抗体の精製方法
【課題】抗体の変性あるいは凝集を引き起こさないｐＨ条件で使用可能な抗体の精製方法を提供する。
【解決手段】抗体を含有する混合液から抗体を精製するための方法であって、アニオン交換基を有する多孔膜を用いて、混合液から不純物を吸着除去する工程と、不純物を除去する工程の次に、トリプトファンを担持した吸着体を用いて抗体を吸着した後、溶出回収する工程とを含む。
【解決手段】抗体を含有する混合液から抗体を精製するための方法であって、アニオン交換基を有する多孔膜を用いて、混合液から不純物を吸着除去する工程と、不純物を除去する工程の次に、トリプトファンを担持した吸着体を用いて抗体を吸着した後、溶出回収する工程とを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の精製技術に関し、特にバイオ医薬品としての抗体の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、標的物質を高い特異性で認識し、結合する。そのため抗体は、研究用試薬や臨床検査試薬として極めて有用である。こと近年においては、種々の治療用抗体が開発され、従来治療が困難であったリウマチや癌などの分野において、画期的な治療薬として医療技術の進歩に大きく貢献している。抗体の精製方法は、大まかに培養及び精製の二工程を含む。培養工程においては、免疫した動物あるいは抗体産性能を持つ細胞を用いて、抗体を含有する血液、腹水、あるいは細胞培養液等が得られる。細胞培養液等には抗体以外の様々なタンパク質やデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等の不純物が含まれる。そのため、精製工程においては、不純物を減じ、抗体の純度を著しく高めることが求められる。
【０００３】
精製工程において重要な役割を果たしているのが、アフィニティリガンドとして用いられる黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のプロテインＡ、あるいはその組換え体であるプロテインＧである。プロテインＡ及びプロテインＧは抗体に対して非常に特異的であり、かつ高い親和性を有する。そのため、プロテインＡ及びプロテインＧを用いた抗体の精製方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。しかし、プロテインＡ及びプロテインＧは、通常、大変高価である。また、プロテインＡ及びプロテインＧを用いた抗体の精製工程では、ｐＨ３付近の低ｐＨ緩衝液のみが用いられる。そのため、プロテインＡ及びプロテインＧは、低ｐＨで変性する抗体には適用できず、また、適用できたとしても抗体の凝集を引き起こすことが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。しかし、ヒトへ投与した場合に、抗体の凝集体は抗原性を示すことが懸念されており、こと治療用抗体の製造においては、凝集体の除去及び残留量のモニタリングが求められる（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
さらに、プロテインＡ及びプロテインＧは、微生物由来のタンパク質であるため、プロテインＡ及びプロテインＧを含む抗体医薬品が投与された場合に、感受性の高い患者ではアナフィラキシー様の症状を引き起こす可能性がある（例えば、非特許文献３参照。）。そのため、抗体医薬品の製造工程の後段において、プロテインＡ及びプロテインＧを除去し、残留量をモニタリングすることが必須となる。
【０００５】
以上の課題を解決するため、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーを組み合わせた方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。また有機化学的に合成されたプロテインＡ模倣リガンドを用い、プロテインＡを用いない抗体の精製方法も報告されている（例えば、特許文献３参照。）。また、プロテインA模倣リガンドは、プロテインAそのものと比較すると、抗体の選択的吸着性が劣るため、吸着後に溶出した溶出液の抗体の精製度が充分でない。一方、弱酸性付近の緩衝液を用いてプロテインＡから抗体を脱離させる方法が報告されている（例えば、特許文献３参照。）。
【特許文献１】欧州特許第３１０７１９号明細書
【特許文献２】特開平７−２６７９９７号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０６４２８１号パンフレット
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Journal of Pharmaceutical Sciences）、２００７年、第９６巻、ｐ．１−２６
【非特許文献２】エイミー・Ｓ・ローゼンブルグ（Amy S. Rosenberg）著、「Overview S ignificance of Protein Aggregation to Therapeutic Protein Products」、[平成２ ０年９月１２日検索]、インターネット＜URL : http://www.fda.gov/cder/regulatory/follow_on/200512/200512_rosenberg.pdf＞
【非特許文献３】Ｅｄｓ．Ｃ．Ｓ．Ｆ．イースモン及びＣ．アドラム（Eds. C.S.F. Easmon and C. Adlam）著、「Staphylococci and Staphylococcal infections 2」、(英国)、アカデミック・プレス（Academic Press Inc.）、１９８３年、ｐ．４２９−４８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献２におけるイオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーを組み合わせた方法では、プロテインＡ及びプロテインＧに比べて結合特性が低いことから、汎用性に乏しく、抗体の工業的な生産に広く用いられるに至っていない。
【０００７】
また、特許文献３では、人工的に合成された化合物を用いる以上、プロテインＡ模倣リガンドを含む抗体医薬品が投与された場合、感受性の高い患者においてアナフィラキシー様の症状が引き起こされる可能性を免れない。さらに、特許文献３では、プロテインＡを用いた方法をベースにしている以上、上記課題の根本的な解決に至っていない。
【０００８】
かかる事情に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、抗体の変性あるいは凝集を引き起こさないｐＨ条件で使用可能であり、安価にかつ簡便に、高い精度で抗体を精製可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者らは、上記問題を解決するため、種々の吸着体及び精製方法について鋭意研究を重ねた結果、アニオン交換基が固定された多孔膜を用いて混合液をろ過することにより、不純物を除去する工程と、次いでトリプトファンを低分子リガンドとした吸着体を用いたアフィニティカラムで抗体を吸着後溶出回収する工程とを組み合わせることにより、高い精度で抗体を精製可能であることを見出し、本発明に係る方法を完成させるに至った。トリプトファンは必須アミノ酸のひとつであり、大量に摂取しない限り毒性はない。因みにマウスへ腹腔内投与した場合の半数致死量（ＬＤ５０）は４．８ｇ／ｋｇである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る抗体の精製方法を用いることにより、抗体の変性を引き起こさず、異種タンパク質、人工合成化合物、あるいは抗体凝集体の混入のない抗体を得ることが可能となる。また、高価なプロテインＡリガンドを有するカラム担体を用いることなく、高い精度で抗体を精製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための最良の形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１２】
（第１の実施形態）
本実施の形態の精製方法は、抗体を含有する混合液から前記抗体を精製するための方法であって、アニオン交換基を有する多孔膜を用いて、前記混合液から不純物を吸着除去する工程と、前記不純物を吸着除去する工程の次に、トリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する工程と、を含む。
【００１３】
最初に、本実施の形態における不純物を吸着除去する工程について説明する。本実施の形態に係るアニオン交換基を有する多孔膜は、基材となる多孔質体と、多孔質体の細孔の側壁表面に化学的又は物理的に固定されたアニオン交換基を備える。ここで、多孔膜が細孔の側壁表面にグラフト鎖を有し、かつグラフト鎖にアニオン交換基が固定されていると、吸着容量が高いためより好ましい。グラフト鎖の材質は特に限定しないが、細孔の側壁表面に導入しやすいことから、メタクリル酸グリシジル又は酢酸ビニルの重合体が好ましく、アニオン交換基を化学的に固定しやすいことから、メタクリル酸グリシジルの重合体がより好ましい。
【００１４】
多孔質体の素材は特に限定はされないが、機械的性質の保持のためにはポリオレフィン系重合体又はオレフィンとハロゲン化オレフィンとの共重合体から構成されていることが好ましい。これらの素材の中でも、機械的強度に特に優れ、かつ高い吸着容量が得られる素材である点で、ポリエチレン及びポリフッ化ビニリデンが好ましく、ポリエチレンがより好ましい。
【００１５】
多孔質体の最表面及び細孔の側壁表面に、グラフト鎖を導入し、グラフト鎖にさらにアニオン交換基を固定する方法は、限定されるものではないが、例えば、特開平２−１３２１３２号公報に開示されている。
【００１６】
アニオン交換基としては、ＤＮＡ、宿主細胞由来のタンパク質（ＨＣＰ）、ウィルス、及びエンドトキシン等の不純物を吸着するアニオン交換基であれば限定されるものではないが、ジエチルアミノ基（ＤＥＡ）、四級アンモニウム基（Ｑ）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、及びジエチルアミノプロピル基等が挙げられる。中でも、多孔質体に導入されたグラフト鎖への化学的な固定が容易であり、高い吸着容量が得られることから、ジエチルアミノ基及び四級アンモニウム基が好ましく、ジエチルアミノ基がより好ましい。
【００１７】
多孔膜の最大細孔径は、濁質成分及びバクテリアをカットし、なおかつ高い透過流速を得るために、０．１μｍ以上、１．０μｍ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．１μｍ乃至０．６μｍの範囲内であり、より好ましくは０．２２μｍ乃至０．５μｍの範囲内である。
【００１８】
多孔膜の形態は、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、キャピラリー、円板又は円筒状など、多孔質体であれば形態は限定しない。しかし、製造のしやすさ、スケールアップ性、モジュール成型した際の膜のパッキング性などから、中空糸膜であることが好ましい。
【００１９】
（請求項４のサポート）
前述のように、抗体を含有する混合液から不純物を吸着除去する目的のためには、アニオン交換基を有する中空糸多孔膜を、モジュールに内蔵されていることが好ましい。中空糸膜モジュールは、多孔質体の最表面及び細孔の側壁表面にアニオン交換基が化学的又は物理的に固定された多孔質中空糸よりなる中空糸多孔膜を内蔵するモジュールである。該モジュールを用いて、溶存するあるいは濁質成分としての不純物を混合液から吸着除去することができる。
【００２０】
次に、本実施の形態におけるトリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する工程を説明する。吸着体は、担体にトリプトファンを担持することにより形成される。担体の素材及び形態は、特に限定されないが、天然高分子又は合成高分子からなる粒子、多孔膜、多孔中空糸、不織布等が使用可能である。また、担体へのトリプトファンの固定化方法は、ｐＨ３乃至９で安定であり、ｐＨ３乃至９の条件下における溶出物濃度が人体に毒性を示す濃度未満となる方法であれば特に限定されない。吸着体として、具体的には、トリプトファン固定化ポリビニルアルコールゲル（以下ＴＲ−ＰＶＡ担体）等が使用可能である。
【００２１】
本実施の形態において、吸着した抗体の溶出には、ｐＨ３乃至９の緩衝液が使用される。ｐＨ３乃至９の緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、及び希塩酸溶液等が使用可能である。また、緩衝液には、例えば塩化ナトリウム、アルギニン等の種々の添加物を添加してもよい。
【００２２】
（第２の実施形態）
本実施の形態における別の精製方法は、抗体を含有する混合液から前記抗体を精製するための方法であって、トリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する精製工程に次いで、以下の工程の少なくとも一つを含む方法により、さらに不純物を除去する。
（１）アニオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、
（２）カチオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、
（３）疎水性クロマトグラフィーで精製する工程。
【００２３】
トリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する工程は、前記第１の実施形態と同様である。
吸着体から抗体を溶出回収した後、さらに抗体を精製するために、アニオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、カチオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、及び疎水性クロマトグラフィーで精製する工程から選ばれる、少なくとも一つの精製工程が実施されてもよい。これらのクロマトグラフィー工程においては、リガンドが固定された樹脂を充填したクロマトグラフィーカラム、あるいはリガンドが固定された多孔膜を用いることができる。ここでリガンドの種類は、抗体精製の目的に適したものであれば、特に限定されない。
【００２４】
本実施の形態（第１及び第２の実施形態を含む。）に適用される、抗体を含有する混合液は特に限定されない。例えば血漿、血清、腹水、あるいは細胞培養液等に、本実施の形態を適用可能である。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例及び比較例によって、本実施の形態をより具体的に説明するが、本発明の実施の形態は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２６】
（製造例１) アニオン交換膜モジュールの作成
外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、細孔径０．３μｍ、空孔率７０％のポリエチレン中空糸に、特開平２−１３２１３２号公報に開示されている方法に従って、グラフト鎖を導入した。その後、アニオン交換基としてジエチルアミノ基をグラフト鎖に固定した。得られた中空糸３本を束ね、中空糸の中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で量末端をポリスルホン酸製モジュールケースに固定し、アニオン交換基を有する中空糸モジュールを作製した。得られたモジュールの内径は９ｍｍ、長さは約３３ｍｍ、モジュールの内容積は約２ｍＬ、モジュール内に占める多孔質中空糸の有効体積は０．８５ｍＬ、中空部分を除いた中空糸多孔膜のみの体積は０．５４ｍＬであった。
【００２７】
（製造例２) 抗体含有細胞培養液の調整
無血清培地にて培養したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養液（塩濃度約０．９質量％、たんぱく質濃度約１ｇ／Ｌ、細胞密度１．１×１０7／ｍＬ）１９６ｍＬに抗体５０ｍｇ／ｍＬを含むヒトγ−グロブリン溶液（ベネシス社、ヴェノグロブリン）４ｍＬを添加し、塩酸によりｐＨ５．０に調整した後、０．４５μｍの精密ろ過膜を透過させることにより、抗体１ｍｇ／ｍＬを含有する細胞培養液を調整した。得られた培養液中の代表的な不純物であるＨＣＰ濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。具体的には、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔの９６ウェルプレートに細胞培養液を滴下し、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩ９６のプレートリーダーを用いてＨＣＰ濃度を測定した。その結果、細胞培養液中のＨＣＰ濃度は、３４６μｇ／ｍＬであった。さらに他の代表的な不純物であるＤＮＡの定量は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて評価する細胞培養液を処理した後、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）フルオロメーターを用いて行った。その結果、細胞培養液中のＤＮＡ濃度は７３４０ｎｇ／ｍＬであった。
【００２８】
（実施例１） 抗体精製その１：アニオン交換膜に次いでＴＲ−ＰＶＡ担体を用いた抗体精製
製造例１で作成したアニオン交換膜モジュールに２０ｍｍｏｌ／L酢酸−０．２ｍｏｌ／L ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍＬを通液して平衡化した後、製造例２で調整した抗体含有細胞培養液５４ｍＬを透過させ、不純物が除去された抗体含有細胞培養液を得た。次に、２ｍＬのＴＲ−ＰＶＡ担体を充填したカラムを、２０ｍｍｏｌ／L酢酸−０．２ｍｏｌ／L ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ５．０）２０ｍＬを用いて平衡化した後、不純物が除去された抗体含有細胞培養液２０ｍＬを通液し、カラムに抗体を吸着させた。その後、カラムに上記緩衝液４０ｍＬを通液して洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Lのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を２０ｍＬ通液して、抗体を溶出回収した。得られた溶出回収液に、等量の１０ｍｍｏｌ／Lリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し中和した後、１．５ｍｍｏｌ／LのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で回収液をｐＨ８．０に調整し、抗体の精製液を得た。
【００２９】
得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度を製造例２と同様にして測定した結果、３．１８μｇ／ｍＬであった。また製造例２と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、３３．２ｎｇ／ｍＬであった。さらに得られた回収液を１０倍希釈し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光係数１．３を用いて得られた精製液中の抗体重量は１８．２ｍｇであった。アニオン交換膜で不純物を除去した後の抗体含有細胞培養液２０ｍＬ中の抗体濃度を１ｍｇ／ｍＬとすると、カラムに添加された抗体の重量は２０ｍｇである。したがって、カラム処理後の抗体の回収率は９１％であった。よって、本実施の形態に係る精製方法により、高い精製度と回収率で抗体を回収できることが示された。
【００３０】
（比較例１） 抗体精製その２：ＴＲ−ＰＶＡ担体のみを用いた抗体精製
製造例２で作成した抗体含有細胞培養液３０ｍＬを０．２μｍ除菌膜（ザルトリウス社製、Ｍｉｎｉｓａｒｔ ｐｌｕｓ）に通液した後、実施例１と同様にして、ＴＲ−ＰＶＡ担体を用いて吸着、溶出回収し、ｐＨ８．０に調整して、抗体の精製液を得た。製造例２と同様にして、得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度及びＤＮＡ濃度を測定したところ、それぞれ１５．３μｇ／ｍＬ及び８４．５ｎｇ／ｍＬであった。また実施例１と同様の方法で抗体の回収率を測定したところ９３％であった。この結果より、ＴＲ−ＰＶＡ担体のみを用いた精製でも不純物は除去されるが、事前にアニオン交換膜を用いて不純物除去をした場合と比較して、精製度が大幅に劣ることが示された。
【００３１】
（実施例２） 抗体精製その３：ＴＲ−ＰＶＡ担体に次いでアニオン交換膜を用いた抗体精製
製造例１で作製したアニオン交換膜モジュールに１０ｍｍｏｌ／LのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍＬを通液して平衡化した。その後、アニオン交換膜モジュールに、比較例１でＴＲ−ＰＶＡ担体を用いて得られたｐＨ８．０の抗体精製液２２．５ｍＬを通液し、さらに上記平衡化緩衝液１０ｍＬを通液して併せて回収し、アニオン交換膜によるＴＲ−ＰＶＡ担体カラム後の精製液を得た。製造例２と同様にして、この抗体精製液中のＨＣＰ濃度及びＤＮＡ濃度を測定したところ、それぞれ５６ｎｇ／ｍＬ及び１．１ｎｇ／ｍＬであった。また実施例１と同様の方法で抗体の回収率を測定したところ８４％であった。
【００３２】
（比較例２） 抗体精製その４：プロテインＡカラムを用いた抗体精製
製造例２で得られた抗体含有細胞培養液２５ｍＬを０．２μｍ除菌膜（ザルトリウス製、Ｍｉｎｉｓａｒｔ ｐｌｕｓ）に通液した後、２０ｍｍｏｌ／Lのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰ １ｍｌ）に１０ｍＬ添加し、抗体を吸着させた。カラムに上記緩衝液２０ｍＬを通液して洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Lのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を１０ｍＬ通液して、抗体を溶出回収した。得られた溶出回収液に、等量の１０ｍｍｏｌ／Lリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し中和した後、１．５ｍｏｌ／LのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で回収液をｐＨ８．０に調整し、抗体の精製液を得た。
【００３３】
得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度を製造例２と同様にして測定した結果、２．９３μｇ／ｍＬであった。また製造例２と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、６３．２ｎｇ／ｍＬであった。さらに得られた回収液を１０倍希釈し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光係数１．３を用いて得られた抗体の回収率は９０％であった。この結果を比較例１の結果と比較すると、ＴＲ−ＰＶＡ担体のみによる抗体の精製度は、プロテインＡカラムのみによる精製度より劣ることが示された。これに対し、実施例１の結果と比較すると、アニオン交換膜で不純物を除去した後に、ＴＲ−ＰＶＡ担体で抗体を精製した場合の精製度は、プロテインＡカラムのみによる精製度と同等とであることが示された。
【００３４】
（比較例３) 抗体精製その５：プロテインＡカラムに次いでアニオン交換カラムを用いた抗体精製
アニオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＨｉＴｒａｐＱ ＦＦ １ｍｌ）に１０ｍｍｏｌ／LのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを通液して平衡化した。その後、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに比較例２でプロテインＡカラムを用いて得られたｐＨ８．０の抗体精製液２２．５ｍＬを通液し、さらに上記平衡化緩衝液１０ｍＬを通液して併せて回収し、アニオン交換クロマトグラフィーカラムによるプロテインＡカラム後の精製液を得た。製造例２と同様にして、得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度及びＤＮＡ濃度を測定したところ、それぞれ４８ｎｇ／ｍＬ及び１．０ｎｇ／ｍＬであった。また実施例１と同様の方法で抗体の回収率を測定したところ８３％であった。この結果を実施例２と比較することにより、ＴＲ−ＰＶＡ担体を用いて不純物を除去した後、さらにアニオン交換膜を用いて抗体を精製した場合の精製度は、プロテインＡカラムに次いでアニオン交換カラムを用いて抗体を精製した場合の精製度と同等であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明に係る抗体の精製方法は、製薬産業及び医療産業等に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の精製技術に関し、特にバイオ医薬品としての抗体の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、標的物質を高い特異性で認識し、結合する。そのため抗体は、研究用試薬や臨床検査試薬として極めて有用である。こと近年においては、種々の治療用抗体が開発され、従来治療が困難であったリウマチや癌などの分野において、画期的な治療薬として医療技術の進歩に大きく貢献している。抗体の精製方法は、大まかに培養及び精製の二工程を含む。培養工程においては、免疫した動物あるいは抗体産性能を持つ細胞を用いて、抗体を含有する血液、腹水、あるいは細胞培養液等が得られる。細胞培養液等には抗体以外の様々なタンパク質やデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等の不純物が含まれる。そのため、精製工程においては、不純物を減じ、抗体の純度を著しく高めることが求められる。
【０００３】
精製工程において重要な役割を果たしているのが、アフィニティリガンドとして用いられる黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のプロテインＡ、あるいはその組換え体であるプロテインＧである。プロテインＡ及びプロテインＧは抗体に対して非常に特異的であり、かつ高い親和性を有する。そのため、プロテインＡ及びプロテインＧを用いた抗体の精製方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。しかし、プロテインＡ及びプロテインＧは、通常、大変高価である。また、プロテインＡ及びプロテインＧを用いた抗体の精製工程では、ｐＨ３付近の低ｐＨ緩衝液のみが用いられる。そのため、プロテインＡ及びプロテインＧは、低ｐＨで変性する抗体には適用できず、また、適用できたとしても抗体の凝集を引き起こすことが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。しかし、ヒトへ投与した場合に、抗体の凝集体は抗原性を示すことが懸念されており、こと治療用抗体の製造においては、凝集体の除去及び残留量のモニタリングが求められる（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
さらに、プロテインＡ及びプロテインＧは、微生物由来のタンパク質であるため、プロテインＡ及びプロテインＧを含む抗体医薬品が投与された場合に、感受性の高い患者ではアナフィラキシー様の症状を引き起こす可能性がある（例えば、非特許文献３参照。）。そのため、抗体医薬品の製造工程の後段において、プロテインＡ及びプロテインＧを除去し、残留量をモニタリングすることが必須となる。
【０００５】
以上の課題を解決するため、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーを組み合わせた方法が知られている（例えば、特許文献２参照。）。また有機化学的に合成されたプロテインＡ模倣リガンドを用い、プロテインＡを用いない抗体の精製方法も報告されている（例えば、特許文献３参照。）。また、プロテインA模倣リガンドは、プロテインAそのものと比較すると、抗体の選択的吸着性が劣るため、吸着後に溶出した溶出液の抗体の精製度が充分でない。一方、弱酸性付近の緩衝液を用いてプロテインＡから抗体を脱離させる方法が報告されている（例えば、特許文献３参照。）。
【特許文献１】欧州特許第３１０７１９号明細書
【特許文献２】特開平７−２６７９９７号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０６４２８１号パンフレット
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Journal of Pharmaceutical Sciences）、２００７年、第９６巻、ｐ．１−２６
【非特許文献２】エイミー・Ｓ・ローゼンブルグ（Amy S. Rosenberg）著、「Overview S ignificance of Protein Aggregation to Therapeutic Protein Products」、[平成２ ０年９月１２日検索]、インターネット＜URL : http://www.fda.gov/cder/regulatory/follow_on/200512/200512_rosenberg.pdf＞
【非特許文献３】Ｅｄｓ．Ｃ．Ｓ．Ｆ．イースモン及びＣ．アドラム（Eds. C.S.F. Easmon and C. Adlam）著、「Staphylococci and Staphylococcal infections 2」、(英国)、アカデミック・プレス（Academic Press Inc.）、１９８３年、ｐ．４２９−４８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献２におけるイオン交換クロマトグラフィー及び疎水クロマトグラフィーを組み合わせた方法では、プロテインＡ及びプロテインＧに比べて結合特性が低いことから、汎用性に乏しく、抗体の工業的な生産に広く用いられるに至っていない。
【０００７】
また、特許文献３では、人工的に合成された化合物を用いる以上、プロテインＡ模倣リガンドを含む抗体医薬品が投与された場合、感受性の高い患者においてアナフィラキシー様の症状が引き起こされる可能性を免れない。さらに、特許文献３では、プロテインＡを用いた方法をベースにしている以上、上記課題の根本的な解決に至っていない。
【０００８】
かかる事情に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、抗体の変性あるいは凝集を引き起こさないｐＨ条件で使用可能であり、安価にかつ簡便に、高い精度で抗体を精製可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者らは、上記問題を解決するため、種々の吸着体及び精製方法について鋭意研究を重ねた結果、アニオン交換基が固定された多孔膜を用いて混合液をろ過することにより、不純物を除去する工程と、次いでトリプトファンを低分子リガンドとした吸着体を用いたアフィニティカラムで抗体を吸着後溶出回収する工程とを組み合わせることにより、高い精度で抗体を精製可能であることを見出し、本発明に係る方法を完成させるに至った。トリプトファンは必須アミノ酸のひとつであり、大量に摂取しない限り毒性はない。因みにマウスへ腹腔内投与した場合の半数致死量（ＬＤ５０）は４．８ｇ／ｋｇである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る抗体の精製方法を用いることにより、抗体の変性を引き起こさず、異種タンパク質、人工合成化合物、あるいは抗体凝集体の混入のない抗体を得ることが可能となる。また、高価なプロテインＡリガンドを有するカラム担体を用いることなく、高い精度で抗体を精製することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための最良の形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１２】
（第１の実施形態）
本実施の形態の精製方法は、抗体を含有する混合液から前記抗体を精製するための方法であって、アニオン交換基を有する多孔膜を用いて、前記混合液から不純物を吸着除去する工程と、前記不純物を吸着除去する工程の次に、トリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する工程と、を含む。
【００１３】
最初に、本実施の形態における不純物を吸着除去する工程について説明する。本実施の形態に係るアニオン交換基を有する多孔膜は、基材となる多孔質体と、多孔質体の細孔の側壁表面に化学的又は物理的に固定されたアニオン交換基を備える。ここで、多孔膜が細孔の側壁表面にグラフト鎖を有し、かつグラフト鎖にアニオン交換基が固定されていると、吸着容量が高いためより好ましい。グラフト鎖の材質は特に限定しないが、細孔の側壁表面に導入しやすいことから、メタクリル酸グリシジル又は酢酸ビニルの重合体が好ましく、アニオン交換基を化学的に固定しやすいことから、メタクリル酸グリシジルの重合体がより好ましい。
【００１４】
多孔質体の素材は特に限定はされないが、機械的性質の保持のためにはポリオレフィン系重合体又はオレフィンとハロゲン化オレフィンとの共重合体から構成されていることが好ましい。これらの素材の中でも、機械的強度に特に優れ、かつ高い吸着容量が得られる素材である点で、ポリエチレン及びポリフッ化ビニリデンが好ましく、ポリエチレンがより好ましい。
【００１５】
多孔質体の最表面及び細孔の側壁表面に、グラフト鎖を導入し、グラフト鎖にさらにアニオン交換基を固定する方法は、限定されるものではないが、例えば、特開平２−１３２１３２号公報に開示されている。
【００１６】
アニオン交換基としては、ＤＮＡ、宿主細胞由来のタンパク質（ＨＣＰ）、ウィルス、及びエンドトキシン等の不純物を吸着するアニオン交換基であれば限定されるものではないが、ジエチルアミノ基（ＤＥＡ）、四級アンモニウム基（Ｑ）、四級アミノエチル基（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、及びジエチルアミノプロピル基等が挙げられる。中でも、多孔質体に導入されたグラフト鎖への化学的な固定が容易であり、高い吸着容量が得られることから、ジエチルアミノ基及び四級アンモニウム基が好ましく、ジエチルアミノ基がより好ましい。
【００１７】
多孔膜の最大細孔径は、濁質成分及びバクテリアをカットし、なおかつ高い透過流速を得るために、０．１μｍ以上、１．０μｍ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．１μｍ乃至０．６μｍの範囲内であり、より好ましくは０．２２μｍ乃至０．５μｍの範囲内である。
【００１８】
多孔膜の形態は、平膜、不織布、中空糸膜、モノリス、キャピラリー、円板又は円筒状など、多孔質体であれば形態は限定しない。しかし、製造のしやすさ、スケールアップ性、モジュール成型した際の膜のパッキング性などから、中空糸膜であることが好ましい。
【００１９】
（請求項４のサポート）
前述のように、抗体を含有する混合液から不純物を吸着除去する目的のためには、アニオン交換基を有する中空糸多孔膜を、モジュールに内蔵されていることが好ましい。中空糸膜モジュールは、多孔質体の最表面及び細孔の側壁表面にアニオン交換基が化学的又は物理的に固定された多孔質中空糸よりなる中空糸多孔膜を内蔵するモジュールである。該モジュールを用いて、溶存するあるいは濁質成分としての不純物を混合液から吸着除去することができる。
【００２０】
次に、本実施の形態におけるトリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する工程を説明する。吸着体は、担体にトリプトファンを担持することにより形成される。担体の素材及び形態は、特に限定されないが、天然高分子又は合成高分子からなる粒子、多孔膜、多孔中空糸、不織布等が使用可能である。また、担体へのトリプトファンの固定化方法は、ｐＨ３乃至９で安定であり、ｐＨ３乃至９の条件下における溶出物濃度が人体に毒性を示す濃度未満となる方法であれば特に限定されない。吸着体として、具体的には、トリプトファン固定化ポリビニルアルコールゲル（以下ＴＲ−ＰＶＡ担体）等が使用可能である。
【００２１】
本実施の形態において、吸着した抗体の溶出には、ｐＨ３乃至９の緩衝液が使用される。ｐＨ３乃至９の緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、及び希塩酸溶液等が使用可能である。また、緩衝液には、例えば塩化ナトリウム、アルギニン等の種々の添加物を添加してもよい。
【００２２】
（第２の実施形態）
本実施の形態における別の精製方法は、抗体を含有する混合液から前記抗体を精製するための方法であって、トリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する精製工程に次いで、以下の工程の少なくとも一つを含む方法により、さらに不純物を除去する。
（１）アニオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、
（２）カチオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、
（３）疎水性クロマトグラフィーで精製する工程。
【００２３】
トリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する工程は、前記第１の実施形態と同様である。
吸着体から抗体を溶出回収した後、さらに抗体を精製するために、アニオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、カチオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、及び疎水性クロマトグラフィーで精製する工程から選ばれる、少なくとも一つの精製工程が実施されてもよい。これらのクロマトグラフィー工程においては、リガンドが固定された樹脂を充填したクロマトグラフィーカラム、あるいはリガンドが固定された多孔膜を用いることができる。ここでリガンドの種類は、抗体精製の目的に適したものであれば、特に限定されない。
【００２４】
本実施の形態（第１及び第２の実施形態を含む。）に適用される、抗体を含有する混合液は特に限定されない。例えば血漿、血清、腹水、あるいは細胞培養液等に、本実施の形態を適用可能である。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例及び比較例によって、本実施の形態をより具体的に説明するが、本発明の実施の形態は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００２６】
（製造例１) アニオン交換膜モジュールの作成
外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、細孔径０．３μｍ、空孔率７０％のポリエチレン中空糸に、特開平２−１３２１３２号公報に開示されている方法に従って、グラフト鎖を導入した。その後、アニオン交換基としてジエチルアミノ基をグラフト鎖に固定した。得られた中空糸３本を束ね、中空糸の中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で量末端をポリスルホン酸製モジュールケースに固定し、アニオン交換基を有する中空糸モジュールを作製した。得られたモジュールの内径は９ｍｍ、長さは約３３ｍｍ、モジュールの内容積は約２ｍＬ、モジュール内に占める多孔質中空糸の有効体積は０．８５ｍＬ、中空部分を除いた中空糸多孔膜のみの体積は０．５４ｍＬであった。
【００２７】
（製造例２) 抗体含有細胞培養液の調整
無血清培地にて培養したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養液（塩濃度約０．９質量％、たんぱく質濃度約１ｇ／Ｌ、細胞密度１．１×１０7／ｍＬ）１９６ｍＬに抗体５０ｍｇ／ｍＬを含むヒトγ−グロブリン溶液（ベネシス社、ヴェノグロブリン）４ｍＬを添加し、塩酸によりｐＨ５．０に調整した後、０．４５μｍの精密ろ過膜を透過させることにより、抗体１ｍｇ／ｍＬを含有する細胞培養液を調整した。得られた培養液中の代表的な不純物であるＨＣＰ濃度を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。具体的には、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＣＨＯ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔの９６ウェルプレートに細胞培養液を滴下し、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＩＩ９６のプレートリーダーを用いてＨＣＰ濃度を測定した。その結果、細胞培養液中のＨＣＰ濃度は、３４６μｇ／ｍＬであった。さらに他の代表的な不純物であるＤＮＡの定量は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて評価する細胞培養液を処理した後、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）フルオロメーターを用いて行った。その結果、細胞培養液中のＤＮＡ濃度は７３４０ｎｇ／ｍＬであった。
【００２８】
（実施例１） 抗体精製その１：アニオン交換膜に次いでＴＲ−ＰＶＡ担体を用いた抗体精製
製造例１で作成したアニオン交換膜モジュールに２０ｍｍｏｌ／L酢酸−０．２ｍｏｌ／L ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍＬを通液して平衡化した後、製造例２で調整した抗体含有細胞培養液５４ｍＬを透過させ、不純物が除去された抗体含有細胞培養液を得た。次に、２ｍＬのＴＲ−ＰＶＡ担体を充填したカラムを、２０ｍｍｏｌ／L酢酸−０．２ｍｏｌ／L ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ５．０）２０ｍＬを用いて平衡化した後、不純物が除去された抗体含有細胞培養液２０ｍＬを通液し、カラムに抗体を吸着させた。その後、カラムに上記緩衝液４０ｍＬを通液して洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Lのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を２０ｍＬ通液して、抗体を溶出回収した。得られた溶出回収液に、等量の１０ｍｍｏｌ／Lリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し中和した後、１．５ｍｍｏｌ／LのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で回収液をｐＨ８．０に調整し、抗体の精製液を得た。
【００２９】
得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度を製造例２と同様にして測定した結果、３．１８μｇ／ｍＬであった。また製造例２と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、３３．２ｎｇ／ｍＬであった。さらに得られた回収液を１０倍希釈し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光係数１．３を用いて得られた精製液中の抗体重量は１８．２ｍｇであった。アニオン交換膜で不純物を除去した後の抗体含有細胞培養液２０ｍＬ中の抗体濃度を１ｍｇ／ｍＬとすると、カラムに添加された抗体の重量は２０ｍｇである。したがって、カラム処理後の抗体の回収率は９１％であった。よって、本実施の形態に係る精製方法により、高い精製度と回収率で抗体を回収できることが示された。
【００３０】
（比較例１） 抗体精製その２：ＴＲ−ＰＶＡ担体のみを用いた抗体精製
製造例２で作成した抗体含有細胞培養液３０ｍＬを０．２μｍ除菌膜（ザルトリウス社製、Ｍｉｎｉｓａｒｔ ｐｌｕｓ）に通液した後、実施例１と同様にして、ＴＲ−ＰＶＡ担体を用いて吸着、溶出回収し、ｐＨ８．０に調整して、抗体の精製液を得た。製造例２と同様にして、得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度及びＤＮＡ濃度を測定したところ、それぞれ１５．３μｇ／ｍＬ及び８４．５ｎｇ／ｍＬであった。また実施例１と同様の方法で抗体の回収率を測定したところ９３％であった。この結果より、ＴＲ−ＰＶＡ担体のみを用いた精製でも不純物は除去されるが、事前にアニオン交換膜を用いて不純物除去をした場合と比較して、精製度が大幅に劣ることが示された。
【００３１】
（実施例２） 抗体精製その３：ＴＲ−ＰＶＡ担体に次いでアニオン交換膜を用いた抗体精製
製造例１で作製したアニオン交換膜モジュールに１０ｍｍｏｌ／LのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）２０ｍＬを通液して平衡化した。その後、アニオン交換膜モジュールに、比較例１でＴＲ−ＰＶＡ担体を用いて得られたｐＨ８．０の抗体精製液２２．５ｍＬを通液し、さらに上記平衡化緩衝液１０ｍＬを通液して併せて回収し、アニオン交換膜によるＴＲ−ＰＶＡ担体カラム後の精製液を得た。製造例２と同様にして、この抗体精製液中のＨＣＰ濃度及びＤＮＡ濃度を測定したところ、それぞれ５６ｎｇ／ｍＬ及び１．１ｎｇ／ｍＬであった。また実施例１と同様の方法で抗体の回収率を測定したところ８４％であった。
【００３２】
（比較例２） 抗体精製その４：プロテインＡカラムを用いた抗体精製
製造例２で得られた抗体含有細胞培養液２５ｍＬを０．２μｍ除菌膜（ザルトリウス製、Ｍｉｎｉｓａｒｔ ｐｌｕｓ）に通液した後、２０ｍｍｏｌ／Lのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬで平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰ １ｍｌ）に１０ｍＬ添加し、抗体を吸着させた。カラムに上記緩衝液２０ｍＬを通液して洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Lのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）を１０ｍＬ通液して、抗体を溶出回収した。得られた溶出回収液に、等量の１０ｍｍｏｌ／Lリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．２）を添加し中和した後、１．５ｍｏｌ／LのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で回収液をｐＨ８．０に調整し、抗体の精製液を得た。
【００３３】
得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度を製造例２と同様にして測定した結果、２．９３μｇ／ｍＬであった。また製造例２と同様にしてＤＮＡ濃度を測定した結果、６３．２ｎｇ／ｍＬであった。さらに得られた回収液を１０倍希釈し、波長２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体の吸光係数１．３を用いて得られた抗体の回収率は９０％であった。この結果を比較例１の結果と比較すると、ＴＲ−ＰＶＡ担体のみによる抗体の精製度は、プロテインＡカラムのみによる精製度より劣ることが示された。これに対し、実施例１の結果と比較すると、アニオン交換膜で不純物を除去した後に、ＴＲ−ＰＶＡ担体で抗体を精製した場合の精製度は、プロテインＡカラムのみによる精製度と同等とであることが示された。
【００３４】
（比較例３) 抗体精製その５：プロテインＡカラムに次いでアニオン交換カラムを用いた抗体精製
アニオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＨｉＴｒａｐＱ ＦＦ １ｍｌ）に１０ｍｍｏｌ／LのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍＬを通液して平衡化した。その後、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに比較例２でプロテインＡカラムを用いて得られたｐＨ８．０の抗体精製液２２．５ｍＬを通液し、さらに上記平衡化緩衝液１０ｍＬを通液して併せて回収し、アニオン交換クロマトグラフィーカラムによるプロテインＡカラム後の精製液を得た。製造例２と同様にして、得られた抗体の精製液中のＨＣＰ濃度及びＤＮＡ濃度を測定したところ、それぞれ４８ｎｇ／ｍＬ及び１．０ｎｇ／ｍＬであった。また実施例１と同様の方法で抗体の回収率を測定したところ８３％であった。この結果を実施例２と比較することにより、ＴＲ−ＰＶＡ担体を用いて不純物を除去した後、さらにアニオン交換膜を用いて抗体を精製した場合の精製度は、プロテインＡカラムに次いでアニオン交換カラムを用いて抗体を精製した場合の精製度と同等であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明に係る抗体の精製方法は、製薬産業及び医療産業等に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を含有する混合液から前記抗体を精製するための方法であって、
アニオン交換基を有する多孔膜を用いて、前記混合液から不純物を吸着除去する工程と、
前記不純物を吸着除去する工程の次に、トリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する工程と、
を含む抗体の精製方法。
【請求項２】
前記アニオン交換基が、前記多孔膜の細孔の側壁表面に結合したグラフト鎖に固定されている、請求項１に記載の抗体の精製方法。
【請求項３】
前記アニオン交換基を有する多孔膜がモジュール内に格納されており、前記混合液を前記多孔膜に透過させることにより、前記混合液から前記不純物を吸着除去する請求項１又は２に記載の抗体の精製方法。
【請求項４】
抗体を含有する混合液から前記抗体を精製するための方法であって、トリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する精製工程に次いで、以下の工程の少なくとも一つを含む方法により、さらに不純物を除去する抗体の精製方法。
（１）アニオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、
（２）カチオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、
（３）疎水性クロマトグラフィーで精製する工程。
【請求項５】
前記クロマトグラフィーで精製する工程において、リガンドが担持された多孔膜又は樹脂を用いる、請求項４に記載の抗体の精製方法。
【請求項１】
抗体を含有する混合液から前記抗体を精製するための方法であって、
アニオン交換基を有する多孔膜を用いて、前記混合液から不純物を吸着除去する工程と、
前記不純物を吸着除去する工程の次に、トリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する工程と、
を含む抗体の精製方法。
【請求項２】
前記アニオン交換基が、前記多孔膜の細孔の側壁表面に結合したグラフト鎖に固定されている、請求項１に記載の抗体の精製方法。
【請求項３】
前記アニオン交換基を有する多孔膜がモジュール内に格納されており、前記混合液を前記多孔膜に透過させることにより、前記混合液から前記不純物を吸着除去する請求項１又は２に記載の抗体の精製方法。
【請求項４】
抗体を含有する混合液から前記抗体を精製するための方法であって、トリプトファンを担持した吸着体を用いて前記抗体を吸着した後、前記抗体を溶出し回収する精製工程に次いで、以下の工程の少なくとも一つを含む方法により、さらに不純物を除去する抗体の精製方法。
（１）アニオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、
（２）カチオン交換クロマトグラフィーで精製する工程、
（３）疎水性クロマトグラフィーで精製する工程。
【請求項５】
前記クロマトグラフィーで精製する工程において、リガンドが担持された多孔膜又は樹脂を用いる、請求項４に記載の抗体の精製方法。
【公開番号】特開２０１０−７０４９０（Ｐ２０１０−７０４９０Ａ）
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２３９２５４（Ｐ２００８−２３９２５４）
【出願日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
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