感受性バイオマーカーとして熱ショックタンパク質７２を用いる、急性腎障害を検出するための診断方法
本発明は、尿サンプル中のバイオマーカーの濃度を測定することによって、早期の急性腎障害を発見するための、信頼性があり、実施が容易で、非侵襲性の診断方法に関し、上記バイオマーカーは、７０ｋＤａの熱ショックタンパク質ファミリーから選択される。より具体的には、本発明は、熱ショックタンパク質７２の同定に関し、当該バイオマーカーは、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットという手段によって、またはＲＴ−ＰＣＲを用いたｍＲＮＡレベルという手段によって同定される。本発明は、効果的な治療法で適時に患者を治療する必要がある、早期段階の急性腎不全または腎障害の重篤性を検出することができないという、医学に存在する現在の課題を解決する手助けとなるものである。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、臨床医学の分野に適合し、急性腎障害（ＡＫＩ）を検出するための診断方法に関する。より具体的には、７２ｋＤａの熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７２）が、非侵襲性で感受性の、ＡＫＩを検出可能な早期のバイオマーカーであることの実証と、尿サンプル中のＨｓｐ７２を検出する定量法とに関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
急性腎障害は、異なる原因で入院している患者間に見られる罹患および死亡の重要な原因である。ＡＫＩの出現率は正常な腎機能を持つ患者における５％から、集中治療室（ＩＣＵ）に入っている患者における３０％までさまざまである。近年の診断および治療の進歩にもかかわらず、ＡＫＩに関連する罹患率および死亡率は非常に高い状態にとどまっており（ＩＣＵの患者において４０％以上６０％以下）、利用可能なＡＫＩ早期発見用のツールの感受性および特異性の欠如が主な原因となり、過去４０年間あまり改善されていない（Clin J Am Soc Nephrol 3:1895-1901,2088)。このため、早期のバイオマーカーの探索は、非常に重要性を増している。さらに、これらの新たなバイオマーカーは、ＡＫＩの早期発見を実現可能なツールとなりうるとともに、程度の異なる腎障害を識別し、重篤なＡＫＩの発症が原因となって慢性腎臓病に発展するリスクのある患者の検出法を確立することができるかもしれない。それゆえ、有効なバイオマーカーの開発は、例えば、ＩＣＵで治療を受けている患者、心臓外科を受診するであろう患者、腎移植患者、またはＡＫＩを発症した患者のような、ＡＫＩに罹患した患者において、ＡＫＩの妥当な治療のための適切な介入治療を行う手助けとなるであろう。そして、上記バイオマーカーは、上記障害を階層化する手助けとなるとともに、慢性腎臓病に発展するリスクのある患者を検出する手助けとなるであろう。
【０００３】
臨床診療において、ＡＫＩの診断法は、血清クレアチニンの増加と、糸球体のろ過率（ＧＦＲ）の評価とに基づいて確立される。血清クレアチニンは慢性腎臓病患者における腎機能の評価には有用であるが、以下の３つの理由により、ＡＫＩ患者においては良い指標とはいえない：１）血清クレアチニンの増加なしに大量の腎組織が障害されうる。明確な例は、腎臓の５０％を供出し、血清クレアチニンレベルに何らの変化も生じない腎移植のドナーに見られる。２）血清クレアチニン濃度は、例えば、骨格筋におけるクレアチンのクレアチニンへの転換、クレアチニンの血液中への遊離、などの腎臓に無関係の多くの因子に依存する。そのため、血清クレアチニンの増加は、クレアチニンの遊離および蓄積に依存するので、遅発型として生じる。３）血清クレアチニンは、例えば、体重、種、性別、年齢、薬物の消費、筋肉の代謝およびタンパク質摂取などの他の因子による影響を受けうる。ＧＦＲの決定に関して、血清クレアチニンは、腎臓の障害および腎臓に無関係の障害によって変化しうる。例えば、血液量減退症または求心性細動脈における血管収縮もしくは血管拡張の程度の変化は、血清クレアチニンの必然的な増加を伴うＴＧＦの減少を引き起こす。このことは、尿細管または腎臓の障害とは相関しない。これら全ての因子は、ＡＫＩを発症する患者の早期の介入治療を困難にしており、結果として良好な予後が得られない（Clin Transl Sci 3;200-208;2008)。
【０００４】
バイオマーカーは、内因性であり、異常な生物学的プロセスを検出するための客観的な指標でありうる生物学的分子である。さらに、バイオマーカーは、薬理学的な介入治療が、病理学的プロセスによって誘発される障害を減じるために有益であるかどうかを検出する手助けとなりうる。
【０００５】
特に、ＡＫＩ患者においては、有益なバイオマーカーは、早期に、正確に、かつ容易に、ＡＫＩの主要な構造的合併症、すなわち急性尿細管壊死（ＡＴＮ）を検出する手助けとなるバイオマーカーであろう。ＡＴＮは、刷子縁の損失および上皮における極性が原因となる、近位尿細管の重篤な障害によって特徴付けられる。これらの特徴により、分離した細胞中に検出することができ、尿中に現れ、それゆえにこの症候群に随伴する尿細管の障害を反映しているバイオマーカーを見出すことができる。
【０００６】
上記バイオマーカーは、他のタイプの腎障害からＡＴＮを区別する手助けとはならないだろうが、尿細管の障害位置、原因および上記障害の時間的経過を特定することも可能かもしれない。
【０００７】
いくつかの研究により、ＡＴＮ検出のためのタンパク質および生化学的マーカーが提案されている。その中には、Ｎ−アセチル−ｂ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、好中球ゼラチナーゼに関連するリポカリン（ＮＧＡＬ）、腎障害分子−１（Ｋｉｍ−１）、シスタチンＣおよびインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）がある（Am J Physiol Renal Physiol 290:F517-F529) (J Am Soc Nephrol 18:904-912, 2007) (Am J of Tranplantation 6:1639-1645;2006)。近年の報告では、心臓手術を受けた９０人の患者について、Ｋｉｍ−１、ＮＡＧおよびＮＧＡＬの診断上の有用性が評価されている。心臓手術後すぐ、または心臓手術の３時間後に、ＡＫＩ検出用のこれらの分子の能力を１のスケールを用いて解析することによって、Ｋｉｍ−１の能力はそれぞれ０．６８と０．６５、ＮＡＧの能力は０．６１と０．６３、ＮＧＡＬは０．５９と０．６５であることが分かった。これらのマーカーの感度を増加させるためには、これらのマーカーの定量と組み合わせる必要があった。そして、この方法では、上記感度とＡＫＩの早期検出とは、それぞれ０．７５と０．７８とに増加した(Clin J Am Soc Nephrol 5;873-882,2009)。このことは、早期診断のためのためのより高い能力と、ＡＫＩによる障害を階層化する能力を備えた新規バイオマーカーの探索が引き続き行われるべきである、という考え方をサポートするものである。
【０００８】
ＡＫＩが発症している間、結果として見られる細胞のストレスを補償するいくつかのメカニズムが活性化され、当該メカニズムの一つは、細胞の恒常性の修復を助ける熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ）の発現増加であることが報告されている(Experientia 18, 571-573,1962)。これらのタンパク質は、複遺伝子性のファミリーに属し、１０ｋＤａから１５０ｋＤａまでの分子量を持つ。これらのタンパク質は分子量によって６つのサブファミリーに分類される：すなわち、１００−１１０ｋＤａ、９０ｋＤａ、７０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ、および１８ｋＤａと３０ｋＤａとの間の分子量を持つＨｓｐサブファミリー(Ann Med. 4:261-71,1999)である。
【０００９】
特に、Ｈｓｐ７０のファミリーは、４つのアイソフォーム、すなわち、Ｇｒｐ７８、ｍＨｓｐ９５、Ｈｓｃ７０および誘導可能なアイソフォーム：Ｈｓｐ７２、によって構成される。後者は、細胞にストレスが与えられた後に発現し、その誘導は、細胞タンパク質の総量の１５％に達しうる(Cell stress chaperones 4;309-316,2003)。この事実は、ＡＫＩの発症中に生じる、ネフロンの近位尿細管からの細胞の分離と共に、我々の発明、すなわち、ＡＫＩの感受性バイオマーカーとして、イムノアッセイを用いて測定するタンパク質レベルと、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）を用いて測定するｍＲＮＡレベルとで尿におけるＨｓｐ７２を検出すること、の基礎として用いた。
【００１０】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）技術とウエスタンブロット解析は、異なるタイプのサンプルにおいて、抗体を用いて特異的にタンパク質を検出するために広く用いられている(Immunology 6th edition, 2007)。
【００１１】
リアルタイムＰＣＲは、特異的な遺伝子のｍＲＮＡレベルの定量的検出に用いられている。
【００１２】
本発明は、患者の適切な介入治療を効果的な治療法で行うために、ＡＫＩを早期発見できないという、臨床治療に存在する課題を解決すること、および、腎臓が受けた腎障害の程度を階層化することに貢献するものである。
【００１３】
〔発明の開示〕
本発明は、尿サンプル中のバイオマーカーＨｓｐ７２の濃度を用いることによって急性腎障害を早期発見するための、非侵襲性の診断法に関する。この方法は、非侵襲性で、信頼性が高く、簡易な方法である。
【００１４】
本発明において、ＡＫＩを検出する方法は、哺乳類、好ましくはヒト由来の尿サンプルを得ること、および、上記バイオマーカー；熱ショックタンパク質７２（Ｈｓｐ７２）の濃度をタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルで定量することを含む。
【００１５】
上記バイオマーカーの濃度は、ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで、例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット解析などの、特に限定されるものではないイムノアッセイを用いて決定されうる。
【００１６】
上記バイオマーカーの定量結果は、対照の値と比較して４０倍と５３３倍との間で変化する。この増加は障害の強さに依存し、尿中の上記バイオマーカーＨｓｐ７２は、上記障害が腎臓において誘発された後３時間から検出されうる。
【００１７】
Ｈｓｐ７２の定量は、阻血期間の増加によって誘発された障害の強さを階層化することができる。そのことは、重篤な腎障害に苦しむ患者を検出するための臨床治療において重要であり、順に適切な追跡調査を行うことができ、その結果、慢性腎臓病の合併症を回避または減少させることができるため、大きなインパクトとなりうるであろう。
【００１８】
〔実施例〕
以下の実施例は上記発明を例示するものであり、いかなる場合も上記発明を限定するものではない。
【００１９】
〔実施例１〕
感受性で、かつ、早期のＡＫＩのバイオマーカーとしてのＨｓｐ７２の有用性を実証するために、我々はラットにおける腎臓の阻血／血流再開（Ｉ／Ｒ）モデルを用いた。阻血／血流再開モデル：オスのウィスターラットを研究中用いた。上記ラットは、ペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いて麻酔し、開腹して、腎臓の椎弓根を精査した。その後、軽度の腎障害から中程度および重篤な腎障害まで、程度の異なる腎障害を評価する目的で、動脈を１０分間，２０分間，３０分間，４５分間、および６０分間クランプすることによって、腎臓への血流を妨げた。さらに、対照として、模擬手術に供したグループを含めた。各グループは６匹のラットで構成した。阻血期間の終了時に、上記ラットは縫合し、腎臓への血流を２４時間再開した。バイオマーカーとしてのＨｓｐ７２のｍＲＮＡレベルを定量する有用性を確定するために、６グループに分けた３６匹のラットを用いた。対照のグループ並びに、１０分間，２０分間，３０分間，４５分間、および６０分間、両側の阻血を行ったラットは、全て２４時間血流を再開した。尿は、後述するように、ｍＲＮＡの分解を避けるための特別な条件下で回収した。
【００２０】
同様の方法で、早期のバイオマーカーとしてのＨｓｐ７２のタンパク質レベルを定量する有用性を確定するために、さらに３３匹のラットを１１のグループ、すなわち、模擬手術に供した対照のグループと、両側を３０分間阻血し、３，６，９，１２，１８，２４，４８，７２，９６および１２０時間血流を再開させたラットに分けた。尿は、ＥＬＩＳＡ法を用いて早期バイオマーカーとしてのＨｓｐ７２タンパク質レベルの感受性を確認するために回収した。
【００２１】
全てのグループにおいて、クレアチニンクリアランスおよび腎臓の血流を測定することによって腎機能を評価した。構造上の障害は光学顕微鏡および形態計測を用いて評価した。尿細管障害のマーカーとして、尿のＮＡＧおよび総タンパク質レベルを測定した。Ｈｓｐ７２が、阻血中に腎臓中に誘導されるかどうかを研究するため、Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを腎臓の組織抽出物中で評価した。Ｈｓｐ７２が程度の異なる腎障害を検出するための感受性かつ早期のバイオマーカーであるかどうかを決定するために、尿のＨｓｐ７２レベルをＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを用いて定量した。
【００２２】
〔実施例２〕リアルタイムＰＣＲを用いることによるＨｓｐ７２の検出
Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡレベルを検出するために、３０分間の両側の阻血を行った３０匹のオスのウィスターラットを６つのグループに分けた。すなわち、模擬手術に供したラット（対照群）、および１０，２０，３０，４５、および６０分、両側の阻血を行い、２４時間の血流再開を行ったグループである。手術の１時間後、上記ラットを代謝ケージ内に２４時間入れた。上記代謝ケージは、予めＲＮＡ阻害剤（ＲＮＡｓｅ Ｚａｐ，Ａｍｂｉｏｎ）で処理しておいた。尿を２４時間回収した管内に、３００μｌのＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を添加し、当該サンプルを３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。尿の沈殿物はｐＨ＝７．４のリン酸バッファーに再度懸濁させ、１３０００ｒｐｍで３分間、再度遠心分離した。総ＲＮＡ抽出は、メーカー（Invitrogen）によって提供されたトリゾール法に従って行った。ＲＮＡの濃度は、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって決定し、ＲＮＡの保存性は、１％アガロースゲル電気泳動によって確認した。各ｃＤＮＡは、３７℃で６０分間、逆転写酵素反応（ＲＴ）を行うことによって、１μｇのＲＮＡから合成した。Ｈｓｐ７２のＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲによって検出した。リボゾームＲＮＡ１８Ｓは、増幅の効率変動値を修正するための対照遺伝子として含有させた。
【００２３】
〔実施例３．ＥＬＩＳＡを用いたＨｓｐ７２の検出〕
Ｈｓｐ７２のタンパク質レベルを検出するために、３６匹のラットを１０，２０，３０，４５、および６０分の両側阻血に供した。手術の１時間後、上記ラットを代謝ケージに２４時間入れ、尿を回収した。尿は、すぐにＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットアッセイに供する必要があるが、その他の尿はＨｓｐ７２の分解を避けるために−８０℃で保存する必要がある。Ｈｓｐ７２のＥＬＩＳＡによる定量には、Stressgene製の市販キットであるＨｓｐ７０高感度ＥＬＩＳＡキットを以下に要約するように用いた：
１）尿サンプル１００μｌをＥＬＩＳＡプレートの各穴に添加した；
２）上記プレートを緩やかに振盪しながら、室温で２時間培養した；
３）上記キットに付属の洗浄バッファーを用いて、各穴について３回洗浄を行う必要がある；
４）一次抗体（抗−Ｈｓｐ７２）１００μｌを上記穴に添加する必要があり、上記プレートを６０分間培養する。終了時に、３）で述べたように３度の洗浄を行う必要がある；
５）ＨＲＰに結合した二次抗体１００μｌを添加する必要があり、室温で再度６０分間培養した。期間の終了時にさらに３回の洗浄を行う必要がある；
６）（上記キット由来の）基質溶液１００μｌを各穴に入れる必要があり、上記プレートは室温で３０分間培養する必要がある；
７）（上記キット由来の）停止溶液１００μｌを添加する必要がある；
８）上記プレートは、メーカーの指示書に記載されているように、４５０ｎｍで読み取る必要がある。
【００２４】
〔実施例４．ウエスタンブロットを用いたＨｓｐ７２の検出〕
上述した上記ラットの尿サンプルと同じものを用いた。それぞれの尿は、１：１００に希釈する必要があり、希釈した当該尿の１０μｌのみが用いられる。希釈した上記尿は、１０μｌのローディングバッファー（６％ＳＤＳ，１５％グリセリン、１５０ｍＭトリス、３％ブロモフェノールブルー、２％β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．６）と混合した。上記タンパク質は９５℃で５分間変性させ、８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動によって分離し、予め１×移動バッファー（１９０ｍＭグリシン、２ｍＭトリス塩基、ＳＤＳ０．１％、trans-blot（SD cell, BioRad）中のメタノール２００ｍＬ）中において９Ｖで６０分間平衡化し、ポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ，Amersham Pharmacia Biotech, Psicataway, NJ, USA）に電気的にブロットし、５％ブロッキング剤（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて室温でＴＢＳ−Ｔ中にブロックする。ブロッキング工程の後、上記膜は、抗-Ｈｓｐ７２一次抗体１：５０００（Stressgene）と４℃で一晩培養した。培養後、上記膜をＴＢＳ−Ｔで各１０分間、３回洗浄した。その後、ＩｇＧヤギ抗-マウス二次抗体を上記膜１：５０００（Santa Cruz Biotechnology Inc）と室温で９０分間培養し、上記膜を再度６回洗浄した。上記Ｈｓｐ７２の量は、市販のキットであるECL plus（GE Healthcare Life Sciences)を用いて検出し、得られたバンドをデンシトメトリー解析のためにスキャンした。
【００２５】
〔結果〕
まず、我々は、両側の阻血を行う時間を異ならせ（１０分〜６０分）、２４時間の血流再開を行うことが腎機能に与える効果を評価した。阻血に供した５グループのラットは、腎機能の異常を発症していた。このことは、図１Ａおよび１Ｂに示すように、血清クレアチニンの顕著な増加、および、クレアチニンクリアランスによって測定したＧＦＲの減少によって実証された。腎機能の異常は、図１Ｃおよび１Ｄに詳しく示されているように、平均動脈圧を変化させることなく、腎臓の血流の減少（１０％から３０％まで）と相関していた。
【００２６】
光学顕微鏡による研究により、両側の阻血を異なる時間行い、２４時間の血流再開を行うと、図２の各グループ（Ａ）〜（Ｆ）の写真に示すように、誘発した阻血の時間にしたがって、程度の異なる尿細管障害が誘導されたことが明らかとなった。上記障害は、刷子縁の損失、尿細管の拡張、細胞の分離、および尿円柱の形成によって特徴付けられた。図２Ｇおよび２Ｈに示されている視野あたりの尿円柱の数、および、障害を受けた尿細管の面積の割合の解析により、阻血時間が長くなるほど、尿細管障害の発生の程度は大きくなることが明らかとなった。このことは、障害の強さと比例して、尿細管の障害と尿円柱の数とが漸進的な増加を示したことを意味する。光学顕微鏡によって評価した組織学的な障害は、阻血／血流再開によって誘導された障害の程度を決定するためのゴールドスタンダードである。それが、次の図面において、Ｈｓｐ７２バイオマーカーと尿細管障害との相関を示す理由である。
【００２７】
尿タンパク質の排出、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）およびＨ２Ｏ２などの、尿細管障害および酸化的なストレスの古典的なマーカーのいくつかを評価した。図３Ａに表されているように、ＮＡＧの増加は、阻血３０分以降のみ統計学的に有意であった。このことは、このマーカーは短い阻血時間（１０分または２０分）によって誘導された腎障害を同定することができないことを意味する。酸化的なストレスマーカーについては、図３Ｂに示すように、Ｈ２Ｏ２の尿中への排出が阻血時間１０分から増加したが、特に阻血時間２０分と６０分との間で、異なるいくつかの阻血の程度に十分に感受的ではなかった。最後に、図３Ｃに示すように、タンパク尿が程度の異なる腎障害を検出する最良のマーカーであることが分かった。Ｈｓｐ７２が異なる阻血時間の間、腎組織に誘導されるかどうかを評価するため、Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを腎組織において決定した。このことは、一度尿を回収するとラットを屠殺し、ｍＲＮＡおよびタンパク質を抽出するために腎臓の一つを取得することを意味する。図４Ａおよび４Ｂに示すように、Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルは、Ｉ／Ｒを行ったグループの各ラット由来の腎組織において有意に増加した。また、阻血／血流再開の時間を異ならせることによって誘導される程度の異なる腎障害を明確に制限する漸進的な増加が認められる。これらの結果は、Ｉ／Ｒ現象の間、Ｈｓｐ７２の発現増加が見られ、我々の発明にとって興味深く、好都合なことに、誘導された障害の程度に比例することを示している。
【００２８】
我々は、感受的で、かつ、非侵襲的な方法を開発するために、このタンパク質が腎臓の阻血／血流再開という障害を受けたラットの尿中に検出されうるかどうかについて、これらのデータを用いて研究することはしなかった。この目的のため、我々は２つのイムノアッセイを用いることによってＨｓｐ７２のレベルを決定した。一つ目はＥＬＩＳＡによるもので、二つ目はウエスタンブロット解析によるものであった。ＥＬＩＳＡによる尿のＨｓｐ７２の定量により、Ｈｓｐ７２が阻血１０分から尿中に検出されうるため、このタンパク質がＡＫＩ由来の優れたバイオマーカーであり、阻血によって誘導された腎障害の程度に従った漸進的な増加を示し、図４Ｃに示すように、６０分の阻血に供したラット中では、対照と比較して２５倍の誘導に達したことが明らかとなった。これらのバイオマーカーの上記漸進的な増加は、阻血による障害のゴールドスタンダード；組織病理学的解析と有意に相関していた。図５Ａは、尿中のＨｓｐ７２の量と、尿円柱の形成との間に、０．８３およびｐ＜０．０００１の関係を持つ正の相関があることを示しており、図５Ｂは、尿のＨｓｐ７２と障害を受けた面積の割合との間に０．７９およびｐ＜０．０００１の相関があることを示している。
【００２９】
我々がＨｓｐ７２のタンパク質レベルを検出するために用いた他の戦略は、異なるグループの尿サンプルからのウエスタンブロット解析によるものであった。図６Ａの上側の図面は、ウエスタンブロット解析由来のオートラジオグラフィを表し、下のグラフはスキャンされたバンドのデンシトメトリー解析を表している。図からわかるように、Ｉ／Ｒは、阻血時間を異ならせたラットにおける尿中のＨｓｐ７２レベルの有意な増加を誘導した。ＥＬＩＳＡ解析と同様に、Ｈｓｐ７２の検出は、１０分間の阻血から統計的に有意であり、誘導された腎障害の程度に比例して増加した。１０分間阻血のグループでは、Ｈｓｐ７２の増加は４０倍であったが、漸進的に増加し、６０分間阻血し重篤な腎障害を持つグループでは５３５倍に達したので、程度の異なる腎障害を検出する感度は、ＥＬＩＳＡを用いた場合よりも、ウエスタンブロットを用いた場合の方が高かった。尿中のＨｓｐ７２の量と、尿円柱の形成との間の、０．９４７６、ｐ＜０．０００１の相関を図６Ｂに示す。これらの結果は、尿中のＨｓｐ７２の検出が、程度の異なる腎障害を検出するために十分な感受性を有していることを実証している。しかしながら、ウエスタンブロットによるこのタンパク質の検出は、ＥＬＩＳＡ解析よりも優れていた（相関を参照）。さらに、ウエスタンブロットでは、わずか０．１μｌの尿しか必要としないが、ＥＬＩＳＡでは１００μｌが必要であることは、強調すべき重要なことである。
【００３０】
Ｈｓｐ７２の検出が、そのタンパク質レベルでの定量にのみ限られるものではないかどうかを調べるため、我々は、阻血に供したラットの尿中におけるＨｓｐ７２のｍＲＮＡ量を調べることにした。抽出したＲＮＡの保存性を図７Ａに示す。Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡの尿中におけるレベルは、図７Ｂに表されているように、阻血に供したラットでは、対照群に比べて増加していた。タンパク質レベルにおいて生じたように、尿中のｍＲＮＡレベルは誘導された障害の程度に比例して増加した。このことは、上記ゴールドスタンダードと相関しており、図７Ｃに示すように、Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡレベルと、視野当たりの尿円柱の数との間には０．８５０９の有意な相関があった。
【００３１】
最後に、ＡＫＩの早期バイオマーカーとしてのＨｓｐ７２の有用性を評価するために、尿中のＨｓｐ７２の濃度を、３０分間の阻血および３時間から１２０時間までの血流再開に供したラットにおいて決定した。図８は、尿細管障害の他のマーカーと比較したＨｓｐ７２の検出結果を示している。図８Ｃに表されているように、早期（血流再開時間が３時間）からＨｓｐ７２の有意な増加が観察され、血流再開時間が１８時間でピークに達し、後にこのタンパク質の尿中への排出は減少した。このことは、７２時間後の尿細管再生と相関している。これらの結果は、ＡＫＩ検出の早期バイオマーカーとしてのＨｓｐ７２の有用性を示している。
【００３２】
さらに、３つの異なる方法論を用いることによって観察される上記バイオマーカーの定量結果は、対照群よりも大きかった。そして、観察された増加は障害の強さに依存している。尿中のＨｓｐ７２が、腎臓の障害が誘導された後、はじめの３時間から検出されうることは強調すべき重要なことである。
【００３３】
〔実施例５．健康で生存中の腎臓ドナーおよびＡＫＩ患者における尿中のＨｓｐ７２レベル〕
５人の健康な腎臓ドナー由来のサンプルを回収し（対照）、Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutricion, Salvador Zubiranの集中治療室から敗血病性のＡＫＩに罹患している９人の患者由来のサンプルを回収した。ＡＫＩＮ（急性腎障害ネットワーク）ガイドラインに従って、基本的に血清クレアチニンの０．３ｍｇ／ｄｌ以上の増加によってＡＫＩと診断した。健康なドナーでは、腎切除の１日前に、その日の最初の尿を回収した（インフォームド・コンセント）。全ての敗血症患者を毎日観察し、ＡＫＩと診断されたときに、新鮮な尿を尿回収バッグから排出することによって回収した。全てのサンプルは冷凍し、Ｈｓｐ７２を解析するまで−８０℃で保存した。
【００３４】
〔健康なドナーおよびＡＫＩ患者における尿中のＨｓｐ７２レベル（結果）〕
Ｈｓｐ７２がヒトのＡＫＩ検出の感受性バイオマーカーであるかどうかを決定するため、尿中での当該タンパク質のレベルを、ウエスタンブロットによって解析し、健康なドナーと集中治療室に入院中のＡＫＩを発症した患者との比較を行った。ＡＫＩは、少なくとも０．３ｍｇ／ｄｌの血清クレアチニンの増加、または６時間、０．５ｍｌ／ｋｇ／ｈよりも小さい尿体積を示すこととして定義された。表１は５人の健康な腎臓ドナーおよび敗血症性ＡＫＩに罹患している９人の患者の一般的特徴および腎機能を示している。ＡＫＩ患者のグループでは、５人が女性、４人が男性であり、年齢は２４歳から８４歳までであった。ＩＣＵに入院した時点では、全ての患者は正常な血清クレアチニン値を示すが、ＩＣＵに滞在中のクレアチニンは、0.55 ± 0.05 mg/dLから 2.30 ±0.52 mg/dLまで増加し、ＡＫＩの発症を示す。尿中のＨｓｐ７２のレベルは図９に表されている。Ｈｓｐ７２は、健康な腎臓ドナーの尿中に殆ど検出できなかった（33.7 ± 7.1 任意単位）が、ＡＫＩ患者ではＨｓｐ７２のレベルは増加した（583 ± 85.1）。注目すべきは、ＡＫＩと診断された患者二名が入院中に死亡し、その二名は、より高いＨｓｐレベルを示した患者の中の二名であったことである。
【００３５】
【表１】
【００３６】
上記発明を十分に開示し、上記発明が新規であると考えるので、我々は、我々の独占的財産として、特許請求の範囲に含有される特徴について権利を請求する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】模擬手術に供したラットと、１０、２０、３０、４５および６０分間の阻血並びに２４時間の血流再開に供したラットと、における腎機能のパラメータ。ＡＫＩは血清クレアチニンの増加（Ａ）、クレアチニンクリアランスの減少（Ｂ）および腎臓の血流（Ｃ）、平均動脈圧に変化がないこと（Ｄ）によって証明された。対照に対して＊ｐ＜０．０５である。
【図２】各グループの腎臓由来の、ＰＡＳ染色した皮質下の組織断片（Ａ−Ｆ）。視野あたりの尿円柱の数の計数；ラットあたり５視野を定量した（Ｇ）。障害を受けた尿細管の面積率は、刷子縁および極性の損失と、細胞の分離とによって決定した。対照に対して＊ｐ＜０．０５である。
【図３】尿細管の障害および酸化的ストレスマーカーの定量。Ｉ／Ｒを行ったグループにおいて、ＮＡＧ（Ａ）、タンパク質（Ｂ）およびＨ２Ｏ２（Ｃ）の尿中排出が、対照に対して増加した。対照に対して＊ｐ＜０．０５である。
【図４】（Ａ）はＩ／Ｒに供したラットの皮質におけるＨｓｐ７２のｍＲＮＡレベルを表す。（Ｂ）は腎皮質におけるＨｓｐ７２タンパク質レベルのウエスタンブロット解析と、Ｉ／Ｒの時間を異ならせたラットにおけるＨｓｐ７２タンパク質の過剰発現とを表す。（Ｃ）は、尿中のＨｓｐ７２濃度を表す。対照に対して＊ｐ＜０．０５である。
【図５】（Ａ）は尿中のＨｓｐ７２の量と、尿円柱の形成との間の正の相関を示す。（Ｂ）は尿中のＨｓｐ７２の量と、障害を受けた尿細管の面積の％との間の関係を示し、ｒ＝０．７９、ｐ＜０．０００１である。
【図６】（Ａ）は、両側の阻血を行ったラットにおけるＨｓｐ７２の尿中濃度のウエスタンブロット解析を示す。（Ｂ）は、ウエスタンブロットによって検出したＨｓｐ７２の量と、尿円柱の形成との間の相関を示す。
【図７】（Ａ）は、尿から抽出したＲＮＡの保存性を示すアガロースゲル電気泳動結果を表す。（Ｂ）は、Ｉ／Ｒに供したラットの尿におけるＨｓｐ７２のｍＲＮＡレベルを表す。対照に対して＊ｐ＜０．０１である。（Ｃ）は、尿中のＨｓｐ７２のｍＲＮＡレベルと、尿円柱の形成との間の相関を表す。
【図８】３０分間両側の阻血および異なる時間の血流再開：３，６，９，１２，１８，２４，４８，７２，９６，１２０時間を行ったラットにおける尿中のＮＡＧ、タンパク質、およびＨｓｐ７２の定量。対照に対して＊ｐ＜０．０５である。
【図９】ウエスタンブロット解析によって決定した、健康な腎臓ドナーおよびＡＫＩ患者における尿中のＨｓｐ７２レベル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、臨床医学の分野に適合し、急性腎障害（ＡＫＩ）を検出するための診断方法に関する。より具体的には、７２ｋＤａの熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７２）が、非侵襲性で感受性の、ＡＫＩを検出可能な早期のバイオマーカーであることの実証と、尿サンプル中のＨｓｐ７２を検出する定量法とに関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
急性腎障害は、異なる原因で入院している患者間に見られる罹患および死亡の重要な原因である。ＡＫＩの出現率は正常な腎機能を持つ患者における５％から、集中治療室（ＩＣＵ）に入っている患者における３０％までさまざまである。近年の診断および治療の進歩にもかかわらず、ＡＫＩに関連する罹患率および死亡率は非常に高い状態にとどまっており（ＩＣＵの患者において４０％以上６０％以下）、利用可能なＡＫＩ早期発見用のツールの感受性および特異性の欠如が主な原因となり、過去４０年間あまり改善されていない（Clin J Am Soc Nephrol 3:1895-1901,2088)。このため、早期のバイオマーカーの探索は、非常に重要性を増している。さらに、これらの新たなバイオマーカーは、ＡＫＩの早期発見を実現可能なツールとなりうるとともに、程度の異なる腎障害を識別し、重篤なＡＫＩの発症が原因となって慢性腎臓病に発展するリスクのある患者の検出法を確立することができるかもしれない。それゆえ、有効なバイオマーカーの開発は、例えば、ＩＣＵで治療を受けている患者、心臓外科を受診するであろう患者、腎移植患者、またはＡＫＩを発症した患者のような、ＡＫＩに罹患した患者において、ＡＫＩの妥当な治療のための適切な介入治療を行う手助けとなるであろう。そして、上記バイオマーカーは、上記障害を階層化する手助けとなるとともに、慢性腎臓病に発展するリスクのある患者を検出する手助けとなるであろう。
【０００３】
臨床診療において、ＡＫＩの診断法は、血清クレアチニンの増加と、糸球体のろ過率（ＧＦＲ）の評価とに基づいて確立される。血清クレアチニンは慢性腎臓病患者における腎機能の評価には有用であるが、以下の３つの理由により、ＡＫＩ患者においては良い指標とはいえない：１）血清クレアチニンの増加なしに大量の腎組織が障害されうる。明確な例は、腎臓の５０％を供出し、血清クレアチニンレベルに何らの変化も生じない腎移植のドナーに見られる。２）血清クレアチニン濃度は、例えば、骨格筋におけるクレアチンのクレアチニンへの転換、クレアチニンの血液中への遊離、などの腎臓に無関係の多くの因子に依存する。そのため、血清クレアチニンの増加は、クレアチニンの遊離および蓄積に依存するので、遅発型として生じる。３）血清クレアチニンは、例えば、体重、種、性別、年齢、薬物の消費、筋肉の代謝およびタンパク質摂取などの他の因子による影響を受けうる。ＧＦＲの決定に関して、血清クレアチニンは、腎臓の障害および腎臓に無関係の障害によって変化しうる。例えば、血液量減退症または求心性細動脈における血管収縮もしくは血管拡張の程度の変化は、血清クレアチニンの必然的な増加を伴うＴＧＦの減少を引き起こす。このことは、尿細管または腎臓の障害とは相関しない。これら全ての因子は、ＡＫＩを発症する患者の早期の介入治療を困難にしており、結果として良好な予後が得られない（Clin Transl Sci 3;200-208;2008)。
【０００４】
バイオマーカーは、内因性であり、異常な生物学的プロセスを検出するための客観的な指標でありうる生物学的分子である。さらに、バイオマーカーは、薬理学的な介入治療が、病理学的プロセスによって誘発される障害を減じるために有益であるかどうかを検出する手助けとなりうる。
【０００５】
特に、ＡＫＩ患者においては、有益なバイオマーカーは、早期に、正確に、かつ容易に、ＡＫＩの主要な構造的合併症、すなわち急性尿細管壊死（ＡＴＮ）を検出する手助けとなるバイオマーカーであろう。ＡＴＮは、刷子縁の損失および上皮における極性が原因となる、近位尿細管の重篤な障害によって特徴付けられる。これらの特徴により、分離した細胞中に検出することができ、尿中に現れ、それゆえにこの症候群に随伴する尿細管の障害を反映しているバイオマーカーを見出すことができる。
【０００６】
上記バイオマーカーは、他のタイプの腎障害からＡＴＮを区別する手助けとはならないだろうが、尿細管の障害位置、原因および上記障害の時間的経過を特定することも可能かもしれない。
【０００７】
いくつかの研究により、ＡＴＮ検出のためのタンパク質および生化学的マーカーが提案されている。その中には、Ｎ−アセチル−ｂ−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、好中球ゼラチナーゼに関連するリポカリン（ＮＧＡＬ）、腎障害分子−１（Ｋｉｍ−１）、シスタチンＣおよびインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）がある（Am J Physiol Renal Physiol 290:F517-F529) (J Am Soc Nephrol 18:904-912, 2007) (Am J of Tranplantation 6:1639-1645;2006)。近年の報告では、心臓手術を受けた９０人の患者について、Ｋｉｍ−１、ＮＡＧおよびＮＧＡＬの診断上の有用性が評価されている。心臓手術後すぐ、または心臓手術の３時間後に、ＡＫＩ検出用のこれらの分子の能力を１のスケールを用いて解析することによって、Ｋｉｍ−１の能力はそれぞれ０．６８と０．６５、ＮＡＧの能力は０．６１と０．６３、ＮＧＡＬは０．５９と０．６５であることが分かった。これらのマーカーの感度を増加させるためには、これらのマーカーの定量と組み合わせる必要があった。そして、この方法では、上記感度とＡＫＩの早期検出とは、それぞれ０．７５と０．７８とに増加した(Clin J Am Soc Nephrol 5;873-882,2009)。このことは、早期診断のためのためのより高い能力と、ＡＫＩによる障害を階層化する能力を備えた新規バイオマーカーの探索が引き続き行われるべきである、という考え方をサポートするものである。
【０００８】
ＡＫＩが発症している間、結果として見られる細胞のストレスを補償するいくつかのメカニズムが活性化され、当該メカニズムの一つは、細胞の恒常性の修復を助ける熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ）の発現増加であることが報告されている(Experientia 18, 571-573,1962)。これらのタンパク質は、複遺伝子性のファミリーに属し、１０ｋＤａから１５０ｋＤａまでの分子量を持つ。これらのタンパク質は分子量によって６つのサブファミリーに分類される：すなわち、１００−１１０ｋＤａ、９０ｋＤａ、７０ｋＤａ、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ、および１８ｋＤａと３０ｋＤａとの間の分子量を持つＨｓｐサブファミリー(Ann Med. 4:261-71,1999)である。
【０００９】
特に、Ｈｓｐ７０のファミリーは、４つのアイソフォーム、すなわち、Ｇｒｐ７８、ｍＨｓｐ９５、Ｈｓｃ７０および誘導可能なアイソフォーム：Ｈｓｐ７２、によって構成される。後者は、細胞にストレスが与えられた後に発現し、その誘導は、細胞タンパク質の総量の１５％に達しうる(Cell stress chaperones 4;309-316,2003)。この事実は、ＡＫＩの発症中に生じる、ネフロンの近位尿細管からの細胞の分離と共に、我々の発明、すなわち、ＡＫＩの感受性バイオマーカーとして、イムノアッセイを用いて測定するタンパク質レベルと、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）を用いて測定するｍＲＮＡレベルとで尿におけるＨｓｐ７２を検出すること、の基礎として用いた。
【００１０】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）技術とウエスタンブロット解析は、異なるタイプのサンプルにおいて、抗体を用いて特異的にタンパク質を検出するために広く用いられている(Immunology 6th edition, 2007)。
【００１１】
リアルタイムＰＣＲは、特異的な遺伝子のｍＲＮＡレベルの定量的検出に用いられている。
【００１２】
本発明は、患者の適切な介入治療を効果的な治療法で行うために、ＡＫＩを早期発見できないという、臨床治療に存在する課題を解決すること、および、腎臓が受けた腎障害の程度を階層化することに貢献するものである。
【００１３】
〔発明の開示〕
本発明は、尿サンプル中のバイオマーカーＨｓｐ７２の濃度を用いることによって急性腎障害を早期発見するための、非侵襲性の診断法に関する。この方法は、非侵襲性で、信頼性が高く、簡易な方法である。
【００１４】
本発明において、ＡＫＩを検出する方法は、哺乳類、好ましくはヒト由来の尿サンプルを得ること、および、上記バイオマーカー；熱ショックタンパク質７２（Ｈｓｐ７２）の濃度をタンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルで定量することを含む。
【００１５】
上記バイオマーカーの濃度は、ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで、例えばＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット解析などの、特に限定されるものではないイムノアッセイを用いて決定されうる。
【００１６】
上記バイオマーカーの定量結果は、対照の値と比較して４０倍と５３３倍との間で変化する。この増加は障害の強さに依存し、尿中の上記バイオマーカーＨｓｐ７２は、上記障害が腎臓において誘発された後３時間から検出されうる。
【００１７】
Ｈｓｐ７２の定量は、阻血期間の増加によって誘発された障害の強さを階層化することができる。そのことは、重篤な腎障害に苦しむ患者を検出するための臨床治療において重要であり、順に適切な追跡調査を行うことができ、その結果、慢性腎臓病の合併症を回避または減少させることができるため、大きなインパクトとなりうるであろう。
【００１８】
〔実施例〕
以下の実施例は上記発明を例示するものであり、いかなる場合も上記発明を限定するものではない。
【００１９】
〔実施例１〕
感受性で、かつ、早期のＡＫＩのバイオマーカーとしてのＨｓｐ７２の有用性を実証するために、我々はラットにおける腎臓の阻血／血流再開（Ｉ／Ｒ）モデルを用いた。阻血／血流再開モデル：オスのウィスターラットを研究中用いた。上記ラットは、ペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）を用いて麻酔し、開腹して、腎臓の椎弓根を精査した。その後、軽度の腎障害から中程度および重篤な腎障害まで、程度の異なる腎障害を評価する目的で、動脈を１０分間，２０分間，３０分間，４５分間、および６０分間クランプすることによって、腎臓への血流を妨げた。さらに、対照として、模擬手術に供したグループを含めた。各グループは６匹のラットで構成した。阻血期間の終了時に、上記ラットは縫合し、腎臓への血流を２４時間再開した。バイオマーカーとしてのＨｓｐ７２のｍＲＮＡレベルを定量する有用性を確定するために、６グループに分けた３６匹のラットを用いた。対照のグループ並びに、１０分間，２０分間，３０分間，４５分間、および６０分間、両側の阻血を行ったラットは、全て２４時間血流を再開した。尿は、後述するように、ｍＲＮＡの分解を避けるための特別な条件下で回収した。
【００２０】
同様の方法で、早期のバイオマーカーとしてのＨｓｐ７２のタンパク質レベルを定量する有用性を確定するために、さらに３３匹のラットを１１のグループ、すなわち、模擬手術に供した対照のグループと、両側を３０分間阻血し、３，６，９，１２，１８，２４，４８，７２，９６および１２０時間血流を再開させたラットに分けた。尿は、ＥＬＩＳＡ法を用いて早期バイオマーカーとしてのＨｓｐ７２タンパク質レベルの感受性を確認するために回収した。
【００２１】
全てのグループにおいて、クレアチニンクリアランスおよび腎臓の血流を測定することによって腎機能を評価した。構造上の障害は光学顕微鏡および形態計測を用いて評価した。尿細管障害のマーカーとして、尿のＮＡＧおよび総タンパク質レベルを測定した。Ｈｓｐ７２が、阻血中に腎臓中に誘導されるかどうかを研究するため、Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを腎臓の組織抽出物中で評価した。Ｈｓｐ７２が程度の異なる腎障害を検出するための感受性かつ早期のバイオマーカーであるかどうかを決定するために、尿のＨｓｐ７２レベルをＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを用いて定量した。
【００２２】
〔実施例２〕リアルタイムＰＣＲを用いることによるＨｓｐ７２の検出
Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡレベルを検出するために、３０分間の両側の阻血を行った３０匹のオスのウィスターラットを６つのグループに分けた。すなわち、模擬手術に供したラット（対照群）、および１０，２０，３０，４５、および６０分、両側の阻血を行い、２４時間の血流再開を行ったグループである。手術の１時間後、上記ラットを代謝ケージ内に２４時間入れた。上記代謝ケージは、予めＲＮＡ阻害剤（ＲＮＡｓｅ Ｚａｐ，Ａｍｂｉｏｎ）で処理しておいた。尿を２４時間回収した管内に、３００μｌのＲＮＡ ｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）を添加し、当該サンプルを３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。尿の沈殿物はｐＨ＝７．４のリン酸バッファーに再度懸濁させ、１３０００ｒｐｍで３分間、再度遠心分離した。総ＲＮＡ抽出は、メーカー（Invitrogen）によって提供されたトリゾール法に従って行った。ＲＮＡの濃度は、２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって決定し、ＲＮＡの保存性は、１％アガロースゲル電気泳動によって確認した。各ｃＤＮＡは、３７℃で６０分間、逆転写酵素反応（ＲＴ）を行うことによって、１μｇのＲＮＡから合成した。Ｈｓｐ７２のＲＮＡレベルは、リアルタイムＰＣＲによって検出した。リボゾームＲＮＡ１８Ｓは、増幅の効率変動値を修正するための対照遺伝子として含有させた。
【００２３】
〔実施例３．ＥＬＩＳＡを用いたＨｓｐ７２の検出〕
Ｈｓｐ７２のタンパク質レベルを検出するために、３６匹のラットを１０，２０，３０，４５、および６０分の両側阻血に供した。手術の１時間後、上記ラットを代謝ケージに２４時間入れ、尿を回収した。尿は、すぐにＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットアッセイに供する必要があるが、その他の尿はＨｓｐ７２の分解を避けるために−８０℃で保存する必要がある。Ｈｓｐ７２のＥＬＩＳＡによる定量には、Stressgene製の市販キットであるＨｓｐ７０高感度ＥＬＩＳＡキットを以下に要約するように用いた：
１）尿サンプル１００μｌをＥＬＩＳＡプレートの各穴に添加した；
２）上記プレートを緩やかに振盪しながら、室温で２時間培養した；
３）上記キットに付属の洗浄バッファーを用いて、各穴について３回洗浄を行う必要がある；
４）一次抗体（抗−Ｈｓｐ７２）１００μｌを上記穴に添加する必要があり、上記プレートを６０分間培養する。終了時に、３）で述べたように３度の洗浄を行う必要がある；
５）ＨＲＰに結合した二次抗体１００μｌを添加する必要があり、室温で再度６０分間培養した。期間の終了時にさらに３回の洗浄を行う必要がある；
６）（上記キット由来の）基質溶液１００μｌを各穴に入れる必要があり、上記プレートは室温で３０分間培養する必要がある；
７）（上記キット由来の）停止溶液１００μｌを添加する必要がある；
８）上記プレートは、メーカーの指示書に記載されているように、４５０ｎｍで読み取る必要がある。
【００２４】
〔実施例４．ウエスタンブロットを用いたＨｓｐ７２の検出〕
上述した上記ラットの尿サンプルと同じものを用いた。それぞれの尿は、１：１００に希釈する必要があり、希釈した当該尿の１０μｌのみが用いられる。希釈した上記尿は、１０μｌのローディングバッファー（６％ＳＤＳ，１５％グリセリン、１５０ｍＭトリス、３％ブロモフェノールブルー、２％β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．６）と混合した。上記タンパク質は９５℃で５分間変性させ、８．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動によって分離し、予め１×移動バッファー（１９０ｍＭグリシン、２ｍＭトリス塩基、ＳＤＳ０．１％、trans-blot（SD cell, BioRad）中のメタノール２００ｍＬ）中において９Ｖで６０分間平衡化し、ポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ，Amersham Pharmacia Biotech, Psicataway, NJ, USA）に電気的にブロットし、５％ブロッキング剤（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて室温でＴＢＳ−Ｔ中にブロックする。ブロッキング工程の後、上記膜は、抗-Ｈｓｐ７２一次抗体１：５０００（Stressgene）と４℃で一晩培養した。培養後、上記膜をＴＢＳ−Ｔで各１０分間、３回洗浄した。その後、ＩｇＧヤギ抗-マウス二次抗体を上記膜１：５０００（Santa Cruz Biotechnology Inc）と室温で９０分間培養し、上記膜を再度６回洗浄した。上記Ｈｓｐ７２の量は、市販のキットであるECL plus（GE Healthcare Life Sciences)を用いて検出し、得られたバンドをデンシトメトリー解析のためにスキャンした。
【００２５】
〔結果〕
まず、我々は、両側の阻血を行う時間を異ならせ（１０分〜６０分）、２４時間の血流再開を行うことが腎機能に与える効果を評価した。阻血に供した５グループのラットは、腎機能の異常を発症していた。このことは、図１Ａおよび１Ｂに示すように、血清クレアチニンの顕著な増加、および、クレアチニンクリアランスによって測定したＧＦＲの減少によって実証された。腎機能の異常は、図１Ｃおよび１Ｄに詳しく示されているように、平均動脈圧を変化させることなく、腎臓の血流の減少（１０％から３０％まで）と相関していた。
【００２６】
光学顕微鏡による研究により、両側の阻血を異なる時間行い、２４時間の血流再開を行うと、図２の各グループ（Ａ）〜（Ｆ）の写真に示すように、誘発した阻血の時間にしたがって、程度の異なる尿細管障害が誘導されたことが明らかとなった。上記障害は、刷子縁の損失、尿細管の拡張、細胞の分離、および尿円柱の形成によって特徴付けられた。図２Ｇおよび２Ｈに示されている視野あたりの尿円柱の数、および、障害を受けた尿細管の面積の割合の解析により、阻血時間が長くなるほど、尿細管障害の発生の程度は大きくなることが明らかとなった。このことは、障害の強さと比例して、尿細管の障害と尿円柱の数とが漸進的な増加を示したことを意味する。光学顕微鏡によって評価した組織学的な障害は、阻血／血流再開によって誘導された障害の程度を決定するためのゴールドスタンダードである。それが、次の図面において、Ｈｓｐ７２バイオマーカーと尿細管障害との相関を示す理由である。
【００２７】
尿タンパク質の排出、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）およびＨ２Ｏ２などの、尿細管障害および酸化的なストレスの古典的なマーカーのいくつかを評価した。図３Ａに表されているように、ＮＡＧの増加は、阻血３０分以降のみ統計学的に有意であった。このことは、このマーカーは短い阻血時間（１０分または２０分）によって誘導された腎障害を同定することができないことを意味する。酸化的なストレスマーカーについては、図３Ｂに示すように、Ｈ２Ｏ２の尿中への排出が阻血時間１０分から増加したが、特に阻血時間２０分と６０分との間で、異なるいくつかの阻血の程度に十分に感受的ではなかった。最後に、図３Ｃに示すように、タンパク尿が程度の異なる腎障害を検出する最良のマーカーであることが分かった。Ｈｓｐ７２が異なる阻血時間の間、腎組織に誘導されるかどうかを評価するため、Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを腎組織において決定した。このことは、一度尿を回収するとラットを屠殺し、ｍＲＮＡおよびタンパク質を抽出するために腎臓の一つを取得することを意味する。図４Ａおよび４Ｂに示すように、Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルは、Ｉ／Ｒを行ったグループの各ラット由来の腎組織において有意に増加した。また、阻血／血流再開の時間を異ならせることによって誘導される程度の異なる腎障害を明確に制限する漸進的な増加が認められる。これらの結果は、Ｉ／Ｒ現象の間、Ｈｓｐ７２の発現増加が見られ、我々の発明にとって興味深く、好都合なことに、誘導された障害の程度に比例することを示している。
【００２８】
我々は、感受的で、かつ、非侵襲的な方法を開発するために、このタンパク質が腎臓の阻血／血流再開という障害を受けたラットの尿中に検出されうるかどうかについて、これらのデータを用いて研究することはしなかった。この目的のため、我々は２つのイムノアッセイを用いることによってＨｓｐ７２のレベルを決定した。一つ目はＥＬＩＳＡによるもので、二つ目はウエスタンブロット解析によるものであった。ＥＬＩＳＡによる尿のＨｓｐ７２の定量により、Ｈｓｐ７２が阻血１０分から尿中に検出されうるため、このタンパク質がＡＫＩ由来の優れたバイオマーカーであり、阻血によって誘導された腎障害の程度に従った漸進的な増加を示し、図４Ｃに示すように、６０分の阻血に供したラット中では、対照と比較して２５倍の誘導に達したことが明らかとなった。これらのバイオマーカーの上記漸進的な増加は、阻血による障害のゴールドスタンダード；組織病理学的解析と有意に相関していた。図５Ａは、尿中のＨｓｐ７２の量と、尿円柱の形成との間に、０．８３およびｐ＜０．０００１の関係を持つ正の相関があることを示しており、図５Ｂは、尿のＨｓｐ７２と障害を受けた面積の割合との間に０．７９およびｐ＜０．０００１の相関があることを示している。
【００２９】
我々がＨｓｐ７２のタンパク質レベルを検出するために用いた他の戦略は、異なるグループの尿サンプルからのウエスタンブロット解析によるものであった。図６Ａの上側の図面は、ウエスタンブロット解析由来のオートラジオグラフィを表し、下のグラフはスキャンされたバンドのデンシトメトリー解析を表している。図からわかるように、Ｉ／Ｒは、阻血時間を異ならせたラットにおける尿中のＨｓｐ７２レベルの有意な増加を誘導した。ＥＬＩＳＡ解析と同様に、Ｈｓｐ７２の検出は、１０分間の阻血から統計的に有意であり、誘導された腎障害の程度に比例して増加した。１０分間阻血のグループでは、Ｈｓｐ７２の増加は４０倍であったが、漸進的に増加し、６０分間阻血し重篤な腎障害を持つグループでは５３５倍に達したので、程度の異なる腎障害を検出する感度は、ＥＬＩＳＡを用いた場合よりも、ウエスタンブロットを用いた場合の方が高かった。尿中のＨｓｐ７２の量と、尿円柱の形成との間の、０．９４７６、ｐ＜０．０００１の相関を図６Ｂに示す。これらの結果は、尿中のＨｓｐ７２の検出が、程度の異なる腎障害を検出するために十分な感受性を有していることを実証している。しかしながら、ウエスタンブロットによるこのタンパク質の検出は、ＥＬＩＳＡ解析よりも優れていた（相関を参照）。さらに、ウエスタンブロットでは、わずか０．１μｌの尿しか必要としないが、ＥＬＩＳＡでは１００μｌが必要であることは、強調すべき重要なことである。
【００３０】
Ｈｓｐ７２の検出が、そのタンパク質レベルでの定量にのみ限られるものではないかどうかを調べるため、我々は、阻血に供したラットの尿中におけるＨｓｐ７２のｍＲＮＡ量を調べることにした。抽出したＲＮＡの保存性を図７Ａに示す。Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡの尿中におけるレベルは、図７Ｂに表されているように、阻血に供したラットでは、対照群に比べて増加していた。タンパク質レベルにおいて生じたように、尿中のｍＲＮＡレベルは誘導された障害の程度に比例して増加した。このことは、上記ゴールドスタンダードと相関しており、図７Ｃに示すように、Ｈｓｐ７２のｍＲＮＡレベルと、視野当たりの尿円柱の数との間には０．８５０９の有意な相関があった。
【００３１】
最後に、ＡＫＩの早期バイオマーカーとしてのＨｓｐ７２の有用性を評価するために、尿中のＨｓｐ７２の濃度を、３０分間の阻血および３時間から１２０時間までの血流再開に供したラットにおいて決定した。図８は、尿細管障害の他のマーカーと比較したＨｓｐ７２の検出結果を示している。図８Ｃに表されているように、早期（血流再開時間が３時間）からＨｓｐ７２の有意な増加が観察され、血流再開時間が１８時間でピークに達し、後にこのタンパク質の尿中への排出は減少した。このことは、７２時間後の尿細管再生と相関している。これらの結果は、ＡＫＩ検出の早期バイオマーカーとしてのＨｓｐ７２の有用性を示している。
【００３２】
さらに、３つの異なる方法論を用いることによって観察される上記バイオマーカーの定量結果は、対照群よりも大きかった。そして、観察された増加は障害の強さに依存している。尿中のＨｓｐ７２が、腎臓の障害が誘導された後、はじめの３時間から検出されうることは強調すべき重要なことである。
【００３３】
〔実施例５．健康で生存中の腎臓ドナーおよびＡＫＩ患者における尿中のＨｓｐ７２レベル〕
５人の健康な腎臓ドナー由来のサンプルを回収し（対照）、Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutricion, Salvador Zubiranの集中治療室から敗血病性のＡＫＩに罹患している９人の患者由来のサンプルを回収した。ＡＫＩＮ（急性腎障害ネットワーク）ガイドラインに従って、基本的に血清クレアチニンの０．３ｍｇ／ｄｌ以上の増加によってＡＫＩと診断した。健康なドナーでは、腎切除の１日前に、その日の最初の尿を回収した（インフォームド・コンセント）。全ての敗血症患者を毎日観察し、ＡＫＩと診断されたときに、新鮮な尿を尿回収バッグから排出することによって回収した。全てのサンプルは冷凍し、Ｈｓｐ７２を解析するまで−８０℃で保存した。
【００３４】
〔健康なドナーおよびＡＫＩ患者における尿中のＨｓｐ７２レベル（結果）〕
Ｈｓｐ７２がヒトのＡＫＩ検出の感受性バイオマーカーであるかどうかを決定するため、尿中での当該タンパク質のレベルを、ウエスタンブロットによって解析し、健康なドナーと集中治療室に入院中のＡＫＩを発症した患者との比較を行った。ＡＫＩは、少なくとも０．３ｍｇ／ｄｌの血清クレアチニンの増加、または６時間、０．５ｍｌ／ｋｇ／ｈよりも小さい尿体積を示すこととして定義された。表１は５人の健康な腎臓ドナーおよび敗血症性ＡＫＩに罹患している９人の患者の一般的特徴および腎機能を示している。ＡＫＩ患者のグループでは、５人が女性、４人が男性であり、年齢は２４歳から８４歳までであった。ＩＣＵに入院した時点では、全ての患者は正常な血清クレアチニン値を示すが、ＩＣＵに滞在中のクレアチニンは、0.55 ± 0.05 mg/dLから 2.30 ±0.52 mg/dLまで増加し、ＡＫＩの発症を示す。尿中のＨｓｐ７２のレベルは図９に表されている。Ｈｓｐ７２は、健康な腎臓ドナーの尿中に殆ど検出できなかった（33.7 ± 7.1 任意単位）が、ＡＫＩ患者ではＨｓｐ７２のレベルは増加した（583 ± 85.1）。注目すべきは、ＡＫＩと診断された患者二名が入院中に死亡し、その二名は、より高いＨｓｐレベルを示した患者の中の二名であったことである。
【００３５】
【表１】
【００３６】
上記発明を十分に開示し、上記発明が新規であると考えるので、我々は、我々の独占的財産として、特許請求の範囲に含有される特徴について権利を請求する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】模擬手術に供したラットと、１０、２０、３０、４５および６０分間の阻血並びに２４時間の血流再開に供したラットと、における腎機能のパラメータ。ＡＫＩは血清クレアチニンの増加（Ａ）、クレアチニンクリアランスの減少（Ｂ）および腎臓の血流（Ｃ）、平均動脈圧に変化がないこと（Ｄ）によって証明された。対照に対して＊ｐ＜０．０５である。
【図２】各グループの腎臓由来の、ＰＡＳ染色した皮質下の組織断片（Ａ−Ｆ）。視野あたりの尿円柱の数の計数；ラットあたり５視野を定量した（Ｇ）。障害を受けた尿細管の面積率は、刷子縁および極性の損失と、細胞の分離とによって決定した。対照に対して＊ｐ＜０．０５である。
【図３】尿細管の障害および酸化的ストレスマーカーの定量。Ｉ／Ｒを行ったグループにおいて、ＮＡＧ（Ａ）、タンパク質（Ｂ）およびＨ２Ｏ２（Ｃ）の尿中排出が、対照に対して増加した。対照に対して＊ｐ＜０．０５である。
【図４】（Ａ）はＩ／Ｒに供したラットの皮質におけるＨｓｐ７２のｍＲＮＡレベルを表す。（Ｂ）は腎皮質におけるＨｓｐ７２タンパク質レベルのウエスタンブロット解析と、Ｉ／Ｒの時間を異ならせたラットにおけるＨｓｐ７２タンパク質の過剰発現とを表す。（Ｃ）は、尿中のＨｓｐ７２濃度を表す。対照に対して＊ｐ＜０．０５である。
【図５】（Ａ）は尿中のＨｓｐ７２の量と、尿円柱の形成との間の正の相関を示す。（Ｂ）は尿中のＨｓｐ７２の量と、障害を受けた尿細管の面積の％との間の関係を示し、ｒ＝０．７９、ｐ＜０．０００１である。
【図６】（Ａ）は、両側の阻血を行ったラットにおけるＨｓｐ７２の尿中濃度のウエスタンブロット解析を示す。（Ｂ）は、ウエスタンブロットによって検出したＨｓｐ７２の量と、尿円柱の形成との間の相関を示す。
【図７】（Ａ）は、尿から抽出したＲＮＡの保存性を示すアガロースゲル電気泳動結果を表す。（Ｂ）は、Ｉ／Ｒに供したラットの尿におけるＨｓｐ７２のｍＲＮＡレベルを表す。対照に対して＊ｐ＜０．０１である。（Ｃ）は、尿中のＨｓｐ７２のｍＲＮＡレベルと、尿円柱の形成との間の相関を表す。
【図８】３０分間両側の阻血および異なる時間の血流再開：３，６，９，１２，１８，２４，４８，７２，９６，１２０時間を行ったラットにおける尿中のＮＡＧ、タンパク質、およびＨｓｐ７２の定量。対照に対して＊ｐ＜０．０５である。
【図９】ウエスタンブロット解析によって決定した、健康な腎臓ドナーおよびＡＫＩ患者における尿中のＨｓｐ７２レベル。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性腎障害の早期発見のための診断方法であって、
ａ．哺乳類から尿サンプルを得ること；および、
ｂ．バイオマーカー；熱ショックタンパク質７２（Ｈｓｐ７２）の濃度の定量、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
尿サンプル中のＨｓｐ７２が、腎臓において上記障害が誘発された後３時間から検出されうることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｈｓｐ７２が、急性腎障害の期間を増加させることによって誘発された上記障害の強さを階層化することができることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記バイオマーカーの濃度がｍＲＮＡレベルで決定されうることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記バイオマーカーの濃度がイムノアッセイを用いて決定されうることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記イムノアッセイはＥＬＩＳＡであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
上記イムノアッセイはウエスタンブロットであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
上記バイオマーカーの定量結果は、対照の値と比較して４０倍と５３３倍との間にあり、当該増加は上記障害の強さに依存することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１】
急性腎障害の早期発見のための診断方法であって、
ａ．哺乳類から尿サンプルを得ること；および、
ｂ．バイオマーカー；熱ショックタンパク質７２（Ｈｓｐ７２）の濃度の定量、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記哺乳類がヒトであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
尿サンプル中のＨｓｐ７２が、腎臓において上記障害が誘発された後３時間から検出されうることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｈｓｐ７２が、急性腎障害の期間を増加させることによって誘発された上記障害の強さを階層化することができることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記バイオマーカーの濃度がｍＲＮＡレベルで決定されうることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記バイオマーカーの濃度がイムノアッセイを用いて決定されうることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記イムノアッセイはＥＬＩＳＡであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
上記イムノアッセイはウエスタンブロットであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
上記バイオマーカーの定量結果は、対照の値と比較して４０倍と５３３倍との間にあり、当該増加は上記障害の強さに依存することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１３−５１１７３５（Ｐ２０１３−５１１７３５Ａ）
【公表日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４１０４０（Ｐ２０１２−５４１０４０）
【出願日】平成２２年１１月２３日（２０１０．１１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＸ２０１０／０００１３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６２４６９
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５１２１３５１６０）ウニベルシダッド ナシオナル アウトノマ デ メキシコ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤ ＮＡＣＩＯＮＡＬ ＡＵＴＯＮＯＭＡ ＤＥ ＭＥＸＩＣＯ
【住所又は居所原語表記】９ Ｐｉｓｏ ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ Ｒｅｃｔｏｒｉａ，Ｃｉｕｄａｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉａ，Ｄｅｌｅｇａｃｉｏｎ Ｃｏｙｏａｃａｎ，Ｃ．Ｐ．０４５１０，Ｍｅｘｉｃｏ，Ｄｉｓｔｒｉｔｏ Ｆｅｄｅｒａｌ，Ｍｅｘｉｃｏ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年４月４日（２０１３．４．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月２３日（２０１０．１１．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＭＸ２０１０／０００１３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０６２４６９
【国際公開日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【出願人】（５１２１３５１６０）ウニベルシダッド ナシオナル アウトノマ デ メキシコ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤ ＮＡＣＩＯＮＡＬ ＡＵＴＯＮＯＭＡ ＤＥ ＭＥＸＩＣＯ
【住所又は居所原語表記】９ Ｐｉｓｏ ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ Ｒｅｃｔｏｒｉａ，Ｃｉｕｄａｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉａ，Ｄｅｌｅｇａｃｉｏｎ Ｃｏｙｏａｃａｎ，Ｃ．Ｐ．０４５１０，Ｍｅｘｉｃｏ，Ｄｉｓｔｒｉｔｏ Ｆｅｄｅｒａｌ，Ｍｅｘｉｃｏ
【Ｆターム（参考）】
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