薬として有効な物質へのそのような媒体および作用剤の使用は当技術分野で周知である。従来の媒体または作用剤は、どれも有効化合物と適合しない場合を除いて、組成物にそれらを使用することが企図されている。補充の有効化合物も組成物中に組み込むことができる。
【００６１】
本明細書で開示している有効作用剤も、リポソームとして製剤化することができる。リポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２巻、３６８８頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７７巻、４０３０頁（１９８０年）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載のような、当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間を増大させたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【００６２】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを定義済みの孔サイズのフィルターを通して押し出し、所望の直径を有するリポソームを得る。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、目的とする投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば吸入）、経皮投与（すなわち局所的）、経粘膜投与、および直腸内投与が挙げられる。非経口施用、皮内施用、または皮下施用するために使用する溶液または懸濁液としては、下記の構成材料を挙げることができる：注射用の水などの滅菌希釈剤、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための作用剤。ｐＨは、塩化水素または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨て注射器または多回用量バイアルに封入することができる。
【００６４】
注射用に使用するのに適した医薬組成物は、注射用滅菌溶液または注射用滅菌分散系を即席で調製するための滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌分散系および滅菌粉末を含む。静脈内投与するための適切な担体としては、生理食塩水、静菌性水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易な注射性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）がある限りは流体であるべきである。組成物は、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散系の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。微生物作用の予防は、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現し得る。多くの場合、等張剤、例えば、砂糖、マニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【００６５】
滅菌注射用溶液は、必要量の有効化合物（例えばＳＩ融合タンパク質）を、上記で列挙した成分の１種またはそれらの組み合わせを有する適当な溶媒に組み込み、その後必要に応じてろ過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散系は、有効化合物を、塩基性の分散媒および上記で列挙した成分からの必要な他成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合の調製方法は、有効成分の粉末と任意の追加的な所望成分を、前もって滅菌ろ過したそれらの溶液から得る、真空乾燥および凍結乾燥である。
【００６６】
経口用組成物は、一般に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入することができ、または錠剤に圧縮することができる。治療的に経口投与するために、有効化合物を賦形剤と一緒に組み込み、錠剤、トローチ剤、またはカプセルの形態で使用することができる。経口用組成物は、うがい薬として使用する液体担体を用いて調製することもでき、液体担体中の化合物は経口的に施用され、ゆすいで（ｓｗｉｓｈ）吐き出されるまたは嚥下される。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ剤などは、下記の成分、または似た性質の化合物をどれでも含んでよい：微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動性促進剤；ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなどの香味料。
【００６７】
吸入によって投与するために、化合物は、適切な高圧ガス、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくは加圧ディスペンサーからのエアロゾル噴霧剤の形態、またはネブライザーの形態で送達される。
【００６８】
経粘膜的または経皮的な手段によっても全身投与することができる。経粘膜的または経皮的に投与するために、浸透させる関門に対して適当な浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与用としては、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻薬または座薬を使用することによって実現可能である。経皮投与するために、有効化合物は軟膏剤、膏薬、ゲル、またはクリームに、当技術分野で一般に公知の通り製剤化される。
【００６９】
化合物は座薬の形態（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の座薬基剤と一緒に）または直腸内に送達するための保持かん腸剤の形態で調製することもできる。
【００７０】
有効化合物は、埋め込みおよびマイクロカプセル化送達系を含めた制御放出製剤など、その化合物が体から迅速に排出されることから保護するであろう担体と一緒に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生物分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、薬学的に許容できる担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【００７１】
経口用組成物または非経口用組成物は、投与を簡単にするため、および用量を均一にするために単位剤形に製剤化される。本明細書で用いる単位剤形とは、治療される対象に対する単位剤形に適合させた、物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果を生ずるよう計算された、所定量の有効化合物を含有する。本発明の単位剤形の規格は、有効化合物特有の特性および実現されるべき特定の治療効果、およびそのような、個体を治療するための有効化合物の配合技術分野における固有の制限によって規定され、またそれらに直接左右される。
【００７２】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与によって（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）、または定位的注射によって（例えば、Ｃｈｅｎら、１９９４年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１巻、３０５４〜３０５７頁を参照されたい）対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含んでよく、または、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた緩慢放出マトリックスを含んでよい。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターが、組換え細胞から無傷で作製され得る場合、この医薬調製物は遺伝子送達系を生じる１つまたは複数の細胞を含んでよい。
【００７３】
必要に応じて、持続的放出調製物を調製することができる。持続的放出調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続的放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル、またはポリビニルアルコール）、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−Ｌ−グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロイドで構成される注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーによって、分子を１００日間にわたって放出することが可能になるが、ある種のヒドロゲル放出タンパク質では、それよりも短期間になる。
【００７４】
医薬組成物は、投与の説明書と一緒に容器、パック、またはディスペンサーの中に含めることができる。
【００７５】
本発明を、下記の非限定的な実施例でさらに例示する。
【実施例】
【００７６】
（実施例１）
Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮａｃαグリカンおよび／またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃグリカンを担持するＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１のＩｇＧ Ｆｃ融合物を分泌する安定な細胞系のエンジニアリング
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現プラスミドを、内生のα１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するＭ．Ｂｒａｓｓｉｃａｅ昆虫細胞に安定にトランスフェクトして所望のエピトープ、Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃαを産生させる。あるいは、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現プラスミドを、α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼおよびコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと一緒にＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトしてＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（血液型Ｐ１エピトープ）構造を産生させる。あるいは、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現プラスミドを、α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ、１つまたは複数のペプチドＧａｌＮＡｃＴ、および場合によって、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミンを作り出すことができる１つまたは複数の酵素、ならびにＥ．ｃｏｌｉ細胞中に存在する糖鎖前駆体からのＵＤＰ−ＧａｌおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと一緒にＥ．Ｃｏｌｉ細胞にトランスフェクトして、Ｇａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（血液型Ｐ１エピトープ）構造を産生させる。種々の選択薬物に対する耐性に基づいて安定なクローンを選択する。
細胞培養
Ｍ．Ｂｒａｓｓｉｃａｅ細胞を、適当な選択培地で培養する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）で培養する。この選択培地は、１種または複数種の薬物選択因子（例えば、プロマイシン、ハイグロマイシンＢ、Ｇ４１８および／またはゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ））を含有する。
発現プラスミドの構築
α１，４ＧａｌＴ発現プラスミドを構築し、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現プラスミドを、Ｌｉｕら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６３巻、１６７３頁（１９９７年）に記載の通り構築する。コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ発現プラスミドを、Ｌｉｕら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５巻（６号）、５７１頁、（２００５年）に記載の通り構築する。
ＤＮＡトランスフェクションとクローン選択：Ｍ．Ｂｒａｓｓｉｃａｅ細胞
Ｍ．Ｂｒａｓｓｉｃａｅ細胞を、７５ｃｍ２のＴ型フラスコに播種し、およそ２４時間後または細胞集密度が７０〜８０％に達した時にトランスフェクトする。トランスフェクトした２４時間後、各Ｔ型フラスコ内の細胞をいくつかの１００ｍｍペトリ皿に分割し、薬物選択因子（例えば、プロマイシン、ハイグロマイシンｂ、Ｇ４１８および／またはゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ））を含有する選択培地でインキュベートする。およそ２週間後に薬物耐性クローンが形成される。クローンを顕微鏡の下で同定し、ピペットマンを用いて手で選び取る。選択されたコロニーを９６ウェルプレート中、選択薬物の存在下でさらに２週間培養する。細胞が８０〜９０％の集密度に達したら細胞培養上清を回収する。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの濃度を、ヤギの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いてＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウェスタンブロットによって評価する。
ＤＮＡトランスフェクションとクローン選択：ＣＨＯ−Ｋ１細胞
接着ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、７５ｃｍ２のＴ型フラスコに播種し、およそ２４時間後または細胞集密度が７０〜８０％に達した時にトランスフェクトする。トランスフェクトするために修飾ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション法を使用することができる（Ｂｏｕｓｓｉｆ， Ｏ．ら、１９９５年、Ｈｅ， Ｚ．ら、２００１年）。トランスフェクトした２４時間度、各Ｔ型フラスコ内の細胞をいくつかの１００ｍｍペトリ皿に分割し、１種または複数種の薬物選択因子（例えば、プロマイシン、ハイグロマイシンｂ、および／またはＧ４１８）を含有する選択培地でインキュベートする。およそ２週間後に薬物耐性クローンが形成される。クローンを顕微鏡の下で同定し、ピペットマンを用いて手で選び取る。選択されたコロニーを９６ウェルプレート中、選択薬物の存在下でさらに２週間培養する。細胞が８０〜９０％の集密度に達したら細胞培養上清を回収する。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの濃度を、ヤギの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いてＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウェスタンブロットによって評価する。最も高いＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現を有するクローンを、α１，４ＧａｌＴをコードするプラスミドでトランスフェクトし、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂクローンの選択に使用したものと異なる薬物選択因子を用いて選択する。耐性クローンをＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって単離し、特徴付けする。
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ上のＧａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα糖鎖エピトープおよびＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃ糖鎖エピトープの密度および酵素結合免疫吸着検定法を用いたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの定量化
細胞培養上清中の組換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ濃度、およびその相対的なαＧａｌエピトープ密度を、下記の通り２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定することができる。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、２０μ／ｍｌの濃度のアフィニティー精製したポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｃａｔ．ｎｒ．５５４８２；Ｃａｐｐｅｌ／Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）で、４℃で一晩コーティングする。プレートをＰＢＳ中１％ＢＳＡで１時間ブロッキングする。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを含有する上清を４時間インキュベートし、次いで０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄する。洗浄後、プレートを、１：３，０００希釈のペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｃａｔ．ｎｏ．Ａ−９９１７；Ｓｉｇｍａ）、または１：２，０００希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートＧＳＡ Ｉ ＩＢ４−レクチン（ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ−５３９１；Ｓｉｇｍａ）で２時間インキュベートする。結合したペルオキシダーゼコンジュゲート抗体またはペルオキシダーゼコンジュゲートＧＳＡレクチンを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン二塩酸塩（ｃａｔ．ｎｒ．Ｔ−３４０５；Ｓｉｇｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で可視化する。２ＭのＨ２ＳＯ４によって反応を停止させ、プレートを４５０ｎｍで読み取る。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ濃度を、融合タンパク質作製に用いた培地中または１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に再懸濁させた精製したマウスＩｇＧ Ｆｃ断片（ｃａｔ．Ｎｒ．０１５−０００−００８；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）の希釈系列を較正に用いて見積もる。エピトープ密度を、２つのＥＬＩＳＡからの相対的なＯ．Ｄ．を比較することによって決定する（ＧＳＡ反応性／抗マウスＩｇＧ反応性）。
【００７７】
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細菌毒素感染の阻害
志賀毒素および／または志賀様毒素と、志賀毒素および／または志賀様毒素の細胞変性作用に感受性の内皮細胞を用いて、感受性宿主細胞における毒素と細胞表面の結合、およびタンパク質合成の妨害を予防することに関する上記の融合タンパク質の阻害能を評価する。
【００７８】
（実施例３）
投与経路
Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮａｃαグリカンおよび／またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃグリカンを担持する組換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（すなわち、ＳＴＩ融合タンパク質）は、溶血性尿毒症症候群を予防するために全身投与される。ＳＴＩ融合タンパク質は、感染部位からの伝播を予防するために直腸内投与される。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載したが、前述の説明は例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことを意図している。他の態様、利点、および改変は以下の特許請求の範囲内である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して志賀毒素産生細菌および志賀様毒素産生細菌による感染を治療または予防するための組成物および方法に関し、より具体的には、志賀毒素および志賀様毒素を阻害する糖鎖エピトープを含む融合ポリペプチドを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
志賀毒素および志賀様毒素は、毒性のＡサブユニットと５つの糖鎖結合性Ｂサブユニットからなる。志賀毒素はＳｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅによって産生される。この毒素は、Ｇｂ３（Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）発現細胞に結合し、内部移行するとタンパク質合成を阻害し、それにより感染個体において下痢、出血性大腸炎または溶血性尿毒症症候群が生じる。Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの感染によって誘発されるサイトカインにより、一部の細胞においてＧｂ３産生が引き起こされ得ることが示されている。志賀様毒素１は志賀毒素とほぼ同一であり、同様にＧｂ３を認識する。志賀様毒素２は違う形態で存在し、その大部分は同様にＧｂ３を認識するが、ある形態はＧｂ４（ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）にも結合することが示されている。複数の研究により、糖鎖リガンドの脂質部も認識において重要な役割を果たしていることが示されている。志賀様毒素１および志賀様毒素２は主に腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）によって産生されるが、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅによっても産生される。志賀毒素と志賀様毒素間に類似性があるにもかかわらず、細胞への作用および宿主免疫系との相互作用に関しては相違がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、志賀毒素および／または志賀様毒素の宿主細胞表面への結合に影響する（すなわち、遮断する、阻害する）糖鎖エピトープが、高密度で、ムチン型タンパク質主鎖上の種々のコア糖鎖によって特異的に発現され得るという発見に一部基づいている。このポリペプチドは、本明細書において志賀毒素阻害性（ＳＴＩ）融合タンパク質またはＳＩポリペプチドと称される。公知の細菌毒素結合活性を有する糖鎖決定基で覆われた十分なＯ−結合型グリカンを担持するこれらの重度にグリコシル化された組換え型タンパク質は、デコイとして、また、例えば気道または消化管における細菌毒素感染を特異的に予防する（例えば立体的に阻害する）ように働き得る。この融合タンパク質は、毒性が低く、薬物に対する細菌の耐性を誘発する危険性が少ない。
【０００４】
一態様において、本発明は、Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα糖鎖エピトープおよび／またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃ糖鎖エピトープを担持し、第２のポリペプチドに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。第１のポリペプチドはこれらのエピトープに対して多価である。第１のポリペプチドは、例えば、ＰＳＧＬ−１またはその一部分などのムチンポリペプチドである。ムチンポリペプチドはＰＳＧＬ−１の細胞外部分であることが好ましい。
【０００５】
第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一領域を含む。例えば、第２のポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドの一領域を含む。あるいは、第２のポリペプチドは免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む。
【０００６】
融合ポリペプチドは多量体である。融合ポリペプチドは二量体であることが好ましい。
【０００７】
ＳＩ融合ポリペプチドをコードする核酸、ならびにここに記載したＳＩ融合ポリペプチドコード核酸を含有するベクターおよびここに記載したベクターまたは核酸を含有する細胞も、本発明に含まれる。場合によって、ベクターは、所望の糖鎖エピトープを合成するために必要な１種または複数種のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む。例えば、ベクターはα１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸、および場合によってコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする核酸を含有する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、志賀毒素および／または志賀様毒素の細胞表面への結合を阻害する（例えば減少させる）方法を提供する。志賀毒素産生細菌および／もしくは志賀様毒素産生細菌または遊離の志賀毒素および志賀様毒素をＳＩ融合ポリペプチドと接触させることによって結合を阻害する。本発明は、患者における志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染、または志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染に付随する障害の症状を、志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染を受けている、またはそれを生じる危険性のある患者を識別し、その患者に本発明の融合ポリペプチドを投与することによって予防または緩和する方法も特色とする。細菌は、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｔｅｎｔｅｒｉａｅ（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、Ｅｓｃｈｅｒｉａ Ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、腸管出血性大腸菌、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）である。
【０００９】
対象は、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物である。対象は、志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染、または志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染に付随する障害を受けている、またはそれを生じる危険性がある。志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染、または志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌の感染に付随する障害を受けている、またはそれを生じる危険性がある対象は、当技術分野で公知の方法によって識別される。
【００１０】
本発明の融合ポリペプチドを含む医薬組成物も本発明に含まれる。
【００１１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似しているまたは同等である方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で挙げた全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照により組み込まれている。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書に支配される。さらに、材料、方法および実施例は例示しているのみであり、限定するものではない。
【００１２】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、志賀毒素および／または志賀様毒素の結合活性に影響する（すなわち、遮断する、阻害する）糖鎖エピトープが、糖タンパク質、例えばムチン型タンパク質主鎖上に高密度で特異的に発現され得るという発見に一部基づいている。このより高い密度の糖鎖エピトープにより、単価のオリゴ糖および野生型、例えば未変性の非組換えで発現された糖タンパク質と比較して結合価および親和性が増加する。
【００１４】
志賀毒素産生細菌および志賀様毒素産生細菌は、特異的な細胞表面糖脂質であるＧｂ３（Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）および／またはＧｂ４（ＧａｌＮＡｃβ３Ｇａｌα４Ｇａｌβ４Ｇｌｃβ１Ｃｅｒ）を介して宿主細胞に結合する。宿主細胞の表面に結合すると、毒素は内部移行し、標的細胞内部のタンパク質合成の阻害を引き起こす。細胞に入った後、タンパク質はＮ−グリコシダーゼとして機能し、リボソームを含むＲＮＡからいくつかの核酸塩基を切断し、それによってタンパク質合成が停止し、その結果、下痢、出血性大腸炎および／または溶血性尿毒症症候群が生じる。
【００１５】
本発明は、志賀毒素および／または志賀様毒素と宿主細胞表面との間の結合相互作用に影響を及ぼす（すなわち、遮断する、阻害する）のに有用な、多数のＧａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃαエピトープおよび／またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃエピトープを含有する糖タンパク質−免疫グロブリン融合タンパク質（本明細書では「ＳＩ融合タンパク質またはＳＩ融合ペプチド」と称する）を提供する。エピトープは末端である、すなわちグリカンの末端にある。ＳＩ融合タンパク質は、志賀毒素および／または志賀様毒素の細胞表面への結合を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％阻害する。例えば、ＳＩ融合タンパク質は、志賀毒素、志賀様毒素１および／または志賀様毒素２の宿主細胞表面への結合を阻害するのに有用である。
【００１６】
ＳＩ融合ペプチドは、志賀毒素および／または志賀様毒素を阻害する結合活性において、糖鎖のモルベースで遊離のサッカライドと比較して効率的である。ＳＩ融合ペプチドは、同等量の遊離のサッカライドと比較して、２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、８０倍、１００倍以上多い量の毒素を阻害する。
融合ポリペプチド
さまざまな態様において、本発明は、糖タンパク質、例えばムチンポリペプチドの少なくとも一部分を含有し、第２のポリペプチドに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。本明細書で使用する「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」とは、非ムチンポリペプチドに作動可能に連結された糖タンパク質ポリペプチドの少なくとも一部分を含む。
【００１７】
「ムチンポリペプチド」とは、ムチンドメインを有するポリペプチドを指す。ムチンポリペプチドは、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個またはそれ以上のムチンドメインを有する。ムチンポリペプチドは、Ｏ−グリカンで置換されたアミノ酸配列を特徴とする任意の糖タンパク質である。例えば、ムチンポリペプチドは、アミノ酸が１つおき、または２つおきにセリンまたはトレオニンになっている。ムチンポリペプチドは分泌タンパク質である。あるいは、ムチンポリペプチドは細胞表面タンパク質である。
【００１８】
ムチンドメインは、アミノ酸のトレオニン、セリンおよびプロリンに富み、そこでオリゴ糖がＮ−アセチルガラクトサミンを介してヒドロキシアミノ酸（Ｏ−グリカン）に連結している。ムチンドメインは、Ｏ−結合グリコシル化部位を含むかあるいはＯ−結合グリコシル化部位からなる。ムチンドメインは、１個、２個、３個、５個、１０個、２０個、５０個、１００個またはそれ以上のＯ−結合グリコシル化部位を有する。あるいは、ムチンドメインはＮ−結合グリコシル化部位を含む。ムチンポリペプチドは、その質量の５０％、６０％、８０％、９０％、９５％または１００％がグリカンによるものである。ムチンポリペプチドは、ＭＵＣ遺伝子（すなわち、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ５ｃ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２など）によってコードされる任意のポリペプチドである。あるいは、ムチンポリペプチドはＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ−１、赤血球グリコホリン、グリコカリシン、グリコホリン、シアロホリン、ロイコシアリン、ＬＤＬ−Ｒ、ＺＰ３、およびエピグリカニンである。ムチンはＰＳＧＬ−１であることが好ましい。ＰＳＧＬ−１は、各々が４０２アミノ酸を含有する、１型膜貫通トポロジーの１２０ｋＤａのサブユニットが２個ジスルフィド結合したホモ二量体糖タンパク質である。細胞外ドメインにおいて、Ｏ−結合オリゴ糖を付加するための３個または４個の潜在部位を含有する１０アミノ酸のコンセンサス配列の繰り返しが１５ある。一実施形態において、１０アミノ酸のコンセンサス配列は、Ａ（Ｉ）ＱＴＴＱ（ＰＡＲ）Ｐ（ＬＴ）Ａ（ＴＥＶ）Ａ（ＰＧ）Ｔ（ＭＬ）Ｅ（配列番号１）である。別の実施形態において、１０アミノ酸のコンセンサス配列はＡＱ（Ｍ）ＴＴＰ（Ｑ）Ｐ（ＬＴ）ＡＡ（ＰＧ）Ｔ（Ｍ）Ｅ（配列番号２）である。ＰＳＧＬ−１は、各単量体に、Ｏ−結合グリコシル化のための部位を５４以上、およびＮ−結合グリコシル化のための部位を４以上有すると予測される。
【００１９】
ムチンポリペプチドは、ムチンタンパク質の全部または一部分を含有する。あるいは、ムチンタンパク質は、ポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分またはその一部分（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ５７４６８に開示されているアミノ酸１９〜３１９）を含む。ムチンポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１のシグナル配列部分（例えば、アミノ酸１〜１８）、膜貫通ドメイン（例えばアミノ酸３２０〜３４３）、および細胞質ドメイン（例えば、アミノ酸３４４〜４１２）も含む。
【００２０】
「非ムチンポリペプチド」は、グリカンによる質量分が少なくとも４０％未満であるポリペプチドを指す。
【００２１】
本発明のＳＩ融合タンパク質の中で、ムチンポリペプチドはムチンタンパク質の全部または一部分に相当する。ＳＩ融合タンパク質は、ムチンタンパク質の少なくとも一部分を含む。「少なくとも一部分」とは、ムチンポリペプチドが少なくとも１つのムチンドメイン（例えば、Ｏ−結合グリコシル化部位）を含有することを意味する。ムチンタンパク質は、ポリペプチドの細胞外部分を含む。例えば、ムチンポリペプチドはＰＳＧＬ−１の細胞外部分を含む。
【００２２】
第１のポリペプチドは、１種または複数種のグリコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。第１のポリペプチドは、２種、３種、５種またはそれ以上のグリコシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。グリコシル化は逐次的または連続的である。あるいは、グリコシル化は同時的またはランダムである、すなわち特定の順序がない。第１のポリペプチドは、Ｎ−結合グリカンまたはＯ−結合グリカンを、タンパク質主鎖に付加またはタンパク質主鎖上に産生することができる任意の酵素によってグリコシル化される。例えば、第１のポリペプチドは、α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼによってグリコシル化される。α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼの適切な供給源としては、これらに限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５９１３２、ＡＡＯ３９１５０、ＡＢＰ３５５３３、ＡＢＰ３５５３２、ＡＢＱ１０７４１、ＡＢＱ１０７４０、ＡＡＳ７７２２１、ＡＡＳ７７２２０、ＡＡＳ７７２１９、ＡＡＳ７７２１６、ＡＡＳ７７２１５、ＡＡＳ７７２１４、ＡＡＸ２０１０９、ＡＡＯ３９１５１、ＡＡＯ３９１４９、ＡＡＰ４７１７０、ＡＡＰ４７１６９、ＡＡＰ４７１６８、ＡＡＰ４７１６７、ＡＡＰ４７１６６、ＡＡＰ４７１６５、およびＡＡＰ４７１６４が挙げられ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。特定の実施形態において、第１のポリペプチドは、α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼおよびコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの両方によってグリコシル化される。コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼの適切な供給源としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ７９６１０、Ｚ１９５５０、ＢＡＢ６６０２４、ＡＰ００１５１５、ＡＪ４２０４１６．１、ＡＫ３１３３４３．１、ＡＬ８３２６４７．２、ＡＹ１９６２９３．１、ＢＣ０７４８８５．２、ＢＣ０７４８８６、ＢＣ１０９１０１、ＢＣ１０９１０２．１、Ｍ９７３４７．１、ＢＡＧ３６１４６．１、ＣＡＤ８９９５６．１、ＡＡＨ７４８８５．１、ＡＡＨ７４８８６．１、ＡＡＩ０９１０２．１、ＡＡＩ０９１０３．１、ＡＡＡ３５９１９．１、ＡＡＨ１７０３２、Ｏ９５３９５、ＮＰ＿００４７４２、ＥＡＷ７７５７２、ＮＰ＿００４７４２．１、ＢＣ０１７０３２、ＡＦ１０２５４２．１、ＡＡＤ１０８２４．１、ＡＦ０３８６５０．１、ＮＭ＿００４７５１．２、Ｑ９Ｐ１０９、ＮＰ＿０５７６７５、ＥＡＷ９５７５１、ＡＦ１３２０３５．１、ＡＡＦ６３１５６．１、およびＮＰ＿０５７６７５．１が挙げられるが、これらに限定されない。第１のポリペプチドは、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％を超える、糖鎖による質量分を含有する。
【００２３】
融合タンパク質の中で、「作動可能に連結された」という用語は、第１のポリペプチドをＯ−結合グリコシル化および／またはＮ−結合グリコシル化することが可能になるように、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドが化学的に連結している（最も一般的には、ペプチド結合などの共有結合によって）ことを指すものとする。融合ポリペプチドをコードする核酸を指して用いる場合、作動可能に連結されたという用語は、ムチンポリペプチドをコードする核酸と非ムチンポリペプチドをコードする核酸が互いにインフレーム融合していることを意味する。非ムチンポリペプチドは、ムチンポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【００２４】
ＳＩ融合タンパク質は、１つまたは複数の追加成分に連結される。例えば、ＳＩ融合タンパク質は、ＳＩ融合タンパク質配列がＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合したＧＳＴ融合タンパク質にさらに連結することができる。そのような融合タンパク質により、ＳＩ融合タンパク質の精製を容易にすることができる。あるいは、ＳＩ融合タンパク質は、固体支持体にさらに連結することができる。さまざまな固体支持体が当業者に公知である。例えば、ＳＩ融合タンパク質は、例えば、金属化合物、シリカ、ラテックス、ポリマー材料、マイクロタイタープレート、ニトロセルロース、またはナイロンまたはそれらの組み合わせで作られた粒子に連結される。固体支持体に連結されたＳＩ融合タンパク質は、志賀毒素産生細菌および志賀様毒素産生細菌によって引き起こされる感染を診断またはスクリーニングするツールとして使用することができる。
【００２５】
融合タンパク質は、異種性シグナル配列（すなわち、ムチン核酸によってコードされるポリペプチド内に存在しないポリペプチド配列）をそのＮ末端に含む。例えば、天然のムチン糖タンパク質シグナル配列を取り出して別のタンパク質からのシグナル配列と置き換えることができる。ある種の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）において、異種性シグナル配列の使用によってポリペプチドの発現および／または分泌を増加させることができる。
【００２６】
本発明のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準の組換えＤＮＡ技法によって作製することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、従来技法に従って、例えば、ライゲーション用の平滑末端または付着末端の利用、適当な末端をもたらす制限酵素消化、必要に応じて突出末端の埋め込み、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションにより、インフレームで互いにライゲーションさせる。融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含めた従来技法によって合成される。あるいは、２つの連続的な遺伝子断片間に相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行い、続いて遺伝子断片をアニーリングし再増幅させてキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２年を参照されたい）。さらに、融合成分（例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。ムチンをコードする核酸をそのような発現ベクターにクローニングし、それによって融合成分を免疫グロブリンタンパク質にインフレームで連結することができる。
【００２７】
ＳＩ融合ポリペプチドは、二量体、三量体または五量体などのオリゴマーとして存在しうる。ＳＩ融合ポリペプチドは二量体であることが好ましい。
【００２８】
第１のポリペプチド、および／または第１のポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野で公知のムチンをコードする配列を用いて構築される。ムチンポリペプチドおよびムチンポリペプチドをコードする核酸の適切な供給源としては、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ６６３６２５およびＮＭ１４５６５０、ＣＡＤ１０６２５およびＡＪ４１７８１５、ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４、ＸＰ００６８６７およびＸＭ００６８６７ならびにＮＰ００３３１７７７およびＮＭ００９１５１が挙げられ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００２９】
ムチンポリペプチド成分は、天然に存在するムチン配列（野生型）に、糖鎖含有量の増加（突然変異していない配列と比べて）をもたらす改変を有する変異型ムチンポリペプチドとして提供される。本明細書で用いる天然に存在する（野生型）ムチン配列における改変とは、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列において１つまたは複数の置換、付加または欠失を含み、それによって、コードされるタンパク質に１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失が導入される。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準の技法によって、天然に存在するムチン配列中に導入することができる。
【００３０】
例えば、変異型ムチンポリペプチドは、野生型ムチンと比較して追加的なＯ−結合グリコシル化部位を含んだ。あるいは、変異型ムチンポリペプチドは、野生型ムチンポリペプチドと比較してセリン残基、トレオニン残基またはプロリン残基の数の増加をもたらすアミノ酸配列の改変を含む。この糖鎖含有量の増加は、当業者に公知の方法によって、ムチンのタンパク質と糖鎖の比を決定することにより評価可能である。
【００３１】
あるいは、ムチンポリペプチド成分は、天然に存在するムチン配列（野生型）に、Ｏ−結合グリコシル化部位が多いムチン配列またはより高度なグリコシル化をもたらすペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼによって好んで認識されるムチン配列をもたらす改変を有する変異型ムチンポリペプチドとして提供される。
【００３２】
一部の実施形態において、ムチンポリペプチド成分は、タンパク質分解に対して耐性が高い（突然変異していない配列と比べて）ムチン配列をもたらす、天然に存在するムチン配列（野生型）に改変を有する変異型ムチンポリペプチドとして提供される。
【００３３】
第１のポリペプチドは全長ＰＳＧＬ−１を含む。あるいは、第１のポリペプチドは、全長に満たないＰＳＧＬ−１ポリペプチド、例えばＰＧＳＬ−１ポリペプチドの機能的断片を含む。例えば、第１のポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドの４００隣接アミノ酸未満の長さ、例えば、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドの３００、２５０、１５０、１００または５０隣接アミノ酸以下の長さ、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドの少なくとも２５隣接アミノ酸の長さである。第１のポリペプチドは、例えば、ＰＳＧＬ−１の細胞外部分である、またはその一部分を含む。代表的なＰＳＧＬ−１ポリペプチドおよび核酸配列としては、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ００６８６７；ＸＭ００６８６７；ＸＰ１４０６９４およびＸＭ１４０６９４が挙げられる。
【００３４】
第２のポリペプチドは可溶性であることが好ましい。一部の実施形態において、第２のポリペプチドは、ＳＩ融合ポリペプチドと第２のムチンポリペプチドの連関を容易にする配列を含む。第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一領域を含む。「少なくとも一領域」とは、軽鎖、重鎖、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、Ｆｖ領域またはそれらの任意の断片などの免疫グロブリン分子の任意の部分を含むことを意味する。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５１６，９６４号、同第５，２２５，５３８号、同第５，４２８，１３０号、同第５，５１４，５８２号、同第５，７１４，１４７号および同第５，４５５，１６５号に記載されている。
【００３５】
第２のポリペプチドは、全長免疫グロブリンポリペプチドを含む。あるいは、第２のポリペプチドは、全長に満たない免疫グロブリンポリペプチド、例えば重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、Ｆｖ、またはＦｃを含む。第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの重鎖を含むことが好ましい。第２のポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域を含むことがより好ましい。
【００３６】
第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能よりも低いエフェクター機能を有する。あるいは、第２のポリペプチドは、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域と同様またはそれより高いエフェクター機能を有する。Ｆｃのエフェクター機能としては、例えば、Ｆｃ受容体結合性、補体結合およびＴ細胞除去活性が挙げられる（例えば米国特許第６，１３６，３１０号を参照されたい）。Ｔ細胞除去活性、Ｆｃエフェクター機能、および抗体安定性をアッセイする方法は当技術分野で公知である。一実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｆｃ受容体に対する親和性が低いまたは親和性を有さない。あるいは、第２のポリペプチドは補体タンパク質Ｃ１ｑに対する親和性が低いまたは親和性を有さない。
【００３７】
本発明の別の態様は、ムチンポリペプチド、またはその派生体、断片、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。ベクターは、免疫グロブリンポリペプチド、またはその派生体、断片、類似体または相同体をコードする核酸に作動可能に連結された、ムチンポリペプチドをコードする核酸を含有する。さらに、ベクターは、α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。本明細書で用いる「ベクター」という用語は、それが連結している別の核酸を運搬する能力がある核酸分子を指す。ベクターの１種は「プラスミド」であり、追加のＤＮＡセグメントをその中にライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲーションすることができる。ある種のベクターは、それが導入された宿主細胞において自己複製する能力がある（例えば、細菌の複製起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導する能力がある。本明細書ではそのようなベクターを「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ技法において有益である発現ベクターは多くの場合プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」とは、プラスミドがベクターの最も一般的な使用形態であるので、互換的に使用することができる。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの、同等の機能を果たすような他の形態の発現ベクターを含むものとする。
【００３８】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞において核酸が発現するのに適した形態で含み、これは組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つまたは複数の制御配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターの中で、「作動可能に連結された」とは、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現が可能になるように（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入された場合は宿主細胞において）制御配列（複数可）に連結されていることを意味するものとする。
【００３９】
「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。そのような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、（１９９０年）に記載されている。制御配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を誘導するものを含む（例えば、組織特異的制御配列）。当業者には当然のことながら、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子に左右され得る。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質または融合ペプチド（例えば、ＳＩ融合ポリペプチド、ＳＩ融合ポリペプチドの突然変異型など）を含めた、タンパク質またはペプチドを作製することができる。
【００４０】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞においてＳＩ融合ポリペプチドを発現させるために設計することができる。例えば、ＳＩ融合ポリペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、（１９９０年）でさらに考察されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写および翻訳することができる。
【００４１】
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質か非融合タンパク質のいずれかの発現を誘導する構成プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて行われる。融合ベクターは、その中にコードされているタンパク質、通常組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつものアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは一般に３つの目的にかなう：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を増加させること；および（ｉｉｉ）親和性精製においてリガンドとして働くことにより組換えタンパク質の精製を助長すること。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、融合成分と組換えタンパク質の接合部にタンパク質分解の切断部位を導入して、組換えタンパク質を融合成分から分離し、続いて融合タンパク質を精製できるようにする。そのような酵素、および同種の認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８年、Ｇｅｎｅ ６７巻、３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合性タンパク質、またはプロテインＡを標的の組換えタンパク質に融合する。
【００４２】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら、（１９８８年）、Ｇｅｎｅ、６９巻、３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、（１９９０年）、６０〜８９頁）が挙げられる。
【００４３】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質の発現を最大にするための１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解性切断する能力に障害がある宿主細菌においてタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、（１９９０年）１１９〜１２８頁を参照されたい。別の戦略は、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を、各アミノ酸に対する個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉにおいて優先的に使用されるものになるように改変することである（例えば、Ｗａｄａら、１９９２年、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０巻、２１１１〜２１１８頁を参照されたい）。本発明の核酸配列のそのような改変は、標準のＤＮＡ合成技法によって行うことができる。
【００４４】
ＳＩ融合ポリペプチド発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおいて発現させるためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７年、ＥＭＢＯＪ．、６巻、２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２年、Ｃｅｌｌ、３０巻、９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７年、Ｇｅｎｅ、５４巻、１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【００４５】
あるいは、ＳＩ融合ポリペプチドは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ細胞またはＳＦ９細胞）においてタンパク質を発現させるために入手可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、１９８３年、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、３巻、２１５６〜２１６５頁）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８９年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０巻、３１〜３９頁）が挙げられる。
【００４６】
本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ、３２９巻、８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１９８７年、ＥＭＢＯ Ｊ．、６巻、１８７〜１９５頁）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用する場合、発現ベクターの調節機能は、多くの場合ウイルス制御要素によってもたらされる。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびサルウイルス４０に由来する。原核細胞と真核細胞の両方に適した他の発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年の第１６章および第１７章を参照されたい。
【００４７】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」と「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書では互換的に用いられる。そのような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の後代または潜在的な後代も指すことが理解されよう。突然変異か環境の影響のいずれかによって、続く世代にある種の一時的変異が起こり得るため、そのような後代は、実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で使用する用語の範囲内に含める。
【００４８】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、ＳＩ融合ポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、Ｍ．ｂｒａｓｓｉｃａｅなどの昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（ヒト、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯＳ細胞など）において発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００４９】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技法またはトランスフェクション技法によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で用いる「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、宿主細胞に外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための、当技術分野で認められているさまざまな技法を指すものとし、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション法、リポフェクション法、または電気穿孔法が挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）、および他の実験マニュアルで見ることができる。
【００５０】
哺乳動物細胞の安定トランスフェクションに関して、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技法によっては、ごく一部の細胞のみがそのゲノムに外来ＤＮＡを組み込み得ることが公知である。これらの組み込み体を同定し選択するために、一般に、選択マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子を、対象の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入する。さまざまな選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する選択マーカーが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、融合ポリペプチドをコードするベクターと同じベクターで宿主細胞に導入することができ、または別々のベクターで導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死ぬ）。
【００５１】
培養した宿主原核細胞または培養した宿主真核細胞などの本発明の宿主細胞は、ＳＩ融合ポリペプチドを作製する（すなわち、発現させる）ために使用することができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いてＳＩ融合ポリペプチドを作製する方法をさらに提供する。一実施形態において、この方法は、本発明の宿主細胞（ＳＩ融合ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入された宿主細胞）を、ＳＩ融合ポリペプチドが作製されるように適切な培地で培養する工程を含む。別の実施形態において、この方法は、培地または宿主細胞からＳＩポリペプチドを単離する工程をさらに含む。
【００５２】
ＳＩ融合ポリペプチドは、抽出、沈降、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などの従来の条件に従って単離し、精製することができる。例えば、免疫グロブリン融合タンパク質は、融合タンパク質のＦｃ部分に選択的に結合する、固定化プロテインＡまたは固定化プロテインＧを含有するカラムに溶液を通すことによって精製することができる。例えば、Ｒｅｉｓ， Ｋ． Ｊ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３２巻、３０９８〜３１０２頁（１９８４年）、ＰＣＴ出願、公開番号ＷＯ８７／００３２９を参照されたい。次いで、カオトロピック塩を用いた処理によって、または酢酸水溶液（１Ｍ）を用いた溶出によって、融合ポリペプチドを溶出することができる。
【００５３】
あるいは、本発明によるＳＩ融合ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて化学合成することができる。ポリペプチドの化学合成については、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ、Ｂｏｄａｓｎｓｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９８８年、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻、２４１〜２４７頁、（１９８６年）；Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、３０巻、７０５〜７３９頁（１９８７年）； Ｋｅｎｔ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７巻、９５７〜９８９頁（１９８８年）、およびＫａｉｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３巻、１８７〜１９８頁、（１９８９年）に記載されている。ポリペプチドは、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないように標準のペプチド精製技法を用いて精製する。「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言葉は、ペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質からペプチドを分離した、ペプチド調製物を含む。一実施形態において、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言葉は、約３０％（乾燥重量）未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質、さらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ペプチド化学物質を有するペプチド調製物を含む。
【００５４】
ポリペプチドの化学合成により、Ｄ−アミノ酸および他の小さい有機分子を含めた、修飾されたアミノ酸または非天然アミノ酸の組み込みが容易になる。ペプチドの１つまたは複数のＬ−アミノ酸の、対応するＤ−アミノ酸アイソフォームへの置き換えを用いて、酵素的加水分解に対するペプチドの抵抗性を増加させ、生物活性のあるペプチドの１つまたは複数の特質、すなわち受容体結合性、機能的効力または作用の持続を増強することができる。例えば、Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９３年、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、３６巻、２５８５〜２５９４頁、Ｋｉｒｂｙら、１９９３年、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、３６巻、３８０２〜３８０８頁；Ｍｏｒｉｔａら、１９９４年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３５３巻、８４〜８８頁；Ｗａｎｇら、１９９３年、Ｉｎｔ．Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．、４２巻、３９２〜３９９頁；ＦａｕｃｈｅｒｅおよびＴｈｉｕｎｉｅａｕ、１９９２年、Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．、２３巻、１２７〜１５９頁を参照されたい。
【００５５】
ペプチド配列に共有結合架橋を導入することにより、ポリペプチド主鎖を立体配座的かつ組織分布的に制約することができる。この戦略は、効力、選択性および安定性が増加した、融合ポリペプチドのペプチド類似体を開発するために使用することができる。環状ペプチドの立体配座エントロピーは、対応する直鎖状ペプチドよりも低いため、非環状類似体よりも環状類似体に対して、より少ないエントロピー減少で特異的な立体配座が採用される可能性があり、その結果、結合自由エネルギーがより有利なものになる。大環状化は、多くの場合、ペプチドのＮ末端とＣ末端の間、側鎖とＮ末端もしくはＣ末端の間［例えば、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６をｐＨ８．５で用いて］（Ｓａｍｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３７巻、５１８２〜５１８５頁（１９９６年））、または２つのアミノ酸側鎖間にアミド結合を形成することによってなされる。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ、３９巻、５１〜１２４頁（１９８８年）を参照されたい。可動性を低減させるために、直鎖配列にジスルフィド架橋も導入される。例えば、Ｒｏｓｅら、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ、３７巻、１〜１０９頁（１９８５年）；Ｍｏｓｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ、１０６巻、５０５〜５１２頁（１９８２年）を参照されたい。さらに、システイン残基のペニシラミン（Ｐｅｎ、３−メルカプト−（Ｄ）バリン）での置き換えが、一部のオピオイド受容体相互作用の選択性を増加させるために用いられる。ＬｉｐｋｏｗｓｋｉおよびＣａｒｒ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、およびＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｇｕｔｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２８７〜３２０頁（１９９５年）。
志賀毒素および／または志賀様毒素の宿主細胞への結合を減少させる方法
志賀毒素および／または志賀様毒素の細胞表面への結合は、細胞を本発明のＳＩ融合ペプチドと接触させることによって阻害される（例えば減少する）。ＳＩ融合タンパク質は、細菌毒素の細胞表面への結合を立体的に阻害し、その結果、細菌毒素の感染を予防する。あるいは、細胞表面への志賀毒素および／または志賀様毒素の結合は、志賀毒素および／または志賀様毒素を本発明のＳＩ融合ペプチドと接触させ、それによってＳＩ融合ペプチドが志賀毒素および／または志賀様毒素に結合し、その結果、志賀毒素および／または志賀様毒素の天然エピトープへの結合が予防されることによって阻害され（例えば減少し）、その結果、細菌毒素の感染が予防される。志賀毒素または志賀様毒素は、例えば、志賀毒素、志賀様毒素１または志賀様毒素２である。志賀様毒素産生細菌は、例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉおよび／またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａである。
【００５６】
付着の阻害は、細胞内部移行の減少およびタンパク質合成阻害の減少を特徴とする。ＳＩ融合ペプチドを対象に全身投与および／または直腸内投与することによって、ＳＩペプチドを対象の１つまたは複数の細胞と接触させる。ＳＩペプチドは、細菌毒素の細胞表面への結合および／または細胞への内部移行を減少させる（例えば、阻害する）のに十分な量を投与する。あるいは、志賀毒素産生細菌および／または志賀様毒素産生細菌を直接ＳＩペプチドと接触させる。志賀毒素／志賀様毒素の細胞表面への結合は、当技術分野で公知の標準の免疫細胞化学アッセイを用いて、例えば、放射活性を用いて毒素の細胞への結合を測定することによって、または他の手段、標識化毒素によって、抗志賀毒素抗体を用いて付着した毒素を検出することによって、または細胞に毒素を接触もしくは暴露させた後のタンパク質合成レベルを測定することによって測定される。
【００５７】
この方法は、志賀毒素および／または志賀様毒素の感染または志賀毒素および／または志賀様毒素に関連付けられる疾患の症状を緩和するのに有用である。志賀毒素および／または志賀様毒素の感染に付随する症状としては、例えば、下痢、出血性大腸炎および／または溶血性尿毒症症候群が挙げられる。
【００５８】
本明細書に記載の方法により、本明細書に記載のような志賀毒素および／または志賀様毒素の感染または障害の１つまたは複数の症状の重症度の軽減またはその緩和がもたらされる。志賀毒素および／または志賀様毒素の感染または志賀毒素および／または志賀様毒素による感染に付随する障害は、一般に、標準の方法論を用いて、医師によって診断および／またはモニタリングされる。
【００５９】
対象は、例えば、任意の哺乳動物、例えばヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタである。治療は、細菌毒素の感染または障害の診断に先立って施される。あるいは、治療は、対象が感染した後に施される。
【００６０】
治療の効果は、特定の細菌毒素感染または細菌毒素感染に付随する障害を診断または治療するための任意の公知の方法に関連して決定される。細菌毒素感染または障害の１つまたは複数の症状が緩和されることで、化合物が臨床上の利点を付与することが示される。
ＳＩ融合ポリペプチドまたはＳＩ融合ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物
本発明のＳＩ融合タンパク質、またはそれらの融合タンパク質をコードする核酸分子（本明細書では「治療用物質」または「有効化合物」とも称される）、およびそれらの派生体、断片、類似体および相同体は、投与するために適した医薬組成物中に組み込むことができる。そのような組成物は、一般に、核酸分子、タンパク質、または抗体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」とは、医薬投与に適合する任意の、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張液および吸収遅延剤などを含めるものとする。適切な担体は、本明細書に参照により組み込まれている、当分野で標準の参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液（ｆｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび固定油などの非水性ビヒクルも使用することができる。医薬として有効な物質へのそのような媒体および作用剤の使用は当技術分野で周知である。従来の媒体または作用剤は、どれも有効化合物と適合しない場合を除いて、組成物にそれらを使用することが企図されている。補充の有効化合物も組成物中に組み込むことができる。
【００６１】
本明細書で開示している有効作用剤も、リポソームとして製剤化することができる。リポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２巻、３６８８頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７７巻、４０３０頁（１９８０年）；および米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載のような、当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間を増大させたリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【００６２】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを定義済みの孔サイズのフィルターを通して押し出し、所望の直径を有するリポソームを得る。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、目的とする投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば吸入）、経皮投与（すなわち局所的）、経粘膜投与、および直腸内投与が挙げられる。非経口施用、皮内施用、または皮下施用するために使用する溶液または懸濁液としては、下記の構成材料を挙げることができる：注射用の水などの滅菌希釈剤、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための作用剤。ｐＨは、塩化水素または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨て注射器または多回用量バイアルに封入することができる。
【００６４】
注射用に使用するのに適した医薬組成物は、注射用滅菌溶液または注射用滅菌分散系を即席で調製するための滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌分散系および滅菌粉末を含む。静脈内投与するための適切な担体としては、生理食塩水、静菌性水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、容易な注射性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）がある限りは流体であるべきである。組成物は、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散系の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、維持することができる。微生物作用の予防は、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現し得る。多くの場合、等張剤、例えば、砂糖、マニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。
【００６５】
滅菌注射用溶液は、必要量の有効化合物（例えばＳＩ融合タンパク質）を、上記で列挙した成分の１種またはそれらの組み合わせを有する適当な溶媒に組み込み、その後必要に応じてろ過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散系は、有効化合物を、塩基性の分散媒および上記で列挙した成分からの必要な他成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合の調製方法は、有効成分の粉末と任意の追加的な所望成分を、前もって滅菌ろ過したそれらの溶液から得る、真空乾燥および凍結乾燥である。
【００６６】
経口用組成物は、一般に不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入することができ、または錠剤に圧縮することができる。治療的に経口投与するために、有効化合物を賦形剤と一緒に組み込み、錠剤、トローチ剤、またはカプセルの形態で使用することができる。経口用組成物は、うがい薬として使用する液体担体を用いて調製することもでき、液体担体中の化合物は経口的に施用され、ゆすいで（ｓｗｉｓｈ）吐き出されるまたは嚥下される。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ剤などは、下記の成分、または似た性質の化合物をどれでも含んでよい：微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動性促進剤；ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなどの香味料。
【００６７】
吸入によって投与するために、化合物は、適切な高圧ガス、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくは加圧ディスペンサーからのエアロゾル噴霧剤の形態、またはネブライザーの形態で送達される。
【００６８】
経粘膜的または経皮的な手段によっても全身投与することができる。経粘膜的または経皮的に投与するために、浸透させる関門に対して適当な浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与用としては、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻薬または座薬を使用することによって実現可能である。経皮投与するために、有効化合物は軟膏剤、膏薬、ゲル、またはクリームに、当技術分野で一般に公知の通り製剤化される。
【００６９】
化合物は座薬の形態（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の座薬基剤と一緒に）または直腸内に送達するための保持かん腸剤の形態で調製することもできる。
【００７０】
有効化合物は、埋め込みおよびマイクロカプセル化送達系を含めた制御放出製剤など、その化合物が体から迅速に排出されることから保護するであろう担体と一緒に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生物分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、薬学的に許容できる担体として使用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【００７１】
経口用組成物または非経口用組成物は、投与を簡単にするため、および用量を均一にするために単位剤形に製剤化される。本明細書で用いる単位剤形とは、治療される対象に対する単位剤形に適合させた、物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と関連して所望の治療効果を生ずるよう計算された、所定量の有効化合物を含有する。本発明の単位剤形の規格は、有効化合物特有の特性および実現されるべき特定の治療効果、およびそのような、個体を治療するための有効化合物の配合技術分野における固有の制限によって規定され、またそれらに直接左右される。
【００７２】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与によって（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）、または定位的注射によって（例えば、Ｃｈｅｎら、１９９４年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１巻、３０５４〜３０５７頁を参照されたい）対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含んでよく、または、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた緩慢放出マトリックスを含んでよい。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターが、組換え細胞から無傷で作製され得る場合、この医薬調製物は遺伝子送達系を生じる１つまたは複数の細胞を含んでよい。
【００７３】
必要に応じて、持続的放出調製物を調製することができる。持続的放出調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続的放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリメタクリル酸２−ヒドロキシエチル、またはポリビニルアルコール）、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−Ｌ−グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性エチレン酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロイドで構成される注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーによって、分子を１００日間にわたって放出することが可能になるが、ある種のヒドロゲル放出タンパク質では、それよりも短期間になる。
【００７４】
医薬組成物は、投与の説明書と一緒に容器、パック、またはディスペンサーの中に含めることができる。
【００７５】
本発明を、下記の非限定的な実施例でさらに例示する。
【実施例】
【００７６】
（実施例１）
Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮａｃαグリカンおよび／またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃグリカンを担持するＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１のＩｇＧ Ｆｃ融合物を分泌する安定な細胞系のエンジニアリング
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現プラスミドを、内生のα１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するＭ．Ｂｒａｓｓｉｃａｅ昆虫細胞に安定にトランスフェクトして所望のエピトープ、Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃαを産生させる。あるいは、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現プラスミドを、α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼおよびコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと一緒にＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトしてＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（血液型Ｐ１エピトープ）構造を産生させる。あるいは、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現プラスミドを、α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ、１つまたは複数のペプチドＧａｌＮＡｃＴ、および場合によって、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミンを作り出すことができる１つまたは複数の酵素、ならびにＥ．ｃｏｌｉ細胞中に存在する糖鎖前駆体からのＵＤＰ−ＧａｌおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと一緒にＥ．Ｃｏｌｉ細胞にトランスフェクトして、Ｇａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃ（血液型Ｐ１エピトープ）構造を産生させる。種々の選択薬物に対する耐性に基づいて安定なクローンを選択する。
細胞培養
Ｍ．Ｂｒａｓｓｉｃａｅ細胞を、適当な選択培地で培養する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２５μｇ／ｍｌの硫酸ゲンタマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）で培養する。この選択培地は、１種または複数種の薬物選択因子（例えば、プロマイシン、ハイグロマイシンＢ、Ｇ４１８および／またはゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ））を含有する。
発現プラスミドの構築
α１，４ＧａｌＴ発現プラスミドを構築し、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現プラスミドを、Ｌｉｕら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６３巻、１６７３頁（１９９７年）に記載の通り構築する。コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ発現プラスミドを、Ｌｉｕら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５巻（６号）、５７１頁、（２００５年）に記載の通り構築する。
ＤＮＡトランスフェクションとクローン選択：Ｍ．Ｂｒａｓｓｉｃａｅ細胞
Ｍ．Ｂｒａｓｓｉｃａｅ細胞を、７５ｃｍ２のＴ型フラスコに播種し、およそ２４時間後または細胞集密度が７０〜８０％に達した時にトランスフェクトする。トランスフェクトした２４時間後、各Ｔ型フラスコ内の細胞をいくつかの１００ｍｍペトリ皿に分割し、薬物選択因子（例えば、プロマイシン、ハイグロマイシンｂ、Ｇ４１８および／またはゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ））を含有する選択培地でインキュベートする。およそ２週間後に薬物耐性クローンが形成される。クローンを顕微鏡の下で同定し、ピペットマンを用いて手で選び取る。選択されたコロニーを９６ウェルプレート中、選択薬物の存在下でさらに２週間培養する。細胞が８０〜９０％の集密度に達したら細胞培養上清を回収する。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの濃度を、ヤギの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いてＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウェスタンブロットによって評価する。
ＤＮＡトランスフェクションとクローン選択：ＣＨＯ−Ｋ１細胞
接着ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、７５ｃｍ２のＴ型フラスコに播種し、およそ２４時間後または細胞集密度が７０〜８０％に達した時にトランスフェクトする。トランスフェクトするために修飾ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション法を使用することができる（Ｂｏｕｓｓｉｆ， Ｏ．ら、１９９５年、Ｈｅ， Ｚ．ら、２００１年）。トランスフェクトした２４時間度、各Ｔ型フラスコ内の細胞をいくつかの１００ｍｍペトリ皿に分割し、１種または複数種の薬物選択因子（例えば、プロマイシン、ハイグロマイシンｂ、および／またはＧ４１８）を含有する選択培地でインキュベートする。およそ２週間後に薬物耐性クローンが形成される。クローンを顕微鏡の下で同定し、ピペットマンを用いて手で選び取る。選択されたコロニーを９６ウェルプレート中、選択薬物の存在下でさらに２週間培養する。細胞が８０〜９０％の集密度に達したら細胞培養上清を回収する。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの濃度を、ヤギの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体を用いてＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウェスタンブロットによって評価する。最も高いＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ発現を有するクローンを、α１，４ＧａｌＴをコードするプラスミドでトランスフェクトし、ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂクローンの選択に使用したものと異なる薬物選択因子を用いて選択する。耐性クローンをＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって単離し、特徴付けする。
ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ上のＧａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα糖鎖エピトープおよびＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃ糖鎖エピトープの密度および酵素結合免疫吸着検定法を用いたＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂの定量化
細胞培養上清中の組換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ濃度、およびその相対的なαＧａｌエピトープ密度を、下記の通り２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定することができる。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを、２０μ／ｍｌの濃度のアフィニティー精製したポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｃａｔ．ｎｒ．５５４８２；Ｃａｐｐｅｌ／Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）で、４℃で一晩コーティングする。プレートをＰＢＳ中１％ＢＳＡで１時間ブロッキングする。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂを含有する上清を４時間インキュベートし、次いで０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄する。洗浄後、プレートを、１：３，０００希釈のペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｃａｔ．ｎｏ．Ａ−９９１７；Ｓｉｇｍａ）、または１：２，０００希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートＧＳＡ Ｉ ＩＢ４−レクチン（ｃａｔ．ｎｏ．Ｌ−５３９１；Ｓｉｇｍａ）で２時間インキュベートする。結合したペルオキシダーゼコンジュゲート抗体またはペルオキシダーゼコンジュゲートＧＳＡレクチンを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン二塩酸塩（ｃａｔ．ｎｒ．Ｔ−３４０５；Ｓｉｇｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で可視化する。２ＭのＨ２ＳＯ４によって反応を停止させ、プレートを４５０ｎｍで読み取る。ＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ濃度を、融合タンパク質作製に用いた培地中または１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に再懸濁させた精製したマウスＩｇＧ Ｆｃ断片（ｃａｔ．Ｎｒ．０１５−０００−００８；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）の希釈系列を較正に用いて見積もる。エピトープ密度を、２つのＥＬＩＳＡからの相対的なＯ．Ｄ．を比較することによって決定する（ＧＳＡ反応性／抗マウスＩｇＧ反応性）。
【００７７】
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細菌毒素感染の阻害
志賀毒素および／または志賀様毒素と、志賀毒素および／または志賀様毒素の細胞変性作用に感受性の内皮細胞を用いて、感受性宿主細胞における毒素と細胞表面の結合、およびタンパク質合成の妨害を予防することに関する上記の融合タンパク質の阻害能を評価する。
【００７８】
（実施例３）
投与経路
Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮａｃαグリカンおよび／またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃグリカンを担持する組換えＰＳＧＬ−１／ｍＩｇＧ２ｂ（すなわち、ＳＴＩ融合タンパク質）は、溶血性尿毒症症候群を予防するために全身投与される。ＳＴＩ融合タンパク質は、感染部位からの伝播を予防するために直腸内投与される。
他の実施形態
本発明をその詳細な説明とともに記載したが、前述の説明は例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことを意図している。他の態様、利点、および改変は以下の特許請求の範囲内である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２のポリペプチドに連結された第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、前記第１のポリペプチドがα１，４ガラクトシルトランスフェラーゼによってグリコシル化されたムチンポリペプチドであり、前記第２のポリペプチドが免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一領域を含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記ムチンポリペプチドが、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによってさらにグリコシル化されたものである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ムチンポリペプチドが、Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮａｃα構造またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃ構造を含むグリカンレパートリーを有する、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ムチンポリペプチドが、ＰＳＧＬ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ５ｃ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、およびＭＡｄＣＡＭ−１またはそれらの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ムチンポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）の少なくとも一領域を含む、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記ムチンポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１の細胞外部分を含む、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記第２のポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドの領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記第２のポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
細菌毒素感染の症状を予防または緩和することを必要とする対象において、細菌毒素感染の症状を予防または緩和するための方法であって、前記対象に請求項１に記載の融合ポリペプチドを投与する工程を含む方法。
【請求項１０】
前記融合ポリペプチドが前記対象に全身投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドが前記対象に直腸内投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌毒素が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ、腸管出血性大腸菌、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅからなる群から選択される細菌によって産生される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌毒素が志賀毒素または志賀様毒素１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌毒素が志賀様毒素２である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ムチン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）
ｉ）免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一部分をコードする核酸に連結された、ムチンポリペプチドをコードする核酸と、
ｉｉ）α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸と、
ｉｉｉ）場合によって、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする核酸と
を含む細胞を準備する工程と、
ｂ）前記ムチン−免疫グロブリン融合ポリペプチドの作製を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程であって、前記融合ポリペプチドが、Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα構造またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃ構造を含むグリカンレパートリーを有する工程と、
ｃ）前記ムチン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを単離する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
前記細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核細胞が哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記原核細胞が細菌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一部分をコードする核酸に連結された、ムチンポリペプチドをコードする核酸と、
ｂ）α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸と、
ｃ）場合によって、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする核酸と
を含む細胞。
【請求項１】
第２のポリペプチドに連結された第１のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、前記第１のポリペプチドがα１，４ガラクトシルトランスフェラーゼによってグリコシル化されたムチンポリペプチドであり、前記第２のポリペプチドが免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一領域を含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記ムチンポリペプチドが、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼによってさらにグリコシル化されたものである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ムチンポリペプチドが、Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮａｃα構造またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃ構造を含むグリカンレパートリーを有する、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ムチンポリペプチドが、ＰＳＧＬ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａ、ＭＵＣ５ｂ、ＭＵＣ５ｃ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ１１、ＭＵＣ１２、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ９６、ＧｌｙＣＡＭ−１、およびＭＡｄＣＡＭ−１またはそれらの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記ムチンポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１）の少なくとも一領域を含む、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記ムチンポリペプチドが、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１の細胞外部分を含む、請求項５に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記第２のポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖ポリペプチドの領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記第２のポリペプチドが、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
細菌毒素感染の症状を予防または緩和することを必要とする対象において、細菌毒素感染の症状を予防または緩和するための方法であって、前記対象に請求項１に記載の融合ポリペプチドを投与する工程を含む方法。
【請求項１０】
前記融合ポリペプチドが前記対象に全身投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドが前記対象に直腸内投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌毒素が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ、腸管出血性大腸菌、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉおよびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅからなる群から選択される細菌によって産生される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌毒素が志賀毒素または志賀様毒素１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌毒素が志賀様毒素２である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ムチン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを作製する方法であって、
ａ）
ｉ）免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一部分をコードする核酸に連結された、ムチンポリペプチドをコードする核酸と、
ｉｉ）α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸と、
ｉｉｉ）場合によって、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする核酸と
を含む細胞を準備する工程と、
ｂ）前記ムチン−免疫グロブリン融合ポリペプチドの作製を可能にする条件下で前記細胞を培養する工程であって、前記融合ポリペプチドが、Ｇａｌα４Ｇａｌβ３ＧａｌＮＡｃα構造またはＧａｌα４Ｇａｌβ４ＧｌｃＮａｃ構造を含むグリカンレパートリーを有する工程と、
ｃ）前記ムチン−免疫グロブリン融合ポリペプチドを単離する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
前記細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核細胞が哺乳動物細胞または酵母細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記原核細胞が細菌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一部分をコードする核酸に連結された、ムチンポリペプチドをコードする核酸と、
ｂ）α１，４ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸と、
ｃ）場合によって、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする核酸と
を含む細胞。
【公表番号】特表２０１１−５１９９１２（Ｐ２０１１−５１９９１２Ａ）
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０８０１２（Ｐ２０１１−５０８０１２）
【出願日】平成２１年５月１１日（２００９．５．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００６０５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３６２９８
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５１０２９６２４７）リコファーマ アーベー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月１１日（２００９．５．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００６０５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３６２９８
【国際公開日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【出願人】（５１０２９６２４７）リコファーマ アーベー (1)
【Ｆターム（参考）】
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