抗体のクラスを変換する方法
【課題】 抗体のクラスを変更する方法の提供を目的とする。
【解決手段】 本発明は、抗体産生Ｂ細胞が産生するモノクローナル抗体の重鎖定常領域遺伝子を所望の他のクラスの重鎖定常領域遺伝子と置き換えた、キメラ重鎖抗体遺伝子を作製し、該キメラ遺伝子を元の抗体産生細胞へ形質導入することにより、所与のモノクローナル抗体産生Ｂ細胞を所望の他のクラスに変化した抗体を産生するＢ細胞に転換する手段を提供するものである。また、本発明の手段により取得される所望の他のクラスに変化した抗体も提供する。
【解決手段】 本発明は、抗体産生Ｂ細胞が産生するモノクローナル抗体の重鎖定常領域遺伝子を所望の他のクラスの重鎖定常領域遺伝子と置き換えた、キメラ重鎖抗体遺伝子を作製し、該キメラ遺伝子を元の抗体産生細胞へ形質導入することにより、所与のモノクローナル抗体産生Ｂ細胞を所望の他のクラスに変化した抗体を産生するＢ細胞に転換する手段を提供するものである。また、本発明の手段により取得される所望の他のクラスに変化した抗体も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体のクラスを変換する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は特定の抗原を認識することで、様々な生体内現象を惹起し、生体内防御の担い手として重要な役割を果たしている。特に、抗体による抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ；ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性や、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性は、ガン細胞などの除去に有効であることから制ガン剤としての用途に用いられている。このような抗体の作用に着目し、実用化された抗体製剤も多く、良好な治療効果を示す製剤も少なくない。さらに、医薬製剤としての用途以外においても、例えば、種々の診断検査薬、あるいは、研究開発上の有効なツールとして広く使用されている。従って、各用途に応じた種々の抗体を多量かつ容易に提供する技術が必要となってくる。
【０００３】
任意の抗原に対して高い特異性を持つ抗体を多量かつ容易に生産する技術として、ＡＤＬｉｂシステムと称される方法が注目を浴びつつある（特許文献１、非特許文献２参照）。この方法によると、所望の特異性及び親和性を有する抗体を簡便な方法により提供することができる。この方法により生産される抗体は、主としてＩｇＭであるが、上述した抗体の様々な用途に対応するためには、ＩｇＭ以外の他のクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）の抗体を調製する必要も生じてくる。
【０００４】
抗体のクラスを変換する方法としては、Ｂ細胞を特定の組成物で刺激することにより高い効率でＩｇＡクラスを発現させる方法（特許文献２）、トランスジェニック非ヒト動物を用いて所望のアイソタイプを産生させる方法（特許文献３）など、様々な方法が報告されているが、現在のところ、有効に実用化されるに至ったものは少ない。Ｂ細胞は本来抗体を産生する浮遊細胞であるため、高濃度の抗体産生、高密度培養などの点で、他の動物細胞発現系に無い長所があり、Ｂ細胞で所望のクラスの抗体産生が可能になることで、抗体産生の効率を向上することが可能になる。しかしながら、既にスクリーニングされたモノクローナル抗体産生Ｂ細胞に、抗体重鎖の定常領域遺伝子を形質導入し、産生モノクローナル抗体を他のクラスに変換する有効な手法は開発されていなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｅｏら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２３：７３１−７３５， ２００５
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００４／０１１６４４
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ９６／２７３９０
【特許文献３】国際公開公報ＷＯ９９／０３９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、抗体のクラスを簡便に変換する方法に関し鋭意研究を行った結果、抗体産生Ｂ細胞から産生される抗体の重鎖可変領域遺伝子と所望のクラスの重鎖定常領域遺伝子とのキメラ重鎖遺伝子を、主として該抗体産生Ｂ細胞に形質導入することのみで、所望のクラスの定常領域を保持した抗体を、該抗体産生Ｂ細胞から産生させ得ることを明らかにした。このような手法だけでは、細胞内で改変型キメラ抗体重鎖と既に存在する抗体軽鎖がアセンブリーするかどうかは不明であったが、解析の結果、意外にも有効な機能を保持するキメラＩｇＧの生成が確認された。この手法によれば、ＣＨＯ細胞などで行われているように軽鎖と重鎖の双方を形質転換する必要がないため、キメラ抗体の作製の手順が少なくとも１／２となる。また、本来抗体を産生している浮遊性のＢ細胞を用いるため、抗体の大量発現などに適した細胞株が容易に入手できるなどの利点があることが判明した。
よって、本発明は、産生する抗体のクラスが変換した抗体産生Ｂ細胞の調製方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「元来産生するモノクローナル抗体のクラスと異なるクラスの抗体を産生する抗体産生Ｂ細胞を改良又は調製する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法。
（ａ）抗体産生Ｂ細胞が元来産生するモノクローナル抗体の重鎖遺伝子の可変領域遺伝子と、他のクラスの定常領域遺伝子とを作用可能に連結したキメラ遺伝子を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製したキメラ遺伝子を発現ベクターに発現可能に挿入し、該発現ベクターを該抗体産生Ｂ細胞に形質導入する工程」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記モノクローナル抗体産生Ｂ細胞から元来産生される抗体のクラスがＩｇＭである上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記他のクラスがＩｇＧである上記（１）又は（２）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「前記抗体産生Ｂ細胞が、ＤＴ４０細胞である上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記抗体産生Ｂ細胞が、該細胞中に存在する全ての抗体重鎖遺伝子の機能を喪失しているものである上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記定常領域遺伝子が、マウス由来である上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記定常領域遺伝子が、ヒト由来である上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記定常領域遺伝子が、ウサギ由来である上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「上記（１）乃至（８）のいずれかに記載の方法により調製された細胞から取得した、クラスが変化した抗体」である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る方法を用いることにより、目的抗原に対するモノクローナルＩｇＭ抗体産生Ｂ細胞を、所望のクラスの特性を有する抗体を産生するＢ細胞に容易に転換することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．抗体産生細胞
本発明において使用する細胞は、抗体を産生するＢ細胞であればいかなるものでも使用することができ、由来する動物の種類も、いかなる動物であってもよい。また、株化されたものでも、されていないものでも使用できるが、好ましくは、株化された細胞が使用され、特に好ましくは、ニワトリ由来Ｂ細胞の株化培養細胞であるＤＴ４０細胞である。
さらに、抗体産生細胞は、染色体に何らかの修飾（例えば、特定の遺伝子の組換え、挿入、削除等）が加えられた、誘導体株、サブラインも含む。例えば、元来保持していた抗体重鎖遺伝子の機能を低下又は喪失させるために修飾を加えた細胞であってもよい。抗体重鎖遺伝子の機能を低下又は喪失させる方法は、当該技術常識に基づいて容易に実施可能であるが、例えば、元来抗体産生細胞に内在する抗体重鎖遺伝子に突然変異を導入する方法、目的遺伝子全体を破壊する方法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法、目的遺伝子に対するアンチセンスを細胞内に導入する方法等、当業者にとって周知の方法が使用可能である。好ましくは、目的遺伝子に突然変異を導入する方法、目的遺伝子全体を破壊する方法又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法であり、より好ましくは、目的遺伝子全体を破壊する方法又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法であり、最も好ましくは、目的遺伝子全体を破壊する方法である。
【００１０】
本発明で用いる細胞の培養条件は当該技術分野において周知の方法によって行われるが、選択される抗体産生Ｂ細胞に適した培地、培養条件（培養温度、ＣＯ２濃度）下で行われることは言うまでもない。しかして、選択される抗体産生細胞がＤＴ４０細胞である場合、例えば、培地はＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、培養温度は例えば３９．５℃、５％のＣＯ２濃度条件下で行う。培養は、細胞濃度を一定に保ちながら行い、適当な期間毎（例えば、日毎、週毎）に目的の細胞から産生される抗体のクラスのチェックを行う。
【００１１】
２．キメラ抗体重鎖遺伝子の調製
本発明を実施するにあたり、目的の抗体産生Ｂ細胞から元来産生される抗体の重鎖遺伝子の調製は、当該技術分野における通常の技術常識に基づいて行うことができる。例えば、目的の抗体産生Ｂ細胞からＲＴ−ＰＣＲ法などを用いて、目的の抗体重鎖遺伝子領域を増幅し、適当なベクター等にクローニングすることができる。この場合、ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーは、抗体産生細胞の所持する遺伝子に関する公知のデータベースなどから、抗体重鎖遺伝子の配列情報を取得し、この情報に基づいて容易に設計することができる。
また、元来産生している抗体の重鎖遺伝子の定常領域を他のクラスの定常領域と置き換えるためには、他のクラスの定常領域をコードする遺伝子を調製する必要がある。この遺伝子は、当該他のクラスの定常領域が由来する細胞などのライブラリーなどから取得するか、または、公知の遺伝子配列情報に基づいて、適当なｃＤＮＡライブラリーなどから、目的の遺伝子をＰＣＲ法により増幅することができる。
【００１２】
取得した抗体産生Ｂ細胞由来の抗体重鎖遺伝子の可変領域遺伝子と、他のクラスの定常領域遺伝子を作用可能に連結する必要がある。ここで、「作用可能に」とは、可変領域遺伝子と他のクラスの定常領域遺伝子とを連結した場合に、定常領域遺伝子が所望のポリペプチドを発現し得るように、すなわち、定常領域遺伝子の読み枠（フレーム）を可変領域遺伝子の読み枠と一致させた状態で連結させることを意味する。可変領域遺伝子と他のクラスの定常領域遺伝子とは直接結合されても、又は、スぺーサーとなるアミノ酸配列が挿入されていてもよい。スペーサーが挿入される場合でも、定常領域遺伝子が所望のポリペプチドを発現し得るように、その読み枠（フレーム）を調整する必要があることは言うまでもない。また、他のクラスの定常領域遺伝子に、さらなる遺伝子、例えば、精製を容易にするためのタグとなるようなペプチド（例えば、Ｈｉｓタグなどのエピトープタグペプチド、ＧＳＴなど）をコードする遺伝子などが作用可能に連結させてもよい。
上記のように作製したキメラ遺伝子は、抗体産生Ｂ細胞由来の抗体重鎖遺伝子の可変領域遺伝子がコードするポリペプチドに、他のクラスの定常領域遺伝子がコードするポリペプチドが連結されたキメラ状態の抗体重鎖ポリペプチドをコードする。
【００１３】
３．キメラ抗体遺伝子発現ベクターの細胞内への導入
作製したキメラ遺伝子を、適当な発現ベクターに組み込むことにより、キメラ状態の抗体重鎖ポリペプチドを発現させることができる。発現ベクターとしては、用いた抗体産生Ｂ細胞内で目的タンパク質を発現可能にする、プロモータ−、エンサンサーなどの構成要素を有するものがよい。
作製した発現ベクターの抗体産生Ｂ細胞への導入は、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法等、公知の方法を使用して容易に行うことができる。
【００１４】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
１．細胞培養
ＤＴ４０細胞の細胞培養は、基本的には、以下の方法で行った。培養機はＣＯ２恒温槽を用い、５％のＣＯ２存在下、３９．５℃で培養した。培地は、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、１０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、２−メルカプトエタノール ５５μＭを加えて使用した。また、トリコスタチンＡ（和光純薬）は、ＤＭＳＯ ２ｍｇ／ｍｌに溶解したものをストックとし、最終濃度が１．２５ｎｇ／ｍＬ、ｍ２．５ｎｇ／ｍＬとなるように、適宜培地で希釈して用いた。
【００１６】
２．抗ＦＩＴＣ抗体産生Ｂ細胞取得
ＦＩＴＣ共役ＢＳＡを抗原とし、ＡＤＬｉｂシステムにより抗体産生細胞を得た。具体的には以下の実験プロセスをとった。
２−１．ＦＩＴＣ共役ＢＳＡ磁気ビーズの作製：
磁気ビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｄｙｎａｌ社）を、また磁気スタンドはＤｙｎａｌ ＭＰＣ（Ｄｙｎａｌ社）を用いた。ビーズ２００μｌを５００μｌのバッファーＡ（０．１Ｍ Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ７．４）で３回洗った後、バッファーＡ２００μｌ中で１２０μｇのＦＩＴＣ共役ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）と３７℃で一晩、回転により攪拌しながら反応させた。次にビーズをバッファーＣ（ＰＢＳ＋０．１％ ＢＳＡ）、２００μｌで２回洗浄した。その後バッファーＤ（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、０．１％ ＢＳＡ）、２００μｌを加え、３７℃で４時間、回転により攪拌しながら反応させ、ブロッキングを行った。その後５００μｌのバッファーＣで２回洗浄した後、０．０２％アジ化ナトリウムを含むバッファーＣ２００μｌに懸濁した。
【００１７】
２−２．ＦＩＴＣ共役ＢＳＡ磁気ビーズによる抗体産生クローンの選択
トリコスタチンＡ、２．５ｎｇ／ｍｌで処理した野生型ＤＴ４０細胞約１×１０８個を洗浄バッファー（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）１０ｍｌで１回、さらに１ｍｌで一回洗浄したのち、１ｍｌの洗浄バッファー中でＦＩＴＣ共役ＢＳＡ磁気ビーズ５×１０６個と混合し、４℃で３０分間、穏やかに回転させつつインキュベートした。その後１ｍｌの洗浄バッファーで５回洗浄した。最後に、磁気ビーズに結合した細胞を５００μｌに懸濁し、これを３０ｍｌの培地に加えたのち、９６穴プレートに３００μｌずつ分注し、３９．５℃で培養した。
【００１８】
２−３．抗ＦＩＴＣ抗体産生クローンのスクリーニング
ＥＬＩＳＡは以下のとおりに行った。上記２−２のステップの６日後、ＦＩＴＣ共役ＢＳＡ ２．５μｇ／ｍＬで９６穴イムノプレートＵ−９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ （Ｎｕｎｃ社）に１００μＬずつ分注し一晩放置した。なお、抗体の特異性を検討するために、コントロールとしてＦＩＴＣラベルしていない、ＢＳＡも同様にプレートに固定した。翌日プレートの中身を捨て、ブロッキングバッファー（０．５％ スキムミルクを含むＰＢＳ）２００μＬを入れ、室温で２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μＬで３回洗浄した。上記２−２で選別して生じたコロニー由来の培養上清それぞれ１００μＬを入れ、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄したのち、二次抗体をＰＢＳで２０００倍に希釈したものを１００μＬ入れ、室温で４５分インキュベートした。なお二次抗体は抗ニワトリＩｇＭ−ＨＲＰ（ＢＥＴＨＹＬ社）を使用した。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄したのち、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）１００μＬ入れ、１０分インキュベートした。その後反応を１Ｎの硫酸１００μＬで停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００１９】
３． 抗ＦＩＴＣニワトリＩｇＭとマウスＩｇＧ２ａキメラ抗体（以下、キメラ抗体）遺伝子の作製
３−１．トータルＲＮＡ抽出
抗ＦＩＴＣ抗体産生細胞からのトータルＲＮＡ抽出には、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し、キットに添付のマニュアルに従って抽出作業を行った。なお、その際、細胞ライセートの調製にはＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用した。
３−２．ＲＴ−ＰＣＲによる抗ＦＩＴＣニワトリＩｇＭ重鎖遺伝子の単離
抗ＦＩＴＣ抗体重鎖遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲにより単離した。ＲＴ−ＰＣＲはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを用いた。トータルＲＮＡ １μｌを鋳型とし、２種のプライマー（ＶＨ−Ｆ１：配列番号１、ＶＨ−Ｒ：配列番号２）を用いた。反応条件は以下の通りである。５５℃、３０ｍｉｎの後、９４℃で２ｍｉｎ処理し、９４℃１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分を２８サイクル行った。その後６８℃で５分インキュベートした。ＲＴ−ＰＣＲにより得られた重鎖断片はＤＨ５α株を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＴＡクローニングし、ｐＡＮＴＩ−ＦＩＴＣ−ＨＣを得た。シークエンスの確認はＡＢＩ社ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７シーケンサーにより行った。
【００２０】
３−３．マウスＩｇＧ２ａの単離
マウスＩｇＧ２ａクローニングはＭｏｕｓｅ Ｓｐｌｅｅｎ ＢＤ Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型とし、２種のプライマー（ｍＩｇＧ２ａＦ−１：配列番号３、ｍＩｇＧ２ａＲ−１：配列番号４）を用いてＰｙｒｏｂｅｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）によりＰＣＲにて行った。反応条件は以下の通りである。９８℃２分の後、９８℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクルの後、７２℃で５分反応させた。ここで得られたマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域断片は、ＥｘＴａｑ（宝酒造）を加えて７２℃１５分反応させることで「Ａ」を付加し、ＤＨ５α株を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＴＡクローニングし、ｐＭＩｇＧ２ａを得た。なお、シークエンスの確認はＡＢＩ社ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７シーケンサーにより行った。
【００２１】
３−４．抗ＦＴＩＣニワトリＩｇＭ−マウスＩｇＧ２ａ融合遺伝子作製
抗ＦＩＴＣニワトリＩｇＭとマウスＩｇＧ２ａキメラ抗体（以下、キメラ抗体）遺伝子は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲを用いて作成した。はじめに、 （ｉ）ｐＡＮＴＩ−ＦＩＴＣ−ＨＣを鋳型とし、プライマーはＶＨ−Ｆ１およびＧｄＩｇＭ−ＣＨ１＋ｍＩｇＧ２ａ−Ｒ：配列番号５の組み合わせ、さらに（ｉｉ）ｐＭＩｇＧ２ａを鋳型としてプライマーはＧｄＩｇＭ−ＣＨ１＋ｍＩｇＧ２ａ−Ｆ：配列番号６およびｍＩｇＧ２ａＲ−１：配列番号４で行った。なお、条件は９８℃２分の後、９８℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を１５サイクルの後、７２℃で５分反応させた。（ｉ）および（ｉｉ）で増幅されたバンドをＱｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により精製し、断片を１μＬずつ混合したものを鋳型とし、（ｉ）、（ｉｉ）と同様の反応条件でＰＣＲを行った。なお、プライマーはＶＨ−Ｆ１および、ｍＩｇＧ２ａＲ−１を用い、以下の条件で行った。得られたキメラ遺伝子断片はＥｘＴａｑ（宝酒造）を加えて７２℃１５分反応させることで「Ａ」を付加し、ＤＨ５α株を用いてｐＣＲ２．１ベクターにＴＡクローニングし、ｐＡＮＴＩ−ＦＩＴＣ−ｍＧ２ａを得た。シークエンスの確認はＡＢＩ社ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７シーケンサーにより行った。
【００２２】
４．キメラ抗体遺伝子発現コンストラクト作製およびその導入
４−１．キメラ抗体発現コンストラクトの作製
発現ベクターはｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用した。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１を制限酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）（宝酒造）によりベクターの末端を平滑化したのち、ＢＡＰ（宝酒造）により脱リン酸化処理した。インサートとなるキメラ遺伝子は、ｐＡＮＴＩ−ＦＩＴＣ−ｍＧ２ａ由来のＥｃｏＲＩ断片を平滑化して得た。ベクター、インサートともにＱｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製したのち、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ２（宝酒造）によりライゲーションを行った。トランスフォーメーションはＤＨ５α株に行った。
【００２３】
４−２．遺伝子導入
上記４−１で得られたキメラ抗体の発現コンストラクトを、抗ＦＩＴＣ抗体産生株に遺伝子導入した。遺伝子導入は、エレクトロポレーションを用いて行った。約２０μｇ相当を制限酵素ＭｌｕＩにより消化して一本鎖にし、精製後、ＰＢＳ、５００μＬに溶解した。抗ＦＩＴＣ抗体産生株約１０７個に対し、約５５０Ｖ、２５μＦの条件でエレクトロポレーションを行ったのち氷上で１０分放置し、２０ｍＬの培地に移し、３７℃で一晩培養した。翌日培養液を遠心（１９０ｘｇ、１０分）し、細胞をペレットに回収後、２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む培地８０ｍＬに懸濁し、９６穴プレートに、２００μＬ／穴で分注した後、３９．５℃で培養した。
【００２４】
５．キメラ抗体の発現および抗原認識の確認
ＥＬＩＳＡは以下のとおりに行った。ＦＩＴＣ共役ＢＳＡ１０μｇ／ｍＬで９６穴イムノプレートＵ−９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ社）に１００μＬずつ分注し一晩放置した。なお、抗体の特異性を検討するために、コントロールとしてＦＩＴＣラベルしていない、ＢＳＡも同様にプレートに固定した。翌日プレートの中身を捨て、ブロッキングバッファー（０．５％ スキムミルクを含むＰＢＳ）２００μＬを入れ、室温で２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μＬで３回洗浄した。その後キメラ抗体産生候補クローン１８クローン由来の培養上清それぞれ１００μＬを入れ、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄したのち、二次抗体をＰＢＳで２０００倍に希釈したものを１００μＬ入れ、室温で４５分インキュベートした。なお二次抗体は抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＢＥＴＨＹＬ社）を使用した。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄したのち、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）１００μＬ入れ、１０分インキュベートした。その後反応を１Ｎの硫酸１００μＬで停止し、６５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１に示す。ナンバー３のクローンが、マウスＩｇＧ２ａとのキメラ抗体を発現していることが確認できた。
【００２５】
６．精製キメラ抗体の生化学的検証
上記５で調製したナンバー３のクローンからキメラ抗体を精製し、その特性についてさらに詳細な検討を加えた。
６−１．精製キメラ抗体の調製
６−１−１．ニワトリ血清成分の調製
５００ｘｇで遠心し、沈殿物を除去したニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｍＬに飽和硫安溶液１０ｍＬを加え、４℃で一晩硫安沈殿を行った。翌日９１００ｘｇで１５分間遠心し、上清をとった。再度９１００ｘｇで１５分間遠心し、上清をとった。上清は０．４５μｍのフィルター（ザルトリウス社）でろ過し、透析チューブ（スペクトラポア社、ＭＷＣＯ：３５００，９．３ｍＬ／ｃｍ）に移し、１ＬのＰＢＳに対し３回（うち２回は４時間、１回は一晩）、４℃で透析した。翌日透析チューブからサンプルを取り出し、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ ＹＭ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）により、２３３０ｘｇで１０ｍＬになるように濃縮した。濃縮後、０．２２μｍのフィルター（ザルトリウス社）により滅菌し、適量ずつ分注して−３０℃にて凍結保存した。
【００２６】
６−１−２．培養上製の作製
抗ＦＩＴＣのキメラ抗体産生ナンバー３のクローンを、無血清培地ＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、ニワトリ血清成分を５％添加して作製した培地（以下、「準無血清培地」と呼ぶ）で培養した。細胞を２ｘ１０６／ｍＬになるように準無血清培地で希釈したものを１４ｃｍシャーレ（Ｎｕｎｃ社）４枚分にそれぞれ５０ｍＬ（計２００ｍＬ）ずつ準備した。これをＣＯ２インキュベータで３９．５℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。ここで得られた培養液を２３３０ｘｇで１５分間遠心し、上清を回収した。上清は再度２３３０ｘｇで１５分間遠心し、これを培養上清とした。
【００２７】
６−１−３．キメラ抗体の精製
ＭａｂＴｒａｐ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）を用い、マニュアルに従ってキメラ抗体を精製した。ペリスタポンプを用い、ほぼ全量の培養上清をＭａｂＴｒａｐにかけた（コントロール用に１０ｍＬだけ分取した）。１０ｍＬのｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、５ｍＬのｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで溶出した。その際、１ｍＬずつ５本のフラクションで回収した。タンパク濃度が最大の溶出フラクション（Ｎｏ．２）をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（１０Ｋ）（ＰＩＥＲＣＥ社）によりＰＢＳに透析した。
【００２８】
６−２．精製キメラ抗体を用いたＥＬＩＳＡによる検討
精製キメラ抗体をｘ５，ｘ２５，ｘ１２５，ｘ６２５，ｘ３１２５，ｘ１５６２５倍希釈したものでＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いて、ＦＩＴＣに対してＥＬＩＳＡを行った。なお、ＥＬＩＳＡは「５．キメラ抗体の発現および抗原認識の確認」と同様に行った。結果を図２に示す。精製キメラ抗体がＥＬＩＳＡレベルでＦＩＴＣに反応していることを示している。
【００２９】
６−３．ウエスタンブロット法による精製キメラ抗体のキャラクタリゼーション
精製キメラ抗体をウエスタンブロットで解析した。４％ ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ社）で電気泳動し、ナイロンメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写後、５％スキムミルクでブロッキングし、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ二次抗体を反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１５分ずつ３回洗浄し、ＥＣＬ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）による化学発光でシグナルを得た。なおシグナルは、ＬＡＳ−１０００（富士写真フィルム）により検出した。結果を図３に示す。精製キメラ抗体は抗マウスＩｇＧ二次抗体に反応し、特異的なバンドが生じている。なお培養上清のレーンにおいて、キメラ抗体のバンドが精製キメラ抗体のそれよりも移動度が大きいが、これはＡＩＭ−Ｖ培地に含まれる、重鎖に分子量の近いタンパク質の量が極めて多いためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、抗体産生Ｂ細胞が産生する抗体のクラスを用途に応じた所望のクラスに変更させることができるため、抗体製剤、抗体診断薬等の分野、または、研究上のツールとして広く利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ＤＴ４０細胞が産生する抗ＦＩＴＣ抗体とマウスＩｇＧ２ａとのキメラ抗体の産生の有無を確認した結果を示す。
【図２】図２は、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いた精製したキメラ抗体に対するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３】図３は、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いた精製したキメラ抗体に対するウエスタンブトロティングの結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体のクラスを変換する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は特定の抗原を認識することで、様々な生体内現象を惹起し、生体内防御の担い手として重要な役割を果たしている。特に、抗体による抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ；ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性や、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）活性は、ガン細胞などの除去に有効であることから制ガン剤としての用途に用いられている。このような抗体の作用に着目し、実用化された抗体製剤も多く、良好な治療効果を示す製剤も少なくない。さらに、医薬製剤としての用途以外においても、例えば、種々の診断検査薬、あるいは、研究開発上の有効なツールとして広く使用されている。従って、各用途に応じた種々の抗体を多量かつ容易に提供する技術が必要となってくる。
【０００３】
任意の抗原に対して高い特異性を持つ抗体を多量かつ容易に生産する技術として、ＡＤＬｉｂシステムと称される方法が注目を浴びつつある（特許文献１、非特許文献２参照）。この方法によると、所望の特異性及び親和性を有する抗体を簡便な方法により提供することができる。この方法により生産される抗体は、主としてＩｇＭであるが、上述した抗体の様々な用途に対応するためには、ＩｇＭ以外の他のクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）の抗体を調製する必要も生じてくる。
【０００４】
抗体のクラスを変換する方法としては、Ｂ細胞を特定の組成物で刺激することにより高い効率でＩｇＡクラスを発現させる方法（特許文献２）、トランスジェニック非ヒト動物を用いて所望のアイソタイプを産生させる方法（特許文献３）など、様々な方法が報告されているが、現在のところ、有効に実用化されるに至ったものは少ない。Ｂ細胞は本来抗体を産生する浮遊細胞であるため、高濃度の抗体産生、高密度培養などの点で、他の動物細胞発現系に無い長所があり、Ｂ細胞で所望のクラスの抗体産生が可能になることで、抗体産生の効率を向上することが可能になる。しかしながら、既にスクリーニングされたモノクローナル抗体産生Ｂ細胞に、抗体重鎖の定常領域遺伝子を形質導入し、産生モノクローナル抗体を他のクラスに変換する有効な手法は開発されていなかった。
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｅｏら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２３：７３１−７３５， ２００５
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００４／０１１６４４
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ９６／２７３９０
【特許文献３】国際公開公報ＷＯ９９／０３９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、上記事情に鑑み、抗体のクラスを簡便に変換する方法に関し鋭意研究を行った結果、抗体産生Ｂ細胞から産生される抗体の重鎖可変領域遺伝子と所望のクラスの重鎖定常領域遺伝子とのキメラ重鎖遺伝子を、主として該抗体産生Ｂ細胞に形質導入することのみで、所望のクラスの定常領域を保持した抗体を、該抗体産生Ｂ細胞から産生させ得ることを明らかにした。このような手法だけでは、細胞内で改変型キメラ抗体重鎖と既に存在する抗体軽鎖がアセンブリーするかどうかは不明であったが、解析の結果、意外にも有効な機能を保持するキメラＩｇＧの生成が確認された。この手法によれば、ＣＨＯ細胞などで行われているように軽鎖と重鎖の双方を形質転換する必要がないため、キメラ抗体の作製の手順が少なくとも１／２となる。また、本来抗体を産生している浮遊性のＢ細胞を用いるため、抗体の大量発現などに適した細胞株が容易に入手できるなどの利点があることが判明した。
よって、本発明は、産生する抗体のクラスが変換した抗体産生Ｂ細胞の調製方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「元来産生するモノクローナル抗体のクラスと異なるクラスの抗体を産生する抗体産生Ｂ細胞を改良又は調製する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法。
（ａ）抗体産生Ｂ細胞が元来産生するモノクローナル抗体の重鎖遺伝子の可変領域遺伝子と、他のクラスの定常領域遺伝子とを作用可能に連結したキメラ遺伝子を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製したキメラ遺伝子を発現ベクターに発現可能に挿入し、該発現ベクターを該抗体産生Ｂ細胞に形質導入する工程」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記モノクローナル抗体産生Ｂ細胞から元来産生される抗体のクラスがＩｇＭである上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記他のクラスがＩｇＧである上記（１）又は（２）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「前記抗体産生Ｂ細胞が、ＤＴ４０細胞である上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記抗体産生Ｂ細胞が、該細胞中に存在する全ての抗体重鎖遺伝子の機能を喪失しているものである上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記定常領域遺伝子が、マウス由来である上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記定常領域遺伝子が、ヒト由来である上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記定常領域遺伝子が、ウサギ由来である上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「上記（１）乃至（８）のいずれかに記載の方法により調製された細胞から取得した、クラスが変化した抗体」である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る方法を用いることにより、目的抗原に対するモノクローナルＩｇＭ抗体産生Ｂ細胞を、所望のクラスの特性を有する抗体を産生するＢ細胞に容易に転換することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．抗体産生細胞
本発明において使用する細胞は、抗体を産生するＢ細胞であればいかなるものでも使用することができ、由来する動物の種類も、いかなる動物であってもよい。また、株化されたものでも、されていないものでも使用できるが、好ましくは、株化された細胞が使用され、特に好ましくは、ニワトリ由来Ｂ細胞の株化培養細胞であるＤＴ４０細胞である。
さらに、抗体産生細胞は、染色体に何らかの修飾（例えば、特定の遺伝子の組換え、挿入、削除等）が加えられた、誘導体株、サブラインも含む。例えば、元来保持していた抗体重鎖遺伝子の機能を低下又は喪失させるために修飾を加えた細胞であってもよい。抗体重鎖遺伝子の機能を低下又は喪失させる方法は、当該技術常識に基づいて容易に実施可能であるが、例えば、元来抗体産生細胞に内在する抗体重鎖遺伝子に突然変異を導入する方法、目的遺伝子全体を破壊する方法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法、目的遺伝子に対するアンチセンスを細胞内に導入する方法等、当業者にとって周知の方法が使用可能である。好ましくは、目的遺伝子に突然変異を導入する方法、目的遺伝子全体を破壊する方法又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法であり、より好ましくは、目的遺伝子全体を破壊する方法又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用する方法であり、最も好ましくは、目的遺伝子全体を破壊する方法である。
【００１０】
本発明で用いる細胞の培養条件は当該技術分野において周知の方法によって行われるが、選択される抗体産生Ｂ細胞に適した培地、培養条件（培養温度、ＣＯ２濃度）下で行われることは言うまでもない。しかして、選択される抗体産生細胞がＤＴ４０細胞である場合、例えば、培地はＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、培養温度は例えば３９．５℃、５％のＣＯ２濃度条件下で行う。培養は、細胞濃度を一定に保ちながら行い、適当な期間毎（例えば、日毎、週毎）に目的の細胞から産生される抗体のクラスのチェックを行う。
【００１１】
２．キメラ抗体重鎖遺伝子の調製
本発明を実施するにあたり、目的の抗体産生Ｂ細胞から元来産生される抗体の重鎖遺伝子の調製は、当該技術分野における通常の技術常識に基づいて行うことができる。例えば、目的の抗体産生Ｂ細胞からＲＴ−ＰＣＲ法などを用いて、目的の抗体重鎖遺伝子領域を増幅し、適当なベクター等にクローニングすることができる。この場合、ＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーは、抗体産生細胞の所持する遺伝子に関する公知のデータベースなどから、抗体重鎖遺伝子の配列情報を取得し、この情報に基づいて容易に設計することができる。
また、元来産生している抗体の重鎖遺伝子の定常領域を他のクラスの定常領域と置き換えるためには、他のクラスの定常領域をコードする遺伝子を調製する必要がある。この遺伝子は、当該他のクラスの定常領域が由来する細胞などのライブラリーなどから取得するか、または、公知の遺伝子配列情報に基づいて、適当なｃＤＮＡライブラリーなどから、目的の遺伝子をＰＣＲ法により増幅することができる。
【００１２】
取得した抗体産生Ｂ細胞由来の抗体重鎖遺伝子の可変領域遺伝子と、他のクラスの定常領域遺伝子を作用可能に連結する必要がある。ここで、「作用可能に」とは、可変領域遺伝子と他のクラスの定常領域遺伝子とを連結した場合に、定常領域遺伝子が所望のポリペプチドを発現し得るように、すなわち、定常領域遺伝子の読み枠（フレーム）を可変領域遺伝子の読み枠と一致させた状態で連結させることを意味する。可変領域遺伝子と他のクラスの定常領域遺伝子とは直接結合されても、又は、スぺーサーとなるアミノ酸配列が挿入されていてもよい。スペーサーが挿入される場合でも、定常領域遺伝子が所望のポリペプチドを発現し得るように、その読み枠（フレーム）を調整する必要があることは言うまでもない。また、他のクラスの定常領域遺伝子に、さらなる遺伝子、例えば、精製を容易にするためのタグとなるようなペプチド（例えば、Ｈｉｓタグなどのエピトープタグペプチド、ＧＳＴなど）をコードする遺伝子などが作用可能に連結させてもよい。
上記のように作製したキメラ遺伝子は、抗体産生Ｂ細胞由来の抗体重鎖遺伝子の可変領域遺伝子がコードするポリペプチドに、他のクラスの定常領域遺伝子がコードするポリペプチドが連結されたキメラ状態の抗体重鎖ポリペプチドをコードする。
【００１３】
３．キメラ抗体遺伝子発現ベクターの細胞内への導入
作製したキメラ遺伝子を、適当な発現ベクターに組み込むことにより、キメラ状態の抗体重鎖ポリペプチドを発現させることができる。発現ベクターとしては、用いた抗体産生Ｂ細胞内で目的タンパク質を発現可能にする、プロモータ−、エンサンサーなどの構成要素を有するものがよい。
作製した発現ベクターの抗体産生Ｂ細胞への導入は、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法等、公知の方法を使用して容易に行うことができる。
【００１４】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００１５】
１．細胞培養
ＤＴ４０細胞の細胞培養は、基本的には、以下の方法で行った。培養機はＣＯ２恒温槽を用い、５％のＣＯ２存在下、３９．５℃で培養した。培地は、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、１０％ＦＢＳ、１％ニワトリ血清、ペニシリン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、２−メルカプトエタノール ５５μＭを加えて使用した。また、トリコスタチンＡ（和光純薬）は、ＤＭＳＯ ２ｍｇ／ｍｌに溶解したものをストックとし、最終濃度が１．２５ｎｇ／ｍＬ、ｍ２．５ｎｇ／ｍＬとなるように、適宜培地で希釈して用いた。
【００１６】
２．抗ＦＩＴＣ抗体産生Ｂ細胞取得
ＦＩＴＣ共役ＢＳＡを抗原とし、ＡＤＬｉｂシステムにより抗体産生細胞を得た。具体的には以下の実験プロセスをとった。
２−１．ＦＩＴＣ共役ＢＳＡ磁気ビーズの作製：
磁気ビーズはＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｄｙｎａｌ社）を、また磁気スタンドはＤｙｎａｌ ＭＰＣ（Ｄｙｎａｌ社）を用いた。ビーズ２００μｌを５００μｌのバッファーＡ（０．１Ｍ Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ７．４）で３回洗った後、バッファーＡ２００μｌ中で１２０μｇのＦＩＴＣ共役ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社）と３７℃で一晩、回転により攪拌しながら反応させた。次にビーズをバッファーＣ（ＰＢＳ＋０．１％ ＢＳＡ）、２００μｌで２回洗浄した。その後バッファーＤ（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、０．１％ ＢＳＡ）、２００μｌを加え、３７℃で４時間、回転により攪拌しながら反応させ、ブロッキングを行った。その後５００μｌのバッファーＣで２回洗浄した後、０．０２％アジ化ナトリウムを含むバッファーＣ２００μｌに懸濁した。
【００１７】
２−２．ＦＩＴＣ共役ＢＳＡ磁気ビーズによる抗体産生クローンの選択
トリコスタチンＡ、２．５ｎｇ／ｍｌで処理した野生型ＤＴ４０細胞約１×１０８個を洗浄バッファー（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）１０ｍｌで１回、さらに１ｍｌで一回洗浄したのち、１ｍｌの洗浄バッファー中でＦＩＴＣ共役ＢＳＡ磁気ビーズ５×１０６個と混合し、４℃で３０分間、穏やかに回転させつつインキュベートした。その後１ｍｌの洗浄バッファーで５回洗浄した。最後に、磁気ビーズに結合した細胞を５００μｌに懸濁し、これを３０ｍｌの培地に加えたのち、９６穴プレートに３００μｌずつ分注し、３９．５℃で培養した。
【００１８】
２−３．抗ＦＩＴＣ抗体産生クローンのスクリーニング
ＥＬＩＳＡは以下のとおりに行った。上記２−２のステップの６日後、ＦＩＴＣ共役ＢＳＡ ２．５μｇ／ｍＬで９６穴イムノプレートＵ−９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ （Ｎｕｎｃ社）に１００μＬずつ分注し一晩放置した。なお、抗体の特異性を検討するために、コントロールとしてＦＩＴＣラベルしていない、ＢＳＡも同様にプレートに固定した。翌日プレートの中身を捨て、ブロッキングバッファー（０．５％ スキムミルクを含むＰＢＳ）２００μＬを入れ、室温で２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μＬで３回洗浄した。上記２−２で選別して生じたコロニー由来の培養上清それぞれ１００μＬを入れ、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄したのち、二次抗体をＰＢＳで２０００倍に希釈したものを１００μＬ入れ、室温で４５分インキュベートした。なお二次抗体は抗ニワトリＩｇＭ−ＨＲＰ（ＢＥＴＨＹＬ社）を使用した。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄したのち、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）１００μＬ入れ、１０分インキュベートした。その後反応を１Ｎの硫酸１００μＬで停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００１９】
３． 抗ＦＩＴＣニワトリＩｇＭとマウスＩｇＧ２ａキメラ抗体（以下、キメラ抗体）遺伝子の作製
３−１．トータルＲＮＡ抽出
抗ＦＩＴＣ抗体産生細胞からのトータルＲＮＡ抽出には、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用し、キットに添付のマニュアルに従って抽出作業を行った。なお、その際、細胞ライセートの調製にはＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用した。
３−２．ＲＴ−ＰＣＲによる抗ＦＩＴＣニワトリＩｇＭ重鎖遺伝子の単離
抗ＦＩＴＣ抗体重鎖遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲにより単離した。ＲＴ−ＰＣＲはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲを用いた。トータルＲＮＡ １μｌを鋳型とし、２種のプライマー（ＶＨ−Ｆ１：配列番号１、ＶＨ−Ｒ：配列番号２）を用いた。反応条件は以下の通りである。５５℃、３０ｍｉｎの後、９４℃で２ｍｉｎ処理し、９４℃１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分を２８サイクル行った。その後６８℃で５分インキュベートした。ＲＴ−ＰＣＲにより得られた重鎖断片はＤＨ５α株を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＴＡクローニングし、ｐＡＮＴＩ−ＦＩＴＣ−ＨＣを得た。シークエンスの確認はＡＢＩ社ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７シーケンサーにより行った。
【００２０】
３−３．マウスＩｇＧ２ａの単離
マウスＩｇＧ２ａクローニングはＭｏｕｓｅ Ｓｐｌｅｅｎ ＢＤ Ｍａｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型とし、２種のプライマー（ｍＩｇＧ２ａＦ−１：配列番号３、ｍＩｇＧ２ａＲ−１：配列番号４）を用いてＰｙｒｏｂｅｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）によりＰＣＲにて行った。反応条件は以下の通りである。９８℃２分の後、９８℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分を３０サイクルの後、７２℃で５分反応させた。ここで得られたマウスＩｇＧ２ａのＦｃ領域断片は、ＥｘＴａｑ（宝酒造）を加えて７２℃１５分反応させることで「Ａ」を付加し、ＤＨ５α株を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にＴＡクローニングし、ｐＭＩｇＧ２ａを得た。なお、シークエンスの確認はＡＢＩ社ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７シーケンサーにより行った。
【００２１】
３−４．抗ＦＴＩＣニワトリＩｇＭ−マウスＩｇＧ２ａ融合遺伝子作製
抗ＦＩＴＣニワトリＩｇＭとマウスＩｇＧ２ａキメラ抗体（以下、キメラ抗体）遺伝子は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲを用いて作成した。はじめに、 （ｉ）ｐＡＮＴＩ−ＦＩＴＣ−ＨＣを鋳型とし、プライマーはＶＨ−Ｆ１およびＧｄＩｇＭ−ＣＨ１＋ｍＩｇＧ２ａ−Ｒ：配列番号５の組み合わせ、さらに（ｉｉ）ｐＭＩｇＧ２ａを鋳型としてプライマーはＧｄＩｇＭ−ＣＨ１＋ｍＩｇＧ２ａ−Ｆ：配列番号６およびｍＩｇＧ２ａＲ−１：配列番号４で行った。なお、条件は９８℃２分の後、９８℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃１分を１５サイクルの後、７２℃で５分反応させた。（ｉ）および（ｉｉ）で増幅されたバンドをＱｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により精製し、断片を１μＬずつ混合したものを鋳型とし、（ｉ）、（ｉｉ）と同様の反応条件でＰＣＲを行った。なお、プライマーはＶＨ−Ｆ１および、ｍＩｇＧ２ａＲ−１を用い、以下の条件で行った。得られたキメラ遺伝子断片はＥｘＴａｑ（宝酒造）を加えて７２℃１５分反応させることで「Ａ」を付加し、ＤＨ５α株を用いてｐＣＲ２．１ベクターにＴＡクローニングし、ｐＡＮＴＩ−ＦＩＴＣ−ｍＧ２ａを得た。シークエンスの確認はＡＢＩ社ＡＢＩｐｒｉｓｍ３７７シーケンサーにより行った。
【００２２】
４．キメラ抗体遺伝子発現コンストラクト作製およびその導入
４−１．キメラ抗体発現コンストラクトの作製
発現ベクターはｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用した。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１を制限酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、クレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）（宝酒造）によりベクターの末端を平滑化したのち、ＢＡＰ（宝酒造）により脱リン酸化処理した。インサートとなるキメラ遺伝子は、ｐＡＮＴＩ−ＦＩＴＣ−ｍＧ２ａ由来のＥｃｏＲＩ断片を平滑化して得た。ベクター、インサートともにＱｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製したのち、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ２（宝酒造）によりライゲーションを行った。トランスフォーメーションはＤＨ５α株に行った。
【００２３】
４−２．遺伝子導入
上記４−１で得られたキメラ抗体の発現コンストラクトを、抗ＦＩＴＣ抗体産生株に遺伝子導入した。遺伝子導入は、エレクトロポレーションを用いて行った。約２０μｇ相当を制限酵素ＭｌｕＩにより消化して一本鎖にし、精製後、ＰＢＳ、５００μＬに溶解した。抗ＦＩＴＣ抗体産生株約１０７個に対し、約５５０Ｖ、２５μＦの条件でエレクトロポレーションを行ったのち氷上で１０分放置し、２０ｍＬの培地に移し、３７℃で一晩培養した。翌日培養液を遠心（１９０ｘｇ、１０分）し、細胞をペレットに回収後、２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含む培地８０ｍＬに懸濁し、９６穴プレートに、２００μＬ／穴で分注した後、３９．５℃で培養した。
【００２４】
５．キメラ抗体の発現および抗原認識の確認
ＥＬＩＳＡは以下のとおりに行った。ＦＩＴＣ共役ＢＳＡ１０μｇ／ｍＬで９６穴イムノプレートＵ−９６ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ社）に１００μＬずつ分注し一晩放置した。なお、抗体の特異性を検討するために、コントロールとしてＦＩＴＣラベルしていない、ＢＳＡも同様にプレートに固定した。翌日プレートの中身を捨て、ブロッキングバッファー（０．５％ スキムミルクを含むＰＢＳ）２００μＬを入れ、室温で２時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）２００μＬで３回洗浄した。その後キメラ抗体産生候補クローン１８クローン由来の培養上清それぞれ１００μＬを入れ、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄したのち、二次抗体をＰＢＳで２０００倍に希釈したものを１００μＬ入れ、室温で４５分インキュベートした。なお二次抗体は抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＢＥＴＨＹＬ社）を使用した。ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー２００μＬで５回洗浄したのち、ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ社）１００μＬ入れ、１０分インキュベートした。その後反応を１Ｎの硫酸１００μＬで停止し、６５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１に示す。ナンバー３のクローンが、マウスＩｇＧ２ａとのキメラ抗体を発現していることが確認できた。
【００２５】
６．精製キメラ抗体の生化学的検証
上記５で調製したナンバー３のクローンからキメラ抗体を精製し、その特性についてさらに詳細な検討を加えた。
６−１．精製キメラ抗体の調製
６−１−１．ニワトリ血清成分の調製
５００ｘｇで遠心し、沈殿物を除去したニワトリ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｍＬに飽和硫安溶液１０ｍＬを加え、４℃で一晩硫安沈殿を行った。翌日９１００ｘｇで１５分間遠心し、上清をとった。再度９１００ｘｇで１５分間遠心し、上清をとった。上清は０．４５μｍのフィルター（ザルトリウス社）でろ過し、透析チューブ（スペクトラポア社、ＭＷＣＯ：３５００，９．３ｍＬ／ｃｍ）に移し、１ＬのＰＢＳに対し３回（うち２回は４時間、１回は一晩）、４℃で透析した。翌日透析チューブからサンプルを取り出し、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ ＹＭ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）により、２３３０ｘｇで１０ｍＬになるように濃縮した。濃縮後、０．２２μｍのフィルター（ザルトリウス社）により滅菌し、適量ずつ分注して−３０℃にて凍結保存した。
【００２６】
６−１−２．培養上製の作製
抗ＦＩＴＣのキメラ抗体産生ナンバー３のクローンを、無血清培地ＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、ニワトリ血清成分を５％添加して作製した培地（以下、「準無血清培地」と呼ぶ）で培養した。細胞を２ｘ１０６／ｍＬになるように準無血清培地で希釈したものを１４ｃｍシャーレ（Ｎｕｎｃ社）４枚分にそれぞれ５０ｍＬ（計２００ｍＬ）ずつ準備した。これをＣＯ２インキュベータで３９．５℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。ここで得られた培養液を２３３０ｘｇで１５分間遠心し、上清を回収した。上清は再度２３３０ｘｇで１５分間遠心し、これを培養上清とした。
【００２７】
６−１−３．キメラ抗体の精製
ＭａｂＴｒａｐ ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）を用い、マニュアルに従ってキメラ抗体を精製した。ペリスタポンプを用い、ほぼ全量の培養上清をＭａｂＴｒａｐにかけた（コントロール用に１０ｍＬだけ分取した）。１０ｍＬのｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、５ｍＬのｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒで溶出した。その際、１ｍＬずつ５本のフラクションで回収した。タンパク濃度が最大の溶出フラクション（Ｎｏ．２）をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｉｚｅｒ（１０Ｋ）（ＰＩＥＲＣＥ社）によりＰＢＳに透析した。
【００２８】
６−２．精製キメラ抗体を用いたＥＬＩＳＡによる検討
精製キメラ抗体をｘ５，ｘ２５，ｘ１２５，ｘ６２５，ｘ３１２５，ｘ１５６２５倍希釈したものでＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いて、ＦＩＴＣに対してＥＬＩＳＡを行った。なお、ＥＬＩＳＡは「５．キメラ抗体の発現および抗原認識の確認」と同様に行った。結果を図２に示す。精製キメラ抗体がＥＬＩＳＡレベルでＦＩＴＣに反応していることを示している。
【００２９】
６−３．ウエスタンブロット法による精製キメラ抗体のキャラクタリゼーション
精製キメラ抗体をウエスタンブロットで解析した。４％ ポリアクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ社）で電気泳動し、ナイロンメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写後、５％スキムミルクでブロッキングし、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ二次抗体を反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１５分ずつ３回洗浄し、ＥＣＬ ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）による化学発光でシグナルを得た。なおシグナルは、ＬＡＳ−１０００（富士写真フィルム）により検出した。結果を図３に示す。精製キメラ抗体は抗マウスＩｇＧ二次抗体に反応し、特異的なバンドが生じている。なお培養上清のレーンにおいて、キメラ抗体のバンドが精製キメラ抗体のそれよりも移動度が大きいが、これはＡＩＭ−Ｖ培地に含まれる、重鎖に分子量の近いタンパク質の量が極めて多いためと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、抗体産生Ｂ細胞が産生する抗体のクラスを用途に応じた所望のクラスに変更させることができるため、抗体製剤、抗体診断薬等の分野、または、研究上のツールとして広く利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ＤＴ４０細胞が産生する抗ＦＩＴＣ抗体とマウスＩｇＧ２ａとのキメラ抗体の産生の有無を確認した結果を示す。
【図２】図２は、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いた精製したキメラ抗体に対するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３】図３は、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ二次抗体を用いた精製したキメラ抗体に対するウエスタンブトロティングの結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
元来産生するモノクローナル抗体のクラスと異なるクラスの抗体を産生する抗体産生Ｂ細胞を改良又は調製する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法。
（ａ）抗体産生Ｂ細胞が元来産生するモノクローナル抗体の重鎖遺伝子の可変領域遺伝子と、他のクラスの定常領域遺伝子とを作用可能に連結したキメラ遺伝子を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製したキメラ遺伝子を発現ベクターに発現可能に挿入し、該発現ベクターを該抗体産生Ｂ細胞に形質導入する工程
【請求項２】
前記モノクローナル抗体産生Ｂ細胞から元来産生される抗体のクラスがＩｇＭである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記他のクラスがＩｇＧである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体産生Ｂ細胞が、ＤＴ４０細胞である請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記抗体産生Ｂ細胞が、該細胞中に存在する抗体重鎖遺伝子の機能を喪失しているものである請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記定常領域遺伝子が、マウス由来である請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記定常領域遺伝子が、ヒト由来である請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記定常領域遺伝子が、ウサギ由来である請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の方法により調製された細胞から取得した、クラスが変化した抗体。
【請求項１】
元来産生するモノクローナル抗体のクラスと異なるクラスの抗体を産生する抗体産生Ｂ細胞を改良又は調製する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程を含む方法。
（ａ）抗体産生Ｂ細胞が元来産生するモノクローナル抗体の重鎖遺伝子の可変領域遺伝子と、他のクラスの定常領域遺伝子とを作用可能に連結したキメラ遺伝子を作製する工程、
（ｂ）工程（ａ）で作製したキメラ遺伝子を発現ベクターに発現可能に挿入し、該発現ベクターを該抗体産生Ｂ細胞に形質導入する工程
【請求項２】
前記モノクローナル抗体産生Ｂ細胞から元来産生される抗体のクラスがＩｇＭである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記他のクラスがＩｇＧである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体産生Ｂ細胞が、ＤＴ４０細胞である請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記抗体産生Ｂ細胞が、該細胞中に存在する抗体重鎖遺伝子の機能を喪失しているものである請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記定常領域遺伝子が、マウス由来である請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記定常領域遺伝子が、ヒト由来である請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記定常領域遺伝子が、ウサギ由来である請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の方法により調製された細胞から取得した、クラスが変化した抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２９１０７３（Ｐ２００９−２９１０７３Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５６７５７（Ｐ２００６−２５６７５７）
【出願日】平成１８年９月２２日（２００６．９．２２）
【出願人】（５０５３６８５３１）株式会社カイオム・バイオサイエンス (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２２日（２００６．９．２２）
【出願人】（５０５３６８５３１）株式会社カイオム・バイオサイエンス (2)
【Ｆターム（参考）】
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