成人Ｔ細胞白血病診断器具
【課題】 ＨＴＬＶ−１感染者のＡＴＬ早期診断又はＡＴＬ患者の診断に好適な安定した高精度のＴＳＬＣ１検出キットを提供する。
【解決手段】
イムノクロマト診断キットの構造において、標識抗体パッドの標識抗体と判定ラインの検出抗体に、抗原たんぱく質の異なる部位を認識する抗ＴＳＬＣ１抗体を用いる。すなわち、標識抗体には、ニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１ Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１）を用い、検出抗体には、この標識抗体との組み合わせで高精度に検出可能なファージディスプレイヒト抗ＴＳＬＣ１抗体を使用する。この組み合わせにより、本発明では、検液中の抗原ＴＳＬＣ１タンパク質が微量でも、高精度で安定してＡＴＬの診断ができる。このことは、ＡＴＬ患者の診断はもとより、ＴＳＬＣ１タンパク質量が少ないＨＴＬＶ−１母子感染者中のＡＴＬ発症リスク群におけるＡＴＬの早期診断に効果的である。
【解決手段】
イムノクロマト診断キットの構造において、標識抗体パッドの標識抗体と判定ラインの検出抗体に、抗原たんぱく質の異なる部位を認識する抗ＴＳＬＣ１抗体を用いる。すなわち、標識抗体には、ニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１ Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１）を用い、検出抗体には、この標識抗体との組み合わせで高精度に検出可能なファージディスプレイヒト抗ＴＳＬＣ１抗体を使用する。この組み合わせにより、本発明では、検液中の抗原ＴＳＬＣ１タンパク質が微量でも、高精度で安定してＡＴＬの診断ができる。このことは、ＡＴＬ患者の診断はもとより、ＴＳＬＣ１タンパク質量が少ないＨＴＬＶ−１母子感染者中のＡＴＬ発症リスク群におけるＡＴＬの早期診断に効果的である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマトグラフィー法（以下「イムノクロマト」という）又はエライザ法によるＴＳＬＣ１（Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ１；以下「ＴＳＬＣ１」という）の検出キット、特に成人Ｔ細胞白血病（Ａｄｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ；以下「ＡＴＬ」という）とその病因となるヒトＴ細胞白血病ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ１；以下「ＨＴＬＶ−１」という）の診断に使用するＴＳＬＣ１検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＬは、主に母乳によるＨＴＬＶ−１感染により発症する腫瘍性疾患である。これまでは、南九州を中心とする地域に特異的にみられる疾患として知られていたが、最近は全国的に広く分布してきている。
厚生労働省による全国調査によれば、ＨＴＬＶ−１感染者数は約１０８万人（２００９年）、ＡＴＬ患者数は増加傾向（年間１０００人超）にある。乳幼時に感染すると、４０〜６０年の感染期間を経て４〜６％の感染者が発症する。ＨＴＬＶ−１感染者中の発症危険率は低いが、臓器浸潤をともなう予後不良の疾患である。一旦急性化すると、今のところ適正な治療法はなく、予後生存率の中央値は１年未満である。
【０００３】
一方、ＴＳＬＣ１は、細胞間接着分子ＩｇＳＦ４（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｕｐｅｒ Ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｎｂｅｒ４；以下「ＩｇＳＦ４」という）とも言われるが、ＴＳＬＣ１という名前からも明らかなように肺癌の抑制遺伝子として見出されたものである。
【０００４】
特許文献１は、この肺癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１のｍＲＮＡとその蛋白質がＡＴＬ患者の白血病細胞において約３０倍以上高発現していることを開示している（表１参照）。同様にＨＴＬＶ−１感染細胞株においても、一部ＴＳＬＣ１の高発現が認められている。正常血液細胞またはその他の白血病細胞においては発現していない（図３参照）。このことから、ＴＳＬＣ１の高発現はＡＴＬ特異的であるとともに、ＨＴＬＶ−１感染者の動態診断においても有用であることを示唆している。
【０００５】
特許文献２は、このＴＳＬＣ１を抗原とする抗体を用いたＡＴＬのイムノクロマト診断器具を開示している。この診断器具は、構造的には典型的なイムノクロマトキットである。例えば、図１に示すように、毛細管現象を利用して検液が流れるように配置された検液滴下パッド、標識パッド、反応膜、検液吸引パッドで構成されている。標識パッドには、金コロイドとＴＳＬＣ１のマウス抗体からなるコンジュゲートパッドを用いている。ニトロセルロースからなる反応膜上には、標識抗体と同一又は異なるハイブリドーマから産生されたＴＳＬＣ１のマウス抗体を線状に固相化した判定ラインを設けてある。検体中にＴＳＬＣ１が含まれていれば、ＴＳＬＣ１は標識抗体との複合体を形成して判定ラインの検出抗体に捕捉され、検出抗体が標識物質の色を呈する。特許文献２では、標識抗体と検出抗体に同一又は異なるハイブリドーマから産生されたマウス抗体の使用例が開示されている。
【０００６】
特許文献３は、肝癌細胞に特異的に発現する分子としてＩｇＳＦ４を同定、これに抗体を作用させることで、抗体依存性細胞障害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；以下「ＡＤＣＣ活性」という）が発揮されるとの知見を得て、癌治療等に有効な抗ＩｇＳＦ４抗体を提供している。またＩｇＳＦ４抗体のひとつの用途として、ＡＴＬ検査用試薬（請求項１４）、被検査細胞を対象としてＩｇＳＦ４を検出するステップを含むＡＴＬ診断用情報を取得する方法（請求項１５）、ＡＴＬ治療に有効なＩｇＳＦ４結合化合物のスクリーニング方法（請求項１９）及びＡＴＬ治療法（請求項２４）も示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−１４７７９８号
【特許文献２】特開２００６−３１７２２０号
【特許文献３】ＷＯ２００６／０９０７５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１はＴＳＬＣ１とＡＴＬの関係を開示しているが、イムノクロマトキットに適性のあるＴＳＬＣ１の抗体に関する言及はない。特許文献２は、前述のように抗ＴＳＬＣ１抗体を用いたＡＴＬのイムノクロマト診断器具を開示している。しかし、この診断器具では、標識抗体と同一または異なるハイブリドーマからなるマウス抗体を判定ラインに固相化している。この例によれば、判定ラインのマウス検出抗体が標識抗体のマウス抗体と同一又は異なっていても、ＴＳＬＣ１の認識に定性な差異はないとされている（表１参照）が、標識抗体と検出抗体とが同一のハイブリドーマからなる抗ＴＳＬＣ１抗体の場合には、検液中の抗原ＴＳＬＣ１タンパク質の同一部位を認識する恐れがあり、検液中のＴＳＬＣ１濃度が低いと検出され難い。かかる観点から、異なる部位を高精度で認識する安定した抗体の組み合わせが望ましい。また特許文献３には、ＩｇＳＦ４（ＴＳＬＣ１）に特異的な抗体が開示されており、その抗体アミノ酸の抗原相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」という）を特定しているが、大部分はＡＤＣＣ活性を利用した肝臓癌の治療に関するものである。ＡＴＬの診断（請求項１４）あるいは汎用キット［００９６］［００９７］に関しては、ＡＴＬ細胞表面マーカーのひとつとして、ＩｇＳＦ４抗体の利用可能性を示唆するにとどまっており［０１７７］。ＴＳＬＣ１検出用のイムノクロマトキット抗体としての好適なＩｇＳＦ４抗体あるいはその組み合わせへの言及はない。
【０００９】
本発明の目的は、前記のごとき状況にかんがみ、ＡＴＬの診断に好適で、安定した高精度の検出能を有するＴＳＬＣ１検出キットを提供するにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、ＨＴＬＶ−１感染者におけるＡＴＬの早期診断に好適で、安定した高精度の検出能を有するＴＳＬＣ１検出キットを提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、鋭意検討した結果、標識抗体と検出抗体にＴＳＬＣ１タンパク質の認識部位が明らかに異なる二種の抗ＴＳＬＣ１抗体を組み合わせて使用することにより、ＡＴＬの診断に好適で、安定した高精度の検出能を得ることができることを見出し、本発明に到った。
【００１２】
すなわち、前記知見に基づく本発明のＴＳＬＣ１検出キットは、下記の特徴及び態様を有する。
項１：固相化されたファージディスプレイヒト抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体と、標識されたニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１ Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１）との組み合わせからなるＴＳＬＣ１検出キット。
項２：ニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体が着色粒子又は酵素で標識されている請求項１記載のＴＳＬＣ１検出キット。
項３：着色粒子標識が、金コロイド、有色ラテックス粒子、及び着色セルロース粒子からなる群から選ばれたひとつである請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
項４：酵素標識が、アルカリホスファターゼと発色基質ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸）との組み合わせからなる請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
項５：酵素標識が、パーオキシダーゼと発色基質ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）との組み合わせからなる請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
項６：請求項１〜５記載のＴＳＬＣ１検出キットを用いたエライザーキット。
項７：請求項１〜５記載のＴＳＬＣ１検出キットを用いたイムノクロマトキット。
項８：検液滴下パッド、標識パッド、反応膜、及び検疫吸引部位をこの順序で上流から下流へと連通するように配置した検査スティックを有し、該標識パッド抗体がニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体であり、反応膜上の検出ラインが個相化されたファージディスプレイヒト抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体であるイムノクロマトキット。
項９：反応膜上の検出ラインの下流に、さらに抗マウスＩｇＧヒツジモノクローナル抗体からなる参照ラインを備えている請求項８のＴＳＬＣ１検出キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、標識抗体にトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体、判定ラインの検出抗体にファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体と、明らかにＴＳＬＣ１タンパク質の異なった部位を認識する抗体を組み合わせることにより、検液中のＴＳＬＣ１タンパク質を安定して検出、その有無を判定できる。また、検出抗体にファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体という、ファージディスプレイ法により得られたヒトモノクローナル抗体を使用することにより、抗原接種動物の免疫系の制約を受ける動物免疫抗体とは異なり、安定した高精度の検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図面に従って本発明を詳述する。図１において検出スティックは、バックシート１、反応膜２、標識抗体パッド３、検液滴下パッド４、検液吸引パッド５を備えている。バックシート１上には、反応膜２を貼り付けてある。反応膜２の一端には標識抗体パッド３を介して検液滴下パッド４を、他端には検液吸引パッド５を設ける。４ａは検液滴下部である。反応膜２上には、抗ＴＳＬＣ１抗体を固相化した判定ライン６と、必要に応じて参照ライン７を塗布する。この検出スティックでは、上流側の検液滴下パッド４の検出滴下部４ａに滴下された検液が、下流側の検液吸引パッド５の吸引により、反応膜２上を流れるように、検液滴下パッド４、標識抗体パッド３、反応膜２、検液吸引パッド５の順序で、少なくともその一部が接触するように配置されている。一方、図２の検出キットは、図１の検出スティックにカバー８を付したものである。カバー８には、検出スティック１の検液滴下部４ａに対応する部分に、開口した検液滴下口８ａを設け、検液吸引パッド５に対応する部分には、吸引した血液が滞留して逆流しないように、開放口９を設けてある。
【００１５】
検出スティックのバックシート１の材質には、特に制限はないが例えば紙を用い、そのサイズは幅６９ｍｍ×長さ３５０ｍｍ×厚さ０．１ｍｍ程度である。
【００１６】
本発明の反応膜２には、ニトロセルロース膜を好適に用いることができるが、タンパク質を吸着する能力を有する担体であれば、膜の種類や材質は問わない。そのままでは吸着能を有さない反応膜については、アミノ基やカルボキシル基を導入して化学的に修飾した抗ＴＳＬＣ１抗体結合能を有する膜も使用できる。
【００１７】
反応膜２の上流側には標識抗体パッド３を設ける。標識抗体パッド３には濾紙を用いる。本発明で使用する標識抗体には、例えば市販のリコンビナントＦｃ−ＳｙｎＣＡＭ由来のニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＳＹＮＣＡＭ／ＴＳＬＣ１ＣＡＤＭ１；Ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１，Ｓｕｂｃｌａｓｓ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ（株式会社医学生物学研究所社製）を好適に用いる。標識物質としては、一般的に金コロイド粒子を用いるが、有色のラテックス粒子でも良い。金コロイド粒子のサイズは、粒子径２０−１００ｎｍ程度が好適である。有色のラテックス粒子径は、０．０５−０．５μｍの範囲が望ましい。これらの粒子は、例えば濃度１０−１０００μｇ／ｍＬの炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で、トリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体を吸着する。また、ラテックス等の微粒子に吸着又は反応せしめた抗体結合粒子を反応膜に封入することも可能である。有色粒子の代わりには、アルカリフォスターゼなどの酵素標識抗体を用いることもできる。
【００１８】
ニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体の一般的作成方法としては、抗原を免疫する動物はニワトリである。免疫用抗原としては、天然のＴＳＬＣ１タンパク質又は組換えＤＮＡ法もしくは化学合成により調製したＴＳＬＣ１タンパク質を用いる。タンパク質としては、アミノ酸配列の全長又は１−３７３の部分ペプチドを用いる。ＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列表に示す。
【００１９】
免疫法には特に制限されないが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などを用いる。免疫の間隔は、数日から数週間、好ましくは４−２１日とする。免疫したニワトリの免疫応答レベルを確認、又は細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択するためには、免疫したニワトリの血中抗体価もしくは抗体産生細胞の培養上清中における抗体価を測定する。抗体価の測定方法としては、例えばＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）などを挙げることができる。
【００２０】
トリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体の作成にあたっては、例えばＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列１−３７３のペプチドをコードする遺伝子をプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ／ＴＳＬＣ１）に組み込むことにより形質転換した大腸菌ＢＬ２１をＬＢ培地に接種して、略３７℃で培養する。培養液はイソプロピル−β−Ｄ−チオガトピラノシド処理して、ＴＳＬＣ１の産生を誘導し、回収する。回収した菌体は、界面活性剤や超音波で破砕処理した後に、沈渣を回収し、Ｎｉ−セファロースカラム等により組み換えＴＳＬＣ１タンパク質として分離、精製する。
【００２１】
アミノ酸配列１−３７３のペプチドは、ＴＳＬＣ１タンパク質の細胞外ドメインに相当するので、これを抗原とする抗体は、蛍光ラベル等により細胞を染色することがきる。またリガンドとの結合を中和する中和抗体としても使える可能性がある。
【００２２】
検液滴下パッド４と検液吸引パッド５には、毛細管現象により検液を吸収又は吸引し易い濾紙を用いる。
【００２３】
また本発明では、反応膜２の中央部近傍表面に、検液の流れに直交するようにファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体からなる判定ライン６を塗布する。ファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体は、ファージディスプレイ法により作成する。ファージディスプレイ法では、機能を負うペプチドやタンパク質（表現型）と、それをコードするＤＮＡ（遺伝子型）がファージ粒子上で対応しており、ディスプレイされたタンパク質とその標的物質との相互作用を検出することができる。このファージディスプレイヒト抗体ライブラリは広く公開されている。ファージディスプレイ法では、抗原に対する動物への免疫やハイブリドーマの作成を要しないため、それらの影響を受けずに、抗体遺伝子から直接モノクローナル抗体を得ることができる。
【００２４】
判定ライン６の塗布、固相化にあたっては、まずファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体を５０μＭ／Ｌ、ｐＨ７．８程度の炭酸緩衝液で透析し、蛋白質量として１ｍｇ／ｍＬの抗体液を得る。次いで、この抗体液を反応膜２上に塗布し、乾燥する。最後に、副反応を抑えるため、反応膜２を１％程度のアルブミンやスキムミルク等の溶液に浸漬、ブロッキングする。水洗、乾燥後、反応膜２は、塗布された判定ライン６が上になるようにバックシート１上に貼着する。
【００２５】
反応膜２の検液下流側には、必要に応じて参照ライン７を設けることもできる。参照ライン７は、検液が検液吸引パッド５の吸引により、参照ライン７まで正常に届いているか否かを検出するもので、例えば抗マウスＩｇＧヒツジモノクローナル抗体を好適に用いることができる。
【００２６】
図２のＴＳＬＣ１検出キットは、図１に示す検出スティックにカバー８を取り付けたものである。検出スティックの検液滴下部４ａに対応するカバー８の部分には、検液滴下口８ａを開口するが、それ以外はすべて閉じて検出スティックを保護している。
【００２７】
本発明では、既述のように、検出抗体として免疫動物によるノイズを回避するため、ファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体を用いることがひとつの特徴である。このファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体との組み合わせで有効な標識抗体として、ファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体とは異なる抗原ＴＳＬＣ１タンパク質の部位を認識するトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体が有効であると考えられる。しかし、実際には、同じ標識トリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体でも、Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１；Ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１；ＩｇＹ１は、表１に示すように、すべてのファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体試料において、抗原濃度０．０３ｎｇ／ｍＬまで有効に検出できるが、表２に示すように、Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１；Ｃｌｏｎｅ ９Ｄ２；ＩｇＹ２は、いずれのファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体試料に対しても、十分な検出能を持たない。このことから、本発明のファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体との組み合わせで有効な標識抗ＴＳＬＣ１体は、Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１；Ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１；ＩｇＹ１である。
【表１】
【表２】
【００２８】
本発明のＴＳＬＣ１検出キットを用いて検液中のＴＳＬＣ１タンパク質を検出するには、抗凝固剤を添加する。検液原としては、血清又は血漿のいずれでも使用できる。抗凝固剤としては、ヘパリンやＥＤＴＡ等を挙げることができる。次に検液を検液滴下用口８ａから、検液滴下パッド４の検液滴下部４ａに滴下する。検液は標識抗体パッド３を介して、反応膜２上に展開される。滴下された検液は、まずこの標識パッド３で標識されたトリ抗ＴＳＬＣ１抗体と反応する。次いで、標識された検液は反応膜２の判定ラインに６に塗布されたファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体と反応し、検液吸引パッド５に吸収される。
この反応は、約５−３０分で終了する。
【００２９】
検液中にＴＳＬＣ１タンパク質が存在すれば、標識抗体と複合体を形成し、判定ラインで捕捉、蓄積されて、標識物質の色を呈し、目視で確認できる。例えば、標識物質が金コロイドの場合には、判定ライン６のラインは赤紫色を呈する。検体中にＴＳＬＣ１タンパク質が存在しなければ、標識抗体と複合体を形成することはないので、判定ライン６に変化はない。判定ライン６が変化しない場合、検液の流れの中断による否かを判定するため、参照ライン７を設けることもできる。参照ライン７は、検液中のＴＳＬＣ１の有無にかかわらす標識物質の色を呈するので、検液が参照ラインまで正常に届いているかを確認できる。参照ライン７が呈色しない場合、判定ライン６の無変化は検液中のＴＳＬＣ１タンパク質の不在ではなく、検液の流れの停滞によると推定できる。
【実施例１】
【００３０】
抗原用ＴＳＬＣ１タンパク質溶液の調整
ＴＳＬＣ１の調製は、ＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列の１番目から３７３番目までのアミノ酸をコードする遺伝子をプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ／ＴＳＬＣ１）に、組み換えＤＮＡ法により、以下のように組み込み調製した。
【００３１】
まず、ｐＥＴＮｄｅＩＴＳＬＣ１プライマー（ｇｃｃａｔａｔｇｃａｇａａｔｃｔｇｔｔｔａｃｇａａａｃａｃ： 配列番号２）及びｐＥＴＴＳＬＣ１ＸｈｏＩプライマー（ｇｃｃｔｃｇａｇａｔｃｃａｃｔｇｃｃｃｔｇａｔｃｇａｇｃｃｃ： 配列番号３）によりＴＳＬＣ１のｃＤＮＡを増幅し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素処理後、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素サイトに挿入した。
【００３２】
次に、プラスミド（ｐＥＴ２８ｂ／ＴＳＬＣ１）で大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、ＬＢ培地１０ｍＬに接種して３７℃で一夜培養した。培養液をＬＢ培地５００ｍＬに接種し、２５℃で培養し、６００ｎｍの吸光度０．５近傍で、βイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド処理し、ＴＳＬＣ１部分のタンパク質の産生を誘導した。さらに一夜培養後、菌体を遠心分離して回収した。回収菌体は超音波破砕処理し、８Ｍ尿素に懸濁、４℃、７時間、おだやかに撹拌した。撹拌後、遠心分離して上清を回収した。回収上清は、キレーティングセファローズＮｉカラム（ファルマシア）にかけた。カラムは、５ｍＭイミダゾールと８Ｍ尿素を含むリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７）と、１００ｍＭイミダゾールを含むリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．５）で洗浄し、７００ｍＭイミダゾールを含むリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．５）で溶離した。溶離ＴＳＬＣ１タンパク質画分は、４Ｍ尿素を含むリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７）中に透析した。透析液中の尿素濃度を徐々に下げ、最終的に０にしてＴＳＬＣ１タンパク質溶液とした。
【００３３】
使用抗体
・判定ライン用のファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体には、株式会社医学生物学研究所社製；ｐｈａｇｅ０３５−１８１、ｐｈａｇｅ０３５−２１２、ｐｈａｇｅ０３５−２７３、ｐｈａｇｅ０３５−２８３を使用した。
・ 標識用のトリ抗ＴＳＬＣ１抗体には、株式会社医学生物学研究所社製；
商品名ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１／ＣＡＤＭ１；Ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１；ＩｇＹ１を使用した。
・参照ライン用の抗マウスＩｇＧヒツジ抗体には、Ａｎｔｉ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を使用した。
【００３４】
反応膜の作製
反応膜２は、幅３０ｍｍ×横３００ｍｍのニトロセルロース膜を用いた。反応膜２上の判定ライン６は、アドテック社製塗布機を用いて、反応膜２の下流端から１３ｍｍの位置に、前記ファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体（Ｎｏ．０３５−２１２）の１ｍｇ／ｍＬを０．０２５ｍＬ／３０ｍｍとなるように線状に塗布した。参照ライン７は、同反応膜２の同端から２２ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬに調製した抗マウスＩｇＧヒツジ抗体を０．０２５ｍＬ／３０ｍｍとなるように線状に塗布した。判定ライン６と参照ライン７を塗布後の反応膜２は、室温で１時間放置し、ブロッキング液に室温で３０分間浸漬し、脱イオン水で５分間の洗浄を３回繰り返した後、再び室温に放置し、乾燥した。
【００３５】
標識抗体パッドの作製
金コロイド液（付記３）５００ｍＬ中に、炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した前記抗ＴＳＬＣ１トリモノクローナル抗体（３Ｅ１）２５．０ｍＬを加え、室温で３０分間反応させた。次いで、０．１ｇ／ｍＬ牛血清アルブミン水溶液５ｍＬを更に加えて、２０分間反応させた。８，０００×Ｇで４℃、３０分間遠心後、沈渣を回収した。５％グルコース及び２．５％ＢＳＡを含む水溶液を全量で１００ｍＬとし金コロイド標識抗体液とした。調製した金コロイド標識抗体液をガラスパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製；商品名 ＮＥＷ ＳＵＲＥＷＩＣＫ ＧＦＣＰ Ｇ０４１）に５ｍＬ／ｍｍ２になるように吸収させ、常温で風乾した。乾燥後、縦１０±１ｍｍ×横３００±５ｍｍに裁断した。裁断した本ガラスパッドを金コロイド標識トリ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体パッド３として用いた。
【００３６】
検査キットの組立
本スティック（図１参照）は、次のように組み立てた。すなわち、バックシート１（幅６ｍｍ×長さ６９ｍｍ×厚さ０．１ｍｍ）の下流端から２１ｍｍの位置に、反応膜２（幅６ｍｍ×長さ３０ｍｍ）下流端が位置するように、判定ライン６及び参照ライン７を上にして貼り付けた。次にこの反応膜２の上流端側に、標識抗体パッド３（幅６ｍｍ×長さ１０ｍｍ）を両接触端が２ｍｍ重なるように貼り付けた。さらに検液滴下パッド４（幅６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）を標識抗体パッド３上に、互いの下流端が一致するように貼り付けた。一方、検液吸引パッド５（幅６ｍｍ×長さ２５ｍｍ）は、反応膜２の下流端と４ｍｍ重なるように貼り付けた。本スティック１本を専用ケースに入れ、ＴＳＬＣ１検査用スティック（図２参照）とした。
【試験例１】
【００３７】
ＴＳＬＣ１検出能の定性的評価。
試料の調製；ＡＴＬ患者、ＨＴＬＶ−１感染者及び健常者の血清又は血漿を用いた。血清又は血漿は、リン酸緩衝液で、１０倍希釈し、試料とした。ＡＴＬ患者の病型は、参考までに表５に示す。
試験方法：各試料約１００μｌをの検液滴下部４ａ実施例１のキット（図１）に滴下した。１５分間静置後、判定ライン６の有無を金コロイド判定用色見本（アドテック社製）により判定した。結果を表３、４及び５に示す。
【試験例２】
ウエスタンブロット法（先願図３）
方法
血清又は血漿をＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒで溶解し９５℃で５分間ｈｅａｔする。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動を行い、タンパク質を分離し、その後ＰＶＤＦ膜に転写した。膜は５％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングし、その後ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１／ＣＡＤＭ１；Ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１；ＩｇＹ１を一次抗体として作用し、ついでＨＲＰラベルしたａｎｔｉ−ｃｈｉｋｅｎ ＩｇＹを二次抗体として作用した。基質を添加して、ＨＲＰの酵素活性により生じた化学発光をイメージアナライザーにて解析した。結果を表３、４及び５に示す。
【試験例３】
試験例１の定量的評価：エライザ法（トリとファージの抗体）
方法
ＴＳＬＣ１陽性抗原（０．６３ｍｇ／ｍＬ）を陽性抗原希釈液（リン酸緩衝液にｔｗｅｅｎ−２０（１ｇ／Ｌ）、牛血清アルブミン（１ｇ／Ｌ）、アジ化ナトリウム（１ｇ／Ｌ）及びフェーノールレッド（１０ｍｇ／Ｌ）を含む）を用いて２５、５０、１００、２００、４００、８００，１６００倍に希釈した。血清又は血漿を検体希釈液を用いて５倍あるいは１０倍希釈した。
希釈した陽性抗原及び検液をｗｅｌｌにそれぞれ５０μＬずつ入れた。ＰＯＤ希釈液（リン酸緩衝液にｔｗｅｅｎ−２０（１ｇ／Ｌ）、牛血清アルブミン（１ｇ／Ｌ）、及びブリリアングリー（５０ｍｇ／Ｌ）を含む）で２００倍希釈したＰＯＤ−３Ｅ１をそれぞれ１００μＬ入れて、よく撹拌した。フィルムでカバーして、遮光、室温にて６時間静置した。６時間後、中の液を捨てて３００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄してよく水気を切った。エライザー発色液（ＴＭＢ−Ｚ）（Ａ液及びＢ液を容積比１：１で混合。Ａ液：蒸留水中に無水クエン酸（４０ｇ／Ｌ）及び過酸化水素（４００μｌ／Ｌ）を含む。Ｂ液：７０％メタノール中にＴＭＢ−Ｚ（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む。）をそれぞれ２００μＬずつ入れてよく撹拌し遮光、室温にて１０分静置した。１０分後反応停止液をそれぞれ５０μＬずつ入れてよく撹拌し、撹拌後すぐにオートリーダー（吸光度４５０ｎｍ）で測定した。結果を表３、４及び５に示す。
【表３】
【表４】
【表５】
考察：表３、表４及び表５から明らかなように、実施例１の標識トリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体とファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体（Ｎｏ．０３５−２１２）を組み合わせた本発明のＴＳＬＣ１検出キットの試験結果は、血清サンプルではＨＴＬＶ−１感染者及びＡＴＬ患者のいずれにおいても、健常者と比較して十分な呈色を示した。又、図３、図４及び図５から試験例１のイムノクロマトの呈色強度と試験例２のウェスタンブロット法の発色強度及び試験例３のエライザ法のＴＳＬＣ１濃度を比較すると、ＨＴＬＶ−１感染者及びＡＴＬ患者のいずれにおいても相関性があり、試験結果の信頼性が高いことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明ＴＳＬＣ１検出キットは、検体中のＴＳＬＣ１タンパク質の有無を安定的に高精度で以って、簡易且つ迅速に判定できるので、臨床現場において、ＨＴＬＶ−１感染者のＡＴＬの早期診断、あるいはＡＴＬ患者の診断に有効に利用可能である。
【符号の説明】
【００３９】
１：バックシート
２：反応膜
３：標識抗体パッド
４：検液滴下パッド
４ａ：検液滴下部
５：検液吸引パッド
６：判定ライン
７：参照ライン
８：カバー
８ａ：検液滴下口
９：開放口
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明のＴＳＬＣ１検出キットを示す模式図で、（ａ）は平面図、（ｂ）は側面図である。
【図２】図１の検出スティックにカバーを付した本発明の検出キットを示す模式図で、（ａ）は平面図、（ｂ）は側面図である。
【図３】エライザ法とイムノクロマトグラフの比較である。
【図４】エライザ法とウェスタンブロット法の比較である。
【図５】イムノクロマトとウェスタンブロット法の比較である。
【配列表】２００６３１７２２００００００１．ａｐｐ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマトグラフィー法（以下「イムノクロマト」という）又はエライザ法によるＴＳＬＣ１（Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ１；以下「ＴＳＬＣ１」という）の検出キット、特に成人Ｔ細胞白血病（Ａｄｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ；以下「ＡＴＬ」という）とその病因となるヒトＴ細胞白血病ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ１；以下「ＨＴＬＶ−１」という）の診断に使用するＴＳＬＣ１検出キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＬは、主に母乳によるＨＴＬＶ−１感染により発症する腫瘍性疾患である。これまでは、南九州を中心とする地域に特異的にみられる疾患として知られていたが、最近は全国的に広く分布してきている。
厚生労働省による全国調査によれば、ＨＴＬＶ−１感染者数は約１０８万人（２００９年）、ＡＴＬ患者数は増加傾向（年間１０００人超）にある。乳幼時に感染すると、４０〜６０年の感染期間を経て４〜６％の感染者が発症する。ＨＴＬＶ−１感染者中の発症危険率は低いが、臓器浸潤をともなう予後不良の疾患である。一旦急性化すると、今のところ適正な治療法はなく、予後生存率の中央値は１年未満である。
【０００３】
一方、ＴＳＬＣ１は、細胞間接着分子ＩｇＳＦ４（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｕｐｅｒ Ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｎｂｅｒ４；以下「ＩｇＳＦ４」という）とも言われるが、ＴＳＬＣ１という名前からも明らかなように肺癌の抑制遺伝子として見出されたものである。
【０００４】
特許文献１は、この肺癌抑制遺伝子ＴＳＬＣ１のｍＲＮＡとその蛋白質がＡＴＬ患者の白血病細胞において約３０倍以上高発現していることを開示している（表１参照）。同様にＨＴＬＶ−１感染細胞株においても、一部ＴＳＬＣ１の高発現が認められている。正常血液細胞またはその他の白血病細胞においては発現していない（図３参照）。このことから、ＴＳＬＣ１の高発現はＡＴＬ特異的であるとともに、ＨＴＬＶ−１感染者の動態診断においても有用であることを示唆している。
【０００５】
特許文献２は、このＴＳＬＣ１を抗原とする抗体を用いたＡＴＬのイムノクロマト診断器具を開示している。この診断器具は、構造的には典型的なイムノクロマトキットである。例えば、図１に示すように、毛細管現象を利用して検液が流れるように配置された検液滴下パッド、標識パッド、反応膜、検液吸引パッドで構成されている。標識パッドには、金コロイドとＴＳＬＣ１のマウス抗体からなるコンジュゲートパッドを用いている。ニトロセルロースからなる反応膜上には、標識抗体と同一又は異なるハイブリドーマから産生されたＴＳＬＣ１のマウス抗体を線状に固相化した判定ラインを設けてある。検体中にＴＳＬＣ１が含まれていれば、ＴＳＬＣ１は標識抗体との複合体を形成して判定ラインの検出抗体に捕捉され、検出抗体が標識物質の色を呈する。特許文献２では、標識抗体と検出抗体に同一又は異なるハイブリドーマから産生されたマウス抗体の使用例が開示されている。
【０００６】
特許文献３は、肝癌細胞に特異的に発現する分子としてＩｇＳＦ４を同定、これに抗体を作用させることで、抗体依存性細胞障害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；以下「ＡＤＣＣ活性」という）が発揮されるとの知見を得て、癌治療等に有効な抗ＩｇＳＦ４抗体を提供している。またＩｇＳＦ４抗体のひとつの用途として、ＡＴＬ検査用試薬（請求項１４）、被検査細胞を対象としてＩｇＳＦ４を検出するステップを含むＡＴＬ診断用情報を取得する方法（請求項１５）、ＡＴＬ治療に有効なＩｇＳＦ４結合化合物のスクリーニング方法（請求項１９）及びＡＴＬ治療法（請求項２４）も示唆している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−１４７７９８号
【特許文献２】特開２００６−３１７２２０号
【特許文献３】ＷＯ２００６／０９０７５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１はＴＳＬＣ１とＡＴＬの関係を開示しているが、イムノクロマトキットに適性のあるＴＳＬＣ１の抗体に関する言及はない。特許文献２は、前述のように抗ＴＳＬＣ１抗体を用いたＡＴＬのイムノクロマト診断器具を開示している。しかし、この診断器具では、標識抗体と同一または異なるハイブリドーマからなるマウス抗体を判定ラインに固相化している。この例によれば、判定ラインのマウス検出抗体が標識抗体のマウス抗体と同一又は異なっていても、ＴＳＬＣ１の認識に定性な差異はないとされている（表１参照）が、標識抗体と検出抗体とが同一のハイブリドーマからなる抗ＴＳＬＣ１抗体の場合には、検液中の抗原ＴＳＬＣ１タンパク質の同一部位を認識する恐れがあり、検液中のＴＳＬＣ１濃度が低いと検出され難い。かかる観点から、異なる部位を高精度で認識する安定した抗体の組み合わせが望ましい。また特許文献３には、ＩｇＳＦ４（ＴＳＬＣ１）に特異的な抗体が開示されており、その抗体アミノ酸の抗原相補性決定領域（以下「ＣＤＲ」という）を特定しているが、大部分はＡＤＣＣ活性を利用した肝臓癌の治療に関するものである。ＡＴＬの診断（請求項１４）あるいは汎用キット［００９６］［００９７］に関しては、ＡＴＬ細胞表面マーカーのひとつとして、ＩｇＳＦ４抗体の利用可能性を示唆するにとどまっており［０１７７］。ＴＳＬＣ１検出用のイムノクロマトキット抗体としての好適なＩｇＳＦ４抗体あるいはその組み合わせへの言及はない。
【０００９】
本発明の目的は、前記のごとき状況にかんがみ、ＡＴＬの診断に好適で、安定した高精度の検出能を有するＴＳＬＣ１検出キットを提供するにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、ＨＴＬＶ−１感染者におけるＡＴＬの早期診断に好適で、安定した高精度の検出能を有するＴＳＬＣ１検出キットを提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、鋭意検討した結果、標識抗体と検出抗体にＴＳＬＣ１タンパク質の認識部位が明らかに異なる二種の抗ＴＳＬＣ１抗体を組み合わせて使用することにより、ＡＴＬの診断に好適で、安定した高精度の検出能を得ることができることを見出し、本発明に到った。
【００１２】
すなわち、前記知見に基づく本発明のＴＳＬＣ１検出キットは、下記の特徴及び態様を有する。
項１：固相化されたファージディスプレイヒト抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体と、標識されたニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１ Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１）との組み合わせからなるＴＳＬＣ１検出キット。
項２：ニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体が着色粒子又は酵素で標識されている請求項１記載のＴＳＬＣ１検出キット。
項３：着色粒子標識が、金コロイド、有色ラテックス粒子、及び着色セルロース粒子からなる群から選ばれたひとつである請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
項４：酵素標識が、アルカリホスファターゼと発色基質ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸）との組み合わせからなる請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
項５：酵素標識が、パーオキシダーゼと発色基質ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）との組み合わせからなる請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
項６：請求項１〜５記載のＴＳＬＣ１検出キットを用いたエライザーキット。
項７：請求項１〜５記載のＴＳＬＣ１検出キットを用いたイムノクロマトキット。
項８：検液滴下パッド、標識パッド、反応膜、及び検疫吸引部位をこの順序で上流から下流へと連通するように配置した検査スティックを有し、該標識パッド抗体がニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体であり、反応膜上の検出ラインが個相化されたファージディスプレイヒト抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体であるイムノクロマトキット。
項９：反応膜上の検出ラインの下流に、さらに抗マウスＩｇＧヒツジモノクローナル抗体からなる参照ラインを備えている請求項８のＴＳＬＣ１検出キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、標識抗体にトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体、判定ラインの検出抗体にファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体と、明らかにＴＳＬＣ１タンパク質の異なった部位を認識する抗体を組み合わせることにより、検液中のＴＳＬＣ１タンパク質を安定して検出、その有無を判定できる。また、検出抗体にファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体という、ファージディスプレイ法により得られたヒトモノクローナル抗体を使用することにより、抗原接種動物の免疫系の制約を受ける動物免疫抗体とは異なり、安定した高精度の検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、図面に従って本発明を詳述する。図１において検出スティックは、バックシート１、反応膜２、標識抗体パッド３、検液滴下パッド４、検液吸引パッド５を備えている。バックシート１上には、反応膜２を貼り付けてある。反応膜２の一端には標識抗体パッド３を介して検液滴下パッド４を、他端には検液吸引パッド５を設ける。４ａは検液滴下部である。反応膜２上には、抗ＴＳＬＣ１抗体を固相化した判定ライン６と、必要に応じて参照ライン７を塗布する。この検出スティックでは、上流側の検液滴下パッド４の検出滴下部４ａに滴下された検液が、下流側の検液吸引パッド５の吸引により、反応膜２上を流れるように、検液滴下パッド４、標識抗体パッド３、反応膜２、検液吸引パッド５の順序で、少なくともその一部が接触するように配置されている。一方、図２の検出キットは、図１の検出スティックにカバー８を付したものである。カバー８には、検出スティック１の検液滴下部４ａに対応する部分に、開口した検液滴下口８ａを設け、検液吸引パッド５に対応する部分には、吸引した血液が滞留して逆流しないように、開放口９を設けてある。
【００１５】
検出スティックのバックシート１の材質には、特に制限はないが例えば紙を用い、そのサイズは幅６９ｍｍ×長さ３５０ｍｍ×厚さ０．１ｍｍ程度である。
【００１６】
本発明の反応膜２には、ニトロセルロース膜を好適に用いることができるが、タンパク質を吸着する能力を有する担体であれば、膜の種類や材質は問わない。そのままでは吸着能を有さない反応膜については、アミノ基やカルボキシル基を導入して化学的に修飾した抗ＴＳＬＣ１抗体結合能を有する膜も使用できる。
【００１７】
反応膜２の上流側には標識抗体パッド３を設ける。標識抗体パッド３には濾紙を用いる。本発明で使用する標識抗体には、例えば市販のリコンビナントＦｃ−ＳｙｎＣＡＭ由来のニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＳＹＮＣＡＭ／ＴＳＬＣ１ＣＡＤＭ１；Ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１，Ｓｕｂｃｌａｓｓ Ｃｈｉｃｋｅｎ ＩｇＹ（株式会社医学生物学研究所社製）を好適に用いる。標識物質としては、一般的に金コロイド粒子を用いるが、有色のラテックス粒子でも良い。金コロイド粒子のサイズは、粒子径２０−１００ｎｍ程度が好適である。有色のラテックス粒子径は、０．０５−０．５μｍの範囲が望ましい。これらの粒子は、例えば濃度１０−１０００μｇ／ｍＬの炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で、トリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体を吸着する。また、ラテックス等の微粒子に吸着又は反応せしめた抗体結合粒子を反応膜に封入することも可能である。有色粒子の代わりには、アルカリフォスターゼなどの酵素標識抗体を用いることもできる。
【００１８】
ニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体の一般的作成方法としては、抗原を免疫する動物はニワトリである。免疫用抗原としては、天然のＴＳＬＣ１タンパク質又は組換えＤＮＡ法もしくは化学合成により調製したＴＳＬＣ１タンパク質を用いる。タンパク質としては、アミノ酸配列の全長又は１−３７３の部分ペプチドを用いる。ＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列表に示す。
【００１９】
免疫法には特に制限されないが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などを用いる。免疫の間隔は、数日から数週間、好ましくは４−２１日とする。免疫したニワトリの免疫応答レベルを確認、又は細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択するためには、免疫したニワトリの血中抗体価もしくは抗体産生細胞の培養上清中における抗体価を測定する。抗体価の測定方法としては、例えばＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）などを挙げることができる。
【００２０】
トリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体の作成にあたっては、例えばＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列１−３７３のペプチドをコードする遺伝子をプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ／ＴＳＬＣ１）に組み込むことにより形質転換した大腸菌ＢＬ２１をＬＢ培地に接種して、略３７℃で培養する。培養液はイソプロピル−β−Ｄ−チオガトピラノシド処理して、ＴＳＬＣ１の産生を誘導し、回収する。回収した菌体は、界面活性剤や超音波で破砕処理した後に、沈渣を回収し、Ｎｉ−セファロースカラム等により組み換えＴＳＬＣ１タンパク質として分離、精製する。
【００２１】
アミノ酸配列１−３７３のペプチドは、ＴＳＬＣ１タンパク質の細胞外ドメインに相当するので、これを抗原とする抗体は、蛍光ラベル等により細胞を染色することがきる。またリガンドとの結合を中和する中和抗体としても使える可能性がある。
【００２２】
検液滴下パッド４と検液吸引パッド５には、毛細管現象により検液を吸収又は吸引し易い濾紙を用いる。
【００２３】
また本発明では、反応膜２の中央部近傍表面に、検液の流れに直交するようにファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体からなる判定ライン６を塗布する。ファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体は、ファージディスプレイ法により作成する。ファージディスプレイ法では、機能を負うペプチドやタンパク質（表現型）と、それをコードするＤＮＡ（遺伝子型）がファージ粒子上で対応しており、ディスプレイされたタンパク質とその標的物質との相互作用を検出することができる。このファージディスプレイヒト抗体ライブラリは広く公開されている。ファージディスプレイ法では、抗原に対する動物への免疫やハイブリドーマの作成を要しないため、それらの影響を受けずに、抗体遺伝子から直接モノクローナル抗体を得ることができる。
【００２４】
判定ライン６の塗布、固相化にあたっては、まずファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体を５０μＭ／Ｌ、ｐＨ７．８程度の炭酸緩衝液で透析し、蛋白質量として１ｍｇ／ｍＬの抗体液を得る。次いで、この抗体液を反応膜２上に塗布し、乾燥する。最後に、副反応を抑えるため、反応膜２を１％程度のアルブミンやスキムミルク等の溶液に浸漬、ブロッキングする。水洗、乾燥後、反応膜２は、塗布された判定ライン６が上になるようにバックシート１上に貼着する。
【００２５】
反応膜２の検液下流側には、必要に応じて参照ライン７を設けることもできる。参照ライン７は、検液が検液吸引パッド５の吸引により、参照ライン７まで正常に届いているか否かを検出するもので、例えば抗マウスＩｇＧヒツジモノクローナル抗体を好適に用いることができる。
【００２６】
図２のＴＳＬＣ１検出キットは、図１に示す検出スティックにカバー８を取り付けたものである。検出スティックの検液滴下部４ａに対応するカバー８の部分には、検液滴下口８ａを開口するが、それ以外はすべて閉じて検出スティックを保護している。
【００２７】
本発明では、既述のように、検出抗体として免疫動物によるノイズを回避するため、ファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体を用いることがひとつの特徴である。このファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体との組み合わせで有効な標識抗体として、ファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体とは異なる抗原ＴＳＬＣ１タンパク質の部位を認識するトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体が有効であると考えられる。しかし、実際には、同じ標識トリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体でも、Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１；Ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１；ＩｇＹ１は、表１に示すように、すべてのファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体試料において、抗原濃度０．０３ｎｇ／ｍＬまで有効に検出できるが、表２に示すように、Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１；Ｃｌｏｎｅ ９Ｄ２；ＩｇＹ２は、いずれのファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体試料に対しても、十分な検出能を持たない。このことから、本発明のファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体との組み合わせで有効な標識抗ＴＳＬＣ１体は、Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１；Ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１；ＩｇＹ１である。
【表１】
【表２】
【００２８】
本発明のＴＳＬＣ１検出キットを用いて検液中のＴＳＬＣ１タンパク質を検出するには、抗凝固剤を添加する。検液原としては、血清又は血漿のいずれでも使用できる。抗凝固剤としては、ヘパリンやＥＤＴＡ等を挙げることができる。次に検液を検液滴下用口８ａから、検液滴下パッド４の検液滴下部４ａに滴下する。検液は標識抗体パッド３を介して、反応膜２上に展開される。滴下された検液は、まずこの標識パッド３で標識されたトリ抗ＴＳＬＣ１抗体と反応する。次いで、標識された検液は反応膜２の判定ラインに６に塗布されたファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体と反応し、検液吸引パッド５に吸収される。
この反応は、約５−３０分で終了する。
【００２９】
検液中にＴＳＬＣ１タンパク質が存在すれば、標識抗体と複合体を形成し、判定ラインで捕捉、蓄積されて、標識物質の色を呈し、目視で確認できる。例えば、標識物質が金コロイドの場合には、判定ライン６のラインは赤紫色を呈する。検体中にＴＳＬＣ１タンパク質が存在しなければ、標識抗体と複合体を形成することはないので、判定ライン６に変化はない。判定ライン６が変化しない場合、検液の流れの中断による否かを判定するため、参照ライン７を設けることもできる。参照ライン７は、検液中のＴＳＬＣ１の有無にかかわらす標識物質の色を呈するので、検液が参照ラインまで正常に届いているかを確認できる。参照ライン７が呈色しない場合、判定ライン６の無変化は検液中のＴＳＬＣ１タンパク質の不在ではなく、検液の流れの停滞によると推定できる。
【実施例１】
【００３０】
抗原用ＴＳＬＣ１タンパク質溶液の調整
ＴＳＬＣ１の調製は、ＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列の１番目から３７３番目までのアミノ酸をコードする遺伝子をプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ／ＴＳＬＣ１）に、組み換えＤＮＡ法により、以下のように組み込み調製した。
【００３１】
まず、ｐＥＴＮｄｅＩＴＳＬＣ１プライマー（ｇｃｃａｔａｔｇｃａｇａａｔｃｔｇｔｔｔａｃｇａａａｃａｃ： 配列番号２）及びｐＥＴＴＳＬＣ１ＸｈｏＩプライマー（ｇｃｃｔｃｇａｇａｔｃｃａｃｔｇｃｃｃｔｇａｔｃｇａｇｃｃｃ： 配列番号３）によりＴＳＬＣ１のｃＤＮＡを増幅し、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素処理後、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中のＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素サイトに挿入した。
【００３２】
次に、プラスミド（ｐＥＴ２８ｂ／ＴＳＬＣ１）で大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、ＬＢ培地１０ｍＬに接種して３７℃で一夜培養した。培養液をＬＢ培地５００ｍＬに接種し、２５℃で培養し、６００ｎｍの吸光度０．５近傍で、βイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド処理し、ＴＳＬＣ１部分のタンパク質の産生を誘導した。さらに一夜培養後、菌体を遠心分離して回収した。回収菌体は超音波破砕処理し、８Ｍ尿素に懸濁、４℃、７時間、おだやかに撹拌した。撹拌後、遠心分離して上清を回収した。回収上清は、キレーティングセファローズＮｉカラム（ファルマシア）にかけた。カラムは、５ｍＭイミダゾールと８Ｍ尿素を含むリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７）と、１００ｍＭイミダゾールを含むリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．５）で洗浄し、７００ｍＭイミダゾールを含むリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７．５）で溶離した。溶離ＴＳＬＣ１タンパク質画分は、４Ｍ尿素を含むリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７）中に透析した。透析液中の尿素濃度を徐々に下げ、最終的に０にしてＴＳＬＣ１タンパク質溶液とした。
【００３３】
使用抗体
・判定ライン用のファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体には、株式会社医学生物学研究所社製；ｐｈａｇｅ０３５−１８１、ｐｈａｇｅ０３５−２１２、ｐｈａｇｅ０３５−２７３、ｐｈａｇｅ０３５−２８３を使用した。
・ 標識用のトリ抗ＴＳＬＣ１抗体には、株式会社医学生物学研究所社製；
商品名ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１／ＣＡＤＭ１；Ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１；ＩｇＹ１を使用した。
・参照ライン用の抗マウスＩｇＧヒツジ抗体には、Ａｎｔｉ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）を使用した。
【００３４】
反応膜の作製
反応膜２は、幅３０ｍｍ×横３００ｍｍのニトロセルロース膜を用いた。反応膜２上の判定ライン６は、アドテック社製塗布機を用いて、反応膜２の下流端から１３ｍｍの位置に、前記ファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体（Ｎｏ．０３５−２１２）の１ｍｇ／ｍＬを０．０２５ｍＬ／３０ｍｍとなるように線状に塗布した。参照ライン７は、同反応膜２の同端から２２ｍｍの位置に、０．５ｍｇ／ｍＬに調製した抗マウスＩｇＧヒツジ抗体を０．０２５ｍＬ／３０ｍｍとなるように線状に塗布した。判定ライン６と参照ライン７を塗布後の反応膜２は、室温で１時間放置し、ブロッキング液に室温で３０分間浸漬し、脱イオン水で５分間の洗浄を３回繰り返した後、再び室温に放置し、乾燥した。
【００３５】
標識抗体パッドの作製
金コロイド液（付記３）５００ｍＬ中に、炭酸カリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で０．１ｍｇ／ｍＬに希釈した前記抗ＴＳＬＣ１トリモノクローナル抗体（３Ｅ１）２５．０ｍＬを加え、室温で３０分間反応させた。次いで、０．１ｇ／ｍＬ牛血清アルブミン水溶液５ｍＬを更に加えて、２０分間反応させた。８，０００×Ｇで４℃、３０分間遠心後、沈渣を回収した。５％グルコース及び２．５％ＢＳＡを含む水溶液を全量で１００ｍＬとし金コロイド標識抗体液とした。調製した金コロイド標識抗体液をガラスパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製；商品名 ＮＥＷ ＳＵＲＥＷＩＣＫ ＧＦＣＰ Ｇ０４１）に５ｍＬ／ｍｍ２になるように吸収させ、常温で風乾した。乾燥後、縦１０±１ｍｍ×横３００±５ｍｍに裁断した。裁断した本ガラスパッドを金コロイド標識トリ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体パッド３として用いた。
【００３６】
検査キットの組立
本スティック（図１参照）は、次のように組み立てた。すなわち、バックシート１（幅６ｍｍ×長さ６９ｍｍ×厚さ０．１ｍｍ）の下流端から２１ｍｍの位置に、反応膜２（幅６ｍｍ×長さ３０ｍｍ）下流端が位置するように、判定ライン６及び参照ライン７を上にして貼り付けた。次にこの反応膜２の上流端側に、標識抗体パッド３（幅６ｍｍ×長さ１０ｍｍ）を両接触端が２ｍｍ重なるように貼り付けた。さらに検液滴下パッド４（幅６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）を標識抗体パッド３上に、互いの下流端が一致するように貼り付けた。一方、検液吸引パッド５（幅６ｍｍ×長さ２５ｍｍ）は、反応膜２の下流端と４ｍｍ重なるように貼り付けた。本スティック１本を専用ケースに入れ、ＴＳＬＣ１検査用スティック（図２参照）とした。
【試験例１】
【００３７】
ＴＳＬＣ１検出能の定性的評価。
試料の調製；ＡＴＬ患者、ＨＴＬＶ−１感染者及び健常者の血清又は血漿を用いた。血清又は血漿は、リン酸緩衝液で、１０倍希釈し、試料とした。ＡＴＬ患者の病型は、参考までに表５に示す。
試験方法：各試料約１００μｌをの検液滴下部４ａ実施例１のキット（図１）に滴下した。１５分間静置後、判定ライン６の有無を金コロイド判定用色見本（アドテック社製）により判定した。結果を表３、４及び５に示す。
【試験例２】
ウエスタンブロット法（先願図３）
方法
血清又は血漿をＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒで溶解し９５℃で５分間ｈｅａｔする。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動を行い、タンパク質を分離し、その後ＰＶＤＦ膜に転写した。膜は５％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングし、その後ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１／ＣＡＤＭ１；Ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１；ＩｇＹ１を一次抗体として作用し、ついでＨＲＰラベルしたａｎｔｉ−ｃｈｉｋｅｎ ＩｇＹを二次抗体として作用した。基質を添加して、ＨＲＰの酵素活性により生じた化学発光をイメージアナライザーにて解析した。結果を表３、４及び５に示す。
【試験例３】
試験例１の定量的評価：エライザ法（トリとファージの抗体）
方法
ＴＳＬＣ１陽性抗原（０．６３ｍｇ／ｍＬ）を陽性抗原希釈液（リン酸緩衝液にｔｗｅｅｎ−２０（１ｇ／Ｌ）、牛血清アルブミン（１ｇ／Ｌ）、アジ化ナトリウム（１ｇ／Ｌ）及びフェーノールレッド（１０ｍｇ／Ｌ）を含む）を用いて２５、５０、１００、２００、４００、８００，１６００倍に希釈した。血清又は血漿を検体希釈液を用いて５倍あるいは１０倍希釈した。
希釈した陽性抗原及び検液をｗｅｌｌにそれぞれ５０μＬずつ入れた。ＰＯＤ希釈液（リン酸緩衝液にｔｗｅｅｎ−２０（１ｇ／Ｌ）、牛血清アルブミン（１ｇ／Ｌ）、及びブリリアングリー（５０ｍｇ／Ｌ）を含む）で２００倍希釈したＰＯＤ−３Ｅ１をそれぞれ１００μＬ入れて、よく撹拌した。フィルムでカバーして、遮光、室温にて６時間静置した。６時間後、中の液を捨てて３００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄してよく水気を切った。エライザー発色液（ＴＭＢ−Ｚ）（Ａ液及びＢ液を容積比１：１で混合。Ａ液：蒸留水中に無水クエン酸（４０ｇ／Ｌ）及び過酸化水素（４００μｌ／Ｌ）を含む。Ｂ液：７０％メタノール中にＴＭＢ−Ｚ（２５０ｍｇ／Ｌ）を含む。）をそれぞれ２００μＬずつ入れてよく撹拌し遮光、室温にて１０分静置した。１０分後反応停止液をそれぞれ５０μＬずつ入れてよく撹拌し、撹拌後すぐにオートリーダー（吸光度４５０ｎｍ）で測定した。結果を表３、４及び５に示す。
【表３】
【表４】
【表５】
考察：表３、表４及び表５から明らかなように、実施例１の標識トリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１抗体とファージヒト抗ＴＳＬＣ１抗体（Ｎｏ．０３５−２１２）を組み合わせた本発明のＴＳＬＣ１検出キットの試験結果は、血清サンプルではＨＴＬＶ−１感染者及びＡＴＬ患者のいずれにおいても、健常者と比較して十分な呈色を示した。又、図３、図４及び図５から試験例１のイムノクロマトの呈色強度と試験例２のウェスタンブロット法の発色強度及び試験例３のエライザ法のＴＳＬＣ１濃度を比較すると、ＨＴＬＶ−１感染者及びＡＴＬ患者のいずれにおいても相関性があり、試験結果の信頼性が高いことを示している。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明ＴＳＬＣ１検出キットは、検体中のＴＳＬＣ１タンパク質の有無を安定的に高精度で以って、簡易且つ迅速に判定できるので、臨床現場において、ＨＴＬＶ−１感染者のＡＴＬの早期診断、あるいはＡＴＬ患者の診断に有効に利用可能である。
【符号の説明】
【００３９】
１：バックシート
２：反応膜
３：標識抗体パッド
４：検液滴下パッド
４ａ：検液滴下部
５：検液吸引パッド
６：判定ライン
７：参照ライン
８：カバー
８ａ：検液滴下口
９：開放口
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明のＴＳＬＣ１検出キットを示す模式図で、（ａ）は平面図、（ｂ）は側面図である。
【図２】図１の検出スティックにカバーを付した本発明の検出キットを示す模式図で、（ａ）は平面図、（ｂ）は側面図である。
【図３】エライザ法とイムノクロマトグラフの比較である。
【図４】エライザ法とウェスタンブロット法の比較である。
【図５】イムノクロマトとウェスタンブロット法の比較である。
【配列表】２００６３１７２２００００００１．ａｐｐ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相化されたファージディスプレイヒト抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体と、標識されたニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１ Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１）との組み合わせからなるＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項２】
ニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体が着色粒子又は酵素で標識されている請求項１記載のＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項３】
着色粒子標識が、金コロイド、有色ラテックス粒子、及び着色セルロース粒子からなる群から選ばれたひとつである請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項４】
酵素標識が、アルカリホスファターゼと発色基質ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸）との組み合わせからなる請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項５】
酵素標識が、パーオキシダーゼと発色基質ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）との組み合わせからなる請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項６】
請求項１〜５記載のＴＳＬＣ１検出キットを用いたエライザーキット。
【請求項７】
請求項１〜５記載のＴＳＬＣ１検出キットを用いたイムノクロマトキット。
【請求項８】
検液滴下パッド、標識パッド、反応膜、及び検疫吸引部位をこの順序で上流から下流へと連通するように配置した検査スティックを有し、該標識パッド抗体がニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体であり、反応膜上の検出ラインが固相化されたファージディスプレイヒト抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体であるイムノクロマトキット。
【請求項９】
反応膜上の検出ラインの下流に、さらに抗マウスＩｇＧヒツジモノクローナル抗体からなる参照ラインを備えている請求項８のＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項１】
固相化されたファージディスプレイヒト抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体と、標識されたニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ ３Ｅ１ Ａｎｔｉ−ＳｙｎＣＡＭ／ＴＳＬＣ１）との組み合わせからなるＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項２】
ニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体が着色粒子又は酵素で標識されている請求項１記載のＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項３】
着色粒子標識が、金コロイド、有色ラテックス粒子、及び着色セルロース粒子からなる群から選ばれたひとつである請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項４】
酵素標識が、アルカリホスファターゼと発色基質ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸）との組み合わせからなる請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項５】
酵素標識が、パーオキシダーゼと発色基質ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）との組み合わせからなる請求項２のＴＳＬＣ１検出キット。
【請求項６】
請求項１〜５記載のＴＳＬＣ１検出キットを用いたエライザーキット。
【請求項７】
請求項１〜５記載のＴＳＬＣ１検出キットを用いたイムノクロマトキット。
【請求項８】
検液滴下パッド、標識パッド、反応膜、及び検疫吸引部位をこの順序で上流から下流へと連通するように配置した検査スティックを有し、該標識パッド抗体がニワトリＩｇＹ抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体であり、反応膜上の検出ラインが固相化されたファージディスプレイヒト抗ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体であるイムノクロマトキット。
【請求項９】
反応膜上の検出ラインの下流に、さらに抗マウスＩｇＧヒツジモノクローナル抗体からなる参照ラインを備えている請求項８のＴＳＬＣ１検出キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１３−４０９１２（Ｐ２０１３−４０９１２Ａ）
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９３３３１（Ｐ２０１１−１９３３３１）
【出願日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【出願人】（３０６０２４６０９）財団法人宮崎県産業支援財団 (23)
【出願人】（５９５００８７１１）アドテック株式会社 (5)
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【公開日】平成２５年２月２８日（２０１３．２．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【出願人】（３０６０２４６０９）財団法人宮崎県産業支援財団 (23)
【出願人】（５９５００８７１１）アドテック株式会社 (5)
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
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