【課題】感覚伝達Ｇタンパク質共役型レセプターをコードする単離された核酸を提供することを、本発明の課題とする。
【解決手段】上記課題は、本明細書に記載されるアミノ酸配列を有するレセプターおよびこれらをコードする核酸配列、ならびに、本明細書に記載される核酸配列およびこれらによってコードされるアミノ酸配列を有するレセプターを提供することによって、解決された。本発明はまた、このようなレセプターに対する抗体、このような核酸およびレセプターを検出する方法、ならびに感覚細胞特異的Ｇタンパク質共役レセプターのモジュレーターのスクリーニング方法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９８年７月２８日出願のＵＳＳＮ６０／０９５，４６４および１９９８年１２月１７日出願のＵＳＳＮ６０／１１２，７４７（両方のその全体が本明細書中に参考として援用される）に対して優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府助成の研究および開発についての声明）
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金番号５Ｒ０１ＤＣ０３１６０の下、米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、感覚細胞特異的Ｇ−タンパク質共役型レセプターの単離された核酸配列およびアミノ酸配列、このようなレセプターに対する抗体、このような核酸およびレセプターを検出する方法、ならびに感覚細胞特異的Ｇ−タンパク質共役型レセプターのモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
味覚伝達は、動物における化学伝達の最も洗練された形態の１つである（例えば、非特許文献１および２を参照のこと）。味覚シグナル伝達は、単純な後生動物から最も複雑な脊椎動物までの動物界全体に見出され；その主な目的は、不揮発性のリガンドに対する確かなシグナル伝達応答を提供することである。これらの様式の各々は、レセプターまたはチャネルによって媒介される異なるシグナル伝達経路によって媒介され、レセプター細胞の脱分極、レセプター電位または活動電位の発生、および味覚求心性ニューロンシナプスでの神経伝達物質の放出をもたらすと考えられる（例えば、Ｒｏｐｅｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：３２９−３５３（１９８９）を参照のこと）。
【０００５】
哺乳動物は、５つの基本的な味覚様式：甘味、苦味、酸味、辛味および旨味（ｕｎａｍｉ）（グルタミン酸ナトリウムの味）を有すると考えられている（例えば、ＫａｗａｍｕｒａおよびＫａｒｅ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｕｎａｍｉ：Ａ Ｂａｓｉｃ Ｔａｓｔｅ（１９８７）；ＫｉｎｎａｍｏｎおよびＣｕｍｍｉｎｇｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５４：７１５−７３１（１９９２）；Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：７１８−７６６（１９９６）；Ｓｔｅｗａｒｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７２：１−２６（１９９７）を参照のこと）。ヒトにおける広範な精神物理学的研究は、舌の異なる領域が、異なる味覚の嗜好性を提示することを報告している（例えば、Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｍｅｎｃｈｅｎ．Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈ．Ａｎａｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６２：５１６−５３０（１８７５）；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｒｅｃｏｒｄ ２１２：２４６−２４９（１９８５）；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｅｅｄｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．４７：１２１３−１２１９（１９９０）を参照のこと）。また、動物における多くの生理学的研究は、味覚レセプター細胞が、異なる味覚物質（ｔａｓｔａｎｔ）に選択的に応答し得ることを示している（例えば、Ａｋａｂａｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０４７−１０５０（１９８８）；Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８０３−２４（１９９２）；Ｂｅｒｎｈａｒｄｔら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４９０：３２５−３３６（１９９６）；Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．７５：１２５６−１２６３（１９９６）を参照のこと）。
【０００６】
哺乳動物において、味覚レセプター細胞は、舌上皮中の異なる乳頭内に分散される味蕾に集結される。有郭乳頭（舌のちょうど背部に見出される）は、１００個（マウス）〜１０００個（ヒト）の味蕾を含み、そして特に、苦味物質に感受性である。葉状乳頭（舌の後部側縁に局在する）は、何万もの味蕾を含み、そして特に、酸味物質および苦味物質に感受性である。単一または２、３個の味蕾を含む茸状乳頭は、舌の前部に存在し、そして多くの甘味の味覚様式を媒介すると考えられる。
【０００７】
各々の味蕾は、種に依存して、５０〜１５０の細胞を含み、これらには、前駆細胞、支持細胞、および味覚レセプター細胞が挙げられる（例えば、Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：７１８−７６６（１９９６）を参照のこと）。レセプター細胞は、脳幹および視床におけるシナプスを通って皮質の味覚中枢に情報を伝達する、求心性神経終末によってこれらの基部で神経支配される。味覚細胞のシグナル伝達および情報処理の機構を解明することは、味覚の機能、調節、および「認識」を理解するために重要である。
【０００８】
味覚細胞機能の精神物理学および生理学について多くのことが知られているが、これらの感覚シグナル伝達応答を媒介する分子および経路については、ほとんど知られていない（Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｎ．ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．３：５３２−５３９（１９９３）に論評される）。電気生理学的研究は、酸味および辛味の味覚物質が、細胞の先端表面上の特異化された膜チャネルを通るＨ⁺イオンおよびＮａ⁺イオンの直接的な進入によって、味覚細胞機能を調節することを示唆する。酸味化合物の場合、味覚細胞の脱分極は、Ｋ⁺チャネルのＨ⁺ブロック（例えば、Ｋｉｎｎａｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７０２３−７０２７（１９８８）を参照のこと）またはｐＨ感受性チャネルの活性化（例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８０３−２４（１９９２）を参照のこと）から生じることが仮説され；塩の伝達は、アミロライド感受性Ｎａ⁺チャネルを介するＮａ⁺の進入によって、部分的に媒介され得る（例えば、Ｈｅｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：４０３−４０５（１９８４）；Ｂｒａｎｄら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２０７−２１４（１９８５）；Ａｖｅｎｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：３５１−３５４（１９８８）を参照のこと）。
【０００９】
甘味、苦味および旨味の伝達は、Ｇ−タンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）シグナル伝達経路によって媒介されると考えられる（例えば、Ｓｔｒｉｅｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６０：１２１−１２６（１９８９）；Ｃｈａｕｄｈａｒｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓ．１６：３８１７−３８２６（１９９６）；Ｗｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３８１：７９６−８００（１９９６）を参照のこと）。紛らわしくも、甘味および苦味の伝達のためのシグナル伝達経路の多くのモデルが存在するのと同様に、ＧＰＣＲカスケードのための多くのエフェクター酵素（例えば、Ｇ−タンパク質サブユニット、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼＣ、アデニル酸シクラーゼ；例えば、ＫｉｎｎａｍｏｎおよびＭａｒｇｏｌｓｋｅｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：５０６−５１３（１９９６）を参照のこと）が存在する。しかし、味覚伝達に関与する特異的な膜レセプター、または個々の味覚伝達経路によって活性化される多くの個々の細胞内シグナル伝達分子については、ほとんど知られていない。苦味のアンタゴニスト、甘味のアゴニスト、ならびに辛味および酸味の味覚のモジュレーターのための、多くの薬理学的適用および食品産業的適用を考えれば、このような分子の同定は、重要である。
【００１０】
味覚レセプター（味覚イオンチャネルを含む）、および味覚シグナル伝達分子（例えば、Ｇ−タンパク質サブユニットおよびシグナル伝達に関与する酵素）の同定ならびに単離は、味覚伝達経路の薬理学的および遺伝的調節を可能にする。例えば、レセプターおよびチャネル分子の有効性は、味覚細胞活性の高親和性のアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニストおよびモジュレーターをスクリーニングすることを可能にする。次いで、このような味覚調節化合物は、製薬産業および食品産業において、食味をカスタマイズするために使用され得る。さらに、このような味覚細胞特異的分子は、舌の味覚細胞と脳の味覚中枢へと導く味覚感覚ニューロンとの間の関係を解明する、味覚の組織分布地図を作製する貴重なツールとして役立ち得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １５：６４５−６５０（１９９３）
【非特許文献２】ＡｖｅｎｅｔおよびＬｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．１１２：１−８（１９８９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
従って、本発明が、初めて、味覚細胞特異的Ｇ−タンパク質共役型レセプターをコードする核酸を提供する。これらの核酸およびこれらがコードするポリペプチドは、Ｇ−タンパク質共役型レセプター（「ＧＰＣＲ」）Ｂ４について「ＧＲＣＰ−Ｂ４」と称される。これらの味覚細胞特異的ＧＰＣＲは、味覚伝達経路の成分である。
【００１３】
１つの局面において、本発明は、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターをコードする単離された核酸を提供し、このレセプターは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７のアミノ酸配列に対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む。
【００１４】
１つの実施態様において、核酸は、配列番号３、配列番号４、または配列番号８のヌクレオチド配列を含む。別の実施態様において、核酸は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする縮重プライマーのセットと同じ配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、選択的にハイブリダイズするプライマーによって増幅される：ＳＡＧＧＰＭＣＦＬＭ（配列番号５）、およびＷＭＲＹＨＧＰＹＶＦ（配列番号６）。
【００１５】
別の局面において、本発明は、配列番号３、配列番号４、または配列番号８の配列を有する核酸に、高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターをコードする単離された核酸を提供する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターをコードする単離された核酸を提供し、このレセプターは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７の配列を有するポリペプチドに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含み、ここで、上記の核酸は、配列番号３、配列番号４、または配列番号８のヌクレオチド配列に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする。
【００１７】
別の局面において、本発明は、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターの細胞外ドメインをコードする単離された核酸を提供し、この細胞外ドメインは、配列番号１の細胞外ドメインに対する約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を有する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターの膜貫通ドメインをコードする単離された核酸を提供し、この膜貫通ドメインは、配列番号１の膜貫通ドメインに対する約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む。
【００１９】
別の局面において、本発明は、単離された感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターを提供し、ここで、このレセプターは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７のアミノ酸配列に対する約７０％を超えるアミノ酸配同一性を含む。
【００２０】
１つの実施態様において、このレセプターは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７に対して生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合する。別の実施態様において、このレセプターは、Ｇ−タンパク質共役型レセプター活性を有する。別の実施態様において、このレセプターは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７のアミノ酸配列を有する。別の実施態様において、このレセプターは、ヒト、ラット、またはマウス由来である。
【００２１】
１つの局面において、本発明は、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターの細胞外ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供し、この細胞外ドメインは、配列番号１の細胞外ドメインに対する約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む。
【００２２】
１つの実施態様において、このポリペプチドは、配列番号１の細胞外ドメインをコードする。別の実施態様において、この細胞外ドメインは、異種ポリペプチドに共有結合的に連結されて、キメラポリペプチドを形成する
１つの局面において、本発明は、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターの膜貫通ドメインを含む単離されたポリペプチドを提供し、この膜貫通ドメインは、配列番号１の膜貫通ドメインに対する約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む。
【００２３】
１つの実施態様において、このポリペプチドは、配列番号１の膜貫通ドメインをコードする。別の実施態様において、このポリペプチドは、配列番号１の細胞質ドメインに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む細胞質ドメインをさらに含有する。別の実施態様において、このポリペプチドは、配列番号１の細胞質ドメインをコードする。別の実施態様において、膜貫通ドメインは、異種ポリペプチドに共有結合的に連結されて、キメラポリペプチドを形成する。別の実施態様において、このキメラポリペプチドは、Ｇ−タンパク質共役型レセプター活性を有する。
【００２４】
１つの局面において、本発明は、配列番号１、配列番号２、または配列番号７のアミノ酸配列に対する約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含むレセプターに選択的に結合する抗体を提供する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、配列番号１、配列番号２、または配列番号７のアミノ酸配列に対する約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含むポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００２６】
別の局面において、本発明は、発現ベクターを用いてトランスフェクトされる宿主細胞を提供する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、感覚細胞において感覚シグナル伝達を調節する化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）化合物を感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターの細胞外ドメインを含むポリペプチドに接触させる工程であって、この細胞外ドメインは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７の細胞外ドメインに対する約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む、工程；および（ｉｉ）この細胞外ドメインに対する化合物の機能的効果を決定する工程。
【００２８】
別の局面において、本発明は、感覚細胞において感覚シグナル伝達を調節する化合物を同定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）化合物を感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターの細胞外ドメインを含むポリペプチドに接触させる工程であって、この膜貫通ドメインは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７の細胞外ドメインに対する約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む、工程；および（ｉｉ）この膜貫通ドメインに対する化合物の機能的効果を決定する工程。
【００２９】
１つの実施態様において、このポリペプチドは、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターであり、このレセプターは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７をコードするポリペプチドに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む。別の実施態様において、ポリペプチドは、異種ポリペプチドに共有結合的に連結する細胞外ドメインを含み、キメラポリペプチドを形成する。別の実施態様において、このポリペプチドは、Ｇ−タンパク質共役型レセプター活性を有する。別の実施態様において、この細胞外ドメインは、共有結合的または非共有結合的のいずれかで、固相に連結される。別の実施態様において、この機能的効果は、細胞内のｃＡＭＰ、ＩＰ３またはＣａ²⁺における変化を測定することによって決定される。別の実施態様において、この機能的効果は、化学的効果である。別の実施態様において、この機能的効果は、化学的効果である。別の実施態様において、この機能的効果は、細胞外ドメインに対する化合物の結合を測定することによって決定される。別の実施態様において、このポリペプチドは、組換え体である。別の実施態様において、このポリペプチドは、細胞または細胞膜において発現される。別の実施態様において、この細胞は，真核生物細胞である。
【００３０】
１つの実施態様において、このポリペプチドは、異種ポリペプチドに共有結合的に連結される膜貫通ドメインを含み、キメラポリペプチドを形成する。
【００３１】
１つの局面において、本発明は、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターを作製する方法を提供し、この方法は、このレセプターを、このレセプターをコードする核酸を含む組換え発現ベクターから発現する工程を包含し、ここで、このレセプターのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、または配列番号７の配列を有するポリペプチドに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む。
【００３２】
１つの局面において、本発明は、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターを含む組換え細胞を作製する方法を提供し、この方法は、このレセプターをコードする核酸を含む発現ベクターを用いてこの細胞を形質導入する工程を包含し、ここで、このレセプターのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、または配列番号７の配列を有するポリペプチドに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む。
【００３３】
１つの局面において、本発明は、感覚伝達Ｇ−タンパク質共役型レセプターをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを作製する方法を提供し、この方法は、このレセプターをコードする核酸を発現ベクターに連結する工程を包含し、ここで、このレセプターのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、または配列番号７の配列を有するポリペプチドに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む。
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１） 感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターをコードする単離された核酸であって、該レセプターが配列番号１、配列番号２、または配列番号７のアミノ酸配列に対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む、単離された核酸。
（項目２） 前記核酸が、配列番号１、配列番号２、または配列番号７に対して生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合するレセプターをコードする、項目１に記載の単離された核酸。
（項目３） 前記核酸が、Ｇタンパク質共役レセプター活性を有するレセプターをコードする、項目１に記載の単離された核酸。
（項目４） 前記核酸が配列番号１、配列番号２、または配列番号７のアミノ酸配列を含むレセプターをコードする、項目１に記載の単離された核酸。
（項目５） 前記核酸が配列番号３、配列番号４、または配列番号８のヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の単離された核酸。
（項目６） 前記核酸がヒト、マウスまたはラットに由来する、項目１に記載の単離された核酸。
（項目７） 項目１に記載の単離された核酸であって、該核酸が以下：
ＳＡＧＧＰＭＣＦＬＭ（配列番号５）および
ＷＭＲＹＨＧＰＹＶＦ（配列番号６）、
からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする縮重プライマーセットと同じ配列に対して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズするプライマーにより増幅される、単離された核酸。
（項目８） 前記核酸が、約９２ｋＤａ〜約１０２ｋＤａの分子量を有するレセプターをコードする、項目１に記載の単離された核酸。
（項目９） 配列番号３、配列番号４、または配列番号８の配列を有する核酸に対して、高度にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターをコードする、単離された核酸。
（項目１０） 感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターをコードする単離された核酸であって、該レセプターは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７の配列を有するポリペプチドに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含み、ここで該核酸が、配列番号３、配列番号４、または配列番号８のヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズする、単離された核酸。
（項目１１） 感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターの細胞外ドメインをコードする単離された核酸であって、該細胞外ドメインは、配列番号１の細胞外ドメインに対して約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を有する、単離された核酸。
（項目１２） 前記核酸が、異種ポリペプチドをコードする核酸に連結されて、キメラポリペプチドを形成する、細胞外ドメインをコードする、項目１１に記載の単離された核酸。
（項目１３） 前記核酸が、配列番号１の細胞外ドメインをコードする、項目１１に記載の単離された核酸。
（項目１４） 感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターの膜貫通ドメインをコードする単離された核酸であって、該膜貫通ドメインは、配列番号１の膜貫通ドメインに対して約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む、単離された核酸。
（項目１５） 前記核酸が、異種ポリペプチドをコードする核酸に連結されて、キメラポリペプチドを形成する、膜貫通ドメインをコードする、項目１４に記載の単離された核酸。
（項目１６） 前記核酸が、配列番号１の膜貫通ドメインをコードする、項目１４に記載の単離された核酸。
（項目１７） 前記核酸が、配列番号１の細胞質ドメインに対して約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む細胞質ドメインをさらにコードする、項目１４に記載の単離された核酸。
（項目１８） 前記核酸が、配列番号１の細胞質ドメインをコードする、項目１７に記載の単離された核酸。
（項目１９） 単離された感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターであって、該レセプターは、配列番号１、配列番号２、または配列番号７のアミノ酸配列に対して約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む、単離されたレセプター。
（項目２０） 前記レセプターが、配列番号１、配列番号２、または配列番号７に対して生成されるポリクローナル抗体に対して特異的に結合する、項目１９に記載の単離されたレセプター。
（項目２１） 前記レセプターが、Ｇタンパク質共役レセプター活性を有する、項目１９に記載の単離されたレセプター。
（項目２２） 前記レセプターが、配列番号１、配列番号２、または配列番号７のアミノ酸配列を有する、項目１９に記載の単離されたレセプター。
（項目２３） 前記レセプターが、ヒト、ラットまたはマウスに由来する、項目１９に記載の単離されたレセプター。
（項目２４） 感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターの細胞外ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該細胞外ドメインは、配列番号１の細胞外ドメインに対して約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む、単離されたポリペプチド。
（項目２５） 前記ポリペプチドが、配列番号１の細胞外ドメインをコードする、項目２４に記載の単離されたポリペプチド。
（項目２６） 前記細胞外ドメインが、異種ポリペプチドに共有結合されて、キメラポリペプチドを形成する、項目２４に記載の単離されたポリペプチド。
（項目２７） 感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターの膜貫通ドメインを含む単離されたポリペプチドであって、該膜貫通ドメインは、配列番号１の膜貫通ドメインに対して約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む、単離されたポリペプチド。
（項目２８） 前記ポリペプチドが、配列番号１の膜貫通ドメインをコードする、項目２７に記載の単離されたポリペプチド。
（項目２９） 配列番号１の細胞質ドメインに対して約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む細胞質ドメインをさらに含む、項目２７に記載の単離されたポリペプチド。
（項目３０） 前記ポリペプチドが、配列番号１の細胞質ドメインをコードする、項目２９に記載の単離されたポリペプチド。
（項目３１） 前記膜貫通ドメインが、キメラポリペプチドを形成する、異種ポリペプチドに共有結合される、項目２７に記載の単離されたポリペプチド。
（項目３２） 前記キメラポリペプチドが、Ｇタンパク質共役レセプター活性を有する項目３１に記載の単離されたポリペプチド。
（項目３３） 項目１９に記載のレセプターに選択的に結合する抗体。
（項目３４） 項目１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目３５） 項目３４のベクターでトランスフェクトされる、宿主細胞。
（項目３６） 感覚細胞における感覚性シグナル伝達を調節する化合物を同定するための方法であって、該方法は以下の工程：
（ｉ）該化合物を感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターの細胞外ドメインを含むポリペプチドと接触させる工程であって、該細胞外ドメインは配列番号１、配列番号２、または配列番号７の細胞外ドメインに対する約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む、工程；および
（ｉｉ）該細胞外ドメインに対する該化合物の機能的効果を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目３７） 前記ポリペプチドが、感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターであって、該レセプターが、配列番号１、配列番号２、または配列番号７をコードするポリペプチドに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８） 前記ポリペプチドが、キメラポリペプチドを形成する、異種ポリペプチドに共有結合される細胞外ドメインを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 前記ポリペプチドが、Ｇタンパク質共役レセプター活性を有する、項目３７または項目３８に記載の方法。
（項目４０） 前記細胞外ドメインが、固相に連結される、項目３６に記載の方法。
（項目４１） 前記細胞外ドメインが、固相に共有結合される、項目４０に記載の方法。
（項目４２） 前記機能的効果が細胞内ｃＡＭＰ、ＩＰ３またはＣａ²⁺の変化を測定することにより決定される、項目３７または項目３８に記載の方法。
（項目４３） 前記機能的効果が化学的効果である、項目３６に記載の方法。
（項目４４） 前記機能的効果が物理的効果である、項目３６に記載の方法。
（項目４５） 前記機能的効果が、細胞外ドメインへの前記化合物の結合を測定することによって決定される、項目３６に記載の方法。
（項目４６） 前記ポリペプチドが、組換え体である、項目３６に記載の方法。
（項目４７） 前記ポリペプチドが、ラット、マウスまたはヒト由来である、項目３６に記載の方法。
（項目４８） 前記ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、または配列番号７のアミノ酸配列を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４９） 前記ポリペプチドが、細胞または細胞膜において発現される、項目３７または項目３８に記載の方法。
（項目５０） 前記細胞が真核生物細胞である、項目４９に記載の方法。
（項目５１） 感覚細胞における感覚性シグナル伝達を調節する化合物を同定するための方法であって、該方法は以下の工程：
（ｉ）該化合物を感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターの膜貫通ドメインを含むポリペプチドと接触させる工程であって、該膜貫通ドメインは配列番号１、配列番号２、または配列番号７の膜貫通ドメインに対する約７０％を超えるアミノ酸配列同一性を含む、工程；および
（ｉｉ）該膜貫通ドメインに対する該化合物の機能的効果を決定する工程、
を包含する、方法。
（項目５２） 前記ポリペプチドが、キメラポリペプチドを形成する、異種ポリペプチドに共有結合される膜貫通ドメインを含む、項目５１に記載の方法。
（項目５３） 前記キメラポリペプチドが、
Ｇタンパク質共役レセプター活性を有する、項目５２に記載の方法。
（項目５４） 前記機能的効果が、細胞内ｃＡＭＰ、ＩＰ３またはＣａ²⁺の変化を測定することにより決定される、項目５１に記載の方法。
（項目５５） 前記機能的効果が化学的効果である、項目５１に記載の方法。
（項目５６） 前記機能的効果が物理的効果である、項目５１に記載の方法。
（項目５７） 前記ポリペプチドが、組換え体である、項目５１に記載の方法。
（項目５８） 前記ポリペプチドが、ラット、マウスまたはヒト由来である、項目５１に記載の方法。
（項目５９） 前記ポリペプチドが、細胞または細胞膜において発現される、項目５１または項目５２に記載の方法。
（項目６０） 前記細胞が真核生物細胞である、項目５９に記載の方法。
（項目６１） 感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターを作製する方法であって、該方法は、該レセプターをコードする核酸を含む組換え発現ベクターから該レセプターを発現する工程を包含し、ここで該レセプターのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、または配列番号７の配列を有するポリペプチドに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む、方法。
（項目６２） 感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターを含む組換え細胞を作製する方法であって、該方法は、該レセプターをコードする核酸を含む発現ベクターで該細胞を形質転換する工程を包含し、ここで該レセプターのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、または配列番号７の配列を有するポリペプチドに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む、方法。
（項目６３） 感覚伝達Ｇタンパク質共役レセプターをコードする核酸を含む組換え発現ベクターを作製する方法であって、該方法は、発現ベクターに該レセプターをコードする核酸を連結する工程を含み、ここで該レセプターのアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２、または配列番号７の配列を有するポリペプチドに対する約７０％を超えるアミノ酸同一性を含む、方法。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．導入）
本発明は、初めて、味覚細胞特異的Ｇ−タンパク質共役型レセプターをコードする核酸を提供する。これらの核酸およびこれらがコードするレセプターは、Ｇ−タンパク質共役型レセプターについて「ＧＰＣＲ」と称し、そしてＧＰＣＲ−Ｂ４と命名される。これらの味覚細胞特異的ＧＰＣＲは、味覚伝達経路の成分である（例えば、実施例ＩＩを参照のこと）。これらの核酸は、味覚細胞において特異的に発現されるために、これらの核酸は、味覚細胞の同定のために役立つプローブを提供する。例えば、ＧＰＣＲポリペプチドおよびタンパク質に対するプローブは、味覚細胞のサブセット（例えば、葉状細胞および有郭細胞、または特定の味覚レセプター細胞（例えば、甘味、酸味、辛味および苦味））を同定するために使用され得る。これらはまた、舌の味覚細胞と脳の味覚中枢へと導く味覚感覚ニューロンとの間の関係を解明する、味覚の組織分布地図を作製するためのツールとして役立つ。さらに、核酸およびそれらがコードするタンパク質は、味覚誘導される挙動を分析するためのプローブとして使用され得る。
【００３５】
本発明はまた、これらの新規な味覚細胞ＧＰＣＲのモジュレーター（例えば、アクチベーター、インヒビター、刺激因子、エンハンサー、アゴニストおよびアンタゴニスト）をスクリーニングする方法を提供する。味覚伝達のこのようなモジュレーターは、味覚シグナル伝達経路の薬理学的および遺伝的調節に有用である。これらのスクリーニング方法は、味覚細胞活性の高親和性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために使用され得る。次いで、これらの調節化合物は、食品産業および製薬産業において、食味をカスタマイズするため使用され得る。従って、本発明は、味覚の調節についてのアッセイを提供し、ここで、ＧＰＣＲ−Ｂ４は、味覚伝達に対するモジュレーターの効果についての、直接的または間接的なレポーター分子として作用する。ＧＰＣＲは、例えば、イオン濃度、膜電位、電流、イオンフラックス、転写、シグナル伝達、レセプター−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度における変化を、インビトロ、インビボおよびエキソビボで測定するために、アッセイにおいて使用され得る。１つの実施態様において、ＧＰＣＲ−Ｂ４は、第２のレポーター分子（例えば、緑色蛍光タンパク質）への結合を介して、間接的なレポーターとして使用され得る（例えば、ＭｉｓｔｉｌｉおよびＳｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：９６１−９６４（１９９７）を参照のこと）。別の実施態様において、ＧＰＣＲ−Ｂ４は、細胞中で組換え発現され、そしてＧＰＣＲ活性を介する味覚伝達の調節が、Ｃａ²⁺レベルにおける変化を測定することによってアッセイされる（実施例ＩＩを参照のこと）。
【００３６】
味覚伝達のモジュレーターについてアッセイする方法としては、以下が挙げられる：ＧＰＣＲ−Ｂ４、それらの部分（例えば、細胞外ドメイン）、またはＧＰＣＲ−Ｂ４の１以上のドメインを含むキメラタンパク質を使用するインビトロリガンド結合アッセイ、卵母細胞ＧＰＣＲ−Ｂ４発現；組織培養細胞ＧＰＣＲ−Ｂ４発現；ＧＰＣＲ−Ｂ４の転写活性化；ＧＰＣＲのリン酸化および脱リン酸化；ＧＰＣＲへのＧ−タンパク質の結合；リガンド結合アッセイ；電位、膜電位および膜コンダクタンスの変化；イオンフラックスアッセイ；細胞内セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰおよびイノシトール三リン酸）における変化；細胞内カルシウムレベルにおける変化；および神経伝達物質の放出。
【００３７】
最後に、本発明は、ＧＰＣＲ−Ｂ４の核酸およびタンパク質発現を検出する方法を提供し、これらは、味覚伝達調節および味覚レセプター細胞の特異的同定の研究を可能にする。ＧＰＣＲ−Ｂ４はまた、父系調査および法医学的調査のための有用な核酸プローブを提供する。ＧＰＣＲ−Ｂ４は、味覚レセプター細胞の亜集団（例えば、葉状、茸状および有郭の味覚レセプター細胞）を同定するための、核酸プローブとして有用である。ＧＰＣＲ−Ｂ４レセプターはまた、味覚レセプター細胞の同定に有用なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製するために使用され得る。味覚レセプター細胞は、以下のような技術を使用して同定され得る：ｍＲＮＡの逆転写および増幅、全ＲＮＡまたはポリＡ⁺ＲＮＡの単離、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、Ｓ１消化、ＤＮＡマイクロチップアレイの走査、ウェスタンブロットなど。
【００３８】
機能的に、ＧＰＣＲ−Ｂ４は、味覚シグナル伝達を媒介するためにＧ−タンパク質と相互作用する、味覚伝達に関与する７つの膜貫通Ｇ−タンパク質共役型レセプターを提示する（例えば、Ｆｏｎｇ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ ８：２１７（１９９６）；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：１８０（１９９４）を参照のこと）。
【００３９】
構造的に、ＧＰＣＲ−Ｂ４のヌクレオチド配列（例えば、配列番号３〜４および配列番号８（それぞれ、ラット、マウスおよびヒトから単離された）を参照のこと）は、約８４２アミノ酸のポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、約９７ｋＤａの推定分子量および９２〜１０２ｋＤａの推定範囲を有する（例えば、ラット、マウスおよびヒトから単離された配列番号１〜２および配列番号７を参照のこと）。他の種由来の関連するＧＰＣＲ−Ｂ４遺伝子は、少なくとも約２５アミノ酸長、必要に応じて、５０〜１００アミノ酸長のアミノ酸領域にわたって、少なくとも約７０％のアミノ酸同一性を共有する。ＧＰＣＲ−Ｂ４は、葉状細胞および茸状細胞において特異的に発現され、舌の有郭味覚レセプター細胞においてより低く発現される。ＧＰＣＲ−Ｂ４は、オリゴ−ｄＴをプライムした有郭ｃＤＮＡライブラリー由来の約１／１５０，０００のｃＤＮＡにおいて見出される中程度に稀な配列である（実施例１を参照のこと）。
【００４０】
本発明はまた、配列番号１に示される以下のＧＰＣＲ−Ｂ４の多型性改変体を提供する：改変体＃１、８位のアミノ酸のイソロイシン残基がロイシン酸残基で置換されている；改変体＃２、２６位のアミノ酸のアスパラギン酸残基がグルタミン酸残基で置換されている；および改変体＃３、４６位のアミノ酸のグリシン残基がアラニン残基で置換されている。
【００４１】
ＧＰＣＲ−Ｂ４のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の特定の領域は、ＧＰＣＲ−Ｂ４の多型性改変体、種間ホモログおよび対立遺伝子を同定するために使用され得る。この同定は、インビトロで（例えば、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下またはＰＣＲ（配列番号５〜６をコードするプライマーを使用する）および配列決定によりなされ得るか、または他のヌクレオチド配列との比較のためにコンピューターシステム中の配列情報を使用することによってなされ得る。代表的に、ＧＰＣＲ−Ｂ４の多型性改変体および対立遺伝子の同定は、約２５アミノ酸以上（例えば、５０〜１００アミノ酸）のアミノ酸配列を比較することによってなされる。少なくとも約７０％以上、必要に応じて８０％または９０〜９５％以上のアミノ酸同一性は、代表的に、タンパク質が、ＧＰＣＲ−Ｂ４の多型性改変体、種間ホモログまたは対立遺伝子であることを実証する。配列比較は、以下に議論される配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して実施され得る。ＧＰＣＲ−Ｂ４またはその保存領域に特異的に結合する抗体はまた、対立遺伝子、種間ホモログおよび多型性改変体を同定するために使用され得る。
【００４２】
ＧＰＣＲ−Ｂ４の多型性改変体、種間ホモログおよび対立遺伝子は、推定ＧＰＣＲ−Ｂ４ポリペプチドの味覚細胞特異的発現を試験することによって確認される。代表的に、配列番号１〜２または配列番号７のアミノ酸配列を有するＧＰＣＲ−Ｂ４は、ＧＰＣＲ−Ｂ４の多型性改変体または対立遺伝子の同定を実施するために、推定ＧＰＣＲ−Ｂ４タンパク質との比較におけるポジティブコントロールとして使用される。多型性改変体、対立遺伝子、および種間ホモログは、Ｇ−タンパク質共役型レセプターの７つの膜貫通構造を保持することが予想される。
【００４３】
ＧＰＣＲ−Ｂ４のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の情報はまた、コンピューターシステムにおいて味覚細胞特異的ポリペプチドのモデルを構築するために使用され得る。これらのモデルは、ＧＰＣＲ−Ｂ４を活性化または阻害し得る化合物を同定するために、連続的に使用される。ＧＰＣＲ−Ｂ４の活性を調節するこのような化合物は、味覚伝達におけるＧＰＣＲ−Ｂ４の役割を研究するために使用され得る。
【００４４】
ＧＰＣＲ−Ｂ４の単離は、Ｇ−タンパク質共役型レセプター味覚伝達のインヒビターおよびアクチベーターについてアッセイするための方法を、初めて提供する。生物学的に活性なＧＰＣＲ−Ｂ４は、例えば、以下を測定するインビボ発現およびインビトロ発現を使用して、味覚伝達物質としてのＧＰＣＲ−Ｂ４のインヒビターおよびアクチベーターを試験するために有用である：ＧＰＣＲ−Ｂ４の転写活性化；リガンド結合；リン酸化および脱リン酸化；Ｇ−タンパク質への結合；Ｇ−タンパク質活性化；調節分子結合；電位、膜電位および膜コンダクタンスの変化；イオンフラックス；細胞内セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰおよびイノシトール三リン酸）；細胞内カルシウムレベル；および神経伝達物質の放出。ＧＰＣＲ−Ｂ４を使用して同定されるこのようなアクチベーターおよびインヒビターは、味覚伝達をさらに研究するため、ならびに特異的な味覚アゴニストおよびアンタゴニストを同定するために使用され得る。このようなアクチベーターおよびインヒビターは、食味をカスタマイズするために薬剤および食品剤として使用される。
【００４５】
ＧＰＣＲ−Ｂ４核酸およびＧＰＣＲ−Ｂ４の発現を検出する方法はまた、味覚細胞を同定するために、ならびに舌および舌の味覚レセプター細胞の脳の味覚感覚ニューロンに対する関係の組織分布地図を作製するために有用である。ヒトＧＰＣＲ−Ｂ４をコードする遺伝子の染色体位置決定は、ＧＰＣＲ−Ｂ４によって引き起こされ、そして関連する疾患、変異および形質を同定するために使用され得る。
【００４６】
（ＩＩ．定義）
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、他で特定されない限り、これらに与えられた意味を有する。
【００４７】
「味覚レセプター細胞」は、舌の味蕾を形成するためのグループ（例えば、葉状細胞、茸状細胞および有郭細胞）へと組織化される、神経上皮細胞である（例えば、Ｒｏｐｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：３２９−３５３（１９８９）を参照のこと）。
【００４８】
「ＧＰＣＲ−Ｂ４」はまた「ＴＲ２」とも呼ばれ、葉状細胞、茸状細胞および有郭細胞のような味覚レセプター細胞において、特異的に発現されるＧ−タンパク質共役型レセプターをいう（例えば、Ｈｏｏｎら、Ｃｅｌｌ ９６：５４１〜５５１（１９９９）（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。このような味覚細胞は、特異的分子（例えば、ガストデューシン（味覚細胞特異的Ｇ−タンパク質））を発現するので、これらの細胞が同定され得る（ＭｃＬａｕｇｈｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５７：５６３−５６９（１９９２））。味覚レセプター細胞はまた、形態に基づいて同定され得る（例えば、Ｒｏｐｅｒ、前出を参照のこと）。ＧＰＣＲ−Ｂ４は、実施例ＩＩに記載されるように、味覚伝達のためのレセプターとして作用する能力を有する。
【００４９】
ＧＰＣＲ−Ｂ４は、「Ｇ−タンパク質共役型レセプター活性」を有する７つの膜貫通領域を有するＧＰＣＲをコードする。例えば、これらは、細胞外刺激に応答してＧ−タンパク質に結合し、そして酵素（例えば、ホスホリパーゼＣおよびアデニル酸シクラーゼ）の刺激を介してセカンドメッセンジャー（例えば、ＩＰ３、ｃＡＭＰ、およびＣａ²⁺）の産生を促進する（ＧＰＣＲの構造および機能の説明については、例えば、Ｆｏｎｇ（前出）、およびＢａｌｄｗｉｎ（前出）を参照のこと）。
【００５０】
従って、用語ＧＰＣＲ−Ｂ４は、（１）配列番号１〜２および配列番号７に対して約２５アミノ酸、必要に応じて５０〜１００アミノ酸のウインドウにわたり、約７０％のアミノ酸配列同一性、必要に応じて約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％のアミノ酸配列同一性を有するか；（２）配列番号１〜２および配列番号７からなる群より選択されるアミノ酸配列およびその保存的に改変された改変体を含む免疫原に対して惹起される抗体に結合するか；（３）配列番号３〜４および配列番号８からなる群より選択される配列およびその保存的に改変された改変体に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特異的にハイブリダイズする（少なくとも約５００ヌクレオチド、必要に応じて、少なくとも約９００ヌクレオチドのサイズで）か；または（４）配列番号５〜６をコードする縮重プライマーセットと同じ配列に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特異的にハイブリダイズするプライマーによって増幅される、多型性改変体、対立遺伝子変異体および種間ホモログをいう。
【００５１】
位相的に、感覚ＧＰＣＲは、Ｎ末端「細胞外ドメイン」、７つの膜貫通領域ならびに対応する細胞質ループおよび細胞外ループを含む「膜貫通ドメイン」、ならびにＣ末端「細胞質ドメイン」を有する（例えば、Ｈｏｏｎら、Ｃｅｌｌ ９６：５４１〜５５１（１９９９）；ＢｕｃｋおよびＡｘｅｌ、Ｃｅｌｌ ６５：１７５〜１８７（１９９１）を参照のこと）。これらのドメインは当業者に公知の方法（例えば、疎水性ドメインおよび親水性ドメインを同定する配列分析プログラム）を使用して構造的に同定され得る（例えば、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５〜１３２（１９８２）を参照のこと）。このようなドメインは、キメラタンパク質を作製するために、および本発明のインビトロアッセイのために、有用である。
【００５２】
従って、「細胞外ドメイン」は、細胞膜から突出し、そして細胞外リガンドに結合するＧＰＣＲ−Ｂ４のドメインをいう。この領域はＮ末端で始まり、そしてほぼアミノ酸５６３位の保存されたグルタミン酸プラスまたはマイナス約２０アミノ酸で終了する。配列番号１のアミノ酸１〜５８０に対応する領域（ヌクレオチド１〜１７４０、ここでヌクレオチド１は、ＡＴＧ開始メチオニンコドンで開始する）は、膜貫通ドメインへわずかに伸長する細胞外ドメインの１つの実施態様である。この実施態様は、可溶性および固相の両方でのインビトロリガンド結合アッセイに有用である。
【００５３】
７つの膜貫通領域ならびに対応する細胞質ループおよび細胞外ループを含む「膜貫通ドメイン」は、ほぼアミノ酸５６３位の保存されたグルタミン酸残基プラスまたはマイナス約２０アミノ酸で始まり、そしてほぼ８１２位の保存されたチロシンアミノ酸残基プラスまたはマイナス約１０アミノ酸で終了するＧＰＣＲ−Ｂ４のドメインをいう。
【００５４】
「細胞質ドメイン」は、８１２位の保存されたチロシンアミノ酸残基プラスまたはマイナス約１０アミノ酸で始まり、そしてこのポリペプチドのＣ末端まで連続するＧＰＣＲ−Ｂ４のドメインをいう。
【００５５】
本明細書中に使用される場合、「生物学的サンプル」は、ＧＰＣＲ−Ｂ４またはＧＰＣＲ−Ｂ４タンパク質をコードする核酸を含む、生物学的組織または液体のサンプルである。このようなサンプルとしては、ヒト、マウス、およびラット（特に、舌（ｔｏｎ））から単離された組織が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルはまた、組織学的目的のために採取された凍結切片のような、組織の切片を含み得る。生物学的サンプルは、代表的には、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、は虫類、および好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモットまたはウサギ）、および最も好ましくは、霊長類（例えば、チンパンジーまたはヒト）のような、真核生物生物体から獲得される。組織としては、舌組織、単離された味蕾、および味覚（ｔｅｓｔｉｓ）組織が挙げられる。
【００５６】
「ＧＰＣＲ活性」とは、ＧＰＣＲがシグナルを伝達する能力をいう。このような活性は、ＧＰＣＲ（または、キメラＧＰＣＲ）をＧ−タンパク質または乱交雑なＧ−タンパク質（例えば、Ｇα１５）のいずれか、および酵素（例えば、ＰＬＣ）に結合させて、そして（ＯｆｆｅｒｍａｎおよびＳｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５））を使用して、細胞内カルシウムの増加を測定することによって、異種細胞において測定され得る。レセプター活性は、蛍光Ｃａ²⁺指標色素および蛍光定量的画像を使用して、［Ｃａ²⁺］_iにおけるリガンド誘導性の変化を記録することによって、効果的に測定され得る。必要に応じて、本発明のポリペプチドは、感覚伝達、必要に応じて味覚細胞における味覚伝達に関与する。
【００５７】
ＧＰＣＲ−Ｂ４媒介味覚伝達を調節する化合物を試験するためのアッセイの文脈における、句「機能的効果」には、レセプターの影響下で、間接的もしくは直接的であるいずれかのパラメーター（例えば、機能的、物理的または化学的効果）の決定を含む。これは、リガンド結合を含み、イオンフラックス、膜電位、電流、転写、Ｇ−タンパク質共役、ＧＰＣＲリン酸化もしくはＧＰＣＲ脱リン酸化、シグナル伝達、レセプター−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度（例えば、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、または細胞内Ｃａ²⁺）における、インビトロ、インビボおよびエキソビボでの変化、ならびに神経伝達物質もしくはホルモンの放出の増加または減少のような他の生理学的効果をも含む。
【００５８】
「機能的効果を決定すること」とは、ＧＰＣＲ−Ｂ４の影響下で、間接的または直接的であるパラメーター（例えば、機能的、物理的および化学的効果）を増加または減少させる化合物についてのアッセイを意味する。そのような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段（例えば、分光学的特徴（例えば、蛍光、吸光、屈折率）、流体力学（例えば、形状）、クロマトグラフィーまたは溶解度特性における変化、パッチクランプ、電位感受性色素、細胞全体の電流、放射性同位体流出、誘導性マーカー、卵母細胞ＧＰＣＲ−Ｂ４発現；組織培養細胞ＧＰＣＲ−Ｂ４発現；ＧＰＣＲ−Ｂ４の転写活性化；リガンド結合アッセイ；電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化；イオンフラックスアッセイ；ｃＡＭＰおよびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）のような細胞内セカンドメッセンジャーにおける変化；細胞内カルシウムレベルにおける変化；神経伝達物質の放出など）により測定され得る。
【００５９】
ＧＰＣＲ−Ｂ４の「インヒビター」、「アクチベーター」および「モジュレーター」は互換的に使用され、味覚伝達についてのインビトロアッセイおよびインビボアッセイを用いて同定される阻害分子、活性化分子、または調節分子（例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストならびにそれらのホモログおよび模倣体）をいう。インヒビターは、例えば、結合して刺激を部分的もしくは全体的にブロックするか、活性化を減少、妨害、遅延するか、味覚伝達を不活化、脱感作、または下方調節する化合物（例えば、アンタゴニスト）である。アクチベーターは、例えば、結合して活性化を刺激、増大、開放、活性化、促進、増強するか、味覚伝達を感作もしくは上方調節する化合物（例えば、アゴニスト）である。モジュレーターは、レセプターと以下のものとの相互作用を変更する化合物を含む：アクチベーターまたはインヒビターに結合する細胞外タンパク質（例えば、エブネリン（ｅｂｎｅｒｉｎ）、および疎水性キャリアファミリーの他のメンバー）；Ｇ−タンパク質；キナーゼ（例えば、レセプターの不活性化および脱感作に関与するロドプシンキナーゼおよびβアドレナリン作用性レセプターキナーゼのホモログ）；およびアレスチン様タンパク質（これもまた、レセプターを不活性化および脱感作する）。モジュレーターは、ＧＰＣＲ−Ｂ４の遺伝的に改変された（例えば、活性化が改変された）バージョン、ならびに天然に存在するリガンドおよび合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低化学分子などを含む。インヒビターおよびアクチベーターについてのそのようなアッセイは、例えば、上記のように、細胞もしくは細胞膜においてＧＰＣＲ−Ｂ４を発現する工程、推定モジュレーター化合物を適用する工程、次いで味覚伝達に対する機能的効果を決定する工程を包含する。潜在的なアクチベーター、インヒビターまたはモジュレーターを用いて処理されるＧＰＣＲ−Ｂ４を含むサンプルまたはアッセイは、インヒビター、アクチベーターまたはモジュレーターを含まないコントロールサンプルと比較されて、阻害の程度を調べる。コントロールサンプル（インヒビターで処理されていない）は、１００％の相対的なＧＰＣＲ−Ｂ４活性値に設定される。コントロールに対するＧＰＣＲ−Ｂ４の活性値が約８０％、必要に応じて５０％または２５〜０％である場合、ＧＰＣＲ−Ｂ４の阻害は、達成される。コントロールに対するＧＰＣＲ−Ｂ４の活性値が１１０％、必要に応じて１５０％、必要に応じて２００〜５００％、または１０００％〜３０００％より高い場合、ＧＰＣＲ−Ｂ４の活性化は達成される。
【００６０】
「生物学的に活性な」ＧＰＣＲ−Ｂ４とは、味覚レセプター細胞において味覚伝達に関与する、上記のような、ＧＰＣＲ活性を有するＧＰＣＲ−Ｂ４をいう。
【００６１】
用語「単離された」「精製された」または「生物学的に純粋な」とは、その天然の状態で見出されるような、通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。純度および均一性は、代表的には分析化学技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー）を用いて決定される。調製物に存在する優勢種であるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離されたＧＰＣＲ−Ｂ４の核酸は、ＧＰＣＲ−Ｂ４の遺伝子と隣接しかつＧＰＣＲ−Ｂ４以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。用語「精製された」とは、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルで本質的に一つのバンドを生じることを示す。詳細には、核酸またはタンパク質は、少なくとも８５％純粋、必要に応じて少なくとも９５％純粋、および必要に応じて少なくとも９９％純粋であることを意味する。
【００６２】
「核酸」とは、一本鎖もしくは二本鎖のいずれかの形態である、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾された骨格残基もしくは結合を含む核酸（これらは、合成したもの、天然に存在するもの、および天然に存在しないものであり、参照核酸と類似した結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似した様式で代謝される）を含む。そのようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホラミダイト、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたそれらの改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補配列、ならびに明らかに示される配列を暗に含む。詳細には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００６４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに対応して適用する。
【００６５】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似した形式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるこれらのアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素に結合されるα炭素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。そのようなアナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたぺプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似した様式で機能する化学化合物をいう。
【００６６】
アミノ酸は、本明細書中で、それらの一般的に公知の三文字の記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される一文字の記号のいずれかで示され得る。同様にヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている一文字コードにより示され得る。
【００６７】
「保存的に修飾された改変体」は、アミノ酸および核酸の両方の配列に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾される改変体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードするか、またはその核酸が本質的に同一な配列に対するアミノ酸配列をコードしない核酸をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸は、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより特定化されているいずれの位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変更せずに記載された任意の対応コドンに変更され得る。そのような核酸の改変は、「サイレントな改変」であり、これは保存的に修飾された改変の１種である。本明細書中の、ポリペプチドをコードするいずれの核酸配列もまた、核酸の全ての可能なサイレントな改変を記載する。当業者は、核酸における各コドン（ＡＵＧ（これは、通常メチオニンをコードする唯一のコドン）およびＴＧＧ（これは、通常、トリプトファンをコードする唯一のコドン）を除く）は、修飾されて、機能的に同一な分子を生じ得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレントな改変は、それぞれ記載される配列において黙認される。
【００６８】
アミノ酸配列に関して、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質配列に対する、個々の置換、欠失または付加（これらは単一のアミノ酸もしくはコードされる配列中のアミノ酸の小さな割合を改変、付加または欠失する）は、「保存的に修飾された改変体」であり、ここで、この改変は、化学的に類似したアミノ酸とのアミノ酸の置換を生じる。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野において周知である。そのような保存的に修飾された改変体は、本発明の多型性改変体、種間ホモログ、および対立遺伝子を加え、かつそれらを除外しない。
【００６９】
以下の８つの群の各々は、互いについての保存的置換体であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【００７０】
ポリペプチド構造のような高分子構造は、組織化の種々のレベルの点において記載され得る。この組織化の一般的考察について、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）ならびにＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照のこと。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは局所的に整列されたポリペプチド内の三次元構造をいう。これらの構造は、ドメインとして一般的に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密なユニットを形成し、かつ代表的には５０〜３５０のアミノ酸長である、ポリペプチドの一部である。典型的なドメインは、β−シートおよびα−ヘリックスのストレッチのようなより小さい組織化の区画からなる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次ユニットの非共有結合的会合により形成される三次元構造をいう。異方性用語はまた、エネルギー用語として公知である。
【００７１】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、³²Ｐ、蛍光色素、電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および上記の７つ（ａｎｔ ｏｒ ７）が、例えば、放射性標識をそのペプチドへ組込むことによって検出可能にされ得、そしてそのペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用されるタンパク質が挙げられる。
【００７２】
「標識された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、リンカーもしくは化学結合を介して共有結合的に、またはイオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、もしくは水素結合を介して非共有結合的にかの、いずれかで標識に結合されるものであり、その結果、プローブの存在が、そのプローブへ結合した標識の存在を検出することによって検出され得る。
【００７３】
本明細書中で使用される場合、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、１つ以上の型の化学結合（通常は、相補的塩基対形成（通常は水素結合形成を介する）を介する）を介して、相補配列の標的核酸へ結合し得る核酸として定義される。本明細書中で使用される場合、プローブは、天然の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシン、など）を含み得る。さらに、プローブ中の塩基は、これがハイブリダイゼーションを干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合により結合され得る。従って、例えば、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合よりもむしろペプチド結合により結合されているペプチド核酸であり得る。プローブが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存して、そのプローブ配列と完全な相補性を欠く標的配列を結合し得ることが当業者に理解される。このプローブは、必要に応じて、同位体、発色団、発光団、色素原を用いて直接的に標識されるか、またはストレプトアビジン複合体が後に結合し得るようなビオチンを用いて間接的に標識される。プローブの存在または非存在についてのアッセイによって、選択配列もしくは部分配列の存在または非存在を検出し得る。
【００７４】
例えば、細胞または核酸、タンパク質、もしくはベクターに対して使用される場合、用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質の導入か、または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていることか、あるいはその細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内で見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常に発現されるか、過小発現されるか、もしくは全く発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００７５】
核酸の一部に対して使用される場合、用語「異種」とは、その核酸が天然で互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、代表的には組換え的に産生され、新規の機能的核酸を作製するよう整列された非関連の遺伝子からの２つ以上の配列（例えば、１つの供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域）を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が天然では互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含む（例えば、融合タンパク質）ことを示す。
【００７６】
「プロモーター」は、核酸の転写を指向する核酸制御配列のアレイとして規定される。本明細書中で使用される場合、プロモーターは、転写開始部位付近の必要な核酸配列（例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメント）を含む。プロモーターはまた、遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを必要に応じて含み、これは、転写開始部位から数千の塩基対程度で配置され得る。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的または発生的調節下で活性であるプロモーターである。用語「作動可能に連結される」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）と第二の核酸配列との間の機能的結合をいい、ここで、この発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指向する。
【００７７】
「発現ベクター」は、核酸構築物であり、宿主細胞中で特定の核酸の転写を許容する一連の特定化された核酸エレメントを用いて組換え的にまたは合成的に作製される。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス、または核酸フラグメントの一部であり得る。代表的には、この発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結されて転写される核酸を含む。
【００７８】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」または「同一性」パーセントとは、比較ウインドウ、または以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いてかもしくは手動のアライメントおよび視覚的検査によって測定されるような設計された領域にわたる最大一致性（ｍａｘｉｍｕｍ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）について比較および整列される場合、同じか、または特定の割合の同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチド（すなわち、特定された領域にわたる７０％の同一性、必要に応じて、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性）を有する、２つ以上の配列または部分配列をいう。次いで、そのような配列は、「実質的に同一である」といわれる。この定義はまた、試験配列の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）をいう。必要に応じて、同一性は、少なくとも約５０アミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域にわたって、またはより好ましくは７５〜１００アミノ酸長もしくはヌクレオチド長である領域にわたって存在する。
【００７９】
配列比較について、代表的には、１つの配列は、試験配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列は、コンピューター中に入力され、部分配列の座標が設計され、必要な場合、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメータが設計される。デフォルトプログラムのパラメータが使用され得るか、または代替的パラメータが設計され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
【００８０】
本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、２０〜６００、通常には約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群より選択される連続する位置の数のいずれか１つのセグメントに対する言及を含み、ここで、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列アライメントの方法は、当該分野において周知である。比較のための最適な配列のアライメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２；４８２（１９８１）の局在相同性アルゴリズムによるか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによるか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によるか、これらのアルゴリズムのコンピューター化されたインプリメンテーション（Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によるか、または手動アライメント化および可視的検査により（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５、補遺を参照のこと）、行われ得る。
【００８１】
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連性および配列同一性パーセントを示すために、進行性の一対のアライメントを用いて、関連した配列の群から複数配列のアライメントを作製する。それはまた、そのアライメントを作製するために使用されるクラスター関係を示す系図または系統樹をプロットし得る。ＰＩＬＥＵＰは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の進行性のアライメント方法の単純化を使用する。使用されるこの方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ５：１５１−１５３（１９８９）により記載される方法と類似している。このプログラムは、各々の最大の長さが５，０００のヌクレオチドまたはアミノ酸の、３００個の配列まで整列させ得る。この複数アライメント手順は、２つの最も類似した配列の対のアライメントで始まり、２つの整列された配列のクラスターを生成する。次いで、このクラスターは、次の最も関連した配列かまたは整列された配列のクラスターに整列される。２つのクラスターの配列は、２つの個々の配列の対のアライメントの単純な伸長によって整列される。最後のアライメントは、一連の進行性の対のアライメントによって達成される。このプログラムは、特定の配列および配列比較の領域についてそれらのアミノ酸座標もしくはヌクレオチド座標を指定することによって、およびプログラムパラメーターを指定することによって実行される。ＰＩＬＥＵＰを用いて、参照配列は、以下のパラメータを用いて、配列同一性パーセントの関連性を決定するために他の試験配列と比較される：デフォルトギャップ重量（３．００）、デフォルトギャップ長重量（０．１０）、および加重終止ギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐ）。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列解析ソフトウェアパッケージ（例えば、バージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４））から入手され得る。
【００８２】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適切な別のアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）において記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に利用可能である。このアルゴリズムは、問い合わせ配列における長さＷの短いワード（単語）（ｗｏｒｄ）を同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を第１に同定することを含み、このＨＳＰは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列される場合、いくつかの正の値の閾値Ｔに一致するかまたはそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。このワードヒットを、累積アライメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致した残基対の報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に０より大きい）およびＮ（一致しない残基のペナルティースコア；常に０より小さい）を用いて算出される。アミノ酸配列について、スコア付けマトリクスが、累積スコアを算出するために使用される。各方向におけるそのワードヒットの伸長は、以下の場合停止される：累積アライメントスコアが、最大達成値から量Ｘが減少する場合；１つ以上の負のスコア残基アライメントの蓄積に起因して、累積スコアが、ゼロ以下になる場合；または、いずれかの配列の末端が届いた場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速さを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列についての、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２のスコア付けマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を用いる。
【００８３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列と類似であると考えられる。
【００８４】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、以下に記載されるように、第１の核酸にコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対して惹起された抗体と免疫交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは、代表的には、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、ここで、この２つのペプチドは、保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、この２つの分子またはそれらの相補体が、以下に記載されるように、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるというなお別の指標は、同じプライマーが、その配列を増幅するために使用され得るということである。
【００８５】
句「〜に選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」とは、その配列が複合混合物（例えば、細胞性ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡの全体）中に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズをいう。
【００８６】
句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが代表的には核酸の複合混合物中のその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる状況において異なる。より高い温度であればあるほど、より長い配列が特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引書は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｔｅｃｈｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ、「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３）において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨでの特定の配列を熱融点（Ｔ_m）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔ_mは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態（Ｔ_mで標的配列が過剰に存在する場合、プローブの５０％が平衡状態で占められる）で標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下）である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３にて約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン濃度、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、かつ温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）について少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加により達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、必要に応じて１０倍のバックグラウンドのハイブリダイゼーションである。例証的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下であり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳで、４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで、６５℃でのインキュベーション、ならびに０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で、６５℃での洗浄。
【００８７】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、なお実質的に同一である。これは、例えば、核酸の複製が遺伝コードにより許容される最大のコード縮重を用いて作製される場合に生じる。そのような場合、核酸は、中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で代表的にハイブリダイズする。例証的な「中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ中、４５℃での洗浄を含む。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して類似したストリンジェンシーの条件を提供することを容易に認識する。
【００８８】
「抗体」は、抗原に特異的に結合し、そして抗原を認識するイムノグロブリン遺伝子からの読み枠領域を含むポリペプチドまたはそのフラグメントをいう。認識されるイムノグロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμの定常領域遺伝子、ならびに無数のイムノグロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、これらは順に、それぞれイムノグロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義される。
【００８９】
例示的なイムノグロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、その各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原の認識に主に寄与する約１００〜１１０アミノ酸以上の可変領域を規定する。用語、可変軽鎖（Ｖ_L）および可変重鎖（Ｖ_H）はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００９０】
抗体は、例えば、インタクトなイムノグロブリンとして、または種々のペプチダーゼを用いた消化により生成されるよく特徴付けられた多くのフラグメントとして存在する。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合のもとで抗体を消化し、Ｆ（ａｂ）’₂を生成する。Ｆ（ａｂ）’₂は、それ自体がジスルフィド結合によりＶ_H−Ｃ_H１に結合された軽鎖であるＦａｂの二量体である。このＦ（ａｂ）’₂は、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊するために穏かな条件下で還元され得、それによってＦ（ａｂ）’₂二量体はＦａｂ’単量体に転換される。Ｆａｂ’単量体は、ヒンジ領域の部分を有する本質的なＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３を参照のこと）。種々の抗体フラグメントがインタクトな抗体の消化の点において規定されるが、当業者は、そのようなフラグメントが化学的もしくは組換えＤＮＡ方法論を用いてのいずれかによりデノボ合成され得ることを理解する。従って、本明細書中で使用される場合、用語抗体はまた、抗体全体の改変により生成される抗体フラグメントか、または組換えＤＮＡ方法論(例えば、単鎖Ｆｖ）を用いてデノボ合成される抗体フラグメントか、またはファージディスプレイライブラリー（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照のこと）を用いて同定される抗体フラグメントのいずれかを含む。
【００９１】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の調製のために、当該分野で公知の任意の技術が使用され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７（１９７５）；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）；Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）の７７〜９６頁を参照のこと）。単鎖抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号）は、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生するために適用され得る。また、トランスジェニックマウス、または他の生物（例えば、他の哺乳動物）を使用して、ヒト化抗体を発現し得る。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体、およびヘテロマーのＦａｂフラグメントを同定し得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４（１９９０）；Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９〜７８３（１９９２）を参照のこと）。
【００９２】
「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域、またはその一部が、変更、置換または交換され、その結果、抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能および/もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に対する新たな特性を付与する全く異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物など）に連結されるか；あるいは（ｂ）可変領域、またはその一部が、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域で変更、置換、または交換される、抗体分子である。
【００９３】
「抗ＧＰＣＲ−Ｂ４」抗体は、ＧＰＣＲ−Ｂ４遺伝子、ｃＤＮＡ、またはその部分配列によってコードされるポリペプチドを特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。
【００９４】
用語「イムノアッセイ」は、抗原を特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、抗原を単離、標的、および/または定量するために、特定の抗体の特異的結合特性を使用することによって特徴付けられる。
【００９５】
句、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」、または「〜と特異的に（または選択的に）免疫反応性」は、タンパク質またはペプチドに対して言及される場合、タンパク質および他の生物製剤の異種集団においてそのタンパク質の存在を決定する結合反応をいう。従って、指定されたイムノアッセイ条件下では、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、特定のタンパク質に結合し、そして実質的に、サンプル中に存在する他のタンパク質に対して有意な量で結合しない。このような条件下での抗体への特異的な結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とし得る。例えば、ラット、マウス、またはヒトのような特定の種由来のＧＰＣＲ−Ｂ４に惹起されるポリクローナル抗体は、ＧＰＣＲ−Ｂ４と特異的に免疫反応性でありかつＧＰＣＲ−Ｂ４の多型性改変体および対立遺伝子を除く他のタンパク質と特異的に免疫反応性でない、ポリクローナル抗体のみを得るために選択され得る。この選択は，他の種由来のＧＰＣＲ−Ｂ４と交叉反応する抗体を減じることによって達成され得る。種々のイムノアッセイ形式は、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために慣用的に使用される（特異的な免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式および条件の記載については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）を参照のこと）。代表的に、特異的または選択的反応は、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、そしてより代表的には、バックグラウンドの１０〜１００倍以上である。
【００９６】
句「〜と選択的に会合する」は、上記で定義されるように、別のものと「選択的にハイブリダイズする」核酸の能力、または上記で定義されるように、タンパク質に「選択的に（または特異的に）結合する」抗体の能力をいう。
【００９７】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、そして発現ベクターの複製または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、または真核生物細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、両生類細胞、もしくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａなど））、例えば、培養細胞、外植片、およびインビボ細胞であり得る。
【００９８】
（ＩＩＩ．ＧＰＣＲ−Ｂ４をコードする核酸の単離）
（Ａ．一般的な組換えＤＮＡ方法）
本発明は、組換え遺伝学の分野における慣用的な技術に依存する。本発明における使用の一般的方法を開示する基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。
【００９９】
核酸について、サイズは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで与えられる。これらは、アガロースゲル電気泳動もしくはアクリルアミドゲル電気泳動から、配列決定された核酸から、または公開されたＤＮＡ配列から推定される。タンパク質について、サイズは、キロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、由来されるアミノ酸配列から、または公開されたタンパク質配列から推定される。
【０１００】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４）に記載されるように、自動合成機を使用して、Ｂｅａｕｃａｇｅ＆Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９〜１８６２（１９８１）に最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｒｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７〜１４９（１９８３）に記載されるように、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによる。
【０１０１】
クローン化された遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、Ｇｅｎｅ １６：２１〜２６（１９８１）の二重鎖テンプレートを配列決定するための鎖終結法を使用してクローン化した後に確認され得る。
【０１０２】
（Ｂ．ＧＰＣＲ−Ｂ４をコードするヌクレオチド配列の単離のためのクローニング方法）
一般に、ＧＰＣＲ−Ｂ４をコードする核酸配列および関連する核酸配列ホモログは、プローブとのハイブリダイゼーションによりｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムＤＮＡライブラリーからクローン化されるか、またはオリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅技術を使用して単離される。例えば、ＧＰＣＲ−Ｂ４配列は、代表的に、核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって、哺乳動物核酸（ゲノムまたはｃＤＮＡ）ライブラリーから単離され、この配列は、配列番号３〜４および８に由来し得る。ＧＰＣＲ−Ｂ４ ＲＮＡおよびｃＤＮＡが単離され得る適切な組織は舌組織であり、必要に応じて、味蕾組織または個々の味覚細胞である。
【０１０３】
プライマーを使用する増幅技術もまた、ＤＮＡまたはＲＮＡからＧＰＣＲ−Ｂ４を増幅および単離するために使用され得る。以下のアミノ酸配列をコードする縮重プライマーもまた、ＧＰＣＲ−Ｂ４の配列を増幅するために使用され得る：配列番号５〜６（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｆａｃｈ＆Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、ＰＣＲ
Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９５）を参照のこと）。これらのプライマーは、例えば、全長配列、または数百のヌクレオチドに対する１つのプローブのいずれかを増幅するために使用され得る。次いで、これは、全長ＧＰＣＲ−Ｂ４についての哺乳動物ライブラリーをスクリーニングするために使用される。
【０１０４】
ＧＰＣＲ−Ｂ４をコードする核酸はまた、プローブとして抗体を使用して、発現ライブラリーから単離され得る。このようなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、配列番号１〜２および７の配列を使用して惹起され得る。
【０１０５】
ＧＰＣＲ−Ｂ４と実質的に同一であるＧＰＣＲ−Ｂ４の多型性改変体、対立遺伝子、および種間ホモログは、ＧＰＣＲ−Ｂ４核酸プローブ、およびオリゴヌクレオチドを使用して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーングすることにより単離され得る。あるいは、発現ライブラリーは、発現されたホモログをＧＰＣＲ−Ｂ４に対して作製された抗血清または精製抗体（これらはまた、ＧＰＣＲ−Ｂ４ホモログを認識し、そしてＧＰＣＲ−Ｂ４ホモログに特異的に結合する）を用いて免疫学的に検出することによって、ＧＰＣＲ−Ｂ４およびＧＰＣＲ−Ｂ４の多型性改変体、対立遺伝子、および種間ホモログをクローン化するために使用され得る。
【０１０６】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、ＧＰＣＲ−Ｂ４ ｍＲＮＡにおいて富化である供給源（例えば、舌組織、または単離された味蕾）を選択すべきである。次いで、ｍＲＮＡは、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡになり、組換えベクターへ連結され、そして増幅、スクリーニングおよびクローニングのために組換え宿主へ移動される。ｃＤＮＡライブラリーを作製およびスクリーニングする方法は、周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ ２５：２６３〜２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【０１０７】
ゲノムライブラリーについて、ＤＮＡは、組織から抽出され、そして約１２〜２０ｋｂのフラグメントを生じるように、機械的に剪断されるかまたは酵素的に消化されるかのいずれかである。次いで、フラグメントは、勾配遠心分離によって所望されないサイズと分離され、そしてバクテリオファージλベクター中に構築される。これらのベクターおよびファージは、インビトロでパッケージされる。組換えファージは、Ｂｅｎｔｏｎ＆Ｄａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９６：１８０〜１８２（１９７７）に記載されるように、プラークハイブリダイゼーションによって分析される。コロニーハイブリダイゼーションは、一般に、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７２：３９６１〜３９６５（１９７５）に記載されるように実施される。
【０１０８】
ＧＰＣＲ−Ｂ４核酸およびそのホモログを単離する代替方法は、合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用およびＲＮＡまたはＤＮＡテンプレートの増幅を組み合わせる（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような方法は、ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡから、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから直接的にＧＰＣＲ−Ｂ４の核酸配列を増幅するために使用され得る。縮重オリゴヌクレオチドは、本明細書で提供される配列を使用してＧＰＣＲ−Ｂ４ホモログを増幅するために設計され得る。制限エンドヌクレアーゼ部位は、プライマーへ組み込まれ得る。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅方法もまた、例えば、発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列をクローン化するために、生理学的サンプル中のｍＲＮＡをコードするＧＰＣＲ−Ｂ４の存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を作製するために、核酸の配列決定のために、または他の目的のために、有用であり得る。ＰＣＲ反応によって増幅された遺伝子は、アガロースゲルから精製され得、そして適切なベクターへクローン化され得る。
【０１０９】
ＧＰＣＲ−Ｂ４の遺伝子発現はまた、当該分野で公知の技術（例えば、ｍＲＮＡの逆転写および増幅、総ＲＮＡまたはポリＡ⁺ＲＮＡの単離、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、プロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）ＤＮＡマイクロチップアレイなど）によって分析され得る。１つの実施態様において、高密度オリゴヌクレオチド分析技術（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TM）は、本発明のＧＰＣＲのホモログおよび多型性改変体を同定するために使用される。同定されるホモログが既知の疾患に関連している場合、それらは、生物学的サンプル中で疾患を検出する際の診断手段としてＧｅｎｅＣｈｉｐ^TMとともに使用され得る（例えば、Ｇｕｎｔｈａｎｄら、ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４：８６９〜８７６（１９９８）；Ｋｏｚａｌら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３〜７５９（１９９６）；Ｍａｔｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：１１０〜１０６（１９９５）；Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１６７５〜１６８０（１９９６）；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．８：４３５〜４４８（１９９８）；Ｈａｃｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３８６５〜３８６６（１９９８）を参照のこと）。
【０１１０】
合成オリゴヌクレオチドは、プローブとしての使用のため、またはタンパク質の発現のために組換えＧＰＣＲ−Ｂ４遺伝子を構築するために使用され得る。この方法は、遺伝子のセンス鎖および非センス鎖の両方を示す、通常４０〜１２０ｂｐ長の一連の重複オリゴヌクレオチドを使用して実施される。次いで、これらのＤＮＡフラグメントは、アニールされ、連結され、そしてクローン化される。あるいは、増幅技術は、ＧＰＣＲ−Ｂ４核酸の特定の部分配列を増幅するために、正確なプライマーを用いて使用され得る。次いで、特定の部分配列は、発現ベクターへ連結される。
【０１１１】
ＧＰＣＲ−Ｂ４をコードする核酸は、代表的に、複製および/または発現のための原核生物細胞もしくは真核生物細胞への形質転換の前に、中間体ベクターへクローン化される。これらの中間体ベクターは、代表的に、原核生物ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはシャトルベクター）である。
【０１１２】
必要に応じて、ＧＰＣＲ−Ｂ４またはそのドメインを含むキメラタンパク質をコードする核酸は、標準的な技術に従って作製され得る。例えば、ドメイン（例えば、リガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば、７つの膜貫通領域ならびに対応する細胞外ループおよびサイトゾルループを包含するもの）、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン）、活性部位、サブユニット会合領域などは、異種タンパク質に共有結合的に連結され得る。例えば、細胞外ドメインは異種ＧＰＣＲ膜貫通ドメインに連結され得るか、または異種ＧＰＣＲ細胞外ドメインは膜貫通ドメインに連結され得る。他の選り抜きの異種タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質、β−ｇａｌ、グルタミン酸レセプター、およびロドプシンプレ配列（ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が挙げられる。
【０１１３】
（Ｃ．原核生物および真核生物における発現）
クローン化された遺伝子または核酸（例えば、ＧＰＣＲ−Ｂ４をコードするｃＤＮＡ）の高レベルの発現を得るために、代表的には、ＧＰＣＲ−Ｂ４を、転写を指向する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸に対する場合には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターへサブクローン化する。適切な細菌性プロモーターは、当該分野で周知であり、そして例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらに記載されている。ＧＰＣＲ−Ｂ４タンパク質を発現するための細菌性発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ ２２：２２９〜２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ ３０２：５４３〜５４５（１９８３）。このような発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、そしてまた、市販されている。１つの実施態様において、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。
【０１１４】
異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。プロモーターは、必要に応じて、異種転写開始部位からの距離が、その天然の設定における転写開始部位からの距離ととほぼ同じ距離に配置される。しかし、当該分野で公知であるように、この距離におけるいくらかの改変は、プロモーター機能を欠失することなく適応され得る。
【０１１５】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的に、宿主細胞においてＧＰＣＲ−Ｂ４をコードする核酸の発現について必要とされるさらなるエレメントを全て含む転写ユニットまたは発現カセットを含む。従って、代表的な発現カセットは、ＧＰＣＲ−Ｂ４をコードする核酸配列に作動可能に連結されるプロモーター、ならびに転写物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位、および翻訳終結を含む。ＧＰＣＲ−Ｂ４をコードする核酸配列は、代表的に、形質転換された細胞によって、コードされたタンパク質の分泌を促進するために、切断可能なシグナルペプチド配列に連結され得る。このようなシグナルペプチドは、とりわけ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、および神経成長因子、ならびにＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの若年性ホルモンエステラーゼ由来のシグナルペプチドを含む。カセットのさらなるエレメントとしては、エンハンサー、そしてゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合には、機能的スプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロンが挙げられ得る。
【０１１６】
プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、効率的な終結を提供するために構造遺伝子の下流に転写終結領域を含むべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られてもよいし、または異なる遺伝子から得られてもよい。
【０１１７】
遺伝情報を細胞へ輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核生物細胞または原核生物細胞における発現のために使用される任意の従来のベクターが、使用され得る。標準的な細菌性発現ベクターとしては、プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ）、および融合発現系（例えば、ＧＳＴおよびＬａｃＺ）が挙げられる。エピトープタグもまた、簡便な単離方法を提供するために組換えタンパク質に付加され得る（例えば、ｃ−ｍｙｃ）。
【０１１８】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、代表的に、真核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）において使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ⁺、ｐＭＴＯ１０／Ａ⁺、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーター、または真核生物細胞における発現に有効であると示される他のベクターの指向下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０１１９】
いくつかの発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー（例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ）を有する。あるいは、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクター（ポリへドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指向下でＧＰＣＲ−Ｂ４をコードする配列を有する）の使用のような、遺伝子増幅に関与しない高収率発現系もまた適切である。
【０１２０】
代表的に発現ベクターに含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を許容するために抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物の配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域中の固有の制限部位を含む。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当該分野で公知の多くの任意の耐性遺伝子が適切である。原核生物の配列は、必要に応じて選択され、その結果、それらは、必要であれば、真核生物細胞中のＤＮＡの複製を妨害しない。
【０１２１】
標準的なトランスフェクション方法は、大量のＧＰＣＲ−Ｂ４タンパク質を発現する細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を生成するために使用され、次いで、このタンパク質は、標準的な技術を使用して精製される（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９〜１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）を参照のこと）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施される（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９〜３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ＆Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：３４７〜３６２（Ｗｕら編、１９８３）を参照のこと）。
【０１２２】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入するための任意の周知の手順が、使用され得る。これらとしては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、血漿ベクター、ウイルスベクター、およびクローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞へ導入するための任意の他の周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）の使用が挙げられる。使用される特定の遺伝子操作手順は、少なくとも１つの遺伝子を、ＧＰＣＲ−Ｂ４を発現し得る宿主細胞へ首尾よく導入し得ることが必要であるのみである。
【０１２３】
発現ベクターが細胞へ導入された後、トランスフェクトされた細胞は、ＧＰＣＲ−Ｂ４の発現を支持する条件下で培養され、このＧＰＣＲ−Ｂ４は、以下で同定される標準的な技術を使用して培養物から回収される。
【０１２４】
（ＩＶ．ＧＰＣＲ−Ｂ４の精製）
天然に存在するＧＰＣＲ−Ｂ４または組換えＧＰＣＲ−Ｂ４のいずれかは、機能的アッセイにおける使用のために精製され得る。必要に応じて、組換えＧＰＣＲ−Ｂ４が精製される。天然に存在するＧＰＣＲ−Ｂ４は、例えば、哺乳動物組織（例えば、舌組織）、およびＧＰＣＲ−Ｂ４ホモログの任意の他の供給源から精製される。組換えＧＰＣＲ−Ｂ４は、任意の適切な細菌発現系および真核生物発現系（例えば、ＣＨＯ細胞または昆虫細胞）から精製される。
【０１２５】
ＧＰＣＲ−Ｂ４は、標準的な技術（硫酸アンモニウムのような物質を用いる選択的沈殿；カラムクロマトグラフィー、免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを含む）によって実質的に純粋まで精製され得る（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）；米国特許第４，６７３，６４１号；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。
【０１２６】
多くの手順は、組換えＧＰＣＲ−Ｂ４が精製されている場合に利用され得る。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質は、可逆的にＧＰＣＲ−Ｂ４に融合され得る。適切なリガンドを用いて、ＧＰＣＲ−Ｂ４は、選択的に精製カラムに吸着され得、次いで、比較的純粋な形態でカラムから遊離され得る。次いで、融合されたタンパク質は、酵素活性によって除去される。最終的に、ＧＰＣＲ−Ｂ４は、イムノアフィニティーカラムを使用して精製され得る。
【０１２７】
（Ａ．組換え細胞からのＧＰＣＲ−Ｂ４の精製）
組換えタンパク質は、代表的にはプロモーター誘導後に、形質転換された細菌細胞または真核生物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくは昆虫細胞）によって大量に発現されるが；しかし、発現は構成的であり得る。ＩＰＴＧを用いるプロモーター誘導は、誘導性プロモーター系の一例である。細胞は、当該分野で標準的な手順に従って増殖される。新鮮細胞または凍結細胞は、タンパク質の単離のために使用される。
【０１２８】
細菌において発現されるタンパク質は、不溶性の凝集物（「封入体」）を形成し得る。いくつかのプロトコルは、ＧＰＣＲ−Ｂ４封入体の精製のために適切である。例えば、封入体の精製は、代表的に、細菌細胞の破壊による（例えば、５０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣＬ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＡＴＰ、および１ｍＭ ＰＭＳＦの緩衝液中でのインキュベーションによる）封入体の抽出、分離および／または精製を包含する。細胞懸濁液は、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓに２〜３回通過させて溶解され得るか、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してホモジナイズされ得るか、または氷上で音波破砕され得る。細菌を溶解する代替方法は、当業者に明らかである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。
【０１２９】
必要であれば、封入体は可溶化され、そして溶解された細胞懸濁液は、代表的に、望ましくない不溶性物質を除去するために遠心分離される。封入体を形成したタンパク質は、適合する緩衝液を用いて希釈または透析することによって再生され得る。適切な溶媒としては、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、容量／容量基準）、およびグアニジン塩酸塩（約４Ｍ〜約８Ｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。凝集物形成タンパク質を可溶化し得るいくつかの溶媒（例えば、ＳＤＳ（ドデシル流酸ナトリウム）、７０％ギ酸）は、免疫原性および／または活性の欠失を付随する、タンパク質の不可逆変性の可能性に起因して、この手順での使用に不適切である。グアニジン塩酸塩および類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、そして、変性剤の除去（例えば、透析による）または希釈によって、再生が生じ、免疫学的および／または生物学的に活性なタンパク質の再形成を可能にする。他の適切な緩衝液は、当業者に公知である。ＧＰＣＲ−Ｂ４は、標準的な分離技術（例えば、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を用いる）によって、他の細菌性タンパク質から分離される。
【０１３０】
あるいは、細菌ペリプラズムからのＧＰＣＲ−Ｂ４の精製が、可能である。細菌の溶解後、ＧＰＣＲ−Ｂ４が細菌のペリプラズムへ輸出される（ｅｘｐｏｒｔ）場合、この細菌のペリプラズムの画分は、当業者に公知の他の方法に加えて、低温浸透圧ショックによって単離され得る。ペリプラズムから組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞を遠心分離してペレットを形成させる。このペレットは、２０％スクロースを含有する緩衝液中に再懸濁される。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、そしてペレットを氷冷の５ｍＭ ＭｇＳＯ₄中に再懸濁し、そして約１０分間氷浴中に保存する。この細胞懸濁液を遠心分離し、そして上清をデカントし、そして保管する。この上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準的な分離技術によって宿主タンパク質から分離され得る。
【０１３１】
（Ｂ．ＧＰＣＲ−Ｂ４を精製するための標準的なタンパク質分離技術）
（溶解度分画）
しばしば最初の工程として、特に、タンパク質混合物が複合体である場合、最初の塩分画は、目的の組換えタンパク質から、望ましくない宿主細胞タンパク質（または細胞培養培地由来のタンパク質）の多くを分離し得る。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水分量を効率的に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質は、これらの溶解度に基づいて沈殿される。タンパク質が疎水性になるにつれ、このタンパク質はより低い硫酸アンモニウム濃度でより沈殿するようである。代表的なプロトコルとしては、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が、２０〜３０％の間であるように、タンパク質溶液に対して飽和硫酸アンモニウムを添加することが挙げられる。この濃度は、最も疎水性のタンパク質を沈殿させる。次いで、沈殿物が廃棄され（目的のタンパク質が疎水性である場合を除く）、そして目的のタンパク質を沈殿させることが既知な濃度まで、硫酸アンモニウムがこの上清に添加される。次いで、沈殿物は、緩衝液中に可溶化され、そして、必要であれば、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかによって、過剰な塩が除去される。タンパク質の溶解度に依存する他の方法（例えば、冷エタノール沈殿）は当業者に周知であり、そして複合体タンパク質混合物を分別するために使用され得る。
【０１３２】
（サイズ差（ｓｉｚｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）濾過）
ＧＰＣＲ−Ｂ４の分子量は、異なる孔サイズの膜（例えば、Ａｍｉｃｏｎの膜またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅの膜）を通す限外濾過を使用して、ＧＰＣＲ−Ｂ４を、より大きなサイズおよびより小さなサイズのタンパク質から単離するために利用され得る。第１工程として、タンパク質混合物は、目的のタンパク質の分子量よりも低分子量のカットオフを有する孔サイズを有する膜を通して限外濾過される。次いで、限外濾過の残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は、目的のタンパク質の分子量よりも大きな分子カットオフを有する膜に対して限外濾過される。組換えタンパク質は、その膜を通過して濾液となる。次いで、濾液は、以下で記載されるようにクロマトグラフィーされ得る。
【０１３３】
（カラムクロマトグラフィー）
ＧＰＣＲ−Ｂ４はまた、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離され得る。さらに、タンパク質に対して惹起される抗体は、カラムマトリクスに結合体化され得、そしてタンパク質が免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｙ）される。これらの方法の全ては、当該分野で周知である。クロマトグラフィー技術が任意のスケールで実施され得、そして多くの異なる製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの装置を使用し得ることは、当業者に明らかである。
【０１３４】
（Ｖ．ＧＰＣＲ−Ｂ４の免疫学的検出）
ＧＰＣＲ−Ｂ４遺伝子の検出、および核酸ハイブリダイゼーション技術を使用する遺伝子発現に加えて、ＧＰＣＲ−Ｂ４を検出するために、例えば、味覚レセプター細胞およびＧＰＣＲ−Ｂ４の改変体を同定するために、イムノアッセイもまた使用され得る。イムノアッセイは、ＧＰＣＲ−Ｂ４を定性的または定量的に分析するために使用され得る。適用可能な技術の一般的な概要は、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）に見出され得る。
【０１３５】
（Ａ．ＧＰＣＲ−Ｂ４に対する抗体）
ＧＰＣＲ−Ｂ４と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、前出；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）；ならびにＫｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７（１９７５）を参照のこと）。このような技術としては、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体の調製、ならびにウサギまたはマウスを免疫化することによるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が挙げられる（例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６（１９８９）を参照のこと）。
【０１３６】
免疫原を含む多くのＧＰＣＲ−Ｂ４は、ＧＰＣＲ−Ｂ４と特異的に反応する抗体を産生するために使用され得る。例えば、組換えＧＰＣＲ−Ｂ４またはその抗原性フラグメントは、本明細書で記載されるように単離される。組換えタンパク質は、上記のように真核生物細胞または原核生物細胞において発現され得、そして一般に上記のように精製され得る。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生のために好ましい免疫原である。あるいは、本明細書に開示される配列に由来し、そしてキャリアタンパク質に結合体化される合成ペプチドは、免疫原として使用され得る。天然に存在するタンパク質はまた、純粋な形態または不純な形態のいずれかにおいて使用され得る。次いで、この生成物は、抗体を産生し得る動物へ注射される。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかが、タンパク質を測定するためのイムノアッセイにおける引き続く使用のために、産生され得る。
【０１３７】
ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に公知である。マウスの近交系系統（例えば、ＢＡＬＢ／Ｃマウス）またはウサギの近交系系統を、標準的なアジュバント（例えば、フロイントアジュバント）および標準的な免疫プロトコールを使用して、タンパク質で免疫する。免疫原性調製物に対する動物の免疫応答を、試験採血を行うことおよびＧＰＣＲ−Ｂ４に対する反応性の力価を測定することによってモニターする。この免疫原に対する適切な高力価の抗体が得られた場合、この動物から血液を採集し、そして抗血清を調製する。所望される場合には、タンパク質に対して反応性の抗体を富化させるための抗血清のさらなる分画が実施され得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、前出を参照のこと）。
【０１３８】
モノクローナル抗体は、当業者に周知の種々の技術によって獲得され得る。簡潔には、所望される抗原で免疫された動物由来の脾臓細胞を、一般的には骨髄腫細胞との融合によって不死化させる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）を参照のこと）。不死化の代替の方法としては、エプスタイン−バーウイルス、オンコジーン、もしくはレトロウイルスでの形質転換、または当該分野において周知の他の方法が挙げられる。単一の不死化細胞から生じたコロニーを、所望の特異性の抗体の産生および抗原に対する親和性についてスクリーニングする。そしてこのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収率は、種々の技術（脊椎動物宿主の腹膜腔内への注射を含む）によって増大され得る。あるいは、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）によって概説された一般的プロトコールに従って、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離し得る。
【０１３９】
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清は収集され、そしてイムノアッセイ（例えば、固体支持体に固定された免疫原を用いる固相イムノアッセイ）において、免疫原タンパク質に対して滴定する。代表的には、１０⁴以上の力価を有するポリクローナル抗血清が選択され、そして競合的結合イムノアッセイを使用して、非ＧＰＣＲ−Ｂ４タンパク質に対するそれらの交叉反応性、または他の生物由来の他の関連タンパク質に対する交叉反応性までも試験した。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、通常は、少なくとも約０．１ｍＭ、より通常には少なくとも約１μＭ、必要に応じて少なくとも約０．１μＭ以下、そして必要に応じて０．０１μＭ以下のＫ_dで結合する。
【０１４０】
一旦、ＧＰＣＲ−Ｂ４特異的抗体が利用可能になると、ＧＰＣＲ−Ｂ４は、種々のイムノアッセイ方法によって検出され得る。免疫学的手順およびイムノアッセイ手順の概説については、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）を参照のこと。さらに、本発明のイムノアッセイは、いくつかの立体配置のいずれでも実施され得る。この立体配置は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍａｇｇｉｏ編、１９８０）；およびＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（前出）に広範に概説される。
【０１４１】
（Ｂ．免疫学的結合アッセイ）
ＧＰＣＲ−Ｂ４は、十分に容認された多くの免疫学的結合アッセイ（例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同第４，８３７，１６８号を参照のこと）のいずれかを使用して、検出および／または定量化され得る。一般的なイムノアッセイの概説については、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３７巻（Ａｓａｉ編、１９９３）；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、第７版、１９９１）もまた参照のこと。免疫学的結合アッセイ（すなわち、イムノアッセイ）は、代表的に、選択されたタンパク質または抗原（この場合、ＧＰＣＲ−Ｂ４またはその抗原性部分配列）に特異的に結合する抗体を使用する。抗体（例えば、抗ＧＰＣＲ−Ｂ４）は、当業者に周知でありそして上記のような多くの手順のいずれかによって産生され得る。
【０１４２】
イムノアッセイはまた、抗体および抗原によって形成される複合体に特異的に結合し、そしてそれを標識する標識化剤をしばしば使用する。標識化剤は、それ自体、抗体／抗原複合体を含む１つの部分であり得る。従って、標識化剤は、標識されたＧＰＣＲ−Ｂ４ポリペプチドまたは標識された抗ＧＰＣＲ−Ｂ４抗体であり得る。あるいは、標識化剤は、抗体／ＧＰＣＲ−Ｂ４複合体に特異的に結合する二次抗体のような第３の部分であり得る（二次抗体は、代表的に、一次抗体が由来する種の抗体に特異的である）。免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合し得る他のタンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）もまた、標識化剤として使用され得る。これらのタンパク質は、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域との強力な非免疫原性反応性を示す（例えば、Ｋｒｏｎｖａｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１４０１−１４０６（１９７３）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−２５４２（１９８５）を参照のこと）。標識化剤は、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が特異的に結合し得る検出可能部分（例えば、ビオチン）で改変され得る。種々の検出可能部分が当業者に周知である。
【０１４３】
アッセイ全体を通して、試薬の各配合の後に、インキュベーション工程および／または洗浄工程が必要とされ得る。インキュベーション工程は、約５秒間から数時間まで、必要に応じて、約５分間から約２４時間まで変動し得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイの様式、抗原、溶液の容量、濃度などに依存する。通常、アッセイは、周辺温度にて実施されるが、これは、一定範囲の温度（例えば、１０℃〜４０℃）にわたって実施され得る。
【０１４４】
（非競合的アッセイ様式）
サンプル中のＧＰＣＲ−Ｂ４を検出するためのイムノアッセイは、競合的または非競合的のいずれかであり得る。非競合的イムノアッセイとは、抗原の量が直接的に測定されるアッセイである。１つの好ましい「サンドウィッチ」アッセイにおいて、例えば、抗ＧＰＣＲ−Ｂ４抗体は、固体基材に直接結合され得、この固体基材上に抗体が固定される。次いで、これらの固定化抗体は、試験サンプル中に存在するＧＰＣＲ−Ｂ４を捕捉する。次いで、このように固定されたＧＰＣＲ−Ｂ４を、標識化剤（例えば、標識を保有するＧＰＣＲ−Ｂ４二次抗体）に結合させる。あるいは、二次抗体は標識を欠いてもよいが、これは、次いで、二次抗体が由来する種の抗体に対して特異的な標識化三次抗体に結合され得る。二次抗体または三次抗体は、代表的には、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）が特異的に結合する検出可能部分（例えば、ビオチン）で改変されて、検出可能部分を提供する。
【０１４５】
（競合的アッセイ様式）
競合的アッセイにおいては、サンプル中に存在するＧＰＣＲ−Ｂ４の量は、サンプル中に存在する未知のＧＰＣＲ−Ｂ４によって、抗ＧＰＣＲ−Ｂ４抗体から置換される（競合により取り除かれる（ｃｏｍｐｅｔｅｄ ａｗａｙ））既知の添加された（外因性）ＧＰＣＲ−Ｂ４の量を測定することによって、間接的に測定される。１つの競合的アッセイにおいて、既知の量のＧＰＣＲ−Ｂ４がサンプルに添加され、次いでこのサンプルを、ＧＰＣＲ−Ｂ４に特異的に結合する抗体と接触させる。この抗体に結合する外因性のＧＰＣＲ−Ｂ４の量は、サンプル中に存在するＧＰＣＲ−Ｂ４の濃度に反比例する。特定の好ましい実施態様において、抗体は固体基材に固定される。抗体に結合するＧＰＣＲ−Ｂ４の量は、ＧＰＣＲ−Ｂ４／抗体複合体中に存在するＧＰＣＲ−Ｂ４の量を測定することによって、あるいは残存している非複合体化タンパク質の量を測定することによってのいずれかで決定され得る。ＧＰＣＲ−Ｂ４の量は、標識されたＧＰＣＲ−Ｂ４分子を提供することによって検出され得る。
【０１４６】
ハプテン阻害アッセイは、別の好ましい競合的アッセイである。このアッセイにおいては、既知のＧＰＣＲ−Ｂ４が固体基材上に固定される。既知の量の抗ＧＰＣＲ−Ｂ４抗体がサンプルに添加され、次いでこのサンプルを、固定されたＧＰＣＲ−Ｂ４と接触させる。既知の固定されたＧＰＣＲ−Ｂ４に結合した抗ＧＰＣＲ−Ｂ４抗体の量は、サンプル中に存在するＧＰＣＲ−Ｂ４の量と反比例する。再度、固定された抗体の量は、抗体の固定された画分または溶液中に残存する抗体の画分のいずれかを検出することによって検出され得る。検出は、直接的であり得るか（ここで、抗体は標識されている）、または上記のように抗体に特異的に結合する標識化部分の引き続く添加によって間接的であり得る。
【０１４７】
（交叉反応性の測定）
競合的結合様式におけるイムノアッセイはまた、交叉反応性の測定のために使用され得る。例えば、配列番号１〜２、および７によって少なくとも部分的にコードされるタンパク質が、固体支持体上に固定され得る。タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ−Ｂ４のタンパク質およびホモログ）は、この固定された抗原への抗血清の結合について競合するアッセイに添加される。添加されたタンパク質が、固定化タンパク質への抗血清の結合について競合する能力は、配列番号１〜２、または７によってコードされるＧＰＣＲ−Ｂ４がそれ自身と競合する能力と比較される。上記のタンパク質についての交叉反応性の百分率は、標準的な計算を使用して算出される。上記に列挙される添加されたタンパク質の各々と１０％未満の交叉反応性を有する抗血清を選択し、そしてプールする。必要に応じて、交叉反応性抗体は、添加される考慮されたタンパク質（例えば、遠縁のホモログ）での免疫吸収によって、プールされた抗血清から取り除かれる。
【０１４８】
次いで、免疫吸着されそしてプールされた抗血清を、上記のような競合的結合イムノアッセイに用いて、免疫原タンパク質（すなわち、配列番号１〜２、または７のＧＰＣＲ−Ｂ４）に対して、おそらくＧＰＣＲ−Ｂ４の対立遺伝子改変体または多型改変体と考えられる第２のタンパク質を比較する。この比較をなすために、２つのタンパク質は各々、広範な濃度でアッセイされ、そして固定化タンパク質への抗血清の結合の５０％を阻害するのに必要とされる各タンパク質の量が決定される。結合の５０％を阻害するために必要とされる第２のタンパク質の量が、結合の５０％を阻害するために必要とされる配列番号１〜２、または７によってコードされるタンパク質の量の１０倍未満である場合、この第２のタンパク質はＧＰＣＲ−Ｂ４免疫原に対して生成されたポリクローナル抗体に特異的に結合するといわれる。
【０１４９】
（他のアッセイ様式）
ウェスタンブロット（イムノブロット）分析が、サンプル中のＧＰＣＲ−Ｂ４の存在を検出および定量化するために使用される。この技術は一般に、以下の工程を包含する：分子量に基づいて、ゲル電気泳動によってサンプルのタンパク質を分離させる工程、分離されたタンパク質を適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルター）に転写する工程、およびＧＰＣＲ−Ｂ４を特異的に結合する抗体と共にサンプルをインキュベートする工程。抗ＧＰＣＲ−Ｂ４抗体は、固体支持体上のＧＰＣＲ−Ｂ４に特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識され得るか、あるいは抗ＧＰＣＲ−Ｂ４抗体に特異的に結合する標識化抗体（例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体）を用いて、引き続き検出され得る。
【０１５０】
他のアッセイ様式としては、リポソームイムノアッセイ（ＬＩＡ）が挙げられ、これは特定の分子（例えば、抗体）に結合して、カプセル化された試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを使用する。次いで、この放出された化学薬品が、標準的技術に従って検出される（Ｍｏｎｒｏｅら、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１（１９８６）を参照のこと）。
【０１５１】
（非特異的結合の削減）
当業者は、イムノアッセイにおいて非特異的結合を最小化することがしばしば所望されることを理解する。特に、アッセイが固体基材に固定された抗原または抗体を含む場合、この基材への非特異的結合の量を最小化することが所望され得る。このような非特異的結合を削減する手段は、当業者に周知である。代表的には、この技術は、基板を蛋白様組成物でコーティングすることを含む。特に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチンのようなタンパク質組成物が広範に用いられ、そして粉乳が最も好ましい。
【０１５２】
（標識）
このアッセイで使用される特定の標識または検出可能な基は、それがこのアッセイにおいて使用される抗体の特異的結合を有意に阻害しない限り、本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的特性または化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野において十分に開発されており、そして一般的に、このような方法において有用な大半の任意の標識が、本発明に適用され得る。従って、標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出され得る任意の組成物である。本発明において有用な標識としては、以下が挙げられる；磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ^TM）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、³Ｈ、¹²⁵Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁴Ｃ、または³²Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用される他の酵素）、および比色標識（例えば、金コロイド、または着色ガラスビーズもしくは着色プラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）。
【０１５３】
標識は、当該分野において周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に対して、直接的または間接的に結合され得る。上記のように、広範な種々の標識が使用され得、ここで標識の選択は、必要とされる感度、化合物との結合の容易さ、安定性の要求度、利用可能な装置、および廃棄設備に依存する。
【０１５４】
非放射能性標識は、しばしば間接的手段によって結合される。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）が、この分子に共有結合される。次いで、このリガンドは、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合される。この別の分子は、固有に検出可能であるか、またはシグナル系（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物）に共有結合されるかのいずれかである。リガンドおよびそれらの標的は、ＧＰＣＲ−Ｂ４を認識する抗体、または抗ＧＰＣＲ−Ｂ４を認識する二次抗体との任意の適切な組み合わせにおいて使用され得る。
【０１５５】
この分子はまた、シグナルを生成する化合物に直接的に結合体化され得る（例えば、酵素または発蛍光団と結合体化することによって）。標的としての目的の酵素は主に、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅ）、特にぺルオキシダーゼである。蛍光化合物としては、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光化合物としては、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。使用され得る種々の標識系またはシグナル生成系の概説としては、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
【０１５６】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性標識である場合、検出のための手段は、オートラジオグラフィーにおける場合のようなシンチレーションカウンターまたは写真フィルムを含む。標識が蛍光標識である場合、これは適切な波長の光で蛍光色素を励起すること、および生じた蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、写真フィルムを利用して、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などのような電子検出器の使用によって、可視的に検出され得る。同様に、酵素標識は、その酵素に適切な基質を提供することおよび生じた反応産物を検出することによって検出され得る。最後に、単純な比色標識は、標識に関連する色を観察することによって単純に検出され得る。従って、種々のディップスティックアッセイ（ｄｉｐｓｔｉｃｋ ａｓｓａｙ）において、結合体化された金はしばしばピンクのように見え、一方で種々の結合体化されたビーズはそのビーズの色に見える。
【０１５７】
いくつかのアッセイ様式は、標識された成分の使用を必要としない。例えば、凝集体化アッセイは、標的抗体の存在を検出するために使用され得る。この場合、抗原をコーティングされた粒子が、標的抗体を含有するサンプルによって凝集体化される。この様式においては、いかなる成分も標識される必要がなく、そして標的抗体の存在は、単純な可視的検査によって検出される。
【０１５８】
（ＶＩ．ＧＰＣＲ−Ｂ４のモジュレーターについてのアッセイ）
（Ａ．ＧＰＣＲ−Ｂ４活性についてのアッセイ）
ＧＰＣＲ−Ｂ４ならびにその対立遺伝子改変体および多型改変体は、味覚伝達に関与するＧタンパク質共役レセプターである。ＧＰＣＲ−Ｂ４ポリペプチドの活性は、機能的効果、化学的効果、および物理的効果を測定するための種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイ（例えば、リガンド結合（例えば、放射性リガンド結合）、第二メッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ₃、ＤＡＧ、またはＣａ²⁺）、イオン流出、リン酸化レベル、転写レベル、神経伝達物質レベルなどを測定すること）を使用して、アッセイされ得る。さらに、このようなアッセイは、ＧＰＣＲ−Ｂ４のインヒビターおよびアクチベーターを試験するために使用され得る。モジュレーターはまた、ＧＰＣＲ−Ｂ４の遺伝的に改変されたバージョンであり得る。味覚伝達活性のこのようなモジュレーターは、味覚をカスタマイズするために有用である。
【０１５９】
アッセイのＧＰＣＲ−Ｂ４は、配列番号１〜２、または７の配列を有するポリペプチドまたはその保存的に改変された改変体から選択される。あるいは、アッセイのＧＰＣＲ−Ｂ４は真核生物に由来し、そしてこれは配列番号１〜２、または７にアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸部分配列を含む。一般的に、アミノ酸配列同一性は、少なくとも７０％、必要に応じて、少なくとも８５％、必要に応じて少なくとも９０〜９５％である。必要に応じて、アッセイのポリペプチドは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン、サブユニット関連ドメイン、活性部位などのようなＧＰＣＲ−Ｂ４のドメインを含む。ＧＰＣＲ−Ｂ４またはそのドメインのいずれかは、異種タンパク質に共有結合されて、本明細書中に記載のアッセイにおいて使用されるキメラタンパク質を作製し得る。
【０１６０】
ＧＰＣＲ−Ｂ４活性のモジュレーターは、上記のように、組換えによって生じるかまたは天然に存在するかのいずれかであるＧＰＣＲ−Ｂ４ポリペプチドを使用して試験される。組換えによって生じるかまたは天然に存在するかのいずれかである、タンパク質は単離され得、細胞において発現され得、細胞由来の膜において発現され得、組織または動物中で発現され得る。例えば、舌の切片、舌から解離された細胞、形質転換された細胞、または膜が使用され得る。調節は、本明細書中に記載のインビトロアッセイまたはインビボアッセイのうちの１つを使用して試験される。味覚伝達はまた、異種のシグナル伝達ドメインに共有結合されたレセプターの細胞外ドメイン、またはレセプターの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインに共有結合された異種の細胞外ドメインのようなキメラ分子を用いて、可溶性反応または固体反応でインビトロにおいて試験され得る。さらに、目的のタンパク質のリガンド結合ドメインを、可溶性反応または固体反応においてインビトロで使用して、リガンド結合についてアッセイし得る。
【０１６１】
ＧＰＣＲ−Ｂ４、ドメイン、キメラタンパク質へのリガンド結合は、溶液において、二重層膜において、固相に付着されて、脂質単層において、またはビヒクルにおいて試験され得る。モジュレーターの結合は、例えば、分光学的特徴（例えば、蛍光、吸着、屈折率）、流体力学特性（例えば、形状）、クロマトグラフィーの特性、または可溶性特性おける変化を使用して試験され得る。
【０１６２】
レセプター−Ｇタンパク質の相互作用もまた試験され得る。例えば、レセプターへのＧタンパク質の結合、またはレセプターからのＧタンパク質の放出を試験し得る。例えば、ＧＴＰの非存在下において、アクチベーターは、Ｇタンパク質（３つすべてのサブユニット）とレセプターとの堅固な複合体の形成を導く。この複合体は、上記に述べたような種々の方法において検出され得る。このようなアッセイは、インヒビターを検索するために改変され得る。ＧＴＰの非存在下でレセプターおよびＧタンパク質にアクチベーターを添加し、堅固な複合体を形成し、次いでレセプター−Ｇタンパク質複合体の解離を観察することによってインヒビターをスクリーニングする。ＧＴＰの存在下では、他の２つのＧタンパク質サブユニットからのＧタンパク質のαサブユニットの放出を、活性化の判断基準として使用する。
【０１６３】
活性化されたＧタンパク質または阻害されたＧタンパク質は、また、標的酵素、チャネル、および他のエフェクタータンパク質の特性を改変する。伝統的な例は、視覚系におけるトランスデューシンによるｃＧＭＰホスホジエステラーゼの活性化、刺激Ｇタンパク質によるアデニル酸シクラーゼの活性化、Ｇｑおよび他の同属Ｇタンパク質によるホスホリパーゼＣの活性化、ならびにＧｉタンパク質および他のＧタンパク質による多岐チャネルの調節である。下流の結果（例えば、ホスホリパーゼＣによるジアシルグリセロールおよびＩＰ３の生成、次いでＩＰ３によるカルシウム流動化）もまた試験され得る。
【０１６４】
活性化されたＧＰＣＲレセプターは、レセプターのＣ末端のＣ末端尾部（ｔａｉｌ）（そしておそらく、他の部位でも同様）をリン酸化するキナーゼの基質となる。従って、アクチベーターは、γ標識されたＧＴＰからレセプターへの³²Ｐの転移を促進し、これは、シンチレーションカウンターでアッセイされ得る。Ｃ末端尾部のリン酸化は、アレスチン様のタンパク質の結合を促進し、そしてＧタンパク質の結合を阻害する。キナーゼ／アレスチン経路は、多くのＧＰＣＲレセプターの脱感受性において重要な役割を果たす。例えば、味覚レセプターが活性にとどまる持続期間を調節する化合物は、所望される味覚を延長するか、または不快な味覚を断つ手段として有用である。ＧＰＣＲシグナル伝達およびシグナル伝達をアッセイする方法の一般的概説については、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２３７巻および第２３８巻（１９９４）および第９６巻（１９８３）；Ｂｏｕｒｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ １０：３４９：１１７−２７（１９９１）；Ｂｏｕｒｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：１２５−３２（１９９０）；Ｐｉｔｃｈｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：６５３−９２（１９９８）を参照のこと。
【０１６５】
有望なＧＰＣＲ−Ｂ４のインヒビターまたはアクチベーターで処理されるサンプルまたはアッセイは、調節の程度を調べるために、試験化合物を伴わないコントロールサンプルと比較される。コントロールサンプル（アクチベーターまたはインヒビターで処置されていない）は、相対的ＧＰＣＲ−Ｂ４活性値１００を割り当てられる。ＧＰＣＲ−Ｂ４の阻害は、コントロールと相対的なＧＰＣＲ−Ｂ４活性値が約９０％、必要に応じて５０％、必要に応じて２５〜０％である場合に達成される。ＧＰＣＲ−Ｂ４の活性化は、コントロールと相対的なＧＰＣＲ−Ｂ４活性値が１１０％、必要に応じて１５０％、２００〜５００％、または１０００〜２０００％である場合に達成される。
【０１６６】
イオン流における変化は、ＧＰＣＲ−Ｂ４を発現する細胞または膜の分極（すなわち、電位）における変化を測定することによって評価され得る。細胞の分極における変化を測定するための手段の１つは、電圧固定およびパッチクランプ技術（例えば、「細胞接着」様式、「裏返し（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）」様式、および「全細胞」様式（例えば、Ａｃｋｅｒｍａｎら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：１５７５−１５９５（１９９７）を参照のこと）を用いて、電流の変化を測定する（それによって分極における変化を測定する）ことによるものである。全細胞の電流は、標準的技術（例えば、Ｈａｍｉｌら、ＰＦｌｕｇｅｒｓ．Ａｒｃｈｉｖ．３９１：８５（１９８１）を参照のこと）を用いて、簡便に測定される。他の公知のアッセイとしては、以下が挙げられる：放射性標識イオン流アッセイおよび電圧感受性色素を用いる蛍光アッセイ（例えば、Ｖｅｓｔｅｒｇａｒｒｄ−Ｂｏｇｉｎｄら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．８８：６７−７５（１９８８）；ＧｏｎｚａｌｅｓおよびＴｓｉｅｎ、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：２６９−２７７（１９９７）；Ｄａｎｉｅｌら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５：１８５−１９３（１９９１）；Ｈｏｌｅｖｉｎｓｋｙら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３７：５９−７０（１９９４）を参照のこと）。一般的に、試験される化合物は、１ｐＭ〜１００ｍＭの範囲で存在する。
【０１６７】
ポリペプチドの機能に対する試験化合物の効果は、上記のパラメーターのいずれかを試験することによって測定され得る。ＧＰＣＲ活性に作用する任意の適切な生理学的変化を使用して、本発明のポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価し得る。機能的な結果がインタクトな細胞または動物を用いて測定される場合、伝達物質放出、ホルモン放出、既知の遺伝的マーカーおよび特徴付けられていない遺伝的マーカーの両方に対する転写の変化（例えば、ノーザンブロット）、細胞増殖またはｐＨ変化のような細胞代謝における変化、および細胞内第二メッセンジャー（例えば、Ｃａ²⁺、ＩＰ３、またはｃＡＭＰ）における変化のような種々の効果もまた測定され得る。
【０１６８】
Ｇタンパク質共役レセプターについての好ましいアッセイは、レセプター活性をレポートするためのイオンまたは電圧感受性色素を載せた細胞を含む。このようなレセプターの活性を決定するためのアッセイはまた、試験される化合物の活性を評価するために、陰性コントロールまたは陽性コントロールとして、他のＧタンパク質共役レセプターに対する公知のアゴニストおよびアンタゴニストを使用し得る。調節化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）を同定するためのアッセイにおいて、細胞質におけるイオンのレベルまたは膜電圧における変化は、それぞれ、イオン感受性、または膜電圧蛍光インジケーターを用いてモニターされる。イオン感受性インジケーターおよび電圧プローブの中で用いられ得るのは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ １９９７カタログに開示されるものである。Ｇタンパク質共役レセプターについて、不規則な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｇタンパク質（例えば、Ｇα１５およびＧα１６）は、選り抜きのアッセイに用いられ得る（Ｗｉｌｋｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１００４９−１００５３（１９９１））。このような不規則なＧタンパク質は、広範囲のレセプターのカップリングを可能にする。
【０１６９】
レセプターの活性化は、代表的には、引き続く細胞内事象を開始する（例えば、カルシウムイオンの細胞内貯蔵物を放出する、ＩＰ３のような第二メッセンジャーを増加させる）。いくつかのＧタンパク質共役レセプターの活性化は、ホスファチジルイノシトールのホスホリパーゼＣ媒介加水分解を通じてイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する（ＢｅｒｒｉｄｇｅおよびＩｒｖｉｎｅ，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３１５−２１（１９８４））。次いで、ＩＰ３は、細胞内カルシウムイオン貯蔵物の放出を刺激する。従って、細胞質カルシウムイオンレベルにおける変化、または第二メッセンジャー（例えばＩＰ３）レベルにおける変化は、Ｇタンパク質共役レセプター機能を評価するために用いられ得る。このようなＧタンパク質共役レセプターを発現する細胞は、細胞内貯蔵物およびイオンチャネルの活性化経由の両方による寄与の結果として、増加した細胞質カルシウムレベルを示し得る。この場合、内部貯蔵物からのカルシウム放出から生じる蛍光応答を識別するために、必要に応じて、キレート剤（例えば、ＥＧＴＡ）を補充した無カルシウム緩衝液においてこのようなアッセイを行うことは、必須ではないが、所望され得る。
【０１７０】
他のアッセイは、活性化された場合に、アデニル酸シクラーゼのような酵素を活性化するかまたは阻害することによって、細胞内環状ヌクレオチド（例えば、ｃＡＭＰ、またはｃＧＭＰ）のレベルの変化を生じるレセプターの活性を決定することに関与し得る。環状ヌクレオチド型イオンチャネル（例えば、杆状体光受容細胞チャネル）およびｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの結合による活性化の際に、カチオンに透過性である嗅覚ニューロンチャネルが存在する（例えば、Ａｌｔｅｎｈｏｆｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：９８６８−９８７２（１９９１）およびＤｈａｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３４７：１８４−１８７（１９９０）を参照のこと）。環状ヌクレオチドレベルの減少を生じるレセプターの活性化の場合、アッセイにおいて細胞にレセプター活性化化合物を加える前に、細胞内環状ヌクレオチドレベルを増加させる薬剤（例えば、フォルスコリン）に、細胞を曝露することが好適であり得る。この型のアッセイのための細胞は、環状ヌクレオチド型イオンチャネルをコードするＤＮＡ、ＧＰＣＲホスファターゼ、およびレセプター（例えば、特定のグルタミン酸レセプター、ムスカリン性アセチルコリンレセプター、ドーパミンレセプター、セロトニンレセプターなど）（これは、活性化された場合に、細胞質中の環状ヌクレオチドのレベルに変化をもたらす）をコードするＤＮＡを用いた、宿主細胞の同時トランスフェクトによって作製され得る。
【０１７１】
好ましい実施態様において、ＧＰＣＲ−Ｂ４活性は、このレセプターをホスホリパーゼＣシグナル伝達経路に結び付ける不規則なＧタンパク質（ＯｆｆｅｒｍａｎｎｓおよびＳｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）を参照のこと；実施例ＩＩもまた参照のこと）を有する異種細胞においてＧＰＣＲ−Ｂ４を発現させることによって測定される。必要に応じて、この細胞株は、ＨＥＫ−２９３（これはＧＰＣＲ−Ｂ４を天然で発現しない）であり、および不規則なＧタンパク質は、Ｇα１５（ＯｆｆｅｒｍａｎｎｓおよびＳｉｍｏｎ、前出）である。味覚伝達の調節は、細胞内Ｃａ²⁺レベルの変化を測定することによってアッセイされる。これはＧＰＣＲ−Ｂ４と会合する分子の投与を介したＧＰＣＲ−Ｂ４シグナル伝達の調節に応じて変化する。Ｃａ²⁺レベルにおける変化は、必要に応じて蛍光Ｃａ²⁺インジケーター色素および蛍光比色画像化を用いて測定される。
【０１７２】
１つの実施態様において、細胞内ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰにおける変化は、イムノアッセイを用いて測定され得る。ＯｆｆｅｒｍａｎｎｓおよびＳｉｍｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５−１５１８０（１９９５）に記載される方法は、ｃＡＭＰのレベルを決定するために用いられ得る。Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１：１５９−１６４（１９９４）に記載される方法もまた、ｃＧＭＰのレベルを決定するために用いられ得る。さらに、ｃＡＭＰおよび／またはｃＧＭＰを測定するためのアッセイキットは、米国特許第４，１１５，５３８号（本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【０１７３】
別の実施態様において、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）加水分解は、米国特許第５，４３６，１２８号（本明細書中で参考として援用される）に従って分析され得る。簡潔には、このアッセイは、４８時間以上の³Ｈ−ミオイノシトールでの細胞の標識に関与する。この標識細胞は、１時間、試験化合物を用いて処理される。処理された細胞は、溶解され、そしてクロロホルム−メタノール−水において抽出され、その後、イノシトールリン酸は、イオン交換クロマトグラフィーによって分離され、そしてシンチレーション計数によって定量された。折りたたみ刺激（ｆｏｌｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）は、緩衝液コントロールの存在下でのｃｐｍに対して、アゴニストの存在下でのｃｐｍの比を計算することによって決定される。同様に、折りたたみ阻害は、緩衝液コントロール（これは、アゴニストを含んでもよいし、含まなくてもよい）の存在下でのｃｐｍに対して、アンタゴニストの存在下でのｃｐｍの比を計算することによって決定される。
【０１７４】
別の実施態様態様において、転写レベルは、シグナル伝達に対する試験化合物の効果を評価するために測定され得る。目的のタンパク質を含む宿主細胞は、任意の相互作用をもたらすのに十分な時間、試験化合物と接触され、次いで遺伝子発現のレベルが測定される。このような相互作用をもたらすための時間は、例えば、時間経過を進むことによって、および時間の関数として転写のレベルを測定することによって、経験的に決定され得る。この転写の量は、当業者に公知の適切である任意の方法を用いることによって、測定され得る。例えば、目的のタンパク質のｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロットを用いて検出され得るか、またはこれらのポリペプチド産物は、免疫アッセイを用いて同定され得る。あるいは、レポーター遺伝子を用いるアッセイに基づく転写は、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，４３６，１２８号に記載されるように用いられ得る。このレポーター遺伝子は、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼであり得る。さらに、目的のタンパク質は、グリーン蛍光タンパク質のような第２のレポーターへの付着を介して間接的レポーターとして用いられ得る（例えば、ＭｉｓｔｉｌｉおよびＳｐｅｃｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：９６１−９６４（１９９７）を参照のこと）。
【０１７５】
次いで、この転写の量は、試験化合物の非存在下で同じ細胞における転写の量か、または目的のタンパク質を欠く実質的に同一の細胞における転写の量のいずれかと比較され得る。実質的に同一の細胞は、組換え細胞が調製されたが、異種ＤＮＡの導入によって改変されていなかった同じ細胞に由来し得る。転写の量におけるいずれの差異も、試験化合物が、目的のタンパク質の活性を変化させる、ある様式を有することを示す。
【０１７６】
（Ｂ．モジュレーター）
ＧＰＣＲ−Ｂ４のモジュレーターとして試験される化合物は、任意の低分子化学物質か、または生物学的実体（例えば、タンパク質、糖、核酸または脂質）であり得る。あるいは、モジュレーターは、ＧＰＣＲ−Ｂ４の遺伝子操作されたバージョンであり得る。代表的には、試験化合物は、低分子化学物質およびペプチドである。本質的に任意の化学物質が、本発明のアッセイにおいて潜在的モジュレーターまたはリガンドとして使用され得るが、最も頻繁には、水溶液または有機（特にＤＭＳＯ−ベース）溶液中に溶解され得る化合物が用いられる。このアッセイは、アッセイ工程を自動化することによって大きな化学ライブラリーをスクリーニングするために設計され、そしてアッセイに対する任意の都合の良い供給源から化合物を提供する。これは、代表的には、並行して（例えば、ロボットアッセイにおいてマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式において）実行される。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などを含む多くの化学物質の供給業者が存在することは明らかである。
【０１７７】
１つの好ましい実施態様において、高処理能スクリーニング法は、多数の潜在的な治療用化合物（潜在的モジュレーターまたはリガンド化合物）を含むコンビナトリアル化学ライブラリーまたはコンビナトリアルペプチドライブラリーを提供することに関する。次いで、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」または「リガンドライブラリー」は、本明細書中に記載されるような、１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングされて、所望の特徴的な活性を提示するこれらのライブラリーのメンバー（特定の化学種またはサブクラス）を同定する。従って、同定された化合物は、従来の「リード化合物」として役割を果たし得るか、またはそれ自身が潜在的もしくは実質的な治療剤として用いられ得る。
【０１７８】
コンビナトリアル化学ライブラリーは、化学合成かまたは生合成のいずれかにより、多数の化学的「ビルディングブロック」（例えば、試薬）を組み合わせることによって生成される多様な化学物質の収集物である。例えば、一次コンビナトリアル化学ライブラリー（例えば、ポリペプチドライブラリー）は、所定の化合物長（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）について可能なあらゆる方法において、一組の化学的ビルディングブロック（アミノ酸）を組み合せることによって形成される。何百万もの化学物質は、化学的ビルディングブロックのこのようなコンビナトリアル混合によって合成され得る。
【０１７９】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｕｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８８（１９９１）を参照のこと）が挙げられるがこれに限定されない。化学的に多様なライブラリーを作製するための他の化学もまた、用いられ得る。このような化学としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ペプトイド（例えば、ＰＣＴ公開公報番号
ＷＯ９１／１９７３５）、コード化ペプチド（例えば、ＰＣＴ公開公報番号 ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、ＰＣＴ公開公報番号 ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グルコース骨格を有する非ペプチド性のペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子化合物ライブラリーのアナログ有機合成（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３（１９９３））、および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ，ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、全て前出、を参照のこと）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照のこと）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照のこと）、糖質ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号を参照のこと）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ Ｃ＆ＥＮ，１月１８日、３３頁（１９９３））；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、米国特許第５，２８８，５１４号などを参照のこと。
【０１８０】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は、市販されている（例えば、３５７ ＭＰＳ、３９０ ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ、４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，９０５０およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡを参照のこと）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーは、それ自身が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ，Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤなどを参照のこと）。
【０１８１】
（Ｃ．固体高処理能アッセイおよび可溶性高処理能アッセイ）
１つの実施態様では、本発明は、分子（例えば、リガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば、あるものは、７つの膜貫通領域およびサイトゾルループを含む）、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、活性部位、サブユニット会合領域などのようなドメイン；キメラ分子を生成するために異種タンパク質に共有結合されるドメイン；あるいはＧＰＣＲ−Ｂ４；天然に存在するかまたは組換えのいずれかのＧＰＣＲ−Ｂ４を発現する細胞もしくは組織）を用いる可溶性アッセイを提供する。別の実施態様では、本発明は、ドメイン、キメラ分子、ＧＰＣＲ−Ｂ４、またはＧＰＣＲ−Ｂ４を発現する細胞もしくは組織が、固相基材に付着される場合、本発明は、固相に基いたインビトロアッセイを高処理能形式で提供する。
【０１８２】
本発明の高処理能アッセイでは、一日で数千までの異なるモジュレーターまたはリガンドをスクリーニングすることが可能である。詳細には、マイクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選択される潜在的モジュレーターに対して別々のアッセイを実行し得るか、または濃度もしくはインキュベーション時間の効果が観察されるべきである場合には、５〜１０ウェルごとに単一モジュレーターを試験し得る。従って、単一の標準的なマイクロタイタープレートは、約１００（例えば、９６）モジュレーターをアッセイし得る。１５３６ウェルプレートが用いられる場合、単一のプレートは、約１００〜約１５００の異なる化合物を容易にアッセイし得る。一日当たり数枚の異なるプレートをアッセイすることが可能であり；約６，０００〜２０，０００までの異なる化合物についてのアッセイスクリーニングは、本発明の統合システムを用いて可能である。最近では、試薬操作に対するマイクロフルイデック（ｍａｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）アプローチが、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって開発されている。
【０１８３】
目的の分子は、固体成分に、直接的にかまたは間接的に、共有結合もしくは非共有結合を介して（例えば、タグを介して）結合され得る。このタグは、種々の成分のいずれかであり得る。一般に、タグを結合する分子（タグバインダー）は、固体支持体に固定され、そして目的のタグ化分子（例えば、目的の味覚伝達分子）は、タグおよびタグバインダーの相互作用によって固体支持体に付着される。
【０１８４】
多数のタグおよびタグバインダーが、文献に十分に記載される公知の分子相互作用に基づいて用いられ得る。例えば、タグが天然のバインダー（例えば、ビオチン、プロテインＡ、またはプロテインＧ）を有する場合、それは、適切なタグバインダー（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、免疫グロブリンのＦｃ領域など）との結合において用いられ得る。ビオチンのような天然のバインダーを有する分子に対する抗体はまた、広く入手可能でかつ適切なタグバインダーである；ＳＩＧＭＡ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９８カタログ（ＳＩＧＭＡ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を参照のこと。
【０１８５】
同様に、任意のハプテン化合物または抗原性化合物は、タグ／タグバインダー対を形成するために適切な抗体と組み合わせて用いられ得る。数千の特異的抗体が市販されており、そして多くのさらなる抗体が文献に記載される。例えば、１つの共通の立体配置では、このタグは、一次抗体であり、そしてタグバインダーは、一次抗体を認識する二次抗体である。抗体−抗原相互作用に加えて、レセプター−リガンド相互作用もまた、タグおよびタグバインダー対として適切である。例えば、細胞膜レセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト（例えば、トランスフェリン、ｃ−ｋｉｔ、ウイルスレセプターリガンド、サイトカインレセプター、ケモカインレセプター、インターロイキンレセプター、免疫グロブリンレセプターおよび抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどのような細胞レセプター−リガンド相互作用；例えば、ＰｉｇｏｔｔおよびＰｏｗｅｒ，Ｔｈｅ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ Ｉ（１９９３）を参照のこと）。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、アヘン剤、ステロイドなど）、細胞内レセプター（例えば、これは、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンＤを含む、種々の小リガンドの効果を媒介する；ペプチド）、薬物、レクチン、糖、核酸（直鎖立体配置および環状ポリマー立体配置の両方）、オリゴサッカリド、タンパク質、リン脂質および抗体は、種々の細胞レセプターと全て相互作用し得る。
【０１８６】
合成ポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、およびポリアセテート）はまた、適切なタグまたはタグバインダーを形成し得る。多くの他のタグ／タグバインダー対はまた、この開示のレビューの際に当業者に明らかであるように、本明細書中に記載されるアッセイシステムにおいて有用である。
【０１８７】
共通のリンカー（例えば、ペプチド、ポリエーテルなど）はまた、タグとしての役割を果たし得、そしてポリペプチド配列（例えば、約５〜２００アミノ酸のポリｇｌｙ配列）を含む。このような可撓性リンカーは、当業者に公知である。例えば、ポリ（エチレン（ｅｔｈｅｌｙｎｅ）グリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可能である。これらのリンカーは、必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能基結合を有する。
【０１８８】
タグバインダーは、現在利用可能な種々の方法のいずれかを用いて固体基材に固定される。固体基材は、タグバインダーの一部と反応性である表面に化学基を固定する化学薬品へ基材の全部または一部を曝露することによって、一般に誘導体化もしくは官能化される。例えば、より長い鎖の部分に付着するのに適している基としては、アミン基、ヒドロキシル基、チオール基、およびカルボキシル基が挙げられる。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、種々の表面（例えば、ガラス表面）を官能化するために用いられ得る。このような固相バイオポリマーアレイの構築は、文献に十分に記載される。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）（例えば、ペプチド、の固相合成を記載する）；（Ｇｅｙｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１０２：２５９−２７４（１９８７）（ピン上での固相成分の合成を記載する）；ＦｒａｎｋおよびＤｏｒｉｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４４：６０３１６０４０（１９８８）（セルロースディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載する）；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６７−７７７（１９９１）；Ｓｈｅｌｄｏｎら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（４）：７１８−７１９（１９９３）；およびＫｏｚａｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（７）：７５３７５９（１９９６）（全てが、固体基材に固定されるバイオポリマーのアレイを記載する）を参照のこと。基材にタグバインダーを固定するための非化学的アプローチとしては、他の一般的方法（例えば、熱、ＵＶ照射による架橋など）が挙げられる。
【０１８９】
（Ｄ．コンピューターに基づくアッセイ）
ＧＰＣＲ−Ｂ４活性を調節する化合物についてのなお別のアッセイは、コンピューターを使った薬物設計に関する。これは、コンピュータシステムを用いて、アミノ酸配列によってコードされる構造情報に基づいてＧＰＣＲ−Ｂ４の三次元構造を作製する。入力アミノ酸配列は、タンパク質の二次、三次、および四次構造のモデルを得るために、コンピュータープログラム中の予め確立されたアルゴリズムを用いて直接かつ能動的に相互作用する。次いで、タンパク質構造のモデルは、例えば、リガンド、に結合する能力を有する構造の領域を同定するために試験される。次いで、これらの領域は、タンパク質に結合するリガンドを同定するために用いられる。
【０１９０】
このタンパク質の三次元構造モデルは、コンピューターシステムへの少なくとも１０アミノ酸残基のタンパク質アミノ酸配列を入力することによってか、またはＧＰＣＲ−Ｂ４ポリペプチドをコードする核酸配列に対応させることによって作製される。ポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１〜２もしくは７、または配列番号３〜４もしくは８およびそれらの保存的改変型からなる群から選択される。このアミノ酸配列は、タンパク質の一次配列または部分配列を表し、これは、タンパク質の構造情報をコードする。少なくとも１０残基のアミノ酸配列（または１０アミノ酸をコードするヌクレオチド配列）が、コンピューターキーボード、コンピューターで読み取り可能な基体（これは、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、磁気テープ、磁気カートリッジ、および磁気チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）、インターネットサイトによって配布される情報、およびＲＡＭによって配布される情報を含むが、これらに限定されない）から、コンピューターシステム中に入力される。次いで、タンパク質の三次元構造モデルは、当業者に公知のソフトウェアを用いて、アミノ酸配列とコンピューターシステムとの相互作用によって作製される。
【０１９１】
アミノ酸配列は、目的のタンパク質の二次、三次、および四次構造を形成するために必要な情報をコードする一次構造を表す。このソフトウェアは、構造モデルを作製するための一次配列によってコードされる特定のパラメーターを調べる。これらのパラメーターは、「エネルギー条件（ｅｎｅｒｇｙ ｔｅｒｍ）」といわれ、そしてこれらとしては、静電的ポテンシャル、疎水的ポテンシャル、溶媒に到達可能な表面、および水素結合が主に挙げられる。第二のエネルギー条件としては、ファンデルワールスポテンシャルが挙げられる。生物学的分子は、累積的な様式においてエネルギー条件を最小にする構造を形成する。従って、このコンピュータープログラムは、二次構造モデルを作製するための一次構造またはアミノ酸配列によってコードされるこれらの条件を用いるものである。
【０１９２】
次いで、二次構造によってコードされるタンパク質の三次構造は、二次構造のエネルギー条件に基づき形成される。この時点で使用者は、さらなる変数（例えば、タンパク質が膜に結合されるかまたは可溶性か否か、体内でのその位置、およびその細胞内配置（例えば、細胞質、表面、もしくは核））を入力し得る。二次構造のエネルギー条件と共にこれらの変数は、三次構造のモデルを形成するために用いられる。三次構造のモデリングにおいて、コンピュータープログラムは、二次構造の疎水性表面と同様のものとを一致させ、そして二次構造の親水性表面と同様のものとを一致させる。
【０１９３】
一旦、この構造が作製されたら、潜在的リガンド結合領域が、コンピューターシステムによって同定される。潜在的リガンドについての三次元構造は、上記のようにアミノ酸またはヌクレオチド配列または化合物の化学組成を入力することによって作製される。次いで、潜在的リガンドの三次元構造は、ＧＰＣＲ−Ｂ４に結合するリガンドを同定するためにＧＰＣＲ−Ｂ４タンパク質の三次元構造と比較される。タンパク質とリガンドとの間の結合親和性は、どのリガンドが、タンパク質に結合する増大された可能性を有するかを決定するためにエネルギー条件を使用して決定される。
【０１９４】
コンピューターシステムはまた、ＧＰＣＲ−Ｂ４遺伝子の変異、多型性改変体、対立遺伝子および種間ホモログをスクリーニングするために用いられる。このような変異は、疾患状態または遺伝形質に関連し得る。上記のように、ＧｅｎｅＣｈｉｐ^TMおよび関連した技術もまた、変異、多型性改変体、対立遺伝子および種間ホモログをスクリーニングするために用いられ得る。一旦改変体が同定されると、診断アッセイは、このような改変型遺伝子を有する患者を同定するために用いられ得る。改変型ＧＰＣＲ−Ｂ４遺伝子の同定は、配列番号１〜２、および７、配列番号３〜４、および８、ならびにそれらの保存的改変型からなる群から選択される、ＧＰＣＲ−Ｂ４をコードする第一の核酸配列またはアミノ酸配列の入力を受けることを伴う。この配列は、上記のようにコンピューターシステムに入力される。次いで、第一の核酸配列またはアミノ酸配列は、第一の配列と実質的な同一性を有する第二の核酸配列またはアミノ酸配列と比較される。この第二の配列は、上記の様式でコンピューターシステムへと入力される。一旦、第一および第二の配列が比較されると、配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸の差異が同定される。このような配列は、ＧＰＣＲ−Ｂ４遺伝子、ならびに疾患状態および遺伝形質に関連する変異における対立遺伝子の差異を表し得る。
【０１９５】
（ＶＩＩＩ．キット）
ＧＰＣＲ−Ｂ４およびそのホモログは、味覚レセプター細胞を同定するための、法医学的判定および父子判定のための、および味覚伝達を試験するための有用なツールである。ＧＰＣＲ−Ｂ４核酸に特異的にハイブリダイズするＧＰＣＲ−Ｂ４に特異的な試薬（例えば、ＧＰＣＲ−Ｂ４プローブおよびプライマー）、ならびにＧＰＣＲ−Ｂ４タンパク質に特異的に結合するＧＰＣＲ−Ｂ４に特異的な試薬（例えば、ＧＰＣＲ−Ｂ４抗体）は、味覚細胞発現および味覚伝達調節を試験するために用いられる。
【０１９６】
サンプル中のＧＰＣＲ−Ｂ４ ＤＮＡおよびＲＮＡの存在についての核酸アッセイとしては、当業者に公知である多くの技術（例えば、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット、ＲＮａｓｅ 保護、Ｓ１分析、ＰＣＲおよびＬＣＲのような増幅技術、およびインサイチュハイブリダイゼーション）が挙げられる。インサイチュハイブリダイゼーションでは、例えば、標的核酸は、引き続く解釈および分析のために細胞形態を保存する間に、細胞内でのハイブリダーゼーションに利用可能であるようにその細胞周囲から遊離される（実施例１を参照のこと）。以下の論文は、インサイチュハイブリダイゼーションの分野の概要を提供する：Ｓｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２３０−２５０（１９８６）；Ｈａａｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第ＶＩＩ巻、１８９−２２６（１９８４）；およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｈａｍｅｓら、編、１９８７）。さらにＧＰＣＲ−Ｂ４タンパク質は、上記の種々の免疫アッセイ技術を用いて検出され得る。この試験サンプルは、代表的には陽性コントロール（例えば、組換えＧＰＣＲ−Ｂ４を発現するサンプル）および陰性コントロールの両方と比較される。
【０１９７】
本発明はまた、ＧＰＣＲ−Ｂ４のモジュレーターをスクリーニングするためのキットを提供する。このようなキットは、容易に入手可能な材料および試薬から調製され得る。例えば、このようなキットは、１つ以上の以下の材料のいずれかを含み得る：ＧＰＣＲ−Ｂ４、反応チューブ、およびＧＰＣＲ−Ｂ４活性を試験するための取り扱い説明書。必要に応じて、このキットは、生物学的に活性なＧＰＣＲ−Ｂ４を含む。広範な種々のキットおよび成分が、本発明に従って調製され得、これらはキットの対象とする使用者および使用者の特定の必要性に依存する。
【０１９８】
（ＩＸ．投与および薬学的組成物）
味覚モジュレーターは、インビボでの味覚の調節（詳細には、苦味の調節）のために哺乳動物非験体に直接投与され得る。投与は、処置されるべき組織（必要に応じて舌または口）との最終的な接触へとモジュレーター化合物を導入するために通常用いられる任意の経路による。味覚モジュレーターは、必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアと共に、任意の適切な様式で投与される。このようなモジュレーターを投与する適切な方法は、利用可能かつ当業者に周知であり、そして１を超える経路が特定の組成物を投与するために用いられ得るが、特定の経路は、別の経路よりも迅速かつ効果的な反応をしばしば提供し得る。
【０１９９】
薬学的に受容可能なキャリアは、投与される特定の組成物によって、およびこの組成物を投与するために用いられる特定の方法によって一部決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な処方が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版、１９８５を参照のこと）。
【０２００】
味覚モジュレーター（単独または適切な他の成分との組み合わせ）は、吸入を介して投与されるエーロゾル処方物（すなわち、これらは「霧状」にされ得る）にされ得る。エーロゾル処方物は、加圧された受容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に配置され得る。
【０２０１】
投与に適切な処方物としては、水溶液および非水溶液、滅菌等張液が挙げられる。これらは、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および処方物に等張性を与える溶質、ならびに滅菌水性懸濁液および滅菌非水性懸濁液（懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る）を含み得る。本発明の実施において、組成物は、例えば、経口的、局所的、静脈内、腹腔内、膀胱内または髄腔内に投与され得る。必要に応じて、この組成物は、経口投与または鼻腔内投与される。化合物の処方は、単位投与または複数投与密閉容器（例えば、アンプルおよびバイアル）中で提示され得る。溶液および懸濁液は、以前に記載の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。モジュレーターはまた、調製される食物または薬物の一部として投与され得る。
【０２０２】
本発明の状況において、患者に投与される用量は、経時的に、被検体において有利な応答をもたらすのに十分であるべきである。この用量は、用いられる特定の味覚モジュレーターの効果および被験体の条件、ならびに体重または処置されるべき領域の表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の被験体における特定の化合物またはベクターの投与に伴ういずれかの有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。
【０２０３】
医師によって投与されるべきモジュレーターの有効量を決定することにおいて、モジュレーターの循環血漿レベル、モジュレーター毒性、および抗モジュレーター抗体の産性を評価し得る。一般に、モジュレーターの用量等価物は、代表的な被験体について約１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【０２０４】
投与について、本発明の味覚モジュレーターは、被験体の質量および全体的な健康に適用されるように、モジュレーターのＬＤ−５０、および種々の濃度でのインヒビターの副作用によって決定される割合で投与され得る。投与は、単回用量または分割用量によって達成され得る。
【０２０５】
本明細書中で引用される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願がそれぞれ参考として援用されるべきであると具体的にかつ個々に指示されるかのように、本明細書中で参考として援用される。
【０２０６】
前述の発明は、明確な理解を目的として、説明および実施例によって、いくぶん詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、特定の変更および改変がそれらに対してなされ得ることは、本発明の教示を考慮して当業者に容易に理解される。
【実施例】
【０２０７】
（実施例）
以下の実施態様例は、制限を目的としてではなく、例示のみを目的として提供される。当業者は、本質的に類似する結果を得るために変更または改変され得る種々の重大でないパラメーターを容易に認識する。
【０２０８】
（実施例Ｉ：ＧＰＣＲ−Ｂ４のクローニングおよび発現）
ラットの有郭および茸状の単一細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーを、用いて、本発明のＧＰＣＲ核酸を単離した。
【０２０９】
単一の葉状乳頭および茸状乳頭をラットの舌から単離（それぞれ１０乳頭）し、そして単一細胞ライブラリー構築方法を用いてそれぞれの乳頭から、第１鎖ｃＤＮＡを調製した（例えば、Ｂｅｒｎｈａｒｄｔら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４９０：３２５〜３３６（１９９６）；Ｄｕｌａｃ＆Ａｘｅｌ，Ｃｅｌｌ ８３：１９５〜２０６（１９９５）を参照のこと）。２０の異なるｃＤＮＡ集団を、味覚レセプターマーカーについて陽性なものについてアッセイし（ＴＣＰ＃１、クローン２７〜５９としても既知；１９９８年７月２８日出願、特許出願代理人登録番号０２３０７Ｅ−０８４２００を参照のこと）、味覚レセプター細胞由来のｃＤＮＡを確認した。このｃＤＮＡをまた、Ｇタンパク質共役レセプタークローンであるＧＰＣＲ−Ｂ３（１９９８年７月２８日出願、ＵＳＳＮ６０／０９４，４６５）を用いてスクリーニングした。ＶＲ／ｍＧｌｕＲ／ＣａＳＴ／ＧＰＣＲ−Ｂ３レセプターの間で高度に保存されたモチーフをコードするように設計された縮重プライマーを用いて、３つの陽性の乳頭を同定し、そしてＰＣＲ増幅のためのｃＤＮＡの供給源として用いた。膜貫通ドメイン６と７との間の領域から好ましいプライマーを得た：［Ｙ／Ｎ］ＦＮＥＡＫ（配列番号９）およびＰＫＣＹ［Ｉ／Ｖ］Ｉ（配列番号１０）。縮重ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにサブクローニングし、そして５２のＰＣＲ産物を配列決定した。これらの産物のうち２０がＧＰＣＲ−Ｂ３に対応した。産物のうち８つが新規なＧＰＣＲ−Ｂ４配列をコードした。
【０２１０】
ゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡらについてプローブとしてラットＧＰＣＲ−Ｂ４クローンを用い、ＧＰＣＲ−Ｂ４のマウス種間相同体を、単離した。ＧＰＣＲ−Ｂ４のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１〜２および７、ならびに配列番号３〜４および８に提供する。
【０２１１】
舌の組織切片へのインサイチュハイブリダイゼーションのためのプローブとしてクローンを用いて、ＧＰＣＲ−Ｂ４の味覚細胞特異的発現を確認する。全てのクローンは、味蕾において特異的発現かまたは優先的発現を示す。
【０２１２】
（実施例ＩＩ：ＧＰＣＲは、味覚伝達レセプターである）
ＧＰＣＲ−Ｂ４の特有の組織分布および苦味伝達の行動的表現は、Ｂ４の発現の部位（有郭乳頭だが、茸状乳頭または味線条（ｇｅｓｃｈｍａｃｋｓｔｒｅｉｆｅｎ）ではない）と苦味感受性との間の相関を示唆する。ＧＰＣＲ−Ｂ４のリガンド選択性を決定するために、異種の細胞における発現を用いた。異種細胞におけるＧＰＣＲ発現のための１つの問題は、ＧＰＣＲがＧタンパク質および適切なシグナル伝達経路に結合する方法を決定することである。この例では、Ｇタンパク質サブユニットであるＧα１５を用いた。これは、ホスホリパーゼＣ媒介シグナル伝達経路へ広範なＧＰＣＲを無差別に結合させる（ＯｆｆｅｒｍａｎｓおよびＳｉｍｏｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５１７５〜１５１８０（１９９５））。結果として、蛍光Ｃａ²⁺指示色素および蛍光画像化を用いて、［Ｃａ²⁺］_iのリガンド誘導性変化を記録することによりレポーター活性を効果的に測定し得る。
【０２１３】
原形質膜におけるＧＰＣＲ−Ｂ４の発現を保証するため、種々の細胞株および発現ベクターを試験した。これらの研究のためのコントロールとして、細胞を哺乳動物のγオピオイドレセプターでトランスフェクトした；このレセプターは通常はＰＬＣに結合しない。そのため［Ｃａ²⁺］_iの全てのアゴニスト誘導性変化は、Ｇα１５を通じた結合を反映する。ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現するＨＥＫ２９３株を、ＴＫ−Ｇα１５、ＣＭＶ−γ−オピオイドおよびｐＥＡＫ−１０エピソームベクター（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（ＥＦ１ａ−［Ｂ４−ＧＰＣＲ］構築物を含む）で同時トランスフェクトした。ＣＭＶ−ＧＦＰ構築物を用いてトランスフェクション効率を決定した。γ−オピオイド／Ｇα１５を発現するコントロール細胞は、ＤＡＭＧＯ（γオピオイドのアンタゴニスト）に強く反応するが、甘味または苦味の味覚物質、あるいは無関係なアゴニストには反応しない（データ示さず）。これらの反応は、Ｇα１５に依存し、そして、刺激の適用後迅速な発現時間である、適切な経時的分解を有する。とりわけ、Ｂ４／Ｇα１５またはＢ４／Ｇα１５／γ−オピオイドを発現する細胞は、十分に特徴付けられた苦味味覚物質フェニルチオカルバミド（ＰＴＣ）に反応したが、多数の天然の甘味料または人工の甘味料にはいずれも反応しなかった。この活性は、全くＢ４レセプター依存性であり、そして、ＰＴＣの生理学的な濃度（３００μＭ〜５ｍＭ）で生じる。
【０２１４】
これらの結果は、ＧＰＣＲ−Ｂ４が、苦味の味覚物質変換に関与することを示唆し、そして将来の実験のための実験的に扱いやすい系を提供する。これには、味覚物質の特異性および選択性の研究、天然の苦味シグナル伝達経路の定義、およびおそらく「味のわかる人（ｔａｓｔｅｒ）」と「味のわからない人（ｎｏｎ−ｔａｓｔｅｒ）」との間のＰＴＣの味覚の劇的な差異を実証するヒトの精神物理的研究の分子的基礎を理解することが挙げられる。

（配列表）

【特許請求の範囲】
【請求項１】
感覚伝達Ｇタンパク質共役型レセプターをコードする単離された核酸。

【公開番号】特開２００９−２０１５２５（Ｐ２００９−２０１５２５Ａ）
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４４７７２（Ｐ２００９−１４４７７２）
【出願日】平成２１年６月１７日（２００９．６．１７）
【分割の表示】特願２０００−５６２３９０（Ｐ２０００−５６２３９０）の分割
【原出願日】平成１１年７月２７日（１９９９．７．２７）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ　リージェンツ　オブ　ザ　ユニバーシティ　オブ　カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ　Ｒｅｇｅｎｔｓ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】