抗がん剤治療の有効性予測方法
【課題】 患者がためらうことなく抗がん剤治療に踏み切れるように、特定の抗がん剤治療が有効であることを高確率で予測できる抗がん剤治療の有効性予測方法を提供する。
【解決手段】 患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量の比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較する工程；及び前記比較工程の結果に基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む方法である。複数のＣＤＫについて、各パラメータと該当する閾値と比較し、それらの比較結果の組み合わせによって予測してもよい。閾値は、所定のがんに対して所定の抗がん剤が投与された抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータについて、抗がん剤治療結果に基づいて設定されることが好ましい。
【解決手段】 患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量の比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較する工程；及び前記比較工程の結果に基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む方法である。複数のＣＤＫについて、各パラメータと該当する閾値と比較し、それらの比較結果の組み合わせによって予測してもよい。閾値は、所定のがんに対して所定の抗がん剤が投与された抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータについて、抗がん剤治療結果に基づいて設定されることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個々のがん患者に対して、抗がん剤治療が有効か否か、とりわけ有効であることを高確率で予測することができる抗がん剤治療の有効性予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの治療方法の一つとして、抗がん剤治療方法がある。しかし、がんの病態は、その種類、発症部位あるいは進行度等により様々であり、こうした多様性と患者個人の応答性の違いは、抗がん剤治療が有効な患者だけでなく、有効でない患者も多く存在する原因となっている。抗がん剤が効かない患者に抗がん剤を投与し続けることは、その抗がん剤の副作用による悪い面だけがクローズアップされることになり、患者には苦痛を強いるだけに成りかねない。
このため、抗がん剤治療に踏み切る場合、その抗がん剤が対象となる患者に効くか効かないかを、治療前に知ることが求められている。
【０００３】
現在、抗がん剤に対する感受性を予測する方法としては、例えば特許文献１に、感受性の違いが遺伝子多型にあるとして、被検細胞のＢＣＲＰの遺伝子多型を同定する、被検細胞の抗がん剤に対する感受性判定方法が開示されている。
【０００４】
ＢＣＲＰは、ＡＢＣトランスポータの１つで、抗がん剤の耐性に関与していることが知られており、またこのＢＣＲＰの発現の個人差が一塩基多型にあることが知られている。このようなことから、特許文献１に開示の感受性判定方法は、患者由来のガン細胞からＤＮＡの塩基配列を調べ、ＢＣＲＰの遺伝子多型を同定し、感受性、副作用の程度を判定するという方法である。
【０００５】
また、特許文献２に、培養がん細胞株の抗がん剤感受性と該細胞のインタクトな状態における遺伝子発現プロファイルに基づき抗がん剤適合性マーカー遺伝子を特定し、特定した抗がん剤適合性マーカー遺伝子と該遺伝子を利用した未知検体の抗がん剤適合性予測方法が開示されている。
【０００６】
この方法では、検体中のがん細胞において、相対的発現量が高い遺伝子群の特定の抗がん剤に対して相関が高い遺伝子群と一致する率が高ければ、該検体はその抗がん剤に対して適合性であると予測し、検体中のがん細胞において相対的発現量が高い遺伝子群が特定の抗がん剤に対して相関が高い遺伝子群と全く一致しなければ、該検体はその抗がん剤に対して適合性が低いと予測するものである。
【０００７】
しかし、この方法で適合と判定されたものであっても、抗がん剤治療が実際に有効であるか否かは８０％程度であるといわれている。有効性が８０％というのは、治療に踏み切るにあたっての指標としては、決して高いといえない。かなりの確実性をもって有効であるといった指標が与えられることが患者にとっては重要である。
【０００８】
一方、がん抑制遺伝子産物であるｐ５３やＲＢタンパク質（網膜芽細胞腫タンパク、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）が、細胞周期制御に関与することが知られ、細胞周期タンパク質とがんとの関係について、近年、研究が進められている。
【０００９】
特許文献３には、細胞周期関連タンパク質を少なくとも２種以上測定し、細胞周期プロファイリングを行なうことにより、薬剤耐性試験及び予後診断が可能となるということは示唆されているが、その具体的方法、効果については一切開示されていない。
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−１９９５８５号
【特許文献２】特開２００３−３０４８８４号
【特許文献３】ＷＯ２００４／０７６６８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、患者がためらうことなく抗がん剤治療に踏み切れるように、特定の抗がん剤治療が有効であることを高確率で予測できる抗がん剤治療の有効性予測方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、実際に患者から採取された腫瘍細胞について、細胞周期関連タンパク質のプロファイリングを種々検討し、さらに実際に抗がん剤治療を行なったときの効果との関係を鋭意検討した結果、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較する工程；及び前記比較工程の結果に基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む。
【００１４】
有効性の予測に採用するサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、１種類であってもよいし（第１の有効性予測方法）、２種類以上であってもよい（第２の有効性予測方法）。
【００１５】
２種類以上のＣＤＫを採用する場合、前記比較工程は、複数のサイクリン依存性キナーゼについて、各キナーゼのパラメータを、それぞれ選択されたパラメータに対応する閾値と比較することにより行ない、前記予測工程は、各キナーゼの比較結果の組み合わせにより、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する方法であってもよいし（第２−１の有効性予測方法）；第１の有効性予測方法の予測工程において前記抗がん治療の有効性が疑われると判定された腫瘍細胞について、第１有効性予測方法で採用したＣＤＫ（第一ＣＤＫ）とは異なるＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択されるパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較することにより、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む方法であってもよい（第２−２の有効性予測方法）。
【００１６】
第２−２の有効性予測方法で、第１ＣＤＫと異なるＣＤＫは、１種類のＣＤＫ（第２ＣＤＫ）であってもよいし、複数種類のＣＤＫを用いてもよい。第２ＣＤＫの場合、第２ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択されるパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較することにより、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む。複数種類のＣＤＫを用いる場合、それぞれのＣＤＫについて、各ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較し、各キナーゼの比較結果の組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する。
【００１７】
さらに、ＣＤＫだけでなく、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の発現量を、対応する閾値と比較し、前記ＣＤＫの比較結果と、前記ＣＤＫインヒビターの比較結果との組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測してもよい（第３の有効性予測方法）。
【００１８】
第１〜第３の有効性予測方法において、前記サイクリン依存性キナーゼは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６からなる群より選択されることが好ましく、第３の有効性予測方法において、前記ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１であることが好ましい。
【００１９】
第１〜第３の有効性予測方法において、前記閾値は、所定のがんに対して所定の抗がん剤が投与された抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータについて、抗がん剤治療結果に基づいて設定されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、実際の抗がん剤治療効果の有無との相関性が大変高く、本発明の予測方法で有効と判定される場合は、ほぼ１００％近く抗がん剤治療が有効な場合に限られるので、抗がん剤治療に踏み切るか否かの指標として優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較する工程；及び前記比較工程の結果に基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む。
【００２２】
本発明の方法で予測する治療の有効性には、術前療法、術後療法の双方が含まれる。術前療法では、原発巣が存在する状態で抗がん剤を投与し続けた結果、原発巣が縮小ないし消失する場合が有効となり、術後療法では、腫瘍の摘出手術を行なった後に抗がん剤を投与し続けた結果、再発しない場合が有効となる。術後療法では、目に見えない転移などに対して、抗がん剤が有効であるかどうかが再発の有無となって現れる。
【００２３】
本発明の予測方法に用いられる試料となる細胞は、患者から採取した腫瘍細胞である。術後療法の場合、手術により摘出された腫瘍組織から腫瘍細胞を得ることができる。術前療法の場合には、患者の腫瘍組織から生検した腫瘍細胞などを用いることができる。
【００２４】
サイクリン依存性キナーゼとは、サイクリンと結合して活性化される酵素群の総称で、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。
【００２５】
ここで、細胞が増殖を開始し、ＤＮＡ複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などの事象を経て、２つの娘細胞となって出発点に戻るまでのサイクルである細胞周期は、図１に示すように、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の４期に分けられる。Ｓ期はＤＮＡの複製期であり、Ｍ期は分裂期である。Ｇ１期は有糸分裂の完了からＤＮＡ合成の開始までの間で、Ｍ期にはいるための準備点検期である。Ｇ１期にある臨界点（動物細胞ではＲ点）をすぎると、細胞周期は始動し、通常途中でとまることなく、一巡する。Ｇ２期は、ＤＮＡ合成の終了から有糸分裂の開始の間である。細胞周期の主なチェックポイントは、Ｇ１期からＳ期にはいる直前、Ｇ２期から有糸分裂への入り口である。特にＧ１期チェックポイントはＳ期開始の引き金をひくため、重要である。Ｇ１期のある点をすぎると、細胞は増殖シグナルがなくなっても、増殖を停止することなく、Ｓ→Ｇ２→Ｍ→Ｇ１と細胞周期を進行させるからである。尚、増殖を停止した細胞で、Ｇ１期のＤＮＡ含量をもった休止期（Ｇ０）があり、細胞周期からはずれた状態にある。増殖誘導により細胞周期内のＧ１期よりやや長い時間の後にＳ期へ進行することができる。
【００２６】
本発明の方法で用いられるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）としては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、及びサイクリンＤ依存性キナーゼなどが挙げられ、がんの種類、抗がん剤の種類に応じて適宜選択される。つまり、がんには種々の種類があり、各患者のがん細胞がもっている細胞周期に関連する性格が抗がん剤治療の有効性に大いに関係するからである。
【００２７】
本明細書における「がん」は、上皮細胞がん、造血器由来のがん、肉腫などを含む。がんの種類としては、例えば、乳がん、胃がん、大腸がん、食道がん、前立腺がん、白血病、骨肉腫等が挙げられる。
【００２８】
本明細書における「抗がん剤」とは、上述のがんに対して抗腫瘍効果のある化学物質のことをいう。
【００２９】
本明細書における「抗がん剤治療」とは、上述の抗がん剤を生体に投与することにより生体の悪性腫瘍を治療することである。
【００３０】
乳がんに対する抗がん剤治療としては、例えばCMF（シクロフォスファミド、メトトレキシエート、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）、ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗がん剤、CE（シクロフォスファミド、エピルビシンの２剤を併用して投与する療法）、AC（ドキソルビシン、シクロフォスファミドの２剤を併用して投与する療法）、CAF（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法）、FEC(フルオロウラシル、エピルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法)、トラスツズマブとパクリタキセルの２剤を併用して投与する療法、カペシタビン等が挙げられ、胃がんに対する抗がん剤治療としては、例えばFAM（フルオロウラシル、ドキソルビシン、マイトマイシンCの３剤を併用して投与する療法）、FAP（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シスプラチンの３剤を併用して投与する療法）、ECF（エピルビシン、シスプラチン、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）、マイトマイシンCとテガフールの２剤を併用して投与する療法、フルオロウラシルとカルムスチンの２剤を併用して投与する療法等が挙げられ、大腸がんに対する抗がん剤治療としては、例えばフルオロウラシルとロイコボリンの２剤を併用して投与する療法、マイトマイシンとフルオロウラシルの２剤を併用して投与する療法等が挙げられ、卵巣がんに対する抗がん剤治療としては、例えばTP（パクリタキセル、シスプラチンの２剤を併用して投与する療法）、TJ（パクリタキセル、カルボプラチンの２剤を併用して投与する療法）、CP（シクロフォスファミド、シスプラチンの２剤を併用して投与する療法）、CJ（シクロフォスファミド、カルボプラチンの２剤を併用して投与する療法）等が挙げられる。
【００３１】
判定の指標とするのは、ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比から選択される１つ又は２つのパラメータである。活性値と発現量の比は、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量で示されるＣＤＫ比活性であってもよいし、ＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値の値であってもよい。
【００３２】
上記のパラメータを所定の閾値と比較することにより抗がん剤治療が有効か否か判定できる。ここで活性値、発現量および活性値と発現量の比から選択されるパラメータとは、抗がん剤の種類、がんの種類により適宜選択されるパラメータである。このパラメータは、過去に抗がん剤治療が行われ、その結果が判明しているがん患者から抗がん剤治療の前に摘出されて保存されていた腫瘍細胞について、CDKの活性値と発現量を測定し、それぞれのパラメータについて、抗がん剤治療結果を解析し、抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータを抗がん剤の有効性判定に用いるパラメータとして選択したものである。
【００３３】
閾値と比較するパラメータは、所定のCDKにおける１つのパラメータであってもよいし、２つのパラメータの組合せであってもよい。２つのパラメータを選択する場合、それぞれにおけるパラメータをそれぞれの閾値と比較する。
【００３４】
判定の指標となるＣＤＫは、１種類であってもよいし（第１の有効性予測方法）、２種類以上であってもよい（第２の有効性予測方法）。
【００３５】
２種類以上のＣＤＫを採用する場合、複数のCDKについて、それぞれにおけるパラメータをそれぞれの閾値と比較し、各キナーゼの比較結果の組み合わせにより、有効性を予測してもよい（第２−１の有効性予測方法）。この場合、閾値と比較するパラメータの種類は、複数のＣＤＫにおいて、同じ種類のパラメータ（例えば発現量）を用いてもよいし、異なる種類のパラメータ（例えば一方のＣＤＫについては発現量を比較し、他方のＣＤＫについては活性値を比較する）を用いてもよい。
【００３６】
また、複数種類のＣＤＫを採用する場合において、まず第１の有効性予測方法で、第１のＣＤＫに基づいて予測し、第１の有効性予測方法で有効性が疑われると判定された腫瘍細胞に関して、第１のＣＤＫとは異なるＣＤＫについて、活性値、発現量および活性値と発現量との比から選択されるパラメータと、該パラメータに対応する閾値と比較することによって、有効性を予測してもよい（第２−２の有効性予測方法）。第２−２の有効性予測方法で、第１ＣＤＫと異なるＣＤＫは、１種類のＣＤＫ（第２ＣＤＫ）であってもよいし、複数種類のＣＤＫ（第３、第４・・・ＣＤＫ）を用いてもよい。複数種類のＣＤＫを用いる場合、それぞれのＣＤＫについて、各ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較し、これらの比較結果の組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する。
【００３７】
第２のＣＤＫについて、有効性の判定に用いるパラメータは、上記群から選ばれる。パラメータは１つだけ選択してもよいし、２つのパラメータを選択して、それぞれの閾値と比較してもよい。また、異なるＣＤＫとして複数種類のＣＤＫ、すなわち第２、さらには第３、第４のＣＤＫについて測定する場合、判定に使用するパラメータは、全て同種のパラメータ（例えば発現量）を用いてもよいし、異なる種類のパラメータ（例えば第２のＣＤＫは発現量とし、第３のＣＤＫは活性値とするなどの組合わせ）を用いてもよい。
【００３８】
本発明の第２の有効性予測方法は、予測の正答率を上げる点で有効である。さらに第２−２の予測方法により、第１の予測方法で有効であると判定されない場合であっても、抗がん剤治療が有効な場合が少なくないので、第２の有効性予測方法を採用する意義がある。
また、抗がん剤治療の効き方にも、さらに病状が悪化することを防止するレベルと、腫瘍を縮小させて、病状を快方に向かわせることができるレベルとに分類することができ、第２の有効性予測方法、特に第２−２の有効性予測方法により、抗がん剤治療の効き方のレベルを加味した予測を行なうこともできる。
【００３９】
本発明の有効性予測方法は、ＣＤＫだけでなく、さらにサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の発現量を、対応する閾値と比較し、前記ＣＤＫの比較結果と、前記ＣＤＫインヒビターの比較結果との組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測してもよい（第３の有効性予測方法）。ＣＤＫインヒビターは、サイクリン・ＣＤＫ複合体に結合し、その活性を阻害する因子群で、ＩＮＫ４ファミリーとＣＩＰ／ＫＩＰファミリーに分類される。本発明の有効性予測方法では、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーが好ましく用いられ、特にｐ２１が好ましく用いられる。ｐ２１は、細胞増殖サイクルにおけるＧ１期及びＧ２期チェックポイントの双方で進行を阻害するインヒビターで、損傷したＤＮＡの修復のための時間を与えることができる。
【００４０】
第３の有効性予測方法は、ＣＤＫを所定パラメータについて閾値と比較した結果と、ＣＤＫインヒビターの発現量を閾値と比較した結果の組み合わせに基づいて、抗がん剤治療の有効性を予測してもよいし、第１段階でＣＤＫを所定パラメータについて閾値と比較し、有効性を予測判定した（第１の有効性予測方法）後、有効であると判定されなかった腫瘍細胞について、第２段階でＣＤＫインヒビターの発現量を閾値と比較し、有効である可能性が高いものを選び出すようにしてもよい。
【００４１】
尚、ＣＭＦ投与の治療有効性予測因子として、Ｈｅｒ２やｐ２１が報告されている。Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（ＩＢＣＳＧ）のトライアルでは、Ｈｅｒ２が過剰発現している乳がん患者に対してＣＭＦ投与が無効であることが示され、ｐ２１に関しては、ｐ２１高発現患者群における無病生存率が、低発現患者群よりも有意に悪いことが報告されている。しかし、Ｈｅｒ２，ｐ２１ともにＣＭＦ療法に対する効果の低い患者群に予測する因子であり、積極的に治療効果のある患者群を予測する因子の報告例はない。一方、本発明の予測方法は、有効であることを積極的に示すもので、しかも閾値を厳格にすることで、１００％に近い有効性を期待できる場合を提示することができる。
【００４２】
本発明の有効性予測方法において、閾値は、抗がん剤の種類、がんの種類により適宜設定される値である。具体的には所定のがんに対して所定の抗がん剤を投与した抗がん剤治療結果と上記のパラメータとの関係を、多くの抗がん剤治療結果について調べ、多数の抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータに関して、その抗がん剤治療結果が有効であった場合を選択できるように設定された値である。好ましくは抗がん剤治療結果が全て有効であった場合のみを選択できるように閾値を設定する。このように、実際の臨床治療結果に基づいて閾値の設定が行われるため、確度の高い有効性の判定が可能となる。閾値の設定に用いる臨床治療結果の数を増加させることにより、有効性判定の確度を向上させることができる。なお、抗がん剤治療結果としては、所定の抗がん剤治療を続けることにより生じた腫瘍サイズの変化や、抗がん剤投与を５〜６年続けて再発の有無を調べた結果等が挙げられる。
【００４３】
ＣＤＫ活性値とは、試料中に含まれるＣＤＫにより基質に導入されたリン酸量に基づく値であり、リン酸量を測定する際に用いられた標識物（例えば３２Ｐ、蛍光）の標準品の測定値から定量的に計算される値（単位をU（ユニット）で表す）である。具体的には、検体の細胞可溶化液から活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）を用いて、基質タンパク質に３２Ｐを取り込ませ、標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとに定量する方法がある。また放射性物質の標識を用いない方法としては、特開２００２−３３５９９７号に開示の方法が挙げられる。この方法は、検体の細胞可溶化液から、目的の活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質を反応させて、該基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量（標識蛍光物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。
【００４４】
活性測定に供する試料は、検体の細胞可溶化液から目的のＣＤＫを特異的に採集することにより調製する。この場合、目的のＣＤＫに特異的な抗ＣＤＫ抗体を用いて調製してもよいし、特定のサイクリン依存性キナーゼ（例えばサイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、サイクリンＥ依存性キナーゼ）活性測定の場合には、抗サイクリン抗体を用いて調製する。いずれの場合も活性型ＣＤＫ以外のＣＤＫが試料に含まれることになる。例えばサイクリン・ＣＤＫ複合体にＣＤＫインヒビターが結合した複合体も含まれる。また、抗ＣＤＫ抗体を用いた場合には、ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体などが含まれる。従って、活性値は、活性型、不活性型、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質の単位（Ｕ）として測定される。
【００４５】
ＣＤＫ発現量とは、細胞可溶化液から測定される目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよいし、特開２００３−１３０８７１号に開示の方法で測定することもできる。目的のタンパク質（ＣＤＫ）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、抗ＣＤＫ１抗体を用いることにより、細胞内に存在するＣＤＫ１のすべて（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体を含む）を捕捉できる。
【００４６】
細胞可溶化液は、腫瘍細胞を含む組織などの生体試料を用いて調製することができる。具体的には、生体試料に緩衝液を添加し、緩衝液中の生体試料をホモジナイズして細胞膜内又は核膜内に存在する物質を緩衝液中に遊離させる。得られたホモジネートを遠心分離して採取される上清を細胞可溶化液とすることができる。この細胞可溶化液には、細胞膜内又は核膜内に存在するタンパク質などの分子が含まれている。遠心分離前及び／又は遠心分離後に、タンパク質の生成や抽出などの処理を行なっていてもよい。上述の緩衝液には、界面活性剤、プロテアーゼインヒビターなどを適宜添加してもよい。
【００４７】
尚、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量（ＣＤＫ比活性）、又はＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値で示される比は、細胞に存在しているＣＤＫのうち、活性を示すＣＤＫの割合に相当し、測定対象である腫瘍細胞が固有のものとして示す増殖状態に基づくＣＤＫ活性レベルといえ、測定に供する試料の調製方法に依存しない。測定試料調製方法、特に生検材料から調製される細胞可溶化液は、実際に採取された組織中に含まれる非細胞性組織、例えば細胞外基質の多寡による影響をうけやすい。従って、ＣＤＫ活性値と発現量との比を用いることにより、測定試料調製時に不可避の影響を控除することができ、タンパク質に着目した判定方法であっても、高精度に有効性を判定することができる。
【００４８】
ＣＤＫインヒビター発現量とは、細胞可溶化液から測定される目的のＣＤＫインヒビター量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよい。目的のタンパク質（ＣＤＫインヒビター）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。目的のタンパク質と特異的に結合できるものであれば、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。例えば、ｐ２１を捕捉する場合、抗ｐ２１モノクローナル抗体、抗ｐ２１ポリクローナル抗体のいずれも用いることができる。
【実施例】
【００４９】
はじめに、下記実施例で用いた測定方法について説明する。
〔測定方法〕
（１）ＣＤＫ活性の測定
目的とする腫瘍細胞を含む組織から調製した検体（細胞可溶化液）から、１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに、５００μｌの溶解緩衝液中に溶解物の全タンパク質量が１００μｇとなる量を加えて試料を調製した。
活性測定しようとするＣＤＫに特異的抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社のポリクローナル抗ＣＤＫ１抗体又はポリクローナル抗ＣＤＫ２抗体）２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（バイオラッド社製）を、上記サンプルに加えて４℃で１時間反応させた後、ビーズを緩衝液（０．１％ＮＰ−４０、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．０）で３回洗浄し、１５μｌのキナーゼ緩衝液中に再懸濁させて、目的のＣＤＫが結合したビーズを含む試料を得た。
【００５０】
この試料においては、ＣＤＫ単体、サイクリン結合した活性型ＣＤＫ、活性型ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの複合体の全て（以下、これらを区別しないときは「ＣＤＫ群」という）がＣＤＫ特異的抗体により捕捉され、ビーズに結合した状態となっている。このような試料中のＣＤＫ群の活性を、下記方法により測定した。
【００５１】
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２に対応する基質であるヒストンＨ１（アップステイトバイオテクノロジー製）１０μｇ、５ｍＭのアデノシン５’−Ｏ−（８−チオ３リン酸）（ＡＴＰ−γＳ、シグマ社製）、及び緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含む基質溶液を調製し、この基質溶液を上記ＣＤＫ含有試料に加えて５０μｌとし、３７℃で１０分間振とうしてインキュベートした。下記式に示すように、基質のセリン又はスレオニン残基が、活性型ＣＤＫによりリン酸化され、モノチオリン酸化基質が得られる。
【００５２】
【化１】
【００５３】
反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心して、ビーズを沈殿させ、モノチオリン酸を溶解した上澄み液１８μｌを採取した。この上澄み液１８μｌに、１５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ９．２、５ｍＭのＥＤＴＡを含む結合緩衝液１５μｌを加えた。さらに、１０ｍＭのヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で暗所において９０分間室温にてインキュベートすることにより、モノチオリン酸化基質のチオリン酸中の硫黄をビオチン化標識した。ヨードアセチルビオチンとチオリン酸との反応の停止は、６−メルカプトエタノールの添加により行った。
【００５４】
ビオチン標識されたチオリン酸化基質０．４μｇを、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦ膜上に添加し、吸引した。得られた膜を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロックし、アビジン−ＦＩＴＣ（ベクター製）を３７℃で１時間反応させた。その後、膜を５０ｍＭ ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１０分間３回洗浄した。洗浄後、膜上のイメージを蛍光イメージアナライザー（バイオラッド社製）により分析した。活性は、検量線に基づいて算出した。
【００５５】
尚、検量線は、既存量のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）をPVDF膜上に吸着させ、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザー（バイオラッド社製）で測定することにより作成した。従って、測定されるCDK活性１Uは、前記タンパク質１ngのときの蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。
【００５６】
（２）ＣＤＫ発現量の測定
ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に浸漬して初期化したＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたスロットブロッターの各ウェル（２×２×３ｍｍ、許容量１００μｌ）に、目的の腫瘍細胞を含む組織から調製した細胞可溶化液を５０μｌずつ注入した。各ウェルには、タンパク質が総量で５〜１５μｇずつ含まれている。
【００５７】
注入後、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約１５０ｍｍＨｇで約５０秒間吸引し、膜に試料を吸着させた。
【００５８】
次いで、試料に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体又はウサギ抗ＣＤＫ２抗体（一次抗体）の溶液を、各ウェルに注入し、室温で約３０分間静置した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。
【００５９】
次に、ビオチン化した抗ウサギ抗体（二次抗体）の溶液を各ウェルに注入し、室温で約３０分間静置した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。
【００６０】
ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン試薬を４０μｌずつ注入し、約３０分間室温で静置して、二次抗体をＦＩＴＣで標識した。ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。
【００６１】
ＰＶＤＦメンブレンをプレートから取外して蒸留水で洗浄し、２０％メタノールに５分間浸漬した。次いで、約１５分間室温で乾燥させた後、膜に吸着されたタンパク質の蛍光強度を、イメージアナライザ（バイオラッド社）によって分析、測定し、予め作成した検量線をもとに、ＦＩＴＣ標識されたタンパク質（ＣＤＫ１又はＣＤＫ２又はＣＤＫ４）を定量（ＣＤＫ個数に対応する量を標準タンパク質の重量（ｎｇ）で換算）した。このようにして測定されるＣＤＫ量は、細胞中に存在しているＣＤＫ群（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体など）の総量である。
【００６２】
尚、検量線は、０．００５％のＮＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＴＢＳ中に、５種類の濃度の純品の組換えＣＤＫタンパク質の溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度と量の関係を表すことにより標準曲線を作成した。
【００６３】
（３）ＣＤＫ比活性の算出
上記で測定したＣＤＫ活性及びＣＤＫ発現量の測定値から、下記式により、ＣＤＫ比活性（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量
【００６４】
（４）ｐ２１の発現量
ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭｐ２１ＷＡＦ１ ＥＬＩＳＡキット（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。
ＷＡＦ１スタンダード（２０ユニット／ｍｌのｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅされたＷＡＦ１）を、検体である細胞可溶化液で段階的に希釈したｗａｆ１試料液（ＷＡＦ１スタンダードと検体の混合液）を調製する。なお、各試料液において、細胞可溶化液は４倍以上希釈されたものとなっている。
ＷＡＦ１に特異的なウサギポリクローナル抗体（一次抗体）を固定した９６穴プラスチックウエルに、上記ＷＡＦ１試料液及びＷＡＦ１スタンダードのみをそれぞれ１００μｌ／ウェルで加える。ウェルプレートをシールし、室温で２時間インキュベートして、一次抗体と反応させた。
洗浄用バッファー（２０倍濃縮液２５ｍｌを、４７５ｍｌの脱イオン水に加えて調製）、３回洗浄した後、検出用抗体（ビオチン化抗ＷＡＦ１モノクローナル抗体）を１００μｌ／ウェルを加え、ウェルプレートをシールして、室温で１時間、反応させた。
各ウェルを洗浄用バッファーで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン希釈液１００μｌ／ウェルを加え、緩やかに攪拌し、プレートをシールして、室温で３０分間反応させた後、未反応のペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを除去した。
各ウェルを洗浄用バッファーで３回洗浄した後、各ウェルに、基質溶液（色素源基質）１００μｌ加え、室温で３０分間、暗所で反応させる。３０分後、各ウェルに、停止液（２．５Ｎ硫酸）１００μｌ加えて、反応を停止させ、各ウェルの吸光度を、プレートリーダーを用いて、４５０／５４０ｎｍで計測した。
ＷＡＦ１スタンダードよりなる検量線から、ＷＡＦ１試料液中のｐ２１ＷＡＦ１濃度を計算した。
【００６５】
〔実施例１：乳がん細胞のＣＤＫ１比活性に基づく予測判定と抗がん剤治療有効性との関係〕
（１）腫瘍細胞及び検体（細胞可溶化液）の調製
測定用腫瘍細胞として、２５人の乳がん患者の手術のより摘出されたがん組織で、５〜６年保存されたものを使用した。尚、摘出手術前には、抗がん剤治療は行なわれていなかったものである。
これらの２５人の患者は、表１に示すように、摘出手術後、ＣＭＦ群の投与治療を受け、２５人中、Ｎｏ．１〜１６は再発せず、Ｎｏ．１７〜２５が再発した。
【００６６】
【表１】
【００６７】
上記乳がん細胞Ｎｏ．１〜２５のそれぞれについて、０．１ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）（カルビオケム社製）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む溶解緩衝液中で、電動ホモジナイザを用いて上記乳がん細胞をホモジナイズし、細胞溶解液を調製した。
不溶物を１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心除去し、検体となる上清（細胞可溶化液）を得た。
【００６８】
（２）ＣＤＫ１比活性と術後再発の有無との相関関係
（１）で調製した細胞可溶化液について、上記測定方法に従って、ＣＤＫ１活性及びＣＤＫ発現量を測定し、比活性を求めた。
【００６９】
各検体のＣＤＫ１比活性を、図２に示す。閾値（カットオフ値）として９０を設定した場合、比活性が９０以上の８例（Ｎｏ．１，６，９，１１〜１５）は、ＣＭＦ治療が有効であると判定された。表１より、この８例の患者はいずれも再発が確認されなかった。以上より、ＣＤＫ１比活性を測定し、所定の閾値と比較することによって、上記８例（Ｎｏ．１，６，９，１１〜１５）の患者はＣＭＦによる治療が有効であると予測できることがわかった。
【００７０】
〔実施例２：乳がん細胞のＣＤＫ２及びＣＤＫ４発現量に基づく予測判定と抗がん剤治療の有効性との関係〕
実施例１で比活性が９０未満であった患者（患者Ｎｏ．２〜５，７，８，１０及び１６〜２５）のがん細胞を用いて、ＣＤＫ２及びＣＤＫ４の発現量（ｎｇ／μｇ ｌｙｓａｔｅ）を測定した。結果を図３に示す。
【００７１】
ＣＤＫ２の閾値を０．１９、ＣＤＫ４の閾値を３に設定した。ＣＤＫ２の発現量が閾値以上且つＣＤＫ４の発現量が閾値以上の場合は、ＣＭＦ治療が有効であると予測した。また、ＣＤＫ２の発現量が閾値未満又はＣＤＫ４の発現量が閾値未満の場合は、ＣＭＦ治療の有効性が低いと予測した。図３及び表１より、２例の例外を除いて、ＣＤＫ２の発現量が閾値以上且つＣＤＫ４の発現量が閾値以上の場合、ＣＭＦ治療後いずれも再発がなく、ＣＭＦ治療が有効であったと確認された。また、２例の例外を除いて、ＣＤＫ２の発現量が閾値未満又はＣＤＫ４の発現量が閾値未満の場合、ＣＭＦ治療後いずれも再発が認められ、ＣＭＦ治療の有効性が低かったことが確認された。以上より、ＣＤＫ１の比活性に基づく予測によって有効性が判定されない場合であっても、ＣＤＫ２及びＣＤＫ４の発現量に基づいて予測することによって、抗がん剤治療の有効性を高確率で判定できることがわかった。
【００７２】
〔実施例３：マウス異種移植片におけるＣＤＫ２及びｐ２１に基づく予測性判断と抗がん剤治療有効性との関係〕
（１）検体（細胞可溶化液）の調製
５種類のヒト由来乳がん培養細胞（細胞Ａ〜Ｅ）を、マウスの背中の皮下に移植し、２１〜２８日間飼育して、乳がん細胞を生着させた。このようにして得られた、表２に示す乳がん細胞の担がんマウスＮｏ．１〜５０について、背中から２．５ｍｍ×２．５ｍｍの組織片（約５０ｍｇ）を切り取り、０．１ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）（カルビオケム）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む溶解緩衝液中で、電動ホモジナイザを用いて、上記乳がん細胞をホモジナイズし、細胞溶解液を調製した。
不溶物を１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心除去し、検体となる上清（細胞可溶化液）を得た。
【００７３】
（２）ＣＤＫ２比活性の測定及び判定
（１）で調製した細胞可溶化液について、上記ＣＤＫ活性の測定及びＣＤＫ発現量の測定方法に従って、ＣＤＫ２活性及びＣＤＫ２発現量を測定し、ＣＤＫ２比活性を求めた。
【００７４】
（３）ｐ２１発現量の測定
（１）で調製した細胞可溶化液について、上記ｐ２１発現量の測定方法に従って、測定した。
【００７５】
（４）担がんマウスの抗がん剤治療結果
担がんマウスＮｏ．１〜５０に、パクリタキセルを２０ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）／日で、１日１回、５日間、投与し、投与開始から１１日目までの腫瘍サイズを測定した。腫瘍サイズの変化に応じて、Ｎｏ．１〜５０のマウスを、タイプＩ、タイプＩＩ及びタイプＩＩＩのいずれかに分類した。
タイプＩのマウスは、抗がん剤に対する感受性が高いと確認されたマウスであり、このタイプのマウスへパクリタキセルを投与することにより、腫瘍はほぼ消失する。タイプＩＩのマウスは、抗がん剤に対する感受性は中程度であると確認されたマウスであり、このタイプのマウスへパクリタキセルを投与することにより腫瘍サイズの増大が抑制される。タイプＩＩＩのマウスは、抗がん剤の感受性が低いと確認されたマウスであり、このタイプのマウスへパクリタキセルを投与しても腫瘍サイズは増大し続ける。
【００７６】
（５）抗がん剤治療判定及び正誤率
（２）で測定されたＣＤＫ２比活性について、カットオフ値４００に設定して、「Ｈｉｇｈ」（４００以上）及び「Ｌｏｗ」（４００未満）のいずれであるかを判定した。また、（３）で測定されたｐ２１発現量について、カットオフ値８に設定して、「Ｈｉｇｈ］（８以上）及び「Ｌｏｗ」（８未満）のいずれであるかを判定した。
さらに、ＣＤＫ２比活性及びｐ２１発現量に基づいて、図４に示すフローチャートに従って、それぞれのマウスが、薬剤感受性が高いタイプＩ、薬剤感受性が中程度のタイプＩＩ、及び薬剤感受性が低いタイプＩＩＩのいずれに該当するかを予測判定した。それぞれの測定値とともに予測判定結果を、表２に示す。
【００７７】
尚、閾値としては、５０例のパラメータ測定値から抗がん剤治療有効性との関係で正答率が最も高くなるカットオフ値を設定した。
【００７８】
【表２】
【００７９】
表２では、（５）においてＣＤＫ２及びＣＤＫインヒビターを用いた有効性の予測結果（表２中、「予測判定」）と、（４）において実際に抗がん剤を投与した結果（表２中、「抗がん剤治療結果」）とが同じ場合は「正」と示し、異なっている場合は「誤」と示した。
【００８０】
表２に示すように、ＣＤＫ２比活性が閾値（４００）以上（「Ｈｉｇｈ」と判定される）マウスは全てタイプＩに分類され、閾値未満（「Ｌｏｗ」と判定される）マウスは、いずれもタイプＩＩ又はタイプＩＩＩに分類された。従って、ＣＤＫ２の比活性と閾値とを比較することにより、抗がん剤治療が有効であることを１００％の確率で予測することができた。
【００８１】
また、ｐ２１発現量が閾値（８）未満（「Ｌｏｗ」と判定される）マウスは、Ｎｏ．８のマウス（タイプＩＩＩに分類されている）以外、タイプＩ又はタイプＩＩに分類された。ｐ２１発現量が閾値以上のマウスは、Ｎｏ．３７，３８，４１，４２，４７，４８以外、タイプＩＩＩに分類された。従って、ｐ２１発現量と閾値とを比較することにより、抗がん剤治療によって腫瘍が消滅あるいは縮小することを高確率で予測することができた。
【００８２】
また、図４のフローチャートに従って抗がん剤治療の有効性を予測した結果は、（４）による実際の抗がん剤治療の結果と、高確率で整合していた。即ち、表２及び表３に示すように、５０例中、間違ったのは７例（正答率８６％）であったが、特に抗がん剤治療が有効であると判定されるタイプＩ及びＩＩについては、３６例中、間違ったのは１例だけで、正答率９７％であった。
【００８３】
【表３】
【００８４】
以上のように、ＣＤＫ２とＣＤＫインヒビターの２種類を用いて、閾値と比較することによって、抗がん剤治療の有効性を、高確率で予測することができた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、個々の患者について、抗がん剤治療が有効である場合に有効であると判定するもので、有効であると判定された場合には、高確率で有効な治療が期待できるので、抗がん剤治療を行なうか否かの、有用な判断指標として、医療現場で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】細胞周期を説明するための図である。
【図２】乳がん細胞Ｎｏ．１〜２５のＣＤＫ１比活性の測定結果を示す図である。
【図３】実施例１で有効と判定されなかった乳がん細胞のＣＤＫ２及びＣＤＫ４発現量の測定結果を示す散布図である。
【図４】実施例３で採用した有効性予測のフローチャートを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個々のがん患者に対して、抗がん剤治療が有効か否か、とりわけ有効であることを高確率で予測することができる抗がん剤治療の有効性予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの治療方法の一つとして、抗がん剤治療方法がある。しかし、がんの病態は、その種類、発症部位あるいは進行度等により様々であり、こうした多様性と患者個人の応答性の違いは、抗がん剤治療が有効な患者だけでなく、有効でない患者も多く存在する原因となっている。抗がん剤が効かない患者に抗がん剤を投与し続けることは、その抗がん剤の副作用による悪い面だけがクローズアップされることになり、患者には苦痛を強いるだけに成りかねない。
このため、抗がん剤治療に踏み切る場合、その抗がん剤が対象となる患者に効くか効かないかを、治療前に知ることが求められている。
【０００３】
現在、抗がん剤に対する感受性を予測する方法としては、例えば特許文献１に、感受性の違いが遺伝子多型にあるとして、被検細胞のＢＣＲＰの遺伝子多型を同定する、被検細胞の抗がん剤に対する感受性判定方法が開示されている。
【０００４】
ＢＣＲＰは、ＡＢＣトランスポータの１つで、抗がん剤の耐性に関与していることが知られており、またこのＢＣＲＰの発現の個人差が一塩基多型にあることが知られている。このようなことから、特許文献１に開示の感受性判定方法は、患者由来のガン細胞からＤＮＡの塩基配列を調べ、ＢＣＲＰの遺伝子多型を同定し、感受性、副作用の程度を判定するという方法である。
【０００５】
また、特許文献２に、培養がん細胞株の抗がん剤感受性と該細胞のインタクトな状態における遺伝子発現プロファイルに基づき抗がん剤適合性マーカー遺伝子を特定し、特定した抗がん剤適合性マーカー遺伝子と該遺伝子を利用した未知検体の抗がん剤適合性予測方法が開示されている。
【０００６】
この方法では、検体中のがん細胞において、相対的発現量が高い遺伝子群の特定の抗がん剤に対して相関が高い遺伝子群と一致する率が高ければ、該検体はその抗がん剤に対して適合性であると予測し、検体中のがん細胞において相対的発現量が高い遺伝子群が特定の抗がん剤に対して相関が高い遺伝子群と全く一致しなければ、該検体はその抗がん剤に対して適合性が低いと予測するものである。
【０００７】
しかし、この方法で適合と判定されたものであっても、抗がん剤治療が実際に有効であるか否かは８０％程度であるといわれている。有効性が８０％というのは、治療に踏み切るにあたっての指標としては、決して高いといえない。かなりの確実性をもって有効であるといった指標が与えられることが患者にとっては重要である。
【０００８】
一方、がん抑制遺伝子産物であるｐ５３やＲＢタンパク質（網膜芽細胞腫タンパク、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）が、細胞周期制御に関与することが知られ、細胞周期タンパク質とがんとの関係について、近年、研究が進められている。
【０００９】
特許文献３には、細胞周期関連タンパク質を少なくとも２種以上測定し、細胞周期プロファイリングを行なうことにより、薬剤耐性試験及び予後診断が可能となるということは示唆されているが、その具体的方法、効果については一切開示されていない。
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−１９９５８５号
【特許文献２】特開２００３−３０４８８４号
【特許文献３】ＷＯ２００４／０７６６８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、患者がためらうことなく抗がん剤治療に踏み切れるように、特定の抗がん剤治療が有効であることを高確率で予測できる抗がん剤治療の有効性予測方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、実際に患者から採取された腫瘍細胞について、細胞周期関連タンパク質のプロファイリングを種々検討し、さらに実際に抗がん剤治療を行なったときの効果との関係を鋭意検討した結果、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較する工程；及び前記比較工程の結果に基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む。
【００１４】
有効性の予測に採用するサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、１種類であってもよいし（第１の有効性予測方法）、２種類以上であってもよい（第２の有効性予測方法）。
【００１５】
２種類以上のＣＤＫを採用する場合、前記比較工程は、複数のサイクリン依存性キナーゼについて、各キナーゼのパラメータを、それぞれ選択されたパラメータに対応する閾値と比較することにより行ない、前記予測工程は、各キナーゼの比較結果の組み合わせにより、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する方法であってもよいし（第２−１の有効性予測方法）；第１の有効性予測方法の予測工程において前記抗がん治療の有効性が疑われると判定された腫瘍細胞について、第１有効性予測方法で採用したＣＤＫ（第一ＣＤＫ）とは異なるＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択されるパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較することにより、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む方法であってもよい（第２−２の有効性予測方法）。
【００１６】
第２−２の有効性予測方法で、第１ＣＤＫと異なるＣＤＫは、１種類のＣＤＫ（第２ＣＤＫ）であってもよいし、複数種類のＣＤＫを用いてもよい。第２ＣＤＫの場合、第２ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択されるパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較することにより、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む。複数種類のＣＤＫを用いる場合、それぞれのＣＤＫについて、各ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較し、各キナーゼの比較結果の組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する。
【００１７】
さらに、ＣＤＫだけでなく、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の発現量を、対応する閾値と比較し、前記ＣＤＫの比較結果と、前記ＣＤＫインヒビターの比較結果との組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測してもよい（第３の有効性予測方法）。
【００１８】
第１〜第３の有効性予測方法において、前記サイクリン依存性キナーゼは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６からなる群より選択されることが好ましく、第３の有効性予測方法において、前記ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１であることが好ましい。
【００１９】
第１〜第３の有効性予測方法において、前記閾値は、所定のがんに対して所定の抗がん剤が投与された抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータについて、抗がん剤治療結果に基づいて設定されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、実際の抗がん剤治療効果の有無との相関性が大変高く、本発明の予測方法で有効と判定される場合は、ほぼ１００％近く抗がん剤治療が有効な場合に限られるので、抗がん剤治療に踏み切るか否かの指標として優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較する工程；及び前記比較工程の結果に基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む。
【００２２】
本発明の方法で予測する治療の有効性には、術前療法、術後療法の双方が含まれる。術前療法では、原発巣が存在する状態で抗がん剤を投与し続けた結果、原発巣が縮小ないし消失する場合が有効となり、術後療法では、腫瘍の摘出手術を行なった後に抗がん剤を投与し続けた結果、再発しない場合が有効となる。術後療法では、目に見えない転移などに対して、抗がん剤が有効であるかどうかが再発の有無となって現れる。
【００２３】
本発明の予測方法に用いられる試料となる細胞は、患者から採取した腫瘍細胞である。術後療法の場合、手術により摘出された腫瘍組織から腫瘍細胞を得ることができる。術前療法の場合には、患者の腫瘍組織から生検した腫瘍細胞などを用いることができる。
【００２４】
サイクリン依存性キナーゼとは、サイクリンと結合して活性化される酵素群の総称で、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。
【００２５】
ここで、細胞が増殖を開始し、ＤＮＡ複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などの事象を経て、２つの娘細胞となって出発点に戻るまでのサイクルである細胞周期は、図１に示すように、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の４期に分けられる。Ｓ期はＤＮＡの複製期であり、Ｍ期は分裂期である。Ｇ１期は有糸分裂の完了からＤＮＡ合成の開始までの間で、Ｍ期にはいるための準備点検期である。Ｇ１期にある臨界点（動物細胞ではＲ点）をすぎると、細胞周期は始動し、通常途中でとまることなく、一巡する。Ｇ２期は、ＤＮＡ合成の終了から有糸分裂の開始の間である。細胞周期の主なチェックポイントは、Ｇ１期からＳ期にはいる直前、Ｇ２期から有糸分裂への入り口である。特にＧ１期チェックポイントはＳ期開始の引き金をひくため、重要である。Ｇ１期のある点をすぎると、細胞は増殖シグナルがなくなっても、増殖を停止することなく、Ｓ→Ｇ２→Ｍ→Ｇ１と細胞周期を進行させるからである。尚、増殖を停止した細胞で、Ｇ１期のＤＮＡ含量をもった休止期（Ｇ０）があり、細胞周期からはずれた状態にある。増殖誘導により細胞周期内のＧ１期よりやや長い時間の後にＳ期へ進行することができる。
【００２６】
本発明の方法で用いられるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）としては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、及びサイクリンＤ依存性キナーゼなどが挙げられ、がんの種類、抗がん剤の種類に応じて適宜選択される。つまり、がんには種々の種類があり、各患者のがん細胞がもっている細胞周期に関連する性格が抗がん剤治療の有効性に大いに関係するからである。
【００２７】
本明細書における「がん」は、上皮細胞がん、造血器由来のがん、肉腫などを含む。がんの種類としては、例えば、乳がん、胃がん、大腸がん、食道がん、前立腺がん、白血病、骨肉腫等が挙げられる。
【００２８】
本明細書における「抗がん剤」とは、上述のがんに対して抗腫瘍効果のある化学物質のことをいう。
【００２９】
本明細書における「抗がん剤治療」とは、上述の抗がん剤を生体に投与することにより生体の悪性腫瘍を治療することである。
【００３０】
乳がんに対する抗がん剤治療としては、例えばCMF（シクロフォスファミド、メトトレキシエート、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）、ドセタキセル、パクリタキセル等のタキサン系抗がん剤、CE（シクロフォスファミド、エピルビシンの２剤を併用して投与する療法）、AC（ドキソルビシン、シクロフォスファミドの２剤を併用して投与する療法）、CAF（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法）、FEC(フルオロウラシル、エピルビシン、シクロフォスファミドの３剤を併用して投与する療法)、トラスツズマブとパクリタキセルの２剤を併用して投与する療法、カペシタビン等が挙げられ、胃がんに対する抗がん剤治療としては、例えばFAM（フルオロウラシル、ドキソルビシン、マイトマイシンCの３剤を併用して投与する療法）、FAP（フルオロウラシル、ドキソルビシン、シスプラチンの３剤を併用して投与する療法）、ECF（エピルビシン、シスプラチン、フルオロウラシルの３剤を併用して投与する療法）、マイトマイシンCとテガフールの２剤を併用して投与する療法、フルオロウラシルとカルムスチンの２剤を併用して投与する療法等が挙げられ、大腸がんに対する抗がん剤治療としては、例えばフルオロウラシルとロイコボリンの２剤を併用して投与する療法、マイトマイシンとフルオロウラシルの２剤を併用して投与する療法等が挙げられ、卵巣がんに対する抗がん剤治療としては、例えばTP（パクリタキセル、シスプラチンの２剤を併用して投与する療法）、TJ（パクリタキセル、カルボプラチンの２剤を併用して投与する療法）、CP（シクロフォスファミド、シスプラチンの２剤を併用して投与する療法）、CJ（シクロフォスファミド、カルボプラチンの２剤を併用して投与する療法）等が挙げられる。
【００３１】
判定の指標とするのは、ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比から選択される１つ又は２つのパラメータである。活性値と発現量の比は、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量で示されるＣＤＫ比活性であってもよいし、ＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値の値であってもよい。
【００３２】
上記のパラメータを所定の閾値と比較することにより抗がん剤治療が有効か否か判定できる。ここで活性値、発現量および活性値と発現量の比から選択されるパラメータとは、抗がん剤の種類、がんの種類により適宜選択されるパラメータである。このパラメータは、過去に抗がん剤治療が行われ、その結果が判明しているがん患者から抗がん剤治療の前に摘出されて保存されていた腫瘍細胞について、CDKの活性値と発現量を測定し、それぞれのパラメータについて、抗がん剤治療結果を解析し、抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータを抗がん剤の有効性判定に用いるパラメータとして選択したものである。
【００３３】
閾値と比較するパラメータは、所定のCDKにおける１つのパラメータであってもよいし、２つのパラメータの組合せであってもよい。２つのパラメータを選択する場合、それぞれにおけるパラメータをそれぞれの閾値と比較する。
【００３４】
判定の指標となるＣＤＫは、１種類であってもよいし（第１の有効性予測方法）、２種類以上であってもよい（第２の有効性予測方法）。
【００３５】
２種類以上のＣＤＫを採用する場合、複数のCDKについて、それぞれにおけるパラメータをそれぞれの閾値と比較し、各キナーゼの比較結果の組み合わせにより、有効性を予測してもよい（第２−１の有効性予測方法）。この場合、閾値と比較するパラメータの種類は、複数のＣＤＫにおいて、同じ種類のパラメータ（例えば発現量）を用いてもよいし、異なる種類のパラメータ（例えば一方のＣＤＫについては発現量を比較し、他方のＣＤＫについては活性値を比較する）を用いてもよい。
【００３６】
また、複数種類のＣＤＫを採用する場合において、まず第１の有効性予測方法で、第１のＣＤＫに基づいて予測し、第１の有効性予測方法で有効性が疑われると判定された腫瘍細胞に関して、第１のＣＤＫとは異なるＣＤＫについて、活性値、発現量および活性値と発現量との比から選択されるパラメータと、該パラメータに対応する閾値と比較することによって、有効性を予測してもよい（第２−２の有効性予測方法）。第２−２の有効性予測方法で、第１ＣＤＫと異なるＣＤＫは、１種類のＣＤＫ（第２ＣＤＫ）であってもよいし、複数種類のＣＤＫ（第３、第４・・・ＣＤＫ）を用いてもよい。複数種類のＣＤＫを用いる場合、それぞれのＣＤＫについて、各ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較し、これらの比較結果の組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する。
【００３７】
第２のＣＤＫについて、有効性の判定に用いるパラメータは、上記群から選ばれる。パラメータは１つだけ選択してもよいし、２つのパラメータを選択して、それぞれの閾値と比較してもよい。また、異なるＣＤＫとして複数種類のＣＤＫ、すなわち第２、さらには第３、第４のＣＤＫについて測定する場合、判定に使用するパラメータは、全て同種のパラメータ（例えば発現量）を用いてもよいし、異なる種類のパラメータ（例えば第２のＣＤＫは発現量とし、第３のＣＤＫは活性値とするなどの組合わせ）を用いてもよい。
【００３８】
本発明の第２の有効性予測方法は、予測の正答率を上げる点で有効である。さらに第２−２の予測方法により、第１の予測方法で有効であると判定されない場合であっても、抗がん剤治療が有効な場合が少なくないので、第２の有効性予測方法を採用する意義がある。
また、抗がん剤治療の効き方にも、さらに病状が悪化することを防止するレベルと、腫瘍を縮小させて、病状を快方に向かわせることができるレベルとに分類することができ、第２の有効性予測方法、特に第２−２の有効性予測方法により、抗がん剤治療の効き方のレベルを加味した予測を行なうこともできる。
【００３９】
本発明の有効性予測方法は、ＣＤＫだけでなく、さらにサイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の発現量を、対応する閾値と比較し、前記ＣＤＫの比較結果と、前記ＣＤＫインヒビターの比較結果との組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測してもよい（第３の有効性予測方法）。ＣＤＫインヒビターは、サイクリン・ＣＤＫ複合体に結合し、その活性を阻害する因子群で、ＩＮＫ４ファミリーとＣＩＰ／ＫＩＰファミリーに分類される。本発明の有効性予測方法では、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーが好ましく用いられ、特にｐ２１が好ましく用いられる。ｐ２１は、細胞増殖サイクルにおけるＧ１期及びＧ２期チェックポイントの双方で進行を阻害するインヒビターで、損傷したＤＮＡの修復のための時間を与えることができる。
【００４０】
第３の有効性予測方法は、ＣＤＫを所定パラメータについて閾値と比較した結果と、ＣＤＫインヒビターの発現量を閾値と比較した結果の組み合わせに基づいて、抗がん剤治療の有効性を予測してもよいし、第１段階でＣＤＫを所定パラメータについて閾値と比較し、有効性を予測判定した（第１の有効性予測方法）後、有効であると判定されなかった腫瘍細胞について、第２段階でＣＤＫインヒビターの発現量を閾値と比較し、有効である可能性が高いものを選び出すようにしてもよい。
【００４１】
尚、ＣＭＦ投与の治療有効性予測因子として、Ｈｅｒ２やｐ２１が報告されている。Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（ＩＢＣＳＧ）のトライアルでは、Ｈｅｒ２が過剰発現している乳がん患者に対してＣＭＦ投与が無効であることが示され、ｐ２１に関しては、ｐ２１高発現患者群における無病生存率が、低発現患者群よりも有意に悪いことが報告されている。しかし、Ｈｅｒ２，ｐ２１ともにＣＭＦ療法に対する効果の低い患者群に予測する因子であり、積極的に治療効果のある患者群を予測する因子の報告例はない。一方、本発明の予測方法は、有効であることを積極的に示すもので、しかも閾値を厳格にすることで、１００％に近い有効性を期待できる場合を提示することができる。
【００４２】
本発明の有効性予測方法において、閾値は、抗がん剤の種類、がんの種類により適宜設定される値である。具体的には所定のがんに対して所定の抗がん剤を投与した抗がん剤治療結果と上記のパラメータとの関係を、多くの抗がん剤治療結果について調べ、多数の抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータに関して、その抗がん剤治療結果が有効であった場合を選択できるように設定された値である。好ましくは抗がん剤治療結果が全て有効であった場合のみを選択できるように閾値を設定する。このように、実際の臨床治療結果に基づいて閾値の設定が行われるため、確度の高い有効性の判定が可能となる。閾値の設定に用いる臨床治療結果の数を増加させることにより、有効性判定の確度を向上させることができる。なお、抗がん剤治療結果としては、所定の抗がん剤治療を続けることにより生じた腫瘍サイズの変化や、抗がん剤投与を５〜６年続けて再発の有無を調べた結果等が挙げられる。
【００４３】
ＣＤＫ活性値とは、試料中に含まれるＣＤＫにより基質に導入されたリン酸量に基づく値であり、リン酸量を測定する際に用いられた標識物（例えば３２Ｐ、蛍光）の標準品の測定値から定量的に計算される値（単位をU（ユニット）で表す）である。具体的には、検体の細胞可溶化液から活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）を用いて、基質タンパク質に３２Ｐを取り込ませ、標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとに定量する方法がある。また放射性物質の標識を用いない方法としては、特開２００２−３３５９９７号に開示の方法が挙げられる。この方法は、検体の細胞可溶化液から、目的の活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質を反応させて、該基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量（標識蛍光物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。
【００４４】
活性測定に供する試料は、検体の細胞可溶化液から目的のＣＤＫを特異的に採集することにより調製する。この場合、目的のＣＤＫに特異的な抗ＣＤＫ抗体を用いて調製してもよいし、特定のサイクリン依存性キナーゼ（例えばサイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、サイクリンＥ依存性キナーゼ）活性測定の場合には、抗サイクリン抗体を用いて調製する。いずれの場合も活性型ＣＤＫ以外のＣＤＫが試料に含まれることになる。例えばサイクリン・ＣＤＫ複合体にＣＤＫインヒビターが結合した複合体も含まれる。また、抗ＣＤＫ抗体を用いた場合には、ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体などが含まれる。従って、活性値は、活性型、不活性型、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質の単位（Ｕ）として測定される。
【００４５】
ＣＤＫ発現量とは、細胞可溶化液から測定される目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよいし、特開２００３−１３０８７１号に開示の方法で測定することもできる。目的のタンパク質（ＣＤＫ）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、抗ＣＤＫ１抗体を用いることにより、細胞内に存在するＣＤＫ１のすべて（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体を含む）を捕捉できる。
【００４６】
細胞可溶化液は、腫瘍細胞を含む組織などの生体試料を用いて調製することができる。具体的には、生体試料に緩衝液を添加し、緩衝液中の生体試料をホモジナイズして細胞膜内又は核膜内に存在する物質を緩衝液中に遊離させる。得られたホモジネートを遠心分離して採取される上清を細胞可溶化液とすることができる。この細胞可溶化液には、細胞膜内又は核膜内に存在するタンパク質などの分子が含まれている。遠心分離前及び／又は遠心分離後に、タンパク質の生成や抽出などの処理を行なっていてもよい。上述の緩衝液には、界面活性剤、プロテアーゼインヒビターなどを適宜添加してもよい。
【００４７】
尚、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量（ＣＤＫ比活性）、又はＣＤＫ発現量／ＣＤＫ活性値で示される比は、細胞に存在しているＣＤＫのうち、活性を示すＣＤＫの割合に相当し、測定対象である腫瘍細胞が固有のものとして示す増殖状態に基づくＣＤＫ活性レベルといえ、測定に供する試料の調製方法に依存しない。測定試料調製方法、特に生検材料から調製される細胞可溶化液は、実際に採取された組織中に含まれる非細胞性組織、例えば細胞外基質の多寡による影響をうけやすい。従って、ＣＤＫ活性値と発現量との比を用いることにより、測定試料調製時に不可避の影響を控除することができ、タンパク質に着目した判定方法であっても、高精度に有効性を判定することができる。
【００４８】
ＣＤＫインヒビター発現量とは、細胞可溶化液から測定される目的のＣＤＫインヒビター量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよい。目的のタンパク質（ＣＤＫインヒビター）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。目的のタンパク質と特異的に結合できるものであれば、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。例えば、ｐ２１を捕捉する場合、抗ｐ２１モノクローナル抗体、抗ｐ２１ポリクローナル抗体のいずれも用いることができる。
【実施例】
【００４９】
はじめに、下記実施例で用いた測定方法について説明する。
〔測定方法〕
（１）ＣＤＫ活性の測定
目的とする腫瘍細胞を含む組織から調製した検体（細胞可溶化液）から、１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに、５００μｌの溶解緩衝液中に溶解物の全タンパク質量が１００μｇとなる量を加えて試料を調製した。
活性測定しようとするＣＤＫに特異的抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社のポリクローナル抗ＣＤＫ１抗体又はポリクローナル抗ＣＤＫ２抗体）２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（バイオラッド社製）を、上記サンプルに加えて４℃で１時間反応させた後、ビーズを緩衝液（０．１％ＮＰ−４０、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．０）で３回洗浄し、１５μｌのキナーゼ緩衝液中に再懸濁させて、目的のＣＤＫが結合したビーズを含む試料を得た。
【００５０】
この試料においては、ＣＤＫ単体、サイクリン結合した活性型ＣＤＫ、活性型ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの複合体の全て（以下、これらを区別しないときは「ＣＤＫ群」という）がＣＤＫ特異的抗体により捕捉され、ビーズに結合した状態となっている。このような試料中のＣＤＫ群の活性を、下記方法により測定した。
【００５１】
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２に対応する基質であるヒストンＨ１（アップステイトバイオテクノロジー製）１０μｇ、５ｍＭのアデノシン５’−Ｏ−（８−チオ３リン酸）（ＡＴＰ−γＳ、シグマ社製）、及び緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含む基質溶液を調製し、この基質溶液を上記ＣＤＫ含有試料に加えて５０μｌとし、３７℃で１０分間振とうしてインキュベートした。下記式に示すように、基質のセリン又はスレオニン残基が、活性型ＣＤＫによりリン酸化され、モノチオリン酸化基質が得られる。
【００５２】
【化１】
【００５３】
反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心して、ビーズを沈殿させ、モノチオリン酸を溶解した上澄み液１８μｌを採取した。この上澄み液１８μｌに、１５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ９．２、５ｍＭのＥＤＴＡを含む結合緩衝液１５μｌを加えた。さらに、１０ｍＭのヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で暗所において９０分間室温にてインキュベートすることにより、モノチオリン酸化基質のチオリン酸中の硫黄をビオチン化標識した。ヨードアセチルビオチンとチオリン酸との反応の停止は、６−メルカプトエタノールの添加により行った。
【００５４】
ビオチン標識されたチオリン酸化基質０．４μｇを、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦ膜上に添加し、吸引した。得られた膜を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロックし、アビジン−ＦＩＴＣ（ベクター製）を３７℃で１時間反応させた。その後、膜を５０ｍＭ ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１０分間３回洗浄した。洗浄後、膜上のイメージを蛍光イメージアナライザー（バイオラッド社製）により分析した。活性は、検量線に基づいて算出した。
【００５５】
尚、検量線は、既存量のタンパク質（ビオチン標識免疫グロブリン）をPVDF膜上に吸着させ、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、タンパク質の蛍光強度を蛍光イメージアナライザー（バイオラッド社製）で測定することにより作成した。従って、測定されるCDK活性１Uは、前記タンパク質１ngのときの蛍光量と同等の蛍光強度を示す値をいう。
【００５６】
（２）ＣＤＫ発現量の測定
ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に浸漬して初期化したＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたスロットブロッターの各ウェル（２×２×３ｍｍ、許容量１００μｌ）に、目的の腫瘍細胞を含む組織から調製した細胞可溶化液を５０μｌずつ注入した。各ウェルには、タンパク質が総量で５〜１５μｇずつ含まれている。
【００５７】
注入後、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約１５０ｍｍＨｇで約５０秒間吸引し、膜に試料を吸着させた。
【００５８】
次いで、試料に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体又はウサギ抗ＣＤＫ２抗体（一次抗体）の溶液を、各ウェルに注入し、室温で約３０分間静置した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。
【００５９】
次に、ビオチン化した抗ウサギ抗体（二次抗体）の溶液を各ウェルに注入し、室温で約３０分間静置した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。
【００６０】
ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン試薬を４０μｌずつ注入し、約３０分間室温で静置して、二次抗体をＦＩＴＣで標識した。ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約５０秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。
【００６１】
ＰＶＤＦメンブレンをプレートから取外して蒸留水で洗浄し、２０％メタノールに５分間浸漬した。次いで、約１５分間室温で乾燥させた後、膜に吸着されたタンパク質の蛍光強度を、イメージアナライザ（バイオラッド社）によって分析、測定し、予め作成した検量線をもとに、ＦＩＴＣ標識されたタンパク質（ＣＤＫ１又はＣＤＫ２又はＣＤＫ４）を定量（ＣＤＫ個数に対応する量を標準タンパク質の重量（ｎｇ）で換算）した。このようにして測定されるＣＤＫ量は、細胞中に存在しているＣＤＫ群（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体など）の総量である。
【００６２】
尚、検量線は、０．００５％のＮＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＴＢＳ中に、５種類の濃度の純品の組換えＣＤＫタンパク質の溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度と量の関係を表すことにより標準曲線を作成した。
【００６３】
（３）ＣＤＫ比活性の算出
上記で測定したＣＤＫ活性及びＣＤＫ発現量の測定値から、下記式により、ＣＤＫ比活性（ｍＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量
【００６４】
（４）ｐ２１の発現量
ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭｐ２１ＷＡＦ１ ＥＬＩＳＡキット（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。
ＷＡＦ１スタンダード（２０ユニット／ｍｌのｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅされたＷＡＦ１）を、検体である細胞可溶化液で段階的に希釈したｗａｆ１試料液（ＷＡＦ１スタンダードと検体の混合液）を調製する。なお、各試料液において、細胞可溶化液は４倍以上希釈されたものとなっている。
ＷＡＦ１に特異的なウサギポリクローナル抗体（一次抗体）を固定した９６穴プラスチックウエルに、上記ＷＡＦ１試料液及びＷＡＦ１スタンダードのみをそれぞれ１００μｌ／ウェルで加える。ウェルプレートをシールし、室温で２時間インキュベートして、一次抗体と反応させた。
洗浄用バッファー（２０倍濃縮液２５ｍｌを、４７５ｍｌの脱イオン水に加えて調製）、３回洗浄した後、検出用抗体（ビオチン化抗ＷＡＦ１モノクローナル抗体）を１００μｌ／ウェルを加え、ウェルプレートをシールして、室温で１時間、反応させた。
各ウェルを洗浄用バッファーで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン希釈液１００μｌ／ウェルを加え、緩やかに攪拌し、プレートをシールして、室温で３０分間反応させた後、未反応のペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンを除去した。
各ウェルを洗浄用バッファーで３回洗浄した後、各ウェルに、基質溶液（色素源基質）１００μｌ加え、室温で３０分間、暗所で反応させる。３０分後、各ウェルに、停止液（２．５Ｎ硫酸）１００μｌ加えて、反応を停止させ、各ウェルの吸光度を、プレートリーダーを用いて、４５０／５４０ｎｍで計測した。
ＷＡＦ１スタンダードよりなる検量線から、ＷＡＦ１試料液中のｐ２１ＷＡＦ１濃度を計算した。
【００６５】
〔実施例１：乳がん細胞のＣＤＫ１比活性に基づく予測判定と抗がん剤治療有効性との関係〕
（１）腫瘍細胞及び検体（細胞可溶化液）の調製
測定用腫瘍細胞として、２５人の乳がん患者の手術のより摘出されたがん組織で、５〜６年保存されたものを使用した。尚、摘出手術前には、抗がん剤治療は行なわれていなかったものである。
これらの２５人の患者は、表１に示すように、摘出手術後、ＣＭＦ群の投与治療を受け、２５人中、Ｎｏ．１〜１６は再発せず、Ｎｏ．１７〜２５が再発した。
【００６６】
【表１】
【００６７】
上記乳がん細胞Ｎｏ．１〜２５のそれぞれについて、０．１ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）（カルビオケム社製）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む溶解緩衝液中で、電動ホモジナイザを用いて上記乳がん細胞をホモジナイズし、細胞溶解液を調製した。
不溶物を１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心除去し、検体となる上清（細胞可溶化液）を得た。
【００６８】
（２）ＣＤＫ１比活性と術後再発の有無との相関関係
（１）で調製した細胞可溶化液について、上記測定方法に従って、ＣＤＫ１活性及びＣＤＫ発現量を測定し、比活性を求めた。
【００６９】
各検体のＣＤＫ１比活性を、図２に示す。閾値（カットオフ値）として９０を設定した場合、比活性が９０以上の８例（Ｎｏ．１，６，９，１１〜１５）は、ＣＭＦ治療が有効であると判定された。表１より、この８例の患者はいずれも再発が確認されなかった。以上より、ＣＤＫ１比活性を測定し、所定の閾値と比較することによって、上記８例（Ｎｏ．１，６，９，１１〜１５）の患者はＣＭＦによる治療が有効であると予測できることがわかった。
【００７０】
〔実施例２：乳がん細胞のＣＤＫ２及びＣＤＫ４発現量に基づく予測判定と抗がん剤治療の有効性との関係〕
実施例１で比活性が９０未満であった患者（患者Ｎｏ．２〜５，７，８，１０及び１６〜２５）のがん細胞を用いて、ＣＤＫ２及びＣＤＫ４の発現量（ｎｇ／μｇ ｌｙｓａｔｅ）を測定した。結果を図３に示す。
【００７１】
ＣＤＫ２の閾値を０．１９、ＣＤＫ４の閾値を３に設定した。ＣＤＫ２の発現量が閾値以上且つＣＤＫ４の発現量が閾値以上の場合は、ＣＭＦ治療が有効であると予測した。また、ＣＤＫ２の発現量が閾値未満又はＣＤＫ４の発現量が閾値未満の場合は、ＣＭＦ治療の有効性が低いと予測した。図３及び表１より、２例の例外を除いて、ＣＤＫ２の発現量が閾値以上且つＣＤＫ４の発現量が閾値以上の場合、ＣＭＦ治療後いずれも再発がなく、ＣＭＦ治療が有効であったと確認された。また、２例の例外を除いて、ＣＤＫ２の発現量が閾値未満又はＣＤＫ４の発現量が閾値未満の場合、ＣＭＦ治療後いずれも再発が認められ、ＣＭＦ治療の有効性が低かったことが確認された。以上より、ＣＤＫ１の比活性に基づく予測によって有効性が判定されない場合であっても、ＣＤＫ２及びＣＤＫ４の発現量に基づいて予測することによって、抗がん剤治療の有効性を高確率で判定できることがわかった。
【００７２】
〔実施例３：マウス異種移植片におけるＣＤＫ２及びｐ２１に基づく予測性判断と抗がん剤治療有効性との関係〕
（１）検体（細胞可溶化液）の調製
５種類のヒト由来乳がん培養細胞（細胞Ａ〜Ｅ）を、マウスの背中の皮下に移植し、２１〜２８日間飼育して、乳がん細胞を生着させた。このようにして得られた、表２に示す乳がん細胞の担がんマウスＮｏ．１〜５０について、背中から２．５ｍｍ×２．５ｍｍの組織片（約５０ｍｇ）を切り取り、０．１ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）（カルビオケム）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む溶解緩衝液中で、電動ホモジナイザを用いて、上記乳がん細胞をホモジナイズし、細胞溶解液を調製した。
不溶物を１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心除去し、検体となる上清（細胞可溶化液）を得た。
【００７３】
（２）ＣＤＫ２比活性の測定及び判定
（１）で調製した細胞可溶化液について、上記ＣＤＫ活性の測定及びＣＤＫ発現量の測定方法に従って、ＣＤＫ２活性及びＣＤＫ２発現量を測定し、ＣＤＫ２比活性を求めた。
【００７４】
（３）ｐ２１発現量の測定
（１）で調製した細胞可溶化液について、上記ｐ２１発現量の測定方法に従って、測定した。
【００７５】
（４）担がんマウスの抗がん剤治療結果
担がんマウスＮｏ．１〜５０に、パクリタキセルを２０ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）／日で、１日１回、５日間、投与し、投与開始から１１日目までの腫瘍サイズを測定した。腫瘍サイズの変化に応じて、Ｎｏ．１〜５０のマウスを、タイプＩ、タイプＩＩ及びタイプＩＩＩのいずれかに分類した。
タイプＩのマウスは、抗がん剤に対する感受性が高いと確認されたマウスであり、このタイプのマウスへパクリタキセルを投与することにより、腫瘍はほぼ消失する。タイプＩＩのマウスは、抗がん剤に対する感受性は中程度であると確認されたマウスであり、このタイプのマウスへパクリタキセルを投与することにより腫瘍サイズの増大が抑制される。タイプＩＩＩのマウスは、抗がん剤の感受性が低いと確認されたマウスであり、このタイプのマウスへパクリタキセルを投与しても腫瘍サイズは増大し続ける。
【００７６】
（５）抗がん剤治療判定及び正誤率
（２）で測定されたＣＤＫ２比活性について、カットオフ値４００に設定して、「Ｈｉｇｈ」（４００以上）及び「Ｌｏｗ」（４００未満）のいずれであるかを判定した。また、（３）で測定されたｐ２１発現量について、カットオフ値８に設定して、「Ｈｉｇｈ］（８以上）及び「Ｌｏｗ」（８未満）のいずれであるかを判定した。
さらに、ＣＤＫ２比活性及びｐ２１発現量に基づいて、図４に示すフローチャートに従って、それぞれのマウスが、薬剤感受性が高いタイプＩ、薬剤感受性が中程度のタイプＩＩ、及び薬剤感受性が低いタイプＩＩＩのいずれに該当するかを予測判定した。それぞれの測定値とともに予測判定結果を、表２に示す。
【００７７】
尚、閾値としては、５０例のパラメータ測定値から抗がん剤治療有効性との関係で正答率が最も高くなるカットオフ値を設定した。
【００７８】
【表２】
【００７９】
表２では、（５）においてＣＤＫ２及びＣＤＫインヒビターを用いた有効性の予測結果（表２中、「予測判定」）と、（４）において実際に抗がん剤を投与した結果（表２中、「抗がん剤治療結果」）とが同じ場合は「正」と示し、異なっている場合は「誤」と示した。
【００８０】
表２に示すように、ＣＤＫ２比活性が閾値（４００）以上（「Ｈｉｇｈ」と判定される）マウスは全てタイプＩに分類され、閾値未満（「Ｌｏｗ」と判定される）マウスは、いずれもタイプＩＩ又はタイプＩＩＩに分類された。従って、ＣＤＫ２の比活性と閾値とを比較することにより、抗がん剤治療が有効であることを１００％の確率で予測することができた。
【００８１】
また、ｐ２１発現量が閾値（８）未満（「Ｌｏｗ」と判定される）マウスは、Ｎｏ．８のマウス（タイプＩＩＩに分類されている）以外、タイプＩ又はタイプＩＩに分類された。ｐ２１発現量が閾値以上のマウスは、Ｎｏ．３７，３８，４１，４２，４７，４８以外、タイプＩＩＩに分類された。従って、ｐ２１発現量と閾値とを比較することにより、抗がん剤治療によって腫瘍が消滅あるいは縮小することを高確率で予測することができた。
【００８２】
また、図４のフローチャートに従って抗がん剤治療の有効性を予測した結果は、（４）による実際の抗がん剤治療の結果と、高確率で整合していた。即ち、表２及び表３に示すように、５０例中、間違ったのは７例（正答率８６％）であったが、特に抗がん剤治療が有効であると判定されるタイプＩ及びＩＩについては、３６例中、間違ったのは１例だけで、正答率９７％であった。
【００８３】
【表３】
【００８４】
以上のように、ＣＤＫ２とＣＤＫインヒビターの２種類を用いて、閾値と比較することによって、抗がん剤治療の有効性を、高確率で予測することができた。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明の抗がん剤治療の有効性予測方法は、個々の患者について、抗がん剤治療が有効である場合に有効であると判定するもので、有効であると判定された場合には、高確率で有効な治療が期待できるので、抗がん剤治療を行なうか否かの、有用な判断指標として、医療現場で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】細胞周期を説明するための図である。
【図２】乳がん細胞Ｎｏ．１〜２５のＣＤＫ１比活性の測定結果を示す図である。
【図３】実施例１で有効と判定されなかった乳がん細胞のＣＤＫ２及びＣＤＫ４発現量の測定結果を示す散布図である。
【図４】実施例３で採用した有効性予測のフローチャートを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較する工程；及び
前記比較工程の結果に基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程；
を含む抗がん剤治療の有効性予測方法。
【請求項２】
前記比較工程は、複数のサイクリン依存性キナーゼについて、各キナーゼのパラメータを、それぞれ選択されたパラメータに対応する閾値と比較することにより行ない、
前記予測工程は、各キナーゼの比較結果の組み合わせにより、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する、
請求項１に記載の有効性予測方法。
【請求項３】
請求項１に記載の予測工程において、前記抗がん剤治療の有効性が疑われると判定された腫瘍細胞について、
前記サイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）とは異なる第二サイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つの第２パラメータと、該第２パラメータに対応する閾値とを比較することにより、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む抗がん剤治療の有効性予測方法。
【請求項４】
請求項１に記載の予測工程において、前記抗がん剤治療の有効性が疑われると判定された腫瘍細胞について、
前記サイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）とは異なる複数のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）それぞれについて、各ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較し、各キナーゼの比較結果の組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む抗がん剤治療の有効性予測方法。
【請求項５】
さらに、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の発現量を、対応する閾値と比較し、
前記予測工程は、前記ＣＤＫの比較結果と、前記ＣＤＫインヒビターの比較結果との組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する、
請求項１に記載の有効性予測方法。
【請求項６】
前記サイクリン依存性キナーゼが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６からなる群より選択される請求項１〜６のいずれかに記載の有効性予測方法。
【請求項７】
前記ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１である請求項５に記載の有効性予測方法。
【請求項８】
前記閾値は、所定のがんに対して所定の抗がん剤が投与された抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータについて、抗がん剤治療結果に基づいて設定される請求項１〜７のいずれかに記載の有効性予測方法。
【請求項１】
患者から採取した腫瘍細胞のサイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、選択されたパラメータに対応する閾値とを比較する工程；及び
前記比較工程の結果に基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程；
を含む抗がん剤治療の有効性予測方法。
【請求項２】
前記比較工程は、複数のサイクリン依存性キナーゼについて、各キナーゼのパラメータを、それぞれ選択されたパラメータに対応する閾値と比較することにより行ない、
前記予測工程は、各キナーゼの比較結果の組み合わせにより、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する、
請求項１に記載の有効性予測方法。
【請求項３】
請求項１に記載の予測工程において、前記抗がん剤治療の有効性が疑われると判定された腫瘍細胞について、
前記サイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）とは異なる第二サイクリン依存性キナーゼの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つの第２パラメータと、該第２パラメータに対応する閾値とを比較することにより、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む抗がん剤治療の有効性予測方法。
【請求項４】
請求項１に記載の予測工程において、前記抗がん剤治療の有効性が疑われると判定された腫瘍細胞について、
前記サイクリン依存性キナーゼ（第一ＣＤＫ）とは異なる複数のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）それぞれについて、各ＣＤＫの活性値、発現量、及び活性値と発現量との比からなる群より選択される少なくとも１つのパラメータと、該パラメータに対応する閾値とを比較し、各キナーゼの比較結果の組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する工程を含む抗がん剤治療の有効性予測方法。
【請求項５】
さらに、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の発現量を、対応する閾値と比較し、
前記予測工程は、前記ＣＤＫの比較結果と、前記ＣＤＫインヒビターの比較結果との組み合わせに基づいて、前記患者の抗がん剤治療の有効性を予測する、
請求項１に記載の有効性予測方法。
【請求項６】
前記サイクリン依存性キナーゼが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６からなる群より選択される請求項１〜６のいずれかに記載の有効性予測方法。
【請求項７】
前記ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１である請求項５に記載の有効性予測方法。
【請求項８】
前記閾値は、所定のがんに対して所定の抗がん剤が投与された抗がん剤治療結果と相関のあるパラメータについて、抗がん剤治療結果に基づいて設定される請求項１〜７のいずれかに記載の有効性予測方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００７−６８８２（Ｐ２００７−６８８２Ａ）
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−４３３７（Ｐ２００６−４３３７）
【出願日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１月１８日（２００７．１．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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