抗ルイスＹ抗イディオタイプ抗体およびその使用
本発明は、抗ルイスＹモノクローナル抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。本発明は、ｈｕ３Ｓ１９３の可変領域に対して特異的に結合するハイブリドーマクローンによって生成されるｍＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング法、およびルイスＹ抗原に対するｈｕ３Ｓ１９３結合を阻害する抗イディオタイプｍＡｂの能力にも関する。また、本発明は、抗ルイスＹモノクローナル抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を生成することが可能なハイブリドーマを提供する。本発明の別の態様は、ＬＭＨ−１、ＬＭＨ−２、ＬＭＨ−３、またはＬＭＨ−４より成る群から選択される抗ルイスＹモノクローナル抗体に特異的であるハイブリドーマを提供することである。本発明は、本発明の抗体を使用するＨＡＭＡ、ＨＡＣＡ、およびＨＡＨＡ反応を検出する方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野、かつより具体的には抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
２５年前のモノクロナール抗体（ｍＡｂ）技術の出現は、有用な研究用試薬の膨大なレパートリーを提供し、癌療法、自己免疫疾患、移植による拒絶反応、抗ウイルス予防における承認された医薬試薬として、および抗血栓剤として抗体を使用する機会を創造した（グレニー（Ｇｌｅｎｎｉｅ）とジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、２０００年）。マウスｍＡｂをキメラｍＡｂ（マウスＶ領域、ヒトＣ領域）およびｍＡｂ相補性決定領域（ＣＤＲ）のみがマウス由来であるヒト化試薬へ変換する分子工学の応用は、ｍＡｂ療法の臨床的成功に重要であった。工学的ｍＡｂは、免疫原性を大幅に削減または遠ざけ、血清中半減を増大させ、ｍＡｂのヒトＦｃ部分は補体および細胞毒性細胞の免疫エフェクターを補充する可能性を増大させる（クラーク（Ｃｌａｒｋ）、２０００年）。生体内分布、薬物動態、および臨床的に投与されるｍＡｂに対する免疫反応の誘導に対する調査には、医薬と内因性タンパク質とを区別する分析の開発が必要である。
【０００３】
抗体は通常、それが認識する抗原に関して定義される。特定の抗原に対する抗体の特異性は、その抗原結合部位、抗原に接触する抗体分子の異なる領域よって判定される。この部位は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域内に存在する。しかし、抗体は、抗体分子の単一特異的集団の独自の重鎖および軽鎖領域と関連した、そのイディオタイプ、イディオトープの集合体、または表面マーカーによっても定義される。抗体に特有の抗原決定基はイディオトープと呼ばれ、イディオトープを有する抗体との抗イディオタイプ抗体の反応によって定義される。イディオタイプは、研究者が免疫反応および遺伝性免疫グロブリン遺伝子における特定の抗体の外観および持続性を追跡できるという点で有用なマーカーである。イディオタイプは、抗イディオタイプ抗体の産生を促進しうる固有の決定基でもある。
【０００４】
抗イディオタイプ抗体は、他の抗体の可変領域に結合し、免疫系において、内部（自己）抗原に対して生じる結合抗体における主要な役割を果たす（ジェルネ（Ｊｅｒｎｅ）、１９７４年）。イディオタイプ抗体を誘発する可変領域によって誘発される抗イディオタイプ抗体は、３つのカテゴリー、すなわち、１）抗原結合部位（パラトープ）におけるエピトープの認識、２）パラトープ近く結合およびイディオタイプ抗体−抗原相互作用の立体的干渉、または３）イディオタイプ抗体（「内部イメージ」抗イディオタイプ抗体）によって認識される抗原の構造的模倣のうちの１つでありうる。後者のカテゴリーの抗イディオタイプは、細菌、ウイルス、および寄生虫感染に加えて腫瘍関連抗原に対する宿主の免疫反応の修飾におけるその可能性が与えられるワクチンとして生成および調査されている（バッタチャリヤ−チャタジー（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）、チャタジー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）ら、２００１年で概説）。齧歯類抗イディオタイプ抗体は、補助剤、および担体、通常、誘発される免疫または抗腫瘍反応に対するキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）との抱合を必要とする。
【０００５】
抗イディオタイプ抗体は、以下、ＥＬＩＳＡと称される酵素免疫測定、注入イディオタイプ抗体の患者の血清レベルを検出するための免疫療法治験における試薬、または投与されるイディオタイプ抗体に対する免疫反応としても利用されうる。かかる免疫反応としては、ヒト抗マウス抗体、ヒト抗キメラ抗体、およびヒト抗ヒト化抗体（以下、それぞれ、ＨＡＭＡ、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡと呼ぶ）が挙げられる。抗イディオタイプ抗体ＮＵＨ−８２は、ヒト腎細胞癌におけるＧ２５０抗原を認識するマウスｍＡｂ Ｇ２５０の結合部位に対するものである（ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）、オカジマ（Ｏｋａｊｉｍａ）ら、１９９４年）。ＮＵＨ−８２は、ｃＧ２５０抗体放射免疫療法を受ける患者におけるＨＡＣＡ反応の測定に有用であることが証明されたが（ステフェンス（ｓｔｅｆｆｅｎｓ）、ボーマン（Ｂｏｅｒｍａｎ）ら、１９９７年）、最近になって、ＮＵＨ−８２は薬物動態分析のために患者の血清におけるｃＧ２５０の血清レベルを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて使用されている（リュー（Ｌｉｕ）、スミス（Ｓｍｙｔｈ）ら、２００２年）。
【０００６】
ｈｕ３Ｓ１９３抗体は、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、および卵巣癌を含む上皮腫瘍を発現するルイスＹ、ジフコシル化炭水化物抗原を標的するために開発された（キタムラ（Ｋｉｔａｍｕｒａ）、ストッカート（Ｓｔｏｃｋｅｒｔ）ら、１９９４年、スコット（Ｓｃｏｔｔ）、ゲレイク（Ｇｅｌｅｉｃｋ）ら、２０００年）。ルイスＹは、上皮由来の腫瘍細胞、例えば、肺癌、腸癌、乳癌、前立腺癌、または卵巣癌の表面上に発現される炭水化物分子である。ルイスＹ抗原は、正常組織において発現されるが、発現レベルは一部の腫瘍型においてより高く、抗原は一部の乳癌、結腸癌、胃癌、食道癌、膵癌、十二指腸癌、肺癌、膀胱癌、および腎癌のほか、胃および島細胞神経内分泌系腫瘍の細胞のマーカーとして使用されうる。ルイスＹ関連関連抗原は、その高い密度と一次および転移性病変における同質の発現により免疫療法の魅力的な標的である（キム（Ｋｉｍ）、ユアン（Ｙｕａｎ）ら、１９８６年、サカモト（Ｓａｋａｍｏｔｏ）ら、１９８６年、チャン（Ｚｈａｎｇ）、コードン−カルド（Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ）ら、１９９７年）。
【０００７】
ｈｕ３Ｓ１９３は、インビトロで強いＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘発し、前臨床試験における選択充実腫瘍の免疫療法として有望であることが証明されおり（クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）、リー（Ｌｅｅ）ら、２０００年ｂ、クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）、リー（Ｌｅｅ）ら、２０００年ａ）、現在、第Ｉ相用量増加臨床試験中である。前臨床生体内分布試験では放射性標識ｈｕ３Ｓ１９３がトレースされ、乳癌の動物モデルにおける安定化した放射性抱合体の腫瘍ターゲティング能を評価した（クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）、リー（Ｌｅｅ）ら、２０００年ａ）。病院では、ｈｕ３Ｓ１９３などｍＡｂが放射性標識リングを使用してトレースされ、生体内分布および腫瘍イメージング、および血清からの放射性抱合体のクリアランスをｍＡｂ薬物動態の尺度として評価することができる（クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）、リー（Ｌｅｅ）ら、２０００年ａ、スコット（Ｓｃｏｔｔ）、ゲレイク（Ｇｅｌｅｉｃｋ）ら、２０００年、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）、スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら、２００１年）。しかし、臨床症状の非存在下には、ＨＡＨＡ免疫反応を検出することはできない。
【０００８】
ｈｕ３Ｓ１９３の免疫エフェクター機能を考えると、初期治験における投与抗体の血清レベルの測定は将来の治療方式の計画を補助し、非標識ｈｕ３Ｓ１９３の薬物動態の測定を可能にすると同時に、ＨＡＨＡを測定する能力はｈｕ３Ｓ１９３の安全性評価を補助するであろう。
【０００９】
具体的には、本発明は、それらが患者の循環において認識する投与イディオタイプの薬物動態をモニタリングするための診断用試薬として免疫療法治験における抗イディオタイプの使用にも関する。同様に、抗イディオタイプは、投与されたイディオタイプｍＡｂに対するＨＡＨＡ、ＨＡＣＡ、またはＨＡＭＡ免疫反応の陽性対照として使用されうる。かかる免疫反応は、患者集団の一部における臨床結果に対して全く影響を与えないか（グルーバー（Ｇｒｕｂｅｒ）、ヴァンハーレム（ｖａｎ Ｈａａｒｌｅｍ）ら、２０００年）、またはその後の治療を不可能にする免疫療法のｍＡｂの薬物動態および生体内分布における過敏反応および劇的な変化と関連しうる（クラーク（Ｃｌａｒｋ）、２０００年）。
【００１０】
（図面の簡単な記載）
図１Ａ−Ｂ：抗−ｈｕ３Ｓ１９３モノクロナール抗体、ＬＭＨ−１（●）、−２（▽）、−３（◇）、および抗−ｈｕＩｇＧ−４（◇）の結合特異性は、ＥＬＩＳＡによって測定された。連続希釈ハイブリドーマ培養上清が、Ａ）ｈｕ３Ｓ１９３（図１Ａ）およびＢ）ｈｕＩｇＧ（図１Ｂ）でコーティングされたマイクロタイタープレートへの結合活性について検査された。二次抱合体（▲）および基質のみ（○）の対照も含めた。ｈｕ３Ｓ１９３に対する特異的結合が、ＬＭＨ−１、−２、および−３で確認された。ＬＭＨ−４は抗ｈｕＩｇＧ結合活性を示した。
【００１１】
図２：クローン増殖後、ハイブリドーマ培養上清が、ｈｕ３Ｓ１９３抗原結合活性を中和する能力についてＥＬＩＳＡによって３部で検査された。平均±ＳＤ結果は、合成Ｌｅｙ抗原でコーティングされたプレートへのｈｕ３Ｓ１９３結合の遮断により抗ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂ、ＬＭＨ−１、−２、および−３の拮抗薬活性を示した。
【００１２】
図３Ａ−Ｄ：３Ｓ１９３イディオトープに対するＬＭＨ−２およびＬＭＨ−３の特異性の確認。図３Ａ。プロテインＡ精製ＬＭＨ−３をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、連続希釈した１０μｇ／ｍｌのｈｕ３Ｓ１９３、ｍｕ３Ｓ１９３、ＢＲ５５．２の３部サンプル、および対照ＩｇＧ１ ｍＡｂ ｈｕＡ３３およびｍｕＡ３３をウェルに添加し、さらにＬＭＨ−３の結合特異性を特徴づけた。このクローンの追加の好ましい特徴は、ビオチニル化ＬＭＨ−３がＬＭＨ−３で捕捉される結合３Ｓ１９３ｍＡｂの検出に利用されうることであった。図３Ｂ。ｈｕ３Ｓ１９３−Ｌｅｙ抗原結合に対する抗Ｌｅｙおよび抗イディオタイプｍＡｂによるＬｅｙ四糖類コーティングプレートへの結合を阻止する拮抗薬結合。図３Ｃ。ｍｕ３Ｓ１９３−Ｌｅｙ抗原結合、および図３Ｄ。ＢＲ５５．２−Ｌｅｙ抗原結合活性。
【００１３】
図４Ａ−Ｃ：患者血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡの開発。図４Ａ。合成抗原Ｌｅｙ−ＢＳＡ抱合体による捕捉、抗ｈｕＩｇＧによる検出の抗イディオタイプ利用可能性より前に利用可能な方法は、患者の注入前血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３標準による低い感度および高いノイズを示す。図４Ｂ。抗ｈｕ３Ｓ１９３イディオタイプＬＭＨ−２による捕捉およびＬＭＨ−２−ビオチンによる検出。低い感度が確認される。図４Ｃ。抗ｈｕ３Ｓ１９３イディオタイプＬＭＨ−３による捕捉およびＬＭＨ−３−ビオチンによる検出は、最小のノイズおよびｈｕ３Ｓ１９３血清中の３ｎｇ／ｍｌに対する感度を示す。
【００１４】
図５：ｈｕ３Ｓ１９３に対する血清ＨＡＨＡ反応のＢｉａｃｏｒｅ分析が最適化され、陽性対照としての抗イディオタイプＬＭＨ−３を使用して確認された。ｈｕ３Ｓ１９３をバイオセンサーチップ上に固定化し、ヒト血清μｇ／ｍｌ）中の抗イディオタイプｍＡｂ ＬＭＨ−３（■）およびアイソタイプマッチド対照抗体（▲）の連続希釈を３部でチップ上を通した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ヒト化抗ルイスＹモノクローナル抗体、ｈｕ３Ｓ１９３に対する抗イディオタイプ抗体に関する。本発明は、ｈｕ３Ｓ１９３の可変領域に対して特異的に結合するハイブリドーマクローンによって生成されるｍＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング法、およびルイスＹ抗原に対するｈｕ３Ｓ１９３結合を阻害する抗イディオタイプｍＡＢの能力にも関する。
【００１６】
本発明は、本発明の抗体を使用するＨＡＭＡ、ＨＡＣＡ、およびＨＡＨＡ反応物を検出する方法にも関する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の１つの態様は、抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供することである。本発明の別の態様は、抗ルイスＹモノクロナール抗体の可変領域に結合する抗ルイスＹ抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。同様に、本発明の別の態様は、抗ルイスＹモノクロナール抗体の結合を遮断する抗イディオタイプ抗体である。本発明の別の態様は、特異的にｈｕ３Ｓ１９３に結合する抗イディオタイプ抗体を提供することである。具体的には、本発明において提供される抗イディオタイプ抗体は、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体より成る群から選択される。
【００１８】
本発明の別の態様は、抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を生成することが可能なハイブリドーマを提供することである。本発明の別の態様は、ＬＭＨ−１、ＬＭＨ−２、およびＬＭＨ−３より成る群から選択される抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的であるハイブリドーマを提供することである。
【００１９】
本発明の別の態様は、抗原への抗体の結合を阻害する抗イディオタイプ抗体の能力を検出する方法を提供する。本発明の別の態様は、結合イディオタイプ抗体を捕捉し、検出する抗イディオタイプの能力を検出するための方法を提供することである。本発明の別の態様は、イディオタイプ抗ルイスＹ抗体に結合する抗イディオタイプ抗体の能力を検出するための方法を提供することである。本発明の別の態様は、サンプル血清中の抗体の量を検出する方法である。
【００２０】
本発明は、ｈｕ３Ｓ１９３を捕捉する抗原としてＢＳＡに結合した合成ルイスＹ四糖類と、結合ｈｕ３Ｓ１９３の検出器としての市販の抗ヒト抗体製剤を使用するＥＬＩＳＡによって、血清サンプル中のｈｕ３Ｓ１９３を測定する方法を含む。アッセイの感度は、高いノイズをもたらす二次抗ｈｕＩｇＧ抗体によって検出される血清サンプルからのｈｕＩｇＧの非特異的結合によって大きく制限されている。ｃＧ２５０に対するＨＡＣＡ反応および抗イディオタイプＮＵＨ−８２を有するｃＧ２５０の血清レベルの測定による経験に基づき、適切な抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂの産生が不可欠となった。
【００２１】
本発明は、本発明の抗体を使用するＨＡＭＡ、ＨＡＣＡ、およびＨＡＨＡ反応物を検出する方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。これらの抗イディオタイプ抗体は、抗ルイスＹモノクロナール抗体の可変領域に結合する抗ルイスＹ抗体に特異的である。同様に、本発明の別の態様は、抗ルイスＹモノクロナール抗体の結合を遮断する抗イディオタイプ抗体である。本発明の別の態様は、特異的に抗ルイスＹモノクロナール、ｈｕ３Ｓ１９３に結合する抗イディオタイプ抗体を提供することである。具体的には、本発明において提供される抗イディオタイプ抗体は、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体より成る群から選択されうる。
【００２３】
また、本発明は、抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を生成することが可能なハイブリドーマを提供する。本発明の別の態様は、ＬＭＨ−１、ＬＭＨ−２、およびＬＭＨ−３より成る群から選択される抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的であるハイブリドーマを提供することである。
【００２４】
本明細書で使用される「ヒト化」抗体という語は、非ヒト種免疫グロブリン由来のそのＣＤＲ（補体決定領域）を有する分子、および主にヒト免疫グロブリン由来の抗体分子の残りを指す。
【００２５】
本明細書で使用される「抗体」という語は、別に指示がない限り、広く抗体分子およびさまざまな抗体由来分子の両方を指す。かかる抗体由来分子は、少なくとも１つの可変領域（重鎖または軽鎖可変領域のいずれか）およびＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂｃフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂｃフラグメント、Ｓｃ抗体 （一本鎖抗体）、二重特異性抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子とのキメラ融合などの分子を含む。
【００２６】
免疫グロブリンに関連して本明細書で使用される「可変領域」という語は、免疫学の当業者によってこの語に与えられた通常の意味を有する。抗体重鎖および抗体軽鎖は「可変領域」および「定常領域」へ分割されうる。可変領域と重鎖領域との分割点は、抗体構造を記載した標準の教科書、例えば、カバト（Ｋａｂａｔ）ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：第５版」、米国保険福祉省、米国政府印刷局（１９９１年）を参照することにより当業者によって容易に決定されうる。
【００２７】
本明細書で使用される「イディオタイプ」という語は、抗原に対するその特異性を決定する抗体分子の部分を指す。イディオタイプは、Ｆａｂ領域に位置しており、その発現には通常、抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域の関与が必要とされる。
【００２８】
本明細書で使用される「アイソタイプ」という語は、免疫グロブリンの重鎖のクラスまたはサブクラス、または軽鎖の型および亜型を決定する抗原を指す。例えば、ＩｇＧの４つのアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４で指名される。
【００２９】
ヒト化抗ルイスＹモノクロナール抗体ｈｕ３Ｓ１９３は、ルイスＹ上皮抗原を特異的に標的する。ｈｕ３Ｓ１９３の薬物動態および病院において投与されるｈｕ３Ｓ１９３に対する免疫反応の測定を補助するために、抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体が生成され、ＨＡＨＡ分析における患者の血清サンプルおよび陽性対照におけるｈｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡ試薬としての適合性について特徴づけられた。ｈｕ３Ｓ１９３で免疫化したマウスからの脾細胞をＳＰ２／０−ＡＧ１４形質細胞腫細胞と融合し、結果として生じたハイブリドーマによって生成された抗イディオタイプ抗体をｈｕ３Ｓ１９３への特異的結合およびルイスＹ抗原に対する競合結合ＥＬＩＳＡにより選択した。９つのハイブリドーマを最初に選択し、ＬＭＨ−１、−２、および−３と指名された３つは、ｈｕ３Ｓ１９３への特異的結合、およびルイスＹ抗原に結合するｈｕ３Ｓ１９３との競合結合を示した。ｈｕ３Ｓ１９３イディオトープの認識は、抗ルイスＹモノクロナール抗体、ＢＲ５５．２、および他の無関係のヒトＩｇＧ、マウスＩｇＧ、ヒト化またはキメラモノクロナール抗体との交差反応の欠如によって特異的と証明された。
【００３０】
抗ルイスＹモノクロナール抗体、ｈｕ３Ｓ１９３に対するマウスモノクロナール抗イディオタイプが生成され、その特異性が規定され、薬物動態および病院で投与されたｈｕ３Ｓ１９３に対する免疫反応をモニタリングするアッセイのための特定の抗イディオタイプの選択を可能にした。
【００３１】
ｈｕ３Ｓ１９３に特異的に結合し、ｈｕ３Ｓ１９３およびｍｕ３Ｓ１９３の結合を阻害するが、ルイスＹ抗原に対するＢＲ５５．２を阻害しない、ＬＭＨ−１、−２、および−３で指名される３つの抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体が生成された。抗ｈｕＩｇＧ ｍＡｂ ＬＭＨ−４も単離され、すべての試験キメラヒト化ｍＡｂまたは精製ｈｕＩｇＧに対する強い結合活性が証明された。４つのＡｂはすべてマウスＩｇＧ１カッパアイソタイプとして同定された。ハイブリドーマＬＭＨ−３はローラー培養における１ｍｌ培養上清当たり１３μｇの精製ＬＭＨ−３を産生し、ＬＭＨ−４は１５μｇ／ｍｌを産生し、これらのクローンが大規模生産に適していることを示す。ＬＭＨ−４は、ｈｕＩｇＧの検出のための検査、またはウシＩｇＧで汚染された組織培養上清からのモノクロナール抗体の親和性精製における試薬としての潜在能力を有する。ＢＩＡｃｏｒｅ分析では、Ｋａ＝４．７６×１０８Ｍ−１（Ｋｄ＝２．１０×１０−９Ｍ）のｈｕ３Ｓ１９３に対するＬＭＨ−３の高い明らかな親和性が測定された。この親和性は、捕捉のための精製ＬＭＨ−３および検出のためのビオチニル化ＬＭＨ−３を使用するｈｕ３Ｓ１９３の血清濃度を測定するための高再現性、感受性、特異性ＥＬＩＳＡアッセイの開発を可能にした。ＢＩＡｃｏｒｅにより血清サンプルのＨＡＨＡ分析の確立は、患者血清における免疫反応の定量のために陽性対照としてＬＭＨ−３を使用することにより可能であり、これらの抗イディオタイプを使用し、腫瘍生検の免疫組織化学的分析を通じて腫瘍へのｈｕ３Ｓ１９３の浸透および結合を試験することもできた。各可変ドメインでの標的抗体を同時に結合することが可能な抗イディオタイプ抗体の生成は、臨床的に投与される標的抗体の安全性および薬物動態プロフィールの評価に高い感度を有する試薬を提供する。ｈｕ３Ｓ１９３免疫療法を受ける患者からの臨床サンプルを試験するための診断検査用試薬として重要な用途を有する抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂが生成されている。
【００３２】
本発明の別の態様は、抗原に対する抗体の結合を阻害する抗イディオタイプ抗体の能力を検出するための方法を提供する。本発明の別の態様は、結合イディオタイプ抗体を捕捉し、検出する抗イディオタイプの能力を検出するための方法を提供することである。本発明の別の態様は、イディオタイプ抗ルイスＹ抗体に結合する抗イディオタイプ抗体の能力を検出するための方法を提供することである。本発明の別の態様は、サンプル血清における抗体の量を検出する方法である。本発明は、本発明の抗体を使用するＨＡＭＡ、ＨＡＣＡ、およびＨＡＨＡ反応を検出する方法にも関する。
【００３３】
血清ｈｕ３Ｓ１９３レベルを測定するための２つのＥＬＩＳＡアッセイを調査した。第１のアッセイには合成ルイスＹ抗原による捕捉が含まれ、第２のアッセイでは抗イディオタイプ抗体が使用された。アッセイの感度および特異性を比較し、ＬＭＨ−３を使用する分析が、ｈｕ３Ｓ１９３に対する高い親和性により合成抗原よりも優れており、高い感度を可能にする非特異的結合の欠如からの低いノイズ、および３ｎｇ／ｍｌの血清ｈｕ３Ｓ１９３の定量限界が見出された。ＢＩＡｃｏｒｅ分析では、Ｋａ＝４．７６×１０８Ｍ−１（Ｋｄ＝２．１０×１０−９Ｍ）のｈｕ３Ｓ１９３に対するＬＭＨ−３の明らかな親和性が測定された。ハイブリドーマは、抗体ＬＭＨ−３の高いレベルを産生する。
【００３４】
以下の実施例は本発明の例示のために示されており、本発明の限定と解釈されてはならない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
細胞培養
すべての分析用試薬を、別に指示がない限り、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、モンタナ州（ＭＯ）、米国）から購入した。
【００３６】
ＳＰ２／０−Ａｇ１４形質細胞腫細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州（ＶＡ）、米国）から購入した。ＳＰ２／０および選択ハイブリドーマクローンを正常ＲＰＭＩ−１６４０培地、すなわち、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、トレース・バイオサイエンス社（ＴＲＡＣＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）、シドニー、オーストラリア）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）、および４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ジブコ・インビトロジェン社（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、Ｍｔ Ｗａｖｅｒｌｅｙ、ビクトリア州、オーストラリア）中で培養した。融合生成物の初期の数代継代を、上記のとおり２０％ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０で培養した。ＨＡＴ培地をハイブリドーマ選択のために使用した、２０％ＦＣＳ、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）、ＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸塩、インスリン培地補充）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地。ハイブリドーマ増殖のために、細胞をＨＴ培地、すなわち、２０％ＦＣＳ、ＨＴ（ヒポキサンチン、チミジン）、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。
【００３７】
実施例２
免疫化およびスクリーニングのための抗体
ヒト化抗ルイスＹ ＩｇＧ１抗体ｈｕ３Ｓ１９３（ロット：Ｄ０１０９７、１０ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳ）、マウス３Ｓ１９３（ｍｕ３Ｓ１９３）、対照アイソタイプマッチドヒト化ｍＡｂ、ｈｕＡ３３（ロット：５ＧＭＡ３３ １０ｍｇ／ｍｌ）、および無関係のアイソタイプマッチドマウス：ヒトキメラＩｇＧ１抗体は、生物学的生産機関（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、ルートビッヒ癌研究協会（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、メルボルン、オーストラリア）によって供給された。精製ヒトＩｇＧはシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から購入された。Ｆ（ａｂ）’２フラグメントを、メーカーの指示に従い免疫化ペプシンによる消化によって調製し（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州（ＩＬ）、米国）、非消化ｈｕ３Ｓ１９３および１ｍｌプロテインＡカラム（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）上の通過よってＦｃ含有フラグメントから精製した。精製フラグメントをミリポア遠心フィルタ（バイオマックス（Ｂｉｏｍａｘ）１０ｋ膜、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、シドニー、オーストラリア）上で１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【００３８】
実施例３
免疫化プロトコール
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを繁殖用施設、ウォルター・アンド・エリザ・ホール研究所（Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、メルボルン、オーストラリアから購入し、飼料および水を自由に与えて飼育した。本試験のために動物で実施されたすべての手順は、オースチン・アンド・レパトリエーション・メディカルセンター（Ａｕｓｔｉｎ ａｎｄ Ｒｅｐａｔｒｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ）の動物倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。免疫化前静脈血液サンプル（２００μｌ）を各動物から収集し、室温（ＲＴ）下に１時間、４℃下に一夜凝固させた。結果として生じる血清（約１００μｌ／マウス）を収集し、−２０℃下に保存した。
【００３９】
免疫化手順をマウス６匹で実施した。０日目、４０μｇ精製ｈｕ３Ｓ１９３：フロイント完全アジュバント（１：１、ｖ：ｖ）含有２００μｌの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。マウスに対し１４日目および２８日目にフロイント不完全アジュバントでｈｕ３Ｓ１９３を４０μｇ含有するブースター注射を投与した。３５日目、免疫化後血液サンプルを尾静脈から収集し、マウス抗ｈｕ３Ｓ１９３抗体の血清力価をＥＬＩＳＡによって測定した。免疫化前血清サンプルを対照として含めた。３回目、４０μｇのｈｕ３Ｓ１９３のみを含有する最後の静脈内（ｉ．ｖ．）ブースター注射後４日にマウスを屠殺した。脾臓を無菌で５ｍｌ ＰＢＳ／Ｇに収集し、融合用に脾細胞懸濁液を調製した。
【００４０】
実施例４
融合およびハイブリドーマ生成
すべての手順を室温下に実施し、これらは以前に公表された方法に基づくものであった（１２）。脾細胞を収集し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、細胞濃度を測定した。同時に、融合パートナーＳＰ２／０細胞を回収し、血清を含まない培地中で洗浄し、計算した。各細胞ペレットを血清を含まないＲＰＭＩ ５ｍｌ中に再懸濁し、次いで５０ｍｌチューブに５：１比の脾細胞：ＳＰ２／０で混合した。細胞混合物を３００×ｇ、１０分遠心分離し、結果として生じる細胞ペレットを軽くたたくことによって静かに破壊した。チューブを３７℃の湯浴中にインキュベートし、培地（１ｍｌ）中５０％ＰＥＧを１分間にわたって滴下した。次いで、予熱した血清を含まないＲＰＭＩ（２ｍｌ）を２分にわたって添加した後、３分にわたって培地８ｍｌを添加した。細胞を３００×ｇ、１０分遠心分離し、ＨＡＴ培地（約１×１０ ５脾細胞、２×１０ ４ＳＰ２／０骨髄腫細胞を含有する６０ｍｌ ＨＡＴ培地／マウス脾臓）中に静かに再懸濁した。混合細胞懸濁液を６個の９６ウェル細胞培養プレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国）へ等分し（１００μｌ／ウェル）、加湿５％ＣＯ２／空気インキュベーター中３７℃下に培養した。
【００４１】
実施例５
モノクロナール抗体選択
ハイブリドーマ培養上清をｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂおよび精製ヒトＩｇＧとの陽性結合活性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。選択クローンを２４ウェル培養プレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））中で増殖させ、その結合活性および競合結合活性をさらにＥＬＩＳＡによって特徴づけた。培養上清中の選択抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体のサブクラスをマウスモノクロナール抗体アイソタイピング用キット（アイソストリップ（ＩｓｏＳｔｒｉｐ）、ロシュ・ディアグノスティックス・ゲーエムベーハー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で測定した。
【００４２】
実施例６
限界希釈によるハイブリドーマのクローニング
一次希釈系列
選択ハイブリドーマクローンを９６ウェルプレートの内側６０ウェル中の２００μｌ ＨＡＴ培地中１００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。外側ウェルを抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で充填し、脱水およびウェルを含有するＨＡＴ培地／細胞の濃縮を阻止した。細胞成長がほぼ密集（約７日）であった場合、上清を収集し、ルイスＹ抗原結合のためのｈｕ３Ｓ１９３への特異的結合およびｈｕ３Ｓ１９３への拮抗薬結合について試験した。陽性クローンを継続的分析およびクローニングのために選択した。
【００４３】
二次希釈系列
本ステップは、単一の細胞から成長したハイブリドーマを確立することを目的とし、培養では脾細胞支持細胞層が利用された。脾細胞を非免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスから調製し、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールを補充した１０ ６細胞／ｍｌ ＨＡＴ培地に再懸濁し、滅菌環境下に室温で一夜インキュベートし、汚染感染がないことを確実にした。翌日、２つの９６ウェルマイクロタイタープレートを、既述どおり、使用したプレートの内側６０ウェルのみで各選択クローン用に調製した。ＨＡＴ培地のアリコート（１００μｌ）を列１に添加し、脾細胞懸濁液を列２−６（１０ ５細胞／ウェル）に添加し、プレートを３７℃下に一夜インキュベートした。選択細胞をＨＡＴ培地中に希釈し、１００、１０、５、１、または０．５細胞を含有する１００μｌのアリコートを、それぞれ、支持細胞を含有する２から６までの列のウェルに添加した。プレートを３７℃下に１０−１４日間インキュベートし、１または０．５細胞／ウェルで接種したウェルからクローンコロニーを選択した。
【００４４】
三次希釈系列
選択クローンが単一の細胞から由来することを確実にするために、すべての選択細胞系は反復回の二次希釈手順を受けた。好ましい系を増殖させ、ストックを調製し、液体窒素下に保存した。
【００４５】
実施例７
抗体産生
ハイブリドーマを産生する選択および再クローン化抗イディオタイプ抗体をローラーボトル（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ニューヨーク州（ＮＹ）、米国）で培養し、培養上清を無菌で回収した。抗イディオタイプ抗体を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８（バッファーＡ）で前平衡した５ｍｌプロテインＡセファロース迅速フロー（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）における親和性クロマトグラフィーによって精製した。２０カラム量バッファーＡでの洗浄後、２００ｍＭ ＮａＣｌ含有１００ｍＭグリシン−ＨＣＬ、ｐＨ２．７を使用して結合抗体を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８を使用して直ちに中和した。ＰＢＳへの４℃での一夜透析後、抗体を遠心フィルタ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、バイオマックス（Ｂｉｏｍａｘ）１０ｋ膜）で濃縮した。還元および非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を検査した。クマシーブルー染色によってタンパク質を視覚化した。ビオチニル化抗イディオタイプ抗体をＥＣＬタンパク質ビオチニル化モジュールキットを使用し、メーカーの指示（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従い調製した。
【００４６】
実施例８
結合特異性のＥＬＩＳＡ分析
ハイブリドーマ上清または精製抗イディオタイプ抗体の結合特異性をＥＬＩＳＡ分析によって特徴づけた。９６ウェルプレート（ヌンク・マキシソープ（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）をｈｕ３Ｓ１９３（１００μｌ、４．０μｇ／ｍｌ）、精製ヒトＩｇＧ、または炭酸バッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ９．６）中の他の対照モノクロナール抗体で４℃下に一夜コーティングした。非特異的結合を３％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温（２３℃）下に２時間遮断した。上清または精製抗体の連続希釈（１：２−１：６３００）を調製し、ウェル当たり１００μｌアリコートを添加した。陽性（ｈｕＩｇＧ）および陰性（抱合体および基質のみ）対照を各アッセイで含めた。プレートを室温下に１時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、次いで１時間二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抱合アルカリホスファターゼ（１００μｌ／ウェル、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：３０００希釈）と一緒にインキュベートした。結合抗体を発色団基質ｐ−ニトロフェニルリン酸基質（ＩＣＮバイオメディカルズ社（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、Ａｕｒｏｒａ、オハイオ州（Ｏｈａｉｏ）、米国）で検出した。光学密度をＶｍａｘキネティックマイクロプレートリーダー（モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｓｕｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）により４５０ｎｍで測定した。
【００４７】
実施例９
拮抗薬活性のＥＬＩＳＡ分析
選択抗イディオタイプ抗体をルイスＹ−抗原コートプレートへのｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂの結合を遮断するその能力について試験した。合成ルイスＹ四糖類は、モル比約３２：１でＢＳＡに結合されて入手可能である（アルバータ・リサーチ・カウンシル（Ａｌｂｅｒｔａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州（Ａｌｂｅｒｔａ）、カナダ）。ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク・マキシソープ（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ））をルイスＹ−ＢＳＡ 抗原（５０μｌ ３．０μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）でコーティングし、４℃下に一夜インキュベートした。プレートを室温下に２時間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで非特異的結合のために遮断した。ハーフログ連続希釈サンプル（上清または精製抗イディオタイプｍＡｂ）を各ウェルに添加した後、ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂ（５０μｌ、１μｇ／ｍｌ最終濃度）を添加した。室温下に１時間のインキュベーション後、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを使用し、結合ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂを検出し、広範な洗浄後、ＡＢＴＳ基質（２，２’−アジノ−ビス−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸、１００μｌ ４０μＭ／ウェル、ＩＣＮ）で視覚化した。光学密度（ＯＤ）をＶｍａｘキネティックマイクロプレートリーダーにより４１５ｎｍで測定した。
【００４８】
実施例１０
Ｈｕ３Ｓ１９３の抗イディオタイプ特異性
抗ルイスＹ ｍＡｂへの結合の精製選択クローンの特異性をさらに、ｈｕ３Ｓ１９３、およびマウスｍＡｂ ｍｕ３Ｓ１９３およびＢＲ５５．２（ルートビッヒ癌研究協会（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）ｈｕ３Ｓ１９３を使用して検査した。特異性を２つのＥＬＩＳＡで検査した。第１のＥＬＩＳＡでは結合イディオタイプｍＡｂの捕捉および検出のための抗イディオタイプが利用され、第２のＥＬＩＳＡでは溶液中でイディオタイプ抗ルイスＹ ｍＡｂに結合し、ルイスＹ抗原結合を阻害する抗イディオタイプｍＡｂの能力が検査された。
【００４９】
第１のアッセイでは、ＥＬＩＳＡマキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレートを選択抗イディオタイプｍＡｂで一夜、４℃下にコーティングした（１００μｌ ４μｇ／ｍｌ ０．０５Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．６）。３％ＦＣＳ／ＰＢＳによる遮断後、連続希釈した１０μｇ／ｍｌのｈｕ３Ｓ１９３、ｍｕ３Ｓ１９３、ＢＲ５５．２の３部サンプル、および無関係の対照ｍＡｂ ｈｕＡ３３およびｍｕＡ３３をウェルに添加し、次いで室温下に１時間インキュベートした。洗浄後、結合ｍＡｂをビオチニル化抗イディオタイプｍＡｂ（ＬＭＨ−３−Ｂｔ、４℃下に一夜、１％ＦＣＳ／ＰＢＳ中１００μｌ／ウェル ４μｇ／ｍｌ）で検出した。結合複合体ストレパビジン−ＨＲＰの（１％ＦＣＳ／ＰＢＳ中１：１０００希釈、１００μｌ／ウェル）検出の後、着色のためにＡＢＴＳを添加した。ＯＤ４１５を既述どおりに測定した。
【００５０】
特異性の第２の試験のために、３つのＥＬＩＳＡプレートを合成ルイスＹ−ＢＳＡ抗原でコーティングした（ＰＢＳ中４．０μｇ／ｍｌ、４℃下に一夜）。次いで、連続希釈抗ルイスＹｍＡｂをプレートの各列上に等分した、プレート１、ｈｕ３Ｓ１９３、プレート２、ｍｕ３Ｓ１９３、プレート３ ＢＲ５５．２最終濃度範囲（０．００３−１０μｇ／ｍｌ）。ルイスＹ抗原への結合の競合を試験するために、他の２つの抗ルイスＹ ｍＡｂおよび２つの抗イディオタイプｍＡｂを２部で（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）添加し、次いで室温下に１時間インキュベートした。洗浄後、プレート１における結合ｈｕ３Ｓ１９３を抗ｈｕＩｇＧ−ＨＲＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１％ＦＣＳ／ＰＢＳ中１００μｌ １：１０００）の後、着色のためのＡＢＴＳで検出し、Ａ４１５ｎｍで測定した。プレート２における結合ｍｕ３Ｓ１９３およびプレート３におけるＢＲ５５．２をヤギ抗−ｍＩｇＧアルカリホスファターゼで検出し、ｐ−ニトロフェノール色原体をＡ４０５で測定した。
【００５１】
実施例１１
血清中のＨｕ３Ｓ１９３のＥＬＩＳＡ測定
血清サンプル中のｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂを試験するために２つのＥＬＩＳＡアッセイが開発された。第１のアッセイでは、合成ルイスＹ−ＢＳＡ抗原（ＰＢＳ中３．０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）をｈｕ３Ｓ１９３捕捉のために利用した。健康ドナー血清中のｈｕ３Ｓ１９３の連続希釈サンプルまたは３％ＢＳＡ／ＰＢＳによるインキュベーション後、抗原に結合するｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂの量をヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体およびＡＢＴＳ基質で検出した。
【００５２】
第２のアッセイには抗イディオタイプ抗体によるコーティングおよびビオチニル化抗イディオタイプ抗体による検出が含まれた。プレートを抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体（０．０５Ｍ炭酸バッファーｐＨ９．６中３．０μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）で一夜、４℃下にコーティングし、次いで２時間、室温（２３℃）下に３％ＢＳＡ／ＰＢＳで遮断した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳまたは健康ドナー血清中のｈｕ３Ｓ１９３（０．０３１５−１０μｇ／ｍｌ）の連続希釈サンプルを３部でプレートに添加し、１時間、室温下にインキュベートした。戦場後、ビオチニル化抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体を添加し（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１００μｌ ３μｇ／ｍｌ）、１時間、室温下にインキュベートした。結合複合体ストレパビジン−ＨＲＰの（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：１０００希釈、１００μｌ／ウェル）検出の後、着色のためにＡＢＴＳを添加した。ＯＤ４１５を既述どおりに測定した。
【００５３】
バイオセンサー分析：
カルボキシメチルデキストランコートセンサーチップ（ＣＭ５）上でＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用してバイオセンサー分析を実施した。チップをチャンネル２でｈｕ３Ｓ１９３、チャンネル３でＬＭＨ−３、およびチャンネル４でウシ血清アルブミン（アルバータ・リサーチ・カウンシル（Ａｌｂｅｒｔａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州（Ａｌｂｅｒｔａ）、カナダ）に結合した合成ルイスｙ四糖類により、標準ＮＨＳ／ＥＤＣアミン結合化学を使用して誘導体化した。ｈｕ３Ｓ１９３およびＬＭＨ−３のサンプルをＨＢＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭジ−Ｎａ−ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）、およびアリコート（３０μｌ）を５μｌ／分の流量でセンサーチップ表面にわたって注入した。注入相後、３００秒間チップ表面上にＨＢＳバッファーを流すことによって解離をモニタリングした。結合抗体を溶出し、１００ｍＭグリシン／１００ｍＭ ＮａＣＬ、ｐＨ２．７、２０μｌの注入によってサンプル間でチップ表面を再生した。結合の動態分析にために、各種濃度のｈｕ３Ｓ１９３およびＬＭＨ−３をセンサーチップ表面上に注入した。明らかな結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を二価分析モデルを使用し、Ｒｍａｘの計算のための全体的、およびローカル適合により、ＢＩＡ評価ｖ３．０ソフトウェア（ファルマシア・バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して計算した。
【００５４】
投与されたモノクロナール抗体に対する患者の免疫反応は、患者血清のバイオコア（Ｂｉｏｃｏｒｅ）（登録商標）分析によって評価されうる（リッター（Ｒｉｔｔｅｒ）、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、２００１年）。抗イディオタイプ抗体は、これらの分析において陽性対照試薬として有用である。したがって、ＬＭＨ−３を健康ドナー血清（３−５０μｇ／ｍｌ）に添加し、免疫化ｈｕ３Ｓ１９３に対する結合反応を確認した。
【００５５】
実施例１２
マウス免疫化およびハイブリドーマクローン選択
３群のＢＡＬＢ／ｃマウスを繰り返しｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂで免疫化し、その血清をマウス抗ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂ活性について評価した。血清サンプルの免疫化前後の免疫活性は、高力価のマウス抗無傷およびＦ（ａｂ）’２ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂの進展を示した。アイソタイプ対照ヒト化ＩｇＧ（ｈｕＡ３３）またはキメラＩｇＧＦ（ａｂ）’２でコーティングされたプレートも強い陽性結合を示した（結果は示さず）。マウスを屠殺し、その脾臓を除去した。脾細胞およびパートナー融合Ｓｐ２／０形質細胞腫細胞を融合し、これら３つの融合からのハイブリドーマをスクリーニングした。ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対して強い結合活性を示すが、対照ｈｕＡ３３または精製ヒトＩｇＧに対しては弱い結合を示し、または結合を示さない３−４ウェルのみを選択し、増殖させた。増殖後、抗体特異性をさらにＥＬＩＳＡアッセイで試験した（図１）。３つの対照ヒト化またはキメラ抗体を第１の融合からのクローンの選択中に使用した。交差結合活性が通常、精製ヒトＩｇＧコーティングプレートで確認されたため、その後のスクリーニングにおいてｈｕ３Ｓ１９３に加えて精製ヒトＩｇＧを主に使用した。
【００５６】
実施例１３
選択抗イディオタイプ抗体の結合および遮断活性
すべての選択ハイブリドーマの結合および拮抗薬活性をさらに分析し、抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体を産生するハイブリドーマを確認した。ハーフログ連続希釈を各ハイブリドーマ培養上清から調製し、ＥＬＩＳＡによって評価した。最初に選択された１２個のクローンのうち、ｈｕ３Ｓ１９３に結合するが、ｈｕＩｇＧには結合せず、ｈｕ３Ｓ１９３のルイスＹ抗原への結合を阻害しうる３つを確認した（図１）。これらのハイブリドーマ、Ｆ１−１、Ｆ２−３、およびＦ３−２７を限界希釈によって単一の細胞からクローン化し、それぞれ、ルートビッヒ癌研究協会（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）メルボルン（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）ハイブリドーマ（ＬＭＨ）−１、ＬＭＨ−２、およびＬＭＨ−３と指名された。クローンの１つ（ＦＳ２−１）は、すべての試験されたキメラヒト化ｍＡｂもしくは精製ｈｕＩｇＧまたは（図１）に対する強い抗ｈｕＩｇＧ結合活性を示し、その後にｈｕＩｇＧ結合に対する陽性対照として使用された。このクローンは単一の細胞から調製され、ＬＭＨ−４を命名された。ＬＭＨ−１から−４までの抗体は、マウスモノクロナール抗体アイソタイピング用キットによってアイソタイプＩｇＧ１ｅとして確認され、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって培養上清から精製された。４つのクローンの結合特異性がＥＬＩＳＡによって確認された（図４Ａ−Ｃ）。ｈｕＩｇＧ定常鎖との交差反応は、ＬＭＨ−１、−２、またはー３では確認されず（図４Ｂ）、３つの抗体はすべて特異的にｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂのみに結合された（図４Ａ）。これらの抗体の拮抗薬活性は、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって分析された。ＬＭＨ−１、−２、および−３抗ｈｕ３Ｓ１９３イディオタイプ抗体は、ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに結合し、ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂのルイスＹ抗原への結合を用量依存的に阻害する（図２）。
【００５７】
実施例１４
抗体結合親和性の測定
溶液中でＬＭＨ−３と相互作用する固定化ｈｕ３Ｓ１９３のバイオセンサー結合実験の明らかな結合親和性では、４．７６×１０８Ｍ−１（Ｋｄ＝２．１０×１０−９Ｍ）のＫａが測定された。チップ上に固定化されたＬＭＨ−３、および分析物として表面上を走るｈｕ３Ｓ１９３との相互実験において、９．１２×１０８Ｍ−１（Ｋｄ＝１．１０×１０−９Ｍ）のＫａが測定された。
【００５８】
実施例１５
Ｈｕ３Ｓ１９３に対する抗イディオタイプ特異性
３Ｓ１９３イディオタイプに対するクローンＬＭＨ−２およびＬＭＨ−３の特異性がこれらの実験で確認された（図５）。プロテインＡ精製ＬＭＨ−３をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、連続希釈した１０μｇ／ｍｌのｈｕ３Ｓ１９３、ｍｕ３Ｓ１９３、ＢＲ５５．２の３部サンプル、および対照ＩｇＧ１ ｍＡｂ ｈｕＡ３３およびｍｕＡ３３をウェルに添加し、さらにＬＭＨ−３の結合特異性を特徴づけた。このクローンの追加の好ましい特徴は、ビオチニル化ＬＭＨ−３がＬＭＨ−３で捕捉された結合３Ｓ１９３ｍＡｂの検出に利用されうることであった。ＥＬＩＳＡの結果（図３Ａ）は、ＬＭＨ−３が特異的に抗ルイスＹ３Ｓ１９３イディオタイプに結合し、マウス抗ルイスＹＢＲ５５．２との反応性は検出されず、対照ｍｕＡ３３およびｈｕＡ３３のマウスおよびヒトＩｇＧ１定常ドメインとの交差反応はなかったことを示した。ｈｕ３Ｓ１９３およぶｍｕ３Ｓ１９３のルイスＹ抗原への結合は、１０μｇ／ｍｌ ＬＭＨ−２およびＬＭＨ−３によって溶液中で有効に競合したが、抗イディオタイプ結合部位の飽和時には、一部のｈｕ３Ｓ１９３およびｍｕ３Ｓ１９３の抗原への結合は確認されなかった（それぞれ、図３Ｂおよび３Ｃ）。マウスＢＲ５５．２ｍＡｂは一部の競合結合をもたらしたが、高い親和性のｍｕ３Ｓ１９３は、最高濃度（１０μｇ／ｍｌ）での場合を除き、ｈｕ３Ｓ１９３のルイスＹ抗原への結合を完全に遮断した（図３Ｂ）。プレート２相互実験においては、低い親和性のｈｕ３Ｓ１９３は、ｍｕ３Ｓ１９３が最初にウェルに添加されると、ルイスＹ抗原に競合しえなかった（図３Ｃ）。プレート３からの結果（図３Ｄ）は、ＢＲ５５．２のルイスＹ抗原への結合が、ｈｕ３Ｓ１９３または抗イディオタイプクローンＬＭＨ−２および−３と競合せず、またはこれらによって阻害されないことを示す。したがって、３Ｓ１９３イディオトープに対するこれらクローンの特異性が確認される。図３Ｂにおいて確認されるＢＲ５５．２による競合は、その異なるルイスＹエピトープへの高い親和性結合に対する立体障害により達成されうる。
【００５９】
実施例１６
臨床サンプルにおけるＨｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイの開発
第１のＥＬＩＳＡアッセイでは、血清および検出用のペルオキシダーゼと抱合された二次ヤギ抗ヒトＩｇＧにおけるｈｕ３Ｓ１９３の捕捉用に使用された合成抗原（ルイスＹ四糖類−ＢＳＡ抱合体）が調査された。合成ルイスＹ抗原は、記録された低い光学密度によって示されるアッセイ感度を削減した、ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対する比較的低い親和性を有する。二次抱合抗体ではすべてのヒト免疫グロブリンが検出され、したがって高いノイズが分析したすべてサンプルで確認された（図４Ａ）。高いノイズ干渉が、特に低い血清ｈｕ３Ｓ１９３濃度でアッセイの感度および精度を大幅に削減する。第２のＥＬＩＳＡアッセイでは、コーティング用に精製抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体ＬＭＨ−１、２、および−３が使用され、二次抗体としてビオチニル化ＬＭＨ−１、−２、または−３が使用され、かつ結合複合体の視覚化用にストレパビジン−ＨＲＰおよびＡＢＴＳ基質が使用された。ＬＭＨ−１およびＬＭＨ−２抗イディオタイプ抗体は、血清中または３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中でｍｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対する強い結合示したが、ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対しては弱い結合を示した。しかし、ヒト化ｍＡｂ、キメラｍＡｂ、マウスｍＡｂ、ヒト血清由来のＩｇまたはマウス血清由来のＩｇを含む対照抗体では交差結合活性は確認されなかった（図４Ｂ）。コーティング抗体または二次抗体の濃度を変更し、かつ異なるコーティングバッファーを使用することによってＬＭＨ−１およびＬＭＨ−２によるＥＬＩＳＡを最適化または改善する試みを調査した。一部の改善が達成されたが、反応パターンへの変化はもたらされなかった（データは示さず）。しかし、捕捉用のＬＭＨ−３抗イディオタイプｍＡｂおよび二次抗体としてＬＭＨ−３−ビオチンを使用することにより、最小の非特異的ノイズ活性を有する血清中でｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂおよびｍｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対する特異的に強い結合が確認された（図４Ｃ）。高再現性のアッセイは優れた感度を示し、血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂまたはｍｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対する検出限界は３ｎｇ／ｍｌであった。
【００６０】
免疫反応のバイオコア分析
抗イディオタイプＬＭＨ−３を使用するｈｕ３Ｓ１９３に対する血清中のＨＡＨＡの測定が開発された。高感度で再現性の方法が確立され、確認された（図５）。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＥＬＩＳＡによって測定される抗−ｈｕ３Ｓ１９３モノクロナール抗体、ＬＭＨ−１（●）、−２（▽）、−３（◇）、および抗−ｈｕＩｇＧ−４（◇）の結合特異性を示す。
【図２】ＥＬＩＳＡによって検査されたハイブリドーマ培養上清のｈｕ３Ｓ１９３抗原結合活性を中和する能力について示す。
【図３】３Ｓ１９３イディオトープに対するＬＭＨ−２およびＬＭＨ−３の特異性の確認を示す。
【図４Ａ】患者血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡの開発を示す。
【図４Ｂ】患者血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡの開発を示す。
【図４Ｃ】患者血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡの開発を示す。
【図５】ｈｕ３Ｓ１９３に対する血清ＨＡＨＡ反応のＢｉａｃｏｒｅ分析が最適化され、陽性対照としての抗イディオタイプＬＭＨ−３を使用して確認されたことを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野、かつより具体的には抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
２５年前のモノクロナール抗体（ｍＡｂ）技術の出現は、有用な研究用試薬の膨大なレパートリーを提供し、癌療法、自己免疫疾患、移植による拒絶反応、抗ウイルス予防における承認された医薬試薬として、および抗血栓剤として抗体を使用する機会を創造した（グレニー（Ｇｌｅｎｎｉｅ）とジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、２０００年）。マウスｍＡｂをキメラｍＡｂ（マウスＶ領域、ヒトＣ領域）およびｍＡｂ相補性決定領域（ＣＤＲ）のみがマウス由来であるヒト化試薬へ変換する分子工学の応用は、ｍＡｂ療法の臨床的成功に重要であった。工学的ｍＡｂは、免疫原性を大幅に削減または遠ざけ、血清中半減を増大させ、ｍＡｂのヒトＦｃ部分は補体および細胞毒性細胞の免疫エフェクターを補充する可能性を増大させる（クラーク（Ｃｌａｒｋ）、２０００年）。生体内分布、薬物動態、および臨床的に投与されるｍＡｂに対する免疫反応の誘導に対する調査には、医薬と内因性タンパク質とを区別する分析の開発が必要である。
【０００３】
抗体は通常、それが認識する抗原に関して定義される。特定の抗原に対する抗体の特異性は、その抗原結合部位、抗原に接触する抗体分子の異なる領域よって判定される。この部位は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域内に存在する。しかし、抗体は、抗体分子の単一特異的集団の独自の重鎖および軽鎖領域と関連した、そのイディオタイプ、イディオトープの集合体、または表面マーカーによっても定義される。抗体に特有の抗原決定基はイディオトープと呼ばれ、イディオトープを有する抗体との抗イディオタイプ抗体の反応によって定義される。イディオタイプは、研究者が免疫反応および遺伝性免疫グロブリン遺伝子における特定の抗体の外観および持続性を追跡できるという点で有用なマーカーである。イディオタイプは、抗イディオタイプ抗体の産生を促進しうる固有の決定基でもある。
【０００４】
抗イディオタイプ抗体は、他の抗体の可変領域に結合し、免疫系において、内部（自己）抗原に対して生じる結合抗体における主要な役割を果たす（ジェルネ（Ｊｅｒｎｅ）、１９７４年）。イディオタイプ抗体を誘発する可変領域によって誘発される抗イディオタイプ抗体は、３つのカテゴリー、すなわち、１）抗原結合部位（パラトープ）におけるエピトープの認識、２）パラトープ近く結合およびイディオタイプ抗体−抗原相互作用の立体的干渉、または３）イディオタイプ抗体（「内部イメージ」抗イディオタイプ抗体）によって認識される抗原の構造的模倣のうちの１つでありうる。後者のカテゴリーの抗イディオタイプは、細菌、ウイルス、および寄生虫感染に加えて腫瘍関連抗原に対する宿主の免疫反応の修飾におけるその可能性が与えられるワクチンとして生成および調査されている（バッタチャリヤ−チャタジー（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）、チャタジー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）ら、２００１年で概説）。齧歯類抗イディオタイプ抗体は、補助剤、および担体、通常、誘発される免疫または抗腫瘍反応に対するキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）との抱合を必要とする。
【０００５】
抗イディオタイプ抗体は、以下、ＥＬＩＳＡと称される酵素免疫測定、注入イディオタイプ抗体の患者の血清レベルを検出するための免疫療法治験における試薬、または投与されるイディオタイプ抗体に対する免疫反応としても利用されうる。かかる免疫反応としては、ヒト抗マウス抗体、ヒト抗キメラ抗体、およびヒト抗ヒト化抗体（以下、それぞれ、ＨＡＭＡ、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡと呼ぶ）が挙げられる。抗イディオタイプ抗体ＮＵＨ−８２は、ヒト腎細胞癌におけるＧ２５０抗原を認識するマウスｍＡｂ Ｇ２５０の結合部位に対するものである（ウエムラ（Ｕｅｍｕｒａ）、オカジマ（Ｏｋａｊｉｍａ）ら、１９９４年）。ＮＵＨ−８２は、ｃＧ２５０抗体放射免疫療法を受ける患者におけるＨＡＣＡ反応の測定に有用であることが証明されたが（ステフェンス（ｓｔｅｆｆｅｎｓ）、ボーマン（Ｂｏｅｒｍａｎ）ら、１９９７年）、最近になって、ＮＵＨ−８２は薬物動態分析のために患者の血清におけるｃＧ２５０の血清レベルを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて使用されている（リュー（Ｌｉｕ）、スミス（Ｓｍｙｔｈ）ら、２００２年）。
【０００６】
ｈｕ３Ｓ１９３抗体は、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、および卵巣癌を含む上皮腫瘍を発現するルイスＹ、ジフコシル化炭水化物抗原を標的するために開発された（キタムラ（Ｋｉｔａｍｕｒａ）、ストッカート（Ｓｔｏｃｋｅｒｔ）ら、１９９４年、スコット（Ｓｃｏｔｔ）、ゲレイク（Ｇｅｌｅｉｃｋ）ら、２０００年）。ルイスＹは、上皮由来の腫瘍細胞、例えば、肺癌、腸癌、乳癌、前立腺癌、または卵巣癌の表面上に発現される炭水化物分子である。ルイスＹ抗原は、正常組織において発現されるが、発現レベルは一部の腫瘍型においてより高く、抗原は一部の乳癌、結腸癌、胃癌、食道癌、膵癌、十二指腸癌、肺癌、膀胱癌、および腎癌のほか、胃および島細胞神経内分泌系腫瘍の細胞のマーカーとして使用されうる。ルイスＹ関連関連抗原は、その高い密度と一次および転移性病変における同質の発現により免疫療法の魅力的な標的である（キム（Ｋｉｍ）、ユアン（Ｙｕａｎ）ら、１９８６年、サカモト（Ｓａｋａｍｏｔｏ）ら、１９８６年、チャン（Ｚｈａｎｇ）、コードン−カルド（Ｃｏｒｄｏｎ−Ｃａｒｄｏ）ら、１９９７年）。
【０００７】
ｈｕ３Ｓ１９３は、インビトロで強いＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘発し、前臨床試験における選択充実腫瘍の免疫療法として有望であることが証明されおり（クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）、リー（Ｌｅｅ）ら、２０００年ｂ、クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）、リー（Ｌｅｅ）ら、２０００年ａ）、現在、第Ｉ相用量増加臨床試験中である。前臨床生体内分布試験では放射性標識ｈｕ３Ｓ１９３がトレースされ、乳癌の動物モデルにおける安定化した放射性抱合体の腫瘍ターゲティング能を評価した（クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）、リー（Ｌｅｅ）ら、２０００年ａ）。病院では、ｈｕ３Ｓ１９３などｍＡｂが放射性標識リングを使用してトレースされ、生体内分布および腫瘍イメージング、および血清からの放射性抱合体のクリアランスをｍＡｂ薬物動態の尺度として評価することができる（クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）、リー（Ｌｅｅ）ら、２０００年ａ、スコット（Ｓｃｏｔｔ）、ゲレイク（Ｇｅｌｅｉｃｋ）ら、２０００年、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）、スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら、２００１年）。しかし、臨床症状の非存在下には、ＨＡＨＡ免疫反応を検出することはできない。
【０００８】
ｈｕ３Ｓ１９３の免疫エフェクター機能を考えると、初期治験における投与抗体の血清レベルの測定は将来の治療方式の計画を補助し、非標識ｈｕ３Ｓ１９３の薬物動態の測定を可能にすると同時に、ＨＡＨＡを測定する能力はｈｕ３Ｓ１９３の安全性評価を補助するであろう。
【０００９】
具体的には、本発明は、それらが患者の循環において認識する投与イディオタイプの薬物動態をモニタリングするための診断用試薬として免疫療法治験における抗イディオタイプの使用にも関する。同様に、抗イディオタイプは、投与されたイディオタイプｍＡｂに対するＨＡＨＡ、ＨＡＣＡ、またはＨＡＭＡ免疫反応の陽性対照として使用されうる。かかる免疫反応は、患者集団の一部における臨床結果に対して全く影響を与えないか（グルーバー（Ｇｒｕｂｅｒ）、ヴァンハーレム（ｖａｎ Ｈａａｒｌｅｍ）ら、２０００年）、またはその後の治療を不可能にする免疫療法のｍＡｂの薬物動態および生体内分布における過敏反応および劇的な変化と関連しうる（クラーク（Ｃｌａｒｋ）、２０００年）。
【００１０】
（図面の簡単な記載）
図１Ａ−Ｂ：抗−ｈｕ３Ｓ１９３モノクロナール抗体、ＬＭＨ−１（●）、−２（▽）、−３（◇）、および抗−ｈｕＩｇＧ−４（◇）の結合特異性は、ＥＬＩＳＡによって測定された。連続希釈ハイブリドーマ培養上清が、Ａ）ｈｕ３Ｓ１９３（図１Ａ）およびＢ）ｈｕＩｇＧ（図１Ｂ）でコーティングされたマイクロタイタープレートへの結合活性について検査された。二次抱合体（▲）および基質のみ（○）の対照も含めた。ｈｕ３Ｓ１９３に対する特異的結合が、ＬＭＨ−１、−２、および−３で確認された。ＬＭＨ−４は抗ｈｕＩｇＧ結合活性を示した。
【００１１】
図２：クローン増殖後、ハイブリドーマ培養上清が、ｈｕ３Ｓ１９３抗原結合活性を中和する能力についてＥＬＩＳＡによって３部で検査された。平均±ＳＤ結果は、合成Ｌｅｙ抗原でコーティングされたプレートへのｈｕ３Ｓ１９３結合の遮断により抗ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂ、ＬＭＨ−１、−２、および−３の拮抗薬活性を示した。
【００１２】
図３Ａ−Ｄ：３Ｓ１９３イディオトープに対するＬＭＨ−２およびＬＭＨ−３の特異性の確認。図３Ａ。プロテインＡ精製ＬＭＨ−３をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、連続希釈した１０μｇ／ｍｌのｈｕ３Ｓ１９３、ｍｕ３Ｓ１９３、ＢＲ５５．２の３部サンプル、および対照ＩｇＧ１ ｍＡｂ ｈｕＡ３３およびｍｕＡ３３をウェルに添加し、さらにＬＭＨ−３の結合特異性を特徴づけた。このクローンの追加の好ましい特徴は、ビオチニル化ＬＭＨ−３がＬＭＨ−３で捕捉される結合３Ｓ１９３ｍＡｂの検出に利用されうることであった。図３Ｂ。ｈｕ３Ｓ１９３−Ｌｅｙ抗原結合に対する抗Ｌｅｙおよび抗イディオタイプｍＡｂによるＬｅｙ四糖類コーティングプレートへの結合を阻止する拮抗薬結合。図３Ｃ。ｍｕ３Ｓ１９３−Ｌｅｙ抗原結合、および図３Ｄ。ＢＲ５５．２−Ｌｅｙ抗原結合活性。
【００１３】
図４Ａ−Ｃ：患者血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡの開発。図４Ａ。合成抗原Ｌｅｙ−ＢＳＡ抱合体による捕捉、抗ｈｕＩｇＧによる検出の抗イディオタイプ利用可能性より前に利用可能な方法は、患者の注入前血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３標準による低い感度および高いノイズを示す。図４Ｂ。抗ｈｕ３Ｓ１９３イディオタイプＬＭＨ−２による捕捉およびＬＭＨ−２−ビオチンによる検出。低い感度が確認される。図４Ｃ。抗ｈｕ３Ｓ１９３イディオタイプＬＭＨ−３による捕捉およびＬＭＨ−３−ビオチンによる検出は、最小のノイズおよびｈｕ３Ｓ１９３血清中の３ｎｇ／ｍｌに対する感度を示す。
【００１４】
図５：ｈｕ３Ｓ１９３に対する血清ＨＡＨＡ反応のＢｉａｃｏｒｅ分析が最適化され、陽性対照としての抗イディオタイプＬＭＨ−３を使用して確認された。ｈｕ３Ｓ１９３をバイオセンサーチップ上に固定化し、ヒト血清μｇ／ｍｌ）中の抗イディオタイプｍＡｂ ＬＭＨ−３（■）およびアイソタイプマッチド対照抗体（▲）の連続希釈を３部でチップ上を通した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ヒト化抗ルイスＹモノクローナル抗体、ｈｕ３Ｓ１９３に対する抗イディオタイプ抗体に関する。本発明は、ｈｕ３Ｓ１９３の可変領域に対して特異的に結合するハイブリドーマクローンによって生成されるｍＡｂのＥＬＩＳＡスクリーニング法、およびルイスＹ抗原に対するｈｕ３Ｓ１９３結合を阻害する抗イディオタイプｍＡＢの能力にも関する。
【００１６】
本発明は、本発明の抗体を使用するＨＡＭＡ、ＨＡＣＡ、およびＨＡＨＡ反応物を検出する方法にも関する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の１つの態様は、抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供することである。本発明の別の態様は、抗ルイスＹモノクロナール抗体の可変領域に結合する抗ルイスＹ抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。同様に、本発明の別の態様は、抗ルイスＹモノクロナール抗体の結合を遮断する抗イディオタイプ抗体である。本発明の別の態様は、特異的にｈｕ３Ｓ１９３に結合する抗イディオタイプ抗体を提供することである。具体的には、本発明において提供される抗イディオタイプ抗体は、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体より成る群から選択される。
【００１８】
本発明の別の態様は、抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を生成することが可能なハイブリドーマを提供することである。本発明の別の態様は、ＬＭＨ−１、ＬＭＨ−２、およびＬＭＨ−３より成る群から選択される抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的であるハイブリドーマを提供することである。
【００１９】
本発明の別の態様は、抗原への抗体の結合を阻害する抗イディオタイプ抗体の能力を検出する方法を提供する。本発明の別の態様は、結合イディオタイプ抗体を捕捉し、検出する抗イディオタイプの能力を検出するための方法を提供することである。本発明の別の態様は、イディオタイプ抗ルイスＹ抗体に結合する抗イディオタイプ抗体の能力を検出するための方法を提供することである。本発明の別の態様は、サンプル血清中の抗体の量を検出する方法である。
【００２０】
本発明は、ｈｕ３Ｓ１９３を捕捉する抗原としてＢＳＡに結合した合成ルイスＹ四糖類と、結合ｈｕ３Ｓ１９３の検出器としての市販の抗ヒト抗体製剤を使用するＥＬＩＳＡによって、血清サンプル中のｈｕ３Ｓ１９３を測定する方法を含む。アッセイの感度は、高いノイズをもたらす二次抗ｈｕＩｇＧ抗体によって検出される血清サンプルからのｈｕＩｇＧの非特異的結合によって大きく制限されている。ｃＧ２５０に対するＨＡＣＡ反応および抗イディオタイプＮＵＨ−８２を有するｃＧ２５０の血清レベルの測定による経験に基づき、適切な抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂの産生が不可欠となった。
【００２１】
本発明は、本発明の抗体を使用するＨＡＭＡ、ＨＡＣＡ、およびＨＡＨＡ反応物を検出する方法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。これらの抗イディオタイプ抗体は、抗ルイスＹモノクロナール抗体の可変領域に結合する抗ルイスＹ抗体に特異的である。同様に、本発明の別の態様は、抗ルイスＹモノクロナール抗体の結合を遮断する抗イディオタイプ抗体である。本発明の別の態様は、特異的に抗ルイスＹモノクロナール、ｈｕ３Ｓ１９３に結合する抗イディオタイプ抗体を提供することである。具体的には、本発明において提供される抗イディオタイプ抗体は、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体より成る群から選択されうる。
【００２３】
また、本発明は、抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を生成することが可能なハイブリドーマを提供する。本発明の別の態様は、ＬＭＨ−１、ＬＭＨ−２、およびＬＭＨ−３より成る群から選択される抗ルイスＹモノクロナール抗体に特異的であるハイブリドーマを提供することである。
【００２４】
本明細書で使用される「ヒト化」抗体という語は、非ヒト種免疫グロブリン由来のそのＣＤＲ（補体決定領域）を有する分子、および主にヒト免疫グロブリン由来の抗体分子の残りを指す。
【００２５】
本明細書で使用される「抗体」という語は、別に指示がない限り、広く抗体分子およびさまざまな抗体由来分子の両方を指す。かかる抗体由来分子は、少なくとも１つの可変領域（重鎖または軽鎖可変領域のいずれか）およびＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂｃフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆａｂｃフラグメント、Ｓｃ抗体 （一本鎖抗体）、二重特異性抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖と他の分子とのキメラ融合などの分子を含む。
【００２６】
免疫グロブリンに関連して本明細書で使用される「可変領域」という語は、免疫学の当業者によってこの語に与えられた通常の意味を有する。抗体重鎖および抗体軽鎖は「可変領域」および「定常領域」へ分割されうる。可変領域と重鎖領域との分割点は、抗体構造を記載した標準の教科書、例えば、カバト（Ｋａｂａｔ）ら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ：第５版」、米国保険福祉省、米国政府印刷局（１９９１年）を参照することにより当業者によって容易に決定されうる。
【００２７】
本明細書で使用される「イディオタイプ」という語は、抗原に対するその特異性を決定する抗体分子の部分を指す。イディオタイプは、Ｆａｂ領域に位置しており、その発現には通常、抗原結合部位を形成する重鎖および軽鎖の可変領域の関与が必要とされる。
【００２８】
本明細書で使用される「アイソタイプ」という語は、免疫グロブリンの重鎖のクラスまたはサブクラス、または軽鎖の型および亜型を決定する抗原を指す。例えば、ＩｇＧの４つのアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４で指名される。
【００２９】
ヒト化抗ルイスＹモノクロナール抗体ｈｕ３Ｓ１９３は、ルイスＹ上皮抗原を特異的に標的する。ｈｕ３Ｓ１９３の薬物動態および病院において投与されるｈｕ３Ｓ１９３に対する免疫反応の測定を補助するために、抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体が生成され、ＨＡＨＡ分析における患者の血清サンプルおよび陽性対照におけるｈｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡ試薬としての適合性について特徴づけられた。ｈｕ３Ｓ１９３で免疫化したマウスからの脾細胞をＳＰ２／０−ＡＧ１４形質細胞腫細胞と融合し、結果として生じたハイブリドーマによって生成された抗イディオタイプ抗体をｈｕ３Ｓ１９３への特異的結合およびルイスＹ抗原に対する競合結合ＥＬＩＳＡにより選択した。９つのハイブリドーマを最初に選択し、ＬＭＨ−１、−２、および−３と指名された３つは、ｈｕ３Ｓ１９３への特異的結合、およびルイスＹ抗原に結合するｈｕ３Ｓ１９３との競合結合を示した。ｈｕ３Ｓ１９３イディオトープの認識は、抗ルイスＹモノクロナール抗体、ＢＲ５５．２、および他の無関係のヒトＩｇＧ、マウスＩｇＧ、ヒト化またはキメラモノクロナール抗体との交差反応の欠如によって特異的と証明された。
【００３０】
抗ルイスＹモノクロナール抗体、ｈｕ３Ｓ１９３に対するマウスモノクロナール抗イディオタイプが生成され、その特異性が規定され、薬物動態および病院で投与されたｈｕ３Ｓ１９３に対する免疫反応をモニタリングするアッセイのための特定の抗イディオタイプの選択を可能にした。
【００３１】
ｈｕ３Ｓ１９３に特異的に結合し、ｈｕ３Ｓ１９３およびｍｕ３Ｓ１９３の結合を阻害するが、ルイスＹ抗原に対するＢＲ５５．２を阻害しない、ＬＭＨ−１、−２、および−３で指名される３つの抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体が生成された。抗ｈｕＩｇＧ ｍＡｂ ＬＭＨ−４も単離され、すべての試験キメラヒト化ｍＡｂまたは精製ｈｕＩｇＧに対する強い結合活性が証明された。４つのＡｂはすべてマウスＩｇＧ１カッパアイソタイプとして同定された。ハイブリドーマＬＭＨ−３はローラー培養における１ｍｌ培養上清当たり１３μｇの精製ＬＭＨ−３を産生し、ＬＭＨ−４は１５μｇ／ｍｌを産生し、これらのクローンが大規模生産に適していることを示す。ＬＭＨ−４は、ｈｕＩｇＧの検出のための検査、またはウシＩｇＧで汚染された組織培養上清からのモノクロナール抗体の親和性精製における試薬としての潜在能力を有する。ＢＩＡｃｏｒｅ分析では、Ｋａ＝４．７６×１０８Ｍ−１（Ｋｄ＝２．１０×１０−９Ｍ）のｈｕ３Ｓ１９３に対するＬＭＨ−３の高い明らかな親和性が測定された。この親和性は、捕捉のための精製ＬＭＨ−３および検出のためのビオチニル化ＬＭＨ−３を使用するｈｕ３Ｓ１９３の血清濃度を測定するための高再現性、感受性、特異性ＥＬＩＳＡアッセイの開発を可能にした。ＢＩＡｃｏｒｅにより血清サンプルのＨＡＨＡ分析の確立は、患者血清における免疫反応の定量のために陽性対照としてＬＭＨ−３を使用することにより可能であり、これらの抗イディオタイプを使用し、腫瘍生検の免疫組織化学的分析を通じて腫瘍へのｈｕ３Ｓ１９３の浸透および結合を試験することもできた。各可変ドメインでの標的抗体を同時に結合することが可能な抗イディオタイプ抗体の生成は、臨床的に投与される標的抗体の安全性および薬物動態プロフィールの評価に高い感度を有する試薬を提供する。ｈｕ３Ｓ１９３免疫療法を受ける患者からの臨床サンプルを試験するための診断検査用試薬として重要な用途を有する抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂが生成されている。
【００３２】
本発明の別の態様は、抗原に対する抗体の結合を阻害する抗イディオタイプ抗体の能力を検出するための方法を提供する。本発明の別の態様は、結合イディオタイプ抗体を捕捉し、検出する抗イディオタイプの能力を検出するための方法を提供することである。本発明の別の態様は、イディオタイプ抗ルイスＹ抗体に結合する抗イディオタイプ抗体の能力を検出するための方法を提供することである。本発明の別の態様は、サンプル血清における抗体の量を検出する方法である。本発明は、本発明の抗体を使用するＨＡＭＡ、ＨＡＣＡ、およびＨＡＨＡ反応を検出する方法にも関する。
【００３３】
血清ｈｕ３Ｓ１９３レベルを測定するための２つのＥＬＩＳＡアッセイを調査した。第１のアッセイには合成ルイスＹ抗原による捕捉が含まれ、第２のアッセイでは抗イディオタイプ抗体が使用された。アッセイの感度および特異性を比較し、ＬＭＨ−３を使用する分析が、ｈｕ３Ｓ１９３に対する高い親和性により合成抗原よりも優れており、高い感度を可能にする非特異的結合の欠如からの低いノイズ、および３ｎｇ／ｍｌの血清ｈｕ３Ｓ１９３の定量限界が見出された。ＢＩＡｃｏｒｅ分析では、Ｋａ＝４．７６×１０８Ｍ−１（Ｋｄ＝２．１０×１０−９Ｍ）のｈｕ３Ｓ１９３に対するＬＭＨ−３の明らかな親和性が測定された。ハイブリドーマは、抗体ＬＭＨ−３の高いレベルを産生する。
【００３４】
以下の実施例は本発明の例示のために示されており、本発明の限定と解釈されてはならない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
細胞培養
すべての分析用試薬を、別に指示がない限り、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、モンタナ州（ＭＯ）、米国）から購入した。
【００３６】
ＳＰ２／０−Ａｇ１４形質細胞腫細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州（ＶＡ）、米国）から購入した。ＳＰ２／０および選択ハイブリドーマクローンを正常ＲＰＭＩ−１６４０培地、すなわち、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、トレース・バイオサイエンス社（ＴＲＡＣＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）、シドニー、オーストラリア）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）、および４ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ジブコ・インビトロジェン社（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、Ｍｔ Ｗａｖｅｒｌｅｙ、ビクトリア州、オーストラリア）中で培養した。融合生成物の初期の数代継代を、上記のとおり２０％ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０で培養した。ＨＡＴ培地をハイブリドーマ選択のために使用した、２０％ＦＣＳ、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）、ＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸塩、インスリン培地補充）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地。ハイブリドーマ増殖のために、細胞をＨＴ培地、すなわち、２０％ＦＣＳ、ＨＴ（ヒポキサンチン、チミジン）、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。
【００３７】
実施例２
免疫化およびスクリーニングのための抗体
ヒト化抗ルイスＹ ＩｇＧ１抗体ｈｕ３Ｓ１９３（ロット：Ｄ０１０９７、１０ｍｇ／ｍｌ ＰＢＳ）、マウス３Ｓ１９３（ｍｕ３Ｓ１９３）、対照アイソタイプマッチドヒト化ｍＡｂ、ｈｕＡ３３（ロット：５ＧＭＡ３３ １０ｍｇ／ｍｌ）、および無関係のアイソタイプマッチドマウス：ヒトキメラＩｇＧ１抗体は、生物学的生産機関（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、ルートビッヒ癌研究協会（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、メルボルン、オーストラリア）によって供給された。精製ヒトＩｇＧはシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）から購入された。Ｆ（ａｂ）’２フラグメントを、メーカーの指示に従い免疫化ペプシンによる消化によって調製し（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州（ＩＬ）、米国）、非消化ｈｕ３Ｓ１９３および１ｍｌプロテインＡカラム（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）上の通過よってＦｃ含有フラグメントから精製した。精製フラグメントをミリポア遠心フィルタ（バイオマックス（Ｂｉｏｍａｘ）１０ｋ膜、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、シドニー、オーストラリア）上で１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【００３８】
実施例３
免疫化プロトコール
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを繁殖用施設、ウォルター・アンド・エリザ・ホール研究所（Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、メルボルン、オーストラリアから購入し、飼料および水を自由に与えて飼育した。本試験のために動物で実施されたすべての手順は、オースチン・アンド・レパトリエーション・メディカルセンター（Ａｕｓｔｉｎ ａｎｄ Ｒｅｐａｔｒｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ）の動物倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。免疫化前静脈血液サンプル（２００μｌ）を各動物から収集し、室温（ＲＴ）下に１時間、４℃下に一夜凝固させた。結果として生じる血清（約１００μｌ／マウス）を収集し、−２０℃下に保存した。
【００３９】
免疫化手順をマウス６匹で実施した。０日目、４０μｇ精製ｈｕ３Ｓ１９３：フロイント完全アジュバント（１：１、ｖ：ｖ）含有２００μｌの腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。マウスに対し１４日目および２８日目にフロイント不完全アジュバントでｈｕ３Ｓ１９３を４０μｇ含有するブースター注射を投与した。３５日目、免疫化後血液サンプルを尾静脈から収集し、マウス抗ｈｕ３Ｓ１９３抗体の血清力価をＥＬＩＳＡによって測定した。免疫化前血清サンプルを対照として含めた。３回目、４０μｇのｈｕ３Ｓ１９３のみを含有する最後の静脈内（ｉ．ｖ．）ブースター注射後４日にマウスを屠殺した。脾臓を無菌で５ｍｌ ＰＢＳ／Ｇに収集し、融合用に脾細胞懸濁液を調製した。
【００４０】
実施例４
融合およびハイブリドーマ生成
すべての手順を室温下に実施し、これらは以前に公表された方法に基づくものであった（１２）。脾細胞を収集し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、細胞濃度を測定した。同時に、融合パートナーＳＰ２／０細胞を回収し、血清を含まない培地中で洗浄し、計算した。各細胞ペレットを血清を含まないＲＰＭＩ ５ｍｌ中に再懸濁し、次いで５０ｍｌチューブに５：１比の脾細胞：ＳＰ２／０で混合した。細胞混合物を３００×ｇ、１０分遠心分離し、結果として生じる細胞ペレットを軽くたたくことによって静かに破壊した。チューブを３７℃の湯浴中にインキュベートし、培地（１ｍｌ）中５０％ＰＥＧを１分間にわたって滴下した。次いで、予熱した血清を含まないＲＰＭＩ（２ｍｌ）を２分にわたって添加した後、３分にわたって培地８ｍｌを添加した。細胞を３００×ｇ、１０分遠心分離し、ＨＡＴ培地（約１×１０ ５脾細胞、２×１０ ４ＳＰ２／０骨髄腫細胞を含有する６０ｍｌ ＨＡＴ培地／マウス脾臓）中に静かに再懸濁した。混合細胞懸濁液を６個の９６ウェル細胞培養プレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ニュージャージー州（ＮＪ）、米国）へ等分し（１００μｌ／ウェル）、加湿５％ＣＯ２／空気インキュベーター中３７℃下に培養した。
【００４１】
実施例５
モノクロナール抗体選択
ハイブリドーマ培養上清をｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂおよび精製ヒトＩｇＧとの陽性結合活性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。選択クローンを２４ウェル培養プレート（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））中で増殖させ、その結合活性および競合結合活性をさらにＥＬＩＳＡによって特徴づけた。培養上清中の選択抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体のサブクラスをマウスモノクロナール抗体アイソタイピング用キット（アイソストリップ（ＩｓｏＳｔｒｉｐ）、ロシュ・ディアグノスティックス・ゲーエムベーハー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で測定した。
【００４２】
実施例６
限界希釈によるハイブリドーマのクローニング
一次希釈系列
選択ハイブリドーマクローンを９６ウェルプレートの内側６０ウェル中の２００μｌ ＨＡＴ培地中１００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。外側ウェルを抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地で充填し、脱水およびウェルを含有するＨＡＴ培地／細胞の濃縮を阻止した。細胞成長がほぼ密集（約７日）であった場合、上清を収集し、ルイスＹ抗原結合のためのｈｕ３Ｓ１９３への特異的結合およびｈｕ３Ｓ１９３への拮抗薬結合について試験した。陽性クローンを継続的分析およびクローニングのために選択した。
【００４３】
二次希釈系列
本ステップは、単一の細胞から成長したハイブリドーマを確立することを目的とし、培養では脾細胞支持細胞層が利用された。脾細胞を非免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスから調製し、１００ｍＭ ２−メルカプトエタノールを補充した１０ ６細胞／ｍｌ ＨＡＴ培地に再懸濁し、滅菌環境下に室温で一夜インキュベートし、汚染感染がないことを確実にした。翌日、２つの９６ウェルマイクロタイタープレートを、既述どおり、使用したプレートの内側６０ウェルのみで各選択クローン用に調製した。ＨＡＴ培地のアリコート（１００μｌ）を列１に添加し、脾細胞懸濁液を列２−６（１０ ５細胞／ウェル）に添加し、プレートを３７℃下に一夜インキュベートした。選択細胞をＨＡＴ培地中に希釈し、１００、１０、５、１、または０．５細胞を含有する１００μｌのアリコートを、それぞれ、支持細胞を含有する２から６までの列のウェルに添加した。プレートを３７℃下に１０−１４日間インキュベートし、１または０．５細胞／ウェルで接種したウェルからクローンコロニーを選択した。
【００４４】
三次希釈系列
選択クローンが単一の細胞から由来することを確実にするために、すべての選択細胞系は反復回の二次希釈手順を受けた。好ましい系を増殖させ、ストックを調製し、液体窒素下に保存した。
【００４５】
実施例７
抗体産生
ハイブリドーマを産生する選択および再クローン化抗イディオタイプ抗体をローラーボトル（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ニューヨーク州（ＮＹ）、米国）で培養し、培養上清を無菌で回収した。抗イディオタイプ抗体を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８（バッファーＡ）で前平衡した５ｍｌプロテインＡセファロース迅速フロー（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）における親和性クロマトグラフィーによって精製した。２０カラム量バッファーＡでの洗浄後、２００ｍＭ ＮａＣｌ含有１００ｍＭグリシン−ＨＣＬ、ｐＨ２．７を使用して結合抗体を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８を使用して直ちに中和した。ＰＢＳへの４℃での一夜透析後、抗体を遠心フィルタ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、バイオマックス（Ｂｉｏｍａｘ）１０ｋ膜）で濃縮した。還元および非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を検査した。クマシーブルー染色によってタンパク質を視覚化した。ビオチニル化抗イディオタイプ抗体をＥＣＬタンパク質ビオチニル化モジュールキットを使用し、メーカーの指示（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従い調製した。
【００４６】
実施例８
結合特異性のＥＬＩＳＡ分析
ハイブリドーマ上清または精製抗イディオタイプ抗体の結合特異性をＥＬＩＳＡ分析によって特徴づけた。９６ウェルプレート（ヌンク・マキシソープ（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）をｈｕ３Ｓ１９３（１００μｌ、４．０μｇ／ｍｌ）、精製ヒトＩｇＧ、または炭酸バッファー（０．０５Ｍ、ｐＨ９．６）中の他の対照モノクロナール抗体で４℃下に一夜コーティングした。非特異的結合を３％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温（２３℃）下に２時間遮断した。上清または精製抗体の連続希釈（１：２−１：６３００）を調製し、ウェル当たり１００μｌアリコートを添加した。陽性（ｈｕＩｇＧ）および陰性（抱合体および基質のみ）対照を各アッセイで含めた。プレートを室温下に１時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、次いで１時間二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ抱合アルカリホスファターゼ（１００μｌ／ウェル、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：３０００希釈）と一緒にインキュベートした。結合抗体を発色団基質ｐ−ニトロフェニルリン酸基質（ＩＣＮバイオメディカルズ社（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、Ａｕｒｏｒａ、オハイオ州（Ｏｈａｉｏ）、米国）で検出した。光学密度をＶｍａｘキネティックマイクロプレートリーダー（モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｓｕｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）により４５０ｎｍで測定した。
【００４７】
実施例９
拮抗薬活性のＥＬＩＳＡ分析
選択抗イディオタイプ抗体をルイスＹ−抗原コートプレートへのｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂの結合を遮断するその能力について試験した。合成ルイスＹ四糖類は、モル比約３２：１でＢＳＡに結合されて入手可能である（アルバータ・リサーチ・カウンシル（Ａｌｂｅｒｔａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州（Ａｌｂｅｒｔａ）、カナダ）。ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク・マキシソープ（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ））をルイスＹ−ＢＳＡ 抗原（５０μｌ ３．０μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）でコーティングし、４℃下に一夜インキュベートした。プレートを室温下に２時間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで非特異的結合のために遮断した。ハーフログ連続希釈サンプル（上清または精製抗イディオタイプｍＡｂ）を各ウェルに添加した後、ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂ（５０μｌ、１μｇ／ｍｌ最終濃度）を添加した。室温下に１時間のインキュベーション後、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを使用し、結合ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂを検出し、広範な洗浄後、ＡＢＴＳ基質（２，２’−アジノ−ビス−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸、１００μｌ ４０μＭ／ウェル、ＩＣＮ）で視覚化した。光学密度（ＯＤ）をＶｍａｘキネティックマイクロプレートリーダーにより４１５ｎｍで測定した。
【００４８】
実施例１０
Ｈｕ３Ｓ１９３の抗イディオタイプ特異性
抗ルイスＹ ｍＡｂへの結合の精製選択クローンの特異性をさらに、ｈｕ３Ｓ１９３、およびマウスｍＡｂ ｍｕ３Ｓ１９３およびＢＲ５５．２（ルートビッヒ癌研究協会（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）ｈｕ３Ｓ１９３を使用して検査した。特異性を２つのＥＬＩＳＡで検査した。第１のＥＬＩＳＡでは結合イディオタイプｍＡｂの捕捉および検出のための抗イディオタイプが利用され、第２のＥＬＩＳＡでは溶液中でイディオタイプ抗ルイスＹ ｍＡｂに結合し、ルイスＹ抗原結合を阻害する抗イディオタイプｍＡｂの能力が検査された。
【００４９】
第１のアッセイでは、ＥＬＩＳＡマキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）プレートを選択抗イディオタイプｍＡｂで一夜、４℃下にコーティングした（１００μｌ ４μｇ／ｍｌ ０．０５Ｍ炭酸バッファー、ｐＨ９．６）。３％ＦＣＳ／ＰＢＳによる遮断後、連続希釈した１０μｇ／ｍｌのｈｕ３Ｓ１９３、ｍｕ３Ｓ１９３、ＢＲ５５．２の３部サンプル、および無関係の対照ｍＡｂ ｈｕＡ３３およびｍｕＡ３３をウェルに添加し、次いで室温下に１時間インキュベートした。洗浄後、結合ｍＡｂをビオチニル化抗イディオタイプｍＡｂ（ＬＭＨ−３−Ｂｔ、４℃下に一夜、１％ＦＣＳ／ＰＢＳ中１００μｌ／ウェル ４μｇ／ｍｌ）で検出した。結合複合体ストレパビジン−ＨＲＰの（１％ＦＣＳ／ＰＢＳ中１：１０００希釈、１００μｌ／ウェル）検出の後、着色のためにＡＢＴＳを添加した。ＯＤ４１５を既述どおりに測定した。
【００５０】
特異性の第２の試験のために、３つのＥＬＩＳＡプレートを合成ルイスＹ−ＢＳＡ抗原でコーティングした（ＰＢＳ中４．０μｇ／ｍｌ、４℃下に一夜）。次いで、連続希釈抗ルイスＹｍＡｂをプレートの各列上に等分した、プレート１、ｈｕ３Ｓ１９３、プレート２、ｍｕ３Ｓ１９３、プレート３ ＢＲ５５．２最終濃度範囲（０．００３−１０μｇ／ｍｌ）。ルイスＹ抗原への結合の競合を試験するために、他の２つの抗ルイスＹ ｍＡｂおよび２つの抗イディオタイプｍＡｂを２部で（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）添加し、次いで室温下に１時間インキュベートした。洗浄後、プレート１における結合ｈｕ３Ｓ１９３を抗ｈｕＩｇＧ−ＨＲＰ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１％ＦＣＳ／ＰＢＳ中１００μｌ １：１０００）の後、着色のためのＡＢＴＳで検出し、Ａ４１５ｎｍで測定した。プレート２における結合ｍｕ３Ｓ１９３およびプレート３におけるＢＲ５５．２をヤギ抗−ｍＩｇＧアルカリホスファターゼで検出し、ｐ−ニトロフェノール色原体をＡ４０５で測定した。
【００５１】
実施例１１
血清中のＨｕ３Ｓ１９３のＥＬＩＳＡ測定
血清サンプル中のｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂを試験するために２つのＥＬＩＳＡアッセイが開発された。第１のアッセイでは、合成ルイスＹ−ＢＳＡ抗原（ＰＢＳ中３．０μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）をｈｕ３Ｓ１９３捕捉のために利用した。健康ドナー血清中のｈｕ３Ｓ１９３の連続希釈サンプルまたは３％ＢＳＡ／ＰＢＳによるインキュベーション後、抗原に結合するｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂの量をヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体およびＡＢＴＳ基質で検出した。
【００５２】
第２のアッセイには抗イディオタイプ抗体によるコーティングおよびビオチニル化抗イディオタイプ抗体による検出が含まれた。プレートを抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体（０．０５Ｍ炭酸バッファーｐＨ９．６中３．０μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）で一夜、４℃下にコーティングし、次いで２時間、室温（２３℃）下に３％ＢＳＡ／ＰＢＳで遮断した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳまたは健康ドナー血清中のｈｕ３Ｓ１９３（０．０３１５−１０μｇ／ｍｌ）の連続希釈サンプルを３部でプレートに添加し、１時間、室温下にインキュベートした。戦場後、ビオチニル化抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体を添加し（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１００μｌ ３μｇ／ｍｌ）、１時間、室温下にインキュベートした。結合複合体ストレパビジン−ＨＲＰの（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：１０００希釈、１００μｌ／ウェル）検出の後、着色のためにＡＢＴＳを添加した。ＯＤ４１５を既述どおりに測定した。
【００５３】
バイオセンサー分析：
カルボキシメチルデキストランコートセンサーチップ（ＣＭ５）上でＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用してバイオセンサー分析を実施した。チップをチャンネル２でｈｕ３Ｓ１９３、チャンネル３でＬＭＨ−３、およびチャンネル４でウシ血清アルブミン（アルバータ・リサーチ・カウンシル（Ａｌｂｅｒｔａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）、Ｅｄｍｏｎｔｏｎ、アルバータ州（Ａｌｂｅｒｔａ）、カナダ）に結合した合成ルイスｙ四糖類により、標準ＮＨＳ／ＥＤＣアミン結合化学を使用して誘導体化した。ｈｕ３Ｓ１９３およびＬＭＨ−３のサンプルをＨＢＳバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭジ−Ｎａ−ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）、およびアリコート（３０μｌ）を５μｌ／分の流量でセンサーチップ表面にわたって注入した。注入相後、３００秒間チップ表面上にＨＢＳバッファーを流すことによって解離をモニタリングした。結合抗体を溶出し、１００ｍＭグリシン／１００ｍＭ ＮａＣＬ、ｐＨ２．７、２０μｌの注入によってサンプル間でチップ表面を再生した。結合の動態分析にために、各種濃度のｈｕ３Ｓ１９３およびＬＭＨ−３をセンサーチップ表面上に注入した。明らかな結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を二価分析モデルを使用し、Ｒｍａｘの計算のための全体的、およびローカル適合により、ＢＩＡ評価ｖ３．０ソフトウェア（ファルマシア・バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して計算した。
【００５４】
投与されたモノクロナール抗体に対する患者の免疫反応は、患者血清のバイオコア（Ｂｉｏｃｏｒｅ）（登録商標）分析によって評価されうる（リッター（Ｒｉｔｔｅｒ）、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、２００１年）。抗イディオタイプ抗体は、これらの分析において陽性対照試薬として有用である。したがって、ＬＭＨ−３を健康ドナー血清（３−５０μｇ／ｍｌ）に添加し、免疫化ｈｕ３Ｓ１９３に対する結合反応を確認した。
【００５５】
実施例１２
マウス免疫化およびハイブリドーマクローン選択
３群のＢＡＬＢ／ｃマウスを繰り返しｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂで免疫化し、その血清をマウス抗ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂ活性について評価した。血清サンプルの免疫化前後の免疫活性は、高力価のマウス抗無傷およびＦ（ａｂ）’２ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂの進展を示した。アイソタイプ対照ヒト化ＩｇＧ（ｈｕＡ３３）またはキメラＩｇＧＦ（ａｂ）’２でコーティングされたプレートも強い陽性結合を示した（結果は示さず）。マウスを屠殺し、その脾臓を除去した。脾細胞およびパートナー融合Ｓｐ２／０形質細胞腫細胞を融合し、これら３つの融合からのハイブリドーマをスクリーニングした。ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対して強い結合活性を示すが、対照ｈｕＡ３３または精製ヒトＩｇＧに対しては弱い結合を示し、または結合を示さない３−４ウェルのみを選択し、増殖させた。増殖後、抗体特異性をさらにＥＬＩＳＡアッセイで試験した（図１）。３つの対照ヒト化またはキメラ抗体を第１の融合からのクローンの選択中に使用した。交差結合活性が通常、精製ヒトＩｇＧコーティングプレートで確認されたため、その後のスクリーニングにおいてｈｕ３Ｓ１９３に加えて精製ヒトＩｇＧを主に使用した。
【００５６】
実施例１３
選択抗イディオタイプ抗体の結合および遮断活性
すべての選択ハイブリドーマの結合および拮抗薬活性をさらに分析し、抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体を産生するハイブリドーマを確認した。ハーフログ連続希釈を各ハイブリドーマ培養上清から調製し、ＥＬＩＳＡによって評価した。最初に選択された１２個のクローンのうち、ｈｕ３Ｓ１９３に結合するが、ｈｕＩｇＧには結合せず、ｈｕ３Ｓ１９３のルイスＹ抗原への結合を阻害しうる３つを確認した（図１）。これらのハイブリドーマ、Ｆ１−１、Ｆ２−３、およびＦ３−２７を限界希釈によって単一の細胞からクローン化し、それぞれ、ルートビッヒ癌研究協会（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）メルボルン（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）ハイブリドーマ（ＬＭＨ）−１、ＬＭＨ−２、およびＬＭＨ−３と指名された。クローンの１つ（ＦＳ２−１）は、すべての試験されたキメラヒト化ｍＡｂもしくは精製ｈｕＩｇＧまたは（図１）に対する強い抗ｈｕＩｇＧ結合活性を示し、その後にｈｕＩｇＧ結合に対する陽性対照として使用された。このクローンは単一の細胞から調製され、ＬＭＨ−４を命名された。ＬＭＨ−１から−４までの抗体は、マウスモノクロナール抗体アイソタイピング用キットによってアイソタイプＩｇＧ１ｅとして確認され、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって培養上清から精製された。４つのクローンの結合特異性がＥＬＩＳＡによって確認された（図４Ａ−Ｃ）。ｈｕＩｇＧ定常鎖との交差反応は、ＬＭＨ−１、−２、またはー３では確認されず（図４Ｂ）、３つの抗体はすべて特異的にｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂのみに結合された（図４Ａ）。これらの抗体の拮抗薬活性は、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって分析された。ＬＭＨ−１、−２、および−３抗ｈｕ３Ｓ１９３イディオタイプ抗体は、ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに結合し、ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂのルイスＹ抗原への結合を用量依存的に阻害する（図２）。
【００５７】
実施例１４
抗体結合親和性の測定
溶液中でＬＭＨ−３と相互作用する固定化ｈｕ３Ｓ１９３のバイオセンサー結合実験の明らかな結合親和性では、４．７６×１０８Ｍ−１（Ｋｄ＝２．１０×１０−９Ｍ）のＫａが測定された。チップ上に固定化されたＬＭＨ−３、および分析物として表面上を走るｈｕ３Ｓ１９３との相互実験において、９．１２×１０８Ｍ−１（Ｋｄ＝１．１０×１０−９Ｍ）のＫａが測定された。
【００５８】
実施例１５
Ｈｕ３Ｓ１９３に対する抗イディオタイプ特異性
３Ｓ１９３イディオタイプに対するクローンＬＭＨ−２およびＬＭＨ−３の特異性がこれらの実験で確認された（図５）。プロテインＡ精製ＬＭＨ−３をＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、連続希釈した１０μｇ／ｍｌのｈｕ３Ｓ１９３、ｍｕ３Ｓ１９３、ＢＲ５５．２の３部サンプル、および対照ＩｇＧ１ ｍＡｂ ｈｕＡ３３およびｍｕＡ３３をウェルに添加し、さらにＬＭＨ−３の結合特異性を特徴づけた。このクローンの追加の好ましい特徴は、ビオチニル化ＬＭＨ−３がＬＭＨ−３で捕捉された結合３Ｓ１９３ｍＡｂの検出に利用されうることであった。ＥＬＩＳＡの結果（図３Ａ）は、ＬＭＨ−３が特異的に抗ルイスＹ３Ｓ１９３イディオタイプに結合し、マウス抗ルイスＹＢＲ５５．２との反応性は検出されず、対照ｍｕＡ３３およびｈｕＡ３３のマウスおよびヒトＩｇＧ１定常ドメインとの交差反応はなかったことを示した。ｈｕ３Ｓ１９３およぶｍｕ３Ｓ１９３のルイスＹ抗原への結合は、１０μｇ／ｍｌ ＬＭＨ−２およびＬＭＨ−３によって溶液中で有効に競合したが、抗イディオタイプ結合部位の飽和時には、一部のｈｕ３Ｓ１９３およびｍｕ３Ｓ１９３の抗原への結合は確認されなかった（それぞれ、図３Ｂおよび３Ｃ）。マウスＢＲ５５．２ｍＡｂは一部の競合結合をもたらしたが、高い親和性のｍｕ３Ｓ１９３は、最高濃度（１０μｇ／ｍｌ）での場合を除き、ｈｕ３Ｓ１９３のルイスＹ抗原への結合を完全に遮断した（図３Ｂ）。プレート２相互実験においては、低い親和性のｈｕ３Ｓ１９３は、ｍｕ３Ｓ１９３が最初にウェルに添加されると、ルイスＹ抗原に競合しえなかった（図３Ｃ）。プレート３からの結果（図３Ｄ）は、ＢＲ５５．２のルイスＹ抗原への結合が、ｈｕ３Ｓ１９３または抗イディオタイプクローンＬＭＨ−２および−３と競合せず、またはこれらによって阻害されないことを示す。したがって、３Ｓ１９３イディオトープに対するこれらクローンの特異性が確認される。図３Ｂにおいて確認されるＢＲ５５．２による競合は、その異なるルイスＹエピトープへの高い親和性結合に対する立体障害により達成されうる。
【００５９】
実施例１６
臨床サンプルにおけるＨｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイの開発
第１のＥＬＩＳＡアッセイでは、血清および検出用のペルオキシダーゼと抱合された二次ヤギ抗ヒトＩｇＧにおけるｈｕ３Ｓ１９３の捕捉用に使用された合成抗原（ルイスＹ四糖類−ＢＳＡ抱合体）が調査された。合成ルイスＹ抗原は、記録された低い光学密度によって示されるアッセイ感度を削減した、ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対する比較的低い親和性を有する。二次抱合抗体ではすべてのヒト免疫グロブリンが検出され、したがって高いノイズが分析したすべてサンプルで確認された（図４Ａ）。高いノイズ干渉が、特に低い血清ｈｕ３Ｓ１９３濃度でアッセイの感度および精度を大幅に削減する。第２のＥＬＩＳＡアッセイでは、コーティング用に精製抗イディオタイプｈｕ３Ｓ１９３抗体ＬＭＨ−１、２、および−３が使用され、二次抗体としてビオチニル化ＬＭＨ−１、−２、または−３が使用され、かつ結合複合体の視覚化用にストレパビジン−ＨＲＰおよびＡＢＴＳ基質が使用された。ＬＭＨ−１およびＬＭＨ−２抗イディオタイプ抗体は、血清中または３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中でｍｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対する強い結合示したが、ｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対しては弱い結合を示した。しかし、ヒト化ｍＡｂ、キメラｍＡｂ、マウスｍＡｂ、ヒト血清由来のＩｇまたはマウス血清由来のＩｇを含む対照抗体では交差結合活性は確認されなかった（図４Ｂ）。コーティング抗体または二次抗体の濃度を変更し、かつ異なるコーティングバッファーを使用することによってＬＭＨ−１およびＬＭＨ−２によるＥＬＩＳＡを最適化または改善する試みを調査した。一部の改善が達成されたが、反応パターンへの変化はもたらされなかった（データは示さず）。しかし、捕捉用のＬＭＨ−３抗イディオタイプｍＡｂおよび二次抗体としてＬＭＨ−３−ビオチンを使用することにより、最小の非特異的ノイズ活性を有する血清中でｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂおよびｍｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対する特異的に強い結合が確認された（図４Ｃ）。高再現性のアッセイは優れた感度を示し、血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３ｍＡｂまたはｍｕ３Ｓ１９３ｍＡｂに対する検出限界は３ｎｇ／ｍｌであった。
【００６０】
免疫反応のバイオコア分析
抗イディオタイプＬＭＨ−３を使用するｈｕ３Ｓ１９３に対する血清中のＨＡＨＡの測定が開発された。高感度で再現性の方法が確立され、確認された（図５）。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＥＬＩＳＡによって測定される抗−ｈｕ３Ｓ１９３モノクロナール抗体、ＬＭＨ−１（●）、−２（▽）、−３（◇）、および抗−ｈｕＩｇＧ−４（◇）の結合特異性を示す。
【図２】ＥＬＩＳＡによって検査されたハイブリドーマ培養上清のｈｕ３Ｓ１９３抗原結合活性を中和する能力について示す。
【図３】３Ｓ１９３イディオトープに対するＬＭＨ−２およびＬＭＨ−３の特異性の確認を示す。
【図４Ａ】患者血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡの開発を示す。
【図４Ｂ】患者血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡの開発を示す。
【図４Ｃ】患者血清サンプルにおけるｈｕ３Ｓ１９３を測定するためのＥＬＩＳＡの開発を示す。
【図５】ｈｕ３Ｓ１９３に対する血清ＨＡＨＡ反応のＢｉａｃｏｒｅ分析が最適化され、陽性対照としての抗イディオタイプＬＭＨ−３を使用して確認されたことを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ルイスＹモノクロナール抗体に対する抗イディオタイプ抗体。
【請求項２】
抗ルイスＹモノクロナール抗体の可変領域に結合する、請求項１記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項３】
抗ルイスＹモノクロナール抗体の結合を遮断する、請求項１記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項４】
ｈｕ３Ｓ１９３と特異的に結合する、請求項１記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項５】
モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項１記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項６】
モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項２記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項７】
モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項３記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項８】
モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項４記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗イディオタイプ抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項２に記載の抗イディオタイプ抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項３に記載の抗イディオタイプ抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項１２】
請求項４に記載の抗イディオタイプ抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項１３】
ＬＭＨ−１、ＬＭＨ−２、およびＬＭＨ−３からなる群から選択される、請求項１２記載のハイブリドーマ。
【請求項１４】
ＬＭＨ−１、ＬＭＨ−２、およびＬＭＨ−３からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される、請求項４記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項１５】
抗イディオタイプ抗体の結合特異性を検出する方法であって、
ａ．Ｅｌｉｓａプレートを抗ルイスＹ抗体、精製ヒトＩｇＧ、または他の対照Ｍａｂでコーティングし、
ｂ．精製抗イディオタイプ抗体を添加し、
ｃ．二次抗体と一緒にインキュベートし、および
ｄ．抗イディオタイプ抗体の抗体との結合が結合特異性を証明するところの、結合した抗イディオタイプ抗体の量を検出する、
ことを含む、方法。
【請求項１６】
前記ｍＡＢがｈｕ３Ｓ１９３である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗イディオタイプ抗体が抗ルイスＹ抗原に対して方向付けられる、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
抗ルイスＹモノクロナール抗体の結合の遮断能を有する抗イディオタイプ抗ルイスＹ抗体を検出する方法であって、
ａ．ＥｌｉｓａプレートをルイスＹ−ＢＳＡ結合抗原でコーティングし、
ｂ．抗イディオタイプ抗体を添加し、
ｃ．モノクロナール抗ルイスＹイディオタイプ抗体を添加し、および
ｄ．抗イディオタイプ抗体の存在および非存在下にて抗原と結合した抗ルイスＹ抗体の量が、抗ルイスモノクロナール抗体の結合を遮断する抗イディオタイプ抗体の能力の証拠である、結合抗ルイスＹモノクロナール抗体を検出する、
ことを含む、方法。
【請求項１９】
抗−抗ルイスＹモノクロナール抗体がｈｕ３Ｓ１９３である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記抗イディオタイプ抗体が抗ルイスＹ抗体に対して方向付けられる、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
血清サンプル中の抗ルイスＹ抗体を検出する方法であって、
ａ．ＥＬＩＳＡプレートを合成ルイスＹ−ＢＳＡ抗原でコーティングし、
ｂ．血清サンプルを前記ＥＬＩＳＡプレートに添加し、
ｃ．ペルオキシダーゼ抱合抗ルイスＹ抗イディオタイプ抗体をＥＬＩＳＡプレートに添加し、および
ｄ．抗ルイスＹ抗体の存在を抗原をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートと結合したペルオキシダーゼ抱合抗ルイスＹ抗イディオタイプ抗体の量から測定する、
ことを含む、方法。
【請求項２２】
前記モノクロナールイディオタイプ抗体がｈｕ３Ｓ１９３である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ヒト化抗ルイスＹモノクロナール抗体が投与されている対象における抗ルイスＹ ＨＡＨＡ反応を検出する方法であって、
ａ．血清サンプルを前記対象から収集し、
ｂ．前記血清サンプルをペルオキシダーゼ抱合抗ルイスＹ抗体の存在または非存在下にてルイスＹ抗原コーティングのＥＬＩＳＡプレートに反応させ、および
ｃ．そこで抗イディオタイプ抗ルイス抗体の存在がＨＡＨＡ反応を証明するところの、抗イディオタイプ抗ルイス抗体の存在または非存在を測定する
ことを含む、方法。
【請求項１】
抗ルイスＹモノクロナール抗体に対する抗イディオタイプ抗体。
【請求項２】
抗ルイスＹモノクロナール抗体の可変領域に結合する、請求項１記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項３】
抗ルイスＹモノクロナール抗体の結合を遮断する、請求項１記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項４】
ｈｕ３Ｓ１９３と特異的に結合する、請求項１記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項５】
モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項１記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項６】
モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項２記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項７】
モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項３記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項８】
モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項４記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗イディオタイプ抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項２に記載の抗イディオタイプ抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項１１】
請求項３に記載の抗イディオタイプ抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項１２】
請求項４に記載の抗イディオタイプ抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項１３】
ＬＭＨ−１、ＬＭＨ−２、およびＬＭＨ−３からなる群から選択される、請求項１２記載のハイブリドーマ。
【請求項１４】
ＬＭＨ−１、ＬＭＨ−２、およびＬＭＨ−３からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される、請求項４記載の抗イディオタイプ抗体。
【請求項１５】
抗イディオタイプ抗体の結合特異性を検出する方法であって、
ａ．Ｅｌｉｓａプレートを抗ルイスＹ抗体、精製ヒトＩｇＧ、または他の対照Ｍａｂでコーティングし、
ｂ．精製抗イディオタイプ抗体を添加し、
ｃ．二次抗体と一緒にインキュベートし、および
ｄ．抗イディオタイプ抗体の抗体との結合が結合特異性を証明するところの、結合した抗イディオタイプ抗体の量を検出する、
ことを含む、方法。
【請求項１６】
前記ｍＡＢがｈｕ３Ｓ１９３である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗イディオタイプ抗体が抗ルイスＹ抗原に対して方向付けられる、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
抗ルイスＹモノクロナール抗体の結合の遮断能を有する抗イディオタイプ抗ルイスＹ抗体を検出する方法であって、
ａ．ＥｌｉｓａプレートをルイスＹ−ＢＳＡ結合抗原でコーティングし、
ｂ．抗イディオタイプ抗体を添加し、
ｃ．モノクロナール抗ルイスＹイディオタイプ抗体を添加し、および
ｄ．抗イディオタイプ抗体の存在および非存在下にて抗原と結合した抗ルイスＹ抗体の量が、抗ルイスモノクロナール抗体の結合を遮断する抗イディオタイプ抗体の能力の証拠である、結合抗ルイスＹモノクロナール抗体を検出する、
ことを含む、方法。
【請求項１９】
抗−抗ルイスＹモノクロナール抗体がｈｕ３Ｓ１９３である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記抗イディオタイプ抗体が抗ルイスＹ抗体に対して方向付けられる、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
血清サンプル中の抗ルイスＹ抗体を検出する方法であって、
ａ．ＥＬＩＳＡプレートを合成ルイスＹ−ＢＳＡ抗原でコーティングし、
ｂ．血清サンプルを前記ＥＬＩＳＡプレートに添加し、
ｃ．ペルオキシダーゼ抱合抗ルイスＹ抗イディオタイプ抗体をＥＬＩＳＡプレートに添加し、および
ｄ．抗ルイスＹ抗体の存在を抗原をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートと結合したペルオキシダーゼ抱合抗ルイスＹ抗イディオタイプ抗体の量から測定する、
ことを含む、方法。
【請求項２２】
前記モノクロナールイディオタイプ抗体がｈｕ３Ｓ１９３である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ヒト化抗ルイスＹモノクロナール抗体が投与されている対象における抗ルイスＹ ＨＡＨＡ反応を検出する方法であって、
ａ．血清サンプルを前記対象から収集し、
ｂ．前記血清サンプルをペルオキシダーゼ抱合抗ルイスＹ抗体の存在または非存在下にてルイスＹ抗原コーティングのＥＬＩＳＡプレートに反応させ、および
ｃ．そこで抗イディオタイプ抗ルイス抗体の存在がＨＡＨＡ反応を証明するところの、抗イディオタイプ抗ルイス抗体の存在または非存在を測定する
ことを含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５２８８６８（Ｐ２００７−５２８８６８Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２３２８９（Ｐ２００６−５２３２８９）
【出願日】平成１６年８月１０日（２００４．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２５７８９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１９２７１
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【出願人】（５０５０２３７７７）ラドウィッグ・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１８日（２００７．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１０日（２００４．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２５７８９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１９２７１
【国際公開日】平成１７年３月３日（２００５．３．３）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【出願人】（５０５０２３７７７）ラドウィッグ・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ (2)
【氏名又は名称原語表記】Ｌｕｄｗｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
【Ｆターム（参考）】
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